WO2013111759A1 - ステルス性かつ高尿排泄性のコラーゲン様ペプチド - Google Patents

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WO2013111759A1
WO2013111759A1 PCT/JP2013/051244 JP2013051244W WO2013111759A1 WO 2013111759 A1 WO2013111759 A1 WO 2013111759A1 JP 2013051244 W JP2013051244 W JP 2013051244W WO 2013111759 A1 WO2013111759 A1 WO 2013111759A1
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WO
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peptide
collagen
proxyl
group
gly
Prior art date
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PCT/JP2013/051244
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English (en)
French (fr)
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隆規 小出
ちさと 山崎
裕之 安井
敏文 高尾
ちひろ 粟田
Original Assignee
学校法人早稲田大学
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Filing date
Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid

Definitions

  • the present invention relates to a stealth and high urinary excretion collagen-like peptide and a pharmaceutical composition containing the peptide as an active ingredient.
  • Non-patent Documents 1-4 various drug carriers such as liposomes, dendrimers, peptide supramolecules, inorganic nanoparticles have been developed (Non-patent Documents 1-4).
  • these relatively large drug carriers are trapped by reticuloendothelial cells and are subject to degradation.
  • the surface of the drug carrier is modified, it can be made difficult to be captured by reticuloendothelial cells.
  • the stealth property of a drug carrier refers to the property that it is difficult to be captured by reticuloendothelial cells.
  • stealth liposomes can be prepared by modifying the surface of liposomes of a certain size with polyethylene glycol.
  • stealth liposomes are too large to be filtered from the glomeruli of the kidney, and therefore have low urinary excretion (Non-patent Documents 5-7).
  • side effects may be caused by staying in the body for a long time after administration.
  • a drug carrier that is stealth and highly excretable in urine has not been known so far.
  • the present invention provides a stealth and high urinary excretion collagen-like peptide.
  • the collagen-like peptide of the present invention may be used as a carrier.
  • the present invention provides a composition comprising a compound having a drug or bioactive group attached to a collagen-like peptide of the present invention.
  • the composition may be a pharmaceutical product.
  • the biologically active group R may be bonded to the peptidyl group of the peptide represented by the following formula 1 through an amide bond or a linker Z.
  • the biologically active group R may be an oxidative stress sensitive group capable of being sensitive to oxidative stress.
  • the collagen-like peptide of the present invention may be a peptide represented by the following formula 2.
  • R represents a fluorescein or PROXYL group.
  • l and n are integers of 0 or more, m is 0 to 3, and 7 ⁇ (l + m + n) ⁇ 11.
  • the collagen-like peptide of the present invention may be a peptide represented by the following formula 3.
  • R represents a fluorescein or PROXYL group.
  • Z represents ⁇ -alanine, glycine, or cysteine.
  • l and n are integers of 0 or more, m is 0 to 3, and 7 ⁇ (l + m + n) ⁇ 11.
  • the amino acid sequence of the peptide of Formula 1 may be any one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 6 and 11 to 14.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition containing at least one collagen-like peptide of the present invention as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be used for detecting or diagnosing in vivo oxidative stress.
  • the pharmaceutical composition of the present invention has a disorder and / or disease selected from the group consisting of radiation damage, fulminant hepatitis, anaphylactic shock, atherosclerosis, angina pectoris, myocardial infarction, Alzheimer's disease, and Parkinson's disease. May be used for detection and / or diagnosis.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be a magnetic resonance contrast agent.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be used for angiography.
  • the present invention provides a delivery method comprising the step of administering to a subject a composition comprising a compound in which a drug or bioactive group is bound to the collagen-like peptide of the present invention.
  • the delivery methods of the invention may be used to treat, prevent and / or diagnose a subject.
  • the delivery method of the present invention may be used to assess a subject's condition.
  • the delivery method of the present invention may be used to detect diseases and / or disorders. Such subjects include, but are not limited to, humans, monkeys, cats, pigs, horses, cows, mice, rats, dogs, rabbits and chickens.
  • the delivery method of the present invention may be applied to a subject exposed to oxidative stress.
  • the oxidative stress may be a disorder and / or disease including but not limited to radiation damage, fulminant hepatitis, anaphylactic shock, atherosclerosis, angina pectoris, myocardial infarction, Alzheimer's disease, Parkinson's disease.
  • the delivery method of the present invention may be used to detect and / or diagnose the disorder and / or disease.
  • the administration route to the subject in the delivery method of the present invention includes, but is not limited to, intravenous, nasal, and the like.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention is preferably an injection, but is not limited thereto.
  • the delivery method of the present invention is used in combination with a delivery system well known to those skilled in the art that can quantitatively, spatially and temporally control the biodistribution of a compound having a drug or bioactive group attached to the collagen-like peptide of the present invention. May be.
  • the present invention comprises the steps of administering to a subject a composition comprising a compound having a drug or biologically active group bound to the collagen-like peptide of the present invention, and after administration, said compound or a part thereof (collagen-like peptide And / or a method for detection, evaluation and / or diagnosis, comprising the step of recovering the bioactive group) and measuring the recovered compound or a part thereof (collagen-like peptide and / or bioactive group).
  • magnetic resonance intensity, fluorescence intensity, molecular weight, recovery rate (%), etc. may be measured.
  • measured values may be compared before and after administration.
  • the measured value after administration may be compared with a reference value.
  • the reference value can be calculated by statistical processing well known to those skilled in the art.
  • the reference value may be determined as an average value measured from a population of healthy subjects.
  • the present invention comprises the steps of administering to a subject a composition comprising a compound having a drug or biologically active group bound to the collagen-like peptide of the present invention, and detecting the distribution or change of said compound after administration.
  • Methods for imaging, evaluation and / or diagnosis are provided.
  • fluorescence, luminescence, radiation, magnetic resonance, near infrared, or the like may be used as a detection means.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further contain one or more pharmaceutically acceptable additives provided that it does not impair the stealth and high urinary excretion properties of the present invention.
  • additives include diluents, binders, lubricants, glidants, disintegrants, carrier solvents, buffering agents, preservatives, stabilizers, adsorbents, and those skilled in the art.
  • Other pharmaceutical excipients that have been included, but are not limited to these.
  • the present invention relates to a first tripeptide sequence (X1-Y1-Gly), ..., an i-th tripeptide sequence (Xi-Yi-Gly), ..., an n-th tripeptide.
  • a stealth and high urinary excretion drug carrier comprising an amino acid sequence comprising the sequence (Xn-Yn-Gly) and comprising a peptide that forms a triple helix at the body temperature of the animal species to be administered is provided.
  • i and n are integers, 1 ⁇ i ⁇ n, 7 ⁇ n ⁇ 11, and the amino acids X1,..., Xi,... Xn are independently selected and Y1, .., Yi,... Yn are also independently selected.
  • the amino acid sequence may be an amino acid sequence in which a basic unit composed of XY-Gly is repeated 7 to 11 times. (Where X and Y are any amino acids independently selected.)
  • the amino acid sequence of the basic unit may be Pro-Hyp-Gly.
  • the basic unit may be repeated continuously.
  • the peptide of the present invention may be modified other than hydroxylation of a proline residue.
  • the peptide may be any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 6 and 11 to 14.
  • the drug carrier of the present invention may be used for delivery of a bioactive compound to a target site by binding a drug or a bioactive group.
  • the drug carrier to which the drug or biologically active group is bound may be a medicine for treatment and / or diagnosis.
  • the peptide may be a homo or hetero trimer.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a compound in which a drug or a biologically active group is bound to the drug carrier.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be used for imaging.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be used for biological function measurement.
  • the biological function measurement may be measurement of oxidative stress. Therefore, the present invention provides a pharmaceutical composition for oxidative stress testing.
  • the pharmaceutical composition for oxidative stress testing of the present invention comprises a compound in which a bioactive group sensitive to oxidative stress is bound to the drug carrier of the present invention.
  • the bioactive group sensitive to oxidative stress includes, but is not limited to, a spin probe labeling agent and a fluorescent labeling agent.
  • the fluorescent labeling agent that reacts sensitively to oxidative stress includes, but is not limited to, an acridine derivative and a fluorescein derivative fluorescent substance.
  • the present invention provides a method for delivering a drug, comprising administering a compound in which a drug or a bioactive group is bound to a stealth and high urinary excretion drug carrier.
  • the drug carrier comprises a first tripeptide sequence (X1-Y1-Gly), ..., an i-th tripeptide sequence (Xi-Yi-Gly), ..., an n-th tripeptide sequence. It comprises an amino acid sequence comprising a peptide sequence (Xn-Yn-Gly) and consists of a peptide that forms a triple helix at the body temperature of the animal species to be administered.
  • i and n are integers, 1 ⁇ i ⁇ n, 7 ⁇ n ⁇ 11, and the amino acids X1,..., Xi,... Xn are independently selected and Y1, .., Yi,... Yn are also independently selected.
  • the amino acid sequence of the peptide may be an amino acid sequence in which a basic unit composed of XY-Gly is repeated 7 to 11 times. (Where X and Y are any amino acids independently selected.)
  • the amino acid sequence of the basic unit may be Pro-Hyp-Gly.
  • the basic unit may be repeated continuously.
  • the peptide may be modified other than hydroxylation of a proline residue.
  • the peptide may be any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 6 and 11 to 14.
  • the drug carrier may be used for drug delivery.
  • the drug or bioactive group to be bound to the drug carrier may be a medicine for treatment and / or diagnosis.
  • the drug carrier may be a homo or hetero trimer.
  • the present invention provides a method for treatment or diagnosis comprising the step of administering a pharmaceutical composition comprising a compound having a drug or a bioactive group bound to the drug carrier of the present invention.
  • the pharmaceutical composition may be used for imaging.
  • the pharmaceutical composition may be used for measuring biological functions.
  • an amino acid is L-form.
  • the amino acids herein include 20 kinds of L-amino acids known to be used for translation of proteins generally used in molecular biology, as well as modified amino acid residues well known in the art, such as 4-amino acids.
  • L-amino acids known to be used for translation of proteins generally used in molecular biology, as well as modified amino acid residues well known in the art, such as 4-amino acids.
  • 4-amino acids includes hydroxy-L-proline, 4-fluoro-L-proline and N-isobutylglycine.
  • hydroxyproline is 4-hydroxy-L-proline and is represented as “Hyp”.
  • the drug carrier refers to a substance that is combined with a drug or a bioactive group to change the in vivo kinetics of the compound having the drug or the bioactive group.
  • a drug carrier with high urinary excretion refers to a substance in which most of the dose is rapidly excreted in the urine, regardless of whether the drug carrier is used alone or has a drug or biologically active group bound thereto.
  • 90% or more, preferably 95% or more of the dose is excreted in urine within 24 hours after administration.
  • a stealth drug carrier means that a certain drug carrier is not decomposed and modified in blood and is not captured by reticuloendothelial cells, whether alone or in a state where a drug or bioactive group is bound. , which is mainly present in the blood.
  • the stealth drug carrier is a collagen-like peptide containing 7 to 11 basic units.
  • the biologically active group refers to a substituent that exerts any biological activity by bonding or interaction with a substance in a living body among substituents of a compound.
  • a bioactive group refers to a substituent that exhibits physiological activity or changes a biological state.
  • the biologically active group is a substituent of a biologically active drug, a radical of a biologically active compound, the compound itself is not a drug, but exhibits a biological activity when bound to a carrier, and Substituents that change due to interaction with in vivo substances are included, but are not limited thereto.
  • the carrier having a biologically active group may be used in treatment of a disease, prevention, examination, diagnosis, and measurement of changes in a biological state by being administered in vivo.
  • the bioactive group is preferably a substituent having sensitivity to oxidative stress, and most preferably a PROXYL group and a fluorescein group.
  • oxidative stress refers to a state unfavorable for a living body in which the oxidation state is enhanced more than the ability of the antioxidant system provided in the living body in order to maintain the balance of the redox state in the living body.
  • Diseases and disorders involving “oxidative stress” include radiation damage, fulminant hepatitis, anaphylactic shock, atherosclerosis, angina pectoris, myocardial infarction, Alzheimer's disease, and / or Parkinson's disease. It is not limited.
  • the drug carrier of the present invention comprises a so-called collagen-like peptide.
  • a collagen-like peptide refers to a first tripeptide sequence (X1-Y1-Gly),..., An i-th tripeptide sequence (Xi-Yi-Gly),.
  • i and n are integers, 1 ⁇ i ⁇ n, 7 ⁇ n ⁇ 11, and X1,..., Xi, ... Xn and Y1, ..., Yi,.
  • Yn is any amino acid independently selected and may be a natural amino acid residue, a modified amino acid residue well known in the art, for example Hyp, 4-fluoro-L-proline or N- Isobutyl glycine may be used.
  • the amino acid sequence of the collagen-like peptide of the present specification may be an amino acid sequence in which a basic unit composed of XY-Gly is repeated 7 times or 8 times or more.
  • X and Y are independently selected amino acids, which may be natural amino acid residues, modified amino acid residues well known in the art such as Hyp, 4-fluoro-L-proline) Or N-isobutylglycine may be used.
  • the collagen-like peptide of the present specification when the basic unit is continuously repeated, one basic unit is always in contact with the adjacent basic unit and no other amino acid residue is interposed.
  • An amino acid sequence in which a basic unit composed of XY-Gly is repeated n times in succession is represented as (XY-Gly) n.
  • the collagen-like peptide of the present specification can be any one or more arbitrary units between one basic unit and an adjacent basic unit, provided that it forms a triple helix in vivo. The amino acid residues may be intervened.
  • amino acid sequence of the collagen-like peptide of the present specification includes any amino acid residue in addition to the basic unit, 80% or more of the amino acid residues in the amino acid sequence of the peptide are occupied by the basic unit. 90% or more of amino acid residues may be occupied by basic units.
  • the amino acid sequence of the basic unit may be X for Pro and Y for Hyp.
  • collagen-like peptides can be synthesized as long as the number of repeating basic units is less than 21.
  • the melting temperature is lower than the body temperature of the animal to be administered.
  • the effect of the present invention could be achieved. Therefore, in the collagen-like peptide of the present specification, the lower limit of the number of repetitions of the basic unit is 7 times. Therefore, the number of repetitions of the basic unit is 7 times or 8 times or more.
  • the upper limit of the number of repetitions of the basic unit is 11 times. Therefore, the number of repetitions of the basic unit is 11 times or less.
  • the homotrimer refers to a trimer composed of three peptides having the same primary structure.
  • the heterotrimer is a trimer composed of two peptides having the same primary structure and one peptide having a primary structure different from the peptide, or three peptides having different primary structures. Whether it is a trimer.
  • the melting temperature refers to a temperature at which half of the triple helical structure of the collagenous peptide of the present specification is transferred to a random coil.
  • the melting temperature is measured by, for example, a known method such as a higher-order structure analysis by circular dichroism spectrum measurement, but can also be measured by other known methods that are not limited thereto.
  • the collagen-like peptide of the drug carrier of the present invention forms a triple helix at the body temperature of the animal species to be administered. Therefore, the collagen-like peptide of the drug carrier of the present invention has a melting temperature higher than the body temperature of the animal species to be administered.
  • animal species to be administered refers to all animal species to which a technique for delivering a drug using the drug carrier of the present invention is applied, and is a treatment target for humans, laboratory animals, and veterinary medicine. Including but not limited to animals. Specifically, animal species to be administered include, but are not limited to, humans, monkeys, cats, pigs, horses, cows, mice, rats, dogs, rabbits and chickens.
  • the average body temperature of these animals is 36 ° C for humans, 38 ° C for monkeys, 38.5 ° C for cats, 38.5 ° C for dogs, 37.5 ° C for rats, and 37.5 ° for mice. C, 39 ° C for pigs, 37.5 ° C for horses, 38.5 ° C for cows, 39 ° C for rabbits and 42 ° C for chickens.
  • the melting temperature of the collagen-like peptide of the drug carrier of the present invention is preferably 36 ° C or higher, more preferably 37 ° C or higher, more preferably 37.5 ° C or higher, more preferably 38 ° C or higher, 38 5 ° C or higher is more preferable, 39 ° C or higher is more preferable, and 42 ° C or higher is more preferable.
  • modification means that any substituent is covalently bonded to a peptide composed of 20 types of L-amino acids used for protein synthesis.
  • subject to modification other than hydroxylation of proline residue means that a hydroxyl group is present on the proline residue on the condition that a triple helix is formed in the animal species to be administered. Except for bonding, any substituent may be bonded to any amino acid residue.
  • Substituents for modifying the collagen-like peptide of the drug carrier of the present invention are acyl group, acetyl group, trifluoroacetyl group, amide group, alkyl group, allyl group, aryl group, guanidyl group, amidine group, guanidyl group, amidine group Carbamoyl group and trinitrophenyl group, but is not limited thereto. Modification of peptides with these substituents is performed by known methods described in literature such as Walker JM, “The protein protocols handbook, 2nd Ed.” HUMANA PRESTO, Totowa, New Jersey, USA (2002). Can be prepared.
  • the collagen-like peptide of the drug carrier of the present invention may be produced by the in vivo metabolic reaction to produce the collagen-like peptide of the present invention or a derivative modified other than hydroxylation of the proline residue.
  • Precursors are included. Examples of the precursor include, but are not limited to, the collagen-like peptide of the present invention or an esterified derivative of the collagen-like peptide that has been modified other than hydroxylation of a proline residue.
  • a compound that exhibits biological activity in vivo is a compound that exhibits biological activity as an agonist by binding to a receptor like a hormonal agent and an agonist binding that binds to a receptor like a receptor antagonist.
  • a compound that exhibits biological activity and a compound that inhibits enzyme activity by binding to an enzyme such as an enzyme inhibitor and exhibits biological activity By binding a compound exhibiting biological activity in the living body to the drug carrier having high stealth and urinary excretion according to the present invention, the excretion into the urine is increased, and the safety of the drug in patients with renal impairment is increased. Sometimes it is possible.
  • the compound capable of detecting or measuring the surrounding environment in the living body includes, but is not limited to, an X-ray contrast agent, an MRI contrast agent, a radiopharmaceutical and a fluorescent probe agent.
  • the drug can be a drug provided with a biological activity capable of detecting or measuring the surrounding environment in the living body.
  • the bond between the drug carrier of the present invention and the drug or biologically active group may be either a covalent bond or a non-covalent bond.
  • Covalent bonds include, but are not limited to, ester bonds, ether bonds, amide bonds, sulfide bonds, disulfide bonds, and the like.
  • the bond between the drug carrier of the present invention and the drug or bioactive group is described in, for example, Walker JM, “The protein protocols handbook, 2nd Ed.” HUMANA PRESS, Toyota, New Jersey, US, (2002). Can be carried out by known procedures.
  • Non-covalent bond includes, but is not limited to, ionic bond, hydrogen bond, hydrophobic bond, van der Waals force bond, metal complex bond, and inclusion.
  • Preferred in vivo biologically active compounds for binding to the drug carrier of the present invention include, for example, 5 ⁇ -reductase inhibitors, 5-lipoxygenase inhibitors, ACE inhibitors, CCK antagonists, COX-I and COXII Inhibitor, HIV protease inhibitor, HMGCoA reductase inhibitor, LH-RH agonist, ⁇ -glucosidase inhibitor, ⁇ - and ⁇ -adrenergic agonist, ⁇ - and ⁇ -adrenergic blocker, aldose reductase inhibitor, aldosterone Antagonist, aromatase inhibitor, angiotensin II receptor antagonist, androgen, ion exchange resin, insulin sensitizer, decongestant, estrogen, lupus erythematosus inhibitor, enkephalinase inhibitor, potassium channel activator / opener, calcium Channel blocker, Cal Umulator, xanthine oxidase inhibitor, chelating agent, glucocortic
  • Specific examples of compounds exhibiting in vivo biological activity preferable for binding to the drug carrier of the present invention include azathioprine, acetohexamide, acetylsalicylic acid, aprepitant, alclofenac, allopurinol, atropine, irbesartan, moxifloxacin hydrochloride, hydrochloric acid Raloxifene, ropivacaine hydrochloride hydrate, estradiol, edaravone, etraviline, emtricitabine, eldecalcitol, benzothiazide, carprofen, carvedilol, candesartan cilexetil, gefitinib, celecoxib, chlordiazepoxide, clonidine, clozapine, codeine, sulfate Delacoxib, diacerein, diclofenac, diltiazem, dutasteride, docetaxel,
  • Some of the compounds showing biological activity in the living body may have a site of action in the cell. Such a compound cannot reach the point of action if it remains bound to the drug carrier of the present invention.
  • a compound is, for example, a compound bound to the drug carrier of the present invention by an ester bond, or by inclusion in an inclusion compound bound to the drug carrier of the present invention, so that the compound can be rapidly released after administration. It can be released from the drug carrier to reach the intracellular action point.
  • a wide variety of compounds exhibiting the biological activity listed herein can benefit from the drug carrier of the present invention by optimizing the binding mode with the drug carrier of the present invention. .
  • the spin probe labeling agent includes N-oxyl-2,2,6,6-tetramethylpiperidine derivatives (Cook R. et al., Biochemistry, 8, 3188 (1963)), N-oxyl-2,2,5,5. -Tetramethylpyrrolidine derivatives (Landgraf, WC, et al., Arch. Biochem. Biophys., 130: 111 (1969)) and N- (2,2,5,5-tetramethyl-3-carbonyl-pyrrolidine-1 -Oxyl) -imidazole (including but not limited to Ohnish S. et al., J. Biochem. 75: 211 (1974)).
  • the compound in which the spin probe labeling agent is bound to the drug carrier of the present invention when the spin probe labeling agent is bound to the amino group of the main chain or side chain of the drug carrier peptide, is represented by Formula 1-1, Formula 1- 2, represented by Formula 2-1 or Formula 2-2.
  • R 1 and R 2 are a peptidyl group of the drug carrier peptide, and the other is a hydrogen atom Or an alkyl group, an allyl group, an aryl group, an aralkyl group, an ester group or an amide group.
  • the compound in which the spin probe labeling agent is bound to the drug carrier of the present invention has the formula 3-1 when the spin probe labeling agent is bound to the carboxyl group of the main chain or side chain of the drug carrier peptide. Or it is represented by Formula 3-2.
  • R 3 is a peptidyl group of the drug carrier peptide.
  • the compound in which the spin probe labeling agent is bound to the drug carrier of the present invention is represented by Formula 4-1 or Formula 4-2 when the spin probe labeling agent is bound to the cysteine group of the drug carrier peptide.
  • R 4 is a peptidyl group of the drug carrier peptide.
  • the compound in which the spin probe labeling agent is bound to the drug carrier of the present invention is represented by the formula 5 when the spin probe labeling agent 3-carboxy PROXL is condensed to the secondary amino group of proline at the amino terminus of the drug carrier peptide. expressed.
  • R 5 represents a peptidyl group from the amino acid second amino acid to the carboxy terminus following the amino terminal proline.
  • the compound of formula 5 may be a compound in which the spin probe labeling agent 3-carboxy PROXYL is condensed and bonded to the secondary amino group of the amino terminal proline residue of the collagen-like peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 or 15.
  • the compound in which the spin probe labeling agent is bound to the drug carrier of the present invention is represented by formula 6 when the spin probe labeling agent 3-carboxy PROXYL is condensed and bonded to the primary amino group at the amino terminus of the drug carrier peptide.
  • R 6 is a peptidyl group from the amino terminus to the carboxy terminus of the drug carrier peptide.
  • the compound of formula 6 may be a compound in which the spin probe labeling agent 3-carboxy PROXYL is condensed and bonded to the amino group of the amino terminal glycine residue of the collagen-like peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 or 14.
  • the compound in which the spin probe labeling agent is bound to the drug carrier of the present invention is represented by Formula 7 when the spin probe labeling agent 3-carbamidomethyl PROXYL is sulfide-bonded to the cysteine residue of the drug carrier peptide.
  • R 7 is a peptidyl group from the amino terminus of the drug carrier peptide to the amino acid residue adjacent to the amino terminus of the cysteine residue, a hydrogen atom (H), or R 19 —C ( ⁇ O ) —, R 19 —C ( ⁇ O) —O—, or R 19 —C ( ⁇ NH) —.
  • R 19 is an alkyl group having 1 to 9 carbon atoms, an alkenyl group having 2 to 9 carbon atoms, an aromatic alkyl group having 6 to 9 carbon atoms, or hydrogen (H).
  • R 8 is a peptidyl group from the amino acid residue adjacent to the carboxyl terminus of the cysteine residue of the drug carrier peptide to the carboxyl terminus, a hydroxyl group, or an amino group.
  • the peptidyl groups are acyl groups, acetyl groups, trifluoroacetyl groups, amide groups, alkyl groups, allyl groups, aryl groups, guanidyl groups, amidine groups, guanidyl groups, It may be modified with substituents including but not limited to amidine groups, carbamoyl groups, and trinitrophenyl groups.
  • the peptidyl groups may be modifications that can be decomposed by metabolic reactions in vivo, for example, esterified derivatives.
  • the compound of formula 7 may be a compound in which the spin probe labeling agent 3-carbamidomethyl PROXYL is sulfide-bonded to the peptidyl group of the collagenous peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable pharmaceutical additive in addition to a drug or a compound having a biologically active group bonded to the drug carrier of the present invention.
  • a pharmaceutically acceptable pharmaceutical additive include, but are not limited to, carrier solvents, buffers, preservatives and stabilizers, and other pharmaceutical additives known to those skilled in the art.
  • the pharmaceutical composition of the present invention When administered to an animal, it is usually administered at a unit dose within the range of 1 to 5000 ⁇ g per kg body weight of the animal. When administered to a human, it is administered at a unit dose within the range of about 0.03 to 1000 ⁇ g per kg body weight of the human individual.
  • Aspartate aminotransferase (AST) in this specification is the same as conventional glutamate oxaloacetate transaminase (GOT).
  • the alanine aminotransferase (ALT) used herein is the same as the conventional glutamate pyruvate transaminase (GPT).
  • AST (GOT) and ALT (GPT) are used as indicators of liver damage.
  • the wave form diagram showing the circular dichroism spectrum of the homotrimer of the peptide 1 thru
  • the graph showing the time-dependent change of the ratio with respect to the addition amount of the residual amount in serum after adding the homotrimer of peptide 1 thru
  • the graph which shows the measurement result of the blood residual rate (%) of the peptide in the rat which administered the peptide 1, 7 or 8.
  • the graph which shows the measurement result of the urinary excretion rate (%) of the unchanged form of PROXYL-PEG, and the urinary excretion rate (%) of an unchanged form + reductant.
  • the graph which shows the urinary excretion rate of the unchanged body in an AAPH administration mouse
  • mouth Structural formula showing a fluorescein labeled peptide.
  • a peptide (Pro-Hyp-Gly) 5 (hereinafter referred to as peptide 9) and a basic unit of (Pro-Pro-Gly) which were obtained by repeating the basic unit of (Pro-Hyp-Gly) 5 times in succession
  • Peptide (Pro-Pro-Gly) 10 (hereinafter referred to as peptide 10) repeated 10 times was purchased from Peptide Institute, Inc. and used for experiments.
  • the amino acid sequences of peptides 1 to 10 are listed in SEQ ID NOs: 1 to 10 in the attached sequence listing, respectively.
  • a brief description of the structure of peptides 1 to 10 is as follows.
  • the amino acid sequence of peptide 1 consists of a sequence in which the basic unit consisting of Pro-Hyp-Gly is repeated 10 times.
  • the amino acid sequence of Peptide 2 consists of a sequence in which the fifth basic unit from the amino terminus is replaced with Pro-Arg-Gly while Peptide 1 repeats the basic unit 10 times in succession.
  • the amino acid sequence of Peptide 3 is a sequence in which the fifth basic unit from the amino terminus is replaced with Asp-Hyp-Gly while the basic unit is repeated 10 times in Peptide 1.
  • Peptides 4 to 6 are peptides in which the carboxyl ends of peptides 1 to 3 are amidated, respectively.
  • the amino acid sequence of peptide 7 consists of a sequence in which the fifth basic unit from the amino terminus is replaced with Pro-Arg-Gly while the basic unit is repeated 12 times in succession.
  • the amino acid sequence of peptide 8 consists of a sequence in which the tenth basic unit from the amino terminus is replaced with Pro-Arg-Gly, while the basic unit is repeated 17 times in succession.
  • Peptide 9 has a sequence in which a basic unit consisting of Pro-Hyp-Gly is repeated 5 times in succession.
  • Peptide 10 has a sequence in which a basic unit consisting of Pro-Pro-Gly is repeated 10 times in succession.
  • Solvent PBS Device: JASCO J-820 equipped with PTC-423L temperature controller and cell length used: 0.5mm Measurement wavelength: 190-260nm Data acquisition: 0.5 nm every scan speed: 50 nm / min Response: 1 second Data integration: 3 times Sensitivity: 100 mdeg Measurement temperature: 4 ° C. In the melting temperature measurement, the temperature was increased at 18 ° C. per hour.
  • FIG. 1 is a waveform diagram showing a circular dichroism spectrum of homotrimers of peptides 1 to 6. From the results shown in FIG. 1, the circular dichroism spectra of the homotrimeric preparations of peptides 1 to 6 all showed a spectrum pattern of a typical collagen triple helix structure having a positive peak at 225 nm. Therefore, it was confirmed that the preparations of peptides 1 to 6 formed a triple helix. The preparations of peptides 7 and 8 were considered to be capable of forming a triple helix in consideration of the chain length dependence of peptide triple helix stability.
  • the melting temperature of peptides 1 to 6 was in the range of 56.5 to 66.0 ° C.
  • the melting temperature of the preparations of peptides 7 and 8 was estimated to be more stable than peptides 1 to 6 and higher than 37 ° C., considering the chain length dependence of peptide triple helix stability.
  • the melting temperatures of peptides 7 and 8 were higher than 37 ° C
  • the melting temperature of peptide 7 was 72 ° C
  • the melting temperature of peptide 8 was higher than the measurement limit of 75 ° C.
  • the melting temperatures of peptides 9 and 10 are well below the body temperature of mammals including humans (about 37 ° C.), and are reported to be 5.0 and 25.0 ° C., respectively (Fields, GB and Rockhop) DJ., Biopolymers (Peptide Science): 40, 345 (1996)).
  • Serum Stability of Collagen-Like Peptides Materials and Methods The serum-like stability of the collagen-like peptides produced in Example 1 was measured. PBS solutions (1.2 ⁇ 10 ⁇ 3 mol / L) of peptides 1, 2, 3 to 9, and 10 are prepared, and fresh healthy human serum is added so that the final peptide concentration is (1.2 ⁇ 10 ⁇ 4 mol / L). 0.2 mL of the mixed reaction was incubated at 37 ° C.
  • FIG. 2 is a graph showing the change with time of the ratio of the residual amount in serum to the added amount after adding homotrimers of peptides 1 to 3, 9, and 10 to human serum.
  • peptides 1, 2, and 3 were stably present in serum, while peptides 9 and 10 were rapidly degraded in serum. Therefore, it was shown that a collagen-like peptide capable of forming a triple helical structure at body temperature is stable in blood.
  • Peptides 4 to 8 were also estimated to be stable in blood considering the melting temperature and chain length dependence of peptide triple helix stability.
  • RP-HPLC The conditions of RP-HPLC are as follows. Apparatus: Agilent 1100 HPLC system (Agilent Technology Co., Ltd.) Column: Cosmosil 5C 18 -AR-II (1 ⁇ 150 mm, Nacalai Tesque) Column temperature: 50 ° C Liquid feed rate: 50 ⁇ L / min Solvent: A solution 0.1% TFA / water, B solution 0.1% TFA / acetonitrile gradient elution: 5-25% B / 5-25 minutes Detection wavelength: 220 nm Injection volume: 100 ⁇ L Fraction collection: 50 ⁇ L / fraction
  • CHCA ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid
  • the residual blood rate was measured for peptides 1, 7, and 8. Briefly, blood was collected from the jugular vein of rats 24 hours after peptide administration, and the peptide concentration in the centrifuged plasma was measured using HPLC-UV method. For plasma treatment, 10 ⁇ L of TFA was added to 100 ⁇ L of plasma to remove proteins. Thereafter, centrifugation was performed at 10,000 ⁇ g for 10 minutes at 4 ° C., and 30 ⁇ L of the supernatant was subjected to HPLC.
  • Results Peptides 1 to 10 were administered intravenously in rats, and the results of urinary excretion rate 24 hours after administration are shown in Table 3.
  • FIG. 3 is a graph showing the measurement results of peptide blood residual ratio (%) in rats administered with peptide 1, 7 or 8.
  • the error bar for each experimental condition indicates the standard deviation of the measured value of the experimental result repeated 3 to 4 times under the same condition.
  • the blood remaining rate (%) of peptide 1 was below the detection limit.
  • the blood remaining rate (%) of peptide 7 was 16%.
  • the blood remaining rate (%) of peptide 8 was 15%.
  • the blood remaining rate (%) of peptide 4 was 0% (data not shown).
  • Peptides 7 and 8 were considered to have decreased urinary excretion rate (%) due to their higher molecular weight than peptides 1 to 6.
  • Peptides 1 to 8 administered intravenously to animals were excreted in the urine almost quantitatively as unchanged substances. In contrast, peptides 9 and 10 were not detected unchanged in urine. Peptides are generally known to be easily degraded by proteases in the body. However, peptides 1 to 8 showed high blood directivity and urinary excretion dynamics reflecting stealth without undergoing biodegradation. Such kinetic characteristics are unique from proteins such as antibodies and large drug carriers such as liposomes. In this example, since no adverse event was observed in the animals to which the collagen-like peptide was administered, this collagen-like peptide was shown to be highly safe.
  • Example 4 Use of Collagen-Like Peptides as Oxidative Stress Test Objectives To evaluate the usefulness of living body as an oxidative stress test drug, it was confirmed in Example 4 that blood directivity and urinary excretion rate reflecting stealth are high
  • the collagen-like peptide thus prepared was labeled with a spin labeling agent and then administered to experimental animals. The usefulness was evaluated by measuring the stability of stable radicals in the living body, blood orientation and urinary excretion.
  • each peptide-resin (about 0.1 mmol) was dissolved in distilled water, m-cresol, thioanisole (0.25 mL each), triisopropylsilane (0.125 mL), trifluoroacetic acid (4. 125 mL) and stirred at room temperature for 1 hour.
  • the excised peptide was precipitated by adding about 5 volumes of ether.
  • the peptide was dissolved in distilled water, purified by high performance liquid chromatography and lyophilized.
  • PROXYL labeled peptides 11 to 15 are peptides consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 11 to 15, respectively.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 is identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • Peptide 11 is a peptide in which the carboxyl terminus of peptide 1 having a sequence in which a basic unit consisting of Pro-Hyp-Gly is repeated 10 times in succession is amidated.
  • Peptide 12 has a glycine at the amino terminus, followed by a sequence in which the basic unit consisting of Pro-Hyp-Gly is repeated seven times on the carboxyl side, followed by Pro-Arg-Gly, and the carboxyl terminus is It is an amidated peptide.
  • Peptide 13 has glycine at the amino terminus, followed by Pro-Arg-Gly on the carboxyl side, followed by a sequence in which the basic unit consisting of Pro-Hyp-Gly is repeated seven times on the carboxyl side, and further It is a peptide in which cysteine is followed on the carboxyl side and the carboxyl terminus is amidated.
  • Peptide 14 is a peptide in which the amino terminus is glycine, and the carboxyl side is followed by a sequence in which a basic unit consisting of Pro-Hyp-Gly is repeated seven times in succession, and the carboxyl terminus is amidated.
  • Peptide 15 is a carboxyl of a peptide consisting of a sequence in which the basic unit consisting of Pro-Hyp-Gly is repeated 10 times in succession and the fifth basic unit from the amino terminus is replaced with Pro-Hyp-Ala. The terminal is an amidated peptide.
  • PROXYL-labeled peptides 11, 12, 14 and 15 are represented by formula 9 with a nitroxide stable radical labeling agent at the amino terminus of the peptidyl group in which the carboxyl group at the carboxy terminus of SEQ ID NOs: 11, 12, 14 and 15 is amidated, respectively. It is a spin probe labeled compound in which 3-carboxy PROXYL shown is condensed.
  • PROXYL labeled peptides 11 and 15 are represented by the following formula 10.
  • PROXYL-labeled peptides 11 and 15 have a carboxy terminus of a collagen-like peptide having the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 11 and 15, respectively, and a spin probe label on the secondary amino group of the proline residue at the amino terminus of the peptide
  • a compound in which 3-carboxy PROXYL, which is an agent, is condensed and bonded, and R 9 in Formula 10 is a peptidyl group from the next amino acid residue to the carboxy terminus of the peptide with the carboxyl group of the proline residue at the amino terminus of the peptide Indicates.
  • Formula 11 represents PROXYL labeled peptides 12 and 14.
  • PROXYL-labeled peptides 12 and 14 are amidated at the carboxy terminus of a collagen-like peptide having the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 12 and 14, respectively, and are a spin probe labeling agent at the primary amino group at the amino terminus of the peptide 3
  • a compound in which -carboxy PROXYL is condensed and bonded, -NH-R 10 in Formula 11 is a peptidyl group of a collagen-like peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 or 14.
  • the following formula 12 represents the PROXYL-labeled peptide 13.
  • PROXYL labeled peptide 13 is a spin probe labeling agent in which the carboxyl group of the cysteine residue at the carboxy terminus of the collagen-like peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 is amidated, and the thiol group of the cysteine residue is 3
  • R 11 in formula 12 is a peptidyl having an amino acid sequence from the amino terminus of the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 to the glycine residue adjacent to the cysteine at the carboxy terminus Represents a group.
  • the PROXYL group represented by the chemical formula (1) is bonded to the side chain terminal of the cysteine of the peptide 13. Therefore, a peptide 13 precursor in which the —SH group of cysteine was free was synthesized beforehand.
  • the peptide 13 precursor was PROXYL-labeled using 3- (2-iodoacetamide) -PROXYL (Sigma Aldrich Japan GK) and purified by HPLC. 10 molar equivalents of 3- (2-iodoacetamido) -PROXYL is added to peptide 13 precursor in 50% ethanol, 0.1% Tris-HCl (pH 8.8), 5 mM EDTA, and 1 at room temperature.
  • PROXYL-labeled peptide trimer formation As in Example 2, the PROXYL-labeled peptide trimer was formed by allowing an aqueous solution of PROXYL-labeled peptide 11 to 15 (1 mg / mL) to stand at 4 ° C for 24 hours. It was done.
  • Pretreatment of urine sample A dilution series with PBS was prepared from a 1.0 mM stock solution dissolved in PBS.
  • Standard sample for calibration curve a standard solution using PBS was diluted with urine of a mouse to which no peptide was administered, and a dilution series for a calibration curve was prepared.
  • Quantitative analysis by X-band ESR method A filtered urine sample having a sample volume of 100 ⁇ L was sealed in a flat quartz cell (JEOL Ltd.), and the concentration of PROXYL-labeled peptide in urine was quantified.
  • ESR measurement conditions were as follows.
  • ESR measurement device X-band electron spin resonance device (JEOL Ltd., RE-3X type) Magnetic field: 320.7 ⁇ 5.0mT Modulation width: 0.1 mT Sweep time: 2.0 minutes Time constant: 0.03 seconds Integration: 3 times Gain: 200 Microwave output: 10.0 mW Microwave frequency: 9.45 GHz Measurement temperature: 23 ° C
  • S / M ratio relative ratio
  • PROXYL A calibration curve was prepared using the labeled peptide concentration and the relative ratio (S / M ratio).
  • PROXYL reduced in vivo was quantified by reoxidation with potassium ferricyanide.
  • 10 ⁇ L of 100 mM potassium ferricyanide final concentration of potassium ferricyanide was 1.0 mM
  • the melting temperature of PROXYL-labeled collagen-like peptide is in the range from 29.0 ° C to 58.0 ° C.
  • the PROXYL-labeled peptide 11 is a PROXYL-labeled peptide of the peptide 4 whose melting temperature was measured in Example 2. Therefore, when Table 2 and Table 5 were compared, the melting temperature decreased from 66.0 ° C. to 58.0 ° C. by PROXYL labeling.
  • PROXYL-labeled peptides 11 and 12 remained unchanged, and almost 100% of the dose was excreted in urine.
  • PROXYL-labeled peptides 13 and 14 had an unchanged urinary excretion rate of 50 to 70%, but the total excretion rate including the reductant was 90% or more of the dose.
  • PROXYL-labeled peptide 15 had an excretion rate of unchanged form of 20% and a total excretion rate of 30% or less including the reduced form.
  • the carbamoyl PROXYL used as a control had an excretion rate of unchanged form of 6%, and a total excretion rate of the reduced form of 9%.
  • the urinary excretion rate was measured in principle according to the method described in Example 5. Briefly, PROXYL-PEG5000 was dissolved in PBS, and 2 mL of a 50 ⁇ M PROXYL-PEG5000 administration solution was prepared. For each mouse, 0.1 mL of the administration solution was administered into the tail vein (dose: 5 nmol / animal). Eight mice were used in this experiment and two mice were bred per cage. Urine was collected 6 hours after administration and filtered through a filter having a pore diameter of 0.45 ⁇ m. Quantification was performed with an X-band ESR apparatus using two 10 ⁇ L capillaries. A standard curve was prepared using urine (control) of 1 ⁇ M, 2.5 ⁇ M and 5 ⁇ M healthy mice. The unchanged form + reduced form was measured by adding potassium ferricyanide.
  • FIG. 4 is a graph showing the measurement results of the urinary excretion rate (%) of the unchanged form of PROXYL-PEG and the urinary excretion rate (%) of the unchanged form + reduced form.
  • the error bar for each experimental condition indicates the standard deviation of the measured value of the experimental result repeated four times under the same condition.
  • the urinary excretion rate (%) of the unchanged form was about 20%, and the urinary excretion rate (%) of the unchanged form + reduced form was about 25%.
  • the urinary excretion rate (%) of PROXYL-PEG5000 was significantly lower than the urinary excretion rate (%) of PROXYL-labeled peptides 10 to 13 (see Table 5).
  • the urinary excretion rate (%) of PROXYL-PEG5000 was lower than the urinary excretion rate (%) of PROXYL-labeled peptide 14 (see Table 5). Therefore, it was revealed that the collagen-like peptide of the present invention is a stealth and high urinary excretion carrier as compared with the conventional delivery system.
  • FIG. 5 shows the time course of signal strength of ESR when PROXYL-labeled peptide 11 (final concentration 10 ⁇ M) or carbamoyl PROXYL (Cb-PROXYL) (final concentration 10 ⁇ M) was reacted with AAPH (final concentration 100 ⁇ M). It is a graph which shows a change. The vertical axis represents the percentage of the relative value of the ESR signal intensity when the ESR signal intensity at the start of the reaction is taken as a control, and the horizontal axis represents the reaction time (unit: hours).
  • the black circle ( ⁇ ) represents the relative value of ESR signal intensity at each reaction time of 10 ⁇ M PROXYL-labeled peptide 11 reacted with 100 ⁇ M AAPH, and the white circle ( ⁇ ) represents 10 ⁇ M carbamoyl PROXYL reacted with 100 ⁇ M AAPH. It represents the relative value of ESR signal intensity at each reaction time.
  • PROXYL-labeled peptide 11 (final concentration 10 ⁇ M) or carbamoyl PROXYL (final concentration 10 ⁇ M) is reacted with AAPH having a final concentration of 100 ⁇ M
  • the signal intensity of ESR is stable without decreasing for 2 hours from the start of the reaction. did.
  • Black circles ( ⁇ ) represent relative values of ESR signal intensity at each reaction time of 10 ⁇ M PROXYL-labeled peptide 11 reacted with 1 mM AAPH, and white circles ( ⁇ ) represent 10 ⁇ M carbamoyl PROXYL reacted with 1 mM AAPH. It represents the relative value of ESR signal intensity at each reaction time.
  • PROXYL-labeled peptide 11 final concentration 10 ⁇ M
  • carbamoyl PROXYL final concentration 10 ⁇ M
  • the ESR signal intensity of PROXYL-labeled peptide 11 starts the reaction within 6 hours from the start of the reaction.
  • the ESR signal intensity of carbamoyl PROXYL decreased to 50% before the start of the reaction.
  • LD of AAPH 50 I was asked to AAPH of LD 50 as a preliminary study. Based on the survival test of mice 12 hours after administration of AAPH intraperitoneally (25, 50 , 75, 100 mg / kg), the LD50 of AAPH was 100 mg / kg.
  • the maximum dose of AAPH was 50 mg / kg.
  • AAPH was administered intraperitoneally at 50 mg / kg.
  • PROXYL-labeled peptide 11 was administered into the tail vein at 5 nmol per mouse.
  • the urinary excretion was quantified using an X-band ESR device, and the urinary excretion rate was determined based on the quantification result and the dose.
  • FIG. 7 is a graph showing the urinary excretion rate of unchanged substance and the urinary excretion rate of unchanged substance and reductant in AAPH-administered mice.
  • the vertical axis represents the urinary excretion rate, that is, the percentage (%) of the urinary excretion rate with respect to the dose.
  • the left bar graph represents the urinary excretion rate of only unchanged (unchanged), and the right bar graph represents the sum of unmodified and reducted (unchanged + reduced). Error bars represent standard deviations of measured values obtained by repeating an experiment under the same conditions three times.
  • An asterisk (*) indicates that p-value is less than 5% in Student's t-test.
  • PROXYL-labeled peptide 11 had an unchanged urinary excretion rate of approximately 100% 6 hours after tail vein administration.
  • the urinary excretion rate of the unchanged form of PROXYL-labeled peptide 11 in AAPH-administered mice decreased to 59%.
  • the urinary excretion rate (33%) of the reduced form of PROXYL-labeled peptide 11 increased, and the urinary excretion rate of the unchanged form of PROXYL-labeled peptide 11 and the reduced form was 92%.
  • the compound having a bioactive group bound to the drug carrier of this example is excreted as a reductant reflecting the oxidative stress state in the administered organism, and therefore has an excellent oxidative stress response. It has been shown that it can be a probe.
  • FIG. 8 shows that PROXYL-labeled peptide 11 (final concentration 10 ⁇ M) or carbamoyl PROXYL (Cb-PROXYL) (final concentration 10 ⁇ M), AAPH (final concentration 1 mM), and ferrous sulfate (final concentration 20 ⁇ M) at a temperature of 23 °.
  • 6 is a graph showing a change over time in signal intensity of ESR when reacted with C.
  • the vertical axis represents the percentage of the relative value of the ESR signal intensity when the ESR signal intensity at the start of the reaction is taken as a control, and the horizontal axis represents the reaction time (unit: hours).
  • Black circles ( ⁇ ) represent relative values of ESR signal intensity at each reaction time of PROXYL-labeled peptide 11 reacted with AAPH and ferrous sulfate, and white circles ( ⁇ ) represent carbamoyl reacted with AAPH and ferrous sulfate. Represents the relative value of ESR signal intensity at each PROXYL reaction time.
  • PROXYL-labeled peptide 11 final concentration 10 ⁇ M
  • carbamoyl PROXYL final concentration 10 ⁇ M
  • PROXYL labeling is carried out within 6 hours from the start of the reaction.
  • the ESR signal intensity of peptide 11 decreased to 69% before the start of the reaction
  • the ESR signal intensity of carbamoyl PROXYL decreased to 50% before the start of the reaction (see FIG. 6).
  • GalN (1750 mg / kg) was administered intraperitoneally to a 12-hour fasted ddy mouse (male, 6 weeks old, body weight 30 g, Shimizu Experimental Materials Co., Ltd.). This time of GalN administration was set to 0 hours. LPS (50 ⁇ g / kg) was administered intraperitoneally at 0.5 hours after GalN administration.
  • Plasma preparation and plasma ALT and AST activity measurements At 6 hours after GalN administration, orbital bleeds were performed using syringes treated with EDTA. After orbital blood collection, centrifugation was performed at 4 ° C. and 800 ⁇ g for 1 minute. The supernatant was collected as plasma. After plasma collection, the activities of alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) were measured with a biochemical automatic analyzer (Fuji Drychem, DRI-CHEM 4000 SV, Fujifilm Corporation).
  • ALT alanine aminotransferase
  • AST aspartate aminotransferase
  • the urinary excretion rate was measured in principle according to the method described in Example 5. Briefly, 5 nmol of PROXYL-labeled peptide 11 per mouse was administered into the tail vein. After 6 hours, urinary excretion was measured with an X-band ESR device. Carbamoyl PROXYL (PROXYL-carbamoyl, Sigma Aldrich Japan LLC) was used as a control.
  • FIG. 9 is a graph showing the activity of ALT and AST in plasma in mice treated with GalN and LPS.
  • the error bar for each experimental condition indicates the standard deviation of the measured value of the experimental result repeated four times under the same condition.
  • An asterisk (**) indicates that the p-value is less than 1% in Student's t-test.
  • the activity of ALT was about 40 (U / L) at 0 hours after GalN administration and about 130 (U / L) at 6 hours after GalN administration.
  • the activity of AST was about 40 (U / L) at 0 hours after GalN administration and about 130 (U / L) at 6 hours after GalN administration. Therefore, it was revealed that oxidative stress was increased in fulminant hepatitis model mice. Note that the mortality of fulminant hepatitis model mice was 80% 24 to 48 hours after the administration of GalN.
  • FIG. 10 is a graph showing the urinary excretion rate of unchanged substance and the urinary excretion rate of unchanged substance and reductant in GalN and LPS-administered mice.
  • the vertical axis represents the urinary excretion rate (%), that is, the percentage (%) of the urinary excretion amount with respect to the dose.
  • the left bar graph represents the urinary excretion rate of only unchanged (unchanged), and the right bar graph represents the sum of unmodified and reducted (unchanged + reduced).
  • Error bars represent standard deviations of measured values obtained by repeating an experiment under the same conditions three times.
  • An asterisk (*) indicates that the p-value is less than 5% in Student's t-test.
  • PROXYL-labeled peptide 11 had an unchanged urinary excretion rate of almost 100% 6 hours after administration into the tail vein. In mice that developed fulminant hepatitis, the unchanged urinary excretion rate of PROXYL-labeled peptide 11 decreased to 73%. Along with this, the urinary excretion rate (20%) of the reduced form of PROXYL-labeled peptide 11 increased, and the urinary excretion rate of the unchanged form of PROXYL-labeled peptide 11 and the reduced form was 93%.
  • the urinary excretion rate of the unchanged form of PROXYL-labeled peptide 11 was about 90% (data not shown).
  • carbamoyl PROXYL had a very low urinary excretion rate of 9% (data not shown) even in healthy mice. Therefore, the peptide of the present invention can evaluate the degree and change of oxidative stress in vivo with low sensitivity and high sensitivity, while carbamoyl PROXYL cannot evaluate the degree and change of oxidative stress with high sensitivity in vivo. It was.
  • ⁇ -alanine- (Pro-Hyp-Gly) 10 peptide was dissolved in a phosphate buffer (150 mM, pH 7) containing 6M guanidine hydrochloride, and ⁇ -alanine- (Pro-Hyp-Gly) 10 peptide solution (28.5 mg). / ML) was prepared.
  • 5-carboxyfluorescein, succinimidyl ester (5-FAM, SE) was dissolved in dimethylformamide (DMF) to prepare a 5-carboxyfluorescein solution (10 mg / mL).
  • the ⁇ -alanine- (Pro-Hyp-Gly) 10 peptide solution and the 5-carboxyfluorescein solution were each in a volume ratio of 2: 5 (5-carboxyfluorescein was converted to ⁇ -alanine- (Pro-Hyp-Gly) 10 peptide. And then stirred at 70 ° C. for 5-6 hours. After the completion of the reaction was confirmed by HPLC, the fluorescein-labeled peptide was isolated by gel filtration using Sephadex G-15. Mass spectrometry (ESI-MS) and circular dichroism spectrum measurements (see Example 1) were performed on the fluorescein labeled peptide.
  • AAPH 50 mg / kg was pre-administered intraperitoneally.
  • a 5 ⁇ M fluorescein-labeled peptide solution was rapidly administered into the tail vein of ddy mice (male, 6 weeks old, body weight 30 g) (the dose per mouse is 0.5 nmol).
  • a 5 ⁇ M fluorescein solution prepared by adding PBS to fluorescein alone was administered to both the AAPH administration group and the AAPH non-administration group.
  • Urine was collected up to 6 hours after administration.
  • Urine was centrifuged at 3,000 ⁇ g for 10 minutes, and the supernatant was collected. The supernatant was filtered through a filter having a pore diameter of 0.45 ⁇ m, frozen, and stored at ⁇ 20 ° C. Urine was thawed and centrifuged at 4,000 xg at 20 ° C. The supernatant was collected and subjected to RP-HPLC. In RP-HPLC, an autosampler (SIL-20A / 20AC, Shimadzu Corporation) was used under the following conditions.
  • RP-HPLC an autosampler (SIL-20A / 20AC, Shimadzu Corporation) was used under the following conditions.
  • FIG. 11 is a structural formula showing a fluorescein-labeled peptide.
  • the fluorescein-labeled peptide is modified by beta-alanine at the amino terminus of peptide 1 consisting of a sequence in which the basic unit consisting of Pro-Hyp-Gly is repeated 10 times in succession, and the amino terminus of the beta-alanine is fluorescein. It is a modified peptide.
  • FIG. 12 is a waveform diagram showing a circular dichroism spectrum of a fluorescein-labeled peptide.
  • the waveform diagram shows the spectral pattern of a typical collagen triple helix structure with a positive peak at 225 nm, which was confirmed to be stable at 37 ° C.
  • FIG. 13 is a graph showing the measurement results of the urinary excretion rate (%) of each unchanged fluorescein-labeled peptide and fluorescein in AAPH-untreated mice and AAPH-treated mice.
  • the error bar for each experimental condition indicates the standard deviation of the measured value of the experimental result repeated three times (fluorescein alone) or four times (fluorescein-labeled peptide) under the same conditions.
  • An asterisk (**) indicates that the p-value is less than 1% in Student's t-test.
  • the unchanged urinary excretion rate (%) was about 71% for the fluorescein-labeled peptide and about 49% for fluorescein.
  • fluorescein-labeled peptide administration group fluorescein was sensitive to oxidative stress by pre-administration of AAPH, and the fluorescein-labeled peptide unchanged recovered in the urine was compared with the AAPH non-administration group. Significantly decreased.
  • the experimental group administered with fluorescein alone no effect of pre-AAPH administration was observed. From this result, it was shown that the fluorescein labeled peptide is useful as an oxidative stress detection agent.
  • the collagen-like peptide of the present invention can be used for detection and diagnosis of biological functions and biological states including oxidative stress in combination with a compound other than PROXYL or fluorescein or a drug active group. is there. Therefore, bioimaging, biofunction measurement, and the like are performed according to the purpose according to the collagen-like peptide of the present invention and a drug or bioactive group for imaging, evaluation and / or diagnosis (for example, fluorescence, luminescence, radiation, magnetic resonance). It was shown that this can be achieved by combining with a signal generating substance such as
  • the collagen-like peptide of the present invention can be used for detection and diagnosis of biological functions and biological states including oxidative stress in combination with compounds other than PROXYL and fluorescein or a drug active group. It is shown. Therefore, bioimaging, biofunction measurement, and the like are performed according to the purpose according to the collagen-like peptide of the present invention and a drug or bioactive group for imaging, evaluation and / or diagnosis (for example, fluorescence, luminescence, radiation, magnetic resonance). It was shown that this can be achieved by combining with a signal generating substance such as

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Abstract

　ステルス性であって、かつ、尿排泄性が高い薬物担体を開発すること。　本発明は、ステルス性かつ高尿排泄性の薬物担体である、コラーゲン様ペプチド、及び、該コラーゲン様ペプチドを含有する医薬組成物を提供する。前記医薬組成物は、薬物又は生物活性基を結合させることにより生体機能又は生体状態の検出、診断等に使用できる。本発明のコラーゲン様ペプチドに生体内の酸化ストレスに感応性の薬物又は生物活性基を結合させることにより、放射線障害、劇症肝炎、アナフィラキシーショック、アテローム動脈硬化症、狭心症、心筋梗塞、アルツハイマー病、又は、パーキンソン病における酸化ストレスを検出又は診断するために用いられる場合がある。また、本発明の医薬組成物は、磁気共鳴造影剤の場合がある。

Description

ステルス性かつ高尿排泄性のコラーゲン様ペプチド
　本発明は、ステルス性かつ高尿排泄性のコラーゲン様ペプチドと、該ペプチドを有効成分として含有する医薬組成物とに関する。
　標的の臓器に薬物を送達したり、薬物の体内での動態を制御するための薬物送達システムの開発は、創薬の一分野をなす重要な領域である。これまでに、リポソーム、デンドリマー、ペプチド超分子、無機ナノ粒子等のさまざな薬物担体が開発されている（非特許文献１－４）。一般に、これら比較的大きなサイズの薬物担体は細網内皮系細胞に捕捉され、分解をうけやすい。これに対し、薬物担体の表面を修飾処理すると、細網内皮系細胞に捕捉されにくくすることができる。薬物担体についてステルス性とは、細網内皮系細胞に捕捉されにくい性質をいう。例えば、一定のサイズのリポソームの表面をポリエチレングリコールで修飾することによって、ステルス性リポソームを作成することができる。ところが、かかるステルス性リポソームは腎臓の糸球体から濾過されるにはサイズが大きすぎるため、尿排泄性が低い（非特許文献５－７）。腎障害を有する患者での薬物の使用、あるいは、通常の診断薬等の使用においては、投与後長時間生体内に滞留することにより副作用を惹起する可能性がある。ステルス性であって、かつ、尿中への排泄性が高い薬物担体はいままでに知られていなかった。
Ｎｉｓｈｉｙａｍａ，　Ｎ．ら、Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍ，２６：２９（２０１１）． Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，　Ｙ．、Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍ　２６：２０（２０１１）． Ｍａｒｔｉｎ，　Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　Ｄｒｕｇ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２：２９（２００３）． Ｔａｋａｋｕｒａ，　Ｙ．ら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１３：７１（２００１）． Ｓｚｅｂｅｎｉ，　Ｊ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｒｅｖｉｅｗｓ，６３：１０２０（２０１１）． Ｊｉａｎｇ，Ｗ．ら、Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ，３，３３３（２０１１）． Ｇｒｅｎａｄｅｒ，　Ｔ．ら、Ａｎｔｉ－Ｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇｓ，２１：８６８（２０１０）．
　そこで、ステルス性であって、かつ、尿排泄性が高い薬物担体を開発する必要がある。
　本発明は、ステルス性かつ高尿排泄性のコラーゲン様ペプチドを提供する。本発明のコラーゲン様ペプチドは担体として用いられる場合がある。本発明は、薬物又は生物活性基が本発明のコラーゲン様ペプチドに結合した化合物を含む、組成物を提供する。前記組成物は医薬品の場合がある。
　本発明のコラーゲン様ペプチドにおいて、生物活性基Ｒが、下記式１で表されるペプチドのペプチジル基に、アミド結合又はリンカーＺを介して結合している場合がある。
　　（化１）
　(Pro-Hyp-Gly)l-(X-Y-Gly)m-(Pro-Hyp-Gly)n　　　(1)
　
　式中、Ｘ及びＹは任意のアミノ酸を表し、主鎖のカルボキシ末端はアミド化されていてもよく、ｌ及びｎは０以上の整数であり、ｍは０ないし３であり、かつ、７≦（ｌ＋ｍ＋ｎ）≦１１である。
　本発明のコラーゲン様ペプチドにおいて、前記生物活性基Ｒは、酸化ストレスに感応可能な酸化ストレス感応基の場合がある。
　本発明のコラーゲン様ペプチドは、下記式２で表されるペプチドの場合がある。
　　（化２）
　R-[(Pro-Hyp-Gly)l-(X-Y-Gly)m-(Pro-Hyp-Gly)n]　　　(2)
　
　式中、Ｒはフルオレセイン又はＰＲＯＸＹＬ基を表す。
　ｌ及びｎは０以上の整数であり、ｍは０ないし３であり、かつ、７≦（ｌ＋ｍ＋ｎ）≦１１である。
　本発明のコラーゲン様ペプチドは、下記式３で表されるペプチドの場合がある。
　　（化３）
　R-Z-[(Pro-Hyp-Gly)l-(X-Y-Gly)m-(Pro-Hyp-Gly)n]　　　(3)
　
　式中、Ｒはフルオレセイン又はＰＲＯＸＹＬ基を表す。
　Ｚは、β－アラニン、グリシン、又はシステインを表す。
　ｌ及びｎは０以上の整数であり、ｍは０ないし３であり、かつ、７≦（ｌ＋ｍ＋ｎ）≦１１である。
　本発明のコラーゲン様ペプチドにおいて、前記式１のペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１ないし６、及び、１１ないし１４からなる群から選択されるいずれか１つの場合がある。
　本発明は、本発明の少なくとも１つのコラーゲン様ペプチドを有効成分として含有する、医薬組成物を提供する。
　本発明の医薬品組成物は、生体内の酸化ストレスを検出又は診断するために用いられる場合がある。
　本発明の医薬品組成物は、放射線障害、劇症肝炎、アナフィラキシーショック、アテローム動脈硬化症、狭心症、心筋梗塞、アルツハイマー病、及び、パーキンソン病からなる群から選択される障害及び／又は疾患を、検出及び／又は診断するために用いられる場合がある。
　本発明の医薬品組成物は、磁気共鳴造影剤の場合がある。
　本発明の医薬品組成物は、血管造影のために用いられる場合がある。
　本発明は、薬物又は生物活性基が本発明のコラーゲン様ペプチドに結合した化合物を含む組成物を被験体に投与するステップを含む送達方法を提供する。本発明の送達方法は、被験体を治療、予防及び／又は診断するために用いられる場合がある。本発明の送達方法は、被験体の状態を評価するために用いられる場合がある。本発明の送達方法は、疾患及び／又は障害を検出するために用いられる場合がある。前記被験体は、ヒト、サル、ネコ、ブタ、ウマ、ウシ、マウス、ラット、イヌ、ウサギ及びニワトリを含むが、これらに限定されない。本発明の送達方法は、酸化ストレスに曝された被験体に適用される場合がある。前記酸化ストレスは、放射線障害、劇症肝炎、アナフィラキシーショック、アテローム動脈硬化症、狭心症、心筋梗塞、アルツハイマー病、パーキンソン病を含むが、これらに限定されない障害及び／又は疾患の場合がある。本発明の送達方法は、前記障害及び／又は疾患を検出及び／又は診断するために用いられる場合がある。本発明の送達方法における被験体への投与経路は、静脈内、経鼻等を含むが、これらに限定されない。本発明の医薬組成物の剤型は、好ましくは注射剤であるが、これに限定されない。本発明の送達方法は、薬物又は生物活性基が本発明のコラーゲン様ペプチドに結合した化合物の体内分布を、量的、空間的及び時間的に制御できる当業者に周知の送達システムと組み合わせて用いられる場合がある。
　本発明は、薬物又は生物活性基が本発明のコラーゲン様ペプチドに結合した化合物を含む組成物を被験体に投与するステップと、投与後に、前記被験体から前記化合物又はその一部（コラーゲン様ペプチド及び／又は生物活性基）を回収するステップと、回収した前記化合物又はその一部（コラーゲン様ペプチド及び／又は生物活性基）を測定するステップとを含む、検出、評価及び／又は診断の方法を提供する。前記測定するステップでは、磁気共鳴強度、蛍光強度、分子量、回収率（％）等が測定される場合がある。前記測定するステップでは、投与前と投与後の間で測定値が比較される場合がある。また、前記測定するステップでは、投与後の測定値が基準値と比較される場合がある。前記基準値は、当業者に周知な統計処理によって算出することができる。前記基準値は、健康な被験体の母集団から測定された値の平均値として決定される場合がある。
　本発明は、薬物又は生物活性基が本発明のコラーゲン様ペプチドに結合した化合物を含む組成物を被験体に投与するステップと、投与後に、前記化合物の分布又は変化を検出するステップとを含む、イメージング、評価及び／又は診断の方法を提供する。前記化合物の分布又は変化を検出するステップでは、蛍光、発光、放射線、磁気共鳴、近赤外線等が検出手段として使用される場合がある。
　本発明の医薬組成物は、本発明のステルス性かつ高尿排泄性の性質を損なわないことを条件として、さらに１種類又は２種類以上の薬学的に許容される添加物を含む場合がある。前記添加物は、希釈剤と、結合剤と、滑剤と、流動促進剤と、崩壊剤と、担体溶媒と、緩衝剤と、防腐剤と、安定化剤と、吸着剤と、当業者に知られたその他の医薬品添加剤とを含むが、これらに限定されない。
　本発明は、第１番目のトリペプチド配列（Ｘ１－Ｙ１－Ｇｌｙ）と、・・・、第i番目のトリペプチド配列（Ｘｉ－Ｙｉ－Ｇｌｙ）と、・・・、第ｎ番目のトリペプチド配列（Ｘｎ－Ｙｎ－Ｇｌｙ）とを含むアミノ酸配列を含み、投与される動物種の体温で３重らせんを形成するペプチドからなる、ステルス性かつ高尿排泄性の薬物担体を提供する。（ここで、ｉ及びｎは整数で、１＜ｉ＜ｎであり、７≦ｎ≦１１であって、Ｘ１、・・・、Ｘｉ、・・・Ｘｎのアミノ酸は独立に選択され、Ｙ１、・・・、Ｙｉ、・・・Ｙｎのアミノ酸も独立に選択される。）
　本発明の薬物担体において、前記アミノ酸配列はＸ－Ｙ－Ｇｌｙからなる基本ユニットが７回ないし１１回繰り返されたアミノ酸配列の場合がある。（ここでＸ及びＹは独立に選択される任意のアミノ酸である。）
　本発明の薬物担体において、前記基本ユニットのアミノ酸配列はＰｒｏ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙの場合がある。
　本発明の薬物担体において、前記基本ユニットは連続して繰り返される場合がある。
　本発明の薬物担体において、本発明の前記ペプチドはプロリン残基のヒドロキシル化以外の修飾を受ける場合がある。
　本発明の薬物担体において、前記ペプチドは配列番号１ないし６、及び、１１ないし１４からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列の場合がある。
　本発明の薬物担体は、薬物又は生物活性基を結合し、生物活性化合物の標的部位への送達に用いられる場合がある。
　本発明の薬物担体において、前記薬物又は生物活性基を結合した薬物担体は、治療及び／又は診断のための医薬の場合がある。
　本発明の薬物担体において、前記ペプチドはホモ又はヘテロ３量体の場合がある。
　本発明は、前記薬物担体に薬物又は生物活性基が結合した化合物を含む医薬組成物を提供する。
　本発明の医薬組成物は、イメージングのために用いられる場合がある。
　本発明の医薬組成物は、生体機能測定のために用いられる場合がある。
　本発明の医薬組成物において、前記生体機能測定は、酸化ストレスの測定の場合がある。そこで、本発明は酸化ストレス検査用の医薬組成物を提供する。本発明の酸化ストレス検査用の医薬組成物は、本発明の薬物担体に酸化ストレスに鋭敏に感応する生物活性基が結合した化合物を含む。前記酸化ストレスに鋭敏に感応する生物活性基は、スピンプローブ標識剤と、蛍光標識剤とを含むが、これらに限定されない。前記酸化ストレスに鋭敏に反応する蛍光標識剤は、アクリジン誘導体及びフルオレセイン誘導体蛍光物質を含むが、これらに限定されない。
　本発明は、薬物又は生物活性基を、ステルス性かつ高尿排泄性の薬物担体に結合した化合物を投与するステップを含む、薬物を送達させる方法を提供する。前記薬物担体は、第１番目のトリペプチド配列（Ｘ１－Ｙ１－Ｇｌｙ）と、・・・、第i番目のトリペプチド配列（Ｘｉ－Ｙｉ－Ｇｌｙ）と、・・・、第ｎ番目のトリペプチド配列（Ｘｎ－Ｙｎ－Ｇｌｙ）とを含むアミノ酸配列を含み、投与される動物種の体温で３重らせんを形成するペプチドからなる。（ここで、ｉ及びｎは整数で、１＜ｉ＜ｎであり、７≦ｎ≦１１であって、Ｘ１、・・・、Ｘｉ、・・・Ｘｎのアミノ酸は独立に選択され、Ｙ１、・・・、Ｙｉ、・・・Ｙｎのアミノ酸も独立に選択される。）
　本発明の薬物を送達させる方法において、前記ペプチドのアミノ酸配列はＸ－Ｙ－Ｇｌｙからなる基本ユニットが７回ないし１１回繰り返されたアミノ酸配列の場合がある。（ここでＸ及びＹは独立に選択される任意のアミノ酸である。）
　本発明の薬物を送達させる方法において、前記基本ユニットのアミノ酸配列はＰｒｏ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙの場合がある。
　本発明薬物を送達させる方法において、前記基本ユニットは連続して繰り返される場合がある。
　本発明の薬物を送達させる方法において、前記ペプチドはプロリン残基のヒドロキシル化以外の修飾を受ける場合がある。
　本発明の薬物を送達させる方法において、前記ペプチドは配列番号１ないし６、及び、１１ないし１４からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列の場合がある。
　本発明の薬物を送達させる方法において、前記薬物担体は薬物の送達に用いられる場合がある。
　本発明の薬物を送達させる方法において、前記薬物担体に結合させる薬物又は生物活性基は、治療及び／又は診断のための医薬の場合がある。
　本発明の薬物を送達させる方法において、前記薬物担体はホモ又はヘテロ３量体の場合がある。
　本発明は、本発明の薬物担体に薬物又は生物活性基が結合した化合物を含む医薬組成物を投与するステップを含む治療又は診断のための方法を提供する。
　本発明の治療又は診断のための方法において、前記医薬組成物はイメージングのために用いられる場合がある。
　本発明の治療又は診断のための方法において、前記医薬組成物は生体機能測定のために用いられる場合がある。
　本明細書と、本明細書に添付される配列表とにおいて、ペプチドの構造は、当業者に周知慣用のアミノ酸の３文字による表記法で記述される。本明細書においてアミノ酸はＬ体である。本明細書のアミノ酸は、分子生物学で一般的なタンパク質の翻訳に用いられることが知られた２０種類のＬ－アミノ酸の他、当該技術分野においてよく知られる修飾アミノ酸残基、例えば、４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリン、４－フルオロ－Ｌ－プロリン及びＮ－イソブチルグリシンを含む。本明細書において、ヒドロキシプロリンは、４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンであり、「Ｈｙｐ」と表される。
　本明細書において、薬物担体とは、薬物又は生物活性基と結合させて薬物又は生物活性基を有する化合物の生体内動態を変化させるための物質をいう。
　本明細書において、高尿排泄性の薬物担体とは、ある薬物担体が、単独でも、薬物又は生物活性基が結合した状態でも、急速に投与量のほとんどが尿中に排泄されるものをいう。例えば、ラットでは、投与後２４時間以内に、投与量の９０％以上、好ましくは、９５％以上が尿中に排泄されるものをいう。
　本明細書において、ステルス性の薬物担体とは、ある薬物担体が、単独でも、薬物又は生物活性基が結合した状態でも、血液中で分解及び修飾を受けず、細網内皮細胞に捕捉されないで、血液中に主に存在するものをいう。例えば、ステルス性の薬物担体は、前記基本ユニットを７個ないし１１個含むコラーゲン様ペプチドである。
　本明細書において、生物活性基とは、化合物の置換基のうち、生体内物質との結合又は相互作用により、いかなる生物活性を発揮させる置換基をいう。好ましくは、生物活性基は、生理活性を示す又は生体状態を変化させる置換基をいう。生物活性基が生理活性を示す又は生体状態を変化させるとき、前記生物活性基の又は前記生体内物質の構造が変化する場合や、これらの構造が変化しなくとも結合するだけの場合がある。具体的には、生物活性基は、生物活性を有する薬物の置換基、生物活性を有する化合物のラジカル、化合物単体自体は薬物ではないが、担体と結合することにより生物活性を示す置換基、及び、生体内物質との相互作用により変化する置換基が含まれるが、これらに限定されない。また、前記生物活性基を有する担体は、生体内に投与されることにより、疾患の治療、予防、並びに、検査、診断、生体状態の変化の測定で使用される場合がある。
　本明細書において、生物活性基は、好ましくは、酸化ストレスに感応性を有する置換基であり、もっとも好ましくは、ＰＲＯＸＹＬ基及びフルオレセイン基である。
　本明細書において、酸化ストレスとは、生体においてレドックス状態のバランスを維持するために生体に備えられた抗酸化システムの能力以上に酸化状態が亢進した生体にとって好ましくない状態をいう。「酸化ストレス」が関与する疾患や障害として、放射線障害、劇症肝炎、アナフィラキシーショック、アテローム動脈硬化症、狭心症、心筋梗塞、アルツハイマー病、及び／又は、パーキンソン病が挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明の薬物担体は、いわゆるコラーゲン様ペプチドからなる。本明細書において、コラーゲン様ペプチドとは、第１番目のトリペプチド配列（Ｘ１－Ｙ１－Ｇｌｙ）と、・・・、第i番目のトリペプチド配列（Ｘｉ－Ｙｉ－Ｇｌｙ）と、・・・、第ｎ番目のトリペプチド配列（Ｘｎ－Ｙｎ－Ｇｌｙ）とを含むアミノ酸配列を含む１次構造を有し、生体内で３重らせん状の３次構造を有するペプチドをいう。ここで、ｉ及びｎは整数で、１＜ｉ＜ｎであり、７≦ｎ≦１１であって、Ｘ１、・・・、Ｘｉ、・・・Ｘｎ及びＹ１、・・・、Ｙｉ、・・・Ｙｎは、独立に選択される任意のアミノ酸であって、天然のアミノ酸残基でもよく、当該技術分野においてよく知られる修飾アミノ酸残基、例えば、Ｈｙｐ、４－フルオロ－Ｌ－プロリン又はＮ－イソブチルグリシンでもよい。
　本明細書のコラーゲン様ペプチドのアミノ酸配列は、Ｘ－Ｙ－Ｇｌｙからなる基本ユニットが７回又は８回以上繰り返されたアミノ酸配列の場合がある。（ここでＸ及びＹは独立に選択される任意のアミノ酸であって、天然のアミノ酸残基でもよく、当該技術分野においてよく知られる修飾アミノ酸残基、例えば、Ｈｙｐ、４－フルオロ－Ｌ－プロリン又はＮ－イソブチルグリシンでもよい。）
　本明細書のコラーゲン様ペプチドにおいて、前記基本ユニットが連続して繰り返されるとは、１個の基本ユニットが隣の基本ユニットに常に接しており、それ以外のアミノ酸残基が介在しないことをいう。Ｘ－Ｙ－Ｇｌｙからなる基本ユニットがｎ回連続して繰り返されたアミノ酸配列は、（Ｘ－Ｙ－Ｇｌｙ）ｎと表記される。代替的には、本明細書のコラーゲン様ペプチドは、生体内で３重らせんを形成することを条件として、１個の基本ユニットと隣の基本ユニットとの間に１個又は２個以上の任意のアミノ酸残基が介在してもかまわない。しかし、本明細書のコラーゲン様ペプチドのアミノ酸配列が基本ユニットの他に任意のアミノ酸残基を含む場合には、当該ペプチドのアミノ酸配列中の８０％以上のアミノ酸残基が基本ユニットで占められることがあり、９０％以上のアミノ酸残基が基本ユニットで占められることがある。
　本明細書のコラーゲン様ペプチドにおいて、基本ユニットのアミノ酸配列はＸがＰｒｏで、ＹがＨｙｐの場合がある。
　Ｋｏｂａｙａｓｈｉ　Ｙ．ら（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、９：４１５（１９７０））によると、コラーゲン様ペプチドは基本ユニットの繰り返し回数が２１回未満であれば合成可能である。
　また、本明細書の実施例に示されるとおり、基本ユニットの繰り返しの回数が５回の場合には融解温度が投与される動物の体温より低いため、投与された動物の体内で３重らせんを形成することができなかった。一方、７回の場合には本発明の作用効果を奏することができた。したがって、本明細書のコラーゲン様ペプチドにおいて、基本ユニットの繰り返しの回数の下限は７回である。よって基本ユニットの繰り返しの回数は、７回又は８回以上である。さらに、本明細書のコラーゲン様ペプチドにおいて、基本ユニットの繰り返しの回数が１２回以上の場合、尿中排泄性の低下を認めたところから、基本ユニットの繰り返しの回数の上限は１１回である。よって基本ユニットの繰り返しの回数は、１１回又は１０回以下である。
　本明細書のコラーゲン様ペプチドにおいて、ホモ３量体とは、同一の１次構造のペプチド３本からなる３量体をいう。またヘテロ３量体とは、同一の１次構造のペプチド２本と、該ペプチドとは異なる１次構造のペプチド１本とからなる３量体か、それぞれ異なる１次構造のペプチド３本からなる３量体かをいう。
　本明細書において、融解温度とは、本明細書のコラーゲン様ペプチドが３重らせん構造の半量がランダムコイルに転移する温度をいう。融解温度は、例えば、円２色性スペクトル測定による高次構造解析などの公知の方法により測定されるが、これに限定されない他の公知の方法によっても測定できる。
　本発明の薬物担体のコラーゲン様ペプチドは投与される動物種の体温で３重らせんを形成する。そこで、本発明の薬物担体のコラーゲン様ペプチドは投与される動物種の体温より高い融解温度を有する。
　本発明において、投与される動物種とは、本発明の薬物担体を用いて薬物を送達する技術が適用される全ての動物種をいい、ヒトと、実験動物と、獣医学の治療対象となる動物とを含むが、これらに限定されない。具体的には、投与される動物種には、ヒト、サル、ネコ、ブタ、ウマ、ウシ、マウス、ラット、イヌ、ウサギ及びニワトリを含むが、これらに限定されない。
　これらの動物の平均体温は、ヒトでは３６°Ｃ、サルでは３８°Ｃ、ネコでは３８．５°Ｃ、イヌでは３８．５°Ｃ、ラットでは３７．５°Ｃ、マウスでは３７．５°Ｃ、ブタでは３９°Ｃ、ウマでは３７．５°Ｃ、ウシでは３８．５°Ｃ、ウサギでは３９°Ｃ、ニワトリでは４２°Ｃである。
　したがって、本発明の薬物担体のコラーゲン様ペプチドの融解温度は、３６°Ｃ以上が好ましく、３７°Ｃ以上がより好ましく、３７．５°Ｃ以上がより好ましく、３８°Ｃ以上がより好ましく、３８．５°Ｃ以上がより好ましく、３９°Ｃ以上がより好ましく、４２°Ｃ以上がより好ましい。
　本明細書において、「修飾」とは、タンパク質の合成に用いられる２０種類のＬ－アミノ酸からなるペプチドにいずれかの置換基が共有結合することをいう。本発明の薬物担体のコラーゲン様ペプチドについて「プロリン残基のヒドロキシル化以外の修飾を受ける」とは、投与される動物種において３重らせんを形成することを条件として、プロリン残基にヒドロキシル基が結合することを除いて、いずれのアミノ酸残基にいかなる置換基が結合するものであってもかまわない。本発明の薬物担体のコラーゲン様ペプチドを修飾する置換基は、アシル基、アセチル基、トリフルオロアセチル基、アミド基、アルキル基、アリル基、アリール基、グアニジル基、アミジン基、グアニジル基、アミジン基、カルバモイル基、トリニトロフェニル基を含むが、これらに限定されない。これらの置換基によるペプチドの修飾は、例えば、Ｗａｌｋｅｒ　ＪＭ編、“Ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｈａｎｄｂｏｏｋ、２ｎｄ　Ｅｄ．”ＨＵＭＡＮＡ　ＰＲＥＳＳ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ（２００２）のような文献に説明される公知の方法により調製することができる。本明細書において、本発明の薬物担体のコラーゲン様ペプチドには、生体内の代謝反応によって、本発明のコラーゲン様ペプチドか、プロリン残基のヒドロキシル化以外の修飾を受けた誘導体かが生成するような前駆体が含まれる。前記前駆体には、本発明のコラーゲン様ペプチドか、該コラーゲン様ペプチドがプロリン残基のヒドロキシル化以外の修飾を受けた誘導体かのエステル化誘導体が含まれるが、これに限られない。
　前記生体内で生物活性を示す化合物は、ホルモン剤のように受容体に結合することによりアゴニストとして生物活性を示す化合物と、受容体拮抗剤のように受容体に結合してアゴニストの結合を阻害することにより生物活性を示す化合物と、酵素阻害剤のように酵素と結合することにより酵素活性を阻害し生物活性を示す化合物とを含むが、これらに限定されない。かかる生体内で生物活性を示す化合物を本発明のステルス性かつ尿排泄性の高い薬物担体に結合させることにより、尿中への排泄性を高め、腎障害患者等での薬物の安全性を高めることが可能な場合がある。
　前記生体での周囲環境を検出又は計測できる化合物は、Ｘ線造影剤、ＭＲＩ造影剤、放射性医薬品及び蛍光プローブ剤を含むが、これらに限定されない。かかる生体での周囲環境を検出又は計測できる化合物を本発明のステルス性かつ尿中への排泄性の高い薬物担体に結合させることにより、化合物の血液指向性や尿中への排泄性を高めることが可能である。
　前記生体での周囲環境を検出又は計測できる化合物の生物活性基を本発明のステルス性かつ尿中への排泄性の高い薬物担体に結合させることにより、ステルス性かつ尿中への排泄性の高い薬物担体に生体での周囲環境を検出又は計測できる生物活性が付与された薬物とすることができる。
　本発明の薬物担体と薬物又は生物活性基との結合は、共有結合及び非共有結合のいずれの場合でもかまわない。共有結合には、エステル結合、エーテル結合、アミド結合、スルフィド結合、ジスルフィド結合などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の薬物担体と薬物又は生物活性基との結合は、例えば、Ｗａｌｋｅｒ　ＪＭ編、“Ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｈａｎｄｂｏｏｋ、２ｎｄ　Ｅｄ．”ＨＵＭＡＮＡ　ＰＲＥＳＳ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳ，（２００２）などに記載されている公知の手順によって実施することができる。
　非共有結合の場合は、イオン結合、水素結合、疎水結合、ファンデルワールス力による結合、金属錯体による結合、及び、包摂が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の薬物担体と薬物とを混合することにより、又は、薬物活性基を結合するための化合物を反応させることにより、前記結合形態によって、結合体を形成できる。
　本発明の薬物担体と結合するのに好ましい生体内で生物活性を示す化合物の薬物は、例えば、５α－レダクターゼ阻害薬、５－リポキシゲナーゼ阻害薬、ＡＣＥ阻害薬、ＣＣＫ拮抗薬、ＣＯＸ－Ｉ及びＣＯＸＩＩ阻害薬、ＨＩＶプロテアーゼ阻害薬、ＨＭＧＣｏＡレダクターゼ阻害薬、ＬＨ－ＲＨ作動薬、α－グルコシダーゼ阻害薬、α－及びβ－アドレナリン作動薬、α－及びβ－アドレナリン遮断薬、アルドース還元酵素阻害薬、アルドステロン拮抗薬、アロマターゼ阻害薬、アンギオテンシンＩＩ受容体拮抗薬、アンドロゲン、イオン交換レジン、インスリン増感剤、うっ血除去薬、エストロゲン、エリテマトーデス抑制薬、エンケファリナーゼ阻害薬、カリウムチャンネル活性化物質／オープナー、カルシウムチャンネル遮断薬、カルシウム調節薬、キサンチンオキシダーゼ阻害剤、キレート剤、グルココルチコイド、コリンエステラーゼ再活性化薬、コリンエステラーゼ阻害薬、コリン作動薬、セロトニンノルアドレナリン再取込阻害薬、セロトニン取込阻害薬、セロトニン受容体作動薬、セロトニン受容体拮抗薬、ソマトスタチン類似体、ドパミン受容体作動薬、ドパミン受容体拮抗薬、トポイソメラーゼＩ及びＩＩ阻害薬、トロンボキサンＡ２受容体拮抗薬、ヒスタミンＨ２受容体拮抗薬、フィブリノーゲン受容体拮抗薬、フッ素サプリメント、ブラジキニン拮抗薬、プロゲストゲン、プロスタグランジン、プロテアーゼ阻害薬、プロラクチン阻害薬、ヘパリン拮抗薬、ペプシン阻害薬、ベンゾジアゼピン拮抗薬、マトリクスメタロプロテイナーゼ阻害薬、モノアミンオキシダーゼ阻害薬、ロイコトリエン拮抗薬、胃及び膵臓分泌刺激薬、胃プロトンポンプ阻害薬、胃細胞保護薬、胃腸管運動促進剤、胃分泌阻害薬、解毒剤、解熱薬、外部寄生生物撲滅薬、角質溶解薬、緩下剤／下剤、肝酵素誘発物質、肝保護物質、気管支拡張薬、逆転写酵素阻害薬、去痰薬、強心薬、筋弛緩剤、駆虫薬、駆梅薬、血管拡張薬及び血管収縮薬を含む血管調節物質、血管保護物質、血栓溶解薬、血漿容積膨張剤、嫌酒薬、呼吸刺激物質、向知性薬、抗アクネ剤、抗アメーバ剤、抗アレルギー薬、抗アンドロゲン剤、抗ウイルス薬、抗うつ薬、抗エストロゲン剤、抗けいれん薬、抗ゴナドトロピン剤、抗コリン薬、抗ジスキネジア薬、抗ニューモシスティス薬、抗パーキンソン病薬、抗ヒスタミン剤、抗ページェット病薬、抗マイコバクテリア薬、抗マラリア薬、抗ムスカリン剤、抗メトヘモグロビン血症薬、抗リケッチア薬、抗悪性腫瘍剤及び補助剤、抗炎症薬、抗活動亢進剤、抗褐色細胞腫薬、抗乾癬薬、抗関節炎／抗リウマチ剤、抗狭心症薬、抗凝固剤、抗菌補助剤、抗菌薬、抗血小板血症薬、抗血栓薬、抗原虫薬、抗鼓腸薬、抗好中球減少薬、抗攻撃性薬、抗甲状腺機能低下薬、抗甲状腺薬、抗高リン血症薬、抗高脂血症薬、抗骨粗しょう症薬、抗脂漏薬、抗湿疹薬、抗蛇毒素、抗徐脈薬、抗真菌薬、抗精神病薬、抗線維化剤、抗前立腺肥大症薬、抗脱毛症剤、抗痛風薬、抗潰瘍薬、抗糖尿病薬、抗動脈硬化剤、抗尿結石症薬、抗不安薬、抗不整脈薬、抗片頭痛薬、抗利尿薬、抗緑内障薬、抗喘息薬、抗躁薬、甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、酵素、酵素補因子、鉱質コルチコイド、降圧薬、骨吸収阻害薬、催吐剤、散瞳薬、子宮収縮抑制薬、止血薬、止瀉薬、脂肪作用薬、収斂薬、縮瞳薬、昇圧薬、消化補助薬、消毒薬／殺菌剤、色素沈着物質、食欲抑制剤、神経保護薬、人工妊娠中絶薬、制酸薬、制吐薬、性腺刺激因子、成長ホルモン阻害薬、成長ホルモン放出因子、成長刺激物質、清拭剤、造血薬、造血薬、脱色剤、炭酸脱水酵素阻害薬、胆石溶解剤、蛋白同化剤、中枢神経刺激薬、鎮咳薬、鎮静薬／催眠薬、鎮痛剤（麻薬性及び非麻薬性鎮痛剤を含む）、鎮痒薬、鎮痙薬、乳汁分泌刺激ホルモン、尿酸排泄促進薬、粘液溶解薬、避妊薬、非ステロイド性抗炎症薬、副腎皮質刺激ホルモン、副腎皮質抑制薬、分娩誘発薬、放射医薬品、麻薬拮抗薬、免疫調節物質、免疫抑制物質、溶血薬、卵巣ホルモン、利胆薬、利尿薬、疱疹状皮膚炎抑制薬及びそれらの組みあわせである医薬類を含むが、これらに限定されない。
　本発明の薬物担体と結合するのに好ましい生体内で生物活性を示す化合物の具体例は、アザチオプリン、アセトヘキサミド、アセチルサリチル酸、アプレピタント、アルクロフェナク、アロプリノール、アトロピン、イルベサルタン、塩酸モキシフロキサシン、塩酸ラロキシフェン、塩酸ロピバカイン水和物、エストラジオール、エダラボン、エトラビリン、エムトリシタビン、エルデカルシトール、ベンゾチアジド、カルプロフェン、カルベジロール、カンデサルタン・シレキセチル、ゲフィチニブ、セレコキシブ、クロルジアゼポキシド、クロニジン、クロザピン、コデイン、リン酸コデイン、硫酸コデイン、デラコキシブ、ジアセレイン、ジクロフェナク、ジルチアゼム、デュタステリド、ドセタキセル、エトドラク、エトポキシド、エトリコキシブ、エベロリムス、フェンブフェン、フェンクロフェナク、フェンプロフェン、フェンチアザク、フルルビプロフェン、グリセオフルビン、ハロペリドール、イブプロフェン、インドメタシン、インドプロフェン、ケトプロフェン、ロラゼパム、酢酸メドロキトプロゲステロン、メゲストロール、メロキシカム、メトキサレン、メチルプレドニゾン、モルヒネ、硫酸モルヒネ、ナプロキセン、ナラトリプタン塩酸塩、ニセルゴリン、ニフェジピン、ニフルミク、オランザピン、オキサプロジン、オキサゼパム、オキシフェンブタゾン、パクリタキセル、パルペリドン、ビルダグリプチン、フェニンジオン、フェノバルビタール、ピロキシカム、ピルプロフェン、プレドニゾロン、プレドニゾン、プロカイン、プロゲステロン、ピリメタミン、リスペリドン、ロフェコキシブ、アセナピン、スルファジアジン、スルファメラジン、スルフイソキサゾール、スリンダク、スプロフェン、タダラフィル、テマゼパム、チアプロフェン酸、チロミソール、トルメチク、バルデコキシブ、ボリノスタット、ロクロニウム臭化物、アセノクマロール、アセチルジギトキシン、アデノシン、アネトール、アニレリジン、アリピプラゾール、イトラコナゾール、イミダフェナシン、エキセメスタン、オロパタジン塩酸塩、ベンゾカイン、ベンゾナテート、ベタメタゾン、酢酸ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、ビサコジル、ブロモジフェンヒドラミン、ブタンベン、クロラムブシル、クロラムフェニコール、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロルプロマジン、パルミチン酸クリンダマイシン、クリオキノール、クロピドグレル、塩酸アミオダロン、酢酸コルチゾン、塩酸シクリジン、塩酸シプロヘプタジン、デメクロサイクリン、ジアゼパム、シスプラチン、ジブカイン、ジギトキシン、ネオスチグミンメチル硫酸塩、ネララビン、メシル酸ジヒドロエルゴタミン、ジメチステロン、ジスルフィラム、トシル酸スブラタスト、ドキュセートカルシウム、ジヒドロゲステロン、エナラプリラート、酒石酸エルゴタミン、エリスロマイシン、エストール酸エリスロマイシン、ピバル酸フルメタゾン、フィンゴリモド塩酸塩、フルオシノロンアセトニド、フルオロメトロン、エナント酸フルフェナジン、フォンダパリヌクスナトリウム、フルランドレノリド、グアイフェネシン、ハラゾン、塩酸フェキソフェナジン、ヒドロコルチゾン、フルチカゾンフランカルボン酸エステル、リバスチグミンレベチラセタム、レボチロキシンナトリウム、メチルクロチアジド、ミコナゾール、メサラジン、モメタゾンフランカルボン酸エステル、硝酸ミコナゾール、ニトロフラゾン、ニトロメルソール、、ペンタゾシン、ペントバルビタール、フェンタニルクエン酸塩、プリミドン、硫酸キニーネ、スタノゾロール、硝酸スルコナゾール、スルファジメトキシン、スルファエチドール、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、スルファピリジン、タクロリムス、テストステロン、トリアゾラム、ラルテグラビルカリウム、リセドロン酸ナトリウム、トリクロルメチアジド及びトリオキサレンを含むが、これらに限定されない。
　本生体内で生物活性を示す化合物のなかには、細胞内に作用点がある場合がある。かかる化合物は本発明の薬物担体と結合したままでは作用点に到達することができない。このような化合物は、例えば、エステル結合で本発明の薬物担体に結合した化合物としたり、あるいは、本発明の薬物担体に結合した包摂化合物に包摂させたりすることにより、投与後、速やかに化合物が薬物担体から放出させて、細胞内の作用点に到達させることが可能となる。このように、本明細書に列挙された生物活性を示す多種多様の化合物は、本発明の薬物担体との結合様式を最適化することにより、本発明の薬物担体の利点を享受することができる。
　前記スピンプローブ標識剤は、Ｎ－オキシル－２，２，６，６－テトラメチルピペリジン誘導体（Ｃｏｏｋ　Ｒ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　８，　３１８８（１９６３））、Ｎ－オキシル－２，２，５，５－テトラメチルピロリジン誘導体（Ｌａｎｄｇｒａｆ，　Ｗ．Ｃ．ら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１３０：１１１（１９６９））及びＮ－（２，２，５，５－テトラメチル－３－カルボニル－ピロリジン－１－オキシル）－イミダゾール（Ｏｈｉｎｉｓｈ　Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７５：２１１（１９７４））を含むが、これらに限定されない。
　本発明の薬物担体に前記スピンプローブ標識剤が結合した化合物は、前記スピンプローブ標識剤が薬物担体ペプチドの主鎖又は側鎖のアミノ基に結合する場合には、式１－１、式１－２、式２－１又は式２－２で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　式１－１、式１－２、式２－１及び式２－２において、Ｒ1及びＲ2のうちいずれか一方は、前記薬物担体ペプチドのペプチジル基であり、他の一方は、水素原子か、アルキル基、アリル基、アリール基、アラルキル基、エステル基又はアミド基かである。
　また、本発明の薬物担体に前記スピンプローブ標識剤が結合した化合物は、前記スピンプローブ標識剤が薬物担体ペプチドの主鎖又は側鎖のカルボキシル基と結合している場合には、式３－１又は式３－２で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　式３－１及び式３－２において、Ｒ3は前記薬物担体ペプチドのペプチジル基である。
　本発明の薬物担体に前記スピンプローブ標識剤が結合した化合物は、前記スピンプローブ標識剤が薬物担体ペプチドのシステイン基と結合する場合には、式４－１又は式４－２で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　式４－１及び式４－２において、Ｒ4は、前記薬物担体ペプチドのペプチジル基である。
　本発明の薬物担体に前記スピンプローブ標識剤が結合した化合物は、スピンプローブ標識剤３－カルボキシＰＲＯＸＬが薬物担体ペプチドのアミノ末端のプロリンの２級アミノ基に縮合結合する場合には、式５で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　式５において、Ｒ5は、前記アミノ末端のプロリンに続く、アミノ末端から２番目のアミノ酸からカルボキシ末端までのペプチジル基を示す。
　式５の化合物は、配列番号１１又は１５のアミノ酸配列のコラーゲン様ペプチドのアミノ末端のプロリン残基の２級アミノ基にスピンプローブ標識剤３－カルボキシＰＲＯＸＹＬが縮合結合した化合物の場合がある。
　本発明の薬物担体に前記スピンプローブ標識剤が結合した化合物は、スピンプローブ標識剤３－カルボキシＰＲＯＸＹＬが薬物担体ペプチドのアミノ末端の１級アミノ基に縮合結合する場合には、式６で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　式６において、Ｒ6は、前記薬物担体ペプチドのアミノ末端からカルボキシ末端までのペプチジル基である。
　式６の化合物は、配列番号１２又は１４のアミノ酸配列のコラーゲン様ペプチドのアミノ末端のグリシン残基のアミノ基にスピンプローブ標識剤３－カルボキシＰＲＯＸＹＬが縮合結合した化合物の場合がある。
　本発明の薬物担体に前記スピンプローブ標識剤が結合した化合物は、スピンプローブ標識剤３－カルバミドメチルＰＲＯＸＹＬが薬物担体ペプチドのシステイン残基とスルフィド結合する場合には、式７で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　式７において、Ｒ7は、前記薬物担体ペプチドのアミノ末端から前記システイン残基のアミノ末端側に隣接するアミノ酸残基までのペプチジル基か、水素原子（Ｈ）か、Ｒ19－Ｃ（＝Ｏ）－か、Ｒ19－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－か、Ｒ19－Ｃ（＝ＮＨ）－かである。ここでＲ19は、炭素数１ないし９のアルキル基か、炭素数２ないし９のアルケニル基か、炭素数６ないし９の芳香族アルキル基か、水素（Ｈ）かである。式７において、Ｒ8は、前記薬物担体ペプチドの前記システイン残基のカルボキシル末端側に隣接するアミノ酸残基からカルボキシル末端までのペプチジル基か、水酸基か、アミノ基かである。ここでＲ7及びＲ8がペプチジル基のとき、該ペプチジル基は、アシル基、アセチル基、トリフルオロアセチル基、アミド基、アルキル基、アリル基、アリール基、グアニジル基、アミジン基、グアニジル基、アミジン基、カルバモイル基、トリニトロフェニル基を含むが、これらに限定されない置換基で修飾されてもよい。さらに、Ｒ7及びＲ8がペプチジル基のとき、該ペプチジル基は、生体内の代謝反応で分解されうる修飾、例えば、エステル化誘導体の場合がある。
　式７の化合物は、配列番号１３のアミノ酸配列のコラーゲン様ペプチドのペプチジル基にスピンプローブ標識剤３－カルバミドメチルＰＲＯＸＹＬがスルフィド結合した化合物の場合がある。
　本発明の医薬組成物は、本発明の薬物担体に薬物又は生物活性基が結合した化合物に加えて、薬学的に許容可能な医薬品添加物を含む場合がある。前記医薬品添加物は、担体溶媒と、緩衝剤と、防腐剤及び安定化剤と、当業者に知られたその他の医薬品添加剤とを含むが、これらに限定されない。
　本発明の医薬組成物は、通常は、動物に投与される場合には、該動物の体重１ｋｇにつき１～５０００μｇの範囲内の単位用量で投与される。ヒトに投与される場合には、該ヒト個体の体重１ｋｇについて約０．０３～１０００μｇの範囲内の単位用量で投与される。
　本明細書におけるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）は従来のグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）と同一である。本明細書におけるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）は従来のグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）と同一である。ＡＳＴ（ＧＯＴ）及びＡＬＴ（ＧＰＴ）は肝臓障害の指標として用いられる。
　本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
ペプチド１ないし６のホモ３量体の円２色性スペクトルを表す波形図。 ペプチド１ないし３、９及び１０のホモ３量体をヒト血清中に添加後、血清中残存量の添加量に対する割合の経時的な変化を表すグラフ。 ペプチド１、７又は８を投与したラットにおけるペプチドの血液残存率（％）の測定結果を示すグラフ。 ＰＲＯＸＹＬ－ＰＥＧの未変化体の尿中排泄率（％）、及び、未変化体＋還元体の尿中排泄率（％）の測定結果を示すグラフ。 ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１（最終濃度１０μＭ）又はカルバモイルＰＲＯＸＹＬ（Ｃｂ－ＰＲＯＸＹＬ）（最終濃度１０μＭ）と、ＡＡＰＨ（最終濃度１００μＭ）とを反応させた場合のＥＳＲ信号強度の経時的な変化を示すグラフ。 ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１（最終濃度１０μＭ）又はカルバモイルＰＲＯＸＹＬ（Ｃｂ－ＰＲＯＸＹＬ）（最終濃度１０μＭ）と、ＡＡＰＨ（最終濃度１ｍＭ）とを反応させた場合のＥＳＲ信号強度の経時的な変化を示すグラフ。 ＡＡＰＨ投与マウスにおける未変化体の尿中排泄率と、未変化体及び還元体の尿中排泄率とを示すグラフ。 ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１（最終濃度１０μＭ）又はカルバモイルＰＲＯＸＹＬ（Ｃｂ－ＰＲＯＸＹＬ）（最終濃度１０μＭ）と、ＡＡＰＨ（最終濃度１ｍＭ）と、硫酸第一鉄（最終濃度２０μＭ）とを反応させた場合のＥＳＲの信号強度の経時的な変化を示すグラフ。 ＧａｌＮ及びＬＰＳ投与マウスにおける血漿中のＡＬＴ及びＡＳＴの活性を示すグラフ。 ＧａｌＮ及びＬＰＳ投与マウスにおける未変化体の尿中排泄率と、未変化体及び還元体の尿中排泄率とを示すグラフ。 フルオレセイン標識ペプチドを示す構造式。 フルオレセイン標識ペプチドの円２色性スペクトルを表す波形図。 ＡＡＰＨ非投与マウス及びＡＡＰＨ投与マウスにおけるフルオレセイン標識ペプチド及びフルオレセインの各未変化体の尿中排泄率（％）の測定結果を示すグラフ。
　以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
　コラーゲン様ペプチドの合成
　材料及び方法
　本実施例において、アミノ酸は、プロリン、ヒドロキシプロリン、グリシン、アルギニン及びアスパラギン酸はＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（メルク株式会社）の製品が購入され、ペプチド合成に供された。Ｃ末端（カルボキシ末端）がカルボキシル基であるペプチドの合成は、２－Ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ－樹脂（株式会社ペプチド研究所）上で、Ｃ末端がアミドであるペプチドの合成は、Ｒｉｎｋ－ａｍｉｄｅ樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（メルク株式会社））上で、通常のＦｍｏｃ型固相合成法により実施された。
　（Ｐｒｏ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ）の基本ユニットを連続して５回繰り返したペプチド（Ｐｒｏ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ）5（以下、ペプチド９と記載）及び（Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）の基本ユニットを連続して１０回繰り返したペプチド（Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）10（以下、ペプチド１０と記載）は、株式会社ペプチド研究所より購入され、実験に供せられた。
　ペプチド１ないし１０のアミノ酸配列は、それぞれ、添付される配列表の配列番号１ないし１０に列挙される。ペプチド１ないし１０の構造の簡単な説明は以下のとおりである。ペプチド１のアミノ酸配列はＰｒｏ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙからなる基本ユニットが連続して１０回繰り返された配列からなる。ペプチド２のアミノ酸配列は、ペプチド１で基本ユニットが連続して１０回繰り返されるうち、アミノ末端から第５番目の基本ユニットがＰｒｏ－Ａｒｇ－Ｇｌｙに置換された配列からなる。ペプチド３のアミノ酸配列は、前記ペプチド１で基本ユニットが連続して１０回繰り返されるうちアミノ末端から第５番目の基本ユニットがＡｓｐ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙに置換された配列からなる。ペプチド４ないし６は、それぞれ、ペプチド１ないし３のカルボキシル末端がアミド化されたペプチドである。ペプチド７のアミノ酸配列は、前記基本ユニットが連続して１２回繰り返されるうち、アミノ末端から第５番目の基本ユニットがＰｒｏ－Ａｒｇ－Ｇｌｙに置換された配列からなる。ペプチド８のアミノ酸配列は、前記基本ユニットが連続して１７回繰り返されるうち、アミノ末端から第１０番目の基本ユニットがＰｒｏ－Ａｒｇ－Ｇｌｙに置換された配列からなる。ペプチド９はＰｒｏ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙからなる基本ユニットが連続して５回繰り返された配列からなる。ペプチド１０はＰｒｏ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙからなる基本ユニットが連続して１０回繰り返された配列からなる。
　結果
　合成された各ペプチドは、Ｂｒｕｋｅｒ　Ａｕｔｏｆｒｅｘ　ＩＩ（ブルカージャパン株式会社）を用いてＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法で解析され、その結果が表１に示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　表１の結果から、ペプチド１ないし８はそれぞれのアミノ酸配列から予測される質量を有することが確認された。
　コラーゲン様ペプチド３重らせん構造の形成
　材料及び方法
　３重らせん構造の形成
　本実施例で合成したペプチド１ないし６について、３重らせん構造の形成を確実とする目的で、ＰＢＳ（生理的リン酸緩衝液）あるいは蒸留水中でペプチド濃度が１～１０ｍｇ／ｍＬ、温度４°Ｃの条件で自己集合させてホモ３量体が形成された。得られたホモ３量体は、４°Ｃにて保存された。
　コラーゲン様ペプチドの高次構造形成の確認
　ペプチド１ないし６のホモ３量体標品の高次構造は、円２色性スペクトル法により確認された。
　円２色性スペクトル測定による高次構造解析
　以下の条件で、本実施例で形成されたペプチド１ないし６のホモ３量体標品の円２色性スペクトルが以下の条件で測定された。
溶媒：ＰＢＳ
装置：ＪＡＳＣＯ　Ｊ－８２０装置にＰＴＣ－４２３Ｌ温度制御装置を装着して使用
セル長：０．５ｍｍ
測定波長：１９０－２６０ｎｍ
データ取り込み：０．５ｎｍ毎
スキャン速度：５０ｎｍ／分
レスポンス：１秒
データ積算：３回
感度：１００ｍｄｅｇ
測定温度：４°Ｃ、融解温度測定では１時間あたり１８°Ｃで温度を上昇させた。
　結果
　図１は、ペプチド１ないし６のホモ３量体の円２色性スペクトルを表す波形図である。
　図１の結果から、ペプチド１ないし６のホモ３量体標品の円２色性スペクトルは、いずれも、２２５ｎｍに正のピークを有する典型的なコラーゲン３重らせん構造のスペクトルパターンを示した。よって、ペプチド１ないし６の標品は３重らせんを形成していることが確認された。なお、ペプチド７及び８の標品は、ペプチド３重らせん安定性の鎖長依存性を考慮すると、３重らせんを形成できると考えられた。
　コラーゲン様ペプチドの融解温度
　ペプチド１ないし６のホモ３量体標品と、ペプチド９及び１０とを溶媒ＰＢＳに１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した標品溶液が用意された。融解温度（３重らせんからランダムコイルへの転移）が、２２５ｎｍの正のコットン効果の楕円率の変化に基づいて測定され、その結果が表２に示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　表２に示すとおり、ペプチド１ないし６の融解温度は５６．５から６６．０°Ｃまでの範囲であった。また、ペプチド７及び８の標品の融解温度は、ペプチド３重らせん安定性の鎖長依存性を考慮すると、ペプチド１ないし６よりも安定であり、３７°Ｃを上回ると推測された。実際に、ペプチド７及び８の融解温度は３７°Ｃよりも高く、ペプチド７の融解温度は７２°Ｃであり、ペプチド８の融解温度は測定限界の７５°Ｃよりも高かった。一方、ペプチド９及び１０の融解温度は、ヒトを含む哺乳動物の体温（約３７°Ｃ）を大きく下回り、それぞれ、５．０及び２５．０°Ｃと報告されている（Ｆｉｅｌｄｓ，　ＧＢ及びＰｒｏｃｋｏｐ　ＤＪ．、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）：４０，３４５（１９９６））。
　コラーゲン様ペプチドの血清中安定性
　材料及び方法
　実施例１で製造されたコラーゲン様ペプチドの血清中安定性が測定された。ペプチド１、２、３ないし９、１０のＰＢＳ溶液（１．２ｘ１０-3ｍｏｌ／Ｌ）が用意され、ペプチド終濃度が（１．２ｘ１０-4ｍｏｌ／Ｌ）となるように新鮮健常ヒト血清と混合された反応液０．２ｍＬが３７°Ｃでインキュベートされた。ペプチド１、２、３ないし９、１０と血清との混合開始時から、前記反応液より一定時間ごとに２０μＬずつサンプルが回収され、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）分析（装置：島津Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ　ｓｙｓｔｅｍ、カラムＣＯＳＭＯＳＩＬ　５Ｃ18－ＡＲ－II（ナカライテスク株式会社）、４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント１０－３０％／３０分、３０－９０％／３５分（ペプチド９のみは５－２０％／３０分、２０－９０％／３５分）ＭｅＣＮ／ＤＷ（０．０５％ＴＦＡ）２２０ｎｍ、６０°Ｃ、１ｍＬ／分）にて各時点におけるペプチドのピーク面積を測定し、その保持率が血中安定性の指標として評価された。
　結果
　図２は、ペプチド１ないし３、９及び１０のホモ３量体をヒト血清中に添加後、血清中残存量の添加量に対する割合の経時的な変化を表すグラフである。図２から明かなとおり、ペプチド１、２、３は血清中で安定に存在したが、ペプチド９及び１０は、血清中で速やかに分解された。よって、体温で３重らせん構造を形成できるコラーゲン様ペプチドは血液中で安定であることが示された。また、ペプチド４ないし８も、融解温度やペプチド３重らせん安定性の鎖長依存性を考慮すると、血液中で安定であると推測された。
　コラーゲン様ペプチド薬物担体のラットにおける尿中排泄率の測定
　材料及び方法
　動物への投与と尿の回収
　７週齢の雄性Ｗｉｓｔａｒ系ラット（清水実験材料株式会社、体重２００－２５０ｇ）が投与条件ごとに４匹用意された。ペプチド１ないし１０の０．１ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液が調製され、ラット１匹あたり２０μｇが右大腿静脈から急速投与された。投与後２４時間までの尿が回収され、３０００×ｇで１０分遠心後、上清がポア径０．４５μｍのフィルターで濾過され、得られた尿検体は－２０°Ｃで保存された。
　尿の前処理及びＲＰ－ＨＰＬＣによる分析
　前記尿検体は解凍され、２０°Ｃで遠心された。回収された上清のうち１．０ｍＬに、２０μｇ／全尿量相当の量の15Ｎ－ペプチドが内部標準として添加され、１０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ３．２）で平衡化された逆相前処理カラム（ＩｎｅｒｔＳｅｐ　ＲＰ１　３０ｍｇ）に懸架された。前記カラムは２０％　アセトニトリル／０．１％　トリフルオロ酢酸１．５ｍＬで溶出され、減圧乾燥された。残渣は０．１％ＴＦＡ　１１０μＬで溶解され、ポア径０．２μｍフィルターで濾過された。得られた濾液がＲＰ－ＨＰＬＣ法による分析に供された。
　ＲＰ－ＨＰＬＣの条件は以下のとおりである。
装置：Ａｇｉｌｅｎｔ　１１００　ＨＰＬＣ　ｓｙｓｔｅｍ（アジレント・テクノロジー株式会社）
カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ　５Ｃ18－ＡＲ－II（１ｘ１５０ｍｍ、ナカライテスク株式会社）
カラム温度：５０°Ｃ
送液速度：５０μＬ／分
溶媒：Ａ液　０．１％ＴＦＡ／水、Ｂ液　０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル
グラジエント溶出：５－２５％　Ｂ／５－２５分
検出波長：２２０ｎｍ
インジェクション量：１００μＬ
フラクション採取：５０μＬ／分画
　尿中排泄率の測定
　内部標準物質がペプチド１ないし１０の水溶液に添加されたサンプルが実施例１と同様にＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法で解析された。前記内部標準物質は、配列番号１ないし１０のアミノ酸配列からなるペプチドのグリシン残基のうち４個が15Ｎで標識されたものが用いられた。得られたペプチドの同位体ピーク強度の比からソフトウェアＩＳＯＴＯＰＩＣＡ（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ－ｄｅ－Ｃｏｓｓｉｏ　Ｊら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　３２（Ｗｅｂ　Ｓｅｒｖｅｒ　ｉｓｓｕｅ）：Ｗ６７４、（２００４））を用いてペプチドの混合比が算出され、検量線が作成された。ＲＰ－ＨＰＬＣの画分の０．５μＬに同量のＣＨＣＡ（α－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸）がマトリックスとして添加され、実施例１と同様にＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法で解析された。目的のペプチドを含む画分のペプチドのピークパターンから、ＩＳＯＴＯＰＩＣＡを用いて内部標準物質と投与ペプチドとの混合比が算出され、前記検量線から尿検体中のペプチド濃度が計算された。前記尿検体の体積及びペプチド濃度に基づいて算出される尿中排泄量の投与量に対する百分率として尿中排泄率（％）が算定された。
　血液残存率の測定
　血液残存率が、ペプチド１、７及び８について測定された。簡潔には、血液が、ペプチド投与後２４時間のラットの頸静脈より採取され、遠心分離した血漿中のペプチド濃度がＨＰＬＣ－ＵＶ法を用いて測定された。血漿の処理では、ＴＦＡ１０μＬが血漿１００μＬに添加され、タンパク質が除去された。その後、遠心分離が、１０，０００×ｇ、４°Ｃで１０分間行われ、上清３０μＬがＨＰＬＣに供された。
　結果
　ペプチド１ないし１０をラット静脈内に投与し、投与後２４時間の尿中排泄率の結果が表３に示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　ペプチドの血液残存率の測定
　図３は、ペプチド１、７又は８を投与したラットにおけるペプチドの血液残存率（％）の測定結果を示したグラフである。各実験条件の誤差棒は同一条件で３ないし４回繰り返した実験結果の測定値の標準偏差を示す。ペプチド１の血液残存率（％）は、検出限界以下であった。ペプチド７の血液残存率（％）は１６％であった。ペプチド８の血液残存率（％）は１５％であった。ペプチド４の血液残存率（％）は０％であった（データは示されない。）。ペプチド７及び８は、ペプチド１ないし６と比較して、分子量が大きいため、尿中排泄率（％）が低下したと考えられた。
　動物に経静脈内に投与したペプチド１ないし８は未変化体としてほぼ定量的に尿中に排泄された。これに対してペプチド９及び１０は尿中に未変化体は検出されなかった。ペプチドは一般的に体内のプロテアーゼにより容易に分解されることが知られている。しかしペプチド１ないし８は、生分解を受けずにステルス性を反映する高い血液指向性と尿中排泄率の動態を示した。このような動態特性は、抗体などのタンパク質やリポソームなどのサイズの大きい薬物担体とも異なる、特異なものであった。なお、本実施例において、上記コラーゲン様ペプチドを投与した動物において有害事象が認められなかったので、本コラーゲン様ペプチドは安全性が高いことが示された。
　酸化ストレス検査薬としてのコラーゲン様ペプチドの使用
　目的
　生体の酸化ストレス検査薬としての有用性を評価するために、実施例４でステルス性を反映する血液指向性及び尿中排泄率が高いことが確認されたコラーゲン様ペプチドは、スピンラベル剤で標識された後に実験動物に投与された。前記有用性は、生体中における安定ラジカルの安定性、血液指向性及び尿中排泄を測定することによって評価された。
　材料及び方法
　スピンプローブ標識ペプチドの合成
　スピンプローブ標識剤（３－カルボキシＰＲＯＸＹＬ（シグマ　アルドリッチ　ジャパン合同会社））で標識したコラーゲン様ペプチド（以下、「ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド」という。）が合成された。簡潔には、実施例１と同様に、ＲＩＮＫ－アミド樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（メルク株式会社））上で、通常のＦｍｏｃ型固相合成法によりペプチド１１ないし１５が合成された。これに３－カルボキシＰＲＯＸＹＬ、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド、各５当量が、溶媒ジメチルホルムアミド中で、室温下、２時間反応させることにより、以下に記載のＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１ないし１５が合成された。なお、カルバモイルＰＲＯＸＹＬ（ＰＲＯＸＹＬ－carbamoyl、シグマ　アルドリッチ　ジャパン合同会社）（図面中で「Ｃｂ－ＰＲＯＸＹＬ」と記載。）が対照として用いられた。
　ペプチドの樹脂からの切り出し及び脱保護は、以下の手順で実行された。すなわち、それぞれのペプチド－樹脂（約０．１ｍｍｏｌ）が、氷冷下、蒸留水、ｍ－クレゾール、チオアニソール（各０．２５ｍＬ）、トリイソプロピルシラン（０．１２５ｍＬ）、トリフルオロ酢酸（４．１２５ｍＬ）と混合され、室温で１時間撹拌された。切り出されたペプチドは、約５倍容のエーテルを加えることにより沈澱された。ペプチドは、蒸留水に溶解され、高速液体クロマトグラフィーによって精製され、凍結乾燥された。
　ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１ないし１５は、それぞれ、配列番号１１ないし１５のアミノ酸配列からなるペプチドである。配列番号１１のアミノ酸配列は配列番号４のアミノ酸配列と同一である。ペプチド１１は、Ｐｒｏ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙからなる基本ユニットが連続して１０回繰り返された配列からなるペプチド１のカルボキシル末端がアミド化されたペプチドである。ペプチド１２は、アミノ末端がグリシンで、そのカルボキシル側にＰｒｏ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙからなる基本ユニットが連続して７回繰り返された配列が続き、さらに、Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｇｌｙが続き、そのカルボキシル末端がアミド化されたペプチドである。ペプチド１３は、アミノ末端がグリシンで、そのカルボキシル側にＰｒｏ－Ａｒｇ－Ｇｌｙが続き、そのカルボキシル側にＰｒｏ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙからなる基本ユニットが連続して７回繰り返された配列が続き、さらにそのカルボキシル側にシステインが続き、そのカルボキシル末端がアミド化されたペプチドである。ペプチド１４は、アミノ末端がグリシンで、そのカルボキシル側にＰｒｏ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙからなる基本ユニットが連続して７回繰り返された配列が続き、そのカルボキシル末端がアミド化されたペプチドである。ペプチド１５は、Ｐｒｏ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙからなる基本ユニットが連続して１０回繰り返された配列のうちアミノ末端から第５番目の基本ユニットがＰｒｏ－Ｈｙｐ－Ａｌａに置換された配列からなるペプチドのカルボキシル末端がアミド化されたペプチドである。
　ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１、１２、１４及び１５は、それぞれ、配列番号１１、１２、１４及び１５のカルボキシ末端のカルボキシル基がアミド化されたペプチジル基のアミノ末端に、ニトロキシド安定ラジカル標識剤で式９に示される３－カルボキシＰＲＯＸＹＬが縮合結合されたスピンプローブ標識化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１及び１５は、下記式１０で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１及び１５は、それぞれ配列番号１１及び１５のアミノ酸配列を有するコラーゲン様ペプチドのカルボキシ末端がアミド化され、かつ、該ペプチドのアミノ末端のプロリン残基の２級アミノ基にスピンプローブ標識剤である３－カルボキシＰＲＯＸＹＬが縮合結合した化合物であり、式１０におけるＲ9は、該ペプチドのアミノ末端のプロリン残基のカルボキシル基とペプチド結合する次のアミノ酸残基からカルボキシ末端までのペプチジル基を示す。
　下記式１１は、ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１２及び１４を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１２及び１４は、それぞれ配列番号１２及び１４のアミノ酸配列を有するコラーゲン様ペプチドのカルボキシ末端がアミド化され、かつ、該ペプチドのアミノ末端の１級アミノ基にスピンプローブ標識剤である３－カルボキシＰＲＯＸＹＬが縮合結合した化合物であり、式１１における－ＮＨ－Ｒ10は、配列番号１２又は１４のアミノ酸配列を有するコラーゲン様ペプチドのペプチジル基である。
　下記式１２は、ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１３を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１３は、それぞれ配列番号１３のアミノ酸配列を有するコラーゲン様ペプチドのカルボキシ末端のシステイン残基のカルボキシル基がアミド化され、かつ、該システイン残基のチオール基にスピンプローブ標識剤である３－カルバミドメチルＰＲＯＸＹＬが縮合結合した化合物であり、式１２におけるＲ11は、配列番号１３のアミノ酸配列を有するペプチドのアミノ末端から、カルボキシ末端のシステインに隣接したグリシン残基までのアミノ酸配列を有するペプチジル基を表す。
　ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１３は、ペプチド１３のシステインの側鎖末端に化学式（１）に示すＰＲＯＸＹＬ基が結合する。そこで、あらかじめシステインの－ＳＨ基がフリーであるペプチド１３前駆体が合成された。前記ペプチド１３前駆体は３－（２－ヨードアセトアミド）－ＰＲＯＸＹＬ（シグマ　アルドリッチ　ジャパン合同会社）を用いて、ＰＲＯＸＹＬ標識され、ＨＰＬＣで精製された。５０％エタノール、０．１％Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、５ｍＭ　ＥＤＴＡ中でペプチド１３前駆体に対して１０モル等量の３－（２－ヨードアセトアミド）－ＰＲＯＸＹＬが加えられ、室温で１時間反応された。ジチオスレイトールが３－（２－ヨードアセトアミド）－ＰＲＯＸＹＬに対して２モル等量加えられ、反応が終結された。目的物は、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ　５Ｃ18－ＡＲ－II（ナカライテスク株式会社）カラム、０．０５％ＴＦＡを含む水―アセトニトリルの直線グラジエントを用いるＲＰ－ＨＰＬＣにより精製され、凍結乾燥された。
　ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチドの３量体形成
　実施例２と同様に、ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１ないし１５の水溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を４°Ｃ、２４時間静置することにより、ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチドの３量体が形成された。
　ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチドの融解温度の測定
　ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１ないし１５の３量体を蒸留水に１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した標品溶液が用意された。融解温度（３重らせんからランダムコイルへの転移）が、実施例２と同様の条件で前記溶液の温度を上昇させながら、２２５ｎｍの正のコットン効果の楕円率の変化に基づいて測定された。
　投与液の調製、動物への投与及び尿の採取
　ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチドの３量体の５０μＭ、１００μＭ及び２００μＭのＰＢＳ溶液が調製された。実験動物として、６週齢の雄性ｄｄｙマウス（清水実験材料株式会社、体重２９．６－３８．７ｇ）が投与条件ごとに８匹用意された。５０μＭの投与液（マウス１匹あたり０．１ｍＬ）が尾静脈から急速投与された（投与量：５ｎｍｏｌ／マウス１匹）。投与後６時間までの尿が回収され、ポア径０．４５μｍのフィルターで濾過後、得られた尿検体はＥＳＲによる定量分析に使用するまで－２０°Ｃで保存された。
　尿試料の前処理
　ＰＢＳで溶解された１．０ｍＭの原液から、ＰＢＳによる希釈系列が調製された。
　検量線用標準試料
　次にＰＢＳによる標準液が、ペプチドを投与されないマウスの尿を用いて希釈され、検量線用の希釈系列が調製された。ここで、尿中濃度の検量線用標準試料は、ＰＢＳ標準液：マウスブランク尿＝１：９の容積比で混合された。
　Ｘ－バンドＥＳＲ法による定量分析
　サンプル内容量が１００μＬの濾過された尿サンプルがフラット石英セル（日本電子株式会社）に封入され、尿中のＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド濃度が定量された。
　ＥＳＲの測定条件は以下の条件で行われた。
ＥＳＲ測定装置：Ｘ－バンド電子スピン共鳴装置（日本電子株式会社、ＲＥ－３Ｘ型）
磁気フィールド：３２０．７±５．０ｍＴ
変調幅：０．１ｍＴ
掃引時間：２．０分
時間定数：０．０３秒
積算：３回
Ｇａｉｎ：２００
マイクロ波出力：１０．０ｍＷ
マイクロ波周波数：９．４５ＧＨｚ
測定温度：２３°Ｃ
ＰＲＯＸＹＬのニトロキシド安定ラジカル由来の３本のＥＳＲ信号における低磁場側から２番目のピーク値が、外部標準であるＭｎ2+由来のＥＳＲピーク値に対する相対比（Ｓ／Ｍ比）で表示され、ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド濃度と前記相対比（Ｓ／Ｍ比）とを用いて検量線が作成された。
　生体内で還元されたＰＲＯＸＹＬは、フェリシアン化カリウムで再酸化して定量された。フェリシアン化カリウムで酸化する場合は、尿サンプル１．０ｍＬに１００ｍＭフェリシアン化カリウム１０μＬ（フェリシアン化カリウムの最終濃度は１．０ｍＭ）が添加され、同様に測定された。
　結果
　ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチドの融解温度
　ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１ないし１５の融解温度が表５に示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　表４に示すとおり、ＰＲＯＸＹＬ標識コラーゲン様ペプチドの融解温度は、２９．０°Ｃから５８．０°Ｃまでの範囲である。実施例２で融解温度が測定されたペプチド４をＰＲＯＸＹＬ標識したペプチドがＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１である。そこで表２と表５とを比較すると、６６．０°Ｃから５８．０°ＣにＰＲＯＸＹＬ標識により融解温度が低下した。
　ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチドの安定ラジカル体及び還元体の尿中排泄率
　表５にＰＲＯＸＹＬ標識ペプチドの尿中排泄率の測定結果が示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
　ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチドの中で、ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１及び１２は、未変化体のままで、投与量のほぼ１００％が尿中に排泄された。ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１３及び１４は、未変化体の尿中排泄率が５０～７０％であったが、還元体をあわせた合計の排泄率は、投与量の９０％以上であった。一方、ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１５は、未変化体の排泄率が２０％、還元体をあわせた合計の排泄率でも３０％以下であった。対照として使用したカルバモイルＰＲＯＸＹＬは、未変化体の排泄率が６％、還元体をあわせた合計の排泄率は９％であった。
　以上の結果から、ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチドの動態は、実施例４及び５で示された血液指向性及び高い尿排泄性のコラーゲン様ペプチドの動態特性に依存する結果となった。
　ＰＲＯＸＹＬ－ＰＥＧ５０００の尿排泄性試験
　材料及び方法
　ＰＲＯＸＹＬ－ＰＥＧ５０００の合成
　メトキシＰＥＧ５０００－アミン（シグマ　アルドリッチ　ジャパン合同会社）４．８４ｍｇを、それぞれ５モル等量の３－カルボキシＰＲＯＸＹＬ（シグマ　アルドリッチ　ジャパン合同会社）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール、及び、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミドとともに溶媒ジメチルホルムアミド中で２時間室温で反応させた。反応終了後、アミノ基の消失がニンヒドリン反応によって確認された。冷エーテルで析出した沈殿（ＰＲＯＸＹＬ－ＰＥＧ５０００）は、エーテル及びイソプロパノールで各５回ずつ洗浄された。沈殿は水に溶解され、凍結乾燥された。その後、生成物は、実施例１で説明されたＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法で解析された。
　尿中排泄率の測定
　尿中排泄率は、原則として実施例５で説明された方法に従って測定された。簡潔には、ＰＲＯＸＹＬ－ＰＥＧ５０００がＰＢＳに溶解され、５０μＭ　ＰＲＯＸＹＬ－ＰＥＧ５０００の投与液２ｍＬが調製された。マウス１匹あたり、前記投与液０．１ｍＬが、尾静脈内に投与された（投与量：５ｎｍｏｌ／匹）。８匹のマウスが本実験では使用され、１ケージあたり２匹のマウスが飼育された。尿が投与後６時間に回収され、ポア径０．４５μｍのフィルターで濾過された。定量は１０μＬキャピラリー２本を用いてＸ－ｂａｎｄ　ＥＳＲ装置で行われた。検量線は、１μＭ、２．５μＭ及び５μＭの健常マウスの尿（対照）を用いて作成された。未変化体＋還元体はフェリシアン化カリウムを添加して測定された。
　結果
　図４は、ＰＲＯＸＹＬ－ＰＥＧの未変化体の尿中排泄率（％）、及び、未変化体＋還元体の尿中排泄率（％）の測定結果を示すグラフである。各実験条件の誤差棒は同一条件で４回繰り返した実験結果の測定値の標準偏差を示す。未変化体の尿中排泄率（％）は約２０％であり、未変化体＋還元体の尿中排泄率（％）は約２５％であった。ＰＲＯＸＹＬ－ＰＥＧ５０００の尿中排泄率（％）はＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１０ないし１３の尿中排泄率（％）と比較して著しく低くかった（表５を参照せよ。）。また、ＰＲＯＸＹＬ－ＰＥＧ５０００の尿中排泄率（％）はＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１４の尿中排泄率（％）よりもより低かった（表５を参照せよ。）。したがって、本発明のコラーゲン様ペプチドは、従来の送達システムと比較して、ステルス性かつ高尿排泄性の担体であることが明らかになった。
　酸化ストレス応答プローブとしてのインビトロの反応性試験（１）
　材料及び方法
　ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて２０μＭに調製したＰＲＯＸＹＬ－（Ｐｒｏ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ）10の１００μＬが、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて各濃度（０．２、２．０ｍＭ）に調製した２，２’－ａｚｏｂｉｓ（２－ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅ）ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＡＡＰＨ、シグマ　アルドリッチ　ジャパン合同会社）の１００μＬと混合され、３７°Ｃで６時間反応させた。
　ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチドによる酸化ストレスの測定
　Ｘ－ｂａｎｄ　ＥＳＲ装置により、経時的（反応開始から０、３０、６０、９０、１２０、２４０、３６０分）にＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１のＥＳＲスペクトル及び信号強度を測定し、測定された信号強度の減少を利用して、ＡＡＰＨ由来のペルオキシルラジカル種（ＲＯＯ・）とＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１との反応性（酸化ストレス応答性）が評価された。同様の実験が、カルバモイルＰＲＯＸＹＬ単体でも行われ、反応性が比較された。
　結果
　図５は、ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１（最終濃度１０μＭ）又はカルバモイルＰＲＯＸＹＬ（Ｃｂ－ＰＲＯＸＹＬ）（最終濃度１０μＭ）と、ＡＡＰＨ（最終濃度１００μＭ）とを反応させた場合のＥＳＲの信号強度の経時的な変化を示すグラフである。縦軸は反応開始時のＥＳＲ信号強度を対照としたときのＥＳＲ信号強度の相対値の百分率を表し、横軸は反応時間（単位は時間）を表す。黒丸（●）は１００μＭのＡＡＰＨと反応させた１０μＭのＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１の各反応時間でのＥＳＲ信号強度の相対値を表し、白丸（○）は１００μＭのＡＡＰＨと反応させた１０μＭのカルバモイルＰＲＯＸＹＬの各反応時間でのＥＳＲ信号強度の相対値を表す。ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１（最終濃度１０μＭ）又はカルバモイルＰＲＯＸＹＬ（最終濃度１０μＭ）と、最終濃度が１００μＭのＡＡＰＨとを反応させた場合、反応開始から２時間までＥＳＲの信号強度は減少することなく安定に存在した。図６は、ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１（最終濃度１０μＭ）又はカルバモイルＰＲＯＸＹＬ（Ｃｂ－ＰＲＯＸＹＬ）（最終濃度１０μＭ）と、ＡＡＰＨ（最終濃度１ｍＭ）とを反応させた場合のＥＳＲの信号強度の経時的な変化を示すグラフである。縦軸は反応開始時のＥＳＲ信号強度を対照としたときのＥＳＲ信号強度の相対値の百分率を表し、横軸は反応時間（単位は時間）を表す。黒丸（●）は１ｍＭのＡＡＰＨと反応させた１０μＭのＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１の各反応時間でのＥＳＲ信号強度の相対値を表し、白丸（○）は１ｍＭのＡＡＰＨと反応させた１０μＭのカルバモイルＰＲＯＸＹＬの各反応時間でのＥＳＲ信号強度の相対値を表す。ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１（最終濃度１０μＭ）又はカルバモイルＰＲＯＸＹＬ（最終濃度１０μＭ）と、最終濃度が１ｍＭのＡＡＰＨとを反応させた場合、反応開始から６時間で、ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１のＥＳＲ信号強度は反応開始前の６９％まで減少し、カルバモイルＰＲＯＸＹＬのＥＳＲ信号強度は反応開始前の５０％まで減少した。
　酸化ストレス応答プローブとしてのインビボの反応性試験（１）
　ＡＡＰＨのＬＤ50
　予備検討としてＡＡＰＨのＬＤ50を求めた。ＡＡＰＨを腹腔内に投与（２５、５０、７５、１００ｍｇ／ｋｇ）したマウスの１２時間後の生存判定試験から、ＡＡＰＨのＬＤ50は１００ｍｇ／ｋｇであった。
　尿中排泄率の定量
　マウスの１００％生存率が確認されたうちで、ＡＡＰＨの最高投与量は５０ｍｇ／ｋｇであった。ＡＡＰＨは５０ｍｇ／ｋｇで腹腔内に投与された。また、ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１がマウス１匹あたり５ｎｍｏｌで尾静脈内に投与された。６時間後、尿中排泄量はＸ－ｂａｎｄ　ＥＳＲ装置を用いて定量され、尿中排泄率が定量結果及び投与量に基づいて求められた。
　結果
　図７は、ＡＡＰＨ投与マウスにおける未変化体の尿中排泄率と、未変化体及び還元体の尿中排泄率とを示すグラフである。縦軸は、尿中排泄率、すなわち、投与量に対する尿中排泄量の百分率（％）を表す。左の棒グラフは未変化体（unchanged）だけの尿中排泄率を表し、右の棒グラフは未変化体及び還元体の和（unchanged+reduced）を表す。誤差棒は、同一条件の実験を３回繰り返した測定値の標準偏差を表す。アスタリスク（＊）はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－検定でｐ値が５％未満であることを示す。ＡＡＰＨを投与しない健常マウスにおいて、ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１は尾静脈内投与後６時間で未変化体の尿中排泄率はほぼ１００％であった。ＡＡＰＨ投与マウスにおいてＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１の未変化体の尿中排泄率は低下し、５９％であった。これに伴って、ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１の還元体の尿中排泄率（３３％）が増加し、ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１の未変化体及び還元体の合計による尿中排泄率は９２％であった。
　また、本実施例の薬物担体に生物活性基の一つであるＰＲＯＸＹＬ基が結合した化合物を投与した動物では有害事象が認められなかったため、本実施例の薬物担体に生物活性基が結合した化合物の高い安全性が示された。
　本実施例で示されたとおり、本実施例の薬物担体に生物活性基が結合した化合物は投与された生体内の酸化ストレス状態を反映して還元体として排泄されるので、優れた酸化ストレス応答プローブとなり得ることが示された。
　酸化ストレス応答プローブとしてのインビトロの反応性試験（２）
　材料及び方法
　２０μＭ　ＰＲＯＸＹＬ－（Ｐｒｏ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ）10　１００μＬが、４．０ｍＭ　２，２’－ａｚｏｂｉｓ（２－ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅ）ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＡＡＰＨ、シグマ　アルドリッチ　ジャパン合同会社）５０μＬと、８０μＭ　硫酸第一鉄（ＦｅＳＯ4、和光純薬工業株式会社）５０μＬとともに混合され、３７°Ｃで６時間反応させた。
　ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチドによる酸化ストレスの測定
　Ｘ－ｂａｎｄ　ＥＳＲ装置により、経時的（反応開始から０、３０、６０、９０、１２０、２４０、３６０分）にＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１のＥＳＲスペクトル及び信号強度を測定し、測定された信号強度の減少から鉄（ＩＩ）イオンの共存下で生成が促進されるＡＡＰＨ由来のペルオキシルラジカル種（ＲＯＯ・）とＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１との反応性（酸化ストレス応答性）が評価された。同様の実験が、カルバモイルＰＲＯＸＹＬ単体でも行われ、反応性が比較された。
　図８は、ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１（最終濃度１０μＭ）又はカルバモイルＰＲＯＸＹＬ（Ｃｂ－ＰＲＯＸＹＬ）（最終濃度１０μＭ）と、ＡＡＰＨ（最終濃度１ｍＭ）と、硫酸第一鉄（最終濃度２０μＭ）とを温度２３°Ｃで反応させた場合のＥＳＲの信号強度の経時的な変化を示すグラフである。縦軸は反応開始時のＥＳＲ信号強度を対照としたときのＥＳＲ信号強度の相対値の百分率を表し、横軸は反応時間（単位は時間）を表す。黒丸（●）はＡＡＰＨ及び硫酸第一鉄と反応させたＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１の各反応時間でのＥＳＲ信号強度の相対値を表し、白丸（○）はＡＡＰＨ及び硫酸第一鉄と反応させたカルバモイルＰＲＯＸＹＬの各反応時間でのＥＳＲ信号強度の相対値を表す。ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１（最終濃度１０μＭ）又はカルバモイルＰＲＯＸＹＬ（最終濃度１０μＭ）と、ＡＡＰＨ（最終濃度１ｍＭ）と、硫酸第一鉄（最終濃度２０μＭ）とを反応させた場合、反応開始から６時間で、ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１（黒丸（●））のＥＳＲ信号強度は反応開始前の３８％まで減少し、同様にカルバモイルＰＲＯＸＹＬ（白丸（○））のＥＳＲ信号強度は反応開始前の１３％まで減少した。
　ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１（最終濃度１０μＭ）又はカルバモイルＰＲＯＸＹＬ（最終濃度１０μＭ）と、鉄（ＩＩ）イオン非共存下でＡＡＰＨ（最終濃度１ｍＭ）とを反応させた場合、反応開始から６時間で、ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１のＥＳＲ信号強度は反応開始前の６９％まで減少し、カルバモイルＰＲＯＸＹＬのＥＳＲ信号強度は反応開始前の５０％まで減少した（図６を参照せよ。）。ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１（最終濃度１０μＭ）又はカルバモイルＰＲＯＸＹＬ（最終濃度１０μＭ）と、鉄（ＩＩ）イオン共存下でＡＡＰＨ（最終濃度１ｍＭ）とを反応させた場合、反応開始から６時間で、ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１のＥＳＲ信号強度は反応開始前の３８％まで減少し、カルバモイルＰＲＯＸＹＬのＥＳＲ信号強度は反応開始前の１３％まで減少した（図８を参照せよ。）。したがって、遷移金属イオンが存在するインビトロの反応条件下ではＡＡＰＨのラジカル生成が促進され、ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１及びカルバモイルＰＲＯＸＹＬの反応性が増大することが示された。
　酸化ストレス応答プローブとしてのインビボの反応性試験（２）（劇症肝炎モデル）
　材料及び方法
　劇症肝炎モデルマウスの作製
　ＧａｌＮ投与液が、Ｄ－ガラクトサミン塩酸塩（ＧａｌＮ、ナカライテスク株式会社）を生理食塩水に溶解して調製された。ＬＰＳ投与液が、大腸菌由来のリポ多糖（ＬＰＳ、シグマ　アルドリッチ　ジャパン合同会社）を生理食塩水に溶解して調製された。ＧａｌＮ及びＬＰＳの投与では、前記投与液は以下の条件で用いられた。対照として、ＧａｌＮ及びＬＰＳの代わりに、生理食塩水が投与された。ＧａｌＮ（１７５０ｍｇ／ｋｇ）は１２時間絶食下のｄｄｙマウス（雄性、６週齢、体重３０ｇ、清水実験材料株式会社）の腹腔内に投与された。このＧａｌＮ投与時が０時間と設定された。ＧａｌＮ投与後０．５時間で、ＬＰＳ（５０μｇ／ｋｇ）が腹腔内に投与された。
　血漿の調製、及び、血漿中のＡＬＴ及びＡＳＴの活性測定
　ＧａｌＮ投与後６時間で、眼窩採血がＥＤＴＡで処理したシリンジを用いて行われた。眼窩採血後、遠心分離が４°Ｃ、８００×ｇの条件下で１分間行われた。上清が血漿として回収された。血漿回収後に、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の活性が生化学自動分析装置（富士ドライケム、ＤＲＩ－ＣＨＥＭ　４０００　ＳＶ、富士フイルム株式会社）で測定された。
　尿中排泄率の測定
　尿中排泄率は、原則として実施例５で説明された方法に従って測定された。簡潔には、マウス１匹あたり５ｎｍｏｌのＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１が尾静脈内に投与された。６時間後、尿中排泄量がＸ－ｂａｎｄ　ＥＳＲ装置によって測定された。なお、カルバモイルＰＲＯＸＹＬ（ＰＲＯＸＹＬ－carbamoyl、シグマ　アルドリッチ　ジャパン合同会社）が対照として用いられた。
　結果
　図９は、ＧａｌＮ及びＬＰＳ投与マウスにおける血漿中のＡＬＴ及びＡＳＴの活性を示すグラフである。各実験条件の誤差棒は同一条件で４回繰り返した実験結果の測定値の標準偏差を示す。アスタリスク（＊＊）はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－検定でｐ値が１％未満であることを示す。ＡＬＴの活性は、ＧａｌＮ投与後０時間では約４０（Ｕ／Ｌ）であり、ＧａｌＮ投与後６時間では約１３０（Ｕ／Ｌ）であった。ＡＳＴの活性は、ＧａｌＮ投与後０時間では約４０（Ｕ／Ｌ）であり、ＧａｌＮ投与後６時間では約１３０（Ｕ／Ｌ）であった。したがって、劇症肝炎モデルマウスでは、酸化ストレスが増大されていることが明らかとなった。なお、ＧａｌＮ投与後２４～４８時間で、劇症肝炎モデルマウスの致死率は８０％であった。
　図１０は、ＧａｌＮ及びＬＰＳ投与マウスにおける未変化体の尿中排泄率と、未変化体及び還元体の尿中排泄率とを示すグラフである。縦軸は、尿中排泄率（％）、すなわち、投与量に対する尿中排泄量の百分率（％）を表す。左の棒グラフは未変化体（unchanged）だけの尿中排泄率を表し、右の棒グラフは未変化体及び還元体の和（unchanged+reduced）を表す。誤差棒は、同一条件の実験を３回繰り返した測定値の標準偏差を表す。アスタリスク（＊）はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－検定でｐ値が５％未満であることを示す。
　劇症肝炎を発症しない健常マウスにおいて、ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１は尾静脈内投与後６時間で未変化体の尿中排泄率はほぼ１００％であった。劇症肝炎を発症したマウスにおいてＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１の未変化体の尿中排泄率は低下し、７３％であった。これに伴って、ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１の還元体の尿中排泄率（２０％）が増加し、ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１の未変化体及び還元体の合計による尿中排泄率は９３％であった。なお、ＬＰＳのみを投与したマウスでは、ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１の未変化体の尿中排泄率は約９０％であった（データは示されない。）。また、カルバモイルＰＲＯＸＹＬは、健常マウスにおいても未変化体と還元体の合計による尿中排泄率は非常に低く、９％であった（データは示されない。）。したがって、本発明のペプチドは、インビボで酸化ストレスの程度及び変化を低侵襲的に高感度に評価できる一方、カルバモイルＰＲＯＸＹＬはインビボで酸化ストレスの程度及び変化を高感度に評価できないことが明らかとなった。
　ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド以外のプローブの開発
　材料及び方法
　５－カルボキシフルオレセイン、サクシニミジル　エステル（インビトロジェン、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）及びＦｍｏｃ－βアラニン（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、メルク株式会社）が購入され、実験に供された。フルオレセイン－βアラニン－（Ｐｒｏ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ）10ペプチド（フルオレセイン標識ペプチド）が合成され、５μＭのフルオレセイン標識ペプチド溶液が調製された。簡潔には、最初に、βアラニン－（Ｐｒｏ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ）10ペプチドが実施例１で説明された方法に従って合成された。βアラニン－（Ｐｒｏ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ）10ペプチドは、６Ｍグアニジン塩酸塩を含むリン酸緩衝液（１５０ｍＭ、ｐＨ７）に溶解され、βアラニン－（Ｐｒｏ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ）10ペプチド溶液（２８．５ｍｇ／ｍＬ）が調製された。５－カルボキシフルオレセイン、スクシンイミジル　エステル（５－ＦＡＭ、ＳＥ）がジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解され、５－カルボキシフルオレセイン溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）が調製された。βアラニン－（Ｐｒｏ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ）10ペプチド溶液と、５－カルボキシフルオレセイン溶液とが、それぞれ、２：５の容積比（５－カルボキシフルオレセインはβアラニン－（Ｐｒｏ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ）10ペプチドに対して５等量）で混合された後、７０°Ｃで５～６時間攪拌された。反応の完結がＨＰＬＣで確認された後、フルオレセイン標識ペプチドはセファデックスＧ－１５を用いたゲル濾過法で単離された。質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）及び円２色性スペクトル測定（実施例１を参照せよ。）が、フルオレセイン標識ペプチドに対して行われた。
　ＡＡＰＨ投与によって惹起される酸化ストレスに対して、フルオレセイン標識ペプチドの酸化ストレス検出剤としての有用性が検討された。実施例８と同様に、ＡＡＰＨ５０ｍｇ／ｋｇが腹腔内に前投与された。また、５μＭのフルオレセイン標識ペプチド溶液は、ｄｄｙマウス（雄性、６週齢、体重３０ｇ）の尾静脈内に急速投与された（マウス１匹あたりの投与量は０．５ｎｍｏｌである。）。対照として、フルオレセイン単体にＰＢＳを添加して調製した５μＭのフルオレセイン溶液がＡＡＰＨ投与群、及び、ＡＡＰＨ非投与群のいずれの実験群に対して投与された。投与後６時間まで、尿が採取された。尿が３，０００×ｇで１０分間遠心分離され、上清が回収された。前記上清はポア径０．４５μｍのフィルターで濾過された後、凍結後、－２０°Ｃで保存された。尿は解凍され、２０°Ｃ、４，０００×ｇで遠心分離された。上清が回収され、ＲＰ－ＨＰＬＣに供された。ＲＰ－ＨＰＬＣでは、オートサンプラー（ＳＩＬ－２０Ａ／２０ＡＣ、株式会社　島津製作所）が以下の条件で用いられた。
　ＲＰ－ＨＰＬＣの条件
　カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ　５Ｃ18－ＡＲ－II（１ｘ１５０ｍｍ、ナカライテスク株式会社）
　カラム温度：６０°Ｃ
　送液速度：１．０ｍＬ／分
　溶媒：Ａ液　０．１％　ＴＦＡ／水、Ｂ液　０．１％　ＴＦＡ／アセトニトリル
　グラジエント溶出：１０－３０％　Ｂ／０－３０分
　蛍光励起波長：４９０ｎｍ、蛍光検出波長：５２０ｎｍ
　インジェクション量：１０μＬ
　結果
　図１１は、フルオレセイン標識ペプチドを示す構造式である。フルオレセイン標識ペプチドは、Ｐｒｏ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙからなる基本ユニットが連続して１０回繰り返された配列からなるペプチド１のアミノ末端がベータ－アラニンで修飾され、さらに該ベータ－アラニンのアミノ末端がフルオレセインで修飾されたペプチドである。
　図１２は、フルオレセイン標識ペプチドの円２色性スペクトルを表す波形図である。波形図は、２２５ｎｍに正のピークを有する典型的なコラーゲン３重らせん構造のスペクトルパターンを示し、この３重らせん構造は３７°Ｃで安定であることが確認された。
　図１３は、ＡＡＰＨ非投与マウス及びＡＡＰＨ投与マウスにおけるフルオレセイン標識ペプチド及びフルオレセインの各未変化体の尿中排泄率（％）の測定結果を示すグラフである。各実験条件の誤差棒は同一条件で３回（フルオレセイン単体）もしくは４回（フルオレセイン標識ペプチド）繰り返した実験結果の測定値の標準偏差を示す。アスタリスク（＊＊）はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－検定でｐ値が１％未満であることを示す。未変化体の尿中排泄率（％）はフルオレセイン標識ペプチドでは約７１％であり、フルオレセインでは約４９％であった。この結果から、フルオレセイン標識ペプチドは、ステルス性及び高尿排泄性を有する一方、フルオレセイン単体では、ステルス性及び高尿排泄性を有しないことが示された。また、フルオレセイン標識ペプチドの未変化体の尿中排泄率（％）は、ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１３ないし１５よりも高かった（表５を参照せよ。）。
　さらに、本結果において、フルオレセイン標識ペプチド投与群では、ＡＡＰＨの前投与によりフルオレセインは酸化ストレスに感応し、尿中に回収されたフルオレセイン標識ペプチド未変化体は、ＡＡＰＨ非投与群と比較し、統計学的に有意な低下を示した。一方、フルオレセイン単体を投与した実験群では、ＡＡＰＨ前投与の影響を認めなかった。本結果より、フルオレセイン標識ペプチドは、酸化ストレス検出剤として有用であることが示された。
　これらの結果は、本発明のコラーゲン様ペプチドは、ＰＲＯＸＹＬやフルオレセイン以外の化合物又は薬物活性基と組み合わせて酸化ストレスをはじめとした生体機能及び生体状態の検出並びに診断に用いることができることを示すものである。したがって、生体イメージング、生体機能測定等は、目的に応じて、本発明のコラーゲン様ペプチドと、イメージング、評価及び／又は診断するための薬剤又は生物活性基（例えば、蛍光、発光、放射線、磁気共鳴等のシグナル発生物質）とを組合せることによって達成できることが示された。
　以上の実施例の結果は、本発明のコラーゲン様ペプチドは、ＰＲＯＸＹＬやフルオレセイン以外の化合物又は薬物活性基と組み合わせて酸化ストレスをはじめとした生体機能及び生体状態の検出並びに診断に用いることができることを示すものである。したがって、生体イメージング、生体機能測定等は、目的に応じて、本発明のコラーゲン様ペプチドと、イメージング、評価及び／又は診断するための薬剤又は生物活性基（例えば、蛍光、発光、放射線、磁気共鳴等のシグナル発生物質）とを組合せることによって達成できることが示された。

Claims (10)

  1. 　ステルス性かつ高尿排泄性であることを特徴とする、コラーゲン様ペプチド。
  2. 　生物活性基Ｒが、下記式１で表されるペプチドのペプチジル基に、アミド結合又はリンカーＺを介して結合していることを特徴とする、請求項１に記載のコラーゲン様ペプチド。
    　　（化１）
    　(Pro-Hyp-Gly)l-(X-Y-Gly)m-(Pro-Hyp-Gly)n　　　(1)
    　
    　式中、Ｘ及びＹは任意のアミノ酸を表し、主鎖のカルボキシ末端はアミド化されていてもよく、ｌ及びｎは０以上の整数であり、ｍは０ないし３であり、かつ、７≦（ｌ＋ｍ＋ｎ）≦１１である。
  3. 　前記生物活性基Ｒは、酸化ストレスに感応可能な酸化ストレス感応基であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のコラーゲン様ペプチド。
  4. 　下記式２で表されるペプチドであることを特徴とする、請求項１ないし３に記載のコラーゲン様ペプチド。
    　　（化２）
    　R-[(Pro-Hyp-Gly)l-(X-Y-Gly)m-(Pro-Hyp-Gly)n]　　　(2)
    　
    　式中、Ｒはフルオレセイン又はＰＲＯＸＹＬ基を表す。
    　ｌ及びｎは０以上の整数であり、ｍは０ないし３であり、かつ、７≦（ｌ＋ｍ＋ｎ）≦１１である。
  5. 　下記式３で表されるペプチドであることを特徴とする、請求項１ないし３に記載のコラーゲン様ペプチド。
    　　（化３）
    　R-Z-[(Pro-Hyp-Gly)l-(X-Y-Gly)m-(Pro-Hyp-Gly)n]　　　(3)
    　
    　式中、Ｒはフルオレセイン又はＰＲＯＸＹＬ基を表す。
    　Ｚは、β－アラニン、グリシン、又はシステインを表す。
    　ｌ及びｎは０以上の整数であり、ｍは０ないし３であり、かつ、７≦（ｌ＋ｍ＋ｎ）≦１１である。
    　
  6. 　前記式（１）のペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１ないし６、及び、１１ないし１４からなる群から選択されるいずれか１つであることを特徴とする、請求項１ないし５に記載のコラーゲン様ペプチド。
  7. 　請求項１ないし６に記載の少なくとも１つのコラーゲン様ペプチドを有効成分として含有することを特徴とする、医薬組成物。
  8. 　生体内の酸化ストレスを検出又は診断するために用いられることを特徴とする、請求項７に記載の医薬組成物。
  9. 　前記生体内の酸化ストレスを検出又は診断が、放射線障害、劇症肝炎、アナフィラキシーショック、アテローム動脈硬化症、狭心症、心筋梗塞、アルツハイマー病、又は、パーキンソン病に用いられることを特徴とする、請求項８に記載の医薬組成物。
  10. 　磁気共鳴造影剤であることを特徴とする、請求項９に記載の医薬組成物。
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