JP2015091760A - コラーゲン様ペプチドからなる薬物担体 - Google Patents

Abstract

【課題】ステルス性であって、かつ、尿排泄性が高い薬物担体を開発すること。
【解決手段】本発明のステルス性かつ高尿排泄性の薬物担体は、第１番目のトリペプチド配列（Ｘ１−Ｙ１−Ｇｌｙ）と、・・・、第i番目のトリペプチド配列（Ｘｉ−Ｙｉ−Ｇｌｙ）と、・・・、第ｎ番目のトリペプチド配列（Ｘｎ−Ｙｎ−Ｇｌｙ）とを含むアミノ酸配列を含み、３重らせん構造を形成する。（ここで、ｉ及びｎは整数で、１＜ｉ＜ｎであり、ｎ≧７であって、Ｘ１、・・・、Ｘｉ、・・・Ｘｎのアミノ酸は独立に選択され、Ｙ１、・・・、Ｙｉ、・・・Ｙｎのアミノ酸も独立に選択される。）前記基本ユニットは連続して繰り返される場合がある。本発明の医薬組成物は本発明の薬物担体に薬物が結合した化合物を含む。
【選択図】なし

Description

本発明は、コラーゲン様ペプチドからなる薬物担体と、これを利用する医薬組成物とに関する。具体的には、コラーゲン様ペプチドからなるステルス性かつ高尿排泄性の薬物担体と、該薬物担体に薬物が結合した化合物を含む医薬組成物とに関する。

標的の臓器に薬物を送達したり、薬物の体内での動態を制御したりするための薬物送達システムの開発は、創薬の一分野をなす重要な領域である。これまでに、リポソーム、デンドリマー、ペプチド超分子、無機ナノ粒子等のさまざな薬物担体が開発されている（非特許文献１−４）。一般に、これら比較的大きなサイズの薬物担体は細網内皮系細胞に捕捉され、分解をうけやすい。これに対し、薬物担体の表面を修飾処理すると、細網内皮系細胞に捕捉されにくくすることができる。薬物担体についてステルス性とは、細網内皮系細胞に捕捉されにくい性質をいう。例えば、一定のサイズのリポソームの表面をポリエチレングリコールで修飾することによって、ステルス性リポソームを作成することができる。ところが、かかるステルス性リポソームは腎臓の糸球体から濾過されるにはサイズが大きすぎるため、尿排泄性が低い（非特許文献５−７）。腎障害を有する患者での薬物の使用、あるいは、通常の診断薬等の使用においては、投与後長時間生体内に滞留することにより副作用を惹起する可能性がある。ステルス性であって、かつ、薬物の尿中排泄性が高い薬物担体はいままでに知られていなかった。

Ｎｉｓｈｉｙａｍａ， Ｎ．ら、Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ，２６：２９（２０１１）． Ｍａｔｓｕｍｕｒａ， Ｙ．、Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ ２６：２０（２０１１）． Ｍａｒｔｉｎ， Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２：２９（２００３）． Ｔａｋａｋｕｒａ， Ｙ．ら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１３：７１（２００１）． Ｓｚｅｂｅｎｉ， Ｊ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，６３：１０２０（２０１１）． Ｊｉａｎｇ，Ｗ．ら、Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ，３，３３３（２０１１）． Ｇｒｅｎａｄｅｒ， Ｔ．ら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ，２１：８６８（２０１０）．

そこで、ステルス性であって、かつ、尿排泄性が高い薬物担体を開発する必要がある。

本発明は、第１番目のトリペプチド配列（Ｘ１−Ｙ１−Ｇｌｙ）と、・・・、第i番目のトリペプチド配列（Ｘｉ−Ｙｉ−Ｇｌｙ）と、・・・、第ｎ番目のトリペプチド配列（Ｘｎ−Ｙｎ−Ｇｌｙ）とを含むアミノ酸配列を含み、投与される動物種の体温で３重らせんを形成するペプチドからなる、ステルス性かつ高尿排泄性の薬物担体を提供する。（ここで、ｉ及びｎは整数で、１＜ｉ＜ｎであり、ｎ≧７であって、Ｘ１、・・・、Ｘｉ、・・・Ｘｎのアミノ酸は独立に選択され、Ｙ１、・・・、Ｙｉ、・・・Ｙｎのアミノ酸も独立に選択される。）

本発明の薬物担体において、前記アミノ酸配列はＸ−Ｙ−Ｇｌｙからなる基本ユニットが７回又は８回以上繰り返されたアミノ酸配列の場合がある。（ここでＸ及びＹは独立に選択される任意のアミノ酸である。）

本発明の薬物担体において、前記基本ユニットのアミノ酸配列はＰｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙの場合がある。

本発明の薬物担体において、前記基本ユニットは連続して繰り返される場合がある。

本発明の薬物担体において、本発明の前記ペプチドはプロリン残基のヒドロキシル化以外の修飾を受ける場合がある。

本発明の薬物担体において、前記ペプチドは配列番号１ないし６、及び、９ないし１２からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列の場合がある。

本発明の薬物担体は、薬物の送達に用いられる場合がある。

本発明の薬物担体において、前記薬物は、治療及び／又は診断のための医薬の場合がある。

本発明の薬物担体において、前記ペプチドはホモ又はヘテロ３量体の場合がある。

本発明は、前記薬物担体に薬物が結合した化合物を含む医薬組成物を提供する。

本発明の医薬組成物は、イメージングのために用いられる場合がある。

本発明の医薬組成物は、生体機能測定のために用いられる場合がある。

本発明の医薬組成物において、前記生体機能測定は、酸化ストレスの測定の場合がある。そこで、本発明は酸化ストレス検査用の医薬組成物を提供する。本発明の酸化ストレス検査用の医薬組成物は、本発明の薬物担体に酸化ストレスに鋭敏に反応する標識剤が結合した化合物を含む。前記酸化ストレスに鋭敏に反応する標識剤は、スピンプローブ標識剤と、蛍光標識剤とを含むが、これらに限定されない。前記酸化ストレスに鋭敏に反応する蛍光標識剤は、アクリジン誘導体及びフルオレセイン誘導体蛍光物質を含むが、これらに限定されない。

本発明はステルス性かつ高尿排泄性の薬物担体と薬物とが結合した化合物を投与するステップを含む、薬物を送達させる方法を提供する。前記薬物担体は、第１番目のトリペプチド配列（Ｘ１−Ｙ１−Ｇｌｙ）と、・・・、第i番目のトリペプチド配列（Ｘｉ−Ｙｉ−Ｇｌｙ）と、・・・、第ｎ番目のトリペプチド配列（Ｘｎ−Ｙｎ−Ｇｌｙ）とを含むアミノ酸配列を含み、投与される動物種の体温で３重らせんを形成するペプチドからなる。（ここで、ｉ及びｎは整数で、１＜ｉ＜ｎであり、ｎ≧７であって、Ｘ１、・・・、Ｘｉ、・・・Ｘｎのアミノ酸は独立に選択され、Ｙ１、・・・、Ｙｉ、・・・Ｙｎのアミノ酸も独立に選択される。）

本発明の薬物を送達させる方法において、前記ペプチドのアミノ酸配列はＸ−Ｙ−Ｇｌｙからなる基本ユニットが７回又は８回以上繰り返されたアミノ酸配列の場合がある。（ここでＸ及びＹは独立に選択される任意のアミノ酸である。）

本発明の薬物を送達させる方法において、前記基本ユニットのアミノ酸配列はＰｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙの場合がある。

本発明の薬物を送達させる方法において、前記基本ユニットは連続して繰り返される場合がある。

本発明の薬物を送達させる方法において、前記ペプチドはプロリン残基のヒドロキシル化以外の修飾を受ける場合がある。

本発明の薬物を送達させる方法において、前記ペプチドは配列番号１ないし６、及び、９ないし１２からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列の場合がある。

本発明の薬物を送達させる方法において、前記薬物担体は薬物の送達に用いられる場合がある。

本発明の薬物を送達させる方法において、前記薬物担体に結合させる薬物は、治療及び／又は診断のための医薬の場合がある。

本発明の薬物を送達させる方法において、前記薬物担体はホモ又はヘテロ３量体の場合がある。

本発明は、本発明の薬物担体に薬物が結合した化合物を含む医薬組成物を投与するステップを含む治療又は診断のための方法を提供する。

本発明の治療又は診断のための方法において、前記医薬組成物はイメージングのために用いられる場合がある。

本発明の治療又は診断のための方法において、前記医薬組成物は生体機能測定のために用いられる場合がある。

本明細書と、本明細書に添付される配列表とにおいて、ペプチドの構造は、当業者に周知慣用のアミノ酸の３文字による表記法で記述される。本明細書においてアミノ酸はＬ体である。本明細書のアミノ酸は、分子生物学で一般的なタンパク質の翻訳に用いられることが知られた２０種類のＬ−アミノ酸の他、当該技術分野においてよく知られる修飾アミノ酸残基、例えば、４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン、４−フルオロ−Ｌ−プロリン及びＮ−イソブチルグリシンを含む。本明細書において、ヒドロキシルプロリンは、４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンであり、「Ｈｙｐ」と表される。

本明細書において、薬物担体とは、薬物と結合させて薬物の生体内動態を変化させるための物質である。

本明細書において、高尿排泄性の薬物担体とは、ある薬物担体が、単独でも、薬物が結合した状態でも、急速に投与量のほとんどが尿中に排泄されることをいう。例えば、ラットでは、投与後２４時間以内に、投与量の９０％以上、好ましくは、９５％以上が尿中に排泄されることをいう。

本明細書において、ステルス性の薬物担体とは、ある薬物担体が、単独でも、薬物が結合した状態でも、血液中で分解及び修飾を受けず、細網内皮細胞に捕捉されないで、血液中に主に存在することをいう。

本発明の薬物担体は、いわゆるコラーゲン様ペプチドからなる。本明細書において、コラーゲン様ペプチドとは、第１番目のトリペプチド配列（Ｘ１−Ｙ１−Ｇｌｙ）と、・・・、第i番目のトリペプチド配列（Ｘｉ−Ｙｉ−Ｇｌｙ）と、・・・、第ｎ番目のトリペプチド配列（Ｘｎ−Ｙｎ−Ｇｌｕ）とを含むアミノ酸配列を含む１次構造を有し、生体内で３重らせん状の３次構造を有するペプチドをいう。ここで、ｉ及びｎは整数で、１＜ｉ＜ｎであり、ｎ≧７であって、Ｘ１、・・・、Ｘｉ、・・・Ｘｎ及びＹ１、・・・、Ｙｉ、・・・Ｙｎは、独立に選択される任意のアミノ酸であって、天然のアミノ酸残基でもよく、当該技術分野においてよく知られる修飾アミノ酸残基、例えば、Ｈｙｐ、４−フルオロ−Ｌ−プロリン又はＮ−イソブチルグリシンでもよい。

本明細書のコラーゲン様ペプチドのアミノ酸配列は、Ｘ−Ｙ−Ｇｌｙからなる基本ユニットが７回又は８回以上繰り返されたアミノ酸配列の場合がある。（ここでＸ及びＹは独立に選択される任意のアミノ酸であって、天然のアミノ酸残基でもよく、当該技術分野においてよく知られる修飾アミノ酸残基、例えば、Ｈｙｐ、４−フルオロ−Ｌ−プロリン又はＮ−イソブチルグリシンでもよい。）

本明細書のコラーゲン様ペプチドにおいて、前記基本ユニットが連続して繰り返されるとは、１個の基本ユニットと隣の基本ユニットとが常に接しており、無関係なアミノ酸残基が介在しないことをいう。Ｘ−Ｙ−Ｇｌｙからなる基本ユニットがｎ回連続して繰り返されたアミノ酸配列は、（Ｘ−Ｙ−Ｇｌｙ）ｎと表記される。代替的には、本明細書のコラーゲン様ペプチドは、生体内で３重らせんを形成することを条件として、１個の基本ユニットと隣の基本ユニットとの間に１個又は２個以上の無関係なアミノ酸残基が介在してもかまわない。しかし、本明細書のコラーゲン様ペプチドのアミノ酸配列が基本ユニットの他に無関係なアミノ酸残基を含む場合には、当該ペプチドのアミノ酸配列中の８０％以上のアミノ酸残基が基本ユニットで占められることがあり、９０％以上のアミノ酸残基が基本ユニットで占められることがある。

本明細書のコラーゲン様ペプチドにおいて、基本ユニットのアミノ酸配列はＸがＰｒｏで、ＹがＨｙｐの場合がある。

Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｙ．ら（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、９：４１５（１９７０））によると、コラーゲン様ペプチドは基本ユニットの繰り返し回数が２１回未満であれば合成可能である。したがって、本明細書のコラーゲン様ペプチドにおいて、基本ユニットの繰り返しの回数の上限は２０回である。よって基本ユニットの繰り返しの回数は２１回未満である。換言すると、基本ユニットの繰り返しの回数は、２０回、１９回、１８回、１７回、１６回、１５回、１４回、１３回、１２回、１１回又は１０回の場合がある。

また、本明細書の実施例に示されるとおり、基本ユニットの繰り返しの回数が５回の場合には融解温度が投与される動物の体温より低いため、投与された動物の体内で３重らせんを形成することができなかった。一方、７回の場合には本発明の作用効果を奏することができた。したがって、本明細書のコラーゲン様ペプチドにおいて、基本ユニットの繰り返しの回数の下限は７回である。よって基本ユニットの繰り返しの回数は、７回又は８回以上である。

本明細書のコラーゲン様ペプチドにおいて、ホモ３量体とは、同一の１次構造のペプチド３本からなる３量体をいう。またヘテロ３量体とは、同一の１次構造のペプチド２本と、該ペプチドとは異なる１次構造のペプチド１本とからなる３量体か、それぞれ異なる１次構造のペプチド３本からなる３量体かをいう。

本明細書において、融解温度とは、本明細書のコラーゲン様ペプチドが３重らせん構造の半量がランダムコイルに転移する温度をいう。融解温度は、例えば、円２色性スペクトル測定による高次構造解析などの公知の方法により測定されるが、これに限定されない他の公知の方法によっても測定できる。

本発明の薬物担体のコラーゲン様ペプチドは投与される動物種の体温で３重らせんを形成する。そこで、本発明の薬物担体のコラーゲン様ペプチドは投与される動物種の体温より高い融解温度を有する。

本発明において、投与される動物種とは、本発明の薬物担体を用いて薬物を送達する技術が適用される全ての動物種をいい、ヒトと、実験動物と、獣医学の治療対象となる動物とを含むが、これらに限定されない。具体的には、投与される動物種には、ヒト、サル、ネコ、ブタ、ウマ、ウシ、マウス、ラット、イヌ、ウサギ及びニワトリを含むが、これらに限定されない。

これらの動物の平均体温は、ヒトでは３６°Ｃ、サルでは３８°Ｃ、ネコでは３８．５°Ｃ、イヌでは３８．５°Ｃ、ラットでは３７．５°Ｃ、マウスでは３７．５°Ｃ、ブタでは３９°Ｃ、ウマでは３７．５°Ｃ、ウシでは３８．５°Ｃ、ウサギでは３９°Ｃ、ニワトリでは４２°Ｃである。

したがって、本発明の薬物担体のコラーゲン様ペプチドの融解温度は、３６°Ｃ以上が好ましく、３７°Ｃ以上がより好ましく、３７．５°Ｃ以上がより好ましく、３８°Ｃ以上がより好ましく、３８．５°Ｃ以上がより好ましく、３９°Ｃ以上がより好ましく、４２°Ｃ以上がより好ましい。

本明細書において、「修飾」とは、タンパク質の合成に用いられる２０種類のＬ−アミノ酸からなるペプチドにいずれかの置換基が共有結合することをいう。本発明の薬物担体のコラーゲン様ペプチドについて「プロリン残基のヒドロキシル化以外の修飾を受ける」とは、投与される動物種において３重らせんを形成することを条件として、プロリン残基にヒドロキシル基が結合することを除いて、いずれのアミノ酸残基にいかなる置換基が結合するものであってもかまわない。本発明の薬物担体のコラーゲン様ペプチドを修飾する置換基は、アシル基、アセチル基、トリフルオロアセチル基、アミド基、アルキル基、アリル基、アリール基、グアニジル基、アミジン基、グアニジル基、アミジン基、カルバモイル基、トリニトロフェニル基を含むが、これらに限定されない。これらの置換基によるペプチドの修飾は、例えば、Ｗａｌｋｅｒ ＪＭ編、“Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｈａｎｄｂｏｏｋ、２ｎｄ Ｅｄ．”ＨＵＭＡＮＡ ＰＲＥＳＳ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ（２００２）のような文献に説明される公知の方法により調製することができる。本明細書において、本発明の薬物担体のコラーゲン様ペプチドには、生体内の代謝反応によって、本発明のコラーゲン様ペプチドか、プロリン残基のヒドロキシル化以外の修飾を受けた誘導体かが生成するような前駆体が含まれる。前記前駆体には、本発明のコラーゲン様ペプチドか、該コラーゲン様ペプチドがプロリン残基のヒドロキシル化以外の修飾を受けた誘導体かのエステル化誘導体が含まれるが、これに限られない。

本明細書において、薬物とは、生体内で生物活性を示す化合物か、生体での周囲環境を検出又は計測できる化合物かをいう。

前記生体内で生物活性を示す化合物は、ホルモン剤のように受容体に結合することによりアゴニストとして生物活性を示す化合物と、受容体拮抗剤のように受容体に結合してアゴニストの結合を阻害することにより生物活性を示す化合物と、酵素阻害剤のように酵素と結合することにより酵素活性を阻害し生物活性を示す化合物とを含むが、これらに限定されない。かかる生体内で生物活性を示す化合物の薬物を本発明のステルス性かつ尿排泄性の高い薬物担体に結合させることにより、尿中排泄性を高め、腎障害患者等での薬物の安全性を高めることが可能な場合がある。

前記生体での周囲環境を検出又は計測できる化合物は、Ｘ線造影剤、ＭＲＩ造影剤、放射性医薬品及び蛍光プローブ剤を含むが、これらに限定されない。かかる生体での周囲環境を検出又は計測できる化合物の薬物を本発明のステルス性かつ尿排泄性の高い薬物担体に結合させることにより、薬物の血液指向性や尿中排泄性を高めることが可能な場合がある。

本発明の薬物担体と薬物との結合は、共有結合及び非共有結合のいずれの場合でもかまわない。共有結合には、エステル結合、エーテル結合、アミド結合、スルフィド結合、ジスルフィド結合などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の薬物担体と薬物との結合は、例えば、Ｗａｌｋｅｒ ＪＭ編、“Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｈａｎｄｂｏｏｋ、２ｎｄ Ｅｄ．”ＨＵＭＡＮＡ ＰＲＥＳＳ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳ，（２００２）などに記載されている公知の手順によって実施することができる。

非共有結合の場合は、イオン結合、水素結合、疎水結合、ファンデルワールス力による結合、及び、金属錯体による結合が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の薬物担体と薬物とを混合することにより、前記結合形態によって、結合体を形成できる。

本発明の薬物担体と結合するのに好ましい生体内で生物活性を示す化合物の薬物には、例えば、５α−レダクターゼ阻害薬、５−リポキシゲナーゼ阻害薬、ＡＣＥ阻害薬、ＣＣＫ拮抗薬、ＣＯＸ−Ｉ及びＣＯＸＩＩ阻害薬、ＨＩＶプロテアーゼ阻害薬、ＨＭＧＣｏＡレダクターゼ阻害薬、ＬＨ−ＲＨ作動薬、α−グルコシダーゼ阻害薬、α−及びβ−アドレナリン作動薬、α−及びβ−アドレナリン遮断薬、アルドース還元酵素阻害薬、アルドステロン拮抗薬、アロマターゼ阻害薬、アンギオテンシンＩＩ受容体拮抗薬、アンドロゲン、イオン交換レジン、インスリン増感剤、うっ血除去薬、エストロゲン、エリテマトーデス抑制薬、エンケファリナーゼ阻害薬、カリウムチャンネル活性化物質／オープナー、カルシウムチャンネル遮断薬、カルシウム調節薬、キサンチンオキシダーゼ阻害剤、キレート剤、グルココルチコイド、コリンエステラーゼ再活性化薬、コリンエステラーゼ阻害薬、コリン作動薬、セロトニンノルアドレナリン再取込阻害薬、セロトニン取込阻害薬、セロトニン受容体作動薬、セロトニン受容体拮抗薬、ソマトスタチン類似体、ドパミン受容体作動薬、ドパミン受容体拮抗薬、トポイソメラーゼＩ及びＩＩ阻害薬、トロンボキサンＡ２受容体拮抗薬、ヒスタミンＨ２受容体拮抗薬、フィブリノーゲン受容体拮抗薬、フッ素サプリメント、ブラジキニン拮抗薬、プロゲストゲン、プロスタグランジン、プロテアーゼ阻害薬、プロラクチン阻害薬、ヘパリン拮抗薬、ペプシン阻害薬、ベンゾジアゼピン拮抗薬、マトリクスメタロプロテイナーゼ阻害薬、モノアミンオキシダーゼ阻害薬、ロイコトリエン拮抗薬、胃及び膵臓分泌刺激薬、胃プロトンポンプ阻害薬、胃細胞保護薬、胃腸管運動促進剤、胃分泌阻害薬、解毒剤、解熱薬、外部寄生生物撲滅薬、角質溶解薬、緩下剤／下剤、肝酵素誘発物質、肝保護物質、気管支拡張薬、逆転写酵素阻害薬、去痰薬、強心薬、筋弛緩剤、駆虫薬、駆梅薬、血管拡張薬及び血管収縮薬を含む血管調節物質、血管保護物質、血栓溶解薬、血漿容積膨張剤、嫌酒薬、呼吸刺激物質、向知性薬、抗アクネ剤、抗アメーバ剤、抗アレルギー薬、抗アンドロゲン剤、抗ウイルス薬、抗うつ薬、抗エストロゲン剤、抗けいれん薬、抗ゴナドトロピン剤、抗コリン薬、抗ジスキネジア薬、抗ニューモシスティス薬、抗パーキンソン病薬、抗ヒスタミン剤、抗ページェット病薬、抗マイコバクテリア薬、抗マラリア薬、抗ムスカリン剤、抗メトヘモグロビン血症薬、抗リケッチア薬、抗悪性腫瘍剤及び補助剤、抗炎症薬、抗活動亢進剤、抗褐色細胞腫薬、抗乾癬薬、抗関節炎／抗リウマチ剤、抗狭心症薬、抗凝固剤、抗菌補助剤、抗菌薬、抗血小板血症薬、抗血栓薬、抗原虫薬、抗鼓腸薬、抗好中球減少薬、抗攻撃性薬、抗甲状腺機能低下薬、抗甲状腺薬、抗高リン血症薬、抗高脂血症薬、抗骨粗しょう症薬、抗脂漏薬、抗湿疹薬、抗蛇毒素、抗徐脈薬、抗真菌薬、抗精神病薬、抗線維化剤、抗前立腺肥大症薬、抗脱毛症剤、抗痛風薬、抗潰瘍薬、抗糖尿病薬、抗動脈硬化剤、抗尿結石症薬、抗不安薬、抗不整脈薬、抗片頭痛薬、抗利尿薬、抗緑内障薬、抗喘息薬、抗躁薬、甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、酵素、酵素補因子、鉱質コルチコイド、降圧薬、骨吸収阻害薬、催吐剤、散瞳薬、子宮収縮抑制薬、止血薬、止瀉薬、脂肪作用薬、収斂薬、縮瞳薬、昇圧薬、消化補助薬、消毒薬／殺菌剤、色素沈着物質、食欲抑制剤、神経保護薬、人工妊娠中絶薬、制酸薬、制吐薬、性腺刺激因子、成長ホルモン阻害薬、成長ホルモン放出因子、成長刺激物質、清拭剤、造血薬、造血薬、脱色剤、炭酸脱水酵素阻害薬、胆石溶解剤、蛋白同化剤、中枢神経刺激薬、鎮咳薬、鎮静薬／催眠薬、鎮痛剤（麻薬性及び非麻薬性鎮痛剤を含む）、鎮痒薬、鎮痙薬、乳汁分泌刺激ホルモン、尿酸排泄促進薬、粘液溶解薬、避妊薬、非ステロイド性抗炎症薬、副腎皮質刺激ホルモン、副腎皮質抑制薬、分娩誘発薬、放射医薬品、麻薬拮抗薬、免疫調節物質、免疫抑制物質、溶血薬、卵巣ホルモン、利胆薬、利尿薬、疱疹状皮膚炎抑制薬及びそれらの組みあわせである医薬類を含むが、これらに限定されない。

本発明の薬物担体と結合するのに好ましい生体内で生物活性を示す化合物の薬物の具体例には、アザチオプリン、アセトヘキサミド、アセチルサリチル酸、アプレピタント、アルクロフェナク、アロプリノール、アトロピン、イルベサルタン、塩酸モキシフロキサシン、塩酸ラロキシフェン、塩酸ロピバカイン水和物、エストラジオール、エダラボン、エトラビリン、エムトリシタビン、エルデカルシトール、ベンゾチアジド、カルプロフェン、カルベジロール、カンデサルタン・シレキセチル、ゲフィチニブ、セレコキシブ、クロルジアゼポキシド、クロニジン、クロザピン、コデイン、リン酸コデイン、硫酸コデイン、デラコキシブ、ジアセレイン、ジクロフェナク、ジルチアゼム、デュタステリド、ドセタキセル、エトドラク、エトポキシド、エトリコキシブ、エベロリムス、フェンブフェン、フェンクロフェナク、フェンプロフェン、フェンチアザク、フルルビプロフェン、グリセオフルビン、ハロペリドール、イブプロフェン、インドメタシン、インドプロフェン、ケトプロフェン、ロラゼパム、酢酸メドロキトプロゲステロン、メゲストロール、メロキシカム、メトキサレン、メチルプレドニゾン、モルヒネ、硫酸モルヒネ、ナプロキセン、ナラトリプタン塩酸塩、ニセルゴリン、ニフェジピン、ニフルミク、オランザピン、オキサプロジン、オキサゼパム、オキシフェンブタゾン、パクリタキセル、パルペリドン、ビルダグリプチン、フェニンジオン、フェノバルビタール、ピロキシカム、ピルプロフェン、プレドニゾロン、プレドニゾン、プロカイン、プロゲステロン、ピリメタミン、リスペリドン、ロフェコキシブ、アセナピン、スルファジアジン、スルファメラジン、スルフイソキサゾール、スリンダク、スプロフェン、タダラフィル、テマゼパム、チアプロフェン酸、チロミソール、トルメチク、バルデコキシブ、ボリノスタット、ロクロニウム臭化物、アセノクマロール、アセチルジギトキシン、アデノシン、アネトール、アニレリジン、アリピプラゾール、イトラコナゾール、イミダフェナシン、エキセメスタン、オロパタジン塩酸塩、ベンゾカイン、ベンゾナテート、ベタメタゾン、酢酸ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、ビサコジル、ブロモジフェンヒドラミン、ブタンベン、クロラムブシル、クロラムフェニコール、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロルプロマジン、パルミチン酸クリンダマイシン、クリオキノール、クロピドグレル、塩酸アミオダロン、酢酸コルチゾン、塩酸シクリジン、塩酸シプロヘプタジン、デメクロサイクリン、ジアゼパム、シスプラチン、ジブカイン、ジギトキシン、ネオスチグミンメチル硫酸塩、ネララビン、メシル酸ジヒドロエルゴタミン、ジメチステロン、ジスルフィラム、トシル酸スブラタスト、ドキュセートカルシウム、ジヒドロゲステロン、エナラプリラート、酒石酸エルゴタミン、エリスロマイシン、エストール酸エリスロマイシン、ピバル酸フルメタゾン、フィンゴリモド塩酸塩、フルオシノロンアセトニド、フルオロメトロン、エナント酸フルフェナジン、フォンダパリヌクスナトリウム、フルランドレノリド、グアイフェネシン、ハラゾン、塩酸フェキソフェナジン、ヒドロコルチゾン、フルチカゾンフランカルボン酸エステル、リバスチグミンレベチラセタム、レボチロキシンナトリウム、メチルクロチアジド、ミコナゾール、メサラジン、モメタゾンフランカルボン酸エステル、硝酸ミコナゾール、ニトロフラゾン、ニトロメルソール、、ペンタゾシン、ペントバルビタール、フェンタニルクエン酸塩、プリミドン、硫酸キニーネ、スタノゾロール、硝酸スルコナゾール、スルファジメトキシン、スルファエチドール、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、スルファピリジン、タクロリムス、テストステロン、トリアゾラム、ラルテグラビルカリウム、リセドロン酸ナトリウム、トリクロルメチアジド及びトリオキサレンを含むが、これらに限定されない。

本生体内で生物活性を示す化合物の薬物のなかには、細胞内に作用点がある場合がある。かかる薬物は本発明の薬物担体と結合したままでは作用点に到達することができない。このような薬物は、例えば、エステル結合で本発明の薬物担体に結合した化合物としたり、あるいは、本発明の薬物担体に結合した包摂化合物に包摂させたりすることにより、投与後、速やかに薬物が薬物担体から放出させて、細胞内の作用点に到達させることが可能となる。このように、本明細書に列挙された生物活性を示す多種多様の化合物は、本発明の薬物担体との結合様式を最適化することにより、本発明の薬物担体の利点を享受することができる。

前記スピンプローブ標識剤は、Ｎ−オキシル−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン誘導体（Ｃｏｏｋ Ｒ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ８， ３１８８（１９６３））、Ｎ−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン誘導体（Ｌａｎｄｇｒａｆ， Ｗ．Ｃ．ら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１３０：１１１（１９６９））及びＮ−（２，２，５，５−テトラメチル−３−カルボニル−ピロリジン−１−オキシル）−イミダゾール（Ｏｈｉｎｉｓｈ Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７５：２１１（１９７４））を含むが、これらに限定されない。

本発明の薬物担体に前記スピンプローブ標識剤が結合した化合物は、前記スピンプローブ標識剤が薬物担体ペプチドの主鎖又は側鎖のアミノ基に結合する場合には、式１−１、式１−２、式２−１又は式２−２で表される。

式１−１、式１−２、式２−１及び式２−２において、Ｒ_１及びＲ_２のうちいずれか一方は、前記薬物担体ペプチドのペプチジル基であり、他の一方は、水素原子か、アルキル基、アリル基、アリール基、アラルキル基、エステル基又はアミド基かである。

また、本発明の薬物担体に前記スピンプローブ標識剤が結合した化合物は、前記スピンプローブ標識剤が薬物担体ペプチドの主鎖又は側鎖のカルボキシル基と結合している場合には、式３−１又は式３−２で表される。

式３−１及び式３−２において、Ｒ_３は前記薬物担体ペプチドのペプチジル基である。

本発明の薬物担体に前記スピンプローブ標識剤が結合した化合物は、前記スピンプローブ標識剤が薬物担体ペプチドのシステイン基と結合する場合には、式４−１又は式４−２で表される。

式４−１及び式４−２において、Ｒ_４は、前記薬物担体ペプチドのペプチジル基である。

本発明の薬物担体に前記スピンプローブ標識剤が結合した化合物は、スピンプローブ標識剤３−カルボキシＰＲＯＸＬが薬物担体ペプチドのアミノ末端のプロリンの２級アミノ基に縮合結合する場合には、式５で表される。

式５において、Ｒ_５は、前記アミノ末端のプロリンに続く、アミノ末端から２番目のアミノ酸からカルボキシ末端までのペプチジル基を示す。

式５の化合物は、配列番号９又は１３のアミノ酸配列のコラーゲン様ペプチドのアミノ末端のプロリン残基の２級アミノ基にスピンプローブ標識剤３−カルボキシＰＲＯＸＹＬが縮合結合した化合物の場合がある。

本発明の薬物担体に前記スピンプローブ標識剤が結合した化合物は、スピンプローブ標識剤３−カルボキシＰＲＯＸＹＬが薬物担体ペプチドのアミノ末端の１級アミノ基に縮合結合する場合には、式６で表される。

式６において、Ｒ_６は、前記薬物担体ペプチドのアミノ末端からカルボキシ末端までのペプチジル基である。

式６の化合物は、配列番号１０又は１２のアミノ酸配列のコラーゲン様ペプチドのアミノ末端のグリシン残基のアミノ基にスピンプローブ標識剤３−カルボキシＰＲＯＸＹＬが縮合結合した化合物の場合がある。

本発明の薬物担体に前記スピンプローブ標識剤が結合した化合物は、スピンプローブ標識剤３−カルバミドメチルＰＲＯＸＹＬが薬物担体ペプチドのシステイン残基とスルフィド結合する場合には、式７で表される。

式７において、Ｒ_７は、前記薬物担体ペプチドのアミノ末端から前記システイン残基のアミノ末端側に隣接するアミノ酸残基までのペプチジル基か、水素原子（Ｈ）か、Ｒ_１９−Ｃ（＝Ｏ）−か、Ｒ_１９−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−か、Ｒ_１９−Ｃ（＝ＮＨ）−かである。ここでＲ_１９は、炭素数１ないし９のアルキル基か、炭素数２ないし９のアルケニル基か、炭素数６ないし９の芳香族アルキル基か、水素（Ｈ）かである。式７において、Ｒ_８は、前記薬物担体ペプチドの前記システイン残基のカルボキシル末端側に隣接するアミノ酸残基からカルボキシル末端までのペプチジル基か、水酸基か、アミノ基かである。ここでＲ_７及びＲ_８がペプチジル基のとき、該ペプチジル基は、アシル基、アセチル基、トリフルオロアセチル基、アミド基、アルキル基、アリル基、アリール基、グアニジル基、アミジン基、グアニジル基、アミジン基、カルバモイル基、トリニトロフェニル基を含むが、これらに限定されない置換基で修飾されてもよい。さらに、Ｒ_７及びＲ_８がペプチジル基のとき、該ペプチジル基は、生体内の代謝反応で分解されうる修飾、例えば、エステル化誘導体の場合がある。

式７の化合物は、配列番号１１のアミノ酸配列のコラーゲン様ペプチドのペプチジル基にスピンプローブ標識剤３−カルバミドメチルＰＲＯＸＹＬがスルフィド結合した化合物の場合がある。

本発明の医薬組成物は、本発明の薬物担体に薬物が結合した化合物に加えて、薬学的に許容可能な医薬品添加物を含む場合がある。前記医薬品添加物は、希釈剤及び膨張剤と、結合剤及び接着剤と、滑剤と、流動促進剤と、可塑剤と、崩壊剤と、担体溶媒と、緩衝剤と、着色料と、香料と、甘味料と、防腐剤及び安定化剤と、吸着剤と、当業者に知られたその他の医薬品添加剤とを含むが、これらに限定されない。本発明の医薬組成物が経口投与用の医薬組成物の場合には、本発明の薬物担体に薬物が結合した化合物と、緩衝剤、賦形剤、滑剤、可塑剤、安定化剤及び崩壊剤を含むが、これらに限定されない、医薬品添加物とが、固形製剤として調製される。本発明の医薬組成物が非経口注射用の医薬組成物の場合の医薬品添加物は、滅菌液剤、懸濁剤及び／又は乳剤をさらに含む場合がある。本発明の医薬組成物が非経口注射用の医薬組成物の場合、本発明の薬物担体に薬物が結合した化合物は固形製剤として調製される。投与直前に前記固形製剤は、生理食塩水、滅菌精製水等の溶媒が添加されて、該溶媒に溶解又は懸濁された状態で注射により投与される場合がある。本発明の医薬組成物又はその一部が固形製剤として調製される場合には、該固形製剤は単位剤形で調製されることが好ましい。

本発明の医薬組成物は、通常は、動物に投与される場合には、該動物の体重１ｋｇにつき１〜５０００μｇの範囲内の単位用量で投与される。ヒトに投与される場合には、該ヒト個体の体重１ｋｇについて約０．０３〜１０００μｇの範囲内の単位用量で投与される。

本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。

ペプチド１ないし６のホモ３量体の円２色性スペクトルを表す波形図。 ペプチド１ないし３、７及び８のホモ３量体を投与後、血清中残存量の投与量に対する割合の経時的な変化を表すグラフ。 ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド９又はカルバモイルＰＲＯＸＹＬと、１００μＭのＡＡＰＨとを反応させた場合のＥＳＲ信号強度の経時的な変化を示すグラフ。 ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド９又はカルバモイルＰＲＯＸＹＬと、１ｍＭのＡＡＰＨとを反応させた場合のＥＳＲ信号強度の経時的な変化を示すグラフ。 ＡＡＰＨ投与マウスにおける未変化体の尿中排泄率と、未変化体及び還元体の尿中排泄率とを示すグラフ。

以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。

材料及び方法
１． コラーゲン様ペプチドの合成
本実施例において、アミノ酸は、プロリン、ヒドロキシプロリン、グリシン、アルギニン及びアスパラギン酸はＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（メルク株式会社）の製品が購入され、ペプチド合成に供された。Ｃ末端（カルボキシ末端）がカルボキシル基であるペプチドの合成は、２−Ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ−樹脂（株式会社ペプチド研究所）上で、Ｃ末端がアミドであるペプチドの合成は、Ｒｉｎｋ−ａｍｉｄｅ樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（メルク株式会社））上で、通常のＦｍｏｃ型固相合成法により実施された。

（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）の基本ユニットを連続して５回繰り返したペプチド（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）_５（以下、ペプチド７と記載）及び（Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）の基本ユニットを連続して１０回繰り返したペプチド（Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）_１０（以下、ペプチド８と記載）は、株式会社ペプチド研究所より購入され、実験に供せられた。

ペプチド１ないし８のアミノ酸配列は、それぞれ、添付される配列表の配列番号１ないし８に列挙される。ペプチド１ないし８の構造の簡単な説明は以下のとおりである。ペプチド１のアミノ酸配列はＰｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙからなる基本ユニットが連続して１０回繰り返された配列からなる。ペプチド２のアミノ酸配列は、ペプチド１で基本ユニットが連続して１０回繰り返されるうち、アミノ末端から第５番目の基本ユニットがＰｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙに置換された配列からなる。ペプチド３のアミノ酸配列は、ペプチド１で基本ユニットが連続して１０回繰り返されるうちアミノ末端から第５番目の基本ユニットがＡｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙに置換された配列からなる。ペプチド４ないし６は、それぞれ、ペプチド１ないし３のカルボキシル末端がアミド化されたペプチドである。ペプチド７はＰｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙからなる基本ユニットが連続して５回繰り返された配列からなる。ペプチド８はＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙからなる基本ユニットが連続して１０回繰り返された配列からなる。

結果
合成された各ペプチドは、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｕｔｏｆｒｅｘ ＩＩ（ブルカージャパン株式会社）を用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法で解析された。その結果が表１に示される。

表１の結果から、ペプチド１ないし６はそれぞれのアミノ酸配列から予測される質量を有することが確認された。

２． コラーゲン様ペプチド３重らせん構造の形成
材料及び方法
２．１ ３重らせん構造の形成
本実施例で合成したペプチド１ないし６について、３重らせん構造の形成を確実とする目的で、ＰＢＳ（生理的リン酸緩衝液）あるいは蒸留水中でペプチド濃度が１〜１０ｍｇ／ｍＬ、温度４°Ｃの条件で自己集合させてホモ３量体が形成された。得られたホモ３量体は、４°Ｃにて保存された。

２．２ コラーゲン様ペプチドの高次構造形成の確認
ペプチド１ないし６のホモ３量体標品の高次構造は、円２色性スペクトル法により確認された。

２．２．１ 円２色性スペクトル測定による高次構造解析
以下の条件で、本実施例（１）で形成されたペプチド１ないし６のホモ３量体標品の円２色性スペクトルが測定された。
溶媒：ＰＢＳ
装置：ＪＡＳＣＯ Ｊ−８２０装置にＰＴＣ−４２３Ｌ温度制御装置を装着して使用
セル長：０．５ｍｍ
測定波長：１９０−２６０ｎｍ
データ取り込み：０．５ｎｍ毎
スキャン速度：５０ｎｍ／分
レスポンス：１秒
データ積算：３回
感度：１００ｍｄｅｇ
測定温度：４°Ｃ、融解温度測定では１時間あたり１８°Ｃで温度を上昇させた。

結果
ペプチド１ないし６のホモ３量体の円２色性スペクトルの測定結果をそれぞれ図１に示した。

図１の結果から、ペプチド１ないし６のホモ３量体標品の円２色性スペクトルは、いずれも、２２５ｎｍに正のピークを有する典型的なコラーゲン３重らせん構造のスペクトルパターンを示した。よって、ペプチド１ないし６の標品は３重らせんを形成していることが確認された。

２．２．２ コラーゲン様ペプチドの融解温度
ペプチド１ないし６のホモ３量体標品と、ペプチド７及び８とを溶媒ＰＢＳに１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した標品溶液が用意された。融解温度（３重らせんからランダムコイルへの転移）が、実施例２と同様の条件で前記溶液の温度を上昇させながら、２２５ｎｍの正のコットン効果の楕円率の変化に基づいて測定された。その結果が表２に示される。

表２に示すとおり、ペプチド１ないし６の融解温度は５６．５から６６．０°Ｃまでの範囲であった。一方、ペプチド７及び８の融解温度は、ヒトを含む哺乳動物の体温（約３７°Ｃ）を大きく下回り、それぞれ、５．０及び２５．０°Ｃと報告されている（Ｆｉｅｌｄｓ， ＧＢ及びＰｒｏｃｋｏｐ ＤＪ．、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）：４０，３４５（１９９６））。

コラーゲン様ペプチドの血清中安定性
材料及び方法
実施例１で製造されたコラーゲン様ペプチドの血清中安定性が測定された。ペプチド１、２、３ないし７、８のＰＢＳ溶液（１．２ｘ１０^−３ｍｏｌ／Ｌ）が用意され、ペプチド終濃度が（１．２ｘ１０^−４ｍｏｌ／Ｌ）となるように新鮮健常ヒト血清と混合された反応液０．２ｍＬが３７°Ｃでインキュベートされた。ペプチド１、２、３ないし７、８と血清との混合開始時から、前記反応液より一定時間ごとに２０μＬずつサンプルが回収され、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）分析（装置：島津Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ｓｙｓｔｅｍ、カラムＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ（ナカライテスク）、４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント１０−３０％／３０分、３０−９０％／３５分（ペプチド７のみは５−２０％／３０分、２０−９０％／３５分）ＭｅＣＮ／ＤＷ（０．０５％ＴＦＡ）２２０ｎｍ、６０°Ｃ、１ｍＬ／分）にて各時点におけるペプチドのピーク面積を測定し、その保持率が血中安定性の指標として評価された。

結果
ペプチド１ないし３、７及び８のホモ３量体を投与後、血清中残存量の投与量に対する割合の経時的な変化を表すグラフを図２に示す。図２から明かなとおり、ペプチド１、２、３は血清中で安定に存在したが、ペプチド７及び８は、血清中で速やかに分解された。よって、体温で３重らせん構造を形成できるコラーゲン様ペプチドは血液中で安定であることが示された。

コラーゲン様ペプチド薬物担体のラットにおける尿中排泄率の測定
材料及び方法
１ 動物への投与と尿の回収
７週齢の雄性Ｗｉｓｔａｒ系ラット（清水実験材料株式会社、体重２００−２５０ｇ）が投与条件ごとに４匹用意された。ペプチド１ないし８の０．１ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液が調製され、ラットの体重１００ｇあたり１００μＬが右大腿静脈から急速投与された。投与後２４時間までの尿が回収され、３０００ｘｇで１０分遠心後、上清が０．４５μｍのフィルターで濾過され、得られた尿検体は−２０°Ｃで保存された。

２ 尿の前処理及びＲＰ−ＨＰＬＣによる分析
前記尿検体は解凍され、２０°Ｃで遠心された。回収された上清のうち１．０ｍＬに、２０μｇ／全尿量相当の量の^１５Ｎ−ペプチドが内部標準として添加され、１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ３．２）で平衡化された逆相前処理カラム（ＩｎｅｒｔＳｅｐ ＲＰ１ ３０ｍｇ）に懸架された。前記カラムは２０％ アセトニトリル／０．１％ トリフルオロ酢酸１．５ｍＬで溶出され、減圧乾燥された。残渣は０．１％ＴＦＡ １１０μＬで溶解され、０．２ μｍフィルターで濾過された。得られた濾液がＲＰ−ＨＰＬＣ法による分析に供された。

ＲＰ−ＨＰＬＣの条件は以下のとおりである。
装置：Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ（アジレント・テクノロジー株式会社）
カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ_１８−ＡＲＩＩ（１ｘ１５０ｍｍ、ナカライテスク株式会社）
カラム温度：５０°Ｃ
送液速度：５０μＬ／分
溶媒：Ａ液 ０．１％ＴＦＡ／水、Ｂ液 ０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル
グラジエント溶出：５−２５％ Ｂ／５−２５分
検出波長：２２０ｎｍ
インジェクション量：１００μＬ
フラクション採取：５０μＬ／分画

３ 尿中排泄率の測定
内部標準物質がペプチド１ないし８の水溶液に添加されたサンプルが実施例１と同様にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法で解析された。前記内部標準物質は、配列番号１ないし８のアミノ酸配列からなるペプチドのグリシン残基のうち４個が^１５Ｎで標識されたものが用いられた。得られたペプチドの同位体ピーク強度の比からソフトウェアＩＳＯＴＯＰＩＣＡ（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−ｄｅ−Ｃｏｓｓｉｏ Ｊら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３２（Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ ｉｓｓｕｅ）：Ｗ６７４、（２００４））を用いてペプチドの混合比が算出され、検量線が作成された。前記４．２節のＲＰ−ＨＰＬＣの画分の０．５μＬに同量のＣＨＣＡ（α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）がマトリックスとして添加され、実施例１と同様にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法で解析された。目的のペプチドを含む画分のペプチドのピークパターンから、ＩＳＯＴＯＰＩＣＡを用いて内部標準物質と投与ペプチドとの混合比が算出され、前記検量線から尿検体中のペプチド濃度が計算された。前記尿検体の体積及びペプチド濃度に基づいて算出される尿中排泄量の投与量に対する百分率として尿中排泄率が算定された。

４ 結果
ペプチド１ないし８をラット静脈内に投与後２４時間の尿中排泄率の結果が表３に示された。

動物に経静脈投与したペプチド１ないし６は未変化体としてほぼ定量的に尿中に排泄された。これに対しペプチド７及び８は尿中に未変化体は検出されなかった。ペプチドは一般的に体内のプロテアーゼにより容易に分解されることが知られている。しかしペプチド１ないし６は、生分解を受けず高い血液指向性と尿中排泄率の動態を示した。このような動態特性は、抗体などのタンパク質やリポソームなどのサイズの大きい薬物担体とも異なる、特異なものであった。

なお、本実施例において、上記コラーゲン様ペプチドを投与した動物において有害事象が認められなかったので、本コラーゲン様ペプチドは安全性が高いことが示された。

５． 酸化ストレス検査薬としてのコラーゲン様ペプチドの使用
実施例３で血液指向性及び尿中排泄率が高いことが確認されたコラーゲン様ペプチドについて、スピンラベル剤で標識されたペプチドが動物に投与され、生体中における安定ラジカルの安定性、血液指向性及び尿中排泄を測定することにより、生体の酸化ストレス検査薬としての有用性が評価された。

１ 材料及び方法
１．１ スピンプローブ標識ペプチドの合成
スピンプローブ標識剤として３−カルボキシＰＲＯＸＹＬ（シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社）がコラーゲン様ペプチドの標識に供された。カルバモイルＰＲＯＸＹＬ（ＰＲＯＸＹＬ−carbamoyl、シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社）が本発明のスピンプローブ標識ペプチド（以下、「ＳＰペプチド」という。）の対照実験に用いられた。実施例１と同様に、ＲＩＮＫ−アミド樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（メルク株式会社））上で、通常のＦｍｏｃ型固相合成法によりペプチド９ないし１３が合成された。これに３−カルボキシＰＲＯＸＹＬ、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、各５当量が、溶媒ジメチルホルムアミド中で、室温下、２時間反応させることにより、以下に記載のＳＰペプチド９ないし１３が合成された。

ペプチドの樹脂からの切り出し及び脱保護は、以下の手順で実行された。すなわち、それぞれのペプチド−樹脂（約０．１ｍｍｏｌ）が、氷冷下、蒸留水、ｍ−クレゾール、チオアニソール（各０．２５ｍＬ）、トリイソプロピルシラン（０．１２５ｍＬ）、トリフルオロ酢酸（４．１２５ｍＬ）と混合され、室温で１時間撹拌された。切り出されたペプチドは、約５倍容のエーテルを加えることにより沈澱された。ペプチドは、蒸留水に溶解され、高速液体クロマトグラフィーによって精製され、凍結乾燥された。

ペプチド９ないし１３は、それぞれ、配列番号９ないし１３のアミノ酸配列からなるペプチドである。配列番号９のアミノ酸配列は配列番号４のアミノ酸配列と同一である。ペプチド９は、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙからなる基本ユニットが連続して１０回繰り返された配列からなるペプチド１のカルボキシル末端がアミド化されたペプチドである。ペプチド１０は、アミノ末端がグリシンで、そのカルボキシル側にＰｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙからなる基本ユニットが連続して７回繰り返された配列が続き、さらに、Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙが続き、そのカルボキシル末端がアミド化されたペプチドである。ペプチド１１は、アミノ末端がグリシンで、そのカルボキシル側にＰｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙが続き、そのカルボキシル側にＰｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙからなる基本ユニットが連続して７回繰り返された配列が続き、さらにそのカルボキシル側にシステインが続き、そのカルボキシル末端がアミド化されたペプチドである。ペプチド１２は、アミノ末端がグリシンで、そのカルボキシル側にＰｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙからなる基本ユニットが連続して７回繰り返された配列が続き、そのカルボキシル末端がアミド化されたペプチドである。ペプチド１３は、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙからなる基本ユニットが連続して１０回繰り返された配列のうちアミノ末端から第５番目の基本ユニットがＰｒｏ−Ｈｙｐ−Ａｌａに置換された配列からなるペプチドのカルボキシル末端がアミド化されたペプチドである。

ペプチド９、１０、１２及び１３は、それぞれ、配列番号９、１０、１２及び１３のカルボキシ末端のカルボキシル基がアミド化されたペプチジル基のアミノ末端に、ニトロキシド安定ラジカル標識剤で式９に示される３−カルボキシＰＲＯＸＹＬが縮合結合されたスピンプローブ標識化合物である。

ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド９及び１３は、下記式１０で表される。

ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド９及び１３は、それぞれ配列番号９及び１３のアミノ酸配列を有するコラーゲン様ペプチドのカルボキシ末端がアミド化され、かつ、該ペプチドのアミノ末端のプロリン残基の２級アミノ基にスピンプローブ標識剤である３−カルボキシＰＲＯＸＹＬが縮合結合した化合物であり、式１０におけるＲ_９は、該ペプチドのアミノ末端のプロリン残基のカルボキシル基とペプチド結合する次のアミノ酸残基からカルボキシ末端までのペプチジル基を示す。

下記式１１は、ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１０及び１２を表す。

ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１０及び１２は、それぞれ配列番号１０及び１２のアミノ酸配列を有するコラーゲン様ペプチドのカルボキシ末端がアミド化され、かつ、該ペプチドのアミノ末端の１級アミノ基にスピンプローブ標識剤である３−カルボキシＰＲＯＸＹＬが縮合結合した化合物であり、式１１における−ＮＨ−Ｒ_１０は、配列番号１０又は１２のアミノ酸配列を有するコラーゲン様ペプチドのペプチジル基である。

下記式１２は、ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１を表す。

ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１は、それぞれ配列番号１１のアミノ酸配列を有するコラーゲン様ペプチドのカルボキシ末端のシステイン残基のカルボキシル基がアミド化され、かつ、該システイン残基のチオール基にスピンプローブ標識剤である３−カルバミドメチルＰＲＯＸＹＬが縮合結合した化合物であり、式１１におけるＲ_１１は、配列番号１１のアミノ酸配列を有するペプチドのアミノ末端から、カルボキシ末端のシステインに隣接したグリシン残基までのアミノ酸配列を有するペプチジル基を表す。

ＳＰペプチド１１は、ペプチド１１のシステインの側鎖末端に化学式（１）に示すＰＲＯＸＹＬ基が結合する。そこで、あらかじめシステインの−ＳＨ基がフリーであるペプチド１１前駆体が合成された。前記ペプチド１１前駆体は３−（２−ヨードアセトアミド）−ＰＲＯＸＹＬ（シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社）を用いて、ＰＲＯＸＹＬ標識され、ＨＰＬＣで精製された。５０％エタノール、０．１％Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．８）、５ｍＭ ＥＤＴＡ中でペプチド１１前駆体に対して１０モル等量の３−（２−ヨードアセトアミド）−ＰＲＯＸＹＬが加えられ、室温で１時間反応された。ジチオスレイトールが３−（２−イオドアセトアミド）−ＰＲＯＸＹＬに対して２モル等量加えられ、反応が終結された。目的物は、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＡＲ（ナカライテスク）カラム、０．０５％ＴＦＡを含む水―アセトニトリルの直線グラジエントを用いる逆相ＨＰＬＣにより精製され、凍結乾燥された。

１．２ ＳＰペプチドの３量体形成
実施例２と同様に、ＳＰペプチド９ないし１３の水溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を４°Ｃ、２４時間静置することにより、ＳＰペプチドの３量体が形成された。

１．３ ＳＰペプチドの融解温度の測定
ＳＰペプチド９ないし１３の３量体を蒸留水に１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した標品溶液が用意された。融解温度（３重らせんからランダムコイルへの転移）が、実施例２と同様の条件で前記溶液の温度を上昇させながら、２２５ｎｍの正のコットン効果の楕円率の変化に基づいて測定された。

１．４ 投与液の調製、動物への投与及び尿の採取
ＳＰペプチドの３量体の５０μＭ、１００μＭ及び２００μＭのＰＢＳ溶液が調製された。実験動物として、６週齢の雄性ｄｄｙマウス（清水実験材料株式会社）、体重２９．６−３８．７ｇ）が投与条件ごとに８匹用意された。５０μＭの投与液（マウス１匹あたり０．１ｍＬ）が尾静脈から急速投与された（投与量：５ｎｍｏｌ／マウス１匹）。投与後６時間までの尿が回収され、０．４５μｍのフィルターで濾過後、得られた尿検体はＥＳＲによる定量分析まで−２０°Ｃで保存された。

１．５ 尿試料の前処理
ＰＢＳで溶解された１．０ｍＭの原液から、ＰＢＳによる希釈系列が調製された。

１．６ 検量線用標準試料
次にＰＢＳによる標準液が、ペプチドを投与されないマウスの尿を用いて希釈され、検量線用の希釈系列が調製された。ここで、尿中濃度の検量線用標準試料は、ＰＢＳ標準液：マウスブランク尿＝１：９の容積比で混合された。

１．７ Ｘ−バンドＥＳＲ法による定量分析
サンプル内容量が１００μＬの濾過された尿サンプルがフラット石英セル（日本電子株式会社）に封入され、尿中のＳＰ−ペプチド濃度が定量された。

ＥＳＲの測定条件は以下の条件で行われた。
ＥＳＲ測定装置：Ｘ−バンド電子スピン共鳴装置（日本電子株式会社、ＲＥ−３Ｘ型）
磁気フィールド： ３２０．７±５．０ｍＴ
変調幅：０．１ｍＴ
掃引時間：２．０分
時間定数：０．０３秒
積算：３回
Ｇａｉｎ：２００
マイクロ波出力：１０．０ｍＷ
マイクロ波周波数：９．４５ＧＨｚ
測定温度：２３°Ｃ
ＰＲＯＸＹＬのニトロキシド安定ラジカル由来の３本のＥＳＲ信号における低磁場側から２番目のピーク値が、外部標準であるＭｎ^２＋由来のＥＳＲピーク値に対する相対比（Ｓ／Ｍ比）で表示され、ＳＰペプチド濃度と前記相対比（Ｓ／Ｍ比）とを用いて検量線が作成された。

生体内で還元されたＰＲＯＸＹＬは、フェリシアン化カリウムで再酸化して定量された。フェリシアン化カリウムで酸化する場合は、尿サンプル１．０ｍＬに１００ｍＭフェリシアン化カリウム１０μＬ（フェリシアン化カリウムの最終濃度は１．０ｍＭ）が添加され、同様に測定された。

２ 結果
２．１ ＳＰペプチドの融解温度
ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド９ないし１３の融解温度が表５に示される。

表４に示すとおり、ＰＲＯＸＹＬ標識コラーゲン様ペプチドの融解温度は、２９．０°Ｃから５８．０°Ｃまでの範囲である。実施例２で融解温度が測定されたペプチド４をＰＲＯＸＹＬ標識したペプチドがＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド９である。そこで表２と表５とを比較すると、６６．０°Ｃから５８．０°ＣにＰＲＯＸＹＬ標識により融解温度が低下した。

２．２ ＳＰペプチドの安定ラジカル還元率及び尿中排泄率
表５にＳＰペプチドの尿中排泄率の測定結果が示される。

ＳＰペプチドの中で、ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド９及び１０は、未変化体のままで、投与量のほぼ１００％が尿中に排泄された。ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１１及び１２は、未変化体の尿中排泄率が５０〜７０％であったが、還元体をあわせた合計の排泄率は、投与量の９０％以上であった。一方、ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド１３は、未変化体の排泄率が２０％、還元体をあわせた合計の排泄率でも３０％以下であった。対照として使用したカルバモイルＰＲＯＸＹＬは、未変化体の排泄率が６％、還元体をあわせた合計の排泄率は９％であった。

以上の結果から、ＳＰペプチドの動態は、実施例３及び４で示された血液指向性及び高い尿排泄性のコラーゲン様ペプチドの動態特性に依存する結果となった。

３ ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチドによる酸化ストレスの定量
３．１ 酸化ストレス応答プローブとしての、インビトロの反応性試験
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて２０μＭに調製したＰＲＯＸＹＬ−（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）_１０の１００μＬと、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて各濃度（０．２、２．０ｍＭ）に調製した２，２’−ａｚｏｂｉｓ（２−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅ）ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＡＡＰＨ、シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社）の１００μＬを混合し、３７°Ｃで６時間反応させた。

Ｘ−ｂａｎｄ ＥＳＲ装置により、経時的（反応開始から０、３０、６０、９０、１２０、２４０、３６０分）にＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド９のＥＳＲスペクトル及び信号強度を測定し、定量された信号強度の減少を利用して、ＡＡＰＨ由来のペルオキシルラジカル種（ＲＯＯ・）とＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド９との反応性（酸化ストレス応答性）が評価された。同様の実験を、カルバモイルＰＲＯＸＹＬ単体でも行い、反応性が比較された。

４ 結果
図３は、ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド９（最終濃度１０μＭ）又はカルバモイルＰＲＯＸＹＬ（最終濃度１０μＭ）と、ＡＡＰＨ（１００μＭ）とを反応させた場合のＥＳＲの信号強度の経時的な変化を示すグラフである。縦軸は反応開始時のＥＳＲ信号強度を対照としたときのＥＳＲ信号強度の相対値の百分率を表し、横軸は反応時間（単位は時間）を表す。黒丸（●）は１００μＭのＡＡＰＨと反応させた１０μＭのＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド９の各反応時間でのＥＳＲ信号強度の相対値を表し、白丸（○）は１００μＭのＡＡＰＨと反応させた１０μＭのカルバモイルＰＲＯＸＹＬの各反応時間でのＥＳＲ信号強度の相対値を表す。ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド９（最終濃度１０μＭ）又はカルバモイルＰＲＯＸＹＬ（最終濃度１０μＭ）と、最終濃度が１００μＭのＡＡＰＨとを反応させた場合、反応開始から２時間までＥＳＲの信号強度は減少することなく安定に存在した。図４は、ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド９（最終濃度１０μＭ）又はカルバモイルＰＲＯＸＹＬ（最終濃度１０μＭ）と、ＡＡＰＨ（１ｍＭ）とを反応させた場合のＥＳＲの信号強度の経時的な変化を示すグラフである。縦軸は反応開始時のＥＳＲ信号強度を対照としたときのＥＳＲ信号強度の相対値の百分率を表し、横軸は反応時間（単位は時間）を表す。黒丸（●）は１ｍＭのＡＡＰＨと反応させた１０μＭのＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド９の各反応時間でのＥＳＲ信号強度の相対値を表し、白丸（○）は１ｍＭのＡＡＰＨと反応させた１０μＭのカルバモイルＰＲＯＸＹＬの各反応時間でのＥＳＲ信号強度の相対値を表す。ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド９（最終濃度１０μＭ）又はカルバモイルＰＲＯＸＹＬ（最終濃度１０μＭ）と、最終濃度が１ｍＭのＡＡＰＨとを反応させた場合、反応開始から６時間で、ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド９のＥＳＲ信号強度は反応開始前の６９％まで減少し、カルバモイルＰＲＯＸＹＬのＥＳＲ信号強度は反応開始前の５０％まで減少した。

５ 酸化ストレス応答プローブとしてのインビボの反応性試験
５．１ ＡＡＰＨのＬＤ５０
予備検討としてＡＡＰＨのＬＤ５０を求めた。ＡＡＰＨを腹腔内投与（２５、５０、７５、１００ｍｇ／ｋｇ）したマウスの１２時間後の生存判定試験から、ＡＡＰＨのＬＤ５０は１００ｍｇ／ｋｇであった。

５．２ 尿中排泄率の定量
マウスの１００％生存が確認された中で最高投与量の５０ｍｇ／ｋｇにてＡＡＰＨを腹腔内投与したマウスに、ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド９をマウス１匹あたり５ｎｍｏｌで尾静脈注射し、６時間の尿中排泄量をＸ−ｂａｎｄ ＥＳＲ装置により定量した。

５．３ 結果
図５は、未変化体の尿中排泄率と、未変化体及び還元体の尿中排泄率とを示すグラフである。縦軸は、尿中排泄率、すなわち、投与量に対する尿中排泄量の百分率を表す。左の棒グラフは未変化体（unchanged）だけの尿中排泄率を表し、右の棒グラフは未変化体及び還元体の和（unchanged+reduced）を表す。誤差棒は、同一条件の実験を４回繰り返した測定値の標準偏差を表す。ＡＡＰＨを投与しない健常マウスにおいて、ＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド９は尾静脈注射後の６時間で未変化体の尿中排泄率はほぼ１００％であることに対して、ＡＡＰＨ投与マウスにおいてＰＲＯＸＹＬ標識ペプチド９未変化体の尿中排泄率は低下し、５８％であった。これに伴って、還元体の尿中排泄率（３３％）が増加し、未変化体と還元体の合計による尿中排泄率は９１％であった。

また、本実施例の薬物担体に薬物が結合した化合物を投与した動物では有害事象が認められなかったため、本実施例の薬物担体に薬物が結合した化合物の高い安全性が示された。

本実施例で示されたとおり、本実施例の薬物担体に薬物が結合した化合物は投与された生体内の酸化ストレス状態を反映して還元体として排泄されるので、優れた酸化ストレス応答プローブとなり得ることが示された。

Claims (12)

1. 第１番目のトリペプチド配列（Ｘ１−Ｙ１−Ｇｌｙ）と、・・・、第i番目のトリペプチド配列（Ｘｉ−Ｙｉ−Ｇｌｙ）と、・・・、第ｎ番目のトリペプチド配列（Ｘｎ−Ｙｎ−Ｇｌｙ）とを含むアミノ酸配列を含み、投与される動物種の体温で３重らせんを形成するペプチドからなることを特徴とする、ステルス性かつ高尿排泄性の薬物担体。（ここで、ｉ及びｎは整数で、１＜ｉ＜ｎであり、ｎ≧７であって、Ｘ１、・・・、Ｘｉ、・・・Ｘｎのアミノ酸は独立に選択され、Ｙ１、・・・、Ｙｉ、・・・Ｙｎのアミノ酸も独立に選択される。）
2. 前記アミノ酸配列はＸ−Ｙ−Ｇｌｙからなる基本ユニットが７回又は８回以上繰り返されたアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１に記載の薬物担体。（ここでＸ及びＹは独立に選択される任意のアミノ酸である。）
3. 前記アミノ酸配列はＰｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙからなる基本ユニットが７回又は８回以上繰り返されたアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項２に記載の薬物担体。
4. 前記基本ユニットは連続して繰り返されることを特徴とする、請求項２又は３に記載の薬物担体。
5. 前記ペプチドはプロリン残基のヒドロキシル化以外の修飾を受けることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか１つに記載の薬物担体。
6. 前記ペプチドは配列番号１ないし６、及び、９ないし１２からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１に記載の薬物担体。
7. 薬物の送達に用いられることを特徴とする、請求項１ないし６のいずれか１つに記載の薬物担体。
8. 前記薬物は、治療及び／又は診断のための医薬であることを特徴とする、請求項７に記載の薬物担体。
9. 前記ペプチドはホモ又はヘテロ３量体であることを特徴とする、請求項１ないし８のいずれか１つに記載の薬物担体。
10. 請求項１ないし９のいずれか１つに記載の薬物担体に薬物が結合した化合物を含むことを特徴とする、医薬組成物。
11. イメージングのために用いられることを特徴とする、請求項１０に記載の医薬組成物。
12. 生体機能測定のために用いられることを特徴とする、請求項１０又は１１に記載の医薬組成物。

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