CN103505746A - 一种胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂及其制法，该对比剂由丙烯酰胺类单体、带有巯基或羧基或氨基的烯丙基类单体、超顺磁性铁氧化物纳米粒、荧光染料和乳铁蛋白组成，其中，丙烯酰胺类单体与带有巯基或羧基或氨基的烯丙基类单体通过聚合反应形成共聚物纳米凝胶，在聚合反应过程中加入超顺磁性铁氧化物纳米粒获得超顺磁性共聚物纳米凝胶。将荧光染料与乳铁蛋白以共价键进行结合获得标记有荧光染料的乳铁蛋白，再将上述超顺磁性共聚物纳米凝胶与标记有荧光染料的乳铁蛋白通过共价键结合获得本发明的胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂，具有特异性、选择性、对比效果好、毒副作用低和双模式成像等特点。
Description
技术领域
本发明涉属于学检验和生物技术领域，涉及胶质瘤靶向磁共振和荧光成像对比剂，具体涉及胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂及制备方法。
背景技术
胶质瘤是脑内最常见的原发性恶性肿瘤，据统计，我国胶质瘤每年新发病例4-13万人，恶性程度高，占全身恶性肿瘤致死率中第四位。目前，胶质瘤的首选治疗方法仍为手术，但临床实践显示，手术难以完全切除，且致残率高，严重影响患者生活质量及生存率。研究表明，造成这一现象的重要原因在于：①胶质瘤的术前诊断缺乏特异性，不能准确分辨细小肿瘤；②胶质瘤切除时缺乏术中引导，由于胶质瘤具有浸润性，无法准确界定肿瘤边界，无法准确切除。因此，如何在术前诊断中特异性显示胶质瘤生物学特性，在术中准确界定胶质瘤的边界，引导手术切除，提高疗效，是当前临床工作需要急迫解决的课题，也是目前有关胶质瘤研究中的热点和难点。
磁共振(MRI)作为一种新型无创检查技术，能安全有效地呈现人体组织及器官的结构及功能形态，已经成为胶质瘤诊断的首选方法。临床应用中，约超过30％的病例需要使用磁共振成像对比剂来接受增强扫描。该方法可以有效提高成像对比度，使原来缺乏对比差异的组织结构显示得更加清晰，从而更好的显示体内组织器官的结构和病变的性质及功能状态，能够大大提高诊断的准确性和灵敏度。超顺磁性氧化铁对比剂可以提高病变组织与正常脑组织的对比度，与传统的钆类对比剂相比，具有磁饱和强度高、弛豫率高和生物相容性好的优点，可被人体正常代谢，对组织无毒副作用。但普通超顺磁性氧化铁对比剂主要被网状内皮系统所识别，被吞噬细胞摄取，沉积在网状内皮细胞丰富的组织和器官中，缺乏对肿瘤组织特别是胶质瘤的靶向性。此外，普通超顺磁性氧化铁对比剂容易团聚，在生理环境下稳定性较差。因此，采用诸如纳米凝胶在内的共聚物包裹超顺磁性氧化铁对比剂，提高其稳定性；并偶联靶向分子，提供主动靶向能力是一种有效方法。
荧光成像是指利用能在特定波长的激发光激发下产生荧光的物质(如量子点、荧光纳米颗粒和荧光染料等)或以荧光素酶以及荧光素组成的荧光报告对作为识踪标记，利用光学检测仪器，通过监控生物个体内荧光报告物质的变化情况实现对目标对象的实时、原位检测。荧光成像更能反映生物组织的实际情况且不必对生物体造成伤害，从而可用于对肿瘤组织、生理病变过程、药物体内分布和作用进行分析和监测。荧光成像检测灵敏度高，生物组织分辨率高，且因不涉及放射性物质和方法，安全性良好。目前，已有研究利用荧光成像引导手术进行并已经尝试在临床上使用。
胶质瘤靶向的配体主要是通过与胶质瘤细胞受体特异性结合，以受体介导机制协助其修饰的载体或其他系统定向运输至肿瘤部位。乳铁蛋白是一种多功能的蛋白质。已经有文献报 道乳铁蛋白能通过单向受体介导的转胞作用通过血脑屏障。有证据表明脑微血管内皮细胞上有乳铁蛋白的结合位点，乳铁蛋白修饰的外源性基因在整个大脑均有表达。同时，乳铁蛋白偶联的基因载体在脑部有较高的累积。
当前，磁共振和荧光双模式成像对比剂已得到广泛研究，在生物学和医学领域发挥了重要的作用，具有很好的应用前景，但仍有发展和完善的空间。(1)对比剂的稳定性不足，容易团聚。(2)对比剂粒径较大，容易发生非特异性吸附和吞噬。(3)磁性材料与荧光材料之间存在相互干扰，导致荧光容易淬灭。(4)靶向分子特异性不足，无法有效到达肿瘤部位。
发明内容
本发明的任务是提供一种胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂，并提供该对比剂的其制备方法。
实现本发明任务的技术方案是：
本发明提供的胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂，是超顺磁性共聚物纳米凝胶和标记有荧光染料的乳铁蛋白的共价键结合物。
所述的超顺磁性共聚物纳米凝胶，是由丙烯酰胺类单体与带有巯基或羧基或氨基的烯丙基类单体进行聚合反应形成共聚物纳米凝胶，并在所述聚合反应过程中加入超顺磁性铁氧化物纳米粒获得的产物，其中所述丙烯酰胺类单体是N-异丙基丙烯酰胺、N-(2-羟丙基)丙烯酰胺、聚丙烯酰吗啉、N-(3-羟丙基)-丙烯酰胺、聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸酯、2-甲基丙烯酰氧基-乙基磷酸胆碱、2-二甲氨基乙基甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯、2-二异丙氨基乙基甲基丙烯酸酯中的一种，优选N-异丙基丙烯酰胺、N-(2-羟丙基)丙烯酰胺或N-(3-羟丙基)-丙烯酰胺。所述的带有巯基或羧基或氨基的烯丙基类单体是丙烯酸、丙烯胺、甲基丙烯酸、甲基丙烯胺、聚2-乙烯基吡啶、甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯、磺胺嘧啶衍生物中的一种，优选丙烯酸、丙烯胺、甲基丙烯酸或甲基丙烯胺。所述的超顺磁性铁氧化物纳米粒是粒径为8-30nm的超顺磁性三氧化二铁纳米粒或超顺磁性四氧化三铁纳米粒，优选为10-20nm的超顺磁性三氧化二铁纳米粒或超顺磁性四氧化三铁纳米粒。
所述的标记有荧光染料的乳铁蛋白是荧光染料与乳铁蛋白通过共价键结合获得的产物，其中所述的荧光染料为Cy系列荧光染料、异硫氰酸荧光素、羰花青染料荧光染料DiR碘化物、羰花青染料荧光染料DiO高氯酸盐中的一种，优选Cy系列荧光染料或羰花青染料荧光染料DiR碘化物；所述的Cy系列荧光染料是Cy3、Cy5、Cy5.5或Cy7，优选Cy5.5或Cy7。
本发明提供的胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、制备超顺磁性共聚物纳米凝胶：取丙烯酰胺类单体、超顺磁性氧化铁纳米粒、N，N’-亚甲基双丙稀酰胺、十二烷基硫酸钠溶于去离子水中，搅拌并通入氮气，加入过硫酸钾和带有巯基或羧基或氨基的烯丙基类单体，在50-100℃反应4-8小时。将反应物用去离子水透析去除未反应单体，冷冻干燥获得冻干粉，即为超顺磁性共聚物纳米凝胶。再用去离子水复溶，得到浓度为3％(质量/体积)的超顺磁性共聚物纳米凝胶溶液。其中，丙烯酰胺类单体与带有巯基或羧基或氨基的烯丙基类单体的摩尔比为4∶1-40∶1，优选8∶1-20∶1。
步骤二、制备标记有荧光染料的乳铁蛋白：取乳铁蛋白溶于碳酸氢钠水溶液中，向其中 加入荧光染料溶液，混合均匀后避光振荡，然后使用SephadexTM G-50树脂柱分离，获得标记有荧光染料的乳铁蛋白。其中，所用乳铁蛋白的碳酸氢钠溶液浓度范围为0.05-50mg/mL，荧光染料溶液浓度范围为1-50mg/mL，荧光染料与乳铁蛋白摩尔比为0.3∶1-50∶1，优选2∶1-20∶1。
步骤三、制备活化的超顺磁性共聚物纳米凝胶：向步骤(1)获得的浓度为3％(质量/体积)的超顺磁性共聚物纳米凝胶溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，振荡后用磁铁分离，并加入pH＝7.4、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液分散，获得浓度为3％(质量/体积)的活化的超顺磁性共聚物纳米凝胶。其中，带有巯基或羧基或氨基的烯丙基类单体、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1∶1∶1。
步骤四、制备胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂：向步骤(3)获得的活化的超顺磁性共聚物纳米凝胶中加入步骤(2)获得的标记有荧光染料的乳铁蛋白，室温下反应过夜，用磁铁分离，即得本发明胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂。其中，活化的超顺磁性共聚物纳米凝胶中铁元素含量与标记有荧光染料的乳铁蛋白中乳铁蛋白含量的摩尔比为1∶0.01-1∶1，优选1∶0.1-1∶0.5。
上述制备方法步骤一中所述的丙烯酰胺类单体是N-异丙基丙烯酰胺、N-(2-羟丙基)丙烯酰胺、聚丙烯酰吗啉、N-(3-羟丙基)-丙烯酰胺、聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸酯、2-甲基丙烯酰氧基-乙基磷酸胆碱、2-二甲氨基乙基甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯或2-二异丙氨基乙基甲基丙烯酸酯中的一种，优选N-异丙基丙烯酰胺、N-(2-羟丙基)丙烯酰胺、N-(3-羟丙基)-丙烯酰胺中的一种；
上述制备方法步骤一中所述的带有巯基或羧基或氨基的烯丙基类单体为丙烯酸、丙烯胺、甲基丙烯酸、甲基丙烯胺、聚2-乙烯基吡啶、甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯、磺胺嘧啶衍生物中的一种，优选丙烯酸、丙烯胺、甲基丙烯酸或甲基丙烯胺。
上述制备方法的步骤二中所述的超顺磁性铁氧化物纳米粒是粒径为8-30nm的超顺磁性三氧化二铁纳米粒或超顺磁性四氧化三铁纳米粒，优选粒径为10-20nm的超顺磁性三氧化二铁纳米粒或超顺磁性四氧化三铁纳米粒。
上述制备方法的步骤二中所述的荧光染料为Cy系列荧光染料、异硫氰酸荧光素、羰花青染料荧光染料DiR碘化物、羰花青染料荧光染料DiO高氯酸盐中的一种，优选Cy系列荧光染料或羰花青染料荧光染料DiR碘化物；所述的Cy系列荧光染料是Cy3、Cy5、Cy5.5或Cy7，优选Cy5.5、Cy7。
本发明利用丙烯酰胺类单体与带有巯基或羧基或氨基的烯丙基类单体通过聚合反应形成共聚物纳米凝胶，并在反应中加入超顺磁性铁氧化物纳米粒获得超顺磁性共聚物纳米凝胶，再通过共价键结合标记有荧光染料的乳铁蛋白制得。所述共聚物纳米凝胶具有良好的载药能力、稳定性和可修饰性，可以大量载负顺磁性氧化铁纳米粒和荧光染料，并提供比单纯铁氧化物纳米粒更加优越的稳定性和可修饰性。同时，乳铁蛋白与胶质瘤细胞高表达的乳铁蛋白受体具有高亲和力，可以有效实现靶向显影。此外，磁共振和荧光双模式成像不但能够用于胶质瘤诊断，从而可以为胶质瘤提供一体化的术前磁共振诊断、术中荧光引导切除和术后疗效评价。
本发明胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂由丙烯酰胺类单体、带有巯基或羧基或氨基的烯丙基类单体、超顺磁性铁氧化物纳米粒、荧光染料和乳铁蛋白组成，其中，丙烯酰胺类单体与带有巯基或羧基或氨基的烯丙基类单体通过聚合反应形成共聚物纳米凝胶；通过在上述聚合反应过程中加入超顺磁性铁氧化物纳米粒获得超顺磁性共聚物纳米凝胶；同时，将荧光染料与乳铁蛋白通过共价键进行结合获得标记有荧光染料的乳铁蛋白；最后，将上述超顺磁性共聚物纳米凝胶与标记有荧光染料的乳铁蛋白通过共价键结合获得本发明的胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂。
本发明胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂的体外表征：
(1)胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂的形貌与粒径：形貌与粒径利用透射电镜表征。结果显示偶联后的对比剂为球形，分布均匀，粒径为30-500nm，优选50-160nm。
(2)胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂的水合半径与粒径分布：水合半径与粒径分布利用激光粒度仪测定。结果显示偶联后的对比剂水合半径为50-800nm，优选80-200nm，粒径分布窄，无团聚。
(3)胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂的磁学性能：磁饱和强度和超顺磁性利用振动样品磁强计测定。对比剂偶联前后具有超顺磁性，磁饱和强度范围分别为30-200emu/g Fe和30-200emu/g Fe，优选范围分别为60-120emu/g Fe和50-110emu/g Fe。
(4)胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂的磁共振成像能力：将对比剂用水稀释成不同浓度，利用磁共振扫描仪测定不同浓度对比剂的成像能力。结果显示对比剂偶联前后均具有良好的成像能力，随着对比剂浓度增加，可以使磁共振信号值显著降低。
(5)胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂的弛豫率：将对比剂用水稀释成不同浓度，利用磁共振扫描仪测定不同浓度对比剂的弛豫时间(T2)值，计算得到偶联前后对比剂的弛豫率(r2)范围为100-300mM-1s-1，优选110-200mM-1s-1。
(6)胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂的荧光发射光谱：荧光光谱通过荧光分光光度计测定。结果显示偶联后对比剂具有与荧光染料标记乳铁蛋白相似的发射峰，表明具有荧光，并证实了偶联步骤。
(7)胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂的荧光成像能力：荧光成像能力通过IVIS小动物成像系统测定。结果显示偶联后的对比剂具有荧光成像的能力，随着对比剂浓度增加，荧光信号强度显著增大。
本发明的有益效果通过以下动物实验表明：
实验动物：Wistar大鼠，湖北预防医学科学院提供，体重200-300g，雄性。
设备：GE 3.0T Signa HDxt磁共振成像系统
(1)大鼠胶质瘤模型的建立：在大鼠前囟右偏3毫米，前偏1毫米的的位置将颅骨钻开，利用立体定位仪将1×106个细胞注入该位置，约10天后瘤直径达到(5mm×5mm)用于动物实验。
(2)实验动物磁共振和荧光成像：大鼠肿瘤模型9只，随机分为3组，一组为空白组，尾静脉注射生理盐水；一组为实验组，尾静脉注射经生理盐水稀释的本发明对比剂，按照12mg Fe/kg体重注射；一组为对照组，尾静脉注射相同剂量的偶联前对比剂，分别在注射前和注射后不同时间点进行磁共振扫描。磁共振扫描后，立即处死大鼠，进行肿瘤荧光成像和拍照。
(3)组织病理分析：大鼠处死后，取脑组织进行组织病理分析，H&E染色用于判定胶质瘤组织，普鲁士蓝染色用于证实铁颗粒的存在。
结果显示，注射本发明胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂后，从注射后6小时起，肿瘤区域的磁共振信号变化明显。在注射后6小时至48小时内，信号变化的程度和范围都显著扩大。胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂能够达到特异性靶向肿瘤的要求。
本发明利用丙烯酰胺类单体与带有巯基或羧基或氨基的烯丙基类单体通过聚合反应形成共聚物纳米凝胶，并在反应中加入超顺磁性铁氧化物纳米粒获得超顺磁性共聚物纳米凝胶，再通过共价键结合标记有荧光染料的乳铁蛋白制得。提供了一种特异性、选择性、对比效果好、毒副作用低的胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂，可以实现胶质瘤靶向的一体化术前磁共振诊断、术中荧光引导切除和术后疗效评价。本发明提供的对比剂显示出以下优势：
(1)与传统钆类对比剂和超顺磁性铁氧化物对比剂相比，本发明中形成的共聚物纳米凝胶是尺度范围在1-1000nm内的聚合物三维网络，由于网络中富含大量的水，因此本发明具有良好的生物相容性。
(2)与传统超顺磁性铁氧化物对比剂和现有文献报告的双模式成像对比剂相比，本发明能够极大地提高稳定性(形成的共聚物纳米凝胶网络可以阻止铁氧化物纳米粒聚集)，特别是生理条件下的稳定性。从而实现稳定地载负大量铁氧化物纳米粒，提高成像能力。
(3)与传统超顺磁性铁氧化物对比剂相比，本发明中形成的共聚物纳米凝胶富含可修饰位点(羧基或巯基或氨基)，能方便、容易地修饰、偶联靶向分子乳铁蛋白，从而赋予该对比剂对胶质瘤的靶向性。
(4)对比剂载负的荧光染料具有灵敏度高、荧光强度高和抗漂白性能强的优点，能够有效应用于体内。
本发明提供了一种胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂及其制备方法。所述对比剂由丙烯酰胺类单体、带有巯基或羧基或氨基的烯丙基类单体、超顺磁性铁氧化物纳米粒、荧光染料和乳铁蛋白组成，其中，丙烯酰胺类单体与带有巯基或羧基或氨基的烯丙基类单体 通过聚合反应形成共聚物纳米凝胶；通过在上述聚合反应过程中加入超顺磁性铁氧化物纳米粒获得超顺磁性共聚物纳米凝胶；同时，将荧光染料与乳铁蛋白通过共价键进行结合获得标记有荧光染料的乳铁蛋白；最后，将上述超顺磁性共聚物纳米凝胶与标记有荧光染料的乳铁蛋白通过共价键结合获得本发明的胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂。该对比剂中的共聚物纳米凝胶具有良好的载药能力、稳定性和可修饰性，可以实现高含量的超顺磁性氧化铁纳米粒和荧光染料载负，并提供比单纯氧化铁纳米粒更加优越的稳定性和可修饰性。同时，乳铁蛋白与胶质瘤细胞高表达的乳铁蛋白受体具有高亲和力，可以有效实现靶向显影。此外，磁共振和荧光双模式成像不但能够用于胶质瘤诊断，还可以在胶质瘤切除手术中提供荧光引导。基于上述优点和特性，本发明提供一种特异性、选择性、对比效果好、毒副作用低的胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂，可以为胶质瘤提供一体化的术前磁共振诊断、术中荧光引导切除和术后疗效评价。
附图说明
图1为胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂的透射电镜结果图。显示对比剂为球形，分散均一，粒径为86.4±3.4nm。
图2为胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂的水合半径分布图。显示对比剂的水合半径为95.5±6.2nm，粒径分布窄。
图3为胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂的稳定性结果。显示对比剂在模拟生理环境的缓冲液中，稳定性良好，没有发生团聚现象。
图4为胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂的磁学性能结果图，图中曲线1为偶联前超顺磁性纳米凝胶(即偶联前的对比剂)，曲线2为偶联后超顺磁性纳米凝胶(即本发明胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂)。显示对比剂偶联前后具有超顺磁性，磁饱和强度分别为67.9emu/g Fe和61.5emu/g Fe。
图5为胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂的磁共振成像结果图，图中第一排为偶联前超顺磁性纳米凝胶(即偶联前的对比剂)，第二排为偶联后超顺磁性纳米凝胶(即本发明胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂)。显示对比剂偶联前后均具有良好的磁共振成像能力，随着对比剂浓度增加，磁共振信号显著降低。
图6为胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂的弛豫率结果图，图中直线1为偶联前超顺磁性纳米凝胶(即偶联前的对比剂)，直线2为偶联后超顺磁性纳米凝胶(即本发明胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂)。显示对比剂偶联前后弛豫率分别为142.7mM-1s-1和129.3mM-1s-1。
图7为胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂的荧光发射光谱图，图中曲线1为标记有荧光染料Cy5.5的乳铁蛋白，曲线2为偶联后超顺磁性纳米凝胶(即本发明胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂)，曲线3为偶联前超顺磁性纳米凝胶(即偶联前的对比剂)。显示显示对比剂具有与荧光染料相同的荧光发射光谱，表明具有荧光。
图8为胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂的荧光成像结果图，图中第一排为偶联前超顺磁性纳米凝胶(即偶联前的对比剂)，第二排为偶联后超顺磁性纳米凝胶(即本发明胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂)。显示对比剂偶联后具有良好的荧光成像能力，随 着对比剂浓度增加，荧光信号显著增大。
图9为不同时间点时胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂在胶质瘤大鼠体内磁共振成像结果图。其中：
第一行(A-F)为生理盐水注射胶质瘤大鼠的体内结果图。显示注射前后肿瘤区域磁共振信号随时间无明显改变。
第二行(G-L)而偶联后对比剂注射胶质瘤大鼠的体内结果图。显示注射前后肿瘤区域磁共振信号随时间明显改变，在时间范围内，随时间延长信号值改变明显，范围增大。
第三行(M-R)为偶联前对比剂注射胶质瘤大鼠的体内结果图。显示注射前后肿瘤区域磁共振信号随时间无明显改变。
图10为胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂在胶质瘤大鼠体内荧光成像结果图。其中：
第一行(A，B)为生理盐水注射胶质瘤大鼠的体内结果图。显示注射前后肿瘤区域荧光信号无明显改变。
第二行(C，D)为偶联后超顺磁性纳米凝胶(即本发明胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂)注射胶质瘤大鼠的体内结果图。显示注射前后肿瘤区域荧光信号明显改变，肿瘤边界清晰可见。
第三行(E，F)为偶联前超顺磁性纳米凝胶(即偶联前的对比剂)注射胶质瘤大鼠的体内结果图。显示注射前后肿瘤区域荧光信号无明显改变。
图11为胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂注射后胶质瘤大鼠脑组织切片组织病理分析结果图(H&E染色)。其中：
A为注射生理盐水。显示为胶质瘤组织，但无边界。
B为注射偶联后超顺磁性纳米凝胶(即本发明胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂)。显示为胶质瘤组织，可见边界。
C为注射偶联前超顺磁性纳米凝胶(即偶联前的对比剂)。显示为胶质瘤组织，但无边界。
图12为为胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂注射后胶质瘤大鼠脑组织切片组织病理分析结果图(普鲁士蓝染色)。其中：
A为注射生理盐水。显示胶质瘤组织中无明显铁颗粒存在。
B为注射偶联后超顺磁性纳米凝胶(即本发明胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂)。显示胶质瘤组织中有大量铁颗粒存在。
C为注射偶联前超顺磁性纳米凝胶(即偶联前的对比剂)。显示胶质瘤组织中仅有少量铁颗粒存在。
具体实施方式
实施例1
一种胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂及其制备
(1)制备超顺磁性共聚物纳米凝胶：取N-(3-羟丙基)-丙烯酰胺、10nm超顺磁性三氧化二铁纳米粒、N，N’-亚甲基双丙稀酰胺、十二烷基硫酸钠溶于去离子水中，搅拌并通入氮气，加入过硫酸钾和甲基丙烯酸，在50-100℃反应4-8小时。其中，N-(3-羟丙基)-丙烯酰胺与甲 基丙烯酸的摩尔比为8∶1。将反应物用去离子水透析去除未反应单体，冷冻干燥获得冻干粉，即为超顺磁性共聚物纳米凝胶。再用去离子水复溶，得到浓度为3％(质量/体积)的超顺磁性共聚物纳米凝胶溶液。
(2)制备标记有荧光染料的乳铁蛋白：取乳铁蛋白溶于碳酸氢钠水溶液中，向其中加入Cy7溶液，混合均匀后避光振荡，然后使用SephadexTM G-50树脂柱分离，获得标记有荧光染料的乳铁蛋白。其中，所用乳铁蛋白的碳酸氢钠溶液浓度范围为0.05mg/mL，Cy7溶液浓度范围为1mg/mL，Cy7与乳铁蛋白摩尔比为2∶1。
(3)制备活化的超顺磁性共聚物纳米凝胶：向步骤(1)获得的浓度为3％(质量/体积)的超顺磁性共聚物纳米凝胶溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，其中，甲基丙烯酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1∶1∶1。振荡后用磁铁分离，并加入pH＝7.4、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液分散，获得浓度为3％(质量/体积)的活化的超顺磁性共聚物纳米凝胶。
(4)制备胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂：向步骤(3)获得的活化的超顺磁性共聚物纳米凝胶中加入步骤(2)获得的标记有荧光染料的乳铁蛋白，其中，活化的超顺磁性共聚物纳米凝胶中铁元素含量与标记有荧光染料的乳铁蛋白中乳铁蛋白含量的摩尔比为1∶0.1。室温下反应过夜，用磁铁分离，即得本发明胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂。
实施例2
一种胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂及其制备
(1)制备超顺磁性共聚物纳米凝胶：取N-异丙基丙烯酰胺、10nm超顺磁性四氧化三铁纳米粒、N，N’-亚甲基双丙稀酰胺、十二烷基硫酸钠溶于去离子水中，搅拌并通入氮气，加入过硫酸钾和丙烯酸，在50-100℃反应4-8小时。其中，N-异丙基丙烯酰胺与丙烯酸的摩尔比为10∶1。将反应物用去离子水透析去除未反应单体，冷冻干燥获得冻干粉，即为超顺磁性共聚物纳米凝胶。再用去离子水复溶，得到浓度为3％(质量/体积)的超顺磁性共聚物纳米凝胶溶液。
(2)制备标记有荧光染料的乳铁蛋白：取乳铁蛋白溶于碳酸氢钠水溶液中，向其中加入Cy5.5溶液，混合均匀后避光振荡，然后使用SephadexTM G-50树脂柱分离，获得标记有荧光染料的乳铁蛋白。其中，所用乳铁蛋白的碳酸氢钠溶液浓度范围为10mg/mL，Cy5.5溶液浓度范围为10mg/mL，Cy5.5与乳铁蛋白摩尔比为10∶1。
(3)制备活化的超顺磁性共聚物纳米凝胶：向步骤(1)获得的浓度为3％(质量/体积)的超顺磁性共聚物纳米凝胶溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，其中，丙烯酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1∶1∶1。振荡后用磁铁分离，并加入pH＝7.4、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液分散，获得浓度为3％(质量/体积)的活化的超顺磁性共聚物纳米凝胶。
(4)制备胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂：向步骤(3)获得的活化的超顺磁性共聚物纳米凝胶中加入步骤(2)获得的标记有荧光染料的乳铁蛋白，其中，活化的超顺磁性共聚物纳米凝胶中铁元素含量与标记有荧光染料的乳铁蛋白中乳铁蛋白含量的摩尔比为1∶0.2。室 温下反应过夜，用磁铁分离，即得本发明胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂。
实施例3
一种胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂及其制备
(1)制备超顺磁性共聚物纳米凝胶：取N-(2-羟丙基)丙烯酰胺、20nm超顺磁性三氧化二铁纳米粒、N，N’-亚甲基双丙稀酰胺、十二烷基硫酸钠溶于去离子水中，搅拌并通入氮气，加入过硫酸钾和丙烯胺，在50-100℃反应4-8小时。其中，N-(2-羟丙基)丙烯酰胺与丙烯胺的摩尔比为20∶1。将反应物用去离子水透析去除未反应单体，冷冻干燥获得冻干粉，即为超顺磁性共聚物纳米凝胶。再用去离子水复溶，得到浓度为3％(质量/体积)的超顺磁性共聚物纳米凝胶溶液。
(2)制备标记有荧光染料的乳铁蛋白：取乳铁蛋白溶于碳酸氢钠水溶液中，向其中加入羰花青染料荧光染料DiR碘化物溶液，混合均匀后避光振荡，然后使用SephadexTM G-50树脂柱分离，获得标记有荧光染料的乳铁蛋白。其中，所用乳铁蛋白的碳酸氢钠溶液浓度范围为50mg/mL，羰花青染料荧光染料DiR碘化物溶液浓度范围为50mg/mL，羰花青染料荧光染料DiR碘化物与乳铁蛋白摩尔比为20∶1。
(3)制备活化的超顺磁性共聚物纳米凝胶：向步骤(1)获得的浓度为3％(质量/体积)的超顺磁性共聚物纳米凝胶溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，其中，丙烯胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1∶1∶1。振荡后用磁铁分离，并加入pH＝7.4、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液分散，获得浓度为3％(质量/体积)的活化的超顺磁性共聚物纳米凝胶。
(4)制备胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂：向步骤(3)获得的活化的超顺磁性共聚物纳米凝胶中加入步骤(2)获得的标记有荧光染料的乳铁蛋白，其中，活化的超顺磁性共聚物纳米凝胶中铁元素含量与标记有荧光染料的乳铁蛋白中乳铁蛋白含量的摩尔比为1∶0.5。室温下反应过夜，用磁铁分离，即得本发明胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂。
实施例4
一种胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂及其制备
(1)制备超顺磁性共聚物纳米凝胶：取聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸酯、8nm超顺磁性四氧化三铁纳米粒、N，N’-亚甲基双丙稀酰胺、十二烷基硫酸钠溶于去离子水中，搅拌并通入氮气，加入过硫酸钾和甲基丙烯胺，在50-100℃反应4-8小时。其中，聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸酯与甲基丙烯胺的摩尔比为4∶1。将反应物用去离子水透析去除未反应单体，冷冻干燥获得冻干粉，即为超顺磁性共聚物纳米凝胶。再用去离子水复溶，得到浓度为3％(质量/体积)的超顺磁性共聚物纳米凝胶溶液。
(2)制备标记有荧光染料的乳铁蛋白：取乳铁蛋白溶于碳酸氢钠水溶液中，向其中加入Cy3溶液，混合均匀后避光振荡，然后使用SephadexTM G-50树脂柱分离，获得标记有荧光染料的乳铁蛋白。其中，所用乳铁蛋白的碳酸氢钠溶液浓度范围为10mg/mL，Cy3溶液浓度范围为10mg/mL，Cy3与乳铁蛋白摩尔比为50∶1。
(3)制备活化的超顺磁性共聚物纳米凝胶：向步骤(1)获得的浓度为3％(质量/体积)的超 顺磁性共聚物纳米凝胶溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，其中，甲基丙烯胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1∶1∶1。振荡后用磁铁分离，并加入pH＝7.4、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液分散，获得浓度为3％(质量/体积)的活化的超顺磁性共聚物纳米凝胶。
(4)制备胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂：向步骤(3)获得的活化的超顺磁性共聚物纳米凝胶中加入步骤(2)获得的标记有荧光染料的乳铁蛋白，其中，活化的超顺磁性共聚物纳米凝胶中铁元素含量与标记有荧光染料的乳铁蛋白中乳铁蛋白含量的摩尔比为1∶1。室温下反应过夜，用磁铁分离，即得本发明胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂。
实施例5
一种胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂及其制备
(1)制备超顺磁性共聚物纳米凝胶：取2-二甲氨基乙基甲基丙烯酸酯、30nm超顺磁性四氧化三铁纳米粒、N，N’-亚甲基双丙稀酰胺、十二烷基硫酸钠溶于去离子水中，搅拌并通入氮气，加入过硫酸钾和甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯，在50-100℃反应4-8小时。其中，2-二甲氨基乙基甲基丙烯酸酯与甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯的摩尔比为40∶1。将反应物用去离子水透析去除未反应单体，冷冻干燥获得冻干粉，即为超顺磁性共聚物纳米凝胶。再用去离子水复溶，得到浓度为3％(质量/体积)的超顺磁性共聚物纳米凝胶溶液。
(2)制备标记有荧光染料的乳铁蛋白：取乳铁蛋白溶于碳酸氢钠水溶液中，向其中加入异硫氰酸荧光素溶液，混合均匀后避光振荡，然后使用SephadexTM G-50树脂柱分离，获得标记有荧光染料的乳铁蛋白。其中，所用乳铁蛋白的碳酸氢钠溶液浓度范围为10mg/mL，异硫氰酸荧光素溶液浓度范围为10mg/mL，异硫氰酸荧光素与乳铁蛋白摩尔比为0.3∶1。
(3)制备活化的超顺磁性共聚物纳米凝胶：向步骤(1)获得的浓度为3％(质量/体积)的超顺磁性共聚物纳米凝胶溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，其中，甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1∶1∶1。振荡后用磁铁分离，并加入pH＝7.4、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液分散，获得浓度为3％(质量/体积)的活化的超顺磁性共聚物纳米凝胶。
(4)制备胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂：向步骤(3)获得的活化的超顺磁性共聚物纳米凝胶中加入步骤(2)获得的标记有荧光染料的乳铁蛋白，其中，活化的超顺磁性共聚物纳米凝胶中铁元素含量与标记有荧光染料的乳铁蛋白中乳铁蛋白含量的摩尔比为1∶0.01。室温下反应过夜，用磁铁分离，即得本发明胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂。
实施例6
一种胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂及其制备
(1)制备超顺磁性共聚物纳米凝胶：取N-异丙基丙烯酰胺、30nm超顺磁性四氧化三铁纳米粒、N，N’-亚甲基双丙稀酰胺、十二烷基硫酸钠溶于去离子水中，搅拌并通入氮气，加入过硫酸钾和丙烯酸，在50-100℃反应4-8小时。其中，N-异丙基丙烯酰胺与丙烯酸的摩尔比为20∶1。将反应物用去离子水透析去除未反应单体，冷冻干燥获得冻干粉，即为超顺磁性共聚物纳米凝胶。再用去离子水复溶，得到浓度为3％(质量/体积)的超顺磁性共聚物纳米凝 胶溶液。
(2)制备标记有荧光染料的乳铁蛋白：取乳铁蛋白溶于碳酸氢钠水溶液中，向其中加入Cy5.5溶液，混合均匀后避光振荡，然后使用SephadexTM G-50树脂柱分离，获得标记有荧光染料的乳铁蛋白。其中，所用乳铁蛋白的碳酸氢钠溶液浓度范围为10mg/mL，Cy5.5溶液浓度范围为20mg/mL，Cy5.5与乳铁蛋白摩尔比为5∶1。
(3)制备活化的超顺磁性共聚物纳米凝胶：向步骤(1)获得的浓度为3％(质量/体积)的超顺磁性共聚物纳米凝胶溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，其中，丙烯酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1∶1∶1。振荡后用磁铁分离，并加入pH＝7.4、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液分散，获得浓度为3％(质量/体积)的活化的超顺磁性共聚物纳米凝胶。
(4)制备胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂：向步骤(3)获得的活化的超顺磁性共聚物纳米凝胶中加入步骤(2)获得的标记有荧光染料的乳铁蛋白，其中，活化的超顺磁性共聚物纳米凝胶中铁元素含量与标记有荧光染料的乳铁蛋白中乳铁蛋白含量的摩尔比为1∶0.5。室温下反应过夜，用磁铁分离，即得本发明胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂。
实施例7
一种磁共振成像对比剂及其制备
取N-异丙基丙烯酰胺、10nm超顺磁性四氧化三铁纳米粒、N，N’-亚甲基双丙稀酰胺、十二烷基硫酸钠溶于去离子水中，搅拌并通入氮气，加入过硫酸钾和丙烯酸，在50-100℃反应4-8小时。其中，N-异丙基丙烯酰胺与丙烯酸的摩尔比为10∶1。将反应物用去离子水透析去除未反应单体，冷冻干燥获得冻干粉，即为偶联前超顺磁性共聚物纳米凝胶。再用去离子水复溶，得到浓度为3％(质量/体积)的偶联前超顺磁性共聚物纳米凝胶溶液，用于对照组实验。
实施例8
胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂的形貌及粒径测定
将实施例2制备的对比剂利用透射电镜表征对其形貌和粒径进行测定。将样品稀释50倍后滴加至铜网上，在200kV电压下于透射电镜(JEM-2010，日本电子公司)下观察，结果(图2)显示本发明对比剂为球形，分散均一，粒径为86.4±3.4nm。
实施例9
胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂的水合半径与粒径分布测定
将实施例2制备的对比剂利用激光粒度仪对其水合半径和粒径分布进行测定。将样品稀释20倍后于激光粒度仪(ZetasizerNano ZS90，英国马尔文公司)下测定，结果(图3)显示本发明对比剂的水合半径为95.5±6.2nm，粒径分布窄。
实施例10
胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂的稳定性测定
将实施例2制备的对比剂利用激光粒度仪对其稳定性进行测定。将样品分散于生理环境模拟液中，稀释10倍后在于室温下静置不同的时间，然后利用激光粒度仪(Zetasizer Nano ZS90， 英国马尔文公司)测定其水合半径来判断其稳定性。结果(图4)显示对比剂在模拟生理环境的缓冲液中，稳定性良好，没有发生团聚现象。
实施例11
胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂的磁学性能测定
将实施例2和实施例7制备的对比剂利用振动样品磁强计对其磁饱和强度和超顺磁性进行测定。将冻干的样品粉末置于振动样品磁强计(Model 7404，美国Lake Shore Cryotronics公司)中测定，结果(图5)显示本发明对比剂偶联前后具有超顺磁性，磁饱和强度分别为67.9emu/g Fe和61.5emu/g Fe。
实施例12
胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂的磁共振成像能力测定
将实施例2和实施例7制备的对比剂利用磁共振扫描仪对其磁共振成像能力进行测定。将样品用水稀释成不同浓度，加入96孔板中，利用磁共振扫描仪(GE 3.0T Signa HDxt磁共振成像系统，美国GE公司)测定不同浓度对比剂的成像能力。结果(图6)显示对比剂偶联前后均具有良好的成像能力，随着对比剂浓度增加，可以使磁共振信号值显著降低。
实施例13
胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂的弛豫率测定
将实施例2和实施例7制备的对比剂利用磁共振扫描仪对其弛豫率进行测定。将样品用水稀释成不同浓度，加入96孔板中，利用磁共振扫描仪(GE 3.0T Signa HDxt磁共振成像系统，美国GE公司)测定不同浓度对比剂的T2值，然后计算对比剂的弛豫率(r2)。结果(图7)显示偶联前后对比剂的弛豫率分别为142.7mM-1s-1和129.3mM-1s-1。
实施例14
胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂的荧光发射光谱测定
将实施例2和实施例7制备的对比剂利用荧光分光光度计对其荧光发射光谱进行测定。将样品稀释20倍，利用荧光分光光度计(FL4500，日本日立公司)测定荧光发射光谱。结果(图8)显示偶联后对比剂具有与荧光染料标记乳铁蛋白相似的发射峰，表明具有荧光，并证实了偶联步骤。
实施例15
胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂的荧光成像能力测定
将实施例2和实施例7制备的对比剂利用IVIS小动物成像系统对其荧光成像能力进行测定。将样品稀释成不同浓度，加入96孔板中，利用IVIS小动物成像系统(IVIS Lumina XR，美国Caliper Life Sciences公司)测定其荧光成像能力。结果(图9)显示偶联后的对比剂具有荧光成像的能力，随着对比剂浓度增加，荧光信号强度显著增大。
实施例16
胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂在胶质瘤大鼠体内磁共振成像能力测定
将实施例2和实施例7制备的对比剂利用磁共振扫描仪(GE 3.0T Signa HDxt磁共振成像系统，美国GE公司)对其在胶质瘤大鼠体内的磁共振成像能力进行测定。所用大鼠为雄性Wistar大鼠(湖北预防医学科学院提供，体重200-300g)。在大鼠前囟右偏3毫米，前偏1毫 米的的位置将颅骨钻开，利用立体定位仪将1×106个细胞注入该位置，约10天后瘤直径达到(5mm×5mm)用于动物实验。大鼠肿瘤模型9只，随机分为3组，一组为空白组，尾静脉注射生理盐水；一组为实验组，尾静脉注射经生理盐水稀释的本发明对比剂，按照12mg Fe/kg体重注射；一组为对照组，尾静脉注射相同剂量的偶联前对比剂，分别在注射前和注射后2、6、12、24、48小时进行磁共振扫描。结果(图10)显示本发明对比剂注射前后，肿瘤区域磁共振信号随时间明显改变，在时间范围内，随时间延长信号值改变明显，范围增大。而对照实施例和生理盐水组，肿瘤组织磁共振信号均无明显改变。
实施例17
胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂在胶质瘤大鼠体内荧光成像测定
将实施例2和实施例7制备的对比剂利用IVIS小动物成像系统(IVIS Lumina XR，美国Caliper Life Sciences公司)对其在胶质瘤大鼠体内的荧光成像能力进行测定。实验动物模型的建立与实验分组与实施例16中保持一致。结果(图11)显示本发明对比剂注射前后，肿瘤区域荧光信号明显改变，肿瘤边界清晰可见。而对照实施例和生理盐水组，肿瘤组织磁共振信号均无明显改变。
实施例18
对比剂注射后胶质瘤大鼠脑组织切片的组织病理分析(H&E染色)
大鼠处死后，取脑组织进行组织病理分析，H&E染色用于判定胶质瘤组织。结果(图12)显示注射发明所述对比剂后，切片区域为胶质瘤组织，切可见肿瘤与正常组织边界，说明对比剂成像范围精确。
实施例19
对比剂注射后胶质瘤大鼠脑组织切片的组织病理分析(普鲁士蓝染色)
大鼠处死后，取脑组织进行组织病理分析，普鲁士蓝染色用于证实铁颗粒的存在。结果(图12)显示注射发明所述对比剂后，肿瘤组织中含有大量铁颗粒，说明对比剂大量靶向进入到肿瘤组织中。而对照实施例组，仅能见少量铁颗粒；而空白组未见铁颗粒。
Claims (10)
1.一种胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂，其特征在于，它是超顺磁性共聚物纳米凝胶和标记有荧光染料的乳铁蛋白的共价键结合物。
2.根据权利要求1所述的对比剂，其特征在于，所述的超顺磁性共聚物纳米凝胶，是由丙烯酰胺类单体与带有巯基或羧基或氨基的烯丙基类单体进行聚合反应形成共聚物纳米凝胶，并在所述聚合反应过程中加入超顺磁性铁氧化物纳米粒获得的产物。
3.根据权利要求2所述的对比剂，其特征在于，所述丙烯酰胺类单体是N-异丙基丙烯酰胺、N-(2-羟丙基)丙烯酰胺、聚丙烯酰吗啉、N-(3-羟丙基)-丙烯酰胺、聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸酯、2-甲基丙烯酰氧基-乙基磷酸胆碱、2-二甲氨基乙基甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯、2-二异丙氨基乙基甲基丙烯酸酯中的一种；优选N-异丙基丙烯酰胺、N-(2-羟丙基)丙烯酰胺或N-(3-羟丙基)-丙烯酰胺。
4.根据权利要求2所述的对比剂，其特征在于，所述的带有巯基或羧基或氨基的烯丙基类单体是丙烯酸、丙烯胺、甲基丙烯酸、甲基丙烯胺、聚2-乙烯基吡啶、甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯、磺胺嘧啶衍生物中的一种；优选丙烯酸、丙烯胺、甲基丙烯酸或甲基丙烯胺。
5.根据权利要求1所述的对比剂，其特征在于，所述的标记有荧光染料的乳铁蛋白，是荧光染料与乳铁蛋白通过共价键结合获得的产物。
6.根据权利要求2所述的对比剂，其特征在于，所述的超顺磁性铁氧化物纳米粒是粒径为8-30nm的超顺磁性三氧化二铁纳米粒或超顺磁性四氧化三铁纳米粒；优选为10-20nm的超顺磁性三氧化二铁纳米粒或超顺磁性四氧化三铁纳米粒。
7.根据权利要求5所述的对比剂，其特征在于，所述荧光染料为Cy系列荧光染料、异硫氰酸荧光素、羰花青染料荧光染料DiR碘化物、羰花青染料荧光染料DiO高氯酸盐中的一种，优选Cy系列荧光染料或羰花青染料荧光染料DiR碘化物。
8.根据权利要求7所述的对比剂，其特征在于，所述的Cy系列荧光染料是Cy3、Cy5、Cy5.5或Cy7，优选Cy5.5或Cy7。
9.一种胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、制备超顺磁性共聚物纳米凝胶：取丙烯酰胺类单体、超顺磁性氧化铁纳米粒、N，N’-亚甲基双丙稀酰胺、十二烷基硫酸钠溶于去离子水中，搅拌并通入氮气，加入过硫酸钾和带有巯基或羧基或氨基的烯丙基类单体，在50-100℃反应4-8小时，将反应物用去离子水透析去除未反应单体，冷冻干燥获得冻干粉，即为超顺磁性共聚物纳米凝胶，再用去离子水复溶，得到浓度为3％(质量/体积)的超顺磁性共聚物纳米凝胶溶液，其中，丙烯酰胺类单体与带有巯基或羧基或氨基的烯丙基类单体的摩尔比为4∶1-40∶1，优选8∶1-20∶1。
步骤二、制备标记有荧光染料的乳铁蛋白：取乳铁蛋白溶于碳酸氢钠水溶液中，向其中加入荧光染料溶液，混合均匀后避光振荡，然后使用SephadexTM G-50树脂柱分离，获得标记有荧光染料的乳铁蛋白，其中，所用乳铁蛋白的碳酸氢钠溶液浓度范围为0.05-50mg/mL，荧光染料溶液浓度范围为1-50mg/mL，荧光染料与乳铁蛋白摩尔比为0.3∶1-50∶1，优选2∶1-20∶1。
步骤三、制备活化的超顺磁性共聚物纳米凝胶：向步骤(1)获得的浓度为3％(质量/体积)的超顺磁性共聚物纳米凝胶溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，振荡后用磁铁分离，并加入pH＝7.4、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液分散，获得浓度为3％(质量/体积)的活化的超顺磁性共聚物纳米凝胶，其中，带有巯基或羧基或氨基的烯丙基类单体、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1∶1∶1。
步骤四、制备胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂：向步骤(3)获得的活化的超顺磁性共聚物纳米凝胶中加入步骤(2)获得的标记有荧光染料的乳铁蛋白，室温下反应过夜，用磁铁分离，即得本发明胶质瘤靶向磁共振和荧光双模式成像对比剂，其中，活化的超顺磁性共聚物纳米凝胶中铁元素含量与标记有荧光染料的乳铁蛋白中乳铁蛋白含量的摩尔比为1∶0.01-1∶1，优选1∶0.1-1∶0.5。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：
步骤一中所述的丙烯酰胺类单体是N-异丙基丙烯酰胺、N-(2-羟丙基)丙烯酰胺、聚丙烯酰吗啉、N-(3-羟丙基)-丙烯酰胺、聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸酯、2-甲基丙烯酰氧基-乙基磷酸胆碱、2-二甲氨基乙基甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯或2-二异丙氨基乙基甲基丙烯酸酯中的一种，优选N-异丙基丙烯酰胺、N-(2-羟丙基)丙烯酰胺、N-(3-羟丙基)-丙烯酰胺中的一种；
步骤一中所述的带有巯基或羧基或氨基的烯丙基类单体为丙烯酸、丙烯胺、甲基丙烯酸、甲基丙烯胺、聚2-乙烯基吡啶、甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯、磺胺嘧啶衍生物中的一种，优选丙烯酸、丙烯胺、甲基丙烯酸或甲基丙烯胺；
步骤二中所述的超顺磁性铁氧化物纳米粒是粒径为8-30nm的超顺磁性三氧化二铁纳米粒或超顺磁性四氧化三铁纳米粒，优选粒径为10-20nm的超顺磁性三氧化二铁纳米粒或超顺磁性四氧化三铁纳米粒；
步骤二中所述的荧光染料为Cy系列荧光染料、异硫氰酸荧光素、羰花青染料荧光染料DiR碘化物、羰花青染料荧光染料DiO高氯酸盐中的一种，优选Cy系列荧光染料或羰花青染料荧光染料DiR碘化物；所述的Cy系列荧光染料是Cy3、Cy5、Cy5.5或Cy7，优选Cy5.5、Cy7。
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| CN (1) | CN103505746B (zh) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105126127A (zh) * | 2015-10-14 | 2015-12-09 | 常州大学 | 一种结肠癌核磁共振多功能造影剂的制备方法 |
| CN105497922A (zh) * | 2014-09-25 | 2016-04-20 | 复旦大学附属华山医院 | 针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂及其制备与应用 |
| CN106770138A (zh) * | 2017-02-08 | 2017-05-31 | 南京大学 | 基于双信号放大的荧光偏振适配体传感器及其应用 |
| CN106727284A (zh) * | 2017-01-09 | 2017-05-31 | 武汉工程大学 | 一种磁性还原增强型药物敏感释放纳米凝胶及其制备和保存方法 |
| CN106902360A (zh) * | 2015-12-22 | 2017-06-30 | 上海交通大学 | 磁共振、荧光双显影纳米凝胶探针及其制备方法 |
| CN109125743A (zh) * | 2018-10-26 | 2019-01-04 | 复旦大学附属华山医院 | 针对脑胶质母细胞瘤靶向纳米磁共振对比剂及制备、应用 |
| CN109481701A (zh) * | 2017-12-27 | 2019-03-19 | 深圳先进技术研究院 | 脑胶质瘤影像纳米探针及其制备方法和应用 |
| CN109876009A (zh) * | 2019-02-27 | 2019-06-14 | 白玥 | 一种人脑胶质瘤小鼠原位模型的构建方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008115854A2 (en) * | 2007-03-19 | 2008-09-25 | Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Multifunctional nanoparticles and compositions and methods of use thereof |
| CN103083689A (zh) * | 2011-11-01 | 2013-05-08 | 复旦大学 | 一种用于脑肿瘤诊断的跨血脑屏障靶向多模态纳米药物 |
-
2013
- 2013-06-05 CN CN201310220938.XA patent/CN103505746B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008115854A2 (en) * | 2007-03-19 | 2008-09-25 | Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Multifunctional nanoparticles and compositions and methods of use thereof |
| CN103083689A (zh) * | 2011-11-01 | 2013-05-08 | 复旦大学 | 一种用于脑肿瘤诊断的跨血脑屏障靶向多模态纳米药物 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 刘欣等: "磁性荧光多功能纳米探针的研制及分析应用", 《分析科学学报》, vol. 26, no. 02, 30 April 2010 (2010-04-30), pages 235 - 239 * |
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105497922A (zh) * | 2014-09-25 | 2016-04-20 | 复旦大学附属华山医院 | 针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂及其制备与应用 |
| CN105497922B (zh) * | 2014-09-25 | 2018-11-16 | 复旦大学附属华山医院 | 针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂及其制备与应用 |
| CN105126127B (zh) * | 2015-10-14 | 2017-11-10 | 常州大学 | 一种结肠癌核磁共振多功能造影剂的制备方法 |
| CN105126127A (zh) * | 2015-10-14 | 2015-12-09 | 常州大学 | 一种结肠癌核磁共振多功能造影剂的制备方法 |
| CN106902360A (zh) * | 2015-12-22 | 2017-06-30 | 上海交通大学 | 磁共振、荧光双显影纳米凝胶探针及其制备方法 |
| CN106727284A (zh) * | 2017-01-09 | 2017-05-31 | 武汉工程大学 | 一种磁性还原增强型药物敏感释放纳米凝胶及其制备和保存方法 |
| CN106727284B (zh) * | 2017-01-09 | 2020-06-02 | 武汉工程大学 | 一种磁性还原增强型药物敏感释放纳米凝胶及其制备和保存方法 |
| CN106770138A (zh) * | 2017-02-08 | 2017-05-31 | 南京大学 | 基于双信号放大的荧光偏振适配体传感器及其应用 |
| CN106770138B (zh) * | 2017-02-08 | 2019-08-06 | 南京大学 | 基于双信号放大的荧光偏振适配体传感器及其应用 |
| CN109481701A (zh) * | 2017-12-27 | 2019-03-19 | 深圳先进技术研究院 | 脑胶质瘤影像纳米探针及其制备方法和应用 |
| CN109481701B (zh) * | 2017-12-27 | 2024-01-05 | 深圳先进技术研究院 | 脑胶质瘤影像纳米探针及其制备方法和应用 |
| CN109125743A (zh) * | 2018-10-26 | 2019-01-04 | 复旦大学附属华山医院 | 针对脑胶质母细胞瘤靶向纳米磁共振对比剂及制备、应用 |
| CN109125743B (zh) * | 2018-10-26 | 2021-06-04 | 复旦大学附属华山医院 | 针对脑胶质母细胞瘤靶向纳米磁共振对比剂及制备、应用 |
| CN109876009A (zh) * | 2019-02-27 | 2019-06-14 | 白玥 | 一种人脑胶质瘤小鼠原位模型的构建方法 |
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| Publication number | Publication date |
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