CN112300998A - 一种适于双光子活体成像胶质瘤细胞系的构建方法及应用 - Google Patents
一种适于双光子活体成像胶质瘤细胞系的构建方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种适于双光子活体成像胶质瘤细胞系的构建方法，通过该胶质瘤细胞构建胶质瘤细胞原位移植动物模型的构建，借用双光子活体成像技术研究胶质瘤细胞在小鼠大脑中的动态发展变化。本发明中改造得到的GL261‑ZsGreen胶质瘤细胞，能够非常成功地用于构建胶质瘤原位移植活体动物模型，在成像观测过程中可以清楚的观察到肿瘤细胞所存在的位置，应用在研究领域可以精准地进行细胞层面的检查，并且可以明显地区分胶质瘤边界，为有效地精准切除肿瘤提供了一种潜在的手段。本发明中增殖的每一个GL261‑ZsGreen癌细胞都带有绿色荧光标记，可以实现对分散转移的单个癌细胞进行精确定位，为进一步研究癌细胞的扩散和胶质瘤的精准治疗提供了可能的方案。
Description
技术领域
本发明属于生物学和肿瘤学技术领域，特别涉及一种适于双光子活体成像胶质瘤细胞系的构建及应用。
背景技术
神经胶质瘤是中枢神经系统中最常见的原发型肿瘤，具有复发性高、预后效果差、患者的死亡率高等特性，严重威胁着患者的生存时间和质量，且目前对于胶质瘤还没有特别有效的治疗策略。近年来，脑肿瘤发病率呈上升趋势，很多脑肿瘤，尤其是星形胶质细胞瘤，在被诊断发现后已经很难通过手术方法彻底地治疗，且预后效果也很差，因此神经胶质瘤的早诊断、早治疗对于改善神经胶质瘤患者生存期起着至关重要的作用。
目前临床上应用的神经胶质瘤检测诊断技术主要依靠磁共振、计算机断层扫描等大型仪器设备,这些检测诊断技术只能对病灶区起到定位和定性的检查作用。在医学研究过程中，对于神经胶质瘤主要采用组织切片及常规的免疫组织化学染色方法进行成像研究，而不能动态监测单个的肿瘤细胞在活体组织中的动态发展和变化。针对神经胶质瘤，目前还缺乏在活体动物中从单个细胞水平监测、研究神经胶质瘤发展、变化的实用方法和技术，难以精准识别神经胶质瘤边界，并且无法清楚地追踪发生转移扩散的单个神经胶质瘤细胞，给神经胶质瘤的研究和医学诊断乃至治疗过程都造成了很大的困难。
近年来，由于双光子荧光显微镜在活体动物成像中的应用，能够直接在活体动物体内观察生物组织深处的亚微米荧光结构。由于双光子显微镜使用的是近红外光作为激发光源，因而受生物组织散射的影响更小，具有更强的穿透能力，大大提高了成像深度，适用于长时间的动态观察研究。在成像时，由于双光子吸收截面很小，只有在焦平面很小的区域内可以激发出荧光，双光子吸收仅局限于焦点处的范围内，因而具有很高的成像分辨率。鉴于双光子的这些优点，使得双光子活体显微成像技术在生命科学研究领域应用得越来越广。但是该技术对成像的样品有一定要求，即样品必须要有双光子激发波段才能进行双光子显微成像。因此，为了在活体动物内动态监测肿瘤细胞，建立一种适于双光子活体成像的胶质瘤细胞系成为一种迫切的需求。
在这里，我们利用慢病毒(Lentivirus)载体构建了一种表达绿色荧光并且适用于双光子活体成像的胶质瘤细胞系。慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1(人类免疫缺陷Ⅰ型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体，可以将外源基因有效地整合到宿主细胞的基因组中，可有效感染分裂的细胞和非分裂的细胞，能大大提高目的基因的转导效率，能够比较方便快捷地实现目的基因的长期、稳定表达。利用慢病毒载体，我们成功将具有双光子激发波段的ZsGreen荧光报告基因整合到了胶质瘤细胞系，并利用该细胞系构建了稳定的胶质瘤原位移植动物模型，借助双光子活体荧光显微技术实时地观察到了神经胶质瘤细胞在活体动物内的动态发展变化。该发明的应用不仅实现了在活体动物内对神经胶质瘤细胞的高分别率成像，追踪单个癌细胞的增殖、迁移和扩散，而且为胶质瘤发生发展的机理研究及胶质瘤治疗药物的开发提供了一种强大的工具。
发明内容
发明目的是构建一种表达绿色荧光蛋白的神经胶质瘤细胞系，应用该细胞系进行胶质瘤细胞原位移植动物模型的构建，借助双光子活体成像技术在细胞水平实现对神经胶质瘤动态监测和研究。
本发明采用以下技术手段：一种适于双光子活体成像胶质瘤细胞系的构建方法，包括以下步骤：
步骤一、提前12小时在24孔培养板中铺设5×104个GL261神经胶质瘤细胞，待细胞汇合度达到60％左右后在DMEM培养基中添加6-8μg/ml的聚凝胺助转剂，再使用带有CMV启动子、具有双光子激发波段的ZsGreen荧光报告基因和嘌呤霉素抗性基因的pHBLV-CMV-MCS-EF1-ZsGreen-T2A-puro慢病毒对预先铺设好的GL261神经胶质瘤细胞进行感染；
步骤二、待上述已经被慢病毒感染过的GL261神经胶质瘤细胞生长48h后更换新鲜的含有嘌呤霉素浓度为2-3μg/ml的DMEM培养基，对GL261神经胶质瘤细胞进行筛选，每2-3天更换一次新鲜的含有嘌呤霉素的培养基；
步骤三、将步骤二中筛选得到的带有绿色荧光标签的神经胶质瘤细胞(GL261-ZsGreen)进行单克隆扩增并且冻存留种。
优选地，所述聚凝胺助转剂的浓度为7μg/ml。
优选地，所述嘌呤霉素的浓度为3μg/ml。
胶质瘤细胞原位移植动物模型的构建方法，包括以下步骤：
步骤一、将上述步骤得到的生长状态良好且稳定表达绿色荧光的GL261-ZsGreen神经胶质瘤细胞用胰酶从培养瓶中消化下来，并且用DMEM培养基把细胞密度调整成5×106个/ml的细胞密度以备用；
步骤二、选取年龄为8-10周龄，体重为20-24g的C57BL/6小鼠，借助脑立体定位仪和微量注射器将步骤一中所得到的1×104个绿色荧光细胞移植在小鼠脑部Bregma点后1.5mm,旁开1.5mm,深度1mm的位置；
步骤三、将步骤二原位移植后的C57BL/6小鼠给予充足的水和食物放置在12h/12h光暗周期、室温(22±2℃)下干净的环境中单笼独自饲养，使带有绿色荧光标签的GL261-ZsGreen神经胶质瘤细胞在小鼠大脑中增殖。
借用双光子活体成像技术研究胶质瘤细胞在小鼠大脑中的动态发展变化方法，包括以下步骤：
步骤一、将荷瘤的C57BL/6小鼠用10％的水合氯醛进行麻醉；把麻醉后的小鼠用特制的小鼠头颅固定器固定起来，借用牙科钻对小鼠的颅骨进行打磨，使颅骨厚度大约为20μm；
步骤二、使用FV1000双光子显微成像系统对小鼠脑部神经胶质瘤进行图像采集，得到GL261-ZsGreen神经胶质瘤细胞在小鼠大脑中存活与发展的动态变化数据。
显微镜镜头选取25x(NA:1.05)的水镜，用890nm波长的激发光激发成像。
上述方法构建的适于双光子活体成像胶质瘤细胞系。
所述适于双光子活体成像胶质瘤细胞系在制备胶质瘤治疗药物中的应用。
所述适于双光子活体成像胶质瘤细胞系在胶质瘤发生机理研究中的应用。
本发明使用双光子显微成像技术，实现了对胶质瘤细胞动态发展的监测，同时也可对分散转移的单个癌细胞进行定位和研究，精准地对神经胶质瘤在细胞层面进行检查追踪。
有益效果：
本发明通过慢病毒基因工程技术对肿瘤细胞进行特异性的具有双光子激发的ZsGreen荧光标记改造，无需采集样品制作组织切片或进行免疫染色，应用双光子成像技术可实时监测肿瘤细胞在活体组织中的动态发展和变化。
本发明中改造得到的GL261-ZsGreen胶质瘤细胞，能够非常成功地用于构建胶质瘤原位移植活体动物模型。在成像观测过程中可以清楚的观察肿瘤细胞所存在的位置，应用在研究领域可以精准进行细胞层面的检查，并且可以明显地区分胶质瘤边界，有效地提高了肿瘤定位和靶向处理的精准性。
本发明中增殖的每一个GL261-ZsGreen癌细胞都带有绿色荧光标记，可以实现对分散转移的单个癌细胞进行精确定位和研究，为进一步精准治疗提供了可能的方案。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步详细的描述。
图1是本发明中所使用慢病毒pHBLV-CMV-MCS-EF1-ZsGreen-T2A-puro载体的基因图谱。
图2是确定用于筛选耐药细胞的最佳嘌呤霉素浓度。A图为确定嘌呤霉素杀死细胞的最佳浓度，操作流程示意图。B图为不同浓度的嘌呤霉素作用于细胞中，影响细胞存活的存活曲线数据。
图3是利用慢病毒pHBLV-CMV-MCS-EF1-ZsGreen-T2A-puro感染GL261细胞的操作流程示意图。
图4是24孔板中的GL261细胞被慢病毒感染后，在荧光显微镜下不同时间点观察细胞的荧光表达和感染成功表达绿色荧光的细胞密度变化统计图。A图是慢病毒感染GL261细胞48h后，DMEM培养基中未添加嘌呤霉素时荧光显微镜下观察到有部分的细胞已经表达绿色荧光。B图是慢病毒感染GL261细胞96h后，用嘌呤霉素筛选48h在荧光显微镜下观察到的绿色荧光细胞。C图是慢病毒感染GL261细胞144h后，用嘌呤霉素筛选96h在荧光显微镜下观察到的绿色荧光细胞。D图是慢病毒感染GL261细胞后同时在嘌呤霉素作用下不同的时间点观察拍照后分析表达绿色荧光标签的GL261细胞的密度变化统计图。从图中的统计数据可以得出，随着嘌呤霉素筛选时间的延长荧光细胞的数目也在增多。
图5是筛选出来的稳定表达绿色荧光蛋白的神经胶质瘤细胞GL261-ZsGreen原位移植进入小鼠大脑中，借助双光子活体荧光显微成像技术实时检测同一位置处神经胶质瘤细胞在小鼠大脑内的动态发展变化。A图是神经胶质瘤细胞GL261-ZsGreen刚刚移植到小鼠大脑皮层中，活体双光子显微成像所得到的图像。B图是神经胶质瘤细胞GL261-ZsGreen移植到小鼠大脑皮层中1天后，活体双光子显微成像所得到的图像。C图是神经胶质瘤细胞GL261-ZsGreen移植到小鼠大脑皮层中2天后，活体双光子显微成像所得到的图像。D图是神经胶质瘤细胞GL261-ZsGreen移植到小鼠大脑皮层中3天后，活体双光子显微成像所得到的图像。E图是神经胶质瘤细胞GL261-ZsGreen移植到小鼠大脑皮层中4天后，活体双光子显微成像所得到的图像。通过以上数据我们可以非常清楚地观察到神经胶质瘤细胞GL261-ZsGreen在小鼠脑部的动态生长变化。
具体实施方式
实施例1
表达绿色荧光的胶质瘤细胞系(GL261-ZsGreen)的构建：
步骤一、提前12小时在24孔培养板中铺设5×104个GL261神经胶质瘤细胞，待细胞汇合度达到60％左右后在DMEM培养基中添加6μg/ml的聚凝胺助转剂，再使用带有CMV启动子、具有双光子激发波段的ZsGreen荧光报告基因和嘌呤霉素抗性基因的pHBLV-CMV-MCS-EF1-ZsGreen-T2A-puro慢病毒对预先铺设好的GL261神经胶质瘤细胞进行感染；
步骤二、待上述已经被慢病毒感染过的GL261神经胶质瘤细胞生长48h后更换新鲜的含有嘌呤霉素浓度为2μg/ml的DMEM培养基，对GL261神经胶质瘤细胞进行筛选，每2天更换一次新鲜的含有嘌呤霉素的培养基；
步骤三、将步骤二中筛选得到的带有绿色荧光标签的神经胶质瘤细胞(GL261-ZsGreen)进行单克隆扩增并且冻存留种。
胶质瘤细胞(GL261-ZsGreen)原位移植动物模型的构建：
步骤一、将上述步骤得到的生长状态良好且稳定表达绿色荧光的GL261-ZsGreen神经胶质瘤细胞用胰酶从培养瓶中消化下来，并且用DMEM培养基把细胞密度调整成5×106个/ml的细胞密度以备用；
步骤二、选取年龄为8-10周龄，体重为20-24g的C57BL/6小鼠，借助脑立体定位仪和微量注射器将步骤一中所得到的1×104个绿色荧光细胞移植在小鼠脑部Bregma点后1.5mm,旁开1.5mm,深度1mm的位置；
步骤三、将步骤二原位移植后的C57BL/6小鼠给予充足的水和食物放置在12h/12h光暗周期、室温(22±2℃)下干净的环境中单笼独自饲养，使带有绿色荧光标签的GL261-ZsGreen神经胶质瘤细胞在小鼠大脑中增殖，以备后续研究使用。
表达绿色荧光的胶质瘤细胞系(GL261-ZsGreen)在胶质瘤发生的机理研究中的应用，使用慢病毒感染GL261神经胶质瘤细胞，构建稳定表达绿色荧光蛋白的细胞株。
实施例2
表达绿色荧光的胶质瘤细胞系(GL261-ZsGreen)的构建：
步骤一、提前12小时在24孔培养板中铺设5×104个GL261神经胶质瘤细胞，待细胞汇合度达到60％左右后在DMEM培养基中添加7μg/ml的聚凝胺助转剂，再使用带有CMV启动子、具有双光子激发波段的ZsGreen荧光报告基因和嘌呤霉素抗性基因的pHBLV-CMV-MCS-EF1-ZsGreen-T2A-puro慢病毒对预先铺设好的GL261神经胶质瘤细胞进行感染；
步骤二、待上述已经被慢病毒感染过的GL261神经胶质瘤细胞生长48h后更换新鲜的含有嘌呤霉素浓度为2μg/ml的DMEM培养基，对GL261神经胶质瘤细胞进行筛选，每3天更换一次新鲜的含有嘌呤霉素的培养基；
步骤三、将步骤二中筛选得到的带有绿色荧光标签的神经胶质瘤细胞(GL261-ZsGreen)进行单克隆扩增并且冻存留种。
实施例3
表达绿色荧光的胶质瘤细胞系(GL261-ZsGreen)的构建：
步骤一、提前12小时在24孔培养板中铺设5×104个GL261神经胶质瘤细胞，待细胞汇合度达到60％左右后在DMEM培养基中添加8μg/ml的聚凝胺助转剂，再使用带有CMV启动子、具有双光子激发波段的ZsGreen荧光报告基因和嘌呤霉素抗性基因的pHBLV-CMV-MCS-EF1-ZsGreen-T2A-puro慢病毒对预先铺设好的GL261神经胶质瘤细胞进行感染；
步骤二、待上述已经被慢病毒感染过的GL261神经胶质瘤细胞生长48h后更换新鲜的含有嘌呤霉素浓度为3μg/ml的DMEM培养基，对GL261神经胶质瘤细胞进行筛选，每3天更换一次新鲜的含有嘌呤霉素的培养基；
步骤三、将步骤二中筛选得到的带有绿色荧光标签的神经胶质瘤细胞(GL261-ZsGreen)进行单克隆扩增并且冻存留种。
实施例4
借用双光子活体成像技术研究胶质瘤细胞(GL261-ZsGreen)在小鼠大脑中的动态发展变化
步骤一、将荷瘤的C57BL/6小鼠用10％的水合氯醛进行麻醉。把麻醉后的小鼠用特制的小鼠头颅固定器固定起来，借用牙科钻对小鼠的颅骨进行打磨，使颅骨厚度大约为10-20μm。步骤二、使用FV1000双光子显微成像系统对小鼠脑部神经胶质瘤进行图像采集，得到GL261-ZsGreen神经胶质瘤细胞在小鼠大脑中存活与发展的动态变化数据。显微镜镜头选取25x(NA:1.05)的水镜，用890nm波长的激发光激发成像。
其中使用双光子显微成像技术，实现了对胶质瘤细胞动态发展的监测，同时也可对分散转移的单个癌细胞进行精确定位和研究，可以更精准地对神经胶质瘤在细胞层面进行检查追踪。
实验例
1.GL261神经胶质瘤细胞的培养
GL261细胞培养在高糖的EMEM培养基中，培养基中添加双抗(100U/ml penicillinG,100U/ml streptomycin，HyClone)以及10％的胎牛血清(兰州民海)。细胞培养箱中环境维持在37℃、95％的湿度以及5％CO2的条件下。待细胞生长汇合度达到90％左右时按照1：3的比例进行传代。
2.构建稳定表达绿色荧光蛋白的神经胶质瘤细胞
2.1慢病毒助转剂聚凝胺(Polybrene)最适浓度的筛选
聚凝胺(Polybrene)是带正电的小分子，可以与细胞表面的阴离子相结合，来提高慢病毒对细胞的感染效率。但是聚凝胺有一定的细胞毒性，不同的细胞对聚凝胺的敏感程度不同。因此在利用Polybrene辅助转染时针对不同的细胞首先要筛选一个合适的浓度，在该浓度下Polybrene既能促进慢病毒对细胞的转染又不影响细胞的生活状态。
把生长状态良好的GL261细胞按照预先调整好的细胞数目1×105个细胞提前12h铺设在24孔板的一个孔中，按照上述的方法在24孔板中铺设同样6个孔的细胞已备用。铺设12h后每一孔中分别添加0μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、10μg/ml的6种不同浓度梯度的Polybrene。添加Polybrene后，12h、24h、36h、48h连续观察，发现添加浓度为0μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml的Polybrene对细胞无明显毒性反应，故确定合适的Polybrene工作浓度为6～8μg/ml；优选7μg/ml作为慢病毒感染细胞时Polybrene的工作浓度。
2.2嘌呤霉素最佳筛选浓度的确定
如图2A图所示，把生长状态良好的GL261细胞按照预先调整好的细胞数目8×104个细胞提前12h铺设在24孔板的一个孔中，按照上述的方法在24孔板中铺设同样11个孔的细胞已备用。铺设12h后每一孔中分别添加0μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml、5μg/ml、6μg/ml、7μg/ml、8μg/ml、9μg/ml、10μg/ml的11种不同浓度梯度的嘌呤霉素(puromycin)。添加puromycin后，1天、2天、3天、4天连续观察并统计存活细胞的数目(密度)，培养到第2天后每一孔中更换新鲜的DMEM培养基并且每一孔中再次添加对应浓度的puromycin。研究发现2-4天内能够完全杀死GL261细胞的嘌呤霉素最小浓度为2μg/ml和3μg/ml，为了保险起见选取3μg/ml为嘌呤霉素的工作浓度。
2.3慢病毒感染GL261神经胶质瘤细胞
本发明中使用的慢病毒为pHBLV-CMV-MCS-EF1-ZsGreen-T2A-puro，具有嘌呤霉素(puromycin)抗性基因和ZsGreen荧光报告基因。
把生长状态良好的GL261细胞按照预先调整好的细胞数目5×104个细胞提前12h铺设在24孔板的一个孔中，37℃培养过夜，取出冻存的慢病毒pHBLV-CMV-MCS-EF1-ZsGreen-T2A-puro，置于冰上融化，移去孔中培养基，加入250μl的DMEM培养基其中包含MOI为3的病毒以及7μg/ml的Polybrene。37℃培养，感染4h后补齐培养基至500μl。感染24h后，吸去含病毒的培养基，更换新鲜的DMEM培养基，继续37℃培养。感染后48h，使用荧光显微镜检测ZsGreen荧光报告基因的表达。观察到图4A中，部分细胞带有绿色荧光，说明GL261细胞被pHBLV-CMV-MCS-EF1-ZsGreen-T2A-puro慢病毒成功感染并且ZsGreen基因成功表达。
2.4嘌呤霉素筛选表达绿色荧光蛋白的GL261细胞
本发明使用的慢病毒中含有嘌呤霉素(puromycin)抗性基因，被慢病毒感染成功的GL261细胞将具有嘌呤霉素抗性，能够在添加了嘌呤霉素的培养基中存活，未被慢病毒感染的细胞不具有嘌呤霉素抗性在嘌呤霉素存在的培养基中无法存活。GL261细胞被病毒感染48h后，更换含3μg/ml嘌呤霉素的新鲜DEME培养基继续培养，每2天更换一次含有浓度为3μg/ml嘌呤霉素的新鲜DEME培养基，直至筛选出稳定表达绿色荧光的GL261细胞。嘌呤霉素筛选48小时后在荧光显微镜下观察，可见图4B，具有绿色荧光的细胞明显增多，嘌呤霉素筛选96小时后，可见图4C，微孔板中存活的细胞均具有绿色荧光，连续筛选传代后，把稳定表达绿色荧光的GL261细胞进行冻存保种。
3.小鼠脑部神经胶质瘤细胞的双光子活体成像
3.1 GL261-ZsGreen细胞原位移植动物模型的构建
3.1.1移植用GL261-ZsGreen细胞的制备
把生长状态良好的GL261-ZsGreen细胞用胰酶从细胞培养瓶中消化下来，对细胞进行计数之后用DMEM培养基把GL261-ZsGreen细胞的密度调整为5×106个/ml,室温放置以备用，最好在90min内用完。
3.1.2小鼠麻醉及颅骨固定
挑选8-10周龄，体重为20-24g，状态良好且毛发光泽的C57BL/6小鼠作为神经胶质瘤细胞移植的受体，在手术开始之前，称量小鼠体重，按照4μl/g体重的标准注射10％的水合氯醛对其进行麻醉，待小鼠进入深度麻醉状态后，将小鼠背部朝上，腹部垫上一层无菌纱布后用酒精棉球对其头部毛发进行擦拭并保证其湿润，用刀片沿耳根处向下刮除双耳到鼻尖的倒三角区域内的毛发，用碘酒对刮毛后的皮肤进行消毒；剪开头顶皮肤，暴露出小鼠颅骨，再将小鼠头部固定在脑立体定位仪上。
3.1.3 GL261-ZsGreen细胞的原位移植
小鼠头颅固定在脑立体定位仪上之后，以Bregma为参考，在其后1.5mm,旁开1.5mm处用牙科钻垂直打孔开窗，不能损伤脑组织。用规格为10μl 26G的微量注射器吸取2μl的GL261-ZsGreen细胞悬液(5×106个/ml)。将微量注射器放置在小鼠颅骨窗口处，缓慢将微量注射器的针头插入小鼠大脑组织中，进针深度为1.4mm。进针后等待2min再把针退出0.4mm，即进针注射深度为1mm。注射速度控制为1μl/min，注射后留针5min，再缓慢拔出针头。缝合小鼠头部皮肤。待小鼠苏醒正常活动后，放置在干净环境中,给予充足的水和食物，以12h/12h光暗周期在室温下饲养(22±2℃)。
3.2原位移植GL261-ZsGreen细胞后双光子成像
将接受移植后的小鼠用10％的水合氯醛进行深度麻醉固定于特制的固定器上，在解剖镜下用牙科钻把小鼠颅骨窗口周围打磨薄，使其厚度大约为10-20μm。小鼠随后放置在FV1000双光子显微镜下成像观察。显微镜的镜头选取25倍水镜(NA：1.05)，激发光波长设置为890nm，若成像过程中小鼠有苏醒迹象，可适当补充麻药。活体成像观测过程中可以清楚地观察肿瘤细胞所存在的位置，以及其在活体组织中的动态发展和变化。双光子成像得到的结果如图5所示，利用ImageJ软件对图像进行数据分析。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种适于双光子活体成像胶质瘤细胞系的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、提前12小时在24孔培养板中铺设5×104个GL261神经胶质瘤细胞，待细胞汇合度达到60％左右后在DMEM培养基中添加6-8μg/ml的聚凝胺助转剂，再使用荧光报告基因和嘌呤霉素抗性基因的pHBLV-CMV-MCS-EF1-ZsGreen-T2A-puro慢病毒对预先铺设好的GL261神经胶质瘤细胞进行感染；
步骤二、待上述已经被慢病毒感染过的GL261神经胶质瘤细胞生长48h后更换新鲜的含有嘌呤霉素浓度为2-3μg/ml的DMEM培养基，对GL261神经胶质瘤细胞进行筛选，每2-3天更换一次新鲜的含有嘌呤霉素的培养基；
步骤三、将步骤二中筛选得到的带有绿色荧光标签的神经胶质瘤细胞GL261-ZsGreen进行单克隆扩增并且冻存留种。
2.根据权利要求1所述的适于双光子活体成像胶质瘤细胞系的构建方法，其特征在于：所述荧光报告基因为带有CMV启动子、具有双光子激发波段的ZsGreen荧光报告基因。
3.根据权利要求1所述的适于双光子活体成像胶质瘤细胞系的构建方法，其特征在于：所述聚凝胺助转剂的浓度为7μg/ml。
4.根据权利要求1所述的适于双光子活体成像胶质瘤细胞系的构建方法，其特征在于：所述嘌呤霉素的浓度为3μg/ml。
5.胶质瘤细胞原位移植动物模型的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、将权利要求1所述步骤得到的生长状态良好且稳定表达绿色荧光的GL261-ZsGreen神经胶质瘤细胞用胰酶从培养瓶中消化下来，并且用DMEM培养基把细胞密度调整成5×106个/ml的细胞密度以备用；
步骤二、选取年龄为8-10周龄，体重为20-24g的C57BL/6小鼠，借助脑立体定位仪和微量注射器将步骤一中所得到的1×104个绿色荧光细胞移植在小鼠脑部Bregma点后1.5mm,旁开1.5mm,深度1mm的位置；
步骤三、将步骤二原位移植后的C57BL/6小鼠给予充足的水和食物放置在12h/12h光暗周期、室温(22±2℃)下环境中单笼独自饲养，使带有绿色荧光标签的GL261-ZsGreen神经胶质瘤细胞在小鼠大脑中增殖。
6.适于双光子活体成像的胶质瘤细胞系，其特征在于：采用权利要求1-3任一项所述方法构建。
7.权利要求6所述适于双光子活体成像胶质瘤细胞系在制备胶质瘤治疗药物中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210202 |
|
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