KR20190023159A - 줄기세포 분화 효율 촉진 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 줄기세포 분화 효율 촉진 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 줄기세포 내에서 EF1α프로모터를 이용하여 Rad51, Rad52, 및 Rad54 유전자를 과발현시켜 줄기세포의 분화속도 및 분화효율을 촉진시키는 것으로 확인되었으며, PEI를 이용하여 상기 유전자를 포함하는 플라스미드의 세포 내의 도입 효율을 높여 본 발명의 분화된 세포를 확보하는 시간과 비용을 절감시킬 수 있는 장점이 있다. 또한, 본 발명의 상기 플라스미드에 의해 과발현되는 유전자는 DNA 수선과 유전자 재조합에 관여하는 것으로 배아줄기세포의 분화유도 과정에서의 유전체 안정성 유지 및 확보가 가능하고, 이에 따라 돌연변이율이 낮은 정상적으로 분화된 세포 개체 수를 효율적으로 높일 수 있는 장점이 있다.

Description

줄기세포 분화 효율 촉진 방법{Method of promoting stem cell differentiation efficiency}

본 발명은 줄기세포 분화 효율을 촉진하는 방법 등에 관한 것이다.

배아줄기세포(embryonic stem cell, ES cell)는 모든 세포로 분화할 수 있는 능력인 전분화능(pluripotency), 다분화능(multipotency), 전형성능(totipotency)을 가지고 있는 세포이다. 배아줄기세포는 분화된 체세포(differentiated somatic cell)와 달리 자가재생산성(self-renewal)을 가지고 있다. 배아줄기세포의 특이적 능력 때문에 세포가 분열을 거듭하면서 다양한 체세포로 분화할 수 있다. 이때 레티노산(비타민A)은 수용체(RAR)와 베타-카테닌 같은 외부신호에 의해 활성화되는 전사인자들과 협동해 이 인자들과 연관되는 유전자들을 작동시킨다. 비타민A는 줄기세포를 신경세포 전구체로 변환시키고, 당단백질인 Wnt에 의해 베타-카테닌이 활성화되면 나타나는 신호에 따라 여러 종류의 세포로 분화할 수 있는 다능성(pluripotency)을 지원하거나 혹은 비신경세포 분화를 촉진시키게 된다.

배아줄기세포는 이 능력을 유지하기 위해 다양하게 조절되는 유전체 안정화 유지 기작을 가지고 있다. 또한 특이적으로 DNA 복제 및 손상회복을 위해 필요한 관련 인자들의 발현이 매우 높게 유지되고 있으며 세포주기에 관계없이 발현이 유지된다. DNA 복제 및 손상 회복을 위해 배아줄기세포는 복제된 자매염색분체(sister chromatid)를 이용하며 특이적으로 상동염색체 재조합 기전 (homologous recombination pathway)을 우선적으로 사용하며, 이에 필요한 관련 인자들의 발현이 세포주기에 관계없이 매우 높게 유지되고 있다. 이러한 상동염색체 재조합 기전은 보통 감수분열 과정에서 발생한다. 감수분열은 두 번의 연속된 분열로 염색체 수가 반감하고 상동염색체가 서로 분리된다. 보통 2개의 상동 DNA 염기서열이 서로 교차하고, 교차가 일어난 부위의 염기서열은 원래 DNA 염기서열대로 유지된다. 이러한 재조합을 상동재조합(homologous recombination) 이라고 한다.

DNA 손상에 의해DNA 이중 가닥 절단(DSBs)이 발생하게 되고 재조합에 의한 DNA 수선이 개시된다. 재조합을 위한 많은 종류의 상동재조합 인자들이 존재하는데, 재조합 초기 과정은 초기 인자인 핵산말단가수분해효소(Mre11-Rad50-Nbs1) 복합체에 의해서 5' 말단을 삭제하는 재절단(resection) 반응을 유도하고 이로 인해 3' 말단의 단일 가닥 DNA(single-strand DNA) 부분이 노출되면서 시작된다. 노출된 3' 말단의 단일가닥에는 RPA(replication protein A) 단백질이 부착하게 되고 RPA는 노출된 말단을 안정시키는 동시에 BRCA2 및 Rad52 등에 의해서 Rad51이 3' 말단에 부착하도록 유도한다.

상동재조합에 있어서 Rad51은 매우 필수적인 역할을 제공한다. Rad51은 상동염색분체 (homologous chromatids) 또는 자매염색분체에 의해서 제공되는 상동 template를 접합시키거나 다른 template로 찾아가 접합하게 하여 적절한 재조합을 가능하게 한다. 또한, 복제 포크 단계를 조절하는 핵심적인 인자로서 세포 성장과 염색체의 구조적 안정성을 유지하는데 기여한다. 상동재조합 단백질들의 기능의 결함으로 재조합 기전이 망가지게 되면 유전체에 돌연변이가 차츰 축적되게 되어 각 기관 및 조직으로 분화되는 세포가 비정상적인 돌연변이를 보유하게 된다. 돌연변이 축적에 의해서 유도되는 유전체 불안정은 세포 사멸 및 암 발생의 원인이 된다.

최근 배아줄기세포에서 특이적으로 조절되는 상동재조합 기전을 활용하여 DNA복제와 수선, 및 세포 분화의 효율을 효과적으로 증진시킬 수 있는 인자들을 선별하고 이를 활성화 하는데 초점을 맞추고 있다. 이를 통해 세포가 분화할 때 상동재조합 핵심 기전의 발현을 조절함으로써 배아줄기세포 특이적으로 조절되는 DNA 손상회복 메커니즘의 효율을 극대화시켜 세포의 유전체 안정성을 유지시키고, 복제오류로 인해 발생하는 돌연변이를 막아 종양 발생과 신체적 질환 발생의 가능성을 최소화하며, 개인 특성을 고려한 맞춤 항암제 개발 및 의료시장 상용화를 가능하게 한다. 또한, 선별된 상동재조합 핵심 인자를 통해 배아줄기세포 분화효율을 조절 가능하게 함으로써 분화된 체세포에서 본래의 기능을 수행할 수 있게 하고 이를 통해 질병 치료를 위한 특별한 형태의 세포를 생산하여 재생의료 시스템을 구축할 수 있는 기틀을 마련하는데 기회를 제공한다.

세포의 분열과 분화는 개체발생 과정에서 특정한 유전정보를 유지하고 기능적으로 특수성을 획득할 수 있는 중요한 과정이다. 세포는 분열 과정에서 보통 두 개의 상동 DNA 염기서열이 서로 교차시키고 교차가 일어난 부위의 염기서열은 원래 DNA 염기서열대로 유지하게 하는 상동재조합을 통해 DNA를 복제하며 외부적인 자극으로 인한 DNA 손상 및 분열과정 중 일어날 수 있는 복제 오류를 바로잡을 수 있다. 상동재조합 과정은 다양한 유전자의 의해서 조절되며 배아줄기세포에서 특이적으로 높은 발현을 유지하고 있는 Rad51, Rad52, Rad54 유전자는 상동재조합 기전에 매우 핵심적인 역할을 수행한다. 하지만 배아줄기세포가 분열을 시작하여 체세포가 되는 과정에서 Rad51, Rad52, Rad54의 발현은 점차 감소한다. 상동재조합 유전자의 감소는 세포 분화효율속도 및 DNA 가닥 수선의 효율을 감소시킨다. DNA 수선 효율의 감소는 복제과정 중 일어날 수 있는 잘못된 유전정보를 바로잡을 수 있는 확률의 감소를 의미하며 수선되지 못한 DNA는 세포의 분열과정동안 계속해서 축적되고 분화된 체세포가 올바른 기능을 수행하지 못하게 한다. 돌연변이 DNA의 축적은 세포사멸(apoptosis)의 원인이 되며, 이것은 정상적인 기능을 수행하는 세포의 수가 감소함을 의미한다. 잘못된 유전정보는 세포, 자손 개체에게 전달되고 이러한 축적은 종양 발생 및 각종 신체적 질환의 원인이 된다.

종래 세포 분화 유도 신호를 제어하는 기술의 부재로 줄기세포에 특이적인 유전학적 진행과정에 대한 연구의 기틀이 마련되지 못하였으며, 단일 상동재조합 인자 발현에 의한 기법은 매우 제한적이고 그 작용효율이 매우 낮고, 분화과정에서 세포증식이 매우 감소되어 분화된 세포를 확보하기 위한 비용이 높은 문제점이 있었다.

이에 따라, 복제 과정 동안의 상동재조합 시스템을 통한 세포 분화효율 및 DNA수선 오류를 효과적으로 극복할 수 있는 실용기술에 대한 연구가 필요한 실정이었다.

XIANMIN ZENG 등, STEM CELLS 2003;21:647-653: Stable Expression of hrGFP by Mouse Embryonic Stem Cells: Promoter Activity in the Undifferentiated State and During Dopaminergic Neural Differentiation

본 발명자들은, 줄기세포에서 Rad51, Rad52, 및 Rad54 유전자의 과발현이 줄기세포 분화속도 및 분화효율을 촉진시킴을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 줄기세포 분화 효율 촉진 방법을 제공함에 목적이 있다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, (가) Rad51 유전자를 포함하는 플라스미드, Rad52 유전자를 포함하는 플라스미드, 및 Rad54 유전자를 포함하는 플라스미드를 제조하는 단계 및 (나) 상기 3개의 플라스미드를 줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포 분화 효율 촉진 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 Rad 51 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 Rad 52 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 Rad 54 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 3개의 플라스미드는 각각 신장인자1알파(EF1α) 프로모터를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 신장인자1알파(EF1α) 프로모터는 서열번호 4의 염기서열을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 줄기세포 분화 효율 촉진 방법은 (가)단계 이후 상기 3개의 플라스미드와 양이온성 고분자를 결합시키는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 양이온성 고분자는 폴리에틸렌이민(PEI)일 수 있다.

본 발명은 줄기세포 분화효율 및/또는 분화속도를 촉진하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따르면 줄기세포 내에서 EF1α프로모터와 함께 Rad51, Rad52, 및 Rad54 유전자를 과발현시켜 줄기세포의 분화 효율 및/또는 분화속도를 촉진시킬 수 있으며, PEI를 이용하여 상기 유전자를 포함하는 플라스미드의 세포 내의 도입 효율을 높여 분화된 세포를 확보하는 시간과 비용을 절감시킬 수 있는 장점이 있다. 또한, 본 발명에 의해 줄기세포 내에서 과발현되는 Rad51, Rad52, 및 Rad54 유전자는 DNA 수선에 관여하는 것으로서, 해당 유전자의 지속적인 발현은 DNA의 수선 효율을 증가시켜 배아줄기세포의 정상적인 분열을 유도하며, 분화된 체세포에서 본래의 기능을 수행하게 한다. 더불어, 세포가 분열 및 분화할 때 발생할 수 있는 돌연변이 DNA를 감소시켜 유전자 변이의 축적에 따른 암세포 형성을 억제할 수 있다. 상기와 같이, 본 발명은 줄기세포 분화과정에서 유전체의 안정성 유지 및 확보가 가능하고, 이에 따라 분화된 세포 개체 수를 높일 수 있는 장점이 있다.

아울러, 본 발명의 적용으로 배아줄기세포 분화 기전을 조절함으로써 유전체 안정성이 확보된 유도만능 배아줄기세포를 제작하여 관련 질병진단 및 치료방법 연구에 기반을 제공할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 세포내 유전자 전달용 복합체가 세포 안으로 엔도사이토시스되어 형질주입되는 과정과 생쥐배아줄기세포에 본 발명의 세포내 유전자 전달용 복합체를 형질주입하는 과정을 도식화한 것이다
도 2는 Rad51을 코딩하는 DAN 시퀀스가 삽입된 EF1α-pcDNA3.1(+) 벡터의 맵을 나타낸 것이다.
도 3은 Rad51을 코딩하는 DAN 시퀀스가 삽입된 EF1α-pcDNA3.1(+) 벡터의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 4는 Rad52을 코딩하는 DAN 시퀀스가 삽입된 EF1α-pcDNA3.1(+) 벡터의 맵을 나타낸 것이다.
도 5는 Rad52을 코딩하는 DAN 시퀀스가 삽입된 EF1α-pcDNA3.1(+) 벡터의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 6는 Rad54을 코딩하는 DAN 시퀀스가 삽입된 EF1α-pcDNA3.1(+) 벡터의 맵을 나타낸 것이다.
도 7는 Rad54을 코딩하는 DAN 시퀀스가 삽입된 EF1α-pcDNA3.1(+) 벡터의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 8은 LF2K, Xfect, 및 PEI 세포형질주입물질의 유전자 도입 효율을 비교 확인한 도이다.
도 9는 EF1α및 CMV 프로모터의 단백질 발현 효율을 비교 확인한 도이다.
도 10은 생쥐배아줄기세포에서 상동재조합 핵심 인자 및 세포 분화 마커의 발현을 비교 확인한 도이다.
도 11는 생쥐배아줄기세포에서 형질주입 전/후로 상동재조합 핵심 인자의 발현량을 비교 확인한 도이다.
도 12는 생쥐배아줄기세포에서 형질주입 전/후로 계통에 따른 분화 마커 단백질의 발현량을 비교 확인한 도이다.
도 13은 배양시간과 상동재조합 인자 발현 조건에 따른 세포의 모양 및 AP염색을 통해 염색되는 세포의 수를 나타낸 것이다.
도 14는 배양시간과 상동재조합 인자 발현 조건에 따라 AP 염색 강도의 평균값을 나타낸 것이다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

줄기세포에 특이적인 유전학적 진행과정의 연구를 위해서는 분화과정에서의 세포증식 및 세포 분화효율을 높게 유지할 수 있어야 하는바, 종래 세포 분화 유도 신호를 제어하는 기술의 부재로 분화된 세포의 확보를 위해서 고비용·저효율의 문제점이 있었다.

이에 본 발명자들은 상동재조합 과정에서 DNA 이중나선의 수선 및 복제에 핵심 유전자인 Rad51, Rad52, 및 Rad54 의 과발현에 의해 배아줄기세포 분화효율 및 분화속도가 증진됨을 실험을 통하여 확인하고 발명을 완성하였다.

본 발명은, 줄기세포 내에서 Rad51 유전자, Rad52 유전자, 및 Rad54 유전자를 과발현시킴으로써 줄기세포의 분화효율 및/또는 분화속도를 촉진하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 줄기세포의 분화효율 및/또는 분화속도의 촉진방법은 (가) Rad51 유전자를 포함하는 플라스미드, Rad52 유전자를 포함하는 플라스미드, 및 Rad54 유전자를 포함하는 플라스미드를 제조하는 단계; 및 (나) 상기 3개의 플라스미드를 줄기세포에 처리하는 단계에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, Rad51 유전자, Rad52 유전자, 및 Rad54 유전자는 Rad51, Rad52, 및 Rad54 의 기능 또는 이와 유사한 기능을 수행하는 단백질을 코딩하는 염기서열일 수 있으며, 바람직하게는, 상기 Rad 51 유전자는 서열번호 1의 염기서열, 상기 Rad 52 유전자는 서열번호 2의 염기서열, 상기 Rad 54 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 가질 수 있다.

상기 플라스미드를 줄기세포에 처리함에 따라 형질주입된 줄기세포는 분화 또는 증식함에 따라 발생할 수 있는 DNA 데미지를 수선하는 기능이 강화된다.

상기 DNA 수선은 상동재조합 기전의 활성화에 의한 것으로 형질주입된 상동재조합 핵심 인자에 의해 수행되며, 보다 구체적으로는 형질주입된 Rad51 유전자에서 발현된 Rad51 단백질에 의해 수행되며, Rad52 및 Rad54 단백질은 Rad51의 기능수행에 필수적인 보조인자이다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 줄기세포 내에서 상기 Rad51 유전자, Rad52 유전자, Rad54 유전자의 과발현을 위해서 상기 Rad51 유전자, Rad52 유전자, Rad54 유전자, 및 상기 세 유전자를 한번에 조절할 수 있는 프로모터를 포함하는 유전자 발현 카세트를 제공할 수 있다.

본 발명에서 “과발현”이란 보통상태에서 세포내 해당유전자가 발현되는 수준보다 높은 수준의 발현을 일컫는 것으로써, 유전체 상에 존재하는 유전자의 프로모터를 강력한 프로모터로 치환하거나, 발현벡터에 해당유전자를 클로닝하여 세포에 형질전환시키는 방법을 통해 발현량을 증가시키는 것 등을 포함하는 개념이다.

본 발명에서, 용어 "벡터 (vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가 능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드 (plasmid)" 및 "벡터 (vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다.

본원 명세서에 사용된 용어 "발현 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어 (recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하 게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.

본 명세서 내에서 사용되는 “프로모터”는 형질주입하고자 하는 유전자의 발현을 촉진시키는 것으로서 상기 프로모터에는 전사에 필요한 기본인자(Basal element)뿐만 아니라, 발현의 촉진 및 조절에 사용될 수 있는 인핸서(enhancer)가 더 포함될 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 측면에 따르면 상기 유전자 발현 카세트를 포함하는 재조합 발현 벡터가 제공될 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 측면에 따르면 상기 재조합 발현 벡터를 줄기세포에 처리함에 따라 줄기세포 분화 또는 증식 효율을 촉진하는 방법을 제공할 수 있다.

상기 재조합 발현 벡터를 세포에 처리함에 따라 형질전환된 세포는 분화 또는 증식함에 따라 발생할 수 있는 DNA 데미지를 수선하는 기능이 강화된다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 3개의 플라스미드는 상기 Rad51, Rad52, 및 Rad54 유전자의 발현을 원할하게 하기 위하여 프로모터를 포함할 수 있으며, 상기 프로모터는 통상의 포유류에서 유전자 발현을 촉진하는 것으로 알려진 프로모터일 수 있고, 바람직하게는 CMV(cytomegalovirus) 또는 EF1α(신장인자1알파, Human elongation factor-1 alpha)일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 EF1α일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 EF1α 프로모터는 서열번호 4의 염기서열을 갖을 수 있으나, EF1α 와 동일 또는 유사한 기능을 수행한다면 반드시 이에 제한되지는 않는다.

마찬가지로, 본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 유전자 발현 카세트의 상기 프로모터는 통상의 포유류에서 유전자 발현을 촉진하는 것으로 알려진 프로모터일 수 있으며, 바람직하게는 CMV 또는 EF1α일 수 있고, 더욱 바람직하게는 EF1α일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서는, 배아줄기세포에서는 일반적으로 포유류에서 단백질 발현을 위해 사용되는 전사 촉진제인 상기 CMV보다 상기 EF1α가 더 높은 효율로 전사를 촉진함을 확인하였다(실시예 5 및 도 6 참조).

또한, 본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 줄기세포 분화효율 및/또는 분화속도 촉진방법은 상기 (가)단계 이후 상기 3개의 플라스미드와 양이온성 고분자를 결합시키는 단계를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 줄기세포 내에서 상기 Rad51 유전자, Rad52 유전자, Rad54 유전자의 과발현을 위해서 상기 재조합 발현 벡터와 양이온성 고분자가 결합된 세포내 유전자 전달용 복합체를 제공할 수 있다.

상기 3개의 플라스미드 또는 상기 재조합 발현 벡터와 양이온성 고분자는 서로 전기적 상호작용으로 착물을 형성하여 폴리플렉스(polyplex)를 형성하고, 상기 폴리플렉스는 유전자를 응축하고 외부 환경으로부터 보호할 뿐 아니라, 상기 유전자를 포함하는 플라스미드 또는 벡터를 목적하는 세포 내로의 진입을 용이하게 하고, 세포 내에서 분해되어 재조합 발현 벡터만 핵 내부로 진입하여 전사될 수 있도록 하는 비-바이러스성 유전자 전달체로 기능한다(도 1 참조).

본 발명의 세포내 유전자 전달용 복합체의 유전자 전달 효율은 양이온성 고분자와 유전자의 배합 비율, 즉 복합체 중의 양이온성 고분자의 질소원자와 유전자의 인산염원자의 비(이하, "N/P 비")에 따라 크게 영향을 받는다. N/P 비가 증가하면 유전자를 더 응축시킬 수 있고, 전체적으로 양전하를 띄게 되어 세포 내로 높은 효율로 전달된다. 그러나 N/P 비가 증가하면 독성이 커지는 단점이 있다. 특히, in vivo에서 전달할 때 여러 단백질과 결합하여 발현 효율이 떨어지고 독성이 높아진다.

본 발명의 복합체에 있어서, 복합체의 N/P 비는 목적하는 복합체의 특성에 맞추어 조절이 가능하며, 바람직하게는 5:1 내지 50:1의 범위일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 10:1의 비율일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 배아줄기세포는 고분자와 유전자의 배합비율에 높은 민감도를 나타내며, 상기와 같은 N/P 비율에서 높은 효율로 유전자를 전달함과 동시에 세포독성을 최소화할 수 있다.

본 명세서에서, 상대적 “발현 정도”는 시험 물질을 처리한 세포에서의 상동재조합 인자 유전자의 발현 정도를, 시험 물질을 처리하지 않은 세포에서의 상동재조합 인자 유전자의 발현 정도와 비교하였을 때의 발현 정도일 수 있다. 상기 발현 정도는 발현량 및 발현 질(quality)을 포함할 수 있다. 또한, 발현 정도는, 예컨대, 단백질의 발현 정도를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 양이온성 고분자는 세포형질주입물질로써 당해 기술분야에서 일반적으로 사용되는 양이온성 고분자일 수 있으며, 예를 들어, 폴리에틸렌이민(PEI, polyethyleneimine), 폴리에틸렌아민(PEA, polyethyleneamine), 폴리-L-라이신(PLL), 키토산 등이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 PEI를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 재조합 발현 벡터는 양이온성 고분자 이외에도 LF2K, Xfect 등의 당해 기술분야에서 일반적으로 사용되는 세포형질주입물질로 알려진 물질을 이용하여 리포플랙스(lipoplex) 등을 형성하여 목표하는 세포 내에 유전자를 전달할 수 있다.

한편, LF2K는 유전자 도입 효율이 가장 높고, DNA와 RNA를 모두 도입할 수 있어 광범위하게 사용되며, Xfect는 줄기세포에 특이적으로 사용되는 줄기세포 전용 도입 물질로 알려져 있다. 반면, PEI는 상기 2개의 제품과는 도입 원리가 다르며, 일반적으로 유전자 도입이 매우 수월한 세포에서만 사용된다.

다만, 배아줄기세포는 유전자를 세포 내로 도입하기 어렵고, 그 효율이 낮으며, 유전자 도입 이후에도 세포사멸의 가능성이 높기 때문에, 배아줄기세포에 유전자를 도입하기 위해 본 실시예 4에서는 기존의 유전자 도입 기술과 다른 방법으로 유전자 도입을 수행하였다(도 1 참조).

또한, 본 발명의 다른 측면에 따르면 상기 유전자 전달용 복합체를 줄기세포에 처리함에 따라 줄기세포 분화효율 및/또는 분화속도 촉진하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 측면에 따르면 상기 재조합 발현 벡터 또는 상기 유전자 전달용 복합체를 이용하여 형질전환된 세포주를 제공할 수 있다.

본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환" 또는 “형질주입”은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다.

RA(Retinoic acid)는 줄기세포 성장에 필수적인 요소로 줄기세포의 빠른 분화를 유도하는 것으로써, 본 발명의 일 실시예에서는, 상기 유전자 전달용 복합체를 처리한 줄기세포에서 RA를 처리한 세포, RA를 처리하지 않는 세포와 비교하여 가장 빠른 분화속도 및 높은 분화효율을 나타냄을 확인하여, 분화과정에서 상동재조합 핵심 유전자(Rad51, Rad52, 및 Rad54 유전자)의 지속적인 발현이 분화의 효율 및 속도를 높임을 밝혀냈다(실시예 6 참조).

또한, 본 발명의 다른 측면에 따르면 상기 재조합 발현 벡터 또는 상기 유전자 전달용 복합체를 이용하여 형질전환된 동물을 제공한다. 바람직하게 상기 동물은 포유류이며, 인간을 제외한 포유류일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 배아줄기세포 내에 형질전환된 Rad51, Rad52, 및 Rad54 유전자가 분화과정 동안 지속적으로 발현함에 따라 세포의 분화효율 및 분화속도를 증진시키며, 아울러 줄기세포와 분화된 세포에서 DNA 및 세포 안정성을 유지하는 것에 기여함을 확인하였다(실시예 8 참조).

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부도면을 참조하여 상세히 설명하기로 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다

실시예 1. 실험준비 및 실험벙법

1-1. 분석에 사용된 세포

생쥐배아줄기세포(J1 mouse embryonic stem cell, J1 mES cell)를 10% horse serum (HS)와 glutamate가 포함된 dulbecco modified eagle medium (DMEM) 배지에서 5% CO₂와 100% 습도를 유지하는 37℃ 배포 배양기에서 배양되며, 줄기배포가 분화되는 것을 저해하기 위해 Leukemia inhibitor factor (LIF)를 세포가 자라는 배지 안에 천분의 일 배율로 희석하여 첨가하였다. 배양중인 세포는 2일 간격으로 배지를 교환해주었으며, 분석을 위해 0,05% Trypsin-EDTA를 처리하여 배양접시로부터 떼어내고, 이를 하기 실험에 이용하였다.

1-2. 웨스턴 블롯 분석(Western blot)

생쥐배아줄기세포로부터 단백질을 분리하기 위해 세포 용해액을 세포에 처리한 후 4℃에서 20분 동안 반응시켰다. 이후 4℃에서 13,500rpm 의 속도로 10분간 원심분리하여 배아줄기세포의 단백질을 추출하였다. 추출된 단백질은 BSA를 사용하여 일정한 농도로 맞추어 주고 이를 9% SDS-PAGE Gel을 사용하여 크기별로 나열하였다. Gel상에 나열된 젤은 PVDF membrane으로 옮겨지고 상동재조합 핵심 인자에 특이적으로 반응하는 항체이용하여 항원-항체 반응을 시켰다. 항체가 부착된 membrane은 단백질 검출 기계를 사용하여 단백질 발현량을 확인하였다.

1-3. Real-time PCR 분석

Real-time PCR (Polymerase Chain Reaction) 분석을 위해 준비된 RNA를 cDNA로 합성하였다. 합성을 위해 Enzynomics사의 reverse transciptase를 사용하였고 회사에서 제공하는 표준 방법을 준수하여 합성하였다. 합성된 cDNA는 상동재조합 핵심 유전자의 염기서열에 맞춘 Primer 한 쌍과 Thermo fisher사의 Maxima SYBR Green 시약과 반응시켰다. 반응된 물질은 Thermo fisher사의 QuantStudio 6 Flex Real-time PCR 기계를 사용하여 분석하였다.

1-4. 알칼리성 인산가수분해효소 염색(Alkaline Phosphatase staining)

생쥐배아줄기세포의 분화 정도를 확인하기 위해 줄기세포의 마커로 많이 사용되고 있는 알칼리성 인산가수분해효소 염색을 수행하였다. 세포는 Millipore사에서 제조한 Alkaline Phosphatase (AP) 염색 키트를 사용하였고, 제조사에서 권장하는 표준 방법에 의하여 세포를 염색하였다.

1-5 Retinoic Acid (RA)

Retinoic Acid (RA)는 줄기세포의 빠른 분화를 유도하는 물질로써, 일반적으로 배양하는 줄기세포의 분화되는 속도보다 RA를 처리하는 세포에서의 분화속도가 상대적으로 빠르다. RA는 비타민 A 대사 물질이며 초기 줄기세포 성장에 있어 필수적인 요소이다.

실시예 2. 플라스미드와 DNA/PEI 복합체 제조방법

2-1. 플라스미드 유전자 발현 벡터의 제조

Invitrogen으로부터 구입한 pcDNA3.1(+) 벡터에는 포유류에서 발현 가능한 Cytomegalovirus (CMV) 촉진유전자(Promoter)를 가지고 있지만, 도 2 내지 도 7에 나타낸 바와 같이, 배아줄기세포에서 발현 효율을 증가시킬 수 있는 EF1α 촉진유전자의 염기서열과 이를 통해 발현하는 상동재조합 유전자 발현 부위인 cording sequence (CDS)를 삽입하였다. EF1α와 상동재조합 유전자 염기서열은 Polymerase Chain Reaction (PCR)을 통해 해당 염기서열을 증폭시킨 후 유전자 발현 벡터의 Multiple Cloning Site (MCS) 부위를 제한효소로 잘라 증폭된 산물을 잘려진 부위에 연결효소 (ligase)를 사용하여 붙여 해당 유전자가 EF1α을 통해 발현하게 하였다.

2-2. DNA/PEI 복합체의 제조

Polysciences (cat# 23966-2)사 로부터 구입된 PEI 분말 10mg을 1차 증류수 1㎖에 넣고 70℃의 항온수조에서 PEI를 녹였다. DNA/PEI 복합체의 세포 내 도입 효율을 높이기 위해 염산 (HCL)을 넣어 최종 pH 7.0을 맞추고, 세포 독성을 최소화 하기 위해 0.22μM 거름망 (filter)에 3번 반복하여 거른 후 -20℃에서 보관하였다. 이 후 상기 실시예 2-1에 의해 제조된 플라스미드 DNA (2㎍)와 PEI (20㎕)를 영양성분이 들어있지 않은 세포 배지인 DMEM (300㎕) 에 섞은 후 상온에 15분간 배양시켜 DNA/PEI 복합체를 생성하였다.

실시예 3. 생쥐배아줄기세포로의 유전자 도입

상기 실시예 2-1의 방법으로 제조된 Rad51, Rad52, Rad54 유전자를 각각 삽입한 pcDNA3.1-EF1α를 상기 실시예 2-2의 방법으로 폴리에틸렌이민(Polyethylenimine, PEI)과 결합시킨 DNA/PEI 복합체를 사용하여 생쥐배아줄기세포에 도입하였다. 구체적으로, 세포가 분열함에 따라 서로 뭉쳐 자라는 경향을 가진 배아줄기세포의 특성상 오래 동안 배양되면 세포가 커지고, 세포 덩어리 안쪽에 위치하고 있는 세포들은 유전자 도입의 효율이 매우 감소함으로, 유전자 도입의 효율을 최대화하기 위해 배아줄기세포는 계대배양한 후 6~8시간 사이의 세포를 사용하였다. 아울러, 기존에 유전자 도입에 사용하는 0.1% Gelatin 대신 0.2%의 농도로 코팅한 배양접시를 사용하여 6시간 이내로 세포를 배양접시에 붙게 하여 최대한 개별 세포 (single cell) 상태에 있는 배아줄기세포에 유전자를 도입하였다. 영양배지에서 배양한 배아줄기세포를 분리하여 영양성분이 없는 DMEM 배지에 옮기고 15분간 배양한 후 상기 DNA/PEI 복합물질을 배지에 접종하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간 배양하였다. 배양 후 유전자 도입이 완료된 배아줄기세포를 수거하여 분석에 사용하였다. 유전자 도입 24 시간 후 각각 1, 3, 5일 동안 배양된 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 웨스턴 블롯 방법을 이용하여 상동재조합 핵심 인자와 줄기세포 분화 정도를 나타내는 단백질인 Oct3/4의 발현 정도를 측정하였다. 또한, 같은 방법으로 유전자를 도입한 세포는 각각 1, 3, 5 일 별로 Alkaline Phosphatase staining (AP) 염색을 통한 세포분화효율을 측정하였다.

실시예 4. 세포형질주입물질에 따른 유전자 발현 효율 비교

유전자 도입 물질(세포형질주입물질)인 LF2K (Lipofectamine 2000), Xfect, 및 PEI을 이용하여 생쥐배아줄기세포에 V5 유전자 도입을 수행하였다. 효율확인을 위해 도입할 DNA의 양 (2㎍)과 세포의 양 (2x10⁵ cells/㎖)은 동일한 조건에서 이루어졌다. LF2K와 Xfect는 제조사에서 권장하는 방법을 준수하여 수행하였고, PEI는 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 수행하였다. 도입 24시간 이후 단백질을 추출할 수 있는 용액을 사용하여 회수된 세포로부터 수용액 상태의 단백질을 얻고, 상기 방법으로 획득된 단백질은 Bradford 분석을 통해 각 농도를 정량하였다. 웨스턴 블롯 분석에 사용된 단백질 농도는 모두 30㎍이고, 동일한 농도의 단백질 시료들은 아크릴아마이드 젤 (Acrylamide Gel)에서 Polyvinylidene Fluoride (PVDF) 멤브레인으로 옮겨진 후, V5에 특이적인 항체를 이용하여 항원-항체 반응이 충분히 일어나도록 하였다. V5에 특이적인 항체가 멤브레인에 결합하고, 결합한 항체에 특이적으로 붙는 2차 항체를 충분히 붙여 발광반응을 통해 멤브레인에 붙어있는 V5 유전자의 발현정도를 관찰하였다. 이후 노출시간을 10초 (도 8의 왼쪽 패널) 120초(도 8의 오른쪽 패널)로 하여 케미닥 (chemidoc)을 이용하여 촬영하였다. 탐지의 목적 유전자인 Rad52-V5의 염기서열의 길이는 총 1363bp로써 단백질 크기로 환산하면 약 50kDa의 크기를 가지므로 50kDa 부근에서 밴드가 관찰되었다. 이에 따라, Rad52가 세포 내부에서 지속적으로 발현함을 간접적으로 확인할 수 있었다. Ctrl은 유전자 도입물질을 넣지 않은 표본을 나타내며 유전자 도입물질의 효율을 비교하기 위한 기준을 나타낸다.

그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, Xfect의 실험 조건에서는 배아줄기세포에 유전자 도입이 되지 않았으며, LF2K에서 낮은 효율의 유전자 도입을 확인하였다. 반면, PEI를 사용한 유전자 도입은 배아줄기세포에서 매우 효과적으로 작용하여 발현하는 것을 확인할 수 있었다. 구체적으로, 10초 촬영에서 유전자 도입 물질 중 PEI만이 유일하게 배아줄기세포로 유전자를 도입했고 정상적으로 발현함을 확인하였다(도 8 왼쪽 패널). 또한, PEI 이외에 다른 유전자 도입 물질 중 효율이 낮아 검출을 못하는 상황을 고려하여 120초 촬영을 진행한 결과, LF2K는 낮은 효율로 유전자 도입과 발현이 확인되었고 Xfect는 유전자 도입이 이루어지지 않은 것을 확인하였다 (도 8 오른쪽 패널).

실시예 5. 전사 촉진제(promoter)에 따른 유전자 발현 효율 비교

EF1α와 다른 전사 촉진제의 단백질 발현 효율을 확인하기 위해 동일한 벡터(vector)에 EF1α와 CMV를 각각 삽입하였고, 상기 실시예 4에서 사용한 PEI 유전자 도입 물질을 사용하여 상기 실시예 4의 방법으로 세포에 도입 후 발현되는 단백질 양을 확인하였다. 각 시료별 농도를 측정하기 위해 Bradford 방법을 사용하여 각 단백질의 농도를 측정한 후 30㎍의 동일한 농도로 실험을 진행하였다. 본 실시예에서 Rad51은 각 전사촉진제의 효율을 확인하기 위해 표본 단백질로 사용되었으며, β-actin은 세포의 내/외부적인 자극 또는 다양한 환경의 변화에도 일정한 발현량을 유지하기 때문에 단백질의 양을 정량하는 척도로써 사용되었다. 즉, β-actin이 적다는 것은 해당 라인에 단백질이 덜 들어갔다는 것을 의미하고, β-actin과 Rad51의 상대적인 발현량을 계산하여 상기 프로모터의 효율을 비교 확인하였다. 정확한 발현량을 계산하기 위해 (도 9 왼쪽 패널)의 Rad51과 β-actin의 밴드를 Image J 프로그램을 통해 정량하였다. 밴드의 색이 진할수록 높은 값을 나타내며 밴드의 강도에 따라서 (도 9 왼쪽 패널)의 실험에서 Rad51과 β-actin의 밴드 값을 수치화하였다(도 9 오른쪽 패널). 하지만, 단백질의 양을 정량하는 척도로 사용되는 β-actin의 값에 차이가 발생할 수 있으므로 발현 값을 비교하고자 하는 대상 (Rad51)을 β-actin으로 나누어 β-actin의 값을 동일하게 맞춘 후 Rad51의 값을 비교하였다.

그 결과, 도 9의 왼쪽 패널에서 나타낸 바와 같이, β-actin 이 가장 낮음에도 불구하고 EF1α에 의해서 발현되는 Rad51 단백질의 양이 매우 많음을 확인 할 수 있었다. 또한, 도 9의 오른쪽 패널에서 나타낸 바와 같이, 각 조건에서 PEI를 20㎕ 사용하였을 경우 단백질 발현 효율은 CMV는 ctrl과 비교하여 약 2배, EF1α는 CMV와 비교하여 약 4.2배 높음을 확인할 수 있었다.

상기 결과에 따라, PEI를 사용하여 배아줄기세포로의 효과적인 유전자 도입이 가능하고, 도입 후 EF1α프로모터에 의한 높은 단백질 발현을 유도하여 배아줄기세포가 5일동안 분화하는 과정 동안 상동재조합 핵심 유전자의 발현을 지속적으로 증가시키고 유지시킬 수 있음을 시사한다.

실시예 6. 생쥐배아줄기세포에서의 생동재조합 핵심 인자 발현 확인

Oct3/4는 줄기세포의 전분화능을 판별할 수 있는 표지 단백질이며, 전분화능을 가진 세포에서만 특이적으로 발현한다. 따라서, 상동재조합 핵심 인자의 발현에 따른 분화효율 및 분화속도에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 분화과정 동안의 RA 미처리구, RA처리구, 및 상동재조합 인자 (Rad51, Rad51+Rad52, Rad51+Rad54, 및 Rad51+Rad52+Rad54)가 도입된 실험구의 세포 분화과정에서 Oct3/4의 발현정도를 분석하였다.

그 결과, 도 10 에 나타낸 바와 같이, RA를 처리하지 않은 세포에서 Oct3/4의 발현 값은 배양 일에 따라 각각 1일 (100%), 3일 (71%), 5일 (12%)로 감소하였다. RA처리구에서 Oct3/4의 발현 값은 RA 미처리구와 비교하여 각각 1일 (74%), 3일 (49%), 5일 (9%)로 분화가 가속화 되며, 같은 조건에서 상동재조합 유전자가 도입된 세포에서는 (Rad51 + Rad52 조건) RA 미처리구와 비교하여 각각 1일 (53%, 2.08배), 3일 (24%, 3.53배), 5일 (5%, 3.18배)로 가장 빠른 속도로 분화하였다. 상기 결과는, 분화과정에서 상동재조합 핵심 유전자의 지속적인 발현은 분화의 효율성을 높여줌을 시사한다.

또한, 도 11에 나타낸 바와 같이, 세포의 배양 일수가 길어질수록 세포질에서 분해되는 단백질이 많아지기 때문에 상동재조합 유전자의 발현은 감소하였고, 일반적인 세포 상태 (RA -)에서 5일 동안 세포를 배양했을 때 Rad51과 Rad54의 발현은 1일 대비 각 41%, 60% 감소하였다. 또한, RA를 처리하여 세포 분화를 가속화시킨 상태에서는 그 감소폭은 더 빠르게 진행되었다. 하지만 Rad51, Rad52, Rad54가 도입된 세포는 5일의 배양 기간 동안 발현이 감소하지 않으며 오히려 증가한다는 점을 확인하였다. 구체적으로, RA 미처리구와 비교했을 때 5일째 Rad51과 Rad54의 발현량은 각각 2.03배, 2.4배 증가하였다.

상기의 결과는 본 발명의 세포내 유전자 전달용 복합체가 세포의 사멸 없이 안정적으로 작용할 수 있다는 것과 핵심 유전자들이 지속적으로 발현하게 하여 배아줄기세포의 분화속도 조절에 기여한다는 가설을 지지하는 데이터이며, 이를 통해 세포의 분화 동안 핵심 유전자의 지속적 발현이 세포 안정성을 유지할 수 있도록 한다는 점을 시사한다.

실시예 7. 생쥐배아줄기세포 분화 계통 마커 발현 확인

배아줄기세포의 네 가지 계통 (외배엽-Ectoderm, 중배엽-Mesoderm, 내배엽-Endoderm, 영양외배엽-Trophectoderm)에서 분화 마커로 대표되는 유전자(Nestin, VE-cadherin, Gata4, Cdx2)를 각 하나씩 선정하고, 생쥐배아줄기세포의 계통에 따른 분화 마커 단백질을 Real-time PCR을 통해 발현 정도를 확인하였다.

그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, 분화 마커는 분화되는 세포가 증가할수록 그 발현량이 증가하는데, Rad51과 Rad52이 분화과정동안 감소하지 않고 계속 발현하고 있을 때의 조건 (5일)에서 각각의 유전자들을 Normal condition (5일)과 비교하였을 때 도 13의 왼쪽 상단부터 순서대로 (시계방향) 45.2배, 19배, 39.4배, 20.4배 증가함을 보였다. 또한, Rad51 단독으로만 발현이 유지되고 있는 조건과 비교했을 때 2.36배, 2.11배, 2.41배, 2.31배로 상동재조합에 필요한 핵심 유전자 모두가 지속적으로 발현하고 있을 때 가장 분화 효율이 높은 것으로 확인되었다.

실시예 8. AP 세포 염색을 통한 분화효율 확인

Retinoic Acid (RA)를 처리하여 자발적인 분화를 유도한 세포에서 상동재조합 핵심 유전자를 세포안으로 도입했을 때 변화하는 세포의 형태와 세포 염색을 통한 분화속도를 확인하였다. 분화하지 않은 배아줄기세포는 분화된 세포와 비교하여 높은 수치로 Alkaline phosphatase (AP)를 발현하는 특징을 가지고 있다. AP란 물질에서 인산기 (phospatate)를 떼어내는 작용을 하는 효소를 말한다. 이런 특성을 고려하여 AP염색을 통해 세포 분화속도를 확인하였다. 분화하지 않은 세포는 AP의 발현량이 많기 때문에 AP염색을 통해 세포의 색이 붉게 염색되며, 반대로 분화하는 세포가 많아지면 AP 발현량이 줄어들고 그에 따라 AP염색으로 인한 붉게 염색되는 세포의 수는 줄어들 것이다.

그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, 1일째 모든 세포는 AP염색을 통해서 염색되는 세포의 비율에 높은 차이가 나타나지 않았다. 이는 1일째의 배아줄기세포에서의 전분화능(pluripotency) 이 비슷하게 유지되고 있다는 것을 의미한다. 배양 후 3일 이후부터 세포의 모양과 AP를 발현하는 세포의 수가 현저히 감소하였다. Rad51+Rad52 또는 Rad51+Rad52+Rad54가 분화동안 계속 발현되고 있는 조건에서 세포의 모양은 기존 동그란 모양이 아닌 분화하여 바닥에 붙어 뻗어있는 세포의 모양으로 변하였다. 또한, AP염색을 통해 염색된 세포의 수가 다른 조건에 비하여 현저히 줄어드는 양상을 보였다. 또한, 5일째의 Rad51+Rad52 또는 Rad51+Rad52+Rad54 조건에서 세포의 모양은 3일째의 분화하는 세포의 형태가 아닌 완전히 분화되어 있는 모습을 보였으며, 동시에 AP염색이 된 세포는 배양 일수 또는 다른 조건에 비하여 월등히 감소하였다.

또한, 상기 AP 염색 후 염색된 정도(밝기 수준)에 따라 측정된 값을 수치화하여 도 12에 나타내었다. 상기 AP염색정도는 AP 염색을 통해 진한 갈색 또는 보라색을 나타낸 세포에 높은 정량 값으로, 염색의 강도가 진한 갈색에서 점차 배경색 (회색)과 비슷해 질수록 낮은 정량 값으로 수치화하였다. 즉, 염색의 강도가 낮아질수록 AP를 발현하는 세포가 감소하는 것을 의미하며 이것은 세포의 분화비율이 높다는 증거가 된다. 각 조건당 측정된 세포의 수는 80개이며 모든 세포의 염색 강도를 측정한 후 가장 높은 것과 낮은 염색 강도 값이 기준으로 잡아 계산하여, 각 조건 당 염색 강도의 평균값을 나타내었다.

그 결과, 도 14에 나타난 바와 같이, AP 염색 대조군으로 사용된 Empty vector 조건과 비교하였을 때, 대조군 (RA(-), Empty vector)는 각 배양 일수에 따라 1일 53.3%, 3일 50.4%, 5일 41.3%의 AP 염색 효율을 보인 반면 상동재조합 핵심 유전자가 모두 도입된 실험군에서는 각 1일 37.4%, 3일 25.8%, 5일 11% 로 5일 기준 상동재조합 유전자가 모두 도입되었을 때 약 30% 이상의 가장 높은 분화효율을 나타내었다.

상기 결과는 상동재조합 핵심 유전자인 Rad51, Rad52, 및 Rad54를 배아줄기세포 분화과정 동안에 지속적으로 발현 유지시킴으로써 세포의 분화효율과 속도를 증진시키며 이를 통해 줄기세포와 분화된 체세포에서 세포 안정성 유지하도록 돕는 다는 점을 시사한다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Method of promoting stem cell differentiation efficiency <130> MP17-150 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1020 <212> DNA <213> mammalian <400> 1 atggctatgc aaatgcagct tgaagcaagt gcagatactt cagtggaaga agaaagtttt 60 ggtccacagc ctatttcacg gttagagcag tgtggcataa atgccaatga tgtgaagaaa 120 ttagaagaag ccggttacca tacagtggag gctgttgctt atgcaccgaa gaaggaacta 180 ataaatatta agggaattag tgaagccaaa gctgacaaaa ttctgactga ggcagcaaaa 240 ttggttccaa tgggtttcac cacggcaact gagtttcacc agcgccggtc agagatcata 300 cagataacta ctggctccaa agagctggac aagctgcttc aaggtggaat tgagactgga 360 tctatcacag agatgtttgg agaattccga actgggaaga cacagatctg tcatacgttg 420 gctgttacat gccagctccc cattgaccgt ggtggaggtg aagggaaggc catgtacatt 480 gacaccgagg gcacctttag gccggagcgg ctgctagcag tagctgagag atacggtctc 540 tctggcagcg atgtcctaga taatgtagca tatgcgcgag ggttcaacac agaccaccag 600 acccagctcc tttaccaagc gtcagccatg atggtagaat ccaggtatgc actgcttatt 660 gtagacagtg ctactgccct ttacagaaca gactactcag ggcggggaga gctttcagcc 720 aggcaaatgc atttggccag atttctgagg atgctgcttc gacttgctga tgagtttggt 780 gtcgcagtgg taatcaccaa ccaggtagta gcccaagtag atggagcagc catgttcgct 840 gcagatccca aaaaacccat tggagggaac atcatcgctc atgcgtcaac caccaggctg 900 tacctgagaa aaggaagagg ggagaccaga atctgcaaaa tctatgactc tccctgtctt 960 cctgaagctg aagctatgtt tgccattaat gcagatggag tgggcgatgc caaagactga 1020 1020 <210> 2 <211> 1284 <212> DNA <213> mammalian <400> 2 atggctgggc ctgaagaagc agtccacaga gggtgtgaca accatcctcc ctttgttggt 60 gggaagtctg tgctcctctt tggacagagc cagtatacag cggatgaata ccaggccatc 120 cagaaagctc tgagacagag actgggtcca gagtacatta gcagccgcat ggctggagga 180 ggtcagaagg tgtgttatat tgaaggtcat cgggtaatta atctggccaa tgagatgttt 240 ggttacaatg gctgggcaca ctccatcacc cagcaaaatg tggattttgt tgacctcaac 300 aatggcaagt tctacgtggg agtctgtgca tttgtaaagg tgcagttaaa ggatggttcc 360 tatcatgagg acgtgggcta tggagttagt gagggcctcc gttcaaaggc cttgtcactg 420 gagaaggcca ggaaggaggc tgtgactgat gggctgaagc gagcactcag gagttttggg 480 aatgcacttg gaaactgtat tctggacaaa gactatctga ggtcactaaa taagcttcca 540 cgacagctcc ctcttgatgt ggatttaact aaaacaaaga gagaagattt tgaaccatct 600 gtagaacagg caagatacaa cagctgccga cagaatgaag cattgggact ccccaaacca 660 caggaagtga cttccccttg cagatcaagc cccccacatg actcgaacat taagcttcag 720 ggggctaagg acatcagcag ctcctgcagt ctggccgcca ccttggagag tgacgccact 780 caccagagga agctccggaa gctccggcag aagcagctcc agcagcagtt ccgggaacag 840 atggagactc gccggcagag ccatgcacct gccgaagagg tggcagccaa gcatgcggca 900 gtacttccag cccctccaaa acacagcacc cctgtaactg cagcctcaga actcctccag 960 gagaaagtcg tctttccaga taaccttgaa gagaaccttg aaatgtggga ccttactcca 1020 gacttagagg acatcattaa gcccttgtgt agagcagaac cagcccaaac ttctgccact 1080 cgaaccttca acaaccagga cagcgtccca catatccatt gccatcagaa accacaagaa 1140 aagcctggac ctgggcacct gcagacctgc aacaccaacc agcatgttct aggtagcaga 1200 ggtgtgtgga agaatgaaag ttctgggttt aattctttaa catgtaaagg aaaggtgcta 1260 gttcatttta agacgctgac ttaa 1284 <210> 3 <211> 2050 <212> DNA <213> mammalian <400> 3 atgaggagga gcttagctcc cagccagttg gccaggagga aaccagaaga cagatcatca 60 gatgatgaag actggcagcc tgggacagta actcctaaga aacgcaagtc cagcagtgag 120 acccaggtcc aggagtgttt cctgtctcct tttcggaagc ccttgactca gctactcaac 180 cggccacctt gtctggatag cagtcaacat gaagcattta ttcgaagtat tttgtcaaag 240 cctttcaagg tccccatccc aaattatcaa ggtcccctgg gctctcgtgc attgggcctg 300 aaaagggttg gagttcgtcg tgcccttcat gaccctctgg aagaaggtgc cttggttctc 360 tatgagcctc ccccactcag cgcccatgac caactgaagc ttgacaagga aaaactccct 420 gttcatgtgg ttgttgatcc tattctcagt aaggtattgc ggcctcatca gagagaggga 480 gtgaagttcc tatgggagtg tgtcaccagt cgtcgaattc ctggaagcca tggctgcatc 540 atggctgatg agatgggcct ggggaagaca ctgcagtgca tcacattgat gtggacactt 600 ttacgccaga gcccagaatg caagccagaa atcgagaagg cagtggtggt gtcaccttct 660 agcctggtga agaactggta caatgaggtt gagaaatggc ttggagggag gattcaacct 720 ctggccatcg atggaggctc gaaggacgag atagaccgaa aactggaagg attcatgaac 780 cagcgtggag ctagagtgcc ttcccccatc ctcatcattt cctatgagac tttccgcctg 840 catgttggag ttcttaaaaa aggaaatgtt ggactggtca tatgtgacga gggccacagg 900 ctaaagaact ctgagaatca gacttaccag gctctggaca gcttgaatac cagccggcgg 960 gtgctaatct ccgggacccc catccaaaat gatttgctgg agtatttcag cttggtgcac 1020 tttgtaaatt ctggcatttt gggaactgcc catgaattca agaagcattt tgagttgcca 1080 attttgaaga gtcgagatgc agctgccagt gaggcagaca ggcagcgtgg ggaggagcgt 1140 ctgcgggagc tcatcggtat tgtgaacagg tgcctgatac ggagaacatc tgatatcctc 1200 tctaagtatc tgcccgtgaa gattgagcag gtggtttgtt gtaggctgac accccttcaa 1260 actgagctat acaagagatt tctgagacag gctaagcctg aagaagaatt gcgtgagggc 1320 aagatgagtg tgtcttccct gtcttctatc acctctctaa agaagctgtg taatcatcca 1380 gctctaatct atgacaagtg tgtggcagag gaggatggct ttgagggcac tttgggtatc 1440 ttcccacctg gttataactc taaagctgta gagccacagt tgtcaggtaa gatgctggtc 1500 cttgattaca ttctggccgt gactcgaagc cgtagcagtg acaaagtcgt gctggtgtct 1560 aattatactc agacattgga tctctttgaa aagctgtgcc gggttcgaag gtacttgtat 1620 gttcgcctgg atggcacgat gtccattaag aagcgagcca aggttgtgga gcgcttcaat 1680 agcccatcga gccctgattt tgttttcatg ctgagcagca aagctggggg ctgtggtctt 1740 aacctcattg gtgctaaccg actggtcatg tttgatcctg actggaatcc agccaatgat 1800 gaacaagcta tggcccgagt ctggcgtgat ggtcaaaaga agatctgcta tatctaccga 1860 ctgctatctg caggaacaat tgaggagaag atctttcagc ggcagagcca caagaaggct 1920 ctgagcagct gtgtggtgga cgaggagcag gatgtggagc gccacttttc tcttggtgag 1980 cttaaagagc tgtttactct ggatgaagca agcctcagtg acacacatga cagattgcat 2040 tgccgcctga 2050 <210> 4 <211> 1184 <212> DNA <213> mammalian <400> 4 cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 60 tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg 120 aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180 gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 240 gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 300 gaattacttc cacctggctg cagtacgtga ttcttgatcc cgagcttcgg gttggaagtg 360 ggtgggagag ttcgaggcct tgcgcttaag gagccccttc gcctcgtgct tgagttgagg 420 cctggcctgg gcgctggggc cgccgcgtgc gaatctggtg gcaccttcgc gcctgtctcg 480 ctgctttcga taagtctcta gccatttaaa atttttgatg acctgctgcg acgctttttt 540 tctggcaaga tagtcttgta aatgcgggcc aagatctgca cactggtatt tcggtttttg 600 gggccgcggg cggcgacggg gcccgtgcgt cccagcgcac atgttcggcg aggcggggcc 660 tgcgagcgcg gccaccgaga atcggacggg ggtagtctca agctggccgg cctgctctgg 720 tgcctggcct cgcgccgccg tgtatcgccc cgccctgggc ggcaaggctg gcccggtcgg 780 caccagttgc gtgagcggaa agatggccgc ttcccggccc tgctgcaggg agctcaaaat 840 ggaggacgcg gcgctcggga gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg aaaagggcct 900 ttccgtcctc agccgtcgct tcatgtgact ccacggagta ccgggcgccg tccaggcacc 960 tcgattagtt ctcgagcttt tggagtacgt cgtctttagg ttggggggag gggttttatg 1020 cgatggagtt tccccacact gagtgggtgg agactgaagt taggccagct tggcacttga 1080 tgtaattctc cttggaattt gccctttttg agtttggatc ttggttcatt ctcaagcctc 1140 agacagtggt tcaaagtttt tttcttccat ttcaggtgtc gtga 1184

Claims (8)

1. 하기 단계를 포함하는 줄기세포 분화 효율 촉진 방법:
   (가) Rad51 유전자를 포함하는 플라스미드, Rad52 유전자를 포함하는 플라스미드, 및 Rad54 유전자를 포함하는 플라스미드를 제조하는 단계; 및
   (나) 상기 3개의 플라스미드를 줄기세포에 처리하는 단계.
2. 제1항에 있어서,
   상기 Rad 51 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 분화 효율 촉진 방법.
3. 제1항에 있어서,
   상기 Rad 52 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 분화 효율 촉진 방법.
4. 제1항에 있어서,
   상기 Rad 54 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 분화 효율 촉진 방법.
5. 제1항에 있어서,
   상기 3개의 플라스미드는 각각 신장인자1알파(EF1α) 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 분화 효율 촉진 방법.
6. 제5항에 있어서,
   상기 신장인자1알파(EF1α) 프로모터는 서열번호 4의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 분화 효율 촉진 방법.
7. 제1항에 있어서,
   상기 줄기세포 분화 효율 촉진 방법은 (가)단계 이후 상기 3개의 플라스미드와 양이온성 고분자를 결합시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 분화 효율 촉진 방법.
8. 제7항에 있어서,
   상기 양이온성 고분자는 폴리에틸렌이민(PEI)인 것을 특징으로 하는, 줄기세포 분화 효율 촉진 방법.

Images