CN116590421A - 融合基因相关F-circP3F原位表达检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医学检验技术领域，尤其是涉及一种横纹肌肉瘤中融合基因相关F‑circP3F原位表达检测试剂盒，所述检测试剂盒包括诊断横纹肌肉瘤的分子标志物F‑circP3F和融合基因PAX3‑FOXO1的试剂和探针，且所述检测试剂盒所依据的检测方法为RNA‑FISH和BaseScope。该检测试剂盒基于RNA‑FISH和BaseScope技术，通过特定序列结构探针的设计，可实现原位显示并检测石蜡包埋组织和细胞中F‑circP3F RNA的表达水平并对其进行细胞定位，可操作性及重复性强，实现了分子标记物的可视化，灵敏度和特异性均较高，为横纹肌肉瘤的诊断、分型及预后评估奠定了检测基础。

Description

融合基因相关F-circP3F原位表达检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物医学检验技术领域，尤其是涉及一种横纹肌肉瘤中融合基因相关F-circP3F原位表达检测试剂盒。
背景技术
横纹肌肉瘤（rhabdomyosarcoma，RMS）是儿童时期最常见的软组织恶性肿瘤，约占儿童所有软组织恶性肿瘤的50%，生长迅速，总体预后较差。根据临床和病理组织形态特征可分为胚胎性（embryonal RMS，ERMS）、腺泡状（alveolar RMS，ARMS）、梭形细胞（spindlecell RMS，SRMS）和多形性（pleomorphic RMS，PRMS）四个主要类型。它们不仅在发病年龄、部位、组织形态等方面有差异，而且在治疗、预后上也各不相同。
迄今的研究发现，不同亚型的RMS中存在两类不同的分子遗传学改变：腺泡状RMS（ARMS）存在特异性染色体易位t （2；13）（q35；q14）、t（1；13）（q36；q14）及其融合基因PAX3/7-FOXO1、PAX3-NCOA1/2和PAX3-FOXO4等；梭形/硬化型RMS（SRMS）中不仅存在VGLL2-NCOA2基因重排，而且40-50%有MyoD1基因突变。融合基因PAX-FOXO1及其产物主要通过阻滞细胞周期、抑制细胞肌分化、增加细胞增殖侵袭迁移能力，并增强其下游靶基因和特定miRNA的表达，促进ARMS的发生发展。与融合基因阴性者相比，融合基因阳性RMS是一种高危性疾病，它对化疗反应差，易转移和复发，总体5年存活率低于50%，并且转移或复发患者的5年存活率低于20%。
环状RNA（circular RNA，circRNA）是1976年Sanger等人首先在植物感染的类病毒发现的闭合环状非编码RNA分子，具有环状共价键结构，对外切酶具有较高的耐受性。随着RNA测序技术的进步和新的生物信息学方法的发展，一些研究揭示了circRNA在人类组织中的广泛表达，并且似乎是所有真核生物的普遍特征。由于其保守性、丰富性和特异性，circRNA在转录后水平具有多种生物学功能并参与肿瘤发生，如能够充当RNA结合蛋白（RBPs）的诱饵，作为蛋白质支架，作为miRNA海绵，作为剪接调节因子，以及作为蛋白质翻译的模板等。
染色体易位所致基因重排或融合基因形成在某些肿瘤中较常见，目前的研究表明其可能是导致这些肿瘤发生的驱动性因素。来自融合基因反剪接的circRNA是除融合蛋白以外参与肿瘤发生发展的另一个途径。这种融合基因相关circRNAs（f-circRNAs）是由染色体易位融合基因产生的，它可以促进来自染色体易位的嵌合mRNA转录本的反向剪接。
迄今为止，人们只在非小细胞肺癌、尤文肉瘤和部分血液系统恶性肿瘤中发现了F-circRNAs的表达。但F-circRNAs相关研究不多，尚未见肿瘤组织或细胞中检测F-circRNAs原位表达的报道。缺乏有效且可靠的实验方法研究F-circRNAs在福尔马林固定、石蜡包埋（Formalin fixed and paraffin embedded，FFPE）组织和细胞水平的时空表达，使得人们对揭示F-circRNAs的功能和了解它们在人类疾病中的作用变得极具挑战性。
申请人前期在运用RT-PCR技术扩增腺泡状RMS中融合基因PAX3-FOXO1及其相关circ RNA时，通过优化引物设计和线性RNA消化，使用发散引物（Divergent primer）在腺泡状RMS细胞系中扩增到一个阳性目的片段，通过对PCR产物Sanger测序并使用NCBI数据库进行比对证实为融合基因PAX3-FOXO1相关环状RNA（Fusion gene PAX3-FOXO1 related circRNA），将其命名为F-circP3F。由于此F-circP3F为国内外首次发现，申请人又设计引物成功扩增并经测序验证了F-circP3F的全长核苷酸序列；circRNA-seq结果再次证实，PAX3-FOXO1阳性ARMS细胞中存在相同的F-circP3F。通过构建沉默和过表达F-circP3F的稳转细胞系并进行功能学实验发现F-circP3F可以促进腺泡状横纹肌肉瘤的增殖、侵袭、迁移能力。
CircRNAs参与许多生物学过程，包括表观遗传修饰、细胞分化和凋亡，是一种独特的生物标志物，可能与生理或疾病状态有关。大量的研究表明circRNAs可以对多个肿瘤生物学过程进行调控，在肿瘤的发生发展过程中扮演了重要的角色，且结构稳定、半衰期长，其表达具有细胞类型和组织特异性。但大多数circRNAs表达水平偏低，且与mRNA相比，表达异质性较强。因此，肿瘤组织中的circRNAs检测要求使用高灵敏度和高特异性的方法，寻找一种稳定且可靠的实验手段精准检测circRNAs，对阐明其空间分布的生物学功能至关重要。
目前，检测circRNA可以通过多种方法来实现，包括使用Northern blot、免疫组织化学（IHC）和原位杂交（ISH）对目标蛋白和mRNA进行组织学评估，以及非组织学方法，如circRNA测序（circRNA-seq）及逆转录-聚合酶链式反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）。其中，Northern blot容易出现RNA的降解，虽然特异性较高能够降低假阳性率，但灵敏度稍低，且实验试剂对人体有害；circRNA测序（circRNA-seq）需要构建文库，数据分析繁杂，价格昂贵，在FFPE样本中检测的效率低，且其结果需要RT-PCR进一步验证。虽然RT-PCR是circRNA识别和定量的首选方法，但是不同的引物PCR不能揭示circRNA的全长序列，不仅可扩增出由该基因同一区域产生的多个circRNA，且由于滚动圈扩增和模板切换，逆转录酶会干扰circRNA的定量；同时，RT-PCR扩增前需将组织或细胞破坏，从中提取核酸作为模板，因此很难将PCR结果与组织或细胞形态学图像联系起来，无法直接观察含有特异性靶序列的细胞类型。
原位检测circRNA不仅证实了其存在，还提供了circRNA的空间丰度信息，这反过来又暗示了它们与其他分子的潜在相互作用，从而有助于更好地理解circRNA的生理和病理功能。因此，有效的原位检测circRNAs的技术非常重要。
此外，NGS研究发现，肿瘤的遗传异质性存在于同一患者或患者不同转移部位的肿瘤中（称为肿瘤间异质性），甚至在同一肿瘤中（称为肿瘤内异质性）。此外，肿瘤的特性也会随时间的推移而变化（时间上的异质性），这给癌症治疗带来了更大的挑战，因为患者可能对单一的治疗不一定有疗效。因此，评估肿瘤的分子异质性是一项具有挑战性的任务，常规分子检测，如RT-PCR和RNA-seq虽可对RNA定量分析，却破坏了样本的形态背景和空间分辨率，限制了研究人员比较异质细胞群之间的RNA表达信息。
鉴于此，提供一种F-circP3F相对量化和可视化方法，以实现对石蜡组织中F-circP3F RNA原位表达水平的检测及亚细胞定位，是本领域技术人员亟须解决的一项技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种横纹肌肉瘤中融合基因相关F-circP3F原位表达检测试剂盒，该检测试剂盒基于RNA-FISH和BaseScope技术，通过特定序列结构探针的设计，可实现原位显示并检测石蜡包埋组织和细胞中F-circP3F RNA的表达水平并对其进行细胞定位，可操作性及重复性强，实现了分子标记物的可视化，灵敏度和特异性均较高，为横纹肌肉瘤的诊断、分型及预后评估奠定了检测基础。
本发明提供一种横纹肌肉瘤中融合基因相关F-circP3F原位表达检测试剂盒，所述检测试剂盒包括诊断横纹肌肉瘤的分子标志物F-circP3F和融合基因PAX3-FOXO1的试剂和探针，且所述检测试剂盒所依据的检测方法为RNA-FISH和BaseScope，
其中，在RNA-FISH检测方法中，所述F-circP3F的探针序列如SEQ ID No.1所示；在BaseScope检测方法中，所述F-circP3F的探针序列如SEQ ID No.2所示，所述PAX3-FOXO1的探针序列如SEQ ID No.3所示。
本发明申请人在研究横纹肌肉瘤中融合基因相关F-circP3F的检测过程中，为实现融合基因相关F-circP3F原位表达，创造性地提出了采用RNA-FISH和BaseScope技术，并对应设计了特定序列结构的探针。其中，在BaseScope技术中探针设计的原理为：“Z”探针由三个元素组成—与RNA分子杂交的较低区域，连接较低区域与“Z”探针尾部的间隔区序列，以及与预扩增序列结合的尾部。一旦双“Z”探针（RNA特异性序列）的底部与细胞内的目标RNA序列结合，信号扩增就通过一系列的序列过程实现。而单个“Z”探针与非特异性位点结合不会产生完整的信号放大分子结合位点，所以在杂交过程中会被洗掉，从而防止产生非特异性信号。每个RNA分子应该与20个“Z”二聚体杂交，而400个标记的探针附着在每个二聚体上，这一过程将导致多达8000倍的信号放大。因此，该检测试剂盒可实现原位显示并检测石蜡包埋组织和细胞中F-circP3F RNA的表达水平并对其进行细胞定位，可操作性及重复性强，实现了分子标记物的可视化，灵敏度和特异性均较高，为横纹肌肉瘤的诊断、分型及预后评估奠定了检测基础。
具体地，在RNA-FISH检测方法中，所述F-circP3F的探针序列为CATCTGATTGGGGTGCTGAGGCTGCTACCCTCAGCCT（SEQ ID No.1）；在BaseScope检测方法中，所述F-circP3F的探针序列为TGGGTGTCAGGCTGAGGGTTAGTGAGCAGCCTCAGCACCC（SEQ ID No.2），所述PAX3-FOXO1的探针序列为ACCATTGGCAATGGCCTCTCACCTCAGAGAATTCAATTCGTCA（SEQ ID No.3）。
此外，因本申请的检测试剂盒既可以用于横纹肌肉瘤石蜡包埋组织中F-circP3F原位表达检测，又可以实现横纹肌肉瘤细胞中F-circP3F原位表达情况的检测。对于circRNA探针设计，一般选择探针长度为55mer左右，跨越环接位点并保证每侧至少22-24mer，为提高分辨率，约每10个碱基引入一个荧光标记。而考虑到待测物存在的形式不同，在RNA-FISH检测方法中，组织用和细胞用F-circP3F的探针区别仅在于所使用的5’端标记物不同，细胞用F-circP3F的探针一般选择直接标记探针，而组织用F-circP3F的探针一般选择生物素标记的间接标记探针。
其中，直接标记探针是将荧光素直接与探针核苷酸或磷酸戊糖骨架共价结合，检测步骤简单，能提高检测效率及可重复率，适用于含有一定量RNA的肿瘤细胞系；但对于circRNA含量相对较少的FFPE组织，其检测灵敏度降低；间接标记探针是采用生物素标记RNA引物序列，在体外将其与耦联链霉亲和素的荧光基团进行亲和结合，利用亲和素-生物素-荧光素复合物，将荧光信号进行放大，便于在组织背景中观察到更强、更明显的荧光信号，从而可以实现检测组织细胞中含量较低的RNA。因此，在本发明中，RNA-FISH检测细胞中F-circP3F的探针序列为Cy3-5'-CATCTGATTGGGGTGCTGAGGCTGCTCACTAACCCTCAGCCT-3'，RNA-FISH检测FFPE组织中F-circP3F的探针序列为Biotin-5'-CATCTGATTGGGGTGCTGAGGCTGCTCACTAACCCTCAGCCT-3'。
作为本技术方案优选地，在RNA-FISH检测方法中，所述检测试剂盒还包括细胞质内阳性对照的探针和细胞核内阳性对照的探针，
其中，所述细胞质内阳性对照为在真核生物细胞中稳定表达的18s rRNA，所述细胞核内阳性对照为在真核生物细胞核内保守且稳定表达的snRNA U6。
具体地，所述18s rRNA的探针序列为CTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTC（SEQ IDNo.4）；所述snRNA U6的探针序列为TTGCGCAGGGGCCATGCTAATCTTCT（SEQ ID No.5）。
同理，细胞用和组织用细胞质内阳性对照18s rRNA的探针序列也略有不同。
作为本技术方案优选地，在BaseScope检测方法中，所述检测试剂盒还包括阳性内参探针和阴性内参探针。并且，具体地，所述阳性内参探针的序列为CGGCCGATGAGAAGAAGAAGGGGCCCAAAGTCACCGTC（SEQ ID No.6）；所述阴性内参探针的序列为TGGTGCGTCAAGCTTCTGGTCATGATGAAGCTCAATAATCTCAACATCCTCAAAATAGTTGGCAGCCATTTTTGAAAATTTCATCATCAGTATCGCACCGAGCGCAAAATTTGGCGCGATGATGGCTCCGATCCCTTTTTCTTCTGTTAAAGATGTGAGCTCTTTTAAATCAGCTTCTGAGAAACCGGTTGTTCCGACAACTGGACGGACTCCGTGCTCTAATGCAATTTTTGTATGTACTTTTCCGATTTCGGGCGTTGTTAAATCAATCAAGACATCCGGTTGTGTTTCTGTAAAACAGGCATGGATATCTGTGTAAATGAAAGCATCTGACTCAACAGGCATCACATCAGATAATTTTTGCTGATCGTATGTATGGTCTATGGCCCCTACAAGGTCAAAATGTGGTGTTCGTTCTGCCAATTTAACAGCTTCCTGCCCCATTCTTC（SEQ ID No.7）。
作为本技术方案优选地，所述检测试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，其中，所述阳性对照为经RT-PCR结果证实的PAX3-FOXO1融合基因和F-circP3F均呈阳性的腺泡状横纹肌肉瘤石蜡组织和RH30细胞系；所述阴性对照为经RT-PCR结果证实的PAX3-FOXO1融合基因和F-circP3F均呈阴性的胚胎型横纹肌肉瘤组织和RD细胞系。
本发明的横纹肌肉瘤中融合基因相关F-circP3F原位表达检测试剂盒，至少具有以下技术效果：
1、本发明的横纹肌肉瘤中融合基因相关F-circP3F原位表达检测试剂盒基于RNA-FISH和BaseScope技术，通过特定序列结构探针的设计，可实现原位显示并检测石蜡包埋组织和细胞中F-circP3F RNA的表达水平并对其进行细胞定位，可操作性及重复性强，实现了分子标记物的可视化，灵敏度和特异性均较高，为横纹肌肉瘤的诊断、分型及预后评估奠定了检测基础；
2、本发明所使用的RNA-FISH技术利用荧光直接或间接标记的短探针，其探针价格低廉，易于合成，且具有良好的组织穿透性和化学稳定性，特异性检测靶mRNA，在本发明评估低表达基因mRNA转录本的组织学定位中具有显著优势；
3、本发明所使用的BaseScope技术通过设计两个反义DNA寡核苷酸，以成对的形式与相邻序列结合，可获得高度的特异性，其仅使用1-3个双Z探针对50-300bp的序列检测，并且使用额外的信号放大步骤确保了足够的灵敏度检测单分子，具有极好的敏感性和特异性，不需要传统ISH所必需的无RNase环境，且探针序列较短可以显示低丰度的circRNA。此外，由于circRNA反向剪切连接序列是唯一的序列，特异性更强，可通过使用靶向后剪接序列的双Z探针检测circRNA；
4、本发明的检测试剂盒所依据的RNA-FISH和BaseScope技术均不需要额外的组织提取DNA或RNA，适用于组织较少的样本。同时，这两种方法均可以直接在FFPE组织切片上进行实验，具有操作简便、快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色的特点，可使宝贵的FFPE样本能够以最有效的方式使用。检测过程中，可将HE染色的肿瘤细胞图像作为参照，实现F-circRNA与融合基因位置分布的可视化，切片中的癌旁细胞是“自然”的内部对照，进一步确保了结果的高度可靠性。此外，BaseScope技术还可直接在明场显微镜下观察和计数阳性信号，便于开展实验和进行大规模检测。因此，本发明的检测试剂盒基于RNA-FISH和BaseScope技术，并通过特定序列结构探针的设计，使横纹肌肉瘤石蜡包埋组织和细胞中F-circP3F RNA表达水平可视化的检测成为可能。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明RNA-FISH检测方法中F-circP3F的探针示意图（细胞中）；
图2为本发明RNA-FISH检测方法中F-circP3F的探针示意图（组织中）；
图3为本发明RNA-FISH检测方法ARMS细胞中F-circP3F RNA、18s rRNA及U6的表达情况；
图4为本发明RNA-FISH检测方法ARMS组织中F-circP3F RNA及18s rRNA表达及定位情况；
图5为本发明RNA-FISH检测方法ERMS组织中F-circP3F RNA及18s rRNA表达及定位情况；
图6为本发明BaseScope检测方法中探针设计示意图；
图7为本发明BaseScope检测方法ARMS组织中可见F-circP3F的阳性表达（×40）；
图8为本发明BaseScope检测方法ERMS组织中可见F-circP3F的阳性表达（×40）。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
RNA-FISH技术检测横纹肌肉瘤细胞中融合基因PAX3-FOXO1相关环状RNA F-circP3F的表达
一、实验材料
1、人横纹肌肉瘤细胞系
人腺泡状横纹肌肉瘤细胞系RH30购自美国标准生物品收藏中心（ATCC），人类胚胎型横纹肌肉瘤细胞系RD购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。其基本信息和分子遗传学特点见表1。
表1. 人横纹肌肉瘤细胞系样本信息表
2、RNA-FISH探针
RNA-FISH实验中所用探针序列详见表2，其中，F-circP3F的探针设计如图1所示。
表2. RNA-FISH探针序列表
3、主要试剂
1） Buffer A（TritonX-100）（GenePharma）
2） Buffer C（20×SSC）（GenePharma）
3） Buffer E（杂交缓冲液）（GenePharma）
4） Buffer F（Tween 20）（GenePharma）
5） 封闭液（GenePharma）
6）SA-Cy3（GenePharma）
7） DAPI（GenePharma）
8） DEPC水（Biosharp）
9） PBS（BI）
10）4%多聚甲醛
11）抗荧光淬灭剂（APPLYGEN）
二、实验方法与步骤
1、细胞爬片制作与处理
（1）将处于对数生长期的RH30细胞接种于12孔板，37℃ 5% CO2培养箱中培养过夜；
（2）吸弃孔板中的培养基，PBS洗两次，每次5 min；
（3）吸弃PBS，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛，室温固定15 min；
（4）吸弃4%多聚甲醛，每孔加入1 mL 0.5% Buffer A（现用现配），室温处理细胞20min；
（5）吸弃0.5% Buffer A，PBS洗两次，每次5 min；
（6）每孔加入1 mL 2X Buffer C，37℃培养箱放置30 min。
2、杂交（避光）
（1）Buffer E提前在75℃水浴锅孵育30 min至澄清透明；
（2）探针稀释：探针冻干粉离心，10000rpm，3min，参照探针标签参数，F-circP3F探针nmole/OD260=2.57，在每OD 探针干粉制品中加入25.7μL灭菌DEPC水，18s rRNA探针nmole/OD260=4.32，则在每OD探针干粉制品中加入43.2μL灭菌DEPC水，振荡混匀，即得浓度为100μmol/L的探针储存液；
（3）配制探针混合液：将探针储存液配置成10μmol/L的工作液，取Cy3标记探针工作液（10μM）40μL，加入Buffer E 360μL配置成体系为400μL/孔的探针混合液。将配置好的探针混合液置于75℃水浴锅变性10min；
（4）吸弃孔板内的2X Buffer C，每孔加入上述探针混合液，37℃培养箱避光杂交孵育16 h。
3、洗涤复染
（1）杂交次日，将样本从37℃培养箱取出，吸弃探针混合液，每孔加入500μL 42℃预热的0.1% Buffer F洗涤5 min；
（2）吸弃0.1% Buffer F，每孔加入500μL 42℃预热的2X Buffer C洗涤5 min；
（3）吸弃2X Buffer C，每孔加入500μL 42℃预热1X Buffer C洗涤5 min，吸弃洗涤液；
（4）每孔加入500μL稀释后的DAPI工作液，避光染色15 min；
（5）吸弃DAPI工作液，PBS洗两次，每次5 min；
（6）滴加抗淬灭剂于干净的载玻片，将细胞爬片细胞面朝下盖在载玻片上，于荧光显微镜下观察，并于2天内完成拍照。
4、判读标准
使用荧光显微镜观察组织和细胞切片：
（1）评估细胞爬片的密度和荧光染色强度是否均一、合适；
（2）评估细胞质阳性对照18s rRNA组和RH30细胞中阳性信号的细胞数量和荧光强度。在20-40×荧光显微镜中，阳性信号表现为细胞质内明显的荧光团簇状信号，典型信号细胞大于3个/油镜视野，至少观察到10个阳性视野，可认定为阳性；
（3）评价RD细胞及NC组荧光信号有无。在20-40×荧光显微镜视野中，每5个视野观察到≤1个典型或不典型阳性信号细胞是可接受的，认定为阴性。
三、结果
选择原代培养的人腺泡状横纹肌肉瘤细胞系RH30分别以RT-PCR检测融合基因阳性和F-circP3F阳性，以真核生物细胞质中稳定表达的18s rRNA作为细胞质阳性对照，以真核生物中稳定且高度保守表达的snRNA U6作为细胞核阳性对照，使用Cy3标记的直接探针标记5’末端进行FISH检测。
使用徕卡荧光显微镜在630×油镜下观察，选择Cy3通道，观察到加入F-circP3F探针的细胞爬片细胞质内出现明显的荧光信号，加入18s rRNA探针的细胞爬片细胞质内出现明显的荧光信号，加入U6探针的细胞核内观察到荧光信号（图3，F-circP3F、18s rRNA（细胞质阳性对照）探针及U6（细胞核阳性对照）探针均为Cy3标记荧光信号，DAPI标记细胞核蓝染；630×油镜）。图中箭头表示某一荧光信号。
实施例2
RNA-FISH技术检测横纹肌肉瘤石蜡包埋组织中融合基因PAX3-FOXO1相关环状RNAF-circP3F的表达
一、实验材料
1、人横纹肌肉瘤组织
8例人腺泡状横纹肌肉瘤（ARMS）和2例胚胎型横纹肌肉瘤为福尔马林固定石蜡包埋组织，其基本信息和分子遗传学特点见表3。
表3. 人横纹肌肉瘤组织样本信息表
2、RNA-FISH探针序列
实验中所用探针序列详见表4，其中，F-circP3F的探针设计如图2所示。
表4. RNA-FISH探针序列表
3、主要试剂
1） Buffer C（20×SSC）（GenePharma）
2） Buffer D（去离子甲酰胺）（GenePharma）
3） Buffer E（杂交缓冲液）（GenePharma）
4）蛋白酶K（GenePharma）
5）封闭液（GenePharma）
6）SA-Cy3（GenePharma）
7）DAPI（GenePharma）
8） DEPC水（Biosharp）
9）PBS（BI）
10）抗荧光淬灭剂（APPLYGEN）
二、实验方法与步骤
1、石蜡组织切片脱蜡
（1）石蜡切片在60℃烤箱中预热2h至石蜡融化；
（2）将切片浸入二甲苯 I，II，III 中各放置10 min；
（3）在梯度酒精中（100%、95%、90%、80%、70%）室温孵育各10 min；
（4）PBS洗切片两次，每次2 min（染缸中浸洗）。
2、蛋白酶 K消化
（1）蛋白酶K原液用 2×Buffer C按照1：800稀释，配制成蛋白酶K工作液，预热至37℃，然后每张切片滴加蛋白酶K工作液100μL，37℃孵育10 min；
（2）吸弃蛋白酶K，将100μL封闭液母液用1×PBS定容至5 mL，配制成1×封闭液，然后每张切片滴加100μL 1×封闭液，37℃孵育30min（1×封闭液置于4℃保存）；
（3）吸弃1×封闭液，每张切片滴加100μL 2×Buffer C室温下漂洗3次，每次1min。
3、变性
（1）配制变性液：2×Buffer C 400μL+ Buffer D 2800μL+ DEPC 800μL定容至4mL，78℃预热变性液；（注：现用现配，Buffer D在通风橱使用）
（2）每张切片滴加预热变性液100μL，78℃孵育8 min；
（3）梯度酒精（70%、80%、90%、100%）脱水，每次 2 min，空气中干燥。
4、杂交（避光）
（1）Buffer E提前在73℃水浴锅孵育30 min，至澄清透亮；
（2）探针稀释：探针冻干粉离心，10000rpm，3min，参照探针标签参数，F-circP3F探针nmole/OD260=2.57，在每OD 探针干粉制品中加入25.7μL灭菌DEPC水，18s rRNA探针nmole/OD260=4.32，则在每OD探针干粉制品中加入43.2μL灭菌DEPC水，振荡混匀，即得浓度为100μmol/L的探针储存液；
（3）配制探针工作液：将探针储存液稀释至5μmol/L(uM)，放入75℃水浴锅变性10min；然后与SA-Cy3按比例加入PBS配制10μL体系：2μL biotin-probe + 1.5μL SA-Cy3 +6.5μL PBS，37℃孵育30 min；
（4）将上述10μL探针工作液和90μL Buffer E混匀；
（5）每张切片滴加100μL变性后的探针混合液，盖上盖玻片，封片胶封片；置于原位杂交仪中，37℃ 孵育12-16 h，注意插入湿度条保持湿度以防干片。
5、洗涤复染
（1）配制洗涤液：2×Buffer C 400μL + Buffer D 2000μL + DEPC水1600μL定容至4 mL（现用现配），43℃ 预热洗涤液；
（2）轻轻去掉盖玻片，吸弃杂交溶液，每张切片滴加预热的洗涤液100μL洗切片15min；
（3）每张切片滴加2×Buffer C 100μL，60℃洗3次，每次10 min；
（4）吸弃2× Buffer C，每张切片滴加100μL的2× Buffer C，37℃洗涤10 min，3次（如果背景深时，适当提高洗涤温度及次数）；
（5）DAPI原液用PBS 1000倍稀释（避光保存和使用），每张切片滴加 100μL稀释好的DAPI工作液，室温下避光孵育15 min；
（6）吸弃DAPI工作液，PBS洗切片2次，每次2 min（染缸中浸洗）；
（7）滴加抗荧光淬灭剂，盖上盖玻片，封片胶封片于荧光显微镜下观察（2天内完成拍摄）。
6、判读标准
使用荧光显微镜观察组织和细胞切片：
（1）评估组织和细胞形态；
（2）评估细胞质阳性对照18s rRNA组和ARMS组阳性信号的细胞数量和荧光强度。在100×油镜视野中，阳性信号表现为细胞质内明显的荧光团簇状信号，每个油镜视野典型信号细胞大于3个，至少观察10个阳性视野，可认定为阳性；
（3）评价阴性对照ERMS组荧光信号有无。在100×油镜的视野中，每5个视野观察到≤1个典型或不典型阳性信号细胞是可接受的，认定为阴性。
三、结果
选取8例腺泡状横纹肌肉瘤（ARMS）和2例胚胎型横纹肌肉瘤（ERMS）的石蜡包埋组织，分别以RT-PCR检测融合基因和F-circP3F阳性的ARMS组织和融合基因及F-circP3F均为阴性的ERMS组织作为阳性和阴性对照，以真核生物细胞质中稳定表达的18s rRNA作为细胞质阳性对照，F-circP3F探针及18S rRNA（胞质对照）探针均为Biotin标记，并使用链霉亲和蛋白（SA）与Cy3耦联的间接结合探针，标记为荧光信号进行FISH检测。
使用徕卡激光共聚焦显微镜在630×油镜下观察，选择Cy3通道，观察到加入F-circP3F探针的8例ARMS组织切片细胞质中均出现明显的荧光信号（图4，其中，HN-S1914361，ARMS，HE，肿瘤呈腺泡状排列，纤维间隔（图4 A，×20）；肿瘤细胞质少，核圆或卵圆形（图4 B，×60）；细胞质中 F-circP3F（+），荧光信号，630×油镜（图4 C）；细胞质阳性对照18s rRNA（+），荧光信号，630×油镜（图4 D），与加入18s rRNA探针的组织切片结果类似，而加入F-circP3F探针的2例ERMS组织切片均未观察到明显的荧光信号（图5，其中，SJT-247687，ERMS，肿瘤片状分布，间质粘液变（图5 A，×20）；横纹肌母细胞样瘤细胞区（图5 B，×60）；细胞质中 F-circP3F（-），无明显荧光信号，630×油镜（图5 C）；细胞质阳性对照18srRNA（+），荧光信号，630×油镜（图5 D）。图中箭头表示某一荧光信号。
实施例3
BaseScope技术检测横纹肌肉瘤组织中融合基因PAX3-FOXO1相关环状RNA F-circP3F的表达
一、实验材料
1、人横纹肌肉瘤组织
人腺泡状横纹肌肉瘤细胞系RH30购自美国标准生物品收藏中心（ATCC），人类胚胎型横纹肌肉瘤细胞系RD购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。10例人腺泡状横纹肌肉瘤（ARMS）和1例胚胎型横纹肌肉瘤为FFPE组织，其基本信息和分子遗传学特点见表5。
表5. 人横纹肌肉瘤组织样本信息表
2、BaseScope探针序列
实验中所用探针序列详见表6，其中，F-circP3F的探针设计如图6所示。
表6. BaseScope探针序列表
3、主要试剂
1）10×靶标修复液（Advanced Cell Diagnostics）
2）50×清洗缓冲液（Advanced Cell Diagnostics）
3）蛋白酶 Ⅲ（Advanced Cell Diagnostics）
4）杂交AMP1（Advanced Cell Diagnostics）
5）杂交AMP2（Advanced Cell Diagnostics）
6）杂交AMP3（Advanced Cell Diagnostics）
7）杂交AMP4（Advanced Cell Diagnostics）
8）杂交AMP5（Advanced Cell Diagnostics）
9）杂交AMP6（Advanced Cell Diagnostics）
10）杂交AMP7（Advanced Cell Diagnostics）
11）杂交AMP8（Advanced Cell Diagnostics）
12）杂交AMP9（Advanced Cell Diagnostics）
13）杂交AMP10（Advanced Cell Diagnostics）
14）杂交AMP11（Advanced Cell Diagnostics）
15）杂交AMP12（Advanced Cell Diagnostics）
16）Red-A和Red-B（Advanced Cell Diagnostics）
17）Green-A和Green-B（Advanced Cell Diagnostics）
二、实验方法与步骤
1、实验前试剂配制
（1）1×靶标修复液配制：10×靶标修复液：去离子水=1：9，混合均匀，现用现配，用后应弃去；
（2）1×清洗缓冲液配制：40℃预热50×清洗缓冲液10-20min后，50×清洗缓冲液：去离子水=1：49混合均匀；1×清洗缓冲液配制后可室温保存2周；
（3）Red配制：混合等体积的Red-A和Red-B，现用现配；
（4）Green配制：混合等体积的Green-A和Green-B，现用现配。
2、石蜡组织切片脱蜡
（1）组织样本切成4um厚切片，将切片固定到防脱载玻片上，于60℃烤片1小时；
（2）脱蜡：切片经新鲜二甲苯脱蜡（10min×2），脱蜡后的切片在新鲜100%乙醇中放置1min，2缸，经空气干燥5min。
3、组织切片靶标修复
（1）每张切片滴加2滴过氧化氢，室温下孵育10min，去离子水清洗，使用新鲜的去离子水重复一次；
（2）用镊子将载玻片架非常缓慢地没入到沸腾的1×靶标修复试剂中；
（3）使用去离子水清洗两次，在新鲜的100%乙醇中上下移动载玻片架，清洗载玻片3-5次，风干载玻片。
4、蛋白酶Ⅲ消化
（1）使用阻水笔在切片周围画圈，将干燥的切片放入载片架中，每张切片加入约2滴蛋白酶Ⅲ，将载片架放入预热的湿度控制盘，盖上盖，密封，放回杂交炉，40℃孵育30min。
5、杂交（避光）
（1）杂交探针：将C2探针和C1探针混合成1：50比例靶探针；使用去离子水清洗两次；将切片置于载玻片架中，每张切片加入约2滴探针以覆盖组织切片；将载玻片架放入湿度控制盘，盖好盖，放入杂交炉中，在40℃下孵育2小时；用1×清洗缓冲液在室温下清洗载玻片2min，2次；
（2）杂交AMP1：将切片置于载玻片架中，每张切片加入约2滴AMP1；将载玻片架放入湿度控制盘，盖好盖，放入杂交炉中，在40℃下孵育30min；用1×清洗缓冲液在室温下清洗载玻片2min，2次。
（3）杂交AMP2：将切片置于载玻片架中，每张切片加入约3滴AMP2；将载玻片架放入湿度控制盘，盖好盖，放入杂交炉中，在40℃下孵育30min；用1×清洗缓冲液在室温下清洗载玻片2min，2次；
（4）杂交AMP3：将切片置于载玻片架中，每张切片加入约2滴AMP3；将载玻片架放入湿度控制盘，盖好盖，放入杂交炉中，在40℃下孵育15min；用1×清洗缓冲液在室温下清洗载玻片2min，2次；
（5）杂交AMP4：将切片置于载玻片架中，每张切片加入约3滴AMP4；将载玻片架放入湿度控制盘，盖好盖，放入杂交炉中，在40℃下孵育30min；用1×清洗缓冲液在室温下清洗载玻片2min，2次；
（6）杂交AMP5：将切片置于载玻片架中，每张切片加入约3滴AMP5；将载玻片架放入湿度控制盘，盖好盖，放入杂交炉中，在40℃下孵育30min；用1×清洗缓冲液在室温下清洗载玻片2min，2次；
（7）杂交AMP6：将切片置于载玻片架中，每张切片加入约2滴AMP6；将载玻片架放入湿度控制盘，盖好盖，放入杂交炉中，在40℃下孵育15min；用1×清洗缓冲液在室温下清洗载玻片2min，2次；
（8）杂交AMP7：将切片置于载玻片架中，每张切片加入约2滴AMP7；将载玻片架放入湿度控制盘，盖好盖室温下孵育30min；用1×清洗缓冲液在室温下清洗载玻片2min，2次；
（9）杂交AMP8：将切片置于载玻片架中，每张切片加入约2滴AMP8；将载玻片架放入湿度控制盘，盖好盖室温下孵育15min；用1×清洗缓冲液在室温下清洗载玻片2min，2次；
（10）加入适量新鲜配制好的Red工作液，室温显色10min；
（11）杂交AMP9：将切片置于载玻片架中，每张切片加入约2滴AMP9；将载玻片架放入湿度控制盘，盖好盖，放入杂交炉中，在40℃下孵育15min；用1×清洗缓冲液在室温下清洗载玻片2min，2次；
（12）杂交AMP10：将切片置于载玻片架中，每张切片加入约2滴AMP10；将载玻片架放入湿度控制盘，盖好盖，放入杂交炉中，在40℃下孵育15min；用1×清洗缓冲液在室温下清洗载玻片2min，2次；
（13）杂交AMP11：将切片置于载玻片架中，每张切片加入约2滴AMP11；将载玻片架放入湿度控制盘，盖好盖，放入杂交炉中，在40℃下孵育30min；用1×清洗缓冲液在室温下清洗载玻片2min，2次；
（14）杂交AMP12：将切片置于载玻片架中，每张切片加入约2滴AMP12；将载玻片架放入湿度控制盘，盖好盖，放入杂交炉中，在40℃下孵育15min；用1×清洗缓冲液在室温下清洗载玻片2min，2次；
（15）加入适量新鲜配制好的Green工作液，室温显色10min。
6、显色及复染
（1）苏木素复染，染色约5-10秒，去离子水短时间冲洗；
（2）专用封片剂封片，晾干后镜检。
7、BaseScope结果判读标准
使用标准明场显微镜观察组织切片：
（1）评估组织和细胞形态；
（2）评估阳性对照探针的染色信号点数量。在20-40×物镜下，阳性对照探针检测结果应为细胞内的可见点状或团簇状信号；
（3）评价阴性对照探针的染色背景。在20×物镜的视野中，每20个细胞显示出一个着色点是可接受的。
三、结果
选取10例腺泡状横纹肌肉瘤（ARMS）和1例胚胎型横纹肌肉瘤（ERMS）的FFPE组织，分别以RT-PCR检测融合基因和F-circP3F均为阳性的ARMS组织和融合基因及F-circP3F均为阴性的ERMS组织作为阳性和阴性对照。
结果使用20-40×物镜下观察，观察到加入F-circP3F探针的10例ARMS组织切片中，其中，7例ARMS中观察到肿瘤细胞质内F-circP3F的阳性表达（图7，左图为荧光信号-F-circP3F；右图为阳性内参PPIB），其余3例ARMS和1例ERMS组织均为阴性（图8，左图为无信号；右图为阳性内参PPIB），BaseScope实验结果如表7所示。图中箭头表示某一荧光信号。
表7. BaseScope实验结果表
由表7可知，通过RNA-FISH和BaseScope技术检测11例横纹肌肉瘤石蜡包埋组织中F-circP3F的表达，比较RNA-FISH和BaseScope技术的敏感性和特异性可知，在8例ARMS组织中，RNA-FISH检出8例F-circP3F（+），BaseScope检出6例F-circP3F（+）；在1例ERMS组织中，RNA-FISH及BaseScope均检出1例F-circP3F（-）。同时结合形态学分析，RNA-FISH和BaseScope均可有效、特异地识别F-circP3F在ARMS石蜡组织中的表达，为临床诊断和分子分型的应用提供了可靠的依据。其中，BaseScope可在同一样本中同时检测PAX3-FOXO1和F-circP3F的表达情况。在10例ARMS组织中，BaseScope检出6例PAX3-FOXO1与F-circP3F均（+），2例PAX3-FOXO1或F-circP3F其一为（+），2例PAX3-FOXO1与F-circP3F均（-）；在1例ERMS组织中，BaseScope检出1例PAX3-FOXO1与F-circP3F均（-）。
表8为本发明所涉及的序列。
表8本发明所涉及序列
综上，基于RNA-FISH和BaseScope技术的检测横纹肌肉瘤石蜡包埋组织或细胞中F-circP3F的检测试剂盒，通过特定序列结构探针的设计，可实现对FFPE组织中F-circP3FRNA原位表达水平的检测及亚细胞定位，为F-circP3F的相对量化和可视化提供了可能，该检测试剂盒可操作性及重复性强，灵敏度和特异性均较高，有利于横纹肌肉瘤的诊断、分型及预后评估，并为了解其在腺泡状横纹肌肉瘤中的功能提供新的见解。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种横纹肌肉瘤中融合基因相关F-circP3F原位表达检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括诊断横纹肌肉瘤的分子标志物F-circP3F和融合基因PAX3-FOXO1的试剂和探针，且所述检测试剂盒所依据的检测方法为RNA-FISH和BaseScope，
其中，在RNA-FISH检测方法中，所述F-circP3F的探针序列如SEQ ID No.1所示；
在BaseScope检测方法中，所述F-circP3F的探针序列如SEQ ID No.2所示，所述PAX3-FOXO1的探针序列如SEQ ID No.3所示。
2.根据权利要求1所述的横纹肌肉瘤中融合基因相关F-circP3F原位表达检测试剂盒，其特征在于，在RNA-FISH检测方法中，所述检测试剂盒还包括细胞质内阳性对照的探针和细胞核内阳性对照的探针，
其中，所述细胞质内阳性对照为在真核生物细胞中稳定表达的18s rRNA，所述细胞核内阳性对照为在真核生物细胞核内保守且稳定表达的snRNA U6。
3.根据权利要求2所述的横纹肌肉瘤中融合基因相关F-circP3F原位表达检测试剂盒，其特征在于，所述18s rRNA的探针序列如SEQ ID No.4所示。
4.根据权利要求2所述的横纹肌肉瘤中融合基因相关F-circP3F原位表达检测试剂盒，其特征在于，所述snRNA U6的探针序列如SEQ ID No.5所示。
5.根据权利要求1所述的横纹肌肉瘤中融合基因相关F-circP3F原位表达检测试剂盒，其特征在于，在BaseScope检测方法中，所述检测试剂盒还包括阳性内参探针和阴性内参探针。
6.根据权利要求5所述的横纹肌肉瘤中融合基因相关F-circP3F原位表达检测试剂盒，其特征在于，所述阳性内参探针的序列如SEQ ID No.6所示。
7.根据权利要求5所述的横纹肌肉瘤中融合基因相关F-circP3F原位表达检测试剂盒，其特征在于，所述阴性内参探针的序列如SEQ ID No.7所示。
8.根据权利要求1所述的横纹肌肉瘤中融合基因相关F-circP3F原位表达检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。
9.根据权利要求8所述的横纹肌肉瘤中融合基因相关F-circP3F原位表达检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为经RT-PCR结果证实的PAX3-FOXO1融合基因和F-circP3F均呈阳性的腺泡状横纹肌肉瘤石蜡组织和RH30细胞系。
10.根据权利要求8所述的横纹肌肉瘤中融合基因相关F-circP3F原位表达检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为经RT-PCR结果证实的PAX3-FOXO1融合基因和F-circP3F均呈阴性的胚胎型横纹肌肉瘤组织和RD细胞系。
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