CN102350002A - 一种胶质瘤靶向分子磁共振对比剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属分子影像学技术领域，涉及一种胶质瘤靶向分子磁共振对比剂及其制备方法和应用。所述的对比剂包括生物素化单克隆抗体及链霉亲和素结合包载Gd的空间稳定免疫脂质体两种复合物，该两种复合物反应结合后成为MAb-X-Y-Z-Gd。本发明的实验结果显示，在主动靶向识别肿瘤新生血管时，所述分子探针不需通过血脑屏障就可与胶质瘤新生微血管结合，并通过生物素-亲和素系统使MRI信号放大，实现高分辨率的胶质瘤特异性靶向成像；所述生物素-亲和素介导的两步法成像具备有效性，为胶质瘤早期诊断、生物学行为的研究、靶向抗血管生存治疗及疗效评价提供了新的无创性方法。

Description

一种胶质瘤靶向分子磁共振对比剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属分子影像学技术领域，涉及胶质瘤靶向分子磁共振对比剂，具体涉及一种胶质瘤靶向分子磁共振对比剂及其制备方法和应用，尤其涉及一种基于Endoglin靶的二步法空间稳定脂质体磁共振分子对比剂及其制备方法和在磁共振分子成像中的用途；所述的对比剂能主动靶向特异性显示脑胶质瘤新生血管。

背景技术

胶质瘤是脑内最常见的原发性恶性肿瘤，据统计，我国胶质瘤每年新发病例4～13万人，恶性度高，占全身恶性肿瘤致死率中第四位。目前，该疾患的首选治疗方法仍为手术，但临床实践显示，手术难以完全切除，且致残率高，严重影响病人生活质量及生存率；分析其中重要原因之一是，当前应用的小分子MR造影剂钆喷酸葡胺(Gd-DTPA)是一种细胞外非特异性对比剂，其可通过通透性增高的胶质瘤血管进入血管周围间隙成像，但并不能与胶质瘤细胞特异性结合，不能准确显示胶质瘤的生物学特性及胶质瘤边界。因此，如何特异性显示胶质瘤生物学特性，准确界定胶质瘤的边界，提高胶质瘤的治疗效果，延长生存期，是当前临床工作需要急迫解决的课题，也是目前有关胶质瘤研究中的热点和难点。

现代医学中，分子影像学(Molecular Imaging，MI)利用目前医学上广泛应用的医学影像技术对生物体内部的生理和病理过程在分子水平上进行无损伤的实时成像，了解体内特异性基因或蛋白质表达的部位、水平、分布及持续时间，可在活体内精细显像，特异性高。所述的分子影像的基本原理是体内引入分子探针，通过探针与靶点物质(如受体、蛋白、核酸等)特异性结合，应用高精度的成像设备对分子进行成像。Weissleder等认为分子成像需要解决几个关键问题，即有效的高亲和力成像探针，探针除具有合适的药效学，还需具有克服生物传递屏障的能力；合适的扩增方法；敏感、快速并具有高分辨率的成像系统，其中制备特异性高亲和力的靶向探针是活体分子显像的关键因素。

目前，用于肿瘤诊断影像技术主要有CT(Computer Tomography)、磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging，MRI)、超声成像、光学成像及正电子发射体层摄影(Position Emission Tomography，PET)等；其中，CT及超声因分辨率及敏感性低而不适宜进行分子影像学研究；光学成像及PET能显示组织功能、代谢及分子信息，但是，由于其在组织内的空间分辨率较低而被限制其单独应用。上述的MRI由于有着很精细的空间分辨率和较高的组织分辨率，可对深部组织的分子影像学特征进行精细准确的定位、定量分析，已成为最理想的分子影像学分析技术之一；但是，常规MRI对信号探测的敏感性仍然较低，目前所用的评价肿瘤血管生成的各类MRI造影剂并没有能够真正将宿主原有的成熟血管和肿瘤新生不成熟微血管特异性区别开，且一般只能检测到组织中微摩尔级的顺磁性成分含量，需要通过信号扩增系统来提高其敏感性。目前，本领域中以钆为基础的顺磁性分子探针是分子影像学研究热点，一些靶向对比剂，如以蛋白为基础的大分子量探针、单克隆抗体为基础的探针、含有钆的多氨基胺分支聚合体探针及微粒为基础的探针初步显示了在MRI中的应用前景。

有研究发现，Endoglin分子(即CD105分子)是血管内皮细胞增殖的标志，与其他内皮细胞标志物如CD31，CD34，VIII因子相关抗原等不同的是，Endoglin仅在处于增殖状态的肿瘤组织血管内皮细胞(即新生的血管内皮细胞)上强表达，而在正常组织的成熟血管上无表达或弱表达。Wikstrom等采用Endoglin或VIII因子相关抗原同时与平滑肌肌动蛋白(actin)进行免疫双标，以检测二者标记的前列腺癌组织的血管是否成熟，发现与VIII因子相关抗原相比，Endoglin标记的微血管密度量少，其中仅19％标本actin同时呈阳性，表明Endoglin主要在未成熟血管上表达，进一步证实了上述观点。此外，还有研究发现，肿瘤组织中新生内皮和血管是不成熟和幼稚的，内皮细胞具有高表达Endoglin的特性，且可作为抗血管生成的靶标。

还有研究证实，Endoglin在胶质瘤新生不成熟血管中亦呈高表达，而在正常脑组织中不表达，且几乎只存在于肿瘤边缘新生血管；因此，若能通过一定的影像学手段对Endoglin进行成像，就能精确、直观的显示肿瘤真实的生物学边界，从而指导临床制定合理准确的治疗措施；同时，有研究还表明胶质瘤的分级与Endoglin表达呈正相关，因此Endoglin分子进行成像，还有助于胶质瘤临床分级、评价血管生成特点及抗血管等治疗的疗效、评估疾病的预后。此外，选择Endoglin分子作为靶分子成像的优势还在于，该分子存在于胶质瘤新生血管内皮细胞表面，分子探针不需通过血脑屏障即可通过抗原抗体反应直接与之结合成像。

现有技术公开了脂质体(Liposome)是以磷脂及胆固醇为主要成分、具有脂质双分子层结构的脂质囊泡，是良好的药物载体；通过表面修饰的脂质体称空间稳定型脂质体(sterically stabilized liposomes，SLs)，在活体内可逃避单核吞噬细胞系统的吞噬作用，具有长循环的特点；所述的脂质体内可包载各种水溶性和脂溶性药物，结合相应的靶向因子后，主动靶向识别病变组织，定点释放药物；所述的包载各种影像标记物质的空间稳定脂质体，已广泛应用于多种模式的分子影像成像过程中，其中，脂质体包载钆剂可提高局部组织内钆的含量，提高磁共振成像的敏感度。

目前，生物素-亲和素系统(Biotin-Avidin System，BAS)是较为常用的信号放大系统，可用于放射免疫成像、脂质体放射核素成像、MR大分子对比剂成像等。与影像标记物质结合后，通过生物素与亲和素间高亲和性作用，可级联放大影像信号；同时，生物素-亲和素系统也是最为常用的药物预靶向定位的主要手段。在分子影像成像过程中，预定位方法通常分为两步法及三步法，其中，两步法包括：生物素化抗体注射与靶点抗原特异性结合预定位；引入已经影像标记的亲和素与之快速结合而成像，而血液循环中的亲和素较快代谢清除，达到理想的对比成像作用。三步法包括：生物素化抗体注射与靶点抗原特异性结合预定位；注射一定量亲和素，可与靶点上生物素化抗体中的抗体结合，同时可与循环中游离生物素化抗体结合促进其代谢清除；注射经标记的亲和素进行显像。所述三步法的优势在于可减少循环背景中的成像干扰，提高靶点局部的成像对比，但其操作较繁琐、亲和素用量较大而具有较明显的毒性作用。所述亲和素(Avidin，Av)和链霉亲和素(Streptavidin，SAv)两者分子结构类似，均具有四个相同亚基，都能与生物素高特异性亲和性结合，但链霉亲和素为近中性蛋白，不含糖基测量，因此，体内与带电分子及细胞膜糖受体非特异性结合较低。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种胶质瘤靶向分子磁共振对比剂，具体涉及一种基于Endoglin靶的二步法空间稳定脂质体磁共振分子对比剂所述的对比剂。

本发明的另一目的是提供上述胶质瘤靶向分子磁共振对比剂的制备方法。

本发明的进一步目的是提供上述胶质瘤靶向分子磁共振对比剂在磁共振分子成像中的用途，尤其是能主动靶向特异性显示脑胶质瘤新生血管中的用途。

本发明采用两步法成像，其中的基于Endoglin靶的MR分子探针不需通过血脑屏障，直接与胶质瘤血管内皮上特异性分子结合成像，且两步法成像增加了肿瘤内对比剂浓度，提供了成像信号，有利于对胶质瘤分子显像。本发明能克服现有技术中通常采用的脑外动物肿瘤模型进行相应分子成像中，对于脑内肿瘤(如胶质瘤)进行分子成像，多数大分子影像标记探针往往受到正常生物屏障(血脑屏障)的阻碍，不能到达肿瘤细胞局部特异性结合而影响成像效果的缺陷。

具体而言，本发明的胶质瘤靶向分子磁共振对比剂，其特征在于，其包括生物素化单克隆抗体及链霉亲和素结合包载Gd的空间稳定免疫脂质体两种复合物，具有如下结构：MAb-X-Y-Z-Gd；所述的复合物的通式分别为：MAb-X和Y-Z-Gd，其中，MAb为特定分子的单克隆抗体，X为生物素(Bio)及其衍生物，Y为亲和素或链霉亲和素(SAv)、Z为空间稳定脂质体(SLs)，Gd为用于磁共振增强成像的钆螯合剂；所述两种复合物反应结合后成为MAb-X-Y-Z-Gd。

本发明中，所述的单克隆抗体MAb，具有高度均质性、仅识别单一抗原决定簇的抗体分子，抗体蛋白内具有氨基或巯基活性基团；

本发明中，所述的生物素及其活性衍生物X，其末端可提供N-羟基琥珀酰亚胺或马来亚酰胺活性基团；

本发明中，所述的Y为亲和素或链霉亲和素大分子蛋白质；

本发明中，所述的空间稳定脂质体Z，其中包含的磷脂衍生物表面可提供巯基或马来酰亚胺或N-羟基琥珀酰亚胺活性基团；

本发明中，所述的Gd为磁共振影像标记物钆的螯合物衍生物，其中，螯合物为二乙基三胺五乙酸(DTPA)可经羧基与硬脂酸胺上的氨基共价连接；

本发明中，所述的Gd螯合物衍生物有2个硬脂酸胺链，形成双链，具有与磷脂类似的结构。

本发明提供了胶质瘤靶向分子磁共振对比剂的制备方法，其特征在于，其包括步骤：

(1)制备空间稳定脂质体：

将脂质体膜材料，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇(CHOL)、甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰乙醇胺(mPEG-DSPE)、钆-二乙三胺五醋酸-二硬脂酰胺(Gd-DTPA-BSA)按一定摩尔比例(总磷脂∶胆固醇摩尔比＝2∶1，mPEG-DSPE摩尔百分比控制于3％～5％，Gd-DTPA-BSA摩尔百分比控制于20％～35％)溶于氯仿甲醇混合溶剂(2∶1容积)中，经40℃旋转蒸发，60℃水化，高压均质仪挤压过膜，制备包载顺磁性物质(Gd)的空间稳定脂质体(Gd-SLs)；然后，评价脂质体的粒径、稳定性、钆含量、磁共振驰豫率及体外MR成像作用等物理性质；

(2)制备基于Endoglin靶的空间稳定免疫脂质体及预定位脂质体分子探针：

①上述Gd-SLs成膜过程中，加入膜材料吡啶二硫丙酰基-聚乙二醇(2000)-二硬脂酰乙醇胺(PDP-PEG(2000)-DSPE)，制备表面修饰结合PDP基团脂质体(PDP-SLs)，所述的PDP-SLs脂质体经二硫苏糖醇(DTT)还原，制得表面结合游离巯基的脂质体(HS-SLs)；

②所述CD105单克隆抗体(CD105～MAb)与丁二酰亚胺-4-(对-马来酰亚胺-苯基)-丁酸酯(SMPB)反应，制备马来酰亚胺苯基丁酰基单克隆抗体(MPB-MAb)；

③将所述HS-SLs与MPB-MAb反应，制得表面连接抗体的空间稳定脂质体(MAb-SLs)；

④将生物素氨基己糖酸-3-磺酸基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Sulfo-NHS-LC-biotin)与所述CD105～MAb反应，制得生物素化单克隆抗体(Bio-MAb)；

⑤链霉亲和素结合空间稳定脂质体(SAv-SLs)的制备过程与MAb-SLs基本相同，将HS-SLs与马来酰亚胺苯基丁酰基链霉亲和素(MPB-SAv)作用，制得链霉亲和素结合空间稳定脂质体(SAv-SLs)；

⑥免疫脂质体粒径测量，体外稳定性表征，体外生物素-亲和素结合实验，测定免疫脂质体抗体蛋白密度及抗体结合率，各种脂质体探针透射电镜观察形态。

本发明方法制备的胶质瘤靶向分子磁共振对比剂的具有以下优点：

(1)制得的钆结合空间稳定脂质体(Gd-SLs)经高压均质仪过膜后粒径控制于117.4±31.8nm；脂质体Gd载药率达87％～100％；常温下(26℃)Gd-SLs磁共振驰豫率为Gd-DTPA的1.16倍，37℃为1.25倍；体外MR成像显示Gd-SLs与Gd-DTPA两对比剂MR T1加权成像作用接近；

(2)空间稳定脂质体结合单克隆抗体后粒径由116.1nm±33.9nm增加至129.9nm±40.9nm，于4℃保存7、14、42天，平均粒径及分布变化较小；将Bio-MAb与SAv-SLs混合10min后，平均粒径增大到(267nm±142.8nm)，分布增宽；免疫脂质体抗体结合率为52～67％，相应抗体/磷脂比例约为47～60μg/μmol；透射电镜显示，脂质体为均匀大小囊泡样结构，将Bio-MAb与SAv-SLs混合后，SAv-SLs有相互聚集作用。

本发明提供了上述胶质瘤靶向分子磁共振对比剂在磁共振分子成像中的用途。

本发明进行了大鼠胶质瘤新生血管内皮细胞Endoglin靶的MR分子成像实验：

①按常规方法建立大鼠C6胶质瘤细胞培养及大鼠原位胶质瘤动物模型；

②模型动物随机分组，分别尾静脉注射钆喷酸葡胺(Gd-DTPA)、空白脂质体(Gd-SLs)、同种型对照IgG脂质体(IgG-SLs)、结合Endoglin单克隆抗体的免疫脂质体探针(MAb-SLs)行MR成像，两步法预定位成像大鼠预先给予生物素化单克隆抗体(Bio-MAb)后再给予链霉亲和素脂质体探针(SAv-SLs)进行成像；

③比较各组大鼠MR T1加权增强图像肿瘤强化表现的差异，分析各组动脉血管、正常脑组织及肌组织、肿瘤组织时间-信号增强特点；比较各组间肿瘤强化程度及强化范围差异、比较组内肿瘤中央部及周边部强化差异；比较各组间肿瘤强化形态的差异；大鼠胶质瘤CD105免疫组织化学染色肿瘤中央部及周边部新生血管计数，比较两者差异。

荷瘤大鼠MR成像结果显示，本发明的对比剂中，顺磁性空间稳定脂质体能有效提高磁共振分子探针体内成像信号，是理想的MR分子影像学对比剂载体；所述的生物素化单克隆抗体与胶质瘤新生血管内皮细胞表面Endoglin分子结合实现预定位，引入链霉亲和素结合包载Gd的空间稳定脂质体，通过生物素-亲和素间的高亲和性特异结合，实现胶质瘤MR分子成像。

本发明还分别应用多种对比剂及分子探针对大鼠原位胶质瘤进行磁共振成像，比较其肿瘤强化的程度、范围，重点分析各种造影剂对肿瘤增强部位的差异，并通过竞争抑制性实验，验证靶向探针成像的特异性；同时，通过病理免疫组织化学检测，进一步验证特异性靶向探针增强部位与肿瘤新生血管内Endoglin分子分布的相关性；通过大鼠胶质瘤两步法MR分子成像实验，结果显示，在主动靶向识别肿瘤新生血管时，所述分子探针不需通过血脑屏障就可与胶质瘤新生微血管结合，并通过生物素-亲和素系统使MRI信号放大，实现高分辨率的胶质瘤特异性靶向成像；结果表明，所述生物素-亲和素介导的两步法成像具备有效性，为胶质瘤早期诊断、生物学行为的研究、靶向抗血管生存治疗及疗效评价提供了新的无创性方法。

本发明所述的对比剂可作为一种基于Endoglin靶的MR分子探针，分别采用两步法的方法对大鼠原位胶质瘤新生血管Endoglin分子进行显像，可用于对胶质瘤生物学行为进行研究，能为活体客观评价胶质瘤血管生成提供新的可靠方法，还可为胶质瘤早期诊断、生物学行为的研究、靶向抗血管生存治疗及疗效评价提供新的无创性方法。

附图说明

图1为本发明中两步法成像的作用原理及方法示意图。

图2为本发明中空间稳定脂质体(Gd-SLs)示意图，其中，

脂质体为具有磷脂双分子层结构的囊泡，囊泡有水相内核，表面修饰PEG链，Gd-DTPA-BSA作为磷脂类似物插入双分子层内。

图3为本发明中脂质体通过100nm膜后粒径分布直方图，其中，

脂质体依次通过各孔径核孔膜，平均粒径逐渐减小，粒径分布宽度和变异指数均显著缩小，脂质体通过100nm膜后，粒径大小、分布、均一性都符合动物实验体内要求。

图4显示了本发明中脂质体粒径稳定性，其中，

脂质体粒径在4℃下长期存放平均粒径变化不大，分布也基本维持不变。而37℃下粒径有一定程度增大，分布略增宽，提示温度对脂质体粒径变化有一定影响。溶液中蛋白对脂质体粒径影响不明显，与单纯4℃环境下存放脂质体粒径变化基本相仿，结果表明，蛋白对脂质体粒径稳定性影响较小。

图5显示了本发明中钆结合脂质体磁共振驰豫率测定结果，其中，

A：脂质体(Gd-SLs)驰豫率相关回归直线；

B：Gd-DTPA驰豫率相关回归直线；

通过A和B中的两拟合曲线，可分别得到两公式，其斜率即为对比剂的驰豫率(R)；结果显示，脂质体驰豫率为80.65mmol^-1·ms^-1，Gd-DTPA驰豫率为69.55mmol^-1·ms^-1；用比驰豫率比较两对比剂弛豫作用，R’＝R_A/R_B＝80.655/69.554＝1.16，结果表明，在常温下(26℃)，脂质体弛豫作用为Gd-DTPA的1.16倍。

图6显示了本发明中钆结合脂质体造影剂体外成像结果，其中，

A：脂质体对比剂T1加权成像图，1～5分别为不同浓度梯度稀释液；

B：Gd-DTPA T1加权成像图，1～5分别为不同浓度梯度稀释液；

配制两种浓度相同的Gd-脂质体及Gd-DTPA对比剂(钆浓度为16.7μmol/ml)，并按浓度梯度1、1/2、1/3、1/4、1/6进行稀释，进行磁共振T1加权成像：测量两对比剂MR信号，计算其平均信号(mean signal intensity)，并比较两者信号差异，结果显示Gd-脂质体/Gd-DTPA信号比值＝1.015；结果表明，所述的两种对比剂在相同浓度下磁共振T1成像作用接近，信号差异与驰豫率差异相仿。

图7为本发明中空间稳定免疫脂质体示意图，其中，在空间稳定脂质体(Gd-SLs)表面修饰的PEG端连接相应抗体，使具有靶向作用；

预定位的原理及步骤：首先给予能与靶向组织相应分子特异性结合的配体，一定作用时间后，配体在靶向组织内浓集，而血液中的配体经代谢清除，此时再给予能与配体结合的药物，使得药物迅速定位于靶向组织，明显提高局部浓度，并减少周围循环时间及毒副作用；本发明可应用该系统制备生物素化CD105单克隆抗体及链霉亲和素结合的空间稳定脂质体。

图8为本发明中免疫脂质体抗体结合前后粒径变化直方图，其中，

直方图显示免疫脂质体抗体结合前后粒径变化情况，可见抗体结合后，直方图右移，平均粒径增大，但分布变化不大。

图9显示了本发明中亲和素脂质体粒径变化情况，其中，

PDP-SLs及SAv-SLs粒径分布直方图对比，SAv-SLs平均粒径较PDP-SLs有所增大，但直方图分布形态无明显变化。

图10为本发明中生物素-亲和素作用后脂质体粒径变化直方图，其中，

MAb-Bio/SAv-SLs粒径直方图显示脂质体平均粒径明显增大，由SAv-SLs平均粒径115.1nm±37.6nm增加至267nm±142.8nm。

图11显示了本发明中脂质体形态电镜观察结果，其中，

透射电镜显示，Gd-SLs、MAb-SLs及SAv-SLs电镜下形态基本一致，表现为大小基本均匀、环形透明囊泡样结构，边缘清晰光整，而脂质体中央呈较均匀透光区，三种脂质体的粒径大小基本相近；将Bio-MAb与SAv-SLs混合后，SAv-SLs有相互聚集作用；

A图为Gd-SLs图，脂质体形态光整，大小较均匀；

B图为SAv-SLs图，大小形态与Gd-SLs基本相仿；

C图为Bio-MAb与SAv-SLs混合后所示脂质体形态，可见脂质体大量聚集，呈团样结构，提示生物素-亲和素间强烈作用介导的脂质体交链。

图12显示了本发明中大鼠尾静脉注射Gd-DTPA后不同时点进行MR成像结果，其中，

A～F图分别为T2加权图像、增强前T1加权图像、增强后即刻、20分钟、120分钟、24小时T1加权图像；可见，注射Gd-DTPA后即刻血管(图C黑箭)及肿瘤(图C白箭)均明显强化，20分钟肿瘤强化略减退，边缘模糊，于120分钟时血管强化明显减退，肿瘤轻度强化，24时点肿块边缘轻度强化，血管强化已消退。

图13为本发明中大鼠两步法(Bio-MAb/SAv-SLs)MR成像图，其中，

A～H图分别为T2加权图像、增强前T1加权图像、增强后即刻、20分钟、120分钟、8小时、24小时、48小时T1加权图像；可见，注射SAv-SLs后血管迅速明显强化，24小时点仍见轻度强化。肿瘤早期边缘强化，8小时点边缘环形强化已较清晰(图F白箭)，24小时及48小时强化环仍清晰(图G、H白箭)。

图14为本发明中各组肿瘤周边部及中央部ΔSI值之间差异图，其中，

仅E组肿瘤中央及周边部强化具有显著差异(P＝0.032)：

A组肿瘤明显强化，周边与中央强化无显著差别；

B、C组肿瘤强化不明显，且周边与中央强化亦无显著差别；

D组肿瘤强化较明显，但周边与中央强化无显著差异；

E组肿瘤强化明显，且周边部与中央部强化有差异，周边部强化高于中央部。

图15显示了本发明中大鼠胶质瘤CD105免疫组织化学染色结果，其中

A：肿瘤种植对侧正常脑组织；

B：肿瘤周边组织，可见较多染色阳性微血管影(白箭)；

C：肿瘤中央部组织微血管少；

结果显示，正常脑组织CD105染色基本呈阴性，且基本不表达阳性染色血管；而肿瘤细胞有轻度染色改变，提示肿瘤细胞亦有轻度CD105分子表达；肿瘤周边部组织内可见多发强阳性染色血管散在分布，而中央部组织多疏松，阳性血管较少或显示不明显。对肿瘤中央部及周边部微血管密度进行统计分析，显示两者具有显著差异性(P＝0.022)。

具体实施方式

实施例1

1、制备空间稳定脂质体

脂质体膜材料(DSPC/CHOL/mPEG-DSPE/Gd-DTPA-BSA)按36/36/3/25摩尔比例溶于适量无水氯仿和甲醇混合溶剂(容积比2∶1)中，40℃旋转蒸发去除溶剂，制备脂质膜，入常温真空干燥箱过夜去除痕量溶剂。按一定比例(100μmol脂质∶3ml)加入HEPES缓冲液(HBS，20mM HEPES，135mM NaCl，pH＝6.5)，剧烈涡旋，60℃水浴振荡水化2小时形成脂质悬液。悬液于60℃高压均质仪依次挤压通过孔径为400nm、200nm、100nm的核孔膜各10次，制得粒径约100～120nm的脂质体。

2、制备PDP-空间稳定脂质体(PDP-SLs)

PDP-空间稳定脂质体膜材料制备方法同第一部分相仿，但在脂质体膜材料中，需加入PDP-PEG-DSPE成分。PDP-PEG-DSPE的作用在于提供吡啶二硫丙酰基基团，经还原剂处理后可获得游离巯基，用于与抗体蛋白链接；膜材料(DSPC/CHOL/mPEG-DSPE/PDP-PEG-DSPE/Gd-DTPA-BSA)按36/36/2.4/0.6/25摩尔比例溶于适量无水氯仿和甲醇混合溶剂(容积比2∶1)中，40℃旋转蒸发去除溶剂，制备脂质膜，入常温真空干燥箱过夜去除痕量溶剂。按一定比例(100μmol脂质∶3ml)加入HEPES缓冲液(HBS，20mM HEPES，135mM NaCl，pH＝6.5)，剧烈涡旋，60℃水浴振荡水化2小时形成脂质悬液。悬液于60℃高压均质仪依次挤压通过孔径为400nm、200nm、100nm的核孔膜各10次，制得粒径约100nm的含PDP基团的脂质体(PDP-SLs)。

3、制备抗体结合-空间稳定脂质体(MAb-SLs)

(1)制备MPB-MAb

精密吸取适量SMPB DMF溶液(25m mol/L)，加入至10mg/ml CD105～MAb(分子量约90kD)溶液中，使两者摩尔比为20∶1，轻微搅拌，室温反应1小时。反应溶液入分子截留10kD超滤离心管，恒温离心机离心(4500rpm，15min)，取出后离心管内加入HEPES-Mes缓冲液(25mM HEPES，25Mm Mes，140mM NaCl，PH＝6.7)适量后再次离心，过程反复5次，去除反应溶液中未结合游离SMPB，制得含有游离马来酰亚胺基的MPB-MAb。

(2)制备HS-脂质体(HS-SLs)

在所制备PDP-PEG-DSPE成分的脂质体(PDP-SLS)中加入适量DTT溶液(1mol/L)，使DTT终浓度为20mmol/ml，轻微搅拌，室温反应半小时，使PDP基团还原。反应溶液G-50凝胶层析分离去除DTT，制得表面修饰含有游离巯基的HS-SLs。

(3)制备MAb-SLs

将所制备之MPB-MAb适量缓慢加入HS-SLs液中，使抗体与磷脂摩尔比约1∶1000，轻微搅拌，室温氮气环境下反应约16小时；反应液用经牛血清白蛋白预饱和的CL-4B凝胶层析分离去除未结合之MPB-MAb，制得抗体结合空间稳定脂质体CD105-SLs。

本实施例同时合成了结合同种型对照IgG蛋白的脂质体IgG-SLs，其合成方法与MAb-SLs的制备方法相同。

4、脂质体的浓缩

实验中所制备的各种脂质体溶液，其钆浓度多≤10μmol/ml，不能满足动物实验要求，因此对脂质体进行浓缩。利用超滤器可对脂质体进行超滤浓缩。条件参数：环境温度25℃以下，氮气压力0.1～0.2MPa，超滤器搅拌速度约100rpm，15nm超滤膜，约1～1.5ml/10min滤过速度。根据需要将脂质体超滤浓缩至所需体积。

5、制备生物素化单克隆抗体(Bio-MAb)

精密吸取适量Sulfo-NHS-LC-biotin DMSO溶液(10mg/L)，加入至10mg/mlCD105～MAb(分子量约90kD)溶液中，轻微搅拌，室温反应2h；反应溶液入分子截留10kD超滤离心管，恒温离心机离心(4500rpm，15min)，取出后离心管内加入HEPES-Mes缓冲液(25mM HEPES，25Mm Mes，140mM NaCl，PH＝6.7)适量后再次离心，过程反复5次，去除反应溶液中未结合之游离Sulfo-NHS-LC-biotin，制得生物素化单克隆抗体Bio-MAb。

6、制备亲和素结合-空间稳定脂质体(SAv-SLs)

(1)制备MPB-SAv

精密吸取适量SMPB DMF溶液(25mmol/L)，加入至10mg/ml SAv(分子量约60kD)溶液中，使两者摩尔比为20∶1，轻微搅拌，室温反应1小时；反应溶液入分子截留10kD超滤离心管，恒温离心机离心(4500rpm，15min)，取出后离心管内加入HEPES-Mes缓冲液(25mM HEPES，25mM Mes，140mM NaCl，PH＝6.7)适量后再次离心，过程反复5次，去除反应溶液中未结合之游离SMPB，制得MPB-SAv。

(2)制备SAv-SLs

将所制备之MPB-SAv适量缓慢加入新近制备的HS-SLs液中，使SAv与磷脂摩尔比约1∶1000，轻微搅拌，室温氮气环境下反应约16小时。反应液用经牛血清白蛋白预饱和的CL-4B凝胶层析分离去除未结合之MPB-SAv，制得SAv-SLs。

测定SAv-SLs的粒径：取适量SAv-SLs与等摩尔Bio-MAb室温下混合后，静置10min后测定粒径，观察两者结合后粒径变化。

结果显示，制得的胶质瘤靶向分子磁共振对比剂的具有以下优点：

(1)钆结合空间稳定脂质体(Gd-SLs)经高压均质仪过膜后粒径控制于117.4±31.8nm；脂质体Gd载药率达87％～100％；常温下(26℃)Gd-SLs磁共振驰豫率为Gd-DTPA的1.16倍，37℃为1.25倍；体外MR成像显示Gd-SLs与Gd-DTPA两对比剂MR T1加权成像作用接近；

(2)空间稳定脂质体结合单克隆抗体后粒径由116.1nm±33.9nm增加至129.9nm±40.9nm，于4℃保存7、14、42天，平均粒径及分布变化较小；将Bio-MAb与SAv-SLs混合10min后，平均粒径增大到(267nm±142.8nm)，分布增宽；免疫脂质体抗体结合率为52～67％，相应抗体/磷脂比例约为47～60μg/μmol；透射电镜显示，脂质体为均匀大小囊泡样结构，将Bio-MAb与SAv-SLs混合后，SAv-SLs有相互聚集作用。

实施例2  大鼠胶质瘤新生血管内皮细胞Endoglin靶的MR分子成像实验

取建立的25只大鼠原位胶质瘤动物模型随机分为A～E共5组，每组5只，分别尾静脉注射钆喷酸葡胺(Gd-DTPA)、空白脂质体(Gd-SLs)、同种型对照IgG脂质体(IgG-SLs)、结合Endoglin单克隆抗体的免疫脂质体探针(MAb-SLs)行MR成像，两步法预定位成像大鼠预先给予生物素化单克隆抗体(Bio-MAb)后再给予链霉亲和素脂质体探针(SAv-SLs)进行成像；比较各组大鼠MR T1加权增强图像肿瘤强化表现的差异，分析各组动脉血管、正常脑组织及肌组织、肿瘤组织时间-信号增强特点；比较各组间肿瘤强化程度及强化范围差异、比较组内肿瘤中央部及周边部强化差异；比较各组间肿瘤强化形态的差异；大鼠胶质瘤CD105免疫组织化学染色肿瘤中央部及周边部新生血管计数，比较两者差异。荷瘤大鼠MR成像结果显示：

①动脉增强表现：注射Gd-DTPA后，动脉血液快速明显强化，即刻达峰值，2小时基本消退，时间-信号曲线呈快进-快出类型；B～E组大鼠注射相应分子探针后，血管强化表现接近，早期快速明显强化，强化峰值于20～60min出现，之后强化信号缓慢下降，于48小时恢复至增强前水平，其时间-信号曲线表现为快进-平台-缓出类型；

②肿瘤强化表现：注射Gd-DTPA后，肿瘤迅速强化达峰值，20min强化即有减退，2小时强化信号约为峰值强度30％，24小时完全退出；注射Gd-SLs及IgG-SLs，肿瘤早期强化不明显，60～120min达峰值呈轻度强化，48小时强化信号为峰值强度42～58％；注射MAb-SLs及Bio-MAb/SAv-SLs两步法成像，肿瘤周边及中央信号迅速增高，于8小时达峰值，后缓慢下降，注射MAb-SLs后肿瘤中央与周边强化程度相仿，而两步法成像周边强化明显高于中央部(P＝0.032)；

③肿瘤强化形态分析的结果显示，注射Gd-DTPA整个肿瘤不均匀强化，Gd-SLs及IgG-SLs组以肿瘤边缘点状强化为主，MAb-SLs及Bio-MAb/SAv-SLs两步法成像肿瘤增强以边缘环形强化为主，而两步法成像肿瘤边缘强化环显示更为清晰；免疫组织化学染色的结果显示，CD105阳性微血管主要沿肿瘤周边分布。

结果显示，在主动靶向识别肿瘤新生血管时，所述分子探针不需通过血脑屏障就可与胶质瘤新生微血管结合，并通过生物素-亲和素系统使MRI信号放大，实现高分辨率的胶质瘤特异性靶向成像；结果表明，所述生物素-亲和素介导的两步法成像具备有效性。

Claims (10)

1.一种胶质瘤靶向分子磁共振对比剂，其特征在于，其包括生物素化单克隆抗体及链霉亲和素结合包载Gd的空间稳定免疫脂质体两种复合物，具有如下结构：MAb-X-Y-Z-Gd；

其中，MAb为特定分子的单克隆抗体，X为生物素Bio及其衍生物，Y为亲和素或链霉亲和素SAv、Z为空间稳定脂质体SLs，Gd为用于磁共振增强成像的钆螯合剂。

2.按权利要求1所述的胶质瘤靶向分子磁共振对比剂，其特征在于，所述的MAb为具有高度均质性、仅识别单一抗原决定簇的抗体分子，抗体蛋白内具有氨基或巯基活性基团。

3.按权利要求1所述的胶质瘤靶向分子磁共振对比剂，其特征在于，所述的生物素Bio及其衍生物X，其末端提供N-羟基琥珀酰亚胺或马来亚酰胺活性基团。

4.按权利要求1所述的胶质瘤靶向分子磁共振对比剂，其特征在于，所述的Y为亲和素或链霉亲和素大分子蛋白质。

5.按权利要求1所述的胶质瘤靶向分子磁共振对比剂，其特征在于，所述的空间稳定脂质体SLs，其中包含的磷脂衍生物表面提供巯基或马来酰亚胺或N-羟基琥珀酰亚胺活性基团。

6.按权利要求1所述的胶质瘤靶向分子磁共振对比剂，其特征在于，所述的Gd为磁共振影像标记物钆的螯合物衍生物，其中，螯合物为二乙基三胺五乙酸其经羧基与硬脂酸胺上的氨基共价连接。

7.按权利要求7所述的胶质瘤靶向分子磁共振对比剂，其特征在于，所述的Gd螯合物衍生物有2个硬脂酸胺链，形成双链，与磷脂结构类似。

8.权利要求1的胶质瘤靶向分子磁共振对比剂的制备方法，其特征在于，其包括步骤：

(1)制备空间稳定脂质体：

将脂质体膜材料，二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰乙醇胺、钆-二乙三胺五醋酸-二硬脂酰胺按一定摩尔比例溶于氯仿甲醇混合溶剂中，经40℃旋转蒸发，60℃水化，高压均质仪挤压过膜，制备包载顺磁性物质的空间稳定脂质体；

(2)，评价脂质体的粒径、稳定性、钆含量、磁共振驰豫率及体外MR成像作用；

(3)制备基于Endoglin靶的空间稳定免疫脂质体及预定位脂质体分子探针：

①上述Gd-SLs成膜过程中，加入膜材料吡啶二硫丙酰基-聚乙二醇(2000)-二硬脂酰乙醇胺，制备表面修饰结合PDP基团脂质体，经二硫苏糖醇还原，制得表面结合游离巯基的脂质体；

②所述CD105单克隆抗体与丁二酰亚胺-4-(对-马来酰亚胺-苯基)-丁酸酯反应，制备马来酰亚胺苯基丁酰基单克隆抗体；

③将所述表面结合游离巯基的脂质体HS-SLs与制得的马来酰亚胺苯基丁酰基单克隆抗体MPB-MAb反应，制得表面连接抗体的空间稳定脂质体；

④将生物素氨基己糖酸-3-磺酸基-N-羟基琥珀酰亚胺酯与所述CD105～MAb反应，制得生物素化单克隆抗体；

⑤链霉亲和素结合空间稳定脂质体的制备过程与MAb-SLs基本相同，将HS-SLs与马来酰亚胺苯基丁酰基链霉亲和素作用，制得链霉亲和素结合空间稳定脂质体；

9.按权利要求8的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的脂质体膜材料，二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰乙醇胺、钆-二乙三胺五醋酸-二硬脂酰胺的摩尔比例为总磷脂∶胆固醇摩尔比＝2∶1，mPEG-DSPE摩尔百分比控制于3％～5％，Gd-DTPA-BSA摩尔百分比控制于20％～35％；所述氯仿甲醇混合溶剂为2∶1容积。

10.权利要求1的胶质瘤靶向分子磁共振对比剂在制备磁共振分子成像探针中的用途。

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