CN115772532B - 荧光标记不同雌激素受体的单克隆肿瘤细胞系的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及多色荧光分别标记不同雌激素受体亚型的单克隆肿瘤细胞系的构建方法，属于生物工程技术领域。构建方法为：将不同的荧光蛋白基因分别与不同的雌激素受体基因序列或不同的雌激素受体干扰序列构建质粒；不同的荧光蛋白基因用于表达不同荧光蛋白，该荧光蛋白作为荧光标签，用于标记不同的雌激素受体过表达或沉默；将得到的质粒分别转染到肿瘤细胞中，得到不同的稳定转染细胞株；再将稳定转染细胞株采用无限稀释法筛选出单克隆细胞系，即得到多色荧光分别标记不同雌激素受体亚型的单克隆肿瘤细胞系。本发明能够得到转染效果良好的、标记不同雌激素受体(ERs)表达水平的六色鼠源性黑素瘤B16单克隆细胞系，且具有良好的传代稳定性。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，更具体地，涉及多色荧光分别标记不同雌激素受体亚型的单克隆肿瘤细胞系的构建方法，尤其涉及一种多色荧光标记不同雌激素受体ERs亚型的黑色素瘤细胞B16单克隆稳转株的构建和筛选方法，该技术可用于肿瘤分子生物学、生物医学光子学、荧光显微成像的研究。
背景技术
雌激素受体(Estrogen receptors，ERs)是多种肿瘤的潜在治疗新靶点。ERs可能通过多种机制影响肿瘤易感性、肿瘤干细胞的自我更新、肿瘤微环境、免疫机能以及生物体的整体代谢平衡。但ERs在多种肿瘤中的预后价值尚无定论。ERs结构和功能的多样性是ERs预后作用存在争议的主要原因之一。ERs具有多个结构相似的亚型，通过复杂的协同或拮抗机制，共同调节生理和病理条件下的多种生物学过程和内环境稳态。因此，需在活体真实的肿瘤微环境中，对ERs的多个亚型展开系统性的同步研究，阐明ERs各亚型之间的相互作用，综合评估ERs对肿瘤进展和预后的作用。
在同一活体条件下对不同的ERs亚型以及肿瘤微环境中的多种重要因素展开长时程的同步示踪研究，是探索ERs在黑色素瘤中的作用机制以及潜在靶点价值的前提和基础。为此，利用多色荧光显微成像技术在同一微环境中对多个ERs亚型展开可视化的活体成像研究，是更为系统性地阐明ERs在肿瘤中的作用及机制的有效方法。但目前尚缺乏对肿瘤细胞中不同的ERs亚型(主要针对ESR1和ESR2两种亚型，分别表达ERα和ERβ蛋白)及其不同的表达水平(过表达或沉默)进行可区分的、稳定的、且可同时进行活细胞或者活体显微成像的多色荧光标记。
基于申请人团队前期的技术方法，已筛选出九种可同时使用并能实现分辨的荧光团，结合特定的双光子选择激发荧光显微成像系统，可同时在活细胞样品中实现九种荧光团标记(专利申请公布号：CN 114774467 A)。该技术筛选出了适用于多色成像的九种荧光团，并是实现了活细胞的九色成像。但该技术只局限于瞬时转染或荧光染料染色的一次性成像，尚缺乏稳定性和可重复性。另外，该技术采用荧光团标记细胞器，属于细胞器结构表征，尚未涉及对感兴趣的关键基因的标记，未能实现活细胞功能和机制的表征。因此，需开发出一种用多色荧光标记肿瘤细胞中ERs的不同亚型和表达水平，且筛选出具有良好传代稳定性的单克隆细胞系，将对肿瘤分子生物学、生物医学光子学、荧光显微成像的研究就有重要的意义。
发明内容
针对现有研究和技术的空缺，本发明的目的在于提供一种多色荧光分别标记不同雌激素受体ERs亚型的单克隆肿瘤细胞系稳转株的构建和筛选方法，从而解决现有技术利用多色荧光显微成像技术在同一微环境中对多个雌激素受体ERs亚型同时展开可视化的活细胞以及活体成像研究的空缺。
根据本发明第一方面，提供了多色荧光分别标记不同雌激素受体亚型的单克隆肿瘤细胞系的构建方法，包括以下步骤：
(1)将表达不同颜色荧光的不同的荧光蛋白基因分别与不同的雌激素受体基因序列或不同的雌激素受体干扰序列构建质粒；所述不同的荧光蛋白基因用于表达不同荧光蛋白，该荧光蛋白作为荧光标签，用于标记不同的雌激素受体过表达或者沉默；所述不同的雌激素受体基因序列用于过表达不同的雌激素受体的蛋白水平，所述不同的雌激素受体干扰序列用于沉默不同的雌激素受体的蛋白表达；
(2)将步骤(1)得到的质粒分别转染到肿瘤细胞中，得到不同的稳定转染细胞株；
(3)将步骤(2)得到的稳定转染细胞株采用无限稀释法筛选出单克隆细胞系，即得到多色荧光分别标记不同雌激素受体亚型的单克隆肿瘤细胞系。
优选地，步骤(1)中，所述不同的荧光蛋白基因分别为红色荧光蛋白基因、青色荧光蛋白基因、蓝色荧光蛋白基因、蓝紫色荧光蛋白基因、绿色荧光蛋白基因和橙红色荧光蛋白基因中的至少两种。
优选地，所述不同的雌激素受体基因序列分别为雌激素受体基因亚型ESR1和雌激素受体基因亚型ESR2。
优选地，步骤(2)中，所述肿瘤细胞为鼠源性肿瘤细胞。
优选地，所述鼠源性肿瘤细胞为黑色素瘤细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞或结肠癌细胞。
优选地，步骤(1)中，在构建质粒的过程中，还包括插入筛选标记基因序列；步骤(2)中，转染之后通过筛选得到不同的稳定转染细胞株。
优选地，所述筛选标记基因序列为抗性基因序列。
优选地，所述抗性基因序列为嘌呤霉素抗性基因序列。
根据本发明另一方面，提供了任一项所述方法构建得到的多色荧光分别标记不同雌激素受体亚型的单克隆肿瘤细胞系。
根据本发明另一方面，提供了所述的多色荧光分别标记不同雌激素受体亚型的单克隆肿瘤细胞系用于荧光显微成像的应用。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：
(1)采用荧光蛋白标记活细胞中感兴趣的关键基因，可以在常规的分子生物学机制研究的同时，还能进行活细胞水平以及活体水平的荧光显微成像，可视化该基因在肿瘤活细胞中甚至在活体荷瘤动物模型中的作用及其机制。
(2)采用不同的荧光蛋白标记目的基因的不同亚型和表达水平，并借助特定的双光子选择激发荧光显微成像系统和光谱分析方法，可以同时对六色不同标记的细胞进行同时成像，以实现在同一实验条件下、以及在活体的同一肿瘤微环境中对目的基因的不同亚型展开同步研究，可实现仅目的基因亚型有差异的单变量控制，能大大提高机制研究的可靠性和可重复性。
(3)肿瘤是一种极具异质性的复杂性疾病，每一个肿瘤中都包含多个基因型或表型不同的子克隆。采用多色标记不同基因型的肿瘤细胞系用于混合接种，构建荷瘤动物模型，可以很好的模拟肿瘤发生发展的异质性演进特征，并能对肿瘤异质性演进行谱系追踪。
(4)本发明所涉及的建立多色标记不同雌激素受体ERs亚型的单克隆肿瘤细胞系的构建方法能够得到转染效果良好的、标记不同ERs表达水平的六色B16单克隆细胞系，且具有良好的传代稳定性。另外，此方法不局限于B16细胞，可以采用本方法构建的质粒类似地转染鼠源性的多种肿瘤细胞系，建立单克隆细胞系，用于ERs在多种癌症中作用和机制的同步可视化研究。
附图说明
图1为mKate-ESR1质粒图谱。
图2为mCerulean-ESR2质粒图谱。
图3为shESR1-TagBFP质粒图谱。
图4为shESR2-EBFP2.0质粒图谱。
图5为shNC-mAmetrine质粒图谱。
图6为CMV-LSSmCherry质粒图谱。
图7为基因表达干扰后B16细胞系的ESR1和ESR2的mRNA表达水平。
图8为各个B16荧光细胞系的共聚焦显微成像实例图像。
图9为六色B16单克隆细胞系的双光子同时成像实例图像。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1
本发明针对ERs的两种主要基因型，ESR1与ESR2(分别表达蛋白ERα和ERβ)，碱基序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
分别用不同的荧光蛋白标记ERα和ERβ的表达水平。
(1)荧光蛋白筛选：选择mKate、mCerulean、LSSmCherry、TagBFP、EBFP2.0和mAmetrine六种荧光蛋白作为荧光标签，标记不同的ERα和ERβ的过表达、沉默(表达下调)或空白荧光对照。上述六种荧光蛋白的激发和发射的光谱峰值如表1所示。
表1
| Fluorophore | λex(激发峰值) | λem(发射峰值) |
| mKate | 588 | 630 |
| Cerulean | 433 | 475 |
| TagBFP | 402 | 457 |
| EBFP2.0 | 383 | 455 |
| mAmetrine | 407 | 525 |
| LSSmcherry | 450 | 620 |
(2)所用主要试剂：Lipofectamine 3000转染试剂盒、1640培养基、opti-MEM培养基和FBS购自赛默飞世尔(Invitrogen)公司，嘌呤霉素购自白鲨生物科技有限公司。
(3)构建质粒：
①mKate-ESR1：将红色荧光蛋白mkate的基因序列与ESR1的基因序列分别插入双框载体pIRES的CMV启动子和IRES启动子之后，以实现mKate与ESR1的共表达；另外，插入嘌呤霉素(Puromycin)抗性基因序列，作为稳定遗传筛选标签。转染入细胞核之后，该质粒中的各个序列片段经转录翻译，可在细胞中表达出相应蛋白，特别是外源性荧光蛋白mKate的表达，以及超过自身基线水平的、内源性ERα蛋白的过表达。质粒图谱如图1所示。
②mCerulean-ESR2：同①类似地，将青色荧光蛋白mCerulean的基因序列与ESR2的基因序列分别插入载体pIRES的CMV启动子和IRES启动子之后，以实现mCerulean与ESR2的共表达，另外，插入嘌呤霉素抗性基因序列，作为稳定遗传筛选标签。转染入细胞核之后，该质粒中的各个序列片段经转录翻译，可在细胞中表达出相应蛋白，特别是外源性荧光蛋白mCerulean的表达，以及超过自身基线水平的、内源性ERβ蛋白的过表达。质粒图谱如图2所示。
③shESR1-TagBFP：将ESR1干扰序列shESR1(其碱基序列为：gcaagcccactgtgttcaactttcaagagaagttgaacacagtgggcttgc)插入U6启动子之后，随后采用CMV启动子连接蓝色荧光蛋白TagBFP的基因序列，实现TagBFP标记的ESR1表达下调；另外，插入嘌呤霉素抗性基因序列，作为稳定遗传筛选标签。转染入细胞核之后，该质粒中的各个序列片段经转录翻译，可在细胞中表达出相应蛋白，特别是外源性荧光蛋白TagBFP的表达，以及由于shESR1干扰序列阻止内源性ESR1基因的正常转录翻译，导致ESR1基因的沉默，ERα蛋白表达显著低于自身基线水平。质粒图谱如图3所示。
④shESR2-EBFP2.0：将ESR2干扰序列shESR2(其碱基序列为：ggtcccatctatatcccttccttcaagagaggaagggatatagatgggacc)插入U6启动子之后，随后采用CMV启动子连接蓝紫色荧光蛋白EBFP2.0的基因序列，实现EBFP2.0标记的ESR2表达下调；另外，插入嘌呤霉素抗性基因序列，作为稳定遗传筛选标签。转染入细胞核之后，该质粒中的各个序列片段经转录翻译，可在细胞中表达出相应蛋白，特别是外源性荧光蛋白EBFP2.0的表达，以及由于shESR2干扰序列阻止内源性ESR2基因的正常转录翻译，导致ESR1基因的沉默，ERβ蛋白表达显著低于自身基线水平。质粒图谱如图4所示。
⑤shNC-mAmetrine：将无义序列shNC(其碱基序列为：gcctaaggttaagtcgccctcgttcaagagacgagggcgacttaaccttaggc)插入U6启动子之后，随后采用CMV启动子连接绿色荧光蛋白mAmetrine的基因序列，实现mAmetrine标记的基因沉默的无义对照；另外，插入嘌呤霉素抗性基因序列，作为稳定遗传筛选标签。该质粒转入的无义序列，与shESR1/2的序列长度类似，但对基因的表达不会产生影响，作为沉默技术操作的对照，以证实该技术操作本身对细胞基因表达和细胞活性不会产生显著影响。质粒图谱如图5所示。
⑥CMV-LSSmCherry：采用CMV启动子连接橙红色荧光蛋白LSSmCherry的基因序列，实现LSSmCherry标记的、对目的基因不做干预的荧光空白对照；另外，插入嘌呤霉素抗性基因序列，作为稳定遗传筛选标签。该质粒只转入荧光蛋白，而对细胞自身的基因组不做任何干预，作为荧光空白对照，以证实荧光蛋白的转入对细胞的基因表达和细胞活性不会产生显著影响。质粒图谱如图6所示。
(4)细胞培养：黑色素瘤细胞B16在5％CO2、37℃培养箱中用含10％FBS和1％双抗的1640培养基培养。
(5)多色标记不同ERs亚型的B16稳转细胞系的建立：
将B16细胞种植于6孔板中，观察细胞汇合度约80％，此时进行转染的操作。具体步骤为：培养24小时后，应用转染试剂lipofectamine 3000将mKate-ESR1、mCerulean-ESR2、shESR1-TagBFP、shESR2-EBFP2.0、shNC-mAmetrine与CMV-LSSmCherry质粒(共6种)分别转染到B16细胞中(共6孔)；48小时后添加2μg/ml抗性筛选试剂嘌呤霉素，经过3-5天的选择性培养后，无荧光细胞(质粒未能成功转入基因组的细胞)大部分死亡，剩余细胞主要是携带荧光蛋白和目的蛋白的稳定转染细胞。待孔板中细胞汇合至95％左右，将各孔中细胞分别消化、接种到培养瓶(包括1μg/mL嘌呤霉素的完全培养基)中继续扩增培养，以提高稳定转染细胞的比例到50％以上。分别收集、冻存6种稳转细胞株：mKate-ESR1-B16、mCerulean-ESR2-B16、shESR1-TagBFP-B16、shESR2-EBFP2.0-B16、shNC-mAmetrine-B16与LSSmCherry-B16。
(6)多色标记不同ERs亚型的B16单克隆稳转细胞系的筛选：
采用无限稀释法筛选各个单克隆细胞系：消化步骤(5)中各培养瓶的稳定转染细胞，以Kate-ESR1-B16为例，消化后计数，按照1个细胞/孔/100μL完全培养基的密度接种到96孔板中。待生长7-10天，细胞形成明显的斑块之后，在荧光显微镜下观测每个孔中细胞的荧光状态，挑选出只有单个斑块、细胞状态良好、荧光亮度高的孔(亮度最佳的5-10株)，消化到48孔板中继续培养，逐步扩增至培养瓶中，所得到的即为单克隆细胞株，冻存备份。
(7)多色标记不同ERs亚型的B16单克隆稳转细胞系的基因表达水平验证：采用荧光半定量PCR检验各个细胞株ESR1和ESR2的基因表达水平，结果如图7所示，ESR1和ESR2均被正确的过表达和沉默。
(7)多色标记不同ERs亚型的B16单克隆稳转细胞系的荧光蛋白的表达验证和成像实例：采用共聚焦显微成像系统分别对每种荧光细胞进行单独地光谱成像，结果如图8显示，每种荧光蛋白均被正确的表达；采用双光子多色显微成像系统对六色混合接种于培养皿的荧光细胞进行成像，结果如图9所示，六色细胞可同时被多色成像系统观测到，且可进行正确地区分。上述成像均在离体活细胞的条件下进行。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.多色荧光分别标记不同雌激素受体亚型的单克隆肿瘤细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将表达不同颜色荧光的不同的荧光蛋白基因分别与不同的雌激素受体基因序列或不同的雌激素受体干扰序列构建共表达质粒；在构建质粒的过程中，还包括插入筛选标记基因序列；所述筛选标记基因序列为抗性基因序列；
所述不同的荧光蛋白基因用于表达不同荧光蛋白，该荧光蛋白作为荧光标签，用于标记不同的雌激素受体过表达或者沉默；所述不同的雌激素受体基因序列用于过表达不同的雌激素受体的蛋白水平，所述不同的雌激素受体干扰序列用于沉默不同的雌激素受体的蛋白表达；
所述不同的雌激素受体过表达序列分别为雌激素受体基因亚型ESR1的序列和雌激素受体基因亚型ESR2的序列；所述ESR1和ESR2的碱基序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；所述ESR1的干扰序列为shESR1，其碱基序列为：gcaagcccactgtgttcaactttcaagagaagttgaacacagtgggcttgc；所述ESR2的干扰序列为shESR2，其碱基序列为：ggtcccatctatatcccttccttcaagagaggaagggatatagatgggacc；
(2)将步骤(1)得到的质粒分别转染到肿瘤细胞中，得到不同的稳定转染细胞株；
(3)将步骤(2)得到的稳定转染细胞株采用无限稀释法筛选出单克隆细胞系，即得到多色荧光分别标记不同雌激素受体亚型的单克隆肿瘤细胞系。
2.如权利要求1所述的多色荧光分别标记不同雌激素受体亚型的单克隆肿瘤细胞系的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述不同的荧光蛋白基因分别为红色荧光蛋白基因、青色荧光蛋白基因、蓝色荧光蛋白基因、蓝紫色荧光蛋白基因、绿色荧光蛋白基因和橙红色荧光蛋白基因中的至少两种。
3.如权利要求1或2所述的多色荧光分别标记不同雌激素受体亚型的单克隆肿瘤细胞系的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述肿瘤细胞为鼠源性肿瘤细胞。
4.如权利要求3所述的多色荧光分别标记不同雌激素受体亚型的单克隆肿瘤细胞系的构建方法，其特征在于，所述鼠源性肿瘤细胞为黑色素瘤细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞或结肠癌细胞。
5.如权利要求1所述的多色荧光分别标记不同雌激素受体亚型的单克隆肿瘤细胞系的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，转染之后通过筛选得到不同的稳定转染细胞株。
6.如权利要求1所述的多色荧光分别标记不同雌激素受体亚型的单克隆肿瘤细胞系的构建方法，其特征在于，所述抗性基因序列为嘌呤霉素抗性基因序列。
7.如权利要求1-6任一项所述方法构建得到的多色荧光分别标记不同雌激素受体亚型的单克隆肿瘤细胞系。
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