CN103083689A - 一种用于脑肿瘤诊断的跨血脑屏障靶向多模态纳米药物 - Google Patents

Abstract

本发明属影像药物领域，涉及一种用于脑肿瘤诊断的跨血脑屏障靶向多模态纳米药物，尤其是具有跨BBB受体主动靶向作用的磁性/荧光纳米诊断药物及其中间体的合成，及其在活体无创脑肿瘤多模态显像中的应用。本发明的多模态纳米诊断药物上分别标记有肿瘤新生血管靶向基团，跨BBB转运基团，磁性及光学影像基团。该药物首先靶向肿瘤外周新生血管，然后通过受体介导的跨BBB转运作用入脑并二级靶向到肿瘤细胞。通过磁共振/光学多模态成像技术，该药物可实现脑肿瘤，特别是BBB未受破坏脑肿瘤的无创高信噪比示踪。本发明将为脑肿瘤的手术前定位及实时影像指导下的脑肿瘤切除提供新的参考途径。

Description

一种用于脑肿瘤诊断的跨血脑屏障靶向多模态纳米药物

技术领域

本发明属影像药物领域，涉及诊断药物，具体涉及一种用于脑肿瘤诊断的跨血脑屏障靶向多模态纳米药物，尤其是具有跨BBB受体主动靶向作用的磁性/荧光纳米诊断药物及其中间体的合成，及其在活体无创脑肿瘤多模态显像中的应用。

背景技术

脑肿瘤是发生于神经外胚层的肿瘤，它具有发病率、复发率、死亡率高和治愈率低等特点。脑胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤(占所有颅内肿瘤的69％)，也是脑肿瘤中最致命(平均5年存活率是5％)的一种。目前脑胶质瘤的治疗是世界公认的难题。手术切除是脑胶质瘤治疗中最主要的手段。但是，由于脑胶质瘤的弥漫性浸润生长的特点，很难精确定位，使得在手术中从周围的正常脑组织中精确切除它变得非常困难。因此，业内公认对脑肿瘤边界的高信噪比示踪是指导肿瘤准确切除的关键。

核磁共振成像(MRI)由于组织空间分辨率高、无电离辐射等优点成为手术前脑胶质瘤定位的最主要手段。但是，MRI对肿瘤边界的描绘常受到小分子造影剂循环时间短、血脑屏障穿透能力差和无靶向特异性等缺点限制。研究显示，血脑屏障是保护大脑正常生理机能的生理结构，因其低通透性的影响，大约98％的小分子和绝大多数的大分子不能穿过它进入大脑。研究发现，20-30％的高级别恶性胶质瘤(III-IV级)及绝大多数低级别胶质瘤(I-II级)因血脑屏障完好原因在注射小分子造影剂后没有出现任何信号增强。因此，创建具有跨血脑屏障并具有受体靶向性的探针是实现胶质瘤(特别是血脑屏障尚未破坏的胶质瘤)高信噪比示踪的关键。

研究表明，脑毛细血管内皮细胞上的低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)可以通过转胞吞作用将内源性蛋白和小分子转运入脑。而多肽Angiopep-2作为LRP的配体，表现出比转铁蛋白和抑肽酶等脑靶向配体更强的跨血脑屏障作用[Demeule，M et al，J.Pharmacol.Exp.Ther.2008，324，1064；Demeule，M et al，J.Neurochem.2008，l06，1534；Ke，W et al，Biomaterials 2009，30，6976.]。更重要的是，LRP不仅在脑毛细血管内皮细胞上有表达，它在脑肿瘤中也高度表达[Maletinska，L et al，Cancer Res.2000，60，2300.]。这表明Angiopep-2将有望特异性引导影像药物穿越血脑屏障并靶向脑胶质瘤。

现有技术公开了有关树枝状大分子聚乙二胺(PAMAM)因其内在性质适合生物医学的应用。所述PAMAM具有一系列的大小尺寸，被称为“代(generation)”，可根据应用需要精确细调分子大小作为，新型药物载体可以标记多个顺磁性基团(标记位点取决于PAMAM的代数)，组成具有较小分子磁性基团驰豫率更高的显像剂。以低代数的树枝状高分子为载体的显像剂，包括G2(二代，3nm)、G3(三代，5nm)和G4(四代，6nm)造影剂通过肾脏快速排泄。但由于减少了外渗，它们依然比Gd-DTPA能更好地显示血管结构。中等代数的树枝状高分子为基础的试剂，包括G5(五代，7nm)和G6(六代，9nm)造影剂，由于长循环时间而部分通过肝胆管排泄。而对于G7(七代，11nm)和G8(八代，13nm)而言，几乎完全是通过肝胆系统排泄，更高代数的则被肝脾等的网状内皮系统所捕获。

光学成像作为新兴影像技术具有高灵敏度，无电离辐射，成本低廉等优点。但由于光在组织上的低穿透率，漫反射和自发荧光等原因，光学成像分辨率较低。业界认为，光学成像和磁共振成像相结合优势互补的多模式影像技术能够提供较单一影像技术更加灵敏和高分辨率的示踪效果。近年来，光学成像中近红外荧光(Near-Infrared Fluorescence)探针的研究悄然兴起。近红外荧光材料的最大吸收和发射波长为650～900nm。在此范围内，生物体对近红外荧光的吸收率低、光散射也较弱，使得近红外光能够穿透更深组织。该区域内的低背景荧光亦能增加荧光技术的灵敏度。这些特点也使NIR技术在生物成像领域发挥重要作用，如手术中的实时荧光引导、组织学边界状态分析等。

目前尚未见具有跨BBB二级靶向多模态纳米诊断药物的报道。

发明内容

本发明的目的是提供新的用于脑肿瘤诊断的跨血脑屏障靶向多模态纳米药物，尤其是具有跨BBB受体主动靶向作用的磁性/荧光纳米诊断药物。本纳米药物能克服现阶段小分子造影剂循环时间短，磁豫率低，无靶向性，特别是血脑屏障(BBB)尚未破坏的脑肿瘤难以准确示踪等缺点，实现脑肿瘤，特别是BBB未受破坏脑肿瘤的无创高信噪比示踪。

本发明的进一步目的是提供上述纳米药物在活体无创脑肿瘤多模态显像中的应用。

具体而言，本发明的用于脑肿瘤诊断的跨血脑屏障靶向多模态纳米药物是一种对血脑屏障未受破坏脑肿瘤具有二级靶向示踪功能的多模态诊断药物，其特征在于，由树枝状高分子作为载体，与Angiopep-2肽链和c[RGDyK]环肽连接制成结构为Den-(NIRP)_x-(MRICA)_y-(PEG-c[RGDyK])_z-(PEG-Angiopep-2)_v的跨血脑屏障靶向多模态纳米药物。

其中，Den代表作为影像药物载体的树枝状高分子；本发明的实施例中，优选Den为2-8代的聚酰胺树枝状高分子；

NIRP为荧光基团，x代表标记在载体上荧光基团数目；NIRP以酰胺键形式标记到所述树枝状高分子上；本发明的实施例中，NIRP为包括荧光素，罗丹明，IR783、Cy5.5等在内的荧光基团；本发明中优选近红外荧光基团Cy5.5；

MRI CA为T1加权顺磁性基团，y代表标记在载体上顺磁性基团数目；CA以酰胺键形式标记到树枝状高分子上；本发明的实施例中，MRI CA为包括Gd-DOTA，Gd-DTPA在内的钆金属配合物；

PEG为聚乙二醇，c[RGDyK]环肽及Angiopep-2肽通过双功能化PEG桥连到树枝状高分子上；z代表载体上PEG-c[RGDyK]标记数目，v代表载体上PEG-Angiopep-2标记数目；

本发明中，用于桥连多肽的双功能化PEG的两端分别是N-羟基琥珀酰亚胺酯和马来酰亚胺；用于桥连Angiopep-2的双功能化PEG的两端分别是伯胺基和马来酰亚胺；

本发明中，PEG上的马来酰亚胺与树枝状高分子上伯胺基反应得到Den-PEG中间产物。

本发明中，c[RGDyK]环肽上的伯氨基与PEG上的N-羟基琥珀酰亚胺酯反应得到PEG-c[RGDyK]；PEG上的马来酰亚胺与树枝状高分子上伯胺基反应得到通过PEG桥连的Den-PEG-c[RGDyK]化合物。

本发明中，PEG上伯胺基与3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯反应得到修饰有吡啶二巯基的PEG。

本发明中，在氨基酸序列为TFFYGGSRGKRNNFKTEEY的Angiopep-2肽链C端引入半胱氨酸得到序列为TFFYGGSRGKRNNFKTEEYC的新肽链；新肽链半胱氨酸上的巯基与标记在树枝状高分子上的2-吡啶二巯基缩合得到通过PEG桥连的Den-PEG-Angiopep-2化合物。

本发明用动态光散射的方法测定纳米影像药物的流体动力学粒径分布和Zeta电位，结果显示，Den-Angio-RGD和Den-RGD的平均直径是15.6nm和13.2nm，平均Zeta电位是+8.6和+11.6mV。

本发明中，标记在影像纳米药物上的c[RGDyK]环肽可特异性识别脑血管内皮细胞和脑胶质瘤细胞上高表达的整合素蛋白α_Vβ₃受体；Angiopep-2可特异性识别脑血管内皮细胞和脑胶质瘤细胞上低密度脂蛋白相关受体；所述二者实现跨血脑屏障的和肿瘤靶向性并提高靶向效率。

本发明中，血脑屏障未受破坏脑肿瘤包括毛细胞型星形细胞瘤(I级)；低度弥漫型星形细胞瘤(II级)；间变型星形细胞瘤(III级)及多型性胶质母细胞瘤(IV级)。

本发明中，多模态指磁共振成像和近红外荧光光学成像，诊断药物可被磁共振成像和光学成像同时无创动态监测。

本发明中，树枝状高分子表面修饰聚乙二醇能提高探针的生物相容性和血液循环时间，线性PEG一端与载体键合，另一端将修饰靶向基团Angiopep-2或c[RGDyK]环肽。长链PEG桥连将载体对Angiopep-2和c[RGDyK]环肽的靶向性影响降到最低，顺磁性基团Gd³⁺-DOTA和近红外荧光基团Cy5.5将直接标记在载体表面。纳米影像药物上标记了罗丹明(Rhodamine)，用荧光显微镜观察离体切片时，更方便追踪纳米影像药物。

本发明利用整合素蛋白α_Vβ₃亚型在胶质瘤新生血管内皮细胞表面及胶质瘤细胞表面均有高度表达特性，以及c[RGDyK]环肽对整合素蛋白α_Vβ₃有很高的结合常数的特性，构建跨血脑屏障二级靶向胶质瘤无创示踪的方法，其中c[RGDyK]环肽、Angiopep-2与影像基团标记在纳米影像药物表面，静脉注射后，探针首先通过c[RGDyK]环肽主动靶向到肿瘤新生血管，探针在脑血管内皮细胞表面浓度的增加将提高LRP转胞吞作用，由于α_Vβ₃ integrin和LRP受体在脑肿瘤细胞表面均高表达，穿越血脑屏障后的探针将再次靶向到肿瘤细胞上。所述的跨血脑屏障二级靶向机制可得到较单一靶向更佳的肿瘤示踪效果。

本发明中，优选G5作为探针载体，既有较长的循环时间，同时还可以通过肿瘤血管与正常血管通透性差异而实现肿瘤被动选择性。

本发明的用于脑肿瘤诊断的跨血脑屏障靶向多模态纳米药物具有如下优点：

多模态纳米药物上标记c[RGDyK]环肽可靶向肿瘤新生血管内皮细胞高表达的整合素蛋白α_Vβ₃受体，该纳米药物在肿瘤内皮细胞表面浓度的增加促使Angiopep-2肽与内皮细胞高表达的低密度脂蛋白相关受体(LRP)的结合，并提高LRP受体介导的跨BBB转运效率；该纳米药物跨越BBB后可与脑肿瘤细胞上高表达的整合素蛋白α_Vβ₃受体和低密度脂蛋白相关受体(LRP)结合实现探针对肿瘤的二级主动靶向作用。所述的多模态二级靶向纳米诊断药物对肿瘤具有很好的靶向示踪性、灵敏度。

为验证目标影像药物对脑肿瘤的靶向示踪灵敏度及信噪比，本发明制备了仅标记有肿瘤血管靶向基团的参比影像药物，两种探针的合成路线如图14所示。

附图说明

图1：C-Angiopep-2的ESI-MS图谱，

多肽TFFYGGSRGKRNNFKTEEYC分子量：2404.6Da。

图2：C-Angiopep-2的分析型HPLC图谱，

色谱方法：色谱柱：YMC HPLC COLUMN 150×4.6mml.D；流动相A：0.1％TFA乙腈溶液；流动相B：0.1％TFA水溶液；流速：0.7mL/min；时间：45min，在214和280nm处探测；洗脱程序：在0到26分钟，洗脱程序从90％到65％的B线性变化，然后，在27-32分钟，维持10％的B冲洗柱子，最后，用90％的B冲洗柱子至平衡。

图3：C-angiopep-2的¹H NMR光谱图。

图4：化合物2的¹H NMR光谱图。

图5：化合物3的¹H NMR光谱图。

图6：化合物6的¹H NMR光谱图。

图7：化合物7的¹H NMR光谱图。

图8：Den-Angio-RGD的¹H NMR光谱图。

图9：纳米诊断药物的水合粒径分布和Zeta电位，

用动态光散射的方法测定纳米影像药物的流体动力学粒径分布(A)和Zeta电位(B)，

Den-Angio-RGD和Den-RGD的平均直径是15.6nm和13.2nm，平均Zeta电位是+8.6和+11.6mV。

图10：纳米影像药物对人类脑胶质瘤U87MG肿瘤细胞的细胞毒性

Den-Angio-RGD和Den-RGD对人类脑胶质瘤U87MG肿瘤细胞的细胞毒性都比未修饰的G5明显低，数据用平均值±方差表示，每个浓度的实验n＝8。

图11：正常小鼠(左图)与荷瘤小鼠(右图)在注射目标影像药物Den-Angio-RGD 24h后活体光学影像图，

纳米影像药物Den-Angio-RGD经尾静脉注射后，体内的肿瘤和周围正常脑组织的近红外荧光强度如图所示，注射剂量0.4mg/mouse，X射线/近红外荧光叠加图像清晰的显示出纳米影像药物在颅骨内的分布。

图12：正常小鼠(上排)与荷瘤小鼠(下排)在注射目标药物Den-Angio-RGD后各个时间点脑部T1-加权磁共振影像图，

正常与荷瘤小鼠大脑在纳米影像药物Den-Angio-RGD注射前和注射后10min，2h和24h代表性的T1加权磁共振图像(1.2mg/mouse，相当于0.05mmol[Gd³⁺]/mouse)如图所示(上排箭头标示处为大脑皮层，下排箭头标示处为肿瘤，H&E图片显示肿瘤边缘，标尺长度为200μm)，荷瘤小鼠注射目标影像药物Den-Angio-RGD 10分钟后即可在肿瘤区域观察到信号增强，2小时后更加明显，而且所显示肿瘤边缘与H&E染色结果相吻合。

图13：荷瘤小鼠激光共聚焦荧光显微镜图像

共聚焦荧光显微镜图像显示，Den-Angio-RGD比Den-RGD显示出更好的脑肿瘤成像能力，图片显示的是脑部种植有U87MG肿瘤的荷瘤裸鼠在尾静脉注射(4nmol/mouse)Den-RGD(上排)和Den-Angio-RGD(下排)24h后的荧光显微镜图片，罗丹明标记的探针显示出红色荧光，用来技术细胞核的DAPI染色显示出蓝色荧光，组织切片的核染色有助于界定肿瘤和正常脑组织的边界。

图14：目标影像药物和参比影像药物两种探针的合成路线，

A：参比纳米影像药物Den-RGD，B：目标纳米影像药物Den-Angio-RGD。

具体实施方式

通过下述实施例将有助于进一步理解本发明，但并不限制本发明的内容。

实施例1

半胱氨酸修饰的多肽Angiopep-2的合成

为了将Angiopep-2连接到G5上，同时也不影响受体结合的特异性，我们用Boc保护的固相多肽合成方法合成了C端修饰有一个半胱氨酸残基Angiopep-2：TFFYGGSRGKRNNFKTEEYC(MW＝2402Da)。得到的整条被保护的线状肽链是

H-Thr(Bzl)-Phe-Phe-Tyr(Br-Z)-Gly-Gly-Ser(Bzl)-Arg(Tos)-Gly-Lys(Cl-Z)-Arg(Tos)-Asn(Xan)-Asn(Xan)-Phe-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Glu(OcHex)-Glu(OcHex)-Tyr(Br-Z)-Cys(PMeBzl)-OH。用HF脱保护，并用制备型HPLC纯化、冻干。产物的纯度通过分析型HPLC证实。ESI-MS中有一个单一的802.5[M3+]峰，计算分子量为2404.6[M+H+]。ESI-MS和分析型HPLC结果见附图1、2。C-Angiopep-2的¹H NMR光谱图见附图3。

实施例2

化合物1的合成

3.5mg(1.0×10^-5mol)c[RGDyK]环肽溶于300μL的DMF中，加入6μL三乙胺混匀。快速加入磁力搅拌下的300μL的8.2mg(4.1×10^-6mol)马来酰亚胺-PEG^2k-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Malemide-PEG^2k-NHS)的DMF溶液中。常温下搅拌反应2小时后，形成c[RGDyK]环肽的PEG衍生物。

实施例3

化合物2的合成

将以上反应液直接加入1.0mL含有11.6mg(4×10^-7mol)的树枝状大分子G5的1X PBS(pH 7.4)溶液中。常温下搅拌1h后，形成化合物2，用分子量10kDa的离心式过滤管进行超滤纯化(4000rpm，30min×3)。G5、PEG和RGD之间的摩尔比通过它们在化合物2的¹H NMR光谱中的积分来计算。每个G5分子上标记了约6个c[RGDyK]环肽。化合物2的¹H NMR光谱图见附图4。

实施例4

化合物3的合成

0.4mg(8×10^-7mol，2.0equiv.)的罗丹明-N-羟基琥珀酰亚胺酯和1.2mg(8.0×10^-7mol，2.0equiv)的Cy5.5-N-羟基琥珀酰亚胺酯溶解在50μL无水的DMF中，然后缓慢逐滴加入1.0mL的化合物2的0.1M HEPES溶液(pH 8.3)。常温下搅拌1h，产物用分子量10kDa的离心式过滤管进行超滤纯化，并浓缩到2.0mL 0.5M的HEPES中(pH 8.3)。50.7mg(5.12×10^-5mol，128equiv.)DOTA-N-羟基琥珀酰亚胺酯白色粉末逐渐加入到上述溶液中，并监测溶液的pH值。整个过程中用5.0M NaOH溶液使溶液pH值控制在8.5左右。常温下避光搅拌3h后，混合物经超滤纯化最后得到c[RGDyK]环肽、罗丹明、Cy5.5和DOTA修饰的树枝状大分子的紫色溶液。每个G5分子上标记了约94个DOTA螯合剂。另外，平均有1.4个罗丹明和1.1个Cy5.5标记到化合物3分子上。化合物3的¹H NMR光谱图见附图5。

实施例5

化合物4的合成

12.7mg Gd₂(CO₃)₃(6×10^-5mol，64equiv.)加入到溶于2mL 0.1M HEPES(pH 8.3)溶液的化合物3中。此悬浊液在60℃下避光搅拌12h。过量Gd₂(CO₃)₃经离心沉淀(2000rpm，8分钟)，然后上清液用分子量10kDa超滤管纯化，最后获得Den-RGD化合物，产率大约为92％(根据G5来计算)。

实施例6

化合物5的合成

2.1mg(6.8×10^-6mol，1.3equiv)的SPDP[N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯]溶于300μL的DMF中，缓慢逐滴加入1.0mL的10.4mg(5.2×10^-6mol)NH₂-PEG^2k-Malemide(氨基-PEG^2k-马来酰亚胺)的1X PBS(pH 7.4)溶液中。常温下反应45分钟后，得到化合物5。

实施例7

化合物6的合成

将以上反应液直接加入1.0mL的17.4mg(4×10^-7mol)的化合物3的1X PBS(pH 7.4)中。常温下搅拌1h后，经超滤纯化得到化合物6。G5 dendrimer和PEG之间的摩尔比通过它们在化合物6的¹H NMR光谱中的积分来计算。化合物6中SPDP的标记个数通过DTT实验来定量。此过程中，过量的DTT加入化合物6的PBS溶液中，搅拌15分钟，测量上述溶液在343nm处的吸光度。SPDP和G5 dendrimer之间的摩尔比通过公式R＝ΔA₃₄₃/8080×C_dendrimer来计算，R代表摩尔比，ΔA₃₄₃代表DTT加入前后343nm处吸光度的变化，C_dendrimer代表G5的摩尔浓度，数值8080代表吡啶-2-硫酮在343nm处的消光系数。经计算，平均每个dendrimer上标记有8个SPDP。化合物6的¹H NMR光谱图见附图6。

实施例8

化合物7的合成

0.4mg(8×10^-7mol，2.0equiv.)的罗丹明-N-羟基琥珀酰亚胺酯和1.2mg(8.0×10^-7mol，2.0equiv)Cy5.5-N-羟基琥珀酰亚胺酯溶解在50μL无水的DMF中，然后缓慢逐滴加入1.0mL化合物6的0.1M HEPES溶液(pH 8.3)。常温下搅拌1h，荧光基团标记产物经超滤纯化并浓缩到约2.0mL 0.5M的HEPES中(pH 8.3)。50.7mg(5.12×10^-5mol，128equiv.)DOTA-N-羟基琥珀酰亚胺酯逐渐加入到上述溶液中，并将溶液pH值控制在8.5左右。常温下避光搅拌3h后(或者过夜)，混合物经超滤纯化得到c[RGDyK]环肽、罗丹明、Cy5.5和DOTA修饰的树枝状大分子7紫色溶液。经计算，平均每个G5分子上标记了约94个DOTA。另外，平均有1.4个罗丹明和1.1个Cy5.5标记到一个化合物7分子上。化合物7的¹H NMR光谱图见附图7。

实施例9

化合物8的合成

溶解有12mg(5.2×10^-6mol，13equiv.)半胱氨酸修饰的多肽angiopep-2(C-Angiopep-2)的DMF溶液加入化合物7(in 2mL PBS)中。室温下避光搅拌过夜。经超滤纯化后，加入12.7mg Gd₂(CO₃)₃(6×10^-5mol，64equiv.)。此悬浊液在60℃下避光搅拌12h。过量Gd₂(CO₃)₃离心沉淀(2000rpm，8分钟)，然后上清液经超滤纯化获得目标化合物Den-Angio-RGD 8，产率大约为92％(根据G5来计算)。

Den-Angio-RGD的¹H NMR光谱图见附图8。

实施例10

对纳米影像药物的流体动力学粒径分布和Zeta电位的测定

目标纳米影像药物Den-Angio-RGD和参比影像药物Den-RGD的流体动力学半径是在室温下用动态光散射的方法测定的。用溶于蒸馏水的2.0mg/ml的牛血清白蛋白标准溶液进行设备校准。样品用0.45μm的滤头过滤并用pH 7.4的1X PBS稀释到100g/mL。流体动力学半径和大小分布通过规则化的公式进行运算。在测定纳米影像药物的表面电荷时，设备用一种Zeta电位为-50mV的标准溶液校准。纳米影像药物溶液用0.45μm的滤头过滤并用10mM的NaCl溶液稀释到200g/mL。

Den-Angio-RGD和Den-RGD的平均直径是15.6nm和13.2nm，平均Zeta电位是+8.6和+11.6mV。

纳米影像药物的流体动力学粒径分布和Zeta电位见附图9。

实施例11

用ICP-AES测定纳米影像药物中的Gd³⁺含量

纳米影像药物Den-Angio-RGD和Den-RGD中的Gd³⁺含量用Hitachi P-4010model ICP-AES(Inductively Coupled Plasma Atomic Emission Spectroscopy，电感耦合等离子体发射光谱仪)进行测定，射频能量为1100W，喷雾器气流速度为0.9L/min。准备好用3％硝酸溶解的Gd³⁺浓度分别为1，5，10，20，50，100，200ppm的标准溶液，标绘相应的色谱峰来绘制标准曲线以对应Gd³⁺含量。0.1mM的纳米影像药物母液用3％的硝酸稀释100倍。样品的Gd³⁺含量通过将探测到的Gd³⁺峰和标准曲线对照而得到。实验结果显示，Gd³⁺-DOTA螯合剂在纳米影像药物Den-Angio-RGD和Den-RGD中的含量均平均达95个。

实施例12

检测纳米影像药物的驰豫率

纳米影像药物Den-Angio-RGD和Den-RGD和商品化的磁共振造影剂Gd³⁺-DOTA的纵向驰豫率根据方程r_1p＝(1/T_sample-1/T_PBS)/[Gd].来计算。PBS和所选择的化合物的四种不同浓度的PBS溶液(pH 7.4)的T1值在室温下于4.7T的磁共振上测定。根据ICP-AES测定的Gd³⁺浓度描绘出纳米影像药物的(1/T_sample-1/T_PBS)值，从而得出纳米影像药物的驰豫率。Gd³⁺-DOTA，Den-Angio-RGD和Den-RGD的纵向驰豫率分别为4.7，6.9and7.4mM^-1s^-1。

实施例13

体外细胞毒性实验

1.细胞培养人源脑肿瘤U87MG细胞在75-cm²培养瓶中单层培养，即用加有10％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺、1％青/链霉素(Invitrogen，Carlsbad，CA)的Alpha 1X培养基(MEM，Mediatech，Manassas，VA)，置于有充分湿气的含5％CO₂的37℃培养箱中培养。当细胞长满80％的面积时可以消化收集，以使细胞保持在指数增长状态。

2.体外细胞毒性实验MTT细胞增殖实验用来测定用纳米影像药物和未修饰的G5对照处理后的细胞的活力。处于指数增长期的细胞单层用0.25％胰酶消化收集，得到单细胞悬液。用血细胞计数器和普通光学显微镜(OLYMPUS BH-2)来计数细胞。优化细胞数量以使得在整个MTT实验中，细胞处于指数增长期。因此，用适量细胞培养液重悬细胞，在96孔板的每个孔中加入含有约2×10³个细胞的100μL单细胞悬液。每个浓度准备了8个复孔。细胞贴壁24小时后，用纳米影像药物Den-Angio-RGD或Den-RGD来处理这些细胞。样品溶液用

的0.22μm注射器式滤器过滤除菌，并且终浓度的梯度范围在0.05-10μM。在37℃，5％CO₂的培养箱中培养4天后，细胞用PBS冲洗干净，然后用MTT来测定细胞的活力。用纳米影像药物和G5处理过的细胞的活力用未处理过的细胞的值来进行标准化。

细胞毒性实验曲线见附图10。

实施例14

小鼠模型和肿瘤原位种植

所有的动物实验都依照复旦大学伦理委员会评估和认可的指南进行。野生型人类U87MG胶质母细胞瘤细胞(1.0×10⁶细胞重悬于5μL PBS)在有小鼠衔接器的立体定位仪的协助下被接种到裸鼠的右侧纹状体(前囟点旁开1.8mm，往前0.6mm，深3mm)。接种后14-18天，颅内肿瘤长到直径0.2-0.5mm大小，可以用来进行显像实验。

实施例15

活体和离体的近红外光学成像研究

活体光学成像研究通过柯达公司的小动物活体显像系统获取。入射光滤光片为630-660nm，而发射谱带通滤色片为6800-720nm。成像前，小鼠用氯胺酮(25mg/kg)和乙酰丙嗪(2.5mg/kg)的混合麻醉剂麻醉，并固定在成像板上。在相同视野下(FOV＝12.8cm，f/stop＝4，Bin＝high resolution)得到X线成像(曝光时间30ms)，白光成像(曝光时间0.2s)和近红外荧光成像(曝光时间2s)。小鼠在注射4.0nmol的纳米药物(基于G5的摩尔数)前及注射后选定的时间点分别收集X线成像和近红外荧光成像。X-ray成像用于对颅骨的定位。活体光学成像完成后，小鼠被处死并用PBS和PFA进行灌流。小鼠的大脑被小心地剥离出来，而主要的脏器包括心、肝、脾、肺、肾和肌肉则用组织切片器(Braintree ScientificInc.，Braintree，MA)切成约厚1-2mm薄片。荧光显微镜下肿瘤和周围正常脑组织的荧光强度由ImageJ软件(National Institutes of Health，Bethesda，MD)定量。

正常小鼠(左图)与荷瘤小鼠(右图)注射目标影响药物Den-Angio-RGD 24h后活体光学成像图见附图11。

实施例16磁共振成像

活体磁共振成像是在Bruker Biospec 47/30磁共振仪上获取。实验前，将自制的三通导管埋入小鼠尾静脉，该导管系统通过T形接头(Cole-Parmer，Vernon Hills，IL)进行调节。小鼠通过异氟烷(0.5-2％)及氧气混合气体予以麻醉。麻醉后的小鼠头部被固定在自制的表面线圈中。小鼠在磁体线圈中的体温通过水浴加热进行维持，呼吸则通过Bruke PhysioGard系统进行持续监控。每只小鼠从尾静脉注射0.05mmol/kg[Gd³⁺]，总共0.25mL体积的纳米影像药物PBS溶液。采集注射前、后脑部动态T1加权像(自旋回波脉冲序列，视野(FOV)2cm×2cm，矩阵128×128，TR＝300ms，TE＝11ms，NA＝8)。三维T1加权像用一个快速小角度激发成像序列(FLASH)来获得，flip angle＝45°，FOV＝1.5cm×1.5cm×1.5cm，矩阵128×128×32，TR＝35ms，TE＝6.2ms，NA＝8。目标区域(ROI)在不同时间点的增强强度(IE)通过以下公式表示IE＝(RI(t)-RI(0))/RI(0)×100％，其中，RI(t)对应于在各个时间点测定的标准化的信号强度，而RI(0)是纳米影像药物注射前标准化的信号强度。时间依赖的肿瘤和周围正常脑组织之间的荧光强度比(T/N比值)用纳米影像药物注射前的值进行标准化。

正常小鼠(上排)与荷瘤小鼠(下排)注射目标影像药物Den-Angio-RGD后在各个时间点脑部T1-加权磁共振成像图片见附图12(上排箭头标示处为大脑皮层，下排箭头标示处为肿瘤，H&E图片显示肿瘤边缘)。

实施例17共聚焦显微镜成像

体内成像研究后，小鼠大脑被小心地剥离出来并浸在4％PFA中12h。固定的大脑接着被放入30％的蔗糖溶液中脱水至沉底，然后切成15μm厚的冰冻切片。切片被包埋并用LeicaTCS SP2激光共聚焦显微镜(Leica Inc.，Wetzlar，Germany)观察，所用的镜头是HCXPL APOCS 40×1.25 oil immersion lens和HCPL APO CS 10×0.40 immersion lens。罗丹明用543nm激光激发，发射光则用560nm带通滤色片的光电倍增管检测。同时，用405nm激光激发DAPI，发射光则用具有490nm二色分光镜和420-480nm带通滤色片的二级光电倍增管检测。同时，共聚焦Z轴方向进行了0.8μm厚的扫描。

激光共聚焦荧光显微镜图像见附图13。

实施例18组织学成像

用纳米影像药物处理过的小鼠大脑被离体并浸没在formalin和PFA的混合液中(体积1∶9混合)固定适当时间。固定好的组织用石蜡包埋并切成3-4μm厚。切片进行H&E染色，并用Leica MZ75高性能立体显微镜2.5X和5.0X的物镜观察。

Claims (10)

1.一种用于脑肿瘤诊断的跨血脑屏障靶向多模态纳米药物，其特征在于，由树枝状高分子作为载体，与Angiopep-2肽链和c[RGDyK]环肽连接制成跨血脑屏障靶向多模态纳米药物，其结构为：Den-(NIRP)_x-(MRICA)_y-(PEG-c[RGDyK])_z-(PEG-Angiopep-2)_v；。

其中，Den为影像药物载体的树枝状高分子；

NIRP为荧光基团，x代表标记在载体上荧光基团数目；NIRP以酰胺键形式标记到所述树枝状高分子上；

MRI CA为T1加权顺磁性基团，y代表标记在载体上顺磁性基团数目；CA以酰胺键形式标记到树枝状高分子上；

PEG为聚乙二醇，c[RGDyK]环肽及Angiopep-2肽通过双功能化PEG桥连到树枝状高分子上；z代表载体上PEG-c[RGDyK]标记数目，v代表载体上PEG-Angiopep-2标记数目。

2.按权利要求1所述的用于脑肿瘤诊断的跨血脑屏障靶向多模态纳米药物，其特征在于，所述的树枝状高分为2-8代的聚酰胺树枝状高分子；

所述的荧光基团选自荧光素，罗丹明，IR783或Cy5.5；

所述的MRI CA选自Gd-DOTA或Gd-DTPA。

3.按权利要求1所述的用于脑肿瘤诊断的跨血脑屏障靶向多模态纳米药物，其特征在于，所述的用于桥连多肽的双功能化PEG的两端分别是N-羟基琥珀酰亚胺酯和马来酰亚胺；用于桥连Angiopep-2的双功能化PEG的两端分别是伯胺基和马来酰亚胺。

4.按权利要求3所述的用于脑肿瘤诊断的跨血脑屏障靶向多模态纳米药物，其特征在于，PEG上的马来酰亚胺与树枝状高分子上伯胺基反应得到Den-PEG中间产物。

5.按权利要求3所述的用于脑肿瘤诊断的跨血脑屏障靶向多模态纳米药物，其特征在于，

所述的c[RGDyK]环肽上的伯氨基与PEG上的N-羟基琥珀酰亚胺酯反应得到PEG-c[RGDyK]；PEG上的马来酰亚胺与树枝状高分子上伯胺基反应得到通过PEG桥连的Den-PEG-c[RGDyK]化合物。

6.按权利要求3所述的用于脑肿瘤诊断的跨血脑屏障靶向多模态纳米药物，其特征在于，

所述的PEG上伯胺基与3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯反应得到修饰有吡啶二巯基的PEG。

7.按权利要求1所述的用于脑肿瘤诊断的跨血脑屏障靶向多模态纳米药物，其特征在于，

所述的Angiopep-2肽的氨基酸序列为TFFYGGSRGKRNNFKTEEY，在其肽链C端引入半胱氨酸得到序列为TFFYGGSRGKRNNFKTEEYC的肽链，该肽链半胱氨酸上的巯基与标记在树枝状高分子上的2-吡啶二巯基缩合得到通过PEG桥连的Den-PEG-Angiopep-2化合物。

8.按权利要求1所述的用于脑肿瘤诊断的跨血脑屏障靶向多模态纳米药物，其特征在于，所述的纳米药物Den-Angio-RGD和Den-RGD的流体动力学粒径分布和Zeta电位分别为：平均直径是15.6nm和13.2nm，平均Zeta电位是+8.6和+11.6mV。

9.按权利要求1所述的用于脑肿瘤诊断的跨血脑屏障靶向多模态纳米药物，其特征在于，所述的脑肿瘤是毛细胞型星形细胞瘤(I级)；低度弥漫型星形细胞瘤(II级)；间变型星形细胞瘤(III级)及多型性胶质母细胞瘤(IV级)。

10.按权利要求1所述的用于脑肿瘤诊断的跨血脑屏障靶向多模态纳米药物，其特征在于，标记在纳米药物上的c[RGDyK]环肽特异性识别脑血管内皮细胞和脑胶质瘤细胞上高表达的整合素蛋白α_Vβ₃受体；Angiopep-2特异性识别脑血管内皮细胞和脑胶质瘤细胞上低密度脂蛋白相关受体。

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