CN102740795B - 用于检测和治疗植入物松动和骨质溶解的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于检测、诊断及治疗骨质溶解和植入物松动的方法和组合物。
Description
根据35U.S.C.§119(e),本申请要求2009年9月9日提交的美国临时专利申请第61/276,213号的优先权。上述申请通过引用并入本文。
本发明得到了在由美国国家卫生研究院授予的基金号第R01AR053325号下的政府支持。美国政府具有本发明的某些权利。
发明领域
本发明涉及骨质溶解和植入物松动的领域。更具体地,本发明提供用于检测和治疗植入物松动和骨质溶解的组合物和方法。
发明背景
在整个说明书中引用了几篇出版物和专利文件,以描述本发明所属领域的发展状况。这些引文中的每一篇都通过引用并入本文,就像全文列出一样。
估计全世界每年进行150万例全关节成形术以治疗晚期关节病(Drees等,(2007)Nat.Clin.Pract.Rheumato1.,3:165-71)。对于全关节置换术,10年的总成功率是90%,同时接近10%的患者需要修正手术,其与较差的结果和较短的植入物存活持续时间有关(Santerre等,(2000)Can.J.Surg.,43:173-9)。认为,由产生自假体组件的接合表面(articulating surface)的磨损颗粒所引起的炎症代表了全关节置换术后的无菌植入物松动及临床失败的主要原因(Holt等,(2007)Clin.Orthop.Relat.Res.,460:240-52)。已证明,磨损颗粒使巨噬细胞活化且在骨-植入物界面诱导导致破骨细胞介导的植入物周围的骨质溶解的肉芽肿炎性反应,导致固定的失去。
非入侵式成像模式比如连续的X-射线和CT已被用于骨质溶解和植入物松动的临床诊断(Leopold等,(1999)Clin.Orthopaed.Rel.Res.,179-86)。这些方法在检测骨质溶解和相关的植入物固定的失去方面是有效的。然而,在骨质溶解的早期阶段,很难检测到骨骼改变且成像过程是昂贵的并伴随高辐射暴露,且需要更灵敏的技术以在大量的骨质溶解形成之前检测颗粒诱导的早期炎症。
发明概述
根据本发明,提供检测植入物松动的方法。在特定的实施方式中,方法包括向受治疗者施用包括至少一种水溶性聚合物和至少一种药学上可接受的载体的组合物,其中水溶性聚合物可操作地连接于至少一种显像剂且其中水溶性聚合物在植入物部位的存在指示植入物松动。在特定的实施方式中,水溶性聚合物是N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)共聚物。
根据本发明的另一方面,提供确定骨质溶解的增加的风险的方法(例如,提供诊断或预后)。在特定的实施方式中,方法包括向受治疗者施用包括至少一种水溶性聚合物和至少一种药学上可接受的载体的组合物,其中水溶性聚合物可操作地连接于至少一种显像剂且其中水溶性聚合物在受治疗者的部位的定位指示骨质溶解的增加的风险。在特定的实施方式中,受治疗者具有骨科(例如,关节置换术)和/或牙科植入物。在特定的实施方式中,水溶性聚合物是N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)共聚物。
在又一方面,提供抑制植入物松动的方法。在特定的实施方式中,方法包括向受治疗者施用包括至少一种水溶性聚合物和至少一种药学上可接受的载体的组合物,其中水溶性聚合物可操作地连接于至少一种治疗剂。在特定的实施方式中,治疗剂是抗炎治疗剂比如地塞米松。水溶性聚合物可经由可降解/可裂开的连接体(linker)比如pH-敏感的连接体可操作地连接于抗炎治疗剂。在特定的实施方式中,水溶性聚合物是N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)共聚物。此外,方法还可包括至少一种另外的抗炎治疗剂的施用。
根据本发明的另一方面,提供抑制受治疗者的骨质溶解的方法。在特定的实施方式中,方法包括向受治疗者施用包括至少一种水溶性聚合物和至少一种药学上可接受的载体的组合物,其中所述水溶性聚合物可操作地连接于至少一种治疗剂。在特定的实施方式中,治疗剂是抗炎治疗剂比如地塞米松。水溶性聚合物可经由可降解/可裂开的连接体比如pH-敏感的连接体可操作地连接于抗炎治疗剂。在特定的实施方式中,水溶性聚合物是N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)共聚物。此外,方法还可包括至少一种另外的抗炎治疗剂的施用。骨质溶解可以是在骨科(orthopedic)或牙科植入物的部位。
附图简述
图1是P-IRDye和P-Alexa的合成示意图。
图2提供P-Dex的化学结构。
图3提供在植入PBS(图3A和图3A-1)或PMMA颗粒(图3B和图3B-1)7天后的小鼠颅盖的代表性微-计算机断层摄影(micro-computer tomography,微-CT)图像。图3A-1和图3B-1分别是图3A和图3B中的选定区域的放大图像。与PBS处理的动物相比,植入PMMA颗粒的动物显示出骨吸收的有力证据。此外,在骨表面比骨体积(BS/BV)及骨厚度方面,两组之间有显著差异(p<0.05)。
图4提供抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色后的未脱钙颅盖(图4A和图4B)及苏木精和伊红(H&E)染色的脱钙颅盖组织切片(图4C和图4D)的代表性图像。未脱钙颅盖组织的TRAP染色显示出通过箭头标示的丰富的TRAP阳性组织的存在(图4B)(以40x放大)。脱钙后,颅盖切片是H&E染色的(图4C和图4D)。图4D中的双箭头标示病灶性(focal)骨吸收的区域(400x)。
图5提供植入磷酸盐缓冲盐水(PBS)或聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)后的活体光学成像。在植入PBS或PMMA后的第二天,经由尾静脉注射给予P-IRDye。在施用光学显像剂之前及在施用光学显像剂后的每一天(持续6天),对小鼠成像。在图5A中,上面一组表示来自PBS处理组的图像。较低的一组表示来自植入PMMA颗粒的组的图像。与PBS组相比,植入PMMA颗粒的动物在植入PMMA颗粒的颅盖区域中表现出更强且持续时间更长的NIR信号。图5B显示测量自所有小鼠的颅盖部位中一致的感兴趣区域(圆)的NIR信号强度。两组中的信号强度差异是统计学上显著的(p<0.05)。
图6提供了抗-Ly-6G(Gr-1,Gr1)、抗-F4/80、抗-CD11c和抗-P4HB抗体染色的来自植入PMMA颗粒的小鼠(用P-Alexa处理)的颅盖和邻近的软组织的冷冻切片的代表性共焦图像。每一组包括4个子图:抗体红染色、P-Alexa绿色荧光、DIC成像及三个的共定位。两组中的红色和绿色的共定位产生了黄色,其证明了在炎症部位HPMA共聚物缀合物被Ly-6G(Gr-1,Gr1)、F4/80或CD11c阳性细胞内化。以400x放大。
图7提供了来自在全身施用P-Alexa 24小时后分离自PMMA颗粒诱导的炎症部位的细胞的荧光激活细胞扫描(FACS)分析的代表性数据。直方图显示用在X-轴上指定的特定的抗体染色的强度(填充),及在相同的图上用同种型对照抗体染色的强度(线)。百分数表示抗体阳性细胞在P-Alexa阳性细胞中的百分比。图7A:25.12%P-Alexa阳性细胞是F4/80阳性的;图7B:35.15%P-Alexa阳性细胞是Ly-6G阳性的;图7C:9.73%P-Alexa阳性细胞是CD11c阳性的;图7D:<1%P-Alexa阳性细胞是P4HB阳性的。
图8显示了在培养的人单核细胞中P-Dex对抑制PMMA颗粒诱导的IL-1α和IL-1βmRNA的作用。相对持家基因GAPDH表示mRNA表达水平,且标准化成未处理的对照细胞,n=3。PMMA组的IL-1αmRNA水平显著高于游离Dex组和P-Dex组(p<0.05)。在游离Dex组和P-Dex组之间未检测到显著的差异性。PMMA组的IL-1βmRNA水平也高于(但不显著)游离Dex组和P-Dex组。
发明详述
本文证明N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)共聚物定位在肉芽肿炎症部位比如由磨损颗粒诱导的部位中。最近的数据表明HPMA共聚物(Duncan,R.(2003)Nature Rev.,2:347-60)选择性地在佐剂诱导的关节炎(AA)大鼠模型中的炎症部位积聚且在缀合造影剂时,共聚物可有效地使关节炎症部位成像(Wang等,(2007)Arthritis Res.Ther.,9:R2;Liu等,(2008)Pharm.Res.,25:2910-9)。在装载地塞米松(Dex,有效的抗炎糖皮质激素)时,在与相等剂量的游离Dex相比时,HPMA共聚物缀合物(P-Dex)提供优良且持久的炎症改善。事实上,HPMA共聚物体系被用于颗粒诱导的骨质溶解小鼠模型中且表明HPMA共聚物体系可有效地用于检测局部颗粒诱导的炎症及用于使治疗性抗炎剂靶向炎症部位以预防骨质溶解。用成像探针标记的HPMA共聚物可用于假体周围的骨质溶解的早期检测。该体系可适合于使用γ或正电子发射体作为哺乳动物(比如人)受治疗者的报告机制,以检测磨损颗粒诱导的植入物周围的肉芽肿的早期形成和骨质溶解的早期迹象。对于可能不与严重的炎症相关的晚期骨质溶解,具有靶向骨的部分的高分子载体可用于靶向早期骨损害的部位。
如上文所述,认为磨损颗粒诱导的炎症是全关节置换术后无菌植入物松动及临床失败的主要原因。由于经常缺乏症状,在植入失败之前的早期检测和干预存在着重大的挑战。为了解决这个问题,开发了基于HPMA共聚物的光学成像造影剂(例如,P-IRDye)并用于磨损颗粒诱导的炎症的检测。使用佐剂诱导的关节炎(AA)大鼠模型,生物相容的水溶性聚合物比如HPMA共聚物可特别定位在关节炎症的部位(Wang等(2004)Pharm.Res.,21:1741-9)。采用鼠骨质溶解模型研究磨损颗粒诱导的炎症,其中聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)颗粒被植入到瑞士韦伯斯特小鼠(Swiss Webster mice)的颅盖上。更具体地,改进已被广泛用于研究无菌植入物松动的标准小鼠颅盖骨质溶解模型(Kaar等,(2001)J.Orthop.Res.,19:171-8;von Knoch等,(2005)Biomaterials 26:5783-9)。在这个模型中,做中线矢状切口以允许颅盖暴露,接着除去骨膜,使颗粒沉积且闭合切口。两个因素有助于植入部位的炎症:手术创伤的自然修复和细胞及组织对植入颗粒的反应。为了使手术创伤的影响最小化,改进这个程序并使用最小侵入方法将PMMA颗粒引入到小鼠颅盖上。这种改进程序包括两个步骤:通过插入的针尖除去骨膜和经由针滴入PMMA颗粒。通过在尸体剖检时分离的颅盖的微计算机断层摄影(μ-CT)、苏木精和伊红(H&E)及抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色证实颗粒诱导的骨质溶解。在植入PMMA颗粒后,经由尾静脉注射向小鼠施用P-IRDye。植入后,动物的活体成像表明大分子造影剂在颗粒植入部位优先分布并持久保留。颅盖相关的软组织的免疫组织化学染色和FACS分析表明HPMA共聚物被F4/80、Ly-6G(Gr1)和CD11c阳性细胞大量摄入,其解释了大分子探针在炎症部位的持久保留。为了测试该体系用于治疗干预的可能性,制备酸敏感的HPMA共聚物-地塞米松缀合物(P-Dex)且表明在颅盖移植物模型中预防PMMA诱导的炎症和骨质溶解。使用体外细胞培养模型,以证明在PMMA攻击的单核细胞中P-Dex预处理抑制IL-1α和IL-1β的表达,其为P-Dex抑制PMMA诱导的骨质溶解的体内效能提供了可能的解释。
使用改进的小鼠颅盖骨质溶解模型的体内光学成像研究表明在颗粒植入后7天P-IRDye主要定位在PMMA颗粒植入部位。此时,软组织发炎,具有清晰可见的肿胀和发红的迹象。来自颗粒植入部位的H&E染色的组织切片显示了与局部组织炎症相关的大量炎性细胞的浸润。动物的每日成像表明在整个研究过程中颗粒植入部位维持P-IRDye信号,并在施用P-IRDye 6天后逐渐降低至原始信号强度的60%。由于提供了延长的检测时段,持久的对比信号水平表明了这种成像系统的临床效用。虽然这种基于聚合物的成像方法可用于与植入物相关的炎症的早期诊断,近红外成像探针的选择优选地适合用于人受治疗者的临床应用的交替显像剂,因为与其它显像剂相比,近红外成像具有较低的组织渗透能力,尤其是渗透通过矿化的组织(Kolari等(1993)Acupunct.Electrother.Res.,18:17-21;Mancini等(1994)J.Appl.Physiol.,77:2740-7)。作为替换物,在哺乳动物、大动物或人的临床应用中,可使用γ或正电子发射体(例如,123I、111In、99mTc、18F、64Cu、201Tl等)。由于这些放射性同位素的高能量水平,通过临床成像模式比如单光子发射CT/CT(SPECT/CT)和正电子发射断层摄影-计算机断层摄影(PET/CT)可容易地检测到它们的信号。还可使用磁共振成像(MRI)来检测本发明的聚合物。
类似于对实体瘤所观察到的增强的渗透性和保留(EPR)效果(Matsumura等(1986)Cancer Res.,46:6387-92),用炎症组织很好地证明了大分子的血管渗透性增加(Henson,P.M.(2005)Nat.Immunol.,6:1179-81)。然而,与实体瘤不同,在从血管外渗后,大分子从炎性组织的间隙空间清除经由淋巴系统快速且稳定地进行(Maeda,H.(2010)BioconjugateChem.,21:797-802)。在本研究中,在炎症部位的P-IRDye持久信号的发现是非常重要的,因为其显示了大分子及其它胶体体系保留在炎症部位的之前未认识到的机制的存在。为了探索这个新的机制,分离与PMMA颗粒相关的小鼠颅盖组织并处理,用于组织学分析和FACS分析。由于共焦显微镜和流式细胞仪不能检测近红外信号,用P-Alexa作为P-IRDye的代替品。为了保证两种缀合物的物理化学性质类似,在P-IRDye的合成中所使用的相同的包含胺的HPMA共聚物前体也被用于P-Alexa的合成中。免疫组织学评估表明P-Alexa被炎症部位的细胞内化。使用一组抗体,将细胞识别为巨噬细胞(F4/80+)、树突细胞(CD11c+)或炎性单核细胞(Grl+)。尽管中性粒细胞上也表达Gr1,H&E染色(例如图4D)证实很少检测到表达中性粒细胞的表型特征的细胞。同时,使用特异性中性粒细胞标记物(大鼠抗小鼠中性粒细胞标记物7/4,AbD Serotec,Raleigh,NC)的FACS分析还表明小于5%百分数的P-Alexa阳性细胞是7/4阳性的。因此,GR1和P-Alexa阳性细胞主要是炎性单核细胞。H&E组织切片的分析证明存在具有成纤维细胞表型特征的细胞,尽管在免疫组织学分析和FACS分析中未检测到P4HB阳性细胞,其可能归因于在处理组织/细胞的过程中的抗原变性。分散自颗粒植入部位的细胞的FACS分析表明大部分的细胞(大于80%)对于Ly-6G(Gr-1,Gr1)是阳性的,其与在PMMA颗粒植入后极早期(immediate period)的急性炎症应答是一致的。这些发现表明高分子成像探针的保留与在炎症部位外渗后由活化的炎性细胞对共聚物的细胞摄入有关。
进行另外的研究以确定这种与颗粒诱导的炎症相关的新的保留机制是否能用于治疗干预的开发,以抑制颗粒诱导的炎症和相关的骨质溶解。微CT结果表明在颗粒植入后一天单一P-Dex的施用使骨质溶解减弱。体外细胞培养研究表明经由内吞作用P-Dex被PMMA处理的人单核细胞内化且其被保留在溶酶体区室中。这种处理伴随着颗粒诱导的炎性细胞因子比如IL-1α和IL-1β的表达的抑制,其可能有助于局部炎症应答的减弱。IL-1和具有诱导破骨细胞的活性相关炎性细胞因子的表达被P-Dex抑制,提供了P-Dex共聚物藉以抑制颗粒诱导的骨质溶解的可能机制。
使用改进的鼠颅盖骨质溶解模型,本文发现基于水溶性大分子比如HPMA共聚物的显像剂可被用于鉴定与颗粒诱导的炎症及随后的骨质溶解的早期阶段相关的炎症部位。鉴定与这种识别相关的新的炎性细胞介导的大分子保留机制。已表明基于HPMA共聚物的地塞米松前药提供与植入的PMMA颗粒相关的炎症的持久抑制。微CT分析显示向鼠颅盖骨质溶解模型全身施用P-Dex是骨保护的。改编这种系统来使用高能量的放射性同位素代替光学成像探针胜过用于人应用的成像工具。此外,本研究表明这种大分子治疗诊断学系统能够将生物活性药物组织特异性地递送到炎症部位以预防骨破坏。
尽管在整个申请中以HPMA共聚物(例如,HPMA-APMA共聚物;还参见图1和图2)为示例,可使用其它水溶性聚合物主链或胶体体系(例如,连接到本文所描述的显像剂、治疗剂和/或靶向剂上)。本发明的水溶性聚合物包括但不限于包括甲基丙烯酰胺主链的聚合物、HPMA共聚物及衍生物、聚乙二醇(包括支链的或嵌段的共聚物,其可经由肽序列、酯或二硫键等降解)、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、葡聚糖、壳聚糖、纤维素及其衍生物、淀粉、明胶、透明质酸及其衍生物,及以下单体的聚合物或共聚物:N-异丙基丙烯酰胺(例如,PNIPAm)、丙烯酰胺、N,N-二甲基丙烯酰胺、N-乙烯基吡咯烷酮(例如,PVP)、醋酸乙烯酯(例如,得到水解成聚乙烯醇或PVA的聚合物)、甲基丙烯酸羟乙酯(例如,PHEMA)、2-甲基丙烯酰基氧基乙基葡糖苷、丙烯酸、甲基丙烯酸(methacrylic)、乙烯基磷酸、苯乙烯磺酸、马来酸、2-甲基丙烯酰基氧基乙基三甲基氯化铵、甲基丙烯酰基酰氨基丙基三甲氧基氯化铵、甲基丙烯酰氧乙基三甲基甲磺酸铵(methacryloylcholine methyl sulfate)、N-羟甲基丙烯酰胺、2-羟基-3-甲基丙烯酰基氧基丙基三甲基氯化铵、2-甲基丙烯酰基氧基乙基三甲基溴化铵、2-乙烯基-1-甲基溴化吡啶鎓、4-乙烯基-1-甲基-溴化吡啶鎓、吖丙啶、(N-乙酰基)吖丙啶、(N-羟乙基)吖丙啶和/或烯丙胺。优选地,水溶性聚合物是生物惰性的,然而,聚合物可任选地具有治疗活性(Rapp等,Synthesis and in vivo biodisposition of [14C]-quatemary ammonium-melphalan conjugate,a potential cartilage-targeted alkylating drug(一种潜在的靶向软骨的烷基化药物[14C]-季铵-美法仑缀合物的合成及体内生物配置),BioconjugChem.(2003)14(2):500-6)。胶体体系/载体包括但不限于脂质体、纳米颗粒及胶束(任选地交联的)。
在本发明的特定实施方式中,本发明的聚合物是包括甲基丙烯酰胺主链的共聚物,其中甲基丙烯酰胺单元具有烷基(alkyl)侧链或芳基侧链。在特定的实施方式中,省略甲基丙烯酰胺主链的酰胺基团。聚合物可包括至少一种治疗剂,至少一种显像剂和/或至少一个靶向部分,全部任选地经由独立选定的间隔基/连接体连接。在本发明的一个实施方式中,复合物的聚合物是嵌段共聚物。将嵌段共聚物最简单地定义为至少两种不同聚合物区段(segment)的缀合物(Tirrel,M.于:Interactions of Surfactants with Polymers andProteins.(表面活性剂与聚合物及蛋白质的相互作用)Goddard E.D.和Ananthapadmanabhan,K.P.(编),CRC Press,Boca Raton,AnnArbor,London,Tokyo,页码59-122,1992)。最简单的嵌段共聚物结构包括在末端连接的两个区段,以生成A-B或B-A类型的二嵌段。多于两个区段通过其末端的相应缀合生成A-B-A类型三嵌段、A-B-A-B类型多嵌段、多区段A-B-C结构及类似物。本发明还包括具有与单一中心连接的多于两个聚合物区段连接的更复杂的结构比如(AB)n或AnBm星型嵌段类(starblock)。
在另外的实施方式中,本发明的聚合物包括以下通用结构:
其中R是连接体;A是显像剂、靶向部分或治疗剂;且m和n独立地是约1至约1000,优选地约10至约500。在特定的实施方式中,R是烷基、芳基或多肽。在特定的实施方式中,R基团包括pH敏感的连接体和/或可裂开的连接体。本发明的单一共聚物可包括连接到一起的多个式(I)的嵌段(例如,约2至约1000,约2至约500,约2至约10,约2至约5)。本发明的单一聚合物可包括至少一种显像剂、至少一种靶向剂和/或至少一种治疗剂。例如,单一聚合物可包括一种HPMA嵌段、包括显像剂的嵌段及包括靶向部分的嵌段(例如,共聚物可具有两个“n”嵌段-A-B-B′嵌段共聚物)。此外,虽然式(I)描述了HPMA嵌段在前(A-B),其它嵌段可在HPMA嵌段的前面(例如,B-A、B-A-B等)。
本发明的聚合物可任选地包括一个或多个靶向部分,其可用于将递送体系导向特定的组织,比如骨、牙齿、软骨或某些细胞类型等。优选地,靶向部分是优选地在体内积聚在硬组织(例如,牙齿和骨)和/或医学植入物(例如,骨移植物/植入物,羟磷灰石覆盖的金属植入物,金属植入物比如不锈钢、钛合金,骨科植入物,牙科植入物及骨髓移植物)中/上而不是积聚在任意其它器官或组织中/上的那些化合物。本发明的靶向部分包括但不限于叶酸、甘露糖、双膦酸盐(例如阿仑膦酸盐)、季铵基团、四环素及其类似物、唾液酸、丙二酸、N,N-二羧基甲胺、4-氨基水杨酸、5-氨基水杨酸、对硬组织或植入材料有特异性的抗体或其片段或衍生物(例如,Fab,人源化抗体和/或单链可变区片段(scFv))和肽类(例如包括约2至约100(特别是6)个D-谷氨酸残基、L-谷氨酸残基、D-天冬氨酸残基、L-天冬氨酸残基、D-磷酸丝氨酸残基、L-磷酸丝氨酸残基、D-磷酸苏氨酸残基、L-磷酸苏氨酸残基、D-磷酸酪氨酸残基和/或L-磷酸酪氨酸残基的肽类)。在特定的实施方式中,靶向部分是阿仑膦酸盐。靶向部分可经由共价键或物理键(连接)与聚合物主链连接。任选地,靶向部分和聚合物主链之间的间隔基可在刺激下裂开,所述刺激包括但不限于pH的改变(例如,酸敏感的连接体)、特定酶活性的存在(例如,组织蛋白酶类(例如,组织蛋白酶K)、MMP等)、氧水平的改变、某一波长的光的存在等。
如上所述,本发明的HPMA共聚物可用于将至少一种治疗剂(药物)递送至疾病部位,用于骨质溶解、与其相关的炎性和/或植入物松动的治疗。在另外的实施方式中,HPMA共聚物可用于将至少一种显像剂递送至期望的部位,用于非侵入式成像以及骨质溶解和植入物松动的早期检测或风险评估。本发明的HPMA共聚物的每一个均可包括至少一种治疗剂和/或显像剂。在另外的实施方式中,施用(同时地或顺序地)多个HPMA共聚物,其中每一个均包括单一治疗剂和/或显像剂。
在特定的实施方式中,可将检测剂/显像剂(或标记物(label))连接于HPMA共聚物主链上。在特定的实施方式中,每一个聚合物链的平均摩尔百分数可在0%-约50%的范围。显像剂可以是对光学成像、磁共振成像(MRI)、正电子发射断层摄影(positron emissiontomography,PET)、计算机断层摄影(CT)、γ-闪烁扫描术成像等有用的化合物。此类试剂对本领域的技术人员来说是公知的。显像剂包括但不限于放射性同位素,同位素,生物素及其衍生物,金(例如,纳米颗粒),光学显像剂(例如,近IR染料(例如,IRDye 800CW)、卟啉类、蒽醌类、蒽吡唑类、苝醌类(perylenequinone)、咕吨类(xanthene)、花青、吖啶类、吩恶嗪类、吩噻嗪类及其衍生物),发色团,荧光化合物(例如,Alexa488、荧光素、若丹明、DiI、DiO及其衍生物),MRI增强剂(例如,DOTA-Gd3+(1,4,7,10-四氮环十二烷-1,4,7,10-四(乙酸))、DTPA-Gd3+(与二乙烯三胺五乙酸的钆复合物)等),顺磁性或超顺磁性离子(例如Gd(III)、Eu(III)、Dy(III)、Pr(III)、Pa(IV)、Mn(II)、Cr(III)、Co(III)、Fe(III)、Cu(II)、Ni(II)、Ti(III)及V(IV)),用11C、13N、15O、18F、64Cu、68Ga或82Rb标记或复合的PET化合物(例如,18F-FDG(氟脱氧葡萄糖)),CT化合物(例如,包含碘或钡的化合物,例如,2,3,5-三碘苯甲酸)及γ或正电子发射体(例如,99mTc、111In、113In、153Sm、123I、123I、18F、64Cu、201Tl等)。
在特定的实施方式中,与本发明的HPMA共聚物连接的治疗剂是抗炎治疗剂、免疫抑制剂、镇痛药物(pain management drug)、合成代谢因子(anabolic factor,例如,促进组织再生和修复的生长因子,比如骨形成蛋白(BMP)、Wnt通路激动剂、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)及靶向骨吸收的剂(例如,双膦酸盐))或骨相关的治疗剂。如本文所使用的,“抗炎治疗剂”是指用于炎性疾病或与之相关的症状的治疗的化合物。抗炎治疗剂包括但不限于非甾体抗炎药物(NSAID;例如阿司匹林、布洛芬、萘普生、水杨酸甲酯、二氟尼柳、消炎痛、舒林酸、双氯芬酸、酮洛芬、酮咯酸、卡洛芬、菲诺洛芬、甲芬那酸、吡罗昔康、美洛昔康、甲氨蝶呤、塞来昔布、伐地昔布、帕瑞昔布、依托昔布及尼美舒利)、皮质甾类(例如,强的松、倍他米松、布地奈德、可的松、地塞米松、氢化可的松、甲基强的松龙、泼尼松龙、去炎松及氟替卡松)、雷帕霉素、rho-激酶抑制剂、病毒性CC-趋化因子抑制剂(vCCI)、糖皮质激素类、类固醇类、β-激动剂类、抗胆碱能剂、甲基黄嘌呤类、柳氮磺吡啶类(sulphasalazine)、氨苯砜、补骨脂素、蛋白质、肽、DMARD、糖皮质激素类(例如,地塞米松)、甲氨蝶呤、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、氯喹、金、金盐、铜、铜盐、青霉胺、D-青霉胺、环孢霉素、脂氧素类(lipoxin)、resolvin、cox-2抑制剂、MAP激酶抑制剂、半胱天冬酶-1抑制剂、JNK抑制剂、ERK抑制剂、Syk抑制剂、JAK抑制剂及保护素。抗炎治疗剂还被提供在Pharmacological Basis of Therapeutics(治疗学的药理学基础),第10版,Gilman等编辑,McGraw-Hill Press(2001)和Remington’s PharmaceuticalScience’s(雷明顿氏药物科学),第18版,Easton:Mack Publishing Co.(1990))。在特定的实施方式中,抗炎治疗剂选自由糖皮质激素类、resolvin、cox-2抑制剂、MAP激酶抑制剂、半胱天冬酶-1抑制剂、JNK抑制剂、ERK抑制剂、Syk抑制剂及JAK抑制剂组成的组。在特定的实施方式中,抗炎治疗剂是地塞米松。
“骨相关的治疗剂”是指适合向病人施用的诱导期望的生物学或药理学的作用的剂,比如但不限于1)增加骨生长,2)预防不期望的生物学作用比如感染,3)使由与骨相关的疾病引起的病症(例如,疼痛或炎症)减轻,和/或4)使来自骨的疾病减轻、减少或消除。在特定的实施方式中,骨相关的治疗剂拥有骨合成代谢作用和/或骨稳定作用。骨相关的治疗剂包括但不限于组织蛋白酶K抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、前列腺素E受体激动剂、前列腺素E1或E2及其类似物、甲状旁腺激素及其片段、resolvin及其类似物、抗微生物剂类、糖皮质激素类(例如,地塞米松)及其衍生物和他汀类(例如,辛伐他汀)。
正如本领域的技术人员将认识到的,如本文所使用的抗炎药物和显像剂包括可接受的盐、酯类或这种酯类的盐。例如,糖皮质激素包括其药学上可接受的盐和酯,因此,在描述药物例如地塞米松时,还描述了其药学上可接受的盐比如地塞米松棕榈酸盐。
治疗剂、显像剂和/或靶向部分可通过间隔基连接到HPMA共聚物主链上。间隔基(连接体)是本领域已知的且本领域的技术人员可基于长度、反应性、柔性等选择间隔基。例如,间隔基可以是具有1-50个,优选地1-15个碳的烷基或炔烃。本发明的间隔基还可以是具有1-20,优选地1-10个残基的肽序列(例如,选自所有天然氨基酸)。本聚合物的连接(连接体结构域)可以是在生理条件下不可降解或可降解的。在一个实施方式中,间隔基可包括在酸性pH下(例如,pH<6,特别是<5.5)可裂开的键。pH敏感的连接体的实例包括但不限于腙键、缩醛键、顺式乌头基(cis-aconityl)间隔基、磷酰胺键、甲硅烷基醚(silyl ether)键等。间隔基还可在刺激下裂开,所述刺激包括但不限于pH的改变、特定的酶(蛋白酶)活性的存在(例如,组织蛋白酶类(例如,组织蛋白酶K)、MMP等)、氧水平的改变等。在特定的实施方式中,连接体/间隔基在生理条件下是生物可降解的且可裂开的。在另外的实施方式中,当显像剂连接到HPMA共聚物主链上时,连接体/间隔基在生理条件下是不可降解的或不可裂开的。
如上所述,本发明的HPMA聚合物可包括至少一种治疗剂、至少一种显像剂和/或至少一种靶向部分。例如,单一聚合物可包括多于一种的治疗剂。作为另外的实例,单一共聚物可包括一种或多种治疗剂和一种或多种显像剂。可选地,可向受治疗者施用多于一种的HPMA共聚物。例如,包括一种或多种治疗剂的共聚物可与包括一种或多种显像剂的共聚物一起施用。
本发明还包括包含至少一种本发明的HPMA共聚物和至少一种药学上可接受的载体的组合物。组合物还包括至少一种其它的抗炎治疗剂。此类组合物可以治疗有效量向需要其的患者施用,用于炎性疾病或疾患的治疗和/或成像。在特定的实施方式中,至少一种其它抗炎剂与上面的组合物分开施用(例如,顺序地或同时地)。
本发明的组合物可通过任意合适的途径施用,例如,通过注射(例如,用于局部(直接)或全身施用(静脉内))、口、肺、局部(topical)、鼻或其它施用模式。组合物可通过任意合适的方式施用,包括胃肠外、肌内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、局部、吸入、经皮、眼内、肺内、直肠内及鼻内施用。在特定的实施方式中,将组合物直接注射到期望的部位。通常,组合物的药学上可接受的载体选自稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体的组。组合物还包括具有各种缓冲含量(例如,Tris HCl、乙酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度的稀释剂;及添加剂比如洗涤剂和增溶剂(例如吐温80、聚山梨酸酯80)、抗氧化剂(例如,抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、防腐剂(例如,Thimersol、苄醇)及填充物(例如乳糖、甘露醇)。组合物还可掺入在高分子化合物比如聚酯类、聚氨基酸类、水凝胶类、聚丙交酯/乙交酯共聚物类、乙烯乙酸乙烯酯共聚物类、聚乳酸、聚乙醇酸等的颗粒制剂中或掺入在脂质体中。这样的组合物可影响本发明的药物组合物的成分的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。参见,例如,Remington’s Pharmaceutical Sciences(雷明顿氏药物科学),第18版(1990,MackPublishing Co.,Easton,PA 18042),页码1435-1712,其通过引用并入本文。本发明的药物组合物可制备成例如液体形式或可以为干燥粉末形式(例如,冻干)。体内递送可通过糖浆、酏剂、液体、片、丸、定时释放胶囊、气雾剂、经皮贴片、注射剂(injection)、滴剂、软膏等的使用来完成。
在另外的实施方式中,本发明的组合物可在控释体系中递送,比如使用静脉输注、可植入的渗透泵、经皮贴片、脂质体或其它施用模式。在特定的实施方式中,可使用泵(参见,Langer,上文;Sefton,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.(1987)14:201;Buchwald等,Surgery(1980)88:507;Saudek等,N.Engl.J.Med.(1989)321:574)。在另外的实施方式中,可采用高分子材料(参见,Medical Applications of Controlled Release(控释的医学应用),Langer和Wise(编辑),CRC出版:Boca Raton,Florida(1974);Controlled DrugBioavailability,Drug Product Design and Performance(可控的药物生物利用度:药物产品设计和性能),Smolen和Ball(编辑),Wiley:New York(1984);Ranger和Peppas,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.(1983)23:61;还参见,Levy等,Science(1985)228:190;During等,Ann.Neurol.(1989)25:351;Howard等,J.Neurosurg.(1989)71:105)。在另外的实施方式中,控释体系可放置在动物靶组织的附近,因此仅需要全身剂量的一部分(参见,例如Goodson,于Medical Applications of Controlled Release(控释的医学应用),上文,(1984)第2卷,页码115-138)。特别地,可将控释装置引入到动物中不适当发炎的部位附近。在Langer的综述(Science(1990)249:15271533)中,讨论了其它的控释体系。
可施用本发明的组合物,用于骨质溶解、与之相关的炎症和/或植入物松动的治疗。本发明组合物的施用的剂量范围是足够大以产生期望的作用(例如,治愈、减轻和/或预防炎性疾患、炎性疾患的症状或炎性疾患易感性)的那些范围。剂量应没有大到引起不利的副作用比如不需要的交叉反应、过敏反应及类似反应的程度。通常,剂量将随着年龄、状况、性别及患者中的疾病程度而变化且可由本领域的技术人员确定。如果发生任何的禁忌症(counter indication),可由具体医生调整剂量。药物的有效量是本领域已知的并且随年龄、体重、受治疗者的病症的严重性、使用的特定化合物、制剂的强度及施用模式而改变。优选地,由治疗的医生谨慎地确定有效量,但可通过使用本领域公知的方法来确定(ThePharmacological Basis of Therapeutics(治疗学的药理学基础),第10版,Gilman等编辑,McGraw-Hill出版(2001);Remington′s Pharmaceutical Science′s(雷明顿氏药物科学),第18版,Easton:Mack Publishing Co.(1990))。本发明的组合物可使用本领域已知的方法来制备,例如,药物组合物的制备是本领域已知的(The Pharmacological Basis ofTherapeutics(治疗学的药理学基础),第10版,Gilman等编辑,McGraw-Hill Press(2001);Remington′s Pharmaceutical Science′s(雷明顿氏药物科学),第18版,Easton:MackPublishing Co.(1990))。
如上文所述,本发明提供用于显像剂的递送的水溶性高分子递送体系,其对于骨科和/或牙科植入物的非侵入式成像、诊断、预后及评估是有用的。本发明包括检测植入物(例如,骨科和/或牙科植入物)的松动和/或骨质溶解的增加的风险的方法。骨科植入物包括植入到活体中以增添或代替其所植入的患者的骨结构的结构。骨科植入物的实例包括但不限于移植物、板、网片(mesh)、置换装置(例如,关节、膝、髋、肘、腕等)、上股骨装置、整形外科植入物、上肱骨装置、肩部装置、被动肌腱装置、脊骨装置、手指/脚趾装置、骨干装置、羟磷灰石覆盖的金属植入物及金属植入物(例如,不锈钢、钛及钛合金)。包含显像剂的聚合物还可用于监测治疗的进程。在另外的示例实施方式中,本发明提供筛选治疗骨质溶解和/或植入物松动的抗炎治疗剂或其它化合物的方法。在一个实施方式中,抗炎剂连接于本发明的水溶性高分子递送体系且向受治疗者施用,且例如使用显像剂监测治疗剂的作用,从而识别有效的治疗剂。在另外的实施方式中,向患者施用抗炎剂且施用连接于本发明的水溶性高分子递送体系的显像剂以监测治疗剂的作用。任选地,可共同施用显像剂,用于监测和/或筛选抗炎剂的活性的目的。任选地,一个或多个靶向部分可用于筛选的方法中。
如上所述,用本发明的聚合物来治疗骨质溶解、与之相关的炎症和/或植入物松动。方法包括向受治疗者(例如,人)施用包括至少一种治疗剂的本发明的HPMA共聚物。本方法可用于预防和/或抑制植入物的松动/失败。
定义
如本文所使用的,“诊断”是指检测和识别受治疗者的疾病或疾患。该术语还包括评价或评估已知患有疾病或疾患的患者的疾病状态(进展、衰退、稳定、对治疗的响应等)。
如本文所使用的,术语“预后”是指提供关于疾病或疾患的存在对受治疗者未来健康的影响的信息(例如,预期发病率或死亡率,骨质溶解的可能性/风险、植入物松动的可能性/风险等)。换而言之,术语“预后”是指提供对疾病或疾患的可能进程和结果或从疾病或疾患中恢复的可能性的预测。
本文所使用的术语“治疗”是指使受到疾病或疾患折磨的患者受益的任何类型的治疗,包括患者的病症的改善(例如,在一个或多个症状中),使病症的进展延缓等。
短语“有效量”是指导致患者病症的改善的治疗剂的量。
“药学上可接受的”是指被美国联邦政府或州政府的管理机构批准或在美国药典或其它普遍公认的药典中列为用于动物且更具体地用于人。
“载体”是指与本发明的活性剂一起施用的例如稀释剂、佐剂、防腐剂(例如,Thimersol、苄醇)、抗氧化剂(例如,抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、增溶剂(例如,吐温80、聚山梨酸酯80)、乳化剂、缓冲剂(例如,Tris HCl、乙酸盐、磷酸盐)、填充物(比如乳糖、甘露醇)、赋形剂、助剂或媒介物。药学上可接受的载体可以是无菌液体比如水和油,包括来源于石油、动物、植物或合成来源的那些油,比如花生油、豆油、矿物油、芝麻油和类似物。优选地采用水或含水的盐溶液及含水的葡萄糖和甘油溶液作为载体,特别是用于注射溶液的载体。组合物可掺入高分子化合物比如聚乳酸、聚乙醇酸等的颗粒制剂中或掺入脂质体或胶束中。这样的组合物可影响本发明的药物组合物的成分的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。本发明的药物组合物可制备成例如液体形式或可以是干燥粉末形式(例如,冻干)。合适的药物载体被描述在E.W.Martin的“Remington′s Pharmaceutical Sciences(雷明顿氏药物科学)”(Mack Publishing Co.,Easton,PA);Gennaro,A.R.,Remington:TheScience and Practice of Pharmacy(雷明顿:药物科学和实践),第20版,(Lippincott,Williams和Wilkins),2000;Liberman等编辑,Pharmaceutical Dosage Forms(药物剂量形式),Marcel Decker,New York,N.Y.,1980;及Kibbe等编辑的Handbook ofPharmaceutical Excipients(药物赋形剂手册)(第三版),American PharmaceuticalAssociation(美国制药协会),华盛顿,1999。
术语“分离的”是指化合物与其生产过程中存在的其它成分分离。“分离的”并非意在排除与其它化合物或材料的人造或合成的混合物,或基本上不干扰基础活性且可例如由于纯化不完全或稳定剂的添加而存在的杂质的存在。
“连接体”、“连接结构域”及“连接”是指包括共价键或共价连接至少两个化合物的原子链的化学部分,例如使靶向部分与治疗剂连接的化学部分。连接体可连接到化合物的任何合成上可行的位置上,但优选地以避免阻断化合物的期望的活性的方式。连接体通常是本领域已知的。示例连接体可包括至少一个任选地被取代的;饱和的或不饱和的;直链的、支链的或环状的烷基或任选地被取代的芳基。在特定的实施方式中,连接体可包括0(即,键)至约500个原子,约1至约100个原子或约1至约50个原子。连接体还可以是多肽(例如,约1至约20个氨基酸)。连接体可以是在生理环境或条件下生物可降解的。连接体还可以是不可降解的且可以是在生理环境或条件下不能够裂开的共价键或任何其它化学结构。
如本文所使用的,术语“生物可降解的”或“生物降解”被定义为通过在生理条件下的增溶水解或通过生物学上形成的实体(其可以是酶或有机体的其它产物)的作用使材料转化成不那么复杂的中间体或最终产物。术语“不可降解的”是指在生理条件下甚至用任何的外部干预不能使其裂开的化学结构。术语“可降解的”是指化学结构经由物理方式(比如超声波作用)、化学方式(比如小于6或大于8的pH)或生物(酶的)方式被裂开的能力。
如本文所使用,术语“靶向骨的”是指在体内施用后优先地在硬组织而不是任何其它器官或组织中积聚的能力。
提供以下的实施例以阐述本发明的某些实施方式。实施例并非意在以任何方式限制本发明。
实施例
材料和方法
聚(HPMA-共-APMA)的合成
将N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA;1g,6.98mmol;等(1973)Eur.Polymer J.,9:7-14),N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐(APMA,12.5mg,0.07mmol,Polysciences,Inc.,Warrington,PA),偶氮二异丁腈(AIBN,6.74mg,41μmol,Sigma-Aldrich,Milwaukee,WI),S,S′-双(a,a′-二甲基-a″-乙酸)三硫代碳酸酯(CTA,6.26mg,23.6μmol,纯度>97%)(Lai等(2002)Macromolecules 35:6754-6)及N-甲基丙烯酰基氨基丙基荧光素硫脲(MA-FITC,4mg)(Omelyanenko等(1998)J.ControlRelease 53:25-37)溶解在8mL甲醇中,置于安瓿中,且用N2吹扫5分钟。安瓿是火焰密封的且在40℃下避光保持48小时。通过LH-20柱(GE HealthCare,Piscataway,NJ)纯化产物以除去未反应的低分子量化合物且然后冻干。最终产量是0.42g。使用茚三酮试验测得共聚物的胺含量是2.7×10-5 mol/g(Moore等(1954)J.Biol.Chem.,211:907-13)。使用安装有紫外检测器和红外检测器的 FPLC系统(GE HealthCare,Piscataway,NJ)基于HPMA均聚物校正,测定共聚物的重均分子量(Mw=3.71×104)及数均分子量(Mn=2.65×104)。还参见Liu等(Pharm.Res.(2008)25:2910-2919)。
IRDye 800CW标记的HPMA共聚物的合成(图1)
将聚(HPMA-共-APMA)(16.5mg,包含0.00044mmol的胺)、IRDye800CWNHS酯(LI-Biosciences,Lincoln,NE)(0.5mg,0.00043mmol)溶解在加入5μL的N,N-二异丙基乙胺的300μL的DMF中。溶液在室温下在黑暗中搅拌过夜。然后,在LH-20柱上纯化产物并冻干。最终产物产量是15.02mg。使用Lambda 10紫外可见光谱仪(PerkinElmer,Shelton,CT)测得IRDye 800CW含量是1.1×10-5mol/g。
Alexa488标记的HPMA共聚物的合成(图1)
将聚(HPMA-共-APMA)(30.0mg,0.0008mmol)、Alexa488NHS酯(0.517mg,0.0008mmol,Invitrogen,Camarillo,CA)溶解在加入5μL的N,N-二异丙基乙胺的0.5mL的DMF中。混合物在室温下在黑暗中搅拌过夜。在LH-20柱上纯化产物并冻干。最终产物产量是28.62mg。使用Lambda 10紫外可见光谱仪测得Alexa488的含量是1.9×10-5mol/g。
小鼠颅盖骨质溶解模型
将聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)颗粒(1-10μm,Bangs Laboratories,Fishers,IN)浸在70%乙醇中过夜,然后在植入前洗涤并悬浮在无菌的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。使用试剂盒(Associates of Cape Cod,Inc.,East Falmouth,MA)进行鲎化验(limulus assay)以确定处理的颗粒不含内毒素。通过腹腔内注射,用70-80mg/kg的氯胺酮和5-7mg/kg的甲苯噻嗪麻醉雄性的瑞士韦伯斯特小鼠(6周,Charles River LaboratoriesInc.,Wilmington,MA)。皮下插入25G针以通过用针尖划30次从颅盖表面除去骨膜。然后,通过插入的针,使PBS(100μL)或PMMA(30mg悬浮在100μL PBS中)沉积在颅盖表面上。所有的动物试验都是根据内布拉斯加大学医疗中心机构动物护理和使用委员会(University ofNebraska Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee)批准的协议进行的。
植入PMMA颗粒的小鼠的近红外光学成像
在植入PMMA颗粒1天后,经由尾静脉注射给予小鼠P-IRDye(0.5mg/小鼠)。注射PBS的组被用作阴性对照且给予相同剂量的P-IRDye。使用XENOGEN200系列成像系统(Hopkinton,MA),在注射造影剂之前及注射造影剂之后每日对小鼠成像,以评估HM A共聚物缀合物的分布,持续6天。
小鼠颅盖的微CT分析
尸体剖检时,通过将骨与下面的脑组织切开并除去被枕骨大孔、耳道及眼眶的结合的骨椭圆板(elliptical plate),取出颅盖。将其存放在70%乙醇中,然后使用Scanco μCT35(Scanco Medical,Brüttisellen,Switzerland)系统在常规的对比条件下(55KVp,145μA,0.36度转动角步骤)以15μm的分辨率扫描。然后,通过系统重建软件进行扫描体积的三维重建和骨背景分割。
组织学评估
对于破骨细胞的识别,将整个颅盖固定在70%乙醇溶液中且然后用商业的染色试剂盒(387A,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)进行TRAP染色。认为染上紫色的细胞是TRAP阳性破骨细胞。对于骨吸收的评估,将颅盖固定在中和的低聚甲醛中,持续24小时,且然后在4℃下在10%EDTA(在PBS中具有0.5%低聚甲醛)中脱钙,持续2周。每2天换一次脱钙溶液。然后,将样本包埋在石蜡中,切片(5μm厚度)且H&E染色。用OlympusBX51显微镜(Olympus,日本)检查TRAP染色的颅盖和H&E切片。
免疫组织化学分析
在植入颗粒的6天后,通过尾静脉注射,给予小鼠P-Alexa(4.0mg/小鼠)。尸体剖检时(注射后24小时),如上所述分离上部颅骨(包括皮肤、下面的软组织和颅盖)。在颗粒沉积区域正中以冠状面将组织切成两部分(The tissue was cut into two halves in thecoronal plane centered over the area of particle deposition),立即包埋在O.C.T.化合物中且用干冰冷冻用于切片(7μm厚度)。得到的玻片首先用10%山羊、兔或驴血清(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)在室温下孵育30分钟。在加入第一抗体{稀释在10%相应的封闭血清(blocking serum)中的兔抗小鼠脯氨酰-4-羟化酶(P4HB,Abcam,Cambridge,MA)、大鼠抗小鼠F4/80(Invitrogen,Camarillo,CA)、大鼠抗小鼠Ly-6G(Gr-1,Grl)(Ebioscience,San Diego,CA)及亚美尼亚仓鼠抗小鼠CDllc(BD Pharmingen,San Jose,CA)}后,切片在加湿室中在室温下孵育1小时。在用PBS洗涤后,加入稀释的第二抗体{藻红蛋白(PE)标记的驴抗兔IgG(Ebioscience,San Diego,CA),PE标记的山羊抗大鼠IgG(Invitrogen,Camarillo,CA)或PE标记的兔抗亚美尼亚仓鼠IgG(Ebioscience,San Diego,CA)}且在黑暗中在室温下孵育另外的30分钟。在对照试验中,第一抗体被相应的同种型对照{纯化的兔IgG(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO),纯化的大鼠IgG(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)及纯化的仓鼠IgG(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)}代替且类似于如上所描述地处理样品。然后,用Nikon Swept Field共焦显微镜评估处理的组织切片。在400x的放大率下拍摄照片。
荧光激活细胞扫描(FACS)分析
类似于免疫组织化学研究,在颗粒植入后的第6天,通过尾静脉注射给予小鼠P-Alexa(2.0mg/小鼠)。尸体剖检时(注射后24小时),分离皮肤和颅盖之间的软组织且无菌切碎。在37℃下,用I型胶原酶(1mg/mL,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)进一步消化组织,持续2小时。在通过70μm细胞过滤网后,得到单细胞悬液(1×106细胞/mL)。然后用ACK裂解缓冲液(Quality Biological,Gaithersburg,MD)除去红细胞。对于CD11c、F4/80和Ly-6G(Gr-1,Gr1)阳性细胞的FACS评估,使样品与抗体{别藻蓝蛋白(APC)标记的仓鼠抗小鼠CD11c(BDPharmingen,San Jose,CA)、PE标记的大鼠抗小鼠F4/80(AbD Serotec,Raleigh,NC)、PE标记的大鼠抗小鼠Ly-6G(Gr-1,Gr1)(Ebioscience,San Diego,CA)}在冰上孵育30分钟。对于P4HB阳性细胞的FACS评估,首先使样品与兔抗小鼠P4HB在冰上孵育30分钟,然后与PE标记的驴抗兔IgG在冰上孵育另外的30分钟。将同种型匹配的APC标记的仓鼠IgG1(BDPharmingen,San Jose,CA)、PE标记的大鼠IgG2b(BD Pharmingen,San Jose,CA)和纯化的兔IgG用作阴性对照。在最后的洗涤后,用Becton Dickinson FACSCaliburTM流式细胞仪分析细胞。
初步的体内治疗研究
在植入PMMA颗粒1天后,将小鼠随机地分成两组且经由尾静脉注射用P-Dex(图2,等效Dex剂量=20mg/kg)和盐水处理。在处理后的第6天,使小鼠安乐死且分离动物的上部颅骨,除去皮肤、下面的软组织和脑组织。然后,如上所述,用70%乙醇固定组织且进行微CT分析。
巨噬细胞培养
如上所述,从衍生自去识别(deidentified)的正常人供体的PBMC制备CD14阳性单核细胞(Rakshit等(2006)J.Bone Joint Surgery 88:788-99)。在24孔的组织培养板中(1mL/孔),在10ng/mL人M-CSF(Peprotech,Rocky Hill,NJ)的存在下,在用10%胎牛血清(VWR,West Chester,PA)和1%抗生素/抗真菌药(Invitrogen,Carlsbad,CA)补充的α-MEM培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA)中,使细胞以106细胞/mL的细胞密度培养24小时。然后用P-Dex(5μM)或游离Dex(地塞米松磷酸钠,0.6μM)脉冲细胞4小时,洗涤并用新鲜的培养基重新装满。两个处理组具有相等剂量的Dex。24小时后,以+/-PMMA颗粒处理细胞(30个颗粒/细胞)3小时。对于炎性细胞因子(IL1-α、IL-1β),如之前描述制备总的细胞RNA(RNeasy,Qiagen)并通过实时RT-PCR分析。还通过ELISA分析条件培养基的炎性细胞因子(TNF,IL1,IL6)。
统计学方法
用学生t检验评估两组之间的比较:假定相等方差的双样品双尾。小于0.05的p值视为统计学上显著的。
结果
评定小鼠颅盖骨质溶解模型中的骨吸收
与PBS处理的动物相比,颅盖骨样本的微CT分析显示了与PMMA颗粒植入部位相关的骨损失的大量病灶区域(图3-B1)。数量上,与PMMA组(19.49±1.60mm-1)相比,PBS对照组具有更小的平均骨表面积比骨体积(BS/BV)的值16.64±0.36mm-1(p<0.05)。在PMMA组中,骨厚度是0.1027±0.0084cm,其显著小于PBS组的0.1200±0.0028cm的骨厚度(p<0.05)。如图4B所示,多个TRAP阳性细胞存在在PMMA颗粒植入部位的骨表面上,与活跃的破骨细胞骨吸收(active osteoclastic bone resorption)一致。在PMMA沉积部位,脱钙的颅盖的H&E染色揭示了高度的炎性细胞浸润的存在(图4D)。
近红外光学成像研究
在植入颗粒2天后,来自P-IRDye的强烈的近红外(NIR)信号与PMMA颗粒沉积部位有关(图5)。每日成像表明P-IRDye信号存留超过7天。NIR信号强度的定量分析证实P-IRDye施用后的第7天残留约60%的信号,与P-IRDye在PMMA颗粒植入部位的保留一致。在PBS对照组中,P-IRDye的分布和保留显著低于PMMA处理组(p<0.05)。
小鼠颅盖冷冻切片的免疫组织化学分析
如图6所示,用抗-F4/80、抗-CD11c、抗-Ly-6G(Gr-1,Gr1)和抗-P4HB抗体对来自PMMA植入动物的小鼠颅盖组织的冷冻切片进行的免疫组织化学染色揭示,很多P-Alexa阳性细胞对Ly-6G(Gr-1,Gr1)或F4/80阳性地染色。CD11c阳性细胞对于Alexa染色是弱阳性或阴性,而未检测到P4HB阳性细胞。
分离自PMMA植入部位的细胞的FACS分析
FACS分析表明分离自炎症部位细胞中超过80%的细胞是Ly-6G(Gr-1,Gr1)阳性的且这些细胞中约18%是P-Alexa阳性细胞。如图7所示,25.1%的P-Alexa阳性细胞是F4/80阳性的;35.15%的P-Alexa阳性细胞是Ly-6G(Gr-1,Gr1)阳性的且9.73%的P-Alexa阳性细胞是CD11c阳性的。所有给出的数据都是同种型对照校正的。用在PMMA颗粒植入后的第一天施用P-Alexa以及在颗粒植入后的第7天的组织分离和处理来重复该研究。尽管总的P-Alexa阳性细胞数目减少,但其仍然被识别为F4/80、Ly-6G或CDl1c阳性的。
P-Dex处理的作用
通过微CT评估P-Dex对骨质溶解的治疗作用。与P-Dex组(0.8618±0.0056)相比,盐水对照组具有显著更小的骨体积比组织体积(BV/TV)的值0.8387±0.0202(p<0.05)。对照组的骨矿物密度(BMD)值是836.4±9.1mg/cm3,其显著低于P-Dex组(858.4±8.7mg/cm3)(p<0.05)。
P-Dex对PMMA颗粒处理的人单核细胞的炎性细胞因子表达的影响
如图8所示,PMMA颗粒攻击导致了在培养的人单核细胞中IL-1α和IL-1βmRNA表达的显著增加。用P-Dex或Dex预处理细胞导致了颗粒诱导的促炎性细胞因子应答(例如,TNF和IL-1)的显著抑制。
虽然已描述了本发明的某些优选实施方式并在上文具体示例,其并非意在使本发明限于此类实施方式。在不脱离如下面的权利要求所提出的本发明的范围和精神情况下,可对本发明作出各种各样的改进。
Claims (20)
1.组合物用于制备被施用至具有植入物的受治疗者以检测植入物松动的药物的用途,所述组合物包括至少一种水溶性聚合物和至少一种药学上可接受的载体,其中所述水溶性聚合物可操作地连接于至少一种显像剂,并且其中所述药学上可接受的载体是无菌液体。
2.组合物用于制备被施用至具有植入物的受治疗者以抑制植入物松动的药物的用途,所述组合物包括至少一种水溶性聚合物和至少一种药学上可接受的载体,其中所述水溶性聚合物可操作地连接于至少一种治疗剂,并且其中所述药学上可接受的载体是无菌液体。
3.如权利要求1或权利要求2所述的用途,其中所述水溶性聚合物是N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)共聚物。
4.如权利要求1所述的用途,其中所述显像剂是放射性同位素。
5.如权利要求1或权利要求2所述的用途,其中所述植入物是骨科或牙科植入物。
6.组合物用于制备被施用至具有植入物的受治疗者以抑制骨质溶解的药物的用途,所述组合物包括至少一种水溶性聚合物和至少一种药学上可接受的载体,其中所述水溶性聚合物可操作地连接于至少一种治疗剂,并且其中所述药学上可接受的载体是无菌液体。
7.组合物用于制备被施用至具有植入物的受治疗者用于确定骨质溶解的增加的风险的药物的用途,所述组合物包括至少一种水溶性聚合物和至少一种药学上可接受的载体,其中所述水溶性聚合物可操作地连接于至少一种显像剂,并且其中所述药学上可接受的载体是无菌液体。
8.如权利要求6或权利要求7所述的用途,其中所述水溶性聚合物是N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)共聚物。
9.如权利要求2或权利要求6所述的用途,其中所述治疗剂是抗炎治疗剂。
10.如权利要求9所述的用途,其中所述抗炎治疗剂是地塞米松。
11.如权利要求7所述的用途,其中所述显像剂是放射性同位素。
12.如权利要求2或权利要求6所述的用途,其中所述水溶性聚合物经由pH-敏感的连接体可操作地连接于所述治疗剂。
13.如权利要求12所述的用途,其中所述pH-敏感的连接体包括腙。
14.如权利要求2或权利要求6所述的用途,其中所述组合物还包括至少一种另外的抗炎治疗剂。
15.如权利要求6或权利要求7所述的用途,其中所述骨质溶解是在骨科或牙科植入物的部位。
16.如权利要求2或权利要求6所述的用途,其中所述治疗剂是地塞米松并且所述水溶性聚合物是N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)共聚物。
17.如权利要求1或权利要求7所述的用途,其中所述水溶性聚合物是N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)共聚物并且所述显像剂是放射性同位素。
18.如权利要求1或权利要求7所述的用途,其中所述水溶性聚合物包含下式:
其中R是连接体;A是所述显像剂;且m和n独立地是1至1000。
19.如权利要求2或权利要求6所述的用途,其中所述水溶性聚合物 包含下式:
其中R是连接体;A是所述治疗剂;且m和n独立地是1至1000。
20.如权利要求19所述的用途,其中所述连接体包括腙键,并且其中所述治疗剂是地塞米松。
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WO2007047556A2 (en) * | 2005-10-14 | 2007-04-26 | Microchips, Inc. | Passive wear-indicating sensor for implantable prosthetic device |
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Non-Patent Citations (1)
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Novel dexamethasone-HPMA copolymer conjugate and its potential application in treatment of rheumatoid arthritis;Dongwang;《Research article》;20070118;第9卷(第1期);第2页右栏第2段-第8页左栏第3段 * |
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