CN109876009A - 一种人脑胶质瘤小鼠原位模型的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新的人脑胶质瘤小鼠原位模型的构建方法,将Luciferase‑GFP基因转导进人脑胶质瘤,并筛选出感染后的人脑胶质瘤阳性细胞,配制形成细胞悬液;小鼠麻醉后将其头部固定,将消毒后的进样针吸取细胞悬液后置于小鼠颅骨上方手术区域;对小鼠颅骨手术区域钻孔后形成注射孔;移动进样针至注射孔中,并深入至脑组织中缓慢注入细胞悬液;注射完细胞悬液后提出进样针,将伤口消毒后粘合;待细胞悬液注入一周后对肿瘤部位进行显像观察,并对所构建的人脑胶质瘤原位模型进行评估。本发明采用更接近人类脑胶质瘤原发病灶生长环境下构建人脑胶质瘤模型,可以有效评估肿瘤生长,方便连续观测并获取研究所需要的重要数据。
Description
技术领域
本发明涉及脑胶质瘤发病及复发机制,开发新的治疗药物研究等技术领域,具体涉及一种人脑胶质瘤小鼠原位模型的构建方法。
背景技术
脑胶质瘤是因为大脑和脊髓胶质细胞癌变所产生的最常见的原发性颅脑恶性肿瘤,其发病率约占颅内肿瘤的35.2%-61.0%,由成胶质细胞衍化而来,具有发病率高、复发率高、死亡率高以及治愈率低的特点。
目前,比较常见的技术是在小鼠皮下建立皮下肿瘤模型,现有皮下肿瘤模型的评估方式包括游标卡尺测量及取瘤测量,第一种方法可实现连续观测,但是误差较大,过程缺乏有效的记录方法;第二种方法不可连续观察。由于在皮下进行人脑胶质瘤模型的构建远离了原发病灶的生长环境,因此,所构建的肿瘤模型不利于对人脑胶质瘤增殖、转移及治疗等方面的研究。
发明内容
本发明的目的在于在更接近人类脑胶质瘤原发病灶生长环境下构建人脑胶质瘤模型,可以有效评估肿瘤生长,方便连续观测并获取研究所需要的重要数据,为此,本发明提供了一种人脑胶质瘤小鼠原位模型的构建方法。
一种人脑胶质瘤小鼠原位模型的构建方法,所述方法包括如下步骤:
步骤1,将Luciferase-GFP基因转导进人脑胶质瘤,并筛选出感染后的人脑胶质瘤阳性细胞,配制形成细胞悬液;
步骤2,小鼠麻醉后将其头部固定,将消毒后的进样针吸取细胞悬液后置于小鼠颅骨上方手术区域;
步骤3,对小鼠颅骨手术区域钻孔后形成注射孔;
步骤4,移动进样针至注射孔中,并深入至脑组织中缓慢注入细胞悬液;
步骤5,注射完细胞悬液后提出进样针,将伤口消毒后粘合;
步骤6,待细胞悬液注入一周后对肿瘤部位进行显像观察,并对所构建的人脑胶质瘤原位模型进行评估。
在将Luciferase-GFP基因转导进人脑胶质瘤之前需要对小鼠禁食不禁水,在740nm的红外光下检测小鼠体内食物状况,直至小鼠体内食物完全排空为止。
所述步骤1中制备GFP人脑胶质瘤阳性细胞的具体方法是:
步骤1.1、将人脑胶质瘤细胞接种于细胞培养皿中,5x105个/皿;
步骤1.2、采用高唐4DMEM培养基(含10%的胎牛血清)培养M-PG-13-GL细胞,收集产生的病毒5ml,采用2000g离心5min,留上清液,并在上清液中加入基因转染增强剂,吸弃培养基后,加入上述所产生的病毒5ml感染人脑胶质瘤细胞;
步骤1.3、重复上述过程制作U87-GL等人源的细胞株或原代胶质瘤细胞,且连续感染人脑胶质瘤细胞至少3天;
步骤1.4、相应培养基扩增已转入GFP的人脑胶质瘤细胞;
步骤1.5、采用流式分选出阳性细胞,制得GFP人脑胶质瘤细胞。
所述步骤2中注入麻醉试剂将小鼠麻醉;在小鼠头部所设定的手术区域进行备皮、消毒,并自眼内眦连线中点向后切开作为手术区域;经小鼠颅定位仪将小鼠的头部固定;消毒冲洗配套的进样针,吸取配制好的细胞悬液后将进样针固定在小鼠颅定位仪上。
所述步骤3中将吸取细胞悬液的进样针对准小鼠前囟,向后向右各移动2cm,通过钻孔工具对进样针所对颅骨表面进行钻孔,钻穿颅骨后形成注射孔。
所述步骤4中将进样针深入脑组织3.5cm,再提起0.5cm,缓慢注入含有105-106个细胞的细胞悬液,注入时间为3-8min。
所述步骤5中注射完细胞悬液后需静置4-6min,然后缓慢提出进样针,对伤口进行消毒、粘合。
所述步骤6中并对所构建模型进行评估的方法是:在小鼠腹腔注射D-虫荧光素(D-Luciferin)溶液,经反应3-8分钟后,将小鼠置于活体成像系统内进行荧光拍照显色,并计算荧光值,当所测荧光值大于1×105p/sec/cm2/sr时,所构建的人脑胶质瘤小鼠原位模型造模成功。
优选地,在小鼠腹腔注射D-虫荧光素(D-Luciferin)溶液150-250μL。
本发明技术方案具有如下优点:
A.本发明将Luciferase-GFP基因转导进人脑胶质瘤中,通过筛选出被感染的阳性人脑胶质瘤细胞配置形成细胞悬液,通过对小鼠进行颅骨钻孔方式将细胞悬液注入脑组织中,再经对肿瘤部位进行显像观测对所构建的肿瘤模型进行评估,实现了肿瘤模型的可视化、有效评估肿瘤生长、转移等变化。
B.本发明通过在在小鼠腹腔注射D-虫荧光素(D-Luciferin)溶液,经反应3-8分钟后,将小鼠置于活体成像系统内进行荧光拍照显色,并计算荧光值,根据荧光值的大小对肿瘤模型进行评估,方便工作人员进行连续性观测,其评估受人为因素影响小,为实验的真实性提供了可靠的依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式,下面将对具体实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明所提供的人脑胶质瘤小鼠原位模型构建方法框图;
图2为本发明所提供的人脑胶质瘤在小鼠颅骨部显像图示。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
如下所采用的GFP为绿色荧光蛋白,其在紫外激发下可见绿光,为激发荧光方式;而luciferase表达的是荧光素酶,需要特定底物反应后才能实现生物发光,luciferase发光为自然光。
如图1所示,本发明提供了一种人脑脑质瘤小鼠原位模型的构建方法,具体步骤如下:
【步骤1】,将Luciferase-GFP基因转导进人脑胶质瘤,并筛选出感染后的人脑胶质瘤阳性细胞,配制形成细胞悬液。
具体方法是:
步骤1.1、将人脑胶质瘤细胞接种于细胞培养皿中,5x105个/皿;
步骤1.2、采用高唐4DMEM培养基(含10%的胎牛血清)培养M-PG-13-GL细胞,收集产生的病毒5ml,采用2000g离心5min,留上清液,并在上清液中加入基因转染增强剂,吸弃培养基后,加入上述所产生的病毒5ml感染人脑胶质瘤细胞;
步骤1.3、重复上述过程制作U87-GL细胞,且连续感染人脑胶质瘤细胞至少3天;
步骤1.4、相应培养基扩增已转入GFP的人脑胶质瘤细胞;
步骤1.5、采用流式分选出阳性细胞,制得GFP人脑胶质瘤细胞。
步骤1.6、移走培养基,采用胰蛋白酶消化和PBS吹打重悬,配置形成细胞悬液;PBS重悬细胞,优选采用密度为1-10*105/5ul。
【步骤2】,小鼠麻醉后将其头部固定,将消毒后的进样针吸取细胞悬液后置于小鼠颅骨上方手术区域
这里优选采用10%的水合氯醛,使用剂量为3.5ml/g,将小鼠麻醉;在小鼠头部所设定的手术区域进行备皮、消毒,并自眼内眦连线中点向后切开1cm的手术区域;经小鼠颅定位仪将小鼠的头部固定;消毒冲洗配套的进样针,吸取细胞悬液后将其固定在小鼠颅定位仪上。
【步骤3】,对小鼠颅骨手术区域钻孔后形成注射孔
将吸取细胞悬液的进样针对准小鼠前囟,向后向右各移动2cm,通过钻孔工具对进样针所对颅骨表面进行钻孔,钻穿颅骨后形成注射孔。
【步骤4】,移动进样针至注射孔中,并深入至脑组织中缓慢注入细胞悬液。具体地将进样针深入脑组织3.5cm,再提起0.5cm,缓慢注入细胞悬液,5ul/只,注入时间为3-8min,优选5min。当然还可以根据所设定的参数对进样针的注入深度、剂量和注入时间进行重新设定,不限于上述参数值。
【步骤5】,注射完细胞悬液后需静置4-6min,优选5min,然后缓慢提出进样针,对伤口进行消毒、粘合。
【步骤6】,待细胞悬液注入一周后对肿瘤部位进行显像观察,并对所构建的人脑胶质瘤原位模型进行评估。通过在小鼠腹腔注射荧光素(luciferin),与人脑胶质瘤细胞充分结合后,拍照显色。
具体的人脑胶质瘤原位模型评估方法如下:
小鼠腹腔注射D-虫荧光素(D-Luciferin)溶液200μL,反应3-8分钟,使其与人脑胶质瘤细胞充分结合后,将小鼠置于小动物活体成像系统内,荧光拍照显色并计算荧光值,荧光值大于1×105p/sec/cm2/sr被认定为造模成功。
在镁离子存在下荧光素酶使荧光素与ATP反应,接着它被氧化形成二氧杂环丁烷结构并发出黄绿色的光。Luciferase-GFP基因所表达的蛋白既可与荧光素结合并发光,再利用小动物成像系统,能够让研究人员直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为。通过本发明,可以观测活体动物体内肿瘤的生长及转移、感染性疾病发展过程、特定基因的表达等生物学过程。
经D-虫荧光素显色的活体小鼠,其肿瘤的大小与分布可通过荧光直观的展示给研究者,根据对荧光值的测定,可以统计各组间肿瘤大小的统计学差异。
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例,而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
Claims (9)
1.一种人脑胶质瘤小鼠原位模型的构建方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤1,将Luciferase-GFP基因转导进人脑胶质瘤,并筛选出感染后的人脑胶质瘤阳性细胞,配制形成细胞悬液;
步骤2,小鼠麻醉后将其头部固定,将消毒后的进样针吸取细胞悬液后置于小鼠颅骨上方手术区域;
步骤3,对小鼠颅骨手术区域钻孔后形成注射孔;
步骤4,移动进样针至注射孔中,并深入至脑组织中缓慢注入细胞悬液;
步骤5,注射完细胞悬液后提出进样针,将伤口消毒后粘合;
步骤6,待细胞悬液注入一周后对肿瘤部位进行显像观察,并对所构建的人脑胶质瘤原位模型进行评估。
2.根据权利要求1所述的人脑胶质瘤小鼠原位模型的构建方法,其特征在于,将Luciferase-GFP基因转导进人脑胶质瘤之前需要对小鼠禁食不禁水,在740nm的红外光下检测小鼠体内食物状况,直至小鼠体内食物完全排空为止。
3.根据权利要求1所述的人脑胶质瘤小鼠原位模型的构建方法,其特征在于,所述步骤1中制备GFP人脑胶质瘤阳性细胞的具体方法是:
步骤1.1、将人脑胶质瘤细胞接种于细胞培养皿中,5x105个/皿;
步骤1.2、采用高唐4DMEM培养基(含10%的胎牛血清)培养M-PG-13-GL细胞,收集产生的病毒5ml,采用2000g离心5min,留上清液,并在上清液中加入基因转染增强剂,吸弃培养基后,加入上述所产生的病毒5ml感染人脑胶质瘤细胞;
步骤1.3、重复上述过程制作U87-GL细胞,且连续感染人脑胶质瘤细胞至少3天;
步骤1.4、相应培养基扩增已转入GFP的人脑胶质瘤细胞;
步骤1.5、采用流式分选出阳性细胞,制得GFP人脑胶质瘤细胞。
4.根据权利要求1所述的人脑胶质瘤小鼠原位模型的构建方法,其特征在于,所述步骤2中注入麻醉试剂将小鼠麻醉;在小鼠头部所设定的手术区域进行备皮、消毒,并自眼内眦连线中点向后切开作为手术区域;经小鼠颅定位仪将小鼠的头部固定;消毒冲洗配套的进样针,吸取配制好的细胞悬液后将进样针固定在小鼠颅定位仪上。
5.根据权利要求1所述的人脑胶质瘤小鼠原位模型的构建方法,其特征在于,所述步骤3中将吸取细胞悬液的进样针对准小鼠前囟,向后向右各移动2cm,通过钻孔工具对进样针所对颅骨表面进行钻孔,钻穿颅骨后形成注射孔。
6.根据权利要求1所述的人脑胶质瘤小鼠原位模型的构建方法,其特征在于,所述步骤4中将进样针深入脑组织3.5cm,再提起0.5cm,缓慢注入含有105-106个人脑胶质瘤细胞的细胞悬液,注入时间为3-8min。
7.根据权利要求1所述的人脑胶质瘤小鼠原位模型的构建方法,其特征在于,所述步骤5中注射完细胞悬液后需静置4-6min,然后缓慢提出进样针,对伤口进行消毒、粘合。
8.根据权利要求1所述的人脑胶质瘤小鼠原位模型的构建方法,其特征在于,所述步骤6中对所构建模型进行评估的方法是:在小鼠腹腔注射D-虫荧光素(D-Luciferin)溶液,经反应3-8分钟后,将小鼠置于活体成像系统内进行荧光拍照显色,并计算荧光值,当所测荧光值大于1×105p/sec/cm2/sr时,所构建的人脑胶质瘤小鼠原位模型造模成功。
9.根据权利要求8所述的人脑胶质瘤小鼠原位模型的构建方法,其特征在于,在小鼠腹腔注射D-虫荧光素(D-Luciferin)溶液150-250μL。
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