CN107847554A - 治疗性肽及其使用方法 - Google Patents

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CN107847554A CN201680036229.8A CN201680036229A CN107847554A CN 107847554 A CN107847554 A CN 107847554A CN 201680036229 A CN201680036229 A CN 201680036229A CN 107847554 A CN107847554 A CN 107847554A
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Abstract

披露了归巢、分布至、靶向、被导向至或积累于肿瘤、癌症或患病细胞中的肽。还披露了跨过血脑屏障，并且归巢、分布至、靶向、被导向至或积累于脑和脑的特定区域中的肽。另外披露了肽或包含此类肽的肽‑活性剂复合物的药物组合物和用途。可以将这样的组合物配制成用于将药物靶向递送或非靶向递送至靶区域、组织、结构或细胞。本披露的靶向组合物可以将肽或肽‑活性剂复合物递送至由该肽靶向的靶区域、组织、结构或细胞。

Description

治疗性肽及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请涉及2015年6月26日提交的美国临时专利申请号62/185,529；2015年6月26日提交的美国临时专利申请号62/185,527；2015年10月9日提交的美国临时专利申请号62/239,743；2015年10月9日提交的美国临时专利申请号62/239,739；2016年4月14日提交的美国临时专利申请号62/322,724；以及2016年6月24日提交的美国临时专利申请号62/354,642，将这些申请中的每个以其全文通过引用并入本文。
背景技术
对于许多类型的癌症，患者预后直接受到药物疗法的功效和外科手术进入肿瘤的影响。具体而言，肿瘤切除的精确度取决于术中成像以检测肿瘤边缘或癌细胞的小病灶。然而，目前的术中成像癌性组织的方法是不精确的。
在这些癌症类型中，脑障碍是特别难以治疗的。血-脑屏障(BBB)可以排除97％以上的小分子进入脑，并且大分子(如抗体)几乎被普遍排除。通常，进入脑的大多数分子都是小的、亲脂性的，并且缺乏靶特异性。旨在治疗脑障碍的药物很少证明是治疗上可行的，其中缺乏进入靶组织是失败的主要原因。另外，许多能够进入脑的药物并不适合治疗脑病症。缺乏进入靶组织和缺乏特异性还导致给予这样的剂量，这些剂量高于如果药物可以归巢、靶向或被导向至脑中的靶区域、组织、结构或细胞的话必需的剂量。
类似地，其他类型的癌症(特别是若干种类型的实体瘤)难以治疗，因为难以在此类肿瘤中达到有效药物的足够高的水平而同时控制药物在正常组织中的副作用。因此，需要将药物特异性地靶向实体瘤，以在肿瘤中达到药物的更高有效剂量，同时使其他组织中的副作用水平最小化。此外，还需要将药物特异性地靶向任何癌性细胞，无论是来自实体瘤还是其他。典型的癌症药物方案通常受限于剂量限制性毒性，并且尽管一些抗体-药物缀合物用于将药物靶向特定肿瘤以便于限制异位毒性，但是这样的特定疗法并不适用于许多肿瘤类型。在本文中，提供了靶向肿瘤的新肽。
发明内容
本披露涉及用于治疗肿瘤的组合物和方法。本文描述的是给予受试者后归巢、分布至、靶向、被导向至、积累于、迁移至和/或结合至癌性细胞的肽。在一些实施例中，本文的组合物和方法利用给予受试者后归巢、分布至、靶向、被导向至、积累于、迁移至和/或结合至脑中的癌性细胞或患病细胞的肽。在一些实施例中，本披露的归巢肽用于将活性剂递送至其组织或细胞。
在多个方面中，本披露提供了如下肽，该肽包含SEQ ID NO:198–SEQ ID NO:209或SEQ ID NO:407–SEQ ID NO:418中任一者的序列或其片段。
在多个方面中，本披露提供了如下肽，该肽包含与SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:192或SEQ ID NO:210–SEQ ID NO:401中任一者具有至少80％序列一致性的序列或其片段。在一些方面中，该肽包含与SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:192或SEQ ID NO:210–SEQ ID NO:401中任一者具有至少85％、至少90％或至少95％序列一致性的序列或其片段。在其他方面中，该肽包含如下序列或其片段，该序列是SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:192或SEQ ID NO:210–SEQ IDNO:401中的任一者。
在多个方面中，本披露提供了如下肽，该肽包含SEQ ID NO:198–SEQ ID NO:209中任一者的序列或其片段。
在多个方面中，本披露提供了如下肽，该肽包含与SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:192中任一者具有至少80％序列一致性的序列或其片段。在一些方面中，该肽包含与SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:192中任一者具有至少85％、至少90％或至少95％序列一致性的序列或其片段。在其他方面中，该肽包含如下序列或其片段，该序列是SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:192中的任一者。
在多个方面中，本披露提供了如下肽，该肽包含SEQ ID NO:407–SEQ ID NO:418中任一者的序列或其片段。
在多个方面中，本披露提供了如下肽，该肽包含与SEQ ID NO:210–SEQ ID NO:401中任一者具有至少80％序列一致性的序列或其片段。在一些方面中，该肽包含与SEQ IDNO:210–SEQ ID NO:401中任一者具有至少85％、至少90％或至少95％序列一致性的序列或其片段。在其他方面中，该肽包含如下序列或其片段，该序列是SEQ ID NO:210–SEQ ID NO:401中的任一者。
在一些方面中，本披露的任何肽是打结肽。在其他方面中，该肽包含至少6个、至少8个、至少10个、至少12个、至少14个或至少16个半胱氨酸残基。在一些方面中，该肽包含半胱氨酸残基之间形成的多个二硫桥。在进一步的方面中，至少5％或更多的残基是形成分子内二硫键的半胱氨酸。在一些方面中，该肽包含穿过二硫化物结的二硫化物。
在一些方面中，该肽的至少一个氨基酸残基处于L构型，或其中该肽的至少一个氨基酸残基处于D构型。在一些方面中，该序列是至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45、至少46、至少47、至少48、至少49、至少50、至少51、至少52、至少53、至少54、至少55、至少56、至少57、至少58个残基、至少59、至少60、至少61、至少62、至少63、至少64、至少65、至少66、至少67、至少68、至少69、至少70、至少71、至少72、至少73、至少74、至少75、至少76、至少77、至少78、至少79、至少80或至少81个残基长。
在一些方面中，该肽与至少一种其他的肽被安排成多聚体结构。
在一些方面中，该肽在生理pH下具有高于+0.5的净正电荷。在其他方面中，该肽在生理pH下具有低于-0.5的净负电荷。
在一些方面中，在给予受试者后，该肽归巢、靶向、积累于、迁移至或被导向至受试者的特定区域、组织、结构或细胞。
在一些方面中，该肽的至少一个残基包含化学修饰。在一些方面中，该化学修饰封闭该肽的N末端。在一些方面中，该修饰是甲基化、乙酰化或酰化。在其他方面中，该化学修饰是：一个或多个赖氨酸残基或其类似物的甲基化；N末端的甲基化；或一个或多个赖氨酸残基或其类似物的甲基化和N末端的甲基化。在一些方面中，该肽连接至酰基加合物。
在一些方面中，该肽连接至活性剂。在进一步的方面中，该活性剂与该肽在该肽的N末端或C末端融合。在一些方面中，该活性剂是神经降压素肽。在进一步的方面中，该神经降压素肽具有SEQ ID NO:420的序列。在又进一步的方面中，与神经降压素肽融合的该肽包含连续序列。在一些方面中，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种活性剂连接至该肽。
在一些方面中，该肽通过可切割接头连接至该活性剂。在其他方面中，该肽通过接头在该肽的以下位置连接至该活性剂：在N末端处、在内部赖氨酸残基的ε胺处、在天冬酰胺或谷氨酰胺残基的羧酸处或在C末端处。在进一步的方面中，该内部赖氨酸残基位于对应于SEQ ID NO:37的氨基酸残基17、SEQ ID NO:37的氨基酸残基25或SEQ ID NO:37的氨基酸残基29的位置。在其他方面中，该内部赖氨酸残基位于对应于SEQ ID NO:246的氨基酸残基15、SEQ ID NO:246的氨基酸残基23或SEQ ID NO:246的氨基酸残基27的位置。
在其他方面中，该肽进一步包含非天然氨基酸，其中该非天然氨基酸是另一氨基酸的插入物、附加物或替代物。
在一些方面中，该肽通过接头在该非天然氨基酸处连接至该活性剂。在其他方面中，该接头包含酰胺键、酯键、氨基甲酸酯键、碳酸酯键、腙键、肟键、二硫键、硫酯键或碳-氮键。在进一步的方面中，该可切割接头包含基质金属蛋白酶、凝血酶、组织蛋白酶或β-葡萄糖醛酸酶的切割位点。在一些方面中，该肽通过非可切割接头连接至该活性剂。
在一些方面中，该活性剂选自下组，该组由以下各项组成：肽、多肽、多核苷酸、抗体、单链可变区片段(scFv)、抗体片段、细胞因子、激素、生长因子、检查点抑制剂、免疫调节剂、神经递质、化学剂、细胞毒分子、毒素、放射增敏剂、辐射防护剂、治疗性小分子、纳米粒子、脂质体、聚合物、树状物、脂肪酸、拟肽、补体固定肽或蛋白质、聚乙二醇、脂质或Fc区域。在其他方面中，该活性剂是多脱氧核糖核苷酸或多核糖核苷酸序列。在另外的方面中，该活性剂是抗炎剂、抗真菌剂、抗病毒剂或抗感染剂。在一些方面中，该活性剂是化学治疗剂。在其他方面中，该活性剂是打结肽。在又其他方面中，该活性剂是放射增敏剂或光敏剂。在一些方面中，该细胞毒分子是澳瑞他汀(auristatin)、MMAE、美登木素生物碱(maytansinoid)、DM1、DM4、多柔比星、卡里奇霉素、铂类化合物、顺铂、紫杉烷、紫杉醇、SN-38、BACE抑制剂、Bcl-xL抑制剂、WEHI-539、维内托克斯(venetoclax)、ABT-199、纳威托克斯(navitoclax)、AT-101、奥巴托克斯(obatoclax)、吡咯并苯并二氮杂卓或吡咯并苯并二氮杂卓二聚体或多拉他汀(dolastatin)。
在其他方面中，该肽连接至可检测剂。在进一步的方面中，该可检测剂与该肽在该肽的N末端或C末端融合。在又进一步的方面中，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种可检测剂连接至该肽。
在一些方面中，该肽通过可切割接头连接至该可检测剂。在其他方面中，该肽通过接头在该肽的以下位置连接至该可检测剂：在N末端处、在内部赖氨酸残基的ε胺处或在C末端处。在进一步的方面中，该内部赖氨酸位于对应于SEQ ID NO:37的氨基酸残基17、SEQ IDNO:37的氨基酸残基25或SEQ ID NO:37的氨基酸残基29的位置。在其他方面中，该内部赖氨酸残基位于对应于SEQ ID NO:246的氨基酸残基15、SEQ ID NO:246的氨基酸残基23或SEQID NO:246的氨基酸残基27的位置。
在一些方面中，该肽进一步包含非天然氨基酸，其中该非天然氨基酸是另一氨基酸的插入物、附加物或替代物。
在一些方面中，该肽通过接头在该非天然氨基酸处连接至该活性剂。在其他方面中，该接头包含酰胺键、酯键、氨基甲酸酯键、腙键、肟键或碳-氮键。在进一步的方面中，该可切割接头包含基质金属蛋白酶、凝血酶、组织蛋白酶或β-葡萄糖醛酸酶的切割位点。在一些方面中，该肽通过非可切割接头连接至该可检测剂。
在其他方面中，该可检测剂是荧光团、近红外染料、造影剂、纳米粒子、含有金属的纳米粒子、金属螯合物、X射线造影剂、PET剂、放射性同位素或放射性核素螯合剂。在一些方面中，该可检测剂是荧光染料。
在一些方面中，该肽归巢、靶向、被导向至、积累于或迁移至肿瘤或癌性细胞。在一些方面中，该肿瘤是实体瘤。在其他方面中，该肿瘤是血液系统恶性肿瘤。在进一步的方面中，该肽穿透该实体瘤。在又进一步的方面中，该肽内化到或穿透癌性细胞。在一些方面中，该肿瘤或癌性细胞来自脑癌、胶质母细胞瘤、结肠癌、三阴性乳癌、转移性癌症或肉瘤。
在一些方面中，该肽跨过血脑屏障从而进入该肿瘤。在其他方面中，该肽跨过血脑脊液屏障从而进入该肿瘤。
在一些方面中，该肽跨过受试者的血脑屏障或血脑脊液屏障。在其他方面中。在其他方面中，该肽跨过受试者的血脑脊液屏障。
在一些方面中，在跨过血脑屏障后，该肽归巢、靶向、被导向至、积累于或迁移至受试者的肿瘤或患病区域、组织、结构或细胞。
在其他方面中，在给予受试者后，该肽归巢、靶向、被导向至、积累于或迁移至受试者的特定脑区域。在进一步的方面中，脑的特定区域包括脑室、脑脊液、海马体、脑膜、嘴侧迁移系统、齿状回、脑室下区或其任何组合。
在一些方面中，该肽影响神经障碍、溶酶体贮积病、癫痫、脑膜炎、脑中的感染、中风和多发性硬化症。在一些方面中，该肽影响与神经退行性疾病关联的蛋白质聚集。在其他方面中，该肽抑制与脑癌关联的途径。在又其他方面中，该肽抑制或激活离子通道。在一些方面中，该肽展示出蛋白酶抑制剂活性。在其他方面中，该肽具有抗细菌、抗真菌或抗病毒活性。
在多个方面中，本披露提供了如下药物组合物，该药物组合物包含本披露的肽或其盐和药学上可接受的载体。在一些方面中，将该药物组合物配制成用于给予受试者。在进一步的方面中，将该药物组合物配制成用于吸入、鼻内给药、口服给药、局部给药、静脉内给药、皮下给药、关节内给药、肌内给药、鞘内给药、腹膜内给药或其组合。
在多个方面中，本披露提供了治疗对其有需要的受试者的病症的方法，该方法包括向受试者给予本披露的肽或药物组合物。在一些方面中，通过吸入、鼻内地、口服地、局部地、静脉内地、皮下地、关节内地、肌内地、腹膜内地或其组合给予该肽或药物组合物。
在一些方面中，该方法的肽或药物组合物。在一些方面中，该病症是肿瘤或癌症。在进一步的方面中，该病症是实体瘤。在一些方面中，该肿瘤是血液系统恶性肿瘤。在其他方面中，该病症是脑肿瘤、三阴性乳癌、结肠癌转移、转移性癌症或肉瘤。在进一步的方面中，该脑肿瘤是不宜动手术的。
在一些方面中，该方法的肽跨过血脑屏障从而归巢、靶向、迁移至、积累于或被导向至脑中的肿瘤。在一些方面中，该肽跨过血脑脊液屏障从而归巢、靶向、迁移至、积累于或被导向至脑中的肿瘤。
在一些方面中，将该方法与其他治疗组合。在进一步的方面中，这些其他的治疗包括化学疗法、放射疗法或免疫调节疗法。
在一些方面中，在给予后，该方法的肽跨越受试者的血脑屏障。在其他方面中，在给予后，该肽跨越受试者的血脑脊液屏障。
在一些方面中，在给予后，该方法的肽归巢、靶向、被导向至、积累于或迁移至受试者的脑室、脑脊液、脑膜、嘴侧迁移系统或海马体。在一些方面中，该病症是脑病症。在其他方面中，该病症是与脑室、脑脊液或海马体的功能关联的。在进一步的方面中，该脑病症是与脑的功能关联的。
在一些方面中，该方法的肽诊断、预防或治疗该脑病症。在进一步的方面中，该脑病症是脑肿瘤或脑癌。在其他方面中，该脑病症是记忆丧失或记忆功能、阿尔茨海默病、帕金森病、多系统萎缩(MSA)、精神分裂症、癫痫、进行性多灶性白质脑病、真菌感染、抑郁、双相型障碍、创伤后应激障碍、中风、创伤性脑损伤、感染或多发性硬化症。
在多个方面中，本披露提供了对受试者的器官或身体区域成像的方法，该方法包括向受试者给予本披露的肽或药物组合物，并且对受试者的器官或身体区域成像。
在一些方面中，该方法包括检测受试者的癌症或患病区域、组织、结构或细胞。在进一步的方面中，该方法包括对受试者进行外科手术。在又进一步的方面中，该方法包括治疗该癌症。
在一些方面中，该方法的外科手术包括去除受试者的癌症或患病区域、组织、结构或细胞。在进一步的方面中，该方法包括在外科手术去除后，对受试者的癌症或患病区域、组织、结构或细胞成像。
通过引用并入
本说明书中提到的、披露的或引用的所有出版物、专利和专利申请都以其全文通过引用并入本文，并且如同每一单独的出版物、专利或专利申请具体且单独地指明通过引用并入。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求书中具体阐述。通过参考对说明性实施例进行阐述的以下详细说明，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，在所述实施例中利用了本发明的原理，并且在所述附图中：
图1说明了通过甲基化赖氨酸而放射性标记的肽。图1A说明了天然的赖氨酸，并且图1B说明了二甲基化的赖氨酸。
图2说明了氟西汀(顶部)和菊糖(底部)对照组的在脑和其他组织中的14C信号。
图3说明了SEQ ID NO:1的放射性标记肽的在脑和其他组织中的14C信号。
图4说明了SEQ ID NO:3的放射性标记肽的在脑和其他组织中的14C信号。
图5说明了SEQ ID NO:1的肽的HPLC谱。
图6说明了SEQ ID NO:2的肽的非还原样品和还原样品的HPLC谱的重叠。
图7说明了SEQ ID NO:3的肽的非还原样品和还原样品的HPLC谱的重叠。
图8说明了SEQ ID NO:4的肽的HPLC谱。
图9说明了表达SEQ ID NO:1到SEQ ID:NO.4的构建体的示例性构造。
图10说明了制备本披露的肽的方法的示意图。
图11说明了来自以下项的肽的小规模表达运行的质量控制数据：SEQ ID NO:4(图11A)、SEQ ID NO:6(图11B)、SEQ ID NO:17(图11C)、SEQ ID NO:25(图11D)和SEQ ID NO:32(图11E)。
图12说明了SEQ ID NO:39肽的HPLC数据和SDS-PAGE凝胶上的非还原对比还原条带，以及SEQ ID NO:25肽的MALDI质谱图。
图12A说明了SEQ ID NO:39的HPLC谱。
图12B说明了在SDS-PAGE凝胶上SEQ ID NO:39的非还原和还原条带。
图12C显示了SEQ ID NO:25的MALDI质谱图的完整谱图。
图12D显示了SEQ ID NO:25的MALDI质谱图的完整谱图的放大部分。
图13说明了在给予9nmol的缀合至Alexa 647荧光染料的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RA肽缀合物)后三小时，鼠类白光和对应的放射自显影图像。
图13A说明了在给予9nmol的缀合至Alexa 647荧光染料的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RA肽缀合物)后三小时，小鼠的冷冻切片的白光图像。
图13B说明了对应于图13A的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予9nmol的缀合至Alexa 647荧光染料的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RA肽缀合物)后三小时，小鼠组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。
图13C说明了在给予9nmol的缀合至Alexa 647荧光染料的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RA肽缀合物)后三小时，与在图13A和图13B中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。
图13D说明了对应于图13C的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予9nmol的缀合至Alexa 647荧光染料的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RA肽缀合物)后三小时，组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。
图13E说明了在给予9nmol的缀合至Alexa 647荧光染料的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RA肽缀合物)后三小时，与在图13A到图13D中所示不同小鼠的冷冻切片的白光图像。
图13F说明了对应于图13E的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予9nmol的缀合至Alexa 647荧光染料的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RA肽缀合物)后三小时，小鼠组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。
图13G说明了在给予9nmol的缀合至Alexa 647荧光染料的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RA肽缀合物)后三小时，与在图13E和图13F中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。
图13H说明了对应于图13G的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予9nmol的缀合至Alexa 647荧光染料的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RA肽缀合物)后三小时，组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。
图14说明了在给予9nmol的缀合至Alexa 647荧光染料的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RA肽缀合物)后二十四小时，鼠类白光和对应的放射自显影图像。
图14A说明了在给予9nmol的缀合至Alexa 647荧光染料的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RA肽缀合物)后二十四小时，小鼠的冷冻切片的白光图像。
图14B说明了对应于图14A的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予9nmol的缀合至Alexa 647荧光染料的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RA肽缀合物)后二十四小时，小鼠组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。
图14C说明了在给予9nmol的缀合至Alexa 647荧光染料的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RA肽缀合物)后二十四小时，与在图14A和图14B中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。
图14D说明了对应于图14C的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予9nmol的缀合至Alexa 647荧光染料的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RA肽缀合物)后二十四小时，组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。
图14E说明了在给予9nmol的缀合至Alexa 647荧光染料的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RA肽缀合物)后二十四小时，与在图14A到图14D中所示不同小鼠的冷冻切片的白光图像。
图14F说明了对应于图14E的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予9nmol的缀合至Alexa 647荧光染料的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RA肽缀合物)后二十四小时，小鼠组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。
图14G说明了在给予9nmol的缀合至Alexa 647荧光染料的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RA肽缀合物)后二十四小时，与在图14E和图14F中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。
图14H说明了对应于图14G的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予9nmol的缀合至Alexa 647荧光染料的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RA肽缀合物)后二十四小时，组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。
图15说明了在给予11nmol的通过缬氨酸-瓜氨酸接头缀合至MMAE的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RZ肽缀合物)后三小时，鼠类白光和对应的放射自显影图像。
图15A说明了在给予11nmol的用缬氨酸-瓜氨酸接头缀合至MMAE的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RZ肽缀合物)后三小时，小鼠的冷冻切片的白光图像。
图15B说明了对应于图15A的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予11nmol的通过缬氨酸-瓜氨酸接头缀合至MMAE的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RZ肽缀合物)后三小时，小鼠组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。
图15C说明了在给予11nmol的通过缬氨酸-瓜氨酸接头缀合至MMAE的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RZ肽缀合物)后三小时，与在图15A和图15B中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。
图15D说明了对应于图15C的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予11nmol的通过缬氨酸-瓜氨酸接头缀合至MMAE的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RZ肽缀合物)后三小时，组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。
图15E说明了在给予11nmol的通过缬氨酸-瓜氨酸接头缀合至MMAE的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RZ肽缀合物)后三小时，与在图15A到图15D中所示不同小鼠的冷冻切片的白光图像。
图15F说明了对应于图15E的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予11nmol的通过缬氨酸-瓜氨酸接头缀合至MMAE的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RZ肽缀合物)后三小时，小鼠组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。
图15G说明了在给予11nmol的通过缬氨酸-瓜氨酸接头缀合至MMAE的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RZ肽缀合物)后三小时，与在图15E和图15F中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。
图15H说明了对应于图15G的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予11nmol的通过缬氨酸-瓜氨酸接头缀合至MMAE的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RZ肽缀合物)后三小时，组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。
图16说明了在给予11nmol的通过缬氨酸-瓜氨酸接头缀合至MMAE的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RZ肽缀合物)后二十四小时，鼠类白光和对应的放射自显影图像。
图16A说明了在给予11nmol的通过缬氨酸-瓜氨酸接头缀合至MMAE的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RZ肽缀合物)后二十四小时，小鼠的冷冻切片的白光图像。
图16B说明了对应于图16A的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予11nmol的通过缬氨酸-瓜氨酸接头缀合至MMAE的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RZ肽缀合物)后二十四小时，小鼠组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。
图16C说明了在给予11nmol的通过缬氨酸-瓜氨酸接头缀合至MMAE的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RZ肽缀合物)后二十四小时，与在图16A和图16B中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。
图16D说明了对应于图16C的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予11nmol的通过缬氨酸-瓜氨酸接头缀合至MMAE的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RZ肽缀合物)后二十四小时，组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。
图16E说明了在给予11nmol的通过缬氨酸-瓜氨酸接头缀合至MMAE的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RZ肽缀合物)后二十四小时，与在图16A到图16D中所示不同小鼠的冷冻切片的白光图像。
图16F说明了对应于图16E的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予11nmol的通过缬氨酸-瓜氨酸接头缀合至MMAE的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RZ肽缀合物)后二十四小时，小鼠组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。
图16G说明了在给予11nmol的通过缬氨酸-瓜氨酸接头缀合至MMAE的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RZ肽缀合物)后二十四小时，与在图16E和图16F中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。
图16H说明了对应于图16G的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予11nmol的通过缬氨酸-瓜氨酸接头缀合至MMAE的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RZ肽缀合物)后二十四小时，组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。
图17说明了在给予12.8nmol的SEQ ID NO:5肽的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-R肽)后三小时，鼠类白光和对应的放射自显影图像。
图17A说明了在给予12.8nmol的SEQ ID NO:5肽的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-R肽)后三小时，小鼠的冷冻切片的白光图像。
图17B说明了对应于图17A的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予12.8nmol的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-R肽)后三小时，小鼠组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。
图17C说明了在给予12.8nmol的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-R肽)后三小时，与在图17A和图17B中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。
图17D说明了对应于图17C的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予12.8nmol的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-R肽)后三小时，组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。
图17E说明了在给予12.8nmol的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-R肽)后三小时，与在图17A到图17D中所示不同小鼠的冷冻切片的白光图像。
图17F说明了对应于图17E的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予12.8nmol的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-R肽)后三小时，小鼠组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。
图17G说明了在给予12.8nmol的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-R肽)后三小时，与在图17E和图17F中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。
图17H说明了对应于图17G的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予12.8nmol的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-R肽)后三小时，组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。
图18说明了在给予14nmol的通过非可切割接头缀合至DM-1的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RY肽缀合物)后三小时，鼠类白光和对应的放射自显影图像。
图18A说明了在给予14nmol的通过非可切割接头缀合至DM-1的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RY肽缀合物)后三小时，小鼠的冷冻切片的白光图像。
图18B说明了对应于图18A的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予14nmol的通过非可切割接头缀合至DM-1的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RY肽缀合物)后三小时，小鼠组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。
图18C说明了在给予14nmol的通过非可切割接头缀合至DM-1的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RY肽缀合物)后三小时，与在图18A和图18B中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。
图18D说明了对应于图18C的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予14nmol的通过非可切割接头缀合至DM-1的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RY肽缀合物)后三小时，组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。
图18E说明了在给予14nmol的通过非可切割接头缀合至DM-1的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RY肽缀合物)后三小时，与在图18A到图18D中所示不同小鼠的冷冻切片的白光图像。
图18F说明了对应于图18E的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予14nmol的通过非可切割接头缀合至DM-1的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RY肽缀合物)后三小时，小鼠组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。
图18G说明了在给予14nmol的通过非可切割接头缀合至DM-1的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RY肽缀合物)后三小时，与在图18E和图18F中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。
图18H说明了对应于图18G的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予14nmol的通过非可切割接头缀合至DM-1的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RY肽缀合物)后三小时，组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。
图19说明了在给予14nmol的通过非可切割接头缀合至DM-1的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RY肽缀合物)后二十四小时，鼠类白光和对应的放射自显影图像。
图19A说明了在给予14nmol的通过非可切割接头缀合至DM-1的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RY肽缀合物)后二十四小时，小鼠的冷冻切片的白光图像。
图19B说明了对应于图19A的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予14nmol的通过非可切割接头缀合至DM-1的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RY肽缀合物)后二十四小时，小鼠组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。
图19C说明了在给予14nmol的通过非可切割接头缀合至DM-1的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RY肽缀合物)后二十四小时，与在图19A和图19B中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。
图19D说明了对应于图19C的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予14nmol的通过非可切割接头缀合至DM-1的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RY肽缀合物)后二十四小时，组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。
图19E说明了在给予14nmol的通过非可切割接头缀合至DM-1的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RY肽缀合物)后二十四小时，与在图19A到图19D中所示不同小鼠的冷冻切片的白光图像。
图19F说明了对应于图19E的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予14nmol的通过非可切割接头缀合至DM-1的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RY肽缀合物)后二十四小时，小鼠组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。
图19G说明了在给予14nmol的通过非可切割接头缀合至DM-1的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RY肽缀合物)后二十四小时，与在图19E和图19F中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。
图19H说明了对应于图19G的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予14nmol的通过非可切割接头缀合至DM-1的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RY肽缀合物)后二十四小时，组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。
图20说明了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:37肽后3小时，来自具有完整肾的小鼠的白光和对应的放射自显影图像。
图20A说明了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:37肽后3小时，具有完整肾的小鼠的冷冻切片的白光图像。
图20B说明了对应于图20A的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:37肽后3小时，具有完整肾的小鼠组织中的肽分布。
图20C说明了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:37肽后3小时，与在图20A和图20B中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。
图20D说明了对应于图20C的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:37肽后3小时，小鼠组织中的肽分布。
图20E说明了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:37肽后3小时，与在图20A到图20D中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。
图20F说明了对应于图20E的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:37肽后3小时，小鼠组织中的肽分布。
图20G说明了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:37肽后3小时，与在图20A到图20F中所示具有完整肾的不同小鼠的冷冻切片的白光图像。
图20H说明了对应于图20G的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:37肽后3小时，小鼠组织中的肽分布。
图20I说明了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:37肽后3小时，与在图20G和图20H中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。
图20J说明了对应于图20I的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:37肽后3小时，小鼠组织中的肽分布。
图20K说明了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:37肽后3小时，与在图20G到图20J中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。
图20L说明了对应于图20K的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:37肽后3小时，小鼠体内的肽分布。
图21说明了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:37肽后3小时，来自具有结扎肾的小鼠的白光和对应的放射自显影图像。
图21A说明了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:37肽后3小时，具有结扎肾的小鼠的冷冻切片的白光图像。
图21B说明了对应于图21A的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:37肽后3小时，具有结扎肾的小鼠组织中的肽分布。
图21C说明了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:37肽后3小时，与在图21A和图21B中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。
图21D说明了对应于图21C的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:37肽后3小时，小鼠组织中的肽分布。
图21E说明了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:37肽后3小时，与在图21A到图21D中所示具有结扎肾的不同小鼠的冷冻切片的白光图像。
图21F说明了对应于图21E的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:37肽后3小时，小鼠组织中的肽分布。
图21G说明了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:37肽后3小时，与在图21E和图21F中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。
图21H说明了对应于图21G的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:37肽后3小时，小鼠组织中的肽分布。
图22说明了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:35肽后3小时，来自具有完整肾的小鼠的白光和对应的放射自显影图像。
图22A说明了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:35肽后3小时，具有完整肾的小鼠的冷冻切片的白光图像。
图22B说明了对应于图22A的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:35肽后3小时，具有完整肾的小鼠组织中的肽分布。
图22C说明了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:35肽后3小时，与在图22A和图22B中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。
图22D说明了对应于图22C的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:35肽后3小时，小鼠组织中的肽分布。
图22E说明了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:35肽后3小时，与在图22A到图22D中所示具有完整肾的不同小鼠的冷冻切片的白光图像。
图22F说明了对应于图22E的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:35肽后3小时，小鼠组织中的肽分布。
图22G说明了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:35肽后3小时，与在图22E和图22F中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。
图22H说明了对应于图22G的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:35肽后3小时，小鼠组织中的肽分布。
图23说明了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:35肽后3小时，来自具有结扎肾的小鼠的白光和对应的放射自显影图像。
图23A说明了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:35肽后3小时，具有结扎肾的小鼠的冷冻切片的白光图像。
图23B说明了对应于图23A的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:35肽后3小时，具有结扎肾的小鼠组织中的肽分布。
图23C说明了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:35肽后3小时，与在图23A和图23B中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。
图23D说明了对应于图23C的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:35肽后3小时，小鼠组织中的肽分布。
图23E说明了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:35肽后3小时，与在图23A到图23D中所示具有结扎肾的不同小鼠的冷冻切片的白光图像。
图23F说明了对应于图23E的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的SEQ ID NO:35肽后3小时，小鼠组织中的肽分布。
图23G说明了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:35肽后3小时，与在图23E和图23F中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。
图23H说明了对应于图23G的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:35肽后3小时，小鼠组织中的肽分布。
图24显示了给药后SEQ ID NO:5肽的半衰期的图。
图25显示了从给予以下项后4小时的小鼠切离的尤文氏肉瘤肿瘤或从未接受任何肽的小鼠切离的尤文氏肉瘤肿瘤的近红外荧光图像的比较：10nmol的缀合至AF647荧光染料的SEQ ID NO:4肽(SEQ ID NO:4-A肽缀合物)、10nmol的缀合至AF647荧光染料的欧前胡素(Imperatoxin)(欧前胡素-A缀合物)、10nmol的缀合至AF647荧光染料的芋螺毒素CVIC(芋螺毒素-A缀合物)或10nmol的缀合至AF647荧光染料的SEQ ID NO:54肽(SEQ ID NO:54-A肽缀合物)。
图25A显示了在给予10nmol的缀合至AF647荧光染料的SEQ ID NO:4肽(SEQ IDNO:4-A肽缀合物)后4小时，从小鼠切离的尤文氏肉瘤肿瘤的近红外荧光图像。
图25B显示了在给予10nmol的缀合至AF647荧光染料的SEQ ID NO:4肽(SEQ IDNO:4-A肽缀合物)后4小时，从与图25A中不同小鼠切离的尤文氏肉瘤肿瘤的近红外荧光图像。
图25C显示了在给予10nmol的缀合至AF647荧光染料的欧前胡素(欧前胡素-A缀合物)后4小时，从小鼠切离的尤文氏肉瘤肿瘤的近红外荧光图像。
图25D显示了在给予10nmol的缀合至AF647荧光染料的欧前胡素(欧前胡素-A缀合物)后4小时，从与图25C中不同小鼠切离的尤文氏肉瘤肿瘤的近红外荧光图像。
图25E显示了在给予10nmol的缀合至AF647荧光染料的芋螺毒素CVIC(芋螺毒素-A缀合物)后4小时，从小鼠切离的尤文氏肉瘤肿瘤的近红外荧光图像。
图25F显示了在给予10nmol的缀合至AF647荧光染料的SEQ ID NO:54肽(SEQ IDNO:54-A肽缀合物)后4小时，从小鼠切离的尤文氏肉瘤肿瘤的近红外荧光图像。
图25G显示了从未接受任何肽的作为阴性对照的小鼠切离的尤文氏肉瘤肿瘤的近红外荧光图像。
图26显示了从给予以下项后4小时的小鼠切离的尤文氏肉瘤肿瘤或从未接受任何肽的小鼠切离的尤文氏肉瘤肿瘤的近红外荧光图像的比较：10nmol的缀合至AF647荧光染料的SEQ ID NO:4肽(SEQ ID NO:4-A肽缀合物)、10nmol的缀合至AF647荧光染料的欧前胡素(欧前胡素-A缀合物)、10nmol的缀合至AF647荧光染料的芋螺毒素CVIC(芋螺毒素-A缀合物)或10nmol的缀合至AF647荧光染料的SEQ ID NO:54肽(SEQ ID NO:54-A肽缀合物)。
图26A显示了在给予10nmol的缀合至AF647荧光染料的SEQ ID NO:4肽(SEQ IDNO:4-A肽缀合物)后4小时，从小鼠切离的肾的近红外荧光图像。
图26B显示了在给予10nmol的缀合至AF647荧光染料的SEQ ID NO:4肽(SEQ IDNO:4-A肽缀合物)后4小时，从与图26A中不同小鼠切离的肾的近红外荧光图像。
图26C显示了在给予10nmol的缀合至AF647荧光染料的欧前胡素(欧前胡素-A缀合物)后4小时，从小鼠切离的肾的近红外荧光图像。
图26D显示了在给予10nmol的缀合至AF647荧光染料的欧前胡素(欧前胡素-A缀合物)后4小时，从与图26C中不同小鼠切离的肾的近红外荧光图像。
图26E显示了在给予10nmol的缀合至AF647荧光染料的芋螺毒素CVIC(芋螺毒素-A缀合物)后4小时，从小鼠切离的肾的近红外荧光图像。
图26F显示了在给予10nmol的缀合至AF647荧光染料的SEQ ID NO:54肽(SEQ IDNO:54-A肽缀合物)后4小时，从小鼠切离的肾的近红外荧光图像。
图26G显示了从未接受任何肽的作为阴性对照的小鼠切离的肾的近红外荧光图像。
图27显示了从给予以下项后4小时的小鼠切离的肝或从未接受任何肽的小鼠切离的肝的近红外荧光图像：10nmol的缀合至AF647荧光染料的SEQ ID NO:4肽(SEQ ID NO:4-A肽缀合物)、10nmol的缀合至AF647荧光染料的欧前胡素(欧前胡素-A缀合物)、10nmol的缀合至AF647荧光染料的芋螺毒素CVIC(芋螺毒素-A缀合物)或10nmol的缀合至AF647荧光染料的SEQ ID NO:54肽(SEQ ID NO:54-A肽缀合物)。
图27A显示了在给予10nmol的缀合至AF647荧光染料的SEQ ID NO:4肽(SEQ IDNO:4-A肽缀合物)后4小时，从小鼠切离的肝的近红外荧光图像。
图27B显示了在给予10nmol的缀合至AF647荧光染料的SEQ ID NO:4肽(SEQ IDNO:4-A肽缀合物)后4小时，从与图27A中不同小鼠切离的肝的近红外荧光图像。
图27C显示了在给予10nmol的缀合至AF647荧光染料的欧前胡素(欧前胡素-A缀合物)后4小时，从小鼠切离的肝的近红外荧光图像。
图27D显示了在给予10nmol的缀合至AF647荧光染料的欧前胡素(欧前胡素-A肽缀合物)后4小时，从与图27C中不同小鼠切离的肝的近红外荧光图像。
图27E显示了在给予10nmol的缀合至AF647荧光染料的芋螺毒素CVIC(芋螺毒素-A缀合物)后4小时，从小鼠切离的肝的近红外荧光图像。
图27F显示了在给予10nmol的缀合至AF647荧光染料的SEQ ID NO:54肽(SEQ IDNO:54-A肽缀合物)后4小时，从小鼠切离的肝的近红外荧光图像。
图27G显示了从未接受任何肽的作为阴性对照的小鼠切离的肝的近红外荧光图
图28显示了不同组织的近红外荧光图像，这些组织是从未接受任何肽的小鼠切离的或从给予10nmol的缀合至AF647荧光染料的SEQ ID NO:54肽(SEQ ID NO:54-A肽缀合物)后4小时的小鼠切离的。
图28A显示了不同组织的近红外荧光图像，这些组织是在给予10nmol的缀合至AF647荧光染料的SEQ ID NO:54肽(SEQ ID NO:54-A肽缀合物)后4小时切离的。顶行上的组织从左至右是肿瘤、肾、肝、心脏和引流淋巴结。底行上的组织从左至右是脑、脾、骨骼肌、肺和侧方淋巴结。组织荧光指示肽缀合物的存在。
图28B显示了不同组织的图28A的近红外荧光图像，这些组织是在给予10nmol的缀合至AF647荧光染料的SEQ ID NO:54肽(SEQ ID NO:54-A肽缀合物)后4小时切离的，但是图像没有拍摄肾。顶行上的组织从左至右是肿瘤、肝、心脏和引流淋巴结。底行上的组织从左至右是脑、脾、骨骼肌、肺和侧方淋巴结。组织荧光指示肽缀合物的存在。
图28C显示了从未接受任何肽的作为阴性对照的小鼠切离的不同组织的近红外荧光图像。顶行上的组织从左至右是肿瘤、肾、肝和心脏。底行上的组织从左至右是脑、脾、骨骼肌和肺。组织荧光指示自体荧光。
图29显示了去除肾或未去除肾的小鼠的内部体腔的离体近红外荧光图像，其中在给予10nmol的缀合至AF647荧光染料的SEQ ID NO:54肽(SEQ ID NO:54-A肽缀合物)后4小时使该小鼠安乐死。
图29A显示了如下小鼠的内部体腔的离体近红外荧光图像，使该小鼠在给予10nmol的缀合至AF647荧光染料的SEQ ID NO:54肽(SEQ ID NO:54-A肽缀合物)后4小时安乐死。Lv指示肝的位置。Tm指示肿瘤的位置。Kd指示肾的位置。Bl指示膀胱的位置。
图29B显示了如在图29A中所示的如下小鼠的内部体腔的离体近红外荧光图像，使该小鼠在给予10nmol的缀合至AF647荧光染料的SEQ ID NO:54肽(SEQ ID NO:54-A肽缀合物)后4小时安乐死，但去除了肾。Lv指示肝的位置。Tm指示肿瘤的位置。Bl指示膀胱的位置。Ht指示心脏的位置。Lg指示肺的位置。
图30说明了SEQ ID NO:55肽的在脑中的14C信号。
图31说明了SEQ ID NO:55的肽的HPLC谱，其中还原的和非还原的色谱图重叠了。
图32说明了在全脑匀浆中SEQ ID NO:55的14C标记的肽的HPLC射线照片。
图32A显示了加入到粗的脑匀浆中，并且使用乙腈梯度和0.1％TFA在装备有闪烁探测器的HPLC上在疏水柱上运行的肽。
图32B显示了在放射性标记肽的全身用药后三个小鼠脑的闪烁HPLC迹线。箭头指示在与图32A所示加入型对照相同的保留时间处对应于SEQ ID NO:55的完整14C标记的肽的峰。
图33说明了矢状(图33A)和冠状(图33B)脑切片，其指示SEQ ID NO:55的肽定位至脑中的特定结构(如脑室和CSF)。在图33A和图33B二者中，放射性扫描示出在左侧，其中暗区具有更高的活性。在正常光照下组织的图像示出在右侧。
图34说明了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:39肽后3小时，具有结扎肾的小鼠的白光图像和对应的放射自显影图像。
图34A说明了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:39肽后3小时，具有结扎肾的小鼠的冷冻切片的白光图像。
图34B说明了对应于图34A的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:39肽后3小时，具有结扎肾的小鼠组织中的肽分布。
图35说明了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:36肽后3小时，具有结扎肾的小鼠的白光图像和对应的放射自显影图像。
图35A说明了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:36肽后3小时，具有结扎肾的小鼠的冷冻切片的白光图像。
图35B说明了对应于图35A的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:36肽后3小时，具有结扎肾的小鼠组织中的肽分布。
图36说明了鼠类冠状脑切片的白光和放射自显影图像，其鉴定了在给予100nmol的SEQ ID NO:55的肽的放射性标记的第一经纯化的级分(第一HPLC肽峰)或来自相同HPLC的SEQ ID NO:55的肽的放射性标记的第二经纯化的级分(第二HPLC肽峰)后3小时的肽分布。
图36A在右侧说明了小鼠的冠状脑切片的白光图像并且在左侧说明了对应于白光图像的放射自显影图像。自动绘图图像中的14C信号鉴定了给予100nmol的肽后3小时的肽分布，其指示SEQ ID NO:55的肽的放射性标记的第一经纯化的级分(第一HPLC肽峰)定位至脑中的特定结构(如脑室和CSF)。
图36B在右侧说明了小鼠的冠状脑切片的白光图像并且在左侧说明了对应于白光图像的放射自显影图像。自动绘图图像中的14C信号鉴定了给予100nmol的肽后3小时的肽分布，其指示SEQ ID NO:55的肽的第二经纯化的级分(来自图36A中的HPLC的第二HPLC肽峰)定位至脑中的特定结构(如脑室和CSF)。
图37说明了具有结扎肾的小鼠的白光图像和对应的放射自显影图像，其鉴定了在给予100nmol的SEQ ID NO:55的肽的放射性标记的第一经纯化的级分(第一HPLC肽峰)后3小时的肽分布。
图37A说明了在给予100nmol的SEQ ID NO:55的肽的放射性标记的第一经纯化的级分(第一HPLC肽峰)后3小时，具有结扎肾的小鼠的冷冻切片的白光图像。
图37B说明了对应于图37A的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的SEQ ID NO:55的肽的放射性标记的第一级分(第一HPLC肽峰)后3小时，具有结扎肾的小鼠组织中的肽分布。
图38说明了具有结扎肾的小鼠的白光图像和对应的放射自显影图像，其鉴定了在给予100nmol的SEQ ID NO:55的肽的放射性标记的第二经纯化的级分(来自图37的HPLC的第二HPLC肽峰)后3小时的肽分布。
图38A说明了在给予100nmol的SEQ ID NO:55的肽的放射性标记的第二经纯化的级分(来自图37的HPLC的第二HPLC肽峰)后3小时，具有结扎肾的小鼠的冷冻切片的白光图像。
图38B说明了对应于图38A的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的SEQ ID NO:55的肽的放射性标记的第二经纯化的级分(来自图37的HPLC的第二HPLC肽峰)后3小时，具有结扎肾的小鼠组织中的肽分布。
图39说明了具有结扎肾的小鼠的白光和对应的放射自显影图像，其鉴定了给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:83肽后3小时的肽分布。
图39A说明了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:83肽后3小时，具有结扎肾的小鼠的冷冻切片的白光图像。
图39B说明了对应于图39A的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:83肽后3小时，具有结扎肾的小鼠组织中的肽分布。
图40在右侧说明了冠状脑切片的白光图像并且在左侧说明了对应于白光图像的放射自显影图像。自动绘图图像中的14C信号鉴定了给予放射性标记的SEQ ID NO:34后3小时的肽分布，并且指示该肽定位至脑中的特定结构(如脑室和CSF)。
图41在右侧说明了冠状脑切片的白光图像并且在左侧说明了对应于白光图像的放射自显影图像。自动绘图图像中的14C信号鉴定了给予放射性标记的SEQ ID NO:83后3小时的肽分布，并且指示该肽定位至脑中的特定结构(如脑室和CSF)。
图42显示了向荷Colo205肿瘤的雌性哈伦(Harlan)无胸腺小鼠给予10nmol的缀合至Cy5.5的SEQ ID NO:37的肽后24小时切离的以下项的近红外荧光图像：Colo205肿瘤(顶部左侧)、结肠(顶部中间)、肝(顶部右侧)、脑(中间左侧)、脾(中间右侧)、肌肉(底部左侧)、皮肤(底部中间)和肾(底部右侧)。
图43显示了向荷MDA-MB-231肿瘤的雌性哈伦无胸腺小鼠给予10nmol的缀合至Cy5.5的SEQ ID NO:37的肽后24小时切离的以下项的近红外荧光图像：MDA-MB-231肿瘤(顶部左侧)、结肠(顶部中间)、肝(顶部右侧)、脑(中间左侧)、脾(中间右侧)、肌肉(底部左侧)、皮肤(底部中间)和肾(底部右侧)。
图44显示了向荷U87肿瘤的雌性哈伦无胸腺小鼠给予10nmol的缀合至Cy5.5的SEQID NO:37的肽后24小时切离的以下项的近红外荧光图像：U87肿瘤(顶部左侧)、结肠(顶部中间)、肝(顶部右侧)、脑(中间左侧)、脾(中间右侧)、肌肉(底部左侧)、皮肤(底部中间)和肾(底部右侧)。
图45显示了带有环位置注释的与SEQ ID NO:3比对的SEQ ID NO:2的序列，和它们对应的3D结构，其中SEQ ID NO:2结构在左侧，并且SEQ ID NO:3结构在右侧。
图46显示了环位置进行了注释的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4的序列比对。
具体实施方式
本披露涉及用于治疗肿瘤的组合物和方法。此外，本披露涉及如下组合物，这些组合物可以跨过血脑屏障，使得能够治疗脑肿瘤以及其他脑障碍和疾病。在一些实施例中，本文的组合物和方法利用给予受试者后归巢、分布至、靶向、被导向至、积累于、迁移至和/或结合至癌性细胞的肽。在进一步的实施例中，本文的组合物和方法利用给予受试者后归巢、分布至、靶向、被导向至、积累于、迁移至和/或结合至脑中的癌性细胞或患病细胞的肽。在其他实施例中，本文所描述的肽跨过血脑屏障进入神经元薄壁组织，从而将治疗活性分子递送至包括脑癌的神经疾病的靶标。在一些实施例中，本披露的归巢肽用于将活性剂递送至其组织或细胞。该活性剂可以对靶向组织或其细胞发挥治疗效果。例如，在某些实施例中，该肽允许将化学治疗剂局部递送至癌性组织或其细胞。作为另一实例，在某些实施例中，该肽允许将治疗药物局部递送至脑的患病组织或细胞。在某些实施例中，将本披露的归巢肽用于对靶向组织或细胞成像。例如，该肽允许使用荧光团进行成像。在某些实施例中，该肽本身具有或诱导治疗反应。
许多类型的肿瘤难以治疗。通常，患者的预后直接受到药物疗法有效杀死癌性细胞的能力以及癌细胞可通过外科手术切除的精确度的影响。例如，治疗肿瘤的一个挑战是许多药物治疗是全身性的，并且因此其使用功效受到全身性使用的毒性的限制。另一挑战是当前癌性组织的术中成像方法不能准确地描绘肿瘤边缘或癌性细胞的小病灶。反而，切除取决于外科医生在视觉上识别肿瘤或者通过在手术环境中触摸进行物理定位肿瘤的能力，这些可能是用于鉴定肿瘤边缘或病灶的不精确的方法。
治疗脑肿瘤以及其他脑障碍和疾病也是具有挑战性并且治疗起来复杂的。一个挑战是给予患者的循环系统中的许多药物不能跨过血-脑屏障(BBB)或血液CSF屏障，这些屏障是将循环血液与脑细胞外液以及中枢神经系统组织分开的选择性屏障。另一挑战是许多药物对脑中的一个或多个靶区域、组织、结构或细胞缺乏足够的特异性。因此，脑病症的治疗通常需要使用高浓度的非特异性药物，导致次优功效和全身性副作用。将药物递送到脑的另一方式是将其直接与外科手术结合使用。另一方式是鉴定跨过血脑屏障的特异性药物。能够跨过BBB的具有特异性且有效的药物可以通过选择性地靶向和递送化合物至特定组织、细胞、结构和区域来抵消许多治疗的非特异性。这样的药物还可用于调节离子通道、蛋白质-蛋白质相互作用、细胞外基质重塑(即，蛋白酶抑制)、细胞内信号传导途径、神经递质信号传导、感染等。这样的靶向疗法可以允许较低的剂量、减少的副作用和治疗效果的改善，这不仅在脑的急性疾病中是有利的，而且在慢性病症中也是有利的。
本披露描述了来源于打结素(knottin)的一类肽，这些肽可以归巢、分布至、靶向、被导向至、积累于、迁移至和/或结合至癌性细胞或患病细胞，并且可以被直接使用或作为治疗癌性细胞或患病细胞的活性药物、肽或分子的载体。归巢、分布至、靶向、迁移至或积累于一个或多个特定癌性区域或患病区域、组织、结构或细胞的肽可以具有较少的脱靶效应和潜在的负效应。
本披露还提供了一种新的载体，该载体可以将活性剂或可检测剂递送至特定区域、组织、结构或细胞，该活性剂或可检测剂可以用于治疗目的和成像目的之一或用于二者。如本文所描述的，可以将活性剂或可检测剂连接至本披露的肽。
此外，本披露描述了来源于打结素的一类肽，这些肽可以有效地跨过BBB或血液CSF屏障，并且被直接使用或作为治疗脑病症的活性药物、肽或分子的载体。例如，阿尔茨海默病是与淀粉样蛋白β肽片段的聚集关联的脑病症。淀粉样蛋白β肽片段的积累是淀粉样前蛋白(APP)被称为β-分泌酶的酶进行蛋白水解切割的结果。可以将可跨过BBB从而与β-分泌酶蛋白酶相互作用并抑制该酶的治疗性肽通过减少淀粉样蛋白β片段的聚集而用于治疗和预防阿尔茨海默病，例如，通过结合或抑制该蛋白酶、拮抗APP切割、调节淀粉样蛋白β片段途径或其他机制。此外，已经将乙酰胆碱酯酶抑制剂(例如，利凡斯的明)用于治疗阿尔茨海默病。然而，这些被全身性地给药并且通常导致在外周的症状，例如心动过缓和支气管收缩。递送更多的作为缀合物的乙酰胆碱酯酶跨过BBB的可能性可以在外周允许较低的剂量和副作用。本披露的肽可以用于治疗各种病症的症状。
本文还描述的是如下肽，这些肽选择性性归巢、分布至、靶向、被导向至、迁移至或积累于脑的特定区域、组织、结构或细胞。在一些情况下，这些肽积累于以下项的一者或多者中：海马体即记忆和学习以及空间导航的中枢；在脑和脊柱中发现的脑脊液(CSF)；脑室系统，即CSF产生和循环的部位；嘴侧迁移流；齿状回；神经干细胞；或神经元前体。海马体的齿状回和脑室下区是成人脑中神经发生的两个位置，并且嘴侧迁移流是用于新神经元迁移的一种机制。因此，靶向那些区域可以允许对神经发生的各个方面(包括修复或再生)的调节。归巢、分布至、靶向、迁移至或积累于脑的一个或多个特定区域、组织、结构或细胞的肽可以具有较少的脱靶效应和潜在的负效应，例如，通常限制针对神经性病症的药物的使用和功效的副作用。另外，这样的肽可以通过直接将现有药物靶向脑的特定区域、组织、结构或细胞，并且帮助药物跨过血脑屏障来提高现有药物的功效。
本披露还提供了一种新的药物载体，该药物载体可以将活性剂或可检测剂递送至脑，该活性剂或可检测剂可以用于治疗目的和成像目的之一或用于二者。血-脑屏障由包围脑组织的内皮细胞之间的特殊紧密连接以及基底膜和星形胶质细胞突起形成。类似地，血液CSF屏障由脉络膜上皮细胞之间的紧密连接、基底膜和内皮细胞形成。BBB和血液CSF屏障的功能之一是保护脑，并且将脑与可能存在于血流中的有害毒素保持隔绝。如本文所描述的，可以将活性剂或可检测剂连接至本披露的肽，并且该连接的肽-活性剂或连接的肽-可检测剂化合物可以跨过血脑屏障或血液CSF屏障。
本披露还提供了用于治疗受试者的病症的方法，其中该方法包括向受试者给予如下肽，该肽归巢、靶向、迁移至、被导向至受试者脑中的区域、组织、结构或细胞，例如海马体、CSF、脑室系统、脑膜、嘴侧迁移流或脑的其他特定区域(例如，黑质(其可能与帕金森病相关联))内。在一些情况下，所给予的肽可以跨过受试者的血脑屏障或血液CSF屏障。从以下详细说明，本领域的技术人员将清楚本披露的另外的方面和优势，其中示出并且描述了本披露的说明性实施例。应当认识到，本披露能够具有其他和不同的实施例，并且在不背离本披露的情况下，它的若干细节能够具有不同方面中的修改。因此，附图和说明书本质上被认为是说明性的而不是限制性的。
从以下详细说明，本领域的技术人员将清楚本披露的另外的方面和优势，其中示出并且描述了本披露的说明性实施例。应当认识到，本披露能够具有其他和不同的实施例，并且在不背离本披露的情况下，它的若干细节能够具有不同方面中的修改。因此，附图和说明书本质上被认为是说明性的而不是限制性的。
如本文所用，用于天然L-对映体氨基酸的缩写是常规的，并且如下：丙氨酸(A，Ala)；精氨酸(R，Arg)；天冬酰胺(N，Asn)；天冬氨酸(D，Asp)；半胱氨酸(C，Cys)；谷氨酸(E，Glu)；谷氨酰胺(Q，Gln)；甘氨酸(G，Gly)；组氨酸(H，His)；异亮氨酸(I，Ile)；亮氨酸(L，Leu)；赖氨酸(K，Lys)；甲硫氨酸(M，Met)；苯丙氨酸(F，Phe)；脯氨酸(P，Pro)；丝氨酸(S，Ser)；苏氨酸(T，Thr)；色氨酸(W，Trp)；酪氨酸(Y，Tyr)；缬氨酸(V，Val)。通常，Xaa可以指示任何氨基酸。在一些实施例中，X可以是天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)或精氨酸(R)。
本披露的一些实施例考虑了任何标准或非标准的氨基酸或其类似物的D-氨基酸残基。根据标准用法和惯例，当氨基酸序列被表示为一系列三个字母或一个字母的氨基酸缩写时，左手方向是氨基端方向，并且右手方向是羧基端方向。
肽
打结素是这样的一类肽，长度范围通常是从约11至约81个氨基酸，这些氨基酸通常被折叠成紧凑结构。打结素典型地被组装成复杂的三级结构，该结构由许多分子内二硫化物交联表征，并且可以含有β链和其他二级结构。二硫键的存在给予打结素显著的环境稳定性，允许它们经得住极端的温度和pH，并且耐受血流中的蛋白水解酶。打结素的刚性还允许它们结合至靶标，而不用支付松软肽在结合靶标时产生的“熵罚(entropic penalty)”。例如，结合受到熵损失的不利影响，熵损失在肽结合靶标以形成复合物时发生。因此，“熵罚”是对结合的不利影响，并且在这种结合时发生的熵损失越大，“熵罚”越大。此外，当形成复合物时，相比刚性构造的分子，柔性的未结合分子损失更多的熵，由于结合成复合物时柔性的损失。然而，未结合分子中的刚性还通常通过限制分子可形成的复合物的数目来增加特异性。这些打结肽能以抗体样亲和力结合靶标。对打结素的序列结构和序列一致性或同源性的更广泛的检查揭示了它们通过在各种各样的动物和植物中的趋同进化而产生。在动物中，它们通常在毒液(例如，蜘蛛和蝎子的毒液)中被发现，并且参与离子通道的调节。植物的打结素蛋白可以抑制动物的蛋白水解酶或具有抗微生物活性，表明打结素可以在植物的天然防御中起作用。
本披露提供了包含或来源于这些打结肽(或打结素)的肽。如本文所用，术语“打结肽”被认为与术语“打结素”和“optide”是可互换的。
本披露的肽可以包含半胱氨酸氨基酸残基。在一些情况下，该肽具有至少6个半胱氨酸氨基酸残基。在一些情况下，该肽具有至少8个半胱氨酸氨基酸残基。在其他情况下，该肽具有至少10个半胱氨酸氨基酸残基、至少12个半胱氨酸氨基酸残基、至少14个半胱氨酸氨基酸残基或至少16个半胱氨酸氨基酸残基。
打结肽可以包含二硫桥。打结肽可以是这样的肽，其中5％或更多的残基是形成分子内二硫键的半胱氨酸。二硫化物连接的肽可以是药物支架。在一些实施例中，这些二硫桥形成结。二硫桥可以在半胱氨酸残基之间形成，例如，在半胱氨酸1和4之间、2和5之间或3和6之间。在一些情况下，一个二硫桥穿过由其他两个二硫桥形成的环，例如，以形成该结。在其他情况下，这些二硫桥可以在任何两个半胱氨酸残基之间形成。
本披露进一步包括肽支架，例如，这些肽支架可以被用作用于产生另外的肽的起始点。在一些实施例中，这些支架可以来源于各种打结肽(或打结素)。在某些实施例中，打结肽被组装成复杂的三级结构，该结构由许多分子内二硫化物交联表征，并且任选地含有β链和其他二级结构(如α螺旋)。例如，在一些实施例中，打结肽包括小的富含二硫化物的蛋白质，其由二硫化物到二硫化物结来表征。例如当一个二硫桥跨过由两种其他二硫化物和互相连接的主链形成的大环时可以获得此结。在一些实施例中，这些打结肽可以包括生长因子半胱氨酸结或抑制剂半胱氨酸结。其他可能的肽结构包括如下肽，该肽具有由两个二硫桥连接的两个平行螺旋而没有β片层(例如，赫福毒素(hefutoxin))。
打结肽可以包含至少一个处于L构型的氨基酸残基。打结肽可以包含至少一个处于D构型的氨基酸残基。在一些实施例中，打结肽是15-40个氨基酸残基长。在其他实施例中，打结肽是11-57个氨基酸残基长。在又其他实施例中，打结肽是11-81个氨基酸残基长。在进一步的实施例中，打结肽是至少20个氨基酸残基长。
这些种类的肽可以来源于已知存在的或与毒素或毒液关联的一类蛋白质。在一些情况下，该肽可以来源于与蝎子或蜘蛛关联的毒素或毒液。该肽可以来源于不同属和种的蜘蛛和蝎子的毒液和毒素。例如，该肽可以来源于以下项的毒液或毒素：黑背以色列金蝎(Leiurus quinquestriatus hebraeus)、图尼塔尼地中海黄蝎(Buthus occitanustunetanus)、以色列黑鳄背蝎(Hottentotta judaicus)、条斑钳蝎(Mesobuthus eupeus)、以色列地中海黄蝎(Buthus occitanus israelis)、赫特施金蝎(Hadrurus gertschi)、黄肥尾蝎(Androctonus australis)、中美毒蝎(Centruroides noxius)、Heterometruslaoticus、非洲黄爪蝎(Opistophthalmus carinatus)、中国虎纹捕鸟蛛(Haplopelmaschmidti)、双针蝎(Isometrus maculatus)、虎纹捕鸟蛛(Haplopelma huwenum)、海南捕鸟蛛(Haplopelma hainanum)、中国虎纹捕鸟蛛、漏斗网蜘蛛(Agelenopsis aperta)、Haydronyche versuta、虎纹捕鸟蛛(Selenocosmia huwena)、白额高脚蛛(Heteropodavenatoria)、智利火玫瑰(Grammostola rosea)、虎纹捕鸟蛛(Ornithoctonus huwena)、澳大利亚漏斗网蜘蛛(Hadronyche versuta)、雪梨漏斗网蜘蛛(Atrax robustus)、Angelenopsis aperta、千里达老虎尾(Psalmopoeus cambridge)、漏斗蛛(Hadronycheinfensa)、鲁图斯拟隙蛛(Paracoelotes luctosus)和敬钊缨毛蛛(Chilobrachysjingzhao)或另一合适的属或种的蝎子或蜘蛛。在一些情况下，肽可以来源于东亚钳蝎(Buthus martensii Karsh)(蝎子)毒素。在一些实施例中，肽可以来源于pfam005453的成员：Toxin_6类别。
表1列出了来源于蝎子或蜘蛛的毒液或毒素并且用于与本披露一起使用的示例性肽。
表1.根据本披露的示例性肽。
在一些情况下，本披露的肽可以包含序列GSX1CX2PCFTTX3X4X5X6X7X8X9CX10X11CCGX12X13X14X15GX16CX17GPX18CX19CX20(SEQ ID NO:198)或其片段，其中X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19和X20各自独立地是任何氨基酸或氨基酸类似物。
在一些情况下，本披露的肽可以包含序列X1CX2PCFTTX3X4X5X6X7X8X9CX10X11CCGX12X13X14X15GX16CX17GPX18CX19C X20(SEQ ID NO:407)或其片段，其中X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19和X20各自独立地是任何氨基酸或氨基酸类似物。
在一些情况下，本披露的肽可以包含序列GSX1CX2PCFTTX3X4X5X6X7X8X9CX10X11CCGX12X13X14X15GX16CX17GPX18CX19CX20(SEQ ID NO:199)或其片段，其中：X1选自M、R、I、D、H或L；X2选自M、I或L；X3选自D、H、E、S、G或I；X4选自H、E、Q、R、Y或T；X5选自Q、R、H、E、Y或F；X6选自M、I或L；X7选自A、F、E、I或Q；X8选自R、E、I、D、N或H；X9选自R、N、H、E、Y、F、I、T或Q；X10选自D或E；X11选自D、I、H、E、R、Y、F或A；X12选自G或I；X13选自R、D、W、F或G；X14选自G、D或S；X15选自R、D、G或Y；X16选自K或R；X17选自Y、N、H、D或W；X18选自Q或H；X19选自L或I；并且X20选自R、G、F或I。
在一些情况下，本披露的肽可以包含序列X1CX2PCFTTX3X4X5X6X7X8X9CX10X11CCGX12X13X14X15GX16CX17GPX18CX19C X20(SEQ ID NO:408)或其片段，其中：X1选自M、R、I、D、H或L；X2选自M、I或L；X3选自D、H、E、S、G或I；X4选自H、E、Q、R、Y或T；X5选自Q、R、H、E、Y或F；X6选自M、I或L；X7选自A、F、E、I或Q；X8选自R、E、I、D、N或H；X9选自R、N、H、E、Y、F、I、T或Q；X10选自D或E；X11选自D、I、H、E、R、Y、F或A；X12选自G或I；X13选自R、D、W、F或G；X14选自G、D或S；X15选自R、D、G或Y；X16选自K或R；X17选自Y、N、H、D或W；X18选自Q或H；X19选自L或I；并且X20选自R、G、F或I。
在一些情况下，本披露的肽可以包含序列GSVGCEECPX1HCX2GX3X4AX5PTCDX6GVCNCNV(SEQ ID NO:201)或其片段，其中X1、X2、X3、X4、X5和X6各自独立地是任何氨基酸或氨基酸类似物。
在一些情况下，本披露的肽可以包含序列VGCEECPX1HCX2GX3X4AX5PTCDX6GVCNCNV(SEQ ID NO:410)或其片段，其中X1、X2、X3、X4、X5和X6各自独立地是任何氨基酸或氨基酸类似物。
在其他情况下，肽可以包含序列GSVGCEECPX1HCX2GX3X4AX5PTCDX6GVCNCNV(SEQ IDNO:202)或其片段，其中X1选自M、A、V、I或L，其中X2选自K或R，其中X3选自K或R，其中X4选自N、H、M、K或Q，其中X5选自N、K、V、I、L、R或Q，并且其中X6选自D、N、G、Y或E。
在其他情况下，肽可以包含序列VGCEECPX1HCX2GX3X4AX5PTCDX6GVCNCNV(SEQ IDNO:411)或其片段，其中X1选自M、A、V、I或L，其中X2选自K或R，其中X3选自K或R，其中X4选自N、H、M、K或Q，其中X5选自N、K、V、I、L、R或Q，并且其中X6选自D、N、G、Y或E。
在一些情况下，本披露的肽可以包含序列GSVGCX1EX2PX3X4CKGKX5AX6PTCX7X8X9X10CX11CNX12(SEQ ID NO:203)或其片段，其中X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11和X12各自独立地是任何氨基酸或氨基酸类似物。
在一些情况下，本披露的肽可以包含序列VGCX1EX2PX3X4CKGKX5AX6PTCX7X8X9X10CX11CNX12(SEQ ID NO:412)或其片段，其中X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11和X12各自独立地是任何氨基酸或氨基酸类似物。
在一些情况下，本披露的肽可以包含序列GSVGCX1EX2PX3X4CKGKX5AX6PTCX7X8X9X10CX11CNX12(SEQ ID NO:204)或其片段，其中：X1选自A或E；X2选自C或D；X3选自M、A、K或V；X4选自H或Y；X5选自N、H、M、K或Q；X6选自N、K、V、I或L；X7选自D、Y、C或E；X8选自D、N、G或Y；X9选自G或E；X10选自V或是不存在的；X11选自N、K或E；并且X12选自V、A、I或D。
在一些情况下，本披露的肽可以包含序列VGCX1EX2PX3X4CKGKX5AX6PTCX7X8X9X10CX11CNX12(SEQ ID NO:413)或其片段，其中：X1选自A或E；X2选自C或D；X3选自M、A、K或V；X4选自H或Y；X5选自N、H、M、K或Q；X6选自N、K、V、I或L；X7选自D、Y、C或E；X8选自D、N、G或Y；X9选自G或E；X10选自V或是不存在的；X11选自N、K或E；并且X12选自V、A、I或D。
在一些情况下，本披露的肽可以包含序列GSX1X2CEDCPX3HCX4X5X6X7X8X9AKCX10NDX11CVCEX12X13(SEQ ID NO:205)或其片段，其中X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12和X13各自独立地是任何氨基酸或氨基酸类似物。
在一些情况下，本披露的肽可以包含序列X1X2CEDCPX3HCX4X5X6X7X8X9AKCX10NDX11CVCEX12X13(SEQ ID NO:414)或其片段，其中X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12和X13各自独立地是任何氨基酸或氨基酸类似物。
在一些情况下，本披露的肽可以包含序列GSX1X2CEDCPX3HCX4X5X6X7X8X9AKCX10NDX11CVCEX12X13(SEQ ID NO:206)或其片段，其中：X1选自V或A；X2选自S、T或G；X3选自D或E；X4选自S或A；X5选自T或Q；X6选自Q或K；X7选自K、N或D；X8选自A或Q；X9选自R或Q；X10选自D或E；X11选自K或R；X12选自P、S或A；并且X13选自K、V或I。
在一些情况下，本披露的肽可以包含序列X1X2CEDCPX3HCX4X5X6X7X8X9AKCX10NDX11CVCEX12X13(SEQ ID NO:415)或其片段，其中：X1选自V或A；X2选自S、T或G；X3选自D或E；X4选自S或A；X5选自T或Q；X6选自Q或K；X7选自K、N或D；X8选自A或Q；X9选自R或Q；X10选自D或E；X11选自K或R；X12选自P、S或A；并且X13选自K、V或I。
在一些情况下，本披露的肽可以包含序列GSX1CX2PCFTTDHQX2ARRCDDCCGGRGRGX3CYGPQCX2CX4(SEQ ID NO:207)或其片段，其中：X1是任何氨基酸或氨基酸类似物(除了P或C)；X2独立地选自A、L、V、I或M；X3选自K或R；并且X4是任何氨基酸或氨基酸类似物(除了C)。
在一些情况下，本披露的肽可以包含序列X1CX2PCFTTDHQX2ARRCDDCCGGRGRGX3CYGPQCX2CX4(SEQ ID NO:416)或其片段，其中：X1是任何氨基酸或氨基酸类似物(除了P或C)；X2独立地选自A、L、V、I或M；X3选自K或R；并且X4是任何氨基酸或氨基酸类似物(除了C)。
在一些情况下，本披露的肽可以包含序列GSMCMPCFTTDHRMAENCDICCGGDGRGXCYGPQCLCR(SEQ ID NO:208)或其片段，其中X是R或K。
在一些情况下，本披露的肽可以包含序列MCMPCFTTDHRMAENCDICCGGDGRGXCYGPQCLCR(SEQ ID NO:417)或其片段，其中X是R或K。
在一些情况下，本披露的肽包含序列GSXCMPCFTTXXXMXXXCDXCCGXXXXGXCXGPXCLCX(SEQ ID NO:209)或其片段，其中X可以独立地是任何氨基酸或氨基酸类似物。
在一些情况下，本披露的肽可以包含序列XCMPCFTTXXXMXXXCDXCCGXXXXGXCXGPXCLCX(SEQ ID NO:418)或其片段，其中X可以独立地是任何氨基酸或氨基酸类似物。
在一些实施例中，本披露的肽包含如下序列，该序列在位置4、5、7、8、12、18、21、22、26、28、30、35或37的一个或多个处具有半胱氨酸残基。例如，在某些实施例中，肽包含如下序列，该序列在位置4处具有半胱氨酸残基。在某些实施例中，肽包含如下序列，该序列在位置5处具有半胱氨酸残基。在某些实施例中，肽包含如下序列，该序列在位置7处具有半胱氨酸残基。在某些实施例中，肽包含如下序列，该序列在位置8处具有半胱氨酸残基。在某些实施例中，肽包含如下序列，该序列在位置12处具有半胱氨酸残基。在某些实施例中，肽包含如下序列，该序列在位置18处具有半胱氨酸残基。在某些实施例中，肽包含如下序列，该序列在位置21处具有半胱氨酸残基。在某些实施例中，肽包含如下序列，该序列在位置22处具有半胱氨酸残基。在某些实施例中，肽包含如下序列，该序列在位置26处具有半胱氨酸残基。在某些实施例中，肽包含如下序列，该序列在位置28处具有半胱氨酸残基。在某些实施例中，肽包含如下序列，该序列在位置30处具有半胱氨酸残基。在某些实施例中，肽包含如下序列，该序列在位置35处具有半胱氨酸残基。在某些实施例中，肽包含如下序列，该序列在位置37处具有半胱氨酸残基。在一些实施例中，该序列中的第一个半胱氨酸残基二硫键键合至该序列中的第4个半胱氨酸残基的，该序列中的第2个半胱氨酸残基二硫键键合至该序列中的第5个半胱氨酸残基，并且该序列中的第3个半胱氨酸残基二硫键键合至该序列中的第6个半胱氨酸残基。在一些实施例中，该序列中的第1个半胱氨酸残基二硫键键合至该序列中的第4个半胱氨酸残基，该序列中的第二个半胱氨酸残基二硫键键合至该序列中的第6个半胱氨酸残基，该序列中的第3个半胱氨酸残基二硫键键合至该序列中的第7个半胱氨酸残基，并且该序列中的第5个半胱氨酸残基二硫键键合至该序列中的第8个半胱氨酸残基。任选地，肽可以包含一个二硫桥，该二硫桥穿过由两个其他二硫桥形成的环，还称作“二-并-穿(two-and-through)”结构系统。
在一些实施例中，本披露的肽可以包含序列GSCXXCXXXXXXXXXXCXXCCXXXXXXXCXXXXCXC(SEQ ID NO:200)，其中至少一些或全部的半胱氨酸残基形成分子内二硫桥，并且X是任何氨基酸或氨基酸类似物。
在一些实施例中，本披露的肽可以包含序列CXXCXXXXXXXXXXCXXCCXXXXXXXCXXXXCXC(SEQ ID NO:409)，其中至少一些或全部的半胱氨酸残基形成分子内二硫桥，并且X是任何氨基酸或氨基酸类似物。
在一些情况下，该肽可以含有仅一个赖氨酸残基，或不含赖氨酸残基。在一些情况下，该肽中的一些或全部的赖氨酸残基被精氨酸残基置换。在一些情况下，该肽中的一些或全部的甲硫氨酸残基被亮氨酸或异亮氨酸置换。在一些情况下，该肽中的一些或全部的色氨酸残基被苯丙氨酸或酪氨酸置换。在一些情况下，该肽中的一些或全部的天冬酰胺残基被谷氨酰胺置换。在一些情况下，该肽的N末端被封闭，例如通过乙酰基基团。可替代地或组合地，在一些情况下，该肽的C末端被封闭，例如通过酰胺基团。在一些实施例中，该肽通过在游离胺上的甲基化进行修饰。例如，完全甲基化可以通过用甲醛和氰基硼氢化钠，使用还原甲基化来完成。
在一些情况下，在SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:209中示出的前两个N末端氨基酸(GS)，或这样的N末端氨基酸(GS)可以不存在，或被任何其他一个或两个氨基酸取代，如在SEQ ID NO:210–SEQ ID NO:418中所示的。
在一些情况下，将肽的C末端Arg残基修饰为另一残基，例如Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。例如，可以将肽的C末端Arg残基修饰为Ile。可替代地，可以将肽的C末端Arg残基修饰为任何非天然氨基酸。这种修饰可以防止在表达、合成、加工、储存、体外或体内期间(包括治疗期间)C末端残基的剪切，同时仍允许保持关键的氢键。关键的氢键可以是在初始折叠成核期间形成的氢键，并且对于形成初始发夹是关键的。
通常，相关结构同系物的NMR溶液结构可用于通知突变策略，这些突变策略可以改善折叠、稳定性、可制造性，同时保持特定的生物学功能。它们可以用来预测一组结构同源的支架的3D药效团，以及预测相关蛋白的可能的移植区以产生具有改进特性的嵌合体。例如，已经将此策略用于鉴定关键的氨基酸位置和环，这些位置和环可以用于设计具有改进特性的药物或校正有害突变，这些突变针对SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQID NO:3的肽使得折叠和可制造性复杂化。表2汇总了关键的氨基酸位置和环，如从SEQ IDNO:5中学到已经将这些位置和环成功地使用。在一些方面中，可以保留在下表中列出的氨基酸，然而在肽序列中的其他残基可以被突变从而改善、改变、去除或以其他方式修饰肽的功能、归巢和活性。
表2.根据本披露的示例性关键氨基酸位置和环。
氨基酸位置 相互作用的残基
T10 H11、H12
D19 C22、G23、G24、G26、R27
R38 R27
关于表2中的上述残基，可以理解的是上述位置和相互作用的残基描述了本文所描述的任何肽序列内的不同但对应的位置。例如，在SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:209中示出的前两个N末端氨基酸(GS)可以不存在，或被任何其他一个或两个氨基酸取代，如在SEQ IDNO:210–SEQ ID NO:418中所示的，并且在N末端氨基酸(GS)不存在的肽中，氨基酸位置T10将对应于T8，并且相互作用的残基H11、H12对应于H9、H10；氨基酸位置D19将对应于D17，并且相互作用的残基C22、G23、G24、G26和R27对应于C20、G21、G22、G24和R25；并且氨基酸位置R38将对应于R36，并且相互作用的残基R27对应于R25。另外地，在位置11处的相互作用的残基可以被天冬氨酸取代。类似地，针对SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:196的本文描述的肽的任何变体将具有类似对应的残基。
另外地，可以将两种或更多种肽的一级序列和三级序列的比较用于揭示可以被用来改善这些肽和对这些肽的生物学活性进行解析的序列和3D折叠模式。例如，比较跨过BBB或进入CSF的两种不同肽支架可以导致对保守的药效团的鉴定，这些药效团可以指导工程化策略，比如设计具有改进的折叠特性的变体。重要的药效团例如可以包含脂肪族残基，这些残基对于蛋白质-蛋白质结合相互作用是重要的。
在一些情况下，该肽是SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:192中的任一者或其功能片段。在其他实施例中，本披露的肽进一步包含与SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:192中任一者具有99％、95％、90％、85％或80％序列一致性或同源性的肽或其片段。
在其他情况下，该肽可以是与SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:192中任一者同源的肽或其功能片段。本文使用术语“同源的”来表示与SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:192或SEQ ID NO:210–SEQ ID NO:410中任一者的序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或大于95％序列一致性或同源性的肽或其功能片段。
在又其他情况下，SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:192或SEQ ID NO:210–SEQ ID NO:410中任一者的肽的变体核酸分子可以通过确定所编码的肽氨基酸序列与SEQ ID NO:1–SEQID NO:192或SEQ ID NO:210–SEQ ID NO:410中任一者的氨基酸序列的序列一致性或同源性，或通过核酸杂交测定来鉴定。这样的肽变体可以包括如下核酸分子：(1)在严格洗涤条件下，这些核酸分子保持与具有SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:192或SEQ ID NO:210–SEQ IDNO:410中任一者的核苷酸序列(或先前序列的任何互补体)的核酸分子杂交，其中洗涤严格度相当于0.5×-2×SSC含0.1％SDS，在55℃-65℃下，和(2)这些核酸分子编码与SEQ IDNO:1–SEQ ID NO:192或SEQ ID NO:210–SEQ ID NO:410中任一者的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或大于95％序列一致性或同源性的肽。可替代地，SEQID NO:1–SEQ ID NO:192或SEQ ID NO:210–SEQ ID NO:410中任一者的肽变体可以被表征为如下核酸分子：(1)在高严格洗涤条件下，这些核酸分子保持与具有SEQ ID NO:1–SEQ IDNO:192或SEQ ID NO:210–SEQ ID NO:410中任一者的核苷酸序列(或先前序列的任何互补体)的核酸分子杂交，其中洗涤严格度相当于0.1×-0.2×SSC含0.1％SDS，在50℃-65℃下，和(2)这些核酸分子编码与SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:192或SEQ ID NO:210–SEQ ID NO:410中任一者的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或大于95％序列一致性或同源性的肽。
通过常规方法确定百分比序列一致性或同源性。参见例如，Altschul等人,Bull.Math.Bio.[数学生物学通报]48:603(1986)，以及Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89:10915(1992)。简言之，将两个氨基酸序列进行比对从而使用空位开放罚分为10、空位延伸罚分为1和Henikoff和Henikoff(同上)的“BLOSUM62”评分矩阵对比对分数进行优化。然后将序列一致性或同源性计算为：([相同匹配的总数目]/[较长序列的长度加引入较长序列以便于比对两个序列的空位的数目])(100)。
另外地，存在许多建立的算法可用于比对两个氨基酸序列。例如，Pearson和Lipman的“FASTA”相似性研究算法是合适的蛋白质比对方法，用于检验由本文披露的肽的氨基酸序列和肽变体的氨基酸序列共享的序列一致性或同源性水平。由Pearson和Lipman,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:2444(1988)，以及由Pearson,Meth.Enzymol.[酶学方法]183:63(1990)描述了FASTA算法。简言之，通过鉴定由具有最高密度的一致性(density of identities)(如果ktup变量是1)或成对的一致性(pairs ofidentities)(如果ktup＝2)的询问序列(例如，SEQ ID NO:1)和测试序列共享的区域，FASTA首先表征序列相似性，而无需考虑保守氨基酸取代、插入或缺失。然后使用氨基酸取代矩阵通过比较所有配对的氨基酸的相似性来为具有最高密度的一致性的十个区域评分，并且将这些区域的末端“修整”成仅包括有助于最高分数的那些残基。如果存在若干个具有大于“截断”值(基于序列长度和ktup值通过预先确定的公式计算)的分数的区域，则对修整的初始区域进行检查从而确定这些区域是否可以连接从而形成具有空位的近似比对。最后，使用尼德曼-翁施-塞勒斯(Needleman-Wunsch-Sellers)算法(Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:444(1970)；Sellers,Siam J.Appl.Math.[应用数学]26:787(1974))的修改(其允许氨基酸插入和缺失)，将两个氨基酸序列的最高评分区域进行比对。用于FASTA分析的说明性参数是：ktup＝1，空位开放罚分＝10，空位延伸罚分＝1，和取代矩阵＝BLOSUM62。如在Pearson,Meth.Enzymol[酶学方法].183:63(1990)的附录2中解释的，通过修改评分矩阵文件(“SMATRIX”)可以将这些参数引入FASTA程序。
使用如上文披露的比率，还可以将FASTA用于确定核酸分子的序列一致性或同源性。对于核苷酸序列比较，ktup值可以在一至六之间变动，优选地从三至六，最优选地是三，并且其他参数如上所述进行设置。
作为“保守氨基酸取代”的常见氨基酸的一些实例通过以下各组内的氨基酸之间的取代来说明：(1)甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，(2)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，(3)丝氨酸和苏氨酸，(4)天冬氨酸和谷氨酸，(5)谷氨酰胺和天冬酰胺，和(6)赖氨酸、精氨酸和组氨酸。BLOSUM62表是来源于蛋白质序列区段的约2,000个局部多重对比的氨基酸取代矩阵，表示多于500个组的相关蛋白质的高度保守的区域(Henikoff和Henikoff,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89:10915(1992))。因此，可以将BLOSUM62取代频率用于定义保守氨基酸取代，其可以被引入本发明的氨基酸序列。尽管有可能仅基于化学特性设计氨基酸取代(如上所讨论的)，表述“保守氨基酸取代”优选地是指由大于-1的BLOSUM62值表示的取代。例如，如果取代由BLOSUM62值为0、1、2或3表征，则氨基酸取代是保守的。根据此系统，优选的保守氨基酸取代由BLOSUM62值为至少1(例如，1、2或3)来表征，然而更优选的保守氨基酸取代由BLOSUM62值为至少2(例如，2或3)来表征。
可以确定对于保持结构完整性关键的区域或结构域内的氨基酸残基。在这些区域内，可以确定特定的残基，这些残基可以或多或少地耐受变化并保持分子的整体三级结构。用于分析序列结构的方法包括但不限于，具有高氨基酸或核苷酸一致性或同源性的多个序列进行比对和使用可用的软件进行计算机分析(例如，Insight II.RTM.指示器和同源性建模工具；MSI，加利福尼亚州圣迭哥)、二级结构倾向、二值模式、互补堆积和内埋的极性相互作用(Barton,G.J.,Current Opin.Struct.Biol.[现代结构生物学评论]5:372-6(1995)和Cordes,M.H.等人,Current Opin.Struct.Biol.[现代结构生物学评论]6:3-10(1996))。通常，当设计对分子的修饰或鉴定特定片段时，对结构的确定典型地可以伴随着对经修饰分子的活性评估。
在进一步的实施例中，该肽片段包含SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:196中任一者的连续片段，该连续片段是至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45、至少46个残基长，其中该肽片段选自该肽的任何部分。
本披露的肽可以进一步包含带正电荷的氨基酸残基。在一些情况下，该肽具有至少1个带正电荷的残基。在一些情况下，该肽具有至少2个带正电荷的残基。在一些情况下，该肽具有至少3个带正电荷的残基。在其他情况下，该肽具有至少4个带正电荷的残基、至少5个带正电荷的残基、至少6个带正电荷的残基、至少7个带正电荷的残基、至少8个带正电荷的残基或至少9个带正电荷的残基。当带正电荷的残基可以选自任何带正电荷的氨基酸残基时，在一些实施例中，这些带正电荷的残基是K、或R、或K和R的组合。
本披露的肽可以进一步包含中性氨基酸残基。在一些情况下，该肽具有35个或更少的中性氨基酸残基。在其他情况下，该肽具有81个或更少的中性氨基酸残基、70个或更少的中性氨基酸残基、60个或更少的中性氨基酸残基、50个或更少的中性氨基酸残基、40个或更少的中性氨基酸残基、36个或更少的中性氨基酸残基、33个或更少的中性氨基酸残基、30个或更少的中性氨基酸残基、25个或更少的中性氨基酸残基或10个或更少的中性氨基酸残基。
本披露的肽可以进一步包含负氨基酸残基。在一些情况下，该肽具有6个或更少的负氨基酸残基、5个或更少的负氨基酸残基、4个或更少的负氨基酸残基、3个或更少的负氨基酸残基、2个或更少的负氨基酸残基或1个或更少的负氨基酸残基。当负氨基酸残基可以选自任何中性带电荷的氨基酸残基时，在一些实施例中，这些负氨基酸残基是E、或D、或E和D二者的组合。
在生理pH下，肽可以具有例如-5、-4、-3、-2、-1、0、+1、+2、+3、+4或+5的净电荷。当净电荷是零时，该肽可以是不带电荷的或是两性离子的。在一些实施例中，该肽含有一个或多个二硫键，并且在生理pH下具有净正电荷，其中净电荷可以是+0.5或低于+0.5、+1或低于+1、+1.5或低于+1.5、+2或低于+2、+2.5或低于+2.5、+3或低于+3、+3.5或低于+3.5、+4或低于+4、+4.5或低于+4.5、+5或低于+5、+5.5或低于+5.5、+6或低于+6、+6.5或低于+6.5、+7或低于+7、+7.5或低于+7.5、+8或低于+8、+8.5或低于+8.5、+9或低于+9.5、+10或低于+10。在一些实施例中，该肽在生理pH下具有净负电荷，其中净电荷可以是-0.5或低于-0.5、-1或低于-1、-1.5或低于-1.5、-2或低于-2、-2.5或低于-2.5、-3或低于-3、-3.5或低于-3.5、-4或低于-4、-4.5或低于-4.5、-5或低于-5、-5.5或低于-5.5、-6或低于-6、-6.5或低于-6.5、-7或低于-7、-7.5或低于-7.5、-8或低于-8、-8.5或低于-8.5、-9或低于-9.5、-10或低于-10。在一些情况下，肽内的一个或多个突变的工程化产生在生理pH下具有改变的等电点、电荷、表面电荷或流变学的肽。对来源于蝎子或蜘蛛的肽的突变的这样的工程化可以改变复合物的净电荷，例如，通过将净电荷减少1、2、3、4或5，或通过将净电荷增加1、2、3、4或5。在这样的情况下，该工程化的突变可以促进该肽跨过血脑屏障的能力。用于改善肽的流变学和效力的合适的氨基酸修饰可以包括保守的或非保守的突变。与肽所源自的毒液或毒素组分的序列相比，该肽可以包含至多1个氨基酸突变、至多2个氨基酸突变、至多3个氨基酸突变、至多4个氨基酸突变、至多5个氨基酸突变、至多6个氨基酸突变、至多7个氨基酸突变、至多8个氨基酸突变、至多9个氨基酸突变、至多10个氨基酸突变或另一合适的数目。在其他情况下，与肽所源自的毒液或毒素组分的序列相比，该肽或其功能片段包含至少1个氨基酸突变、至少2个氨基酸突变、至少3个氨基酸突变、至少4个氨基酸突变、至少5个氨基酸突变、至少6个氨基酸突变、至少7个氨基酸突变、至少8个氨基酸突变、至少9个氨基酸突变、至少10个氨基酸突变或另一合适的数目。在一些实施例中，可以将突变在肽内进行工程化以提供在生理pH下具有所希望的电荷或稳定性的肽。
本披露还涵盖本文所描述的各种肽的多聚体。多聚体的实例包括二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体等。多聚体可以是由多个相同的亚单元形成的同聚体或由多个不同的亚单元形成的异聚体。在一些实施例中，本披露的肽与具有至少一种其他的肽，或两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种其他肽被安排成多聚体结构。在某些实施例中，多聚体结构的肽各自具有相同的序列。在替代性实施例中，多聚体结构的一些或全部的肽具有不同的序列。
本披露进一步包括肽支架，例如，这些肽支架可以被用作用于产生另外的肽的起始点。在一些实施例中，这些支架可以来源于各种打结肽或打结素。用于支架的一些合适的肽可以包括但不限于，氯毒素、甜蛋白、环杆菌素、stecrisp、赫纳毒素(hanatoxin)、中期因子、赫福毒素、马铃薯羧肽酶抑制剂、气泡蛋白(bubble protein)、吸引素(attractin)、α-GI、α-GID、μ-PIIIA、ω-MVIIA、ω-CVID、χ-MrIA、ρ-TIA、芋螺睡眠肽G(conantokin G)、芋螺迟缓肽G(contulakin G)、GsMTx4、玛格毒素、shK、毒素K、糜蛋白酶抑制剂(CTI)以及EGF上皮调节蛋白核心。
在一些情况下，该肽包含SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:192或SEQ ID NO:210–SEQ IDNO:410中任一者的序列。在一些实施例中，该肽序列的侧翼是另外的氨基酸。一个或多个另外的氨基酸可以例如赋予肽所希望的体内电荷、等电点、化学缀合位点、稳定性或生理学特性。
两种或更多种肽可以共享一定程度的序列一致性或同源性，并且共享体内相似特性。例如，肽可以与SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:192的肽中的任一者共享一定程度的序列一致性或同源性。在一些情况下，本披露的一种或多种肽可以具有高达约20％成对序列一致性或同源性、高达约25％成对序列一致性或同源性、高达约30％成对序列一致性或同源性、高达约35％成对序列一致性或同源性、高达约40％成对序列一致性或同源性、高达约45％成对序列一致性或同源性、高达约50％成对序列一致性或同源性、高达约55％成对序列一致性或同源性、高达约60％成对序列一致性或同源性、高达约65％成对序列一致性或同源性、高达约70％成对序列一致性或同源性、高达约75％成对序列一致性或同源性、高达约80％成对序列一致性或同源性、高达约85％成对序列一致性或同源性、高达约90％成对序列一致性或同源性、高达约95％成对序列一致性或同源性、高达约96％成对序列一致性或同源性、高达约97％成对序列一致性或同源性、高达约98％成对序列一致性或同源性、高达约99％成对序列一致性或同源性、高达约99.5％成对序列一致性或同源性或高达约99.9％成对序列一致性或同源性。在一些情况下，本披露的一种或多种肽可以与第二肽具有至少约20％成对序列一致性或同源性、至少约25％成对序列一致性或同源性、至少约30％成对序列一致性或同源性、至少约35％成对序列一致性或同源性、至少约40％成对序列一致性或同源性、至少约45％成对序列一致性或同源性、至少约50％成对序列一致性或同源性、至少约55％成对序列一致性或同源性、至少约60％成对序列一致性或同源性、至少约65％成对序列一致性或同源性、至少约70％成对序列一致性或同源性、至少约75％成对序列一致性或同源性、至少约80％成对序列一致性或同源性、至少约85％成对序列一致性或同源性、至少约90％成对序列一致性或同源性、至少约95％成对序列一致性或同源性、至少约96％成对序列一致性或同源性、至少约97％成对序列一致性或同源性、至少约98％成对序列一致性或同源性、至少约99％成对序列一致性或同源性、至少约99.5％成对序列一致性或同源性、至少约99.9％成对序列一致性或同源性。可以将各种方法和软件程序用于确定两种或更多种肽之间的同源性，例如NCBI BLAST、Clustal W、MAFFT、Clustal Omega、AlignMe、Praline或另一合适的方法或算法。
将成对序列比对用于鉴定具有相似性的区域，该相似性可以指示两个生物序列(蛋白质或核酸)之间的功能的、结构的和/或进化的关系。相比之下，多重序列比对(MSA)是三个或更多个生物学序列的比对。从MSA应用的输出，可以推测同源性以及测定的序列之间的进化关系。本领域技术人员将认识到如本文所用的，已经将“序列同源性”和“序列一致性”以及“百分比(％)序列一致性”和“百分比(％)序列同源性”可交换地使用，从而意指在适当的情况下与参考多核苷酸或氨基酸序列的序列关联性或序列变异。
化学修饰
可以将肽以各种方式中的一种或多种进行化学修饰。在一些实施例中，该肽可以被突变为添加功能、删除功能或改变体内行为。可以将二硫键联之间的一个或多个环进行修饰或替换以包括来自其他肽的活性元件(例如在Moore和Cochran，Methods inEnzymology[酶学方法],503,第223-251页,2012中描述的)。还可以将氨基酸突变，例如以增加半衰期，改变、添加或删除体内的结合行为，添加新的靶向功能，改变表面电荷和疏水性，或给予缀合位点。N-甲基化是甲基化的一个实例，甲基化可以在本披露的肽中发生。在一些实施例中，该肽通过在游离胺上的甲基化进行修饰。例如，完全甲基化可以通过用甲醛和氰基硼氢化钠，使用还原甲基化来完成。图1说明了具有甲基化和不具有甲基化的SEQ IDNO:1的肽的模型。
化学修饰可以例如延长肽的半衰期或改变生物分布或药代动力学曲线。化学修饰可以包含聚合物、聚醚、聚乙二醇、生物聚合物、聚氨基酸、脂肪酸、树状物、Fc区、简单的饱和碳链(棕榈酸酯或豆蔻酸酯(myristolate))或白蛋白。聚氨基酸可以包括例如具有重复的单个氨基酸的聚氨基酸序列(例如，聚甘氨酸)、和具有可以遵循或不遵循一定模式的混合的聚氨基酸序列的聚氨基酸序列(例如，gly-ala-gly-ala)、或前述项的任何组合。
在一些实施例中，可以将本披露的肽进行修饰，使得该修饰增加这些肽的稳定性和/或半衰期。在一些实施例中，将疏水性部分附接至例如N末端、C末端或内部氨基酸可以用于延长本披露的肽的半衰期。在其他实施例中，本披露的肽可以包括翻译后修饰(例如，甲基化和/或酰胺化)，这些修饰可以影响例如血清半衰期。在一些实施例中，简单的碳链(例如，通过豆蔻酰化和/或棕榈酰化)可以缀合至融合蛋白或肽。在一些实施例中，简单的碳链可以使得融合蛋白或肽可容易地与未缀合的材料分离。例如，可以用于将融合蛋白或肽与未缀合的材料分离的方法包括但不限于，溶剂萃取和反相色谱法。亲脂性部分可以通过可逆结合至血清白蛋白而延长半衰期。缀合的部分可以例如是通过可逆结合至血清白蛋白而延长肽的半衰期的亲脂性部分。在一些实施例中，该亲脂性部分可以是胆固醇或胆固醇衍生物(包括胆甾烯、胆甾烷、胆甾二烯和氧甾酮)。在一些实施例中，可以将这些肽缀合至豆蔻酸(十四酸)或其衍生物。在其他实施例中，将本披露的肽偶联(例如，缀合)至半衰期改变剂。半衰期改变剂的实例包括但不限于：聚合物，聚乙二醇(PEG)，羟乙基淀粉，聚乙烯醇，水溶性聚合物，两性离子的水溶性聚合物，水溶性聚(氨基酸)，脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸的水溶性聚合物，含有甘氨酸、谷氨酸和丝氨酸的水溶性聚合物，Fc区，脂肪酸，棕榈酸，或结合至白蛋白的分子。
在一些实施例中，SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:196的前两个N末端氨基酸(GS)充当间隔子或接头，以便于促进与另一分子的缀合或融合，以及以便于促进肽从这样的缀合分子或融合分子的切割。在一些实施例中，本披露的融合蛋白或肽可以缀合至其他部分，例如，这些部分可以修饰或影响对这些肽特性的改变。
活性剂缀合物
可以将根据本披露的肽缀合或融合至药剂用于在治疗肿瘤、癌症和脑疾病和障碍中使用。例如，在某些实施例中，将本文描述的肽融合至另一分子，例如提供功能能力的活性剂。可以将肽通过载体的表达与活性剂融合，该载体含有该肽的序列与该活性剂的序列。在不同实施例中，该肽的序列和该活性剂的序列从相同的开放阅读框(ORF)表达。在不同实施例中，该肽的序列和该活性剂的序列可以包含连续序列。与分别表达时的功能能力相比，该肽和该活性剂可以在融合肽中各自保留相似的功能能力。在某些实施例中，活性剂的实例包括其他肽，例如神经降压素肽。神经降压素是一种13个氨基酸的神经肽，其可以参与调节黄体化激素和催乳素释放，并且可以与多巴胺能系统相互作用，但不跨过血脑屏障。因此，神经降压素肽和可以跨过血脑屏障的本文所描述的肽中的一者融合可以产生能够跨过血液屏障的融合肽，该融合肽可以保留神经降压素肽的功能能力。例如，将本披露的肽的DNA序列插入到神经降压素的基因中以制造肽-神经降压素融合物。
此外，例如，在某些实施例中，将本文描述的肽附接到另一分子，例如提供功能能力的活性剂。在一些实施例中，可以将1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种活性剂连接至肽。可以通过例如缀合至多个赖氨酸残基和/或N末端等的方法，或通过将多种活性剂连接至支架(如聚合物或树状物)，并且然后将该活性剂-支架附接至肽来附接多种活性剂(例如在Yurkovetskiy,A.V.,Cancer Res[癌症研究]75(16):3365–72(2015)中描述的)。活性剂的实例包括但不限于：肽、寡肽、多肽、拟肽、多核苷酸、多核糖核苷酸、DNA、cDNA、ssDNA、RNA、dsRNA、微小RNA、寡核苷酸、抗体、单链可变区片段(scFv)、抗体片段、适配子、细胞因子、干扰素、激素、酶、生长因子、检查点抑制剂、PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA4抑制剂、CD抗原、趋化因子、神经递质、离子通道抑制剂、离子通道激活剂、G蛋白偶联受体抑制剂、G蛋白偶联受体激活剂、化学剂、放射增敏剂、辐射防护剂、放射性核素、治疗性小分子、类固醇、皮质类固醇、抗炎剂、免疫调节剂、补体固定肽或蛋白质、肿瘤坏死因子抑制剂、肿瘤坏死因子激活剂、肿瘤坏死因子受体家族激动剂、肿瘤坏死受体拮抗剂、Tim-3抑制剂、蛋白酶抑制剂、氨基糖、化学治疗剂、细胞毒化学制剂、毒素、酪氨酸激酶抑制剂、抗感染剂、抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂、氨基糖苷、非类固醇抗炎药物(NSAID)、他汀、纳米粒子、脂质体、聚合物、生物聚合物、聚糖、蛋白多糖、糖胺聚糖、聚乙二醇、脂质、树状物、脂肪酸、或Fc区、或其活性片段或修饰。在一些实施例中，该肽共价地或非共价地连接至活性剂，例如，直接地或通过接头。例如，可以使用的细胞毒分子包括澳瑞他汀、MMAE、MMAF、多洛他汀(dolostatin)、澳瑞他汀F、单甲基澳瑞他汀D、DM1、DM4、美登木素生物碱、美登素、卡里奇霉素、N-乙酰基-γ-卡里奇霉素、吡咯并苯并二氮杂卓、PBD二聚体、多柔比星、长春花生物碱(4-去乙酰基长春花碱)、多卡米新(duocarmycin)、蘑菇毒伞肽的环状八肽类似物、埃博霉素、和蒽环类(anthracyline)、CC-1065、紫杉烷、紫杉醇、卡巴他赛、多西他赛、SN-38、伊立替康、长春新碱、长春花碱、铂类化合物、顺铂、甲氨蝶呤以及BACE抑制剂。在McCombs,J.R.,AAPS J[美国药物科学家协会杂志],17(2):339–51(2015)，Ducry,L.,Antibody Drug Conjugates[抗体药物缀合物](2013)，以及Singh,S.K.,Pharm Res.[药物研究]32(11):3541–3571(2015)中描述了活性剂的另外的实例。可以将本文披露的肽用于归巢、分布至、靶向、导向至、积累于、迁移至和/或结合至癌性细胞，并且因此还可以用于定位附接的或融合的活性剂。此外，可以将打结氯毒素肽在细胞中内化(Wiranowska,M.,Cancer Cell Int.[国际癌细胞],11:27(2011))。因此，在活性剂缀合物或融合物的功效中，活性剂肽缀合物或融合肽的内化后的细胞内化、亚细胞定位和细胞内转运可以是重要因子。(Ducry,L.,Antibody DrugConjugates[抗体药物缀合物](2013)；和Singh,S.K.,Pharm Res.[药物研究]32(11):3541–3571(2015))。将适合与本文的实施例一起使用的示例性接头在下文做进一步详细的讨论。
与抗体-药物缀合物(例如，Adcetris、Kadcyla、麦罗塔(Mylotarg))相比，在一些方面中，如本文所描述的缀合至活性剂的肽由于其尺寸较小可以表现出更好的实体瘤渗透。在其他方面中，与抗体-药物缀合物相比，如本文所描述的缀合至活性剂的肽由于渗入BBB的能力还能够更好地到达脑肿瘤。在某些方面中，与抗体-药物缀合物相比，如本文所描述的缀合至活性剂的肽能够携带不同的或更高剂量的活性剂。在又其他方面中，与抗体-药物缀合物相比，如本文所描述的缀合至活性剂的肽可能具有更好的所定义药物比率的位点特异性递送。在其他方面中，该肽可易于在有机溶剂(除水之外)中进行溶剂化，这可以允许用于药物(其通常具有低的水溶解性)的溶剂化和缀合的更多的合成路径以及更高的缀合产率、更高比率的缀合至肽(对比抗体)的药物，和/或减少缀合过程中的聚集体/高分子量种类形成。另外地，可以通过否则不存在于短序列中的残基或通过包括非天然氨基酸而将一个或多个独特的氨基酸残基引入该肽，允许位点特异性缀合至该肽。
还可以将本披露的肽或融合肽缀合至其他部分，这些部分可以起到其他作用，例如提供用于从组织或体液中取回肽的亲和手柄(affinity handle)(例如，生物素)。例如，还可以将本披露的肽或融合肽缀合至生物素。除了延长半衰期，生物素还可以充当用于从组织或其他位置取回肽或融合肽的亲和手柄。在一些实施例中，可以使用可同时充当可检测标记和亲和手柄的荧光生物素缀合物。可商购的荧光生物素缀合物的非限制性实例包括阿托(Atto)425-生物素、阿托488-生物素、阿托520-生物素、阿托-550生物素、阿托565-生物素、阿托590-生物素、阿托610-生物素、阿托620-生物素、阿托655-生物素、阿托680-生物素、阿托700-生物素、阿托725-生物素、阿托740-生物素、荧光素生物素、生物素-4-荧光素、生物素-(5-荧光素)缀合物、和生物素-B-藻红蛋白、Alexa fluor 488生物胞素、Alexafluor 546、Alexa Fluor 549、荧光黄尸胺生物素-X、荧光黄生物胞素、俄勒冈绿(Oregongreen)488生物胞素、生物素-罗丹明以及四甲基罗丹明生物胞素。在一些其他实例中，这些缀合物可以包括化学发光化合物、胶态金属、发光化合物、酶、放射性同位素和顺磁标记。在一些实施例中，还可以将本文描述的肽附接至另一分子。例如，还可以将该肽序列附接至另一活性剂(例如，小分子、肽、多肽、多核苷酸、抗体、适配子、细胞因子、生长因子、神经递质、任一前述项的活性片段或修饰、荧光团、放射性同位素、放射性核素螯合剂、酰基加合物、化学接头或糖等)。在一些实施例中，该肽可以与活性剂融合，或共价地或非共价地连接至活性剂。
另外地，来源于毒素或毒液的多于一个肽序列可以存在于特定的肽上或与特定的肽融合。通过多种技术可以将肽掺入生物分子中。可以通过化学转化将肽掺入，例如形成共价键(如酰胺键)。可以例如通过固相或液相肽合成将肽掺入。可以通过制备编码该生物分子的核酸序列掺入肽，其中该核酸序列包括编码该肽的子序列。该子序列可以是编码该生物分子的序列，或可以替代编码该生物分子的序列的子序列。
可检测剂缀合物
可以将肽缀合至用于成像、研究、治疗学、治疗诊断学、药学、化学疗法、螯合疗法、靶向药物递送以及放射疗法的药剂。在一些实施例中，将肽缀合至可检测剂或与可检测剂融合，这些可检测剂是例如荧光团、近红外染料、造影剂、纳米粒子、含有金属的纳米粒子、金属螯合物、X射线造影剂、PET剂、金属、放射性同位素、染料、放射性核素螯合剂或可以用于成像的另一合适的材料。在一些实施例中，可以将1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种可检测剂连接至肽。放射性同位素的非限制性实例包括α发射体、β发射体、正电子发射体和γ发射体。在一些实施例中，该金属或放射性同位素选自下组，该组由以下各项组成：锕、镅、铋、镉、铯、钴、铕、钆、铱、铅、镥、锰、钯、钋、镭、钌、钐、锶、锝、铊和钇。在一些实施例中，该金属是锕、铋、铅、镭、锶、钐或钇。在一些实施例中，该放射性同位素是锕-225或铅-212。在一些实施例中，这些近红外染料不容易被生物组织和体液淬灭。在一些实施例中，该荧光团是在650nm和4000nm之间的波长范围内发射电磁辐射的荧光剂，将这样的发射用于检测此类药剂。在本披露中可以用作缀合分子的荧光染料的非限制性实例包括DyLight-680、DyLight-750、VivoTag-750、DyLight-800、IRDye-800、VivoTag-680、Cy5.5或吲哚菁绿(ICG)。在一些实施例中，近红外染料通常包括花菁染料(例如，Cy7、Cy5.5和Cy5)。在本披露中用作缀合分子的荧光染料的另外的非限制性实例包括吖啶橙或吖啶黄、Alexa Fluor(例如，AlexaFluor 790、750、700、680、660和647)及其任何衍生物、7-放线菌素D、8-苯胺基萘-1-磺酸、阿托染料及其任何衍生物、金胺-罗丹明染剂及其任何衍生物、bensantrhone、bimane、9-10-双(苯乙炔基)蒽、5,12-双(苯乙炔基)并四苯(naththacene)、双苯酰亚胺、脑彩虹(brainbow)、钙黄绿素、羧基荧光素(carbodyfluorescein)及其任何衍生物、1-氯-9,10-双(苯乙炔基)蒽及其任何衍生物、DAPI、DiOC6、DyLight Fluor及其任何衍生物、艾吡可酮(epicocconone)、溴化乙锭、FlAsH-EDT2、Fluo染料及其任何衍生物、FluoProbe及其任何衍生物、荧光素及其任何衍生物、Fura及其任何衍生物、GelGreen及其任何衍生物、GelRed及其任何衍生物、荧光蛋白及其任何衍生物、m同种型蛋白及其任何衍生物(例如像mCherry)、七甲川(hetamethine)染料及其任何衍生物、赫斯特(hoeschst)染剂、亚氨基香豆素(iminocoumarin)、印度黄、indo-1及其任何衍生物、来若丹(laurdan)、荧光黄及其任何衍生物、荧光素及其任何衍生物、荧光素酶及其任何衍生物、部花菁(mercocyanine)及其任何衍生物、尼罗染料(nile dye)及其任何衍生物、苝、焰红染料、phyco染料及其任何衍生物、碘化丙锭(propium iodide)、比染因(pyranine)、罗丹明及其任何衍生物、瑞博绿(ribogreen)、RoGFP、红荧烯、芪及其任何衍生物、磺基罗丹明及其任何衍生物、SYBR及其任何衍生物、synapto-pHluorin、四苯基丁二烯、tetrasodium tris、德克萨斯红(TexasRed)、达旦黄(Titan Yellow)、TSQ、伞形酮、蒽酮紫(violanthrone)、黄色荧光蛋白以及YOYO-1。其他合适的荧光染料包括但不限于，荧光素和荧光素染料(例如，荧光素异硫花菁(isothiocyanine)或FITC、萘并荧光素、4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素、6-羧基荧光素或FAM等)、羰花菁、部花菁、苯乙烯染料、氧杂菁染料(oxonol dye)、藻红蛋白、赤藓红、曙红、罗丹明染料(例如，羧基四甲基-罗丹明或TAMRA、羧基罗丹明6G、羧基-X-罗丹明(ROX)、丽丝胺罗丹明B、罗丹明6G、罗丹明绿(rhodamine Green)、罗丹明红(rhodamine Red)、四甲基罗丹明(TMR)等)、香豆素和香豆素染料(例如，甲氧基香豆素、二烷基氨基香豆素、羟基香豆素、氨甲基香豆素(AMCA)等)、俄勒冈绿染料(例如，俄勒冈绿488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514等)、德克萨斯红、德克萨斯红-X、SPECTRUM RED、SPECTRUM GREEN、花菁染料(例如，CY-3、Cy-5、CY-3.5、CY-5.5等)、ALEXA FLUOR染料(例如，ALEXA FLUOR 350、ALEXA FLUOR 488、ALEXA FLUOR 532、ALEXA FLUOR 546、ALEXA FLUOR 568、ALEXA FLUOR 594、ALEXA FLUOR633、ALEXA FLUOR 660、ALEXA FLUOR 680等)、BODIPY染料(例如，BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY TMR、BODIPY TR、BODIPY 530/550、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665等)、IRDye(例如，IRD40、IRD 700、IRD 800等)以及类似物。另外的合适的可检测剂描述于PCT/US14/56177中。放射性同位素的非限制性实例包括α发射体、β发射体、正电子发射体和γ发射体。在一些实施例中，该金属或放射性同位素选自下组，该组由以下各项组成：锕、镅、铋、镉、铯、钴、铕、钆、铱、铅、镥、锰、钯、钋、镭、钌、钐、锶、锝、铊和钇。在一些实施例中，该金属是锕、铋、铅、镭、锶、钐或钇。在一些实施例中，该放射性同位素是锕-225或铅-212。
本披露的其他实施例提供了缀合至放射增敏剂或光敏剂的肽。放射增敏剂的实例包括但不限于：ABT-263、ABT-199、WEHI-539、紫杉醇、卡铂、顺铂、奥沙利铂、吉西他滨、依他硝唑、米索硝唑、替拉扎明以及核酸碱基衍生物(例如，卤代嘌呤或嘧啶，如5-氟脱氧尿苷)。光敏剂的实例包括但不限于：当被照射时产生热的荧光分子或荧光珠、纳米粒子、卟啉和卟啉衍生物(例如，二氢卟酚、细菌二氢卟酚、异细菌二氢卟酚、酞菁和萘酞菁)、金属卟啉、金属酞菁、白芷素、chalcogenapyrrillium染料、叶绿素、香豆素、黄素和相关化合物(例如咯嗪和核黄素)、富勒烯、脱镁叶绿酸、焦脱镁叶绿酸、花菁(例如，部花菁540)、脱镁叶绿素、萨卟啉(Sapphyrin)、得克萨卟啉(texaphyrin)、红紫素、类卟吩(porphycene)、吩噻嗪鎓、亚甲蓝衍生物、萘酰亚胺、尼罗蓝衍生物、醌、苝醌(例如，金丝桃素、竹红菌素和尾孢毒素)、补骨脂素、醌、类维生素A、罗丹明、噻吩、verdin、呫吨染料(例如，曙红、赤藓红、孟加拉玫瑰红(rose bengal))、卟啉的二聚和寡聚形式以及前药(例如，5-氨基乙酰丙酸)。有利地，此方法允许同时使用治疗剂(例如，药物)和电磁能(例如，辐射或光)高度特异性地靶向患病细胞(例如，癌细胞)。在一些实施例中，该肽与该药剂融合，或共价地或非共价地连接至该药剂，例如，直接地或通过接头。将适合与本文的实施例一起使用的示例性接头在下文做进一步详细的讨论。
接头
可以将根据本披露的归巢、分布至、靶向、迁移至、积累于或被导向至癌性细胞或患病细胞或特定脑区域(例如，海马体、脑室系统、CSF)的肽通过接头，或在不存在接头的情况下直接附接至另一部分(例如，活性剂或可检测剂)，例如小分子、第二肽、蛋白质、抗体、抗体片段、适配子、多肽、多核苷酸、荧光团、放射性同位素、放射性核素螯合剂、聚合物、生物聚合物、脂肪酸、酰基加合物、化学接头或糖或本文所描述的其他活性剂或可检测剂。可以将跨过血-脑屏障或血液CSF的肽通过接头或在不存在接头的情况下直接附接至另一分子，例如小分子、第二肽、蛋白质、抗体、抗体片段、适配子、多肽、荧光团、放射性同位素、放射性核素螯合剂、聚合物、生物聚合物、脂肪酸、酰基加合物、化学接头或糖或本文所描述的其他活性剂或可检测剂。在不存在接头的情况下，例如，可以将活性剂或可检测剂融合至肽的N末端或C末端以产生活性剂或可检测剂融合肽。在其他实施例中，连接可以经由还原烷基化通过肽融合而产生。
通过将肽共价附接至另一分子的区域可以进行直接附接。例如，可以将活性剂或可检测剂融合至肽的N末端或C末端以产生活性剂或可检测剂融合肽。作为另一实例，可以通过接头将该肽在N末端、内部赖氨酸残基或C末端处附接至另一分子的氨基酸序列的末端。如果附接是在内部赖氨酸残基处，则另一分子可以在该内部赖氨酸残基的ε胺处连接至该肽。例如，这些内部赖氨酸残基可以位于对应于SEQ ID NO:37的氨基酸残基17、SEQ IDNO:37的氨基酸残基25或SEQ ID NO:37的氨基酸残基29或所披露的一种或多种肽的类似的残基(例如在SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:196任一者中的任何对应的赖氨酸残基)的位置处。作为另一实例，这些内部赖氨酸残基可以位于对应于SEQ ID NO:246的氨基酸残基15、SEQID NO:246的氨基酸残基23或SEQ ID NO:246的氨基酸残基27或所披露的一种或多种肽的类似的残基(例如在SEQ ID NO:210–SEQ ID NO:405任一者中的任何对应的赖氨酸残基)的位置处。在一些进一步的实例中，可以将该肽通过侧链附接至另一分子，该侧链是例如赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、非天然氨基酸残基或谷氨酸残基的侧链。接头可以是酰胺键、酯键、醚键、氨基甲酸酯键、碳酸酯键、碳-氮键、三唑、大环、肟键、腙键、碳-碳单、双或三键、二硫键、两个半胱氨酸之间的二碳桥、两个半胱氨酸之间的三碳桥或硫醚键。在又其他实施例中，该肽包含非天然氨基酸，其中该非天然氨基酸是另一氨基酸的插入物、附加物或替代物，并且该肽通过接头在该非天然氨基酸处连接至该活性剂。在一些实施例中，可以将所披露的一种或多种肽自身的类似区域(例如通过如本文所描述的酰胺键、酯键、醚键、氨基甲酸酯键、碳-氮键、三唑、大环、肟键、腙键、碳-碳单、双或三键、二硫键、硫醚键或其他接头，氨基酸序列的末端、氨基酸侧链如赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、非天然氨基酸残基或谷氨酸残基的侧链)用于连接其他分子。
通过接头进行附接涉及将接头部分掺入在另一分子和该肽之间。该肽和另一分子均可以共价地附接至该接头。该接头可以是可切割的、非可切割的、自灭的、亲水性的或疏水性的。该接头具有至少两个官能团(一个键合至另一分子，并且一个键合至该肽)，以及两个官能团之间的连接部分。一些示例性接头描述于Jain,N.,Pharm Res.[药物研究]32(11):3526–40(2015)；Doronina,S.O.,Bioconj Chem.[生物共轭化学]19(10):1960–3(2008)；Pillow,T.H.,J Med Chem.[药物化学杂志]57(19):7890–9(2014)；Dorywalksa,M.,Bioconj Chem.[生物共轭化学]26(4):650–9(2015)；Kellogg,B.A.,Bioconj Chem.[生物共轭化学]22(4):717–27(2011)，以及Zhao,R.Y.,J Med Chem.[药物化学杂志]54(10):3606–23(2011)。
用于附接的官能团的非限制性实例包括能够形成例如以下项的官能团：酰胺键、酯键、醚键、碳酸酯键、氨基甲酸酯键、碳-氮键、三唑、大环、肟键、腙键、碳-碳单、双或三键、二硫键或硫醚键。能够形成此类键的官能团的非限制性实例包括氨基基团；羧基基团；醛基；叠氮基团；炔烃和烯烃基团；酮；酰肼；肼；酰基卤，例如酰基氟、酰基氯、酰基溴和酰基碘；酸酐，包括对称的、混合的和环酐；碳酸酯；键合至离去基团的羰基官能度，例如氰基、琥珀酰亚胺基和N-羟基琥珀酰亚胺基；马来酰亚胺；被设计为水解的含有马来酰亚胺基团的接头；马来酰亚胺己酰基；MCC([N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-甲酸酯)；N-乙基马来酰亚胺；马来酰亚胺链烷；mc-vc-PABC；DUBA(多卡米新羟基苯甲酰胺-氮杂吲哚接头)；SMCC琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-甲酸酯；SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)；SPDB(N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯)；磺基-SPDB N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基丁酸酯；SPP N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯；二硫代吡啶基马来酰亚胺(DTM)；羟胺，乙烯基-卤基基团；卤代乙酰胺基基团；溴代乙酰胺基；羟基基团；巯基基团；以及具有例如烷基、烯基、炔基、烯丙基或苄基离去基团(如卤化物、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、三氟甲磺酸酯、环氧化物、磷酸酯、硫酸酯和苯磺酸酯)的分子。
连接部分的非限制性实例包括亚烷基、亚烯基、亚炔基、聚醚例如聚乙二醇(PEG)、聚酯、聚酰胺、聚氨基酸、多肽、可切割肽、Val-Cit、Phe-Lys、Val-Lys、Val-Ala、如在Doronina等人,2008中给出的其他肽接头、可被β-葡萄糖醛酸酶切割的接头、可被组织蛋白酶或被组织蛋白酶B、D、E、H、L、S、C、K、O、F、V、X或W切割的接头、Val-Cit-p-氨基苄基氧基羰基、葡糖苷酸-MABC、氨基苄基氨基甲酸酯、D-氨基酸和聚胺，其中的任一者未被取代或被以下任意数目的取代基取代，例如卤素、羟基基团、巯基基团、氨基基团、硝基基团、亚硝基基团、氰基基团、叠氮基基团、亚砜基团、砜基团、磺胺基团、羧基基团、羧醛基团(carboxaldehyde group)、亚胺基团、烷基基团、卤代烷基基团、烯基基团、卤代烯基基团、炔基基团、卤代炔基基团、烷氧基基团、芳基基团、芳氧基基团、芳烷基基团、芳基烷氧基基团、杂环基基团、酰基基团、酰氧基基团、氨基甲酸酯基团、酰胺基团、尿烷基团、环氧化物、带电荷的基团、两性离子的基团和酯基团。将分子连接在一起的反应的其他非限制性实例包括点击化学、无铜点击化学、HIPS连接、施陶丁格(Staudinger)连接和肼-异-皮克特-施彭格勒反应(hydrazine-iso-Pictet-Spengler)。
接头的非限制性实例包括：
以及
其中每个n独立地是0至约1,000；1至约1,000；0至约500；1至约500；0至约250；1至约250；0至约200；1至约200；0至约150；1至约150；0至约100；1至约100；0至约50；1至约50；0至约40；1至约40；0至约30；1至约30；0至约25；1至约25；0至约20；1至约20；0至约15；1至约15；0至约10；1至约10；0至约5；或1至约5。在一些实施例中，每个n独立地是0、约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49或约50。在一些实施例中，m是1至约1,000；1至约500；1至约250；1至约200；1至约150；1至约100；1至约50；1至约40；1至约30；1至约25；1至约20；1至约15；1至约10；或1至约5。在一些实施例中，m是0、约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49或约50。或如在Jain,N.,Pharm Res.[药物研究]32(11):3526-40(2015)或Ducry,L.,Antibody Drug Conjugates[抗体药物缀合物](2013)中披露的任何接头。
在一些情况下，接头可以是琥珀酸接头，并且药物可以通过酯键或酰胺键(在中间有两个亚甲基碳)附接至肽。在其他情况下，接头可以是同时具有羟基基团和羧酸(例如羟基己酸或乳酸)的任何接头。
在一些实施例中，该接头可以释放处于未修饰形式的活性剂。在其他实施例中，该活性剂可以通过化学修饰释放。在又其他实施例中，分解代谢可以释放仍连接至接头部分和/或肽部分的活性剂。
该接头可以是非可切割接头或可切割接头。在一些实施例中，该非可切割接头可以通过将缀合部分交换到血清白蛋白上的游离硫醇上来缓慢释放缀合部分。在一些实施例中，使用可切割接头可以允许从该肽中释放缀合部分(例如，治疗剂)，例如在靶向肿瘤或癌性细胞后。在其他实施例中，使用可切割接头可以允许缀合的治疗剂在跨过BBB后并且任选地在靶向特定脑区域后从该肽中释放。在一些情况下，该接头是酶可切割的，例如缬氨酸-瓜氨酸接头。在一些实施例中，该接头含有自灭的部分。在其他实施例中，该接头包括特定蛋白酶的一个或多个切割位点，例如基质金属蛋白酶(MMP)、凝血酶、组织蛋白酶或β-葡萄糖醛酸酶的切割位点。可替代地或组合地，该接头通过其他机制(例如经由pH、还原或水解)是可切割的。
该接头的水解或还原速率可根据应用进行微调或修改。例如，与具有靠近酯羰基的庞大基团的接头的水解相比，具有未受阻的酯的接头的水解速率要快。庞大基团可以是甲基基团、乙基基团、苯基基团、环或异丙基基团或提供立体位阻效应的任何基团。在一些情况下，立体位阻效应可以由药物自身提供，例如当通过其羧酸缀合时由酮咯酸提供。该接头的水解速率可以根据缀合物在靶位置中的停留时间来调整。例如，当从肿瘤或脑中相对快速地清除肽时，可以调整该接头以迅速水解。当肽在靶位置中具有较长的停留时间时，较慢的水解速率将允许延长递送活性剂。“Programmed hydrolysis in designingpaclitaxel prodrug for nanocarrier assembly[在设计用于纳米载体组装的紫杉醇前药中的程序化水解]”Sci Rep[科学报告]2015,5,12023Fu等人提供了修改的水解速率的实例。
制造方法
可以将不同表达载体/宿主系统用于本文所描述的肽的重组表达。这样的系统的非限制性实例包括微生物，例如用含有编码本文所描述的肽或肽融合蛋白/嵌合蛋白的核酸序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用含有前述核酸序列的重组酵母表达载体转化的酵母；用含有前述核酸序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用含有前述核酸序列的重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒(CaMV)、烟草花叶病毒(TMV))感染的或用含有前述核酸序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或用重组病毒表达载体(例如，腺病毒、痘苗病毒)感染的动物细胞系统，这些重组病毒表达载体包括工程化为含有前述核酸序列的多拷贝(在双微小染色体中稳定扩增的(例如，CHO/dhfr、CHO/谷氨酰胺合成酶)或不稳定扩增的)的细胞系(例如，鼠类细胞系)。二硫键形成和肽的折叠可以在表达过程中或表达后或在表达过程中和表达后发生。
可以使宿主细胞适应于表达本文所描述的一种或多种肽。这些宿主细胞可以是原核的、真核的或昆虫细胞。在一些情况下，宿主细胞能够调节插入序列的表达，或者以所希望的特定方式修饰和加工基因或蛋白质产物。例如，来自某些启动子的表达可以在某些诱导剂(例如用于金属硫蛋白启动子的锌离子和镉离子)的存在下升高。在一些情况下，肽产物的修饰(例如磷酸化)和加工(例如切割)对于肽的功能可能是重要的。宿主细胞可以具有用于肽的翻译后加工和修饰的特有且特定的机制。在一些情况下，用于表达这些肽的宿主细胞分泌最少量的蛋白水解酶。
在基于细胞或病毒的样品的情况下，可以在纯化之前处理有机体从而保存和/或释放靶多肽。在一些实施例中，使用固定剂将这些细胞固定。在一些实施例中，这些细胞被裂解。可以按这样的方式对细胞材料进行处理，该方式不破坏相当大比例的细胞，但从该细胞材料的表面和/或从细胞之间的间隙中去除蛋白质。例如，可以将细胞材料浸泡在液体缓冲液中，或在植物材料的情况下可以进行真空处理，以便于去除位于胞间隙和/或植物细胞壁中的蛋白质。如果细胞材料是微生物，则可以从微生物培养基中提取蛋白质。可替代地，可以将这些肽包装在内涵体中。可以将这些内涵体与培养基中的细胞组分进一步分离。在一些实施例中，这些细胞不被破坏。由细胞或病毒呈递的细胞肽或病毒肽可用于完整细胞或病毒颗粒的附接和/或纯化。除了重组系统之外，还可以在提取之前使用蛋白质和肽合成中采用的各种已知的技术在无细胞系统中合成肽。
在一些情况下，宿主细胞产生具有药物附接点的肽。附接点可以包含赖氨酸残基、N末端、半胱氨酸残基、半胱氨酸二硫键或非天然氨基酸。该肽还可以经合成而产生，例如通过固相肽合成或液相肽合成。肽合成可以通过芴甲氧羰基(Fmoc)化学或通过丁氧羰基(Boc)化学进行。该肽可以在合成过程中或合成后或在合成过程中和合成后折叠(二硫键形成)。肽片段可以经合成或重组产生。然后可以将肽片段经酶或合成而连接在一起。
图10说明了制造表达本披露的肽的构建体的方法的示意图，例如在图9中说明的和如贯穿本披露以及在本文提供的SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:196中描述的构建体。
在其他方面中，可以通过常规的固相化学合成技术，例如根据Fmoc固相肽合成方法(“Fmoc solid phase peptide synthesis,a practical approach[Fmoc固相肽合成，实用方法]”由W.C.Chan和P.D.White编辑,Oxford University Press[牛津大学出版社],2000)制备本披露的肽。
肽药物组合物
本披露的药物组合物可以是本文所描述的任何肽与其他化学组分的组合，这些化学组分是如载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂、抗氧化剂、增溶剂、缓冲剂、渗透剂、盐、表面活性剂、氨基酸、包封剂、膨胀剂、冷冻保护剂和/或赋形剂。该药物组合物促进了将本文所描述的肽给予有机体。可以将药物组合物作为药物组合物以治疗有效量通过各种形式和途径给予，这些形式和途径包括例如静脉内、皮下、肌内、直肠、气雾剂、肠胃外、眼(ophthalmic)、肺、经皮、阴道、眼(optic)、鼻、口腔、舌下、吸入、皮肤、鞘内、鼻内和局部给药。可以将药物组合物以局部或全身性方式给予，例如，通过将本文所描述的肽直接注射进器官，任选地在储器(depot)中。
可以将肠胃外注射剂配制为用于快速浓注或连续输注。这些药物组合物可以处于适合肠胃外注射的形式，作为在油性或水性运载体中的无菌悬浮液、溶液或乳液，并且可以含有配制剂(如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂)。用于肠胃外给予的药物配制品包括处于水溶形式的本文所描述的肽的水溶液。可以将本文所描述的肽的悬浮液制备成油性注射悬浮液。适合的亲脂性溶剂或运载体包括脂肪油如芝麻油或合成的脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酯，或者脂质体。水性注射悬浮液可以含有增加悬浮液的粘性的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。该悬浮液还可以含有合适的稳定剂或增加本文所描述的这些肽的溶解性和/或减少这些肽的聚集以允许制备高度浓缩的溶液的试剂。可替代地，本文所描述的肽可以被冻干或处于粉末形式用于在使用前用合适的运载体(例如无菌无热原水)进行重构。在一些实施例中，将经纯化的肽经静脉内给予。可以将本文所描述的肽给予受试者，归巢、靶向、迁移至或被导向至受试者的器官(例如海马体)并跨过血脑屏障。
可以将本披露的肽在外科手术过程中直接应用于器官或器官组织或细胞(例如脑或脑组织或细胞)。可以将本文所描述的重组肽局部给予，并且可以将其配制成多种可局部给予的组合物，例如溶液、悬浮液、洗液、凝胶剂、糊剂、药棒、香膏剂、乳膏剂和软膏剂。这样的药物组合物可以含有增溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲剂和防腐剂。
在实践本文提供的治疗或使用的方法时，可以将本文所描述的治疗有效量的肽以药物组合物形式给予患有影响免疫系统的病症的受试者。在一些实施例中，该受试者是哺乳动物(例如人)。治疗有效量可以根据疾病的严重程度、受试者的年龄和相对健康状况、所用化合物的效力以及其他因素而广泛地变化。
可以使用一种或多种生理学上可接受的载体(包含赋形剂和助剂)来配制药物组合物，这些赋形剂和助剂有助于将活性化合物加工成可药用的制剂。可以根据所选给药途径修改配方。可以例如通过在重组系统中表达肽、纯化肽、冻干肽、混合、溶解、制粒、制作糖衣丸、磨细、乳化、包封、包埋或压缩过程来制造包含本文所描述的肽的药物组合物。这些药物组合物可以包括至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂以及呈游离碱或药学上可接受的盐形式的本文所描述的化合物。
用于制备本文所描述的肽(包含本文所描述的化合物)的方法包括将本文所描述的肽与一种或多种惰性的药学上可接受的赋形剂或载体一起配制以形成固体、半固体或液体组合物。固体组合物包括例如散剂、片剂、可分散颗粒剂、胶囊剂、扁囊剂和栓剂。这些组合物还可以含有少量的无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂以及其他药学上可接受的添加剂。
药学上可接受的赋形剂的非限制性实例可以例如发现于Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy[雷明顿:药学科学与实践]，Nineteenth Ed(Easton,Pa.:MackPublishing Company,1995)[第19版，宾夕法尼亚州伊斯顿：马克出版公司，1995]；Hoover,John E.,Remington’s Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学]，Mack PublishingCo.,Easton,Pennsylvania 1975[马克出版公司，宾夕法尼亚州伊斯顿1975]；Liberman,H.A.和Lachman,L.编辑，Pharmaceutical Dosage Forms[药物剂型],Marcel Decker,NewYork,N.Y.,1980[马塞尔·德克尔公司，纽约州纽约市，1980]；以及PharmaceuticalDosage Forms and Drug Delivery Systems[药物剂型和药物递送系统]，Seventh Ed.(Lippincott Williams&Wilkins1999)[第7版，利平科特威廉姆斯·威尔金斯1999]，将其中的每者以其全文通过引用而并入。
在成像和外科手术方法中肽的使用
本披露涉及归巢、分布至、靶向、迁移至、积累于或被导向至癌性细胞或患病细胞的肽。本披露涉及归巢、靶向、迁移至、积累于或被导向至体内的特定区域、组织、结构或细胞的肽以及使用这样的肽的方法。这些肽具有结合能力从而跨过血脑屏障或血液CSF屏障，使得它们可用于各种应用。这些能力使得它们可用于各种应用。特别地，这些肽在其被导向的生物分子的位点特异性调节中具有用途。这样的肽的最终用途包括例如成像、研究、治疗学、治疗诊断学、药学、化学疗法、螯合疗法、靶向药物递送以及放射疗法。一些用途可以包括靶向药物递送和成像。
在一些实施例中，本披露的肽递送金属、放射性同位素、染料、荧光团或可以用于在成像中使用的另一合适的材料。放射性同位素的非限制性实例包括α发射体、β发射体、正电子发射体和γ发射体。在一些实施例中，该金属或放射性同位素选自下组，该组由以下各项组成：锕、镅、铋、镉、铯、钴、铕、钆、铱、铅、镥、锰、钯、钋、镭、钌、钐、锶、锝、铊和钇。在一些实施例中，该金属是锕、铋、铅、镭、锶、钐或钇。在一些实施例中，该放射性同位素是锕-225或铅-212。
在一些实施例中，该荧光团是在650nm和4000nm之间的波长范围内发射电磁辐射的荧光剂，将这样的发射用于检测此类药剂。在本披露中可以用作缀合分子的荧光染料的非限制性实例包括DyLight-680、DyLight-750、VivoTag-750、DyLight-800、IRDye-800、VivoTag-680、Cy5.5、ZW800、ZQ800或吲哚菁绿(ICG)。在一些实施例中，近红外染料通常包括花菁染料(例如，Cy7、Cy5.5和Cy5)。在本披露中用作缀合分子的荧光染料的另外的非限制性实例包括吖啶橙或吖啶黄、Alexa Fluor(例如，Alexa Fluor 790、750、700、680、660和647)及其任何衍生物、7-放线菌素D、8-苯胺基萘-1-磺酸、阿托染料及其任何衍生物、金胺-罗丹明染剂及其任何衍生物、bensantrhone、bimane、9-10-双(苯乙炔基)蒽、5,12-双(苯乙炔基)并四苯、双苯酰亚胺、脑彩虹、钙黄绿素、羧基荧光素及其任何衍生物、1-氯-9,10-双(苯乙炔基)蒽及其任何衍生物、DAPI、DiOC6、DyLight Fluor及其任何衍生物、艾吡可酮、溴化乙锭、FlAsH-EDT2、Fluo染料及其任何衍生物、FluoProbe及其任何衍生物、荧光素及其任何衍生物、Fura及其任何衍生物、GelGreen及其任何衍生物、GelRed及其任何衍生物、荧光蛋白及其任何衍生物、m同种型蛋白及其任何衍生物(例如像mCherry)、七甲川染料及其任何衍生物、赫斯特染剂、亚氨基香豆素、印度黄、indo-1及其任何衍生物、来若丹、荧光黄及其任何衍生物、荧光素及其任何衍生物、荧光素酶及其任何衍生物、部花菁及其任何衍生物、尼罗染料及其任何衍生物、苝、焰红染料、phyco染料及其任何衍生物、碘化丙锭、比染因、罗丹明及其任何衍生物、瑞博绿、RoGFP、红荧烯、芪及其任何衍生物、磺基罗丹明及其任何衍生物、SYBR及其任何衍生物、synapto-pHluorin、四苯基丁二烯、tetrasodium tris、德克萨斯红、达旦黄、TSQ、伞形酮、蒽酮紫、黄色荧光蛋白以及YOYO-1。其他合适的荧光染料包括但不限于，荧光素和荧光素染料(例如，荧光素异硫花菁或FITC、萘并荧光素、4′,5′-二氯-2′,7′-二甲氧基荧光素、6-羧基荧光素或FAM等)、羰花菁、部花菁、苯乙烯染料、氧杂菁染料、藻红蛋白、赤藓红、曙红、罗丹明染料(例如，羧基四甲基-罗丹明或TAMRA、羧基罗丹明6G、羧基-X-罗丹明(ROX)、丽丝胺罗丹明B、罗丹明6G、罗丹明绿、罗丹明红、四甲基罗丹明(TMR)等)、香豆素和香豆素染料(例如，甲氧基香豆素、二烷基氨基香豆素、羟基香豆素、氨甲基香豆素(AMCA)等)、俄勒冈绿染料(例如，俄勒冈绿488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514等)、德克萨斯红、德克萨斯红-X、SPECTRUM RED、SPECTRUM GREEN、花菁染料(例如，CY-3、Cy-5、CY-3.5、CY-5.5等)、ALEXA FLUOR染料(例如，ALEXA FLUOR 350、ALEXA FLUOR 488、ALEXAFLUOR 532、ALEXA FLUOR 546、ALEXA FLUOR 568、ALEXA FLUOR 594、ALEXA FLUOR 633、ALEXA FLUOR 660、ALEXA FLUOR 680等)、BODIPY染料(例如，BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY TMR、BODIPY TR、BODIPY 530/550、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665等)、IRDye(例如，IRD40、IRD 700、IRD 800等)以及类似物。另外的合适的可检测剂描述于PCT/US14/56177中或可以在成像中使用的另一合适的材料。
本发明提供了使用与可检测剂缀合的本披露的肽用于术中成像以及切除癌症、癌性组织、肿瘤组织、癌性细胞或患病组织的方法。在一些方面中，使用本披露的肽通过荧光成像可检测癌症、癌性组织、肿瘤组织或患病组织或前述项的细胞，荧光成像允许对癌症、癌性组织、肿瘤组织、癌性细胞或患病组织进行术中可视化。在一些方面中，将本披露的肽缀合至一种或多种可检测剂。在进一步的实施例中，该可检测剂包含偶联至该肽的荧光部分。在另一实施例中，该可检测剂包含放射性核素。在一些方面中，成像是术前成像。在其他方面中，在开腹手术过程中实现成像。在进一步的方面中，在使用内窥镜检查或其他非侵入性外科手术技术的同时完成成像。在仍进一步的方面中，在外科手术去除癌症、癌性组织、肿瘤组织或患病组织或前述项的细胞后进行成像。
在一些方面中，本披露提供了用于检测癌症、癌性组织、肿瘤组织或患病组织或前述项的细胞的方法，该方法包括以下步骤：使感兴趣的组织与本披露的肽接触，其中将该肽缀合至可检测剂，并且测量该肽的结合水平，其中相对于正常组织，升高的结合水平是由可检测剂的增加的检测来指示，这指示该组织是癌症、癌性组织、肿瘤组织或患病组织或前述项的细胞。
癌症的治疗
在一个实施例中，该方法包括向对其有需要的受试者给予有效量的本披露的肽。
如本文所用的术语“有效量”指使所治疗疾病或病症的一种或多种症状得到某种程度缓解的药剂或化合物的充足给药量。结果可以为疾病征象、症状或原因的减少和/或缓和，或者任何其他所希望的生物系统变化。可以给予含有此类药剂或化合物的组合物用于预防性、增强性和/或治疗性治疗。任何个案中的适当“有效”量可以使用诸如剂量递增研究等技术来确定。
本披露的方法、组合物和试剂盒可以包括预防、治疗、阻止、逆转或减轻病症症状的方法。治疗可以包括用本披露的肽治疗受试者(例如，患有疾病或病症的个体、家畜、野生动物或实验动物)。该疾病可以是癌症或肿瘤。在治疗疾病中，该肽可以接触肿瘤或癌性细胞。该受试者可以是人。受试者可以是人；非人灵长类动物，例如黑猩猩和其他猿和猴物种；农场动物，例如牛、马、绵羊、山羊、猪；家畜，例如兔、狗和猫；实验动物，包括啮齿动物，例如大鼠、小鼠和豚鼠等。受试者可以是任何年龄。受试者可以是例如老年人、成人、青少年、青春期前的儿童、儿童、幼童、婴儿和子宫内的胎儿。
可以在临床发病之前向该受试者提供治疗。可以在临床发病之后向该受试者提供治疗。可以在临床发病后1天、1周、6个月、12个月或2年或更长时间后向该受试者提供治疗。可以在临床发病后向该受试者提供多于1天、1周、1个月、6个月、12个月或2年或更长时间的治疗。可以在临床发病后向该受试者提供少于1天、1周、1个月、6个月、12个月或2年的治疗。治疗还可以包括在临床试验中对人进行治疗。治疗可以包括向受试者给予药物组合物，例如贯穿本披露描述的一种或多种药物组合物。治疗可以包括将本披露的肽静脉内地、皮下地、肌内地、通过吸入、皮肤地、局部地、口服地、舌下地、鞘内地、经皮地、鼻内地、经腹膜途径或直接进入脑(例如通过脑室内途径)而递送至受试者。治疗可以包括将肽-活性剂复合物静脉内地、皮下地、肌内地、通过吸入、皮肤地、局部地、口服地、鞘内地、经皮地、鼻内地、肠胃外地、口服地、经腹膜途径、经鼻地、舌下地或直接进入脑而给予受试者。
在一些实施例中，本披露提供了用于治疗癌症或肿瘤的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予有效量的本披露的肽。可以用本披露的肽治疗的癌症或病症的一个实例是实体瘤。可以用本披露的肽治疗的癌症或病症的另外的实例包括三阴性乳癌、乳腺癌、乳腺癌转移、本文所描述的任何癌症的转移、结肠癌、结肠癌转移、肉瘤、急性淋巴母细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关的癌症(例如卡波西肉瘤、AIDS相关的淋巴瘤)、原发性CNS淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、儿童星形细胞瘤、星形细胞瘤、儿童非典型畸胎样/横纹肌样(rhabdiod)肿瘤、CNS非典型畸胎样/横纹肌样肿瘤、非典型畸胎样/横纹肌样肿瘤、基底细胞癌、皮肤癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、尤文肉瘤家族的肿瘤、骨肉瘤、软骨瘤、软骨肉瘤、原发性和转移性骨癌、恶性纤维组织细胞瘤、儿童脑干神经胶质瘤、脑干神经胶质瘤、脑肿瘤、脑和脊髓肿瘤、中枢神经系统胚胎性肿瘤、儿童中枢神经系统胚胎性肿瘤、中枢神经系统生殖细胞肿瘤、儿童中枢神经系统生殖细胞肿瘤、颅咽管瘤、儿童颅咽管瘤、室管膜瘤、儿童室管膜瘤、乳腺癌、支气管肿瘤、儿童支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、类癌肿瘤、胃肠癌、未知的原发性癌、心脏肿瘤、儿童心脏肿瘤、原发性淋巴瘤、宫颈癌、胆管癌、脊索瘤、儿童脊索瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、慢性骨髓增生性肿瘤、结肠癌、结肠直肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、原位导管癌、子宫内膜癌、食管癌、鼻腔神经胶质瘤、儿童鼻腔神经胶质瘤、尤文肉瘤、颅外生殖细胞肿瘤、儿童颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、眼癌、眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、输卵管癌、骨纤维组织细胞瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道间质瘤、卵巢癌、睾丸癌、妊娠滋养细胞疾病、神经胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞癌、组织细胞增生症、郎格罕细胞组织细胞增生症、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑色素瘤、黑色素瘤、黑色素瘤转移、胰岛细胞瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、肾癌、肾细胞肿瘤、维尔姆斯瘤(Wilms tumor)、儿童肾肿瘤、唇和口腔癌、肝癌、肺癌、非霍奇金淋巴瘤、巨球蛋白血症、华氏巨球蛋白血症、男性乳腺癌、梅克尔细胞癌、隐匿性原发转移性鳞状颈癌、涉及NUT基因的中线道癌、口腔癌、多发性内分泌瘤综合征、儿童多发性内分泌瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、蕈状真菌病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性肿瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生性肿瘤、慢性骨髓增生性肿瘤、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非小细胞肺癌、口咽癌、低度恶性潜能肿瘤、胰腺癌、胰腺神经内分泌肿瘤、乳头瘤病、儿童乳头瘤病、副神经节瘤、副鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、咽癌、垂体肿瘤、胸膜肺母细胞瘤、儿童胸膜肺母细胞瘤、原发性腹膜癌、前列腺癌、直肠癌、怀孕相关的癌症、横纹肌肉瘤、儿童横纹肌肉瘤、唾液腺癌、塞扎里综合征、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤、胸腺癌、甲状腺癌、肾、骨盆、和输尿管的移行细胞癌、子宫癌、尿道癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、阴道癌、血管肿瘤以及外阴癌。
在一些实施例中，该肽结合至钾通道。在一些实施例中，该肽结合至钠通道。在一些实施例中，该肽封闭钾通道和/或钠通道，在一些实施例中，该肽激活钾通道和/或钠通道。在一些实施例中，该肽与离子通道或氯通道或钙通道相互作用。在一些实施例中，该肽与以下项相互作用：烟碱乙酰胆碱受体、瞬时受体电位通道、NMDA受体、血清素受体、KIR通道、GABA通道、甘氨酸受体、谷氨酸受体、酸感离子通道、K2P通道、Nav1.7或嘌呤能受体。在一些实施例中，该肽与基质金属蛋白酶相互作用，抑制癌细胞迁移或转移，或具有抗肿瘤活性。在一些实施例中，该肽与钙激活的钾通道相互作用。在一些实施例中，该肽具有抗细菌、抗真菌或抗病毒活性。在一些实施例中，该肽抑制蛋白酶。在一些实施例中，该肽与影响疼痛的通道相互作用。在一些实施例中，该肽对受影响的器官或其结构具有其他治疗效果。
在一些实施例中，本披露的肽展示出蛋白酶抑制剂活性。在某些实施例中，将肽用于抑制感兴趣的蛋白酶，例如与凝固关联的蛋白酶(例如，凝血酶、因子10a)、与代谢关联的蛋白酶(例如，DPP-IV)、与癌症关联的蛋白酶(例如，基质金属蛋白酶、组织蛋白酶)、与病毒感染关联的蛋白酶(例如，HIV蛋白酶)以及与炎症关联的蛋白酶(例如，类胰蛋白酶、激肽释放酶)。
在一些实施例中，可以将本披露的肽修饰为具抗炎性，例如通过掺入免疫选择性抗炎衍生物(ImSAID)的特性。在某些实施例中，将ImSAID掺入或添加到如本文所描述的能够靶向癌性细胞的肽上。FEG是赋予抗炎特性的关键序列的实例。可替代地或组合地，可以将本披露的肽缀合至免疫调节分子从而逆转、减少或限制炎症。
在一些实施例中，将本披露的肽用于治疗癌症。例如，在某些实施例中，将本文提供的肽直接用于抑制与关键的与癌症关联的途径，例如RAS、MYC、PHF5A、BubR1、PKMYT1或BuGZ。
在一些方面中，将本披露的肽缀合至一种或多种治疗剂。在某些方面中，该治疗剂是选自但不限于以下项的化学治疗剂、抗癌药物或抗癌剂：放射性同位素、毒素、酶、致敏药物、核酸(包括干扰RNA)、抗体、抗血管生成剂、顺铂、铂类化合物、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、生长因子抑制剂、紫杉烷、紫杉醇、卡巴他赛、替莫唑胺、拓扑替康、氟尿嘧啶、长春新碱、长春花碱、4-去乙酰基长春花碱、甲基苄肼、氨烯咪胺(decarbazine)、六甲蜜胺、甲氨蝶呤、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、磷酸氟达拉滨、克拉屈滨、喷司他丁、阿糖孢苷、阿扎胞苷、依托泊苷、替尼泊苷、伊立替康、多西他赛、多柔比星、柔红霉素、更生霉素、伊达比星、普卡霉素、丝裂霉素、博莱霉素、它莫西芬、氟他胺、亮丙瑞林、戈舍瑞林、氨鲁米特(aminogluthimide)、阿那曲唑、安吖啶、天冬酰胺酶、米托蒽醌、米托坦和氨磷汀、长春花生物碱、蘑菇毒伞肽的环状八肽类似物、埃博霉素、和蒽环类、CC-1065、SN-38、和BACE抑制剂，及其等效物，连同光消融剂。例如，在某些实施例中，将本披露的肽缀合至帕博西尼，一种具有有限的跨过血脑屏障的能力的CDK 4/6抑制剂。作为另一实例，在某些实施例中，将本披露的肽缀合至单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、MMAF、澳瑞他汀、多洛他汀、澳瑞他汀F、单甲基澳瑞他汀D、美登木素生物碱(例如，DM-1、DM4、美登素)、吡咯并苯并二氮杂卓二聚体、卡里奇霉素、N-乙酰基-γ-卡里奇霉素、多卡米新、蒽环霉素、微管抑制剂或DNA损伤剂。
任选地，本披露的某些实施例提供了缀合至放射增敏剂或光敏剂的肽。放射增敏剂的实例包括但不限于：ABT-263、ABT-199、WEHI-539、紫杉醇、卡铂、顺铂、奥沙利铂、吉西他滨、依他硝唑、米索硝唑、替拉扎明以及核酸碱基衍生物(例如，卤代嘌呤或嘧啶，如5-氟脱氧尿苷)。光敏剂的实例包括但不限于：当被照射时产生热的荧光分子或荧光珠、卟啉和卟啉衍生物(例如，二氢卟酚、细菌二氢卟酚、异细菌二氢卟酚、酞菁和萘酞菁)、金属卟啉、金属酞菁、白芷素、chalcogenapyrrillium染料、叶绿素、香豆素、黄素和相关化合物(例如咯嗪和核黄素)、富勒烯、脱镁叶绿酸、焦脱镁叶绿酸、花菁(例如，部花菁540)、脱镁叶绿素、萨卟啉、得克萨卟啉、红紫素、类卟吩、吩噻嗪鎓、亚甲蓝衍生物、萘酰亚胺、尼罗蓝衍生物、醌、苝醌(例如，金丝桃素、竹红菌素和尾孢毒素)、补骨脂素、醌、类维生素A、罗丹明、噻吩、verdin、呫吨染料(例如，曙红、赤藓红、孟加拉玫瑰红)、卟啉的二聚和寡聚形式以及前药(例如，5-氨基乙酰丙酸)。有利地，此方法允许同时使用治疗剂(例如，药物)和电磁能(例如，辐射或光)高度特异性地靶向癌细胞。
在某些实施例中，本披露的肽被突变成归巢、分布至、靶向、迁移至、积累于或被导向至某些组织而不是其他组织，从而改变其功能的强度或特异性，或从而获得或丧失功能，例如使离子通道激动或抑制蛋白酶。
本披露还涵盖“串联”肽的使用，其中将两种或更多种肽缀合或融合在一起。在某些实施例中，串联肽包含如上和本文讨论的缀合或融合在一起的两种或更多种打结肽，其中至少一种打结肽能够靶向特定区域，并且至少一种其他的打结肽提供特定的治疗活性，例如BIM类似物。
在一些实施例中，本披露提供了用于治疗癌症的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予有效量的本披露的肽。
在一些实施例中，本披露提供了用于治疗癌症的方法，该方法包括向对其有需要的患者给予有效量的包含本披露的肽和药学上可接受的载体的药物组合物。
在一些实施例中，本披露提供了用于抑制细胞侵袭活性的方法，该方法包括向受试者给予有效量的本披露的肽。
可以将如本文所描述的包含SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:192或SEQ ID NO:210–SEQID NO:401中任一者的序列的肽、和任何肽衍生物或肽-活性剂用于靶向上GI疾病和癌症(例如，咽喉癌、口腔癌、食管癌、唾液腺癌、扁桃体癌、咽癌、腺肉瘤、口腔恶性黑色素瘤、头颈癌)。可以将如本文所描述的包含SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:192或SEQ ID NO:210–SEQ IDNO:401中任一者的序列的肽、和任何肽衍生物或肽-活性剂用于另外地靶向胆囊疾病和癌症。
可以给予本文所描述的毒液或毒素来源的一种或多种肽、经修饰的肽、经标记的肽、肽-活性剂缀合物和药物组合物用于预防性和/或治疗性治疗。在治疗性应用中，可以将这些组合物按一定量给予已经患有疾病或病症的受试者，该量足以治愈或至少部分地阻止疾病或病症的症状，或足以治愈、痊愈、改善或减轻病症。还可以给予本文所描述的这样的肽以预防(全部地或部分地)患上、感染病症或使其恶化，减少患上、感染病症或使其恶化的可能性。针对此用途有效的量可以基于疾病或病症的严重程度和过程、先前的疗法、受试者的健康状况、体重和对药物的反应、以及治疗医师的计算而变化。
在一些实施例中，本披露提供了治疗受试者的肿瘤或癌性细胞的方法，该方法包括给予受试者包含SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:196或SEQ ID NO:210–SEQ ID NO:405中任一者的序列的肽或其功能片段。
可以按任何顺序或同时地给予本文所描述的多种肽。在一些情况下，可以按任何顺序或同时地给予来源于毒素或毒液的肽的多个功能片段。如果同时给予，可以将本文所描述的多种肽按单一统一的形式(例如静脉内注射)或按多种形式(例如随后的静脉内剂量)提供。
可以将肽包装成试剂盒。在一些实施例中，试剂盒包括对这些肽的使用或给予的书面说明。
脑肿瘤和其他脑疾病和障碍的治疗
在一个实施例中，该方法包括向对其有需要的受试者给予有效量的本披露的肽。
如本文所用的术语“有效量”指使所治疗疾病或病症的一种或多种症状得到某种程度缓解的药剂或化合物的充足给药量。结果可以为疾病征象、症状或原因的减少和/或缓和，或者任何其他所希望的生物系统变化。可以给予含有此类药剂或化合物的组合物用于预防性、增强性和/或治疗性治疗。任何个案中的适当“有效”量可以使用诸如剂量递增研究等技术来确定。
本披露的方法、组合物和试剂盒可以包括预防、治疗、阻止、逆转或减轻病症症状的方法。治疗可以包括用本披露的肽治疗受试者(例如，患有疾病或病症的个体、家畜、野生动物或实验动物)。该疾病可以是脑或脊髓疾病。在治疗疾病中，该肽可以跨过受试者的血脑屏障或血脑脊液屏障。该受试者可以是人。受试者可以是人；非人灵长类动物，例如黑猩猩和其他猿和猴物种；农场动物，例如牛、马、绵羊、山羊、猪；家畜，例如兔、狗和猫；实验动物，包括啮齿动物，例如大鼠、小鼠和豚鼠等。受试者可以是任何年龄。受试者可以是例如老年人、成人、青少年、青春期前的儿童、儿童、幼童、婴儿和子宫内的胎儿。
可以在临床发病之前向该受试者提供治疗。可以在临床发病之后向该受试者提供治疗。可以在临床发病后1天、1周、6个月、12个月或2年或更长时间后向该受试者提供治疗。可以在临床发病后向该受试者提供多于1天、1周、6个月、1个月、12个月或2年或更长时间的治疗。可以在临床发病后向该受试者提供少于1天、1周、1个月、6个月、12个月或2年的治疗。治疗还可以包括在临床试验中对人进行治疗。治疗可以包括向受试者给予药物组合物，例如贯穿本披露描述的一种或多种药物组合物。治疗可以包括将本披露的肽静脉内地、皮下地、肌内地、通过吸入、皮肤地、局部地、口服地、舌下地、鞘内地、经皮地、鼻内地、经腹膜途径或直接进入脑(例如通过脑室内途径)而递送至受试者。治疗可以包括将肽-活性剂复合物静脉内地、皮下地、肌内地、通过吸入、皮肤地、局部地、口服地、鞘内地、经皮地、鼻内地、肠胃外地、口服地、经腹膜途径、经鼻地、舌下地或直接进入脑而给予受试者。
可以通过本披露的肽调节多个脑区域、组织、结构或细胞的活动。一些脑区域、组织、结构包括：a)大脑，包括大脑皮层、基底神经节(纹状体)和嗅球；b)小脑，包括齿状核、间位核、顶核和前庭核；c)间脑，包括丘脑、下丘脑和垂体腺后部；和d)脑干，包括脑桥、黑质、延髓；e)颞叶，包括海马体和齿状回(包括颗粒下层)；f)脑室系统，包括侧脑室(右脑室和左脑室)、第三脑室、第四脑室、室内孔、大脑导水管、正中孔、右和左侧孔、脉络丛和脑室下区；g)CSF和关联的组织，包括蛛网膜下腔、脑池、脑沟；h)脑膜，包括硬脑膜、蛛网膜和软脑膜；i)嘴侧迁移流；j)神经干细胞、神经祖细胞和新的神经细胞；以及k)在上述(a)–(j)中的任何细胞或细胞类型。在一些实施例中，本披露的肽能够跨过BBB或血液CSF屏障并且积累在一个或多个特定脑区域、组织、结构或细胞中。例如，在某些实施例中，本文所描述的肽归巢、靶向、被导向至、迁移至或积累于海马体、CSF、脑室系统、脑膜、或嘴侧迁移流、或其组合。
在一些实施例中，本披露提供了用于治疗脑疾病或病症的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予有效量的本披露的肽。脑疾病或病症可以是任何神经退行性疾病或溶酶体贮积病。神经退行性疾病可以是与中枢神经系统结构或功能的丧失相关的任何疾病、病情或病症，包括与中枢神经系统结构或功能的丧失相关的任何疾病、病情或病症，包括但不限于阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、额颞叶痴呆、进行性核上性麻痹和皮质基底节变性。溶酶体贮积病可以是与溶酶体功能缺陷相关的任何疾病、病情或病症，包括但不限于克拉伯病、戈谢病、泰-萨二氏病、尼曼-皮克病、庞贝氏症、贺勒综合征和亨特综合征。可以用本披露的肽治疗的脑疾病或病症的另外的实例包括听神经瘤(前庭神经鞘瘤)、急性硬膜下血肿、成瘾(例如，酗酒、药物成瘾、尼古丁或烟草成瘾等)、阿尔茨海默病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS，或卢伽雷氏病)、间变型星形细胞瘤(AA)、焦虑及相关的障碍、厌食、反社会型人格障碍、导水管狭窄、蛛网膜囊肿、小脑扁桃体下疝畸形(Arnold Chiari Malformation)、动静脉畸形(AVM)、星形细胞瘤、自闭症、颤搐、双相型障碍、脑动脉瘤、脑发作、脑转移、脑干胶质瘤、贪食症、颈动脉狭窄、儿童灾难性癫痫、海绵状血管瘤、大脑动脉瘤、脑挫伤和脑内血肿、脑出血、小脑扁桃体下疝畸形(ChiariMalformation)、脊索瘤、舞蹈病、脉络膜囊肿、慢性硬脑膜下血肿、胶样囊肿、昏迷、脑震荡、颅骨枪伤、皮质基底节变性、颅咽管瘤、颅缝早闭、库欣病、囊肿(表皮样肿瘤)、痴呆、抑郁及相关障碍、进食障碍、体重减轻和饱腹感、糖尿病、德拉韦综合征(Dravet Syndrome)、室管膜瘤、癫痫、硬膜外血肿癫痫、特发性震颤、颞叶外癫痫、面关节综合征、额颞叶痴呆、神经节神经胶质瘤、戈谢病、生殖细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤(GBM)、神经胶质瘤、颈静脉球体瘤、舌咽神经痛、成血管细胞瘤、半面痉挛、脑积水、亨廷顿病、免疫系统障碍、脑内出血、贺勒综合征、亨特综合征、颅内低压、JPA(青少年纤维性星形细胞瘤)、克拉伯病、雷葛氏综合征(Lennox-Gestaut Syndrome)、脂肪脊髓脊膜膨出、低级星形细胞瘤(LGA)、淋巴细胞性垂体炎、淋巴瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、脑膜炎、颞叶内侧癫痫、转移性脑肿瘤、偏头痛、线粒体病、烟雾病、多发性硬化症、多系统萎缩(MSA)、尼曼-皮克病、尼尔森综合征、脑囊虫病、神经退行性疾病、纤维神经瘤、神经性疼痛、无功能型垂体腺瘤、正常压力脑积水、强迫性障碍、少突神经胶质瘤、视神经胶质瘤、骨髓炎、帕金森病、偏执狂及相关障碍、小儿脑积水、幻肢痛、纤维性星形细胞瘤、松果体肿瘤、松果体母细胞瘤、成松果体细胞瘤、垂体腺瘤(肿瘤)、垂体卒中、垂体功能衰竭、庞贝氏症、带状疱疹后遗神经痛、创伤后癫痫、创伤后应激障碍、原发性CNS淋巴瘤、泌乳素瘤、假性脑瘤、进行性核上性麻痹、拉特克氏裂囊肿(Rathke’sCleft Cyst)、复发性腺瘤、风湿性关节炎、精神分裂症、神经鞘瘤、脊柱侧凸、颅骨骨折、裂隙脑室综合征、痉挛、自发性低颅压、中风(脑发作、TIA)、蛛网膜下出血、瘘管、泰-萨二氏病、促甲状腺细胞(TSH)分泌腺瘤、斜颈、短暂脑缺血发作(TIA)、创伤性脑损伤、创伤性血肿、三叉神经痛、脑室炎、前庭神经鞘瘤、抑郁、情绪障碍、溶酶体贮积病、记忆障碍、学习障碍、空间记忆或导航障碍、应激相关的障碍、创伤后应激障碍、疼痛、衰老、海马萎缩、脑感染(包括真菌感染)和进行性多灶性白质脑病或另一脑疾病或病症。在其他情况下，可以将本披露的肽用于治疗酗酒、烟瘾、药物成瘾或焦虑。
在一些实施例中，该肽结合至脑中的钾通道。在一些实施例中，该肽结合至脑中的钠通道。在一些实施例中，该肽封闭钾通道和/或钠通道，在一些实施例中，该肽激活钾通道和/或钠通道。在一些实施例中，该肽与离子通道或氯通道或钙通道相互作用。在一些实施例中，该肽与以下项相互作用：烟碱乙酰胆碱受体、瞬时受体电位通道、NMDA受体、血清素受体、KIR通道、GABA通道、甘氨酸受体、谷氨酸受体、酸感离子通道、K2P通道、Nav1.7或嘌呤能受体。在一些实施例中，该肽与基质金属蛋白酶相互作用，抑制癌细胞迁移或转移，或具有抗肿瘤活性。在一些实施例中，该肽与钙激活的钾通道相互作用。在一些实施例中，该肽具有抗细菌、抗真菌或抗病毒活性。在一些实施例中，该肽抑制蛋白酶。在一些实施例中，该肽与影响疼痛的通道相互作用。在一些实施例中，该肽对脑或其结构具有其他治疗效果。
在一些实施例中，将本披露的肽用于诊断或治疗与海马体关联的疾病或病症。海马体是参与学习、记忆、情绪和认知的关键脑结构。海马体变化(包括减少的体积和细胞性、降低的神经元密度和神经递质功能缺陷)与障碍的发作、持续和/或进展有关，这些障碍包括晚年抑郁(Taylor))；重性抑郁和双相型障碍(Drevets)；创伤后应激障碍(PTSD)(Schmidt)；阿尔茨海默病(Nava-Mesa)；和精神分裂症(Perez)。可以将本发明的靶向海马体的肽用于治疗这些疾病或用于靶向治疗活性物质从而治疗这些疾病等。在一些实施例中，通过作用于受体(例如GABA、NMDA、AMPA、多巴胺、或血清素受体)将这些肽用于治疗这些疾病。海马体中的齿状回也可以是神经发生的部位。
在一些实施例中，将本披露的肽用于诊断或治疗与CSF或脑室系统关联的疾病或病症。CSF是围绕脑和脊柱并在其中循环的液体，该液体为脑提供机械保护，并在中枢神经系统的体内平衡和代谢中发挥作用。CSF由脑室系统产生并在其内循环。与CSF或脑室系统关联的疾病和病症包括但不限于：反社会型人格障碍、脑出血、脉络膜囊肿、痴呆、室管膜瘤、脑积水、脑膜炎、多系统萎缩(MSA)、神经退行性疾病(例如肌萎缩性脊髓侧索硬化症、帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病)、创伤后应激障碍、精神分裂症、蛛网膜下出血、创伤性脑损伤和脑室炎。
可以将本披露的靶向CSF或脑室系统的肽用于治疗这些疾病或用于靶向治疗活性物质从而治疗这些疾病等。例如，在某些实施例中，将本披露的肽用于调节与疾病关联的靶标，例如线粒体去泛素化酶USP30(例如，用于治疗帕金森病)或双亮氨酸拉链激酶(例如，用于治疗神经退化)。作为另一实例，在某些实施例中，将缀合至治疗剂的肽用于治疗神经退行性疾病(例如阿尔茨海默病)。这样的药物还可以包括加兰他敏、donzepil、他克林或甚至通常认为毒性过大的神经毒素(例如沙林)。可用于治疗神经退行性疾病的治疗剂的实例包括但不限于：乙酰胆碱酯酶抑制剂(例如，利凡斯的明)、加兰他敏、donzepil、他克林和神经毒素(例如，沙林)。与利用非靶向全身性递送的先前方法相比，此方法允许在外周具有较低的剂量和减少的副作用的同时进行治疗。在又另一实例中，在某些实施例中，在用放射治疗脑转移期间，将归巢、分布至、靶向、迁移至、积累于或被导向至脑室空间的肽用作辐射防护剂(例如，单独地或作为与例如氨磷汀等的辐射防护化合物的缀合物)。
在一些实施例中，将本披露的肽用于抑制小电导钙激活的钾通道(SK通道)。抑制SK通道的肽包括例如Toxin_6类别的成员。任选地，这样的肽可以展示出归巢至特定脑区域(例如脑室)。在某些实施例中，本披露的肽对一个或多个SK通道亚型(例如SK1、SK2、SK3或SK4通道亚型中的一个或多个)具有特异性。在某些实施例中，SK3亚型的抑制增加了多巴胺能神经元中的放电(firing)频率，因此提高了多巴胺的水平，这可以改善帕金森病的身体症状。
在一些实施例中，将本披露的肽用于影响(例如，减少、减缓或抑制)与神经退行性疾病关联的蛋白质(例如τ蛋白、朊病毒蛋白、淀粉样蛋白β、α突触核蛋白、帕金蛋白或亨廷顿蛋白)的聚集。
在一些实施例中，将本披露的肽用于抑制或激活一个或多个特定的离子通道，并且这些离子通道的抑制或激活缓解一系列疾病的症状。表3说明了示例性离子通道和可以根据本文提供的组合物和方法治疗的相关疾病。
表3.根据本披露的示例性离子通道和相关疾病。
在一些实施例中，本披露的肽展示出蛋白酶抑制剂活性。在某些实施例中，将能够跨过BBB的肽用于抑制与阿尔茨海默病关联的蛋白酶，例如β和γ分泌酶。在替代性实施例中，将可能能够或可能不能够跨过BBB的肽用于抑制其他感兴趣的蛋白酶，例如与凝固关联的蛋白酶(例如，凝血酶、因子10a)、与代谢关联的蛋白酶(例如，DPP-IV)、与癌症关联的蛋白酶(例如，基质金属蛋白酶、组织蛋白酶)、与病毒感染关联的蛋白酶(例如，HIV蛋白酶)以及与炎症关联的蛋白酶(例如，类胰蛋白酶、激肽释放酶)。
在一些实施例中，可以将本披露的肽修饰为具抗炎性，例如通过掺入免疫选择性抗炎衍生物(ImSAID)的特性。在某些实施例中，将ImSAID掺入或添加到如本文所描述的能够靶向特定脑区域的肽上。FEG是赋予抗炎特性的关键序列的实例。可替代地或组合地，可以将本披露的肽缀合至免疫调节分子从而逆转、减少或限制炎症。
在一些方面中，将本披露的肽缀合至一种或多种治疗剂。在某些实施例中，将本文所描述的肽用作缀合物以递送治疗剂跨过BBB或血液CSF屏障，并且任选地进入脑中的特定区域、组织、结构或细胞。这样的治疗剂的实例包括抗炎分子(例如，地塞米松、强的松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙或去炎松(traimcinolone))、抗真菌剂(例如，氟康唑、两性霉素B、酮康唑或阿巴芬净)、抗病毒剂(例如，阿昔洛韦、西多福韦)、生长因子(例如，NGF或EGF)或抗感染剂(例如，环丙沙星、四环素、红霉素或链霉素)。例如，在某些实施例中，将本披露的肽缀合至抗真菌剂以便于治疗脑的真菌感染，该真菌感染在其他情况下使用先前的方法和组合物是非常难以治疗的。作为另一实例，在某些实施例中，将本披露的BBB渗入肽缀合至西多福韦以便于治疗由JC病毒导致的进行性多灶性白质脑病(PML)，该病在其他情况下没有可靠的治疗。
在一些实施例中，将本披露的肽用于治疗脑癌。例如，在某些实施例中，将本文提供的肽直接用于抑制与关键的与癌症关联的途径，例如RAS、MYC、PHF5A、BubR1、PKMYT1或BuGZ。可替代地或组合地，将本披露的肽用于携带缀合的治疗剂跨过BBB以便于治疗脑癌。
在进一步的方面中，该治疗剂是选自但不限于以下项的化学治疗剂、抗癌药物或抗癌剂：放射性同位素、毒素、酶、致敏药物、核酸(包括干扰RNA)、抗体、抗血管生成剂、顺铂、铂类化合物、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、生长因子抑制剂、紫杉烷、紫杉醇、卡巴他赛、替莫唑胺、拓扑替康、氟尿嘧啶、长春新碱、长春花碱、4-去乙酰基长春花碱、甲基苄肼、氨烯咪胺、六甲蜜胺、甲氨蝶呤、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、磷酸氟达拉滨、克拉屈滨、喷司他丁、阿糖孢苷、阿扎胞苷、依托泊苷、替尼泊苷、伊立替康、多西他赛、多柔比星、柔红霉素、更生霉素、伊达比星、普卡霉素、丝裂霉素、博莱霉素、它莫西芬、氟他胺、亮丙瑞林、戈舍瑞林、氨鲁米特、阿那曲唑、安吖啶、天冬酰胺酶、米托蒽醌、米托坦和氨磷汀、长春花生物碱、蘑菇毒伞肽的环状八肽类似物、埃博霉素、和蒽环类、CC-1065、SN-38、和BACE抑制剂，及其等效物，连同光消融剂。例如，在某些实施例中，将本披露的肽缀合至帕博西尼，一种具有有限的跨过BBB的能力的CDK 4/6抑制剂。作为另一实例，在某些实施例中，将本披露的肽缀合至单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、MMAF、澳瑞他汀、多洛他汀、澳瑞他汀F、单甲基澳瑞他汀D、美登木素生物碱(例如，DM-1、DM4、美登素)、吡咯并苯并二氮杂卓二聚体、N-乙酰基-γ-卡里奇霉素、卡里奇霉素、多卡米新、蒽环霉素、微管抑制剂或DNA损伤剂。
任选地，本披露的某些实施例提供了缀合至放射增敏剂或光敏剂的肽。放射增敏剂的实例包括但不限于：ABT-263、ABT-199、WEHI-539、紫杉醇、卡铂、顺铂、奥沙利铂、吉西他滨、依他硝唑、米索硝唑、替拉扎明以及核酸碱基衍生物(例如，卤代嘌呤或嘧啶，如5-氟脱氧尿苷)。光敏剂的实例包括但不限于：当被照射时产生热的荧光分子或荧光珠、卟啉和卟啉衍生物(例如，二氢卟酚、细菌二氢卟酚、异细菌二氢卟酚、酞菁和萘酞菁)、金属卟啉、金属酞菁、白芷素、chalcogenapyrrillium染料、叶绿素、香豆素、黄素和相关化合物(例如咯嗪和核黄素)、富勒烯、脱镁叶绿酸、焦脱镁叶绿酸、花菁(例如，部花菁540)、脱镁叶绿素、萨卟啉、得克萨卟啉、红紫素、类卟吩、吩噻嗪鎓、亚甲蓝衍生物、萘酰亚胺、尼罗蓝衍生物、醌、苝醌(例如，金丝桃素、竹红菌素和尾孢毒素)、补骨脂素、醌、类维生素A、罗丹明、噻吩、verdin、呫吨染料(例如，曙红、赤藓红、孟加拉玫瑰红)、卟啉的二聚和寡聚形式以及前药(例如，5-氨基乙酰丙酸)。有利地，此方法允许同时使用治疗剂(例如，药物)和电磁能(例如，辐射或光)高度特异性地靶向癌细胞。
在某些实施例中，本披露的肽被突变成保留跨过BBB或血液CSF屏障并归巢、分布至、靶向、迁移至、积累于或被导向至某些组织，但获得或丧失功能(例如使离子通道激动或抑制蛋白酶)的能力。在其他实施例中，本披露的肽被突变成归巢、分布至、靶向、迁移至、积累于或被导向至某些组织而不是其他组织，从而改变其功能的强度或特异性，或从而获得或丧失功能。
本披露还涵盖“串联”肽的使用，其中将两种或更多种肽缀合或融合在一起。在某些实施例中，串联肽包含如上和本文讨论的缀合或融合在一起的两种或更多种打结肽，其中至少一种打结肽能够跨过BBB并任选地靶向特定脑区域，并且至少一种其他的打结肽提供特定的治疗活性，例如BIM类似物。
在一些实施例中，本披露提供了用于治疗癌症的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予有效量的本披露的肽。
在一些实施例中，本披露提供了用于治疗癌症的方法，该方法包括向对其有需要的患者给予有效量的包含本披露的肽和药学上可接受的载体的药物组合物。
在一些实施例中，本披露提供了用于抑制细胞侵袭活性的方法，该方法包括向受试者给予有效量的本披露的肽。
在一些方面中，本披露提供了用于检测癌症、癌性组织或肿瘤组织的方法，该方法包括以下步骤：使感兴趣的组织与本披露的肽接触，其中将该肽缀合至可检测剂，并且测量该肽的结合水平，其中相对于正常组织，升高的结合水平指示该组织是癌症、癌症组织或肿瘤组织。
本发明提供了使用与可检测剂缀合的本披露的肽用于术中成像以及切除癌症、癌性组织或肿瘤组织的方法。在一些方面中，使用本披露的肽通过荧光成像可检测癌症、癌性组织或肿瘤组织，荧光成像允许对癌症、癌性组织或肿瘤组织进行术中可视化。在一些方面中，将本披露的肽缀合至一种或多种可检测剂。在进一步的实施例中，该可检测剂包含偶联至该肽的荧光部分。在另一实施例中，该可检测剂包含放射性核素。在一些方面中，使用开腹手术实现成像。在进一步的方面中，使用内窥镜检查或其他非侵入性外科手术技术完成成像。
在一些情况下，可以将该肽或肽-活性剂用于靶向脑中的癌症，通过跨过BBB或血液CSF屏障，并且然后具有抗肿瘤功能、靶向毒性，抑制转移等。在其他情况下，可以将该肽或肽-活性剂用于标记、检测或对这样的脑损伤(包括肿瘤和转移等其他损伤)进行成像，这些脑损伤可以通过不同的外科手术技术去除。
另外，本披露的某些肽可以在脑外的疾病和病症中具有另外的适用性。可以将如本文所描述的包含SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:192或SEQ ID NO:210–SEQ ID NO:401中任一者的序列的肽、和任何肽衍生物或肽-活性剂用于另外地靶向上GI疾病和癌症(例如，咽喉癌、口腔癌、食管癌、唾液腺癌、扁桃体癌、咽癌、腺肉瘤、口腔恶性黑色素瘤、头颈癌)。可以将如本文所描述的包含SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:192或SEQ ID NO:210–SEQ ID NO:401中任一者的序列的肽、和任何肽衍生物或肽-活性剂用于另外地靶向胆囊疾病和癌症。
可以给予本文所描述的毒液或毒素来源的一种或多种肽、经修饰的肽、经标记的肽、肽-活性剂缀合物和药物组合物用于预防性和/或治疗性治疗。在治疗性应用中，可以将这些组合物按一定量给予已经患有疾病或病症的受试者，该量足以治愈或至少部分地阻止疾病或病症的症状，或足以治愈、痊愈、改善或减轻病症。还可以给予本文所描述的这样的肽以预防(全部地或部分地)患上、感染病症或使其恶化的可能性。针对此用途有效的量可以基于疾病或病症的严重程度和过程、先前的疗法、受试者的健康状况、体重和对药物的反应、以及治疗医师的计算而变化。
在一些实施例中，本披露提供了治疗受试者的脑病症的方法，该方法包括给予受试者包含SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:196中任一者的序列的肽或其功能片段。
可以按任何顺序或同时地给予本文所描述的多种肽。在一些情况下，可以按任何顺序或同时地给予来源于毒素或毒液的肽的多个功能片段。如果同时给予，可以将本文所描述的多种肽按单一统一的形式(例如静脉内注射)或按多种形式(例如随后的静脉内剂量)提供。
可以将肽包装成试剂盒。在一些实施例中，试剂盒包括对这些肽的使用或给予的书面说明。
实例
以下实例被包括在内从而进一步描述本披露的一些方面，并且其不应被用来限制本发明的范围。
实例1
肽的制造
此实例描述了本文所描述的肽的制造。使用所公开的方法在哺乳动物细胞培养物中产生来源于蝎子和蜘蛛的打结素蛋白的肽。(A.D.Bandaranayke,C.Correnti,B.Y.Ryu,M.Brault,R.K.Strong,D.Rawlings.2011.Daedalus:a robust,turnkey platform forrapid production of decigram quantities of active recombinant proteins inhuman cell lines using novel lentiviral vectors[代达罗斯：使用新颖慢病毒载体在人类细胞系中用于快速生产分克量的活性重组蛋白的稳健统包平台].Nucleic AcidsResearch.[核酸研究](39)21,e143)。
使用标准分子生物学技术，肽序列被逆翻译成DNA，合成，并且与噬铁蛋白(siderocalin)符合读框地克隆。(M.R.Green,Joseph Sambrook.Molecular Cloning.[分子克隆]2012Cold Spring Harbor Press.[冷泉港出版社])。将所得的构建体包装进慢病毒，转染进HEK293细胞，扩增，通过固定化金属亲和色谱(IMAC)分离，用烟草蚀斑病毒蛋白酶切割，并且通过反相色谱纯化至同质。纯化后，将每种肽冻干并且冷冻储存。
实例2
肽放射性标记
此实例描述了肽的放射性标记。通过还原性甲基化，使用14C甲醛和氰基硼氢化钠，用标准技术对若干打结素进行放射性标记。将这些序列工程化为在N末端具有氨基酸“G”和“S”。参见Methods in Enzymology[酶学方法]第91卷:1983第570页和JBC 254(11):1979第4359页。将过量的甲醛用于保证完全甲基化(每个游离胺的二甲基化)。将这些经标记的肽在Strata-X柱(菲罗门(Phenomenex)8B-S100-AAK)上通过固相萃取进行分离，用具有5％甲醇冲洗，并且在具有2％甲酸的甲醇中回收。随后在具有轻微加热和氮气流的排污蒸发器中去除溶剂。
实例3
肽给药
此实例说明了肽的给药。将不同剂量的肽经尾静脉注射给予重20g–25g的雌性哈伦无胸腺裸鼠(n＝2只小鼠/打结素)。将实验一式两份地进行。将肾结扎从而防止这些肽的肾滤过。通过甲基化赖氨酸和N末端，将SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:36–SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:39的肽进行放射性标记，因此实际的结合剂可以含有一个或多个甲基或二甲基赖氨酸和甲基化的或二甲基化的氨基末端(图1)。
在麻醉的同时，将20nmol的每种肽的靶剂量给予单独的荷侧肉瘤A204肿瘤的雌性哈伦无胸腺裸鼠。将剂量进行调整用于全身放射自显影。在动物被安乐死并切片之前，允许每种肽(靶剂量为20nmol)在动物体内自由循环3小时的目标时间。一些动物在接受肽后死亡，这可能是由于用于结扎每只小鼠肾的麻醉和外科手术的并发症，或者由于一些肽的毒性作用。每种肽的循环时间从动物到动物各不相同。在未经历肾结扎的动物中将跨过BBB的氟西汀(百优解(Prozac))用作阳性对照。将菊糖用作阴性对照，因为已知这种聚糖不跨过BBB。
实例4
肽跨过血脑屏障并归巢至脑
此实例显示了肽跨过血脑屏障(BBB)和/或血脑脊液(CSF)屏障，并且在一些情况下归巢至脑中的特定位置。在给药期结束时，将小鼠在己烷/干冰浴中冷冻，并且然后在羧基甲基纤维素块中冷冻。用切片机获得包括脑、肿瘤、肝、肾、肺、心脏、脾、胰腺、肌肉、脂肪、胆囊、上胃肠道、下胃肠道、骨、骨髓、生殖道、眼睛、软骨、胃、皮肤、脊髓、膀胱、唾液腺以及其他类型的组织的整个动物矢状切片的薄的冷冻切片，允许在冷冻机中干燥，并且暴露于磷相仪板持续约10天。
使这些板显影，并将来自每个器官的信号(光密度测定法)相对于在每只动物的心脏血液中发现的信号归一化。组织中的信号要比该组织中预期来自血液的信号暗指示区域、组织、结构或细胞中的积累。氟西汀可以跨过血脑屏障，并且是阳性对照。菊糖不能跨过血脑屏障，并且是阴性对照。图2说明了氟西汀(顶部)和菊糖(底部)对照组的在脑和其他组织中的14C信号。图3说明了SEQ ID NO:1的放射性标记肽的在脑和其他组织中的14C信号。图4说明了SEQ ID NO:3的放射性标记肽的在脑和其他组织中的14C信号。图30说明了放射自显影图像，显示了用SEQ ID NO:55的肽处理的小鼠脑中的14C信号。
此外，脑含有大约3％的血液。因此，当将血液中的每个区域的放射性信号与脑中的放射性信号相比较时，脑中的信号远高于血液中信号的3％，这可以归因于该材料通过BBB在脑中的积累。选择脑对比血液中至少10％的扩散信号的比率作为高渗入的参考水平。光密度信号还可以指示在脑中规定位置内的高浓度，这可以指示跨过BBB和/或血液CSF屏障。图34A显示了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:39肽后3小时，具有结扎肾的小鼠的冷冻切片的白光图像。图34B显示了对应于图34A的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:39肽后3小时，具有结扎肾的小鼠组织中的肽分布，并且放射性标记的SEQ ID NO:39肽的平均脑/血比率被测定为是6.01％。图35A显示了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:36肽后3小时，具有结扎肾的小鼠的冷冻切片的白光图像。图35B显示了对应于图35A的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:36肽后3小时，具有结扎肾的小鼠组织中的肽分布，并且放射性标记的SEQ ID NO:36的平均脑/血比率被测定为是9.64％。
表4列出了每种肽向脑中的迁移的汇总。针对血液的数字指示心脏血液中的光密度信号。针对脑的数字指示在该组织中的信号相比于心脏血液中检测到的信号的百分比。
表4.在血液中或至脑中的肽迁移的汇总。
与阴性对照肽菊糖、GS-海南捕鸟蛛毒素GSKCLPPGKPCYGATQKIPCCGVCSHNNCT(SEQID NO:419)和钾通道肽相比，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:34、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37的肽高度地渗入血脑屏障中。与阴性对照肽菊糖、GS-海南捕鸟蛛毒素和钾通道肽相比，SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:39和SEQ IDNO:55的肽适度地渗入血脑屏障中。SEQ ID NO:35–SEQ ID NO:39的肽是SEQ ID NO:5的肽的经设计的变体，因此另外地说明可以将变体设计为高度地或非高度地渗入血脑屏障。此外，发现SEQ ID NO:55的肽特异性地迁移至脑中的区域、组织、结构或细胞中，可能地是海马体、CSF、脑室、脑膜和/或嘴侧迁移流(例如，参见实例11)。图5到图8和图31分别说明了以下项的肽的HPLC谱：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:4；和SEQ ID NO:55。
实例5
与治疗剂一起的肽给予和归巢
此实例描述了与治疗剂一起的肽给予和归巢。将本披露的肽重组表达或化学合成，并且然后缀合至药物。可替代地，在重组表达过程中，将本披露的肽与药物融合。将例如如下项等的药物用于药物-肽缀合物或融合物中：细胞毒化疗药物(例如，紫杉烷、烷基化剂或微管抑制剂)、反义(siRNA、dsRNA)、抗抑郁剂、抗精神病药、离子通道阻滞剂、蛋白酶抑制剂、神经递质、抗病毒剂、抗生素、抗真菌剂、神经生长因子、单克隆抗体、细胞因子或可以影响脑的其他药物，例如噻奈普汀、苯妥英、氟西汀、锂、三环抗抑郁药、抗精神病药、丙戊酸钠、米非司酮、抗癫痫药物、维生素A、抗氧化剂、神经发生促进剂、选择性血清素再吸收抑制剂、血清素/去甲肾上腺素再吸收抑制剂、帕罗西汀、苯妥英、神经营养因子、neurturin、激素或睾酮。使用在由Greg Hermanson描述于Bioconjugate Techniques[生物缀合技术]中的技术制造药物-肽缀合物。将一种或多种药物-肽缀合物或融合物给予人或动物。
实例6
用本披露的肽缀合物治疗脑感染
此实例描述了用肽缀合物治疗脑感染。将本披露的肽重组表达或化学合成，并且然后缀合至抗真菌或抗细菌化合物，例如氟康唑、利福平、环丙沙星或阿奇霉素。将这些药物与SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:196或SEQ ID NO:210–SEQ ID NO:405的肽中的任一者偶联将抗真菌或抗细菌化合物靶进脑中。将一种或多种抗真菌或抗细菌肽缀合物给予人或动物。
实例7
将肽-药物缀合物靶向脑的区域
使用在由Greg Hermanson描述于Bioconjugate Techniques[生物缀合技术]中的技术，将本披露的肽重组表达或化学合成，并且然后缀合至药物，例如：美金刚、他克林、利凡斯的明或donzepil。上文提及的药物典型地跨过血脑屏障，然而将这些药物与SEQ IDNO:55–SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:160或SEQ ID NO:190中任一者的肽偶联将药物靶向受试者的海马体CSF、脑室系统、脑膜、嘴侧迁移流或齿状回。将一种或多种药物-肽缀合物给予人或动物。
实例8
用本披露的肽缀合物治疗病毒
此实例描述了用肽缀合物治疗病毒。进行性多灶性白质脑病(PML)是脑的病毒疾病，该疾病很难治疗，因为这些抗病毒剂典型地不跨过血脑屏障。将本披露的肽重组表达或化学合成，并且然后缀合至抗病毒化合物(例如西多福韦或阿糖孢苷)。将这些药物与SEQID NO:1–SEQ ID NO:196或SEQ ID NO:210–SEQ ID NO:405的肽中的任一者偶联将抗病毒化合物靶进脑中。将一种或多种抗病毒肽缀合物给予人或动物。
实例9
用本披露的肽缀合物治疗脑肿瘤
此实例描述了用肽缀合物治疗脑肿瘤。许多化疗药物不跨过血-脑屏障。将本披露的肽重组表达或化学合成，并且然后直接地或通过接头缀合至化学治疗性化合物，例如环磷酰胺、多柔比星、澳瑞他汀(例如，单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、多洛他汀、澳瑞他汀F、MMAD)、美登木素生物碱(例如，DM1、DM4、美登素)、吡咯并苯并二氮杂卓二聚体、卡里奇霉素(例如，N-乙酰基-γ-卡里奇霉素)、长春花生物碱(例如，4-去乙酰基长春花碱)、多卡米新、蘑菇毒伞肽的环肽类似物、埃博霉素、蒽环霉素、CC-1065、紫杉烷(例如，紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛)、SN-38、伊立替康、长春新碱、微管抑制剂、DNA损伤剂或替尼泊苷。将这些药物与SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:196或SEQ ID NO:210–SEQ ID NO:405的肽中的任一者偶联将化学治疗性化合物靶向进脑中并且任选地靶向至肿瘤。将一种或多种化学治疗剂-肽缀合物给予人或动物。
实例10
使用哺乳动物表达系统的肽表达
此实例描述了使用哺乳动物表达系统表达肽。根据在Bandaranayake等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究]2011年11月；39(21):e143中描述的方法表达肽。使用烟草蚀斑病毒蛋白酶从噬铁蛋白切割肽并通过FPLC在疏水柱上使用乙腈和0.1％TFA的梯度进行纯化。然后将肽冻干并冷冻储存。
图11A到图11E说明了来自以下项的肽的小规模(30mL)哺乳动物表达研究的质量控制数据：SEQ ID NO:4(图11A)、SEQ ID NO:6(图11B)、SEQ ID NO:17(图11C)、SEQ ID NO:25(图11D)和SEQ ID NO:32(图11E)。这些图说明了使用乙腈和0.1％TFA的梯度在疏水柱上的HPLC迹线。较暗的迹线是天然肽，并且较浅的迹线是用100mM二硫苏糖醇还原后的肽。图11A、图11D和图11E还包括显示了在SDS-PAGE凝胶上的非还原和还原条带的插图。图11A和图11C还包括提供分子质量并指示已经形成了所有的二硫化物的MALDI质谱图。另外地，与其他肽(例如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:17)相比(图11A到图11C)，图11D说明了SEQ ID NO:25肽在还原的HPLC迹线上具有更大的纯度。这种更高的纯度可能是由于非Arg的C末端残基(即，在此C末端残基是Ile)的存在，这样的残基可以防止剪切。
图12A到图12D说明了来自SEQ ID NO:39(图12A&图12B)和SEQ ID NO:25(图12C&图12D)的肽的小规模(30mL)哺乳动物表达研究的质量控制数据。图12A中的图说明了使用乙腈和0.1％TFA的梯度SEQ ID NO:39在疏水柱上的HPLC迹线。较暗的迹线是天然肽，并且较浅的迹线是用100mM二硫苏糖醇还原后的肽。图12B是显示了在SDS-PAGE凝胶上SEQ IDNO:41的肽的氧化和还原条带的图像。图12C显示了SEQ ID NO:25的MALDI质谱图的完整谱图，提供了分子质量并指示已经形成了所有的二硫化物。图12D显示了图12C的放大部分。
实例11
肽归巢至脑室和脑脊液
此实例说明了SEQ ID NO:55的肽归巢至脑室和脑脊液(CSF)。
将不同剂量的肽经尾静脉注射给予重20g–25g的雌性哈伦无胸腺裸鼠(n＝2只小鼠/打结素)。将实验一式两份地进行。将肾结扎从而防止这些肽的肾滤过。通过甲基化赖氨酸和N末端，将每种肽进行放射性标记，因此实际的结合剂可以含有一个或多个甲基或二甲基赖氨酸和甲基化的或二甲基化的氨基末端。在麻醉的同时，将50-100nmol的携带10-50uCi的14C的每种肽的靶剂量给予雌性哈伦无胸腺裸鼠。在动物被安乐死并切片之前，允许每种肽在动物体内自由循环。氟西汀跨过血脑屏障(BBB)，并且因此用作未经历肾结扎的动物中的阳性对照。菊糖不跨过BBB，并且因此用作阴性对照。
全身放射自显影图像
对于全身放射自显影图像，在给药期结束时，将小鼠在己烷/干冰浴中冷冻，并且然后在羧基甲基纤维素块中冷冻。制备整个动物矢状切片并将其冷冻用于成像。用切片机获得例如脑、肿瘤、肝、肾、肺、心脏、脾、胰腺、肌肉、脂肪、胆囊、上胃肠道、下胃肠道、骨、骨髓、生殖道、眼睛、软骨、胃、皮肤、脊髓、膀胱、唾液腺以及其他类型的组织等的组织的这些薄的冷冻切片，允许其在冷冻机中干燥，并且暴露于磷相仪板持续约7天。使这些板显影，并将来自每个器官的信号(光密度测定法)相对于在每只动物的心脏血液中发现的信号归一化。组织中的信号要比该组织中预期来自血液的信号暗指示区域、组织、结构或细胞中的积累。
图37A说明了在给予100nmol的SEQ ID NO:55的肽的放射性标记的第一经纯化的级分(第一HPLC肽峰)后3小时，具有结扎肾的小鼠的冷冻切片的白光图像。图37B说明了对应于图37A的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的SEQ ID NO:55的肽的放射性标记的第一级分(第一HPLC肽峰)后3小时，具有结扎肾的小鼠组织中的肽分布。图38A说明了在给予100nmol的SEQ ID NO:55的肽的放射性标记的第二经纯化的级分(来自图37A的HPLC的第二HPLC肽峰)后3小时，具有结扎肾的小鼠的冷冻切片的白光图像。图38B说明了对应于图38A的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的SEQ ID NO:55的肽的放射性标记的第二经纯化的级分(来自图37A的HPLC的第二HPLC肽峰)后3小时，具有结扎肾的小鼠组织中的肽分布。图39A显示了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:83肽后3小时，具有结扎肾的小鼠的冷冻切片的白光图像。图39B显示了对应于图39A的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:83肽后3小时，具有结扎肾的小鼠组织中的肽分布。
脑切片放射自显影图像
对于矢状和冠状脑切片的放射自显影图像，在给药期结束时，将经麻醉小鼠的头部切下，将脑分离并在己烷/干冰浴中冷冻，并且然后在羧基甲基纤维素块中冷冻。每隔0.5mm制备40um的脑组织切片，这产生可用于成像的薄的冷冻切片。用低温切片机获得薄的冷冻切片，允许其在冷冻机中干燥，并且暴露于磷相仪板持续约7天，然后在Raytest CR-35扫描仪上显影。
图33A和图33B显示了矢状(图33A)和冠状(图33B)脑切片，其指示SEQ ID NO:55的肽定位至脑中的特定结构(如脑室和CSF)。在每个图中，放射性扫描示出在左侧，其中暗区具有更高的活性。在正常光照下组织的图像示出在右侧。图36A在右侧说明了小鼠的冠状脑切片的白光图像并且在左侧说明了对应于白光图像的放射自显影图像。自动绘图图像中的14C信号鉴定了给予肽后的肽分布，其指示SEQ ID NO:55的肽的放射性标记的第一经纯化的级分(第一HPLC肽峰)定位至脑中的特定结构(如脑室和CSF)。图36B在右侧说明了小鼠的冠状脑切片的白光图像并且在左侧说明了对应于白光图像的放射自显影图像。自动绘图图像中的14C信号鉴定了给予肽后的肽分布，其指示SEQ ID NO:55的肽的第二经纯化的级分(来自图36A的HPLC的第二HPLC肽峰)定位至脑中的特定结构(如脑室和CSF)。自动绘图图像中的14C信号鉴定了肽分布，其指示SEQ ID NO:55的肽的第二经纯化的峰定位至脑中的特定结构(如脑室和CSF)。图40在右侧显示了冠状脑切片的白光图像并且在左侧显示了对应于白光图像的放射自显影图像。自动绘图图像中的14C信号鉴定了给予放射性标记的SEQ IDNO:34后3小时的肽分布，并且指示该肽定位至脑中的特定结构(如脑室和CSF)。图41在右侧显示了冠状脑切片的白光图像并且在左侧显示了对应于白光图像的放射自显影图像。自动绘图图像中的14C信号鉴定了给予放射性标记的SEQ ID NO:83后3小时的肽分布，并且指示该肽定位至脑中的特定结构(如脑室和CSF)。
脑组织的HPLC
对于脑组织的HPLC，将收集的冷冻的脑均质化以在缓冲液中分离蛋白质，该缓冲液由在PBS中的1mM Tris pH 8、150mM NaCl、1mM EDTA、25mM蔗糖和蛋白酶抑制剂混合物组成。将每个脑样品添加至5体积(w:v)的缓冲液中并在锁定的圆底2ml具有钢珠的管中在Qialyzer上以30/sec的频率均质化2分钟。将均质化样品在4℃下以16,000rpm在TOMY TX-160离心机上离心30分钟，或以最高速在台式离心机上离心30分钟，并且收集可溶性上清液。制备可溶性上清液用于HPLC分析，通过在0.2um注射器过滤器中过滤，通过样品后使用甲醇冲洗过滤器。收集经过滤的样品和甲醇，并使用气态氮在排污蒸发器上干燥。将经干燥的样品重悬浮于125ul中。
图32A和图32B说明了在全脑匀浆中SEQ ID NO:55的14C标记的肽的HPLC射线照片。图32A显示了加入到粗的脑匀浆中，并且使用乙腈梯度和0.1％TFA在装备有闪烁探测器的HPLC上在疏水柱上运行的肽。图32B显示了在放射性标记肽的全身用药后三个小鼠脑的闪烁HPLC迹线。因此，完整的SEQ ID NO:55肽存在于用肽经静脉内给药的小鼠的脑中。
实例12
用本披露的肽治疗痴呆
此实例描述了用本披露的肽治疗痴呆。将SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:196或SEQ IDNO:210–SEQ ID NO:405的肽中的一种或多种重组表达或化学合成。任选地，在给予之前SEQID NO:1–SEQ ID NO:196或SEQ ID NO:210–SEQ ID NO:405的肽被突变成结合τ蛋白。将这些肽给予人或动物。这些肽跨过血脑屏障并且特异性地结合τ蛋白从而抑制与不同形式的痴呆关联的有毒τ蛋白聚集体的积累。
可替代地，将SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:196或SEQ ID NO:210–SEQ ID NO:405的肽中的一种或多种重组表达或化学合成，然后缀合至他克林。将一种或多种他克林-肽缀合物给予人或动物。将他克林与SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:196或SEQ ID NO:210–SEQ ID NO:405的肽中的任一者偶联将他克林靶向进脑中，允许更多地递送至中枢神经系统(CNS)中，并且更少地递送于导致副作用的外周中。
实例13
用本披露的肽缀合物治疗神经退行性疾病
此实例描述了用肽缀合物治疗神经退行性疾病。将本披露的肽重组表达或化学合成，并且然后缀合(或重组表达和融合)至生长因子，例如表皮生长因子(EGF)，其可以调节祖细胞的增殖或募集至多发性硬化症损伤并促进髓鞘再生。将这些药物与SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:196或SEQ ID NO:210–SEQ ID NO:405中任一者的肽偶联将生长因子靶进脑中。将一种或多种生长因子-肽缀合物给予人或动物。
另外地，将本披露的肽重组表达或化学合成，并且然后缀合至用于治疗神经退行性疾病(例如，阿尔茨海默病)的治疗性化合物，例如乙酰胆碱酯酶抑制剂(例如，利凡斯的明)、加兰他敏、donzepil、他克林或神经毒素(例如，沙林)。将这些药物与SEQ ID NO:1–SEQID NO:196或SEQ ID NO:210–SEQ ID NO:405中任一者的肽偶联将治疗性化合物靶进脑中。将一种或多种治疗性缀合物给予人或动物。
实例14
对本披露的肽的功能的修饰
此实例说明了对肽的功能的修饰。本披露的肽在一个或多个残基处被突变以便于修饰其活性。这样的修饰可以包括获得或丧失结合至某些离子通道、抑制某些蛋白酶或抗微生物活性。将经修饰的肽重组表达或化学合成。将一种或多种经修饰的肽给予人或动物。可以将经修饰的肽直接用作治疗剂。可替代地，将经修饰的肽缀合至治疗剂从而将治疗剂靶进脑中。
实例15
用本披露的肽治疗神经退行性疾病
此实例描述了用肽治疗神经退行性疾病。将本披露的肽重组表达或化学合成并给予人或动物。该肽跨过BBB并激动或拮抗离子通道，例如钾钠通道、氯通道、钙通道、烟碱乙酰胆碱受体、瞬时受体电位通道、NMDA受体、血清素受体、KIR通道、GABA通道、甘氨酸受体、谷氨酸受体、酸感离子通道、K2P通道、Nav1.7或嘌呤能受体，从而提供治疗效果。
实例16
给予肽后的全身放射自显影
此实例显示了被给予不同剂量的放射性标记肽或放射性标记的肽缀合物的雌性哈伦无胸腺裸鼠的全身放射自显影。每只小鼠的肾是完整或结扎以防止这些肽的肾滤过。通过甲基化赖氨酸和N末端，将这些肽或肽缀合物进行放射性标记，因此实际的结合剂可以含有一个或多个甲基或二甲基赖氨酸和甲基化的或二甲基化的氨基末端。这些放射性标记肽是SEQ ID NO:5的放射性标记肽、SEQ ID NO:35的放射性标记肽或SEQ ID NO:37的放射性标记肽。这些放射性标记的肽缀合物是缀合至Alexa 647荧光染料的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RA肽缀合物)、缀合至MMAE的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ IDNO:5-RZ肽缀合物)或缀合至DM-1的SEQ ID NO:5的放射性标记肽(SEQ ID NO:5-RY肽缀合物)。通过将Alexa 647缀合至在具有NHS酯的N末端或赖氨酸上的游离胺来制备SEQ ID NO:5-RA肽缀合物。通过用缬氨酸-瓜氨酸-PABC接头将MMAE缀合至具有NHS酯的SEQ ID NO:5肽的K氨基酸残基来制备SEQ ID NO:5-RZ肽缀合物，例如显示在具有以下结构(I)的化合物中：
通过用非可切割接头将DM-1缀合至具有NHS酯的SEQ ID NO:5肽的K氨基酸残基来制备SEQ ID NO:5-RY肽缀合物，例如显示在具有以下结构(II)的化合物中：
在麻醉的同时，将9-14nmol的携带2uCi的14C的每种肽的靶剂量给予雌性哈伦无胸腺裸鼠。
更具体地，将9nmol的SEQ ID NO:5-RA肽缀合物的剂量给予具有完整肾的四只小鼠。将11nmol的SEQ ID NO:5-RZ肽的剂量给予具有完整肾的四只小鼠。将12.8nmol的放射性标记的SEQ ID NO:5肽的剂量给予具有完整肾的两只小鼠。将14nmol的SEQ ID NO:5-RY肽缀合物的剂量给予具有完整肾的四只小鼠。将100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:35肽的剂量给予具有结扎肾的两只小鼠和具有完整肾的两只小鼠。将100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:37肽的剂量给予具有结扎肾的两只小鼠和具有完整肾的两只小鼠。在麻醉的同时，将每种肽的靶剂量给予雌性哈伦无胸腺裸鼠。接受放射性标记的SEQ ID NO:5肽、SEQID NO:5-RA肽缀合物、SEQ ID NO:5-RZ肽缀合物或SEQ ID NO:5-RY肽缀合物的小鼠是荷RH-28肿瘤的雌性哈伦无胸腺小鼠。在动物被安乐死并切片之前，允许每种肽在动物体内自由循环。给予肽后三小时，使接受9nmol剂量的SEQ ID NO:5-RA肽缀合物的两只小鼠安乐死。给予肽后二十四小时，使接受9nmol剂量的SEQ ID NO:5-RA肽缀合物的两只小鼠安乐死。给予肽后三小时，使接受11nmol剂量的SEQ ID NO:5-RZ肽缀合物的两只小鼠安乐死。给予肽后二十四小时，使接受11nmol剂量的SEQ ID NO:5-RZ肽缀合物的两只小鼠安乐死。给予肽后三小时，使接受12.8nmol剂量的放射性标记的SEQ ID NO:5肽的两只小鼠安乐死。给予肽后三小时，使接受14nmol剂量的SEQ ID NO:5-RY肽缀合物的两只小鼠安乐死。给予肽后二十四小时，使接受14nmol剂量的SEQ ID NO:5-RY肽缀合物的两只小鼠安乐死。给予肽后三小时，使接受100nmol剂量的放射性标记的SEQ ID NO:35肽的四只小鼠安乐死。给予肽后三小时，使接受100nmol剂量的SEQ ID NO:37肽的四只小鼠安乐死。
在给药期结束时，将小鼠在己烷/干冰浴中冷冻，并且然后在羧基甲基纤维素块中冷冻。制备整个动物矢状切片，这产生可用于成像的薄的冷冻切片。用切片机获得动物的薄的冷冻切片，允许其在冷冻机中干燥，并且暴露于磷相仪板持续约10天。
使这些板显影，并将来自每个器官的信号(光密度测定法)相对于在每只动物的心脏血液中发现的信号归一化。组织中的信号要比该组织中预期来自血液的信号暗指示区域、组织、结构或细胞中的肽积累。
图13A说明了在给予9nmol的SEQ ID NO:5-RA肽缀合物后三小时，小鼠的冷冻切片的白光图像。图13B说明了对应于图13A的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予9nmol的SEQ ID NO:5-RA肽缀合物后三小时，小鼠组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。图13C说明了在给予9nmol的SEQ ID NO:5-RA肽缀合物后三小时，与在图13A和图13B中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。图13D说明了对应于图13C的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予9nmol的SEQ ID NO:5-RA肽缀合物后三小时，组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。图13E说明了在给予9nmol的SEQ ID NO:5-RA肽缀合物后三小时，与在图13A到图13D中所示不同小鼠的冷冻切片的白光图像。图13F说明了对应于图13E的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予9nmol的SEQ ID NO:5-RA肽缀合物后三小时，小鼠组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。图13G说明了在给予9nmol的SEQ ID NO:5-RA肽缀合物后三小时，与在图13E和图13F中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。图13H说明了对应于图13G的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予9nmol的SEQ ID NO:5-RA肽缀合物后三小时，组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。
图14A说明了在给予9nmol的SEQ ID NO:5-RA肽缀合物后二十四小时，小鼠冷冻切片的白光图像。图14B说明了对应于图14A的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予9nmol的SEQ ID NO:5-RA肽缀合物后二十四小时，小鼠组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。图14C说明了在给予9nmol的SEQ ID NO:5-RA肽缀合物后二十四小时，与在图14A和图14B中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。图14D说明了对应于图14C的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予9nmol的SEQ ID NO:5-RA肽缀合物后二十四小时，组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。图14E说明了在给予9nmol的SEQ ID NO:5-RA肽缀合物后二十四小时，与在图14A到图14D中所示不同小鼠的冷冻切片的白光图像。图14F说明了对应于图14E的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予9nmol的SEQ ID NO:5-RA肽缀合物后二十四小时，小鼠组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。图14G说明了在给予9nmol的SEQ ID NO:5-RA肽缀合物后二十四小时，与在图14E和图14F中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。图14H说明了对应于图14G的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予9nmol的SEQ ID NO:5-RA肽缀合物后二十四小时，组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。
图15A说明了在给予11nmol的SEQ ID NO:5-RZ肽缀合物后三小时，小鼠冷冻切片的白光图像。图15B说明了对应于图15A的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予11nmol的SEQ ID NO:5-RZ肽缀合物后三小时，小鼠组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。图15C说明了在给予11nmol的SEQ ID NO:5-RZ肽缀合物后三小时，与在图15A和图15B中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。图15D说明了对应于图15C的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予11nmol的SEQ ID NO:5-RZ肽缀合物后三小时，组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。图15E说明了在给予11nmol的SEQ ID NO:5-RZ肽缀合物后三小时，与在图15A到图15D中所示不同小鼠的冷冻切片的白光图像。图15F说明了对应于图15E的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予11nmol的SEQ ID NO:5-RZ肽缀合物后三小时，小鼠组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。图15G说明了在给予11nmol的SEQ ID NO:5-RZ肽缀合物后三小时，与在图15E和图15F中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。图15H说明了对应于图15G的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予11nmol的SEQ ID NO:5-RZ肽缀合物后三小时，组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。
图16A说明了在给予11nmol的SEQ ID NO:5-RZ肽缀合物后二十四小时，小鼠冷冻切片的白光图像。图16B说明了对应于图16A的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予11nmol的SEQ ID NO:5-RZ肽缀合物后二十四小时，小鼠组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。图16C说明了在给予11nmol的SEQ ID NO:5-RZ肽缀合物后二十四小时，与在图16A和图16B中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。图16D说明了对应于图16C的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予11nmol的SEQ ID NO:5-RZ肽缀合物后二十四小时，组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。图16E说明了在给予11nmol的SEQ ID NO:5-RZ肽缀合物后二十四小时，与在图16A到图16D中所示不同小鼠的冷冻切片的白光图像。图16F说明了对应于图16E的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予11nmol的SEQ ID NO:5-RZ肽缀合物肽后二十四小时，小鼠组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。图16G说明了在给予11nmol的SEQ ID NO:5-RZ肽缀合物后二十四小时，与在图16E和图16F中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。图16H说明了对应于图16G的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予11nmol的SEQ ID NO:5-RZ肽缀合物后二十四小时，组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。
图17A说明了在给予12.8nmol的放射性标记的SEQ ID NO:5肽后三小时，小鼠冷冻切片的白光图像。图17B说明了对应于图17A的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予12.8nmol的放射性标记的SEQ ID NO:5肽后三小时，小鼠组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。图17C说明了在给予12.8nmol的放射性标记的SEQ ID NO:5肽后三小时，与在图17A和图17B中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。图17D说明了对应于图17C的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予12.8nmol的放射性标记的SEQ ID NO:5肽后三小时，组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。图17E说明了在给予12.8nmol的放射性标记的SEQ ID NO:5肽后三小时，与在图17A到图17D中所示不同小鼠的冷冻切片的白光图像。图17F说明了对应于图17E的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予12.8nmol的放射性标记的SEQ ID NO:5肽后三小时，小鼠组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。图17G说明了在给予12.8nmol的放射性标记的SEQ ID NO:5肽后三小时，与在图17E和图17F中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。图17H说明了对应于图17G的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予12.8nmol的放射性标记的SEQ ID NO:5肽后三小时，组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。
图18A说明了在给予14nmol的SEQ ID NO:5-RY肽缀合物后三小时，小鼠冷冻切片的白光图像。图18B说明了对应于图18A的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予14nmol的SEQ ID NO:5-RY肽缀合物后三小时，小鼠组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。图18C说明了在给予14nmol的SEQ ID NO:5-RY肽缀合物后三小时，与在图18A和图18B中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。图18D说明了对应于图18C的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予14nmol的SEQ ID NO:5-RY肽缀合物后三小时，组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。图18E说明了在给予14nmol的SEQ ID NO:5-RY肽缀合物后三小时，与在图18A到图18D中所示不同小鼠的冷冻切片的白光图像。图18F说明了对应于图18E的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予14nmol的SEQ ID NO:5-RY肽缀合物后三小时，小鼠组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。图18G说明了在给予14nmol的SEQ ID NO:5-RY肽缀合物后三小时，与在图18E和图18F中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。图18H说明了对应于图18G的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予14nmol的SEQ ID NO:5-RY肽缀合物后三小时，组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。
图19A说明了在给予14nmol的SEQ ID NO:5-RY肽缀合物后二十四小时，小鼠冷冻切片的白光图像。图19B说明了对应于图19A的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予14nmol的SEQ ID NO:5-RY肽缀合物后二十四小时，小鼠组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。图19C说明了在给予14nmol的SEQ ID NO:5-RY肽缀合物后二十四小时，与在图19A和图19B中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。图19D说明了对应于图19C的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予14nmol的SEQ ID NO:5-RY肽缀合物后二十四小时，组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。图19E说明了在给予14nmol的SEQ ID NO:5-RY肽缀合物后二十四小时，与在图19A到图19D中所示不同小鼠的冷冻切片的白光图像。图19F说明了对应于图19E的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予14nmol的SEQ ID NO:5-RY肽缀合物后二十四小时，小鼠组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。图19G说明了在给予14nmol的SEQ ID NO:5-RY肽缀合物后二十四小时，与在图19E和图19F中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。图19H说明了对应于图19G的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予14nmol的SEQ ID NO:5-RY肽缀合物后二十四小时，组织(包括RH-28肿瘤)中的肽分布。
图20A说明了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:37肽后三小时，具有完整肾的小鼠冷冻切片的白光图像。图20B说明了对应于图20A的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:37肽后三小时，具有完整肾的小鼠组织中的肽分布。图20C说明了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:37肽后三小时，与在图20A和图20B中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。图20D说明了对应于图20C的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:37肽后三小时，小鼠组织中的肽分布。图20E说明了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:37肽后三小时，与在图20A到图20D中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。图20F说明了对应于图20E的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:37肽后三小时，小鼠组织中的肽分布。图20G说明了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:37肽后三小时，与在图20A到图20F中所示具有完整肾的不同小鼠的冷冻切片的白光图像。图20H说明了对应于图20G的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:37肽后三小时，小鼠组织中的肽分布。图20I说明了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:37肽后三小时，与在图20G和图20H中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。图20J说明了对应于图20I的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:37肽后三小时，组织中的肽分布。图20K说明了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:37肽后三小时，与在图20G到图20J中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。图20L说明了对应于图20K的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:37肽后三小时，组织中的肽分布。
图21A说明了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:37肽后三小时，具有结扎肾的小鼠冷冻切片的白光图像。图21B说明了对应于图21A的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:37肽后三小时，具有完整肾的小鼠组织中的肽分布。图21C说明了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:37肽后三小时，与在图21A和图21B中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。图21D说明了对应于图21C的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:37肽后三小时，小鼠组织中的肽分布。图21E说明了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:37肽后三小时，与在图21A到图21D中所示具有结扎肾的不同小鼠的冷冻切片的白光图像。图21F说明了对应于图21E的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的放射性标记的SEQ IDNO:37肽后三小时，小鼠组织中的肽分布。图21G说明了在给予100nmol的放射性标记的SEQID NO:37肽后三小时，与在图21E和图21F中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。图21H说明了对应于图21G的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:37肽后三小时，组织中的肽分布。
图22A说明了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:35肽后三小时，具有完整肾的小鼠冷冻切片的白光图像。图22B说明了对应于图22A的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:35肽后三小时，具有完整肾的小鼠组织中的肽分布。图22C说明了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:35肽后三小时，与在图22A和图22B中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。图22D说明了对应于图22C的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:35肽后三小时，小鼠组织中的肽分布。图22E说明了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:35肽后三小时，与在图22A到图22D中所示具有完整肾的不同小鼠的冷冻切片的白光图像。图22F说明了对应于图22E的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的放射性标记的SEQ IDNO:35肽后三小时，小鼠组织中的肽分布。图22G说明了在给予100nmol的放射性标记的SEQID NO:35肽后三小时，与在图22E和图22F中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。图22H说明了对应于图22G的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:35肽后三小时，组织中的肽分布。
图23A说明了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:35肽后三小时，具有结扎肾的小鼠冷冻切片的白光图像。图23B说明了对应于图23A的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:35肽后三小时，具有结扎肾的小鼠组织中的肽分布。图23C说明了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:35肽后三小时，与在图23A和图23B中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。图23D说明了对应于图23C的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:35肽后三小时，小鼠组织中的肽分布。图23E说明了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:35肽后三小时，与在图23A到图23D中所示具有结扎肾的不同小鼠的冷冻切片的白光图像。图23F说明了对应于图23E的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的放射性标记的SEQ IDNO:35肽后三小时，小鼠组织中的肽分布。图23G说明了在给予100nmol的放射性标记的SEQID NO:35肽后三小时，与在图23E和图23F中相同小鼠的不同冷冻切片的白光图像。图23H说明了对应于图23G的放射自显影图像，其中14C信号鉴定了在给予100nmol的放射性标记的SEQ ID NO:35肽后三小时，组织中的肽分布。这些图说明了缀合至药物的肽可以将药物靶向肿瘤组织。
实例17
给予后的肽半衰期
此实例描述了给予后对SEQ ID NO:5肽的半衰期的分析。将12.8nmol的携带2uCi的14C的放射性标记的SEQ ID NO:5肽的靶剂量静脉内地给予每只小鼠。在给予肽后5分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时和24小时进行心脏穿刺以获得血液用于半衰期分析。将来自每个时间点的血液处理为血浆，并且然后通过液体闪烁计数分析14C，将其用于测定放射性标记的SEQ ID NO:5肽的半衰期。图24显示了放射性标记的SEQ ID NO:5肽的半衰期的图。
实例18
肽分布至尤文氏肉瘤
此实例显示了给予具有A763尤文氏肉瘤的动物后的肽分布。将SEQ ID NO:4、欧前胡素GSDCLPHLRRCRADNDCCGRRCRRRGTNAERRCR(SEQ ID NO:421)、芋螺毒素CVICGSCRGRGQSCSRLMYDCCTGSCSRRGRC(SEQ ID NO:422)或SEQ ID NO:54重组表达或化学合成，并且然后将肽的N末端缀合至Alexflour647(AF647)以分别产生SEQ ID NO:4-A缀合的肽(SEQ ID NO:4-A肽缀合物)、欧前胡素-A缀合的肽(欧前胡素-A缀合物)、芋螺毒素CVIC-A缀合的肽(芋螺毒素-A缀合物)或SEQ ID NO:54-A缀合的肽(SEQ ID NO:54-A肽缀合物)。
在麻醉的同时，将10nmol的每种肽缀合物的靶剂量给予单独的荷侧A673尤文氏肉瘤肿瘤的雌性哈伦无胸腺裸鼠。在动物被安乐死之前，允许每种肽缀合物在动物体内自由循环4小时。将肿瘤、肾、肝、心脏、淋巴结、脑、脾、骨骼肌、淋巴结和肺从每只动物切离，并使用IVIS Spectrum成像。
图25A显示了在给予10nmol的SEQ ID NO:4-A肽缀合物后，从小鼠切离的尤文氏肉瘤肿瘤的近红外荧光图像。图25B显示了在给予10nmol的SEQ ID NO:4-A肽缀合物后，从与图25A中不同小鼠切离的尤文氏肉瘤肿瘤的近红外荧光图像。图25C显示了在给予10nmol的欧前胡素-A肽缀合物后，从小鼠切离的尤文氏肉瘤肿瘤的近红外荧光图像。图25D显示了在给予10nmol的欧前胡素-A缀合物后，从与图25C中不同小鼠切离的尤文氏肉瘤肿瘤的近红外荧光图像。图25E显示了在给予10nmol的欧前胡素-A肽缀合物后，从小鼠切离的尤文氏肉瘤肿瘤的近红外荧光图像。图25F显示了在给予10nmol的SEQ ID NO:54-A肽缀合物后，从小鼠切离的尤文氏肉瘤肿瘤的近红外荧光图像。图25G显示了从未接受任何肽的作为阴性对照的小鼠切离的尤文氏肉瘤肿瘤的近红外荧光图像。组织荧光指示肽缀合物的存在。
图26A显示了在给予10nmol的SEQ ID NO:4-A肽缀合物后，从小鼠切离的肾的近红外荧光图像。图26B显示了在给予10nmol的SEQ ID NO:4-A肽缀合物后，从与图26A中不同小鼠切离的肾的近红外荧光图像。图26C显示了在给予10nmol的欧前胡素-A肽缀合物后，从小鼠切离的肾的近红外荧光图像。图26D显示了在给予10nmol的欧前胡素-A缀合物后，从与图26C中不同小鼠切离的肾的近红外荧光图像。图26E显示了在给予10nmol的芋螺毒素-A肽缀合物后，从小鼠切离的肾的近红外荧光图像。图26F显示了在给予10nmol的SEQ ID NO:54-A肽缀合物后，从小鼠切离的肾的近红外荧光图像。图26G显示了从未接受任何肽的作为阴性对照的小鼠切离的肾的近红外荧光图像。组织荧光指示肽缀合物的存在。
图27A显示了在给予10nmol的SEQ ID NO:4-A肽缀合物后，从小鼠切离的肝的近红外荧光图像。图27B显示了在给予10nmol的SEQ ID NO:4-A肽缀合物后，从与图27A中不同小鼠切离的肝的近红外荧光图像。图27C显示了在给予10nmol的欧前胡素-A肽缀合物后，从小鼠切离的肝的近红外荧光图像。图27D显示了在给予10nmol的欧前胡素-A缀合物后，从与图27C中不同小鼠切离的肝的近红外荧光图像。图27E显示了在给予10nmol的芋螺毒素-A肽缀合物后，从小鼠切离的肝的近红外荧光图像。图27F显示了在给予10nmol的SEQ ID NO:54-A肽缀合物后，从小鼠切离的肝的近红外荧光图像。图27G显示了从未接受任何肽的作为阴性对照的小鼠切离的肝的近红外荧光图像。组织荧光指示肽缀合物的存在。
图28A显示了在给予10nmol的SEQ ID NO:54-A肽缀合物后切离的不同组织的近红外荧光图像。顶行上的组织从左至右是肿瘤、肾、肝、心脏和引流淋巴结。底行上的组织从左至右是脑、脾、骨骼肌、肺和侧方淋巴结。组织荧光指示肽缀合物的存在。图28B显示了不同组织的图28A的近红外荧光图像，这些组织是在给予10nmol的SEQ ID NO:54-A肽缀合物后切离的，但是图像没有拍摄肾。顶行上的组织从左至右是肿瘤、肝、心脏和引流淋巴结。底行上的组织从左至右是脑、脾、骨骼肌、肺和侧方淋巴结。组织荧光指示肽缀合物的存在。图28C显示了从未接受任何肽的作为阴性对照的小鼠切离的不同组织的近红外荧光图像。顶行上的组织从左至右是肿瘤、肾、肝和心脏。底行上的组织从左至右是脑、脾、骨骼肌和肺。组织荧光指示肽缀合物的存在。
图29A显示了如下小鼠的内部体腔的离体近红外图像，使该小鼠在给予10nmol的SEQ ID NO:54-A肽缀合物后4小时安乐死。Lv指示肝的位置。Tm指示肿瘤的位置。Kd指示肾的位置。Bl指示膀胱的位置。组织荧光指示SEQ ID NO:54-A肽缀合物的存在。图29B显示了如在图29A中所示的如下小鼠的内部体腔的离体近红外图像，使该小鼠在给予10nmol的SEQID NO:54-A肽缀合物后4小时安乐死，但去除了肾。Lv指示肝的位置。Tm指示肿瘤的位置。Bl指示膀胱的位置。Ht指示心脏的位置。Lg指示肺的位置。组织荧光指示SEQ ID NO:54-A肽缀合物的存在。
实例19
用本披露的肽治疗尤文氏肉瘤
此实例描述了使用本文所描述的肽治疗尤文氏肉瘤。将本披露的肽重组表达或化学合成，并且然后直接地或通过可切割接头或非可切割接头缀合至化学治疗药物，例如环磷酰胺、多柔比星、澳瑞他汀(例如，单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、多洛他汀、澳瑞他汀F、MMAD)、美登木素生物碱(例如，DM1、DM4、美登素)、吡咯并苯并二氮杂卓二聚体、卡里奇霉素(例如，N-乙酰基-γ-卡里奇霉素)、长春花生物碱(例如，4-去乙酰基长春花碱)、多卡米新、蘑菇毒伞肽的环肽类似物、埃博霉素、蒽环霉素、CC-1065、紫杉烷(例如，紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛)、SN-38、伊立替康、长春新碱、长春花碱、铂类化合物(例如，顺铂)、甲氨蝶呤、微管抑制剂、异环磷酰胺、依托泊苷、芬维A胺、DNA损伤剂或替尼泊苷。将这些化学治疗药物与SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:192或SEQ ID NO:210–SEQ ID NO:401中任一者的肽偶联将药物靶向尤文氏肉瘤。将一种或多种化学治疗药物-肽缀合物给予人或动物。
实例20
用本披露的肽缀合物治疗胶质母细胞瘤
此实例描述了使用本文所描述的肽治疗胶质母细胞瘤。将本披露的肽重组表达或化学合成，并且然后直接地或通过可切割接头或非可切割接头缀合至化学治疗药物，例如环磷酰胺、多柔比星、澳瑞他汀(例如，单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、多洛他汀、澳瑞他汀F、MMAD)、美登木素生物碱(例如，DM1、DM4、美登素)、吡咯并苯并二氮杂卓二聚体、卡里奇霉素(例如，N-乙酰基-γ-卡里奇霉素)、长春花生物碱(例如，4-去乙酰基长春花碱)、多卡米新、蘑菇毒伞肽的环肽类似物、埃博霉素、蒽环霉素、CC-1065、紫杉烷(例如，紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛)、SN-38、伊立替康、长春新碱、长春花碱、铂类化合物(例如，顺铂)、甲氨蝶呤、微管抑制剂、替莫唑胺、卡莫司汀、拓扑替康、放射性同位素、帕博西尼、DNA损伤剂或替尼泊苷。将这些化学治疗药物与SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:196或SEQ IDNO:210–SEQ ID NO:405中任一者的肽偶联将药物靶向胶质母细胞瘤。将一种或多种化学治疗药物-肽缀合物给予人或动物。
实例21
用本披露的肽缀合物治疗三阴性乳癌
此实例描述了使用本文所描述的肽治疗三阴性乳癌。将本披露的肽重组表达或化学合成，并且然后直接地或通过可切割接头或非可切割接头缀合至化学治疗药物，例如环磷酰胺、多柔比星、澳瑞他汀(例如，单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、多洛他汀、澳瑞他汀F、MMAD)、美登木素生物碱(例如，DM1、DM4、美登素)、吡咯并苯并二氮杂卓二聚体、卡里奇霉素(例如，N-乙酰基-γ-卡里奇霉素)、长春花生物碱(例如，4-去乙酰基长春花碱)、多卡米新、蘑菇毒伞肽的环肽类似物、埃博霉素、蒽环霉素、CC-1065、紫杉烷(例如，紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛)、SN-38、伊立替康、长春新碱、长春花碱、铂类化合物(例如，顺铂)、甲氨蝶呤、微管抑制剂、iniparib、卡铂、DNA损伤剂或替尼泊苷。将这些化学治疗药物与SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:192或SEQ ID NO:210–SEQ ID NO:401中任一者的肽偶联将药物靶向三阴性乳癌。将一种或多种化学治疗药物-肽缀合物给予人或动物。
实例22
与可检测剂一起给予肽
此实例描述了与可检测剂一起给予肽。将本披露的肽重组表达或化学合成，并且然后缀合至可检测剂，例如荧光团、近红外荧光染料、造影剂、纳米粒子、含有金属的纳米粒子、金属螯合物、X射线造影剂、PET剂、放射性同位素或放射性核素螯合剂。将一种或多种可检测剂-肽缀合物给予人或动物。
实例23
用本披露的肽缀合物治疗转移性结肠癌
此实例描述了使用本文所描述的肽治疗转移性结肠癌。将本披露的肽重组表达或化学合成，并且然后直接地或通过可切割接头或非可切割接头缀合至化学治疗药物，例如环磷酰胺、多柔比星、澳瑞他汀(例如，单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、多洛他汀、澳瑞他汀F、MMAD)、美登木素生物碱(例如，DM1、DM4、美登素)、吡咯并苯并二氮杂卓二聚体、卡里奇霉素(例如，N-乙酰基-γ-卡里奇霉素)、长春花生物碱(例如，4-去乙酰基长春花碱)、多卡米新、蘑菇毒伞肽的环肽类似物、埃博霉素、蒽环霉素、CC-1065、紫杉烷(例如，紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛)、SN-38、伊立替康、长春新碱、长春花碱、铂类化合物(例如，顺铂)、甲氨蝶呤、微管抑制剂、卡培他滨、氟尿嘧啶、伊立替康、奥沙利铂、DNA损伤剂或替尼泊苷。将这些化学治疗药物与SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:192或SEQ ID NO:210–SEQ IDNO:401中任一者的肽偶联将药物靶向转移性结肠癌。将一种或多种化学治疗药物-肽缀合物给予人或动物。
实例24
用经突变的肽治疗非脑癌
此实例描述了用于治疗非脑癌的经突变的肽。本披露的肽是经突变的。此突变防止经突变的肽跨过血脑屏障。将经突变的肽重组表达或化学合成，并且然后直接地或通过可切割接头或非可切割接头缀合至化学治疗药物，例如环磷酰胺、多柔比星、澳瑞他汀(例如，单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、多洛他汀、澳瑞他汀F、MMAD)、美登木素生物碱(例如，DM1、DM4、美登素)、吡咯并苯并二氮杂卓二聚体、卡里奇霉素(例如，N-乙酰基-γ-卡里奇霉素)、长春花生物碱(例如，4-去乙酰基长春花碱)、多卡米新、蘑菇毒伞肽的环肽类似物、埃博霉素、蒽环霉素、CC-1065、紫杉烷(例如，紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛)、SN-38、伊立替康、长春新碱、长春花碱、铂类化合物(例如，顺铂)、甲氨蝶呤、微管抑制剂、卡培他滨、氟尿嘧啶、伊立替康、奥沙利铂、DNA损伤剂或替尼泊苷。将这些化学治疗药物与SEQID NO:1–SEQ ID NO:192或SEQ ID NO:210–SEQ ID NO:401中任一者的经突变的肽偶联将药物靶向非脑癌。例如，经突变的肽药物缀合物被靶向三阴性乳癌。将一种或多种化学治疗药物-肽缀合物给予人或动物。
实例25
改变肽药物缀合物的半衰期的方法
此实例描述了用于增加肽药物缀合物的半衰期以改善将肽-药物缀合物递送至肿瘤并增加在肿瘤处肽药物缀合物暴露时间的四种方法。
在第一种方法中，将本披露的肽重组表达或化学合成，并且然后通过可切割接头或非可切割接头缀合至化学治疗药物，例如环磷酰胺、多柔比星、MMAE、DM1、卡里奇霉素、紫杉酚或替尼泊苷。另外地，该肽药物缀合物包括在接头区域缀合的部分，例如脂肪酸(例如，棕榈酸)、烃链或聚合物(例如，聚乙二醇)。将这些化学治疗药物与SEQ ID NO:1–SEQ IDNO:196或SEQ ID NO:210–SEQ ID NO:405中任一者的肽偶联将药物靶向肿瘤。将一种或多种化学治疗药物-肽缀合物给予人或动物。在给予患者后，通过添加该部分来增加肽药物缀合物的半衰期，改善将肽药物缀合物递送至肿瘤，并增加在肿瘤处的肽药物暴露时间来治疗肿瘤。例如，当缀合至Alexa MMAE或紫杉酚时，肽的半衰期从数分钟增加至数小时。
在第二种方法中，通过突变肽来改变肽药物缀合物的半衰期。SEQ ID NO:1–SEQID NO:196或SEQ ID NO:210–SEQ ID NO:405中任一者的肽被突变成增加白蛋白结合。将经突变的肽重组表达或化学合成，并且然后直接地或通过可切割接头或非可切割接头缀合至化学治疗药物，例如环磷酰胺、多柔比星、MMAE、DM1、卡里奇霉素、紫杉酚或替尼泊苷。将这些化学治疗药物与SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:196或SEQ ID NO:210–SEQ ID NO:405中任一者的肽偶联将药物靶向癌症。将一种或多种化学治疗药物-肽缀合物给予人或动物。在给予患者后，通过肽中的突变来增加肽药物缀合物的半衰期，这改善了将肽药物缀合物递送至肿瘤并增加了肽药物暴露时间来治疗肿瘤。
在第三种方法中，通过另外地将亲脂性部分缀合至肽药物缀合物来改变肽药物缀合物的半衰期。将该肽重组表达或化学合成，并且然后直接地或通过可切割接头或非可切割接头缀合至化学治疗药物，例如环磷酰胺、多柔比星、MMAE、DM1、卡里奇霉素、紫杉酚或替尼泊苷。然后将肽药物缀合物直接地或通过可切割接头或非可切割接头缀合至亲脂性部分，例如Alexa679或Cy5.5。将这些化学治疗药物与SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:196或SEQ IDNO:210–SEQ ID NO:405中任一者的肽偶联将药物靶向癌症。将一种或多种化学治疗药物-肽缀合物给予人或动物。在给予患者后，通过缀合至亲脂性部分来增加肽药物缀合物的半衰期，这改善了将肽药物缀合物递送至肿瘤并增加了肽药物暴露时间来治疗肿瘤。例如，当缀合至Alexa 679或Cy5.5时，肽药物缀合物的半衰期是增加的。
在第四种方法中，通过另外地将抗体的Fc部分缀合至肽药物缀合物来改变肽药物缀合物的半衰期。将该肽重组表达或化学合成，并且然后直接地或通过可切割接头或非可切割接头缀合至化学治疗药物，例如环磷酰胺、多柔比星或替尼泊苷。然后将肽药物缀合物直接地或通过可切割接头或非可切割接头缀合至抗体的Fc部分。将这些化学治疗药物与SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:196或SEQ ID NO:210–SEQ ID NO:405中任一者的肽偶联将药物靶向癌症。将一种或多种化学治疗药物-肽缀合物给予人或动物。在给予患者后，通过缀合至抗体的Fc部分来增加肽药物缀合物的半衰期，这改善了将肽药物缀合物递送至肿瘤并增加了肽药物暴露时间来治疗肿瘤。例如，当缀合至抗体的Fc部分时，肽药物缀合物的半衰期增加至数天。
实例26
将药物缀合至肽上的多个位点
此实例描述了药物在含有至少三个赖氨酸残基的肽上的多个位点处的缀合。将本披露的具有至少三个赖氨酸残基的肽重组表达或化学合成，并且然后将4种化学治疗药物分子在4个不同位点处分别与该肽缀合。这些位点是肽的不同赖氨酸和N末端。
实例27
多种药物分子与肽的缀合
此实例描述了多种药物分子与肽的缀合。将四种化学治疗药物分子附接至支链骨架或聚合物骨架。将本披露的肽重组表达或化学合成，并且然后将含有四种化学治疗药物分子的支链骨架或聚合物骨架缀合至该肽。该肽是SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:196或SEQ IDNO:210–SEQ ID NO:405中的任一者。
实例28
本披露的肽缀合物中的接头
此实例描述了使用可切割接头或非可切割接头从而将化学治疗药物附接至肽。将本披露的肽重组表达或化学合成，并且然后通过酯缀合至化学治疗药物。此接头是可切割接头，并且在随时间酯水解或被血清和细胞酯酶切割时，将化学治疗药物从肽缀合物中释放。另外地，将本披露的肽重组表达或化学合成，并且然后用缬氨酸-瓜氨酸组织蛋白酶B可切割接头缀合至MMAE。可替代地，将本披露的肽重组表达或化学合成，并且然后通过马来酰亚胺接头缀合至化学治疗药物。此接头是非可切割接头。将化学治疗药物通过该接头经由交换到血清白蛋白上的游离巯基上而缓慢释放。另外地，将本披露的肽重组表达或化学合成，并且然后通过NHS酯缀合至化学治疗药物从而产生酰胺，这产生非可切割接头。
实例29
肽缀合物和放射疗法的共同给予
此实例描述了本文所描述的肽和放射疗法对肿瘤的共同给予。将本披露的肽重组表达或化学合成，并且然后直接地或通过可切割接头或非可切割接头缀合至化学治疗药物。将这些化学治疗药物与SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:196或SEQ ID NO:210–SEQ ID NO:405中任一者的肽偶联将药物靶向肿瘤。将一种或多种化学治疗药物-肽缀合物给予人或动物，同时还用靶向肿瘤的放射疗法来治疗该人或动物。
实例30
肽归巢至肿瘤
此实例描述了肽归巢至肿瘤。在含水条件下，将本披露的肽用花菁5.5(Cy5.5)NHS酯近红外荧光团进行标记。将本披露的肽在50mM碳酸氢钠(pH 8.3)中溶解至2mg/mL。将Cy5.5NHS酯以10mg/mL溶解于无水二甲亚砜中。将大约0.1摩尔当量的染料以10分钟间隔添加至肽水溶液中并充分混合。将在214和678nm处检测到的分析型HPLC用于评估反应的完成。一旦完成，则使用半制备型HPLC纯化单标记的产物。通过质谱法确认单个Cy5.5-缀合的产物的存在。
将一定剂量的肽经尾静脉注射给予重20g–25g的雌性哈伦无胸腺裸鼠(n＝3只小鼠/肽)。
将每种肽通过在染料上的活性NHS酯在N末端处化学缀合至Cy5.5或化学缀合至反应性赖氨酸。将10nmol的携带一个荧光团分子的每种肽的剂量给予荷肿瘤的雌性哈伦无胸腺裸鼠。基于溶液的荧光，将所得的荧光进行归一化。这些肿瘤是Colo205(人结肠癌细胞系)、MDA-MB231(三阴性人乳腺癌细胞系)或U87(人神经胶质瘤细胞系)的皮下异种移植物，将这些移植物植入小鼠的侧腹。在动物被安乐死之前，允许每种肽和每种对照在动物体内自由循环。
在24小时给药期结束时，通过CO2窒息使小鼠安乐死。收获血液、肿瘤、肌肉、肾、肝、脾和结肠组织并放置在冰上的PBS中。然后使用700nm通道、21微米分辨率和自动强度设置将组织在Odyssey CLx扫描仪(LI-COR)上扫描。使用Image Studio软件版本5.2(LI-COR)测量感兴趣的区域(ROI)内的信号强度。所有的ROI具有相同的尺寸。
表5列出了来自荷Colo205肿瘤的雌性哈伦无胸腺小鼠的SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的Cy5.5标记肽的一式三份的全器官近红外荧光量化数据。在表5中每一行表示来自单个小鼠的数据(将针对每种组织的信号经3ROI/组织进行平均)。
表5.在荷Colo205肿瘤的小鼠中针对缀合至Cy5.5的本披露的肽的全器官近红外荧光量化数据。肿瘤/肌肉是肿瘤中的信号与肌肉中的信号的比率。
缀合至Cy5.5的肽 肿瘤 结肠 肝 脾 肌肉 肿瘤/肌肉
SEQ ID NO:25 3380000 3023333.3 6426666.7 1913333.3 592000 5.7094595
SEQ ID NO:25 2233333.3 3210000 9326666.7 1870000 762333.33 2.9296021
SEQ ID NO:25 2093333.3 2603333.3 7376666.7 1523333.3 660333.33 3.1701161
SEQ ID NO:32 5210000 5373333.3 13933333 2346666.7 1529666.7 3.4059708
SEQ ID NO:32 3393333.3 5346666.7 15466667 2640000 1293333.3 2.6237113
SEQ ID NO:32 3543333.3 4546666.7 14433333 2796666.7 1073333.3 3.3012422
SEQ ID NO:17 3746666.7 4606666.7 18766667 4140000 1340000 2.7960199
SEQ ID NO:17 4943333.3 5340000 18466667 4153333.3 1636666.7 3.0203666
SEQ ID NO:17 6860000 4263333.3 16800000 3923333.3 1360000 5.0441176
SEQ ID NO:6 3846666.7 4996666.7 14166667 1800000 1098666.7 3.5012136
SEQ ID NO:6 6143333.3 6287500 16900000 2206666.7 780333.33 7.872704
SEQ ID NO:6 6333333.3 4790000 17100000 2013333.3 904000 7.0058997
SEQ ID NO:37 6646666.7 3703333.3 8753333.3 2213333.3 1083666.7 6.1334974
SEQ ID NO:37 9890000 4010000 9173333.3 2343333.3 807666.67 12.245151
SEQ ID NO:37 7570000 4040000 15100000 5746666.7 1526666.7 4.9585153
SEQ ID NO:35 6526666.7 6460000 12733333 2843333.3 1710000 3.8167641
SEQ ID NO:35 6780000 8023333.3 13966667 2470000 1076666.7 6.2972136
SEQ ID NO:35 16566667 9543333.3 18433333 3926666.7 1593333.3 10.39749
SEQ ID NO:36 19133333 11933333 34466667 11300000 2506666.7 7.6329787
SEQ ID NO:36 15466667 10913333 24366667 10500000 2233333.3 6.9253731
SEQ ID NO:36 19100000 12666667 35333333 14733333 2600000 7.3461538
表6列出了来自荷MDA-MB231肿瘤的雌性哈伦无胸腺小鼠的SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的Cy5.5标记的肽的全器官荧光量化数据。在表6中每一行表示来自单个小鼠的数据(将针对每种组织的信号经3ROI/组织进行平均)。
表6.在荷MDA-MB-231肿瘤的小鼠中针对缀合至Cy5.5的本披露的肽的全器官荧光量化数据。肿瘤/肌肉是肿瘤中的信号与肌肉中的信号的比率。
缀合至Cy5.5的肽 肿瘤 结肠 肝 脾 肌肉 肿瘤/肌肉
SEQ ID NO:25 3210000 2316666.67 7876666.67 1593333.33 824666.67 3.892482
SEQ ID NO:25 4830000 2856666.67 8083333.33 1460000 647000 7.465224
SEQ ID NO:25 4363333.33 2116666.67 7273333.33 1440000 490666.67 8.892663
SEQ ID NO:32 9813333.33 5303333.33 18166666.7 3046666.67 1716666.7 5.716505
SEQ ID NO:32 8773333.33 5390000 16700000 3713333.33 1450000 6.050575
SEQ ID NO:32 9796666.67 6963333.33 18300000 3540000 1866666.7 5.248214
SEQ ID NO:17 3313333.33 2346666.67 13400000 2283333.33 923666.67 3.587153
SEQ ID NO:17 5500000 3130000 12766666.7 2500000 706333.33 7.786692
SEQ ID NO:17 6210000 3636666.67 15833333.3 3006666.67 688000 9.026163
SEQ ID NO:6 5940000 5080000 13400000 1650000 1316000 4.513678
SEQ ID NO:6 5806666.67 4650000 13700000 1840000 1130000 5.138643
SEQ ID NO:6 3406666.67 3430000 12233333.3 1576666.67 839333.33 4.058777
SEQ ID NO:37 6740000 2946666.67 7910000 1686666.67 594000 11.3468
SEQ ID NO:37 5370000 2836666.67 9440000 1850000 903666.67 5.942457
SEQ ID NO:37 7966666.67 4123333.33 8163333.33 1373333.33 969000 8.221534
SEQ ID NO:35 9056666.67 6296666.67 17233333.3 2756666.67 1410000 6.423168
SEQ ID NO:35 14666666.7 8340000 21300000 3473333.33 1740000 8.429119
SEQ ID NO:36 2103333.33 1560000 5186666.67 1683333.33 517000 4.068343
SEQ ID NO:36 1032500 688333.333 1933333.33 643333.333 125666.67 8.21618
表7列出了来自荷U87肿瘤的雌性哈伦无胸腺小鼠的缀合至Cy5.5的SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:35或SEQ IDNO:36的肽的全器官荧光量化数据。在表7中每一行表示来自单个小鼠的数据(将针对每种组织的信号经3ROI/组织进行平均)。
表7.在荷U87肿瘤的小鼠中缀合至Cy5.5的根据本披露的肽的全器官荧光量化数据。肿瘤/肌肉是肿瘤中的信号与肌肉中的信号的比率。
缀合至Cy5.5的肽 肿瘤 结肠 肝 脾 肌肉 肿瘤/肌肉
SEQ ID NO:25 4490000 3380000 10766667 2126667 NA NA
SEQ ID NO:25 6756667 2943333 8483333 1500000 748000 9.032976827
SEQ ID NO:25 8073333 3500000 12366667 2483333 830666.7 9.719101124
SEQ ID NO:32 10173333 7316667 24200000 4513333 NA NA
SEQ ID NO:32 17166667 8343333 32466667 5870000 2756667 6.22732769
SEQ ID NO:32 5973333 6500000 18166667 3220000 1286667 4.642487047
SEQ ID NO:17 12166667 5626667 24233333 4786667 1140000 10.67251462
SEQ ID NO:17 8390000 3913333 16266667 2913333 1099333 7.63189812
SEQ ID NO:17 7723333 4803333 16233333 3563333 1010667 7.64182058
SEQ ID NO:6 4823333 4110000 17366667 2020000 1090000 4.425076453
SEQ ID NO:6 6983333 5956667 18666667 2423333 1856667 3.761220826
SEQ ID NO:6 7510000 5373333 20666667 2830000 1566667 4.793617021
SEQ ID NO:37 8920000 3316667 1.10E+07 2923333 1270333 7.021779061
SEQ ID NO:37 8640000 2456667 9176667 1873333 1065333 8.110137672
SEQ ID NO:37 10286667 2553333 9016667 1896667 1014667 10.13797635
SEQ ID NO:35 12066667 4880000 13733333 3423333 1686667 7.154150198
SEQ ID NO:35 20900000 4980000 13900000 4030000 1780000 11.74157303
SEQ ID NO:35 2.30E+07 5970000 18066667 4230000 1903333 12.08406305
SEQ ID NO:36 26500000 16033333 45500000 11800000 3166667 8.368421053
SEQ ID NO:36 28933333 28433333 32866667 6786667 3470000 8.338136407
SEQ ID NO:36 15700000 12400000 39300000 7663333 2180000 7.201834862
图42显示了Colo205肿瘤(顶部左侧)、结肠(顶部中间)、肝(顶部右侧)、脑(中间左侧)、脾(中间右侧)、肌肉(底部左侧)、皮肤(底部中间)和肾(底部右侧)的近红外荧光图像，其说明了给予后缀合至Cy5.5的SEQ ID NO:37的肽在荷Colo205肿瘤的雌性哈伦无胸腺小鼠体内的分布。图43显示了MDA-MB-231肿瘤(顶部左侧)、结肠(顶部中间)、肝(顶部右侧)、脑(中间左侧)、脾(中间右侧)、肌肉(底部左侧)、皮肤(底部中间)和肾(底部右侧)的近红外荧光图像，其说明了给予后缀合至Cy5.5的SEQ ID NO:37的肽在荷MDA-MB-231肿瘤的雌性哈伦无胸腺小鼠体内的分布。图44显示了U87肿瘤(顶部左侧)、结肠(顶部中间)、肝(顶部右侧)、脑(中间左侧)、脾(中间右侧)、肌肉(底部左侧)、皮肤(底部中间)和肾(底部右侧)的近红外荧光图像，其说明了给予后缀合至Cy5.5的SEQ ID NO:37的肽在荷U87肿瘤的雌性哈伦无胸腺小鼠体内的分布。
在每种肿瘤中检测了SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36的肽，并且其具有大于或等于2的肿瘤/肌肉比率，这指示这些肽中的每一种可以归巢至多种肿瘤类型。肿瘤/肌肉是可以用于评价归巢至肿瘤的比率，因为像肝、脾和结肠等的其他器官是消除这些肽的潜在途径。
SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:6的肽各自具有单个赖氨酸残基，这指示用Cy5.5染料缀合可以在赖氨酸残基和/或在N末端发生。SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36的肽不具有赖氨酸残基，并且除了经突变的赖氨酸残基以外与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:17的肽是相同的，这指示用Cy5.5染料缀合可以在SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36的N末端发生。因为所有的SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:35和SEQ IDNO:36的肽在肿瘤中被检测到，这指示内部赖氨酸残基和N末端位置都是用于修饰和缀合的可容许的位置，例如通过将细胞毒分子附接至肽用于治疗癌症。此外，与SEQ ID NO:17、SEQID NO:25和SEQ ID NO:32相比，SEQ ID NO:35–SEQ ID NO:37通常展示出更高的归巢至肿瘤，指示与N末端缀合可能有利于肿瘤归巢。因此，显示突变SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:32中的赖氨酸可增强它们的肿瘤归巢能力，这表明N末端可能是用于通常缀合活性剂的优选位置。
实例31
测定经改进的肽变体的方法
此实例显示了用于通过比较和分析支架肽的一级序列和三级结构来确定改进肽变体的方式的方法。比较SEQ ID NO:2肽和SEQ ID NO:3的一级序列和三级结构。这两种肽均来自Theraphotoxin家族并且被认为是BBB渗入物。将此方法用于鉴定SEQ ID NO:2或SEQID NO:3的序列部分，其可以被潜在地移植到Theraphotoxin家族的其他成员上，并将该家族的非BBB渗入成员转化为BBB渗入物。
图45显示了带有环位置注释的与SEQ ID NO:3比对的SEQ ID NO:2的序列，和它们对应的3D结构，其中SEQ ID NO:2结构在左侧，并且SEQ ID NO:3结构在右侧。将两个支架的序列比对用于鉴定芳香族药效团，该药效团对于蛋白质-蛋白质结合相互作用和对于BBB渗入可能是重要的。基于对SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的序列和3D构象的检查，SEQ ID NO:2中的残基F5、F32和F34以及残基W5、W30和W32可能是用于这些肽的BBB渗入特性的重要残基。另外，SEQ ID NO:2中的W6和SEQ ID NO:3中的W27还可能是用于BBB渗入的重要残基。此比较还显示与典型的打结素相比，SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3两者在其序列中具有更高百分比的脂肪族残基，并因此对于这些肽的BBB渗入特性可能潜在地是重要的。另外地，对结构同源性的比较使得设计出具有改进的折叠特性的变体。例如，在这些变体中的形成必需的β-发夹的环(环4)中进行突变以改进折叠，并且显示在任何环(环1-4)中的特定突变对变体的行为和活性可具有显著效果。该比较还显示SEQ ID NO:2环2的较长的长度对于折叠可能是重要的，因为SEQ ID NO:3具有较短的环并在表达中折叠不太好。
另外地，将一级序列和结构指导的同源性用于比较SEQ ID NO:1肽和SEQ ID NO:4肽。这些肽来自氯毒素家族，并且氯毒素家族的成员或类似物也可以是BBB渗入物。
图46显示了环位置进行了注释的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4的序列比对，其被用于鉴定对于SEQ ID NO:1的折叠和稳定性重要的位置。例如，在C末端处添加另外的残基可以显著地改变支架的稳定性。结果，与SEQ ID NO:1相比，用在SEQ ID NO:1的C末端Cys残基后附加的另外的残基制备的变体折叠地更好。然而，所附加的残基的身份是重要的。与折叠较好的Asn相比，具有附加的Arg的变体是不太有利的，这可以归因于酶的剪切。另外地，显示环2的长度可允许以不同的长度折叠，指示可以改变环2从而改进可制造性和稳定性或从而引入新的生物学活性。
实例32
同系物分析和变体设计
此实例描述了同系物的分析和变体的设计。由Uniprot数据库鉴定SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:55的肽的同系物。然后使用实例1的方法表达这些肽中的一些肽，并且用附加至N末端的GS氨基酸表示。使用从对这些同系物的结构、序列比对和/或测试表达的分析或文献收集的信息，设计并表达SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3和SEQ ID NO:55的肽的变体。
SEQ ID NO:1的肽的同系物的示例性序列是SEQ ID NO:85–SEQ ID NO:110的肽。SEQ ID NO:1的肽的经设计变体的示例性序列是SEQ ID NO:111–SEQ ID NO:133的肽。
SEQ ID NO:2的肽的同系物的示例性序列是SEQ ID NO:134–SEQ ID NO:138的肽。SEQ ID NO:2的肽的经设计变体的示例性序列是SEQ ID NO:139–SEQ ID NO:162的肽。
SEQ ID NO:3的肽的同系物的示例性序列是SEQ ID NO:163–SEQ ID NO:168的肽。SEQ ID NO:3的肽的经设计变体的示例性序列是SEQ ID NO:169–SEQ ID NO:192的肽。
SEQ ID NO:55的肽的同系物的示例性序列是SEQ ID NO:56–SEQ ID NO:63、SEQID NO:65–SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71–SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74–SEQ ID NO:79的肽。SEQ ID NO:55的肽的经设计变体的示例性序列是SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:84的肽。
实例33
肽-神经降压素肽融合物
此实例描述了肽-神经降压素肽融合物。神经降压素是13个氨基酸的神经肽ELYENKPRRPYIL(SEQ ID NO:420)，其参与黄体化激素和催乳素释放的调节并与多巴胺能系统具有显著的相互作用。
将神经降压素肽与SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:98的肽融合，并使用实例1的方法表达以产生SEQ ID NO:193–SEQ ID NO:196的肽。还将神经降压素肽与GSS-Hadrucalcin EKDCIKHLQRCRENKDCCSKKCSRRGTNPEKRCR(SEQ ID NO:423)融合以产生SEQ IDNO:197的肽。
实例34
肽-神经降压素肽融合物
此实例描述了肽-神经降压素肽融合物的使用方法。神经降压素肽不跨过血脑屏障，而是在中枢神经系统内产生并发出信号。因此，将神经降压素肽与如本文所描述的可以跨过血脑屏障的肽融合。表达SEQ ID NO:193–SEQ ID NO:196的肽-神经降压素肽融合物并给予对其有需要的受试者。给予后，SEQ ID NO:193–SEQ ID NO:196的肽-神经降压素肽融合物跨过受试者的血脑屏障并且治疗疼痛或其他神经降压素缺陷的适应症。该受试者可以是人。
实例35
肽的生物分布
此实例描述了肽的生物分布。在给药期结束时，将小鼠在己烷/干冰浴中冷冻，并且然后在羧基甲基纤维素块中冷冻。用切片机获得包括脑、肿瘤、肝、肾、肺、心脏、脾、胰腺、肌肉、脂肪、胆囊、上胃肠道、下胃肠道、骨、骨髓、生殖道、眼睛、胃、脊髓、膀胱、唾液腺以及其他类型的组织的整个动物矢状切片的薄的冷冻切片，允许在冷冻机中干燥，并且暴露于磷相仪板持续约10天。
使这些板显影，并将来自每个器官的信号(光密度测定法)相对于在每只动物的心脏血液中发现的信号归一化。组织中的信号要比该组织中预期来自血液的信号暗指示区域、组织、结构或细胞中的积累。
表8列出了每种肽向肝和肺中的迁移的汇总。针对肝或肺的数字指示在该组织中的信号相比于心脏血液中检测到的信号的百分比。
表8.肽迁移至肝或肺的汇总。
肽 肝 肺
SEQ ID NO:1 129.99 89.98
SEQ ID NO:2 507.95 148.59
SEQ ID NO:3 109.00 181.48
SEQ ID NO:4 97.22 75.34
SEQ ID NO:34 82.37 118.19
SEQ ID NO:35 82.80 106.60
SEQ ID NO:37 95.22 110.28
SEQ ID NO:55 51.65 84.67
菊糖 126.76 242.98
GS-海南捕鸟蛛毒素 70.61 85.11
钾通道肽 39.89 79.28
SEQ ID NO:36 128.72 104.62
SEQ ID NO:39 84.20 76.27
表9列出了每种肽向脾、胰腺、肌肉、脂肪组织、胆囊、上消化道和下消化道中的迁移的汇总。
表9.肽迁移至脾、胰腺、肌肉、脂肪组织、胆囊、上消化道或下消化道的汇总。数字指示所指示的组织中的信号相比于来自心脏中血液的信号的百分比。
表10列出了每种肽向每只动物的生殖道、皮肤和唾液腺中的迁移的汇总。针对生殖道、皮肤或唾液腺的数字指示在该组织中的信号相比于心脏血液中检测到的信号的百分比。
表10.肽迁移至生殖道或唾液腺的汇总。
表11列出了每种肽向每只动物的脊髓和膀胱中的迁移的汇总。高、中和低指示在血液中每面积的放射性信号与在组织中的每面积的放射性信号的比较。ND指示在该组织中未检测到肽。
表11.肽迁移至脊髓或膀胱的汇总。
肽 脊髓 膀胱
SEQ ID NO:1 中 ND
SEQ ID NO:2 低 低
SEQ ID NO:3 低 ND
SEQ ID NO:4 低 ND
SEQ ID NO:55 低 低
虽然已经在本文示出并描述了本发明的优选实施例，但是对本领域的普通技术人员而言应该显而易见是这样的实施例仅以举例方式提供。预期的是本发明受本说明书内所提供的具体实例的限制。尽管已经参照前述说明书描述了本发明，但是本文的实施例的描述和说明并不意味着从限制意义上进行解释。在不背离本发明的情况下本领域的普通技术人员现在将会想到众多变体、变化以及替代。此外，应该理解本发明的所有方面并非限制于本文阐述的取决于各种条件和变量的具体描绘、配置或相对比例。应该理解的是，本文描述的本发明的实施例的不同替代方案可以用于实践本发明。因此，应该想到的是，本发明还应该覆盖任何此类替代方案、修改、变体或等效物。预期的是以下权利要求书限定了本发明的范围以及由此覆盖在这些权利要求和它们的等效物的范围内的方法和结构。

Claims (113)

1.一种肽，该肽包含SEQ ID NO:198–SEQ ID NO:209或SEQ ID NO:407–SEQ ID NO:418中任一者的序列或其片段。
2.一种肽，该肽包含与SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:192或SEQ ID NO:210–SEQ ID NO:401中任一者具有至少80％序列一致性的序列或其片段。
3.如权利要求2所述的肽，其中该序列与SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:192或SEQ ID NO:210–SEQ ID NO:401中任一者具有至少85％、至少90％或至少95％序列一致性，或具有其片段。
4.如权利要求2-3中任一项所述的肽，其中该序列是SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:192或SEQ ID NO:210–SEQ ID NO:401中的任一者或其片段。
5.一种肽，该肽包含SEQ ID NO:198–SEQ ID NO:209中任一者的序列或其片段。
6.一种肽，该肽包含与SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:192中任一者具有至少80％序列一致性的序列或其片段。
7.如权利要求6所述的肽，其中该序列与SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:192中任一者具有至少85％、至少90％或至少95％序列一致性，或具有其片段。
8.如权利要求6-7中任一项所述的肽，其中该序列是SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:192中的任一者或其片段。
9.一种肽，该肽包含SEQ ID NO:407–SEQ ID NO:418中任一者的序列或其片段。
10.一种肽，该肽包含与SEQ ID NO:210–SEQ ID NO:401中任一者具有至少80％序列一致性的序列或其片段。
11.如权利要求10所述的肽，其中该序列与SEQ ID NO:210–SEQ ID NO:401中任一者具有至少85％、至少90％或至少95％序列一致性，或具有其片段。
12.如权利要求10-11中任一项所述的肽，其中该序列是SEQ ID NO:210–SEQ ID NO:401中的任一者或其片段。
13.如权利要求1-12中任一项所述的肽，其中该肽是打结肽。
14.如权利要求1-13中任一项所述的肽，其中该肽包含至少6个、至少8个、至少10个、至少12个、至少14个或至少16个半胱氨酸残基。
15.如权利要求1-14中任一项所述的肽，其中该肽包含半胱氨酸残基之间形成的多个二硫桥。
16.如权利要求1-15中任一项所述的肽，其中至少5％或更多的残基是形成分子内二硫键的半胱氨酸。
17.如权利要求1-16中任一项所述的肽，其中该肽包含穿过二硫化物结的二硫化物。
18.如权利要求1-17中任一项所述的肽，其中该肽的至少一个氨基酸残基处于L构型，或其中该肽的至少一个氨基酸残基处于D构型。
19.如权利要求1-18中任一项所述的肽，其中该序列是至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45、至少46、至少47、至少48、至少49、至少50、至少51、至少52、至少53、至少54、至少55、至少56、至少57、至少58个残基、至少59、至少60、至少61、至少62、至少63、至少64、至少65、至少66、至少67、至少68、至少69、至少70、至少71、至少72、至少73、至少74、至少75、至少76、至少77、至少78、至少79、至少80或至少81个残基长。
20.如权利要求1-19中任一项所述的肽，其中该肽与至少一种其他的肽被安排成多聚体结构。
21.如权利要求1-20中任一项所述的肽，其中该肽在生理pH下具有高于+0.5的净正电荷。
22.如权利要求1-20中任一项所述的肽，其中该肽在生理pH下具有低于-0.5的净负电荷。
23.如权利要求1-22中任一项所述的肽，其中在给予受试者后，该肽归巢、靶向、积累于、迁移至或被导向至该受试者的特定区域、组织、结构或细胞。
24.如权利要求1-23中任一项所述的肽，其中该肽的至少一个残基包含化学修饰。
25.如权利要求24所述的肽，其中该化学修饰封闭该肽的N末端。
26.如权利要求24所述的肽，其中该修饰是甲基化、乙酰化或酰化。
27.如权利要求24所述的肽，其中该化学修饰是：
一个或多个赖氨酸残基或其类似物的甲基化；
N末端的甲基化；或
一个或多个赖氨酸残基或其类似物的甲基化和N末端的甲基化。
28.如权利要求1-27中任一项所述的肽，其中该肽连接至酰基加合物。
29.如权利要求1-28中任一项所述的肽，其中该肽连接至活性剂。
30.如权利要求29所述的肽，其中该活性剂与该肽在该肽的N末端或C末端融合。
31.如权利要求30所述的肽，其中该活性剂是神经降压素肽。
32.如权利要求31所述的肽，其中该神经降压素肽具有SEQ ID NO:420的序列。
33.如权利要求30-32中任一项所述的肽，其中与神经降压素肽融合的该肽包含连续序列。
34.如权利要求29-33中任一项所述的肽，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种活性剂连接至该肽。
35.如权利要求29-34中任一项所述的肽，其中该肽通过可切割接头连接至该活性剂。
36.如权利要求29-35中任一项所述的肽，其中该肽通过接头在该肽的以下位置连接至该活性剂：在N末端处、在内部赖氨酸残基的ε胺处、在天冬酰胺或谷氨酰胺残基的羧酸处或在C末端处。
37.如权利要求36所述的肽，其中该内部赖氨酸残基位于对应于SEQ ID NO:37的氨基酸残基17、SEQ ID NO:37的氨基酸残基25或SEQ ID NO:37的氨基酸残基29的位置。
38.如权利要求36所述的肽，其中该内部赖氨酸残基位于对应于SEQ ID NO:246的氨基酸残基15、SEQ ID NO:246的氨基酸残基23或SEQ ID NO:246的氨基酸残基27的位置。
39.如权利要求29-38中任一项所述的肽，该肽进一步包含非天然氨基酸，其中该非天然氨基酸是另一氨基酸的插入物、附加物或替代物。
40.如权利要求39所述的肽，其中该肽通过接头在该非天然氨基酸处连接至该活性剂。
41.如权利要求36-40中任一项所述的肽，其中该接头包含酰胺键、酯键、氨基甲酸酯键、碳酸酯键、腙键、肟键、二硫键、硫酯键或碳-氮键。
42.如权利要求35所述的肽，其中该可切割接头包含基质金属蛋白酶、凝血酶、组织蛋白酶或β-葡萄糖醛酸酶的切割位点。
43.如权利要求29-42中任一项所述的肽，其中该肽通过非可切割接头连接至该活性剂。
44.如权利要求29所述的肽，其中该活性剂选自下组，该组由以下各项组成：肽、多肽、多核苷酸、抗体、单链可变区片段(scFv)、抗体片段、细胞因子、激素、生长因子、检查点抑制剂、免疫调节剂、神经递质、化学剂、细胞毒分子、毒素、放射增敏剂、辐射防护剂、治疗性小分子、纳米粒子、脂质体、聚合物、树状物、脂肪酸、拟肽、补体固定肽或蛋白质、聚乙二醇、脂质或Fc区。
45.如权利要求29所述的肽，其中该活性剂是多脱氧核糖核苷酸或多核糖核苷酸序列。
46.如权利要求29所述的肽，其中该活性剂是抗炎剂、抗真菌剂、抗病毒剂或抗感染剂。
47.如权利要求29所述的肽，其中该活性剂是化学治疗剂。
48.如权利要求29所述的肽，其中该活性剂是打结肽。
49.如权利要求29所述的肽，其中该活性剂是放射增敏剂或光敏剂。
50.如权利要求29所述的肽，其中该细胞毒分子是澳瑞他汀、MMAE、美登木素生物碱、DM1、DM4、多柔比星、卡里奇霉素、铂类化合物、顺铂、紫杉烷、紫杉醇、SN-38、BACE抑制剂、Bcl-xL抑制剂、WEHI-539、维内托克斯、ABT-199、纳威托克斯、AT-101、奥巴托克斯、吡咯并苯并二氮杂卓或吡咯并苯并二氮杂卓二聚体或多拉他汀。
51.如权利要求1-50中任一项所述的肽，其中该肽连接至可检测剂。
52.如权利要求51所述的肽，其中该可检测剂与该肽在该肽的N末端或C末端融合。
53.如权利要求51-52中任一项所述的肽，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种可检测剂连接至该肽。
54.如权利要求51-53中任一项所述的肽，其中该肽通过可切割接头连接至该可检测剂。
55.如权利要求51-53中任一项所述的肽，其中该肽通过接头在该肽的以下位置连接至该可检测剂：在N末端处、在内部赖氨酸残基的ε胺处或在C末端处。
56.如权利要求55所述的肽，其中该内部赖氨酸位于对应于SEQ ID NO:37的氨基酸残基17、SEQ ID NO:37的氨基酸残基25或SEQ ID NO:37的氨基酸残基29的位置。
57.如权利要求55所述的肽，其中该内部赖氨酸残基位于对应于SEQ ID NO:246的氨基酸残基15、SEQ ID NO:246的氨基酸残基23或SEQ ID NO:246的氨基酸残基27的位置。
58.如权利要求51-57中任一项所述的肽，该肽进一步包含非天然氨基酸，其中该非天然氨基酸是另一氨基酸的插入物、附加物或替代物。
59.如权利要求58所述的肽，其中该肽通过接头在该非天然氨基酸处连接至该活性剂。
60.如权利要求55-59中任一项所述的肽，其中该接头包含酰胺键、酯键、氨基甲酸酯键、腙键、肟键或碳-氮键。
61.如权利要求54所述的肽，其中该可切割接头包含基质金属蛋白酶、凝血酶、组织蛋白酶或β-葡萄糖醛酸酶的切割位点。
62.如权利要求51-61中任一项所述的肽，其中该肽通过非可切割接头连接至该可检测剂。
63.如权利要求51-62中任一项所述的肽，其中该可检测剂是荧光团、近红外染料、造影剂、纳米粒子、含有金属的纳米粒子、金属螯合物、X射线造影剂、PET剂、放射性同位素或放射性核素螯合剂。
64.如权利要求51所述的肽，其中该可检测剂是荧光染料。
65.如权利要求1-64中任一项所述的肽，其中该肽归巢、靶向、被导向至、积累于或迁移至肿瘤或癌性细胞。
66.如权利要求65所述的肽，其中该肿瘤是实体瘤。
67.如权利要求65-66中任一项所述的肽，其中该肿瘤是血液系统恶性肿瘤。
68.如权利要求66-67所述的肽，其中该肽穿透该实体瘤。
69.如权利要求66-67所述的肽，其中该肽内化到或穿透癌性细胞。
70.如权利要求65-69中任一项所述的肽，其中该肿瘤或癌性细胞来自脑癌、胶质母细胞瘤、结肠癌、三阴性乳癌、转移性癌症或肉瘤。
71.如权利要求65-70中任一项所述的肽，其中该肽跨过血脑屏障从而进入该肿瘤。
72.如权利要求65-71中任一项所述的肽，其中该肽跨过血脑脊液屏障从而进入该肿瘤。
73.如权利要求1-72中任一项所述的肽，其中该肽跨过受试者的血脑屏障或血脑脊液屏障。
74.如权利要求1-73中任一项所述的肽，其中该肽跨过受试者的血脑脊液屏障。
75.如权利要求73-74中任一项所述的肽，其中在跨过血脑屏障后，该肽归巢、靶向、被导向至、积累于或迁移至该受试者的肿瘤或患病区域、组织、结构或细胞。
76.如权利要求1-75中任一项所述的肽，其中在给予受试者后，该肽归巢、靶向、被导向至、积累于或迁移至该受试者的特定脑区域。
77.如权利要求76所述的肽，其中该脑的特定区域包括脑室、脑脊液、海马体、脑膜、嘴侧迁移系统、齿状回、脑室下区或其任何组合。
78.如权利要求1-77中任一项所述的肽，其中该肽影响神经障碍、溶酶体贮积病、癫痫、脑膜炎、脑中的感染、中风和多发性硬化症。
79.如权利要求1-78中任一项所述的肽，其中该肽影响与神经退行性疾病关联的蛋白质聚集。
80.如权利要求1-79中任一项所述的肽，其中该肽抑制与脑癌关联的途径。
81.如权利要求1-80中任一项所述的肽，其中该肽抑制或激活离子通道。
82.如权利要求1-81中任一项所述的肽，其中该肽展示出蛋白酶抑制剂活性。
83.如权利要求1-82中任一项所述的肽，其中该肽具有抗细菌、抗真菌或抗病毒活性。
84.一种药物组合物，该药物组合物包含如权利要求1-83中任一项所述的肽或其盐和药学上可接受的载体。
85.如权利要求84所述的药物组合物，其中将该药物组合物配制成用于给予受试者。
86.如权利要求84-85中任一项所述的药物组合物，其中将该药物组合物配制成用于吸入、鼻内给药、口服给药、局部给药、静脉内给药、皮下给药、关节内给药、肌内给药、鞘内给药、腹膜内给药或其组合。
87.一种治疗对其有需要的受试者的病症的方法，该方法包括：
向该受试者给予如权利要求1-83中任一项所述的肽或如权利要求84-86中任一项所述的药物组合物。
88.如权利要求87所述的方法，其中通过吸入、鼻内地、口服地、局部地、静脉内地、皮下地、关节内地、肌内地、腹膜内地或其组合给予该肽或药物组合物。
89.如权利要求87-88中任一项所述的方法，其中在给予后，该肽或药物组合物归巢、靶向、积累于、迁移至或被导向至该受试者的癌性或患病区域、组织、结构或细胞。
90.如权利要求87-89中任一项所述的方法，其中该病症是肿瘤或癌症。
91.如权利要求87-90中任一项所述的方法，其中该病症是实体瘤。
92.如权利要求87-90中任一项所述的方法，其中该肿瘤是血液系统恶性肿瘤。
93.如权利要求87-89中任一项所述的方法，其中该病症是脑肿瘤、三阴性乳癌、结肠癌转移、转移性癌症或肉瘤。
94.如权利要求93所述的方法，其中该脑肿瘤是不宜动手术的。
95.如权利要求91-94中任一项所述的方法，其中该肽跨过血脑屏障从而归巢、靶向、迁移至、积累于或被导向至脑中的该肿瘤。
96.如权利要求91-95中任一项所述的方法，其中该肽跨过血脑脊液屏障从而归巢、靶向、迁移至、积累于或被导向至脑中的该肿瘤。
97.如权利要求87-95中任一项所述的方法，其中将该方法与其他治疗组合。
98.如权利要求97所述的方法，其中这些其他的治疗包括化学疗法、放射疗法或免疫调节疗法。
99.如权利要求87-98中任一项所述的方法，其中在给予后，该肽跨过该受试者的血脑屏障。
100.如权利要求87-99中任一项所述的方法，其中在给予后，该肽跨过该受试者的血脑脊液屏障。
101.如权利要求87-100中任一项所述的方法，其中在给予后，该肽归巢、靶向、被导向至、积累于或迁移至该受试者的脑室、脑脊液、脑膜、嘴侧迁移系统或海马体。
102.如权利要求87-101中任一项所述的方法，其中该病症是脑病症。
103.如权利要求87-102中任一项所述的方法，其中该病症是与脑室、脑脊液或海马体的功能关联的。
104.如权利要求103所述的方法，其中该脑病症是与脑的功能关联的。
105.如权利要求103-104中任一项所述的方法，其中该肽诊断、预防或治疗该脑病症。
106.如权利要求103-105中任一项所述的方法，其中该脑病症是脑肿瘤或脑癌。
107.如权利要求103-106中任一项所述的方法，其中该脑病症是记忆丧失或记忆功能、阿尔茨海默病、帕金森病、多系统萎缩(MSA)、精神分裂症、癫痫、进行性多灶性白质脑病、真菌感染、抑郁、双相型障碍、创伤后应激障碍、中风、创伤性脑损伤、感染或多发性硬化症。
108.一种对受试者的器官或身体区域成像的方法，该方法包括：
向该受试者给予如权利要求1-83中任一项所述的肽或如权利要求84-87中任一项所述的药物组合物；并且
对该受试者的该器官或身体区域成像。
109.如权利要求108所述的方法，该方法进一步包括检测该受试者的癌症或患病区域、组织、结构或细胞。
110.如权利要求108-109中任一项所述的方法，该方法进一步包括对该受试者进行外科手术。
111.如权利要求108-110中任一项所述的方法，该方法进一步包括治疗该癌症。
112.如权利要求108-111中任一项所述的方法，其中该外科手术包括去除该受试者的该癌症或患病区域、组织、结构或细胞。
113.如权利要求112所述的方法，该方法进一步包括在外科手术去除后，对该受试者的该癌症或患病区域、组织、结构或细胞成像。
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