CN108753749B - 家蚕tRNA异戊烯基转移酶基因及其重组载体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种家蚕tRNA异戊烯基转移酶基因及其重组载体和应用，家蚕tRNA异戊烯基转移酶基因的核苷酸如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示，为3种不同选择性剪接形式，组织表达表明精巢中表达量最高，卵巢次之；酵母功能验表明BmIPT1具有tRNA异戊烯基转移酶功能，可以作为异戊烯基化修饰的催化剂和家蚕育种中的应用，也可作为鳞翅目害虫防控的打靶基因。

Description

家蚕tRNA异戊烯基转移酶基因及其重组载体和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及家蚕tRNA异戊烯基转移酶基因，还涉及含有该基因的重组表达载体和应用。

背景技术

家蚕(Bombyx mori)被人类驯化、利用的主要价值在于其高效的蛋白质合成能力以及生产丝蛋白质纤维的能力。生长速度快、个体大、茧层率高是数千年来家蚕驯化选择的主要性状，研究家蚕高效的蛋白合成能力具有重要的理论及应用价值。

家蚕以桑叶为饲料，其取食期仅20余天，但体重急速增长，从1龄初的0.5mg增长到5龄末的5g增长了约10000倍，泌丝器官丝腺更是增长了160000倍。有研究表明，在家蚕5龄3天，每个后部丝腺细胞能够合成10⁵个丝素分子。整个丝腺每秒钟合成的丝素分子为6×10⁹个，其速率是肝细胞合成血清白蛋白的50倍以上(崔振腾,陈亚洁et al.2013)。家蚕丝腺是已知的蛋白质合成和分泌能力最强大的昆虫器官。如此高的蛋白合成速率令众多科技工作人十分着迷，一直想找到其中的奥秘所在。

研究家蚕高效的蛋白合成能力具有重要的理论及应用价值。首先，蚕体蛋白质的高效合成能力是蚕桑生产的最重要的经济性状。蚕体、特别是丝腺的蛋白质合成能力决定了蚕茧的产量与质量，也从很大程度上影响着蚕丝产业的经济效益。研究蚕体、特别是丝腺器官的蛋白质高效合成与分泌的机制，对于通过分子操作培育高产、优质的蚕品种及改良丝腺或其他组织器官蛋白质合成成分具有重要意义。此外，因为蚕体、特别是丝腺具有高效的蛋白质合成分泌能力，加之其是高等真核生物，具有完善的蛋白质翻译后修饰加工系统且对人畜安全等，其是潜在的具有特别优势特征的生物反应器选择系统，有巨大的开发价值，引起科研工作者的广泛关注。但是，众多的尝试均发现无论采用什么启动子，外源蛋白质的表达量均低于家蚕自身蛋白的表达量。因此，蚕体、特别是丝腺的高效蛋白质合成分泌机制的解析也必将为推动家蚕作为生物反应器等新用途开发提供理论支撑。

关于家蚕蛋白的高效表达调控研究目前主要集中于丝蛋白相关基因的转录调控方面。研究发现转录因子SGF-1,SGF-2,SGF-3,SGF-4和FBF-A1均对Fib-H的表达具有调控作用。P25蛋白的表达与顺式作用元件SGFB和PSGF及miRNA-2B有重要关系(Huang,Zou etal.2011)。赵小明等发现bHLH转录因子Bmdimm和Bmsage均参与调控Fib-H的表达，其中Bmdimm通过直接结合于Fib-H的E-box区域参与调控Fib-H的表达，而Bmsage与SGF1形成复合物后增加Fib-H的表达(Zhao,Liu et al.2014,Zhao,Liu et al.2015)。而周春燕等发现Multiprotein bridging factor 2和核受体BmFTZ-F1在对丝素重链Fib-H的表达发挥着负调控作用(Zhou,Zha et al.2016,Zhou,Zha et al.2016)。由此可见，影响家蚕丝蛋白合成与分泌的相关基因数量及信号通路非常多，大多数学者比较统一的看法是丝蛋白合成分泌的调控是一个复杂的多通路机制，可能受基因组DNA、转录调控、翻译调控，蛋白组装及分泌等众多因素的影响。

transfer RNAs(tRNA)是在几乎所有生物体中均存在的由70-90个核苷酸组成的非编码RNA。其通过反密码子与mRNA上的密码子之间的信息交流解译蛋白翻译密码实现蛋白翻译，可见其在蛋白翻译过程中发挥着重要的枢纽作用。遗传信息的解码是否正确对于细胞能否生存下来起着决定性作用，而transfer RNAs(tRNA)对于蛋白翻译的效率及准确性都发挥着至关重要的作用。众多研究显示，生物体通过调控tRNA上的碱基的转录后修饰实现对其活性的调控(Torres,Batlle et al.2014)。为了实现tRNA活性的精准调控，事实上，大部分生物会将其所编码基因的1％-10％用在tRNA的修饰上(El Yacoubi,Bailly etal.2012)。在不同的tRNA中，有超过100种不同的碱基修饰。许多碱基修饰位于tRNA的反密码子环上，特别是紧邻反密码子的34位和37位碱基，这些修饰主要包括mcm5U34,5-methylcytidine(m5C34),N6-threonylcarbamoyladenosine(t6A37)和N6-isopentenyladenosine(i6A37)(Schweizer,Bohleber et al.2017)。

tRNA的37位核苷酸是一个嘌呤碱基，一般认为此嘌呤碱基发挥着稳固tRNA对密码子识别的状态。如果密码子的第一个碱基为A或U，那么几乎所有生物对应此密码子的tRNA的37位嘌呤碱基均会发生修饰。最为典型的修饰是对37位腺嘌呤碱基进行异戊烯基化，即N6-isopentenyladenosine(i6A37)(Schweizer,Bohleber et al.2017)。研究显示，tRNA的37位腺嘌呤碱基异戊烯基化修饰一方面可以稳定密码子第一个碱基与反密码子间的A-U碱基配对，避免错误识别；此外，tRNA的37位腺嘌呤碱基异戊烯基化修饰也可以阻止U33和A37间形成氢键，干扰tRNA的反密码子环的构象。tRNA的37位腺嘌呤碱基异戊烯基化修饰是通过tRNA异戊烯基转移酶催化生成的。在不同物种中，已证实tRNA异戊烯基转移酶基因突变会对蛋白质合成的效率、精确性以及对生物体生长发育的产生不同程度的影响。家蚕作为一种具有高效的蛋白质合成能力的生物，其蛋白质合成的高效性是否受tRNA的37位腺嘌呤碱基异戊烯基化修饰调控至今未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供家蚕tRNA异戊烯基转移酶基因，本发明的目的之二在于提供含有所述家蚕RNA异戊烯基转移酶基因的重组载体；本发明的目的之三在于提供家蚕tRNA异戊烯基转移酶基因编码的家蚕tRNA异戊烯基转移酶；本发明的目的之四在于提供所述家蚕tRNA异戊烯基转移酶在作为异戊烯基化修饰催化剂中的应用；本发明的目的之五在于提供所述家蚕tRNA异戊烯基转移酶基因在家蚕品种育种中的应用。

为解实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

1、家蚕tRNA异戊烯基转移酶基因，所述家蚕tRNA异戊烯基转移酶基因的核苷酸如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。

2、含有所述家蚕RNA异戊烯基转移酶基因的重组载体。

3、所述家蚕tRNA异戊烯基转移酶基因编码的家蚕tRNA异戊烯基转移酶。

4、所述家蚕tRNA异戊烯基转移酶在作为异戊烯基化修饰催化剂中的应用。

5、所述家蚕tRNA异戊烯基转移酶基因在家蚕品种育种中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明提供了家蚕tRNA异戊烯基转移酶基因，该基因有3种不同选择性剪接形式，包括BmIPT1，BmIPT2和BmIPT 3，不同剪接在不同组织中有表达，其中精巢中表达量最高，卵巢次之；酵母功能验表明BmIPT1具有tRNA异戊烯基转移酶功能，BmIPT2和3并不发挥tRNA异戊烯基转移酶的功能，下调BmIPT的转录水平后，可能影响家蚕不同的蛋白的合成效率，造成蛋白合成紊乱，从而打乱其正常的吐丝营茧、变态发育进程，最后导致死亡，证明BmIPT的正常表达对于家蚕蛋白合成、变态发育至关重要。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为家蚕BmIPT的PCR扩增产物检测(M：DL2000Maker；1：以家蚕丝腺cDNA为模板的BmIPT扩增产物检测)。

图2为家蚕BmIPT不同选择性剪接形式。

图3为家蚕tRNA异戊烯基化转移酶(BmIPT)结构域分析。

图4为家蚕BmIPT在家蚕五龄三天各组织的表达特征分析。

图5为家蚕BmIPT在家蚕不同发育时期的表达特征分析。

图6为BmIPT在不是发育时期丝腺中的qPCR检测(**：p value<0.01；ASG:前部丝腺；MSG:中部丝腺；PSG:后部丝腺；1D 5^th:五龄第一天；4D 5^th:五龄第四天)。

图7为BmIPT在家蚕和野蚕中的表达量的qPCR检测(*：p<0.05，**：p<0.01)。

图8为BmIPT重组酵母菌株在半乳糖糖原的培养基上的生长情况。

图9为BmIPT重组酵母菌株在赖氨酸缺陷型培养基上的生长情况。

图10为BmIPT1-MT-8重组酵母菌株中异戊烯基化腺嘌呤核苷酸的HPLC检测。

图11为干扰处理后BmIPT的qPCR检测。

图12为dsRNA干扰处理后家蚕的吐丝营茧情况(a.dsEGFP处理组家蚕的吐丝营茧情况；b-d.dsBmIPT处理组家蚕的吐丝营茧情况)。

图13为RNAi后预蛹期48h家蚕解剖图(A：dsBmIPT和dsEGFP处理后预蛹期48h的体腔比较；B：dsBmIPT和dsEGFP处理后预蛹期48h的丝腺比较)。

图14为蛹期24h观察RNAi处理后家蚕的组织器官降解情况(A/D：注射dsEGFP的蛹期24h的家蚕；B/E：注射dsBmIPT后部分吐丝的蛹期24h的家蚕；C/F：注射dsBmIPT后无法吐丝的蛹期24h的家蚕；A\B\C:去除中肠前观察；D\E\F:去除中肠后观察)。

图15为RNAi后蛹期家蚕表型观察(A：蛹两天；B：蛹5天背面拍照；C：蛹5天腹面拍照)。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1、家蚕BmIPT基因序列的获得

设计如下扩增引物，BmIPT-F1：5'-atggctttgcgtactgtgat-3'(SEQ ID NO.1)；BmIPT-R1：5'-ttaatcttgtttttgttccttgtt-3'(SEQ ID NO.2)；然后以家蚕丝腺cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。结果显示，扩增获得三条不同大小的条带。

分别回收不同大小的条带并进行克隆测序，经序列分析及拼接，结果如图2所示。结果发现三个条带均由引物特异扩增获得，来自于基因组上的同一位置，属于同一基因的不同选择性剪接形式，分别命名为BmIPT1，BmIPT2和BmIPT3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。将回收的BmIPT1，BmIPT2和BmIPT3连接pEASY-T5，分别获得重组质粒BmIPT1-pEASY-T5，BmIPT2-pEASY-T5和BmIPT3-pEASY-T5。

将BmIPT1，BmIPT2和BmIPT3三种形式的BmIPT的蛋白序列与人类(NP_060116.2)和拟南芥(NP_565658.1)的tRNA异戊烯基转移酶基因的蛋白序列进行比对，结果如图3所示。结果发现，BmIPT1与人类和拟南芥的tRNA异戊烯基转移酶基因的结构域类似，都含有ATP/GTP结合位点，DMAPP结合位点和锌指结构域；而BmIPT2则只含有ATP/GTP结合位点，DMAPP结合位点；BmIPT3的ATP/GTP结合位点不完整。

实施例2、BmIPT的表达特征分析

基于家蚕基因芯片表达谱数据，对家蚕中BmIPT的表达特征进行分析。首先，分析BmIPT在五龄第三天家蚕各组织样品中的表达特征，组织样品包括精巢、卵巢、头、表皮、脂肪体、中肠、血细胞、马氏管、前/中部丝腺、后部丝腺，结果如图4所示。结果显示，tRNA异戊烯基转移酶基因在家蚕各个组织器官均有表达，其中在精巢中表达量最高，卵巢次之；在血细胞和丝腺中，BmIPT的表达量也较高。其次，分析BmIPT在家蚕中的时期表达特征，如图5所示。结果显示，BmIPT在家蚕五龄六天、上蔟后60h以及化蛾期等时期都呈现明显的高量表达。家蚕五龄六天是丝蛋白大量合成的时期，而上蔟后60h及化蛾期是家蚕幼虫-蛹、蛹-成虫变态发育中旧组织器官降解、新组织器官再造的关键时期，期间均需要大量蛋白的合成。

此外通过荧光定量PCR技术(qRT-PCR)，对BmIPT在不同发育时期的丝腺以及其在家蚕与野蚕中的表达特征进行了分析。以家蚕GAPDH基因作为内参基因，荧光定量PCR引物如下所示。

BmIPT-qrtF：5’-ttcaggaagatgtggataacg-3’(SEQ ID NO.6)；

BmIPT-qrtR：5’-tttgggtgcagtctattgg-3’(SEQ ID NO.7)；

BmGAPDHQRTf：5’-cattccgcgtccctgttgctaat-3’(SEQ ID NO.8)；

BmGAPDHQRTr：5’-gctgcctccttgaccttttgc-3’(SEQ ID NO.9)；

实验以家蚕五龄一天和五龄四天的前部丝腺、中部丝腺、后部丝腺为模板，探究了BmIPT在丝腺中的表达量变化，结果如图6所示。结果显示，随着家蚕的生长发育，家蚕中部丝腺和后部丝腺中的BmIPT的表达量显著升高。

此外，鉴于家蚕(Bombyx mori)经过人类长期的驯化，与野桑蚕相比，其个体大小，生长速度，茧层率等都有明显的提高。本实验探究了BmIPT在野蚕和家蚕各组织中的表达量的差异，结果如图7所示。结果显示，与野蚕相比，BmIPT在家蚕的中肠，丝腺，脂肪体中都有显著更高量的表达，特别是丝腺中，其表达量的差异更明显。

实施例3、BmIPT对tRNA异戊烯基转移酶缺陷型酵母的功能互补检测

本研究使用的酵母菌株MT-8的基因型为：MATa SUP7 ura3-1his5-2 leu2-3，112ade2-1 trp1 lys1-1 lys2-1 can1-100 MOD5::TRP1。mod5基因是酵母中的tRNA异戊烯基转移酶基因，其在MT-8菌株中是突变的。此外，MT-8菌株中从头合成腺嘌呤途径中ade2-1基因含有无义突变，且tRNA SUP7无义突变抑制子由于缺少异戊烯基化修饰不能抑制其无义突变。因此，MT-8在富营养的培养基上生长时，腺嘌呤途径中中间产物累积并被氧化，导致酵母菌株颜色呈红色。只有MT-8中转入mod5基因的同源功能性tRNA异戊烯基转移酶基因恢复其异戊烯基化修饰能力时，异戊烯基化修饰的tRNA SUP7抑制子才能抑制ade2-1基因的无义突变，在一定程度上恢复其从头合成腺嘌呤的能力，重组酵母菌株在富营养的培养基上才会恢复为白色或粉白色。此外，MT-8菌株含有lys1-1和lys2-1基因无义突变，因此其不能在缺赖氨酸的培养基上生长。当将tRNA异戊烯基转移酶基因的同源基因转入MT-8菌株中时，由于恢复其异戊烯基化能力，tRNA SUP7抑制子才能抑制lys1-1和lys2-1基因的无义突变，因此可以在缺赖氨酸的培养基上生长。据此，可以向MT-8菌株中转入tRNA异戊烯基转移酶候选基因，检测其是否具有向tRNA转移异戊烯基的功能。

将MT-8的永久菌涂布于完全培养基(YPD固体培养基)上，并放置于30℃培养箱中进行培养，挑取单菌落在YPD液体培养基上进行扩培。之后所有的酵母培养均在28-30℃的培养箱中进行。利用Gateway的方法构建酵母表达载体，具体为采用引物BmIPT-F2：5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcatggctttgcgtactgtgat-3’(SEQ ID NO.10)和BmIPT-R2：5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcatcttgtttttgttccttgtt-3’(SEQ ID NO.11)从重组质粒BmIPT1-pEASY-T5，BmIPT2-pEASY-T5和BmIPT3-pEASY-T5扩增对应的目的基因片段，通过BP反应连入入门载体pDoner^TM 207(Invitrogen)，进而通过LR反应连入酵母表达载体pAG306GAL-ccdB-TAP(Addgene)，获得重组质粒pAG306GAL-BmIPT1-TAP，pAG306GAL-BmIPT2-TAP和pAG306GAL-BmIPT3-TAP。制备MT-8酵母感受态细胞,采用LiAc法将pAG306GAL-BmIPT1-TAP，pAG306GAL-BmIPT2-TAP和pAG306GAL-BmIPT3-TAP分别转入MT-8中，获得重组酵母株BmIPT1-MT-8，BmIPT2-MT-8和BmIPT3-MT-8。

将MT-8，BmIPT1-MT-8，BmIPT2-MT-8，BmIPT3-MT-8涂板于以半乳糖为糖原的YPG培养板上，诱导BmIPT的表达，结果如图8所示。涂板3天之后发现，MT-8、BmIPT2-MT-8，BmIPT3-MT-8菌株呈红色，而BmIPT1-MT-8呈粉白色。实验结果初步说明BmIPT1是家蚕的功能性tRNA异戊烯基转移酶。为了进一步验证BmIPT候选基因的功能，检测了重组酵母菌株在缺赖氨酸的培养基上的生长情况。结果如图9所示，MT-8在缺少赖氨酸的培养板上不能生长，BmIPT1-MT-8能正常生长，BmIPT3和BmIPT2的MT-8重组酵母株与MT-8一致，不能在缺赖氨酸的培养基上生长。这进一步证实了BmIPT1基因具有很强的异戊烯基化修饰的能力。

最后利用HPLC实验对酶解后的RNA中的异戊烯基腺嘌呤进行检测。将上述诱导表达的酵母菌株于3天时收集起来，提取其RNA，并溶解于DEPC水(pH5.3，冰乙酸调平)中，测量其浓度，将浓度调于6000ng/μl，加入核酸酶P1和碱性磷酸酶，在37℃，酶切3h，将所得样品进行过滤，用于HPLC检测，HPLC检测结果如图10所示。HPLC检测结果显示，异戊烯基化腺嘌呤核苷酸标品在34-35min处有一个显著的峰，MT-8中在标品出峰位置没有出峰，证明其没有异戊烯基化修饰，BmIPT1-MT-8在标品出峰位置有一个明显的峰，证明其腺嘌呤核苷酸已被异戊烯基化修饰，BmIPT1基因具有异戊烯基化能力。

实施例4、基于RNAi的BmIPT的功能研究

为进一步探究BmIPT的功能，采用RNAi手段下调BmIPT的表达量来探究其对家蚕吐丝营茧、变态发育等的影响，以期探讨tRNA异戊烯基化对家蚕蛋白翻译的影响程度。首先采用dsBmIPTF和dsBmIPTR引物，从重组质粒BmIPT1-pEASY-T5扩增含有T7启动子的BmIPT对应dsRNA的合成模板。以昆虫转基因载体pBac 3×p3EGFP作为模板，采用引物dsEGFPF和dsEGFPR进行扩增，获得EGFP对应dsRNA的合成模板。采用dsRNA合成试剂盒(RibomaxTMLarge Scale RNA Production System-T7Kit)合成BmIPT对应的dsRNA：dsBmIPT和对照dsRNA：dsEGFP。

dsBmIPTF：5’-gtaatacgactcactataggggctcatagatcctgcgatg-3’(SEQ IDNO.12)；

dsBmIPTR：5’-gtaatacgactcactatagggctgttgtgcctctcgtgg-3’(SEQ ID NO.13)；

dsEGFPF：5’-gtaatacgactcactatagggagaacgtaaacggccacaagttc-3’(SEQ IDNO.14)；

dsEGFPR：5’-gtaatacgactcactatagggagatgctcaggtagtggttgtcg-3’(SEQ IDNO.15)；

将家蚕正常饲养至五龄五天，并选取状态良好的家蚕按体重将其平均分为两组，每组35头，一组用于注射dsEGFP，一组用于注射dsBmIPT。注射部位选择家蚕的第二或第三腹足；dsRNA注射量为40μg/头。注射之后立即饷食，并放于25℃培养箱进行饲养和后续观察。选取干扰处理24h后的家蚕收集血细胞，提取RNA，使用反转录试剂盒将其反转录成cDNA，通过qRT-PCR技术对BmIPT的转录水平进行定量检测，检测结果如图11所示。定量结果显示，注射dsBmIPT的实验组相比注射dsEGFP的对照组来说，其BmIPT的表达量显著性降低，说明干扰效果显著。观察发现，dsEGFP处理组全部可以吐丝结茧，茧的颜色为黄色，其吐丝量明显高于dsBmIPT组(图12，a)；dsBmIPT处理组则表现出三种表型，第一种完全不能进行吐丝(图12，d)，其比例达到50％；第二种可以进行吐丝，但其吐丝量极少，形成一小块丝片(图12，c)，约占10％；第三种可以吐丝营造形成1个颜色偏白的薄茧，此种类型比例为40％(图12，b)。

解剖dsBmIPT组中部分吐丝的家蚕和dsEGFP组预蛹期48h的家蚕，结果如图13所示，dsBmIPT组中中部丝腺明显大于dsEGFP组；将丝腺单独取出观察，发现dsBmIPT处理组个体的中部丝腺腺腔仍充满着物质，而其后部丝腺与dsEGFP组个体类似，已经中空而萎缩，进入了组织降解阶段；而dsEGFP组个体的中部丝腺和后部丝腺均因腔内物质排出而呈萎缩状。这一现象间接说明了下调BmIPT的表达量，一定程度上改变了中部丝腺和后部丝腺内蛋白合成成分的相对比例，使家蚕吐丝量减少或不能正常吐丝。

dsEGFP组和dsBmIPT组家蚕的化蛹率均为100％。在化蛹后24h进一步对RNAi处理后的表型进行解剖观察，发现与dsEGFP处理组个体相比，dsBmIPT组个体的幼虫期中肠和丝腺均退化降解缓慢。dsBmIPT组个体化蛹后24h均可见明显的中肠和丝腺组织器官，而dsEGFP组个体的中肠和丝腺已几近降解消失(图14)。实验结果初步表明，下调BmIPT的表达后，会打乱家蚕变态发育中的组织降解再生过程，使其中肠、丝腺的组织退化降解速度变慢。

继续观察RNAi处理后蛹期的表型，发现dsBmIPT组蛹体体软且呈不正常的形状，随着时间的延长表现为明显的体色加深，最终不能完成蛹-成虫的转变，在化蛾前全部死亡。(如图15所示)。以上RNAi结果表明，下调BmIPT的表达后，可能影响家蚕不同的蛋白的合成效率，造成蛋白合成紊乱，从而打乱其正常的吐丝营茧、变态发育进程，最后导致死亡。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 西南大学

<120> 家蚕tRNA异戊烯基转移酶基因及其重组载体和应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggctttgc gtactgtgat 20

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttaatcttgt ttttgttcct tgtt 24

<210> 3

<211> 1482

<212> DNA

<213> 家蚕(Bombyx mori)

<400> 3

atggctttgc gtactgtgat ttcttctcga attccaatgg tgataatatt aggtgctact 60

gggacaggaa aaactaagct tggtgtggaa ttagcacaga aatttgccac tgaaataatc 120

agtgccgatt caatgcagat atacaaagga ttggatatcg tgacggcaaa agcgagtcct 180

caagaacggg agatggctcc tcatcatctc ttggacatac tggagcctca ccagtttttc 240

acggtagtag acttccggaa cagagcctta aaaattattg acagcttaat cgaccagaag 300

aaaatcccaa taatagttgg aggcacgatc tactacattg aatccatcgt ctatcaaatc 360

cttgttgaga gtatggacga cacagatgca ctgctgtggg ataaaagtcg taggaagaga 420

gatatagata atacacctaa tacagctgaa aaaatatcta agaaaacaaa cgatggctgt 480

ggtggcgata ataaaatgaa agtgaaagga gaacaaccaa aagaagatga agaatttata 540

agaataacgc tatcaactga caaagaagtt aaaattctag atgctgaaga ggaaactttg 600

aagagacagc ttcaggaaga tgtggataac gaagctcggt tcacaaacaa cgaaataagt 660

gaaaaactga ggctcataga tcctgcgatg gccaatagac tgcacccaaa taatcggagg 720

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gacgaacaga aggtgtgcga agggcagctt cggaaaccag actccactat aatattatgg 840

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aagaaaatga gatcacaaaa caaggaacaa aaacaagatt aa 1482

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<211> 1271

<212> DNA

<213> 家蚕(Bombyx mori)

<400> 4

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gggacaggaa aaactaagct tggtgtggaa ttagcacaga aatttgccac tgaaataatc 120

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gacgaacaga aggtgtgcga agggcagctt cggaaaccag actccactat aatattatgg 840

cttaaatgtg aacaagatgt ccacgataag cgtcttgacg ctcgcgtcga ctcgatgctg 900

gaagcgggcc tcattgagga gctgctggat ttccacgaga ggcacaacag gcaccggata 960

caggacggga ggtgccttta gtttacgaat tggacactac agatgtaacc aaatgggatg 1020

aaaacgtgaa aaacaaggct attaaaataa tagaaagttt catcaatagc actgattctg 1080

atgttttacc aataaaacag catcttcaaa gtgataaact gcatacagac ggaaattctt 1140

ttaatttttg tgaaatttgt aatcgaatca taataggcga taacgtttat gctattcatt 1200

taaaatctgt gcgtcacatg aaggttttaa agaaaatgag atcacaaaac aaggaacaaa 1260

aacaagatta a 1271

<210> 5

<211> 1212

<212> DNA

<213> 家蚕(Bombyx mori)

<400> 5

atggctttgc gtactgtgat ttcttctcga attccaatgg tgataatatt aggtgctact 60

gggacaggaa aatccatcgt ctatcaaatc cttgttgaga gtatggacga cacagatgca 120

ctgctgtggg ataaaagtcg taggaagaga gatatagata atacacctaa tacagctgaa 180

aaaatatcta agaaaacaaa cgatggctgt ggtggcgata ataaaatgaa agtgaaagga 240

gaacaaccaa aagaagatga agaatttata agaataacgc tatcaactga caaagaagtt 300

aaaattctag atgctgaaga ggaaactttg aagagacagc ttcaggaaga tgtggataac 360

gaagctcggt tcacaaacaa cgaaataagt gaaaaactga ggctcataga tcctgcgatg 420

gccaatagac tgcacccaaa taatcggagg aagattttga ggtcgataga agtctggttg 480

aagacaggac gtcgtcacag cgagatcctg gacgaacaga aggtgtgcga agggcagctt 540

cggaaaccag actccactat aatattatgg cttaaatgtg aacaagatgt ccacgataag 600

cgtcttgacg ctcgcgtcga ctcgatgctg gaagcgggcc tcattgagga gctgctggat 660

ttccacgaga ggcacaacag gcaccggata caggacggga gctcaccaga ctacaccaaa 720

ggcgttttcc aaactcttgg cttcaaagaa ttccacgatt acctgatgat gtccgaagac 780

gaaaggaatt cggaggcggg caagaaacta ctgaagacca gcattgaaaa catgaagatg 840

gccacccgga gatacgcgag acgtcaaaac aaaatgtttc gtcaaagatt tttagaacat 900

cccagaagag aggtgccttt agtttacgaa ttggacacta cagatgtaac caaatgggat 960

gaaaacgcga aaaacaaggc tattaaaata atagaaagtt tcatcaatag cactgattct 1020

gatgttttac caataaaaca gcatcttcaa agtgataaac tgcatacaga cggaaattct 1080

tttaattttt gtgaaatttg taatcgaatc atcataggcg ataacgttta tgctattcat 1140

ttaaaatctg tgcgtcacat gaaggtttta aagaaaatga gatcacaaaa caaggaacaa 1200

aaacaagatt aa 1212

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttcaggaaga tgtggataac g 21

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tttgggtgca gtctattgg 19

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cattccgcgt ccctgttgct aat 23

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gctgcctcct tgaccttttg c 21

<210> 10

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt catggctttg cgtactgtga t 51

<210> 11

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc atcttgtttt tgttccttgt t 51

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gtaatacgac tcactatagg ggctcataga tcctgcgatg 40

<210> 13

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gtaatacgac tcactatagg gctgttgtgc ctctcgtgg 39

<210> 14

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gtaatacgac tcactatagg gagaacgtaa acggccacaa gttc 44

<210> 15

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gtaatacgac tcactatagg gagatgctca ggtagtggtt gtcg 44

Claims (5)

1.家蚕tRNA异戊烯基转移酶基因，其特征在于：所述家蚕tRNA异戊烯基转移酶基因的核苷酸如SEQ ID NO.3所示。

2.含有权利要求1所述家蚕tRNA异戊烯基转移酶基因的重组载体。

3.权利要求1所述家蚕tRNA异戊烯基转移酶基因编码的家蚕tRNA异戊烯基转移酶。

4.权利要求3所述家蚕tRNA异戊烯基转移酶在作为异戊烯基化修饰催化剂中的应用。

5.权利要求1所述家蚕tRNA异戊烯基转移酶基因在家蚕育种中的应用。

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