RU2471871C2 - Способ и устройство для определения строения хромосом - Google Patents
Способ и устройство для определения строения хромосом Download PDFInfo
- Publication number
- RU2471871C2 RU2471871C2 RU2007129399/10A RU2007129399A RU2471871C2 RU 2471871 C2 RU2471871 C2 RU 2471871C2 RU 2007129399/10 A RU2007129399/10 A RU 2007129399/10A RU 2007129399 A RU2007129399 A RU 2007129399A RU 2471871 C2 RU2471871 C2 RU 2471871C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- chromosome
- chromosomes
- segments
- specified
- dna probes
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 134
- 210000001726 chromosome structure Anatomy 0.000 title abstract 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims abstract description 414
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 77
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 claims abstract description 69
- 230000016507 interphase Effects 0.000 claims abstract description 69
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 66
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 65
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 34
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 25
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 claims abstract description 23
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 claims abstract description 20
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 60
- 230000005945 translocation Effects 0.000 claims description 52
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 44
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 28
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 claims description 26
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 23
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 17
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 17
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 15
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 14
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 claims description 11
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 11
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 11
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 11
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 claims description 10
- 210000004910 pleural fluid Anatomy 0.000 claims description 10
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 claims description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 4
- 210000004252 chorionic villi Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 4
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 claims 11
- 239000000049 pigment Substances 0.000 claims 4
- 206010061764 Chromosomal deletion Diseases 0.000 claims 1
- 208000016718 Chromosome Inversion Diseases 0.000 claims 1
- 208000034951 Genetic Translocation Diseases 0.000 claims 1
- 208000037280 Trisomy Diseases 0.000 claims 1
- 208000037516 chromosome inversion disease Diseases 0.000 claims 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 abstract description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 description 54
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 description 44
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 description 44
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 description 44
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 25
- 238000002509 fluorescent in situ hybridization Methods 0.000 description 21
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 20
- 230000002559 cytogenic effect Effects 0.000 description 20
- 101150084935 PTER gene Proteins 0.000 description 18
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 13
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 13
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 13
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 12
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 11
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 10
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 10
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 9
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 8
- 238000001444 catalytic combustion detection Methods 0.000 description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 8
- 206010008805 Chromosomal abnormalities Diseases 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 7
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 7
- 238000003793 prenatal diagnosis Methods 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 6
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 6
- 201000010374 Down Syndrome Diseases 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 5
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 5
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 101150037674 PMA2 gene Proteins 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 4
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 3
- 208000036626 Mental retardation Diseases 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010068052 Mosaicism Diseases 0.000 description 3
- 230000008711 chromosomal rearrangement Effects 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000001531 micro-dissection Methods 0.000 description 3
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- 101150049556 Bcr gene Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 108091081400 Subtelomere Proteins 0.000 description 2
- 206010053871 Trisomy 8 Diseases 0.000 description 2
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000002593 Y chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000815 hypotonic solution Substances 0.000 description 2
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 2
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 2
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- DWCZIOOZPIDHAB-UHFFFAOYSA-L methyl green Chemical compound [Cl-].[Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1C(C=1C=CC(=CC=1)[N+](C)(C)C)=C1C=CC(=[N+](C)C)C=C1 DWCZIOOZPIDHAB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 2
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 208000000995 spontaneous abortion Diseases 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 208000034298 trisomy chromosome 8 Diseases 0.000 description 2
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 2
- UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001917 2,4-dinitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C(=C1*)[N+]([O-])=O)[N+]([O-])=O 0.000 description 1
- VCESGVLABVSDRO-UHFFFAOYSA-L 2-[4-[4-[3,5-bis(4-nitrophenyl)tetrazol-2-ium-2-yl]-3-methoxyphenyl]-2-methoxyphenyl]-3,5-bis(4-nitrophenyl)tetrazol-2-ium;dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 VCESGVLABVSDRO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 208000012239 Developmental disease Diseases 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 108010034791 Heterochromatin Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 101100384865 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cot-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100352578 Nicotiana plumbaginifolia PMA3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 241000212749 Zesius chrysomallus Species 0.000 description 1
- 108700025690 abl Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000009223 counseling Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 210000004458 heterochromatin Anatomy 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000009403 interspecific hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000003765 sex chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 239000012780 transparent material Substances 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000036266 weeks of gestation Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6841—In situ hybridisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6879—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for sex determination
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5091—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Virology (AREA)
- Physiology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу определения строения интерфазных хромосом, способу колориметрической гибридизации in situ, способу визуального обнаружения Робертсоновских транслокаций между акроцентрическими хромосомами в образце, полученном от человека, и способу подтверждения присутствия маркерных хромосом в образце. Способ определения строения интерфазных хромосом включает получение образца, содержащего клетки, который имеет по меньшей мере одну хромосому для определения строения. Получают совокупность различных ДНК-зондов, специфичных к хромосомам и участкам хромосом человека, при этом указанные ДНК-зонды содержат различные метки и способны маркировать по меньшей мере одну нормальную контрольную хромосому из указанной по меньшей мере одной интерфазной хромосомы для определения строения по существу равномерно по всей длине указанной нормальной контрольной хромосомы. Проводят гибридизацию указанного образца с указанными ДНК-зондами. Применяют совокупность ферментов, антител и субстратов для выявления характерно окрашенных сегментов указанной хромосомы для колориметрического анализа указанного образца. Используют визуальный анализ для определения строения указанной хромосомы. Предложенное изобретение позволяет определять строение хромосом и выявлять различные цитогенетические отклонения. 4 н. и 28 з.п. ф-лы, 25 ил., 25 табл., 10 пр.
Description
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение относится к области цитогенетики, в частности, к определению строения хромосом.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Цитогенетика - область изучения хромосом на стадии метафазы клеточного цикла. Именно на этой стадии хромосомы находятся в наиболее конденсированном состоянии и наиболее удобны для изучения как в нормальном состоянии, так и в состоянии болезни. В настоящее время наиболее часто применяемым способом в области цитогенетики (во всем мире) является краткосрочное (<10 дней) либо долгосрочное (вплоть до 45 дней) культивирование образцов, взятых для анализа. В качестве образцов могут выступать периферическая кровь, костный мозг, амниотическая жидкость, солидная ткань, продукты оплодотворения, плевральная жидкость и т.п. После успешного культивирования при помощи различных способов получают метафазные хромосомы и исследуют их для определения того, имеет ли анализируемый индивид генетическую аномалию. Этот способ является достаточно сложным и требует применения многочисленных химических веществ и реактивов, а также значительного количества времени и квалификации.
Исследования хромосом часто требуются для различных диагностических целей, включающих следующие: 1) пренатальную диагностику; 2) хромосомный тест периферической крови (для тестирования пациентов с аномальными фенотипическими характеристиками, умственной отсталостью, пар с проблемами бесплодия, а также с проблемами многочисленных выкидышей для определения наличия генетической обусловленности отклонения; 3) диагностику лейкемии/лимфомы (крайне необходимы как для точной диагностики, так и для назначения курса лекарственных препаратов) и 4) диагностику и назначение лечения солидной опухоли (для опухолей мочевого пузыря, простаты, груди, легких и т.п.).
В течение почти пятнадцати лет для получения информации о хромосоме/кариотипе использовали метод под названием флюоресцентная гибридизация in situ (Fluorescent In Situ Hybridization, FISH). Однако этот метод имеет ряд ограничений. Применение способа FISH не дает полную информацию о кариотипе. Значительная часть исследований способом FISH проводилась на интерфазном ядре, когда хромосомы не видны обычными цитогенетическими способами, без дополнительного культивирования. Недавно стал возможен более полный анализ хромосом или кариотипа с применением метода мультиплексной FISH (M-FISH). Сложность этого метода состоит в том, что для получения хромосом для анализа все же необходим один пассаж клеток. Только после этого методом M-FISH можно выявить предположительные аномалии, а также обнаружить новые или не предполагаемые изменения.
Совсем недавно было разработано несколько способов многоцветного дифференциального окрашивания хромосом, таких как многоцветное дифференциальное окрашивание (multicolor banding, MCG), метод многоцветного «штрихового кода» хромосомы, метод многоцветного окрашивания, основанный на межвидовой гибридизации (rх-FISH), метод спектрального многоцветного дифференциального окрашивания (SCAN). Из всех этих способов только MCG применялся для анализа интерфазных хромосом.
В большинстве основанных на FISH методах используют зонды, специфичные для определенного заболевания. При создании специфичных для некоторого заболевания зондов набор таких зондов ограничен имеющимися данными о специфических изменениях, таких как транслокации, делеции, инверсии, амплификации участков хромосомы или другие известные хромосомные аномалии. Без предварительных знаний о предполагаемой генетической аномалии методы цитогенетики не способны диагностировать не известное или не предполагаемое генетическое нарушение. Применение зондов сплошного окрашивания хромосом позволяет обнаружить не выявленные ранее транслокации. Однако этот способ является очень трудоемким и требует применения набора из двадцати четырех (24) отдельных зондов для окрашивания хромосом. Более того, данный способ позволяет выявить только один тип генетической аномалии, а именно транслокацию между двумя различными хромосомами. Часто при развитии болезни генетические отклонения состоят из ряда проявлений, включающих транслокации, делеции или инверсии. Все эти дополнительные изменения, в особенности внутрихромосомные перестройки, невозможно обнаружить доступными наборами зондов для окрашивания хромосом. Вместо этого, для их обнаружения обычно требуется дополнительный набор или несколько наборов зондов, специфичных для определенного заболевания, в связи с чем данная методика становится недопустимо дорогостоящей и недоступной для обычной клинической цитогенетической лаборатории.
С вышеупомянутыми методами исследования метафазных хромосом связан ряд дополнительных недостатков, которые включают: очень сложный рисунок окрашивания сегментов хромосом, получаемый при идентификации отдельных хромосом человека; методики требуют применения очень дорогого оборудования, такого как фильтры, дихроичные зеркала, ПЗС (Charge-Coupled Device, CCD-камеры (Charge-Coupled Device, CCDб устройство (камера) с переносом заряда), сложные компьютерные программы, интерферометры и другие специализированные приборы для интерпретации рисунка исчерченности; указанные методики не предоставляют полную информацию о кариотипе, т.е. обнаруживают определенного типа аномалии, например, Робертсоновские транслокации; все методики основаны на применении флуорохромов, свечение которых гаснет или затухает, и образующийся рисунок исчерченности не является постоянным; образующемуся рисунку исчерченности компьютерная программа присваивает определенные псевдоцвета, а сам рисунок не может быть интерпретирован человеком путем прямого наблюдения; указанные методики хотя и применимы для исследовательских задач, но не подходят для практического применения в клинических цитогенетических лабораториях; а также наличие маркерных хромосом, имеющих структурные изменения, которые как правило не могут быть отслежены, что особенно существенно, поскольку маркерные хромосомы играют важную диагностическую и прогностическую роль в ряде клинических случаев.
Один тип генетической аномалии имеет особое значение при генетической диагностике, эта аномалия известна как Робертсоновская транслокация. Робертсоновские транслокации представляют собой транслокации между акроцентрическими хромосомами, которые соединяются своими центромерами, в результате чего в кариотипе становится на одну центромеру меньше. Робертсоновские транслокации имеют клиническое значение, в частности, при пренатальной диагностике. Патологическое состояние под названием однородительская дисомия (ОРД) характерно для хромосом 13, 14, и 15. ОРД у плода, обнаруженная при пренатальной диагностике, способствует тяжелым клиническим проявлениям и в значительной степени увеличивает показатели заболеваемости/смертности новорожденных.
Содержание документов и публикаций, цитируемых в данном описании, включено в данное описание посредством ссылок в полном объеме, в той степени, в которой они напрямую не противоречат данному описанию.
Краткое описание изобретения
Таким образом, задачей настоящего изобретения является обеспечение способа и устройства для определения строения хромосом. Аспекты настоящего изобретения включают способ определения строения интерфазных хромосом, включающий получение образца, содержащего клетки с хромосомами для анализа; получение видоспецифичных ДНК-зондов, при этом указанные ДНК-зонды способны маркировать по меньшей мере одну хромосому по существу равномерно по длине хромосомы; гибридизацию образца с ДНК-зондами; применение совокупности ферментов для получения характерно окрашенных сегментов хромосомы для колориметрического анализа образца; применение визуального анализа для определения строения хромосомы на основании колориметрического анализа.
Кроме того, способ предусматривает проведение гибридизации in situ. В типичном варианте реализации гибридизацию in situ можно проводить на пластинке. Пластинка (предметное стекло) может, например, содержать некоторое количество лунок для приема материала, гибридизации и анализа упомянутого строения ДНК.
В другом аспекте настоящего изобретения средства для визуального анализа включают световой микроскоп или CCD камеру (камеру с переносом заряда).
Аспекты настоящего изобретения предусматривают получение образцов для исследования из: амниотической жидкости; периферической крови;
плевральной жидкости; костного мозга; опухолевой ткани; продуктов оплодотворения или из любого другого источника, содержащего клетки, имеющие хромосомы для анализа.
Способ согласно аспектам данного изобретения включает визуальное определение хромосомных аномалий, таких как, например, транслокации или, более конкретно, Робертсоновские транслокации.
Способ согласно аспектам данного изобретения предусматривает получение полной информации о кариотипе.
Изобретение также охватывает способ колориметрической гибридизации in situ, включающий стадии: получения образца, содержащего клетки с хромосомами для определения строения; получения видоспецифических ДНК-зондов, способных маркировать хромосому в по существу равномерно по длине хромосомы; гибридизации in situ образца с указанными ДНК-зондами; применения совокупности ферментов для получения характерного окрашивания сегментов хромосомы для колориметрического анализа; и применения визуального анализа для определения строения указанной хромосомы.
Способ может дополнительно включать стадию in situ гибридизации образца на пластинке, при этом пластинка содержит некоторое количество лунок для приема материала, гибридизации и анализа упомянутого строения ДНК.
Изобретение может также включать способ визуального выявления Робертсоновских транслокаций в хромосомах, включающий стадии: получения образца, содержащего клетки с хромосомами для анализа; получения специфичных для человека ДНК-зондов, способных маркировать по меньшей мере две хромосомы в по существу равномерно по длине каждой из хромосом; гибридизации образца с указанными ДНК-зондами; применения совокупности ферментов для получения характерного окрашивания сегментов хромосом для колориметрического анализа; и применения визуального анализа для определения того, произошла ли Робертсоновская транслокация между указанными хромосомами.
Согласно изобретению, способ может также включать гибридизацию образца in situ на пластинке, содержащей некоторое количество лунок для приема материала, гибридизации и анализа упомянутого строения ДНК. Этот способ может также включать визуальный анализ, с применением светового микроскопа или CCD камеры.
Способ также предусматривает выбор источника данного образца ДНК из группы, включающей: амниотическую жидкость, периферическую кровь, плевральную жидкость, костный мозг, опухолевую ткань и продукты оплодотворения.
В дополнительном варианте реализации настоящего изобретения, способ обнаружения маркерных хромосом включает стадии: получения образца, содержащего клетки с хромосомами для определения строения; получения специфичных для человека ДНК-зондов, при этом указанные ДНК-зонды способны маркировать по меньшей мере две хромосомы по существу равномерно по длине каждой из указанных хромосом; гибридизации вышеуказанного образца с указанными ДНК-зондами; и применения совокупности ферментов для получения характерного окрашивания сегментов хромосом для колориметрического анализа хромосом.
Способ обнаружения маркерных хромосом может включать in situ гибридизацию образца на пластинке, содержащей некоторое количество лунок для приема материала, гибридизации и анализа строения ДНК. Детекцию можно осуществлять посредством визуального анализа с применением светового микроскопа или CCD-камеры.
Образец ДНК для анализа может быть получен из одного из следующих источников: амниотическая жидкость, периферическая кровь, плевральная жидкость, костный мозг, опухолевая ткань и продукты оплодотворения.
Другой аспект настоящего изобретения предусматривает способ мечения хромосомы, включающий стадии: получения образца, содержащего клетки с хромосомами для мечения, получения видоспецифичных ДНК-зондов, при этом ДНК-зонды могут быть способными пометить хромосому по существу равномерно по ее длине, гибридизации хромосомы с ДНК-зондами, в результате чего происходит мечение хромосомы.
Способ может включать in situ гибридизацию хромосомы на пластинке, при этом пластинка содержит некоторое количество лунок для приема материала, гибридизации и анализа строения ДНК. Способ дополнительно предусматривает получение ДНК из источника, выбранного из группы, включающей: амниотическую жидкость, периферическую кровь, плевральную жидкость, костный мозг, опухолевую ткань и продукты оплодотворения.
Типичный вариант реализации согласно аспектам настоящего изобретения включает набор для определения строения интерфазных хромосом, множество видоспецифичных ДНК-зондов, при этом указанные ДНК-зонды способны маркировать по меньшей мере одну хромосому по существу равномерно по длине хромосомы, множество ферментов для получения характерного окрашивания сегментов хромосомы для колориметрического анализа и некоторое количество пластинок для in situ гибридизации хромосомы с набором зондов.
Набор может дополнительно включать средства визуального анализа для колориметрического анализа одной хромосомы, такие как, например, микроскоп или камера.
Другой вариант реализации согласно аспектам настоящего изобретения включает набор зондов, включающий множество видоспецифичных ДНК-зондов, при этом ДНК-зонды могут быть сконструированы для маркирования (мечения) по меньшей мере одной хромосомы по существу равномерно по длине указанной хромосомы. Набор зондов может дополнительно включать совокупность ферментов для получения характерного окрашивания сегментов указанной хромосомы. Дополнительный вариант реализации согласно аспектам настоящего изобретения включает пластинку для in situ гибридизации интерфазных хромосом, которая включает стеклянную пластинку, дополнительно содержащую некоторое количество лунок, в которых можно проводить in situ гибридизацию.
Выше описан способ исследования строения хромосом с применением способа определения строения интерфазных хромосом (Interphase Chromosome Profiling, ICP) для получения полной информации о хромосомах и кариотипе при использовании любого типа клеток/образца без необходимости дополнительного культивирования ткани. Это достигается путем комбинирования патентуемых наборов ДНК-зондов и технологии колориметрической гибридизации in situ (Colorimetric In Situ Hybridization, CISH) на интерфазном ядре. Применение способов, раскрытых в данной заявке, позволяет обнаружить приблизительно 99% всех хромосомных аномалий с получением результатов при общей продолжительности анализа (turn around time, TAT) менее 48 часов.
Изобретение относится к способам и устройству для получения полной информации о кариотипе человека путем наблюдения отдельных хромосом человека в интерфазных клетках в гибридизационных камерах на совокупности пластинок. Анализ IСР не требует предварительных данных о наличии определенных или предполагаемых заболеваний, он выявляет известные и не известные генетические изменения и предоставляет полную информацию о кариотипе в рамках одного исследования. Кроме того, IСР не требует культивирования клеток и обеспечивает способ обнаружения почти всех типов хромосомных изменений в интерфазном ядре.
Дополнительные задачи и преимущества настоящего изобретения ясны с учетом нижеследующего подробного описания изобретения и прилагаемых графических материалов, при этом одни и те же номера ссылок относятся к одному и тому же признаку, компоненту или элементу.
Краткое описание графических материалов
Патент или заявка содержит, по меньшей мере, один чертеж и/или микрофотографию, исполненную в цвете.
Фиг.1а и 1b представляют собой идеограммы строения интерфазных хромосом, иллюстрирующие типичную цветную исчереченность хромосомы согласно аспектам настоящего изобретения.
Фиг.2а и 2b представляют собой известные из предшествующего уровня техники идеограммы G-окрашивания (бандирования) с разрешением, составляющим 400 бэндов.
Фиг.3а-3d представляют собой сопоставление выявляемого строения интерфазных хромосом (ICP) и идеограммы G-окрашивания согласно аспектам настоящего изобретения.
Фиг.4а и 4b представляют собой изображения полей зрения микроскопа, демонстрирующие транслокацию между хромосомами 9 и 22, соответственно, согласно аспектам настоящего изобретения.
Фиг.5а и 5b представляют собой изображения полей зрения микроскопа, демонстрирующие наличие транслокации и отсутствие транслокации соответственно, в целях проверки согласно аспектам настоящего изобретения.
Фиг.6а, 6b и 6c представляют собой изображения выявления маркерной хромосомы в составе хромосом 3, 7 и 10 соответственно, согласно аспектам настоящего изобретения.
Фиг.7 представляет собой конечное изображение поля зрения микроскопа при обнаружении материала маркерной хромосомы, в хромосомах 3, 7 и 10, согласно аспектам настоящего изобретения.
Фиг.8 представляет собой изображение поля зрения микроскопа, демонстрирующее интерстициальную делецию в хромосоме 13, согласно аспектам настоящего изобретения.
Фиг.9 представляет собой изображение поля зрения микроскопа, демонстрирующее Робертсоновскую транслокацию, затрагивающую хромосомы 14 и 21, согласно аспектам настоящего изобретения.
Фиг.10 представляет собой изображение поля зрения микроскопа, демонстрирующее парацентрическую инверсию короткого плеча хромосомы 8, согласно аспектам настоящего изобретения.
Фиг.11 представляет собой изображение поля зрения микроскопа, демонстрирующее перицентрическую инверсию короткого плеча хромосомы 16, согласно аспектам настоящего изобретения.
Фиг.12а и 12b представляют собой изображения полей зрения микроскопа, демонстрирующие интерстициальные транслокации, затрагивающие хромосомы 17 и 19 соответственно, согласно аспектам настоящего изобретения.
Фиг.13а и 13b представляют собой микрофотографии колориметрической in situ гибридизации из предшествующего уровня техники.
Фиг.14 иллюстрирует гибридизационную пластинку.
ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНОГО ВАРИАНТА РЕАЛИЗАЦИИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
На Фиг.1 каждая хромосома представлена в виде идеограммы характерного окрашивания сегментов хромосомы - ICP. Центромерные/перицентромерные области показаны черным цветом; теломеры короткого плеча обозначены синим цветом, а теломеры длинного плеча обозначены красным цветом. Для акроцентрических хромосом 14, 15 и 21, идеограммы ICP разделены на две части: левую и правую. На левой идеограмме представлено окрашивание сегментов хромосомы в случае, когда хромосома была введена первой, а на правой идеограмме представлено окрашивание хромосомы в случае, когда хромосома была введена второй. Термины первый и второй относятся к порядку соответствующей хромосомы при комбинировании акроцентрических хромосом на Пластинке 1. Для хромосом 13 и 22 характерен только один вариант характерного окрашивания сегментов ICP, поскольку эти хромосомы всегда вводят как первую и вторую, соответственно. Фиг.2 представляет собой идеограмму стандартного дифференциального G-окрашивания хромосом с разрешением, составляющим 400 бэндов.
Каждую хромосому, например, хромосому человека, можно идентифицировать на стадии интерфазы посредством гибридизации специфических последовательностей ДНК на различных хромосомах. Эти последовательности могут располагаться в цетромерных или теломерных областях хромосомы, или в специфичных областях, лежащих между центромерой и теломерой. Размещение указанных последовательностей на хромосоме предусмотрено таким образом, что они по существу равномерно распределены по хромосоме с учетом общей длины короткого и длинного плеча хромосомы. С использованием принципа по существу равномерного распределения, все плечи хромосом человека можно отнести к одной из трех групп: Группа 1 (малые), Группа 2 (средние) и Группа 3 (большие). В пределах каждой группы индивидуальные сегменты располагаются по существу на одинаковом расстоянии друг от друга. Такое расположение в сочетании с описанной в данной заявке техникой окрашивания обеспечивает создание уникального для каждой хромосомы рисунка окрашивания сегментов хромосомы. Хромосомы разделяют на несколько групп на основании их размера, и хромосомы в пределах каждой группы имеют рисунок с одинаковой цветовой последовательностью для удобства опознавания.
Каждое плечо хромосомы имеет индивидуальный «рисунок» окрашенных сегментов. Любые изменения этого рисунка могут свидетельствовать о генетических изменениях (то есть, хромосомной аномалии). Как правило, центромеры хромосомы окрашивают черным, по мере продвижения от центромеры к концу плеча окрашенные сегменты образуются при смешивании в различных соотношениях двух основных цветов, применяемых для окрашивания концевых (теломерных) сегментов хромосом. К примеру, если теломера короткого плеча окрашена синим цветом, а теломера длинного плеча окрашена красным цветом, то окрашенный сегмент между центромерой и теломерой будет представлять собой смесь красного и синего цветов в различных соотношениях, например иметь темно-красный, темно-синий, светло-синий, фиолетовый и красновато-коричневый цвет. С применением такого дифференциального окрашивания можно легко распознать хромосомные аномалии в интерфазной клетке при помощи простого светового микроскопа, без каких-либо манипуляций с цветами, что имеет место при использовании способов, применяемых в настоящее время в данной области для детекторов на основе FISH, фильтров, дихроичных зеркал, CCD камер, сложных компьютерных программ или интерферометрической спектроскопии.
В альтернативном варианте реализации хромосому можно окрашивать черным или другим различимым цветом в дополнительных равноудаленных участках короткого и длинного плеча хромосомы, расположенных между основными характерно окрашенными сегментами. Такое дополнительное окрашивание позволяет упростить визуальное обнаружение генетических аномалий, увеличивая разрешение, а также обеспечивая ориентиры, которые могут быть идентифицированы пользователем. В данной заявке отличающиеся по цвету сегменты называют основными сегментами (бэндами), а дополнительные сплошные сегменты, такие как, например, черные полосы, называют второстепенными сегментами (бэндами).
Для обеспечения дополнительных различий между коротким плечом и длинным плечом хромосомы второстепенные сегменты короткого и длинного плеч могут быть окрашены с получением различных по толщине полос (сегментов) на соответствующих плечах хромосомы. Например, второстепенные сегменты короткого плеча можно окрасить таким образом, что они будут иметь одинаковую толщину, меньшую чем у второстепенных сегментов на длинном плече хромосомы. Такое окрашивание может упростить выявление аномалий, затрагивающих отдельную хромосому.
В отличие от FISH, в настоящем изобретении обнаружение гибридизированных последовательностей основано на колориметрической in situ гибридизации (Colorimetric In Situ Hybridization, CISH). Согласно аспектам настоящего изобретения добавление специфических ферментов, конъюгированных с ДНК-зондами в определенных соотношениях, может привести к образованию различных цветов. Это делает возможным протекание последовательных или одновременных ферментативных реакций на одном и том же участке хромосомы в интерфазной клетке.
В настоящее время в основанных на FISH подходах, известных в данной области, применяют специфические ДНК-зонды для обнаружения известных генетических аномалий с применением как метафазных хромосом, так и интерфазных ядер. Для проверки диагноза, прежде всего, проводят тестирование с определенным набором зондов, и если результаты теста положительные, тестирование не продолжают. Однако очень часто первоначальный «рабочий диагноз», поставленный практикующим врачом, является неправильным, и лаборанты вынуждены перебирать один за другим множество наборов ДНК-зондов. Это не только занимает много времени, но также является дорогостоящим. В худшем случае может возникнуть недостаток исследуемого материала (то есть, метафазных или интерфазных хромосом) для проведения серии гибридизаций, необходимых для получения полной информации о кариотипе и правильной постановки диагноза.
Классический цитогенетический анализ остается общепринятым, поскольку 1) он не требует предварительной информации о заболевании; 2) он способен выявить не только известные, но и неизвестные генетические аномалии и 3) он дает полную информацию о кариотипе за один эксперимент. Однако этот способ требует культивирования, что значительно увеличивает продолжительность анализа. Кроме того, для таких типов тканей, как солидные опухоли и продукты оплодотворения, процент успешных попыток культивирования очень низок, что приводит к недостатку или полному отсутствию значимой информации. Кроме того, выявление маркерной хромосомы часто очень затруднительно и вообще невозможно при применении стандартного дифференциального G-окрашивания. Настоящее изобретение позволяет преодолеть эти проблемы, не требуя культивирования клеток и обеспечивая достоверный способ обнаружения всех типов хромосомных изменений в интерфазном ядре менее чем за 48 часов.
IСР облегчает определение почти всех хромосомных аномалий благодаря применению одного универсального набора зондов, без какой-либо предварительной информации о наличии определенных генетических аномалий в образце. При таком исследовании в капле или лунке гибридизационной камеры (пластинки) можно проанализировать одну интерфазную хромосому. Например, гибридизационные камеры включают набор из трех пластинок, каждая из которых содержит 10 лунок. Пластинку 1 можно применять для обнаружения Робертсоновских транслокаций (транслокаций между акроцентрическими хромосомами (т.е., хромосомами 13, 14, 15, 21 и 22)). Пластинку 2 можно применять для исследования хромосом 1-10. Пластинку 3 можно применять для исследования хромосом 11, 12, 16-20, X и Y. В одном из аспектов изобретения, две лунки можно преднамеренно оставлять пустыми для дополнительного тестирования. Способ ICP позволяет избегать излишних реакций гибридизации с многочисленными наборами различных зондов, позволяя таким образом получить полную информацию о кариотипе при объединении результатов, полученных лишь для 28 лунок.
В одном аспекте изобретения технику ICP применяют согласно следующим стадиям: 1) создание ДНК-зондов; 2) in situ гибридизация; 3) колориметрическая детекция гибридизации ДНК и 4) микроскопический анализ. Стадия 1 может включать применение ДНК-зондов из 24 хромосом человека, содержащих метку, такую как ДНП, биотин, флуоресцеин и т.п. В частности, зонды могут быть созданы путем микродиссекции хромосом или другим способом, известным в данной области, для получения определенного участка хромосомы, с которым необходимо осуществить гибридизацию. Например, зонд может быть создан с применением способа микродиссекции, с применением плазмид, космид, компьютерных способов анализа геномной информации, синтеза и т.п. На Стадии 2 интерфазные клетки в каждой лунке гибридизуют в течение ночи с одним набором ДНК-зондов, специфичных для хромосомы или аномалии, которую необходимо выявить. Гибридизацию можно осуществлять с применением стандартных способов in situ гибридизации, например, с предварительной обработкой ферментами для обеспечения проникновения ДНК-зондов через ядерную мембрану и денатурации ДНК для разделения двух ее нитей. На Стадии 3 каждую конкретную метку можно выявить при помощи стандартных способов детекции. Детекция может быть последовательной или одновременной. На основании заранее определенного соотношения цветов в различных сегментах по всей длине отдельных хромосом смешивание, например, двух цветов, в результате двух ферментативных реакций, приводит к образованию нового детектируемого цвета. Различные цвета сегментов хромосом могут быть заранее определены, и, как показано на Фиг.1, могут быть представлены в виде идеограммы для удобства сравнительного анализа. Согласно Стадии 4, проявление цвета отдельных сегментов на хромосоме может быть замечено и проанализировано человеком с применением простого стандартного светового микроскопа.
В пренатальной диагностике общая продолжительность анализа является критическим параметром, и с проведением анализа могут быть связаны значительные переживания родителей, ожидающих результатов. Для принятия решения и контроля протекания беременности крайний срок для получения результатов ограничен 24 неделей беременности. При нормальных обстоятельствах стандартный хромосомный тест проводят на сроке приблизительно 16-20 недель беременности, при этом результаты готовы через 10-14 дней. Таким образом, тестирование с применением аминоцентеза на поздних сроках беременности, как правило, является нежелательным. В некоторых клинических случаях необходимо проведение хромосомного анализа в течение последних нескольких недель беременности. При определенных обстоятельствах результаты должны быть получены в кратчайшие сроки. При анализе с применением аминоцентеза на ранних сроках (т.е. 12 недель) получение результатов обычно занимает значительно более 10-14 дней. Обычно это обусловлено небольшим количеством клеток, доступных для анализа. Во всех подобных случаях классическая цитогенетика, как правило, не может определить природу маркерных хромосом. В результате необходимо проведение специальных исследований, требующих дополнительного времени и денег. Стандартный анализ методом FISH можно осуществить за 48 часов, но его возможности ограничены, и он не может предоставить полную информацию о хромосомах, в том числе обнаружить Робертсоновские транслокации, которые могут потенциально увеличивать заболеваемость, обуславливая такие патологические состояния, как однородительская дисомия (ОРД).
Хромосомный анализ клеток периферической крови может быть выполнен для пациентов с аномальными фенотипическими характеристиками, такими как, например, умственная отсталость, или у пар с проблемами бесплодия или многократными выкидышами для постановки генетического диагноза. Как правило, с применением современных подходов общая продолжительность такого анализа составляет 5 дней, однако, стандартный хромосомный анализ не может идентифицировать маркерные хромосомы и несбалансированные хромосомные перестройки. Эти случаи требуют дополнительного тестирования, что увеличивает общую продолжительность анализа и увеличивает его стоимость. При определенных условиях, аномалии затрагивают концы хромосом (т.е. «скрытые перестройки»), что может остаться незамеченным при обычном тестировании. В настоящее время обнаружение такого рода аномалий требует проведения дорогостоящего анализа методом FISH для получения какого-либо диагностического заключения.
Например, среди пациентов с такими заболеваниями, как идиопатическая умственная отсталость (ID), приблизительно у 5-9% наблюдаются ультрамикроскопические субтеломерные перестройки, которые не могут быть выявлены способами классической цитогенетики. Более того, у приблизительно 7% всех пациентов с нормальным кариотипом, имеющих ID, нарушения развития, наблюдаются субтеломерные перестройки. В некоторых случаях необходим стандартный анализ дополнительных клеток, что может значительно увеличить стоимость.
При анализе лейкемии/лимфомы информация о хромосомах является не только крайне необходимой для постановки точного диагноза, но также крайне важна для назначения различных схем лекарственного лечения. Часто врач может ожидать результатов, чтобы принять критическое решение о дальнейшем лечении. В современных способах тестирования общая продолжительность анализа составляет обычно около 5 дней. Одним из основных недостатков современных способов тестирования является то, что стандартный хромосомный анализ не может идентифицировать маркерные хромосомы и производные хромосом, а также упомянутые выше скрытые перестройки, затрагивающие теломеры. В этих случаях может потребоваться дополнительное тестирование, что приводит к увеличению общей продолжительности анализа и увеличению его стоимости. В некоторых случаях с нормальными/аномальными результатами необходим анализ значительно большего числа клеток стандартными способами тестирования, что может также увеличить стоимость. К несчастью, во многих случаях невозможно получить дополнительные клетки с хромосомами для тестирования. Приблизительно в 5-10% случаев вообще не удается получить информацию о хромосомах из-за невозможности культивирования.
Значение информации о хромосомах для диагностики солидных опухолей и ведения пациента быстро возрастает. Для раков солидных тканей, например, мочевого пузыря, простаты, почки, груди, легкого и т.п., стандартный хромосомный анализ может занимать до 30 дней или более, и более чем в 70-80% случаев невозможно получить результаты. Это приводит к увеличению случаев неудавшихся исследований. Как и в случаях лейкемии и лимфомы, описанных выше, маркерные хромосомы и их производные невозможно выявить с применением стандартных способов анализа хромосом.
Информацию о хромосомах можно получить на абортивном материале для постановки генетического диагноза и для предоставления рекомендаций пациенту относительно будущей беременности. С применением современных способов тестирования, общая продолжительность генетического тестирования ткани такого рода может составлять до 30-45 дней. Что еще более важно, в 20-40% случаев результаты не могут быть получены при помощи стандартного хромосомного анализа из-за повреждения образца. Таким образом, для правильной диагностики генетической аномалии и предоставления консультации пациенту, как правило, необходимы дополнительные исследования. Впоследствии, такие дополнительные исследования увеличивают стоимость и необходимое для анализа время.
ICP восполняет недостатки, обусловленные ограничениями современных способов тестирования, удовлетворяя существующие потребности клинической цитогенетики и медицины, и является наиболее эффективным по времени и стоимости исследования.
Следующие примеры иллюстрируют способы осуществления изобретения. Данные примеры следует истолковывать как очевидные варианты реализации изобретения, но не в качестве ограничения применения изобретения.
Пример 1 - Применение гибридизационных камер
Согласно современным подходам, для получения многоцветного кариотипа на основе метафазных хромосом используют 24 различных цвета. Для получения метафазных хромосом материал из различных видов образцов, таких как, например, периферическая кровь, костный мозг, амниотическая жидкость, солидные массы и тому подобное, необходимо культивирование. В целом для получения полной информации о кариотипе необходимо проанализировать 20 клеток. Часто доступное количество клеток ограничено. До настоящего изобретения не существовало способа для эффективного использования исходного материала так, чтобы могла быть получена полная характеристика генетических изменений, присутствующих в предоставленном для исследования образце. В данной области существует несколько способов для исследования конкретных наборов хромосом, однако, эти способы довольно ограничены. Как обсуждалось выше, предполагаемая генетическая аномалия должна быть известна заранее, и подобные анализы позволяют получить только ограниченную информацию. Применяя настоящее изобретение с одним универсальным набором зондов без предварительного знания о конкретных генетических изменениях в образце, можно полностью охарактеризовать почти все хромосомные изменения. Так можно проанализировать одну хромосому за один раз в интерфазных клетках в капле или лунке гибридизационной камеры.
В одном аспекте изобретения, гибридизационная камера может состоять из набора пластинок и, как проиллюстрировано на диаграмме, каждая пластинка может содержать лунки. Например, пластинка 1 может представлять собой пластинку для определения особого типа хромосомных перестроек, называемых Робертсоновскими транслокациями. Робертсоновские транслокации представляют собой транслокации между акроцентрическими хромосомами, которые соединяются центромерами, что приводит к уменьшению центромер в кариотипе на одну. Например, когда Робертсоновская транслокация имеет место между хромосомой 14 и хромосомой 21 в сбалансированной форме, в кариотипе присутствуют одна нормальная 21, одна нормальная 14 и объединенная хромосома 14/21, так что общее количество хромосом в геноме человека изменяется с 46 до 45. В геноме человека присутствуют пять акроцентрических хромосом (хромосомы 13, 14, 15, 21 и 22), и любая из них может участвовать в этом типе перестроек, включая перестройки между обеими копиями одной и той же хромосомы, то есть приводящие к образованию, например, объединенной хромосомы 21/21. Перестройка может приводить к образованию сбалансированного или несбалансированного кариотипа. В несбалансированной форме общее количество хромосом в целом остается 46, однако, в кариотипе, вероятно, присутствуют три копии одной из акроцентрических хромосом.
Применяя современные методы FISH на клиническом образце, полученного от пациента с синдромом Дауна, обычно обнаруживают три копии специфичного для синдрома Дауна участка, то есть 21 q22. Такой результат является достаточным для проявления свободной формы синдрома Дауна, характеризующегося тремя копиями хромосомы 21 в отсутствии Робертсоновских транслокаций. Однако такой же клинический фенотип синдрома Дауна может обуславливаться Робертсоновской транслокацией, затрагивающей хромосому 21 и любую другую акроцентрическую хромосому. Последнюю невозможно обнаружить с применением современных способов, используемых в данной области. Это имеет важное клиническое значение для генетического консультирования и контроля протекания последующей беременности, поскольку показатель риска рецидива сильно отличается между свободной формой и Робертсоновской формой синдрома Дауна. Соответственно, ценная информация потеряна. Это ограничение можно преодолеть при помощи настоящего изобретения.
Робертсоновская транслокация, затрагивающая хромосомы, отличные от 21-й, может также быть клинически значимой в пренатальной диагностике. Патологическое состояние, называемое однородительская дисомия (ОРД), характерно для хромосом 13, 14, и 15. Когда сбалансированные Робертсоновские транслокации происходят между акроцентрическими хромосомами и затрагивают хромосомы 13, 14 или 15, возрастает риск того, что у носителя будет ОРД. ОРД у плода, обнаруженная при пренатальной диагностике, способствует возникновению тяжелых клинических проявлений и значительно увеличивает уровень смертности. До настоящего изобретения единственным способом обнаружения Робертсоновских транслокаций и определения потенциальной ОРД было применение способов стандартной цитогенетики. Выявление строения интерфазных хромосом (ICP) позволяет преодолеть эту проблему путем обнаружения всех Нобертсоновских транслокаций в интерфазных клетках, таким образом, обеспечивая ценную информацию для контроля протекания беременности при пренатальной диагностике.
Пластинка 2 может содержать лунки для хромосом 1-10. Пластинка 3 может содержать лунки для хромосом 11, 12, 16, 17, 18, 19, 20, X/Y с дополнительными лунками, оставленными специально пустыми для дополнительного анализа. При тщательном размещении 25-30 интерфазных клеток в каждой лунке можно изучать даже поврежденные образцы, поскольку отсутствуют излишние реакции гибридизации, и при объединении результатов для отдельных лунок можно получить полную информацию о кариотипе.
Пример 2 - Набор ДНК-зондов
Набор зондов включает уникально сконструированные комбинации ДНК-зондов для каждой из 24 хромосом. Каждая хромосома человека содержит центромеру, а также одно короткое и одно длинное плечо, соединенные в области центромеры. Все хромосомы содержат на концах плеч специфические последовательности ДНК, называемые теломерами, уникальные для каждой хромосомы. Акроцентрические хромосомы содержат только центромеры и длинные плечи. Их короткие плечи являются вариабельными и могут отсутствовать в геноме, и не имеют никакого клинического значения. Поэтому зонды для детекции коротких плеч акроцентрических хромосом не конструируют.
На Фиг.1 представлен рисунок окрашивания сегментов хромосомы, полученный согласно настоящему изобретению. Для сравнения представлено стандартное G-окрашивание (т.е., золотой стандарт). Идеограмма представляет собой схематическое изображение всех сегментов, видимых на хромосоме. На основании данной идеограммы G-окрашивания каждой хромосоме человека была присвоена определенная длина в единицах. Например, хромосома 1, самая большая хромосома человека, имеет 73 единицы длины, при этом короткое плечо имеет 36 единиц длины, а длинное - 37; хромосома 2 имеет 68 единиц длины, при этом короткое плечо - 27 единиц длины, а длинное плечо - 41. Длины всех хромосом в единицах представлены на идеограммах.
В соответствии с современной методологией хромосомы классифицируют, как правило, на основании характера G-окрашивания, и хромосомы разделяют на группы от А до G и половые хромосомы. Хромосомы 1-3 относят к группе А, 3-4 - к группе В, 6-12 и Х - к группе С, 13-15 - к группе D, 16-18 относят к группе F, а 19-20, а также Y хромосому относят к группе G. Сегменты (бэнды) отдельных хромосом, как правило, выявляют химическим окрашиванием, и они имеют строго определенное положение на хромосоме и являются неизменными. Вследствие этого, идентификация хромосомных изменений, затрагивающих область между двумя по природе своей близко расположенными G-бэндами, может быть и часто является затруднительной. Эта проблема может быть решена при помощи настоящего изобретения путем распределения «окрашенных сегментов» по существу на равном расстоянии относительно друг друга с учетом общего размера короткого и длинного плеч. Это может упростить идентификацию хромосомных изменений в интерфазных ядрах.
С применением принципа по существу равномерной гибридизацией на хромосомах, плечи хромосом человека можно отнести к одной из трех групп: хромосомы группы 1 (малые) имеют 4-6 единиц длины; группы 2 (средние) имеют 7-19 единиц длины; группы 3 (большие) имеют 20-41 единиц длины. В пределах каждой группы индивидуальные бэнды расположены по существу на равном расстоянии друг от друга. Например, короткое плечо может иметь 5 сегментов, и длинное плечо может также иметь 5 сегментов. С учетом окрашенного сегмента в области центромеры хромосома 1 имеет всего 11 (5+1+5) окрашенных сегментов. Таким образом, при наблюдении хромосомы 1 человека в клетках на стадии интерфазы с применением способа ICP настоящего изобретения можно увидеть в направлении от конца короткого плеча окрашенный сегмент, затем «неокрашенный» сегмент, окрашенный сегмент, окрашенный сегмент т.п. до центромеры, и такой рисунок сохраняется до конца длинного плеча с окрашенным сегментом. С учетом всех сегментов, окрашенных и неокрашенных, в норме хромосома 1 должна иметь в общей сложности 21 полосу. Разрешающая способность бэндирования такого типа равна или превосходит стандартное разрешение бэндирования при G-окрашивании, проводимом исключительно на метафазных хромосомах, которые можно получить только после культивирования. В качестве другого примера, в соответствии с вышеприведенной моделью, хромосома 18 имеет короткое плечо группы 1 и длинное плечо группы 2; хромосома Y имеет короткое плечо группы 1 и длинное плечо группы 1.
В качестве дополнительного примера, относящегося к хромосоме 1, в промежуточных участках между цветными сегментами могут быть окрашены второстепенные сегменты. Такого рода окрашивание второстепенных сегментов может добавить, например, восемь (8) дополнительных сегментов, в результате чего общее число окрашенных сегментов в хромосоме 1 становится равным девятнадцати (19).
Как показано на Фиг.1, способ классификации проиллюстрирован соответствующим расположением (рисунком) окрашенных сегментов хромосом человека. Как правило, исключительно для наглядности, сегменты в области центромеры могут быть окрашены черным, и по мере продвижения от центромеры к концу короткого плеча, окрашенные сегменты могут быть получены за счет смешивания в различных соотношениях двух основных цветов, применяемых для выделения концевых (теломерных) сегментов. В одном аспекте изобретения, теломерный сегмент короткого плеча может быть окрашен в синий цвет, а теломерный сегмент длинного плеча может быть окрашен в красный цвет. В другом аспекте изобретения для хромосом 1, 5, 9, 16 и 19 вместо центромеры можно использовать перицентромерный сегмент, т.е. сегмент, непосредственно примыкающий к центромере.
Исключительно для наглядности, на примере хромосомы 1, центромера может быть окрашена черным, следующий сегмент в коротком плече может быть окрашен смесью цветов в соотношении 1 часть синего к 9 частям красного, дающей результирующий темно-красный цвет. Следующий сегмент может быть окрашен 7 частями синего к 3 частям красного с получением светло-синего цвета. Следующий сегмент может быть окрашен 5 частями синего к 5 частям красного с получением фиолетового цвета. Следующий сегмент может быть окрашен 3 частями синего к 7 частям красного с получением красновато-коричневого цвета. Наконец, теломерный сегмент может иметь 100% синий цвет, что обозначает конец теломеры. Такую последовательность сегментов между центромерой и теломерой, 7:3, 5:5, 3:7, можно изменить на противоположную при взаимной замене основных цветов для окрашивания длинного плеча. Следовательно, длинное плечо хромосомы 1 в направлении от центромеры, окрашенной в черный цвет, будет иметь 3 красный:7 синий (красновато-коричневый); 5 красный:5 синий (фиолетовый); 7 красный:3 синий (светло-синий) цвет сегментов и, наконец, красный цвет теломерной полосы (100%). Окрашивание целой хромосомы от короткого плеча к длинному плечу представляет собой смену синего, красновато-коричневого, фиолетового, светло-синего, темно-красного, черного, красновато-коричневого, фиолетового, светло-синего и красного цветов. Как ясно из данного описания, каждое плечо имеет четкий рисунок цветных сегментов, и любые изменения этого рисунка указывают на наличие генетического изменения.
Согласно аспектам настоящего изобретения, изменения могут быть легко выявлены в клетках на стадии интерфазы с применением простого светового микроскопа без необходимости обработки цветов при помощи фильтров, дихроичных зеркал, CCD камер, сложных компьютерных программ, интерферометров и т.п., применяемых в настоящее время в данной области для основанной на FISH детекции хромосомных изменений. Поскольку цветные сегменты, полученные согласно настоящему изобретению, располагаются более или менее на равных расстояниях относительно друг друга, независимо от размера плеча, изменение последовательности цветов, потеря или наличие дополнительных цветных сегментов, уменьшение или увеличение единиц длины нецветных сегментов, смещение последовательности цветов указывают на наличие хромосомных аномалий. Этот способ можно применять для обнаружения как численных, так и структурных аномалий по существу любой хромосомы человека. Несколько примеров идентификации хромосомных аномалий, в особенности идентификации маркерных хромосом с применением ICP, описаны ниже. Согласно современной методологии, маркерные хромосомы можно было идентифицировать только на метафазных хромосомах. С применением настоящего изобретения маркерные хромосомы можно идентифицировать в интерфазных ядрах. В результате, значительно экономятся время и деньги.
Пример 3 - Методика CISH
В настоящем изобретении применяют методику колориметрической гибридизации in situ (CISH). При использовании CISH существует множество преимуществ. Наиболее значительные преимущества - это практичность доступного для цитогенетических лабораторий оборудования и избежание излишних расходов, связанных с оборудованием, которое основано на FISH. В то время как подход, основанный на FISH, является достаточным для научных исследований, CISH является уникально подходящей для рутинных клинических цитогенетических лабораторий и лабораторий, занимающихся другими патологиями. Как обсуждалось выше, хромосомные перестройки легко определяются в интерфазных клетках при обычной световой микроскопии без дополнительных манипуляций. При применении способа CISH для представления результатов не используют псевдоцвета, как в методиках многоцветной FISH. Кроме того, как правило, то, что видно в поле микроскопа, представляет собой результат тестирования, то есть истинно окрашенное изображение. Цвет, описанный выше, например, предназначен для обычного глаза человека, не являющегося дальтоником, который может различать близкие цвета. Это дает дополнительные возможности для выполнения текущих цитогенетических анализов даже специалистами невысокой квалификации, таким как лаборанты. Поэтому существует возможность экономии средств и времени, поскольку высококвалифицированные специалисты требуют большую зарплату и их довольно трудно найти.
В настоящее время в методиках CISH применяют только общие ферментативные реакции для получения специфичных цветов в месте реакции. Смешивание специфичных ферментов, конъюгированных с ДНК-зондами, в определенных пропорциях, как здесь описано, с получением различающихся цветов не было известно. В то время, как последовательные ферментативные реакции в различных областях интерфазного ядра были известны из уровня техники, до настоящего изобретения не были возможны последовательные ферментативные реакции в одной и той же области (например, в любой данной области в интерфазном ядре). Главный недостаток CISH по сравнению с FISH - это разрешение (то есть яркость) сигнала в месте реакции. За последние несколько лет в области CISH было сделано несколько усовершенствований, так что при необходимости теперь возможна амплификация сигнала в месте реакции. Кроме того, при включении нескольких лигандов, к которым впоследствии присоединяются ферменты, в течение стадий приготовления ДНК-зондов может быть получено усиление интенсивности сигнала для окрашенных сегментов.
Способ CISH имеет преимущество в том, что он является постоянным. Полученная цветная реакция постоянна и может быть сохранена для применения впоследствии. С другой стороны, сигналы FISH быстро гаснут и вовсе неприменимы для ретроспективного анализа. Поскольку новые генетические изменения обнаруживаются у пациентов (то есть во время лечения) для установления клинической корреляции, наличие предварительно прогибридизированного препарата будет особенно полезным при применении для сравнительных целей.
Пример 4 - Рабочий пример
В настоящее время цитогенетические способы опираются на точки естественного разрыва хромосом при дизайне зондов, которые фланкируют эти участки. Например, для обнаружения специфичной для лейкемии транслокации, такой как транслокация между хромосомой 9 и 22, конструируют зонды для обнаружения точек разрыва на хромосоме 9 в сегменте 9q34 (ген abl) и сегменте 22qII.2 (ген bсr). При использовании двух цветов, красного для 22 и зеленого для 9, нормальная интерфазная реакция имеет вид как два красных пятна и два зеленых пятна, тогда как транслокация приводит к появлению одного зеленого, одного красного и одного желтого, обусловленного слиянием красного и зеленого. Например, при использовании настоящего изобретения та же транслокация будет проявляться как замещение хромосомы 9 в двух сегментах и хромосомы 22 в двух сегментах. Получающийся рисунок окрашивания сегментов в лунке с хромосомой 9 на соответствующей пластинке будет: начиная от теломеры короткого плеча, голубой, красновато-коричневый, черный, фиолетовый, непрерывный участок светло-голубого и красный в отдалении от этого участка, то есть замещение красного, что указывает на разрыв между светло-голубым и красным, на участке, где располагается ген abl на хромосоме 9. Неразделенная цветовая последовательность в той же лунке представляет собой нормальную хромосому 9. Аналогично, рисунок окрашивания сегментов хромосомы 22 будет представляться красным, отделенным от фиолетового, где непрерывный участок темно-синего будет указывать на разрыв между красным и фиолетовым. Ген bcr на хромосоме 22 находится между двумя цветными сегментами: красным и фиолетовым. Снова, неразделенный рисунок окрашивания из красного, фиолетового и темно-синего показывает нормальную хромосому 22. Поскольку центромера хромосомы 22 перекрестно гибридизуется с хромосомой 14, будут присутствовать два дополнительных отдельных красных сигнала. Гибридизационные лунки для хромосомы 14 будут также иметь 2 дополнительные красные или голубые точки. Если это представляет собой единственное генетическое изменение в образце, при прочтении препаратов интерфазных хромосом все лунки, содержащие хромосому 22, будут иметь описанные выше характеристики, лунка, содержащая хромосому 9, будет иметь описанные выше цветовые характеристики, а все остальные хромосомы будут иметь два участка непрерывного окрашивания сегментов. В зависимости от пола пациента, либо XX, либо XY, рисунок окрашивания хромосом прочитывался бы в лунке, содержащей зонды для Х и Y хромосом. Как можно увидеть из этого примера, предварительное знание о статусе заболевания не является необходимым для применения способа ICP.
В применении согласно аспектам настоящего изобретения при простой транслокации, подобной приведенному выше примеру траслокации 9:22, подтверждение транслокации может быть получено средствами визуального анализа. Окрашивание каждого из индивидуальных цветных сегментов, включая промежуточные черные второстепенные сегменты, для всех хромосом человека в геноме может быть доступно в наборе в красный или синий цвет. Как указано ранее, для дополнительных и/или подтверждающих тестов, можно специально оставить пустые области или лунки в гибридизационной камере. Таким образом, при выборе одного из нецентромерного или нетеломерного сегмента по любую сторону от разрыва на хромосоме 9 и хромосоме 22 и введении их в гибридизационную камеру, любая клетка на стадии интерфазы, несущая траснлокацию, имела бы порядок окрашивания красный, красный, синий, синий. Наложение красного и синего цветов указывало бы на транслокацию. Клетки, не содержащие транслокацию в этой цветовой схеме, имели бы порядок окрашивания красный, красный, синий, синий. Поскольку цетромеры не окрашены, перекрестная гибридизация для хромосомы 22 отсутствует.
Например, эту цветовую схему можно применять для проверки практически любой простой транслокации, независимо от того, какой сегмент хромосомы вовлечен. Даже сложная транслокация, включающая более двух хромосом, может быть определена и диагностирована систематическими дополнительными гибридизациями с применением вышеописанного способа.
Пример 5 - Идентификация маркерных хромосом
По определению маркерных хромосом, данному в клинической цитогенетике, выявляющей их при помощи методики стандартного G-окрашивания, происхождение центромер и дополнительного материала на такой хромосоме невозможно идентифицировать. Тем не менее такие маркерные хромосомы играют важную роль в возникновении заболевания и/или его развитии. Применяя 24-цветные методики FISH на метафазных хромосомах, можно в целом идентифицировать природу маркерных хромосом. Однако их идентификация в интерфазном ядре затруднена и с применением современных методик не может быть выполнена.
Пример маркерной хромосомы описывают следующим образом: имеет центромеру хромосомы 3; все короткое плечо хромосомы 3; два сегмента из длинного плеча хромосомы 7; и теломеру длинного плеча из хромосомы 10. Такая хромосома представляет собой очень сложный маркер и в цитогенетике рака, особенно цитогенетике солидных опухолей, этот тип встречается регулярно.
При применении способов по настоящему изобретению в модели ICP гибридизацию завершают, применяя технологию на трех пластинках, при этом результаты будут следующими: пластинка 1 - не содержит изменений (т.е. норма); пластинка 2, 1-2, 4-6, 8-9 не содержат изменений (т.е. норма); пластинка 3 - не содержит изменений (т.е. норма). На пластинке 2 в гибридизационной лунке для хромосомы 3 был бы выявлен аномальный профиль окрашивания сегментов. В дополнение к двум нормальным смежным цветным сегментам, вероятно, будут присутствовать дополнительные сегменты центромеры и короткого плеча. Аналогично, в лунке для хромосомы 7 в дополнение к двум смежным цветным сегментам будут присутствовать два дополнительных соседних цветных сегмента. Наконец, в лунке для хромосомы 10 в зависимости от того, сбалансирован или нет состав теломеры длинного плеча хромосомы 10, можно наблюдать либо два смежных цветных сегмента и отдельный дополнительный сегмент теломеры, либо один непрерывный участок цветных сегментов и замещение сегмента теломеры из второй цветовой последовательности сегментов. На Фиг.6 изображена маркерная хромосома в трех различных интерфазных клетках.
Согласно аспектам настоящего изобретения, в модели IСР маркерные хромосомы можно «реконструировать». Взяв центральный фрагмент из хромосомы 3 и ацентрические фрагменты из 7 и 10 и гибридизуя все вместе в интерфазной клетке, можно подтвердить, сформирован ли «предполагаемый» маркер из всех этих фрагментов. Если обнаружена непрерывная цветовая последовательность сегментов, то, вероятно, результат положительный. Кроме того, соответствующие сегменты на нормальных хромосомах 3, 7 и 10 будут также, вероятно, выделенными, подтверждая тем самым природу маркерной хромосомы. На Фиг.7 изображен «реконструированный маркер» с остальными цветными сегментами, как было описано.
| Таблица А | ||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 13/14 | 13/15 | 13/21 | 13/22 | 14/15 |
| 14/21 | 14/22 | 15/21 | 15/22 | 21/22 |
| 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
В таблице А представлены комбинации акроцентрических хромосом на пластинке 1 согласно аспектам настоящего изобретения. В зависимости от того, была ли введена хромосома первой или второй, центромера будет иметь красный или голубой цвет с остальной цветовой последовательностью согласно представлению на идеограммах. Цветовая последовательность слева от хромосомы на идеограмме представляет первую, а последовательность справа представляет собой вторую в комбинации. Для хромосом 13 и 22 представлен только один цвет, потому что их всегда вводят только или как первую, или как вторую.
Поскольку центромеры хромосом 13 и 21 могут перекрестно гибридизоваться в лунке #3, все центромеры будут фиолетовыми (красный+голубой). Это справедливо вне зависимости от того, имеет ли место транслокация между этими двумя хромосомами. При наличии транслокации, в сбалансированном состоянии будет на одну центромеру меньше (то есть 3 вместо 4) в интерфазных клетках, находящихся в этой лунке, тогда как в несбалансированном состоянии останется 4 центромеры. То же общее правило применимо также для хромосом 14 и 22. Поэтому интерфазные клетки в лунке #7 будут себя вести сходно с хромосомами 13 и 21. Как в сбалансированном, так и в несбалансированном состоянии, вероятно, будет более длинный непрерывный участок цветов из обеих хромосом без центромеры, что указывает на наличие Робертсоновской транслокации. Во всех лунках, кроме #3 и #7, вероятно, будут присутствовать 2 или более дополнительных сегмента центромер, представляющие перекрестную гибридизацию. Этот подход обеспечивает множество возможностей для совместного рассмотрения генетических аномалий.
Пример 7 - Методика клеточных измерений
Согласно аспектам настоящего изобретения, ICP подходит для исследования всех типов образцов, таких как, например, периферическая кровь, вытяжка из костного мозга, амниотическая жидкость, ворсины хориона, плевральная жидкость, биопсия лимфатического узла, масса солидной опухоли, продукты оплодотворения и др. Из этих типов образцов только «жидкие» образцы, такие как кровь, костный мозг, амниотическая жидкость и плевральная жидкость, содержат единичные клетки. Остальные образцы являются тканями, содержащими агрегаты клеток, связанных друг с другом. Для выполнения ICP, необходимы единичные интерфазные клетки. Таким образом, согласно другому аспекту настоящего изобретения, может быть разработан способ для добавления или нанесения 25-30 клеток в каждую лунку на пластинках гибридизационной камеры.
Существующие методики, с применением ферментов, например, коллагеназы и трипсина, которые могут диссоциировать твердые ткани на суспензии единичных клеток. Как обсуждалось выше, жидкие образцы в основном не требуют такого типа обработки для получения единичных клеток. При получении суспензии единичных клеток из образца любого типа, концентрацию клеток доводят до значения, чтобы каждая «капля» из пипетки содержала 25-30 клеток. Например, если мл образца содержит 1000 клеток, и каждый мл содержит 10 капель, то тогда каждая капля содержит 100 клеток. Поскольку каждая лунка получит только одну каплю для IСР, образец соответствующим образом разводят, в этом случае, в 3,5-4 раза так, чтобы каждая капля содержала требуемое количество клеток. Если исходный объем был 10 клеток на каждую каплю, то образец концентрируют в 2,5-3 раза центрифугированием и удалением излишнего объема так, чтобы каждая капля содержала требуемое количество клеток.
Эта методика обеспечивает то, что даже "аномальные" образцы, образцы, имеющие малый объем, можно анализировать полностью настоящим изобретением, тогда как другие методы в уровне техники могут не давать полную информацию о кариотипе.
Пример 8 - Применение гипотонической обработки
В большинстве современных методик FISH применяют мазки, полученные из образца без гипотонической обработки. Открытие значения гипотонической обработки, например, растворов KCl и цитрата Na, дало начало современной цитогенетике. Надлежащее «набухание» метафазных клеток обеспечивает разделение метафазных хромосом при помещении содержащей их капли на пластинку. Аналогично, правильное разделение интерфазных хромосом важно для успешного формирования рисунка чередующихся многоцветных сегментов. Проводя эксперименты с различными гипотоническими растворами в различной концентрации, как в отдельности, так и в комбинации, можно добиться соответствующего «набухания» интерфазных клеток, перед их фиксацией в гибридизационной лунке на пластинке.
Пример 9 - Методика ICP
Получение ДНК-зондов, специфичных для человека:
1) Для каждой хромосомы участок гибридизации ДНК-зонда изображен на стандартных идеограммах G-окрашивания. Как было описано ранее, хромосома 1 может иметь 19 ДНК-зондов: 1 в области перицентромеры, 4 цветных для короткого плеча + 5 черных для короткого плеча + 1 в области теломеры короткого плеча, 3 цветных для длинного плеча + 4 черных для длинного плеча + 1 в области теломеры длинного плеча.
2) Можно осуществить микродиссекцию или выделение каждого сегмента хромосомы с применением других способов, известных в данной области для препарирования стандартных G-окрашенных метафазных хромосом.
3) Каждый «препарированный» сегмент хромосомы можно амплифицировать при помощи методики ПЦР с вырожденными праймерами (DOP-PCR), описанной Telenius (1992).
4) Повторяющиеся последовательности можно удалить из пробы, применяя меченную биотином Cot-1 ДНК, которая затем удаляется магнитными шариками, конъюгированными с авидином, как описано Craig (1997).
5) Освобожденные от повторяющихся последовательностей зонды, полученные в первом цикле ПЦР с вырожденными праймерами (DOP-PCR), можно подвергнуть последующим раундам амплификации с применением методологии, описанной Liehr (2002).
6) С применением стандартной процедуры обработки ультразвуком можно получить зонды длиной приблизительно 200 н.п. - 600 н.п. Кроме того, можно получить меньшие по размеру фрагменты с применением стандартных способов, например при помощи набора Vector labs Nickit.
7) Фрагменты ДНК можно пометить меткой, такой как, например, ДНФ (DNP), биотин, флуоресцеин или т.п., с применением стандартной методики или технологии мечения, например при помощи набора Vector Labs FastTag.
8) Метку выбирают согласно выбранной заранее методологии.
9) При помощи способа FastTag, например, можно присоединять метки к многочисленным сайтам по всей нити ДНК для достижения более высокой чувствительности в сайте гибридизации.
10) Полученные из 24 хромосом человека ДНК-зонды готовы теперь для in situ гибридизации с интерфазными клетками, находящимися в пластинках гибридизационных камер.
11) Можно создать самим центромерные и теломерные ДНК-зонды или применять коммерчески доступные зонды. Можно получить зонды, предназначенные для ICP, без необходимости мечения, и, как описано выше, необходимую метку можно ввести в ДНК.
In situ гибридизация:
1) Суспензию отдельных клеток можно поместить в каждую лунку пластинок трехгибридизационных камер. Суспензию обрабатывают гипотоническим раствором и фиксируют раствором, содержащим метанол и уксусную кислоту в соотношении 3:1.
2) Интерфазные клетки в каждой лунке можно прогибридизовать с одним набором ДНК-зондов, специфичных для данной лунки, с применением стандартных способов in situ гибридизации, таких, как с предварительной ферментативной обработкой, обеспечивающей проникновение ДНК-зондов через ядерную мембрану, при этом осуществляют денатурацию ДНК для разделения цепей ДНК.
3) Гибридизацию можно проводить в течение ночи.
4) Для удаления остаточных непрогибридизовавшихся зондов с пластинок, после гибридизации можно проводить отмывки препаратов.
Колориметрическая детекция гибридизации ДНК (CISH):
1) Биотиновые метки можно обнаружить при помощи фермента глюкозоксидазы, конъюгированного с авидином D, после реакции с субстратом TNBT, специфичным для глюкозоксидазы. В результате этого может образоваться черный осадок в сайте гибридизации ДНК (то есть, в центромерных и перицентромерных сегментах, а также в промежуточных участках коротких и длинных плеч всех хромосом).
2) Флуоресцеиновую метку можно обнаружить при помощи антител к флуоресцеину, конъюгированных с ферментом пероксидазой, после реакции с субстратом, таким как, например, NovaRed, специфичным для пероксидазы. В результате этого образуется красный осадок в сайте гибридизации ДНК, т.е. в теломерах длинных плеч и в других сегментах хромосомы, на всех хромосомах.
3) Метку ДНФ (DNP) можно обнаружить при помощи анител к ДНФ, конъюгированных с ферментом щелочной фосфатазой, при реакции с субстатом, таким как, например, «vector blue», специфичным для щелочной фосфатазы. Это приводит к образованию синего осадка в сайте гибридизации ДНК, т.е., в теломерах коротких плеч и в других сегментах хромосомы, на всех хромосомах.
4) Эти три реакции выполняют последовательно, чередуя с необходимыми стадиями блокирования и отмывки. Коммерческие субстраты следует применять в соответствии с протоколом изготовителя.
5) Последовательность может быть следующей: детекция биотина, флуоресцеина и ДНФ.
6) В качестве альтернативы, можно проводить все три реакции одновременно, поскольку применяются различные ферменты и субстраты специфичны для этих соответствующих ферментов.
7) Как описано выше, центромеры акроцентрических хромосом можно окрасить в цвета, такие как, например, синий или красный, отличные от черного. То же можно проделать с определенными сегментами в хромосоме 10, 12 и Y, а также с сегментами длинных плеч акроцентрических хромосом для обеспечения соответствующей идентификации всех хромосомных перестроек.
8) Пластинки можно дополнительно окрасить для улучшения контраста специальным красителем, например, метиловым зеленым (Vector Labs), и заключали в гистологическую среду, такую как, например, «permount» (Vector Labs). Метиловый зеленый можно применять, поскольку он обеспечивает исключительный контраст с тремя основными цветами: черным, синим и красным.
9) На основании заданного соотношения цветов в различных сегментах вдоль длины отдельных хромосом смешение двух цветов (две ферментативные реакции) приводит к образованию нового детектируемого цвета. Пример цветовой схемы для всех сегментов всех хромосом человека представлен на Фиг.1.
Микроскопический анализ:
1) При проявлении цвета в отдельных сегментах хромосом, интерфазные хромосомы можно наблюдать с применением простого стандартного светового микроскопа без дополнительных вспомогательных средств. В качестве средства визуализации можно применять CCD камеры, однако, они не являются необходимыми.
2) Начиная с пластинки 1 можно зарегистрировать цветной рисунок каждой интерфазной клетки. На основании ожидаемого в норме цветного рисунка, представленного на идеограммах, можно определить нормальный или аномальный статус соответствующих акроцентрическимх хромосом. Как правило, можно проанализировать 20 клеток на стадии интерфазы в каждой лунке.
3) После повторения такого же анализа для оставшихся хромосом на пластинках 2 и 3, т.е. регистрирования нормального и аномального статуса каждой хромосомы с применением 20 интерфазных клеток, можно объединить результаты с получением полной информации о кариотипе индивида, прошедшего тестирование.
4) При предписании дополнительного анализа, например, при подозрении на наличие мозаицизма - нормальных и аномальных клеток, для анализа простых или сложных транслокаций, маркерных хромосом или т.п., для подтверждающих экспериментов можно применять пустые лунки, например, на пластинке #3. При необходимости в зависимости от целей подтверждающего эксперимента можно применять целую дополнительную пластинку.
5) Характер исчерченности любой хромосомы можно документально зафиксировать путем простого фотографирования на цифровую камеру.
6) Простую мозаичность можно легко обнаружить микроскопическим анализом. Даже сложная, явно родственная клональная мозаичность может быть выявлена. Следующий пример иллюстрирует процедуру выявления согласно аспектам настоящего изобретения.
Пример 10 - Анализ кариотипа
В качестве примера анализировали кариотип со следующими результатами: +8/t(9; 22)/t(9; 22), +8/норма.
В случае хронической гранулоцитарной лейкемии имеется 2 клональных отклонения: t(9; 22), как обсуждалось выше, характерное изменение для этой болезни. Трисомия 8 (+8) означает развитие заболевания в сложной форме. Однако трисомия 8 может существовать одна как «неродственный» клон. Таким образом, клинически очень важно установить имеет ли один и тот же клон как t(9; 22), так и +8.
Например, при первой реакции ICP было 10 клеток с t(9; 22); 5 клеток с+8, 15 клеток, нормальных по хромосоме 8, и 10 клеток, нормальных по хромосомам 9 и 22. Как уже упоминалось, выявление транслокации можно осуществить посредством «красного-синего» эксперимента, где наложение красного и синего указывает на транслокацию, а их отдельное расположение указывает на отсутствие транслокации. При объединении этого результата с результатом окрашивания центромеры хромосомы 8 (черный) результаты, вероятно, будут следующими: возможно, было 5 клеток с t(9; 22); 5 клеток с t(9; 22) и +8; 10 клеток нормальных по хромосомам 8, 9 и 22. Эти результаты четко показывают, что +8 является частью развития заболевания, а не несвязанным событием. Если бы +8 представляло собой несвязанное событие, то не наблюдалось бы клеток с объединенным результатом.
На Фиг.14 проиллюстрирована гибридизационная пластинка, согласно аспектам настоящего изобретения, и обозначена ссылкой под номером 10. Пластинка 10 может содержать тело 20, множество лунок 22 и зону идентификационной отметки 24. Тело 20 может быть выполненным из стекла или любого другого прозрачного материала, подходящего для выполнения на нем гибридизации, указанные лунки 22 могут включать зоны с тиснением для разделения лунок 22. Лунки 22 могут также быть выполненными в виде выточенных углублений, отлитых углублений или т.п. для приема и гибридизации образца. Зона идентификационной отметки 24 может быть выполнена в виде прозрачной или матовой зоны для проставления отметки или другого способа идентификации.
Следующие таблицы обеспечивают краткую сводку для пользователя для сравнения результатов, полученных при применении способов, раскрытых здесь, со способами, в которых использован золотой стандарт G-окрашивания.
Таблицы, представленные ниже, иллюстрируют профиль исчерченности интерфазных хромосом (IPC) по сравнению со стандартными способами G-окрашивания. Для облегчения введены следующие сокращения: Q = длинное плечо; Р = короткое плечо; р = проксимальный по отношению к центромере; q = дистальный по отношению к центромере; Теr = Теломера; mа = основной сегмент; и mi = второстепенный сегмент.
| Таблица 1 | ||
| Хромосома 1 | ||
| Исчерченность ICP | G-исчерченность | |
| Теломера (pter) | Pma5 | P36.3 |
| Pmi5 | P36.1d | |
| Pma4 | P34.3d/p35p | |
| Pmi4 | P33 | |
| Pma3 | P31.3d | |
| Pmi3 | P31.1d | |
| Pma2 | P31.1p | |
| Pmi2 | P22.1 | |
| Pmal | P13.3d/p21p | |
| Pmil | P13.1 | |
| Центромера | Q0 | Q12 |
| Qmil | Q21.3 | |
| Qmal | Q23 | |
| Qmi2 | Q25 | |
| Qma2 | Q31d | |
| Qmi3 | Q32.1 | |
| Qma3 | Q32.2/q32.3 | |
| Qmi4 | Q42.1 | |
| Теломера (qter) | Qma4 | Q44 |
| Таблица 2 | ||
| Хромосома 2 | ||
| Исчерченность ICP | G-исчерченность | |
| Теломера (pter) | Pma4 | P25/p25.3 |
| Pmi4 | P23d/p24p | |
| Pma3 | P22d/p23p | |
| Pmi3 | P21d | |
| Pma2 | P16 | |
| Pmi2 | P15 | |
| Pmal | P13 | |
| Центромера | P/q 0 | P/q 0 |
| Qmil | Q13 | |
| Qmal | Q21.1 | |
| Qmi2 | Q22p | |
| Qma2 | Q23 | |
| Qmi3 | Q24.3 | |
| Qma3 | Q31d/q32.1p | |
| Qmi4 | Q32.3d/q33p | |
| Qma4 | Q34d/q35p | |
| Qmi5 | Q36 | |
| Теломера (qter) | Qma5 | Q37.3 |
| Таблица 3 | ||
| Хромосома 3 | ||
| Исчерченность IСР | G-исчерченность | |
| Теломера (pter) | Pma4 | p26 |
| Pmi4 | P24d/p25p | |
| Pma3 | P24p | |
| Pmi3 | P21d/p22p | |
| Рma2 | P21.3p | |
| Pmi2 | P14.3 | |
| Pmal | P13/p14.1p | |
| Pmil | p12 | |
| Центромера | p/q o | |
| Qmil | Q13.1 | |
| Qmal | q13.3 | |
| Qmi2 | q21d | |
| Qma2 | Q23/q24p | |
| Qmi3 | Q25.1 | |
| Qma3 | Q26.2 | |
| Qmi4 | q2 7 | |
| Теломера (qter) | Qma4 | q29 |
| Таблица 4 | ||
| Хромосома 4 | ||
| Исчерченность ICP | G-исчерченность | |
| Теломера (pter) | Рma2 | p16d |
| Pmi2 | P15.3 | |
| Pmal | P15.1 | |
| Pmil | P14p/p13d | |
| Центромера | p/q 0 | |
| Qmil | Q13.2 | |
| Qmal | Q21.2 | |
| Qmi2 | q22d | |
| Qma2 | Q25/q24d | |
| Qmi3 | Q26/q26d | |
| Qma3 | q28p | |
| Qmi4 | Q31.1 | |
| Qma4 | Q31.3/q32p | |
| Qmi5 | q33 | |
| Теломера (qter) | Qma5 | q35 |
| Таблица 5 | ||
| Хромосома 5 | ||
| Исчерченность IСР | G-исчерченность | |
| Теломера (pter) | Pma2 | P15.3 |
| Pmi2 | P15.2/p15.1 | |
| Pmal | p14 | |
| Pmil | P13.2 | |
| Парацентромера | Q0 | Q11.2 |
| Qmil | Q12d/q13.1 | |
| Qmal | Q13.3/q14p | |
| Qmi2 | q15 | |
| Qma2 | q21d | |
| Qmi3 | Q23.1 | |
| Qma3 | Q23.3/q31.1 | |
| Qmi4 | Q31.3 | |
| Qma4 | Q32/q33.1 | |
| Qmi5 | q34 | |
| Теломера (qter) | Qma5 | Q35.2/q35.3 |
| Таблица 6 | ||
| Хромосома 6 | ||
| Исчерченность ICP | G-исчерченность | |
| Теломера (pter) | Pma3 | p25 |
| Pmi3 | p23d | |
| Pma2 | P22/p22.2 | |
| Pmi2 | P21.3p | |
| Pmal | P21.2 | |
| Центромера | p/q 0 | |
| Qmil | q13 | |
| Qmal | Q16.I/q15 | |
| Qmi2 | q21p | |
| Qma2 | Q22.1 | |
| Qmi3 | Q22.3d | |
| Qma3 | q24 | |
| Qmi4 | Q25.3 | |
| Теломера (qter) | Qma4 | q27 |
| Таблица 7 | ||
| Хромосома 7 | ||
| Исчерченность ICP | G-исчерченность | |
| Теломера (pter) | Pma3 | P22 |
| Pmi3 | P21d | |
| Pma2 | P21p/p15.3 | |
| Pmi2 | P15.1 | |
| Pmal | P14p/p13d | |
| Pmil | P12 | |
| Центромера | p/q 0 | |
| Qmil | Q11.23p | |
| Qmal | Q21.1 | |
| Qmi2 | Q21.3/q22p | |
| Qma2 | Q31.1 | |
| Qmi3 | Q31.3 | |
| Qma3 | Q32 | |
| Qmi4 | Q35 | |
| Теломера (qter) | Qma4 | q36 |
| Таблица 8 | ||
| Хромосома 8 | ||
| Исчерченность IСР | G-исчерченность | |
| Теломера (pter) | Pma2 | P23.2/p23.3 |
| Pmi2 | P22d | |
| Pmal | P21.2 | |
| Pmil | P12 | |
| Центромера | p/q 0 | |
| Qmil | Q12 | |
| Qmal | Q13d/q21.1p | |
| Qmi2 | Q21.2 | |
| Qma2 | Q21.3d/q22.1 | |
| Qmi3 | Q22.3 | |
| Qma3 | Q23d | |
| Qmi4 | Q24.1 | |
| Теломера (qter) | Qma4 | Q24.3 |
| Таблица 9 | ||
| Хромосома 9 | ||
| Исчерченность IСР | G-исчерченность | |
| Теломера (pter) | Pma2 | P24 |
| Pmi2 | P23p | |
| Pmal | P21 | |
| Pmil | P13p | |
| Парацентромера | QO | Q12 |
| Qmil | Q21.2 | |
| Qmal | Q22.1 | |
| Qmi2 | Q22.3 | |
| Qma2 | Q31d/q32 | |
| Qmi3 | Q34. | |
| Теломера (qter) | Qma3 | Q34.2/q34.3 |
| Таблица 10 | ||
| Хромосома 10 | ||
| Исчерченность ICP | G-исчерченность | |
| Теломера | Pma2 | Р15 |
| Pmi2 | Р14р | |
| Pmal | P12.3d/p13p | |
| Pmil | P11.2d | |
| Центромера | p/q 0 | |
| Qmil | Q21.1p | |
| Qmal | Q21.3d | |
| Qmi2 | Q22.1 | |
| Qma2 | Q22.3d/q23.1p | |
| Qmi3 | Q23.3 | |
| Qma3 | Q24.3d/q25.1p | |
| Qmi4 | Q25.3 | |
| Теломера (qter) | Qma4 | Q26.2/q26.3 |
| Таблица 11 | ||
| Хромосома 11 | ||
| Исчерченность ICP | G-исчерченность | |
| Теломера (pter) | Рma3 | P15.5 |
| Pmi3 | P15.2/p15.3 | |
| Рma2 | P14d | |
| Pmi2 | P14p | |
| Pmal | P13/p12d | |
| Pmil | P11.2 | |
| Центромера | p/q 0 | |
| Qmil | Q12d | |
| Qmal | Q13.3/q13.4 | |
| Qmi2 | Q14.1 | |
| Qma2 | Q21 | |
| Qmi3 | Q22.3 | |
| Qma3 | Q23.2/q23.3p | |
| Qmi4 | Q23.3d | |
| Теломера (qter) | Qma4 | q25 |
| Таблица 12 | ||
| Хромосома 12 | ||
| Исчерченность ICP | G-исчерченность | |
| Теломера (pter) | Рma2 | P13.3 |
| Pmi2 | P13.1 | |
| Pmal | P12.2/p12.3p | |
| Pmil | P11.2 | |
| Центромера | p/q 0 | |
| Qmil | Q13.1p | |
| Qmal | Q13.3/q14p | |
| Qmi2 | Q15 | |
| Qma2 | Q21.3p | |
| Qmi3 | Q22 | |
| Qma3 | Q23d | |
| Qmi4 | Q24.1d | |
| Теломера (qter) | Qma4 | Q24.32/q24.33 |
| Таблица 13 | ||
| Хромосома 13 | ||
| Исчерченность IСР | G-исчерченность | |
| Центромера | Q0 | |
| Qmil | Q12.3 | |
| Qmal | Q14.2 | |
| Qmi2 | Q21.1 | |
| Qma2 | Q21.3 | |
| Qmi3 | Q22 | |
| Qma3 | Q31 | |
| Qmi4 | Q32d | |
| Теломера (qter) | Qma4 | q34 |
| Таблица 14 | ||
| Хромосома 14 | ||
| Исчерченность ICP | G-исчерченность | |
| Центромера | Q0 | |
| Qmil | Q12p | |
| Qmal | Q13d | |
| Qmi2 | Q2I/q21d | |
| Qma2 | Q22d/q23 | |
| Qmi3 | Q24.1 | |
| Qma3 | Q24.3 | |
| Qmi4 | Q31d | |
| Теломера (qter) | Qma4 | Q32.2/q32.3 |
| Таблица 15 | ||
| Хромосома 15 | ||
| Исчерченность ICP | G-исчерченность | |
| Центромера | Q0 | |
| Qmil | Q13 | |
| Qmal | Q14d/q15p | |
| Qmi2 | Q21.1 | |
| Qma2 | Q21.3d/q22.1 | |
| Qmi3 | Q22.3 | |
| Qma3 | Q24 | |
| Qmi4 | q25d | |
| Теломера (qter) | Qma4 | Q25.2/q26.3 |
| Таблица 16 | ||
| Хромосома 16 | ||
| Исчерченность ICP | G-исчерченность | |
| Теломера (pter) | Pma2 | P13.3 |
| Pmi2 | P13.1 | |
| Pmal | P12p | |
| Pmil | P11.2 | |
| Парацентромера | Q0 | Q11.2 |
| Qmil | Q13 | |
| Qmal | Q21d/q22p | |
| Qmi2 | Q22d/q23p | |
| Теломера (qter) | Qma2 | q24 |
| Таблица 17 | ||
| Хромосома 17 | ||
| Исчерченность ICP | G-исчерченность | |
| Теломера (pter) | Pma2 | P13d |
| Pmi2 | P13p/p12d | |
| Pmal | P12p | |
| Pmil | P11.2 | |
| Центромера | p/q 0 | |
| Qmil | Q11.2d/q12p | |
| Qmal | Q21.2/q21.3p | |
| Qmi2 | Q21.3d/q22p | |
| Qma2 | Q22d/q23p | |
| Qmi3 | Q24 | |
| Теломера (qter) | Qma3 | q25 |
| Таблица 18 | ||
| Хромосома 18 | ||
| Исчерченность ICP | G-исчерченность | |
| Теломера (pter) | Pmal | Р11.3/р11.32 |
| Pmil | P11.2 | |
| Центромера | p/q 0 | |
| Qmil | Q11.2d | |
| Qmal | Q12.3d | |
| Qmi2 | Q21.1 | |
| Qma2 | Q21.3 | |
| Qmi3 | Q22 | |
| Теломера (qter) | Qma3 | q23 |
| Таблица 19 | ||
| Хромосома 19 | ||
| Исчерченность ICP | G-исчерченность | |
| Теломера (pter) | Pma2 | P13.3d |
| Pmi2 | P13.3p | |
| Pmal | P13.2 | |
| Pmil | P13.1p | |
| Парацентромера | Qo | Q12 |
| Qmil | Q13.1 | |
| Qmal | Q13.1d/q13.2p | |
| Qmi2 | Q13.3 | |
| Теломера (qter) | Qma2 | Q13.4 |
| Таблица 20 | ||
| Хромосома 20 | ||
| Исчерченность ICP | G-исчерченность | |
| Теломера (pter) | Pma2 | P13d |
| Pmi2 | P13p/p12d | |
| Pmal | P12p/p11.2d | |
| Центромера | p/q 0 | |
| Qmil | Q11.2 | |
| Qmal | Q12 | |
| Qmi2 | Q13.1 | |
| Теломера (qter) | Qma2 | Q13.3 |
| Таблица 21 | ||
| Хромосома 21 | ||
| ICP Bands | G-исчерченность | |
| Центромера | Q0 | |
| Qmil | Q21p | |
| Qmal | Q21d | |
| Qmi2 | Q22.1 | |
| Теломера | Qma2 | Q22.3 |
| Таблица 22 | ||
| Хромосома 22 | ||
| Исчерченность ICР | G-исчерченность | |
| Центромера | Q0 | |
| Qmil | Q11.2 | |
| Qmal | Q12.3/q13.1p | |
| Qmi2 | Q13.1d | |
| Теломера (qter) | Qma2 | Q13.3 |
| Таблица X | ||
| Хромосома Х | ||
| Исчерченность ICP | G-Исчерченность | |
| Теломера (pter) | Pma3 | P22.3 |
| Pmi3 | P22.1d | |
| Pma2 | P22.1p/p21.3 | |
| Pmi2 | P21.1 | |
| Pmal | P11.4/p11.3 | |
| Pmil | P11.23 | |
| Центромера | p/q 0 | |
| Qmil | P13p | |
| Qmal | P13d/p21.1p | |
| Qmi2 | Q21.3d | |
| Qma2 | Q22 | |
| Qmi3 | Q25d/q26p | |
| Qmi4 | Q27p | |
| Теломера (qter) | Qma4 | q28 |
| Таблица Y | ||
| Хромосома Y | ||
| Исчерченность ICP | G-исчерченность | |
| Теломера (pter) | Pmal | P11.3/p11.2d |
| Pmil | P11.2p | |
| Центромера | p/q 0 | |
| Qmil | Q11.221 | |
| Qmal | Q11.222/q11.223 | |
| Qmi2 | Q11.23 | |
| Q Гетерохроматин | Qma2 | q12 |
Ввиду того, что предшествующее описание представлено авторами изобретения в наилучшей форме для применения изобретения на практике и помогает специалистам в соответствующей области в осуществлении данного изобретения, ясно, что способы, включающие модификации и варианты, очевидны для специалистов в данной области. По существу, оно не ограничено данным описанием, но включает вышеупомянутые очевидные варианты, и ограничено только объемом следующей формулы.
Claims (32)
1. Способ определения строения интерфазных хромосом, включающий следующие стадии:
получение образца, содержащего клетки, который имеет по меньшей мере одну интерфазную хромосому для определения строения;
получение совокупности различных ДНК-зондов, специфичных к хромосомам и участкам хромосом человека, при этом указанные ДНК-зонды содержат различные метки и способны маркировать по меньшей мере одну нормальную контрольную хромосому из указанной по меньшей мере одной интерфазной хромосомы для определения строения по существу равномерно по всей длине указанной нормальной контрольной хромосомы;
гибридизацию указанного образца с указанными ДНК-зондами;
детектирование гибридизации указанных ДНК-зондов с указанной по меньшей мере одной интерфазной хромосомой для определения строения с применением двух различных ферментов, двух различных антител и двух различных субстратов, причем указанные два различных фермента и два различных антитела образуют два различных конъюгата фермент-антитело, при этом каждое из указанных антител связывается с одной из указанных меток, которая присоединена к одному из указанных специфичных ДНК-зондов и каждый из указанных различных ферментов реагирует со своим специфичным субстратом из указанных различных субстратов, таким образом, что получают смешанные характерные основные цветные сегменты на по меньшей мере одной интерфазной хромосоме для определения строения;
сравнение указанных смешанных характерных основных цветных сегментов на указанной по меньшей мере одной интерфазной хромосоме для определения строения со смешанными характерными основными цветными сегментами на указанной нормальной контрольной хромосоме посредством визуального анализа и
определение интерфазного строения хромосомы указанной по меньшей мере одной интерфазной хромосомы для определения строения, причем указанные смешанные характерные основные цветные сегменты на указанной нормальной контрольной хромосоме получают посредством гибридизации указанной нормальной контрольной хромосомы с указанными ДНК-зондами и детектирования гибридизации указанных ДНК-зондов с указанной нормальной контрольной хромосомой с применением указанных конъюгатов фермент-антитело и указанных субстратов, и
каждый из соседних сегментов из указанных смешанных характерных основных цветных сегментов на указанной нормальной контрольной хромосоме расположен на по существу одинаковом расстоянии от других, при этом указанный способ включает создание второстепенных характерных сегментов среди указанных смешанных характерных основных цветных сегментов указанной по меньшей мере одной интерфазной хромосомы для определения строения с применением дополнительного дифференциального красителя, где указанный дифференциальный краситель образуется в результате специфичной реакции третьего субстрата и фермента, причем указанный фермент является частью конъюгата фермент-антитело, при этом указанное антитело связано со специфичной меткой, которая связана со специфичным ДНК-зондом, находящимся на интерфазной хромосоме, причем указанные смешанные характерные основные цветные сегменты и указанные характерные второстепенные сегменты на указанной по меньшей мере одной интерфазной хромосоме для определения строения присутствуют в соотношении 1:1.
получение образца, содержащего клетки, который имеет по меньшей мере одну интерфазную хромосому для определения строения;
получение совокупности различных ДНК-зондов, специфичных к хромосомам и участкам хромосом человека, при этом указанные ДНК-зонды содержат различные метки и способны маркировать по меньшей мере одну нормальную контрольную хромосому из указанной по меньшей мере одной интерфазной хромосомы для определения строения по существу равномерно по всей длине указанной нормальной контрольной хромосомы;
гибридизацию указанного образца с указанными ДНК-зондами;
детектирование гибридизации указанных ДНК-зондов с указанной по меньшей мере одной интерфазной хромосомой для определения строения с применением двух различных ферментов, двух различных антител и двух различных субстратов, причем указанные два различных фермента и два различных антитела образуют два различных конъюгата фермент-антитело, при этом каждое из указанных антител связывается с одной из указанных меток, которая присоединена к одному из указанных специфичных ДНК-зондов и каждый из указанных различных ферментов реагирует со своим специфичным субстратом из указанных различных субстратов, таким образом, что получают смешанные характерные основные цветные сегменты на по меньшей мере одной интерфазной хромосоме для определения строения;
сравнение указанных смешанных характерных основных цветных сегментов на указанной по меньшей мере одной интерфазной хромосоме для определения строения со смешанными характерными основными цветными сегментами на указанной нормальной контрольной хромосоме посредством визуального анализа и
определение интерфазного строения хромосомы указанной по меньшей мере одной интерфазной хромосомы для определения строения, причем указанные смешанные характерные основные цветные сегменты на указанной нормальной контрольной хромосоме получают посредством гибридизации указанной нормальной контрольной хромосомы с указанными ДНК-зондами и детектирования гибридизации указанных ДНК-зондов с указанной нормальной контрольной хромосомой с применением указанных конъюгатов фермент-антитело и указанных субстратов, и
каждый из соседних сегментов из указанных смешанных характерных основных цветных сегментов на указанной нормальной контрольной хромосоме расположен на по существу одинаковом расстоянии от других, при этом указанный способ включает создание второстепенных характерных сегментов среди указанных смешанных характерных основных цветных сегментов указанной по меньшей мере одной интерфазной хромосомы для определения строения с применением дополнительного дифференциального красителя, где указанный дифференциальный краситель образуется в результате специфичной реакции третьего субстрата и фермента, причем указанный фермент является частью конъюгата фермент-антитело, при этом указанное антитело связано со специфичной меткой, которая связана со специфичным ДНК-зондом, находящимся на интерфазной хромосоме, причем указанные смешанные характерные основные цветные сегменты и указанные характерные второстепенные сегменты на указанной по меньшей мере одной интерфазной хромосоме для определения строения присутствуют в соотношении 1:1.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный дополнительный дифференциальный краситель включает черный пигмент.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанная по меньшей мере одна интерфазная хромосома для определения строения содержит длинное плечо и короткое плечо, при этом толщина указанных характерных второстепенных сегментов на указанном длинном плече хромосомы приблизительно в два раза больше, чем толщина указанных характерных второстепенных сегментов на коротком плече хромосомы.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанная гибридизация представляет собой гибридизацию in situ, причем образец находится на пластинке.
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что указанная пластинка содержит некоторое количество лунок для нанесения, гибридизации и анализа указанной по меньшей мере одной интерфазной хромосомы для определения строения.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный визуальный анализ включает применение светового микроскопа.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный визуальный анализ включает применение CCD-камеры.
8. Способ по п.1, отличающийся тем, что источник указанного образца выбран из группы, включающей амниотическую жидкость, хориальные ворсины, периферическую кровь, плевральную жидкость, костный мозг и опухолевую ткань.
9. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный визуальный анализ применяют для обнаружения предполагаемой хромосомной аномалии на указанной по меньшей мере одной интерфазной хромосоме для определения строения посредством сравнения указанных смешанных характерных основных цветных сегментов и характерных второстепенных сегментов на указанной по меньшей мере одной интерфазной хромосоме для определения строения со смешанными характерными основными цветными сегментами и характерными второстепенными сегментами на указанной нормальной контрольной хромосоме, причем указанные характерные второстепенные сегменты на указанной нормальной контрольной хромосоме получают посредством окрашивания указанной нормальной контрольной хромосомы с применением дифференциального красителя.
10. Способ по п.9, отличающийся тем, что указанная хромосомная аномалия представляет собой структурную хромосомную аномалию или количественную хромосомную аномалию.
11. Способ по п.9, отличающийся тем, что указанная хромосомная аномалия выбрана из группы, включающей хромосомную транслокацию, хромосомную делецию, хромосомную инверсию, трисомию или амплификацию хромосомы.
12. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанное строение интерфазной хромосомы применяют для получения полного кариотипа в случае, когда образец получен от человека.
13. Способ колориметрической гибридизации in situ, включающий следующие стадии:
получение образца, содержащего клетки, который имеет по меньшей мере одну хромосому для определения строения;
получение совокупности различных ДНК-зондов, специфичных к хромосомам и участкам хромосом человека, при этом указанные ДНК-зонды содержат различные метки и способны маркировать по меньшей мере одну хромосому для определения строения по существу равномерно по всей длине указанной по меньшей мере одной хромосомы для определения строения;
гибридизацию in situ указанного образца с указанными ДНК-зондами; и
детектирование гибридизации указанных ДНК-зондов с указанной по меньшей мере одной интерфазной хромосомой для определения строения с применением двух различных ферментов, двух различных антител и двух различных субстратов, причем указанные два различных фермента и два различных антитела образуют два различных конъюгата фермент-антитело, при этом каждое из указанных антител связывается с одной из указанных меток, которая присоединена к одному из указанных специфичных ДНК-зондов и каждый из указанных различных ферментов реагирует со своим специфичным субстратом из указанных различных субстратов, таким образом, что получают смешанные характерные основные цветные сегменты на по меньшей мере одной указанной хромосоме для определения строения и каждый из соседних сегментов из указанных смешанных характерных основных цветных сегментов на указанной хромосоме для определения строения расположен на по существу одинаковом расстоянии от других, при этом указанный способ включает создание второстепенных характерных сегментов среди указанных смешанных характерных основных сегментов указанной по меньшей мере одной хромосомы для определения строения с применением дополнительного дифференциального красителя, где указанный дифференциальный краситель образуется в результате специфичной реакции третьего субстрата и фермента, причем указанный фермент является частью конъюгата фермент-антитело, при этом указанное антитело связано со специфичной меткой, которая связана со специфичным ДНК-зондом, находящимся на хромосоме, причем указанные основные сегменты и указанные второстепенные сегменты на указанной по меньшей мере одной хромосоме для определения строения присутствуют в соотношении 1:1.
получение образца, содержащего клетки, который имеет по меньшей мере одну хромосому для определения строения;
получение совокупности различных ДНК-зондов, специфичных к хромосомам и участкам хромосом человека, при этом указанные ДНК-зонды содержат различные метки и способны маркировать по меньшей мере одну хромосому для определения строения по существу равномерно по всей длине указанной по меньшей мере одной хромосомы для определения строения;
гибридизацию in situ указанного образца с указанными ДНК-зондами; и
детектирование гибридизации указанных ДНК-зондов с указанной по меньшей мере одной интерфазной хромосомой для определения строения с применением двух различных ферментов, двух различных антител и двух различных субстратов, причем указанные два различных фермента и два различных антитела образуют два различных конъюгата фермент-антитело, при этом каждое из указанных антител связывается с одной из указанных меток, которая присоединена к одному из указанных специфичных ДНК-зондов и каждый из указанных различных ферментов реагирует со своим специфичным субстратом из указанных различных субстратов, таким образом, что получают смешанные характерные основные цветные сегменты на по меньшей мере одной указанной хромосоме для определения строения и каждый из соседних сегментов из указанных смешанных характерных основных цветных сегментов на указанной хромосоме для определения строения расположен на по существу одинаковом расстоянии от других, при этом указанный способ включает создание второстепенных характерных сегментов среди указанных смешанных характерных основных сегментов указанной по меньшей мере одной хромосомы для определения строения с применением дополнительного дифференциального красителя, где указанный дифференциальный краситель образуется в результате специфичной реакции третьего субстрата и фермента, причем указанный фермент является частью конъюгата фермент-антитело, при этом указанное антитело связано со специфичной меткой, которая связана со специфичным ДНК-зондом, находящимся на хромосоме, причем указанные основные сегменты и указанные второстепенные сегменты на указанной по меньшей мере одной хромосоме для определения строения присутствуют в соотношении 1:1.
14. Способ по п.13, отличающийся тем, что указанный дополнительный дифференциальный краситель включает черный пигмент.
15. Способ по п.13, отличающийся тем, что указанная по меньшей мере одна хромосома для определения строения содержит длинное плечо и короткое плечо, при этом толщина указанных характерных второстепенных сегментов на указанном длинном плече хромосомы приблизительно в два раза больше, чем толщина указанных характерных второстепенных сегментов на коротком плече хромосомы.
16. Способ по п.13, отличающийся тем, что гибридизацию in situ проводят пластинке.
17. Способ по п.16, отличающийся тем, что указанная пластинка содержит некоторое количество лунок для нанесения, гибридизации и анализа указанной по меньшей мере одной интерфазной хромосомы для определения строения.
18. Способ визуального обнаружения Робертсоновских транслокаций между акроцентрическими хромосомами в образце, полученном от человека, включающий следующие стадии:
получение от человека образца, содержащего клетки с акроцентрическими хромосомами для определения строения;
получение совокупности различных ДНК-зондов, специфичных к хромосомам и участкам хромосом человека, при этом указанные ДНК-зонды содержат различные метки и способны маркировать нормальные акроцентрические хромосомы по существу равномерно по длине каждой из указанных нормальных акроцентрических хромосом;
гибридизацию указанного образца с указанными ДНК-зондами;
детектирование гибридизации указанных ДНК-зондов с акроцентрическими хромосомами для определения строения с применением двух различных ферментов, двух различных антител и двух различных субстратов, причем указанные два различных фермента и два различных антитела образуют два различных конъюгата фермент-антитело, при этом каждое из указанных антител связывается с одной из указанных меток, которая присоединена к одному из указанных специфичных ДНК-зондов и каждый из указанных ферментов реагирует со своим специфичным субстратом из указанных различных субстратов, таким образом, что получают смешанные характерные основные цветные сегменты на каждой из указанных акроцентрических хромосом; и
сравнение указанных смешанных характерных основных цветных сегментов на каждой из указанных акроцентрических хромосом для определения строения со смешанными характерными основными цветными сегментами на нормальных контрольных акроцентрических хромосомах посредством визуального анализа и определение присутствия Робертсоновской транслокации между указанными акроцентрическими хромосомами для определения строения, причем указанные смешанные характерные основные цветные сегменты на указанной нормальной контрольной акроцентрической хромосоме получают посредством гибридизации указанной нормальной контрольной акроцентрической хромосомы с указанными ДНК-зондами и детектирования гибридизации указанных ДНК-зондов с указанной нормальной контрольной акроцентрической хромосомой с применением указанных конъюгатов фермент-антитело и указанных субстратов, и
каждый из соседних сегментов из указанных смешанных характерных основных цветных сегментов на указанной нормальной контрольной акроцентрической хромосоме расположен на по существу одинаковом расстоянии от других, при этом указанный способ включает создание второстепенных характерных сегментов среди указанных смешанных характерных основных цветных сегментов на каждой из указанных акроцентрических хромосом для определения строения с применением дополнительного дифференциального красителя, где указанный дифференциальный краситель образуется в результате специфичной реакции третьего субстрата и фермента, причем указанный фермент является частью конъюгата фермент-антитело, при этом указанное антитело связано со специфичной меткой, которая связана со специфичным ДНК-зондом, находящимся на каждой из указанных акроцентрических хромосом, причем указанные смешанные характерные основные цветные сегменты и указанные характерные второстепенные сегменты на каждой из указанных акроцентрических хромосом для определения строения присутствуют в соотношении 1:1.
получение от человека образца, содержащего клетки с акроцентрическими хромосомами для определения строения;
получение совокупности различных ДНК-зондов, специфичных к хромосомам и участкам хромосом человека, при этом указанные ДНК-зонды содержат различные метки и способны маркировать нормальные акроцентрические хромосомы по существу равномерно по длине каждой из указанных нормальных акроцентрических хромосом;
гибридизацию указанного образца с указанными ДНК-зондами;
детектирование гибридизации указанных ДНК-зондов с акроцентрическими хромосомами для определения строения с применением двух различных ферментов, двух различных антител и двух различных субстратов, причем указанные два различных фермента и два различных антитела образуют два различных конъюгата фермент-антитело, при этом каждое из указанных антител связывается с одной из указанных меток, которая присоединена к одному из указанных специфичных ДНК-зондов и каждый из указанных ферментов реагирует со своим специфичным субстратом из указанных различных субстратов, таким образом, что получают смешанные характерные основные цветные сегменты на каждой из указанных акроцентрических хромосом; и
сравнение указанных смешанных характерных основных цветных сегментов на каждой из указанных акроцентрических хромосом для определения строения со смешанными характерными основными цветными сегментами на нормальных контрольных акроцентрических хромосомах посредством визуального анализа и определение присутствия Робертсоновской транслокации между указанными акроцентрическими хромосомами для определения строения, причем указанные смешанные характерные основные цветные сегменты на указанной нормальной контрольной акроцентрической хромосоме получают посредством гибридизации указанной нормальной контрольной акроцентрической хромосомы с указанными ДНК-зондами и детектирования гибридизации указанных ДНК-зондов с указанной нормальной контрольной акроцентрической хромосомой с применением указанных конъюгатов фермент-антитело и указанных субстратов, и
каждый из соседних сегментов из указанных смешанных характерных основных цветных сегментов на указанной нормальной контрольной акроцентрической хромосоме расположен на по существу одинаковом расстоянии от других, при этом указанный способ включает создание второстепенных характерных сегментов среди указанных смешанных характерных основных цветных сегментов на каждой из указанных акроцентрических хромосом для определения строения с применением дополнительного дифференциального красителя, где указанный дифференциальный краситель образуется в результате специфичной реакции третьего субстрата и фермента, причем указанный фермент является частью конъюгата фермент-антитело, при этом указанное антитело связано со специфичной меткой, которая связана со специфичным ДНК-зондом, находящимся на каждой из указанных акроцентрических хромосом, причем указанные смешанные характерные основные цветные сегменты и указанные характерные второстепенные сегменты на каждой из указанных акроцентрических хромосом для определения строения присутствуют в соотношении 1:1.
19. Способ по п.18, отличающийся тем, что указанный дополнительный дифференциальный краситель включает черный пигмент.
20. Способ по п.18, отличающийся тем, что указанная гибридизация представляет собой гибридизацию in situ, причем образец находится на пластинке.
21. Способ по п.20, отличающийся тем, что указанная пластинка содержит некоторое количество лунок для нанесения, гибридизации и анализа указанных акроцентрических хромосом для определения строения.
22. Способ по п.18, отличающийся тем, что указанный визуальный анализ включает применение светового микроскопа.
23. Способ по п.18, отличающийся тем, что указанный визуальный анализ включает применение CCD-камеры.
24. Способ по п.18, отличающийся тем, что источник указанного образца, полученного от человека, выбран из группы, включающей: амниотическую жидкость, хориальные ворсины, периферическую кровь, плевральную жидкость, костный мозг и опухолевую ткань.
25. Способ подтверждения присутствия маркерных хромосом в образце, включающий стадии:
получение образца, содержащего клетки с хромосомным материалом, который предположительно включает частичные хромосомы, для анализа;
получение совокупности различных ДНК-зондов, специфичных к хромосомам и участкам хромосом человека, при этом указанные ДНК-зонды содержат различные метки и способны маркировать нормальные контрольные хромосомы для указанных частичных хромосом по существу равномерно по всей длине каждой из указанных нормальных контрольных хромосом;
гибридизацию указанного образца с указанными ДНК-зондами; и
детектирование гибридизации указанных ДНК-зондов с хромосомным материалом, который предположительно включает частичные хромосомы с применением двух различных ферментов, двух различных антител и двух различных субстратов, причем указанные два различных фермента и два различных антитела образуют два различных конъюгата фермент-антитело, при этом каждое из указанных антител связывается с одной из указанных меток, которая присоединена к одному из указанных специфичных ДНК-зондов и каждый из указанных различных ферментов реагирует со своим специфичным субстратом из указанных различных субстратов, таким образом, что получают смешанные характерные основные цветные сегменты на указанном хромосомном материале, который предположительно включает частичные хромосомы; и
сравнение указанных смешанных характерных основных цветных сегментов на указанном хромосомном материале, который предположительно включает частичные хромосомы, со смешанными характерными основными цветными сегментами на указанных нормальных контрольных хромосомах посредством визуального анализа и определение содержит ли указанный хромосомный материал указанные частичные хромосомы, причем присутствие указанных частичных хромосом в указанном хромосомном материале указывает на присутствие указанных маркерных хромосом в указанном образце, указанные смешанные характерные основные цветные сегменты на указанных нормальных контрольных хромосомах получают посредством гибридизации указанных нормальных контрольных хромосом с указанными ДНК-зондами и, детектирования гибридизации указанных ДНК-зондов с указанными нормальными контрольными хромосомами с применением указанных конъюгатов фермент-антитело и указанных различных субстратов, и
каждый из соседних сегментов из указанных смешанных характерных основных цветных сегментов на указанной нормальной контрольной хромосоме расположен на по существу одинаковом расстоянии от других, при этом указанный способ включает создание второстепенных характерных сегментов среди указанных смешанных характерных основных цветных сегментов на каждой из указанных хромосом из указанного хромосомного материала, который предположительно включает частичные хромосомы, при этом указанные второстепенные характерные сегменты получают в результате специфичной реакции третьего субстрата и фермента, причем указанный фермент является частью конъюгата фермент-антитело, при этом указанное антитело связано со специфичной меткой, которая связана со специфичным ДНК-зондом, находящимся на хромосомном материале, который предположительно включает частичные хромосомы, причем указанные смешанные характерные основные цветные сегменты и указанные характерные второстепенные сегменты на каждой из указанных хромосом из указанного хромосомного материала, который предположительно включает частичные хромосомы, присутствуют в соотношении 1:1.
получение образца, содержащего клетки с хромосомным материалом, который предположительно включает частичные хромосомы, для анализа;
получение совокупности различных ДНК-зондов, специфичных к хромосомам и участкам хромосом человека, при этом указанные ДНК-зонды содержат различные метки и способны маркировать нормальные контрольные хромосомы для указанных частичных хромосом по существу равномерно по всей длине каждой из указанных нормальных контрольных хромосом;
гибридизацию указанного образца с указанными ДНК-зондами; и
детектирование гибридизации указанных ДНК-зондов с хромосомным материалом, который предположительно включает частичные хромосомы с применением двух различных ферментов, двух различных антител и двух различных субстратов, причем указанные два различных фермента и два различных антитела образуют два различных конъюгата фермент-антитело, при этом каждое из указанных антител связывается с одной из указанных меток, которая присоединена к одному из указанных специфичных ДНК-зондов и каждый из указанных различных ферментов реагирует со своим специфичным субстратом из указанных различных субстратов, таким образом, что получают смешанные характерные основные цветные сегменты на указанном хромосомном материале, который предположительно включает частичные хромосомы; и
сравнение указанных смешанных характерных основных цветных сегментов на указанном хромосомном материале, который предположительно включает частичные хромосомы, со смешанными характерными основными цветными сегментами на указанных нормальных контрольных хромосомах посредством визуального анализа и определение содержит ли указанный хромосомный материал указанные частичные хромосомы, причем присутствие указанных частичных хромосом в указанном хромосомном материале указывает на присутствие указанных маркерных хромосом в указанном образце, указанные смешанные характерные основные цветные сегменты на указанных нормальных контрольных хромосомах получают посредством гибридизации указанных нормальных контрольных хромосом с указанными ДНК-зондами и, детектирования гибридизации указанных ДНК-зондов с указанными нормальными контрольными хромосомами с применением указанных конъюгатов фермент-антитело и указанных различных субстратов, и
каждый из соседних сегментов из указанных смешанных характерных основных цветных сегментов на указанной нормальной контрольной хромосоме расположен на по существу одинаковом расстоянии от других, при этом указанный способ включает создание второстепенных характерных сегментов среди указанных смешанных характерных основных цветных сегментов на каждой из указанных хромосом из указанного хромосомного материала, который предположительно включает частичные хромосомы, при этом указанные второстепенные характерные сегменты получают в результате специфичной реакции третьего субстрата и фермента, причем указанный фермент является частью конъюгата фермент-антитело, при этом указанное антитело связано со специфичной меткой, которая связана со специфичным ДНК-зондом, находящимся на хромосомном материале, который предположительно включает частичные хромосомы, причем указанные смешанные характерные основные цветные сегменты и указанные характерные второстепенные сегменты на каждой из указанных хромосом из указанного хромосомного материала, который предположительно включает частичные хромосомы, присутствуют в соотношении 1:1.
26. Способ по п.25, отличающийся тем, что указанный дополнительный дифференциальный краситель включает черный пигмент.
27. Способ по п.25, отличающийся тем, что каждая хромосома в указанном хромосомном материале содержит длинное плечо и короткое плечо, и при этом толщина указанных характерных второстепенных сегментов на указанном длинном плече хромосомы приблизительно в два раза больше, чем толщина указанных характерных второстепенных сегментов на коротком плече хромосомы.
28. Способ по п.25, отличающийся тем, что указанная гибридизация представляет собой гибридизацию in situ, причем образец находится на пластинке.
29. Способ по п.28, отличающийся тем, что указанная пластинка содержит некоторое количество лунок для нанесения, гибридизации и анализа указанного хромосомного материала, который предположительно включает частичные хромосомы.
30. Способ по п.25, отличающийся тем, что указанный визуальный анализ включает применение светового микроскопа.
31. Способ по п.25, отличающийся тем, что указанный визуальный анализ включает применение CCD-камеры.
32. Способ по п.25, отличающийся тем, что источник указанного образца ДНК выбран из группы, включающей: амниотическую жидкость, хориальные ворсины, периферическую кровь, плевральную жидкость, костный мозг и опухолевую ткань.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US11/034,085 | 2005-01-12 | ||
| US11/034,085 US7943304B2 (en) | 2005-01-12 | 2005-01-12 | Method and apparatus for chromosome profiling |
| PCT/US2005/046601 WO2006076142A2 (en) | 2005-01-12 | 2005-12-22 | Method and apparatus for chromosome profiling |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2007129399A RU2007129399A (ru) | 2009-02-20 |
| RU2471871C2 true RU2471871C2 (ru) | 2013-01-10 |
Family
ID=36653700
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2007129399/10A RU2471871C2 (ru) | 2005-01-12 | 2005-12-22 | Способ и устройство для определения строения хромосом |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7943304B2 (ru) |
| EP (1) | EP1838873B1 (ru) |
| JP (1) | JP5344335B2 (ru) |
| KR (1) | KR20070105987A (ru) |
| CN (1) | CN101128602A (ru) |
| AU (1) | AU2005324348B2 (ru) |
| CA (1) | CA2595897C (ru) |
| GB (1) | GB2437460A (ru) |
| RU (1) | RU2471871C2 (ru) |
| WO (1) | WO2006076142A2 (ru) |
| ZA (1) | ZA200706183B (ru) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2522961C1 (ru) * | 2012-12-10 | 2014-07-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт клинической иммунологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИКИ" СОРАМН) | Способ определения маркера развития ревматоидного артрита на основе выявления укорочения относительной длины теломер на отдельных хромосомах в т-лимфоцитах периферической крови |
| RU2654575C2 (ru) * | 2013-05-15 | 2018-05-21 | БиДжиАй Дженомикс Ко., Лтд. | Способ и устройство для детектирования хромосомных структурных аномалий |
| RU2828103C1 (ru) * | 2023-11-17 | 2024-10-07 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук" | Способ получения панели ДНК-зондов для определения хромосомных транслокаций, делеций и амплификаций |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8057995B2 (en) * | 2006-10-11 | 2011-11-15 | Genecare Medical Genetics Center, Inc. | Methods of chromosome drying and spreading |
| US10697005B2 (en) | 2013-06-26 | 2020-06-30 | Ramesh Vallabhaneni | Method and system for tracking specific in situ hybridizations in biological samples using molecular barcodes |
| US11149299B2 (en) * | 2015-06-25 | 2021-10-19 | Ramesh Vallabhaneni | Method and system for multiplex profiling of chromosomes in biological samples using target-specific DNA probes |
| EP3591572B1 (en) * | 2018-07-06 | 2021-09-01 | Tata Consultancy Services Limited | Method and system for automatic chromosome classification |
| CN115375682B (zh) * | 2022-10-24 | 2023-01-20 | 湖南自兴智慧医疗科技有限公司 | 一种染色体罗氏易位异常检测方法、系统及存储介质 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2092018C1 (ru) * | 1994-06-22 | 1997-10-10 | Приморский сельскохозяйственный институт | Способ идентификации хромосом растительных клеток |
| WO2003033733A2 (en) * | 2001-10-15 | 2003-04-24 | Uwe Claussen | Process for the detection of chromosomal aberrations in interphase nuclei |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6344315B1 (en) | 1986-01-16 | 2002-02-05 | The Regents Of The University Of California | Chromosome-specific staining to detect genetic rearrangements associated with chromosome 3 and/or chromosome 17 |
| US5756696A (en) | 1986-01-16 | 1998-05-26 | Regents Of The University Of California | Compositions for chromosome-specific staining |
| US6280929B1 (en) | 1986-01-16 | 2001-08-28 | The Regents Of The University Of California | Method of detecting genetic translocations identified with chromosomal abnormalities |
| US5447841A (en) | 1986-01-16 | 1995-09-05 | The Regents Of The Univ. Of California | Methods for chromosome-specific staining |
| US6203977B1 (en) | 1988-11-15 | 2001-03-20 | Yale University | Delineation of individual human chromosomes in metaphase and interphase cells by in situ suppression hybridization |
| US5817462A (en) * | 1995-02-21 | 1998-10-06 | Applied Spectral Imaging | Method for simultaneous detection of multiple fluorophores for in situ hybridization and multicolor chromosome painting and banding |
| US5856097A (en) | 1992-03-04 | 1999-01-05 | The Regents Of The University Of California | Comparative genomic hybridization (CGH) |
| US5427910A (en) * | 1992-12-09 | 1995-06-27 | Compucyte Corporation | Method of cytogenetic analysis |
| US6136540A (en) | 1994-10-03 | 2000-10-24 | Ikonisys Inc. | Automated fluorescence in situ hybridization detection of genetic abnormalities |
| GB9704054D0 (en) | 1997-02-27 | 1997-04-16 | Univ Cambridge Tech | Assay |
| US6051835A (en) | 1998-01-07 | 2000-04-18 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Spectral imaging apparatus and methodology |
| US6524798B1 (en) | 1999-06-18 | 2003-02-25 | Applied Imaging Corporation | High efficiency methods for combined immunocytochemistry and in-situ hybridization |
| US20030017491A1 (en) * | 2000-09-14 | 2003-01-23 | Zuo-Rong Shi | Chromogenic in situ hybridization methods, kits, and compositions |
| FR2826977B1 (fr) * | 2001-07-03 | 2004-07-16 | Imstar S A | Procede et systeme de detection de desequilibre inter-chromosomique par hybridation in situ de sondes fluorescentes (fish) sur des noyaux cellulaires en interphases |
-
2005
- 2005-01-12 US US11/034,085 patent/US7943304B2/en active Active
- 2005-12-22 GB GB0714525A patent/GB2437460A/en not_active Withdrawn
- 2005-12-22 CN CNA2005800486786A patent/CN101128602A/zh active Pending
- 2005-12-22 WO PCT/US2005/046601 patent/WO2006076142A2/en active Application Filing
- 2005-12-22 EP EP05855200.1A patent/EP1838873B1/en active Active
- 2005-12-22 RU RU2007129399/10A patent/RU2471871C2/ru active
- 2005-12-22 JP JP2007550393A patent/JP5344335B2/ja active Active
- 2005-12-22 KR KR1020077018128A patent/KR20070105987A/ko not_active Ceased
- 2005-12-22 CA CA2595897A patent/CA2595897C/en active Active
- 2005-12-22 AU AU2005324348A patent/AU2005324348B2/en active Active
-
2007
- 2007-07-26 ZA ZA200706183A patent/ZA200706183B/xx unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2092018C1 (ru) * | 1994-06-22 | 1997-10-10 | Приморский сельскохозяйственный институт | Способ идентификации хромосом растительных клеток |
| WO2003033733A2 (en) * | 2001-10-15 | 2003-04-24 | Uwe Claussen | Process for the detection of chromosomal aberrations in interphase nuclei |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| LEMKE J. ET AL., The DNA-based structure of human chromosome 5 in interphase, Am J Hum Genet, 2002, v.71, no.5, p.1051-9. * |
| LEMKE J. ET AL., The DNA-based structure of human chromosome 5 in interphase, Am J Hum Genet, 2002, v.71, no.5, p.1051-9. MACVILLE M.V. ET AL., Spectral imaging of multi-color chromogenic dyes in pathological specimens, Anal Cell Pathol., 2001, v. 22, no.3, p.133-42. * |
| MACVILLE M.V. ET AL., Spectral imaging of multi-color chromogenic dyes in pathological specimens, Anal Cell Pathol., 2001, v. 22, no.3, p.133-42. * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2522961C1 (ru) * | 2012-12-10 | 2014-07-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт клинической иммунологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИКИ" СОРАМН) | Способ определения маркера развития ревматоидного артрита на основе выявления укорочения относительной длины теломер на отдельных хромосомах в т-лимфоцитах периферической крови |
| RU2654575C2 (ru) * | 2013-05-15 | 2018-05-21 | БиДжиАй Дженомикс Ко., Лтд. | Способ и устройство для детектирования хромосомных структурных аномалий |
| US11004538B2 (en) | 2013-05-15 | 2021-05-11 | Bgi Genomics Co., Ltd. | Method and device for detecting chromosomal structural abnormalities |
| RU2828103C1 (ru) * | 2023-11-17 | 2024-10-07 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук" | Способ получения панели ДНК-зондов для определения хромосомных транслокаций, делеций и амплификаций |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2005324348A1 (en) | 2006-07-20 |
| US7943304B2 (en) | 2011-05-17 |
| JP5344335B2 (ja) | 2013-11-20 |
| GB0714525D0 (en) | 2007-09-05 |
| AU2005324348B2 (en) | 2011-09-01 |
| WO2006076142A2 (en) | 2006-07-20 |
| ZA200706183B (en) | 2008-06-25 |
| EP1838873A4 (en) | 2009-08-12 |
| CA2595897C (en) | 2016-11-15 |
| EP1838873A2 (en) | 2007-10-03 |
| US20060154263A1 (en) | 2006-07-13 |
| KR20070105987A (ko) | 2007-10-31 |
| RU2007129399A (ru) | 2009-02-20 |
| EP1838873B1 (en) | 2014-07-23 |
| GB2437460A (en) | 2007-10-24 |
| JP2008526227A (ja) | 2008-07-24 |
| CN101128602A (zh) | 2008-02-20 |
| WO2006076142A3 (en) | 2007-10-11 |
| CA2595897A1 (en) | 2006-07-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ventura et al. | FISH analysis for the detection of lymphoma-associated chromosomal abnormalities in routine paraffin-embedded tissue | |
| JP3871066B2 (ja) | 正常部位抑制ハイブリダイゼーシヨンおよびその使用 | |
| Schröck et al. | Spectral karyotyping and multicolor fluorescence in situ hybridization reveal new tumor-specific chromosomal aberrations | |
| Tsuchiya | Fluorescence in situ hybridization | |
| US20090258365A1 (en) | METHOD FOR DETECTING IGF1R/Chr 15 in CIRCULATING TUMOR CELLS USING FISH | |
| US9562259B2 (en) | Method of analyzing chromosomal inversions | |
| Wan | Cancer cytogenetics: an introduction | |
| RU2471871C2 (ru) | Способ и устройство для определения строения хромосом | |
| US8574836B2 (en) | Method and apparatus for chromosome profiling | |
| Murthy et al. | New approaches to fluorescence in situ hybridization | |
| Weier et al. | FISH in cancer diagnosis and prognostication: from cause to course of disease | |
| JP4137269B2 (ja) | 生体高分子における変異の同定法 | |
| Bayani et al. | Comparative genomic hybridization | |
| Babu et al. | Interphase chromosome profiling: A method for conventional banded chromosome analysis using interphase Nuclei | |
| Hu et al. | Fluorescence in situ hybridization | |
| US6605436B1 (en) | Method and kit for detecting intrachromosome imbalance in interphase nuclei and their applications | |
| Min et al. | Cytogenetic studies using FISH: background | |
| Tibiletti | Fluorescence In Situ Hybridization | |
| Dolan | Conventional and molecular cytogenetics in cancer | |
| Swansbury et al. | Fluorescence in situ hybridization methods and troubleshooting applied to fixed cell suspensions | |
| Blancato et al. | Fluorescent in situ hybridization (FISH): Principles and methodology | |
| Giefing et al. | FISH and FICTION in Lymphoma Research | |
| Wang et al. | Diagnostic Approaches to Hematologic Malignancies | |
| CN105803063A (zh) | 一种单通道下检测eml4/alk基因融合的探针标记方法 | |
| Ward | Molecular Genetics of Breast Neoplasia. |