CN105497922A - 针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂及其制备与应用，所述磁共振对比剂包括靶向功能分子，荧光标记物和纳米载体；所述的靶向功能分子为针对癫痫灶区高表达的P-糖蛋白具有高亲和力的短肽；所述荧光标记物以共价连接的方式包载在纳米载体内，短肽通过共价连接的方式与纳米粒表面的聚乙二醇相连。该对比剂可通过静脉注射，使得短肽与癫痫灶区高表达的P-糖蛋白结合，促进纳米载体在癫痫灶聚集，MRI？T2加权显像病灶区呈显著低信号，从而能够准确、直观显示特发性/隐源性癫痫灶，有助于临床提高治疗的精确性和安全性，评价抗癫痫治疗方式的疗效、评估癫痫患者的预后。

Description

针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂及其制备与应用

技术领域

本发明属分子影像学技术领域，涉及一种针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂及其制备与应用。

背景技术

癫痫是以慢性、自发性、反复性为其临床特点的最常见神经病症之一。据统计，我国现有癫痫患者约900万，每年新增病例45万，其中约1/3患者虽经正规抗癫痫药物治疗，但发作仍不能得以控制，明显增加了病情严重性、死亡率和社会家庭经济负担。目前，癫痫灶切除手术效果较为肯定，但临床实践显示，手术难以完全切除，且致残率高，严重影响病人的生活质量。分析其重要原因之一是，癫痫作为一种神经元异常放电引起的大脑功能紊乱的疾病，按病因学可分为存在脑部结构/代谢异常的症状性癫痫和目前常规检查无法发现异常病灶的特发性/隐源性癫痫。脑电图(electroencephalogram,EEG)仍是癫痫灶最为常用的检查方法，但EEG的空间分辨率很低，头皮EEG检测对于发掘脑深部或某些不敏感部位的致痫灶敏感性极低。因此，如何特异性显示未有或不易检查出形态异常的那部分特发性/隐源性癫痫灶，增加了手术的精确性和安全性，提高了痫灶切除率和癫痫控制率，减少了手术并发症，是当前临床工作需要急迫解决的课题，也是目前有关癫痫研究中的热点和难点。

现代医学中，分子影像学(MolecularImaging,MI)利用当今医学上广泛应用的医学影像技术对生物体内部的生理和病理过程在分子水平进行无损伤的实时成像，了解体内特异性基因或蛋白质表达的部位、水平、分布及持续时间，可在活体内精细显像，特异性高。所述的分子影像的基本原理是体内引入分子探针，通过探针与靶点物质(如受体、蛋白、核酸等)特异性结合，应用高精度的成像设备对分子进行成像，有望提高特发性/隐源性癫痫的检出率和准确率。

目前，神经影像学技术主要有CT(ComputerTomography)、磁共振成像(MagneticResonanceImaging,MRI)、超声成像、光学成像及正电子发射体层摄影(PositionEmissionTomography,PET)等；其中，CT与超声成像因分辨率及敏感性低，均不适宜进行分子影像学研究；光学成像与PET能显示组织功能、代谢及分子信息，但是由于其在组织内的空间分辨率较低，从而限制了其单独应用。MRI由于有着精细的空间分辨率和较高的组织分辨率，可对深部组织的分子影像学特征进行精细准确的定位、定量分析，已成为最理想的分子影像学分析技术之一。然而，常规MRI对信号探测的敏感性仍然较低，目前所用的MRI造影剂缺乏特异性，不能的与靶点物质高亲和力结合，并且一般只能检测到组织中微摩尔级的顺磁性成分含量，需要通过信号扩增系统来提高其敏感性。当前，本领域中以超小型超顺磁性氧化铁粒子(UltrasmallSuperparamagneticIronOxide，USPIO)为基础的纳米探针，因其半衰期较长、在组织中广泛分布，易于在细胞间通透移动，T2*效应致信号强度明显降低，方法简单，重复性好，适用于带有特定分子的细胞及组织显像，已成为分子影像学研究热点。

研究表明，P-糖蛋白是表达在血脑屏障毛细血管内皮细胞近管腔侧的多药转运体，能识别多种抗癫痫药物，并将其泵出血脑屏障，减少病灶区域内神经元周围细胞外液抗癫痫药物的有效浓度，降低药物的效价，从而无法抑制癫痫发作。因此P-糖蛋白表达增多是引起癫痫多药耐药的重要原因。以P-糖蛋白作为纳米磁共振对比剂靶点物质具有几个主要的优势：第一，纳米磁共振对比剂通过癫痫部位的增强透过和滞留效应可以提高病灶部位的分布，降低非靶向部位的分布，提高对比剂的显像效果，降低药物的毒副作用；第二、癫痫灶毛细血管内皮细胞管腔面特异性高表达，而正常细胞不表达或低表达P-糖蛋白，在纳米磁共振对比剂表面链接一个靶向功能分子，通过靶向功能分子与癫痫灶细胞表面的P-糖蛋白特异性结合，能够准确、直观显示癫痫灶真实的生物学边界；第三、P-糖蛋白存在于毛细血管内皮细胞管腔面，分子探针不需要通过血脑屏障即可通过特异性结合而显像；第四、P-糖蛋白分子成像还有助于临床评价抗癫痫治疗的疗效、评估疾病的预后。

线性短肽3-Methylbutyryl-Val-Val-Sta-Ala-Sta-Cys(简称PepstatinA，胃酶抑素A)分子量小，结构稳定、与P-糖蛋白亲和力高、不干扰细胞代谢等优点(SharomFJ.TheP-glycoproteinmultidrugtransporter.EssaysBiochem,2011,7；50(1):161-78.)，易通过共价键与USPIO结合，有望介导该短肽修饰的纳米磁共振对比剂显示癫痫灶。目前国内外未见报道。

目前，现有诊断技术无法从分子机制层面解决癫痫灶的早期准确显示这一问题，同时现有对比剂不能通过量化反映P-糖蛋白的表达量从而有助于早期提示是否为耐药性癫痫、以达到帮助临床提高治疗的精确性和安全性，也不存在一种递药系统导向性地将相关治疗药物靶向运至病灶、从而实现显影、治疗一体化。

根据上述背景，本申请发明人针对现有技术缺陷，拟以该短肽为靶向功能分子，聚乙二醇-超小型超顺磁性氧化铁粒子(PEG-USPIO)为载体，附以荧光标记物，构建一种全新的脑癫痫灶靶向纳米磁共振对比剂。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂及其制备与应用；具体涉及一种短肽修饰的纳米靶向对比剂。本发明对比剂可通过脑癫痫灶血脑屏障毛细血管内皮细胞与P-糖蛋白特异性结合，直观显示癫痫灶真实的生物学边界，提高癫痫的检出率和准确率。

第一方面，本发明提供一种针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂，所述纳米磁共振对比剂包括超小型超顺磁性氧化铁粒子(USPIO)、胃酶抑素A、免疫荧光标记物、聚乙二醇(PEG)。

优选地，所述超小型超顺磁性氧化铁粒子的表面活性基团包括羧基、马亚酰亚胺基、巯基、胺基、生物素或亲和素。

优选地，所述超小型超顺磁性氧化铁粒子(USPIO)的直径在50nm以下；所述USPIO安全性高，可生物降解，主要缩短组织T2时间，可与多种配体连接形成靶向对比剂，灵敏度、特异度高。

更优选地，所述超小型超顺磁性氧化铁粒子(USPIO)的粒径为10～20nm。

优选地，所述免疫荧光标记物包括异硫氰酸荧光素(FITC)。

优选地，所述聚乙二醇的分子量为1000～20000；

更优选地，所述聚乙二醇的分子量为2000～5000。

第二方面，本发明提供一种针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂的制备，所述制备的具体包括如下步骤：

步骤一、将超小型超顺磁性氧化铁粒子(USPIO)、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺(DSPE-PEG-MAL)及磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-免疫荧光标记(DSPE-PEG-免疫荧光标记)按重量比为(1～3):(8～12):1混合，溶于二氯甲烷，冰水浴超声10min；37℃旋蒸去除二氯甲烷；4℃下2500rpm离心后弃上清，水分散沉淀，获得水分散纳米粒；

步骤二、向水分散纳米粒加入巯基活化的胃酶抑素A，搅拌；2500rpm4℃离心，弃上清；用缓冲液分散沉淀，得靶向纳米磁共振对比剂。

优选地，步骤二中，所述缓冲液包括磷酸缓冲液；所述磷酸缓冲液的浓度为pH6～8的0.01M的磷酸缓冲液。

优选地，步骤二中，所述水分散纳米粒中超小型超顺磁性氧化铁粒子(USPIO)与巯基活化的胃酶抑素A的重量比为10:1。

步骤二中，水分散纳米粒和巯基活化的胃酶抑素A通过共价结合反应得靶向纳米磁共振对比剂。

第三方面，本发明提供一种针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂在制备特异性显示高表达P-糖蛋白癫痫灶的临床诊断试剂中的应用；所述临床诊断试剂包括癫痫灶的早期MRI分子影像诊断试剂。

第四方面，本发明提供一种针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂递药系统，所述递药系统的靶向功能分子为线性短肽胃酶抑素A，荧光标记物为异硫氰酸荧光素(FITC)，纳米载体为表面聚乙二醇修饰的超小型超顺磁性氧化铁粒子(USPIO)；抗脑癫痫药物以包裹或共价连接的方式与纳米载体结合，线性短肽通过共价连接的方式与纳米载体表面的聚乙二醇相连。

优选地，所述递药系统的粒径为30～50nm。

优选地，所述抗脑癫痫药物为对脑癫痫有抑制、治疗效果的或与其他药物有协同抑制、治疗效果的药物组分。

本发明针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂，是以毛细血管内皮细胞管腔面P-糖蛋白为靶点，由聚乙二醇(PEG)，超小型超顺磁性氧化铁粒子(USPIO)，荧光标记物异硫氰酸荧光素(FITC)及导向性短肽分子胃酶抑素A组成。该递药系统一方面可通过与P-糖蛋白特异性结合，靶向脑癫痫灶毛细血管内皮细胞，另一方面通过长循环纳米粒的增强渗透和滞留作用向癫痫组织内蓄积，蓄积在组织内的纳米粒可以被MRI及荧光显微镜所识别，实现脑癫痫灶的双模态显影。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)从分子机制层面解决现有技术无法早期准确显示癫痫灶，能直观显示特发性/隐源性癫痫；

(2)对比剂与P-糖蛋白特异性结合，通过量化间接反映P-糖蛋白的表达量，有助于早期提示是否为耐药性癫痫，帮助临床提高治疗的精确性和安全性，评价疗效、评估预后；

(3)对比剂结合对脑癫痫有抑制、治疗效果的或与其他药物有协同抑制、治疗效果的药物组分，冀望通过靶向递药为及时干预提供帮助，实现显影与治疗一体化。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为靶向纳米共振对比剂的两步法构建及作用原理示意图；

图2为靶向纳米共振对比剂的表征图；

其中，A为电镜图；B为粒径分布图；

图3为靶向纳米共振对比剂的磁敏感特征表征图；

其中，A为纳米粒磁滞回线；B为不同浓度下纳米粒MRIT2信号强度；

图4为建立体外RBCECs模型，比较对照组及谷氨酸诱导组RBCECs的P-糖蛋白表达结果图；

其中，A为免疫荧光共聚焦定性分析图，谷氨酸诱导下(右)RBCECs的P-糖蛋白表达明显高于正常对照组(左)；B为流式细胞仪FITC荧光定量分析，谷氨酸诱导(右)RBCECs的P-糖蛋白增高2.5倍；

图5为建立体外RBCECs模型，分析靶向纳米粒对P-糖蛋白的特异性结合的结果示意图；

其中，A为流式细胞仪FITC荧光定量分析结果图，P-糖蛋白高表达时，靶向纳米粒结合力最高；B为谷氨酸诱导组，免疫荧光共聚焦定性显示靶向纳米粒在RBCECs的分布明显高于单纯纳米粒；

图6为建立癫痫动物模型，比较癫痫组与假手术组海马区P-糖蛋白表达的结果示意图；

其中，A、B为WesternBlot定量分析结果图；C为免疫荧光共聚焦定性分析结果示意图，癫痫组P-糖蛋白明显增高；

图7为建立癫痫动物模型，分析靶向纳米粒对P-糖蛋白的特异性结合的结果示意图；

其中，A为MRI直观显示靶向纳米粒(右)在癫痫灶的分布明显高于单纯纳米粒(左)；B为脑组织冰冻切片普鲁士蓝染色示癫痫灶内靶向纳米粒高聚集。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1

本实施例提供一种针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂及其制备，具体如下所示：

PEG-USPIO纳米粒的制备：准确称量10mg脂质USPIO，50mgDSPE-PEG-MAL，5mgDSPE-PEG-FITC，溶于2ml二氯甲烷后，冰水浴下超声10min，37℃旋蒸15min去除二氯甲烷，2500rpm4℃离心10min后弃上清，0.5mL去离子水分散沉淀获得纳米粒。

胃酶抑素A-PEG-USPIO纳米粒的制备：在制备所得的去离子水分散的纳米粒2ml(5mg/mLUSPIO)加入巯基活化试剂胃酶抑素A2mg/ml0.5ml后低速电动搅拌4h，2500rpm4℃离心10min后弃上清，0.5mL0.01MPBS(pH7.4)分散沉淀获得我们所需要的带有靶向功能分子的纳米粒。

采用粒径分析仪测定纳米粒的粒径及Zeta电位，经过1％(w/v,pH7.0)磷钨酸负染色后，透射电镜观察粒子形态，结果如如图2：胃酶抑素A-PEG-USPIO形状规则圆整，直径约为40nm；同时采用MRI分析靶向纳米粒的磁敏感特征及T2信号强度，结果如图3：纳米粒磁敏感稳定，具备极好的T2WI信号对比度。

实施例2

将BCEC细胞(大鼠脑毛细血管内皮细胞)以5×10⁵细胞每孔的浓度接种于六孔板中进行实验；1～3孔为空白对照组；4～6孔为实验组，每孔加入100uM(1.5g/100ml)谷氨酸，于37℃孵育30min后，PBS(磷酸缓冲液)清洗两遍，加入完全培养液常规培养；24h后每组分别加入PBS、PEG-USPIO、胃酶抑素A-PEG-USPIO(USPIO浓度为50μg/ml)，于30min后取样行免疫荧光共聚焦定性分析、流式细胞仪FITC荧光定量分析，结果如图4、图5所示：图4所示谷氨酸可诱导BCEC细胞高P-糖蛋白，图5所示靶向功能分子胃酶抑素A可占据了P-糖蛋白的结合位点，有助于纳米粒转运与显影。

实施例3

立体定位SD大鼠左侧海马CA3区，微针注射3μL红藻氨酸(KA，0.5mg/mL)，建立癫痫动物模型；注射3μLPBS(磷酸缓冲液)为假手术对照组；4％多聚甲醛心脏灌流，取脑，通过免疫荧光共聚焦成像及WesternBlot分析观察癫痫组、假手术组海马区P-糖蛋白的表达，结果如图6所示：图6显示癫痫组海马区P-糖蛋白表达明显高于假手术组，提示癫痫发作与P-糖蛋白表达增高关系密切。

实施例4

建立SD大鼠癫痫动物模型，按PEG-USPIO、胃酶抑素A-PEG-USPIO分为两组，以10mg/kg剂量，鼠尾静脉给药0.3ml，4h后行3.0TMRI颅脑T2WI扫描，如图7A结果所示，短肽胃酶抑素A修饰的USPIO纳米粒在脑癫痫部位的分布明显多于未修饰的纳米粒，其T2信号强度明显减低。

生理盐水及4％多聚甲醛心脏灌流，取脑后行冰冻切片，普鲁士兰溶液染色，观察USPIO在癫痫灶内及癫痫灶周围组织中的分布，如图7B结果所示，短肽胃酶抑素A修饰的纳米粒在脑海马区的分布呈明显铁染色，在动物水平证实了PepstatinA可与P-糖蛋白的特异性结合，靶向功能分子短肽胃酶抑素A的修饰有助于USPIO纳米粒分布到癫痫部位。

实施例5

本实施例提供一种针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂及其制备，具体方案与实施例1相同，不同之处仅在于：

超小型超顺磁性氧化铁粒子(USPIO)、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺(DSPE-PEG-MAL)及磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-免疫荧光标记(DSPE-PEG-免疫荧光标记)的重量比为1:8:1。

实施例6

本实施例提供一种针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂及其制备，具体方案与实施例1相同，不同之处仅在于：

超小型超顺磁性氧化铁粒子(USPIO)、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺(DSPE-PEG-MAL)及磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-免疫荧光标记(DSPE-PEG-免疫荧光标记)的重量比为3:12:1。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (10)

1.一种针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂，其特征在于，所述纳米磁共振对比剂包括超小型超顺磁性氧化铁粒子、胃酶抑素A、免疫荧光标记物和聚乙二醇。

2.根据权利要求1所述的针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂，其特征在于，所述超小型超顺磁性氧化铁粒子的表面活性基团包括羧基、马亚酰亚胺基、巯基、胺基、生物素或亲和素。

3.根据权利要求1或2所述的针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂，其特征在于，所述超小型超顺磁性氧化铁粒子的直径在50nm以下。

4.根据权利要求1所述的针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂，其特征在于，所述免疫荧光标记物包括异硫氰酸荧光素。

5.根据权利要求1所述的针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量为1000～20000。

6.一种针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂的制备，其特征在于，所述制备的具体包括如下步骤：

步骤一、将超小型超顺磁性氧化铁粒子、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺及磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-免疫荧光标记按重量比为(1～3):(8～12):1混合，溶于二氯甲烷，冰水浴超声10min；37℃旋蒸去除二氯甲烷；4℃下2500rpm离心后弃上清，水分散沉淀，获得水分散纳米粒；

步骤二、向水分散纳米粒加入巯基活化的胃酶抑素A，搅拌；2500rpm4℃离心，弃上清；用缓冲液分散沉淀，得靶向纳米磁共振对比剂。

7.根据权利要求6所述的针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂的制备，其特征在于，步骤二中，所述缓冲液包括磷酸缓冲液。

8.一种针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂在制备特异性显示高表达P-糖蛋白癫痫灶的临床诊断试剂中的应用。

9.一种针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂递药系统，其特征在于，所述递药系统的靶向功能分子为线性短肽胃酶抑素A，荧光标记物为异硫氰酸荧光素，纳米载体为表面聚乙二醇修饰的超小型超顺磁性氧化铁粒子；抗脑癫痫药物以包裹或共价连接的方式与纳米载体结合，线性短肽通过共价连接的方式与纳米载体表面的聚乙二醇相连。

10.根据权利要求9所述的针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂递药系统，其特征在于，所述递药系统的粒径为30～50nm。