EP2046392A2 - Röntgendichtes konjugat - Google Patents

Röntgendichtes konjugat

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Publication number
EP2046392A2
EP2046392A2 EP07786390A EP07786390A EP2046392A2 EP 2046392 A2 EP2046392 A2 EP 2046392A2 EP 07786390 A EP07786390 A EP 07786390A EP 07786390 A EP07786390 A EP 07786390A EP 2046392 A2 EP2046392 A2 EP 2046392A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
peptide
conjugate
conjugate according
cells
acid
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP07786390A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Stefan Heckl
Alexander Sturzu
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Universitaetsklinikum Tuebingen
Original Assignee
Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Universitaetsklinikum Tuebingen
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eberhard Karls Universitaet Tuebingen, Universitaetsklinikum Tuebingen filed Critical Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Publication of EP2046392A2 publication Critical patent/EP2046392A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
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    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT
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    • A61K49/0043—Fluorescein, used in vivo
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    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a radiopaque conjugate, the use of the conjugate for the preparation of a diagnostic and therapeutic composition, a pharmaceutical and / or diagnostic composition comprising the conjugate, a method for the diagnostic and / or analytical treatment of biological material or a living being, and a method for the therapeutic treatment of a living being.
  • Computed tomography is a very widespread imaging method in emergency and routine examinations, which enables a particularly high resolution, for example of the lung parenchyma, in comparison to magnetic resonance tomography.
  • Contrast agents are used to increase contrast in CT.
  • iodine-containing substances such as iopromide (Ultravist®) or ipitridol (Xenetix®).
  • These contrast agents have as a backbone, due to its radiopaque iodine atoms, 2,3,5-triiodobenzoic acid (TIBA), which was originally mainly used to induce a premature flowering / maturation period Plants was used; see.
  • TIBA 2,3,5-triiodobenzoic acid
  • the currently used iodine-containing contrast agents have the disadvantage that they can not penetrate the membrane of the biological cells and therefore only in the intercellular space, i. in the interstitium of tumors (see Krause W., Delivery of diagnostic agents in computed tomography, Adv. Drug Deliv. Rev., 159-173 (1999)).
  • a contrast agent which has an amphiphilic character and forms in physiological fluids micelles.
  • the contrast agent contains three molecules of TIBA per total molecule bound to a carboxylic acid backbone. Both components form a hydrophobic block.
  • This hydrophobic block is in turn bound to a hydrophilic polymer component consisting of monomethoxypolyethylene glycol (MPEG).
  • MPEG monomethoxypolyethylene glycol
  • the contrast agent because of its retention in the bloodstream, be used exclusively for the presentation of bloodstreams, as a so-called "blood pool” contrast agent, for example in the context of angiography, which is eliminated again after a short time from the body.
  • a comparable very high molecular weight "blood pool” contrast agent is described in the publication by Fu et al., "Dendritic ionidated contrast agents with PEG cores for CT imaging: synthesis and preliminary characterization", Bioconjugate Chem. 17, 1043-1056 (2006 ) having triiodophtalamide groups coupled via beta-alanine to polylysine in the form of "lysine trees".
  • US 2005/0119470 A1 discloses a composition consisting of an iodine-containing compound, namely 2,3,5-triiodobenzoic acid (TIBA), and two peptides or nucleic acids which can at least partially hybridize with one another.
  • TIBA 2,3,5-triiodobenzoic acid
  • RNA silencer two peptides or nucleic acids which can at least partially hybridize with one another.
  • the known extracellular contrast agents are not able to penetrate into biological cells, tumor tissue, for example, can not be exactly distinguished from healthy tissue by computer tomography. Only a washed out representation of the tumor borders occurs. If the said extracellular contrast agents are administered during or directly after an operation, then the contrast agent runs along the intercellular space opened by the surgeon to beyond the tumor borders.
  • WO 2006/069677 A2 describes a composition which comprises a derivative of 2,3,5-triiodobenzoic acid (TIBA) and a "targeting group", for example a nuclear localization sequence (NLS), in combination with a material for producing an implantable medical Device and a therapeutically active agent.
  • TIBA 2,3,5-triiodobenzoic acid
  • NLS nuclear localization sequence
  • the metal clip Since the biopsied tumor does not remain constantly large but changes in size, the metal clip does not remain in its original position and shifts. In biopsies of the mammary gland tissue, one year later, the metal clips could be found far away from the original biopsy site even in another breast quadrant; Philpotts L.E. & Lee C.H., Clip migration after 11-gauge vacuum-assisted stereotactic biopsy: case report. Radiology 222, 794-796 (2002). If bleeding occurs during a biopsy, the metal clip can also be flushed out of the biopsy area via the puncture channel to below the skin; see. Parikh J., Ultrasound Demonstration of Skin Migration within 6 weeks of 11-gauge vacuum-assisted stereotactic breast biopsy. Breast J. 10, 539-542 (2004).
  • radioactive substances may be used, such as radioactive iodine.
  • radioactive iodine Currently, this radioiodine therapy in humans only succeeds in thyroid carcinoma, since this special type of tumor cell expresses the sodium iodine symporter on the cell surface.
  • radioactive iodine is administered to a patient, it is taken up by the thyroid carcinoma cells together with sodium, ie in the sodium iodine symport, into the cell interior, where it can develop its radiochemotherapeutic effect.
  • the sodium-iodine-symporter is present only in thyroid carcinoma, other aggressive cancers, such as brain, prostate or intestinal tumors, in humans so far can not be treated with radioactively labeled iodine ( 131 I), since these tumors can not absorb the iodine .
  • radioactively labeled iodine 131 I
  • these tumors can not absorb the iodine
  • to access human colon carcinoma cells for radioactively labeled iodine they must first be transfected with the gene of the sodium iodine symporter; see. Scholz IV et al., Radioiodine therapy of colon cancer following tissue-specific sodium iodide symporter gene transfer. Gene Ther. 12, 272-80 (2005).
  • These human colon carcinoma cells then express, just like the thyroid carcinoma cells, the cell surface sodium iodine symporter and can now also absorb the radioactively labeled iodine.
  • radioiodine therapy of thyroid carcinoma healthy tissues such as, for example, salivary glands, gastric mucosa and the tactile breast, also receive radioactively labeled iodine, since the sodium iodine symporter is also expressed here; see. Spitzweg C. et al., Analysis of human sodium iodide expression gene in extrathyroidal tissues and cloning of its complementary deoxyribonucleic acids from salivary gland, mammary gland, and gastric mucosa. J. Clin. Endocrinol. Metab. 83, 1746-51 (1998). Therefore, with radioiodine therapy currently used, e.g. Salivary inflammation and changes in taste occur; see. Alexander C.
  • an object of the invention to provide a radiopaque substance which is suitable as a contrast agent and with which the disadvantages of the currently used iodine contrast agents are avoided.
  • it is intended to provide such a contrast agent with which tomographic sharply richer tumor margins can be displayed than is the case with the current contrast agents.
  • Another object of the present invention is to provide a substance which enables improved biopsy site marking than is the case with metal clips currently used.
  • a further object of the invention is to provide a radiopaque substance which can be used therapeutically, in particular for the treatment of tumors, and with which the disadvantages of current radioiodine therapy can be avoided.
  • a substance is to be provided which shows a rapidly occurring effect after administration and is preferably non-radioactive.
  • the first compound may have 1, 2, 3, 4 or 5 halogens or 1, 2, 3, 4 or 5 hydrogen atoms.
  • the halogens or hydrogens can be arranged at any of the indicated positions R 1 to R s .
  • the first compound may have different or identical halogens.
  • R 6 is a carboxyl group
  • 5-iodobenzoic acid, 4-iodobenzoic acid 5-IBA / MIBA, 4-IBA / MIBA; Position R 1 or R 5 or R 4 ), 2,3- or 3,5-diiodobenzoic acid (2,3-DIBA, 3,5-DIBA, two iodine atoms at position R 1 and R 2 or R 4 and R 3 5 or R 3 and R s ), 3,5-diiodobenzoic acid (3,5-DIBA, two iodine atoms at position R3 and R 5 or Ri and Rs), 2,4,6-, 2,3,6- , or 2,3,5-trichlorobenzoric acid (TCBA, three chlorine atoms at the positions R 2 , R 4 , R s , or R 2 , R 3 , R s , and R 2 , R 3 , R s
  • a conjugate is understood to be the linking product of a plurality of substances.
  • the substances linked to one another comprise the first compound and optionally further, for example, second and third compounds and also the first peptide and optionally further, for example second and third peptides.
  • the linkage can be carried out in any desired manner, for example by covalent or ionic bonding.
  • the inventors have found that a particularly good signal in imaging processes can be achieved by the radiopaque halogens with the conjugate according to the invention.
  • the inventors have further surprisingly found that the first compound in complex with a first peptide can penetrate the membrane of biological cells and, moreover, can penetrate into the cell nucleus.
  • the cell membrane and nuclear membrane permeability of the conjugate according to the invention has the great advantage that now the boundaries of a particular tissue or a tumor in the context of an imaging method, such as a computed tomography, can be displayed sharply.
  • the conjugate when administered during or immediately after surgery, can no longer extend beyond the tumor borders along the opened intercellular space.
  • the cell membrane and nuclear membrane permeability of the conjugate according to the invention without coupling of additional large transmembrane transport units, such as, for example, penetratin or transportan. This avoids an unnecessary increase in molecular weight, which could affect the signaling in computed tomography.
  • the conjugate according to the invention is relatively small, ie it is in the range from about 1400 Da to about 3300 Da, preferably from 1600 Da to 1800 Da.
  • the conjugate according to the invention is free of a hydrophilic polymer component, such as monomethoxypolyethylene glycol (MPEG), polyethylene glycol (PEG), polyvinylpyrrolidone (PVP) etc., which are already due to its size would prevent penetration of a compound coupled thereto into the interior of biological cells.
  • a hydrophilic polymer component such as monomethoxypolyethylene glycol (MPEG), polyethylene glycol (PEG), polyvinylpyrrolidone (PVP) etc.
  • MPEG monomethoxypolyethylene glycol
  • PEG polyethylene glycol
  • PVP polyvinylpyrrolidone
  • the conjugate according to the invention is substantially smaller and preferably has a molecular weight of about 0.5 to about 5 kDa, more preferably from about 1 to about 3 kDa, most preferably about 2 kDa.
  • the conjugate according to the invention comprises an amino acid consisting of peptide bonds linked together by peptide bonds, which preferably contains at least two different amino acids. that the conjugate according to the invention can penetrate into biological cells, whereas the known contrast agent remains exclusively in the blood and does not even get into the interstitium.
  • the conjugate according to the invention also has a very large halogen content, up to about 40%, in contrast to the known contrast agent on the whole construct, is not toxic to the whole organism and does not form micelles.
  • the operability of the conjugate according to the invention does not require such a peptide which is hybridizable with an oligomeric compound, such as another peptide or a nucleic acid.
  • the conjugate according to the invention is particularly well suited for labeling a biopsy site since it is biopsied after administration to the biopsy site Tissue remains fixed in place. A later finding of the biopsy site is thus possible without problems.
  • the conjugate of the invention after its uptake into the cells in the latter within a short time the programmed cell death, the so-called apoptosis, triggers.
  • the first compound alone in the form of triiodobenzoic acid (TIBA)
  • TIBA triiodobenzoic acid
  • the initiation of apoptosis by the conjugate according to the invention in the ingested cells takes place already at low concentrations, e.g. in the range of ⁇ 300 ⁇ g conjugate / ml.
  • contrast agents such as diatrizoates, ioxaglates, iopromides, iotroan, do not trigger apoptosis until very high concentrations, e.g. at 250 mg iodine per milliliter); see. Zhang et al. (2000), Effects of radiographic contrast media on proliferation and apoptosis of human vascular endothelial cells, The British Journal of Radiology 73, pp. 1034-1041.
  • the therapeutically usable apoptosis-initiating property of the conjugate according to the invention already shows itself without the presence of a further therapeutically active agent or / and a material for producing an implantable medical device.
  • the conjugate according to the invention has a significant therapeutic potential, which can be used for the treatment of tumor diseases.
  • the uptake into the cells is independent of the sodium-iodine-symporter, so that now not only thyroid carcinomas can be treated, but also other tumors, such as prostate carcinomas, brain tumors and breast cancer.
  • Radiolabeling of the halogens can be dispensed with, since, surprisingly, the apoptosis of the tumor cells is already triggered by the compound that accumulates in the nucleus and is bound to the peptide. Thereby remains a radioactive strain on the body, in particular the gastric mucosa, the salivary glands and the lactating breast from. Patients also no longer need to spend therapy in screened rooms.
  • the conjugate according to the invention can be given into a tumor cavity during an operation, for example for 20 minutes. Following this, the resection cavity is rinsed with conjugate-free buffer solution to remove excess conjugate that was not taken up by the cells.
  • the tumor cells lining the resection cavity are thereby stained intracellularly or intranuclearly and the tumor borders can be sharply visualized in comparison to the previous interstitial iodine contrast agents.
  • the computed tomography devices currently available on the market for use in the operating room and intraoperative resection control can be used, e.g. the mobile CT scanner Philips Tomoscan M, Philips Medical Systems, Eindhoven, The Netherlands.
  • the uptake into healthy tissue is prevented on account of the blood brain barrier intact in the healthy brain parenchyma, whereas in the brain tumor the blood-brain barrier is permeable, so that the conjugate can penetrate and specifically trigger apoptosis.
  • the higher signal density of the tumor cells in computed tomography can be regarded as a sign of tumor apoptosis.
  • a reservoir for example an omaya reservoir, can be applied intratumorally during a brain operation.
  • the solution with the conjugates according to the invention may optionally be infused over a number of cycles via this access.
  • the first peptide may be attached to the first compound in a variety of ways by methods known to those skilled in the art, for example by taking advantage of Compound-side carboxyl group (R 6 ) and formation of a peptidic bond with a peptide-side free NH 2 group.
  • halogen of the first compound is one selected from the group consisting of: iodine, bromine, fluorine, chlorine, and astatine.
  • the first compound is one selected from the group consisting of: triiodobenzoic acid (TIBA), 5-iodobenzoic acid (5-IBA, 5-MIBA), 4-iodobenzoic acid (4- IBA, 4-MIBA), 2,3-diiodobenzoic acid (2,3-DIBA), 3,5-diiodobenzoic acid (3,5-DIBA), 2,5-diiodobenzoic acid (2,5-DIBA), trichlorobenzoic acid ( TCBA), trifluorobenzoic acid (TFBA), tribromobenzoic acid (TBBA), tribromophenyl isothiocyanate (TBPI).
  • TIBA triiodobenzoic acid
  • 5-IBA 5-iodobenzoic acid
  • 5-MIBA 5-MIBA
  • 4-iodobenzoic acid (4- IBA, 4-MIBA
  • TIBA has the molecular formula I3C6H2CO2H and a molecular weight of 499.81 Da.
  • TIBA is listed under CAS number 88-82-4.
  • the benzene ring of the compound is iodine-iodinated 3 times, preferably at positions 2, 3 and 5 (R 1 , R 2 and R 4 ) or 2, 4 and 6 (R 1 , R 3 and R 5 ). The iodination is also possible at other positions of the benzene ring.
  • IBA / MIBA has the molecular formula IC6H4CO2H and a molecular weight of 248.02 Da.
  • IBA / MIBA is listed under CAS number 88-67-5.
  • 2,3-DIBA, 3,5-DIBA, 2,5-DIBA have the molecular formulas C7H4I2O2 and the molecular weights of 373,914 Da on.
  • 2,3-DIBA, 3,5-DIBA, 2,5-DIBA are listed under CAS numbers 19094-48-5 (3.5) and 14192-12-2 (2.5), respectively.
  • TCBA has the molecular formula C 7 H 3 Cl 3 O 2 and a molecular weight of 225.45862 Da.
  • TCBA is listed under CAS number 50-73-7.
  • TFBA has the molecular formula C 7 H 3 F 3 O 2 and a molecular weight of 176.09 Da.
  • TFBA is listed under CAS number 121602-93-5.
  • TBPI has the molecular formula C 7 H 2 Br 3 NS and a molecular weight of 371.87158.
  • TBPI is listed under CAS number 22134-11-8.
  • TBBA has the molecular formula C? H 3 Br 3 O 2 and a molecular weight of 358.81 Da.
  • TBBA is listed under CAS number 633-12-5.
  • the first peptide of the conjugate according to the invention has a net positive charge.
  • Net charge is understood as meaning the charge of the first peptide which, under physiological conditions (pH 7), results from the charge contribution of the individual positively or negatively charged amino acid residues of the peptide.
  • the inventors have surprisingly found that the cell membrane and nuclear permeability of the conjugate of the invention is particularly well achieved when the first peptide has a net positive charge.
  • the first peptide preferably has such amino acids that are positively charged under physiological conditions.
  • the first peptide according to the invention therefore preferably has one or more molecules of the "basic" amino acids arginine (R), lysine (K) or histidine (H).
  • the first peptide in the conjugate according to the invention prefferably has 2-20, more preferably 5-10, and most preferably seven amino acids.
  • the inventors have surprisingly found that such short peptides are sufficient to mediate the transport of the conjugate through both the cell membrane and the nuclear membrane.
  • large transport peptides such as penetratin or transportan, are therefor not mandatory. Due to the small size of the first peptide, the ratio between the TIBA signaling in the imaging method and the non-signaling first peptide is kept as low as possible, and a good signal is generated even with a small amount of conjugate.
  • the first peptide is derived from a nuclear localization sequence (NLS).
  • NLS nuclear localization sequence
  • NLS Nuclear localization sequences
  • the nuclear membrane permeability of the conjugate of the invention was also achieved using a mutant NLS. Already a 20% or 40%, preferably 60%, more preferably 80%, most preferably 90% sequence identity with a natural NLS is sufficient. It is crucial that at least one or more of the "basic" amino acids contained in the natural NLS remain present.
  • the first compound is bound to the peptide via its carboxyl group.
  • This measure has the advantage that a group which is particularly suitable for coupling the peptide to the benzene ring of the first compound is used without as a result, the halogen substituents are involved in the bond or, if appropriate, sterically hindered or shielded, but rather are available for realizing the invention.
  • the first peptide has a free amino function in the side chain via which it is bonded to the first compound.
  • This measure has the advantage that even on the first peptide a particularly suitable reactive group is exploited, via which a binding to the first compound, for example.
  • a particularly suitable reactive group is exploited, via which a binding to the first compound, for example.
  • free amino functions are found, for example, in the side chain of asparagine (N), glutamine (Q), or lysine (K) and at the N-terminus of the peptide.
  • the peptide has an ⁇ -amino function of a C-terminal lysine residue, via which it is bound to the compound.
  • the conjugate according to the invention assumes a particularly advantageous conformation which ensures the imaging and apoptosis-inducing properties.
  • the terminal lysine residue may either be part of the first peptide or may be attached to a terminal end of the first compound as a kind of "hanger".
  • the first peptide has the amino acid sequence PKKKRKV (SEQ ID NO: 1) or PKKTRKV (SEQ ID NO: 2) or PLGLA (SEQ ID NO: 13).
  • the C-terminus is on the right and the N-terminus on the left.
  • the usual one-letter code was used for Amino acids.
  • This measure has the advantage of providing the design prerequisites for a first peptide which has a net positive charge and is derived from the NLS sequence of the SV40 T antigen.
  • the sequence PKKKRKV was identically taken from the NLS of the SV40-T antigen, while in the sequence PKKTRKV at the fourth position opposite to the NLS from the SV40-T antigen a lysine (K) was replaced by a threonine (T).
  • first peptides with sequences having homology of 80%, 85%, 90%, 95%, 98% to SEQ ID NO: 1 or NO 2 are also suitable.
  • a lysine residue can readily be provided, for example, at the C-terminus, so that, for example, the following sequences are obtained: PKKKRKVX or PKKTRKVK, wherein the lysine "hanger" is shown in italics.
  • the conjugate according to the invention has a detectable marker.
  • a detectable marker means any compound which can be identified by means of imaging methods. These include color indicators such as dyes having fluorescent, phosphorescent or chemiluminescent properties, dansyl or coumarin dyes, AMPPD, CSPD, non-radioactive indicators such as biotin or digoxigenin, alkaline phosphatase, peroxidase, etc.
  • radioactive indicators such as 32 P, 3 S, 132 I, 31 I, 14 C or 3 H can be used, in which case the disadvantages described above in connection with the radioiodine therapy in Purchase must be taken.
  • microscopy, blotting, hybridization techniques or autoradiography may be considered as imaging techniques.
  • the detectable marker is a fluorescent dye, preferably fluorescein isothiocyanate (FITC).
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • Fluorescence microscopes are available in most operating theaters. Thus, after administration of the conjugates according to the invention into the tumor cell, the tumor borders can already be displayed by fluorescence microscopy during the operation. This allows an even better localization of the tumor and possibly better therapeutic or surgical measures.
  • the detectable marker has a free amino function of an amino acid, preferably an ⁇ -amino function of a lysine residue, via which it is bound to the peptide.
  • the lysine residue can either be part of the first peptide or can be attached to a terminal, preferably C-terminal, end of the first peptide as a kind of "hanger" for the detectable marker.
  • a Aminoklarespacer is arranged, which preferably has 2 amino acids, more preferably the amino acid sequence GG (SEQ ID NO: 3).
  • This measure has the advantage that interfering steric interactions between the detectable marker and the first compound are largely avoided and thus the conjugate according to the invention remains functional despite the bound further detectable marker.
  • the amino acid spacer can have any amino acid sequence or even a length of 1 or 3 amino acids, since this essentially serves to space the first peptide or the detectable marker from the first compound, although the sequence GG has proved to be particularly suitable.
  • the spacer can furthermore have C and / or N-terminal lysine residues as "hangers" for the detectable marker or the first compound
  • the amino acid spacer can also be replaced by a nonpeptidic spacer as long as the function described above is ensured.
  • the conjugate according to the invention further comprises at least one component which confers tumor cell specificity or specificity for virus-infected cells.
  • Such a component which may be coupled to or incorporated into the conjugate in a manner known to those skilled in the art, may be realized, for example, in the form of an antibody and / or an aptamer having a specificity or affinity for such Cell, for example, binds to a tumor marker or an infection marker that is specifically expressed on the surface of a tumor or infected cell.
  • Such a component may also be realized, for example, in the form of a synthetic ligand having specificity for such cells, or by viruses or components thereof, which are coupled to the conjugate of the invention and confer tropism to tumor cells or virus-infected cells to the latter.
  • the component has a third peptide which (i) has a charge which at least neutralizes the net positive charge of the first peptide, and (ii) is linked to the conjugate via a second peptide which has an amino acid recognition sequence for a tumor cell or virus-specific enzyme having.
  • tumor cell- or virus-specific enzyme are preferably matrix metalloproteinases (MMP), cathepsins, prostate-specific antigen (PSA), herpes simplex virus protease, human immunodeficiency virus protease, cytomegalovirus protease, interleukin-lß-converting enzyme in question.
  • This measure has the advantage that a tumor cell specificity or specificity for virus-infected cells is imparted to the conjugate according to the invention in a particularly effective manner.
  • various tumor or carcinoma cells express characteristic enzymes and secrete them into their cellular environment, for example in order to digest the surrounding connective tissue in order to invade previously healthy tissues or organs.
  • Glioblastomas for example, predominantly express and secrete matrix metalloproteinase 2 (MMP2).
  • MMP2 matrix metalloproteinase 2
  • Breast cancers express and secrete predominantly cathepsins which recognize and cut a specific amino acid sequence.
  • Prostate cancers express and secrete mainly prostate specific antigen (PSA). It is also known that virus-infected cells express and secrete virus-specific proteases.
  • PSA prostate specific antigen
  • Herpes simplex virus (HSV) infected cells secrete herpes simplex virus protease.
  • Cells infected with the HIV virus express and secrete HIV proteases.
  • Cells infected with cytomegalovirus express and secrete a protease specific for this type of virus.
  • MMP2 recognizes the sequence PLGVR (SEQ ID NO: 4), PLGVA (SEQ ID NO: 5) or PLGLA (SEQ ID NO: 13), while cathepsin B recognizes the specific sequences KK (SEQ ID NO: 6) and / or RR (SEQ ID NO. SEQ ID NO. 7).
  • Cathepsin D recognizes the sequence PIC (Et) FF, where "Et” denotes an ester branch, Cathepsin K recognizes the specific sequence GGPRGLPG (SEQ ID No. 8), whereas PSA recognizes the amino acid sequence HSSKLQ (SEQ ID No.
  • Enzymes and their specific recognition and cleavage sites are well described in the art, an overview of which is given in Hahn, WC and Weinberg, RA, Rules for making human tumor cells, N. Engl. J. Med. 347, pages 1593-1603 (2002), the content of which is incorporated herein by reference.
  • the HSV protease recognizes the amino acid sequence AEAGALVNASSAAHVDV (SEQ ID NO: 10), the HIV protease recognizes the sequence SQNYPIVQ (SEQ ID NO: 11), the cytomegalovirus protease recognizes the sequence GWNASCRLA (SEQ ID NO: 12).
  • Second peptides with sequences having homology of 80%, 85%, 90%, 95%, 98% to the above sequences are also suitable.
  • the third peptide of the component having a charge that at least neutralizes the net positive charge of the first peptide is of particular importance for tumor cell specificity of the conjugate or specificity for virus-infected cells.
  • the third peptide has a net negative charge that cancels the positive charge of the first peptide.
  • the negative net charge of the third peptide can be realized, for example, by negatively charged amino acids, such as glutamic acid (E) or aspartic acid (D).
  • At least neutralizing in this context means that the third peptide can also result in a net negative charge of the modified construct of the invention As a result of this neutralization or negativity of the charge of the conjugate of the present invention so modified, the latter accumulates in the interstitium and is no longer in However, the situation is different in the environment of tumor cells, where the tumor cell-specific extracellular proteases mentioned above cause the cleavage of the second peptide, the corresponding one This results in the environment of tumor cells or of virus-infected cells at a loss of the neutralizing or negative charge of the third peptide.
  • the positively charged first peptide re-affords a net positive charge whereby the conjugate of the present invention can penetrate both the cell membrane and the nuclear membrane of the tumor cells and virus-infected cells, respectively. This process is thus dependent on the environment of the tumor cells or virus-infected cells, so that the modified conjugate according to the invention can only penetrate into such cells and there develop the apoptotic effect.
  • the component has the following, namely a second compound with the following formula:
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 and R s each independently correspond to a halogen or a hydrogen
  • a second one peptide linked to the second compound which has an amino acid recognition sequence for a tumor cell- or virus-specific enzyme, the component being linked to the conjugate via the second peptide.
  • the inventors thus provide such a conjugate which itself blocks in its ability to penetrate into the cytoplasm or cell nuclei of healthy cells. This self-lock is ensured by the presence of the second connection. Due to the associated size and configuration of the conjugate, an uptake into the cytoplasm or the Nucleus of healthy cells prevented. Rather, the conjugate remains in the interior and is excreted from the organism after some time. By contrast, in the vicinity of tumor cells or virus-infected cells, the second, specificity-mediating peptide is recognized and cut by the tumor- or virus-specific proteases.
  • the second compound is thereby cleaved from the conjugate and the latter can penetrate due to the first peptide in the cytoplasm and the cell nucleus of the tumor cell.
  • the separated second compound remains after cleavage by the tumor or virus-specific protease for some time in the interstitium and acts in a configuration as a contrast agent advantageously significantly in the signaling in the tumor or infected area with them until they are removed from the interstitium and the organism is excreted. It is particularly advantageous that the separated second compound has no neurotoxic properties, as described, for example, for peptides with a negative net charge; see. Garattini et al. (2000), Glutamic Acid, Twenty Years later, J. Nutr. 130 (4S Suppl.): 901S-9S.
  • the conjugate according to the invention thus modified becomes, as it were, "activated” in the vicinity of tumor or virus-infected cells and cell membrane and nuclear membrane permeable, whereas such activation does not occur in the presence of healthy cells modified conjugate unfolds its properties exclusively in tumor cells or virus-infected cells.
  • the halogen of the second compound is selected from a group consisting of: iodine, bromine, fluorine, chlorine, and astatine.
  • halogens are characterized by their high radiopacity and therefore provide particularly good signals in imaging processes.
  • the second compound is selected from the group consisting of: triiodobenzoic acid (TIBA), 5-iodobenzoic acid (5-IBA, 5- MIBA), 4-iodobenzoic acid (4-IBA, 4-MIBA), 2,3-diiodobenzoic acid (2,3-DIBA), 3,5-diiodobenzoic acid (3,5-DIBA), 2,5-diiodobenzoic acid (2, 5-DIBA), trichlorobenzoic acid (TCBA), trifluorobenzoic acid (TFBA), tribromobenzoic acid (TBBA), tribromophenyl isocyanate (TBPI).
  • TIBA triiodobenzoic acid
  • 5-IBA 5-iodobenzoic acid
  • 4-MIBA 4-iodobenzoic acid
  • the second peptide has the amino acid sequence PLGLR (SEQ ID NO: 4) and / or PLGVA (SEQ ID NO: 5) and / or PLGLA (SEQ ID NO: 13).
  • MMP-2 matrix metalloproteinase 2
  • Second peptides with sequences having homology of 80%, 85%, 90%, 95%, 98% to SEQ ID NO: 4 or NO. 5 are also suitable.
  • MMP-2 inhibitors such as prinomastate
  • the second peptide is bound to the second compound via the ⁇ -amino function of a C-terminal lysine residue.
  • the lysine residue may be part of the second peptide, but also connect to it C- or N-terminal, so that, for example, the following sequences for the second peptide are obtained: PLGLRiC or PLGVAiC, wherein the lysine "hanger" is shown in italics .
  • the Lysine residue may preferably be covalently bound to the second peptide via its ⁇ -amino group or its ⁇ -carboxyl group.
  • the conjugate according to the invention has a third peptide, which preferably has a net positive charge, more preferably 2 to 20, preferably 5 to 10, more preferably 7 amino acids. Further, it is preferred if the third peptide is derived from a nuclear localization sequence (NLS). The third peptide preferably has a free amino function of a side chain via which it is bonded to the second compound, preferably via an ⁇ -amino function of an N-terminal lysine residue. It is preferred if the third peptide has the amino acid sequence PKKKRKV (SEQ ID NO: 1) or the amino acid sequence PKKTRKV (SEQ ID NO: 2).
  • the third peptide thus has the same properties as the first peptide.
  • the comments made on the first peptide therefore apply correspondingly to the third peptide.
  • a detectable marker such as FITC
  • another dye such as rhodamine
  • rhodamine may also be coupled to the third peptide in the appropriate manner so that the markers differ from one another. This measure creates a more or less symmetrical tumor-specific conjugate, wherein after cleavage of the second peptide by a tumor cell-specific protease, such as MMP-2, both cleavage products can penetrate specifically into the tumor cell.
  • the tumor cell specificity-mediating component comprises a nucleic acid molecule which hybridizes under stringent conditions to tumor cell-specific molecules, preferably oncogenes.
  • nucleic acid molecule can be bound in a variety of ways to the conjugate according to the invention by methods known to those skilled in the art. There is a coupling both to the first and / or second peptide and to TIBA conceivable.
  • the nucleic acid sequence is chosen so that it is largely complementary to the nucleic acid sequence of tumor cell-specific molecules, such as, for example, the coding sequence of an oncogene.
  • nucleic acid molecule can thereby act in the manner of an "anchor” and accumulate the conjugate according to the invention in the tumor cells, so that only there can its activity be unfolded For this purpose, in contrast, there is no accumulation of the construct according to the invention in non-transformed, healthy cells
  • the nucleic acid molecule can be designed to hybridize either to the mRNA or to the DNA coding for the tumor cell-specific molecules: an overview of known oncogenes and genes, the are involved in the growth of tumors, and from which the sequences for the realization of the nucleic acid molecule can be derived, can be found in Vogelstein, B. and Kinzler KW, Cancer genes and pathways day control, Nat. Med. 10, pages 789- 799 (2004). The content of this publication is incorporated herein by reference logon application.
  • Another object of the present invention relates to the use of the conjugate described above for the preparation of a diagnostic composition, which is preferably a contrast agent for computed tomography (CT) and / or radioiodine therapy.
  • a diagnostic composition which is preferably a contrast agent for computed tomography (CT) and / or radioiodine therapy.
  • Another object relates to the use of the conjugate according to the invention for the preparation of a therapeutic composition, which is preferably an apoptosis-inducing composition.
  • a further subject relates to a pharmaceutical and / or diagnostic composition
  • a pharmaceutical and / or diagnostic composition comprising the conjugate according to the invention and optionally a pharmaceutically and / or diagnostically acceptable carrier.
  • Diagnostically and pharmaceutically acceptable carriers with optionally further additives are well known in the art and are described, for example, in the paper by Kibbe A., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Edition, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press 2000. These include, for example, binders, disintegrants, lubricants, salts and other substances used in the formulation of drugs.
  • Another object of the present invention relates to a method for the diagnostic and / or analytical treatment of biological material or a living being, comprising the following steps: (a) incubation or administration of the conjugate according to the invention with biological material or into a living being, (b) carrying out a imaging process.
  • Imaging techniques are generally nuclear medicine / radiology techniques, including angiography, positron emission tomography, scintigraphy, and near-infrared imaging and conventional fluorescence microscopy, respectively, with computed tomography (CT) being preferred.
  • CT computed tomography
  • Another object of the present invention relates to a method for the therapeutic treatment of a living being, in which the conjugate according to the invention is administered into the animal.
  • Fig. 1 shows by way of example the ESI mass spectra for the conjugates 1-4 with molecular masses of 2123.4 Da (Kl) (A), 2096.3 Da (K2) (B), 1641.8 Da (K3) (C ) and 1614.6 Da (K4) (D).
  • Fig. 2 shows fluorescence and transmission light microscopic images of human malignant U373 glioma cells after incubation with PBS alone for 20 minutes (native, column 1), TIBA-containing conjugate 2 (mutant NLS) (126 ⁇ M, 260 ⁇ M, 2.6 mM, columns 2-4) and non-TIBA-containing conjugate 4 (mutant NLS) (26 ⁇ M, 260 ⁇ M, 2.6 mM, columns 5-7).
  • TIBA-containing conjugate 2 126 ⁇ M, 260 ⁇ M, 2.6 mM, columns 2-4
  • non-TIBA-containing conjugate 4 mutant NLS
  • FITC channel Localization of the FITC-labeled conjugate. Untreated cells show no autofluorescence.
  • Second column (propidium iodide (P ⁇ ) channel): result of the PI vitality test. The nuclei of dead cells are stained. The living cells remain dark.
  • FIG. 3A FACS (fluorescence activated cell sorting) analysis demonstrating a low percentage of highly labeled cells after incubation with non-TIBA-containing conjugates (conjugate 3: 26 ⁇ M / 6%, 260 ⁇ M / 7%, and 2.6 mM / 10%) (conjugate 4: 26 ⁇ M / 4%, 260 ⁇ M / 11% and 2.6 mM / 13%).
  • FIG. 3B After incubation with the TIBA-containing conjugates (conjugate 1: 26 uM / 22 ° / 0/260 uM / 82% and 2.6 mM / 93%) (conjugate 2: 26 uM / 0%, 260 uM / 78% and 2.6 mM / 86%) a marked increase of strongly stained cells to more than 90% could be observed.
  • FIG. 3C After incubation with the TIBA-containing conjugates at 260 ⁇ M and 2.6 mM, two cell populations could be distinguished on a morphological basis (side scatter versus forward scatter FACS analysis).
  • Figure 4A CLSM images of human malignant U373 glioma cells.
  • Annexin V Alexa TM 568 reagent was used to detect phosphatidyl serine in the outer membrane of necrotic or apoptotic cells. Incubation with TIBA alone or non-tiba-containing conjugates 3 and 4 did not result in the binding of annexin V-Alexa TM 568 reagent to the surface of the glioma cells. The co-incubation of TIBA with conjugates 3 and 4 also did not result in the binding of Annexin V Alexa TM 568 reagent to the surface of the glioma cells and did not result in a higher cell staining rate.
  • Glioma cells A very large number of cell nuclei were stained with the FITC-labeled TIBA-containing conjugates 1 (row 1) and 2 (row 2) (260 ⁇ M) (left column). Most of these cells show the expression of phosphatidylserine in the outer membrane and were therefore stained with the Annexin V Alexa TM 568 reagent (right column).
  • FIG. 4C Fluorescence microscopy of semithin sections (approximately 0.4 ⁇ m) of human malignant U373 glioma cells after incubation with the TIBA conjugates 1 (correct NLS) and 2 (mutated NLS). The nucleoli of the cells are clearly colored.
  • Fig. 5B Corresponding MTT test results of cell pellets from computed tomography after incubation with conjugate 2 (top) and conjugate 1 (bottom) both: 26 ⁇ M, 260 ⁇ M and 2.6 mM). Only vital cells oxidize the yellow methyl thiaoctyl tetrazolium (MTT) salt in blue formazan (incubation either with PBS alone or with both conjugates at 26 ⁇ M).
  • MTT yellow methyl thiaoctyl tetrazolium
  • Figure 5C CT uptake (InSpace) of U373 human malignant glioma cells after incubation (20 minutes) with PBS alone (left), TIBA-containing conjugate 1 (correct NLS) (middle), and TIBA-containing conjugate 2 (mutant NLS) (right) (both 2.6 mM). There were no significant differences between conjugates 1 and 2.
  • FIG. 5D Corresponding signal density for the cell pellets in the tubes 1-9 (partial illustration A).
  • Fig. 6A Top: CT image of human prostate cancer cells (PC3) after
  • PC3 FACS (fluorescence activated cell sorting) analysis similar to that of human malignant U373 cells.
  • the upper cloud represents the population of strongly stained cells (high, right histogram peak, upper left image).
  • the lower cloud represents the population of the weakly colored cells (flat, left histogram peak, lower left image)
  • Fig. 7 Confocal laser microscopy of human malignant LN18 glioma cells.
  • Annexin-V-Alexa TM 568 reagent was used to detect phosphate! - Dylserin in the outer membrane leaf necrotic or apoptotic cells ver used.
  • Coincubation of either MIBA (4-monoiodo benzoic acid) or DIBA (2,5-diiodobenzoic acid) with Conjugate 3 did not bind Annexin-V-Alexa TM 568 to the glioma cell surface and was compared to incubation with Conjugate 3 alone is not associated with a higher staining rate.
  • Fig. 8 Confocal laser microscopy of human malignant LNI 8 glioma cells.
  • U373 glioma cells after incubation with conjugate 12 Many nuclear stained nuclei; top left: FITC channel: determination of the localization of the conjugate; top right: Annexin channel for staining with annexin-Alexa as a sign of strong expression of phosphatidylserine in cell death; bottom left: transmitted light microscopy; bottom right: superposition of FITC- u. Annexin channel.
  • LN18 and U373 glioma cells with conjugate 12 (260 ⁇ M and 2.6 mM). At the higher concentration significantly more cells are stained in both cell lines. This staining is more pronounced in U373 glioma cells.
  • the cloud diagram shows two morphologically different populations at the higher concentration.
  • FIG. 12 CT image (InSpace mode) of the LN18 and U373 glioma cells according to FIG.
  • Fig. 13 Confocal laser microscopy of LN18 glioma cells.
  • TFBA free, uncoupled trifluorobenzoic acid
  • conjugate 13 trifluorobenzoic acid is tightly coupled to K3
  • PI propidium iodide
  • Figure 14 CLSM of LN18 glioma cells. After incubation with conjugate 3 together with free trichlorobenzoic acid, only a few nuclear-colored cells are present. These cells remain vital (lack of staining with Anne). xin-Alexa, column 2). Only after incubation with conjugate 14 (TCBA tightly coupled to K3) do almost all nuclei stain. The cells are dead (color, with Alexa-annexin).
  • Fig. 15 Confocal laser microscopy of LN18 glioma cells. Incubation with free tribromophenyl isocyanate (TBPI) alone does not lead to cell death (no Annexin-Alexa staining, 2nd column). The TBPI-free conjugate 3 does not nuclearly nucleate a small number of cells, which remain vital (no staining with annexin). The co-incubation of free TBPI with conjugate 3 also leads to only a few nuclear-stained cells without impairment of vitality (lack of staining with annexin). Only after incubation of Kl 5 (TBPI fixed to K3) does a massive nuclear staining of almost all cells appear (column 1). Alexa-annexin binds to the surface of cells (2nd column, signs of cell death).
  • TBPI tribromophenyl isocyanate
  • Fig. 16 A Confocal laser microscopy (superimposition of the FITC and Alexa
  • the nuclei of the LN18 glioma cells accumulate the FITC-labeled tribromophenyl isocyanate-NLS conjugate (K 15).
  • the red Alexa annexin binds to phosphatidylserine, which is strongly expressed on the cell surface in cell death.
  • B Fluorescence activated cell sorting (FACS) analysis of LN 18 and U373 glioma cells after incubation with either conjugate 3 alone, conjugate 3 plus free tribromophenyl isocyanate (TBPI) or the TBPI-NLS conjugate 15.
  • a marked increase in strong cells stained with FITC shift of the histogram peak to the right
  • C Semi-thin section of an LN18 glioma cell. The nucleolus (in the center) is strongly stained by the tribromophenyl isocyanate-NLS conjugate 15.
  • FIG. 18 Active principle of the tumor-specific conjugate 16.
  • Fig. 19 Confocal laser microscopy of LN18 glioma cells after incubation with conjugate 16 in the presence of inactive (top row) or active matrix metalloproteinase 2 (MMP-2).
  • MMP-2 active matrix metalloproteinase 2
  • the nuclei first stain through the cleaved conjugate after exposure to the active MMP-2 (left column). Only the cleaved conjugate triggers cell death (uptake of propidium iodide, second column).
  • FACS fluorescence activated cell sorting
  • Fig. 21 CT image (in space mode).
  • Left tube LN18 glioma cells (native,
  • Conjugates 1-8 (Table 1) were synthesized on an Eppendorf ECOSYN P solid phase synthesizer with Fmoc-Rink amide Tentagel SRAM (0.25 mM / g) (Rapp Polymere, Tübingen, Germany). All amino acids (0.1 mM per 0.4 g resin), except for the N-terminal proline, were incorporated with amino functions protected by the 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) group: The functions of the side chains were protected as tert-butyl ether (threonine), 2.2.4.6.7.
  • Fmoc-Lys N * -2,3,5-triiodobenzoyl was prepared by the coupling of KP-Fmoc-Lys-OH with 2,3,5-triiodobenzoic acid (TIBA) by activation with isobutylchloroformate (1 eq.). and N-methylmorpholine (1 eq.) (mixed anhydride coupling). The substance was recrystallized from the DMF / diethyl ether.
  • the FITC portions were introduced into the lysine 8 residue with fluorescein-5 (6) -isothiocanate in DMSO-N-methylmorpholine (1 eq.) After the 4-methyltrityl group of lysine-8 with TFA in dichloromethane. romethan (1%) + triisopropylsilane (1%) for 1 hour at room temperature.
  • the N-terminal proline was introduced as a Boc derivative.
  • a simultaneous cleavage of the protecting groups of the amino acid side chains was carried out by reacting the resin in a mixture of 12 ml trifluoroacetic acid, 0.3 ml ethanedithiol, 0.3 ml anisole, 0.3 ml water and 0.1 ml triisopropylsilane for 2 hours was incubated. The mixture was filtered and washed with TFA, and the combined filtrates were precipitated with anhydrous diethyl ether.
  • the crude products were further purified by HPLC on a Nucleosil column 100 C18 (7 ⁇ m) 250 ⁇ 10, monitoring elution at 214 nm (buffer A: 0.07% TFA / H 2 O, buffer B: 80% CH 3 CN / 0.058 % TFA / H 2 O, 4 ml / min).
  • the peptides were analyzed for purity by analytical high performance liquid chromatography (HPLC) and electrospray ionization mass spectrometry (ESI / MS) (see 1.2). The purity of the substance was at least 98%.
  • Fmoc Lys (N-benzoyl), Fmoc Lys (N -4-monoiodobenzoyl) and Fmoc Lys (N-2,5-diiodobenzoyl) were prepared by coupling N-Fmoc Lys-OH with benzoic acid (BA), 4-monoiodobenzoic acid (MIBA ) and 2,5-diiodobenzoic acid (DIBA) (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany) [activation with isobutylchloroformate (iBuOCOCI) (1 eq.) (Merck) and N-methylmorpholine (NMM) (1 eq.) (Fluka, Buchs, Switzerland) (mixed anhydride coupling)].
  • BA benzoic acid
  • MIBA 4-monoiodobenzoic acid
  • DIBA 2,5-diiodobenzoic acid
  • IBA 2,5-diio
  • conjugates 9, 10 and 11 were otherwise described in the same way as in 1.1.1.
  • the purity of the conjugates (at least 98%., was checked by analytical HPLC (high performance liquid chromatography).
  • the mass was determined by electrospray ionization mass spectrometry (ESI / MS) (see 1.2).
  • Fmoc Pro N-triiodobenzoyl was prepared by coupling N-Fmoc-Pro-OH with triiodobenzoic acid.
  • the remaining synthesis of conjugate 12 was carried out on an Eppendorf ECOSYN P solid-phase peptide synthesizer (Eppendorf-Biotronik, Hamburg, Germany) as described under 1.1.1 [purity of the conjugate at least 98%, analytical HPLC (high-performance liquid chromatography)] , The mass was determined by electrospray ionization mass spectrometry (ESI / MS) as in Sch. 1 (see 1.2).
  • Fmoc Lys (N-benzoyl), Fmoc Lys (N-trichlorobenzoyl), Fmoc Lys (N -2,5-trifluorobenzoyl), and Fmoc Lys (N-2,4,6-tribromo-phenyl-ureido) -OH were prepared by coupling N -Fmoc Lys-OH with either benzoic acid (BA), trichlorobenzoic acid (TCBA), trifluorobenzoic acid (TFBA) (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany) or 2,4,6-tribromophenyl isocyanate (TBPI) (Sigma-Aldrich) Activation with isobutyl chloroformate (iBuOCOCI) (1 eq.) (Merck) and N-methylmorpholine (NMM) (1 eq.) (Fluka, Buchs, Switzerland) (mixed anhydride coupling).
  • BA benzoic acid
  • Lysine derivatives with 4-methoxytrityl (Mmt) protection were used for the side chains to be provided with the triiodobenzoyl groups.
  • the N-terminal amino acid proline is introduced into the peptide as Boc-proline.
  • the Mmt side-chain protecting group is cleaved by one-hour addition of 1% TFA / dichloromethane (DCM) solution containing 1% triisopropylsilane.
  • DCM dichloromethane
  • the exposed side chain becomes available for coupling with 2.3.5% triiodobenzoic acid Available (3 eq in the presence of 3 eq of TBTU and 6 eq of diisopropylethylamine within 1.5 h at room temperature).
  • the Dde-protecting group is cleaved by multiple additions of the resin with a 2.5% hydrazine hydrate solution in DMF within one hour.
  • the fluorescein urea derivative is prepared by coupling 0.5 mM fluorescein 5 (6) isothiocyanate in the presence of eq. Amount of diisopropylethylamine in DMSO prepared overnight at room temperature.
  • the remaining protective groups and the peptide are split off from the resin after drying. This is done by stirring the dried resin for three hours in a mixture of 12 ml of TFA, 0.3 ml of ethanedithiol (EDT), 0.3 ml of anisole, 0.3 ml of water and 0.1 ml of triisopropylsilane at room temperature.
  • the crude peptides thus obtained are purified by semipreparative HPLC using a Nucleosil 100 7 mm C18 column (10 ⁇ 250 mm) (buffer A: 0.07% TFA / H 2 O, buffer B: 80% CH 3 CN in 0.058% TFA / H 2 O) (4 ml / min 90 bar, 214 nm); 10® 90% B in 13 min.
  • the resulting conjugate is homogeneous in analytical HPLC (purity at least 98%) and consistent with its structure (ESI-MS).
  • the conjugates were analyzed by ESI-MS on an Esquire 3000+ spectrometer ion trap mass spectrometer (Bruker-Daltonics, Bremen, Germany).
  • the peptides were dissolved in 40% ACN, 0.1% formic acid in water (v / v / v) (20 pmol / ⁇ l) was dissolved and uniformly infused using a syringe pump (5 ⁇ l / min flow rate).
  • the mass spectra were generated in the positive ion mode. Dry gas (6 l / min) was brought to a temperature of 325 0 C, the nebulizer to 20.0 psi and the electrospray voltage to - 3700 V.
  • the conjugate 16 was dissolved in HEPES buffer containing once the active MMP-2 (Calbiochem, Bad Soden, Germany) and once the inactive MMP-2 proform (Calbiochem). Incubation in HEPES with active MMP-2 took 2 hours.
  • APMA 4-aminophenyl mercuric acetate
  • conjugate 16 was incubated with HEPES buffer only. The experiments were also performed with an MMP-2 inhibitor. The cleavage products were evaluated by HPLC:
  • Buffer B 0.058% CF 3 COOH / 80% CH 3 CN
  • U373 human malignant glioma cells were exposed to up to 70% confluence in RPMI 1640 ready mix medium containing L-glutamine and 10% FBS-GoId (PAA). bora tories, Pasching, Austria) at 37 0 C, 5% CO 2 (vol / vol) in 4-well PIatten (NUNC, Wiesbaden, Germany) with approximately 300,000 cells per well grown.
  • the cells were washed with Dulbecco's PBS (D-PBS; GIBCO, Invitrogen, Germany) alone (negative control) and 26 micromolar to 260 micromolar and 2.6 millimolar solutions of the conjugates 1-4 in D-PBS for 20 minutes at 37 0 C.
  • D-PBS Dulbecco's PBS
  • GIBCO Invitrogen, Germany
  • a reversal microscope (Axiovert 135 M, Carl Zeiss, Jena, Germany), Long-distance (LD) Objective (Carl Zeiss, Jena, Germany), an illuminator N HBO103 (Carl Zeiss, Jena , Germany) and standard fluorescence filters for excitation and emission of FITC and PI.
  • the images were taken with a 3-CCD color video camera (MC3254P, Sony, Japan) and the Axiovision software (Carl Zeiss, Jena, Germany). The intensity of cell fluorescence was recorded as the exposure time required to produce fluorescence images.
  • the inner ear spiral CT protocol is as follows: tube voltage 120 KV, effective mAs 550, acquisition time TI: 1.5, SL 0.75 / 0.75 / 4.5, FOV: 50 0/52, core : U70, window: invertebral disc.
  • 3D images were obtained using the InSpace software (Syngo CT 2006G) (Siemens AG, Er Weg, Germany).
  • the FACS analysis was carried out as described under 1.4.
  • the cells in the other ten tubes were each treated with benzoic acid (BA), monoiodobenzoic acid (MIBA) or diiodobenzoic acid (DIBA) alone (260 ⁇ M), conjugate 3 alone (260 ⁇ M), conjugate 3 plus either BA, MIBA or DIBA (260 ⁇ M ), as well as conjugates 9, 10 and 11 alone (260 ⁇ M).
  • BA benzoic acid
  • MIBA monoiodobenzoic acid
  • DIBA diiodobenzoic acid
  • human LN-18 and U373 glioma cells were cultured in 75 cm 2 culture bottles (Corning Costar) (70% confluence) (conditions as in 1.4).
  • Accutase TM (PAA Laboratories) was added to allow the cells to detach from the bottom of the culture flask. The cells were collected and then divided into Eppendorf tubes (6 x 10 6 cells per tube). The cells in the first two tubes served as control (only PBS, LN18 and U373 glioma cells native).
  • the cells in the other tubes were incubated with a 260 ⁇ M or 2.6 mM solution of conjugate 12 for 20 minutes at 37 ° C and 5% CO 2 and then 3 times with PBS buffer washed out and centrifuged at 800 rpm (rounds per minute) for 5 min. In a small part of the cells, the MMT test (see 1.4) was used to check how many of the cells were still alive. Computed tomography of Cell centrifugation was performed with a Somatom Sensation 16 (Siemens).
  • An orbital CT coil was used: tube voltage 120KV, effective mAs 550, time of imaging TI: 1.5, SL 0.75 / 0.75 / 4.5, FOV: 50 0/52, GT: 0.0, kernel: U70, window: intervertebral disc.
  • 3D images were taken using the InSpace software (Syngo CT 2006G) (Siemens AG, Er Weg, Germany).
  • human LN18 and U373 glioma cells were cultured in 75 cm 2 culture flasks (70% confluency) (conditions as described in section 1). Accutase TM (PAA Laboratories) was added to allow the cells to detach from the culture soil. The cells were collected and then divided into Eppendorf tubes (6 x 10 6 cells per tube). The first 4 tubes were incubated for 20 minutes with each of the conjugates 3, 13, 14 and 15 dissolved in PBS buffer at a concentration of 260 ⁇ M.
  • TCBA trichlorobenzoic acid
  • TFBA trifluorobenzoic acid
  • TBPI tribromophenyl isocyanate
  • NLS-FITC conjugate 3 260 ⁇ M
  • Cells served as controls were incubated with either CIBA, FIBA, TBPI (each 260 ⁇ M in PBS) or with PBS buffer (native control) alone. After incubation, the cells were washed three times with PBS buffer and centrifuged at 800 rpm (rounds per minute). Computed tomography and FACS analysis of cell centrifugates were performed three times as in 1.5.1 and 1.4, respectively.
  • APMA 4-aminophenyl mercuric acetate
  • the cells in the other four tubes were incubated with 65 and 130 ⁇ M of jugate 10 for 1 and 2 hours both with and without MMP-2 inhibitor I (37 ° C and 5% CO2).
  • the MMP-2 inhibitor I was as previously described by Yin et al. 2006 described applied. After incubation for 1 or 2 hours, it was washed out 3 times with PBS buffer and centrifuge at 800 rpm for 5 min. Cell vitality was then checked using methyl thiazoyl tetrazolium (MTT) salt (Sigma Aldrich, Germany) (15 mg / ml). The formation of formazan was examined after 20 minutes in a transmitted light microscope.
  • MTT methyl thiazoyl tetrazolium
  • PI propidium iodide
  • a temporal bone CT coil was used: tube voltage 120KV, effective mAs 550, time of imaging TI: 1.5, SL 0.75 / 0.75 / 4.5, FOV: 50 0/52, GT: 0.0, kernel: U70, window: intervertebral disc.
  • the signal density of each cell pellet was measured.
  • the FACS analysis was performed on a Becton Dickinson FACSCalibur [100 ⁇ l of the cell suspension (IxIO 6 cells) plus 300 ⁇ l FACS buffer (D-PBS buffer with 1% paraformaldehyde)]. Approximately 25000-35000 cells were measured per sample [fluorescence excitation: argon ion laser (488nm), fluorescence detection: 540-565nm bandpass filter]. The experiments were each carried out three times.
  • Human malignant glioma cells (U373) were grown in 4-well plates under the same conditions as described for fluorescence microscopy in 1.5. The cells were incubated for 20 minutes with each of the conjugates dissolved in 0.1% DMSO / PBS at 260 ⁇ m. The cells were further co-incubated with TIBA and the two non-TIBA-containing conjugates (3 and 4) in 0.1% DMSO / PBS at 260 ⁇ m. Due to the insolubility of TIBA (but not the conjugates) in pure PBS, both TIBA and the conjugates were dissolved in 0.1% DMSO / PBS at 260 ⁇ m for incubation. As controls, the cells were incubated with PBS alone, 0.1% DMSO / PBS alone and TIBA alone (260 ⁇ m in 0.1% DMSO / PBS).
  • phosphatidylserine in the outer membrane of apoptotic cells was carried out with Annexin V Alexa TM 568 reagent according to the manufacturer's protocol (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, USA). Confocal laser scanning microscopy was performed using a LSM510 reversal laser scanning microscope (Carl Zeiss, Jena, Germany) (objectives: LD Achroplan 40x0.6, Plan Neofluar 20x0.50, 40x0.75). For fluorescence excitation, the 488 nm line of an argon-ion laser and the 534 nm line of a helium-neon laser were used with suitable beam splitters and barrier filters for FITC and Alexa, respectively. Superimposed images of FITC and Alexa stained samples were generated by overlaying overlapping views. All measurements were made on live, unfixed cells.
  • Human malignant LN18 and U373 glioma cells were grown in four-well plates (NUNC, Wiesbaden, Germany) (approximately 300,000 cells per well) as under 1.5. Cells were incubated at 37 ° C / 5% CO 2 for 20 minutes with each of conjugates 3, 9, 10 and 11 at a concentration of 260 ⁇ M (dissolved in PBS) (GIBCO, Invitrogen, Germany). Cells were also co-incubated with either CIBA, FIBA or TBPI, as well as NLS-FITC conjugate 3 (260 ⁇ M each). Control cells were incubated with only CIBA, FIBA or TBPI (260 ⁇ M in PBS) alone.
  • NUNC Wiesbaden, Germany
  • the cells were washed three times with PBS and subsequently Then incubate again in Ready Mix medium.
  • the FITC-labeled conjugates as well as the Alexa annexin for the detection of phosphatidylserine as a sign of cell death were localized with confocal laser microscopy (CLSM) as described in 1.6.1. All measurements were made on living cells.
  • Human malignant LN18 and U373 glioma cells were grown in four-well plates (NUNC, Wiesbaden, Germany) (approximately 300,000 cells per well) as in 1.5. The cells were incubated at 37 ° C / 5% CO 2 for 20 minutes with the conjugate 12 at concentrations of 260 ⁇ M and 2.6 mM (dissolved in PBS buffer) (GIBCO, Invitrogen, Germany). As a control, cells were incubated with PBS buffer only. After the incubations, the cells were washed three times with PBS and then incubated again in Ready Mix medium. The detection of phosphatidylserine and CLSM was as in 1.6.1. All measurements were made on living cells three times.
  • Human malignant LN18 and U373 glioma cells were grown in four-well plates (NUNC, Wiesbaden, Germany) (approximately 300,000 cells per well) as described under Sh. 1 bred. The cells were incubated at 37 0 C / 5% CO 2 for 20 minutes with each of the conjugates 3, 13, 14 and 15 at a concentration of 260 uM (dissolved in PBS) (GIBCO, Invitrogen, Germany) incubated. Cells were also co-incubated with either CIBA, FIBA or TBPI, as well as NLS-FITC conjugate 3 (260 ⁇ M each). Control cells were incubated with only CIBA, FIBA or TBPI (260 ⁇ M in PBS) alone.
  • NUNC Wiesbaden, Germany
  • Human malignant glioma cells (U373 and LN18) were seeded in 25 cm 2 culture flasks containing 3 ml RPMI-1640 Ready Mix medium with L-glutamine and 10% fetal bovine serum (FBS) (PAA laboratories, Pasching, Austria) [ 37 ° C, 5% CO2 (vol / vol)]. The medium was left for one day so that enough MMP-2 secreted by the glioma cells could accumulate. To activate the MMP-2 present in the medium in the inactive proform, the medium was incubated with APMA on the day of the study (final APMA concentration in the medium: ImM, with 1% DMSO) (confluency of the cells: 70%).
  • FBS fetal bovine serum
  • the BIS-TIBA conjugate 16 was in each case dissolved without MMP-2 inhibitor in the APMA-containing media of 4 bottles (26 and 130 ⁇ M) (both cell lines).
  • the BIS-TIBA conjugate 16 was again dissolved in the APMA-containing media of 4 bottles (26 and 130 ⁇ M) but now with MMP-2 inhibitor I.
  • both glioma cell lines were incubated in a one day old medium both with and without APMA and inhibitor.
  • MTT-SaIz and propidium iodide (PI) were used as under 1.4.
  • phosphatidylserine in the outer membrane leaf of apoptotic cells was detected with Annexin-V-Alexa TM 568 reagent as per the recommendation of the manufacturer (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, USA).
  • a portion of the cells stained for FACS analysis were fixed in paraformaldehyde with 2% agar, dehydrated in ethanol, embedded in Lowricyl K4M (Polysciences, Eppelheim, Germany) and at room temperature according to the manufacturer's instructions UV polymerized. Semi-thin sections (about 0.4 ⁇ m) were cut and evaluated by fluorescence microscopy.
  • FITC-labeled conjugates were synthesized: the correct NLS of the SV-40 T antigen with TIBA (conjugate 1 Kl), a mutant NLS of the SV-40 T antigen with TIBA (conjugate 2, K2) and both conjugates without TIBA (Conjugates 3 and 4, K3 and K4).
  • the same conjugates again without FITC are designated as conjugates 5 to 8, K5 to K8; Table 1, on the left side for all conjugates as usual, the C-terminus and shown on the right side of the N-terminus, Fig. 1.
  • the conjugate Kl has a molecular weight of 2123.4 Da, the conjugate K2 of 2096.3 Da, the conjugate K3 of 1641.8 Da, the conjugate K4 of 1614.6 Since the K5 conjugate is 1735.4 Da, the K6 conjugate is 1708.3 Da, the K7 conjugate is 1493.1 Da, the K8 conjugate is 1466.0 Da.
  • FITC-labeled conjugates were synthesized: the NLS of the SV40 T antigen with the non-iodinated benzoic acid (BA) (conjugate 9), the 4-monoiodobenzoic acid (MIBA) (conjugate 10) or the 2,5-diiodobenzoic acid (DIBA) (Conjugate 11); Table 1
  • the conjugate 9 has a molecular weight of 1745.95 Da, the conjugate 10 of 1871.83 Da and the conjugate 11 of 1997.72 Da.
  • FITC-labeled conjugate was synthesized in which triiodobenzoic acid (TIBA) was coupled to the proline; Table 1.
  • TIBA triiodobenzoic acid
  • the conjugate 12 has a molecular weight of 2123.4 Da.
  • FITC-labeled conjugates were synthesized: the NLS of the SV40 T antigen with the trifluorobenzoic acid (TFBA) (Conjugate 13), trichlorobenzoic acid (TCBA) (Conjugate 14), and tribromobenzoic acid (TBPI) (Conjugate 15); Table 1.
  • TFBA trifluorobenzoic acid
  • TCBA trichlorobenzoic acid
  • TBPI tribromobenzoic acid
  • the conjugate 13 has a molecular weight has a molecular weight of 1799.90 Da, the conjugate 14 of 1847.81 Da and the conjugate 15 of 1997.75 Da.
  • 2.1.5 Conjugate 16 :
  • the conjugate 16 has a molecular weight of 3255.76 Da.
  • Intracellular staining was confirmed by examination of semithin sections (about 0.4 ⁇ m) of the incubated cells ( Figure 4C).
  • the human malignant LN18 and U373 glioma cells showed no autofluorescence in confocal laser microscopy after incubation with PBS buffer alone.
  • conjugate 9 (conjugate 3 coupled to BA) stained only a small number of U373 glioma cells (8%) and LN18 glioma cells (9%) (comparable to conjugate 3) ( Figure 8). These few stained cells showed no signs of cell death (lack of binding of Annexin-V-Alexa TM 568 reagent to phosphatidylserine in the outer membrane leaf) ( Figure 8).
  • the human malignant LNl 8 and U373 glioma cells showed no autofluorescence in confocal laser microscopy after incubation with PBS buffer.
  • the human malignant LN 18 and U373 glioma cells showed no autofluorescence in confocal laser microscopy after incubation in pure PBS buffer (FIG. 13).
  • the sole incubation with trifluorobenzoic acid, with trichlorobenzoic acid or the tribromophenyl isocyanate (in each case 260 ⁇ M) led to no impairment of cell vitality (FIG. 15).
  • the principle of action of the conjugate 16 is schematically illustrated by a particular embodiment.
  • the first peptide is located in the form of a nuclear localization sequence (NLS).
  • NLS nuclear localization sequence
  • the first compound in the form of triiodobenzoic acid (TIBA) is covalently bound to the NLS.
  • the second peptide which has an interface which is recognized and cleaved by the tumor-specific protease MMP-2, is bound to the carboxyl group of the lysine residue by means of peptide binding.
  • the second peptide is shown as a thin bar.
  • the second compound connects. This is likewise bound to the second peptide via a lysine residue in the form of triodoiodobenzoic acid (TIBA), which is not shown in the second peptide in the second peptide.
  • TIBA triodoiodobenzoic acid
  • This conjugate 16 of the present invention is unable to invade healthy untransformed cells due to its size and lack of MMP-2 (left). Only in the presence of transformed tumor cells that secrete MMP-2 into the environment, the second peptide is cleaved. The liberated residual conjugate 16, due to the presence of NLS and its reduced size in the cytoplasm and the cell nucleus of the tumor cell can be taken (right). After the induction of apoptosis in the tumor cells by the residual conjugate 9, the cleavage products are then "disposed of" via macrophages and possibly excreted from the organism.
  • the human malignant LN18 and U373 glioma cells showed no autofluorescence in confocal laser microscopy (CLSM) after incubation alone with APMI (4-aminophenyl mercuric acetate) -containing RPMI medium both with and without inhibitor. Both the inhibitor and APMA in the medium did not affect cell viability.
  • CLSM confocal laser microscopy
  • the cells showed only a slight increase in signal density after incubation with inhibitor-containing medium compared to the untreated control (13 and 130 ⁇ M) (FIG. 21).
  • a significant increase in the signal density occurred after incubation of the cells with the BIS-TIBA conjugate (Kl 6) (130 ⁇ M) in inhibitor-free medium (FIG. 21).
  • HPLC High Performance Liquid Chromatography
  • the BIS-TIBA conjugate (Kl 6) is cleaved both in the presence of the active MMP-2 and the APMA-activated MMP-2 proform, and that this cleavage can be prevented by the presence of the inhibitor (FIG. 22).
  • the inventors thus provide a conjugate which is both an improved contrast agent and an apoptosis-inducing therapeutic.
  • the conjugate is tumor-specific and thus enables targeted diagnosis and / or therapy of a tumor disease.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein röntgendichtes Konjugat, die Verwendung des Konjugates zur Herstellung einer diagnostischen und therapeutischen Zusammensetzung, eine pharmazeutische und/oder diagnostische Zusammensetzung, die das Konjugat aufweist, ein Verfahren zur diagnostischen und/oder analytischen Behandlung von biologischem Material oder einem Lebewesen, sowie ein Verfahren zur therapeutischen Behandlung eines Lebewesens.

Description

Röntgendichtes Konjugat
Die vorliegende Erfindung betrifft ein röntgendichtes Konjugat, die Verwendung des Konjugates zur Herstellung einer diagnostischen und therapeutischen Zusammensetzung, eine pharmazeutische und/oder diagnostische Zusammensetzung, die das Konjugat aufweist, ein Verfahren zur diagnostischen und/oder analytischen Behandlung von biologischem Material oder einem Lebewesen, sowie ein Verfahren zur therapeutischen Behandlung eines Lebewesens.
Die Computertomographie (CT) ist ein sehr weit verbreitetes, bildgebendes Verfahren bei Notfall- und Routineuntersuchungen, die im Vergleich zur Magnetresonanztomographie eine besonders hohe Auflösung, bspw. des Lungenparenchyms, ermöglicht. Zur Erhöhung des Kontrastes in der CT werden Kontrastmittel verwendet. Derzeit werden hauptsächlich iodhaltige Substanzen verwendet, wie bspw. Iopromid (Ultravist®) oder Iobitridol (Xenetix®). Diese Kontrastmittel weisen als Grundgerüst aufgrund seiner röntgendichten Iodatome 2,3,5-Triiodobenzoesäure (TIBA) auf, das ursprünglich hauptsächlich zur Induktion einer verfrühten Blüte-/Reifezeit bei Pflanzen verwendet wurde; vgl. Galston A.W. The Effect of 2,3,5-Triiodobenzoic Acid on the Growth and Flowering of Soybeans. American Journal of Botanγ 34, 356-360 (1947). Da TIBA sich in Wasser nicht löst, weisen diese Kontrastmittel Mehrfachsubstitutionen auf, wozu bspw. eine Vielzahl von OH-Gruppen an TIBA angekoppelt werden. Dadurch erhalten die genannten Kontrastmittel ein hohes Molekulargewicht, nämlich von 791 Da im Falle von Iopromid und von 835 Da im Falle von Iobitridol.
Die derzeit verwendeten iodhaltigen Kontrastmittel haben den Nachteil, dass diese die Membran der biologischen Zellen nicht durchdringen können und sich deshalb nur im Zwischenzellraum, d.h. in dem Interstitium, von Tumoren anreichern können (vgl. Krause W., Delivery of diagnostic agents in computed tomography, Adv. Drug Deliv. Rev., 159-173 (1999)).
In dem Dokument US 5,567,410 und der Publikation Torchilin V.P., Polymerie contrast agents for medical imaging, Current Pharmaceutical Biotechnology, 183-215 (2000), wird ein Kontrastmittel vorgeschlagen, das einen amphiphilischen Charakter hat und in physiologischen Flüssigkeiten Micellen bildet. Das Kontrastmittel enthält pro Gesamtmolekül drei Moleküle TIBA, die an ein Carbonsäure-Rückgrad gebunden sind. Beide Komponenten bilden einen hydrophoben Block. Dieser hydrophobe Block ist wiederum an eine hydrophile Polymerkomponente gebunden, die aus Monomethoxypolyethylenglycol (MPEG) besteht. Dieser MPEG-Komponente ist sehr groß und hat ein Molekulargewicht von ca. 12 kDa, so dass ein Gesamtmolekül des bekannten Kontrastmittels ein Gewicht von bis zu 30 kDa erreicht. Durch die enorme Größe sowie die amphiphilische Natur dieses Gesamtmoleküls wird verhindert, dass Letzteres die Blutbahn verlässt und somit nicht in das Interstitium, geschweige denn in das umgebende Gewebe eindringen kann. Die Autoren schlagen deshalb vor das Kontrastmittel wegen seines Verbleibens in der Blutbahn ausschließlich zur Darstellung von Blutbahnen, als sogenanntes „Blood-Pool"-Kontrastmittel bspw. im Rahmen der Angiographie zu verwenden, das nach kurzer Zeit wieder aus dem Körper eliminiert wird. Ein vergleichbares „Blood-Pool "-Kontrastmittel mit sehr großem Molekulargewicht wird in der Publikation von Fu et al., Dendritic ionidated contrast agents with PEG- cores for CT imaging: synthesis and preliminary characterization, Bioconjugate Chem. 17, 1043 - 1056 (2006), beschrieben, das Triiodophtalamide-Gruppen aufweist, die über beta-Alanin an Polylysin in Form von „Lysinbäumchen" gekoppelt sind.
Aus der US 2005/0119470 Al ist eine Zusammensetzung bekannt, die aus einer iodhaltigen Verbindung, nämlich 2,3,5-Triiodobenzoesäure (TIBA), und zwei Peptiden oder Nucleinsäuren besteht, die zumindest teilweise miteinander hybridisieren können. Diese Zusammensetzung wird nicht als Kontrastmittel sonder vielmehr als „RNA-Silenzer" vorgeschlagen.
Da die bekannten extrazellulären Kontrastmittel nicht in der Lage sind in biologische Zellen einzudringen, kann bspw. Tumorgewebe computertomographisch nicht exakt von gesundem Gewebe abgegrenzt werden Es kommt lediglich zu einer verwaschenen Darstellung der Tumorgrenzen. Werden die genannten extrazellulären Kontrastmittel während oder direkt nach einer Operation verabreicht, so läuft das Kontrastmittel entlang des durch den Operateur eröffneten Zwischenzellraums bis über die Tumorgrenzen hinaus.
In der WO 2006/069677 A2 wird eine Zusammensetzung beschrieben, die ein Derivat von 2,3,5-Triiodobenzoesäure (TIBA) und eine „targeting group", beispielsweise eine Kernlokalisierungssequenz (NLS), in Kombination mit einem Material zur Herstellung einer implantierbaren medizinischen Vorrichtung und einem therapeutisch aktiven Agenz aufweist.
Wird ein Brust- oder Hirntumor stereotaktisch biopsiert, so muss später die Biopsie- stelle mit dem dort gewonnenen histologischen Ergebnis eindeutig zu lokalisieren sein. Deshalb wird derzeit an dieser Stelle ein Metall-Clip platziert, der bei späteren CT- oder Magnetresonanztomographie(MRT)-Kontrollen, aber auch bei erneuter Biopsie oder Operation klar erkennbar sein muss. Bei dieser Vorgehensweise haben jedoch viele Patienten ein Fremdkörpergefühl durch das Vorhandensein des Metall- Clips in der Brust oder im Gehirn. Bei kernspintomograhischen Kontrollen verursachen die Metall-Clips Suszeptibilitätsartefakte und verschlechtern somit die anatomische Auflösung des umgebenden Gewebes; vgl. Matsuura H. et al., Quantification of susceptibility artifacts produced on high-field magnetic resonance images by various biomaterials used for neurosurgical implants. Technical note. J. Neurosurg. 97, 1472- 5 (2002).
Da der biopsierte Tumor nicht konstant groß bleibt, sondern sich in seiner Größe verändert, bleibt auch der Metall-Clip nicht an seiner ursprünglichen Stelle und verschiebt sich. Bei Biopsien im Brustdrüsengewebe konnten ein Jahr später die Metall-Clips weit entfernt von der ursprünglichen Biopsiestelle sogar in einem anderen Brustquadranten gefunden werden; Philpotts L.E. & Lee C.H., Clip migration after 11-gauge vacuum-assisted stereotactic biopsy: case report. Radiology 222, 794- 796 (2002). Treten während einer Biopsie Blutungen auf, so kann der Metall-Clip auch aus dem Biopsiegebiet über den Stichkanal bis unter die Haut herausgeschwemmt werden; vgl. Parikh J., Ultrasound demonstration of clip migration to Skin within 6 weeks of 11-gauge vacuum-assisted stereotactic breast biopsy. Breast J. 10, 539-542 (2004).
Ziel der sogenannten Radiotherapie in der Onkologie ist die vollständige und gezielte Vernichtung der Tumorzellen durch den Einsatz von Radioaktivität. Hierbei können radioaktive Substanzen zum Einsatz kommen, wie bspw. radioaktives Iod. Derzeit gelingt diese Radioiodtherapie beim Menschen nur beim Schilddrüsenkarzinom, da diese spezielle Tumorzellart den Natrium-Iod-Symporter an der Zelloberfläche expri- miert. Wird einem Patienten radioaktives Iod verabreicht, so wird es von den Schild- drüsenkarzinomzellen zusammen mit Natrium, d.h. im Natrium-Iod-Symport, in das Zellinnere aufgenommen und kann dort seine radiochemotherapeutische Wirkung entfalten. Da der Natrium-Iod-Symporter nur im Schilddrüsenkarzinom vorliegt, können andere aggressive Krebsarten, wie z.B. Hirn-, Prostata- oder Darmtumore, beim Menschen bisher nicht mit radioaktiv markiertem Iod (131I) therapiert werden, da diese Tumoren das Iod nicht aufnehmen können. Um z.B. humane Kolonkarzinomzellen für radioaktiv markiertes Iod zugänglich zu machen, müssen sie zuvor mit dem Gen des Natrium-Iod-Symporters transfiziert werden; vgl. Scholz I.V. et al., Radioio- dine therapy of colon cancer following tissue-specific sodium iodide symporter gene transfer. Gene Ther. 12, 272-80 (2005). Diese humanen Kolonkarzinomzellen expri- mieren dann, genau wie die Schilddrüsenkarzinomzellen, den Natrium-Iod- Symporter der Zelloberfläche und können jetzt auch das radioaktiv markierte Iod aufnehmen.
Bei der Radioiodtherapie des Schilddrüsenkarzinoms nehmen auch gesunde Gewebe, wie bspw. Speicheldrüsen, Magenmucosa und die taktierende Brust, das radioaktiv markierte Iod auf, da auch hier der Natrium-Iod-Symporter exprimiert wird; vgl. Spitzweg C. et al., Analysis of human sodium iodide symporter gene expression in extrathyroidal tissues and cloning of its complementary deoxyribonucleic acids from salivary gland, mammary gland, and gastric mucosa. J. Clin. Endocrinol. Metab. 83, 1746-51 (1998). Deshalb können bei der derzeit eingesetzten Radioiodtherapie z.B. Speicheldrüsenentzündungen sowie Geschmacksveränderungen auftreten; vgl. Alexander C. et al., Intermediate and long-term side effects of high-dose radioiodine therapy for thyroid Carcinoma. Journal of Nuclear Mediane 39, 1551-1554 (1998). Während der Therapie sind die Patienten in speziellen abgeschirmten Räumen untergebracht, da sie als Strahlenquelle von der Umgebung abgeschirmt werden müssen. Die Wirkung tritt nicht sofort ein.
Vor diesem Hintergrund ist es eine der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe eine röntgendichte Substanz bereitzustellen, die sich als Kontrastmittel eignet, und mit welcher die Nachteile der derzeit verwendeten Iodkontrastmittel vermieden werden. Insbesondere soll ein solches Kontrastmittel bereitgestellt werden, mit dem sich computertomographisch schärfere Tumorränder darstellen lassen können, als dies mit den derzeitigen Kontrastmitteln der Fall ist. Eine weitere der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe ist es eine Substanz bereitzustellen, mit der eine verbesserte Markierung einer Biopsiestelle ermöglicht wird, als dies mit den derzeit verwendeten Metall-Clips der Fall ist.
Ferner liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde eine röntgendichte Substanz bereitzustellen, die insbesondere zur Behandlung von Tumoren therapeutisch genutzt werden kann, und mit welcher die Nachteile der derzeitigen Radioiodtherapie vermieden werden können. Insbesondere soll eine Substanz bereitgestellt werden, die nach der Verabreichung eine rasch eintretende Wirkung zeigt und vorzugsweise nicht radioaktiv ist.
Diese Aufgaben werden durch die Bereitstellung eines Konjugates gelöst, das eine erste Verbindung mit folgender Formel
, in der R1, R2, R3, R4 und R5 jeweils unabhängig voneinander einem Halogen oder einem Wasserstoff entsprechen, in der R6 einer Carboxygruppe (COOH) oder Isothio- cyanat (S=C=N) entspricht, sowie mindestens ein erstes Peptid aufweist, wobei das Konjugat derart ausgestaltet ist, dass es Zellmembran- und kernmembranpermeabel ist.
Die erste Verbindung kann 1, 2, 3, 4 oder 5 Halogene bzw. 1, 2, 3, 4 oder 5 Wasserstoffatome aufweisen. Die Halogene bzw. Wasserstoffe können an jeder der angegebenen Positionen R1 bis Rs angeordnet sein. Die erste Verbindung kann verschiedene oder identische Halogene aufweisen. Entsprechend der Identität und Anordnung der Halogene spricht man im Fall, in dem R6 eine Carboxylgruppe ist, bspw. von 5- Iodobenzoesäure, 4-Iodobenzoesäure (5-IBA/MIBA, 4-IBA/MIBA; ein Iodatom an Position R1 bzw. R5 oder R4), 2,3- oder 3,5-Diiodobenzoesäure (2,3-DIBA, 3,5-DIBA; zwei Iodatome an Position R1 und R2 bzw. R4 und R5 bzw. R3 und Rs), 3,5- Diiodobenzoesäure (3,5-DIBA; zwei Iodatome an Position R3 und R5 bzw. Ri und Rs), 2,4,6-, 2,3,6-, oder 2,3,5-Trichlorobenzorsäure (TCBA; drei Chloratome an den Positionen R2, R4, Rs, bzw. R2, R3, Rs, bzw. R2, R3, Rs), 3,4,5-, 2,3,4-, 2,4,5- Trifluorobenzoesäure (TFBA; je drei Fluoratome an den Positionen R3, R4, Rs, bzw. R2, R3, R4 oder R2, R4, Rs) etc. Wenn R6 Isothiocyanat ist, an den Positionen R2, R4 und Rs Bromatome sitzen, spricht man von 2,4,6-Tribromophenyl Isothiocyanat (TBPI).
Erfindungsgemäß wird unter einem Konjugat das Verknüpfungsprodukt aus mehreren Substanzen verstanden. Die miteinander verknüpften Substanzen umfassen die erste Verbindung und ggf. weitere bspw. zweite und dritte Verbindungen sowie das erste Peptid und ggf. weitere bspw. zweite und dritte Peptide. Die Verknüpfung kann auf beliebige Art und Weise erfolgen, bspw. durch kovalente oder ionische Bindung.
Die Erfinder haben herausgefunden, dass durch die röntgendichten Halogene mit dem erfindungsgemäßen Konjugat ein besonders gutes Signal in bildgebenden Verfahren erzielt werden kann.
Die Erfinder haben ferner überraschenderweise herausgefunden, dass die erste Verbindung im Komplex mit einem ersten Peptid die Membran von biologischen Zellen durchdringen und darüber hinaus in den Zellkern eindringen kann. Die Zellmembran- und Kernmembranpermeabilität des erfindungsgemäßen Konjugates hat den großen Vorteil, dass sich nun die Grenzen eines bestimmten Gewebes bzw. eines Tumors im Rahmen eines bildgebenden Verfahrens, wie einer Computertomographie, scharf darstellen lassen. Das Konjugat kann bei einer Verabreichung während oder direkt nach einer Operation nicht mehr entlang des eröffneten Zwischenzellraums über die Tumorgrenzen hinauslaufen.
Dabei war besonders überraschend, dass die Zellmembran- und Kernmembranpermeabilität des erfindungsgemäßen Konjugates ohne ein Ankoppeln von zusätzlichen großen Transmembran-Transporteinheiten, wie bspw. Penetratin oder Transportan, erzielt wird. Dadurch wird eine unnötige Vergrößerung des Molekulargewichts, was die Signalgebung in der Computertomographie beeinflussen könnte, vermieden. So ist das erfindungsgemäße Konjugat relativ klein, d.h. es liegt im Bereich von ca. 1.400 Da bis ca. 3.300 Da, vorzugsweise von 1.600 Da bis 1.800 Da.
Im Gegensatz zu dem von Torchilin (2000, a.a.O.) und in der US 5,567,410 beschriebenen Kontrastmittel ist das erfindungsgemäße Konjugat frei von einer hydrophilen Polymerkomponente, wie Monomethoxypolyethylenglycol (MPEG), Polyethylengly- col (PEG), Polyvinylpyrrolidon (PVP) etc., die bereits aufgrund ihrer Größe ein Eindringen einer daran gekoppelten Verbindung in das Innere von biologischen Zellen verhindern würde. Dadurch ist das erfindungsgemäße Konjugat wesentlich kleiner und weist vorzugsweise ein Molekulargewicht von ca. 0,5 bis ca. 5 kDa, weiter vorzugsweise von ca. 1 bis ca. 3 kDa, höchst bevorzugt von ca. 2 kDa auf. Anstelle einer Carbonsäure, die in dem bekannten Kontrastmittel als „Rückgrad" zur Befestigung von drei Molekülen TIBA dient, weist das erfindungsgemäße Konjugat ein aus über Peptidbindungen miteinander verknüpfte Aminosäuren bestehendes Peptid auf, das vorzugsweise zumindest zwei verschiedene Aminosäuren enthält. Durch diese Maßnahmen wird sichergestellt, dass das erfindungsgemäße Konjugat in biologische Zellen eindringen kann, wohingegen das bekannte Kontrastmittel ausschließlich im Blut verbleibt und nicht einmal in das Interstitium gelangt. Das erfindungsgemäße Konjugat weist ferner im Gegensatz zu dem bekannten Kontrastmittel einen sehr großen Halogengehalt auf, bis zu ca. 40 % bezogen auf das Gesamtkonstrukt, ist für den Gesamtorganismus nicht toxisch und bildet keine Micellen.
Im Gegensatz zu der Verbindung, die in der US 2005/0119470 beschrieben wird, erfordert die Funktionsfähigkeit des erfindungsgemäßen Konjugates kein solches Peptid, das mit einer oligomeren Verbindung, wie einem weiteren Peptid oder einer Nucleinsäure, hybridisierbar ist.
Die Erfinder haben festgestellt, dass sich das erfindungsgemäße Konjugat besonders gut zur Markierung einer Biopsiestelle eignet, da es nach der Gabe in das biopsierte Gewebe ortsfixiert bleibt. Ein späteres Auffinden der Biopsiestelle ist dadurch unproblematisch möglich.
Die Erfinder haben ferner überraschenderweise festgestellt, dass das erfindungsgemäße Konjugat nach seiner Aufnahme in die Zellen in den Letzteren innerhalb kurzer Zeit den programmierten Zelltod, die sog. Apoptose, auslöst. Wie die Erfinder feststellen, wird bspw. die erste Verbindung allein, und zwar in Form von Triiodobenzoesäu- re (TIBA), nicht in Zellen aufgenommen. Die Auslösung der Apoptose durch das erfindungsgemäße Konjugat in den aufgenommenen Zellen erfolgt bereits bei niedrigen Konzentrationen, z.B. im Bereich von < 300 μg Konjugat / ml. Hierzu im Gegensatz lösen traditionelle Kontrastmittel, wie Diatrizoate, Ioxaglate, Iopromide, Iotro- lan, erst bei sehr hohen Konzentrationen Apoptose ausgelöst, z.B. bei 250 mg Iod pro Milliliter); vgl. Zhang et al. (2000), Effects of radiographic contrast media on prolif- eration and apoptosis of human vascular endothelial cells, The British Journal of Radiology 73, Seiten 1034 bis 1041.
Im Gegensatz zu der aus der WO 2006/069677 A2 bekannten Zusammensetzung zeigt sich die therapeutisch nutzbare apoptoseauslösende Eigenschaft des erfindungsgemäßen Konjugates bereits ohne das Vorhandensein eines weiteren therapeutisch aktiven Agens oder/und eines Materials zur Herstellung einer implantierbaren medizinischen Vorrichtung.
Damit weist das erfindungsgemäße Konjugat ein bedeutendes therapeutisches Potential auf, das zur Behandlung von Tumorerkrankungen genutzt werden kann. Die Aufnahme in die Zellen erfolgt unabhängig vom Natrium-Iod-Symporter, so dass nun nicht nur Schilddrüsenkarzinome behandelt werden können, sondern auch andere Tumoren, wie bspw. Prostatakarzinome, Hirntumoren und das Mammakarzinom.
Auf eine radioaktive Markierung der Halogene kann verzichtet werden, da die Apoptose der Tumorzellen erstaunlicherweise bereits durch die sich im Zellkern anreichernde Verbindung, welche an das Peptid gebunden ist, ausgelöst wird. Dadurch bleibt eine radioaktive Belastung des Körpers, insbesondere der Magenmucosa, der Speicheldrüsen und der laktierenden Brust, aus. Die Patienten müssen ferner die Therapie nicht mehr in abgeschirmten Räumen verbringen.
Das erfindungsgemäße Konjugat kann während einer Operation für bspw. 20 Minuten in eine Tumorhöhle gegeben werden. Im Anschluss daran wird die Resektionshöhle mit konjugatfreier Pufferlösung gespült, um überschüssiges Konjugat zu entfernen, das von den Zellen nicht aufgenommen wurde. Die Tumorzellen, die die Resektionshöhle auskleiden, werden dabei intrazellulär bzw. intranukleär angefärbt und es können im Vergleich zu den bisherigen interstitiellen Iodkontrastmitteln die Tumorgrenzen scharf dargestellt werden. Hierbei können die derzeit auf dem Markt befindlichen Computertomographiegeräte für den Gebrauch im Operationssaal und zur intraoperativen Resektionskontrolle zur Anwendung kommen, z.B. der mobile CT Scanner Philips Tomoscan M, Philips Medical Systems, Eindhoven, Niederlande.
Im Falle der Behandlung eines Hirntumors mit dem erfindungsgemäßen Konjugat wird aufgrund der im gesunden Himparenchym intakten Bluthirnschranke die Aufnahme in gesundes Gewebe verhindert, wohingegen im Hirntumor die Bluthirnschranke durchlässig ist, so dass das Konjugat eindringen und gezielt die Apoptose auslösen kann. Gleichzeitig kann die höhere Signaldichte der Tumorzellen in der Computertomographie als Zeichen für Tumorapoptose gewertet werden.
Alternativ zur intraoperativen Verabreichung der erfindungsgemäßen Konjugate in die Resektionshöhle kann während einer Hirnoperation ein Reservoir, bspw. ein Omaya-Reservoir, intratumoral angebracht werden. Postoperativ kann über diesen Zugang die Lösung mit den erfindungsgemäßen Konjugaten ggf. über mehrere Zyklen infundiert werden.
Das erste Peptid kann auf vielfältige Art und Weise mittels dem Fachmann bekannter Verfahren an die erste Verbindung angebracht werden, bspw. unter Ausnutzung der verbindungsseitigen Carboxylgruppe (R6) und Ausbildung einer peptidischen Bindung mit einer peptidseitigen freien NH2-Gruppe.
Die der Erfindung zugrunde liegenden Aufgaben werden hiermit vollkommen gelöst.
Bevorzugt ist es, wenn es sich bei dem Halogen der ersten Verbindung um ein solches handelt, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Iod, Brom, Fluor, Chlor, und Astat.
Mit dieser Maßnahme werden auf vorteilhafte Art und Weise die konstruktiven Voraussetzungen für das erfindungsgemäße Konjugat geschaffen. Diese Halogene zeichnen sich durch ihre hohe Röntgendichte aus und liefern deshalb in bildgebenden Verfahren besonders gute Signale.
Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, wenn es sich bei der ersten Verbindung um eine solche handelt, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Triiodobenzoesäure (TIBA), 5-Iodobenzoesäure (5-IBA, 5-MIBA), 4-Iodobenzoesäure (4-IBA, 4-MIBA), 2,3- Diiodobenzoesäure (2,3-DIBA), 3,5-Diiodobenzoesäure (3,5-DIBA), 2,5-Diiodo- benzoesäure (2,5-DIBA), Trichlorobenzorsäure (TCBA), Trifluorobenzoesäure (TFBA), Tribromobenzoesäure (TBBA), Tribromphenyl Isothiocyanat (TBPI).
Die Erfinder haben herausgefunden, dass es sich bei den genannten Substanzen um eine zur Realisierung des erfindungsgemäßen Konjugates besonders geeignete erste Verbindung handelt. TIBA weist die Molekularformel I3C6H2CO2H sowie ein Molekulargewicht von 499,81 Da auf. TIBA ist unter der CAS-Nummer 88-82-4 verzeichnet. Bei TIBA ist der Benzolring der Verbindung 3fach iodiert, vorzugsweise an den Positionen 2, 3 und 5 (R1, R2 und R4) bzw. 2, 4 und 6 (R1, R3 und R5). Die Iodierung ist aber auch an anderen Positionen des Benzolringes möglich. IBA/MIBA weist die Molekularformel IC6H4CO2H sowie ein Molekulargewicht von 248.02 Da auf. IBA/MIBA ist unter der CAS-Nummer 88-67-5 verzeichnet. 2,3-DIBA, 3,5-DIBA, 2,5- DIBA weisen die Molekularformeln C7H4I2O2 sowie die Molekulargewichte von 373,914 Da auf. 2,3-DIBA, 3,5-DIBA, 2,5-DIBA sind unter der CAS-Nummern 19094- 48-5 (3,5) bzw. 14192-12-2 (2,5) verzeichnet. TCBA weist die Molekularformel C7H3Cl3O2 sowie ein Molekulargewicht von 225.45862 Da auf. TCBA ist unter der CAS-Nummer 50-73-7 verzeichnet. TFBA weist die Molekularformel C7H3F3O2 sowie ein Molekulargewicht von 176.09 Da auf. TFBA ist unter der CAS-Nummer 121602- 93-5 verzeichnet. TBPI weist die Molekularformel C7H2Br3NS sowie ein Molekulargewicht von 371.87158 auf. TBPI ist unter der CAS-Nummer 22134-11-8 verzeichnet. TBBA weist die Molekularformel C?H3Br3θ2 sowie ein Molekulargewicht von 358,81 Da auf. TBBA ist unter der CAS-Nummer 633-12-5 verzeichnet..
Dabei ist es bevorzugt, wenn das erste Peptid des erfindungsgemäßen Konjugates eine positive Nettoladung aufweist.
Unter Nettoladung wird die Ladung des ersten Peptides verstanden, die unter physiologischen Bedingungen (pH 7) aus dem Ladungsbeitrag der einzelnen positiv oder negativ geladenen Aminosäurereste des Peptides resultiert. Die Erfinder haben überraschenderweise herausgefunden, dass die Zellmembran- und Zellkernpermeabilität des erfindungsgemäßen Konjugates besonders gut erreicht wird, wenn das erste Peptid eine positive Nettoladung aufweist. Mit anderen Worten, das erste Peptid weist vorzugsweise solche Aminosäuren auf, die unter physiologischen Bedingungen positiv geladen sind. Das erfindungsgemäße erste Peptid weist deshalb vorzugsweise ein oder mehrere Moleküle der „basischen" Aminosäuren Arginin (R), Lysin (K) oder Histidin (H) auf.
Dabei ist es bevorzugt, wenn das erste Peptid in dem erfindungsgemäßen Konjugat 2-20, weiter vorzugsweise 5-10 und höchst bevorzugt sieben Aminosäuren aufweist.
Die Erfinder haben überraschenderweise herausgefunden, dass derartig kurze Peptide ausreichend sind, um den Transport des Konjugates sowohl durch die Zellmembran als auch die Kernmembran zu vermitteln. Wie bislang im Stand der Technik angenommen, sind große Transportpeptide, wie Penetratin oder Transportan, hierfür nicht erforderlich. Durch die geringe Größe des ersten Peptides wird das Verhältnis zwischen der in bildgebenden Verfahren signalgebenden TIBA und dem nicht- signalgebenden ersten Peptid so gering wie möglich gehalten, und es wird bereits bei geringer Konjugatmenge ein gutes Signal erzeugt.
Ferner ist es bevorzugt, wenn das erste Peptid von einer Kernlokalisierungssequenz (NLS) abgeleitet ist.
Kernlokalisierungssequenzen (NLS) wurden erstmals von Kalderon et al., A short amino acid sequence able to specify nuclear location. Cell 39, 499-509 (1984), beschrieben. Sie ermöglichen größeren zytoplasmatischen Proteinen den Eintritt in den Zellkern durch die kleinen Kernporen. Die NLS-Sequenzen werden von Importin-alfa und -beta erkannt, woraufhin sich die Kernporen für die großen Proteine aus dem Zytoplasma öffnen. Die Erfinder haben zur Realisierung des erfindungsgemäßen Konjugates rein beispielhaft die NLS des SV40-T- Antigens herangezogen und hiervon sieben aufeinanderfolgende Aminosäuren verwendet.
Dabei war besonders überraschend, dass es zur Vermittlung der Kernmembranpermeabilität nicht erforderlich war, eine exakte NLS zu verwenden. Die Kernmembranpermeabilität des erfindungsgemäßen Konjugates wurde auch bei Verwendung einer mutierten NLS erreicht. Bereits eine 20%ige bzw. 40%ige, vorzugsweise 60%ige, weiter bevorzugt 80%ige, höchst bevorzugt 90%ige Sequenzidentität mit einer natürlichen NLS ist ausreichend. Entscheidend ist, dass zumindest eine oder mehrere der in der natürlichen NLS enthaltenden „basischen" Aminosäuren vorhanden bleiben.
Bei dem erfindungsgemäßen Konjugat ist es bevorzugt, wenn die erste Verbindung über dessen Carboxylgruppe an das Peptid gebunden ist.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass eine für eine Kopplung des Peptides besonders geeignete Gruppe am Benzolring der ersten Verbindung verwendet wird, ohne dass dadurch die Halogen-Substituenten in die Bindung involviert oder ggf. sterisch behindert bzw. abgeschirmt werden, vielmehr zur Realisierung der Erfindung zu Verfügung stehen.
Weiter ist es bevorzugt, wenn das erste Peptid eine freie Aminofunktion in der Seitenkette aufweist, über die es an die erste Verbindung gebunden ist.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass auch an dem ersten Peptid eine besonders geeignete reaktive Gruppe ausgenutzt wird, über die eine Bindung an die erste Verbindung, bspw. durch Reaktion mit der Carboxylgruppe und der Ausbildung einer Peptidbindung, ermöglicht wird. Freie Aminofunktionen finden sich bspw. in der Seitenkette von Asparagin (N), Glutamin (Q), oder Lysin (K) und an dem N-Terminus des Peptides.
Dabei ist es besonders bevorzugt, wenn das Peptid eine ε-Aminofunktion eines C- terminal gelegenen Lysinrestes aufweist, über die es an die Verbindung gebunden ist.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass über die ε-Aminofunktion des endständigen Lysinrestes auf besonders effiziente Art und Weise das erste Peptid an die erste Verbindung gebunden werden kann. Das erfindungsgemäße Konjugat nimmt dabei eine besonders vorteilhafte Konformation ein, die die bildgebenden und apoptosein- duzierenden Eigenschaften gewährleistet. Der endständige Lysinrest kann entweder Bestandteil des ersten Peptides sein, oder aber an ein terminales Ende der ersten Verbindung als eine Art „Aufhänger" angebracht werden.
Nach einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung weist das erste Peptid die Aminosäuresequenz PKKKRKV (SEQ ID Nr. 1) oder PKKTRKV (SEQ ID Nr. 2) oder PLGLA (SEQ ID Nr. 13) auf.
Bei dieser Darstellung befindet sich der C-Terminus auf der rechten und der N- Terminus auf der linken Seite. Verwendet wurde der übliche Ein-Buchstaben-Code für Aminosäuren. Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass die konstruktiven Voraussetzungen für ein erstes Peptid geschaffen werden, das eine positive Nettoladung aufweist und sich von der NLS-Sequenz des SV40-T-Antigens ableitet. Die Sequenz PKKKRKV wurde identisch aus der NLS des SV40-T-Antigens übernommen, während bei der Sequenz PKKTRKV an der vierten Stelle gegenüber der NLS aus dem SV40-T- Antigen ein Lysin (K) gegen ein Threonin (T) ausgetauscht wurde. Die Erfinder haben überraschenderweise herausgefunden, dass auch eine solche gegenüber der NLS- Sequenz des SV40-T-Antigens modifizierte Sequenz die erfindungsgemäße Funktion vermittelt und die Zellmembran- und Kernmembranpermeabilität des Konjugates sicherstellt. Es versteht sich, dass auch die anderen Positionen in der NLS des SV40-T- Antigens ausgetauscht werden können, ohne die erfindungsgemäße Funktion des Konjugates zu beeinträchtigen, solange die Zellmembran- und Kernmembranpermeabilität erhalten bleibt. So sind erste Peptide mit Sequenzen, die eine Homologie von 80%, 85%, 90%, 95%, 98% zu der SEQ ID Nr. 1 oder Nr. 2 aufweisen, ebenfalls geeignet. Zur Anbringung der ersten Verbindung lässt sich ohne weiteres bspw. an dem C-Terminus ein Lysinrest vorsehen, so dass bspw. folgende Sequenzen erhalten werden PKKKRKVX bzw. PKKTRKVK, wobei der Lysin-„Aufhänger" kursiv dargestellt ist.
Ferner ist es bevorzugt, wenn das erfindungsgemäße Konjugat einen detektierbaren Marker aufweist.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass das erfindungsgemäße Konjugat am Orte seiner Anreicherung nicht nur mittels der Computertomographie, sondern aufgrund dieses weiteren Markers mittels klassischer bildgebender Verfahren in vivo, in situ aber ggf. auch in vitro darstellbar ist. So können Tumorgrenzen auch mittels klassischer und intraoperativer bildgebenden Verfahren, bspw. der Nahinfrarotbildgebung, erkennbar gemacht werden. Erfindungsgemäß wird unter einem detektierbaren Marker eine jegliche Verbindung verstanden, die mittels bildgebender Verfahren identifiziert werden kann. Hierzu zählen Farbindikatoren, wie Farbstoffe mit fluoreszierenden, phosphoreszierenden oder chemilumineszierenden Eigenschaften, Dansyl- oder Cumarinfarbstoffe, AMPPD, CSPD, nicht-radioaktive Indikatoren, wie Biotin oder Digoxigenin, alkalische Phosphatase, Peroxydase etc. In Ausnahmefällen können auch radioaktive Indikatoren, wie 32P, 3SS, 132I, 31I, 14C oder 3H zum Einsatz kommen, wobei dann die oben im Zusammenhang mit der Radioiodtherapie dargestellten Nachteile in Kauf genommen werden müssen. Je nach der Natur des Markers kommen als bildgebende Verfahren Mikroskopie-, Blotting-, Hybridisierungstechni- ken bzw. die Autoradiographie in Frage.
Besonders bevorzugt ist es, wenn es sich bei dem detektierbaren Marker um einen Fluoreszenzfarbstoff handelt, vorzugsweise um Fluoresceinisothiocyanat (FITC).
In den meisten Operationssälen stehen Fluoreszenzmikroskope zur Verfügung. So können nach der Verabreichung der erfindungsgemäßen Konjugate in die Tumorzelle bereits während der Operation die Tumorgrenzen fluoreszenzmikroskopisch dargestellt werden. Dies ermöglicht eine noch bessere Lokalisierung des Tumors und ggf. bessere therapeutische bzw. chirurgische Maßnahmen.
Dabei ist es bevorzugt, wenn der detektierbare Marker eine freie Aminofunktion einer Aminosäure, vorzugsweise eine ε-Aminofunktion eines Lysinrestes aufweist, über die er an das Peptid gebunden ist.
Der Lysinrest kann entweder Bestandteil des ersten Peptides sein, bzw. an ein terminales, vorzugsweise C-terminales Ende des ersten Peptides als eine Art „Aufhänger" für den detektierbaren Marker angebracht werden. Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass dadurch der detektierbare Marker auf besonders effiziente Art und Weise an das erfindungsgemäße Konjugat gebunden wird, ohne dass dessen Zellmembran- und Kernmembranpermeabilität sowie dessen Wirksamkeit im Hinblick auf die Kontrastverleihung und Apoptoseinduktion negativ beeinflusst werden.
Dabei ist es bevorzugt, wenn zwischen dem detektierbaren Marker und der ersten Verbindung ein Aminosäurespacer angeordnet ist, der vorzugsweise 2 Aminosäuren, weiter vorzugsweise die Aminosäuresequenz GG (SEQ ID Nr. 3) aufweist. Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass störende sterische Interaktionen zwischen dem detektierbaren Marker und der ersten Verbindung weitgehend vermieden werden und dadurch das erfindungsgemäße Konjugat trotz des gebundenen weiteren detektierbaren Markers funktionell bleibt. Es versteht sich, dass der Aminosäurespacer eine beliebige Aminosäuresequenz bzw. auch eine Länge von 1 oder 3 Aminosäuren aufweisen kann, da dieser im Wesentlichen dazu dient, das erste Peptid bzw. den detektierbaren Marker von der ersten Verbindung zu beabstanden, wobei sich allerdings die Abfolge GG als besonders geeignet erwiesen hat. Der Spacer kann ferner als „Aufhänger" für den detektierbaren Marker bzw. die erste Verbindung C- und/oder N- terminal Lysinreste aufweisen. Der Aminosäurespacer kann auch durch ein nicht- peptidischen Spacer ersetzt werden, solange die vorstehend erläuterte Funktion gewährleistet ist.
Dabei ist es bevorzugt, wenn das erfindungsgemäße Konjugat ferner zumindest eine Komponente aufweist, die eine Tumorzellspezifität oder eine Spezifität für virusinfizierte Zellen verleiht.
Solch eine Komponente, die an das Konjugat auf dem Fachmann bekannte Art und Weise gekoppelt oder in dieses eingefügt werden kann, lässt sich bspw. in Form eines Antikörpers oder/und eines Aptamers realisieren, der bzw. das eine Spezifität oder eine Affinität für eine solche Zelle aufweist, bspw. an einen Tumormarker oder einen Infektionsmarker bindet, die spezifisch auf der Oberfläche einer Tumor- oder infizierten Zelle exprimiert werden. Solch eine Komponente kann ferner bspw. in Form eines synthetischen Liganden realisiert werden, der eine Spezifität für derartige Zellen aufweist, oder durch Viren oder Komponenten hiervon, die an das erfindungsgemäße Konjugat gekoppelt werden und dem Letzteren einen Tropismus für Tumorzellen bzw. virusinfizierte Zellen verleihen.
Dabei ist es ferner bevorzugt, wenn die Komponente ein drittes Peptid aufweist, das (i) eine die positive Nettoladung des ersten Peptides zumindest neutralisierende Ladung aufweist, und (ii) über ein zweites Peptid an das Konjugat gebunden ist, das eine Aminosäureerkennungssequenz für ein tumorzell- oder virusspezifisches Enzym aufweist. Als tumorzell- bzw. virusspezifisches Enzym kommen vorzugsweise Matrixmetalloproteinasen (MMP), Cathepsine, prostataspezifisches Antigen (PSA), Herpes-Simplex-Virus-Protease, Humanes-Immundefizienz-Virus-Protease, Cytomega- lovirus-Protease, Interleukin-lß-konvertierendes Enzym in Frage.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass dem erfindungsgemäßen Konjugat auf besonders wirksame Art und Weise eine Tumorzellspezifität bzw. Spezifität für virusinfizierte Zellen verliehen wird. So ist im Stand der Technik bekannt, dass verschiedene Tumor- bzw. Karzinomzellen charakteristische Enzyme exprimieren und in deren zelluläre Umgebung sekretieren, bspw. um zur Invasion von bislang gesunden Geweben oder Organen das umgebende Bindegewebe zu verdauen. So exprimieren und sekretieren bspw. Glioblastome vorwiegend Matrixmetalloproteinase 2 (MMP2). Mammakarzinome exprimieren und sekretieren vorwiegend Cathepsine, die eine spezifische Aminosäuresequenz erkennen und schneiden. Prostatakarzinome exprimieren und sekretieren hauptsächlich prostataspezifisches Antigen (PSA). Es ist auch bekannt, dass virusinfizierte Zellen virusspezifische Proteasen exprimieren und sekretieren. Herpes-simplex-Virus (HSV) infizierte Zellen sekretieren Herpes-simplex- Virus-Protease. Zellen, die mit dem HIV- Virus infiziert sind, exprimieren und sekretieren HIV-Proteasen. Zellen, die mit dem Cytomegalovirus infiziert sind, exprimieren und sekretieren eine Protease, die für diese Art von Virus spezifisch ist.
Sämtliche der vorstehend genannten Enzyme haben eine Substratspezifität, d.h. es werden definierte Aminosäuresequenzen als Schnittstellen erkannt. MMP2 erkennt die Sequenz PLGVR (SEQ ID Nr. 4), PLGVA (SEQ ID Nr. 5) oder PLGLA (SEQ ID Nr. 13), während Cathepsin B die spezifischen Sequenzen KK (SEQ ID Nr. 6) und/oder RR (SEQ ID Nr. 7) erkennen. Cathepsin D erkennt die Sequenz PIC(Et)FF, wobei „Et" eine Esterverzweigung bezeichnet. Cathepsin K erkennt die spezifische Sequenz GGPRGLPG (SEQ ID Nr. 8). PSA erkennt hingegen die Aminosäuresequenz HSSKLQ (SEQ ID Nr. 9). Weitere tumorzellspezifische Enzyme und deren spezifische Erken- nungs- und Schnittstellen sind im Stand der Technik gut beschrieben. Ein Überblick hierüber wird in Hahn, W.C. und Weinberg, R.A., Rules for making human tumour cells, N. Engl. J. Med. 347, Seiten 1593-1603 (2002) gegeben, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung ist.
Die HSV-Protease erkennt die Aminosäuresequenz AEAGALVNASSAAHVDV (SEQ ID Nr. 10), die HIV-Protease erkennt die Sequenz SQNYPIVQ (SEQ ID Nr. 11), die Cyto- megalovirus-Protease erkennt die Sequenz GWNASCRLA (SEQ ID Nr. 12).
Sämtliche der zuvor genannten Sequenzen können als zweites Peptid oder als Bestandteil des zweiten Peptides verwendet werden, über das die Komponente bzw. das dritte Peptid an das erfindungsgemäße Konjugat gebunden ist. Zweite Peptide mit Sequenzen, die eine Homologie von 80%, 85%, 90%, 95%, 98% zu den vorstehenden Sequenzen aufweisen, sind ebenfalls geeignet.
Das dritte Peptid der Komponente, das eine Ladung aufweist, die die positive Nettoladung des ersten Peptides zumindest neutralisiert, ist für die Tumorzellspezifität des Konjugates bzw. Spezifität für virusinfizierte Zellen von besonderer Wichtigkeit. Um die positive Nettoladung des ersten Peptides zu neutralisieren, weist das dritte Peptid eine negative Nettoladung auf, die die positive Ladung des ersten Peptides aufhebt. Die negative Nettoladung des dritten Peptides kann bspw. durch negativ geladene Aminosäuren realisiert werden, wie Glutaminsäure (E) oder Asparaginsäure (D).
„Zumindest neutralisierend" bedeutet in diesem Zusammenhang, dass durch das dritte Peptid auch eine negative Nettoladung des modifizierten erfindungsgemäßen Konstruktes resultieren kann. Als Ergebnis dieser Neutralisierung oder Negativierung der Ladung des so modifizierten erfindungsgemäßen Konjugates, akkumuliert sich das Letztere im Interstitium und ist nicht länger in der Lage in das Zytoplasma oder den Zellkern von nicht-transformierten, gesunden Zellen einzudringen. In der Umgebung von Tumorzellen ist die Situation jedoch eine andere. Hier befinden sich die oben erwähnten tumorzellspezifischen extrazellulären Proteasen, die die Spaltung des zweiten Peptides bewirken, das die entsprechende Erkennungssequenz für diese Proteasen aufweist. Dadurch kommt es in der Umgebung von Tumorzellen bzw. von virusinfizierten Zellen zu einem Verlust der neutralisierenden bzw. negativen Ladung des dritten Peptides. Folglich herrscht durch das positiv geladene erste Peptid erneut eine positive Nettoladung vor, wodurch das erfindungsgemäße Konjugat sowohl die Zellmembran als auch die Kernmembran der Tumorzellen bzw. virusinfizierten Zellen durchdringen kann. Dieser Vorgang ist somit abhängig von der Umgebung der Tumorzellen bzw. virusinfizierten Zellen, so dass das erfindungsgemäß modifizierte Konjugat nur in solche Zellen eindringen und dort die apoptotische Wirkung entfalten kann.
Alternativ weist die Komponente Folgendes auf, nämlich eine zweite Verbindung mit folgender Formel:
in der R1, R2, R3, R4 und Rs jeweils unabhängig voneinander einem Halogen oder einem Wasserstoff entsprechen, und R6 einer Carboxylgruppe (COOH) oder Isothio- cyanat (S=C=N) entspricht, und ein zweites an die zweite Verbindung gebundenes Peptid, das eine Aminosäureerkennungssequenz für ein tumorzell- oder virusspezifisches Enzym aufweist, wobei die Komponente über das zweite Peptid an das Konjugat gebunden ist.
Auch durch diese Maßnahme wird die die Tumorzellspezifität bzw. Spezifität für virusinfizierte Zellen des erfindungsgemäßen Konjugates sichergestellt. Die Erfinder stellen damit überraschenderweise ein solches Konjugat bereit, das sich in seiner Fähigkeit in das Cytoplasma bzw. Zellkerne von gesunden Zellen eindringen zu können, selbst blockiert. Diese Selbstblockade wird durch das Vorhandensein der zweiten Verbindung gewährleistet. Aufgrund der damit verbundenen Größe und Konfiguration des Konjugates, wird eine Aufnahme in das Cytoplasma bzw. den Zellkern von gesunden Zellen verhindert. Das Konjugat verbleibt vielmehr im In- terstitium und wird nach einiger Zeit aus dem Organismus ausgeschieden. In der Umgebung von Tumorzellen bzw. virusinfizierten Zellen hingegen wird das zweite, spezifitätvermittelnde Peptid von den tumor- bzw. virusspezifischen Proteasen erkannt und geschnitten. Die zweite Verbindung wird dadurch von dem Konjugat abgespalten und letzteres kann aufgrund des ersten Peptides in das Cytoplasma und den Zellkern der Tumorzelle eindringen. Die abgetrennte zweite Verbindung verbleibt nach der Abspaltung durch die tumor- oder virusspezifische Protease noch für einige Zeit im Interstitium und wirkt bei einer Ausgestaltung als Kontrastmittel vorteilhafterweise maßgeblich bei der Signalgebung im Tumor bzw. infizierten Areal mit, bis sie aus dem Interstitium abgeführt und dem Organismus ausgeschieden wird. Besonders vorteilhaft ist, dass die abgetrennte zweite Verbindung keine neurotoxi- schen Eigenschaften aufweist, wie dies bspw. für Peptide mit negativer Nettoladung beschrieben ist; vgl. Garattini et al. (2000), Glutamic Acid, Twenty Years Later, J. Nutr. 130 (4S Suppl.): 901S-9S.
Das so modifizierte erfindungsgemäße Konjugat wird in der Umgebung von tumor- bzw. virusinfizierten Zellen sozusagen „aktiviert" und Zellmembran- und zellkern- membranpermeabel, wohingegen eine solche Aktivierung in Gegenwart von gesunden Zellen ausbleibt. Dieser Vorgang ist hochselektiv und spezifisch, so dass das erfindungsgemäße modifizierte Konjugat seine Eigenschaften ausschließlich in Tumorzellen bzw. virusinfizierten Zellen entfaltet.
Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, wenn das Halogen der zweiten Verbindung ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus: Iod, Brom, Fluor, Chlor, und Astat.
Diese Halogene zeichnen sich durch ihrer hohe Röntgendichte aus und liefern deshalb in bildgebenden Verfahren besonders gute Signale.
Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, wenn die zweite Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Triiodobenzoesäure (TIBA), 5-Iodobenzoesäure (5-IBA, 5- MIBA), 4-Iodobenzoesäure (4-IBA, 4-MIBA), 2,3-Diiodobenzoesäure (2,3-DIBA), 3,5- Diiodobenzoesäure (3,5-DIBA), 2,5-Diiodobenzoesäure (2,5-DIBA), Trichlorobenzoe- säure (TCBA), Trifluorobenzoesäure (TFBA), Tribromobenzoesäure (TBBA), Tribromphenyl Isocyanat (TBPI).
Wie oben im Zusammenhang mit der ersten Verbindung erläutert, haben die Erfinder herausgefunden, dass diese Substanzen zur Realisierung der zweiten Verbindung besonders geeignet sind.
Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, wenn das zweite Peptid die Aminosäuresequenz PLGLR (SEQ ID Nr. 4) und/oder PLGVA (SEQ ID Nr. 5) und/oder PLGLA (SEQ ID Nr. 13) aufweist.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass ein solches Konjugat bereitgestellt wird, mit dem spezifisch und hochselektiv Gehirntumoren dargestellt, bzw. behandelt werden können. Die angegebenen Aminosäuresequenzen werden von der für Gehirntumoren charakteristischen Matrix-Metalloproteinase 2 (MMP-2) erkannt und geschnitten. Zweite Peptide mit Sequenzen, die eine Homologie von 80%, 85%, 90%, 95%, 98% zu der SEQ ID Nr. 4 oder Nr. 5 aufweisen, sind ebenfalls geeignet. Mit einem solchen Konjugat kann auch die Wirkung von MMP-2-Inhibitoren, wie Prinomastat, bei der Antiangiogenesetherapie bei Gliomen computertomographisch kontrolliert werden.
Dabei ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn das zweite Peptid über die ε- Aminofunktion eines C-terminal gelegenen Lysinrestes an die zweite Verbindung gebunden ist.
Mit dieser Maßnahme werden die konstruktiven Voraussetzungen für eine stabile Anbringung der zweiten Verbindung, bspw. TIBA, geschaffen. Der Lysinrest kann Bestandteil des zweiten Peptides sein, sich aber auch C- oder N-terminal an dieses anschließen, so dass bspw. folgende Sequenzen für das zweite Peptid erhalten werden: PLGLRiC bzw. PLGVAiC, wobei der Lysin-„Aufhänger" kursiv dargestellt ist. Der Lysinrest kann dabei vorzugsweise über seine α-Aminogruppe oder seine α- Carboxylgruppe kovalent an das zweite Peptid gebunden sein.
Nach einer bevorzugten Weiterbildung weist das erfindungsgemäße Konjugat ein drittes Peptid auf, welches vorzugsweise eine positive Nettoladung, weiter bevorzugt 2 bis 20, vorzugsweise 5 bis 10, weiter vorzugsweise 7 Aminosäuren aufweist. Weiter ist es bevorzugt, wenn das dritte Peptid von einer Kernlokalisierungssequenz (NLS) abgeleitet ist. Das dritte Peptid weist vorzugsweise eine freie Aminofunktion einer Seitenkette auf, über die es an die zweite Verbindung gebunden ist, vorzugsweise über eine ε-Aminofunktion eines N-terminal gelegenen Lysinrestes. Bevorzugt ist es, wenn das dritte Peptid die Aminosäuresequenz PKKKRKV (SEQ ID Nr. 1) oder die Aminosäuresequenz PKKTRKV (SEQ ID Nr. 2) aufweist.
Das dritte Peptid weist somit die gleichen Eigenschaften wie das erste Peptid auf. Die zum ersten Peptid gemachten Ausführungen gelten deshalb für das dritte Peptid entsprechend. Beispielsweise kann an das dritte Peptid auf die entsprechende Art und Weise ebenfalls ein detektierbarer Marker, wie FITC, oder aber auch ein anderer Farbstoff, wie Rhodamin, gekoppelt sein, so dass sich die Marker voneinander unterscheiden. Diese Maßnahme schafft ein mehr oder weniger symmetrisches tumorspezifisches Konjugat, wobei nach der Spaltung des zweiten Peptides durch eine tumor- zellspezifische Protease, wie MMP-2, beide Spaltprodukte spezifisch in die Tumorzelle eindringen können.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform weist die Tumorzellspezifität- vermittelnde Komponente ein Nukleinsäuremolekül auf, das unter stringenten Bedingungen an tumorzellspezifische Moleküle, vorzugsweise an Onkogene, hybridisiert.
Solch ein Nukleinsäuremolekül kann mittels dem Fachmann bekannter Verfahren auf vielfältige Art und Weise an das erfindungsgemäße Konjugat gebunden werden. Dabei ist eine Kopplung sowohl an das erste und/oder zweite Peptid als auch an TIBA denkbar. Die Nukleinsäuresequenz wird hierbei so ausgesucht, dass sie weitgehend komplementär zur Nukleinsäuresequenz von tumorzellspezifischen Molekülen, wie bspw. der Codierungssequenz eines Onkogenes, ist. Solch ein Nukleinsäuremolekül kann dadurch in der Art eines „Ankers" wirken und das erfindungsgemäße Konjugat in den Tumorzellen akkumulieren, so dass nur dort seine Aktivität entfaltet werden kann. Hierzu im Gegensatz erfolgt keine Akkumulierung des erfindungsgemäßen Konstruktes in nicht-transformierten, gesunden Zellen, da dort tumorspezifische Moleküle nicht oder nur in sehr schwachem Maße exprimiert werden. Das Nukleinsäuremolekül kann dabei so ausgestaltet sein, dass es entweder an die mRNA oder auch an die DNA hybridisiert, die für die tumorzellspezifischen Moleküle codieren. Einen Überblick über bekannte Onkogene und Gene, die in das Wachstum von Tumoren involviert sind, und von denen die Sequenzen zur Realisierung des Nuk- leinsäuremoleküls abgeleitet werden können, findet sich in Vogelstein, B. und Kinzler K.W., Cancer genes and pathways day control, Nat. Med. 10, Seiten 789-799 (2004). Der Inhalt dieser Publikation ist durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung des vorstehend beschriebenen Konjugates zur Herstellung einer diagnostischen Zusammensetzung, wobei es sich vorzugsweise um ein Kontrastmittel für die Computertomographie (CT) und/oder Radioiodtherapie handelt.
Ein weiterer Gegenstand betrifft die Verwendung des erfindungsgemäßen Konjugates zur Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung, bei der es sich vorzugsweise um eine apoptoseauslösende Zusammensetzung handelt.
Ein weiterer Gegenstand betrifft eine pharmazeutische und/oder diagnostische Zusammensetzung, die das erfindungsgemäße Konjugat und ggf. eine pharmazeutische und/oder diagnostisch akzeptablen Träger aufweist. Diagnostisch und pharmazeutisch akzeptable Träger mit ggf. weiteren Zusätzen sind im Stand der Technik allgemein bekannt und werden bspw. in der Abhandlung von Kibbe A., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Edition, American Pharmaceu- tical Association and Pharmaceutical Press 2000, beschrieben. Hierunter fallen bspw. Bindemittel, Sprengmittel, Schmiermittel, Salze und weitere im Rahmen der Formulierung von Arzneimittel verwendete Stoffe.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur diagnostischen und/oder analytischen Behandlung von biologischem Material oder einem Lebewesen, das folgende Schritte aufweist: (a) Inkubation oder Verabreichung des erfindungsgemäßen Konjugates mit biologischem Material oder in ein Lebewesen, (b) Durchführung eines bildgebenden Verfahrens.
Bei den bildgebenden Verfahren handelt es sich allgemein um nuklearmedizinische bzw. radiologische Verfahren, einschließlich Angiographie, Positronenemissionstomographie, Szintigraphie, sowie um die Nahinfrarotbildgebung bzw. konventionelle Fluoreszenzmikroskopie, wobei eine Computertomographie (CT) bevorzugt ist.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur therapeutischen Behandlung eines Lebewesens, bei dem das erfindungsgemäße Konjugat in das Lebewesen verabreicht wird.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Im Anschluss werden Ausführungsbeispiele der Erfindung angegeben, die rein illustrativen Charakter haben und die Reichweite der Erfindung nicht einschränken. Dabei wird Bezug genommen auf die beiliegenden Figuren, in denen Folgendes gezeigt ist: Fig. 1 zeigt beispielhaft die ESI-Massenspektren für die Konjugate 1-4 mit molekularen Massen von 2123,4 Da (Kl)(A), 2096,3 Da (K2)(B), 1641,8 Da (K3)(C) und 1614,6 Da (K4)(D).
Fig. 2 zeigt fluoreszenz- und transmissionslichtmikroskopische Aufnahmen von humanen malignen U373-Gliomzellen nach 20minütiger Inkubation mit PBS allein (nativ, Spalte 1), TIBA-enthaltendem Konjugat 2 (mutierte NLS) (126 μM, 260 μM, 2,6 mM, Spalten 2-4) und Nicht- TIBA-enthaltendem Konjugat 4 (mutierte NLS) (26 μM, 260 μM, 2,6 mM, Spalten 5-7).
Erste Spalte (FITC-Kanal): Lokalisierung des FITC-markierten Konjuga- tes. Unbehandelte Zellen zeigen keine Autofluoreszenz.
Zweite Spalte (Propidiumiodid (PΙ)-Kanal): Ergebnis des PI- Vitalitätstests. Die Kerne von toten Zellen sind angefärbt. Die lebenden Zellen bleiben dunkel.
Dritte Spalte: Ergebnis des MTT- Vitalitätstests. Lebende Zellen oxidieren Methyl-thiazoyl-tetrazolium (MTT)-SaIz, produzieren blaue Forma- zangranula, die mit zunehmender Inkubationsdauer lange Kristalle ausbilden.
Vierte Spalte: Die Überlagerung der FITC-, PI- und Formazan- Aufnahmen demonstriert eindeutig, dass die meisten der Zellen, die das Konjugat 4 im μmolaren und mmolaren Bereich aufgenommen haben, vital sind (Produktion von Formazan, kein PI innerhalb des Zellkerns). Hierzu im Gegensatz sind sämtliche Zellen, die das Konjugat 2 mit einer Konzentration von 260 μM oder mehr aufgenommen haben, nicht vital (keine Formazan-Produktion, Aufnahme von PI in den Kern). Eine Aufnahme von PI in gesunde, lebende Zellen mit Formazan-Produktion ist möglich, nachdem es durch die langen Formazankristalle zu einer mechanischen Schädigung ihrer Zellmembran gekommen ist.
FIG. 3A) FACS (fluoreszenzaktivierte Zellsortierung)-Analyse, die einen niedrigen prozentualen Anteil von stark markierten Zellen nach der Inkubation mit den Nicht-TIBA-enthaltenden Konjugaten demonstriert (Konjugat 3: 26 μM/6 %, 260 μM/7 % und 2,6 mM/10 %) (Konjugat 4: 26 μM/4 %, 260 μM/11 % und 2,6 mM/13 %).
FIG. 3B) Nach der Inkubation mit den TIBA-enthaltenden Konjugaten (Konjugat 1: 26 μM/22 °/0/ 260 μM/82 % und 2,6 mM/93 %) (Konjugat 2: 26 μM/0 %, 260 μM/78 % und 2,6 mM/86 %) konnte eine deutliche Zunahme von stark angefärbten Zellen auf mehr als 90 % beobachtet werden.
FIG. 3C) Nach der Inkubation mit den TIBA-enthaltenden Konjugaten bei 260 μM und 2,6 mM konnten auf morphologischer Basis zwei Zellpopulationen voneinander unterschieden werden (Side-Scatter versus Vorwärts-Scatter-FACS- Analyse) .
Fig. 4A) CLSM-Aufnahmen von humanen malignen U373-Gliomzellen. Das
Annexin-V-Alexa™-568-Reagens wurde verwendet, um Phosphatidylse- rin in der Außenmembran von nekrotischen oder apoptotischen Zellen zu detektieren. Die Inkubation mit TIBA allein oder den Nicht-Tiba- enthaltenden Konjugaten 3 und 4 resultierte nicht in der Bindung von Annexin- V- Alexa™-568- Reagens an die Oberfläche der Gliomzellen. Die Co-Inkubation von TIBA mit den Konjugaten 3 und 4 führte ebenfalls nicht zu der Bindung des Annexin-V-Alexa™-568-Reagens an die Oberfläche der Gliomzellen und nicht zu einer höheren Zeilfärbungsrate. Allerdings konnte eine Bindung des Annexin-V-Alexa™-568-Reagens nach der Inkubation mit den TIBA-enthaltenden Konjugaten 1 und 2 beobachtet werden. Nach der Inkubation mit PBS oder 0,1 % DMSO/PBS allein konnten keine Anzeichen von Zelltod ausgemacht werden (CLSM- Aufnahmen nicht gezeigt).
Fig. 4B) Übersichtsaufnahmen (CLSM) von humanen malignen U373-
Gliomzellen. Es wurde eine sehr große Anzahl von Zellkernen mit dem FITC-markierten TIBA-enthaltenden Konjugaten 1 (Reihe 1) und 2 (Reihe 2) (260 μM) (linke Spalte) angefärbt. Die meisten dieser Zellen zeigen die Expression von Phosphatidylserin in der Außenmembran und wurden deshalb mit dem Annexin-V-Alexa™-568-Reagens gefärbt (rechte Spalte).
Fig. 4C) Fluoreszenzmikroskopie von Semidünnschnitten (ca. 0,4 μm) von humanen malignen U373-Gliomzellen nach der Inkubation mit den TIBA-Konjugaten 1 (korrekte NLS) und 2 (mutierte NLS). Die Nucleoli der Zellen sind deutlich gefärbt.
Fig. 5A) Repräsentative CT- Aufnahme von humanen malignen U373-
Gliomzellen mit lediglich niedriger Signaldichte nach der Inkubation (20 Minuten) mit PBS allein (Röhrchen 1), Ultravist (Iopromid) (260 μM) (Röhrchen 2), TIBA allein (260 μM) (Röhrchen 3) und Konjugaten 2 (Röhrchen 4) und 1 (Röhrchen 5) allein (beide 26 μM). Eine signifikante Zunahme der Signaldichte konnte nur nach der Inkubation mit den TIBA-enthaltenden Konjugaten 2 und 1 bei höheren Konzentrationen beobachtet werden [Konjugat 2: 260 μM (Röhrchen 6) und Konjugat 1: 260 μM (Röhrchen 7)] [Konjugat 2: 2,6 mM (Röhrchen 8) und Konjugat 1: 2,6 mM (Röhrchen 9)]. Etwa 6xlO6 Zellen pro Röhrchen wurden untersucht. Die Untersuchungen erfolgten in Dreifachansätzen [Fensterung: -1/74]. Fig. 5B) Entsprechende MTT-Testergebnisse von Zellpellets von der Computertomographie nach der Inkubation mit Konjugat 2 (oben) und Konjugat 1 (unten) beide: 26 μM, 260 μM und 2,6 mM). Nur vitale Zellen oxidie- ren das gelbe Methyl-thiaozyl-tetrazolium (MTT)-SaIz in blaues Forma- zan (Inkubation entweder mit PBS allein oder mit beiden Konjugaten bei 26 μM).
Fig. 5C) CT- Aufnahme (InSpace) von humanen malignen U373-Gliomzellen nach der Inkubation (20 Minuten) mit PBS allein (links), TIBA- enthaltendem Konjugat 1 (korrekte NLS) (Mitte) und TIBA- enthaltendem Konjugat 2 (mutierte NLS) (rechts) (beide 2,6 mM). Es wurden keine wesentlichen Unterschiede zwischen den Konjugaten 1 und 2 festgestellt.
Fig. 5D) Korrespondierende Signaldichte für die Zellpellets in den Röhrchen 1-9 (Teilabbildung A).
Fig. 6A) Oben: CT-Aufnahme von humanen Prostatakrebszellen (PC3) nach der
Inkubation (20 Minuten) mit dem Nicht-TIBA-enthaltenden Konjugat 4 (mutierte NLS) (260 μM, links) und dem TIBA-enthaltenden Konjugat 1 (korrekte NLS) (260 μM, rechts) (Fensterung: -2/112). Unten: Fluoreszenz- und Transmissionslicht-mikroskopische Aufnahmen von humanen Prostatakrebszellen (PC3) nach der Inkubation für 20 Minuten mit PBS allein (nativ, Reihe 1), Nicht-TIBA-enthaltendem Konjugat 3 (korrekte NLS) (520 μM, Reihe 2) und dem TIBA-enthaltendem Konjugat 2 (mutierte NLS) (520 μM, Reihe 3). Fig. 6B) Prostatakrebszellen
(PC3). FACS (fluoreszenzaktivierte Zellsortierung)-Analyse, die der von humanen malignen U373-Zellen ähnelt.
Fig. 6C) Nach der Inkubation mit den TIBA-enthaltenden Konjugaten bei 260 μM und 2,6 mM konnten auf morphologischer Basis zwei Zellpo- pulationen voneinander unterschieden werden (Side-Scatter versus Vorwärts-Scatter-FACS-Analyse). Die obere Wolke (Bild rechts oben) repräsentiert die Population der stark gefärbten Zellen (hoher, rechts gelegner Histogrammgipfel; Bild links oben). Die untere Wolke (Bild rechts unten) repräsentiert die Population der schwach gefärbten Zellen (flacher, links gelegner Histogrammgipfel; Bild links unten)
Fig. 7 Konfokale Laser Mikroskopie humaner maligner LN18-Gliomzellen.
Annexin-V-Alexa™ 568 Reagenz wurde zur Detektion von Phosphat! - dylserin im äusseren Membranblatt nekrotischer oder apoptotischer Zellen ver-wendet. Die Koinkuabtion von entweder MIBA (4- Monojodbenzoesäure) oder DIBA (2,5-Dijodobenzoesäure) mit Konju- gat 3 führte zu keiner Bindung von Annexin-V-Alexa™ 568 an der O- berfläche der Gliomzellen und war im Vergleich zur Inkubation mit Konjugat 3 allein nicht mit einer höheren Färbungsrate verbunden.
Fig. 8 Konfokale Laser Mikroskopie humaner maligner LNl 8 Gliomzellen. Die
Inkubation mit den Konjugaten 3 und 9 (260 μM) führte zur nuklearen Färbung bei nur wenigen Zellen. Diese blieben vital (keine Annexin-V- Alexa™ 568 Reagenz-Färbung). Ein hoher Prozentsatz an Zellen mit Zeichen des Zelltodes (Annexin-V-Alexa™ 568 Reagenz-Färbung) fand sich jedoch nach Inkubation mit den MIBA (4-Monojodbenzoesäure)- und DIBA (2,5-Dijodobenzoesäure)-enthaltenden Konjugaten 10 und ll (260 μM).
Fig. 9 FACS (fluorescence activated cell sorting)-Analyse. Eine deutliche
Zunahme der stark gefärbten Zellen (über 80%) fand sich erst nach Inkubation mit den MIBA (4-Monojodbenzoesäure)- und DIBA (2,5- Dijodobenzoesäure)-enthaltenden Konjugaten 10 und 11 (260 μM). Dies zeigt sich an der Verlagerung des Histogrammgipfels nach rechts. Fig. 10 CLSM (Konfokale Laser Mikroskopie). U373-Gliomzellen nach Inkubation mit Konjugat 12: Viele nuklear gefärbte Zellkerne; links oben: FITC-Kanal: Bestimmung der Lokalisation des Konjugates; rechts oben: Annexin-Kanal für die Färbung mit Annexin-Alexa als Zeichen für eine starke Expression von Phosphatidylserin beim Zelltod; links unten: Durchlichtmikroskopie; rechts unten: Überlagerung des FITC- u. Annexin-Kanals.
Fig. 11 FACS (fluorescence activated cell sorting)-Analyse nach Inkubation der
LN18- und U373-Gliomzellen mit Konjugat 12 (260 μM und 2.6 mM). Bei der höheren Konzentration werden bei beiden Zelllinien deutlich mehr Zellen gefärbt. Diese Färbung ist bei U373-Gliomzellen stärker ausgeprägt. Im Wolkendiagramm zeigen sich bei der höheren Konzentration zwei morphologisch verschiedene Populationen.
Fig. 12 CT-BiId (InSpace Modus) der LN18- und U373-Gliomzellen nach
Inkubation mit Konjugat 12 (260 μM und 2.6 mM). Erst nach Inkubation mit der höheren Konzentration sind die Zellzentrifugate in den Röhrchen aufgrund der höheren Signaldichte abgrenzbar.
Fig. 13 Konfokale Laser Mikroskopie von LN18-Gliomzellen. Die Inkubation von freier, nicht gekoppelter Trifluorobenzoesäure (TFBA) gemeinsam mit Konjugat 3 führt nur zu wenigen gefärbten Zellen, welche vital bleiben [keine zelluläre Aufnahme von Propidium Iodid (PI)]. Die Inkubation mit Konjugat 13 (Trifluorobenzoesäure ist fest an K3 gekoppelt) färbt jedoch eine große Zahl von Zellen nuklear (linke Spalte). Diese Zellen nehmen jetzt PI auf und sind nicht mehr vital (zweite Spalte).
Fig. 14 CLSM von LN18-Gliomzellen. Nach Inkubation mit Konjugat 3 gemeinsam mit freier Trichlorobenzoesäure stellen sich nur wenig nuklear gefärbte Zellen dar. Diese bleiben vital (fehlende Färbung mit Anne- xin-Alexa, Spalte 2). Erst nach Inkubation mit Konjugat 14 (TCBA fest an K3 gekoppelt) färben sich fast alle Zellkerne. Die Zellen sind tot (Färb, mit Alexa- Annexin).
Fig. 15 Konfokale Laser Mikroskopie von LN18-Gliom-zellen. Die Inkubation nur mit freiem, Tribromophenyl-isocyanat (TBPI) führt nicht zum Zelltod (keine Annexin-Alexa-Färbung, 2. Spalte). Das TBPI-freie Konjugat 3 färbt nur wenig Zellen nuklear an, diese bleiben vital (keine Färbung mit Annexin). Auch die gemeinsame Inkubation von freiem TBPI mit Konjugat 3 führt nur zu wenig nuklear gefärbten Zellen ohne Beeinträchtigung der Vitalität (fehlende Färbung mit Annexin). Erst nach Inkubation von Kl 5 (TBPI fest an K3) zeigt sich eine massive Kernfärbung fast aller Zellen (Spalte 1). Alexa-Annexin bindet an die Oberfläche der Zellen (2. Spalte, Zeichen für Zelltod).
Fig. 16 A: Konfokale Laser Mikroskopie (Überlagerung des FITC- und Alexa-
Bildes). Die Zellkerne der LN18-Gliomzellen reichern das FITC- markierte Tribromophenyl Isocyanat-NLS-Konjugat (K 15) an. Das rote Alexa-Annexin bindet an Phosphatidylserin, welches beim Zelltod stark an der Zelloberfläche exprimiert wird. B: FACS (fluorescence activated cell sorting)-Analyse von LN 18- und U373-Gliomzellen nach Inkubation entweder mit Konjugat 3 allein, Konjugat 3 plus freiem Tribromophenyl Isocyanat (TBPI) oder dem TBPI-NLS-Konjugat 15. Eine deutliche Zunahme der stark mit FITC gefärbten Zellen (Verschiebung des Histogrammgipfels nach rechts) zeigt sich nur nach Inkubation mit dem Konjugat 15. C: Semidünnschnitt einer LN18-Gliomzelle. Der Nukleolus (im Zentrum) ist durch das Tribromophenyl Isocyanat-NLS- Konjugat 15 stark angefärbt.
Fig. 17 FACS (fluorescence activated cell sorting)-Analyse von LN-18 und
U373-Gliomzellen. Die Inkubation der Konjugate 13 [Trifluorobenzoe- säure (TFBA) an K3 gekoppelt] oder 14 [Trichlorobenzoesäure (TCBA) an K3 gekoppelt] führt jeweils zu einer Verschiebung des Histogrammgipfels nach rechts und damit zu einer Zunahme der Anzahl stark FITC- gefärbter Zellen. Wird jedoch die freie, ungebundene TFBA bzw. TCBA gemeinsam mit dem Konjugat 3 inkubiert, bleibt die Rechtsverschiebung des Histogrammgipfels aus.
Fig. 18 Wirkprinzip des tumorspezifischen Konjugates 16.
Fig. 19 Konfokale Laser Mikroskopie von LN18-Gliomzellen nach Inkubation mit Konjugat 16 in Gegenwart inaktiver (obere Reihe) oder aktiver Mat-- rix-Metalloproteinase 2 (MMP-2). Die Zellkerne färben sich erst durch das gespaltene Konjugat nach Einwirkung der aktiven MMP-2 (linke Spalte). Nur das gespaltene Konjugat löst Zelltod aus (Aufnahme von Propidium Iodid, zweite Spalte).
Fig. 20 FACS (fluorescence activated cell sorting)-Analyse von LN18-Gliom- zellen nach Inkubation mit dem Konjugat 16 in Kulturmedien jeweils mit inaktiver oder aktiver Matrix-Metalloproteinase 2 (MMP-2) bei 65 und 260 μM. Nach Spaltung des Konjugates 16 durch die aktive MMP-2 werden die LN18-Gliomzellen deutlich stärker gefärbt (Verschiebung des Histogrammgipfels nach rechts).
Fig. 21 CT-BiId (In Space Modus). Linkes Röhrchen: LN18-Gliomzellen (nativ,
60 minütige Inkubation in Medium ohne Konjugat 16). Mittleres Röhrchen: LN18-Gliomzellen nach 60 minütiger Inkubation mit Konjugat 16 (260 μM) in MMP-2 haltigem Medium. Die MMP-2 wurde durch den MMP-2 Inhibitor I blockiert. Rechtes Röhrchen: LN-18-Gliomzellen nach 60 minütiger Inkubation mit Kl 6 (260 μM) in MMP-2-haltigem Medium. Die aktive MMP-2 wurde nicht mit dem MMP-2 Inhibitor I blockiert. Fig. 22 HPLC (High Performance Liquid Chromatography) von Konjugat 16 vor (A) und nach (B) Einwirkung der Matrix-Metalloproteinase 2 (MMP- 2). Vor der Spaltung des Konjugates 16 findet sich nur ein Peak, der sich nach Spaltung in zwei Komponenten aufteilt.
Ausführungsbeispiele:
1. Material und Methoden
1.1 Peptidsynthese
1.1.1 Konjugate 1 bis 8:
Die Konjugate 1 bis 8 (Tabelle 1) wurden auf einem Eppendorf-ECOSYN P- Festphasensyntheseapparat mit Fmoc-Rink-Amid-Tentagel SRAM (0,25 mM/g) (Rapp Polymere, Tübingen, Deutschland) synthetisiert. Sämtliche Aminosäuren (0,1 mM pro 0,4 g Harz), außer dem N-terminalen Prolin, wurden mit A- minofunktionen inkorporiert, die durch die 9-Fluorenylmethyloxy- carbonyl(Fmoc)-Gruppe geschützt waren: Die Funktionen der Seitenketten wurden geschützt als Tert-butylether (Threonin), 2.2.4.6.7. -Pentamethyl- dihydrobenzofuran-5-sulfonyl(arginin), Tert-butyloxycarbonyl (Lysin, außer Lysin 8) oder 4-Methyltrityl (Lysin-8). Fmoc-Lys (N*-2,3,5-Triiodobenzoyl) wurde durch die Kopplung von KP-Fmoc-Lys-OH mit 2,3,5-Triiodobenzoesäure (TIBA) hergestellt, indem eine Aktivierung mit Isobutylchloroformiat (1 eq.) und N-Methylmorpholin (1 eq.) erfolgte (gemischte Anhydridkopplung). Die Substanz wurde aus dem DMF/Diethylether rekristallisiert. Sämtliche Kopplungen wurden unter Verwendung eines vierfachen Überschusses von Aminosäuren und dem Kopplungsreagens 2-(l-H-Benzotriazol-l-yl)-l.1.3.3. - tetramethyluronium-tetrafluoroborat (TBTU) + Diisopropylethylamin (2 eq.) gegenüber der Menge von Harz durchgeführt. Vor der Kopplung der geschützten Aminosäuren wurden die Fmoc-Gruppen von dem Aminoende des wachsenden Fragmentes unter Verwendung von 25 % Piperidin in DMF entfernt. Die FITC-Anteile wurden in den Lysin-8-Rest mit Fluorescein-5(6)-isothiocanat in DMSO - N-Methylmorpholin (1 eq.) eingebracht, nachdem die 4-Methyltrityl-Gruppe von Lysin-8 mit TFA in Dichlo- romethan (1 %) + Triisopropylsilan (1 %) für 1 Stunde bei Raumtemperatur entfernt wurde. Das N-terminale Prolin wurde als Boc-Derivat eingebracht. Es wurde eine simultane Spaltung der Schutzgruppen der Aminosäureseitenketten durchgeführt, indem das Harz in einer Mischung von 12 ml Trifluoressig- säure, 0,3 ml Ethandithiol, 0,3 ml Anisol, 0,3 ml Wasser und 0,1 ml Triisopropylsilan für 2 Stunden inkubiert wurde. Die Mischung wurde filtriert und mit TFA gewaschen, und die kombinierten Filtrate wurden mit wasserfreiem Diethylether präzipitiert.
Die Rohprodukte wurden ferner durch HPLC auf einer Nucleosilsäule 100 C18 (7 μm) 250 x 10 gereinigt, wobei die Elution bei 214 nm überwacht wurde (Puffer A: 0,07 % TFA/H2O, Puffer B: 80 % CH3CN/0,058 % TFA/H2O; 4 ml/min). Die Peptide wurden mittels einer analytischen Hochleistung- Flüssigkeitschromatographie (HPLC) und Elektrospray-Ionisierungs-Massen- Spektrometrie (ESI/MS) auf Reinheit analysiert (siehe 1.2). Die Reinheit der Substanz war zumindest 98 %.
1.1.2 Konjugate 9, 10 und 11
Fmoc Lys (N-Benzoyl), Fmoc Lys (N -4-Monoiodobenzoyl) und Fmoc Lys (N- 2,5-Diiodobenzoyl) wurden durch Kopplung von N -Fmoc Lys-OH mit Benzoesäure (BA), 4-Monojodobenzoesäure (MIBA) und 2,5-Dijodobenzoesäure (DIBA) (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland) hergestellt [Aktivierung mit Isobutylchloroformiat (iBuOCOCI) (1 eq.) (Merck) und N-Methylmorpholin (NMM) (1 eq.) (Fluka, Buchs, Schweiz) (gemischte Anhydridkupplung)]. Die Synthese der Konjugate 9, 10 und 11 wurde sonst auf die gleiche Weise wie unter 1.1.1 beschrieben. Die Reinheit der Konjugate (mindestens 98%., wurde mit der analytischen HPLC (high Performance liquid chromatography) überprüft. Die Masse wurde durch Elektrospray-Ionisierungs-Massenspektrometrie (ESI/MS) bestimmt (siehe 1.2).
1.1.3 Konjugat 12:
Fmoc Pro (N-Trijodobenzoyl) wurde hergestellt durch Kopplung von N-Fmoc- Pro-OH mit Trijodobenzoesäure. Die übrige Snythese des Konjugates 12 wurde so auf einem Eppendorf ECOSYN P Festphasenpeptidsynthesizer (Eppendorf- Biotronik, Hamburg, Germany) durchgeführt, wie unter 1.1.1 beschrieben [Reinheit des Konjugates mindestens 98%, analytische HPLC (high perfor- mance liquid chromatography)]. Die Masse wurde wie in Absch.l durch Elek- trospray-Ionisierungs-Massen-spektrometrie (ESI/MS) bestimmt (siehe 1.2).
1.1.4 Konjugate 13, 14, 15
Fmoc Lys (N-Benzoyl), Fmoc Lys (N -Trichlorobenzoyl), Fmoc Lys (N -2,5- Trifluorobenzoyl) sowie Fmoc Lys (N-2,4,6-Tribromophenyl-Ureido)-OH wurden hergestellt durch Kopplung von N -Fmoc Lys-OH mit entweder Benzoesäure (BA), Trichlorobenzoesäure (TCBA), Trifluorobenzoesäure (TFBA) (Sigma- Aldrich, Tauf-kirchen, Deutschland) oder 2,4,6-Tribromophenyl Isocyanat (TBPI) (Sigma-Aldrich) [Aktivierung mit Isobutylchloroformiat (iBuOCOCI) (1 eq.)(Merck) und N-Methyl-morpholin (NMM) (1 eq.) (Fluka, Buchs, Schweiz) (gemischte Anhydridkupplung). Die übrige Synthese der Konjugate wurde auf die gleiche Weise wie unter 1.1.1 beschrieben durchgeführt [Reinheit in der analytischen HPLC (high Performance liquid chromatography) mindestens 98%]. Die Masse wurde durch Elektrospray-Ionisierungs-Massenspektrometrie (ESI/MS) bestimmt (siehe 1.2).
1.1.5 Konjugat 16 Die Synthese des tumorspezifischen Konjugates 16 erfolgte nach der Fmoc- Festphasensynthese auf einem Eppendorf ECOSYN P Peptidsynthesizer (Ep- pendorf-Biotronik, Hamburg, Germany). Dabei diente die basisch abspaltbare 9-Fluorenylmethyloxycarbonylgruppe als Amino-schutzgruppe. Als Trägermaterial wurde das Tentagel S Rink-Amid-Harz (Rapp-Polymere, Tübingen, Germany) verwendet. Die Synthese wurde im 0.1 mMol Massstab durchgeführt. Die Kupplungen wurden mit den entsprechend geschützten Fmoc- Aminosäuren bei 4-fachem Überschuss mit 2 (IH Benzotriazol-l-yl)-l.1.3.3- tetramethyluronoium tetrafluoroborat [TBTU] (4eq) in Gegenwart von 8 eq. Diisopropylethylamin innerhalb von 40 Minuten durchgeführt. Als Schutzgruppen für die Seitenketten wurden verwendet: für Lysin: Tert. Butyloxycar- bonyl (Boc), für Arginin: Pbf (N6-2.2.4.6.7-Pentamethyldihydro-benzofuran-5- SuIf onyl).
Für die Seitenketten, die mit den Trijodobenzoylgruppen versehen werden sollten, wurden Lysin-Derivate mit 4-Methoxytrityl (Mmt)-Schutz verwendet. Für die Position, die den Fluoresceinharnstoffrest tragen soll, wurde das Lys- Dde-Derivat [Dde=l-(4.4-Dimethyl-2,6-Dioxocyclohex-l-Ylidene)-Ethyl] verwendet.
Nach erfolgter Kopplung wurde der Fmoc-Rest jeweils mit 25% Piperidin/ Di- methylformamid (DMF)-Lösung innerhalb von 11 Min. abgespalten. Nach mehrfachem Waschen mit Dimethylformamid (DMF) steht das Peptidharz für eine weitere Kupplung zur Verfügung.
Nach sukzessivem Aufbau des Peptides vom C-Terminus beginnend wird die N-terminale Aminosäure Prolin als Boc-Prolin in das Peptid eingeführt. Dann wird die Mmt-Seitenkettenschutzgruppe durch mehrfaches Versetzen mit 1% TFA/Dichlor-methan(DCM)-Lösung, die 1% Triisopropylsilan enthält, innerhalb einer Stunde abgespalten. Nach mehrfachem Waschen mit DMF und Neutralisieren des entstandenen TFA-Salzes mit Diisopropylethylamin, steht die freigelegte Seitenkette für eine Kupplung mit 2.3.5 Trijodobenzoesäure zur Verfügung (3 eq. in Gegenwart von 3 eq. TBTU und 6 eq Diisopropylethyla- min innerhalb 1.5 h bei Raumtemperatur). Dann wird die Dde-Schutzgruppe durch mehrfaches Versetzen des Harzes mit einer 2.5 %-igen Hydrazinhydrat- Lösung in DMF innerhalb einer Stunde abgespalten.
Nach mehrfachem Waschen mit DMF, wird das Fluoresceinharnstoffderivat durch Kopplung von 0.5 mM Fluorescein 5(6)-Isothiocyanat in Gegenwart der eq. Menge Diisopropylethylamin in DMSO über Nacht bei Raumtemperatur hergestellt.
Nach mehrfachem Waschen mit DMF, Methanol und Dichlormethan werden nach Trocknen die restlichen Schutzgruppen sowie das Peptid vom Harz simultan abgespalten. Dies geschieht durch drei Stunden langes Rühren des getrockneten Harzes in einer Mischung aus 12 ml TFA, 0.3 ml Ethandithiol (EDT), 0.3 ml Anisol, 0.3 ml Wasser und 0.1 ml Triisopropylsilan bei Raumtemperatur.
Dann wird direkt in gekühltem absoluten Diethylether filtriert. Das präzipitierte Peptid wird abfiltriert, mit Ether gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die so erhaltenen Rohpeptide werden durch semipräparative HPLC unter Verwendung einer Nucleosil 100 7mm C18 Säule (10 x 250 mm) gereinigt (Puffer A: 0.07% TFA/H20, Puffer B: 80% CH3CN in 0.058% TFA/H2O) (4ml/min 90 bar, 214 nm); 10® 90%B in 13 min. Das so erhaltene Konjugat ist homogen in der analytischen HPLC (Reinheit mindestens 98%) und in Einklang mit seiner Struktur (ESI-MS).
1.2 Elektrospray-Ionisierungs-Massen-Spektrometrie (ESI-MS)
Die Konjugate wurden mittels ESI-MS auf ein Esquire3000+ Spektrometer ion trap mass spectrometer (Bruker-Daltonics, Bremen, Deutschland) analysiert. Die Peptide wurden in 40 % ACN, 0,1 % Ameisensäure in Wasser (v/v/v) (20 pmol/μl) gelöst und gleichmäßig infundiert, wozu eine Spritzenpumpe verwendet wurde (5 μl/min Flussrate). Die Massenspektren wurden im Modus für positive Ionen erstellt. Trockengas (6 l/min) wurde auf eine Temperatur von 325 0C, der Vernebler auf 20,0 psi und die Elektrosprayspannung auf - 3700 V gebracht.
1.3 Spaltungstest (Konjugat 16)
Das Konjugat 16 wurde in HEPES-Puffer gelöst, welcher einmal die aktive MMP-2 (Calbiochem, Bad Soden, Germany) und einmal die inaktive MMP-2- Proform (Calbiochem) enthielt. Die Inkubation in HEPES mit aktiver MMP-2 dauerte 2 Stunden.
Zur Umwandlung der inaktiven MMP-2-Proform in die aktive MMP-2 wurde APMA (4-aminophenyl mercuric acetate) verwendet. Dazu wurde APMA- Stammlösung (100 raM in DMSO) zur Lösung mit dem Proenzym und dem Konjugat dazugegeben (endgültige APMA-Konzentration: ImM, mit 1% DMSO). Danach wurde das Konjugat 2 Stunden inkubiert.
Zur Kontrolle wurde das Konjugat 16 nur mit HEPES-Puffer inkubiert. Die Versuche wurden auch mit einem MMP-2-Inhibitor durchgeführt. Die Spaltprodukte wurden mit der HPLC evaluiert:
Säule: Nucleosil 100 5μm Ci8 (250x4); Puffer A: 0.07% CF3COOH/H2O;
Puffer B: 0.058% CF3COOH/80% CH3CN
10 → 90% B in 36 min; 170 bar; 1 ml/min; 214 nm
1.4 Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie (Konjugate 1 bis 4)
Humane maligne U373-Gliomzellen wurden bis zu 70 % Konfluenz in RPMI- 1640-Ready-Mix-Medium enthaltend L-Glutamin und 10 % FBS-GoId (PAA Ia- boratories, Pasching, Österreich) bei 37 0C, 5 % CO2 (vol/vol) in 4-Well-PIatten (NUNC, Wiesbaden, Deutschland) mit etwa 300.000 Zellen pro Well wachsen gelassen. Die Zellen wurden mit Dulbecco's PBS (D-PBS; GIBCO, Invitrogen, Deutschland) allein (Negativkontrolle) und mit 26 μmolaren, 260 μmolaren und 2,6 mmolaren Lösungen der Konjugate 1-4 in D-PBS für 20 Minuten bei 37 0C in einer Atmosphäre mit 5 % CO2 inkubiert. Danach wurden die Zellen dreimal mit Puffer gewaschen und dann erneut mit Ready-Mix-Medium inkubiert. Die Zellvitalität wurde anschließend durch die Zugabe von Methyl- thiazoyl-tetrazolium (MTT)-SaIz (Sigma Aldrich, Deutschland) bei einer Konzentration von 15 mg/ml überprüft. Nach 20 Minuten wurde die Produktion von Formazan untersucht. Wenn blaue Formazangranula detektiert wurden, wurde Propidiumiodid (PI) zu dem Medium hinzugegeben (1 μM PI; Molecular Probes, Eugene, OR, USA), um Zellen mit beschädigten Zellmembranen zu de- tektieren. Die Formazan-Produktion wurde für zumindest zwei Stunden beobachtet. Zur Fluoreszenz- und Transmissions-Lichtmikroskopie wurde ein Umkehrmikroskop (Axiovert 135 M, Carl Zeiss, Jena, Deutschland), Long-distance (LD)-Obj ektive (Carl Zeiss, Jena, Deutschland), ein Illuminator N HBO103 (Carl Zeiss, Jena, Deutschland) und Standardfluoreszenzfilter zur Anregung und Emission von FITC und PI verwendet. Die Aufnahmen wurden mit einer 3-CCD-Farbvideokamera (MC3254P, Sony, Japan) und der Axiovision Software (Carl Zeiss, Jena, Deutschland) gemacht. Die Intensität der Zellfluoreszenz wurde als die Expositionszeit aufgenommen, die zur Herstellung von Fluoreszenzaufnahmen erforderlich war.
Nach der Aufnahme wurde Accutase™ (PAA laboratories, Pasching, Österreich) zu den Wells hinzugegeben, um die Ablösung der Zellen für die weitere FACS- Analyse zu erreichen. Die Fluoreszenz wurde in einem Becton Dickinson FACSCalibur gemessen. Insgesamt wurden 20.000 Ereignisse pro Probe analysiert. Die Untersuchungen erfolgten in Dreifachansätzen.
1.5 Computertomographie und Durchflusscytometrie 1.5.1 Konjugate 1 bis 8
Für die CT und FACS wurden humane U373-Gliomzellen unter den gleichen Bedingungen in 75 cm2 Kulturflaschen wachsen gelassen (Corning Costar, Bodenheim, Deutschland) (70 % Konfluenz). Accutase™ (PAA laboratories, Pa- sching, Österreich) wurde hinzugegeben, um die Ablösung der Zellen zu erreichen, die geerntet und anschließend in Eppendorf-Röhrchen aliquotiert wurden (6 x 10δ Zellen pro Röhrchen). Wie bei den Untersuchungen, die mittels Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt wurden, dienten die Zellen im ersten Röhrchen als Kontrolle (nur PBS). Die Zellen in den anderen Röhrchen wurden mit 260 μM Ultravist, 260 μM TIBA in PBS und 26 μM, 260 μM und 2,6 mM der Konjugate 1-4 in PBS inkubiert. Nach einer 20-minütigen Inkubationsdauer bei 37 0C in einer Atmosphäre von 5 % CO2 wurden die Zellen dreimal in PBS gewaschen und bei 800 rpm für 5 Minuten zentrifugiert.
Aus jedem Eppendorf-Röhrchen wurde eine Zellprobe dem MTT-Test zugeführt (beschrieben unter 1.4), um mikroskopisch zu bestimmen, ob die Zellen vital waren. Eine in-vitro-CΪ der Zellpellets wurde mit einem Somatom Sensation 16 (Siemens) durchgeführt, das für klinische Routineuntersuchungen verwendet wird.
Das Innenohr-Spiral-CT-Protokoll lautet wie folgt: Röhrenspannung 120 KV, effektive mAs 550, Aufnahmezeit TI: 1,5, SL 0,75/0,75/4,5, FOV: 50 0/52, ker- nel: U70, Fenster: invertebral disc.
3D-Aufnahmen wurden unter Verwendung der InSpace Software (Syngo CT 2006G) (Siemens AG, Erlangen, Deutschland) erlangt.
Die FACS- Analyse erfolgte wie beschrieben unter 1.4.
1.5.2 Konjugate 9, 10 und 11: Die humanen malignen U373- und LN18-Gliomzellen wurden in 75 cm2 Kulturflaschen (Corning Costar) (70% Konfluenz) unter den 1.4 beschriebenen Bedingungen gezüchtet, mit Accutase™ (PAA Laboratories) vom Flaschenboden abgelöst und anschließend auf Eppendorf-Röhrchen (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) aufgeteilt (6 x 106cells pro Röhrchen). Die Zellen im ersten Röhrchen dienten als Kontrolle (nur PBS-Puffer). Die Zellen in den anderen zehn Röhrchen wurden jeweils mit Benzoesäure (BA), Monojodobenzoesäure (MIBA) oder Dijodobenzoesäure (DIBA) allein (260 μM), Konjugat 3 allein (260 μM), Konjugat 3 plus entweder BA, MIBA or DIBA (260 μM), sowie den Kon- jugaten 9, 10 und 11 allein (260 μM) inkubiert.
Nach 20-minütiger Inkubation bei 37°C/5% CO2 wurden die Zellen dreimal mit PBS-Puffer ausgewaschen und mit 800 rpm (rounds per minute) 5 Min. zentrifugiert. Die Fluoreszenz wurde in einem Becton Dickinson FACSCalibur, wie unter 1.4, gemessen. Die Computertomographie wurde wie unter 1.5.1 durchgeführt. Die Untersuchungen wurden zweimal wiederholt.
1.5.3 Konjugat 12:
Für die CT und FACS-Untersuchung wurden humane LN-18 und U373- Gliomzellen in 75 cm2 Kulturflaschen (Corning Costar) (70% Konfluenz) gezüchtet (Bedingungen wie unter 1.4). Hinzugefügt wurde Accutase™ (PAA Laboratories), damit sich die Zellen vom Boden der Kulturflasche ablösen. Die Zellen wurden gesammelt und anschließend auf Eppendorf-Röhrchen aufgeteilt (6 x 106 Zellen pro Röhrchen). Die Zellen in den ersten beiden Röhrchen dienten als Kontrolle (jeweils nur PBS, LN18- und U373-GliomzeIIen nativ). Die Zellen in den anderen Röhrchen (jeweils LNl 8- und U373-Gliomzellen) wurden mit einer 260 μM bzw. 2.6 mM Lösung des Konjugates 12 für 20 Minuten bei 37°C und 5% CO2 inkubiert und anschließend 3 mal mit PBS-Puffer ausgewaschen und mit 800 rpm (rounds per minute) 5 Min. lang zentrifugiert. Bei einem kleinen Teil der Zellen wurde mit dem MMT-Test (siehe 1.4) geprüft, wie viele von den Zellen noch lebten. Die Computertomographie der Zellzentrifugate wurde mit einem Somatom Sensation 16 (Siemens) durchgeführt.
Es wurde eine Orbita-CT-Spirale verwendet: tube voltage 120 KV, effective mAs 550, time of imaging TI: 1.5, SL 0.75/0.75/4.5, FOV: 50 0/52, GT: 0.0, kernel: U70, window: intervertebral disc. 3D-Bilder wurden mit der InSpace Software (Syngo CT 2006G) (Siemens AG, Erlangen, Germany) angefertigt.
Die FACS-Analyse wurde wie unter 1.4 durchgeführt. Der Versuch wurde zweimal wiederholt.
1.5.4 Konjugate 13, 14 und 15
Für die CT- und FACS-Untersuchung wurden humane LN18- und U373- Gliomzellen in 75 cm2 Kulturflaschen (70% Konfluenz) gezüchtet (Bedingungen wie unter Absch. 1). Accutase™ (PAA Laboratories) wurde hinzugefügt, damit sich die Zellen vom Kulturboden lösen. Die Zellen wurden gesammelt und anschließend auf Eppendorf-Röhrchen aufgeteilt (6 x 106 Zellen pro Röhrchen). Die ersten 4 Röhrchen wurden für 20 Minuten mit jedem der in PBS- Puffer gelösten Konjugate 3, 13, 14 und 15 bei einer Konzentration von 260 μM inkubiert. Die nächsten 3 Röhrchen dienten zur Koinkubation der Zellen mit entweder Trichlorobenzoesäure (TCBA), Trifluorobenzoesäure (TFBA) oder Tribromophenyl Isocyanat (TBPI) und dem NLS-FITC-Konjugat 3 (260 μM). Als Kontrolle dienten Zellen, die lediglich mit entweder CIBA, FIBA, TBPI (jeweils 260 μM in PBS) oder mit PBS-Puffer (Nativkontrolle) allein inkubiert wurden. Nach den Inkubationen wurden die Zellen dreimal mit PBS-Puffer ausgewaschen und mit 800 rpm (rounds per minute) zentrifugiert. Die Computertomographie und FACS-Analyse der Zellzentrifugate wurde wie in 1.5.1 bzw. 1.4 dreimal durchgeführt.
1.5.5 Konjugat 16: Humane U373- und LN18-Gliomzellen wurden in 25 cm2 Kulturflaschen (Corning Costar, Bodenheim Germany) (70% Konfluenz) gezüchtet, welche 3 ml RPMI- 1640 Ready Mix Medium mit L-Glutamin und 10% FBS (fetal bovine serum)-Gold (PAA laboratories, Pasching, Österreich) enthielten [37 0C, 5% CO2 (vol/vol)]. Accutase™ (PAA laboratories, Pasching, Österreich) wurde hinzugefügt um die Zellen vom Flaschenboden abzulösen. Die Zellen wurden gesammelt und anschliessend auf 8 Eppendorf-Röhrchen aufgeteilt (6 x 106 Zellen pro Röhrchen). Zur Umwandlung der inaktiven MMP-2-Proform in die aktive MMP-2 wurde APMA (4-Aminophenyl mercuric acetate) verwendet. Dazu wurde eine 1%-ige APMA-Stammlösung (10OmM in DMSO) zur Lösung mit dem Proenzym und dem Konjugat 16 gegeben (endgültige APMA- Konzentration: ImM, mit 1% DMSO). Die Zellen in den ersten vier Röhrchen dienten als Kontrolle (nur RPMI-Medium sowohl mit als auch ohne APMA).
Die Zellen in den anderen vier Röhrchen wurden mit 65 und 130 μM des Kon- jugates 10 für 1 bzw. 2 Stunden sowohl mit als auch ohne MMP-2 Inhibitor I inkubiert (37°C und 5% CO2). Der MMP-2 Inhibitor I wurde wie zuvor von Yin et al. 2006 beschrieben angewendet. Nach 1- bzw. 2-stündiger Inkubation wurde 3 mal mit PBS-Puffer aus-gewaschen und mit 800 rpm für 5 min zentri- fugiert. Die Zellvitalität wurde dann mit Hilfe des Methyl-Thiazoyl- Tetrazolium (MTT) Salzes (Sigma Aldrich, Germany) (15 mg/ml) überprüft. Die Bildung von Formazan wurde nach 20 Minuten im Durchlichtmikroskop untersucht.
Nachdem blaue Formazankörnchen detektiert werden konnten, wurde Propi- dium Iodid (PI) in das Medium gegeben (1 μM PI; Molecular Probes, Eugene, OR, USA) um Zellen mit geschädigten Membranen zu lokalisieren. Die Forma- zanproduktion wurde über einen Zeitraum von mindestens 2 Stunden untersucht. Für die Fluoreszenz- und Durchlichtmikroskopie wurde ein inverses Mikroskop (Axiovert 135 M, Carl Zeiss, Jena, Germany), ein Long Distance (LD) Objectiv (Carl Zeiss, Jena, Deutschland), ein Illuminator N HBO 103 (Carl Zeiss, Jena, Deutschland), sowie Standard-Fluoreszenzfilter für die Exzitation und Emission des FITC und PI verwendet.
Die Computertomographie der Zellzentrifugate wurde mit einem Somatom Sensation 16 (Siemens), welches auch für klinische Routineuntersuchungen verwendet wird, durchgeführt.
Es wurde eine Felsenbein-CT-Spirale verwendet: tube voltage 120 KV, effective mAs 550, time of imaging TI: 1.5, SL 0.75/0.75/4.5, FOV: 50 0/52, GT: 0.0, kernel: U70, window: intervertebral disc. Die Signaldichte von jedem Zellpellet wurde gemessen.
3D-Bilder wurden mit der InSpace Software (Syngo CT 2006G) (Siemens AG, Erlangen, Deutschland) angefertigt. Die FACS-Analyse wurde durchgeführt wie nachfolgend beschrieben. Der Versuch wurde zweimal wiederholt.
Die FACS-Analyse wurde auf einem Becton Dickinson FACSCalibur durchgeführt [100 μl der Zellsuspension (IxIO6 Zellen) plus 300μl FACS-Puffer (D-PBS- Puffer mit 1% Paraformaldehyd)]. Ungefähr 25000-35000 Zellen wurden pro Probe gemessen [Fluoreszenzanregung: Argonionenlaser (488nm), Fluorezenz- detektion: 540-565 nm Bandpassfilter]. Die Versuche wurden jeweils dreimal durchgeführt.
1.6 Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) und Annexin- V-Bindungs- assay/Vitalitätsprüfung
1.6.1 Konjugate 1 bis 8
Humane maligne Gliomzellen (U373) wurden in 4-Well-Platten unter den gleichen Bedingungen, wie für die Fluoreszenzmikroskopie unter 1.5 beschrieben, wachsen gelassen. Die Zellen wurden für 20 Minuten mit jedem der Konjugate, gelöst in 0,1 % DMSO/PBS bei 260 μm, inkubiert. Die Zellen wurden ferner separat mit TIBA und den beiden Nicht-TIBA-enthaltenden Konjugaten (3 und 4) in 0,1 % DMSO/PBS bei 260 μm, co-inkubiert. Aufgrund der Unlöslichkeit von TIBA (nicht jedoch der Konjugate) in reinem PBS wurden sowohl TIBA als auch die Konjugate in 0,1 % DMSO/PBS bei 260 μm, zur Inkubation gelöst. Als Kontrollen wurden die Zellen mit PBS allein, 0,1 % DMSO/PBS allein und TIBA allein (260 μm in 0,1 % DMSO/PBS) inkubiert.
Die Detektion von Phosphatidylserin in der Außenmembran von apoptoti- schen Zellen erfolgte mit Annexin-V-Alexa™-568-Reagens gemäß dem Protokoll des Herstellers (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, USA). Die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie erfolgte mit einem Umkehr-Laser- Scanning-Mikroskop LSM510 (Carl Zeiss, Jena, Deutschland) (Objektive: LD Achroplan 40x0,6, Plan Neofluar 20x0,50, 40x0,75). Zur Fluoreszenzanregung wurde die 488 nm-Linie eines Argon-Ionen-Lasers und die 534 nm-Linie eines Helium-Neon-Lasers mit geeigneten Strahlenteilern und Barrier-Filtern für FITC bzw. Alexa verwendet. Überlagerte Bilder von FITC- und Alexa-gefärbten Proben wurden durch Überlagerung von sich deckenden Ansichten erzeugt. Sämtliche Messungen erfolgten an lebenden, nicht-fixierten Zellen.
1.6.2 Konjugate 9, 10 und 11
Humane maligne LN18- und U373-Gliomzellen wurden in Vier-Lochplatten (NUNC, Wiesbaden, Germany) (ungefähr 300 000 cells pro Loch) wie unter 1.5 gezüchtet. Die Zellen wurden bei 37°C / 5% CO2 für 20 Minuten mit jedem der Konjugate 3, 9, 10 und 11 bei einer Konzentration von 260 μM (gelöst in PBS) (GIBCO; Invitrogen, Deutschland) inkubiert. Die Zellen wurden ebenso koinkubiert mit entweder CIBA, FIBA oder TBPI sowie dem NLS-FITC-Konjugat 3 (jeweils 260 μM). Als Kontrolle dienten Zellen, die lediglich mit entweder CIBA, FIBA oder TBPI (260 μM in PBS) allein inkubiert wurden. Nach den Inkubationen wurden die Zellen dreimal mit PBS ausgewaschen und anschlie- ßend wieder in Ready Mix Medium inkubiert. Die FITC-markierten Konjugate sowie das Alexa-Annexin zur Detektion von Phosphatidylserin als Zeichen des Zelltodes wurden mit der Konfokalen Laser Mikroskopie (CLSM) wie unter 1.6.1 lokalisiert. Alle Messungen wurden an lebenden Zellen durchgeführt.
1.6.3 Konjugat 12:
Humane malignane LN18- und U373- Gliomzellen wurden in Vier- Lochplatten (NUNC, Wiesbaden, Deutschland) (ungefähr 300 000 Zellen pro Loch) angezüchtet wie in 1.5. Die Zellen wurden bei 37°C/5% CO2 für 20 Minuten mit dem Konjugat 12 bei Konzentrationen von 260 μM und 2.6 mM (gelöst in PBS-Puffer) (GIBCO, Invitrogen, Deutschland) inkubiert. Als Kontrolle wurden Zellen nur mit PBS-Puffer inkubiert. Nach den Inkubationen wurden die Zellen dreimal mit PBS ausgewaschen und anschließend wieder in Ready Mix Medium inkubiert. Die Detektion von Phosphatidylserin und CLSM erfolgte wie in 1.6.1. Alle Messungen wurden an lebenden Zellen dreimal durchgeführt.
1.6.4 Konjugate 13 bis 15
Humane maligne LN18- und U373-Gliomzellen wurden in Vier-Lochplatten (NUNC, Wiesbaden, Germany) (ungefähr 300 000 cells pro Loch) wie unter Absch. 1 gezüchtet. Die Zellen wurden bei 370C / 5% CO2 für 20 Minuten mit jedem der Konjugate 3, 13, 14 und 15 bei einer Konzentration von 260 μM (gelöst in PBS) (GIBCO; Invitrogen, Deutschland) inkubiert. Die Zellen wurden ebenso koinkubiert mit entweder CIBA, FIBA oder TBPI sowie dem NLS-FITC- Konjugat 3 (jeweils 260 μM). Als Kontrolle dienten Zellen, die lediglich mit entweder CIBA, FIBA or TBPI (260 μM in PBS) allein inkubiert wurden. Nach den Inkubationen wurden die Zellen dreimal mit PBS ausgewaschen und an- schliessend wieder in Ready Mix Medium inkubiert. Die FITC-markierten Konjugate sowie das Alexa-Annexin zur Detektion von Phosphatidylserin als Zei- chen des Zelltodes wurden mit der Konfokalen Laser Mikroskopie (CLSM) wie unter 1.6.1 lokalisiert. Alle Messungen wurden an lebenden Zellen durchgeführt.
1.6.5 Konjugat 16
Humane maligne Gliomzellen (U373 und LN18) wurden in 25 cm2 Kulturflaschen ausgesät, welche 3 ml RPMI- 1640 Ready Mix Medium mit L-Glutamin und 10% FBS (fetal bovine serum)-Gold (PAA laboratories, Pasching, Austria) enthielten [37 0C, 5% CO2 (vol/vol)]. Das Medium wurde ein Tag lang so belassen, damit sich genügend von den Gliomzellen sezernierte MMP-2 anreichern konnte. Zur Aktivierung der im Medium in der inaktiven Proform vorliegenden MMP-2 wurde das Medium am Tag der Untersuchung mit APMA inkubiert (endgültige APMA-Konzentration im Medium: ImM, mit 1% DMSO) (Konfluenz der Zellen: 70%).
In einem ersten Versuch wurde das BIS-TIBA-Konjugat 16 jeweils ohne MMP-2 Inhibitor in den APMA-haltigen Medien von 4 Flaschen gelöst (26 und 130 μM) (beide Zelllinien). In einem zweiten Versuch wurde das BIS-TIBA- Konjugat 16 wiederum in den APMA-haltigen Medien von 4 Flaschen (26 und 130 μM) gelöst, jedoch jetzt mit MMP-2 Inhibitor I.
Als Kontrollen wurden beide Gliomzelllinien in einem ein Tag alten Medium sowohl mit als auch ohne APMA und Inhibitor inkubiert.
Zur Überprüfung der Vitalität wurde MTT-SaIz und Propidium Iodid (PI) wie unter 1.4 verwendet. Zudem wurde Phosphatidylserin im äusseren Membranblatt apoptotischer Zellen wurde mit dem Annexin-V-Alexa™ 568 Reagenz entsprechend der Empfehlung des Herstellers durchgeführt (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, USA) detektiert. Für die Konfokale Laser Mikroskopie wurde ein inverses LSM510 Laserscanmikroskop (Carl Zeiss, Jena, Deutschland) (Objektive: LD Achroplan 40x0.6, Plan Neofluar 20x0.50, 40x0.75) verwendet [Fluoreszenzanregung bei 488 nm (Argonionenlaser) und 534 nm (Helium-Neon Laser]. Überlagerte Bilder von FITC- und Alexa-gefärbten Zellen wurden hergestellt. Alle Messungen wurden an lebenden, nicht fixierten Zellen dreimal durchgeführt.
1.7 Semidünnschnitte
Ein Teil der Zellen, der für die FACS-Analyse gefärbt wurde, wurde in Para- formaldehyd mit 2 % Agar fixiert, in Ethanol dehydriert, eingebettet in Lowic- ryl K4M (Polysciences, Eppelheim, Deutschland) und gemäß der Angaben des Herstellers bei Raumtemperatur UV-polymerisiert. Semidünnschnitte (etwa 0,4 μm) wurden geschnitten und mittels Fluoreszenzmikroskopie evaluiert.
2. Ergebnisse
2.1 Synthese der Kon jugate
2.1.1 Konjugate 1 bis 8:
FITC-markierte Konjugate wurden synthetisiert: Die korrekte NLS des SV-40-T- Antigens mit TIBA (Konjugat 1 Kl), eine mutierte NLS des SV-40-T-Antigens mit TIBA (Konjugat 2, K2) und beide Konjugate ohne TIBA (Konjugate 3 und 4, K3 und K4). Die gleichen Konjugate nochmals ohne FITC sind als Konjugate 5 bis 8, K5 bis K8 bezeichnet; Tabelle 1, auf der linken Seite ist für sämtliche Konjugate wie üblich der C-Terminus und auf der rechten Seite der N- Terminus dargestellt, Fig. 1.
Das Konjugat Kl weist ein Molekulargewicht von 2123,4 Da auf, das Konjugat K2 von 2096,3 Da auf, das Konjugat K3 von 1641,8 Da auf, das Konjugat K4 von 1614,6 Da auf, das Konjugat K5 von 1735,4 Da auf, das Konjugat K6 von 1708,3 Da auf, das Konjugat K7 von 1493,1 Da auf, das Konjugat K8 von 1466,0 Da auf.
2.1.2 Konjugate 9 bis 11:
Es wurden drei FITC-markierte Konjugate synthetisiert: Die NLS des SV40 T- Antigens mit der nichtiodierten Benzoesäure (BA) (Konjugat 9), der 4-Mono- iodobezoesäure (MIBA) (Konjugat 10) oder der 2,5 Diiodobenzoesäure (DIBA) (Konjugat 11); Tabelle 1
Das Konjugat 9 weist ein Molekulargewicht von 1745.95 Da auf, das Konjugat 10 von 1871.83 Da und das Konjugat 11 von 1997.72 Da.
2.1.3 Konjugat 12:
Es wurde ein FITC-markiertes Konjugat synthetisiert, bei dem Triiodobenzoe- säure (TIBA) an das Prolin gekoppelt wurde; Tabelle 1.
Das Konjugat 12 weist ein Molekulargewicht von 2123,4 Da auf.
2.1.4 Konjugate 13 bis 15:
Es wurden drei weitere FITC-markierte Konjugate synthetisiert: Die NLS des SV40 T- Antigens mit der Trifluorobenzoesäure (TFBA) (Konjugat 13), der Trichlorobenzoesäure (TCBA) (Konjugat 14) und Tribromobenzoesäure (TBPI) (Konjugat 15); Tabelle 1.
Das Konjugat 13 weist ein Molekulargewicht weist ein Molekulargewicht von 1799,90 Da, das Konjugat 14 von 1847,81 Da und das_Konjugat 15 von 1997.75 Da auf. 2.1.5 Konjugat 16:
Es wurde ein mit FITC-Farbstoff markiertes SV40 T-Antigen-NLS-Konjugat konstruiert, welches zwei TIBA enthält. Diese beiden TIBA sind über eine spaltbare Peptidbrücke verbunden; Tabelle 1.
Das Konjugat 16 weist ein Molekulargewicht von 3255,76 Da auf.
2.2 Aufnahme der Konjugate in die Zelle bzw. den Zellkern/Induktion der Apopto- se
2.2.1 Konjugate 1 bis 8:
Eine signifikante Autofluoreszenz von humanen malignen U373-Gliomzellen wurde vor der Evaluierung der Konjugate mittels Fluoreszenzmikroskopie ausgeschlossen (Fig. 2A).
Nach der Inkubation mit den TIBA-Konjugaten 1 oder 2 bei einer Konzentration von 26 μM zeigte lediglich ein kleiner prozentualer Anteil der Zellen (bis zu 22 %) eine zytoplasmatische und nukleare Färbung, wie mittels Fluoreszenzmikroskopie, konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie und fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) demonstriert (Figuren 2 und 3). Diese Zellen zeigten keine Anzeichen von Zelltod, was durch die Produktion von Formazan in dem MTT-Test und der nicht-erfolgten Aufnahme von Propidiumiodid (PI) demonstriert wird (Fig. 2 und 4A). Die Side-Scatter versus Vorwärts-Scatter-FACS- Analyse zeigte keine Veränderungen in der zellulären Morphologie im Vergleich zu den Kontrollen (Zellen, die nur mit PBS inkubiert wurden) (Fig. 3).
Eine deutliche Zunahme des prozentualen Anteiles der stark gefärbten Zellen auf bis zu 93 % wurde nach der Inkubation mit den TIBA-Konjugaten bei Konzentrationen von 260 μM und 2,6 mM beobachtet (Figuren 2, 3, 4). Dies ging einher mit einer Zelltodrate von 90 % (Bindung des Annexin- V- Alexa™-568- Reagens an Phosphatidylserin in der Außenmembran, PI-Aufnahme und fehlende Formazan-Produktion im MTT-Test (Figuren 2, 4 und 5B). Nach der Inkubation mit den TIBA-Konjugaten bei diesen höheren Konzentrationen konnten zwei morphologisch unterschiedliche Zellpopulationen durch deren Charakteristika in dem Vorwärts- und Seiten-Licht-Scatter unterschieden werden (Fig. 3).
Kein Zelltod, sowie lediglich eine kleine Anzahl von gefärbten Zellen (bis zu 13 %) wurde nach der Inkubation mit den Konjugaten beobachtet, die kein TIBA enthielten (Konjugate 3 und 4, Tabelle 1), und zwar bei denselben Konzentrationen (26 μM, 260 μM und 2,6 mM) (Figuren 2, 3 und 4A).
Die Co-Inkubation von TIBA (260 μM) zusammen mit einem der nicht-TIBA- enthaltenden Konjugaten 3 oder 4 führte zu keinerlei Veränderungen in Bezug auf die Anzahl der gefärbten Zellen oder die Zellvitalität. Die Inkubation mit TIBA allein scheint keinerlei zytotoxische Effekte bei Konzentrationen von 260 μM hervorzurufen (Fig. 4A).
Die intrazelluläre Färbung (insbesondere Nucleoli) wurde durch die Untersuchung von Semidünnschnitten (etwa 0,4 μm) der inkubierten Zellen bestätigt (Fig. 4C).
In der CT führte die Inkubation der Zellen mit PBS allein und mit den TIBA- Konjugaten 1 und 2 bei variierenden Konzentrationen (26 μM, 260 μM und 2,6 mM) zu Unterschieden in den Signaldichten (Fig. 5 A und D), obwohl keine wesentlichen Unterschiede zwischen den Konjugaten 1 und 2 festgestellt werden konnten (Fig. 5A, C und D). Die Inkubation mit 260 μM Ultravist (Iopromid), dem Kontrastmittel, das regelmäßig in klinischen Routineuntersuchungen eingesetzt wird, und mit 260 μM TIBA allein führte nicht zu einem Anstieg der Signaldichte in den Zellpellets im Vergleich zur nativen Kontrolle (PBS allein) (Fig. 5A und D).
2.2.2 Konjugate 9 bis 11:
Die humanen malignen LN18- und U373-Gliomzellen zeigten nach Inkubation mit PBS-Puffer allein keine Eigenfluoreszenz in der Konfokalen Laser Mikroskopie.
Die alleinige Inkubation mit Benzoesäure, 4-Monojodobenzoesäure, oder 2,5- Diiodobenzoesäure führte zu keinen zytotoxischen Effekten (bei einer Konzentration von 260 μM).
Nach der Inkubation der Zellen mit dem Konjugat 3, welches keine BA, MIBA or DIBA enthält, waren nur wenige Zellen gefärbt und ohne Zeichen des Zelltodes (U373 Gliomzellen: 8%, LN18 Gliomzellen: 9%) (Fig. 7).
Die Koinkubation entweder von BA, MIBA oder von DIBA (260 μM) mit Konjugat 3, welches alle diese drei Komponenten nicht enthält, führte zu keiner nennenswerten Veränderung der Menge stark gefärbter Zellen und der Zellvitalität (Fig.7).
Auch Konjugat 9 (Konjugat 3 gekoppelt an BA) färbte nur eine geringe Zahl von U373-Gliomzellen (8%) und LN18-Gliomzellen (9%) (vergleichbar mit Konjugat 3) (Fig. 8). Diese wenigen, gefärbten Zellen zeigten keine Zeichen des Zelltodes (fehlende Bindung von Annexin-V-Alexa™ 568 Reagenz an Phospha- tidylserin im äusseren Membranblatt) (Fig. 8).
Zu einer deutlichen Zunahme stark gefärbter Zellen (bis 70%) kam es nach In- ku-bation mit dem MIBA-enthaltenden NLS-Konjugat 10 (Fig. 8). Diese Zu- nähme stark gefärbter Zellen war mit einer hohen Zelltodrate verbunden (An- nexin-V-Alexa™ 568 Färbung) (Abb.8).
Ein weiteres Iodatom innerhalb des Benzolrings (Konjugat 11) führte zu keiner zusätzlichen Erhöhung der Anzahl stark gefärbter Zellen im Vergleich zu Konjugat 10 mit nur einem Iodatom (Fig. 8).
Die Ergebnisse der Konfokalen Laser Mikroskopie spiegelten sich in der FACS (fluorescence activated cell sorting)-Analyse wieder (Fig. 9).
Mit Semidünnschnitten (ca. 0.4 μm) konnte gezeigt werden, dass sich die Kon- jugate in den Nukleolen anhäuften.
2.2.3 Konjugat 12:
Die humanen malignen LNl 8- und U373-Gliomzellen zeigten nach Inkubation mit PBS-Puffer keine Eigenfluoreszenz in der Konfokalen Laser Mikroskopie.
Jedoch war nach Inkubation der Zellen mit dem Konjugat 12 eine grosse Anzahl (bis 70%) stark nuklear gefärbt und färbte sich dann auch mit dem Anne- xin-V-Alexa™ 568 Reagenz (Fig. 10). Dies bedeutet, dass die Zellen den Zelltod einleiteten (Fig. 10). Auf den Semidünnschnitten (ca. 0.4 μm) konzentrierte sich das Konjugat 12 in den Nukleolen.
In der FACS (fluorescence activated cell sorting)-Analyse zeigten sich, vergleichbar mit dem Konjugat 1 zwei morphologisch unterschiedliche, vitale und nicht vitale Zellpopulationen (Fig. 11).
Computertomographisch zeigten die beiden Zelllinien erst nach Inkubation bei 2.6 mM eine deutliche Erhöhung der Signaldichte gegenüber den unbe- handelten Zellen, wobei sich die U373- im Vergleich zu den LN18-Gliomzellen mit leicht höherer Signaldichte darstellten (Fig. 12). Nach Inkubation der Zellen mit 260 μM Hessen sich diese, wie bei der unbehandelten Kontrolle, aufgrund der zu geringen Signaldichte, in den Eppendorf-Röhrchen nicht abgrenzen (Fig. 12).
2.2.4 Konjugate 13 bis 15
Die humanen malignen LN 18- und U373-Gliomzellen zeigten nach Inkubation in reinem PBS-Puffer keine Eigenfluoreszenz in der Konfokalen Laser Mikroskopie (Fig. 13). Die alleinige Inkubation mit Trifluorobenzoesäure, mit Trichlorobenzoe-säure oder dem Tribromophenyl Isocyanat (jeweils 260 μM) führte zu keiner Beeinträchtigung der Zellvitalität (Fig. 15). Nach der Inkubation der Zellen mit dem Trichlorobenzoesäure (TCBA)-, Trifluorobenzoesäure (TFBA)- und Tribromophenyl Isocyanat (TPBI)-freien FITC-markierten NLS Konjugat 3, waren nur wenige Zellen ohne Zeichen des Zelltodes gefärbt (U373-Gliomzellen: 8%, LN18-Gliomzellen: 9%) (Fig. 15). Nach Inkubation mit dem an Benzoesäure gekoppelten NLS-Peptid (Konjugat 9) nahm die Färbungsrate im Vergleich zu Konjugat 3 ohne Benzoesäure nicht zu; die Zellen blieben vital (Fig. 8).
Die Koinkuabtion entweder von freier, ungebundener Trichlorobenzoesäure (TCBA)-, Trifluorobenzoesäure (TFBA)- oder dem Tribromophenyl Isocyanat (TPBI) (260 μM) und Konjugat 3, welches all diese drei Komponenten nicht enthält, führte zu keiner nennenswerten Veränderung der Anzahl der stark gefärbten Zellen sowie der Zellvitalität (Fig.13-15, 16, unten u. 17).
Eine deutliche Zunahme der stark gefärbten Zellen (bis 70%) zeigte sich nach Inkubation mit den TCBA-, TFBA- oder dem TPBI-enthaltenden Konjugaten 13, 14 bzw. 15 (Abb. 13-16). Die stark gefärbten Zellen zeigten jeweils Zeichen des Zelltodes (Bindung von Annexin- V- Alexa™ 568 Reagenz an Phosphatidyl- serin im äußeren Membranblatt) (Fig.13-16). In der Computertomographie führten die TCBA-, TFBA- und TPBI-Konjugate (260 μmol) zu keiner Erhöhung der Signaldichte der Zellzentrifugate. Mit Semidünnschnitten (ca. 0.4 μm) konnte gezeigt werden, dass die Konjugate sich in den Nukleolen anhäuften (Abb.16 unten).
2.2.5 Konjugat 16:
Wirkprinzip:
In Fig. 18 ist das Wirkprinzip des Konjugates 16 anhand einer besonderen Ausgestaltung schematisch erläutert. Am N-terminalen Ende des Konjugates 16 ist das erste Peptid in Form einer Kernlokalisierungssequenz (NLS) angeordnet. Über einen C-terminal gelegenen nicht dargestellten Lysinrest ist die erste Verbindung in Form von Triiodobenzoesäure (TIBA) an die NLS kovalent gebunden. An die Carboxylgruppe des Lysinrestes ist mittels Peptidbindung das zweite Peptid gebunden, das eine Schnittstelle aufweist, die von der tumorspezifischen Protease MMP-2 erkannt und gespalten wird. Das zweite Peptid ist als dünner Balken dargestellt. An den C-Terminus des zweiten Peptides schließt sich die zweite Verbindung an. Diese ist ebenfalls über einen im zweiten Peptid C-terminal gelegenen nicht dargestellten Lysinrest in Form von Triiodobenzoesäure (TIBA) an das zweite Peptid gebunden.
Dieses erfindungsgemäße Konjugat 16 kann in gesunde nicht-transformierte Zellen aufgrund seiner Größe und des Fehlens von MMP-2 nicht eindringen (links). Erst in Gegenwart von transformierten Tumorzellen, die MMP-2 in die Umgebung sekretieren, wird das zweite Peptid gespalten. Die frei werdende Restkonjugat 16, kann aufgrund der vorhandenen NLS und seiner reduzierten Größe in das Cytoplasma und den Zellkern der Tumorzelle aufgenommen werden (rechts). Nach der Induktion der Apoptose in den Tumorzellen durch das Restkonjugat 9 werden dann die Spaltprodukte über Makrophagen „entsorgt" und ggf. aus dem Organismus ausgeschieden.
Tumorzellspezifität:
Die humanen, malignen LN18- und U373-Gliomzellen (adhärent und abgelöst) zeigten nach alleiniger Inkubation mit APMA (4-aminophenyl mercuric acetate)-haltigem RPMI-Medium sowohl mit als auch ohne Inhibitor keine Eigenfluoreszenz in der Konfokalen Laser Mikroskopie (CLSM). Sowohl der Inhibitor als auch APMA im Medium führten zu keiner Beeinträchtigung der Zellvitalität. Bei Anwesenheit des Inhibitors im APMA-haltigen Medium führte die Inkubation von adhärenten und abgelösten LN18- und U373- Gliomzellen mit dem BIS-TIBA Konjugat 16 (130 μM) nur zu wenigen gefärbten Zellkernen in der Konfokalen Laser Mikroskopie (CLSM) (Fig. 19) und FACS (fluorescence activated cell sorting)-Analyse (Fig. 20). Diese Zellen blieben vital.
Bei Fehlen des Inhibitors im APMA-haltigen Medium führte die Inkubation von ad-härenten und abgelösten LN18-Gliomzellen mit dem BIS-TIB A- Konjugat 16 (130 μM) zu einer massiven Zunahme der Zellkernfärbung in der CLSM (Fig. 19) und FACS-Analyse (Fig. 20), wobei diese Zellen nekrotisch waren [Aufnahme von Propidium Iodid (PI) in die Zellkerne] (Fig. 19).
In der Computertomographie zeigten die Zellen nach Inkubation mit inhibi- torhaltigem Medium nur eine geringfügige Zunahme der Signaldichte gegenüber der unbehandelten Kontrolle (13 und 130 μM) (Fig. 21). Zu einer deutlichen Zunahme der Signaldichte kam es aber nach Inkubation der Zellen mit dem BIS-TIBA-Konjugat (Kl 6) (130 μM) in inhibitorfreiem Medium (Fig. 21). Mit der HPLC (High Performance Liquid Chromatography) konnte gezeigt werden, dass das BIS-TIBA-Konjugat (Kl 6) sowohl in Gegenwart der aktiven MMP-2 als auch der durch APMA aktivierten MMP-2-Proform gespalten wird, und dass diese Spaltung durch Anwesenheit des Inhibitors vehindert werden kann (Fig. 22).
3. Zusammenschau
Die Erfinder stellen folglich ein Konjugat bereit, das sowohl ein verbessertes Kontrastmittel als auch ein apoptoseauslösendes Therapeutikum darstellt. Nach einer bevorzugten Weiterbildung ist das Konjugat tumorspezifisch und ermöglich so eine gezielte Diagnose und/oder Therapie einer Tumorerkrankung.

Claims

Patentansprüche
1. Konjugat, aufweisend:
- eine erste Verbindung mit folgender Formel:
in der R1, R2, R3, R4 und Rs jeweils unabhängig voneinander einem Halogen oder einem Wasserstoff entsprechen, und in der R6 entweder einer Carbo- xylgruppe (COOH) oder Isothiocyanat (S=C=N) entspricht, und
- mindestens ein erstes Peptid, wobei das Konjugat derart ausgestaltet ist, dass es Zellmembran- und kern- membranpermeabel ist.
2. Konjugat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Halogen der ersten Verbindung ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus: Iod, Brom, Fluor, Chlor, und Astat.
3. Konjugat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Triiodoben- zoesäure (TIBA), 5-Iodobenzoesäure (5-IBA, 5-MIBA), 4-Iodobenzoesäure (4- IBA, 4-MIBA), 2,3-Diiodobenzoesäure (2,3-DIBA), 3,5-Diiodobenzoesäure (3,5- DIBA), 2,5-Diiodobenzoesäure (2,5-DIBA), Trichlorobenzorsäure (TCBA), Trifluorobenzoesäure (TFBA), Tribromobenzoesäure (TBBA), Tribromphenyl Isothiocyanat (TBPI).
4. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Peptid eine positive Nettoladung aufweist.
5. Konjugat nach einem der Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Peptid 2 bis 20, vorzugsweise 5 bis 10, weiter vorzugsweise 7 Aminosäuren aufweist.
6. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Peptid von einer Kernlokalisierungssequenz (NLS) abgeleitet ist.
7. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Verbindung über dessen Carboxylgruppe an das erste Peptid gebunden ist.
8. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Peptid eine freie Aminofunktion einer Seitenkette aufweist, über die es an die erste Verbindung gebunden ist.
9. Konjugat nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Peptid über eine ε-Aminofunktion eines C-terminal gelegenen Lysinrestes aufweist, über die es an die Verbindung gebunden ist.
10. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Peptid die Aminosäuresequenz PKKKRKV (SEQ ID Nr. 1) aufweist.
11. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Peptid die Aminosäuresequenz PKKTRKV (SEQ ID Nr. 2) aufweist.
12. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass es ferner einen detektierbaren Marker aufweist.
13. Konjugat nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der detek- tierbare Marker einen Fluoreszenzfarbstoff, vorzugsweise Fluoresceinisothiocy- anat (FITC) aufweist.
14. Konjugat nach Ansprüche 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass der detektierbare Marker eine freie Aminofunktion einer Aminosäure aufweist, ü- ber die er an das erste Peptid gebunden ist.
15. Konjugat nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der detektierbare Marker eine ε-Aminofunktion eines Lysinrestes aufweist, über die er an das erste Peptid gebunden ist.
16. Konjugat nach einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen dem detektierbaren Marker und der ersten Verbindung ein A- minosäurespacer angeordnet ist.
17. Konjugat nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Amino- säurespacer 2 Aminosäuren aufweist.
18. Konjugat nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Aminosäurespacer die Aminosäuresequenz GG (SEQ ID Nr. 3) aufweist.
19. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass es ferner zumindest eine Komponente aufweist, die eine Tumorzellspezi- fität oder eine Spezifität für virusinfizierte Zellen verleiht.
20. Konjugat nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Komponente ein drittes Peptid aufweist, das (i) eine die positive Nettoladung des ersten Peptides zumindest neutralisierende Ladung aufweist, und (ii) über ein zweites Peptid an das Konjugat gebunden ist, das eine Aminosäureerkennungssequenz für ein tumorzell- oder virusspezifisches Enzym aufweist.
21. Konjugat nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Komponente Folgendes aufweist, nämlich
- eine zweite Verbindung mit folgender Formel:
in der R1, R2, R3, R4 und Rs jeweils unabhängig voneinander einem Halogen oder einem Wasserstoff entsprechen, und in der R6 entweder einer Carbo- xylgruppe (COOH) oder Isothiocyanat (S=C=N) entspricht, und
- ein zweites an die zweite Verbindung gebundenes Peptid, das eine Aminosäureerkennungssequenz für ein tumorzell- oder virusspezifisches Enzym aufweist,
wobei die Komponente über das zweite Peptid an das Konjugat gebunden ist.
22. Konjugat nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Halogen der zweiten Verbindung ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus: Iod, Brom, Fluor, Chlor, und Astat.
23. Konjugate nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Triiodoben- zoesäure (TIBA), 5-Iodobenzoesäure (5-IBA, 5-MIBA), 4-Iodobenzoesäure (4- IBA, 4-MIBA), 2,3-Diiodobenzoesäure (2,3-DIBA), 3,5-Diiodobenzoesäure (3,5- DIBA), 2,5-Diiodobenzoesäure (2,5-DIBA), Trichlorobenzorsäure (TCBA), Trifluorobenzoesäure (TFBA), Tribromobenzoesäure (TBBA), Tribromphenyl Isothiocyanat (TBPI).
24. Konjugat nach einem der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass das tumorzell- oder virusspezifische Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Matrixmetalloproteinasen (MMP), Cathepsine, prostataspezifisches Antigen (PSA), Herpes-Simplex-Virus-Protease, Humanes-Immun- defizienz-Virus-Protease, Cytomegalovirus-Protease, Caspase, Interleukin-lß- konvertierendes Enzym, Thrombin.
25. Konjugat nach einem der Ansprüche 21 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass das zweite Peptid die Aminosäuresequenz PLGLR (SEQ ID Nr. 4) aufweist.
26. Konjugat nach einem der Ansprüche 21 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass das zweite Peptid die Aminosäuresequenz PLGVA (SEQ ID Nr. 5) aufweist.
27. Konjugat nach einem der Ansprüche 21 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass das zweite Peptid die Aminosäuresequenz PLGLA (SEQ ID Nr. 13) aufweist
28. Konjugat nach einem der Ansprüche 21 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass das zweite Peptid über die ε-Aminofunktion eines C- terminal gelegenen Lysinrestes an die zweite Verbindung gebunden ist.
29. Konjugat nach einem der Ansprüche 21 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass das es ein drittes Peptid aufweist.
30. Konjugat nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass das dritte Peptid eine positive Nettoladung aufweist.
31. Konjugat nach Anspruch 29 oder 30, dadurch gekennzeichnet, dass das dritte Peptid 2 bis 20, vorzugsweise 5 bis 10, weiter vorzugsweise 7 Aminosäuren aufweist.
32. Konjugat nach einem der Ansprüche 29 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass das dritte Peptid von einer Kernlokalisierungssequenz (NLS) abgeleitet ist.
33. Konjugat nach einem der Ansprüche 29 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass das dritte Peptid eine freie Aminofunktion einer Seitenkette aufweist, über die es an die zweite Verbindung gebunden ist.
34. Konjugat nach einem der Ansprüche 29 bis 33, dadurch gekennzeichnet, dass das dritte Peptid über eine ε- Aminofunktion eines N- terminal gelegenen Lysinrestes aufweist, über die es an die Verbindung gebunden ist.
35. Konjugat nach einem der Ansprüche 29 bis 34, dadurch gekennzeichnet, dass das dritte Peptid die Aminosäuresequenz PKKKRKV (SEQ ID Nr. 1) aufweist.
36. Konjugat nach einem der Ansprüche 29 bis 34, dadurch gekennzeichnet, dass das dritte Peptid die Aminosäuresequenz PKKTRKV (SEQ ID Nr. 2) aufweist.
37. Konjugat nach einem der Ansprüche 19 bis 36, dadurch gekennzeichnet, dass die Komponente ein Nukleinsäuremolekül aufweist, das unter stringen- ten Bedingungen mit an tumorzellspezifische Moleküle hybridisiert.
38. Konjugat nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass die tumor- zellspezifischen Moleküle Onkogene aufweisen.
39. Verwendung des Konjugates nach einem der Ansprüche 1 bis 38 zur Herstellung einer diagnostischen Zusammensetzung.
40. Verwendung nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, dass die diagnostische Zusammensetzung ein Kontrastmittel für die Computertomographie (CT) und/oder Radioiodtherapie aufweist.
41. Verwendung des Konjugates nach einem der Ansprüche 1 bis 38 zur Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung.
42. Verwendung nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, dass die therapeutische Zusammensetzung eine apoptoseauslösende Zusammensetzung ist.
43. Pharmazeutische und/oder diagnostische Zusammensetzung, die das Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 38 und ggf. einen pharmazeutisch und/oder diagnostisch akzeptablen Träger aufweist.
44. Verfahren zur diagnostischen und/oder analytischen Behandlung von biologischem Material oder einem Lebewesen, das folgende Schritte aufweist:
(a) Inkubation oder Verabreichung des Konjugates nach einem der Ansprüche 1 bis 38 mit biologischem Material oder in ein Lebewesen,
(b) Durchführung eines bildgebenden Verfahrens.
45. Verfahren nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, dass das bildgebende Verfahren Computertomographie (CT) ist.
46. Verfahren zur therapeutischen Behandlung eines Lebewesens, das den folgenden Schritt aufweist: Verabreichung des Konjugates nach einem der Ansprüche 1 bis 38 in ein Lebewesen.
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