CN109481700A - 一种用于肝癌早期诊断的分子探针及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于肝癌早期诊断的分子探针及其制备方法,属于高分子材料和医学工程技术领域。本发明的分子探针为两亲性共聚物形成的核壳结构,内核层由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺片段形成,外壳层由聚乙二醇片段形成,所述内核层中包裹超顺磁性纳米颗粒,所述外壳层末端与B6短肽相连接,所述外壳层表面与Cy5.5‑N‑羟基琥珀酰亚胺酯相连接。本发明的分子探针具有MRI/荧光双模态、双靶点、高灵敏度、高分辨率和生物相容性良好的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于肝癌早期诊断的分子探针及其制备方法,属于高分子材料和医学工程技术领域。
背景技术
肝癌的早期诊断和治疗是摆在各国科学家面前亟待攻克的难题,目前全世界每年新发肝癌患者约六十万,居恶性肿瘤的第五位。中国肝癌病人约占全球发病人数的55%,已经严重威胁我国人民健康和生命。由于肝癌多由肝炎和肝硬化转移而来,恶性程度高,手术切除后容易转移和复发,因此临床上仍普遍采用口服或注射的抗癌化疗药物治疗(化疗)。然而,药物在肿瘤部位的特异性聚集效果不佳,缺乏有效的靶向技术,导致正常细胞也受到药物的攻击,不可避免地产生毒副作用;而且治疗过程与成像示踪(或诊断)亦不能同时进行,对迅速发展、转移的肿瘤遏制效果有限。因此,发展集靶向治疗与成像示踪于一体的新技术手段,成为目前肝癌诊疗中面临的一个重要课题。
分子影像学是采用非侵入性的手段在活体内表征、量度和观测人或者动物体内的细胞水平和分子水平的生物学过程,并对之进行成定性和定量的研究。与传统影像学相比,在疾病诊断方面,它能够在机体完整的微环境状态下对体内组织器官微观病变进行分子水平的探测与显像,因此可以从生理、生化水平认识疾病,阐明病变组织生物过程的变化、病变细胞基因表达、代谢活性以及细胞层面生物活动的状态,为早期诊断、治疗和病理的研究提供分子水平信息。分子探针是分子显像的关键,在分子成像中对分子探针的要求包括:具备生物学兼容性,能够在人体参与正常生理代谢;能够克服生理屏障,如血管壁、脑屏障、细胞膜等;分子探针和靶向分子的结合具有高度的灵敏度、特异性。
2004年,Gao等(Nat.Biotechnol.,2004,22:969-976)首次对小动物体内肿瘤进行了活体成像,他们用聚合物纳米颗粒层和聚乙二醇包覆量子点,并将其附着在前列腺特异性的单克隆抗体上,然后将这种量子点注射到有前列腺肿瘤的裸鼠循环系统。通过荧光成像分析技术发现,量子点主要聚集在肿瘤周围。荧光成像分析可得到实体瘤敏感的多色荧光图,获得肿瘤大小和定位信息。Nasongkla等(Nano Lett.,2006,6:2427-2430)对载有超顺磁性铁氧化物的聚合物胶束进行了系统研究,发现其在癌细胞双重靶向输运和磁共振成像(MRI)方面有很好的应用前景,对于恶性肿瘤的诊断具有重要意义。
MRI探针要想用于肝癌的早期诊断,还存在如下几个严峻的挑战:(1)尽可能小的粒径;小的粒径是保障探针克服各种生物传递屏障,进入靶部位的前提,同时也可避免探针堵塞肺部毛细血管。(2)增强特异性和敏感性;需要寻找特异性更强的靶向分子,以实现探针的高度特异性,增强靶区信号改变的同时降低非特异性区域的背景信号。(3)在核素的选择上,简化核素标记反应的步骤,提高标记反应的得率,缩短标记反应和纯化的时间。
然而,目前所使用的成像技术均有一个共同的缺点:灵敏度低、准确性差,尤其不能对肿瘤部位的边界进行很明确的确定,不利于肿瘤的切除与治疗。相对于其他成像技术而言,纳米颗粒通过与靶向分子偶联,可以增强其在靶部位的富集,起到更优的成像或治疗效果。而快速、便捷的荧光成像技术正好弥补这一缺陷,因此,多模态成像已成为分子影像发展的趋势。其中,MRI/荧光成像既能发挥荧光的功能分子显像特性,又能发挥MRI的高分辨的解剖学特性以及MRI功能特性,且避免了CT的电离损伤。MRI/荧光成像技术的发展对MRI/荧光多功能分子影像探针的研究提出需求,高度特异性、成像多功能化以及良好的生物相容性成为亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种用于肝癌早期诊断的分子探针及其制备方法,本发明的分子探针具有MRI/荧光双模态、双靶点、高灵敏度、高分辨率和生物相容性良好的优点。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案为:一种用于肝癌早期诊断的分子探针,所述分子探针为两亲性共聚物形成的核壳结构,内核层由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺片段形成,外壳层由聚乙二醇片段形成,所述内核层中包裹超顺磁性纳米颗粒,所述外壳层末端与B6短肽相连接,所述外壳层表面与Cy5.5-N-羟基琥珀酰亚胺酯相连接。
本发明以与肝癌细胞特异性结合的B6短肽(氨基酸序列为:CGHKAKGPRK)为靶标,制备聚合物纳米胶束载体(DSPE-PEG),同时将超顺磁性铁氧体纳米粒子(SPIO)通过疏水静电作用与载体组装复合在一起,最后将Cy5.5-N-羟基琥珀酰亚胺酯修饰在胶束表面,合成胶束(SPIO-DSPE-PEG-Cy5.5/B6),构筑用于肝癌早期诊断的具有MRI/荧光双模态靶向成像的分子探针。
本发明的分子探针为纳米载体,采用两亲性共聚物形成的一种核壳结构,其内核层由疏水性二硬脂酰磷脂酰乙醇胺片段形成,外壳层由亲水性聚乙二醇片段形成,B6多肽分子通过酰胺化反应连接在胶束亲水表面,Cy5.5-N-羟基琥珀酰亚胺酯通过载体表面氨基修饰。本发明的分子探针可以实现靶向聚集在肿瘤部位成像,且同时控制药物的释放。
本发明在纳米载体的自组装过程中,将疏水性磁性纳米粒子包裹在聚合物载体的疏水内核中,并将靶向基团B6短肽分子偶联在亲水性链末端,保证胶束形成后靶向分子位于载体的外壳层,同时将荧光染料分子Cy5.5-N-羟基琥珀酰亚胺酯通过纳米载体表面的官能团进行连接,合成本发明提出的双模态靶向性纳米胶束探针B6-DSPE-PEG-SPION/Cy5.5,使其具备肝癌细胞主动靶向识别和MRI/荧光显影效果。
作为本发明所述分子探针的优选实施方式,所述分子探针的粒径为50~250nm。
作为本发明所述分子探针的优选实施方式,所述超顺磁性纳米颗粒的粒径为5~30nm。
作为本发明所述分子探针的优选实施方式,所述B6短肽的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。
作为本发明所述分子探针的优选实施方式,所述分子探针包含以下重量份的组分:二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-氨基5~20份、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺5~20份、超顺磁性纳米颗粒1~5份、Cy5.5-N-羟基琥珀酰亚胺酯十分之一至百分之一份、B6短肽百万分之一份至十万分之一份。
作为本发明所述分子探针的优选实施方式,所述超顺磁性纳米颗粒的制备方法为:将三乙酰丙酮铁、二乙酰丙酮锰、二乙酰丙酮锌与1,2-十六烷二醇混合,然后加入油酸和油胺,并加入二苄醚作为溶剂,氩气保护下反应,200℃反应2h,然后加热至300℃回流反应0.5h,得到超顺磁性纳米颗粒。
本发明还提供了上述分子探针的制备方法,包括以下步骤:
(1)将超顺磁性纳米颗粒加入四氢呋喃中,并加入二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-氨基、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺混合,室温下超声,加入至去离子水中,得混合溶液;
(2)将步骤(1)所得的混合溶液置于透析袋中透析,收集透析袋中的胶束水溶液,然后冷冻干燥,得粉末状固体;
(3)将步骤(2)所得的粉末状固体配制成胶束溶液,加入Cy5.5-N-羟基琥珀酰亚胺酯、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺,活化后加入N-羟基琥珀酰亚胺发生反应,然后加入B6短肽,反应过夜;
(4)将步骤(3)的反应液在蒸馏水中透析,将透析后的溶液冷冻干燥得到分子探针。
作为本发明所述分子探针的制备方法的优选实施方式,所述步骤(1)中,超声时间为10min。
作为本发明所述分子探针的制备方法的优选实施方式,所述步骤(2)中,透析袋的截留分子量为8000~14000D,透析时每6h换水一次,透析时间为24h,冷冻干燥时间为20h。
作为本发明所述分子探针的制备方法的优选实施方式,所述步骤(3)中,胶束溶液的浓度为2mg/mL,粉末状固体与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:2:2,活化时间为10min,加入N-羟基琥珀酰亚胺的反应时间为2h;所述步骤(4)中,透析袋的截留分子量为5000D,透析时每6h换水一次。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:本发明以肺癌的早期诊断为出发点,通过对靶点MRI/荧光双模态多功能分子影像探针的制备、性能、体内与体外生物学行为及影像学评价等重大科学问题的研究,发展出创新的超小粒径超顺磁性纳米颗粒制备、核素标记、小分子多肽筛选及多模态成像系统集成的新方法,在此基础上形成具有MRI/荧光双模态、双靶点、高灵敏度、高分辨率和良好的生物相容性的新一代MRI/荧光分子影像探针制备技术。
附图说明
图1为实施例1制备的分子探针的透射电子显微镜照片图。
图2为实施例2制备的分子探针的透射电子显微镜照片图。
图3为对比例1制备的分子探针的透射电子显微镜照片图。
图4为对比例2制备的分子探针的透射电子显微镜照片图。
图5为效果例1中MRI-T2WI图像的信号统计图。
图6为效果例2中小鼠的荧光成像图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点,下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明实施例中所采用的试验方法,如无特殊说明均为常规方法;所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到,其中,B6短肽来源于上海吉尔生化有限公司。
本发明实施例中,超顺磁性纳米颗粒的制备方法如下:
将2mmol Fe(acac)3(三乙酰丙酮铁)、0.6mmol Mn(acac)2(二乙酰丙酮锰)、0.4mmol Zn(acac)2(二乙酰丙酮锌)与10mmol 1,2-十六烷二醇装入反应容器中混合,再分别加入3mmol油酸和3mmol油胺,并加入10mL二苄醚作溶剂,在氩气保护下磁力搅拌,加热至200℃保温2h,然后加热至300℃回流反应0.5h。冷却至室温后,在反应产物中加入40mL乙醇后离心(8000rpm,10min)得到棕黑色的沉淀物,除去滤液,向沉淀中加入0.05mL油酸和0.05mL油酰胺后,用正己烷将沉淀物溶解分散。离心(8000rpm,10min)后除去未分散的杂质,再次在无水乙醇中沉淀离心(8000rpm,10min),最后分散在正己烷中保存。
实施例1
本发明分子探针的一个实施例,其制备方法如下:
(1)称取重量组分1份粒径约5nm的超顺磁性纳米颗粒,加入5mL四氢呋喃,将混合物与重量组分5份二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-氨基和重量组分5份磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺混合后,室温下超声10min,使聚合物和磁性纳米粒子充分分散和溶解,超声条件下逐滴加入至100mL去离子水中,得混合液;
(2)将混合液置于透析袋(分子量:8000~14000D)中,每6小时换水一次,透析24小时后得到胶束水溶液,透析结束后,收集透析袋中形成的胶束水溶液,然后冷冻干燥20h,得到粉末状固体;
(3)将步骤(2)得到的粉末状固体配制成胶束溶液2.5mL,加入重量组分万分之一份荧光染料Cy-5.5-NHS(Cy5.5-N-羟基琥珀酰亚胺酯),加入粉末状固体重量2倍的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺),活化10min后加入粉末状固体重量2倍的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺),反应2h;然后加入重量组分十万分之一份B6短肽,反应过夜;
(4)将步骤(3)的反应液用5000D的透析袋在蒸馏水中透析,除去游离的B6短肽,6h换水一次;将胶束水溶液冷冻干燥得到分子探针。
用动态激光光散射仪测定本实施例粒子的粒径分布。图1为本实施例分子探针的透射电子显微镜照片图。由图1可知,本实施例的平均粒径为142nm,粒子呈球形,多分散性为0.235,分散比较均匀。
实施例2
本发明分子探针的一个实施例,其制备方法如下:
(1)称取重量组分5份粒径约20nm的超顺磁性纳米颗粒,加入5mL四氢呋喃,将混合物与重量组分20份mg二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-氨基和重量组分20份磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺混合后,室温下超声10min,使聚合物和磁性纳米粒子充分分散和溶解,超声条件下逐滴加入至100mL去离子水中,得混合液;
(2)将混合液置于透析袋(分子量:8000~14000D)中,每6小时换水一次,透析24小时后得到胶束水溶液,透析结束后,收集透析袋中形成的胶束水溶液,然后冷冻干燥20h,得到粉末状固体;
(3)将步骤(2)得到的粉末状固体配制成胶束溶液2.5mL(2mg/mL),加入重量组分十万分之一份荧光染料Cy-5.5-NHS(Cy5.5-N-羟基琥珀酰亚胺酯),加入粉末状固体重量2倍的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺),活化10min后加入粉末状固体重量2倍的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺),反应2h;然后加入重量组分百万分之一份B6短肽,反应过夜;
(4)将步骤(3)的反应液用5000D的透析袋在蒸馏水中透析,除去游离的B6短肽,6h换水一次;将胶束水溶液冷冻干燥得到分子探针。
用动态激光光散射仪测定本实施例的粒径分布,图2为本实施例的透射电子显微镜照片图。由图2可知,本实施例的平均粒径为120nm,粒子呈球形,多分散性为0.219,分散比较均匀。
对比例1
称取50mg粒径约25nm的超顺磁性纳米颗粒,加入5mL四氢呋喃,将混合物与50mg二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺混合后,室温下超声10min,使聚合物和磁性纳米粒子充分分散和溶解,超声条件下逐滴加入至100mL去离子水中;将溶液至于透析袋(分子量:8000~14000D)中,每6小时换水一次,透析24小时后得到胶束水溶液;透析结束后,收集透析袋中形成的胶束水溶液,然后冷冻干燥20小时,得到粉末状固体。
用动态激光光散射仪测定粒子的粒径分布,图3为本对比例的透射电子显微镜照片图。由图3可知,平均粒径为112nm,粒子呈球形,多分散性为0.201,分散比较均匀。
对比例2
称取50mg粒径约20nm的超顺磁性纳米颗粒,加入5mL四氢呋喃,将混合物与50mg磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-氨基混合后,室温下超声10min,使聚合物和磁性纳米粒子充分分散和溶解,超声条件下逐滴加入至100mL去离子水中;将溶液至于透析袋(分子量:8000~14000D)中,每6小时换水一次,透析24小时后得到胶束水溶液;透析结束后,收集透析袋中形成的胶束水溶液,然后冷冻干燥20小时,得到粉末状固体;配制胶束溶液2.5mL(2mg/mL),加入3mg荧光染料Cy-5.5-NHS,反应5h,然后冷冻干燥20小时,得到粉末状固体。
用动态激光光散射仪测定粒子的粒径分布,图4为本对比例的透射电子显微镜照片图。由图4可知,平均粒径为138nm,粒子呈球形,多分散性为0.218,分散比较均匀。
效果例1本发明实施例1分子探针的体外靶向效果
构建HepG2肝癌荷瘤小鼠模型,荷瘤小鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉后,俯卧位固定于实验板上,用注射器抽取浓度为0.1mg/mL的对比例1和实施例1制得的制剂0.2mL,缓慢注入尾静脉。注射完毕轻轻拔出针头,立即用无菌纱布轻压针孔,至皮肤表面不再渗液。注射4h及注射后48小时行MRI T2加权成像。肿瘤组织注射纳米材料后,MRI-T2WI图像显示肿瘤内部出现条片状、斑片状低信号区。信号统计图如图5所示,由图5可知,注射实施例1材料的裸鼠肿瘤的低信号比注射对比例1材料的裸鼠高32%。表明本发明的分子探针可以聚集于肿瘤组织,具有良好的靶向性。
效果例2本发明实施例1分子探针的荧光成像效果
构建HepG2肝癌荷瘤小鼠模型,将实施例1和对比例2的材料尾静脉注射至荷瘤裸鼠,在注射后1、2、4、6、24小时5个时间点放置入活体动物成像仪成像,将发射波长及激发波长设置为662nm和646nm,如图6所示。由图6可知,尾静脉注射后进行活体成像观察,发现纳米材料向肿瘤组织聚集,于注射后12小时达到最高,并可持续至24小时;注射实施例1材料的裸鼠肿瘤在各个时间点的浓度和面积均大于对比例2材料。
最后所应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州贝奥吉因生物科技有限公司
<120> 一种用于肝癌早期诊断的分子探针及其制备方法
<130> 20181120
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Cys Gly His Lys Ala Lys Gly Pro Arg Lys
1 5 10
Claims (10)
1.一种用于肝癌早期诊断的分子探针,其特征在于,所述分子探针为两亲性共聚物形成的核壳结构,内核层由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺片段形成,外壳层由聚乙二醇片段形成,所述内核层中包裹超顺磁性纳米颗粒,所述外壳层末端与B6短肽相连接,所述外壳层表面与Cy5.5-N-羟基琥珀酰亚胺酯相连接。
2.如权利要求1所述的分子探针,其特征在于,所述分子探针的粒径为50~250nm。
3.如权利要求1所述的分子探针,其特征在于,所述超顺磁性纳米颗粒的粒径为5~30nm。
4.如权利要求1所述的分子探针,其特征在于,所述B6短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
5.如权利要求1所述的分子探针,其特征在于,所述分子探针包含以下重量份的组分:二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-氨基5~20份、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺5~20份、超顺磁性纳米颗粒1~5份、Cy5.5-N-羟基琥珀酰亚胺酯万分之一至十万分之一份、B6短肽十万分之一至百万分之一份。
6.如权利要求1所述的分子探针,其特征在于,所述超顺磁性纳米颗粒的制备方法为:将三乙酰丙酮铁、二乙酰丙酮锰、二乙酰丙酮锌与1,2-十六烷二醇混合,然后加入油酸和油胺,并加入二苄醚作为溶剂,氩气保护下反应,200℃反应2h,然后加热至300℃回流反应0.5h,得到超顺磁性纳米颗粒。
7.如权利要求1~6任一项所述的分子探针的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将超顺磁性纳米颗粒加入四氢呋喃中,并加入二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-氨基、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺混合,室温下超声,加入至去离子水中,得混合溶液;
(2)将步骤(1)所得的混合溶液置于透析袋中透析,收集透析袋中的胶束水溶液,然后冷冻干燥,得粉末状固体;
(3)将步骤(2)所得的粉末状固体配制成胶束溶液,加入Cy5.5-N-羟基琥珀酰亚胺酯、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺,活化后加入N-羟基琥珀酰亚胺发生反应,然后加入B6短肽,反应过夜;
(4)将步骤(3)的反应液在蒸馏水中透析,将透析后的溶液冷冻干燥得到分子探针。
8.如权利要求7所述的分子探针的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中,超声时间为10min。
9.如权利要求7所述的分子探针的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中,透析袋的截留分子量为8000~14000D,透析时每6h换水一次,透析时间为24h,冷冻干燥时间为20h。
10.如权利要求7所述的分子探针的制备方法,其特征在于,所述步骤(3)中,胶束溶液的浓度为2mg/mL,粉末状固体与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:2:2,活化时间为10min,加入N-羟基琥珀酰亚胺的反应时间为2h;所述步骤(4)中,透析袋的截留分子量为5000D,透析时每6h换水一次。
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