CN103687624A - 靶向的聚合缀合物和其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了聚合缀合物，所述聚合缀合物包含具有与其附接的骨靶向部分和治疗活性剂的聚合物骨架，其中所述骨靶向部分经由支化单元与所述聚合物骨架的一端附接，如此以致所述骨靶向部分与所述聚合物的摩尔比为至少2∶1。还公开了包含这些缀合物的药物组合物，及所述药物组合物在治疗骨相关的疾患中的用途。

Description

靶向的聚合缀合物和其用途
发明领域和背景
本发明在其一些实施方案中涉及聚合缀合物和它们在治疗和/或诊断中的用途，且更具体地但并非排他地涉及骨靶向的聚合缀合物及其在治疗和/或监测骨相关的疾病和疾患中的用途。
对于癌症化学治疗的成功的一个限制因素在于治疗剂在肿瘤中的积聚。在施用提供能够有效杀死癌细胞所需的化学治疗剂的体内浓度的化学治疗剂的足够量方面遇到困难。
化学治疗剂在肿瘤中的积聚取决于几个因素，包括化学治疗剂的大小、表面特征和循环半衰期及肿瘤中血管生成的程度。
已研发了聚合物-抗癌药物缀合物作为针对癌症的治疗，旨在解决目前使用低分子量药物的方案(protocol)的相关局限性。抗癌剂与水溶性聚合物的偶合已显示了改善安全性谱和抗肿瘤疗效二者，由于例如可能的毒性制剂的避免；并显示有助于改善的生物分布和药代动力学，其由它们的被限制的分布和促进被动靶向实体瘤的增强的渗透和滞留(EPR)效应引起。
美国专利号6,884,817中展示了通过抗肿瘤药物与水溶性聚合物的缀合获得的增加的活性而减少的毒性的实例。
最近的研究已指向合成承载用于组合治疗的两种抗癌药物的靶向的缀合物(Allen，T.M.Nat.Rev.Cancer2002；2：750-763；Brumlik等人ExpertOpin.Drug Delivery2008；5：87-103；Segal等人PLoS ONE2009；4：e5233；Canal等人J.Controlled Release2010，146：388-399)或聚合物(Vicent等人Angew.Chem.，Int.Ed.Engl.2005；44(26)；4061-4066；Pasut等人J.Med.Chem.2009；52；6499-6502.Greco，F.；Vicent等人J.Adv.Drug Delivery Rev.2009；61：1203-1213.)。Satchi-Fainaro等人公开了靶向的缀合物，其中紫杉醇(PTX)和阿仑膦酸盐(ALN)被偶合至HPMA共聚物(Miller等人Angew.Chem.，Int.Ed.Engl.2009；48：2949-2954.)。相对于游离药物，示例性的此缀合物被证明呈现增强的抗癌和抗血管生成活性及明显减少的毒性。就这一点而言的其他研究在Segal等人(PLoS ONE2009；4：e5233)；和Wang等人(Mol.Pharmaceutics2006；3：717-25)中描述。
WO2004/062588教导了用于骨靶向的药物递送的水溶性聚合缀合物。该申请中教导的聚合药物递送系统是基于骨靶向剂诸如阿仑膦酸盐和D-Asp8与化学治疗剂(例如，四环素)的甲基丙烯酸羟丙基酯(HPMA)缀合物。
WO2009/141823教导了聚合缀合物，该聚合缀合物包含具有与其附接的骨靶向部分诸如阿仑膦酸盐和抗血管生成剂诸如紫杉醇或TNP-470的多个聚合物骨架(例如，源自HPMA)。
WO2009/141826教导了具有与其附接的血管生成靶向部分和治疗活性剂诸如抗癌剂或抗血管生成剂的聚合物(例如，PGA)的缀合物。
WO2009/141827教导了具有与其附接的抗血管生成剂诸如TNP-470和高装载的骨靶向部分诸如阿仑膦酸盐(ALN)的源自甲基丙烯酸羟丙基酯(HPMA)共聚物的缀合物。
PTX是用于治疗一些癌症的有效的抗癌药物，然而，由于其缺乏的肿瘤选择性及在Cremophor EL中的制剂二者，其与一些严重的副作用相关。近年来，低剂量的紫杉醇具有抗血管生成特性已变得明显(Wang等人Anticancer Drugs2003；14：13-19)。
Meerum Terwogt等人(PNU166945；Anticancer drugs2001；12：315-323)描述了紫杉醇的HPMA共聚物缀合物。该缀合物旨在改善药物溶解性并提供紫杉醇的控释。
二膦酸盐诸如阿仑膦酸盐(ALN)是被用于治疗骨质疏松症、骨转移及预防骨折的分子。这些化合物呈现对骨矿物羟基磷灰石异常高的亲和力，并因此已知还被用作靶向部分(Uludag，H.Curr Pharm Des2002；8：1929-1944)。
阿仑膦酸盐用于骨相关的疾病和癌症相关的高钙血症的治疗被认为是有效的。其已显示通过一些不同的机理在一些体内癌症模型中具有抗肿瘤作用(Tuomela等人2008，BMC Cancer8：81；Molinuevo等人2007，Eur JPharmacol562：28-33；Hashimoto等人2005，Cancer Res65：540-545)。另外，发现阿仑膦酸盐通过以下具有抗血管生成活性：(i)在卵巢癌模型中抑制VEGF引起的Rho活化(Hashimoto等人2007，Biochem Biphys Res Commun354：478-484)、(ii)在甲羟戊酸途径中抑制法尼基焦磷酸合酶(Russell RG2007，Pediatrics119Suppl2：S150-162)；和(iii)在骨肉瘤细胞系中调节MMP-2表达的细胞水平(Cheng等人2004，Pediatr Blood Cancer42；410-415)。
聚(乙二醇)(PEG)是被批准用于人类使用的聚合物。尽管已知其是非生物可降解的，其在施用进入活的有机体之后是容易可排泄的。典型观察到对于具有低于40kDa的分子量的聚合物或对于具有小于100nm的流体力学直径的聚合物的高排泄。体外研究显示其在水溶液中的存在未显示对蛋白构象或酶的活性的不利影响。在例如Yamaoka等人(1994，J PharmSci83；601-606)中描述了PEG与生物活性化合物的共价附接。
然而，PEG作为低分子量药物(小分子)的载体的潜力被其固有的低装载而限制，其固有的低装载是由于聚合物的化学结构。事实上，只有PEG的末端链基团(在末端)可被修饰并被用于药物偶合。
Wang等人(在Bioconj.Chem.，2003，14，853-859中)教导了基于水溶性聚合物诸如PEG和HPMA的骨靶向的药物递送系统，具有与其附接的骨靶向部分诸如阿仑膦酸盐和Asp8及FITC作为用于检测目的的模型药物。
Katsumi等人(在J.Pharma.Sci.，2011，100，3783-3792中)也教导了PEG缀合的阿仑膦酸盐和其在治疗骨质疏松症中的作用。
Pasut等人(在J.Bioactive and Comp.Poltm.，2005，20，213中)公开了具有高的药物装载、具有基于己二酸或β-谷氨酸支化单元的树型化合物(树枝状)结构的PEG-表柔比星缀合物。
Pasut等人(在J.Med.Chem.2009；52(20)，6499-6502中)报道了关于携带表柔比星(EPI)和每PEG一个或多个一氧化氮(NO)分子的PEG缀合物的合成、表征和生物学性能。
还报道了在药物装载方面不同的聚(乙二醇)、吉西他滨(一种抗肿瘤剂)和靶向部分的生物缀合物(Pasut等人，J.Control Release.2008；127(3)：239-48)。
Canal等人(在J.Controlled Release2010；146：388-399中)公开了具有每聚合链不同叶酸含量的一系列PEG-表柔比星缀合物。在PEG链的一端合成树枝状大分子结构，旨在增加叶酸分子的数量。
Choe等人(在J.Controlled Release2002；79：41-53中)报道了关于阿糖胞苷(ara-C)的多种N-氨基PEG-前体药物的研究。在LX-1实体肺肿瘤模型中，当在摩尔基础上比较时，一些PEG前体药物呈现比阿糖胞苷较佳的活性。然而，将阿糖胞苷装载到PEG上的程度被所得溶液的高粘度限制。
Choe等人(在J.Controlled Release2002；79：55-70中)描述了使用天冬氨酸(Asp)和AspAsp树枝状大分子获得的支化PEG(40,000)酸的合成。这些树枝状酸与阿糖胞苷(ara-C)的缀合通过使用允许支链较大的分开以容纳靠近彼此的一些大的阿糖胞苷分子的间隔基(spacer)而实现。
Berna等人(在Biomacromolecules2006，7：146-153中)合成了具有氨基或羧基末端基团的新的单分散的PEG-树枝状大分子。使用单分散的Fmoc-氨基PEG丙酸作为单体和使用尸胺、三(2-氨乙基)胺或赖氨酸作为支化部分，制备了基于PEG的树枝状大分子。
在例如美国专利号5,714,166、6417,339和6,632,889；及在具有公布号2003/064050和2003/023968的美国专利申请中公开了树枝状结构和药物或其他生物活性分子的其他组合。
骨转移是与晚期恶性肿瘤、特别是三大癌症：乳腺癌、前列腺癌和肺癌中的晚期恶性肿瘤相关的最常见的并发症之一。来自乳腺癌的骨转移是典型溶骨的，涉及造成病理性骨再吸收的破骨细胞的动员，伴随剧烈疼痛、骨折、神经压迫和高钙血症。这些病灶的形成和溶骨性质是基于骨质破坏和肿瘤扩大的循环中癌细胞和骨髓基质之间的复杂的相互作用。细胞相互作用和参与骨转移的分子组成的复杂性已阻碍该过程的关键生物特征、特别是用于骨髓中转移细胞的长期生存的基础的机理说明。
化学治疗剂、激素剥夺和二膦酸盐是用于晚期转移性疾病的常见治疗。然而，随时间的推移，疾病发展为标准的治疗无法控制恶性肿瘤的阶段并进一步发展为高度化学治疗耐受性的状态。
发明概述
根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了一种缀合物，所述缀合物包含聚合物骨架，所述聚合物骨架具有与其附接的治疗活性剂和骨靶向部分的聚合物骨架，治疗活性剂与聚合物骨架的一端附接且骨靶向部分经由支化单元与聚合物骨架的另一端附接，其中骨靶向部分与聚合物的摩尔比为至少2∶1。
根据本发明的一些实施方案，支化单元具有树枝状结构。
根据本发明的一些实施方案，支化单元包括至少一个三官能部分，所述三官能部分包括至少3个官能团，每一个官能团独立地选自由以下组成的组：胺、羧酸酯(carboxylate)、硫代羧酸酯、羟基、硫醇、氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯、磺酸酯、亚磺酸酯、磺酰胺、膦酸酯、亚膦酸酯、磷酰基、脲和硫脲。
根据本发明的一些实施方案，三官能部分选自由以下组成的组：谷氨酸、β-谷氨酸、氨基己二酸、天冬氨酸、赖氨酸和3-羟基-2-胺丙醇。
根据本发明的一些实施方案，支化单元具有树枝状结构且缀合物由通式I表示：
D-L1-[B*]-P-[B1]m 0-[B2]m 1-[B3]m 2......[Bg-L2]m g-1-[T]m g
式I
其中：
D是治疗活性剂；
P是聚合物骨架；
T是骨靶向部分；
B*是支化单元或不存在；
L1是连接部分，将治疗活性剂连接至聚合物骨架的一端；
L2是第二连接部分，经由支化单元将靶向部分连接至聚合物的另一端，或不存在；
B1、B2、B3....Bg各自独立地是支化部分，其中B1、B2、B3....Bg一起形成具有树枝状结构的支化单元；
m是等于2、3、4、5或6的整数，代表树枝状结构的分支数目；并且
g是从1至20范围的整数，代表树枝状结构的代的数目。
根据本发明的一些实施方案，治疗活性剂选自由以下组成的组：抗血管生成剂和抗癌剂。
根据本发明的一些实施方案，治疗活性剂可用于治疗骨相关的疾病或疾患。
根据本发明的一些实施方案，治疗活性剂选自由以下组成的组：紫杉醇、2-甲氧基雌二醇、普啉司他、巴马司他、BAY12-9566、羧胺三唑、CC-1088、乙酸右美沙芬、乙酸二甲基呫吨酮、内皮抑素、IM-862、马马司他、基质金属蛋白酶、青霉胺、PTK787/ZK222584、RPI.4610、乳酸角鲨胺、SU5416、沙利度胺、TNP-470、考布他汀、他莫西芬、COL-3、新伐司他、BMS-275291、SU6668、抗-VEGF抗体、Medi-522(Vitaxin II)、CAI、白介素-12、IM862、阿米洛利(Amilloride)、血管抑蛋白、血管抑素K1-3、血管抑素K1-5、卡托普利、DL-α-二氟甲基鸟氨酸、盐酸DL-α-二氟甲基鸟氨酸、
Figure BDA0000455687210000062
内皮抑素TM蛋白、烟曲霉素、除莠霉素A、4-羟基苯基视黄酰胺、胡桃醌、层粘连蛋白、层粘连蛋白六肽、层粘连蛋白五肽、熏草菌素A、甲羟孕酮、乙酸甲羟孕酮、米诺环素、盐酸米诺环素、胎盘核糖核酸酶抑制剂、苏拉明、苏拉明钠盐、人血小板凝血酶敏感蛋白、中性粒细胞、针对特定促血管新生因子和/或它们的受体的单克隆抗体、多种促血管新生生长因子受体的酪氨酸激酶抑制剂、mTOR的抑制剂、干扰素、IL-12、EMD121974(西仑吉肽)、Vitaxin；角鲨胺(Squalamin)、COX-2抑制剂、PDGFR抑制剂、NM3和2-ME2。
根据本发明的一些实施方案，治疗活性剂是紫杉醇(PTX)。
根据本发明的一些实施方案，治疗活性剂经由生物可裂解的连接部分与聚合物骨架附接。
根据本发明的一些实施方案，生物可裂解的连接部分选自由以下组成的组：水解可裂解的连接部分、pH敏感的连接部分和酶促可裂解的连接部分。
根据本发明的一些实施方案，生物可裂解的部分是水解可裂解的连接部分。
根据本发明的一些实施方案，水解可裂解的连接部分包含酯键。
根据本发明的一些实施方案，水解可裂解的连接部分源自琥珀酸。
根据本发明的一些实施方案，酶促可裂解的连接部分被患病的骨组织中过量表达的酶裂解。
根据本发明的一些实施方案，酶是胞外酶。
根据本发明的一些实施方案，酶促可裂解的连接部分被选自由以下组成的组的酶裂解：组织蛋白酶K、组织蛋白酶D、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L、豆球蛋白(legumain)、MMP-2和MMP-9。
根据本发明的一些实施方案，聚合物骨架源自选自由以下组成的组的聚合物：聚(亚烷基二醇)、聚(2-烷基-2-噁唑啉)和包含聚(亚烷基二醇)和/或聚(2-烷基-2-噁唑啉)的共聚物。
根据本发明的一些实施方案，聚合物骨架源自聚(亚烷基二醇)。
根据本发明的一些实施方案，聚合物骨架源自聚(乙二醇)(PEG)。
根据本发明的一些实施方案，骨靶向部分是二膦酸盐部分。
根据本发明的一些实施方案，二膦酸盐部分选自由以下组成的组：阿仑膦酸盐、英卡膦酸盐、氯膦酸盐、替鲁膦酸盐、依替膦酸盐、伊班膦酸盐、奈立膦酸盐、奥帕膦酸盐、利塞膦酸盐、吡膦酸盐、帕米膦酸盐和唑来膦酸盐。
根据本发明的一些实施方案，二膦酸盐是阿仑膦酸盐。
根据本发明的一些实施方案，聚合物是聚(乙二醇)，骨靶向部分是阿仑膦酸盐，且治疗活性剂是紫杉醇。
根据本发明的这些实施方案中的一些，支化单元具有树枝状结构并包含以树枝状结构排列的至少3个β-谷氨酸部分。
根据本发明的一些实施方案，紫杉醇经由水解可裂解的连接部分与末端骨架单元附接。
根据本发明的一些实施方案，水解可裂解的连接部分包含酯键。
根据本发明的一些实施方案，缀合物还包含与其附接的标记剂(labeling agent)。
根据本发明的一些实施方案，标记剂选自由以下组成的组：荧光剂、放射性剂、磁化剂、发色团、生物发光剂、化学发光剂、磷光剂和重金属团簇。
根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了包含本文描述的任何缀合物(作为活性成分)和药学上可接受的载体的药物组合物。
根据本发明的一些实施方案，药物组合物被包装在包装材料中并在包装材料中或包装材料上用印刷物说明药物组合物在骨相关的疾病或疾患的治疗中的用途。
根据本发明的一些实施方案，缀合物包含标记剂，且组合物被包装在包装材料中并在包装材料中或包装材料上用印刷物说明组合物在监测骨相关的疾病或疾患中的用途。
根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了治疗需要该治疗的受试者中骨相关的疾病或疾患的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本文描述的缀合物。
根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了监测受试者中骨相关的疾病或疾患的方法，该方法包括：
向受试者施用本文描述的缀合物，该缀合物还包括标记剂；和采用成像技术以监测身体或其部分内的缀合物的分布。
根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了如本文描述的缀合物作为药剂的用途。
根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了如本文描述的缀合物在制造用于治疗骨相关的疾病或疾患的药剂中的用途。
根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了如本文描述的缀合物作为诊断剂的用途，所述缀合物还包含标记剂。
根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了如本文描述的缀合物在制造用于监测骨相关的疾病或疾患的诊断剂中的用途，所述缀合物还包含标记剂。
根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了如本文描述的缀合物，其被鉴定用于治疗骨相关的疾病或疾患。
根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了如本文描述的缀合物，其被鉴定用于监测骨相关的疾病或疾患，所述缀合物还包含标记剂。
根据本发明的一些实施方案，疾病或疾患与血管生成相关。
根据本发明的一些实施方案，疾病或疾患选自由以下组成的组：骨转移和骨癌。
根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了一种缀合物，所述缀合物包含聚合物骨架，所述聚合物骨架具有与其一端附接的二膦酸盐部分的聚合物骨架，所述二膦酸盐经由支化单元与聚合物骨架附接，其中二膦酸盐与聚合物的摩尔比为至少2∶1。
根据本发明的一些实施方案，聚合物骨架源自聚(亚烷基二醇)。
根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了一种缀合物，所述缀合物包含聚合物骨架，所述聚合物骨架具有与其附接的治疗活性剂的聚合物骨架，所述治疗活性剂与聚合物骨架的一端附接，其中聚合物骨架还包含经由支化单元与聚合物骨架的另一端附接的反应基团，其中该官能团与聚合物的摩尔比为至少2∶1。
根据本发明的一些实施方案，反应基团可用于将靶向部分附接至缀合物。
根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了制备权利要求1-30中任一项所述的缀合物的方法，所述方法包括：
提供包含聚合物骨架的缀合物，所述聚合物骨架具有与其一端附接的二膦酸盐部分的聚合物骨架，其中该二膦酸盐经由支化单元与聚合物骨架附接，如本文描述的；
提供治疗活性剂；和
将治疗活性剂与权利要求44所述的缀合物附接，从而制备缀合物。
除非另外定义，本文使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属的领域内普通技术人员所普遍理解的相同的含义。尽管与本文描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可被用于本发明实施方案的实行或测试，以下描述了示例性的方法和/或材料。在冲突的情况下，将以本专利说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实例仅是阐述性的并不预期必然限制。
附图简述
参考附图，仅通过举例，本文描述了本发明的一些实施方案。现在详细特定参考附图，应强调的是特定的显示是通过举例并用于本发明实施方案的阐述性讨论的目的。就这一点而言，与附图一起进行的描述使得可如何实行本发明的实施方案对本领域技术人员将变得明显。
在附图中：
图1A-C展示了根据本发明一些实施方案的示例性的缀合物PEG-ALN(化合物1，图1A)、PTX-PEG(化合物2，图1B)和PEG-PTX-ALN(化合物3，图1C)的化学结构；通过其中X是-C(＝O)-的化学结构展示了未标记的缀合物，并通过其中X是偶合至FITC的赖氨酸残基的化学结构展示了FITC-标记的缀合物。
图2展示了根据本发明的一些实施方案用于制备PTX-PEG-ALN缀合物(化合物3)的示例性的合成途径的示意图。
图3展示了根据本发明的一些实施方案用于制备FITC标记的PTX-PEG-ALN缀合物(FITC标记的化合物3)的示例性的合成途径的示意图。
图4A-B是展示如通过实时颗粒分析仪(NanoSight LM20TM)所确定的PTX-PEG(化合物2；图3A)和PTX-PEG-ALN(化合物3；图3B)的平均流体力学直径的条形图。
图5A-B展示了比较图，显示示例性的PTX-PEG-ALN缀合物在血浆(菱形)中、在pH7.4(正方形)和在pH5(三角形)下孵育之后的稳定性，表示为初始量缀合物的％缀合物，如通过RP-HPLC在指示的时间点监测的(图5A)；并显示示例性的PTX-PEG-ALN缀合物在pH7.4(空白正方形)和pH5(黑色正方形)下孵育之后的稳定性及示例性的PTX-PEG缀合物在pH7.4(空白三角形)和pH5(黑色三角形)下孵育之后的稳定性，由平均胶束大小表示，如通过动态光散射(Malvern Nano-S)监测的(图5B)。
图6展示了显示持续0、2、5、10和60分钟孵育之后示例性的缀合物PEG-ALN和PTX-PEG-ALN与骨矿物质HA的结合动力学的图，如通过FPLC分析的。
图7展示了显示持续1小时孵育之后，系列浓度PTX-PEG-ALN(黑色正方形)、PEG(黑色菱形)、PEI(黑色圆形)、PTX媒介物(1∶1∶8乙醇/Cremophor EL/盐水，黑色菱形)及作为游离药物的PTX+ALN的组合(空白正方形)对大鼠红血细胞的溶血的影响的图。结果表示为％血红蛋白释放。由于相似的值，一些符号重叠。
图8A-B展示了比较图，显示在持续72小时孵育之后，不同浓度的PEG(黑色菱形)、如本文描述的PEG-ALN缀合物(黑色圆形)、如本文描述的PTX-PEG缀合物(黑色三角形)、游离PTX(空白三角形)和游离ALN(空白圆形)在当量浓度处(图8A)和不同浓度的PEG(黑色菱形)、如本文描述的PTX-PEG-ALN缀合物(黑色正方形)和作为游离药物的PTX和ALN的组合在当量浓度处(图8B)对PC3细胞的影响。数据代表平均值±s.d.。X-轴以对数刻度表示。
图9是显示2小时孵育之后，作为游离药物的PTX和ALN的组合、游离PTX、游离ALN、PEG、如本文描述的PTX-PEG-ALN缀合物、如本文描述的PTX-PEG缀合物和如本文描述的PEG-ALN缀合物对PC3细胞的迁移的影响的定量分析的条形图，表示为与对照、未处理的细胞相比的％迁移的细胞。数据代表平均值±s.d.。
图10A-B展示了比较图，显示在持续72小时孵育之后，不同浓度的作为游离药物的PTX和ALN的组合(空白正方形)、游离PTX(空白三角形)、游离ALN(空白圆形)和当量浓度的PEG(黑色菱形)、PTX-PEG-ALN(黑色正方形)、PTX-PEG(黑色三角形)和PEG-ALN(黑色圆形)缀合物对鼠(murine)4T1(图10A)和人MDA-MB-231(图10B)乳腺癌细胞系的增殖的影响。数据代表平均值±s.d.。X-轴以对数刻度表示。
图11A-B展示了比较图，显示不同浓度的作为游离药物的PTX和ALN组合(空白正方形)、游离PTX(空白三角形)、游离ALN(空白圆形)和当量浓度的PEG(黑色菱形)、PTX-PEG-ALN(黑色正方形)、PTX-PEG(黑色三角形)和PEG-ALN(黑色圆形)缀合物对HUVEC增殖的影响(图11A)，其中X-轴以对数刻度表示(图11A)；及这些处理对HUVEC向化学引诱物VEGF的迁移的影响，其中用代表向单独的VEGF的迁移的100％将迁移标准化为％迁移(图11B)。展示了迁移的细胞的数目的定量分析。
图12A-B展示了用作为游离药物的PTX和ALN的组合、游离PTX、游离ALN和当量浓度的PEG、PTX-PEG-ALN、PTX-PEG和PEG-ALN缀合物处理之后，接种在
Figure BDA0000455687210000121
上的HUVEC的毛细管-样管结构的代表性图像(图12A；比例尺代表100μm)；和显示这些处理对HUVEC形成毛细管-样管结构的能力的影响的条形图，表示为管的平均长度的定量分析(图12B)。数据代表平均值±s.d.。*P＜0.05，**P＜0.01。
图13A-B是显示静脉注射胫骨中具有MDA-MB-231人乳腺肿瘤的SCID小鼠之后，使用荧光非侵入性成像系统(CRITM Maestro)测量的FITC标记的PEG(PEG树枝状大分子；黑色)、PTX-PEG(灰色)、PTX-PEG-ALN(白色)和PEG-ALN(条纹)缀合物的生物分布，并展示了FITC标记的缀合物体内半定量的时间依赖的肿瘤积聚的特征的条形图，评价为目的代表性区域的荧光强度的肿瘤/背景(正常皮肤)比(图13A)和处理之后8小时切除的肿瘤和器官的离体荧光强度(图13B)。数据代表平均值±s.e.m.。
图14展示了比较图，显示1∶1∶8乙醇∶Cremophor EL∶盐水中的PTX(空白三角形)、PBS pH＝6中的PTX-PEG缀合物(黑色三角形)和PBS pH＝6中的PTX-PEG-ALN缀合物(黑色正方形)(剂量：等同于10mg/Kg PTX，每组n＝10只动物)在雌性Balb/C小鼠中的药代动力学特征。每一个点都是动物中PTX血清水平的平均值(*＝PTX-PEG对PTX的p＜0.05；**＝PTX-PEG-ALN对PTX的p＜0.05)。Y-轴以对数刻度表示。
图15A-D展示了比较图，显示每隔一天向胫骨中具有4T1-mCherry肿瘤的小鼠静脉施用15mg/kg游离的PTX(空白三角形)、35mg/kg游离的ALN(空白圆形)、当量浓度的作为游离的药物的ALN和PTX的组合(空白正方形)、PTX-PEG(黑色三角形)、PEG-ALN(黑色圆形)、PTX-PEG-ALN(黑色正方形)缀合物和盐水(黑色菱形)或PTX-媒介物(空白菱形)作为对照的作用，如通过肿瘤的活体非侵入性荧光成像测量的(图15A；比例尺代表15mm)；胫骨中4T1-mCherry肿瘤的对应的荧光图像(图15B)；显示在当量剂量的游离药物的指示的处理之后，小鼠中从初始重量的％体重变化的比较图(图15C)；和显示盐水对照和不同处理组的肿瘤切片的H&E组织染色的图像(图15D)。*针对盐水处理的小鼠分析了用PEG缀合物处理的小鼠的值P＜0.05，针对用PTX-媒介物处理的对照小鼠分析了游离PTX的P值。数据代表平均值±s.e.m.(每组n＝6只小鼠)。
图16A-B是展示具有以下特征的小鼠中来自在第11天收集的血液样品的WBC计数(图16A)和由血管标志物CD34染色评价的微血管密度(MVD)分析(图16B)的条形图：胫骨中具有4T1-mCherry乳腺癌并每隔一天静脉施用15mg/kg游离PTX和以当量浓度的缀合物PTX-PEG、PEG-ALN、PTX-PEG-ALN处理及用盐水或PTX-媒介物处理作为对照。*针对盐水处理的小鼠分析了用PEG缀合物处理的小鼠的值P＜0.05，针对用PTX-媒介物处理的对照小鼠分析了游离PTX的P值。数据代表平均值±s.e.m.(每组n＝6只小鼠)。
图17A-B是展示在胫骨中具有4T1-mCherry肿瘤的小鼠中，每隔一天静脉施用15mg/kg游离PTX和以等价PTX浓度的PTX-PEG、PEG-ALN、PTX-PEG-ALN缀合物和盐水或PTX-媒介物对照对凋亡的CEC计数(图17A)和有活性的CEP水平(图17B)的影响的条形图，如使用对在处理的第11天采集的血液样品执行的流式细胞术分析所测量的。外周血中凋亡的CEC和有活性的CEP的数目的计算是基于每一只小鼠的WBC。*针对盐水对照小鼠分析了用PEG-PTX-ALN缀合物处理的小鼠的值P＜0.05。数据代表平均值±s.e.m.(每组n＝6只小鼠)。
图18A-D展示了比较图，显示每隔一天静脉施用35mg/kg游离的ALN和15mg/kg游离的PTX的组合(空白正方形)、17.5mg/kg游离的ALN和7.5mg/kg游离的PTX的组合(黑色三角形)及PTX-PEG-ALN缀合物(黑色正方形)(剂量：等同于15mg/kg PTX和35mg/kg ALN)和盐水(黑色菱形)或PTX-媒介物(空白菱形)对照的抗肿瘤效果，如通过胫骨中MDA-MB-231-mCherry肿瘤的活体非侵入性荧光成像所测量的(图18A)，插图显示获得的胫骨中MDA-MB-231-mCherry肿瘤的荧光图像，比例尺为15mm；比较图显示每一个测试组中从初始重量的％体重变化(图18B)；图像显示每一个测试组中的胫骨中MDA-MB-231-mCherry-标记的肿瘤的肿瘤切片的H&E染色(图18C)；和图像显示盐水对照和PTX-PEG-ALN-处理的小鼠的骨髓(ossea medulla)肿瘤切片的H&E染色(图18D)。数据代表平均值±s.e.m.(每组n＝6只小鼠)。*针对盐水处理的小鼠分析了用PTX-PEG-ALN缀合物处理的小鼠的值P＜0.05，针对用PTX-媒介物处理的对照小鼠分析了游离PTX+ALN的组合的P值。
图19A-B是展示具有以下特征的小鼠中来自在第20天收集的血液样品的WBC计数(图16A)和由血管标志物CD34染色评价的微血管密度(MVD)分析(图16B)的条形图：胫骨中具有MDA-MB-231-mCherry-标记的肿瘤并每隔一天静脉施用15mg/kg游离PTX和35mg/kg游离ALN的组合、作为游离药物的17.5mg/kg游离ALN和7.5mg/kg游离PTX的组合、以当量浓度的PTX-PEG-ALN缀合物处理和用盐水或PTX-媒介物处理作为对照。*针对盐水处理的小鼠分析了用PTX-PEG-ALN缀合物处理的小鼠的值P＜0.05，针对用PTX-媒介物处理的对照小鼠分析了游离PTX和游离ALN的组合的P值。数据代表平均值±s.e.m.(每组n＝6只小鼠)。
图20A-B是展示胫骨中具有MDA-MB-231-mCherry肿瘤的小鼠中，每隔一天静脉施用15mg/kg游离PTX和35mg/kg游离ALN的组合、PTX-PEG-ALN缀合物(剂量：等同于15mg/kg PTX和35mg/kg ALN)，并施用盐水作为对照，对凋亡的CEC计数(图20A)和有活性的CEP水平(图20B)的影响的条形图，如使用对在处理的第20天采集的血液样品执行的流式细胞术分析所测量的。外周血中凋亡的CEC和有活性的CEP的数目的计算是基于每一只小鼠的WBC。*针对盐水对照小鼠分析了用PEG-PTX-ALN缀合物处理的小鼠的值P＜0.05。数据代表平均值±s.e.m.(每组n＝6只小鼠)。
本发明具体实施方案的描述
本发明在其一些实施方案中涉及化学缀合物和它们在治疗和/或诊断中的用途，且更具体地并非排他地涉及骨靶向的聚合缀合物及其在监测和/或治疗骨相关的疾病和疾患中的用途。
在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，要理解的是本发明不必然地将其应用限于以下的描述中或由实施例示例的详细阐述。本发明能够具有其他实施方案或以多种方式被实行或实施。
如上文讨论的，用于治疗骨相关的癌症和其他血管生成相关的骨病症的目前已知的剂，以实现治疗活性的剂量的特征是高毒性的，其限制了它们的用途。
在简化本发明的实行时，本发明人已设计出并成功地制备和实行了基于异双官能PEG-树型化合物(本文还称为PEG-树枝状大分子)的新的缀合物诸如，例如，具有与其附接的骨靶向部分和治疗活性剂的NH2-PEG-βGlu-(βGlu)2-(COOH)4。本发明人已证明可以以高度均一性和对活性剂的比的很好的控制获得此类缀合物，其可通过定义聚合物的树枝状结构预先被确定。
设计的异双官能PEG-树型化合物允许通过将治疗剂和靶向剂连接在聚合物的两个不同端链再分靶向和治疗功能。该设计可导致在疏水性治疗活性剂和亲水性靶向部分的情况下两亲的缀合物的获得。活性剂(治疗活性剂和靶向部分)的空间分离，除了提供形成自组装的胶束的可能性之外，保持亲水性靶向部分的所有分子暴露于水，并从而立即可用于与期望的靶(例如，骨矿物质)结合。
设计的异双官能PEG-树型化合物还允许获得具有高度均一性的缀合物，由于其提供了对缀合的部分的比和缀合物的化学结构的大的控制。最佳的治疗活性部分/靶向部分的比可通过可控制地生长树型化合物结构而选择。另外，可实现骨靶向部分诸如ALN的高装载，其已被报道以解释快速并提高的靶向骨肿瘤和增强的抗血管生成活性二者的原因(见，例如，WO2009/141827)。
如在随后的实施例部分显示的，示例性的PTX-PEG-ALN缀合物(见，图1，化合物3)已被成功合成并显示可能通过双重靶向：通过ALN(主动机制)和通过利用EPR效应(被动机制)靶向骨肿瘤。缀合物的构件(琥珀酸、PEG和β-谷氨酸)都是无毒的，且未发现由缀合物呈现的溶血活性(如与包含Cremophor EL的用于PTX的商业增溶的媒介物相反)。
在设计示例性的聚合缀合物时，在其中PTX释放被设计为趋溶酶体药物释放(例如，通过使用对细胞内组织蛋白酶敏感的组织蛋白酶可裂解的连接部分)的情况下，本发明人已考虑到缀合物与细胞外骨基质的高亲和力，其可影响缀合物通过内摄作用进入癌细胞并因此减慢PTX释放的速率。为此目的，设计了示例性的缀合物以在骨转移环境中呈现较快的药物释放和/或药物释放，其中该缀合物将快速积聚。可通过在生理pH下通过简单的水解作用释放药物的酯或其他水解可裂解的连键或经由由胞外酶(例如，存在于环绕骨的细胞外基质中的酶)可裂解的连接体将药物连接至聚合物实现该目的。
事实上，如随后的实施例部分显示的，已显示了在没有酯酶的显著贡献的条件下通过基于水解的机制释放药物(PTX)的示例性缀合物。
还显示了在生理pH下快速药物释放还影响缀合物的胶束的稳定性，其在此pH下直至约3小时是稳定的。小鼠模型中示例性缀合物的药代动力学特征显示了相比于溶解在Cremophor EL中的游离PTX明显的半衰期增加(分别约5和6倍更长)，据此，PTX的细胞毒性与游离PTX的细胞毒性是可比的，从而指示缀合该药物未减少其治疗活性而导致与已知的PTX制剂相比减少的副作用。
如在随后的实施例部分进一步显示的，示例性的缀合物在抑制增殖、毛细管-样管形成和内皮细胞的迁移中的作用表明这些缀合物具有抗血管生成特性。
生物分布分析显示在注射的8小时之后，测试的所有FITC-标记的缀合物在肿瘤中的优先的积聚，可能作为EPR效应的结果。由于肾排泄，发现示例性的缀合物明显地在肾中积聚。
根据本发明一些实施方案的示例性缀合物在测试的鼠同基因和人异种移植的小鼠模型中显示实质的抗肿瘤作用。另外，此类缀合物的优越性通过与游离药物相比增强的安全性而不妨碍骨靶向亲和力被进一步证实。
根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了包含具有与其附接的治疗活性剂和骨靶向部分的聚合物骨架的缀合物。在一些实施方案中，治疗活性剂和骨靶向部分通过聚合物骨架空间分离。在一些实施方案中，治疗活性剂与聚合物骨架的一端(例如，与聚合物骨架的一端的末端骨架单元)附接且骨靶向部分与聚合物骨架的另一端(例如，与聚合物骨架的另一端的末端骨架单元)附接。在一些实施方案中，骨靶向部分经由支化单元与聚合物骨架(例如，与聚合物骨架的末端骨架单元)附接，如此以致骨靶向部分与所述聚合物的摩尔比为至少2∶1。
本文描述的缀合物还可被称为聚合缀合物。
聚合物骨架：
如本文所用的，短语“聚合物骨架”描述了与彼此共价连接的多个骨架单元。骨架单元和因此的聚合物骨架是存在于缀合物所源自的聚合物中的骨架单元和聚合物骨架。
“源自”是指除了具有如本文描述的缀合至其的部分(任选地经由支化单元、连接部分和/或间隔基，如本文描述的)之外，聚合物骨架与其源自的聚合物相同。
如本文所用的，术语“聚合物”描述了由与彼此共价连接的多个重复的结构单元(可互换地称为骨架单元或单体单元)组成并形成聚合物的聚合物骨架的物质、优选有机物质、但可选地无机物质。如本文所用的术语“聚合物”包含有机和无机聚合物并还包含一种或多种均聚物、共聚物或其混合物(掺合物)。如本文所用的术语“均聚物”描述了由一种类型的单体单元组成并因此由同种骨架单元组成的聚合物。如本文所用的术语“共聚物”描述了由多于一种类型的单体单元组成并因此由异种骨架单元组成的聚合物。异种骨架单元可通过其侧基与彼此不同。
为了简单起见，如贯穿本文可互换地使用的术语“聚合物”和“聚合物骨架”指均聚物、共聚物二者和其混合物。
在一些实施方案中，本文描述的聚合缀合物由从与彼此共价连接的多个骨架单元形成的聚合物骨架组成。治疗活性剂和骨靶向部分各自直接或间接地与聚合物骨架的不同端，例如与聚合物骨架的不同的末端骨架单元附接。因此，在一些实施方案中，治疗活性剂和骨靶向部分通过聚合物骨架彼此空间分离。
“末端骨架单元”指在聚合链的末端的骨架单元，其仅与聚合物的另一个骨架单元附接(且与聚合物骨架中所有其他骨架单元不同，不与两个骨架单元附接)。在一些实施方案中，靶向部分和治疗活性剂各自直接或间接地与末端骨架单元附接，同时利用形成末端骨架单元的部分或在末端骨架单元内产生或与末端骨架单元附接的官能团以便于附接。
在一些实施方案中，如本文描述的聚合缀合物因此包含聚合物骨架，该聚合物骨架包含多个相同(在均聚物的情况下)或不同(在共聚物的情况下)的骨架单元，其中，除了在骨架每一端的末端骨架单元，所有这些骨架单元是未官能化的，即，不具有与其附接的任何治疗活性剂、标记剂和/或靶向部分，并不具有可被用于直接或间接地附接治疗活性剂、标记剂和/或靶向部分至其的任何官能团。
适于在本实施方案的环境中使用的聚合物是生物相容、非免疫原性及无毒性的。聚合物用作使能够特定递送入肿瘤组织的载体，可能由于本文讨论的EPR效应。
聚合物可以是生物稳定的聚合物、生物可降解的聚合物或其组合(在共聚物的情况下)。
如在本发明实施方案的环境中使用的术语“生物稳定的”，描述了在生理条件下保持完整的化合物或聚合物(例如，是体内未降解的并因此是非生物可降解的或非生物可裂解的)。
术语“生物可降解的”描述了可在生理和/环境条件下分解为分解产物的物质。此生理和/或环境条件包括，例如，水解作用(通过水解裂解的分解)、酶促催化(酶促降解)和机械相互作用。该术语典型地指在这些条件下分解如此以致50％重量的物质在短于1年的时间段内分解的物质。
如在本发明实施方案的环境中使用的术语“生物可降解”还包括术语“生物可吸收”，其描述了在生理条件下分解为分解产物的物质，该分解产物经受生物吸收进入宿主生物体，即，成为宿主生物体的生物化学系统的代谢物。
在一些实施方案中，聚合物是如本文定义的生物稳定的聚合物。由于避免了在其到达期望的部位之前聚合物的生物降解，此类聚合物可允许设计聚合缀合物以在期望的身体部位(例如，骨组织)选择性释放治疗活性剂。
聚合物可以是水溶性或水不溶性的。在一些实施方案中，聚合物在室温下是水溶性的。
在一些实施方案中，聚合物是两亲的聚合物。
聚合物还可以是带电荷的聚合物或未带电荷的聚合物。带电荷的聚合物可以是阳离子聚合物，在生理pH下具有带正电荷的基团及净正电荷；或阴离子聚合物，在生理pH下具有带负电荷的基团及净负电荷。未带电荷的聚合物在生理pH下可具有带正电荷和带负电荷的基团，具有中性净电荷，或可以根本就无电荷。
在一些实施方案中，聚合物具有100Da至800kDa范围内的平均分子量。在一些实施方案中，聚合物具有低于60kDa的平均分子量。在一些实施方案中，聚合物的平均分子量的范围为10kDa至60kDa、或15kDa至60kDa、或10kDa至40kDa或15kDa至40kDa。还包含任何中间范围或值。
具有高于10kDa的分子量的聚合物质典型呈现EPR效应，如本文描述的，而具有100kDa和更高的分子量的聚合物质在血浆中具有相对长的半衰期和无效的肾清除。因此，可确定聚合缀合物的分子量，同时考虑血浆中的半衰期、肾清除和缀合物在肿瘤中的积聚。
可通过聚合作用(或共聚合作用)的程度，至少在某种程度上控制聚合物的分子量。任选地，利用了具有期望分子量的市售可得的聚合物。
用于本发明实施方案的环境中的聚合物可以是合成的聚合物或天然存在的聚合物。在一些实施方案中，聚合物是合成的聚合物。
适于在本实施方案的环境中使用的示例性的聚合物包括但不限于，聚(亚烷基二醇)、聚(2-烷基-2-噁唑啉)、葡聚糖、水溶性聚氨基酸、聚谷氨酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚(D，L-丙交酯-乙交酯共聚物)(PLA/PLGA)、聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)(poly(hydroxyalkylmethaacrylamide))、聚甘油、聚酰胺-胺(PAMAM)和聚乙烯亚胺(PEI)。
在一些实施方案中，聚合物是两亲的、生物稳定的、生物相容的和免疫原性聚合物。示例性的此类聚合物包括，但不限于，聚(亚烷基二醇)、聚(2-烷基-2-噁唑啉)和包含聚(亚烷基二醇)和/或聚(2-烷基-2-噁唑啉)的共聚物。
在一些实施方案中，用于在本实施方案的环境中使用的适合的聚合物可以由以下的通式表示：
ZWx-{[(CRxRy)k]-W}n-[(CRxRy)k]-WyL
其中：
k是从1至6、优选从2至4、更优选地是2或3的整数，代表每一个骨架单元中碳原子的数目(长度)；
n是从100至1000的整数，代表聚合物中骨架单元的数目，并优选地根据聚合物的期望的分子量选择或确定，如上文概述的；
Z和L各自独立地是在聚合物的一个末端的基团，并可以是氢、烷基、环烃基、芳基、烷氧基、硫代烷氧基、芳氧基、硫代芳氧基、羰基、硫代羰基，并还可以选自由以下组成的组：氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯、脒基、胍、肼、酰肼，等等；
W、Wx和Wy各自独立地是选自由以下组成的组的包含杂原子的基团：氧、硫、NRw、PRw和SiRwRz，并优选地选自由以下组成的组：氧、硫或NRw；并且
Rz、Ry、Rw和Rz各自独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、环烃基、芳基、烷氧基、硫代烷氧基、芳氧基、硫代芳氧基、羰基、硫代羰基，并还可选自由以下组成的组：氧代(oxo)、氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯、脒基、胍、肼、酰肼，只要取代基不干扰骨靶向部分和/或治疗活性部分的结合、和/或与所述骨靶向部分和/或治疗活性部分反应。
基团[(CRxRy)k]-W代表聚合物中重复的骨架单元。在一些实施方案中，所有的骨架单元都是相同的。任选地，骨架单元通过杂原子W、RxRy取代基、值k或二者而与彼此不同。
在示例性的实施方案中，至少50％的骨架单元是相同的，例如，它们彼此包含相同的杂原子和相同的k值，并还可被相同地取代。任选地，至少70％、任选地至少90％和任选地100％的骨架单元是相同的。
基团WxZ和WyL代表在聚合物末端的官能团。在其中W、Wx和WY是相同的且Z和L各自是氢的情况下，聚合物被认为通过重复单元的固有的官能度被官能化(例如，其被诸如-OH、NHR，等等的基团封端)。在一些实施方案中，聚合物可被修饰以包括非源自重复单元的基团，例如，通过胺或任何其他基团代替当W、Wx和Wy的每一个都是氢时存在的官能羟基基团。
在一些实施方案中，在任何以上描述的聚合物的实施方案中，W是O，如此以致聚合物是聚(亚烷基二醇)。
如本文所用的短语“聚(亚烷基二醇)”包含共享以下通式的聚醚聚合物家族：-O-[(CRxRy)k-O-]n-，其中k代表存在于每一个亚烷基二醇单元中的亚甲基基团的数目，且n代表重复单元的数目，并因此代表聚合物的大小或长度。任选地，聚(亚烷基二醇)链的单元中k不同。例如，聚(亚烷基二醇)链可包含连接在一起的乙二醇(k＝2)和丙二醇(k＝3)二者的单元。
当Rx和Ry各自是氢且m是2时，聚合物是聚(乙二醇)(PEG)。
WxZ和WyL基团可各自为羟基(OH)基团，或可被修饰如此以致PEG被修饰以在其一端或两端包括其他官能团。
在一些实施方案中，如本文定义的，W是NRw且Rw是羰基，如此以致聚合物是聚(2-烷基-2-噁唑啉)或其类似物。聚(2-烷基-2-噁唑啉)的“类似物”是指羰基可被硫代羰基代替和/或烷基可被环烃基或芳基代替。
如本文定义用于这些实施方案的，WxZ和WyL基团可各自为NHRw基团，或可被修饰如此以致聚(2-烷基-2-噁唑啉)被修饰以在其一端或两端包括其他官能团。
如本文描述的这些聚合物可具有任何分子量。
这些聚合物还可以形成共聚物的部分，其还可包含另一种聚合物的骨架单元。另一种聚合物的骨架单元可散布(interdisperse)在如本文描述的骨架单元之间，或一种类型的聚合物的骨架单元的链可在一端或两端连接至另一种聚合物的骨架单元的链。
聚(亚烷基二醇)的示例性的适合的共聚物是PEG和PGA的共聚物。
应指出的是本文提供的用于术语“聚合物”的描述指本文描述的缀合物中的聚合物骨架单元源自其的那些聚合物。然而，在本文描述的缀合物中，聚合物骨架的每一端中的末端骨架单元被用于附接骨靶向部分和治疗活性剂至其，并因此这些末端骨架单元被衍生化以具有直接或间接地与其附接的这些部分，并因此具备至少一些不同的结构特性。
在一些实施方案中，WxZ和WyL基团是上文描述的式，或被用于直接或间接附接治疗活性部分或骨靶向部分的在聚合物末端的任何其他反应基团。
在一些实施方案中，在聚合物骨架一端的官能团自身被用于附接骨靶向部分和/或在聚合物的另一端的基团自身被用于附接治疗活性剂。
在一些实施方案中，一端或两端的基团被修饰以便于治疗活性部分和/或骨靶向部分的附接，和/或以包括需要的连接部分，如本文进一步详细描述的。
治疗活性剂：
如本文所用的，“治疗活性剂”包含能够呈现有益的治疗效果，诸如治疗或预防医疗病症、疾病或疾患的任何剂，如本文定义的。术语“治疗活性剂”和“药物”在本文被互换使用。
在一些实施方案中，与聚合物骨架的一端(例如，末端骨架单元之一)附接的治疗活性剂是在骨组织的环境中呈现治疗效果这样的治疗活性剂。因此，在一些实施方案中，治疗活性剂是适于治疗骨相关的疾病或疾患这样的治疗活性剂，如下文定义的。
在一些实施方案中，治疗活性剂是抗血管生成剂。
短语“抗血管生成剂(anti-angiogenesis agent)”(其在本文还被互换地称为“抗血管生成剂(anti-angiogenic agent)”或“血管生成抑制剂”)描述了具有(a)抑制内皮细胞增殖或迁移、(b)杀死增殖的内皮细胞和/或(c)抑制组织(例如，肿瘤组织)中新血管的形成的能力的剂。
适于在本发明实施方案的环境中使用的示例性抗血管生成剂，包括，但不限于紫杉醇、2-甲氧基雌二醇、普啉司他、巴马司他、BAY12-9566、羧胺三唑、CC-1088、乙酸右美沙芬、乙酸二甲基呫吨酮、内皮抑素、IM-862、马马司他、基质金属蛋白酶、青霉胺、PTK787/ZK222584、RPI.4610、乳酸角鲨胺、SU5416、沙利度胺、TNP-470、考布他汀、他莫西芬、COL-3、新伐司他、BMS-275291、SU6668、抗-VEGF抗体、Medi-522(Vitaxin II)、CAI、白介素-12、IM862、阿米洛利、血管抑
Figure BDA0000455687210000241
蛋白、血管抑素K1-3、血管抑素K1-5、卡托普利、DL-α-二氟甲基鸟氨酸、盐酸DL-α-二氟甲基鸟氨酸、
Figure BDA0000455687210000242
内皮抑素TM蛋白、烟曲霉素、除莠霉素A、4-羟基苯基视黄酰胺、胡桃醌、层粘连蛋白、层粘连蛋白六肽、层粘连蛋白五肽、熏草菌素A、甲羟孕酮、乙酸甲羟孕酮、米诺环素、盐酸米诺环素、胎盘核糖核酸酶抑制剂、苏拉明、苏拉明钠盐、人血小板凝血酶敏感蛋白、中性粒细胞、针对特定促血管新生因子和/或它们的受体的单克隆抗体(例如，阿瓦斯汀、艾比特思、维克替比、赫赛汀)；多种促血管新生生长因子受体的小分子酪氨酸激酶抑制剂(例如它塞瓦、多吉美、索坦、易瑞沙(Iressa))；mTOR的抑制剂(雷帕霉素的哺乳动物靶)(例如驮瑞塞尔(Torisel))；干扰素α、β和γ；IL-12；基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂(例如COL3、马马司他、巴马司他)；EMD121974(西仑吉肽)；Vitaxin；角鲨胺、COX-2抑制剂、PDGFR抑制剂(例如，格列卫(Gleevec))；NM3和2-ME2。
如本文所用的，术语“COX-2抑制剂”指相对优先于COX-1抑制酶COX-2的非甾族药物。COX-2抑制剂的优选的实例包括，但不限于，塞来考昔、帕瑞考昔、罗非考昔、伐地考昔、美洛昔康和艾托考昔。
在一些实施方案中，抗血管生成剂选自由以下组成的组：TNP-470、紫杉醇、针对特定促血管新生因子和/或它们的受体的单克隆抗体(例如，阿瓦斯汀、艾比特思、维克替比、赫赛汀)；多种促血管新生生长因子受体的小分子酪氨酸激酶抑制剂(例如它塞瓦、多吉美、索坦、易瑞沙)；mTOR的抑制剂(雷帕霉素的哺乳动物靶)(例如驮瑞塞尔)；干扰素α、β和γ；IL-12；基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂(例如COL3、马马司他、巴马司他)；EMD121974(西仑吉肽)；Vitaxin；角鲨胺、COX-2抑制剂、PDGFR抑制剂(例如，格列卫)；NM3和2-ME2。
在一些实施方案中，抗血管生成剂是紫杉醇。
微管干扰剂紫杉醇是常用于晚期转移性乳腺癌的治疗的药物。然而，紫杉醇是神经毒性的，其引起血液毒性且许多乳腺肿瘤形成针对其的耐受性。最近已显示超低剂量的紫杉醇抑制血管生成。然而，紫杉醇是难溶性的且目前所用的溶解其商业形式的赋形剂Cremophor EL或乙醇引起超敏反应。
可选地，治疗活性剂可以是通过其他作用机制(即，不通过抑制血管生成)起作用的抗癌剂(抗肿瘤剂)。此类剂包括，但不限于，烷化剂、抗代谢物和抗肿瘤抗生素，如这些是本领域任何技术人员已知的。
连接部分：
由于本文描述的缀合物旨在在患病的身体部位释放治疗活性剂，在一些实施方案中，治疗活性剂通过生物可裂解的部分与聚合物附接。生物可裂解的部分可以是生物可裂解的键或生物可裂解的连接基团。
在一些实施方案中，治疗活性剂通过键、优选通过生物可裂解的键且优选通过水解可裂解的键直接与聚合物骨架的末端骨架单元附接，如本文定义的。
在一些实施方案中，治疗活性剂通过连接部分(本文还称为连接体、连接体基团、连接体部分或连接基团)直接或间接地(例如，通过间隔基)连接至聚合物骨架的末端(例如，聚合物骨架的末端骨架单元)，据此，在一些实施方案中，直接/间接的连键被设计为在以期望的身体部位为特征的条件下是可裂解的，如下文详细描述的。
将治疗活性剂连接至聚合物的连接部分在本文还被称为第一连接部分，且，在下文代表性式I中被表示为L1。
本文描述的连接部分指用于将治疗活性剂偶合至聚合物骨架而不负面影响剂的治疗效果的化学部分。
在一些实施方案中，连接部分是生物可降解的(或生物可裂解的)连接部分。
如本文所用的短语“生物可降解的连接部分”描述了当暴露于生理条件时能够被降解、或被裂解的连接体。此类生理条件可以是例如，水环境、pH、特定的酶，等等。
因此，根据一些实施方案，生物可降解的连接体是水解可裂解的连接部分、pH敏感的连接体或酶促可裂解的连接体。
在一些实施方案中，生物可降解的连接部分是水解可裂解的连接部分。
如本文所用的，短语“水解可裂解的连接部分或键”描述了可被水环境诸如生理介质中的水解作用裂解的连接部分或键。该短语不包含在特定pH下可被裂解或被生理介质中的酶裂解的连接部分或键，而包含当在或约生理pH(例如，pH7)下与水介质诸如生理介质接触之后通过水解作用可被裂解的连接部分或键。
由于水解可裂解的连接部分或键在聚合缀合物接触生理、水介质之后允许治疗活性剂的快速释放，其是有优势的。在缀合物包含如本文描述的高装载的骨靶向部分的情况下，水解可裂解的连接部分或键甚至是更有优势的，由于骨靶向部分的存在导致在细胞外骨基质处的快速积聚并减慢聚合缀合物通过内化进入细胞。因此，允许在存在于细胞外骨基质的条件下，即通过在基质pH下简单的水解作用释放治疗活性剂的连接部分，将导致治疗活性剂在期望的身体部位快速并有效的释放。
在一些实施方案中，水解可裂解的部分包含或由一种或多种水解可裂解的键组成。此类水解可裂解的部分的实例包括包括一种或多种水解可裂解的键，诸如，但不限于，酯键、亚胺键、腙键、缩酮键、缩醛键和碳酸酯键。
在一些实施方案中，水解可裂解的部分包含水解可裂解的键诸如酯并因此可源自，例如羧酸或醇，其与聚合物骨架的末端附接(例如，与末端骨架单元附接)。
在一些实施方案中，水解可裂解的部分在将治疗活性剂偶合至聚合物骨架的末端(例如，聚合物的末端骨架单元)时形成并由存在于治疗活性剂中或在治疗活性剂中产生和在聚合物骨架末端(例如，在末端骨架单元内)的官能团定义。
例如，当水解可裂解的部分包含酯键，此部分可在存在于治疗活性剂内或在治疗活性剂内(例如，通过间隔基或通过化学修饰)产生的羟基官能团和存在于聚合物骨架的末端(例如在聚合物骨架的末端骨架单元内)或在聚合物骨架的末端(例如在聚合物骨架的末端骨架单元内)(例如，通过连接部分和/或间隔基和/或化学修饰)产生的羧基基团之间形成。
可选地，例如，当水解可裂解的部分包含酯键，此部分可在存在于治疗活性剂内或在治疗活性剂内(例如，通过间隔基或化学修饰)产生的羧酸酯官能团和存在于聚合物骨架的末端(例如在聚合物骨架的末端骨架单元内)或在聚合物骨架的末端(例如在聚合物骨架的末端骨架单元内)(例如，通过连接部分和/或间隔基和/或化学修饰)产生的羟基基团之间形成。
另外可选地，例如，当水解可裂解的部分包含亚胺键，此部分可在醛官能团和胺官能团之间形成，一个存在于治疗活性剂内或在治疗活性剂内(例如，通过间隔基)产生，且一个存在于聚合物骨架的末端骨架单元内或在聚合物骨架的末端骨架单元内(例如，通过连接部分和/或间隔基)产生。
相似地，腙可从酰胺和肼形成。
本领域技术人员将容易认识到，如何基于固有存在于聚合物的末端及存在于治疗活性剂中的官能团设计其中治疗活性剂经由水解可裂解的部分与聚合物骨架的末端(例如，与聚合物骨架的末端骨架单元)附接的缀合物。
在一个实例中，通过将羧酸附接至药物上的游离羟基基团在治疗活性剂上产生羧酸酯，从而产生水解可裂解的酯键。在这些实施方案中，羧酸代表水解可裂解的连接部分，并可经由另外的酯键和/或任何其他键、经由在其另一端的官能团与末端骨架单元附接。示例性的此双官能团的羧酸包括，但不限于，二羧酸诸如丁二酸、丙二酸、草酸、戊二酸、己二酸、癸二酸、邻苯二甲酸，等等。此酯化的双官能团羧酸是示例性的水解可裂解的连接部分。
pH敏感的连接体包含仅当经受某种pH条件，诸如酸性pH(例如，低于7)、中性pH(6.5-7)或碱性pH(高于7)时才被裂解或降解的化学部分。
可设计此连接体，例如以在酸性或碱性条件下经受水解作用，并因此，缀合物在身体中直至其到达其中pH分别是酸性或碱性的生理环境之前保持完整并不会释放与聚合物附接的剂。
示例性的pH敏感的连接部分包括，但不限于，腙键、酯(包括原酸酯)键、顺-乌头残基的酰胺键、三苯甲基基团、缩醛、缩酮、Gly-酯和-[Gly-Phe-Gly]-(SEQ ID NO：1)部分。
在一些实施方案中，生物可降解的连接部分是酶促可裂解的连接部分。
此连接体典型被设计以包括化学部分，典型地但非排他地，被预先选择的酶识别的氨基酸序列。此氨基酸序列在本领域中通常被称为“识别基序”。包含此连接体的缀合物典型地在其环境中不存在预先选择的酶时基本上保持完整，并因此不会裂解或降解以直至与酶接触才释放与其附接的治疗活性剂。
在一些实施方案中，酶促可裂解的连接体被在肿瘤组织中表达的酶裂解。在一些实施方案中，酶促可裂解的连接体被在肿瘤组织中过量表达的酶裂解。包含此连接体的缀合物确保了例如大量缀合的治疗活性剂仅在肿瘤组织处才从缀合物释放，因此减少与药物的非选择性施用相关的副作用并进一步增强肿瘤部位的药物的浓度。
适合的连接体包括，但不限于，烷基链；用一个或多个取代基任选地取代且其中一个或多个碳原子任选地被氮、氧和/或硫杂原子间隔的烷基链。
其他适合的连接体包括氨基酸和/或寡肽。
此类烷基链和/或寡肽任选地可被官能化以允许它们与从而连接的部分(例如，聚合物骨架和治疗活性剂)的共价结合。此官能化可包括参与此共价结合的反应基团的并入或产生，如下文详细描述的。
在一些实施方案中，连接体是生物可降解的寡肽，其包含例如2至10个氨基酸残基。
在一些实施方案中，酶促可裂解的连接体通过预先选择的细胞酶，例如，见于成骨细胞、破骨细胞、癌细胞或增殖的内皮细胞的溶酶体中的细胞酶是可裂解的。
此类酶的非限制性实例包括，但不限于，组织蛋白酶K、组织蛋白酶D、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L和豆球蛋白、组织蛋白酶B、MMP-2和MMP-9。
由于可设计本文描述的缀合物以靶向骨矿物质，并因此不被内摄进入细胞，在一些实施方案中，预先选择的酶是存在于细胞外基质中、细胞外这样的酶。示例性的此类酶包括，但不限于，组织蛋白酶K、组织蛋白酶D、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L、MMP-2和MMP-9。
豆球蛋白和组织蛋白酶B主要在溶酶体(细胞内)中表达，不过一些量被分泌至细胞外基质。
在一些实施方案中，连接体通过组织蛋白酶K是可裂解的。
组织蛋白酶K是参与骨重建和再吸收的溶酶体半胱氨酸蛋白酶并主要在破骨细胞中表达。其表达被组织损伤后和骨肿瘤中释放的炎症性细胞因子刺激(Pan等人2006，J Drug Target14：425-435；Husmann等人2008，MolCarcinog47：66-73)。
具有组织蛋白酶K可裂解的位点的连接体的非限制性实例是包含氨基酸序列-[Gly-Gly-Pro-Nle]-(SEQ ID NO：2)的连接体。
具有组织蛋白酶D可裂解的位点的连接体的非限制性实例是包含或由氨基酸序列-[Gly-Thr-Gln-Phe-Phe]-(SEQ ID NO：3)和-[Gly-Ser-Thr-Phe-Phe]-(SEQ ID NO：4)组成的连接体。
具有组织蛋白酶H可裂解的位点的连接体的非限制性实例是包含或由氨基酸序列-[Leu-Gly]-(SEQ ID NO：5)组成的连接体。
具有组织蛋白酶L可裂解的位点的连接体的非限制性实例是包含或由氨基酸序列-[Ala-Phe-Arg-Ser-Ala-Ala-Gln]-(SEQ ID NO：6)组成的连接体。
具有豆球蛋白可裂解的位点的连接体的非限制性实例是包含或由氨基酸序列-[Ala-Ala-Asn]-(SEQ ID NO：7)组成的连接体。
具有MMP-2和MMP-9可裂解的位点的连接体的非限制性实例是包含或由氨基酸序列-[His-Pro-Val-Gly-Leu-Leu-Ala-Arg]-(SEQ ID NO：8)、-[Pro-Val-Ser-Leu-Ser-Tyr]-(SEQ ID NO：9)和-[Gly-Pro-Val-Gly-Leu-Ile-Gly-Lys]-(SEQ ID NO：10)组成的连接体。
具有组织蛋白酶B可裂解的位点的连接体的非限制性实例是包含或由氨基酸序列-[Arg]-、-[Cit-Val]-(SEQ ID NO：11)、-[Arg-Arg]-(SEQ IDNO：12)、-[Phe-Lys]-(SEQ ID NO：13)、[Gly-Phe-Leu-Gly](SEQ ID NO：14)、-[Gly-Phe-Ala-Leu]-(SEQ ID NO：15)、-[Ala-Leu-Ala-Leu]-(SEQ IDNO：16)、-[Gly-Leu-Gly]-(SEQ ID NO：17)、-[Gly-Phe-Gly]-(SEQ ID NO：18)、-[Gly-Phe-Leu-Gly-Phe-Lys]-(SEQ ID NO：19)和其组合组成的连接体。
还可构建包含预先选择的氨基酸序列(识别基序)的寡肽连接体，如此以致识别基序在连接体内重复几次，从而增强附接的剂的选择性释放。相同或不同酶的多种识别基序也可被并入连接体内。相似地，连接体可包含多个pH敏感的键或部分。包含此多个可裂解的位点的连接体可增强治疗活性剂在期望的身体部位的选择性释放，从而减少不良副作用，并进一步增加释放的药物在其呈现其活性的身体部位处的相对浓度。
在一些实施方案中，治疗活性剂经由间隔基连接至聚合物骨架和/或至连接部分，如本文描述的。
在一些实施方案中，治疗活性剂经由支化单元附接至第一连接部分或附接至聚合物骨架，如本文定义的并在下文式I中由变量“B*”表示。
在这些实施方案中，由于支化单元允许每mol聚合物附接多于1mol治疗活性剂(例如，2mol或3mol)，治疗活性剂的装载可被增加。
支化单元可直接地或经由如本文定义的间隔基与聚合物骨架附接。
支化单元还可经由连接部分和/或间隔基与聚合物骨架附接，如本文描述的。
支化单元可直接地或经由间隔基与聚合物骨架附接，且连接部分可与支化单元附接，因此经由支化单元将治疗活性剂与聚合物连接，如下文关于骨靶向部分所描述的。
与支化单元的每一个分支附接的治疗活性剂可以是相同或不同的。
骨靶向部分：
如贯穿本文所用的，短语“骨靶向部分”描述了在体内施用之后能够优先在硬组织(即，骨组织)而不是任何其他器官或组织中积聚的部分。
在一些实施方案中，骨靶向部分的特征为对骨矿物质(例如，对羟基磷灰石)的强亲和力。
在一些实施方案中，骨靶向部分是二膦酸盐。
二膦酸盐(BP)诸如阿仑膦酸盐是具有与骨矿化的内源调节因子无机焦磷酸盐(PPi)的化学结构相似的化学结构的化合物。二膦酸盐在生理条件下呈现对骨矿物质的强亲和力的药代动力学特征，它们的低毒性和抗血管生成活性(典型地在其相对高的浓度呈现)是用于靶向局限在骨组织中的肿瘤有利的。
因此，在一些实施方案中，本文描述的骨靶向部分是包含至少两个膦酸(-P(＝O)(OH)2)基团和任选地其他官能团的化合物。
示例性的化合物具有以下的通式：
Figure BDA0000455687210000311
或其药学上可接受的盐，如本文定义的，
其中R1和R2各自独立地选自由以下组成的组：氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烃基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的杂脂环族、卤素、羟基、硫醇、烷氧基、硫代烷氧基、芳氧基和硫代芳氧基，如下文定义的。
在一些实施方案中，R1和R2的至少一种是烷基、环烃基、芳基、杂芳基或杂脂环族，如本文定义的被任选地取代。
在一些实施方案中，烷基、环烃基、芳基、杂芳基或杂脂环族被诸如胺、羟基、硫醇、卤素、羧酸酯，等等的反应基团取代，如本文定义的，其使得其能够与支化单元的相容的反应基团(官能团)的缀合。
在一些实施方案中，R1和R2的至少一种是羟基且另一种是烷基、环烃基、芳基、杂芳基或杂脂环族，如本文描述的。
在一些实施方案中，R1是羟基且R2是用氨基基团封端的烷基。烷基可在其骨架链中具有1至6个碳原子。
在一些实施方案中，二膦酸盐是氨基-二膦酸盐，其在R1和R2取代基的一种或两种中包含氨基基团。
适于在本发明实施方案的环境中使用的示例性的二膦酸盐骨靶向部分包括但不限于，阿仑膦酸盐、英卡膦酸盐、氯膦酸盐、替鲁膦酸盐、依替膦酸盐、伊班膦酸盐、奈立膦酸盐、奥帕膦酸盐、利塞膦酸盐、吡膦酸盐、帕米膦酸盐和唑来膦酸盐。
在一些实施方案中，骨靶向部分是阿仑膦酸盐(4-氨基-1-羟基亚丁基)双膦酸)：
Figure BDA0000455687210000321
在本文，术语“阿仑膦酸盐”和“二膦酸盐”包含任何其药学上可接受的盐、溶剂化物和/或水合物，如下文定义的。
如本文描述的，骨靶向部分与聚合物的摩尔比为至少2∶1，并通过支化单元的特性和支化单元中靶向部分可被附接的官能团的数目确定。
高度支化的支化单元，诸如以在本文描述的树枝状结构排列的支化单元，允许靶向部分的3、4或多个分子与单个聚合物骨架附接，如此以致骨靶向部分与聚合物的摩尔比为3∶1、4∶1和甚至更高，即，6∶1、8∶1、9∶1、10∶1、16∶1和甚至可以更高。
因此，依据缀合物的总重量的重量百分数，骨靶向部分的装载可以是高的。
在一些实施方案中，骨靶向部分的装载是至少3％重量、或至少5％重量或至少7％重量或至少10％重量。例如，作为示例性的骨靶向部分的阿仑膦酸盐的装载可以是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％或12％重量和甚至更高。
骨靶向部分的高装载可被有效用于向骨组织递送治疗活性剂。
骨靶向部分可直接地、经由键或经由连接部分(式I中的L2)和/或间隔基与支化单元附接。连接部分可被用于促进骨靶向部分与支化单元附接。因此，例如，在其中支化单元具有与骨靶向部分的官能团化学不相容的官能团的情况下，连接部分和/或间隔基可被附接至支化单元或被附接至骨靶向部分以使骨靶向部分能够经由支化单元附接至聚合物。
任选地，支化单元经由连接部分或间隔基与聚合物骨架的末端骨架单元附接，出于与本文对支化单元适用的相同的原因。
骨靶向部分与支化单元的连键和支化单元与聚合物的连键，无论是键或经由连接部分和/或间隔基，可以是生物可裂解或生物稳定的(非生物可裂解)。
“生物可裂解”是指键或连接部分在生理条件，例如，水解、酶促，或在生理pH下可被裂解，如下文进一步详细描述的。
“生物稳定”是指键或连接部分在生理条件不能够被裂解。
在一些实施方案中，骨靶向部分经由生物稳定的连键附接至聚合物，即，骨靶向部分和支化单元之间的连键是生物稳定的且支化单元和聚合物之间的连键也是生物稳定的。这可避免骨靶向部分在其到达其靶之前的释放，并因此改进了缀合物的靶向性并避免当存在于非患病组织或不同于骨组织的组织中时可由游离的骨靶向部分引起的负作用(例如，细胞毒性)。
还任选地，骨靶向部分可经由间隔基与支化单元附接。可使用间隔基以避免由将两个或多个靶向部分附接至支化单元产生的空间相互作用和/或位阻。间隔基可允许两个或多个大的靶向部分与支化单元附接。还任选地，支化单元可经由间隔基附接至聚合物骨架，如本文描述的。
支化单元：
如上文讨论的，骨靶向部分经由支化单元与聚合物骨架附接。支化单元被用于在聚合物的末端产生多于一个可被用于将骨靶向部分附接至聚合物的官能团(或反应基团)，并因此选择支化单元以提供骨靶向部分和聚合物的期望的摩尔比，其为2∶1或更大。
在本文，短语“支化单元”描述了可被视为间隔基或连接部分的化学部分，所述间隔基或连接部分用于经由第一部分的相同位置将该部分附接至两个或多个其他部分。即，支化部分是当附接至物质的单个位置、基团或原子时产生被连接至该单个位置、基团或原子的两个或多个官能团，并因此将单个官能度“支化”为两个或多个官能度的化学部分。
在一些实施方案中，支化单元源自具有用于直接或间接附接聚合物的末端骨架单元的一个官能团、和两个或多个另外的官能度的化学部分，所述两个或多个另外的官能度各自包含用于附接骨靶向部分的反应基团。
因此，在一些实施方案中，支化单元源自包含3个或多个官能团的三官能部分，如上文描述的。
要注意的是对于本文描述的关于缀合物、部分、单元和/或聚合物的任何实施方案，缀合物内的部分、单元和/或聚合物可源自描述的缀合物、部分、单元和/或聚合物，且“源自”被用于描述在与另一个部分和/或单元缀合之后的部分、单元或聚合物骨架，据此当缀合时，存在于聚合物、单元或部分中的官能部分已与缀合的单元、部分或聚合物骨架相互作用。
在一些实施方案中，支化单元源自包含至少一个三官能部分的化学部分。此三官能部分包含至少3个官能团，并任选地4、5、6或多个官能团，其中一个官能团被用于与聚合物的末端骨架单元附接且两个或多个其他官能团被用于与骨靶向部分附接。该3个或多个官能团可以是相同或不同的。示例性的此官能团包括，但不限于，胺、羧酸酯、硫代羧酸酯、羟基、硫醇、氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯、磺酸酯、亚磺酸酯、磺酰胺、膦酸酯、亚膦酸酯、磷酰基、脲和硫脲。在一些实施方案中，3个官能团的每一个独立地为胺、羟基、硫醇或羧酸酯，如本文定义的术语。
示例性的三官能部分包括，但不限于，谷氨酸、β-谷氨酸、氨基己二酸、天冬氨酸、赖氨酸、3-羟基-2-胺丙醇、和除了氨基酸固有的胺和羧酸酯基团之外具有包含羧酸酯的侧链、或包含氨基的侧链、或包含羟基的侧链、或包含硫醇的侧链或两个或多个以上描述的官能部分的组合的任何其他氨基酸。
在一些实施方案中，本文描述的任何支化单元都包含以树枝状结构排列的本文描述的三官能部分。
“树枝状结构”是指完全级联支化的、高度确定的结构，所述结构通常包含核心、一些代的分支(ramification)(还已知并在本文被称为“分支(branches)”或“支化部分(branching moiety)”)和外表面。分支的代由从核放射状地向外延伸的重复的结构单元组成。第N代的树枝状结构的外表面通常由第N(最终)代的末端官能团(还已知并在本文被称为“端基”)组成。第一代树枝状结构具有一个支化部分，且端基的数目将取决于支化部分的分支的数目。第二代树枝状结构具有另外两个支化部分，且端基的数目将取决于支化部分的分支的数目并将相应提高。
其中支化单元以树枝状结构排列的缀合物可由通式I表示：
D-L1-[B*]-P-[B1]m 0-[B2]m 1-[B3]m 2......[Bg-L2]m g-1-[T]m g
式I
其中：
D是如本文定义的治疗活性剂；
P是如本文定义的聚合物，或源自如本文定义的聚合物的聚合物骨架；
D是如本文定义的骨靶向部分；
B*是如本文定义的支化单元，治疗活性剂通过其与聚合物骨架附接，或不存在；
L1是第一连接部分，将治疗活性剂连接至聚合物的末端骨架单元，并可任选地不存在，如本文进一步讨论的；
L2是第二连接部分，经由支化单元连接骨靶向部分至所述聚合物的其他末端骨架单元，或不存在；
B1，B2，B3....Bg各自独立地是支化部分，其中B1，B2，B3....Bg一起形成具有树枝状结构的支化单元，如本文描述的；
m是等于2、3、4、5或6的整数，代表树枝状结构的分支数目，且优选地为2、3或4；并且
g是从1至20范围的整数，代表树枝状结构的代数，并优选地从1至10、或从1至6的范围，或为1、2、3或4。
在一些实施方案中，g为2。
树枝状结构因此由支化部分的级联组成，其中每一代中支化部分的数目等于mg-1。因此，例如，当g＝1时，支化部分的数目是1(m0)，且经由支化单元与聚合物附接的骨靶向部分的数目等于支化部分的分支数目。当g＝1时，支化单元由单个支化部分组成。当m＝2时，存在与聚合物骨架附接的2个支化单元。
当g＝2时，第二代的支化部分的数目是(m1)，且经由支化单元与聚合物附接的骨靶向部分的数目是支化部分的分支数目的(数学的)幂。当g＝2时，支化单元由m1+1个支化部分组成。当m＝2时，存在与聚合物骨架附接的4个支化单元。
组成树枝状结构中支化单元的支化部分可以是本文描述的作为适用于支化单元的任何部分。可在支化单元内使用两种或多种类型的支化部分，尽管优选地，相同的支化部分组成树枝状支化单元。
间隔基：
如本文所用的术语“间隔基”描述了共价附接至、并插入在聚合物骨架和支化单元、支化单元和骨靶向部分、支化单元和连接部分或聚合物骨架和连接部分之间的化学部分，从而在隔开的部分之间形成桥-样结构。
如本文所用的术语“间隔基”还描述了这样的化学部分：共价附接至、并插入在聚合物骨架和治疗活性剂、聚合物骨架和治疗活性剂通过其与聚合物附接的连接部分、连接部分和治疗活性剂、或任何这些部分和支化单元之间，如果存在于其中治疗活性剂附接的聚合物的末端，从而在隔开的部分之间形成桥-样结构。
适合的间隔基包括，但不限于亚烷基链，其被一个或多个取代基任选地取代且其任选地被一个或多个氮、氧和/或硫杂原子间隔。
其他适合的间隔基包括氨基酸和氨基酸序列，其任选地用被偶合至聚合物骨架/骨靶向部分/支化单元/连接部分/治疗活性剂的一个或多个反应基团官能化。
在一些实施方案中，间隔基具有式G-(CH2)n-K，其中n是从1至10的整数；且G和K分别是反应基团，诸如，例如，NH、O、羧酸酯、酰胺、羰基、S，等等。
在一些实施方案中，间隔基是氨基酸序列，任选地惰性氨基酸序列(即，不会影响缀合物的亲和力或选择性)。
在某些情况下，间隔基被用于使得隔开的部分的更有效并更简单的附接成为可能，根据空间考虑(使得缀合位点被较少地阻碍)或化学反应性考虑(向附接的位点添加相容的反应基团)。在某些情况下，间隔基可有助于所得缀合物的性能。例如，间隔基可使得酶促可裂解的连接部分被较少地位阻并因此对酶促相互作用更敏感。
在一些实施方案中，间隔基是可降解的间隔基，其能够经受降解反应以释放与其附接的剂。在一些实施方案中，间隔基是如本文定义的生物可降解的。
间隔基可以是，例如，取代的或未取代的环烃基基团、取代的或未取代的杂脂环族基团、取代的或未取代的芳基基团和取代的或未取代的杂芳基；其中取代基可以是，例如，羟基、烷氧基、硫代羟基、硫代环氧基、氰基、硝基、羰基、硫代羰基、C-羧基、O-羧基、O-氨甲酰基、N-氨甲酰基、O-硫代氨甲酰基、N-硫代氨甲酰基、亚磺酰基、磺酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、氨基和NRaRb，其中Ra和Rb各自独立地为氢、烷基、环烃基、芳基、羰基、磺酰基、三卤甲基磺酰基且，当组合时，五或六元的杂脂环族环，据此间隔基可直接地、通过环基团或可选地经由一个或多个取代基连接至治疗活性剂/骨靶向部分/连接体/聚合物。
在一些实施方案中，间隔基促进治疗活性剂或连接部分与聚合物骨架附接，或骨靶向部分与支化单元附接或支化单元与聚合物骨架附接。这可通过向待被互相偶合的一个或两个部分赋予反应基团和/或通过修饰部分之一的溶解性以促进其与另一个部分反应而完成。
例如，在某些情况下聚合物是水溶性聚合物而治疗活性剂是疏水性的，并因此在水溶液中或在极性有机溶剂中具有有限的溶解度。在此类情况下，可将间隔基与治疗活性剂附接以增强其水溶解性并在水溶液或质子或极性有机溶剂中促进其与聚合物的缀合。
还可使用间隔基以将其他剂(例如，如下文描述的标记剂)附接至缀合物。
取决于空间考虑，间隔基的长度和组成可不同并可被用于从聚合物骨架隔开治疗活性剂和/或骨靶向部分。
任何以上描述的间隔基和连接部分都可被用于本文描述的具有或不具有树枝状结构的任何支化单元。
示例性聚合缀合物：
在一些实施方案中，聚合缀合物可以呈胶束的形式，所述胶束由于骨靶向部分(诸如阿仑膦酸盐)的亲水性特征、两亲的聚合物和抗癌剂和/或抗血管生成剂常见的疏水性特征而形成，如在随后实施例部分中进一步详细讨论的。
如上文讨论的，本发明人已将阿仑膦酸盐与紫杉醇一起缀合至PEG聚合物骨架并通过缀合物与羟基磷灰石(作为模拟骨组织的模型)的增强的结合显示获得的聚合缀合物的骨靶向能力。还显示了缀合物在治疗骨癌转移的小鼠模型中有益的治疗活性。
根据一些实施方案，缀合物包含本文描述的任何聚合物(或源自其的聚合物骨架)，骨靶向部分是阿仑膦酸盐，且治疗活性剂是紫杉醇。
根据一些实施方案，缀合物包含源自聚(乙二醇)的聚合物骨架，骨靶向部分是阿仑膦酸盐且治疗活性剂是紫杉醇。
在这些实施方案的一些中，支化单元具有如本文定义的树枝状结构，且，在这些实施方案的一些中，支化单元包含以树枝状结构排列的至少3个β-谷氨酸部分，如本文描述的。
在这些实施方案的一些中，紫杉醇经由水解可裂解的连接部分诸如包含酯的部分(羧酸酯)与末端骨架单元附接。
在这些实施方案的一些中，包含酯的部分源自双官能的羧酸诸如琥珀酸。
在一些实施方案中，化学结构具有结构：
Figure BDA0000455687210000391
其中n是从10至1000范围的整数。
图1描绘了示例性的此缀合物的化学结构(作为化合物3)。
标记的缀合物：
本文描述的任何缀合物还可包含与其附接的标记剂。标记剂可与连接部分、间隔基、支化部分或单元的任何一种附接，如本文描述的。
在一些实施方案中，标记剂与间隔基附接，如本文描述的，且间隔基桥接两种治疗活性剂、第一连接部分和聚合物的末端骨架单元。
在一些实施方案中，标记剂与间隔基附接，如本文描述的，且间隔基桥接两种骨靶向部分、支化单元和聚合物的末端骨架单元。
标记剂与缀合物的附接，使能够利用这些缀合物用于监测骨相关的疾病或疾患，例如，监测由本文描述的缀合物呈现的治疗效果。
如本文所用的，短语“标记剂”描述了可检测的部分或探针。适于在这些实施方案的环境中使用的示例性标记剂包括，但不限于，荧光剂、放射性剂、磁化剂、发色团、生物发光剂、化学发光剂、磷光剂和重金属团簇。
短语“放射性剂”描述了通过发射致电离粒子和放射物而损失能量(衰变)的物质(即，放射性核素或放射性同位素)。当物质衰变时，可通过检测其发射的放射物测定其存在。为了这些目的，放射性衰变的一种特别有用的类型是正电子发射。示例性的放射性剂包括99mTc、18F、131I和125I。
术语“磁化剂”描述了被吸引至外加磁场的物质。这些物质常用作对比介质(contrast media)以改善内部身体结构在磁共振成像(MRI)中的可见性。用于对比增强的最常用的化合物是基于钆的化合物。MRI对比剂改变了它们存在的组织和体腔的弛豫时间，其取决于图像加权能够提供更高或更低的信号。
如本文所用的，术语“发色团”描述了当与另一种分子附接时使得后者着色并因此当应用多种分光光度法测量时是可见的化学部分。
术语“生物发光剂”描述了通过生物化学过程发射光的物质。
术语“化学发光剂”描述了作为化学反应的结果发射光的物质。
短语“荧光剂”指在暴露于来自外源的放射物过程中，在特定波长下发射光的化合物。
短语“磷光剂”指在不具有可感知的热或外部激发的情况下，如通过磷的缓慢氧化而发射光的化合物。
重金属团簇例如，可以是，例如，用于电子显微技术中的标记使用的金原子团簇。
在一些实施方案中，标记剂是荧光剂，诸如FITC。图1中描绘了如本文描述的示例性的FITC标记的缀合物(FITC标记的化合物3)。
如上文讨论的，由于EPR效应，肿瘤血管结构具有用于摄入大分子和具有高分子量和大的流体力学直径的胶质药物载体的增强的能力。因此，如本文描述的具有足够大的流体力学直径的缀合物是有益的。本文使用了术语“足够大”以描述与其他组织相比，具有导致肿瘤组织中积聚的缀合物的比增加的流体力学直径的缀合物。最佳的比的确定充分在本领域技术人员的能力之内。例如，比可以是1.1、2、3、4、5等。在一些实施方案中，流体力学直径在从15nm至300nm的范围内。在一些实施方案中，流体力学直径在从50nm至250nm的范围内。在一些实施方案中，流体力学直径在从100nm至250nm的范围内。在又另一个实施方案中，流体力学直径在从150nm至200nm的范围内。可如以下，根据随后在下文中的实施例部分的材料与方法描述的测量流体力学直径。
缀合物的化学形式：
可如其原样，或作为其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或前体药物施用或另外利用上文描述的缀合物。
短语“药学上可接受的盐”指母体化合物的带电物质和其抗衡离子，其典型地被用于修饰母体化合物的溶解性特征和/或减少母体化合物对生物体的任何显著的刺激，同时不消除施用的化合物的生物活性和特性。优选地通过将盐与碱或酸接触并以常规方式分离母体化合物来再生化合物的中性形式。化合物的母体形式与多种盐形式在某些物理特性方面不同，诸如在极性溶剂中的溶解性，但除此之外，为了本发明的目的，盐等同于化合物的母体形式。
短语“药学上可接受的盐”指包含用相对无毒的酸或碱制备的部分和/或缀合物的盐，取决于在本文描述的化合物上发现的特定的取代基。当本发明的缀合物包含相对酸性的官能度时，可通过将此类缀合物的中性(即，非电离的)形式与足够量的期望的纯碱接触或在适合的惰性溶剂中的碱接触获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐的实例包括钠、钾、钙、铵、有机氨基或镁盐、或相似的盐。当本发明的缀合物包含相对碱性的官能度时，可通过将此类缀合物的中性形式与足够量的期望的纯酸接触或在适合的惰性溶剂中的酸接触获得酸加成盐。药学上可接受的酸加成盐的实例包括，源自无机酸例如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸、或亚磷酸，等等的盐，和源自相对无毒的有机酸例如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、反丁烯二酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸，等等的盐。还被包括的是氨基酸诸如精氨酸等等的盐、和有机酸像葡糖醛酸或半乳糖醛酸等等的盐(见，例如，Berge等人，″Pharmaceutical Salts″，Journal of Pharmaceutical Science，1977，66，1-19)。本发明的某些特定的缀合物包含允许缀合物转化为碱加成盐或酸加成盐的碱性和酸性官能度。
优选地通过将盐与碱或酸接触并以常规方式分离母体缀合物来再生缀合物的中性形式。缀合物的母体形式与多种盐形式在某些物理性质方面不同，诸如在极性溶剂中的溶解性，但除此之外，为了本发明的目的，盐等同于缀合物的母体形式。
在一个实例中，利用了阿仑膦酸的药学上可接受的盐。示例性的此盐是阿仑膦酸钠。包含阿仑膦酸盐的缀合物可因此包含阿仑膦酸的钠盐。
术语“前体药物”指在体内转化为活性化合物(活性母体药物)的剂。前体药物典型地用于促进母体药物的施用。与药物组合物中的母体药物相比，前体药物还可具有改进的溶解性。前体药物还经常被用于实现活性化合物的体内缓释。
本文描述的缀合物可具有不对称碳原子(光学中心)或双键；外消旋物、对映体、非对映体、几何异构体和个体异构体(individual isomer)被包含在本发明的范围内。
如本文所用的，术语“对映体”描述了仅通过彼此的完全的反转/反映(镜像)与其对应物(counterpart)是可重叠的化合物的立体异构体。对映体被称为具有“手型性”，由于它们相对于彼此就像左手和右手。除了当存在于自身具有手型性的环境中诸如所有生命系统之外，对映体具有相同的化学和物理特性。
本文描述的缀合物可以呈非溶剂化形式及溶剂化形式，包括水化形式存在。通常，溶剂化形式等同于非溶剂化形式，并被包含在本发明的范围内。
术语“溶剂化物”指具有可变的化学计量的复合物(例如，二-、三-、四-、五-、六-、等等)，其由溶质(本文描述的缀合物)和溶剂形成，据此溶剂不会干扰溶质的生物活性。适合的溶剂包括，例如，乙醇、乙酸，等等。
术语“水化物”指如上文定义的溶剂化物，其中溶剂是水。
本发明的某些缀合物可呈多晶型或无定型存在。通常，对于本发明涵盖的用途，所有物理形式是等同的并预期在本发明的范围内。
用途：
如上文讨论的，本文描述的缀合物包含使得缀合物能够靶向骨和骨相关的(类骨质)结构的骨靶向部分。由于缀合物的治疗活性，它们可有效地被用于治疗骨相关的疾病和疾患。
因此，根据本发明一些实施方案的另一个方面，提供了治疗有相应需要的受试者中骨相关的疾病或疾患的方法。这些方法通过向受试者施用治疗有效量的本文描述的任何缀合物实现。
因此，根据本发明一些实施方案的另一个方面，提供了本文描述的任何缀合物作为药剂的用途。在一些实施方案中，药剂用于治疗骨相关的疾病或疾患。
根据本发明一些实施方案的另一个方面，本文描述的缀合物被鉴定用于治疗骨相关的疾病或疾患。
如本文所用的，术语“方法”指用于实现给定任务的方式、手段、技术和程序，包括，但不限于，化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知的或从已知的方式、手段、技术和程序中容易开发的那些方式、手段、技术和程序。
短语“骨相关的疾病或疾患”描述了其中骨形成、沉积或再吸收异常的疾病或疾患，特别是特征在于过度血管生成的疾病或疾患。短语“骨相关的疾病或疾患”包含发生于除了骨之外的身体部位中的从骨相关的疾病或疾患发展而来的疾病和疾患，诸如，例如，骨癌在另一个器官中的转移。骨相关的疾病或疾患包括，但不限于，骨癌和骨癌转移、由于骨转移的骨量减少、牙周病、类风湿性关节炎中关节周围的磨损、佩吉特病、恶性高钙血症、由骨转移产生的溶骨性病变、由癌症治疗造成的骨异常和骨肥大。
如本文所用的，术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减慢或逆转病症的进展，基本上改善病症的临床或美学症状或基本上阻止病症的临床或美学症状的出现。当可治疗的疾病是骨癌时，术语将包含肿瘤生长或转移的任何抑制，或肿瘤生长或转移的任何试图的抑制、减慢或消除。
本文应指出的是通过本文描述的方法靶向治疗活性剂，由于缀合物选择性朝向骨组织，治疗活性剂的毒性被很大程度地减少。因此，除了在临床明显的疾病中使用本文描述的缀合物之外，任选地与其他药物组合，这些缀合物可潜在地被用作由于残留的休眠的癌症而处于复发风险的个体的长期预防药。
如本文所用的术语“受试者”(在本文可互换地被称为“患者”)指已作为治疗、观察或实验的对象的动物、优选地哺乳动物、最优选地人。
如在随后的实施例部分中显示的，根据本文描述的一些实施方案，示例性的缀合物抑制血管生成和细胞增殖并因此可被用于治疗特征为病理性过度血管生成的骨相关的疾病和疾患，其中血管生成和/或细胞增殖的抑制是有益的。
因此，在一些实施方案中，骨相关的疾病或疾患与血管生成相关。
肿瘤的生长和转移特别依赖于血管生成的程度。肿瘤血管生成是渗入癌变肿瘤的血管网络的增殖，目的是供给养分和氧气并去除废弃产物，因此导致肿瘤生长。肿瘤血管生成包括激素刺激和肿瘤发生的活化、血管生成生长因子的表达、血浆蛋白的渗出、临时细胞外基质(ECM)的沉积、ECM的降解、和内皮毛细管的迁移、增殖和延伸。进一步血管扩张的抑制因此是用于癌症治疗的活跃的研究的焦点。
因此，在一些实施方案中，骨相关的疾病或疾患选自由以下组成的组：骨癌转移和骨癌。
在本文可互换地使用术语“癌症”和“肿瘤”以描述其中一组细胞显示不受控制的生长(分化超出正常限制)的一类疾病。术语“癌症”包含恶性和良性肿瘤及从原发性或继发性肿瘤发展而来的疾病病症。术语“恶性肿瘤”描述了其生长是非自限性的、能够侵入邻近组织并可以能够扩散至远处组织(转移)的肿瘤。术语“良性肿瘤”描述了非恶性的肿瘤(即，不会以不受限制、入侵性方式生长，不会侵入周围组织且不会转移)。术语“原发性肿瘤”描述了在其第一次出现的原始部位的肿瘤。术语“继发性肿瘤”描述了已从其生长的原始(原发)部位扩散至靠近或远离原发部位的另外的部位的肿瘤。
术语“骨癌”描述了从骨组织出现的肿瘤。如本文所用的术语“骨癌”还包含位于靠近骨结构或与骨相关的组织，诸如软骨、骨腔和骨髓中的肿瘤。术语“骨癌”还包含从骨细胞发展而来的癌症(即，原发性肿瘤)和已从位于骨中的原发性肿瘤“脱离”、“漏出”或“溢出”，进入淋巴管和/或血管、通过淋巴系统和/或血流循环、在身体内的别处的正常组织中定殖并增殖从而形成继发性肿瘤的癌细胞。例如，经常在肺和其他器官中发现源于骨肉瘤的转移。这些病变产生类骨质并因此可被具有对骨矿物羟基磷灰石高亲和力的化合物诸如阿仑膦酸盐和其他二膦酸盐及寡天冬氨酸盐相似地靶向。
骨癌最常见于胳膊和腿的骨中，但其可存在于任何骨中。
骨癌还称为肉瘤。存在骨的几种类型的肉瘤，取决于肿瘤形成处的骨组织的种类。根据本发明的实施方案是可治疗的骨癌的示例性的类型包括，但不限于，骨肉瘤、尤因肉瘤、软骨肉瘤、纤维肉瘤、恶性巨细胞瘤和脊索瘤。
骨肉瘤是原发性骨癌的最常见的类型并被分类为恶性间质肿瘤，其中肿瘤直接产生缺陷型类骨质(未成熟的骨)。其是富含血管并极具破坏性的恶性肿瘤，最常出现于长骨的干骺端。提出了一些策略，诸如基于免疫的治疗、肿瘤抑制剂或自杀基因治疗或不常用于骨肉瘤的抗癌药物(Quan等人Cancer Metastasis Rev2006；10：707-713)。然而，仍有1/3的患者死于该毁灭性的癌症，且对于患有不可切除的疾病的患者，没有有疗效的全身性治疗。
术语“骨转移”描述了从位于除了骨之外的身体部位的原发性肿瘤发展而来但转移至骨的癌症(即，继发性肿瘤)。通常转移或扩散至骨的癌症包括乳腺癌、肺癌、甲状腺癌、前列腺癌、一些脑癌和肾癌。
例如，前列腺癌是工业化国家中的男性中最常见的癌症并是男性癌症死亡率的第二大主要原因。前列腺癌主要转移至骨，但其他器官部位包括肺、肝和肾上腺也被影响。患有晚期转移性疾病的患者中的骨转移发生率为约70％。骨转移与相当大的骨骼发病率相关，包括严重的骨痛、病理性骨折、脊髓或神经根受压和恶性的高钙血症。
如上文讨论的，本文描述的缀合物还可被用于监测骨相关的疾病或疾患。在此情况下，缀合物还包含如本文定义的用于使用众所周知的成像技术容易监测患者体内的缀合物的标记剂。例如，在骨相关的疾病或疾患是骨癌的情况下，缀合物的检测，如通过标记剂信号的水平所评价的，可用于检测除了骨之外的身体部位中的骨癌转移。
因此，根据本发明一些实施方案的另一个方面，提供了监测受试者中骨相关的疾病或疾患的方法。根据本发明这些实施方案的方法通过向受试者施用本文描述的任何缀合物并采用用于监测身体或其部分中缀合物的分布的成像技术实现，如本文描述的，所述缀合物具有与聚合物附接的标记剂。
因此，根据本发明一些实施方案的另一个方面，提供了本文描述的具有如本文描述的标记剂的任何缀合物作为诊断剂和/或在制造用于监测骨相关的疾病或疾患的诊断剂中的用途。
根据本发明一些实施方案的另一个方面，本文描述的包含标记剂的每一种缀合物，被鉴定用作监测骨相关的疾病或疾患的诊断剂。
适合的成像技术包括但不限于，正电子发射断层摄影(PET)、γ-闪烁扫描法、磁共振成像(MRI)、功能性磁共振成像(FMRI)、脑磁图描记术(MEG)、单光子发射计算机断层扫描技术(SPECT)、计算机轴向断层(CAT)扫描、超声、荧光镜检查和常规X射线成像。适合的成像技术的选择取决于标记剂的性质并在本领域的技术之内。例如，如果标记剂包含Gd离子，那么适合的成像技术则是MRI；如果标记剂包含放射性核素，适合的成像技术则为γ-闪烁扫描法；如果标记剂包含超声剂，超声则是适合的成像技术，等等。
根据本发明的另一个方面，提供了包含本文描述的任何缀合物(作为活性成分)和药学上可接受的载体的药物组合物。
因此，在本文描述的任何方法和用途中，可向个体提供本文描述的任何缀合物本身、或作为药物组合物的部分，其中缀合物与药学上可接受的载体混合。
如本文所用的“药物组合物”指本文描述的一种或多种缀合物(作为活性成分)、或其生理上可接受的盐或前体药物，与包括但不限于以下的其他化学成分的制品：生理上可接受的载体、赋形剂、润滑剂、缓冲剂、抗菌剂、填充剂(例如，甘露醇)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸或亚硫酸氢钠)、抗炎剂、抗病毒剂、化学治疗剂、抗组胺药物，等等。药物组合物的目的是为了便于向受试者施用化合物。术语“活性成分”指负责生物效果的化合物。
可被互换地使用的术语“生理上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”指不会对生物体造成显著刺激且不会消除施用的化合物的生物活性和特性的载体或稀释剂。
在本文，术语“赋形剂”指添加至药物组合物以进一步便于药物的施用的惰性物质。赋形剂的实例包括且不限于碳酸钙、磷酸钙、多种糖和多种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
关于药物配制和施用的技术可见于“Remington′s PharmaceuticalSciences”Mack Publishing Co.，Easton，PA，最新版，其通过引用并入本文。
因此，可使用便于将化合物加工为可在药学上使用的制品的一种或多种药学上可接受的载体，包括赋形剂和辅助物，以常规方式配制用于根据本发明使用的药物组合物。适合的制剂取决于选择的施用途径。剂量可取决于采用的剂型和利用的施用途径而不同。准确的制剂、施用途径和剂量可由个体的医师根据患者的病症选择(见，例如，Fingl等人，1975，在“ThePharmacological Basis of Therapeutics”中的第1章第1页)。
取决于选择的局部或是全身性治疗或施用并取决于待被治疗的区域，可配制药物组合物用于以一种或多种途径施用。可口服地、通过吸入、或肠胃外地，例如，通过静脉滴注或腹膜内、皮下、肌内或静脉注射，或局部地(包括经眼地、经阴道地、经直肠地、鼻内地)进行施用。
用于局部施用的制剂可包括但不限于洗剂、软膏、凝胶、乳膏、栓剂、滴剂、液体、喷剂和散剂。常规的药学载体、水、粉末或油基、增稠剂，等等可以是需要的或可取的(desirable)。
用于口服施用的组合物包括散剂或颗粒剂、混悬剂或水或非水介质中的溶液、囊剂、丸剂、扁囊剂、胶囊或片剂。增稠剂、稀释剂、调味剂、分散助剂、乳化剂或黏合剂可以是可取的。
用于肠胃外施用的制剂可包括但不限于，无菌溶液，其还可包含缓冲液、稀释剂和其他适合的添加剂。设想了缓慢释放的组合物用于治疗。
待被施用的组合物的量，当然，将取决于被治疗的受试者、痛苦的严重程度、施用的方式、处方医师的判断，等等。
药物组合物还可包含另外的药学活性或非活性剂，诸如但不限于，抗菌剂、抗氧化剂、缓冲剂、填充剂、表面活性剂、抗炎剂、抗病毒剂、化学治疗剂和抗组胺药物。
根据本发明的实施方案，在包装材料中包装上文描述的药物组合物并在包装材料中或包装材料上用印刷物说明药物组合物用于治疗骨相关的疾病或疾患的用途，如本文描述的。
根据本发明的另一个实施方案，在包装材料中包装药物组合物并在包装材料中或包装材料上用印刷物说明药物组合物用于监测骨相关的疾病或疾患的用途，如本文描述的。
若有需要，本发明的组合物可在包装或分配器装置(dispenser device)中呈现，诸如FDA批准的药盒，其可包含含有活性成分的一个或多个单位剂型。包装可包含，例如，金属或塑料薄片，诸如泡罩包装。包装或分配器装置可随附用于施用的说明。包装或分配器还可容纳与容器相关的通告，所述通告以管理药物的生产、使用或销售的政府机构规定的形式，所述通告反映机构批准的组合物的形式或人用或兽用施用。此通告，例如，可以是美国食品和药物管理局批准用于处方药物的标签或是批准的产品插页。
在本文描述的任何方法、用途和组合物中，本文描述的缀合物可与另外的治疗活性剂组合被使用。此类另外的剂包括，作为非限制性实例，化学治疗剂、抗血管生成剂、激素、生长因子、抗生素、抗微生物剂、抗抑郁剂、免疫刺激剂和可增强缀合物的治疗效果和/或被治疗的受试者健康的任何其他剂。
合成和中间体：
在设计用于制备如本文描述的缀合物的合成途径的过程中，本发明人已成功制备了代表性的中间体结构，所述中间体结构可用于制备如本文描述的缀合物和/或可用于评价如本文描述的缀合物的生物活性。
根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了一种包含具有与其一端(例如，与其末端骨架单元)附接的二膦酸盐部分的聚合物骨架的缀合物，所述二膦酸盐经由支化单元与所述末端骨架附接，其中所述二膦酸盐与所述聚合物的摩尔比为至少2∶1。
如本文关于聚合物、在二膦酸盐环境中的支化单元和骨靶向部分描述的实施方案都被包含在本文描述的该方面的实施方案中。
在一些实施方案中，支化单元具有树枝状结构。
在一些实施方案中，此缀合物可由如下的式II表示：
A-P-[B1]m 0-[B2]m 1-[B3]m 2......[Bg-L2]m g-1-[T*]m g
式II
其中：
P是所述聚合物骨架；
T*是如本文描述的二膦酸盐骨靶向部分；
A是聚合物骨架的端基，且可以是聚合物固有的官能团本身或是受保护的，或在聚合物末端产生的任何其他官能团，如上文描述的；
L2是连接部分，经由支化单元将所述靶向部分连接至聚合物骨架的一端(例如，连接至聚合物的末端骨架单元)，如本文描述的，或不存在；
B1、B2、B3....Bg各自独立地是支化单元，其中B1、B2、B3....Bg一起形成具有树枝状结构的支化单元，如本文描述的；
m是等于2、3、4、5或6的整数，代表所述树枝状结构的分支数目；并且
g是从1至20范围的整数，代表所述树枝状结构的代的数目。
在一些实施方案中，聚合物是聚(亚烷基二醇)。
在一些实施方案中，二膦酸盐是阿仑膦酸盐。
在一些实施方案中，聚合物是聚(亚烷基二醇)，且二膦酸盐是阿仑膦酸盐。
根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了一种包含具有与其附接的治疗活性剂的聚合物骨架的缀合物，所述治疗活性剂与聚合物骨架的一端(例如，与聚合物的一端的末端骨架单元)附接，其中聚合物还包含经由支化单元与聚合物骨架的另一端(例如，与聚合物的另一端的末端骨架单元)附接的反应基团，如本文描述的，其中所述官能团与所述聚合物的摩尔比为至少2∶1。
在一些实施方案中，反应基团可用于将靶向部分，例如骨靶向部分附接至缀合物。
如本文关于聚合物、支化单元、连接部分和治疗活性剂描述的实施方案都被包含在本文描述的该方面的实施方案中。
在一些实施方案中，支化单元具有树枝状结构。
在一些实施方案中，此缀合物可由如下的式III表示：
D-L1-[B*]-P-[B1]m 0-[B2]m 1-[B3]m 2......[Bg-L2]m g-1-[R]m g
式I
其中：
D是如本文描述的治疗活性剂；
P是如本文描述的聚合物骨架；
R是反应基团；
B*是支化单元或不存在；
L1是连接部分，将治疗活性剂连接至聚合物骨架的一端，如本文描述的；
L2是第二连接部分，经由支化单元将反应基团连接至聚合物骨架的另一端，或不存在；
B1、B2、B3....Bg各自独立地是支化单元，其中B1、B2、B3....Bg一起形成具有树枝状结构的支化单元，如本文描述的；
m是等于2、3、4、5或6的整数，代表树枝状结构的分支数目；并且
g是从1至20范围的整数，代表树枝状结构的代的数目。
在一些实施方案中，第一连接部分是如本文描述的水解可裂解的部分。
在一些实施方案中，聚合物骨架源自聚(亚烷基醇)，如本文描述的，且在一些实施方案中，其源自PEG。
反应基团可以是，例如，羟基、胺、羧酸酯、卤化物、硫酸酯、磺酸酯，等等。
在一些实施方案中，反应基团是羧酸酯。
根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了制备如本文描述的聚合缀合物的方法。
在一些实施方案中，该方法通过将包含具有经由支化部分与其一端附接的骨靶向部分的聚合物骨架的缀合物与治疗活性剂反应来实现。
在一些实施方案中，选择缀合物和治疗活性剂以产生如本文描述的水解可裂解的连接部分。在这些实施方案的一些中，该方法还包含在反应之前，将此连接部分附接至治疗活性剂，据此通过在缀合物和连接部分之间形成键来执行反应。
可由本领域技术人员选择条件、任选的保护基团、任选的活化基团，等等以有效执行反应同时考虑反应物的化学结构。
在一些实施方案中，反应缀合物具有如本文描述的通式III。
可通过在聚合物骨架的一端(例如，在其另一端受保护)顺序地并可控地生长树枝状支化单元，通过支化部分的顺序附接执行提供此缀合物，如本文描述的。
在随后的实施例部分及在图2中描述了本文描述的示例性的方法。
在一些实施方案中，制备如本文描述的聚合缀合物的方法通过将如本文描述的聚合物骨架和治疗活性剂的缀合物与一个或多个骨靶向部分一起反应来实现，所述缀合物由两个或多个反应基团封端。
总述：
如本文所用的术语“约”指±10％。
术语“包含(comprise)”、“包含(comprising)”、“包含(include)”、“包含(including)”和具有(having)和它们的同源词指“包括但不限于”。
术语“由...组成”指“包括并限于”。
术语“基本上由...组成”指组合物、方法或结构可包括另外的成分、步骤和/或部分，而只要该另外的成分、步骤和/或部分不会实质改变所要求保护的组合物、方法或结构的基本和新颖的特征。
本文使用的词“示例性的”指“用作实例、例子或例证”。描述为“示例性的”任何实施方案不必然被解释为优选的或比其他实施方案更具优势和/或排除来自其他实施方案的特征的并入。
本文使用的词“任选地”指“在一些实施方案中被提供且在其他实施方案中未被提供”。本发明的任何特定的实施方案可包括多个“任选的”特征，除非此类特征是矛盾的。
如本文所用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指代物，除非上下文另有清楚规定。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可包括多种化合物，包括其混合物。
贯穿本申请，可以以范围的形式呈现本发明的多种实施方案。应理解的是，以范围的形式的描述仅为了方便和简洁并不应被解释为对本发明的范围的刻板的限制。因此，范围的描述应被认为具有明确公开的所有可能的子范围及该范围内的单个数值。例如，范围诸如从1至6的描述应被认为具有明确公开的子范围诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6，等等，及该范围内的单个数，例如，1、2、3、4、5和6。这适用而不论范围的宽度。
本文无论何时显示数值的范围，其意在包括显示的范围内的任何引用的数值(分数或整数)。在本文可互换地使用短语“范围为/范围在”第一个显示的数和第二个显示的数之间和“范围为/范围在”第一个显示的数“至”第二个显示的数之间，并意在包括第一个和第二个显示的数及它们之间的所有的分数和整数数值。
如本文所用的术语“方法”指用于实现给定任务的方式、手段、技术和程序，包括，但不限于，化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知的或从已知的方式、手段、技术和程序中容易开发的那些方式、手段、技术和程序。
如本文所用的术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减慢或逆转病症的进展，基本上改善病症的临床或美学症状或基本上阻止病症的临床或美学症状的出现。
如贯穿本文使用的，术语“烷基”指包括直链和支链基团的饱和的脂肪烃。优选地，烷基基团具有1至20个碳原子。本文无论何时阐述了数值范围；例如，“1-20”，其暗示在烷基基团的情况下，基团可包含1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子，等等，直至并包含20个碳原子。更优选地，烷基是具有1至10个碳原子的中等大小的烷基。最优选地，除非另外说明，烷基是具有1至4个碳原子的低级烷基。烷基基团可以是未取代的或取代的，只要取代基不干扰化合物的性能和/或期望的用途。当被取代时，取代基基团可以是，例如，环烃基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂脂环族、卤素、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、亚硫酰基、磺酰基、氰基、硝基、叠氮化物、膦酰基、亚膦酰基、氧代、羰基、硫代羰基、脲、硫脲、O-氨甲酰基、N-氨甲酰基、O-硫代氨甲酰基、N-硫代氨甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、C-羧基、O-羧基、亚磺酰氨基和氨基，如这些术语在本文中被定义的。
“环烃基”基团指所有碳单环或稠环(即，共享相邻的碳原子对的环)基团，其中多个环之一不具有完全共轭的π电子体系。环烃基基团的非限制性实例是环丙烷、环丁烷、环戊烷、环戊烯、环己烷、环己二烯、环庚烷、环庚三烯和金刚烷。环烃基基团可以是未取代的或取代的，只要取代基不干扰化合物的性能和/或期望的用途。当被取代时，取代基基团可以是，例如，烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂脂环族、卤素、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、亚硫酰基、磺酰基、氰基、硝基、叠氮化物、膦酰基、亚膦酰基、氧代、羰基、硫代羰基、脲、硫脲、O-氨甲酰基、N-氨甲酰基、O-硫代氨甲酰基、N-硫代氨甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、C-羧基、O-羧基、亚磺酰氨基和氨基，如这些术语在本文中被定义的。
“烯基”基团指由至少两个碳原子和至少一个碳-碳双键组成的烃基基团。
“炔基”基团指由至少两个碳原子和至少一个碳-碳三键组成的烃基基团。
“芳基”基团指具有完全共轭的π电子体系的所有碳单环或稠环多环(即，共享相邻的碳原子对的环)基团。芳基基团的非限制性实例为苯基、萘基和蒽基。芳基基团可以是未取代的或取代的，只要取代基不干扰化合物的性能和/或期望的用途。当被取代时，取代基基团可以是，例如，烷基、烯基、炔基、环烃基、芳基、杂芳基、杂脂环族、卤素、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、亚硫酰基、磺酰基、氰基、硝基、叠氮化物、膦酰基、亚膦酰基、氧代、羰基、硫代羰基、脲、硫脲、O-氨甲酰基、N-氨甲酰基、O-硫代氨甲酰基、N-硫代氨甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、C-羧基、O-羧基、亚磺酰氨基和氨基，如这些术语在本文中被定义的。
“杂芳基”基团指具有一个或多个原子诸如，例如，氮、氧和硫在环中和，另外，具有完全共轭的π电子体系的单环或稠环(即，共享相邻的原子对的环)基团。杂芳基基团的非限制性实例包括吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、吡唑、吡啶、嘧啶、吲哚、假吲哚、喹啉、异喹啉和嘌呤。杂芳基基团可以是未取代的或取代的，只要取代基不干扰化合物的性能和/或期望的用途。当被取代时，取代基基团可以是，例如，烷基、烯基、炔基、环烃基、芳基、杂芳基、杂脂环族、卤素、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、亚硫酰基、磺酰基、氰基、硝基、叠氮化物、膦酰基、亚膦酰基、氧代、羰基、硫代羰基、脲、硫脲、O-氨甲酰基、N-氨甲酰基、O-硫代氨甲酰基、N-硫代氨甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、C-羧基、O-羧基、亚磺酰氨基和氨基，如这些术语在本文中被定义的。
“杂脂环族”基团指具有一个或多个原子诸如氮、氧和硫在环中的单环或稠环基团。环还可具有一个或多个双键。然而，环不具有完全共轭的π电子体系。杂脂环族基团可以是未取代的或取代的，只要取代基不干扰化合物的性能和/或期望的用途。当被取代时，取代基基团可以是，例如，孤对电子、烷基、烯基、炔基、环烃基、芳基、杂芳基、杂脂环族、卤素、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、亚硫酰基、磺酰基、氰基、硝基、叠氮化物、膦酰基、亚膦酰基、氧代、羰基、硫代羰基、脲、硫脲、O-氨甲酰基、N-氨甲酰基、O-硫代氨甲酰基、N-硫代氨甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、C-羧基、O-羧基、亚磺酰氨基和氨基，如这些术语在本文中被定义的。代表性的实例是哌啶、哌嗪、四氢呋喃、四氢吡喃、吗啉，等等。
“羟基”基团指-OH基团。
“叠氮化物”基团指-N＝N+＝N-基团。
“烷氧基”基团指-O-烷基和-O-环烷基二者基团，如本文定义的。
“芳氧基”基团指-O-芳基和-O-杂芳基二者基团，如本文定义的。
“巯基”或“硫醇”基团指-SH基团。
“硫代烷氧基”基团指-S-烷基和-S-环烷基二者基团，如本文定义的。
“硫代芳氧基”基团指-S-芳基和-S-杂芳基二者基团，如本文定义的。
“羰基”基团指-C(＝O)-R’基团，其中R’如上文定义的。
“硫代羰基”基团指-C(＝S)-R’基团，其中R’如本文定义的。
“C-羧基”基团指-C(＝O)-O-R’基团，其中R’如本文定义的。
“O-羧基”基团指R’C(＝O)-O-基团，其中R’如本文定义的。
“氧代”基团指＝O基团。
“羧酸酯”或“羧基”包含C-羧基和O-羧基二者基团，如本文定义的。
“羧酸”基团指C-羧基基团，其中R’是氢。
“硫代羧基”或“硫代羧酸酯”基团指-C(＝S)-O-R’和-O-C(＝S)R’基团。
“酯”指C-羧基基团，其中R’不是氢。
酯键指-O-C(＝O)-键。
“卤素”基团指氟、氯、溴或碘。
“亚硫酰基”基团指-S(＝O)-R’基团，其中R’如本文定义的。
“磺酰基”基团指-S(＝O)2-R’基团，其中R’如本文定义的。
“磺酸酯”基团指-S(＝O)2-O-R’基团，其中R’如本文定义的。
“硫酸酯”基团指-O-S(＝O)2-O-R’基团，其中R’如本文定义的。
“磺酰胺”或“磺酰氨基”基团包含S-磺酰氨基和N-磺酰氨基二者基团，如本文定义的。
“S-磺酰氨基”基团指-S(＝O)2-NR’R”基团，R’和R”的每一个都如本文定义的。
“N-磺酰氨基”基团指R’S(＝O)2-NR”基团，其中R’和R”的每一个都如本文定义的。
“O-氨甲酰基”基团指-OC(＝O)-NR’R”基团，其中R’和R”的每一个都如本文定义的。
“N-氨甲酰基”基团指R’OC(＝O)-NR”-基团，其中R’和R”的每一个都如本文定义的。
“氨甲酰基”或“氨基甲酸酯”基团包含O-氨甲酰基和N-氨甲酰基基团。
氨基甲酸酯键描述了-O-C(＝O)-NR′-键，其中R′如本文描述的。
“O-硫代氨甲酰基”基团指-OC(＝S)-NR’R”基团，其中R’和R”的每一个都如本文定义的。
“N-硫代氨甲酰基”基团指R’OC(＝S)NR”-基团，其中R’和R”的每一个都如本文定义的。
“硫代氨甲酰基”或“硫代氨基甲酸酯”基团包含O-氨甲酰基和N-氨甲酰基基团。
硫代氨基甲酸酯键描述了-O-C(＝S)-NR′-键，其中R′如本文描述的。
“C-酰氨基”基团指-C(＝O)-NR’R”基团，其中R’和R”的每一个都如本文定义的。
“N-酰氨基”基团指R’C(＝O)-NR”-基团，其中R’和R”的每一个都如本文定义的。
“酰胺”基团包含C-酰氨基和N-酰氨基二者的基团。
酰胺键描述了-NR′-C(＝O)-键，其中R′如本文定义的。
“脲”基团指-N(R’)-C(＝O)-NR”R’”基团，其中R’和R”的每一个都如本文定义的，且R’”被如本文对R’和R”定义的来定义。
“硝基”基团指-NO2基团。
“氰基”基团指-C≡N基团。
术语“膦酰基”或“膦酸酯”描述了-P(＝O)(OR’)(OR”)基团，R’和R”如上文定义的。
术语“磷酸酯”描述了-O-P(＝O)(OR’)(OR”)基团，R’和R”的每一个都如上文定义。
“磷酸”是磷酸酯基团，其中每一个R都是氢。
术语“亚膦酰基”描述了-PR’R”基团，R’和R”的每一个都如上文定义的。
术语“硫脲”描述了-N(R’)-C(＝S)-NR”-基团，R’和R”的每一个都如上文定义的。
应领会的是，为了清晰而在分开的实施方案的环境中描述的本发明的某些特征，也可以以单个实施方案的组合提供。相反地，为了简洁而在单个实施方案的环境中描述的本发明的多种特征，还可以单独地或以任何适合的次组合或如适当地以本发明的任何其他描述的实施方案提供。多种实施方案的环境中描述的某些特征不被认为是那些实施方案的必要特征，除非该实施方案没有那些要素就不起作用。
如上文描绘的并如在下面的权利要求书部分中要求保护的本发明的多种实施方案和方面在随后的实施例中找到实验支持。
实施例
现在参考下面的实施例与以上的描述一起，以非限制性的方式阐述本发明。
实施例1
化学合成和表征
材料与实验方法
材料：
要求无水条件的所有反应都在Ar或N2气氛下执行。化学药品和溶剂为A.R.级别或由标准技术纯化。
紫杉醇(PTX)获自Indena(Milan，IT)或获自Alcon Biosciences Ltd.(Mumbai，India；Petrus Chemicals and Materials Ltd.，Israel)。
阿仑膦酸盐(ALN)购自Alcon Biosciences Ltd.(Mumbai，India；PetrusChemicals and Materials Ltd.，Israel)。
Boc-NH-PEG5kDa-NHS和Lys(εFmoc)-OH获自Iris Biotech GmbH(Marktredwitz，Germany)。
N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)、N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)、琥珀酸酐、β-谷氨酸(β-Glu)、硅胶(SiO2)、无水硫酸钠(Na2SO4)、三乙胺(TEA)、三氟乙酸(TFA)、2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)、二甲基亚砜-d6和D2O购自Sigma-Aldrich。
Glycil-甘氨酸(Gly-Gly)获自Merck(Darmstadt，Germany)。
所有其他化学试剂，包括盐和溶剂购自Sigma-Aldrich。
设备资料：
使用硅胶板Merck60F254执行薄层色谱法(TLC)；通过在UV光下照射和/或通过用磷钼酸溶液(乙醇中20％wt.)处理、随后通过加热可视化化合物。
使用Bruker AMX200或400设备执行1H NMR测量。化学位移以相对于TMS(δ＝0ppm)的δ和以Hz的偶合常数J表示。除非另有声明，在室温下作为溶剂的CDCl3中记录光谱。
缀合物中游离的和总PTX含量的确定：
使用Agilent300-Extend C18(4.6×250mm；5μm)柱、及固定在227nm的UV检测器，通过反向HPLC评价缀合物中PTX的量。洗脱液A和B分别为H2O和CH3OH。通过以下的梯度执行洗脱：以1mL/分钟的流速，在5分钟内从5％B至50％B、在14分钟内从50％B至80％B、在5分钟内从80％B至100％B、及在5分钟内从100％B至5％B。
在PTX从缀合物释放之后，通过RP-HPLC评价总药物含量。将3mg缀合物溶解于1mL的MeOH。添加2％(v/v)的NaOH0.2N之后，于50℃持续2小时孵育溶液。随后通过乙酸乙酯提取药物。蒸发有机相并将残余物溶解于甲醇。如以上报道的执行洗脱。使用用相同方法获得的PTX校准曲线计算PTX的量。使用已知浓度的PTX的溶液计算的该分析的标准误差为±1.89％。
与PEG结合的ALN含量的确定：
高氯酸溶液中ALN和Fe3+离子之间的发色复合物的形成被用于通过分光光度法确定ALN含量(如Kuljanin等人J.Pharm.Biomed.Anal.2002，28，1215-1220中描述的)。简言之，将缀合物(2.5mg、5mg和10mg)溶解于0.1mL的4mM FeCl3和0.8mL的0.2M高氯酸(HClO4)的混合物中。针对连续稀释的0-3mM ALN的校准图确定缀合物中ALN的含量。通过分光光度法在λ＝300nm处测量样品吸光度。
缀合物的动态光散射(DLS)：
使用实时粒径分析仪(NanoSight LM20TM)评价了缀合物的平均流体力学直径。将PTX-PEG和PTX-PEG-ALN(5mg/mL)注入室中，允许持续30秒平衡并通过Nanoparticle Tracking Analysis(NTA)软件分析。
缀合物在不同pH值的缓冲溶液中及在血浆中的稳定性：
于37℃持续48小时在pH5和pH7.4的PBS中孵育每一种缀合物(3mg/mL)以评价药物释放。在预定的时间取出50μL的样品并使用以上报道的条件通过RP-HPLC分析，评价色谱图谱中缀合物峰的下降。
还于37℃持续48小时在小鼠血浆中孵育测试的缀合物，该小鼠血浆在持续10分钟以2000×g离心血液样品之后获得。在预定的时间取出60μL的样品并将60μL的CH3CN添加至获得的血浆蛋白沉淀。以15000×g离心样品并取出上清液并使用以上报道的条件通过RP-HPLC分析。
还通过动态光散射评价缀合物的稳定性。制备了PBS pH5和pH7.4中的每一种缀合物(7mg/mL)的溶液并用手动挤出机(Liposofast Avestin)在200nm处立即挤出溶液并使用光散射设备(Malvern Nano-S，Worcestershire，United Kingdom)分析溶液。将设备固定在37℃，检测器位置为173°并持续4小时每20分钟一次执行分析(在平衡的5分钟之后执行首次测量)，及，储存于相似的条件中之后，在24小时时分析样品。
化学合成
PEG-ALN、PEG-PTX和PTX-PEG-ALN缀合物的合成：
分别在图1A、1B和1C中描绘了根据本发明一些实施方案的示例性缀合物PEG-ALN(化合物1)、PEG-PTX(化合物2)和PTX-PEG-ALN(化合物3)的化学结构，其中X是-C(＝O)-。
在图2中描绘了用于制备PTX-PEG-ALN(化合物3)的示例性合成途径。
以三个主要步骤执行PTX-PEG(化合物2)的合成：SPTX的合成、PEG-树型化合物的合成、和SPTX与PEG-树型化合物的结合(见，图2)。
使用β-谷氨酸(βGlu)作为对称的双羧基支化单元在市售的Boc-NH-PEG-NHS的羧基活化的末端构建PEG-树型化合物。
首先通过将ALN靶向残基连接至PEG树型化合物的羧基基团及随后通过移除Boc保护基团获得PEG-ALN。
SPTX与PEG-ALN的偶合产生PTX-PEG-ALN。
2’-琥珀酰-紫杉醇(SPTX)的制备：将585mg(5.85mmol)的琥珀酸酐添加至溶解于30mL的无水吡啶的1克(1.17mmol)的紫杉醇。于室温持续48小时搅拌反应。通过SiO2柱(30×2.5cm)上的色谱分析纯化SPTX、用氯仿-甲醇混合物(97∶3至90∶10)洗脱SPTX并通过TLC(氯仿-甲醇90∶10中Rf0.5)确定SPTX。
通过1H-NMR光谱表征SPTX，显示PTX的特征信号和琥珀酸间隔基的特征信号，如下：
SPTX(CDCl3)的1H-NMR：δ＝1.15(s，3H，C16)、1.24(s，3H，C17)、1.68(s，3H，C18)、1.79(s，3H，C19)、2.24(s，3H，C31)、2.38(s，3H，C29)、2.5-2.7(m，4H，-CH2-CH2-琥珀酸间隔基)、4.9(d，1H，C5)、5.66(d，1H，C2’)、6.27(s，1H，C10)、7.25(s，3’-Ph)、7.4(m，3’-NBz)、7.5(m2-OBz)、7.75(d，3’NBz)、8.1(d，2-OBz)ppm。
Boc-NH-PEG-βGlu-(COOH)2(化合物4)的制备：将Boc-NH-PEG-NHS(MW4928Da；3.5克；0.71mmol)添加至溶解于150mL的具有pH8.0的0.1M硼酸盐缓冲液/CH3CN(3∶2)混合物中的β-谷氨酸(βGlu；313mg；2.13mmol)。允许反应混合物在搅拌下持续5小时进行。其后用0.2N HCl将反应混合物的pH调节至约4.5并通过用CHCl3提取(6×300mL)将过量的βGlu去除。有机相经无水Na2SO4干燥、在真空下浓缩并在搅拌下滴入1L冷的二乙醚中。处于-20℃下1小时之后，过滤沉淀物并在真空下干燥，从而得到化合物4(3.345克，95％收率)。根据Snyder和Sabocinsky分析通过TNBS测试证实缀合物中不存在游离βGlu(Anal.Biochem.1975，64，284-288)。
Boc-NH-PEG-βGlu-(NHS)2(化合物5)的制备：将化合物4(3.33克；0.67mmol)溶解于100mL的无水CH2Cl2，并添加NHS(469mg；4.07mmol)和DCC(1.114克；5.4mmol)。在室温下过夜搅拌反应混合物并其后过滤反应混合物并将其滴入1升冷的二乙醚。处于-20℃下1小时之后，过滤沉淀物并在真空下干燥，以得到化合物5(3.1mg，89.5％收率)。基于如在别处报道的(见，Pasut等人，2005，上述)Gly-Gly的等摩尔溶液的氨基基团修饰确定活化程度为91％。
Boc-NH-PEG-βGlu-(βGlu)2-(COOH)4(化合物6；PEG-树型化合物)的制备：将βGlu(532mg；3.6mmol)溶解于200mL的pH8.0的0.1M硼酸盐缓冲液/CH3CN(3∶2)混合物，并将化合物5(3.09mg；0.6mmol)添加至溶液。如上文关于制备化合物4所描述的处理反应混合物并相似地纯化产物以得到化合物6(2.9克，92％收率)。
Boc-NH-PEG-βGlu-(βGlu)2-(NHS)4(化合物7)的制备：如上文关于制备化合物5所描述的，将化合物6(1.7克；0.32mmol)与NHS和DCC一起，以得到化合物7(1.52克，89％收率)。活化的程度为81％。
Boc-NH-PEG-βGlu-(βGlu)2-(ALN)4(化合物8)的制备：在室温下，将ALN(802mg；2.46mmol)溶解于pH8.0的0.1M硼酸盐缓冲液，添加化合物7(1.45克；0.25mmol)并持续5小时搅拌反应混合物。如上文关于化合物4的描述纯化产物，从而得到化合物8(1.3克，83％收率)。
PEG-ALN(化合物1)的制备：在室温下，将化合物8(1.2克)溶解于4mL CH2CH2/CF3COOH/H2O(55.4∶45.4∶0.1体积比)的混合物中并持续3小时搅拌反应混合物，且其后蒸发反应混合物以去除TFA和溶剂。将获得的油溶解于CH2Cl2并将溶液滴入400mL的二乙醚。过滤并在真空下干燥沉淀物以得到PEG-ALN缀合物化合物1(1.1克，91％收率)。
H2N-PEG-βGlu-(βGlu)2-(COOH)4(化合物9；PEG-树枝状大分子)的制备：在室温下，将化合物6(1.2克)溶解于4mL CH2CH2/CF3COOH/H2O(55.4∶45.4∶0.1体积比)的混合物并持续3小时搅拌反应混合物以去除保护基团t-Boc，且其后蒸发反应混合物以去除TFA和溶剂。将获得的油溶解于CH2Cl2并将溶液滴入400mL的二乙醚。过滤并在真空下干燥沉淀物以得到化合物9(1.17克，97％收率)。
化合物2(PEG-PTX)的制备：将SPTX(190mg；0.2mmol)溶解于无水DMF(5mL)，并添加无水DMF(2mL)中HOBT(40.5mg；0.3mmol)、EDC(40.2mg；0.22mmol)的溶液。在室温下持续5小时搅拌反应混合物，并随后添加溶解于5mL DMF中的530mg化合物9，并在室温下允许所得混合物在搅拌下反应24小时。其后，在真空下将反应混合物减至小体积(约5mL)并使用用DMF洗脱的Sephadex LH-20树脂通过凝胶过滤色谱法从过量的SPTX纯化产物。将包含化合物2的级分收集在圆底烧瓶中并在真空下蒸发DMF。将残余物溶解于5mL的无水CH2Cl2并在搅拌下将溶液滴入500mL的冷二乙醚。处于-20℃下1小时之后，过滤沉淀物并在真空下干燥，从而得到PEG-PTX缀合物(化合物2；425mg；69.2％收率)。
化合物3(PTX-PEG-ALN)的制备：将SPTX(190mg；0.2mmol)溶解于无水DMF(5mL)，并添加无水DMF(2mL)中HOBT(40.5mg；0.3mmol)和EDC(40.2mg；0.22mmol)的溶液。在室温下持续5小时搅拌反应混合物，且随后添加溶解于5mL的DMF的650mg化合物1(PEG-ALN)并在室温下允许所得混合物在搅拌下反应24小时。在真空下将反应混合物减至小体积(约5mL)并使用用DMF洗脱的Sephadex LH-20树脂通过凝胶过滤色谱法从过量的SPTX纯化产物。将包含化合物3的级分收集在圆底烧瓶中并在真空下蒸发DMF。将残余物溶解于5mL的无水CH2Cl2并在搅拌下将溶液滴入500mL的冷二乙醚。处于-20℃下1小时之后，过滤沉淀物并在真空下干燥，从而得到PTX-PEG-ALN缀合物(化合物3；550mg；74.7％收率)。
FITC标记的PTX-PEG、PEG-ALN和PTX-PEG-ALN缀合物的合成：
图1A、1B和1C中分别描绘了根据本发明一些实施方案的示例性FITC标记的缀合物，FITC标记的-PEG-ALN(FITC标记的-化合物1)、FITC标记的-PEG-PTX(FITC标记的-化合物2)和FITC标记的-PTX-PEG-ALN(FITC标记的-化合物3)的化学结构，其中X是代表偶合至赖氨酸残基的FITC的结构。
图3中描绘了用于制备PTX-PEG-ALN(FITC标记的-化合物3)的示例性合成途径。
通过利用如上文描述的用于非标记的缀合物的制备的相同的化学策略执行FITC标记的-缀合物(FITC标记的-化合物1、2和3)的合成，并通过并入Lys残基及利用用于与FITC偶合的Lys的ε氨基基团执行FITC的附接(见，图3)。
Boc-NH-PEG-L-Lys(εFmoc)-OH(化合物13)的制备：将L-Lys(εFmoc)-OH(313mg；0.67mmol)溶解于50mL的具有pH＝8的H2O/CH3CN(3∶2)混合物，添加Boc-NH-PEG-NHS(MW4928Da；1.1克；0.2mmol)并在室温下允许反应混合物在搅拌下持续5小时进行。其后通过添加0.2N HCl将pH调节为约4.5并通过CHCl3(5×80mL)的提取从过量的L-Lys(εFmoc)-OH中纯化化合物13。有机相经无水Na2SO4干燥、在真空下浓缩并从500mL的二乙醚中沉淀。通过过滤回收产物并在真空下干燥，从而得到Boc-NH-PEG-L-Lys(εFmoc)-OH(化合物13；1.0克；83.0％收率)。通过如上文描述的Snaider Sobociski分析表征产物，以证实游离L-Lys(εFmoc)-OH的不存在。
1H-NMR(d6-DMSO)：δ＝1.3(s，9H，Boc)、3.4-3.6(s，422H，CH2PEG)、7.2-7.5(m，8H，Fmoc基团)、7.7(d，4H，Fmoc基团)、7.9(d，4H，Fmoc基团)ppm。
Boc-NH-PEG-L-Lys(εFmoc)-NHS(化合物14)的制备：如上文关于化合物5和7所描述的，通过将化合物13(800mg)与NHS和DCC反应而活化化合物13，以得到化合物14(94％收率)。
Boc-NH-PEG-L-Lys(εFmoc)-βGlu-(βGlu)2-(COOH)4(化合物15；FITC标记的-PEG树枝状大分子)的制备：如上文关于化合物4和6所描述的，将化合物14与βGlu反应以得到化合物15(89.1％收率)。
Boc-PEG-L-Lys(εNH2)-βGlu-(βGlu)2-(COOH)4(化合物16)的制备：将化合物15(530mg)溶解于10mL的DMF和20％(v/v)哌啶的混合物，并在室温下持续15分钟搅拌溶液以去除Fmoc保护基团。随后蒸发反应混合物以去除溶剂，将残余物溶解于5mL的CH2Cl2并将溶液滴入300mL的二乙醚。过滤并在真空下干燥沉淀物以得到化合物16(92.7％收率)。
Boc-PEG-L-Lys(εFITC)-βGlu-(βGlu)2-(COOH)4(化合物17)的制备：将FITC(38.9mg)溶解于DMF(10mL)，并添加化合物16(470mg)和Et3N(11μL)。在室温下持续5小时搅拌反应混合物并其后使用具有截留3500Da的膜通过针对0.1M磷酸盐缓冲液pH＝8.0的深入(extensive)透析去除过量的FITC。用H2O mQ过夜执行透析的最后步骤以去除磷酸盐。随后冻干产物，从而得到化合物17(86.4％收率)。通过RP-HPLC分析化合物17以证实游离FITC的不存在。
Boc-PEG-L-Lys(εFITC)-βGlu-(βGlu)2-(ALN)4(化合物18)的制备：如上文关于化合物7所描述的，用NHS/DCC活化化合物17(244mg)且其后如上文关于化合物8所描述的，将NHS-活化的产物偶合至ALN以得到化合物18(79,2％收率)。
FITC标记的-PEG-ALN(FITC标记的-化合物1)的制备：如上文关于化合物1的制备所描述的，通过TFA水解过程从化合物18中移除Boc保护基团，从而得到FITC标记的-化合物1(90.4％收率)。
FITC标记的-PTX-PEG(FITC标记的-化合物2)的制备：如上文关于化合物9所描述的，反应化合物17以去除Boc保护基团，并如上文关于化合物2所描述的将所得产物与SPTX反应，从而得到FITC标记的-化合物2(65.9％收率)。
FITC标记的-PTX-PEG-ALN(FITC标记的-化合物3)的制备：如上文关于化合物3所描述的，将FITC-标记的化合物1偶合至SPTX，从而得到FITC标记的-化合物3(62.8％收率)。
缀合物的理化性质：
如上文方法部分描述的，通过高氯酸中ALN和Fe3+离子之间形成的发色复合物并针对ALN的校准图，通过分光光度法确定PTX-PEG-ALN(化合物3)和PEG-ALN(化合物1)非标记的和标记的缀合物中ALN的含量。
通过当溶解于DMSO时缀合物的RP-HPLC分析直接确定PTX-PEG-ALN和PTX-PEG缀合物中游离PTX的含量。所有缀合物中的游离PTX杂质都低于0.6％(w/w)。
在水解缀合物以释放连接的药物之后，通过RP-HPLC执行缀合物中总PTX量的确定。
使用PBS Ph＝8中ε64185M-1cm-1通过分光光度法测量标记的缀合物中FITC的含量。
使用具有Nanoparticle Tracking Analysis(NTA)技术的激光光散射显微术(NanoSight LM20TM，Salisbury，UK)评价PTX-PEG-ALN和PTX-PEG缀合物的流体力学直径和粒径分布。将所得数据展示在图4A和4B中。如在那里显示的，PTX-PEG-ALN和PTX-PEG缀合物在PBS pH7.4中的平均流体力学直径为约190nm。
表1中展示了PEG缀合物和FITC标记的缀合物的理化性质。
表1
Figure BDA0000455687210000661
Figure BDA0000455687210000671
缀合物在不同pH值和血浆中的稳定性的评价：
当在37℃持续48小时孵育时，在生理pH(7.4)、溶酶体pH(5)的缓冲溶液中，及在小鼠血浆中评价了示例性PTX-PEG-ALN缀合物，化合物3的稳定性，并通过RP-HPLC监测缀合物的降解。将所得数据展示在图5A中。在pH7.4时及在血浆中，约50％的PTX-PEG-ALN缀合物在前1小时内降解，且剩余的缀合物在24小时内降解。对于PTX-PEG发现相似的结果。
于37℃，通过动态光散射还监测了48小时期间缀合物胶束的稳定性，并将结果展示在图5B中。如在那里显示的，胶束的稳定性与PTX释放的动力学一致。当在pH5下孵育时，PTX-PEG-ALN和PTX-PEG缀合物的胶束持续直至24小时保持相同的粒径，而在pH7.4下，相同的胶束持续3小时稳定，3小时后由于PTX从缀合物的释放，样品的粒径开始增加。释放的PTX不可溶于水缓冲液并形成沉淀，因此形成悬液并使得系统不稳定。
实施例2
体外研究
材料与实验方法
达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM)、RPMI1640、胎牛血清(FBS)、青霉素、链霉素、制霉菌素、L-谷氨酰胺、Hepes缓冲液、丙酮酸钠和纤连蛋白获自Biological IndustriesLtd.(Kibbutz Beit Haemek，Israel)。
EGM-2培养基购自Cambrex(Walkersville，MD，U.S.A)。
Figure BDA0000455687210000672
基质购自BD Biosciences，USA。
Peroxidase Block购自Merck，Germany。
人脐静脉内皮细胞(HUVEC)获自Cambrex(Walkersville，MD，U.S.A)。
羟基磷灰石结合分析：
将PEG、PEG-ALN和PTX-PEG-ALN缀合物溶解于磷酸盐缓冲的盐水(PBS)，pH7.4(5mg/mL)中。在600μL PBS、pH7.4中，将缀合物溶液(600μL)与羟基磷灰石(HA)散剂(30mg)一起孵育。NH2-PEG-(COOH)4(H2N-PEG-βGlu-(βGlu)2-(COOH)4；PEG-树枝状大分子，化合物9，表示为PEG)被用作对照。以7000RPM持续3分钟离心孵育的样品，并在0、2、5、10和60分钟之后收集来自上层(100μL)的样品。使用HiTrapTM去盐柱
Figure BDA0000455687210000681
的快速蛋白液相色谱(FPLC，AKTATM
Figure BDA0000455687210000682
Amersham Biosciences)分析被用于检测样品中未结合的缀合物(FPLC条件：AKTATM
Figure BDA0000455687210000683
流动相100％DDW，2mL/分钟，λ＝215nm)。使用
Figure BDA0000455687210000684
AKTATM软件执行缀合物的HA-结合动力学分析。在每一个时间点，计算来自色谱的曲线下面积(AUC)。将每一个HA-孵育的缀合物色谱的AUC对不存在HA时缀合物样品的AUC百分数标准化。
细胞培养：
在补充10％胎牛血清(FBS)、100μg/mL青霉素、100U/mL链霉素、12.5U/mL制霉菌素和2mM L-谷氨酰胺的DMEM中培养PC3人类前列腺腺癌MDA-MB-231和MDA-MB-231细胞。
在补充10％FBS、100μg/mL青霉素、100U/mL链霉素、12.5U/mL制霉菌素、2mM L-谷氨酰胺、10mM Hepes缓冲液和1mM丙酮酸钠的RPMI1640中培养4T1细胞。
根据制造商的操作说明在EGM-2培养基(Cambrex)中生长人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。
在37℃；5％CO2下生长细胞。
细胞活性分析：
将PC3细胞铺板在96孔板上的补充5％FBS的DMEM中(5×103细胞/孔)并持续24h孵育(37℃；5％CO2)。在孵育24小时之后，用包含10％FBS的DMEM替换培养基。持续72小时将细胞暴露于系列浓度的PTX和ALN的组合、单独的每一种药物、及与PEG、PEG-ALN、PEG-PTX、PTX-PEG-ALN缀合物一起。孵育之后，通过MTT计数PC3细胞。
将HUVEC铺板在24孔板上的补充5％FBS的生长因子减少的培养基(EBM-2，Cambrex，USA)中(1.5×104细胞/孔)。孵育24小时(37℃；5％CO2)之后，用EGM-2(Cambrex，USA)替换培养基。将4T1和MDA-MB-231细胞铺板在96孔板上的补充5％FBS的DMEM中(5×103细胞/孔)并持续24h孵育(37℃；5％CO2)。其后用包含10％FBS的DMEM替换培养基并用系列浓度的游离PTX和ALN的组合、每一种单独的游离药物、及用PEG和示例性的PEG-ALN、PTX-PEG、PTX-PEG-ALN缀合物持续直至72小时攻击细胞。孵育之后，通过库尔特粒度仪计数HUVEC。
通过噻唑蓝四唑蓝(Thiazolyl Blue Tetrazolium Blue)(MTT)(Sigma-Aldrich，Israel)，如下测量4T1和MDA-MB-231细胞活性：将30μl的2mg/mL MTT溶液添加至包含生长在100μl培养基中的细胞的孔。5小时孵育之后，用二甲基亚砜(DMSO)替换培养基直至形成蓝色。通过分光光度法在560nm处测量活性。
迁移分析：
使用用10μg/mL纤连蛋白(Biological industries，Beit Haemek，Israel)包被的修饰的8μm Boyden chambers
Figure BDA0000455687210000691
(Costar Inc.，USA)执行细胞迁移分析。用游离PTX(10nM)和ALN(46nM)的组合、每一种单独的药物、及用等同于PTX和ALN浓度的PEG、PEG-ALN、PTX-PEG、PTX-PEG-ALN缀合物攻击PC3(15×104细胞/100μL)，并在向包含10％FBS的DMEM迁移之前将PC3添加至transwells的上室持续2小时孵育。孵育之后，允许细胞在下室中的10％FBS存在或不存在情况下持续4小时向室的下面迁移。随后固定并染色细胞(Hema3Stain System；FisherDiagnostics，USA)。使用与Nikon DS5冷却CCD相机集成的NikonTE2000E倒置显微镜，通过10X物镜、明场照明成像染色的迁移的细胞。使用NIH图像软件计数每张膜上来自采集的图像的迁移的细胞。将迁移标准化为迁移百分数，100％表示迁移至包含FBS的培养基。
毛细管-样管形成分析：
在冰上，用
Figure BDA0000455687210000701
基质(50μL/孔)(BD Biosciences，USA)包被24孔板的表面，并其后在37℃持续30分钟实现聚合作用。用游离PTX(5nM)和ALN(23nM)的组合、用单独的每一种游离药物、并用当量浓度的PEG、PEG-ALN、PTX-PEG和PTX-PEG-ALN缀合物攻击HUVEC(3×104)，且其后，在完全EGM-2培养基存在下将HUVEC接种在经包被的板上。孵育(37℃；5％CO2)8小时之后，使用与Nikon DS5冷却CCD相机集成的Nikon TE2000E倒置显微镜，通过4X物镜、明场技术成像孔。
红血细胞(RBC)溶解分析：
于37℃持续1小时将大鼠RBC溶液(2％w/w)与连续稀释的游离PTX和游离ALN的组合、PEG、及以等同于PTX和ALN浓度的如本文描述的PTX-PEG-ALN缀合物一起孵育。阴性对照为PBS和Dextran(约70000Da的MW)而阳性对照为1％w/v的Triton X100溶液(100％溶解)和聚(乙烯亚胺)(PEI)。离心之后，移出上清液并使用酶标仪(Genios，TECAN)在550nm处测量其吸光度。结果表示为相对于阳性对照(Triton X100)释放的血红蛋白的百分数。
统计方法：
体外数据表示为平均值±标准差(s.d.)。使用非配对的t-检验确定统计显著性。P＜0.05被认为统计显著。所有统计检验均为双侧。
结果
缀合物与羟基磷灰石(HA)的结合
二膦酸盐ALN，已知为具有强的骨亲和力的骨靶向部分，被选择作为骨靶向部分。评价了示例性的包含ALN的缀合物与骨矿物质的结合能力。羟基磷灰石被用作模拟骨组织的模型。如上文描述的，执行了体外HA结合分析和使用HiTrapTM去盐柱的FPLC分析。如图6中显示的，5分钟孵育之后，80％或90％的PTX-PEG-ALN或PEG-ALN缀合物分别与HA结合并到达稳定状态，显示缀合物与骨矿物质的高结合能力。
PTX-PEG-ALN缀合物的生物相容性：
使用大鼠红血细胞(RBC)溶血分析评价了PTX-PEG-ALN的生物相容性。将大鼠RBC溶液与系列浓度的PTX和ALN的组合、PEG、和与等同于PTX和ALN的浓度的PTX-PEG-ALN缀合物、PTX媒介物(1∶1∶8乙醇∶Cremophor EL∶盐水)和用作溶血的对照的聚乙烯亚胺(PEI)一起孵育。将所得数据呈现在图7中并显示了直至5mg/mL的所有测试的浓度下的PTX-PEG-ALN缀合物(黑色正方形)未呈现可检测的RBC溶血(体内施用之后，估计的血液浓度为约0.5mg/mL)。已知PTX媒介物对正常非增殖细胞的细胞毒性，且确实，观察到与PTX媒介物一起孵育的RBC中约8％的RBC溶血(黑色菱形)。在与以相当于5mg/mL的缀合物的最高浓度、作为游离药物的PTX+ALN的组合一起孵育的RBC中观察到约5％的溶血(空白正方形)。观察到的该溶血可能由这些药物溶解在其中的Cremophor EL媒介物造成。
PC3细胞的抗增殖效应：
紫杉醇(taxane)PTX是被批准作为用于转移性乳腺癌的一线治疗的有效的细胞毒性剂，且在临床中，其正被测试与用于治疗转移性前列腺癌的其他化学治疗剂组合。为了评价在与PEG聚合物缀合之后PTX是否保持其细胞毒性活性，执行了PC3人前列腺腺癌细胞的增殖分析。将所得数据呈现在图8A和8B中。PEG-β-谷氨酸树枝状大分子(表示为PEG)用作对照并发现以测试的任何浓度都是无毒的。PC3细胞的增殖被PTX-PEG和PTX-PEG-ALN缀合物、被单独的游离PTX及被游离PTX和游离ALN的组合相似地抑制，所有的处理都呈现25-60nM的IC50，并显示当与PEG缀合时，PTX保持其有效的细胞毒性。
发现单独的ALN仅在10μM的测试的最高浓度下是有毒的，然而，在当量浓度下与PEG结合的ALN，在测试的任何浓度下都是无毒的。
对PC3人前列腺腺癌细胞的迁移的影响：
与当量浓度的单独的游离药物及与表示为PEG的PEG-β-谷氨酸树枝状大分子相比，评价了示例性的PTX-PEG、PEG-ALN和PTX-PEG-ALN缀合物对PC3细胞向FBS迁移的能力的影响。结果展示在图9中并显示，与PTX-PEG和PTX-PEG-ALN缀合物二者及与游离PTX+ALN的组合一起孵育的PC3向PBS的迁移被相似地抑制了约70％。
鼠4T1和人MDA-MB-231乳腺癌细胞系的抗增殖作用：
为了评价在与PEG聚合物缀合之后PTX和ALN是否保持它们的细胞毒性活性，执行了4T1和MDA-MB-231细胞的增殖分析。结果展示在图10A(4T1细胞)和图10B(MDA-MB-231细胞)中。如在图10A中显示的，4T1细胞的增殖被所有包含PTX的制剂以相似的方式抑制，呈现约10nM的IC50，并还被作为游离药物的PTX和ALN的组合和被PTX-PEG-ALN缀合物以相似的方式抑制，呈现约20nM的IC50。
如在图10B中显示的，MDA-MB-231细胞的增殖也被所有包含PTX的制剂抑制，呈现约1nM的IC50，并还被作为游离药物的PTX和ALN的组合及被PTX-PEG-ALN缀合物以相似的方式抑制，呈现约10nM的IC50。
PEG-β-谷氨酸树枝状大分子，表示为PEG，用作对照并以测试的所有浓度都是无毒的。发现单独的ALN仅在10μM的测试的最高浓度下是有毒的，然而，当量浓度的与PEG结合的ALN，在测试的所有浓度下都是无毒的。
抗血管生成特性：
为了评价本文描述的缀合物是否具有与PTX相似的抗血管生成特性，对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)进行了内皮细胞增殖、毛细管-样管形成和迁移分析。图11A展示了不同浓度的游离PTX+ALN的组合(空白正方形)、PTX(空白三角形)、ALN(空白圆形)和当量浓度的PEG(黑色菱形)、PTX-PEG-ALN(黑色正方形)、PTX-PEG(黑色三角形)和PEG-ALN(黑色圆形)缀合物对HUVEC增殖的影响。X-轴以对数刻度表示。如在图11A中显示的，HUVEC的增殖被所有包含PTX的制剂相似地抑制，呈现约2nM的IC50，并还被作为游离药物的PTX和ALN的组合和被PTX-PEG-ALN缀合物以相似的方式抑制，呈现约4nM的IC50。
图11B展示了作为游离药物的PTX和ALN的组合、单独的PTX和ALN的每一种、和当量浓度的PEG、PTX-PEG-ALN、PTX-PEG和PEG-ALN缀合物对HUVEC向VEGF迁移的能力的影响。如在图11B中显示的，与PTX-PEG和PTX-PEG-ALN缀合物二者及与游离PTX和ALN的组合一起孵育的HUVEC向VEGF的迁移被抑制了约80％。
通过抑制HUVEC的增殖和迁移显示游离的和缀合的PTX和ALN具有抗血管生成潜力，测量了缀合物对HUVEC在
Figure BDA0000455687210000731
上形成毛细管-样管结构的能力的影响，作为指示血管生成级联事件中另外的关键步骤。
图12A展示了在所显示的处理之后，接种在
Figure BDA0000455687210000732
上的HUVEC的毛细管-样管结构的代表性图像(比例尺代表100μm)，显示毛细管-样管结构形成被所有包含PTX的制剂(具有和不具有ALN)抑制。
如图12B中显示的，根据毛细管的长度，作为游离药物的PTX和ALN的组合抑制HUVEC的管状结构的形成约60％。以PTX-当量浓度的PTX-PEG和PTX-PEG-ALN缀合物抑制HUVEC的管状结构的形成约50％。
测试了在关于HUVEC的迁移和毛细管-样管形成分析中使用的处理的浓度，并发现在指示的孵育时间处是无细胞毒性的，而是特异性抑制迁移和形成毛细管-样管的能力。
总的说来，进行的体外研究显示与游离的PTX相比，当与PEG结合时，PTX呈现对多种细胞系的相似的细胞毒性，表明PTX可从缀合物释放并实现相似的肿瘤细胞杀死效果。内皮细胞的增殖、毛细管-样管形成和迁移的抑制显示了PTX-PEG和PTX-PEG-ALN缀合物具有抗血管生成特性，并与当量浓度的游离药物同样有效。与HA的改善的结合能力显示了由包含ALN的缀合物呈现的组合的靶向作用。
实施例3
体内研究
材料与实验方法
材料：
所有单克隆抗体都购自BD Biosciences并根据制造商的操作说明被用于流式细胞术分析。
大鼠抗-鼠CD34第一抗体(MEC14.7)来自Abcam(Cambridge，MA)。兔抗大鼠抗体、抗兔辣根过氧化物酶-缀合的抗体(ABC检测试剂盒)和ImmPACTTM DAB稀释剂试剂盒来自Vector Laboratories(Burlingame，CA，USA)。
pEGFPLuc质粒来自Clontech(Mountain View，CA，USA)。核染色来自Procount，BD Pharmingen(San Jose，CA，USA)。
7-氨基放线菌素D(7AAD)来自Chemicon(Billerica，MA)。
葡聚糖(约70000的MW)和所有其他化学试剂，包括盐和溶剂都购自Sigma-Aldrich，Israel。
PC3人前列腺腺癌、MDA-MB-231人乳腺癌和4T1鼠乳腺癌细胞系购自American Type Culture Collection(ATCC)。
Balb/C小鼠获自Harlan。
SCID小鼠获自Harlan。
人胚肾293T(HEK293T)细胞获自ATCC。
所有其他试剂和溶剂都获自已知的供应商。
小鼠中的药代动力学研究：
在30只雌性Balb/C小鼠(23-25克)中确定了PTX、PTX-PEG和PTX-PEG-ALN的药代动力学。将小鼠随机分为三组，每组10只动物。通过尾静脉向用5％异氟烷气体(在密闭的罐子(cage)里与O2混合)麻醉的小鼠施用150μL的1∶1∶8乙醇∶Cremophor EL∶盐水中的PTX、PBS pH6中的如本文描述的PTX-PEG缀合物或PBS pH6中如本文描述的PTX-PEG-ALN缀合物(剂量：相当于10mg/Kg PTX)。在预定时间处，用肝素化的毛细管从两只动物的眼窝后静脉丛/窦采集两个血液样品(150μL)，并随后以1,500g持续15分钟离心。向50μL的血浆添加350μL的CH3CN用于蛋白沉淀，并以20,000g持续5分钟离心所得混合物。收集并冷冻干燥300μL等份的上清液。将残余物溶解于50μL的CH3OH并在上文报道的条件下通过RP-HPLC分析。对于PTX-PEG和PTX-PEG-ALN缀合物，冷冻干燥后的残余物也通过与2％NaOH2N溶液一起孵育被水解，如以上报道的。
mCherry-感染的人MDA-MB-231和鼠4T1乳腺癌细胞系的产生：
从pART7-mCherry(由来自Tel Aviv University的A.Avni惠赠)亚克隆mCherry到pQCXIP(Clontech)中。用pQC-mCherry和相容的包装质粒(pMD.G.VSVG和pGag-pol.gpt)共转染人胚肾293T(HEK293T)细胞。转染之后四十八(48)小时，收集了包含pQC-mCherry逆转录病毒粒子的上清液。用逆转录酶病毒粒子培养基感染4T1和MDA-MB-231细胞，并在感染后的48小时，通过嘌呤霉素抗性选择mCherry阳性细胞。
PTX-PEG-ALN缀合物的抗肿瘤活性的评价：
通过用100μl的4×105mCherry-标记的4T1细胞胫骨内注射Balb/c雌性小鼠建立乳腺癌的同基因小鼠模型。在肿瘤细胞接种之后1天，开始治疗。将小鼠随机分为9组(n＝6只小鼠/组)并静脉(i.v.)注射100μl PTX(15mg/kg)、ALN(35mg/kg)、作为游离药物的PTX和ALN的组合、和当量浓度的PTX-PEG、PEG-ALN或PTX-PEG-ALN缀合物。用市售的PTX媒介物1∶1∶8乙醇∶Cremophor EL∶盐水或盐水静脉注射的小鼠被用作对照。
通过用100μl的1×105mCherry-标记的MDA-MB-231细胞胫骨内注射雌性SCID小鼠建立乳腺癌的异种移植小鼠模型。
在肿瘤细胞接种之后10天开始治疗，此时大部分小鼠具有指示肿瘤摄入的荧光信号。将小鼠分为5组(n＝6只小鼠/组)且所有组的平均荧光强度大约相等。将这些组随机分配并接受100μl PTX(15mg/kg)+ALN(35mg/kg)、PTX(7.5mg/kg)+ALN(17.5mg/kg)、当量浓度的PTX-PEG-ALN缀合物、和PTX-媒介物或盐水对照的静脉(i.v.)注射。每隔一天通过尾静脉静脉注射用于两种小鼠模型的所有处理，执行5次注射。通过CRITMMaestro非侵入性的活体成像系统监测肿瘤发展。在结束时，移除并分析胫骨，如下文描述的。数据表示为平均值±SEM。
FITC标记的PEG、PTX-PEG、PEG-ALN和PTX-PEG-ALN缀合物的身体分布：
对胫骨中具有MDA-MB-231肿瘤的SCID小鼠注射i.v.(静脉内地)FITC-标记的PEG和FITC-标记的PTX-PEG、PEG-ALN和PTX-PEG-ALN缀合物。通过测量荧光强度信号在不同的时间点(0、2、4、6和8小时)评价缀合物在肿瘤中的积聚。在结束时(8小时后)，切除并成像肿瘤、器官和骨。使用非侵入性成像系统(CRI MaestroTM)成像器官。使用对肿瘤和其他组织上定义的感兴趣区域(ROI)测量确定荧光。通过肿瘤的荧光强度和正常皮肤的荧光强度之间的比确定时间依赖的肿瘤对比特征。数据表示为平均值±标准差(s.d.)(n＝3)。
通过流式细胞术测量循环内皮细胞(CEC)和循环内皮祖细胞(CEP)：
通过眼窝后静脉窦取血从麻醉的小鼠获得血液。使用流式细胞术定量CEC和CEP，如在Shaked等人(在Cancer Cell2005；7：101-111中)描述的。简言之，处理后24小时，将血液收集在含有EDTA的管中以避免凝血。单克隆抗体被用于检测具有以下抗原表型的CEC和CEP群体：CD13+/VEGFR2+/CD45-/dim。CEP群体也是CD117+。在一些实验中使用核染色以排除血小板或细胞碎片。7-氨基放线菌素D(7AAD)被用于区别凋亡的和死亡的细胞与活的细胞。红细胞溶解之后，分析了细胞悬液并获得至少200,000细胞每样品。当足够数目的事件(即＞50，典型地50-150)被收集在未处理的对照动物中的CEC和CEP的枚举门(enumeration gate)内时，分析被认为是提供信息的。
确定了染色的细胞的百分数并与适合的阴性对照比较。阳性染色被定义为强于非特异性背景染色。
在Cyan ADP流式细胞分析仪(Beckman Coulter)上执行流式细胞术研究并用Summit(Beckman Coulter)软件分析。数据表示为平均值±平均值的标准误差(SEM)。
白血细胞(WBC)计数：
通过眼窝后静脉窦取血从麻醉的小鼠获得血液。处理后二十四小时，将血液收集在含有0.1M EDTA的管中以避免凝血。从小鼠中取出血液后不到五分钟计数样品。将10μl的血液样品与90μl的追踪溶液(DDW中1％的乙酸)混合，并通过Z1
Figure BDA0000455687210000771
Particle Counter(Beckman CoulterTM)计数细胞。数据表示为平均值±s.e.m.。
免疫组织化学研究：
通过标准方法使用4％多聚甲醛固定、随后在EDTA中脱钙及石蜡包埋的样品执行胫骨中肿瘤的免疫组织化学分析。将4μm的石蜡切片去石蜡、再水化并通过苏木精和伊红(H&E)染色。关于CD34染色，在蒸汽压力锅(Decloaking Chamber，BioCare Medical，Walnut Creek，CA)中将载玻片去石蜡并用10mM柠檬酸盐缓冲液，pH＝6.0持续20分钟预处理。
于室温在水化室中执行所有另外的步骤。用Peroxidase Block(Merck，Germany)持续10分钟覆盖载玻片以猝灭内源过氧化物酶活性，随后通过与50mM Tris-HCl，pH7.4中2％的马血清一起持续30分钟孵育以封闭非特异性结合位点。于4。，将大鼠抗-鼠CD34第一抗体(MEC14.7 1∶50稀释；Abcam，Cambridge，MA)施加到Tris-HCl，pH7.4中的1％的兔血清白蛋白过夜。在50mM TrisHCl，pH7.4中洗涤载玻片并持续30分钟施加兔抗大鼠抗体(1∶750稀释；Vector Laboratories，CA，USA)。在进一步洗涤之后，使用HistoMark TrueBlue过氧化物酶体系(KPL，USA)根据制造商的使用说明显影免疫过氧化物酶染色并用番红复染色。如先前描述的计算微血管密度(MVD)(Weidner等人，NEngl J Med1991；324：1-8)。
统计：
体内数据表示为平均值±s.e.m.。使用非配对的t-检验确定统计显著性。P＜0.05被认为统计显著。所有统计检验均为双侧的。
结果
药代动力学研究：
在小鼠中确定了溶解于1∶1∶8乙醇∶Cremophor EL∶盐水的PTX和示例性缀合物PTX-PEG和PTX-PEG-ALN的药代动力学。通过RP-HPLC评价PTX的血清水平并将获得的数据展示在图14中。如在图14中显示的，在游离PTX施用之后，记录到高水平的药物，然而，在注射后5分钟，PTX浓度急剧下降，并在60分钟时是不可检测的。相反，两种缀合物显示了明显的半衰期延长，并在PTX-PEG注射的3小时后及在PTX-PEG-ALN注射的24小时后具有可检测的PTX水平。特别地，PTX、PTX-PEG和PTX-PEG-ALN的清除半衰期(T1/2β)分别为15.1分钟、77.9分钟及85.5分钟。
以下的表2总结了这些研究中获得的药代动力学参数，并清楚地显示了PTX-PEG和PTX-PEG-ALN缀合物的延长的血液循环。
表2
Figure BDA0000455687210000781
如在表2中显示的，PTX-PEG和PTX-PEG-ALN的清除半衰期(T1/2β)分别为77.9分钟和85.5分钟，其相对于游离PTX的15.1分钟是显著的延长。因此，PTX-PEG和PTX-PEG-ALN的曲线下面积(AUC)也是增加的，导致分别比游离PTX的AUC值大13倍和30倍的值。
体内肿瘤积聚和身体分布：
使用非侵入性荧光成像技术监测FITC-标记的PEG、PTX-PEG、PEG-ALN和PTX-PEG-ALN缀合物的实时分布和肿瘤积聚。用FITC-标记的缀合物静脉注射胫骨中具有MDA-MB-231-mCherry乳腺癌肿瘤的小鼠。在缀合物的施用之后，小鼠立即变为完全荧光的。半定量的时间依赖性肿瘤/背景对比特征源自肿瘤和正常的皮肤区域内相等面积的平均荧光强度，并在图13A中展示。如本文显示的，测试的FITC-标记的缀合物逐渐地并优先地在肿瘤部位积聚。注射后8小时后，切除肿瘤和主要器官用于离体成像以确定组织分布，如在图13B中展示的。如在那里显示的，除了肿瘤之外，由于肾排泄，所有测试的缀合物的摄入主要在肾组织中。观察到PEG-ALN和PTX-PEG-ALN缀合物在骨中的优先积聚，显示ALN保持其与骨矿物质的结合能力。
对胫骨中同基因4T1-mCherry鼠乳腺癌的抗肿瘤疗效和毒性：
评价了静脉注射之后PTX-PEG-ALN缀合物对胫骨中同基因mCherry标记的4T1鼠乳腺癌的抗肿瘤疗效。用MTD的PTX和当量浓度的缀合物处理小鼠。使用荧光成像系统(CRITM Maestro)非侵入性地监测肿瘤生长。
如在图15A-D中展示的，在用PTX-PEG和PTX-PEG-ALN缀合物处理的小鼠中记录到显著的肿瘤生长抑制。在第15天，当处死小鼠时，与盐水处理的小鼠相比，PTX-PEG-ALN和PTX-PEG缀合物分别抑制肿瘤生长48％和37％(见，图15A)。ALN的处理有剧毒并在游离ALN-处理的小鼠和游离ALN+PTX的组合处理的小鼠二者中的2次注射内造成严重的体重下降和死亡(见，图15C)。因此，在这些组中，肿瘤的发展未能够被确定。相比于游离ALN，用PEG-ALN缀合物处理的小鼠未减轻体重。在任何其他处理的组中未记录到进一步的体重下降(见，图15C)。
通过胫骨的H&E染色的代表性组织切片显示了大部分PEG缀合物处理的小鼠都具有完整的皮质骨和松质骨(图15D)。然而，在对照组和在用PTX处理的小鼠中，肿瘤充斥在骨髓空间并破坏了松质骨和皮质骨二者。与小鼠的所有处理组中观察到的较小的肿瘤和减少的坏死百分数相比，在小鼠的对照组中，由于并入坏死缺氧的核的较大尺寸的肿瘤，观察到增加的坏死百分数。
如在图16A中显示的，用测试的缀合物或用PTX媒介物处理的小鼠中WBC计数都在正常范围内，并与用盐水注射的对照小鼠的WBC计数相似。仅在游离PTX处理的小鼠中，记录到WBC计数的显著的降低。由于游离ALN和游离ALN和PTX的组合的严重的毒性作用，其在第11天之前造成死亡，因此未能从这些小鼠组获得关于WBC计数的数据。
CD34染色的石蜡包埋切片的免疫组化分析在图16B中展示并显示了与盐水处理的对照组相比，用PTX、PTX-PEG和PTX-PEG-ALN处理的小鼠中微血管密度(MVD)约50％的显著下降，存在PTX-PEG-ALN缀合物。
在显示本文描述的缀合物的抗血管生成活性的体外结果之后，测试了不同处理对胫骨中具有4T1-mCherry腺癌的小鼠中的血液循环中的CEC和CEP群体的影响。
有活性的CEP已显示与血管生成相关。用紫杉醇化学治疗剂处理它们之后24小时，观察到小鼠的外周血中的有活性的CEP的数目的大幅度增加。发现此类细胞大量存在于处理的肿瘤部位，并因此可解释治疗之后，血管生成和肿瘤再生的减少。另外，凋亡的CEC可能代表血管损伤和/或转换(turnover)和重塑的间接标志物。
使用多参数流式细胞术分析了凋亡的CEC和有活性的CEP二者的群体，并将获得的数据展示在图17A和17B中。如在图17A中显示的，在所有的处理中，血液中的凋亡CEC计数都不存在差异。然而，在用PTX-PEG-ALN缀合物处理的小鼠中，血液中的凋亡CEC计数存在显著增加。如在图17B中显示的，与PTX-PEG-ALN或PTX-PEG治疗相反，观察到PTX治疗之后有活性的CEP的增加。这些结果提供了对由如本文描述的PTX-PEG-ALN缀合物呈现的抗血管生成活性的进一步的支持。
对胫骨中MDA-MB-231-mCherry乳腺癌的异种移植模型的抗肿瘤疗效和毒性：
还评价了静脉注射之后如本文描述的示例性的缀合物对胫骨中mCherry-标记的MDA-MB-231乳腺癌的异种移植的小鼠模型的抗肿瘤影响。结果展示在图18A-D中并显示了与盐水对照小鼠相比，用PTX-PEG-ALN缀合物处理的小鼠呈现较佳的抗肿瘤疗效，肿瘤生长的50％的抑制(见，图18A)。
如在18B中显示的，PTX-PEG-ALN缀合物未引起体重减轻。然而，游离PTX和ALN的MTD(最小治疗剂量)的组合是剧毒的，并在一次处理之内引起死亡。用游离PTX和ALN的组合的一半剂量的处理也是剧毒的并引起几乎达到20％下降的严重体重减轻，但在撤消治疗之后得到恢复(图18B)。
如在图18C中显示的，胫骨中MDA-MB-231-mCherry肿瘤的石蜡包埋的切片的代表性H&E染色显示了与来自对照小鼠中的mCherry-4T1肿瘤的H&E相似，肿瘤充斥骨髓、破坏骨并渗透进入软组织和近端关节。相比之下，用PTX-PEG-ALN缀合物处理的小鼠具有完整的皮质骨和松质骨。在对照小鼠中，肿瘤广泛地入侵骨髓，破坏骨小梁。当用本文公开的缀合物处理时，骨看起来正常，具有轻微的不规则的小梁轮廓。
如在图18D中显示的，与在用PTX-PEG-ALN缀合物处理的小鼠中观察到的较小的肿瘤和减少的总体坏死百分数相比，在小鼠的对照组中，由于具有缺氧的核的较大尺寸的肿瘤，观察到总体增加的坏死百分数。相反地，在仅用缀合物处理的小鼠中观察到骨髓中显著坏死的核，而在对照小鼠中，骨髓内的肿瘤是有活性的，并未观察到坏死。
用缀合物或游离药物的组合处理的小鼠的WBC计数与用盐水或PTX-媒介物处理的对照小鼠是可比的(见，图19A)。
如在图19B中显示的，CD34染色的石蜡包埋切片的免疫组织化学分析显示了在用游离PTX+ALN的组合和PTX-PEG-ALN缀合物处理的小鼠中，PTX-PEG-ALN缀合物的处理和游离PTX+ALN的组合的处理分别存在约73％和54％的微血管密度(MVD)的显著降低。
图20A和20B展示了不同的处理对该小鼠模型中CEC和CEP的血液水平的影响。在那里显示了，与4T1相反，在MDA-MB-231小鼠模型中，当与其他组相比，仅在用PTX-媒介物处理的组中存在凋亡的CEC的大量增加(见，图20A)。另外，与4T1肿瘤模型类似，在MDA-MB-231肿瘤中，与其他处理相反，观察到用PTX-PEG-ALN缀合物治疗之后有活性的CEP的下降，表明缀合物具有抗血管生成作用(见，图20B)。
概括地说，在体内进行的研究中获得的数据显示了根据本发明一些实施方案的示例性的缀合物，如本文描述的PTX-PEG-ALN缀合物在鼠同基因和人异种移植二者的小鼠模型中显示实质的抗肿瘤效果。在其安全性方面与游离的药物相比，缀合物的优越性是明显的。在用游离PTX+ALN的组合处理的两种小鼠模型中，在首次注射内引起死亡。即使用一半剂量的游离PTX+ALN处理也是剧毒的并造成体重20％的降低，而用PTX-PEG-ALN缀合物的处理则未造成体重的降低。同样，与游离ALN相比，用PEG-ALN缀合物处理的小鼠未减轻体重，表明与PEG的缀合增加了ALN的安全性，并未妨碍其骨靶向亲和力。不希望被任何特定的理论束缚，假定尽管游离ALN通过血管扩散并影响除了骨以外的正常健康的组织，并引起毒性，缀合物则仅靶向骨。
在用示例性的PTX-PEG-ALN缀合物处理的小鼠中的WBC水平与对照小鼠中的WBC水平是可比的，而用游离PTX处理的小鼠中，呈现了WBC水平的显著下降。这些结果显示了PTX与PEG和ALN的缀合降低了PTX对骨髓的毒性作用。
关于4T1-mCherry和mCherry-MDA-MB-231二者的模型的H&E染色显示了用示例性的PTX-PEG-ALN缀合物处理的小鼠中的完整的骨。然而，在对照小鼠中，骨被破坏，且肿瘤渗透进入近端软组织和近端关节。尽管与用示例性的PTX-PEG-ALN缀合物处理的小鼠相比，在对照处理的小鼠中，总体坏死百分数是增加的，在缀合物处理的小鼠的骨髓中则观察到特定较大的坏死区域。这些发现表明如设计的示例性的PTX-PEG-ALN缀合物靶向骨内，并在骨内是有活性的。与盐水处理的对照小鼠相比，PEG-ALN处理的小鼠的H&E染色显示了更受保护的骨。
对4T1和MDA-MB-231肿瘤切片实施的免疫组织化学CD34染色显示了PTX-PEG-ALN缀合物针对肿瘤内皮细胞并抑制血管生成，表明由如本文描述的缀合物引起的抗肿瘤作用是通过破坏向肿瘤的血液供给介导的。这些数据佐证了由示例性的缀合物呈现的体外抗血管生成活性和血管生成细胞标志物，凋亡的CEC和有活性的CEP的体内评价。
总的说来，这些研究显示了由如本文描述的缀合物呈现的优越的疗效和降低的毒性，特别是与游离PTX相比。
尽管已联合其特定的实施方案描述了本发明，明显的是，许多可替代的选择、修改和变化对本领域技术人员将是明显的。因此，本发明预期包括落入所附权利要求书的精神和广泛的范围内的所有此类可替代的选择、修改和变化。
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请在本文通过引用整体被并入本说明书，其程度如同每一个单独的出版物、专利或专利申请明确地并单独地指出通过引用被并入本文的相同的程度。另外，本申请中任何参考文献的列举或确认不应被解释为承认此参考文献作为本发明的现有技术是可用的。就使用的每部分标题而言，它们不应被解释为必然限制。
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Claims (48)

1.一种缀合物，所述缀合物包含聚合物骨架，所述聚合物骨架具有与其附接的治疗活性剂和骨靶向部分的聚合物骨架，所述治疗活性剂与所述聚合物骨架的一端附接且所述骨靶向部分经由以树枝状结构排列的支化单元与所述聚合物骨架的另一端附接，其中所述骨靶向部分与所述聚合物的摩尔比为至少2∶1，所述缀合物由以下的通式I表示：
D-L1-[B*]-P-[B1]m0-[B2]m1-[B3]m2......[Bg-L2]mg-1-[T]mg
式I
其中：
D是所述治疗活性剂；
P是所述聚合物骨架；
T是所述骨靶向部分；
B*是支化单元或不存在；
L1是连接部分，将所述治疗活性剂连接至所述聚合物骨架的所述一端；
L2是第二连接部分，经由所述支化单元将所述靶向部分连接至所述聚合物的所述另一端，或不存在；
B1、B2、B3...Bg各自独立地是支化部分，其中B1、B2、B3...Bg一起形成具有所述树枝状结构的所述支化单元；
m是等于2、3、4、5或6的整数，代表所述树枝状结构的分支数目；并且
g是从1至20范围的整数，代表所述树枝状结构的代的数目。
2.一种缀合物，所述缀合物包含聚合物骨架，所述聚合物骨架具有与其附接的治疗活性剂和骨靶向部分的聚合物骨架，所述治疗活性剂与所述聚合物骨架的一端附接且所述骨靶向部分经由支化单元与所述聚合物骨架的另一端附接，其中所述骨靶向部分与所述聚合物的摩尔比为至少2∶1。
3.根据权利要求2所述的缀合物，其中所述支化单元具有树枝状结构。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的缀合物，其中所述支化单元包括至少一个三官能部分，所述三官能部分包括至少3个官能团，每一个所述官能团独立地选自由以下组成的组：胺、羧酸酯、硫代羧酸酯、羟基、硫醇、氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯、磺酸酯、亚磺酸酯、磺酰胺、膦酸酯、亚膦酸酯、磷酰基、脲和硫脲。
5.根据权利要求4所述的缀合物，其中所述三官能部分选自由以下组成的组：谷氨酸、β-谷氨酸、氨基己二酸、天冬氨酸、赖氨酸和3-羟基-2-胺丙醇。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的缀合物，其中所述治疗活性剂选自由以下组成的组：抗血管生成剂和抗癌剂。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的缀合物，其中所述治疗活性剂可用于治疗骨相关的疾病或疾患。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的缀合物，其中所述治疗活性剂选自由以下组成的组：紫杉醇、2-甲氧基雌二醇、普啉司他、巴马司他、BAY12-9566、羧胺三唑、CC-1088、乙酸右美沙芬、乙酸二甲基呫吨酮、内皮抑素、IM-862、马马司他、基质金属蛋白酶、青霉胺、PTK787/ZK222584、RPI.4610、乳酸角鲨胺、SU5416、沙利度胺、TNP-470、考布他汀、他莫西芬、COL-3、新伐司他、BMS-275291、SU6668、抗-VEGF抗体、Medi-522(Vitaxin II)、CAI、白介素-12、IM862、阿米洛利、血管抑
Figure FDA0000455687200000021
蛋白、血管抑素K1-3、血管抑素K1-5、卡托普利、DL-α-二氟甲基鸟氨酸、盐酸DL-α-二氟甲基鸟氨酸、
Figure FDA0000455687200000022
内皮抑素TM蛋白、烟曲霉素、除莠霉素A、4-羟基苯基视黄酰胺、胡桃醌、层粘连蛋白、层粘连蛋白六肽、层粘连蛋白五肽、熏草菌素A、甲羟孕酮、乙酸甲羟孕酮、米诺环素、盐酸米诺环素、胎盘核糖核酸酶抑制剂、苏拉明、苏拉明钠盐、人血小板凝血酶敏感蛋白、中性粒细胞、针对特定促血管新生因子和/或它们的受体的单克隆抗体、多种促血管新生生长因子受体的酪氨酸激酶抑制剂、mTOR的抑制剂、干扰素、IL-12、EMD121974(西仑吉肽)、Vitaxin；角鲨胺、COX-2抑制剂、PDGFR抑制剂、NM3和2-ME2。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的缀合物，其中所述治疗活性剂是紫杉醇(PTX)。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的缀合物，其中所述治疗活性剂经由生物可裂解的连接部分与所述聚合物骨架附接。
11.根据权利要求10所述的缀合物，其中所述生物可裂解的连接部分选自由以下组成的组：水解可裂解的连接部分、pH敏感的连接部分和酶促可裂解的连接部分。
12.根据权利要求10所述的缀合物，其中所述生物可裂解的部分是水解可裂解的连接部分。
13.根据权利要求11和12中任一项所述的缀合物，其中所述水解可裂解的连接部分包含酯键。
14.根据权利要求13所述的缀合物，其中所述水解可裂解的连接部分源自琥珀酸。
15.根据权利要求11所述的缀合物，其中所述酶促可裂解的连接部分被患病的骨组织中过量表达的酶裂解。
16.根据权利要求15所述的缀合物，其中所述酶是胞外酶。
17.根据权利要求16所述的缀合物，其中所述酶促可裂解的连接部分被选自由以下组成的组的酶裂解：组织蛋白酶K、组织蛋白酶D、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L、豆球蛋白、MMP-2和MMP-9。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的缀合物，其中所述聚合物骨架源自选自由以下组成的组的聚合物：聚(亚烷基二醇)、聚(2-烷基-2-噁唑啉)和包含聚(亚烷基二醇)和/或聚(2-烷基-2-噁唑啉)的共聚物。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的缀合物，其中所述聚合物骨架源自聚(亚烷基二醇)。
20.根据权利要求19所述的缀合物，其中所述聚合物骨架源自聚(乙二醇)(PEG)。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的缀合物，其中所述骨靶向部分是二膦酸盐部分。
22.根据权利要求21所述的缀合物，其中所述二膦酸盐部分选自由以下组成的组：阿仑膦酸盐、英卡膦酸盐、氯膦酸盐、替鲁膦酸盐、依替膦酸盐、伊班膦酸盐、奈立膦酸盐、奥帕膦酸盐、利塞膦酸盐、吡膦酸盐、帕米膦酸盐和唑来膦酸盐。
23.根据权利要求21所述的缀合物，其中所述二膦酸盐是阿仑膦酸盐。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的缀合物，其中所述聚合物是聚(乙二醇)，所述骨靶向部分是阿仑膦酸盐，且所述治疗活性剂是紫杉醇。
25.根据权利要求24所述的缀合物，其中所述支化单元具有树枝状结构并包含以所述树枝状结构排列的至少3个β-谷氨酸部分。
26.根据权利要求24和25中任一项所述的缀合物，其中所述紫杉醇经由水解可裂解的连接部分与所述末端骨架附接。
27.根据权利要求26所述的缀合物，其中所述水解可裂解的连接部分包含酯键。
28.根据权利要求27所述的缀合物，所述缀合物具有以下结构：
其中n是从10至1000范围的整数。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的缀合物，所述缀合物还包含与其附接的标记剂。
30.根据权利要求29所述的缀合物，其中所述标记剂选自由以下组成的组：荧光剂、放射性剂、磁化剂、发色团、生物发光剂、化学发光剂、磷光剂和重金属团簇。
31.一种药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的权利要求1-30中任一项所述的缀合物和药学上可接受的载体。
32.根据权利要求31所述的药物组合物，所述药物组合物被包装在包装材料中并在所述包装材料中或所述包装材料上用印刷物说明所述药物组合物用于治疗骨相关的疾病或疾患的用途。
33.根据权利要求32所述的药物组合物，其中所述缀合物包括标记剂，所述组合物被包装在包装材料中并在所述包装材料中或所述包装材料上用印刷物说明所述组合物用于监测骨相关的疾病或疾患的用途。
34.一种治疗有相应需要的受试者中骨相关的疾病或疾患的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-31中任一项所述的缀合物。
35.一种监测受试者中骨相关的疾病或疾患的方法，所述方法包括：
向所述受试者施用权利要求29和30中任一项所述的缀合物；和采用成像技术以监测身体或其部分内的所述缀合物的分布。
36.权利要求1-30中任一项所述的缀合物作为药剂的用途。
37.权利要求1-30中任一项所述的缀合物在制造用于治疗骨相关的疾病或疾患的药剂中的用途。
38.权利要求29和30中任一项所述的缀合物作为诊断剂的用途。
39.权利要求29和30中任一项所述的缀合物在制造用于监测骨相关的疾病或疾患的诊断剂中的用途。
40.根据权利要求1-30中任一项所述的缀合物，所述缀合物被鉴定用于治疗骨相关的疾病或疾患。
41.根据权利要求29和30中任一项所述的缀合物，所述缀合物被鉴定用于监测骨相关的疾病或疾患。
42.根据权利要求32、33、34、35、37和39至41中任一项所述的组合物、方法、用途或缀合物，其中所述疾病或疾患与血管生成相关。
43.根据权利要求42所述的组合物、方法、用途或缀合物，其中所述疾病或疾患选自由以下组成的组：骨转移和骨癌。
44.一种缀合物，所述缀合物包含聚合物骨架，所述聚合物骨架具有与其一端附接的二膦酸盐部分的聚合物骨架，所述二膦酸盐经由支化单元与所述聚合物骨架附接，其中所述二膦酸盐与所述聚合物的摩尔比为至少2∶1。
45.根据权利要求44所述的缀合物，其中所述聚合物骨架源自聚(亚烷基二醇)。
46.一种缀合物，所述缀合物包含聚合物骨架，所述聚合物骨架具有与其附接的治疗活性剂的聚合物骨架，所述治疗活性剂与所述聚合物骨架的一端附接，其中所述聚合物骨架还包含经由支化单元与所述聚合物骨架的另一端附接的反应基团，其中所述官能团与所述聚合物的摩尔比为至少2∶1。
47.根据权利要求46所述的缀合物，其中所述反应基团可用于将靶向部分附接至所述缀合物。
48.一种制备权利要求1-30中任一项所述的缀合物的方法，所述方法包括：
提供权利要求44所述的缀合物；
提供所述治疗活性剂；和
将所述治疗活性剂与权利要求44所述的缀合物附接，从而制备所述缀合物。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106687142A (zh) * 2014-09-09 2017-05-17 雷蒙特亚特特拉维夫大学有限公司 基于酶响应性两亲性peg‑树枝化基元杂化物的胶束递送系统
CN107106711A (zh) * 2014-10-17 2017-08-29 Scv公司 用于诊断和治疗骨病的共轭二膦酸盐
CN107106709A (zh) * 2014-09-26 2017-08-29 南非核能源有限公司 靶向肿瘤细胞的含代谢物和epr剂的放射性药物缀合物
CN109010089A (zh) * 2018-07-13 2018-12-18 安徽医科大学 一种用于龋齿预防和浅龋治疗的纳米材料的制备方法
US10869939B2 (en) 2015-08-03 2020-12-22 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Delivery system in micellar form having modular spectral response based on enzyme-responsive amphiphilic PEG-dendron hybrid polymers

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2600901B1 (en) 2010-08-06 2019-03-27 ModernaTX, Inc. A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof
ES2737960T3 (es) 2010-10-01 2020-01-17 Modernatx Inc Nucleósidos, nucleótidos y ácidos nucleicos modificados y sus usos
AU2012236099A1 (en) 2011-03-31 2013-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
WO2012153297A1 (en) 2011-05-11 2012-11-15 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Targeted polymeric conjugates and uses thereof
CA2843503C (en) * 2011-08-12 2020-12-22 Ulrich Hersel Polymeric hyperbranched carrier-linked prodrugs
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP3682905B1 (en) 2011-10-03 2021-12-01 ModernaTX, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
EP2791160B1 (en) 2011-12-16 2022-03-02 ModernaTX, Inc. Modified mrna compositions
US9303079B2 (en) 2012-04-02 2016-04-05 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
AU2013243948A1 (en) 2012-04-02 2014-10-30 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins associated with human disease
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
EP4074834A1 (en) 2012-11-26 2022-10-19 ModernaTX, Inc. Terminally modified rna
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
CA2926218A1 (en) 2013-10-03 2015-04-09 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
GB201418068D0 (en) 2014-10-13 2014-11-26 Cambridge Entpr Ltd Polymer
EP3228650B1 (en) * 2014-12-04 2022-03-09 Delta-Fly Pharma, Inc. Novel peg derivative
WO2017079260A1 (en) * 2015-11-02 2017-05-11 University Of Rochester Phosphonate-chloroquine conjugates and methods using same
US11786607B2 (en) 2017-06-15 2023-10-17 Modernatx, Inc. RNA formulations
WO2019046809A1 (en) 2017-08-31 2019-03-07 Modernatx, Inc. METHODS OF MANUFACTURING LIPID NANOPARTICLES
EP3684463A4 (en) 2017-09-19 2021-06-23 Neuroenhancement Lab, LLC NEURO-ACTIVATION PROCESS AND APPARATUS
US11717686B2 (en) 2017-12-04 2023-08-08 Neuroenhancement Lab, LLC Method and apparatus for neuroenhancement to facilitate learning and performance
WO2019133997A1 (en) 2017-12-31 2019-07-04 Neuroenhancement Lab, LLC System and method for neuroenhancement to enhance emotional response
US11364361B2 (en) 2018-04-20 2022-06-21 Neuroenhancement Lab, LLC System and method for inducing sleep by transplanting mental states
CN113382683A (zh) 2018-09-14 2021-09-10 纽罗因恒思蒙特实验有限责任公司 改善睡眠的系统和方法
CN109674789B (zh) * 2019-01-23 2021-10-26 广东银珠医药科技有限公司 羧胺三唑与谷氨酸摄取与代谢抑制剂在抗肿瘤中的用途
US11786694B2 (en) 2019-05-24 2023-10-17 NeuroLight, Inc. Device, method, and app for facilitating sleep
CN110865092A (zh) * 2019-12-10 2020-03-06 中国科学院金属研究所 利用x射线荧光光谱表征高温合金成分分布的原位分析方法
CN114712310A (zh) * 2022-01-18 2022-07-08 中国人民解放军空军军医大学 可高效入胞的智能骨靶向递送药物的制备方法及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009141823A2 (en) * 2008-05-22 2009-11-26 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Conjugates of a polymer, a bisphosphonate and an anti-angiogenesis agent and uses thereof in the treatment and monitoring of bone related diseases
CN101835496A (zh) * 2007-10-23 2010-09-15 尼克塔治疗公司 靶向羟基磷灰石的多臂聚合物以及由其制造的偶联物

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX9504664A (es) 1994-03-07 1997-05-31 Dow Chemical Co Conjugados de dendrimeros bioactivos y/o dirigidos.
US6441025B2 (en) 1996-03-12 2002-08-27 Pg-Txl Company, L.P. Water soluble paclitaxel derivatives
DE19624705A1 (de) 1996-06-20 1998-01-08 Deutsches Krebsforsch Dendrimere auf Saccharid-Basis
EP0981555A4 (en) 1997-02-18 2005-01-12 Donald A Tomalia CONVERGENT SELF-SPONSORING POLYMERIZATION
US7005124B2 (en) 1997-07-07 2006-02-28 Dendritic Nanotechnologies, Inc. Dendritic-antineoplastic drug delivery system
JP2001251602A (ja) 2000-03-03 2001-09-14 Matsushita Electric Ind Co Ltd 番組受信装置および送信装置
WO2004062588A2 (en) 2003-01-06 2004-07-29 University Of Utah Water-soluble polymeric bone-targeting drug delivery system
US7332164B2 (en) 2003-03-21 2008-02-19 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Heterobifunctional polymeric bioconjugates
ITMI20030743A1 (it) 2003-04-11 2004-10-12 Biopeg Ltd Derivati di polietilenglicoli che rilasciano ossido nitrico.
WO2009141826A2 (en) 2008-05-22 2009-11-26 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Novel conjugates of polymers having a therapeutically active agent and an angiogenesis targeting moiety attached thereto and uses thereof in the treatment of angiogenesis related diseases
EP2300021A4 (en) 2008-05-22 2014-10-08 Univ Ramot CONJUGATE OF A POLYMER, ANTI-ANGIOGENESE AGENT AND TARGETING REST, AND USES THEREOF FOR THE TREATMENT OF BONE-RELATED ANGIOGENESIS STATES
IT1398857B1 (it) 2009-06-10 2013-03-21 Univ Padova Coniugati polimerici fosfolipidi
WO2012153297A1 (en) 2011-05-11 2012-11-15 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Targeted polymeric conjugates and uses thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101835496A (zh) * 2007-10-23 2010-09-15 尼克塔治疗公司 靶向羟基磷灰石的多臂聚合物以及由其制造的偶联物
WO2009141823A2 (en) * 2008-05-22 2009-11-26 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Conjugates of a polymer, a bisphosphonate and an anti-angiogenesis agent and uses thereof in the treatment and monitoring of bone related diseases

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106687142A (zh) * 2014-09-09 2017-05-17 雷蒙特亚特特拉维夫大学有限公司 基于酶响应性两亲性peg‑树枝化基元杂化物的胶束递送系统
CN107106709A (zh) * 2014-09-26 2017-08-29 南非核能源有限公司 靶向肿瘤细胞的含代谢物和epr剂的放射性药物缀合物
CN107106709B (zh) * 2014-09-26 2021-04-06 南非核能源有限公司 靶向肿瘤细胞的含代谢物和epr剂的放射性药物缀合物
CN107106711A (zh) * 2014-10-17 2017-08-29 Scv公司 用于诊断和治疗骨病的共轭二膦酸盐
US10869939B2 (en) 2015-08-03 2020-12-22 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Delivery system in micellar form having modular spectral response based on enzyme-responsive amphiphilic PEG-dendron hybrid polymers
CN109010089A (zh) * 2018-07-13 2018-12-18 安徽医科大学 一种用于龋齿预防和浅龋治疗的纳米材料的制备方法
CN109010089B (zh) * 2018-07-13 2021-06-29 安徽医科大学 一种用于龋齿预防和浅龋治疗的纳米材料的制备方法

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