CN102058891A - 聚乙二醇修饰的荧光磁性硅纳米载体及制法和应用 - Google Patents
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Abstract
一种荧光磁性硅纳米载体，以顺磁性Fe3O4为内核，包埋在二氧化硅形成的硅壳中间；该硅纳米载体中同时包埋有荧光物质；该硅纳米载体的表面分别修饰有氨基聚酰胺-胺树枝状大分子及聚乙二醇分子。制备方法是，共沉淀法制备超顺磁性Fe3O4，用二氧化硅包埋Fe3O4和荧光染料，通过增加纳米载体表面氨基数将更多的聚乙二醇修饰在硅纳米载体表面。该载体不仅能荧光示踪、磁共振造影，还可用于连接针对靶组织的抗体、配体、配基和药物等。与未修饰的荧光磁性硅纳米载体相比，经聚乙二醇修饰的载体延长了其在血液中的循环时间，进而提高了载体穿越血脑屏障的能力，为脑部疾病的诊断及治疗提供了一条新的途径。
Description
技术领域
本发明属于基因和药物转运领域，具体地涉及一种荧光磁性硅纳米载体。
本发明还涉及上述荧光磁性硅纳米载体的制备方法。
本发明还涉及上述荧光磁性硅纳米载体在制备治疗脑部疾病药物和制备作为细胞标记药物中的应用。
背景技术
各种恶性肿瘤及帕金森病等中枢神经系统的疾病严重威胁着人类的健康，脑部药物治疗的最大障碍是由于血脑屏障的存在，几乎所有大分子药物和98％的小分子药物都不能透过血脑屏障，而纳米技术的应用因其粒径超小，比表面积大等优点为非创伤性转运药物或基因入脑提供了一种很有潜力的脑部给药方式。
本发明所合成的荧光磁性硅纳米载体(FMSNs)兼具荧光示踪与核磁共振造影技术的功能，并可以载药将诊断和治疗相结合，还可以应用于细胞标记、细胞定量分析和磁性分离等。
但据目前报道，荧光磁性硅纳米载体尚不能跨越血脑屏障进入脑实质，且该纳米载体还存在荧光泄漏；血液循环半衰期短，易被网状内皮系统(RES)吞噬等缺陷。
发明内容
本发明的目的在于提供一种PEG通过PAMAM修饰的荧光磁性硅纳米载体。
本发明的又一目的在于通过PAMAM的键合增加大量官能团进而大大增加PEG的结合量，促使荧光磁性硅纳米载体克服血脑屏障进入脑实质，并且还缓解了荧光泄露问题；同时也提供制备上述荧光磁性硅纳米载体的方法。
为实现上述目的，本发明提供的荧光磁性硅纳米载体，以直径5纳米～10纳米的顺磁性Fe3O4为内核，包埋在二氧化硅形成的硅壳内部；该硅纳米载体中同时包埋有荧光物质；该硅纳米载体的表面分别修饰有氨基的聚酰胺-胺树状大分子(PAMAM)及聚乙二醇分子(PEG)。
所述的荧光磁性硅纳米载体，其中，所述荧光物质为荧光素异硫氰酸酯或罗丹明异硫氰酸酯。
本发明提供的制备上述表面修饰有聚乙二醇的荧光磁性硅纳米载体，其主要步骤为：
将聚酰胺-胺树枝状大分子修饰的荧光磁性硅纳米载体(PFMSNs)分散在无水甲醇溶液中，加入聚乙二醇，避光搅拌，用磁铁从反应溶液中分离出棕黄色的固体，所得固体采用倾注法用双蒸水洗涤，真空干燥，得到表面修饰有聚乙二醇的荧光磁性硅纳米载体(PEG-PFMSNs)。
所述的方法，其中，所述聚酰胺-胺树状大分子包括所有商品化的半代和整代及其对硅球的直接修饰。
所述的方法，其中，所述聚乙二醇包括在硅球上所有分子量的聚乙二醇大分子。
本发明的荧光磁性硅纳米载体可以用于制备治疗脑部疾病的药物，以及用于制备诊断脑部疾病的试剂。
本发明的荧光磁性硅纳米载体还可以用于制备作为细胞标记药物。
本发明首次分别将聚乙二醇分子以及聚酰胺-胺树状大分子共价键合在荧光磁性硅纳米载体的表面，同时载体内部镶嵌的荧光染料不仅可以用于荧光示踪又可以作为模型药物研究。该载体表面由于覆盖聚酰胺-胺树状分子，具有大量可供修饰的官能团，可用于连接更易于靶向血脑屏障的抗体而成为具有靶向药物载体的潜力。研究结果表明：此材料通过颈动脉注射，可以穿越血脑屏障，从而使其在诊断和治疗脑部疾病方面具有巨大的潜力。
附图说明
图1是本发明PEG-PFMSNs的透射电子显微镜(TEM)图。
图2是载体的热失重分析(TGA)图；其中：
曲线A是公知产品FMSNs；
曲线B是本发明中间产品PFMSNs；
曲线C是本发明PEG-PFMSNs；图中的横坐标为温度，纵坐标为剩余重量百分数。
图3是载体的Zeta电势图。
图4是大鼠颈动脉注射载体后脑内分布情况。
图5是大鼠颈动脉注射载体后，脑组织亚细胞水平透射电子显微镜结果。其中，图5a中，本发明载体位于脑血管内皮细胞膜中；图5b及d中，本发明载体位于神经元轴突中；图5c中，本发明载体位于神经元树突中；图5e为脑血管切面图；图5f为图5e中血管的局部放大图(表示血管内皮细胞紧密连接完好，细胞膜结构完整)；
图6是大鼠颈动脉注射载体后，脑组织切片神经元细胞免疫荧光染色后分析结果。其中，图6a为单纯激发红色荧光时显示的神经元免疫荧光染色结果；图6b为单纯激发绿色荧光时显示的本发明载体自带绿色荧光结果图；图6c为a和b的叠加图。
具体实施方式
本发明为了改善硅纳米粒的生物相容性，解决泄露的问题并提高表面官能团数量，用高聚物聚酰胺-胺树枝状大分子(PAMAM)对其表面进行修饰，不仅阻止了荧光分子或药物分子的泄漏，改善了生物不相容和聚集的问题，而且也使载体具有更多可供载药或基因的官能团；更重要的是，本发明选用了柔软有弹性且水溶性好的聚乙二醇分子(PEG)修饰在PAMAM的外围来解决载体血液半衰期短以及易被RES系统吞噬的问题。PEG的柔性链可以阻止血浆蛋白对硅纳米载体的吸附，减少了被RES系统识别吞噬的可能性，从而延长了载体在血液中的循环时间，增加细胞内外的浓度梯度，促进载体穿越血脑屏障。
PAMAM、PEG的键合，不仅克服了荧光磁性硅纳米载体的一些缺陷，更重要的是改变了它在体内的过程，使其能够有效穿越血脑屏障，为载体穿越血脑屏障并同时达到诊断和治疗脑部疾病的目的提供了理论基础。
本发明提供了表面修饰有聚乙二醇的荧光磁性硅纳米载体。为叙述上的方便，将表面修饰有聚乙二醇的荧光磁性硅纳米载体用PEG-PFMSNs表示，如图1所示。
聚乙二醇通过树状分子修饰的荧光磁性硅纳米载体，具有好的光稳定性和生物相容性，不仅用来实现高效、稳定的体内外组织或细胞的标记和造影，同时由于内部可以包覆、纳米载体中PAMAM的氨基可以共价或物理结合药物、DNA等，因此可用作基因和药物载体。
本发明的聚乙二醇修饰的荧光磁性硅纳米载体，用来评估对血脑屏障的穿透能力。
本发明制备荧光磁性硅纳米载体的方法中：
采用共沉淀法制备Fe3O4，在FeCl3·6H2O、(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O、NH3·H2O、油酸及水的存在下，制得了Fe3O4磁性纳米粒子。
采用的是油包水微乳液法制备FMSNs，将Fe3O4粉末悬浮在环己烷中，加入曲拉通X-100、正己醇、H2O、正硅酸乙酯(TEOS)，搅拌后加入氨水，通过TEOS的水解和缩聚，在磁性Fe3O4外面形成第一层二氧化硅，再加FITC-APS的乙醇溶液和TEOS，反应形成FITC镶嵌的二氧化硅包覆层。
PEG-PFMSNs的制备，采用了聚酰胺-胺树状大分子对FMSNs进行修饰，增加了表面的官能团数目，然后将PEG修饰到PFMSNs的表面上，得到PEG-PFMSNs。
本发明提供的PEG-PFMSNs，由于在荧光磁性硅纳米载体(FMSNs)表面共价键合了聚乙二醇分子及聚酰胺-胺树状大分子，有效的覆盖了硅壳表面的FITC分子，避免了其对周围环境的接触所导致的毒副作用。同时阻止了纳米粒包覆的FITC的外泄，保持了FITC的光稳定性。
本发明提供的载体，在进行颈动脉注射后，能有效地穿越血脑屏障；且穿越机制为跨胞作用，为诊断和治疗脑部疾病开辟了一条新的途径。
实施例1
1)Fe3O4的制备：
采用Lopez-Lopez et al法合成油酸包被的Fe3O4磁性纳米粒子：将3.04g FeCl3·6H2O与2.65g(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O混合(摩尔比Fe3+∶Fe2+＝2∶1.2)，溶于40ml水中，剧烈搅拌并超声，迅速加入8ml NH3·H2O(25％)和0.8ml油酸，N2保护下反应1小时，升温至95℃，冷却，调pH值至5～6，用永磁铁从反应溶液中分离出黑色的Fe3O4固体，所得固体采用倾注法用水洗涤三次后，乙醇洗三次，真空干燥。
2)FMSNs的制备：
室温下将40mg Fe3O4粉末溶于308ml环己烷中，搅拌下加入75.5ml曲拉通X-100、64ml正己醇、13.6ml H2O、1.6ml正硅酸乙酯(TEOS)，搅拌6小时。然后加入4.64ml氨水(25％)，反应24小时，加入800μlFITC-APS乙醇溶液和1.2ml TEOS，避光搅拌24小时。用永磁铁从反应溶液中分离出红棕色的SiO2(FITC)@Fe3O4固体，所得固体采用倾注法用无水乙醇洗五次，无水甲醇洗一次，再分散在40ml无水甲醇中。
3)ICP-PAMAM的制备：
室温下将121.3mg 2.0代聚酰胺-胺(PAMAM)树枝状大分子溶于8ml无水甲醇中，磁力搅拌下加入9.3μl(0.028mmol)异氰酸丙基三乙氧基硅烷(ICP)，避光搅拌24小时。
4)中间产品PFMSNs的制备：
室温下将上述ICP-PAMAM的溶液加入到300mg FMSNs的甲醇溶液中，避光搅拌48小时。用永磁铁从反应溶液中分离出PFMSNs固体，所得固体采用倾注法用无水乙醇洗三次，无水甲醇洗两次后，真空干燥。
5)PEG-PFMSNs的制备：
室温下将100mg PFMSNs重悬在40ml pH＝8.0的磷酸盐缓冲液(PBS)中超声搅拌，加入Tresylated MPEG-5000(PAMAM∶TresylatedMPEG-5000mol/mol＝1∶16)，反应4小时。用磁铁从反应溶液中分离出PEG-PAMAM-SiO2(FITC)@Fe3O4固体，其透射电镜图见图1，双蒸水洗三次后，真空干燥。
本发明产品PEG-PFMSNs的热失重(TGA)、X-射线光电子能谱分析(XPS)及Zeta电势的表征见图2、3及表1。
从图2中可以看出a、b、c的剩余重量百分数逐渐减小从而证明荧光磁性硅纳米载体的表面官能团的正确键合。
从图3中可以看出荧光磁性硅纳米载体表面修饰后Zeta电势相应改变也证明载体表面官能团的正确键合。
表1是载体的X-射线光电子能谱表征结果；选择MgKα靶(hv＝1253.6eV)，功率250W(12.5×20mA)，采用固定通能(FAT-FixedAnalyzer Transimission)模式工作，本底真空优于10-7pa(10-9Torr)。以污染碳峰的C1s(284.6eV)为定标表准，扣除荷电效应的影响从而确定样品的真实结合能(读数误差±0.2eV)。通过分析修饰了PEG的硅壳荧光磁性纳米粒与未修饰PEG的硅壳荧光磁性纳米粒表面各元素的含量相比，Si2p含量减少，而N1s的含量先增加(由于PAMAM的修饰)，再减少(由于PEG的修饰)，可以得到PEG及PAMAM成功修饰到了FMSNs的外围。
表1
实施例2
动物实验
1)大鼠颈动脉注射：通过颈内动脉将载体注入大鼠体内：大鼠以10％水合氯醛(1.2ml/kg体重)腹腔注射麻醉，仰卧固定，颈正中切口，暴露右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，电凝颈外动脉的两个细小分支，在颈外动脉的第一个分支前结扎，在结扎处的远心端电凝。将颈外动脉反折并从其插管通过颈外动脉用蠕动泵将载体的生理盐水溶液(2mg/2ml/280g体重)注入颈内动脉，然后再注入0.5ml生理盐水，取出导管，颈外动脉注药处结扎，缝合。
2)取脑组织及后固定：注射药物1小时后，大鼠以10％水合氯醛(1.2ml/kg)腹腔注射麻醉，仰卧固定，沿胸廓下沿打开胸腔，在心尖处用眼科剪剪一个小开口，将灌注针由左心室插入总动脉，固定灌注针，打开灌注泵，缓慢灌注生理盐水，同时轻轻按摩肝脏，待肝脏发白后，相同速度用4％多聚甲醛继续灌注，调慢流速至5ml/min，继续灌注至各组织发硬为止(约20～30min)，断头取脑置于30％的蔗糖溶液陈化至组织沉于瓶底。
3)冰冻切片：将脑组织从蔗糖溶液中取出后，用蒸馏水清洗干净，切成适宜大小的块置于冰台上。液氮中速冻10秒，以水包埋组织，切成厚度为30μm展于载玻片上，或切成50μm的薄片悬浮于PBS溶液中。
4)纳米粒在脑组织的分布实验(DAPI染色)：展于载玻片上的组织切片与DAPI溶液避光孵育15分钟，吸去DAPI溶液，以PBS溶液洗三次，甘油封固。激光共聚焦显微镜下观察。结果见图4，图4中可发绿色荧光(图4中箭头所指部分)的为本发明载体PEG-PFMSNs中的FITC，发蓝色荧光的为DAPI染细胞核的结果。可观察到载体在脑内细胞的分布情况，以及可见其穿越血脑屏障分布在脑细胞胞质中的结果。
5)纳米粒穿越血脑屏障的实验(超薄切片透射电子显微镜实验)：将脑组织切成1mm3的小块，置于2.5％的戊二醛溶液中固定，以环氧树脂包埋，用超薄切片机将包埋好的脑组织切成超薄切片，包埋在150目的铜网上，染色后在透射电子显微镜HITACHI-7650上观察载体进入细胞情况。见图5，从图5中可以很清楚的观察到载体在脑血管内皮细胞质及星形胶质细胞的分布，另外，在神经元细胞质中也发现了纳米粒的分布，同时也能观察到脑血管内皮细胞连接紧密且细胞膜结构完整，证明载体可以穿越血脑屏障，且其穿越机制为跨胞作用。
6)纳米粒进入脑组织神经元实验(脑组织冰冻切片的免疫荧光染色)：组织冰冻切片与一抗NeuN(1∶1000稀释)避光孵育过夜(24h)，用加曲拉通X-100的磷酸盐缓冲液(PBST)洗三次，再加入二抗(Alexa594标记，1∶300稀释)孵育2-3小时，甘油封固。激光共聚焦显微镜下观察。结果见图6，从图6中可以看出，红色荧光(神经元细胞)与绿色荧光(本发明产品)重叠后形成黄色荧光，证明两者处于同一位置(共定位)，这意味着载体确实进入神经元细胞胞质。
Claims (10)
1.一种荧光磁性硅纳米载体，以顺磁性Fe3O4为内核，包埋在二氧化硅形成的硅壳中间；该硅纳米载体中同时包埋有荧光物质；该硅纳米载体的表面分别修饰有氨基聚酰胺-胺树枝状大分子及聚乙二醇分子。
2.如权利要求1所述的硅壳荧光磁性纳米粒，其中，所述顺磁性Fe3O4的直径为5纳米～10纳米。
3.如权利要求1所述的荧光磁性硅纳米载体，其中，所述荧光物质为荧光素异硫氰酸酯、罗丹明异硫氰酸酯或其他荧光染料。
4.一种制备权利要求1所述硅壳荧光磁性纳米粒的方法，其主要步骤为：
将聚酰胺-胺树枝状大分子修饰的荧光磁性硅纳米载体分散在无水甲醇溶液中，加入聚乙二醇，避光搅拌，用磁铁从反应溶液中分离出棕黄色的固体，所得固体采用倾注法洗涤，真空干燥，得到表面修饰有聚乙二醇的荧光磁性硅纳米载体。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述聚酰胺-胺树状大分子包括所有代数对硅球的直接修饰。
6.如权利要求4所述的方法，其中，所述聚酰胺-胺树状大分子包括在硅球上所有逐代合成的半代和整代的聚酰胺-胺树状大分子，以及能产生氨基的所有试剂。
7.如权利要求4所述的方法，其中，所述聚乙二醇包括所有分子量或端基的聚乙二醇。
8.如权利要求4所述的方法，其中，所述的倾注法洗涤是采用双蒸水洗涤。
9.权利要求1所述的荧光磁性硅纳米载体在制备治疗或诊断脑部疾病的药物或试剂中的应用。
10.权利要求1所述的荧光磁性硅纳米载体在制备作为细胞标记药物中的应用。
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