CN111065732A - 肿瘤类器官模型 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种产生在非癌组织中生长的癌症人工3D组织培养物的方法，所述方法包括下述步骤：提供多能干细胞或祖细胞的聚集体，在3D生物相容性基质中培养和扩增所述细胞，其中使所述细胞分化以便将所述聚集体发展成所需尺寸的组织培养物；其中在任何所述步骤期间或在组织培养中通过表达癌基因和/或通过抑制肿瘤抑制基因使所述细胞的至少一部分经历致癌作用，并且还包括使得具有表达的癌基因或抑制的肿瘤抑制基因的所述细胞发展成癌细胞的步骤；药物筛选方法；溶瘤病毒筛选方法；3D组织培养物；和用于进行本发明的方法的试剂盒。

Description

肿瘤类器官模型
本发明涉及在体外生长的人工组织模型领域。
背景技术
恶性脑肿瘤是毁灭性最强的癌症之一，其存活率几乎可以忽略不计，几十年来一直没有改善。由于巨大的遗传学(McLendon等，2008,Nature,455,1061-8)和形态学(Louis等，2016,Acta Neuropathol,131,803-20)异质性，使得开发适宜的脑癌模型和有效疗法存在挑战性。此外，人和啮齿动物大脑之间明显的形态和生理差异限制了适当动物模型的发展(Lui等，2011,Cell,146,18-36)。人脑癌细胞系以及2D培养的癌症干细胞(Hu等，2016,Cell,167,1281-1295.e18)充当了替代模型，但是其没有囊括3D肿瘤环境。
类器官培养模型的最新发展为直接在人体组织中模拟疾病开辟了新途径。其包括成体干细胞(ASC)的器官再生(Sato等，2009,Nature,459,262-5)或多能干细胞(PSC)的器官发育(Kelava和Lancaster,2016,Cell Stem Cell,18,736-48)，以非常精确的方式在组织学和生理学上类似于器官的类器官(Lancaster和Knoblich,2014,Science,345,1247125)。
US 2014/302491 A1涉及一种用于哺乳动物组织长期培养的培养系统。
Xiaolei等，Cell Stem Cell 18(1)(2016):25-38是一篇对基于干细胞的类器官的综述。
WO 00/75286 A2描述了多种癌症组织的体外3D模型，可以将其用于筛选应用。
Ridder等，International Journal of Cancer Research and Treatment 17(6B)(1997)涉及脑肿瘤球状体，其附着在人皮肤球状体上以检测肿瘤的侵袭性。
Nygaard等，Journal of Neurosurgery 89(3)(1998):2843-2857描述了与大鼠脑聚集体共培养的胶质母细胞瘤球状体。
Zhu等，The Journal of Experimental Medicine 214(10)(2017):2843-2857描述了寨卡病毒对胶质母细胞瘤的溶瘤作用。
Wang等，PLOS ONE 9(4)(2014):1描述了研究3D类器官作为疾病进展模型。
已将类器官用于模拟多种人类疾病(Johnson和Hockemeyer,2015,Curr OpinCell Biol,37,84-90)，包括癌症(Neal和Kuo,2016,Annu Rev Pathol)。对于ASC衍生的肿瘤类器官，可以通过使用基因修饰的ASC(Barker等，2009,Nature,457,608-11；Drost等，2015,Nature,521,43-7；Matano等，2015,Nature Medicine,21,256-62)或原发肿瘤(Boj等，2015,Cell,160,324-38)作为初始材料来实现。然而，对于PSC衍生的类器官，这种方法是困难的，因为这些类器官的生长要求通常与成年肿瘤细胞不相容，否则将对其施加选择性压力。
因此，仍然存在一个产生改进的癌症模型培养物的目标，特别是癌症的3D培养物，以及特别是模拟与体内癌症特别相似的癌症体外培养物的其他特征。
发明内容
特别地，本发明的目的是再现癌症发展过程在现实生活中的情况。通过在类器官中引入肿瘤发生以及正常、非癌组织的发育解决了这一目标。
本发明提供了一种产生在非癌组织中生长的癌症人工3D组织培养物的方法，所述方法包括下述步骤：提供多能干细胞或祖细胞的聚集体，在3D生物相容性基质中培养和扩增所述干细胞或祖细胞，其中使所述细胞分化以便将所述聚集体发展成所需尺寸的组织培养物；其中在任何所述步骤期间或在组织培养中通过表达癌基因和/或通过抑制肿瘤抑制基因使所述细胞的至少一部分经历致癌作用，并且还包括使得具有表达的癌基因或抑制的肿瘤抑制基因的所述细胞发展成癌细胞的步骤。
本发明的方法还用于检测未知基因，而不是一种或多种(已知)的癌基因或肿瘤抑制基因。培养物还可以用于检测候选试剂的潜在致癌作用。因此，本发明还提供了一种筛选一种或多种候选基因或试剂对致癌作用的影响的方法，所述方法包括产生人工3D组织培养物，所述方法包括下述步骤：提供多能干细胞或祖细胞的聚集体，在3D生物相容性基质中培养和扩增所述干细胞或祖细胞，其中使所述细胞分化以便将所述聚集体发展成所需尺寸的组织培养物；其中在任何所述步骤期间或在组织培养中通过表达或抑制所述候选基因或通过使用所述候选试剂处理所述细胞使所述细胞的至少一部分经历致癌作用，并且还包括在使得其表达或抑制候选基因以发展成癌细胞的条件下培养所述细胞的步骤。
本发明还提供了人工3D组织培养物，例如类器官，其包含非癌组织和癌组织。在人工3D组织培养物中，优选癌组织过表达一种或多种癌基因和/或一种或多种肿瘤抑制基因被抑制(例如，表达或活性)，其中优选地与非癌组织相比，在癌组织中除所述癌基因或肿瘤抑制基因以外的其他基因的基因表达基本上未被修饰，其中所述组织(i)是可以通过根据本发明的方法获得的；和/或(ii)至少在所述癌组织的细胞中包含转基因或用于抑制肿瘤抑制基因的构建体；和/或(iii)包含3D生物相容性基质，优选凝胶、胶原凝胶或水凝胶。
还提供了一种检测候选化合物的致癌作用或其对癌组织的影响的方法，所述方法包括将在本发明方法中的细胞或组织与候选化合物接触或者将本发明的组织与候选化合物接触，并且保持对所述接触的组织进行培养，并观察与未与所述候选化合物接触的所述组织相比在所述组织中的任何改变。同样地，本发明提供了将本发明方法中的组织或细胞暴露于某种条件下，而不是将其与候选化合物接触。此类条件可以是例如升高的温度，受限的或增加的营养素或者改变的氧化还原电位，癌细胞可以对其做出反应并显示出不同的行为或生长速率。
还提供了一种检测候选溶瘤病毒的致癌作用或其对癌组织的影响的方法，所述方法包括将在本发明方法中的细胞或组织与候选溶瘤病毒接触或者将本发明的组织与候选溶瘤病毒接触，并且保持对所述接触的组织进行培养，并观察与未与所述候选溶瘤病毒接触的所述组织相比在所述组织中的任何改变。同样地，本发明提供了将本发明方法中的组织或细胞暴露于某种条件下，而不是将其与候选溶瘤病毒接触。此类条件可以是例如升高的温度，受限的或增加的营养素或者改变的氧化还原电位，癌细胞可以对其做出反应并显示出不同的行为或生长速率。
在一个进一步的方面，本发明提供了用作药物(特别是溶瘤病毒)的寨卡病毒。特别提供了用于治疗神经系统癌症的寨卡病毒。与之相关的是一种在患者中治疗神经系统癌症的方法，所述方法包括用寨卡病毒治疗患有神经系统癌症的患者，以除去所述癌症。还提供了寨卡病毒在制备用于治疗神经元癌症的药物中的用途。神经系统癌症或神经元癌症可以是例如胶质母细胞瘤或神经母细胞瘤或CNS-PNET(中枢神经系统原始神经外胚层肿瘤)。
还提供了一种药物组合物，所述组合物包含能复制的寨卡病毒和所述病毒的稳定剂。
还提供了一种适于提供根据本发明的组织培养物的试剂盒。试剂盒可以包含(i)转染载体，其包含癌基因转基因或用于破坏肿瘤抑制基因的构建体，(ii)3D生物相容性基质，优选地还包含(iii)组织分化剂、干细胞培养基、核转染培养基或其组合。
在下面的详细描述中一起描述了本发明的所有实施方式，并且所有优选的实施方式均涉及所有实施方式、方面、方法、组织和试剂盒等。例如，试剂盒或其组分可以用于或者适于本发明的方法。在所描述的方法中使用的任何组分可以在试剂盒中。本发明的组织是本发明方法的结果或者可以用于本发明的方法。对本发明方法的优选和详细描述在本发明所得组织的适用性中相似地阅读。除非另有说明，否则所有实施方式可以彼此组合。
具体实施方式
本发明涉及一种产生在非癌组织中生长的癌症人工3D(三维)组织培养物的方法。此类3D组织培养物可以在体外形成，并显示出体外细胞培养物的所有显着特征，如由于缺少相邻的障碍物(如体内发现的其他器官或骨骼)而导致的形状基本均一和/或没有方向性——除非是人工引入的，例如使用诸如WO 2017/121754 A1中公开的定向生长基底。在本发明的所有实施方式中，所产生的3D培养物优选是类器官。类器官是从干细胞或器官祖细胞发育而来的器官特异性细胞类型的集合，并通过细胞分选和空间受限的谱系定向以类似于体内的方式自我组织(Lancaster和Knoblich,Science 345(6194),2014:1247125)。
本发明提供了包含癌组织的3D组织培养物，并因此作为癌症和癌症发展的体外模型。这允许进行任何研究应用，如药物筛选或者测试组织培养物和/或癌症或非癌症部位在环境影响(如营养或温度变化或暴露于其他试剂或化合物)下的反应。因此，本发明还涉及一种筛选一种或多种候选基因或试剂对致癌作用或癌症疗法的影响的方法。所述候选基因或试剂可以是任何此类药物或影响或基因修饰，如抑制一种或多种疑似肿瘤抑制基因和/或增强一种或多种疑似癌基因的表达。
本发明的标志是癌组织在非癌组织上生长或从非癌组织开始生长。这样可以再现更多类似体内的作用，如浸润或侵袭和监测早期致癌作用。因此，培养非癌或癌前细胞，然后在由从业者选择的培养物的发育阶段(优选当祖细胞已经开始发育的阶段)开始致癌作用。祖细胞是一种生物细胞，与干细胞一样，具有分化成特定类型细胞的趋势，但是已经比干细胞更具特异性，并且被迫分化成其靶细胞类型。祖细胞是类器官拟发展为的组织类型，例如神经元祖细胞。致癌作用在本文中也称为癌发生或肿瘤发生。
如背景技术部分中所总结的，此前的培养物(包括类器官)是从癌细胞(例如，来自特定类型癌症患者的细胞，如胶质母细胞瘤)培养的(Huber等，Cancer Res 2016 76(8):2465–2477)。由于肿瘤块是这种类器官的唯一产物，因此这种类器官不能发育正常健康组织的复杂器官结构，包括不同的发育或分化区域。与此相反，如能够通过此类3D组织培养物或类器官所再现的，本发明允许具有各种发育区域或发育层的正常组织发育。致癌作用开始后，可以观察到不同行为或不同分化的细胞。特别地，与在体内的情况一样，并非3D组织培养物中存在的所有细胞谱系都可能引起特定类型的癌症。本发明可以观察到不同细胞类型的这种不同行为。因此，考虑到致癌作用，本发明有助于追踪和鉴定可以引起特定癌症的特定细胞谱系。根据本发明，致癌作用是对培养物中非癌细胞的修饰，即在组织的细胞中引入癌性突变，而不是通过癌细胞浸润，如在WO 2017/05173 A1中所公开的转移性类器官模型中所研究的。根据本发明，还可以研究非转移性癌症。因此，优选地，本发明组织的癌细胞是非转移性的，即不具有转移的可能性。在其他实施方式中，癌细胞是转移性的。此类转移行为可以例如是通过监测离开3D组织培养物并能够在另一个类器官中形成新的肿瘤或癌症的细胞来确定的。在优选的实施方式中，癌症是非金属化或正在转移的，条件是在3D组织培养物中不形成外部或内部起源的转移。“外部起源的转移”指来自在2D组织培养物或聚集体中尚未发育的细胞的转移。“内部起源的转移”指来自在2D组织培养物或聚集体中已发育的细胞的转移；这可能是被允许的或不被允许的。
本发明的方法基于已知的产生3D组织培养物或类器官的方法，如在下述中所公开的：Lancaster,M.A.等，Nature 501,373–379(2013)；Lancaster等，Nature Protocols 9(10)(2014):2329-2340；WO 2014/090993A1；WO 2017/121754 A1；WO 2017 123791 A1；WO2017 117547 A1；WO 2015/135893 A1(神经元和神经类器官)；WO 2017/142069 A1(胃类器官)；WO 2017 115982 A1(软骨类器官)；WO 2017/059171 A1；WO 2016/183143 A1；WO2015/184273 A1(心脏类器官)；WO 2017/049243 A1；WO 2015/130919 A1(肾脏类器官)；WO2016/141137 A1(血管类器官)；WO 2016/174604 A1(乳房/小叶类器官)；WO 2015/196012A1(前列腺类器官)；WO 2016/061464 A1(肠类器官)；WO 2015/183920 A1(胃类器官)；WO2014/127170 A1；WO 2012/014076 A2(肝脏类器官)(其均通过引用并入本文)。根据本发明可以使用任何此类类器官产生方法或所得到的类器官。
通常，本发明的方法包括提供多能干细胞或祖细胞的聚集体的步骤。此类聚集体可以由单一干细胞(如诱导的多能干细胞(iPS)或分离的胚胎多能干细胞)发育。例如，干细胞或祖细胞可以是从胚胎早期阶段分离的细胞。此类方法不需要破坏胚胎。如在以上段落中引用的参考文献中所公开的，尤其是在WO 2014/090993 A1中所公开的，细胞可以发育成聚集体，在本领域中也称为“类胚体”。将聚集体作为本发明方法的起点，但是也可以通过进行这些步骤以达到聚集体阶段定义发明的过程。下述内容适于进行所述方法，但也适于所得到的聚集体。
iPS细胞的使用可用于个体化诊断和医疗。可以将来自患者(特别是肿瘤患者)的细胞转化成iPS细胞并用于本发明的方法。所述细胞可以是来自所述患者的正常、健康细胞。可以将本发明的致癌作用用于再现同一患者的肿瘤，从而能够基于此类肿瘤细胞及其致癌作用修饰来研究肿瘤发生。
例如，可以检查患者的肿瘤细胞中可能导致肿瘤发展的异常修饰。此类修饰可以是DNA甲基化或基因表达的突变或变化。本发明的致癌作用能够反映所述修饰(例如，通过突变被修饰的基因)在所述肿瘤细胞中的异常甲基化或表达。假设基因表达是肿瘤发展的最终有效原因，可以将任何此类修饰用于修饰根据本发明方法中的致癌作用步骤中的细胞，只要基因表达改变即可，特别是能唤起患者肿瘤细胞的那样。
如果已经通过本发明的方法确认了特定修饰是引起疾病的原因，则可以通过个体化药物特异性靶向所述基因，如通过上调或下调所述基因或其基因产物的活性至正常活性状态的方向。上调或下调可以通过本领域公知的常规方法来实现，如通过给予药物或转基因或抑制性化合物，如抑制性核酸。
本发明的聚集体可以通过培养多能干细胞或祖细胞或单细胞获得。在优选的实施方式中，3D组织培养的聚集体或细胞具有相同的遗传谱系，例如来自相同的单个细胞。原则上，如果在伦理理由上是被允许的，则细胞也可以是全能的。“全能”细胞可以在体内分化为任何细胞类型，包括像发育中通常发生的那样受到刺激后的种系。因此，可以将全能细胞定义为能够生长(即，发育)成整个生物体的细胞。根据本发明的方法中使用的细胞优选不是全能的，而是(严格的)多能的。
在一个特别优选的实施方式中，本发明的细胞(包括与其相关的所有其他实施方式)是人细胞或非人细胞，例如灵长类细胞。本发明的细胞通常是真核细胞。作为细胞来源的其他非人动物是小鼠、猫、犬、仓鼠、啮齿动物、大鼠、奶牛、马、绵羊等。
“多能”干细胞不能生长成完整的生物体，但能够产生源自全部三个胚层(即中胚层、内胚层和外胚层)的细胞类型，并且可能能够产生生物体的所有细胞类型。多能性可以是细胞(例如，在某些干细胞中)中可见的特征，或者其可以是人工诱导的。例如，在本发明的一个优选实施方式中，多能干细胞来源于体细胞、专能干细胞、单能干细胞或祖细胞，其中多能干细胞是被诱导的。在本文中，将此类细胞称为诱导的多能干细胞。体细胞、专能干细胞、单能干细胞或祖细胞可以(例如，所使用的)来自患者，在本发明方法的约束下，其转变为多能干细胞。可以研究这种细胞或所得到的组织培养物的异常情况，例如，在根据本发明方法的组织培养发育过程中。
“多能”细胞能够从生物体的两种或更多种不同器官或组织中的每一个产生至少一种细胞类型，其中所述细胞类型可以源自相同或源自不同胚层，但是不能产生生物体的所有细胞类型。
而相反的是，“单能”细胞能够分化成仅一种细胞谱系的细胞。
“祖细胞”是与干细胞一样具有分化为特定类型细胞的能力的细胞，分化的选择有限，通常只有一个靶细胞。祖细胞通常是单能细胞，其也可以是专能细胞。
随着分化能力的降低，干细胞分化的顺序如下：全能、多能、专能、单能。例如，在本发明的类器官的发育过程中，干细胞由多能神经干细胞(也可能是全能性细胞)分化成专能神经干细胞，进一步分化为组织类型的单能干细胞，然后分化为非干细胞组织细胞。组织细胞可以是神经元细胞或神经上皮细胞，如神经胶质细胞。
优选用分化因子处理聚集体或组织，以起始分化成特定的目标组织类型。或者，聚集体可以已被诱导用于特定组织类型的分化，例如通过在其产生过程中处理细胞。因此，聚集体优选地发育成分化的目标组织类型。由于癌症可以发生在任何组织上，因而对于本发明任何组织类型也均是可能的。同样地，对于包括由任何组织产生类器官在内的几乎任何组织类型培养均是已知的。在一个优选的实施方式中，聚集体或本发明的组织包括或发育成(“组织命运”)神经元、胃、结缔、软骨、骨、骨髓、心脏、肾脏、血管、乳腺或导管小叶、视网膜、前列腺、肠、胃、肺、内皮或肝脏组织。祖细胞可以是这些组织中的任何一个，或者可以注定要发育成这些组织中的任何一个。特别优选是神经元组织，特别是脑组织。给予细胞或聚集体的分化因子用于分化成任何此类组织。聚集体或组织可包含已经历组织特异性分化的这种组织的任何干细胞或祖细胞。优选地，组织包括选自神经元或神经源性、脂肪形成性、肌源性、腱生性、软骨源性、成骨性、韧带形成性，皮源性，肝性或内皮细胞的细胞。在一些情况下，组合也是可能的，例如器官细胞(例如，神经元、肌源性或肝性细胞)与将发育成支持组织(例如，内皮细胞、脂肪形成细胞、韧带形成细胞)的细胞的组合。在这些方法中，分化可以由通常已知的组织特异性生长或分化因子(也称为分化诱导剂)引发。比如，例如在本领域中公知的，和例如在WO 2009/023246 A2、WO 2004/084950 A2和WO 2003/042405 A2中所公开的。此外，分化或生长因子可以是骨形态发生蛋白、软骨来源的形态发生蛋白、生长分化因子、血管生成因子、血小板衍生的生长因子、血管内皮生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子、神经生长因子、集落刺激因子、神经营养因子、生长激素、白介素、结缔组织生长因子、甲状旁腺激素相关蛋白(例如，在WO 2004/084950 A2中公开的)。这些因子/试剂是市售的，不需要进行进一步描述。当然，本发明的试剂盒中可以包含针对上述任何一种组织类型的此类因子/试剂。优选地，在方法中使用了或在试剂盒中提供了神经、神经元或神经源性分化因子，优选在本发明组织中存在的神经、神经元或神经源性细胞。在本发明的一种优选方法中，多能干细胞或祖细胞分化成神经或神经元细胞和/或组织发育成类器官。在具有癌组织的神经元或神经3D组织培养物的情况下，本发明在本文中也称为脑瘤类器官。
聚集体或组织可以包含任何组织的祖细胞(如干细胞)，特别是上文所述的那些组织。祖细胞优选地选自下组：全能干细胞、多能干细胞、专能干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、造血干细胞、胰腺干细胞、心脏干细胞、胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、神经干细胞(特别是神经嵴干细胞)、肾脏干细胞、肝脏干细胞、肺脏干细胞、成血管细胞和内皮祖细胞。该方法中使用的多能细胞或祖细胞可以来源于去分化的软骨源性细胞、肌源性细胞、成骨细胞、腱生细胞、韧带形成细胞，脂肪形成性细胞，神经源性细胞或皮源性细胞。神经元干细胞或祖细胞可以分化为星形胶质细胞和/或少突胶质细胞，并且任选地进一步分化为神经胶质细胞。在任何这样的阶段，都可能发生致癌作用。优选地，致癌作用发生在神经外胚层的阶段，例如当聚集体或组织包含神经外胚层时。
可以通过将细胞与组织特异性生长或分化因子接触实现分化。然后，细胞可以分化成所需的组织。此类组织特异性生长或分化因子可以是神经元或神经源性、肌源性、腱生性、软骨源性或成骨性分化因子等。特别优选的是神经元分化因子。这将决定在以后的发育中发育成各种类型的细胞组织。因此，细胞将从多能细胞转变为专能细胞。然后，其他组织类型将不会或者仅可能再次变成多能状态。通常并非所有的细胞均分化成选定的组织类型。当约30％或更多，或者至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％的细胞开始向选定的组织类型分化通常是足够的，以及通过使用具有各组织命运的专能细胞进行转化以减少其分化潜能(值％以细胞量的分数表示)。当然，这种分化命运仅适用于通过使用人工生长和去分化刺激而未恢复到未分化或分化程度较低的细胞。显然，甚至体细胞可以返回至多能细胞，且这并不是指当定义本文的分化状态时就是这样的。优选地，没有因子引入细胞时，细胞将返回至多能细胞。
在3D生物相容性基质中培养和扩增多能干细胞或祖细胞的聚集体，其中细胞能够进行分化以使得聚集体发育成所需尺寸的组织培养物和/或更高级的分化状态。这种高级可以是增加数量的不同组织特异性分化状态，例如至少两种不同祖细胞和组织特异性(例如，神经或神经元)分化层的细胞。在神经元组织的情况下，至少一个祖细胞层包含外部放射状神经胶质细胞，外部或皮质外室管膜下区的细胞和/或皮质内纤维层的细胞是优选的。
在产生含癌组织的本发明方法中，至少一部分所述干细胞或祖细胞经历了致癌作用。当然，用于致癌作用的“干细胞或祖细胞”还包括任何后代细胞，包括这些干细胞或祖细胞在聚集体或3D组织培养物中分化成的细胞。如上所述，可以在聚集体或3D组织发育的任何阶段开始致癌作用，其包括细胞发育的任何阶段，其中优选地，当致癌作用开始时，组织特异性或组织命运已经开始。通过在任何方法步骤中(例如，在3D基质培养之前或培养期间的聚集体细胞中)或在组织培养中表达癌基因和/或通过抑制肿瘤抑制基因来实现致癌作用。使具有表达癌基因或抑制肿瘤抑制基因的所述细胞发展成癌细胞。
在针对其致癌作用筛选(即，检测)一种或多种候选基因或试剂的本发明方法中，至少一部分所述干细胞或祖细胞包括其后代在任何方法步骤中(例如，在3D基质培养之前或培养期间的聚集体细胞中)或在组织培养中通过表达或抑制候选基因或者通过使用候选试剂处理细胞经历潜在的致癌作用。在使得细胞表达或抑制候选基因或者使得细胞受到试剂的作用发育成癌细胞的条件下培养细胞或组织。此类条件可以是3D组织培养物或类器官通常使用的正常培养条件。这些包括在含有营养素的培养基中以及适宜的温度和压力下培养非癌或癌细胞。
致癌作用(或肿瘤发生)是在本发明方法中的人工步骤。其中涉及癌基因(也称为“肿瘤基因”)的表达或过表达，或者肿瘤抑制基因表达的降低或抑制，或者这两者，或者一种以上此类癌基因的表达/过表达和/或肿瘤抑制基因表达的降低或抑制的组合。这导致在3D人工组织培养物的细胞中发展成癌症——也就是说，至少一部分所述细胞，不一定是所有细胞。
数百种癌基因和肿瘤抑制基因是本领域公知的。这类基因已收集在诸如在cancer.sanger.ac.uk/census/的“癌基因普查”数据库中(Futreal等，Nature ReviewsCancer 4,177-183(2004))。任何已知的癌基因或肿瘤抑制基因均可以用在本发明的方法中，特别是检测其对在本发明的组织或类器官中的致癌作用的影响。
优选的癌基因、肿瘤抑制基因或候选基因选自选自下组的癌基因：ABL1、ABL2、AF15Q14、AF1Q、AF3p21、AF5q31、AKT、AKT2、ALK、ALO17、AML1、API、APC、ARHGEF、ARHH、ARNT、ASPSCR1、ATIC、ATM、AXL、BCL10、BCL11A、BCL11B、BCL2、BCL3、BCL5、BCL6、BCL7A、BCL9、BCR、BHD、BIRC3、BLM、BMPR1A、BRCA1、BRCA2、BRD4、BTG1、CBFA2T1、CBFA2T3、CBFB、CBL、CCND1、c-fos、CDH1、c-jun、CDK4、c-kit、CDKN2A-p14ARF、CDKN2A-p16INK4A、CDX2、CEBPA、CEP1、CHEK2、CHIC2、CHN1、CLTC、c-met、c-myc、COL1A1、COPEB、COX6C、CREBBP、c-ret、CTNNB1、CYLD、D10S170、DDB2、DDIT3、DDX10、DEK、EGFR、EIF4A2、ELKS、ELL、EP300、EPS15、erbB、ERBB2、ERCC2、ERCC3、ERCC4、ERCC5、ERG、ETV1、ETV4、ETV6、EVI1、EWSR1、EXT1、EXT2、FACL6、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FEV、FGFR1、FGFR1OP、FGFR2、FGFR3、FH、FIP1L1、FLI1、FLT3、FLT4、FMS、FNBP1、FOXO1A、FOXO3A、FPS、FSTL3、FUS、GAS7、GATA1、GIP、GMPS、GNAS、GOLGA5、GPC3、GPHN、GRAF、HEI1O、HER3、HIP1、HIST1H4I、HLF、HMGA2、HOXA11、HOXA13、HOXA9、HOXC13、HOXD11、HOXD13、HRAS、HRPT2、HSPCA、HSPCB、hTERT、IL21R、IRF4、IRTA1、JAK2、KIT、KRAS2、LAF4、LASP1、LCK、LCP1、LCX、LHFP、LMO1、LMO2、LPP、LYL1、MADH4、MALTl、MAML2、MAP2K4、MDM2、MECT1、MEN1、MET、MHC2TA、MLF1、MLH1、MLL、MLLT1、MLLT10、MLLT2、MLLT3、MLLT4、MLLT6、MLLT7、MLM、MN1、MSF、MSH2、MSH6、MSN、MTS1、MUTYH、MYC、MYCL1、MYCN、MYH11、MYH9、MYST4、NACA、NBS1、NCOA2、NCOA4、NF1、NF2、NOTCH1、NPM1、NR4 A3、NRAS、NSD1、NTRK1、NTRK3、NUMA1、NUP214、NUP98、NUT、OLIG2、p53、p27、p57、pl6、p21、p73、PAX3、PAX5、PAX7、PAX8、PBX1、PCM1、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、PICALM、PIM1、PML、PMS1、PMS2、PMX1、PNUTL1、POU2AF1、PPARG、PRAD-1、PRCC、PRKAR1A、PRO1073、PSIP2、PTCH、PTEN、PTPN11、RAB5EP、RAD51L1、RAF、RAP1GDS1、RARA、RAS、Rb、RB1、RECQL4、REL、RET、RPL22、RUNX1、RUNXBP2、SBDS、SDHB、SDHC、SDHD、SEPT6、SET、SFPQ、SH3GL1、SIS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMARCB1、SMO、SRC、SS18、SS18L1、SSH3BP1、SSX1、SSX2、SSX4、Stathmin、STK11、STL、SUFU、TAF15、TALI、TAL2、TCF1、TCF12、TCF3、TCL1A、TEC、TCF12、TFE3、TFEB、TFG、TFPT、TFRC、TIF1、TLX1、TLX3、TNFRSF6、TOP1、TP53、TPM3、TPM4、TPR、TRA、TRB、TRD、TRIM33、TRIP11、TRK、TSC1、TSC2、TSHR、VHL、WAS、WHSC1L18、WRN、WT1、XPA、XPC、ZNF145、ZNF198、ZNF278、ZNF384、ZNFN1A1，和特别优选的选自MYC、CDKN2A、CDKN2B、EGFR、EGFRvIII、NF1、PTEN、p53(TP53)或其组合。还优选PTEN、ATM、ATR、EGFR、ERBB2、ERBB3、ERBB4、Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、AKT、AKT2、AKT3、HIF、HIF1a、HIF3a、Met、HRG、Bcl2、PPARα、PPARγ、WT1(Wilms瘤)、FGF受体家族成员(成员1、2、3、4、5)、CDKN2a、APC、RB(视网膜母细胞瘤基因)、MEN1、VHL、BRCA1、BRCA2、AR(雄激素受体)、TSG101、IGF、IGF受体、Igf1、Igf2、Igf 1受体、Igf 2受体、Bax、Bcl2、半胱天冬酶家族(成员1、2、3、4、6、7、8、9、12)、Kras、Apc。可以根据本发明使用的其他且优选的癌症基因是以下一种或多种基因：CDKN2A、CDKN2B、CDKN2C、NF1、PTEN、p53(TP53)、ATRX、RB1、CDK4、CDK6、MDM2-B、EGFR、EGFRvIII、PDGFRA、H3F3A(优选改变K27M或G34R)、MYC、SMARB1、PTCH1、CTNNB1、MET、RTK、FGFR1、FGFR2、FGFR3、PI3-激酶、PIK3CA、PIK3R1、PIK3C2G、PIK3CB、PIK3C2B、PIK3C2A、PIK3R2、PTEN、BRAF、MDM2、MDM4、MDM1、IDH1、IDH2；或其组合，如CDKN2A和CDKN2B、CDKN2A和CDKN2B和EGFR、CDKN2A和CDKN2B和EGFRvIII、CDKN2A和CDKN2B和EGFR和EGFRvIII、CDKN2A和CDKN2B和PTEN、CDKN2A和CDKN2B和p53、CDKN2A和CDKN2B和PDGFRA、EGFR和CDK4、EGFRvIII和CDK4、EGFR和EGFRvIII和CDK4、MDM2-B和CDK4、NF1和PTEN和p53、EGFRvIII和CDKN2A和PTEN、H3F3A和ARTX和p53。基因缩写或基因名称在本领域中使用，并且完整的基因名称总结在基因数据库如NCBI数据库或EPI数据库中。GeneCards数据库(www.genecards.org/)从各种数据库收集信息并提供累积的摘要。Gene Cards是从这些基因获取更多信息的首选数据库。优选的组合是(i)CDKN2A、CDKN2B、EGFR和EGFRvIII，(ii)NF1、PTEN和p53，或者(iii)EGFRvIII、CDKN2A和PTEN，或者(iv)MYC。此类组合例如(i)CDKN2A-/CDKN2B-/EGFROE/EGFRvIIIOE，(ii)NF1-/PTEN-/p53-，或者(iii)EGFRvIIIOE/CDKN2A-/PTEN-，或者(iv)MYCOE，上标减号(“-”)表示表达减少或抑制和上表字母OE(“OE”)过表达。如在本发明中所使用的在这些基因中的致癌突变优选是在体内的患者或癌细胞中发现的变化。通过将基因与健康细胞中的野生型核酸序列进行比较，可以容易地鉴定出或已经鉴定出这种突变。可以从本文中提及的各种出版物或数据库知晓致癌作用。
优选地，癌基因选自ras、raf、Bcl-2、Akt、Sis、src、Notch、Stathmin、mdm2、abl、hTERT、c-fos、c-jun、c-myc、erbB、HER2/Neu、HER3、c-kit、c-met、c-ret、flt3、API、AMLl、axl、alk、fms、fps、gip、lck、MLM、PRAD-1和trk。优选地，肿瘤抑制基因选自p53、Rb、PTEN、BRCA-1、BRCA-2、APC、p57、p27、p16、p21、p73、p14ARF、Chek2、NF1、NF2、VHL、WRN、WT1、MEN1、MTS1、SMAD2、SMAD3和SMAD4。
在本发明的筛选方法中，可以突变所选择的候选基因，否则可以引入随机基因中的突变，如通过非特异性诱变，例如辐射或化学致癌作用，或者通过致癌病毒暴露，如逆转录病毒或DNA病毒，例如乳头瘤病毒。可以通过遗传分析鉴定这些改变的基因。
特别优选在神经元肿瘤中发现的致癌突变，特别是在聚集体或3D组织培养物的细胞中包含神经细胞的情况下。此类基因改变是本领域公知的，并且已在上文提及的数据库或在科学文献中发表，如在Brennan等，Cell 2013；155(2):462–477或McLendon等，2008,Nature,455,1061-8中。
癌基因和/或肿瘤抑制基因的选择也可以根据在患者中发现的临床癌症中的基因型进行选择。因此，本发明还提供了在患者的癌细胞中检测异常表达的基因并如上所述在本发明的聚集体或3D组织培养物的细胞中表达或抑制这样的基因(根据患者中发现的表达模式)的方法。患者中异常表达基因的检测可以与患者的健康细胞或与作为对照的相同物种的其他健康个体的细胞比较，优选地，其中所述比较细胞/对照细胞与所分析的癌细胞也是相同组织或分化类型。异常表达可以是表达水平减少或增加至少25％，优选至少30％、至少50％或至少75％的偏差(全部％-以mol.％计)。除编码序列中的表达水平改变外，或作为替代，其他种类的致癌突变可包括功能突变的丧失或获得。功能丧失或获得可能是基因产物活性变化降低或增加至少25％，优选至少30％、至少50％或至少75％(全部％-以酶活性单位U-％或开特-％计)。表达水平和活性均是相对于所述基因/基因产物的野生型表达或活性的。在特定实施方式中，肿瘤抑制基因被敲除突变所阻止。在特定实施方式中，可以引入(如果其在健康细胞中不存在)癌基因，或者与对照相比，具有至少2倍，优选地至少4倍的表达/活性(如上所述，以mol.-％或酶单位开特计)。
引入此类突变的方法是本领域熟知的，包括例如通过CRISPR-Cas或使用转基因进行同源重组的敲除或敲减或者诱变。为此，将能够引起所述突变的遗传物质引入细胞中。可以将遗传构建体用于将此类遗传物质引入细胞中。构建体例如可以表达载体、整合载体、转座子或病毒。
用于通过引入构建体或其他遗传物质产生致癌突变的示例方法是转染或转导。细胞转染通常涉及在细胞膜上瞬时打孔或开孔以允许物质摄入(US 7,732,175 B2)。可以使用磷酸钙(即，磷酸三钙)，通过电穿孔，通过细胞挤压或者通过将阳离子脂质与所述物质混合以产生与细胞膜融合并将货物沉淀在其中的脂质体来进行转染。将外源DNA引入真核细胞的方法有很多种：有些依赖物理处理(电穿孔、细胞挤压、纳米颗粒、磁转染)；另外一些依赖化学物质或将其作为载体的生物颗粒(病毒)。非病毒方法包括物理方法，如电穿孔、显微注射、基因枪、穿刺转染(impalefection)、流体静压力、连续输注、细胞挤压、光学激光转染、基因枪转染(粒子轰击)、磁转染和超声处理(声穿孔)，以及化学方法，如脂质转染，其是利用脂质体载体的脂质介导的DNA转染过程、磷酸钙转染、树状大分子转染、聚阳离子转染、FuGENE转染。还可以包括使用聚合物基因载体(polyplexes)。这些方法可以彼此之间或与其他辅助技术(如热休克)组合。
病毒介导的基因递送利用病毒将其DNA注入宿主细胞内的能力。待递送的基因被包装进入复制缺陷的病毒颗粒中。迄今为止使用的病毒包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒和单纯疱疹病毒。使用病毒载体的转导可用于在哺乳动物细胞中插入或修饰基因。例如，构建质粒，其中待转移的基因位于病毒序列的翼侧，所述病毒序列被病毒蛋白用来识别病毒基因组并将其包装成病毒颗粒。该质粒与其他质粒(DNA构建体)一起插入(通常通过转染)到生产细胞中，其他质粒携带形成感染性病毒粒子所需的病毒基因。在这些生产细胞中，这些包装构建体表达的病毒蛋白结合到要转移的DNA/RNA上的序列(取决于病毒载体的类型)并将其插入病毒颗粒中。优选地，使用的质粒均不包含病毒形成所需的所有序列，因此需要同时转染多个质粒才能获得感染性病毒粒子。同样优选的是，仅携带待转移序列的质粒含有使得遗传物质能够在病毒颗粒中包装的信号，因此没有编码病毒蛋白的基因被包装。然后将从此类生产细胞收集的病毒应用于待改变的3d组织培养物或聚集体的细胞。
通过使用适宜的条件突变载体(例如，包含可逆的基因捕获)引入条件突变是可能的。条件突变优选促进可逆突变，其在刺激后可以分别逆转为基因活化或基因失活状态，例如，如在双Flex系统中一样(WO 2006/056615 A1；WO 2006/056617 A1；WO 2002/88353 A2；WO 2001/29208 A1)。突变可以是随机的或者在特定基因处位点定向的。因而，在本发明的一些实施方式中，通过随机(正向)或位点定向(反向)诱变将可逆突变引入多能干细胞。适宜的载体包括具有可逆突变的插入盒。可以在本发明方法的任何阶段打开或关闭突变。优选的突变是不可逆的，并且在癌细胞或癌前细胞子代细胞中是可遗传的。
能够致癌的遗传物质可以编码任何癌基因的激动剂或者肿瘤抑制基因的抑制剂(或拮抗剂)。此类遗传元件可以是表达载体、表达整合载体或敲入载体(激动剂)或抑制性核酸、敲除或敲减载体(抑制剂)。肿瘤抑制基因的示例性抑制剂包括反义寡核苷酸或抑制性RNA分子，如小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNAs)、微RNA(miRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)和小核RNA(snRNA)，以及簇状规律间隔的短回文重复(CRISPR)干扰系统(CRISPRi)，其包含下调一种或多种肿瘤抑制基因表达的向导crRNA和Cas蛋白。Cas可以是核酸酶缺陷的Cas(例如，dCas9)。此类抑制剂也可以由抑制剂的表达系统编码，例如作为具有表达载体或表达整合载体的癌基因。
可以将任何类型的启动子可操作地连接至靶核酸序列。启动子的实例包括但不限于组织特异性启动子、组成型启动子、诱导型启动子和对特定刺激有应答或无应答的启动子。
靶向编辑工具可用于过度或减少/抑制表达，例如通过增强癌基因的启动子，同源重组(敲入)和引入癌基因的基因，或者破坏、消除或抑制肿瘤抑制基因的表达。基因组编辑工具，如转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)和锌指核酸酶(ZFN)，已经在很多生物体中影响了生物技术、基因治疗和功能基因组研究领域。最近，RNA引导的核酸内切酶(RGEN)被互补的RNA分子导向其靶位。Cas9/CRISPR系统是REGEN。tracrRNA是另一种此类工具。这些是靶向核酸酶系统的实例：这些系统具有将核酸酶定位至靶位点的DNA结合成员。然后，该位点被核酸酶切割。TALEN和ZFN具有与DNA结合成员融合的核酸酶。发现Cas9/CRISPR在靶DNA上彼此之间是同源的。DNA结合成员在染色体DNA中具有同源序列。通常根据预期的同源序列设计DNA结合成员，以便在预期的位点处或附近获得溶核作用。某些实施方式不受限制地适用于所有这样的系统；包括使核酸酶重新切割最小化的实施方式，用于在预期残基处精确制备插入缺失的实施方式和在DNA结合位点处掺入的等位基因的位置。使用CRISPR-Cas系统的癌症发生(＝致癌)方法是例如在WO 2014/204723 A1(通过引用并入本文)和各种其他文件中所公开的。根据本发明可以使用任何这样的方法。
例如，如在实施例章节中所示的，其仅用于举例说明而不是限制本发明，将转座子介导的插入与CRISPR/Cas9介导的基因组编辑的组合用于在大脑类器官中模拟人脑肿瘤发生。通过筛选在癌症患者中发现的功能获得性突变和功能丧失性突变的多种组合(McLendon等，2008,Nature,455,1061-8)，已证实通过标记物表达和转录组分析可以将大型、异种可移植肿瘤的生长分类为中枢神经系统原始神经外胚层肿瘤(CNS-PNET)或胶质母细胞瘤(GBM)。该方法启动了在任何患者的遗传背景下携带一组特定驱动突变的肿瘤的转化，从而允许以个性化方式进行潜在的靶向药物测试。最后，新开发的3D脑肿瘤模型用于筛选癌症药物并证明寨卡黄病毒的溶瘤活性，从而确定其对脑肿瘤治疗的潜在适用性。已证明这些脑肿瘤模型可用于评价药物对具有特定DNA畸变的肿瘤的有效性。
本发明方法进一步包括在3D生物相容性基质中培养和扩增所述干细胞的步骤。在该步骤中，细胞能够分化并发育成所需尺寸的组织培养物。如以上公开各种类器官的参考文献所概述的那样，此类步骤通常是已知的，例如在WO2014/090993和WO2017/121754中所公开的。将聚集体的细胞优选以所述聚集体本身的形式置于在所述3D生物相容性基质中，即不从聚集体中分离细胞。
使组织生长以形成3D组织培养物可以采用如本领域所公知的在3D(三维)基质中的组织培养方法进行。3D基质不同于2D培养物，如2D培养物是在表面平坦的培养皿中的。“3D培养物”指能够在所有三个维度上扩增，而不会被一个侧壁(如培养皿的底板)所阻挡的培养物。此类培养物优选地是在悬液中。3D生物相容性基质可以是凝胶，特别是刚性稳定的凝胶，其导致生长的细胞培养物/组织进一步扩增和分化。适宜的3D基质可以包含胶原。更优选地，3D基质包括胞外基质(ECM)，或其选自胶原、层粘连蛋白、巢蛋白和肝素硫酸化蛋白聚糖的任何组分或其任何组合。胞外基质可以来自Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤或其任何组分，如层粘连蛋白、胶原蛋白、优选4型胶原蛋白、巢蛋白、以及任选地进一步为肝素硫酸化蛋白聚糖或其任何组合。此类基质是Matrigel。Matrigel是本领域公知的(US 4,829,000)，并且此前已用于模拟3D心脏组织(WO 01/55297 A2)或神经元组织(WO 2014/090993)。优选地，基质包含层粘连蛋白、胶原和巢蛋白，优选浓度为30％-85％或50％-85％层粘连蛋白、3％-50％胶原和足量巢蛋白，以使得基质形成凝胶，通常是0.5％-10％巢蛋白。如果胶原的量不足以用于凝胶形成，则层粘连蛋白可能需要存在巢蛋白以形成凝胶。甚至更优选地，基质包含至少3.7mg/ml的浓度，以重量计其包含约30％-85％层粘连蛋白，5％-40％胶原蛋白IV，任选地1％-10％nidogen，任选地1％-10％硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和1％-10％巢蛋白。Matrigel的固体成分通常包含约60％层粘连蛋白、30％胶原IV和8％巢蛋白。针对基质成分给出的所有％值以wt.-％计。巢蛋白是一种与层粘连蛋白和胶原蛋白相互作用的桥接分子。可以在步骤r)中加入此类基质组分。这些组分也是本发明试剂盒的优选部分。3D基质可以进一步包含生长因子，如EGF(表皮生长因子)、FGF(成纤维细胞生长因子)、NGF、PDGF、IGF(胰岛素样生长因子)的任何一种，特别是IGF-1、TGF-β、组织纤溶酶原激活剂。3D基质也可以不含任何这些生长因子。
在通常情况下，3D基质是生物相容性基质的3D结构。其优选地包含胶原、明胶、壳聚糖、透明质酸、甲基纤维素、层粘连蛋白和/或藻酸盐。基质可以是凝胶，特别是水凝胶。有机化学水凝胶可以包含聚乙烯醇、聚丙烯酸钠、丙烯酸酯聚合物和具有大量亲水基团的共聚物。水凝胶包含亲水性聚合物链网络，有时发现其为胶态凝胶，其中水是分散介质。水凝胶是高吸收性(其可以含有90wt.-％或更多的水)天然或合成聚合物。由于其具有较高的含水量，因而水凝胶还具有与天然组织非常相似程度的弹性。3D基质或其成分(尤其是ECM或胶原蛋白)可能仍保留在生成的3D组织培养物中。优选地，3D基质是胶原基质，优选地其含有I型和/或II型胶原。特别优选地，3D生物相容性基质是胶原凝胶或胶原水凝胶。优选地，在悬浮培养物中培养所述细胞和/或3D基质的聚集体。悬浮培养物可阻止与培养容器的固体壁接触，并使3D组织培养物在形成过程中均匀地向各个方向扩展。3D组织培养物无需与此类固体壁接触即可形成，且无因接触这样的壁而停止扩展的区域。
综上所述，致癌作用优选地在多能干细胞已被刺激进行组织特异性分化(如神经分化)后进行。例如，致癌作用是在3D生物相容性基质中扩增所述干细胞之前。致癌作用可以是所述基因的重组修饰，优选地通过引入用于表达癌基因的转基因或者用于抑制肿瘤抑制基因的基因抑制构建体。可以通过核转染(如电穿孔)将转基因或构建体引入细胞。
在本发明的一个进一步优选的实施方式中，使用标记物(优选地标记物基因)对癌细胞进行标记。可能的标记物或标记是报告基因如荧光蛋白，优选GFP(绿色荧光蛋白)、增强的绿色荧光蛋白(eGFP)、d2EGFP、CFP(青色荧光蛋白)、YFP(黄色荧光蛋白)、RFP(drFP583；也称为红色荧光蛋白)、BFP(蓝色荧光蛋白)、smURFP(小超红色荧光蛋白)、HcRed、DsRed、DsRed单体、ZsGreen、AmCyan、ZsYellow、增强的蓝色荧光蛋白(eBFP)、增强的黄色荧光蛋白(eYFP)、GFPuv、增强的青色荧光蛋白(eCFP)、远红造礁珊瑚荧光蛋白；β-半乳糖苷酶；荧光素酶；过氧化物酶，例如，辣根过氧化物酶；碱性磷酸镁，例如SEAP，和葡萄糖氧化酶等任何细胞表面标记物(如Thy1.1)。
标记物的另一种类型是酶标记。“酶标记”指将底物转化成可检测产物的酶。用于本发明的适宜酶标记包括但不限于半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、荧光素酶(例如，萤火虫和海肾荧光素酶)、碱性磷酸酶(例如，SEAP)和葡萄糖氧化酶。可以通过酶将底物催化成可识别的产物来确定标记物的存在。
其他标记物是可检测的蛋白，特别是细胞表面蛋白。可以通过与结合配偶体通过化学或物理相互作用的分子相互作用检测表面蛋白。表面蛋白可以是“结合对”中的任何配偶体。结合对是彼此之间通过结合相互作用的分子。“结合对的配偶体”指第一和第二部分中的一个，其中其中第一和第二部分彼此具有合适的结合亲和性，以检测其成员彼此结合的对。用于本发明的适宜结合对包括但不限于抗原/抗体。优选地，癌细胞表达能够检测到的肿瘤抗原。此类肿瘤抗原可以是如上所述人工表达的癌基因之一。
可以将此类标记物与如上所述的致癌元素一起引入或者与所述元素分别引入。在所有实施方式中优选的是与致癌作用一起引入，以追踪所处理的细胞。在任何情况下，所述标记均带有鉴定癌细胞的标记物。因此，本发明还包括在所述组织培养物中鉴定癌细胞的步骤。所述鉴定步骤优选通过鉴定标记物进行。此类鉴定方法是本领域所熟知的，并且包括细胞分选(例如，FACS-荧光活化细胞分选)、免疫测定、标记物光检测、磁分离等。优选地，标记物是可以传递给标记细胞的子代细胞的遗传标记物。标记细胞可以是用于致癌作用的细胞，其可以已经是癌细胞或者可以不是癌细胞。优选的标记物不同于癌基因。
通过上述和以下描述的方法和优选实施方式中的任何一个可获得的人工3D组织培养物，其具有相应赋予的特征，也构成了本发明的一部分。产生这种3D组织培养物通常是本发明方法中的步骤。除了上述特征以外，3D组织培养物可以包含非癌组织和癌组织。如上所述，癌组织过表达癌基因和/或具有抑制表达的肿瘤抑制基因，优选地与能够检测的标记物基因组合。癌基因通常与非癌细胞具有相同遗传背景，即来自相同来源的原始祖细胞，例如，多能干细胞。因此，与非癌组织相比，在癌组织中所述癌基因或肿瘤抑制基因以外的基因优选基本上未被修饰。而且，所述组织(i)可以通过根据本发明的方法获得；和/或(ii)至少包含用于在癌组织的细胞中抑制肿瘤抑制基因的转基因或构建体；和/或(iii)包含3D生物相容性基质，优选如上文所公开的凝胶、胶原凝胶或水凝胶。3D组织培养物可以是类器官或具有任何一种类器官的特征，如其1.含有多种器官特异性细胞类型，即根据选择用于分化的一般器官，细胞具有不同的分化类型(例如，神经祖细胞可以进一步分化成前脑细胞，具有背侧神经节突起和尾侧神经节突起性质的细胞，具有腹侧-内侧神经节突起性质的细胞，具有背侧皮质性质的细胞等，如上文所述的任何一般亚分化类型)；2.能够再现器官的一些特定功能(例如，排泄、过滤、神经活性、收缩)；3.组合在一起并且在空间上类似于器官。类器官的形成再现了发育过程中自组织的两个主要过程：细胞分选和空间受限的谱系定向。在本发明的3D组织培养物中发现的根据特定组织部分的这种自组织和分化使人联想到体内发育。当然，这种天然发育存在于非癌细胞中。癌细胞可能与天然组织或器官发育不同，并表现出癌/肿瘤表型，如不受控制的生长以及在严重癌症的情况下出现向非癌组织部分的侵袭。优选地，如在本文中进一步描述的，组织包含癌性或增殖性中枢神经系统病症的细胞，特别优选胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤或CNS-PNET(中枢神经系统原始神经外胚层肿瘤)。
在本发明优选的实施方式中，3D组织培养物生长至某一尺寸或具有至少100μm的尺寸，优选至少150μm，特别优选至少200μm。“尺寸”指在3d空间中的最长尺寸。优选3D组织培养物的形状是球形，特别是最短尺寸不低于最长尺寸的20％，特别是不低于最长尺寸的30％或不低于40％。优选3D组织培养物的体积是至少1x106μm3，特别优选至少2x106μm3、至少4x106μm3、至少6x106μm3、至少8x106μm3、至少10x106μm3、至少15x106μm3和/或尺寸至少250μm，特别优选至少350μm。
3D组织培养物的尺寸通常最多10mm，优选最多5mm、最多2mm、最多1250μm或最多800μm，例如体积最多4200mm3、最多2400mm3、最多1200mm3、最多800mm3、最多400mm3、最多100mm3、最多50mm3、最多8mm3、最多2mm3或最多1mm3。在一些实施方式中，3D组织培养物可以是更大的，其尺寸最多15mm，优选最多10mm或最多5mm，例如其体积最多15000mm3、最多10000mm3或最多8000mm3。
在本发明的所有实施方式中，本发明的3D组织培养物可以包含或不包含血管网络，特别地，本发明的3D组织培养物可仅包含单一分化谱系的细胞，例如神经细胞或器官，如神经、胃、结缔、软骨、骨、骨髓、心脏、肾脏、血管、乳腺或导管小叶、视网膜、前列腺、肠、胃、肺、内皮或肝脏组织。这种结局可以通过使用上文所公开的适宜分化因子来控制。在分化中也可以允许有一些改变，但是需要保持严格分化成选自中胚层、内胚层和外胚层的仅一个胚层的组织。而且，3D组织培养物可以由一种分化谱系的所述细胞均匀地构成。因此，可以不存在其他分化谱系，如在3D组织培养物上的结缔组织层。
3D组织培养物可以表达某些分化表达标记物或缺乏这种表达标记物的表达作为特异性分化的信号。
优选地，所述组织培养物包含神经组织，且其中癌组织是神经组织肿瘤。
优选地，3D组织培养物包含表达DLX2的细胞。DLX2在具有腹侧前脑性质的细胞中表达。优选地，这种组织类型包括在本发明的组织中。
优选地，3D组织培养物包含表达GSX2的细胞。GSX2在具有背侧神经节突起和尾侧神经节突起性质的细胞中表达。优选地，这种组织类型包括在本发明的组织中。
优选地，3D组织培养物包含表达NKX2-1的细胞。NKX2-1在具有腹侧-内侧神经节突起性质的细胞中表达。优选地，这种组织类型包括在本发明的组织中。
优选地，3D组织培养物包含表达LHX6的细胞。LHX6在具有腹侧-内侧神经节突起性质子区域的细胞中表达。优选地，这种组织类型包括在本发明的组织中。
优选地，3D组织培养物包含表达FoxG1的细胞。FoxG1在具有背侧皮质性质的细胞中表达。优选地，这种组织类型包括在本发明的组织中。
优选地，3D组织培养物包含表达TBR1的细胞。TBR1在具有背侧前脑性质的细胞中表达。优选地，这种组织类型包括在本发明的组织中。
优选地，3D组织培养物包含表达TBR2的细胞。TBR2在具有背侧皮质性质的细胞中表达。优选地，这种组织类型包括在本发明的组织中。
本发明的3D组织培养物可以在非癌细胞组织(部分)与癌细胞组织(部分)之间包含一个侵袭或融合区域。这样的侵袭或融合区域可以使各组织类型的细胞并存，从而产生作为连续组织的组织，其中一侧是癌类型，而另一侧是非癌类型。
优选地，非癌组织至少在组织的核心，癌组织至少在组织的表面。由于在3D基质中培养之前通常不破坏聚集体，且聚集体在3D生物相容性基质中连续生长至3D组织培养物状态，从而增强了其生长和向体内样谱系的分化，考虑到致癌作用优选地发生在聚集体或3D组织培养物表面接触时，因此致癌突变将首先出现在表面上的细胞中。引入致癌作用的其他聚集体或组织处理可以是注射，因此，癌症的生长可能始于注射部位，其可以是3D组织培养物的核心。“至少”指在特定组织位置中存在的细胞，但是也可以存在于组织的其他部分。在非侵袭性癌细胞的情况下，癌细胞可以仍在其原始位置，如组织表面。在侵袭性细胞的情况下，癌细胞可以存在于整个组织中。例如，MYC-OE肿瘤细胞通常是非侵袭性的。在GBM肿瘤细胞的情况下，癌细胞不仅在表面上生长，而且侵入组织的核心中。正常非癌细胞也在类器官表面上生长。
还提供了一种检测或筛选候选化合物或试剂的致癌作用或其对癌组织的影响的方法，所述方法包括将本发明方法中的细胞或组织与候选化合物或试剂接触或者将本发明的组织与候选化合物或试剂接触，并且保持对所述接触的组织进行培养，并观察与未与所述候选化合物接触的所述组织相比在组织中的任何改变。同样地，本发明提供了将本发明方法中的组织或细胞暴露于某种条件下，而不是将其与候选化合物接触。此类条件可以是例如升高的温度，受限的营养素或者改变的氧化还原电位，与未暴露于所述条件下的行为或生长相比，癌细胞可以对其做出反应并显示出不同的行为或生长速率。因此，本发明的3D组织培养物及其产生方法也可以作为研究工具，以研究任何化学物质(化合物，例如药物或其他刺激)、(生物)试剂(例如，病毒，如溶瘤病毒和/或黄病毒)、环境(例如，温度、压力、光暴露、氧化还原电位、营养物、辐射)的影响对组织中的细胞(特别是正在经历致癌作用的细胞)生长和活性的影响。温度变化优选升高温度；营养素改变例如葡萄糖或其他碳水化合物能量源减少，脂肪或脂肪酸增加；氧化还原电位改变可以是例如加入氧化剂或还原剂或氧化剂(如维生素C)；光可以是UV光；辐射可以可以通过α或β辐射源进行；病毒可以是溶瘤病毒或黄病毒、逆转录病毒或DNA病毒。在还包含非癌细胞的本发明的组织中，还可以将对癌细胞的作用与对相同或不同3D组织培养物中非癌细胞的作用进行比较。因此，可以鉴定对癌细胞比对非癌细胞具有更强作用的癌症特异性化合物、试剂或环境因素。在这种情况下，化合物、试剂或环境因素可以是合格的癌症治疗候选物，对比化合物或试剂或环境因素无差别地杀死癌细胞和非癌细胞。相对于每个非癌细胞，癌症特异性作用优选地杀死或生长抑制2个或更多个癌细胞。优选地，该比例是相对于每个非癌细胞3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个或者100个或更多个癌细胞。可以对如此分类的治疗候选物进行进一步的癌症测试，例如在动物模型或在患者中。
可以根据3D组织培养物中癌症发展的所需性质分析和选择候选化合物或试剂。例如，可以针对其减慢甚至阻止癌症生长的潜力对化合物或试剂进行分析。而且，可以筛选其破坏肿瘤或癌细胞的能力。可以筛选与非癌细胞相比的这种作用，如果应该进一步考虑将候选化合物作为癌症治疗药物，那么与癌细胞相比，非癌细胞最好不受这种有害作用的影响。可以在候选化合物或试剂中搜索本发明细胞或组织的任何类型的活性，包括代谢转换或信号传导。本质上，本发明高度分化的组织可以用作用于对任何化合物的任何作用进行组织行为测试的模型。如在本发明的组织培养物中可以观察到的，这种方法还可以用于测试旨在治疗癌症的治疗药物对非癌细胞的副作用。如所述的，作为检测或筛选候选化合物或试剂的替代，也可以将环境条件用于相同作用和目的的分析。此类作用可以是升高温度，如40℃及以上，或者减少营养素，如撤去碳水化合物或矿物质源。
候选药物(如候选化合物或试剂)可以是生物分子(如蛋白、肽、核酸)，或者包含或由此类生物分子组成，如病毒或小分子抑制剂。小分子通常是尺寸为5000道尔顿或更小(例如，2500道尔顿或更小，或者甚至1000道尔顿或更小)的小有机化合物。候选药物、试剂或化合物针对其他适应症可能是已知的和/或可能是已知化学化合物。此类已知化合物例如是在化合物数据库中公开的，如www.selleckchem.com，其收集抑制剂化合物信息，包括化合物的细胞靶点。优选地，候选化合物是癌基因的抑制剂，特别是已根据本发明的方法人工引入的癌基因，其采用根据上文所述的本发明方法的靶向或随机诱变(以及然后对其进行鉴定)。例如，针对靶基因EGFR可以筛选很多和任何化合物，www.selleckchem.com列出了50多种抑制剂，当然其均是合格的筛选靶点。进一步的候选化合物是病毒颗粒，特别是感染性病毒颗粒，包括野生型病毒或减毒病毒。由于其具有抗癌作用，因而将有效的病毒称为溶瘤病毒，但是并不严格需要其裂解肿瘤或癌细胞。已发现能够作为癌症的可用治疗选择的此类病毒是寨卡黄病毒。本文的实施例显示了其在神经肿瘤类器官中的溶瘤可能性。其用途是本发明进一步的方面。
在特别优选的实施方式中，检测或筛选候选化合物或试剂对任何癌性或增殖性神经系统病症的影响，特别优选胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤或CNS-PNET(中枢神经系统原始神经外胚层肿瘤)。因此，本发明的组织包含此类病症，或者在本发明的方法中此类病症是在致癌作用步骤中产生的。此类方法特别地用于筛选或检测潜在的治疗化合物或试剂。
也可以将本发明的3D组织培养物植入动物中。可能的植入部位是动物中的任何部位，如皮下或在器官腔中，如在肾脏附近。所述筛选或检测方法也可以在动物模型中进行，例如通过给予动物候选化合物或试剂。示例性的动物是例如非人灵长类、啮齿类、非人哺乳动物等。候选试剂或药物可以与药物制剂联合施用。下面进一步描述了示例性的药物制剂。因此，本发明还提供了包含本发明的3D组织培养物的动物。
在进一步的方面中，本发明提供了寨卡病毒作为溶瘤病毒的用途。特别是提供了寨卡病毒用于治疗神经系统癌症中的用途。与之相关的是一种在患者中治疗神经系统癌症的方法，所述方法包括使用寨卡病毒治疗患有神经系统癌症的患者以除去所述癌症。进一步提供了寨卡病毒在制备用于治疗神经系统癌症的药物中的用途。还提供了一种使用寨卡病毒治疗神经系统癌症的方法。癌细胞可以在患者中或在体外，例如在所述的3D组织培养物中。神经系统癌症可以是例如脑癌或脊髓癌。如本文中所示，寨卡病毒(ZIKV)优先感染类器官中的肿瘤细胞，并严重损害肿瘤生长。结果表明，脑类器官可以用于检测脑肿瘤疗法的策略，并且可以用于显示ZIKA作为溶瘤病毒的用途。
溶瘤病毒及其治疗癌症的用途是本领域熟知的(参见WO 1998/035028 A2、WO2001/053506 A2、WO 2002/067861 A2、WO 2004/078206 A1、WO 2017/070110 A1、WO 2017/085175 A1、WO 2017/132552 A1、WO 2017/120670 A1；Russell等，Nat Biotechnol.30(7):658–670(2012))，其可以单独使用(即，作为唯一的抗癌药物)或与其他癌症疗法(特别是化疗)联用(WO 2008/043576 A1、WO 2017/121925 A1)。使用寨卡病毒的本发明的疗法是一种溶瘤病毒疗法，并且特别的方面是可以如本领域所公知的使用该病毒，如在适于病毒递送和/或其稳定性的制剂中施用病毒。可以在本发明的方法和组织培养物中作为候选化合物，对候选溶瘤病毒的溶瘤作用进行检测或筛选。
寨卡病毒(ZIKV)是一种由蚊子传播的黄病毒，其分布在非洲和亚洲的大部分地区。该病毒感染可能引起在临床上类似于登革热的急性发热性疾病。已对其进行了表征并且其在本领域中是可用的(Haddow等，PLoS neglected tropical diseases 6(2)2012:e1477，其通过引用并入本文)。可以使用任何毒株，如非洲毒株或亚洲毒株，包括其任何谱系，包括MR 766、ArD 41519、IbH 30656、EC Yap、P6-740或FSS13025。此外，可以将寨卡病毒减毒或进行重组工程改造以包含其他抗原或减毒修饰。本发明的寨卡病毒基因组优选仍然与由Haddow等，2012(如上所述)保藏和审核的谱系MR 766、ArD 41519、IbH 30656、EC Yap、P6-740或FSS13025中的任何一种具有至少85％或至少90％或至少95％的序列同一性。
在一些实施方式中，本发明提供了一种在需要其的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述对象施用本文所述的溶瘤寨卡病毒或其组合物。在一些实施方式中，所述对象是小鼠、大鼠、家兔、猫、犬、马、非人灵长类或人。在一些实施方式中，溶瘤病毒或其组合物通过静脉内、皮下、肿瘤内、肌内、鼻内、肠胃外或腹膜内施用。病毒可以全身性或局部施用。在转移性肿瘤的情况下，全身性施用是优选的。在单个肿瘤的情况下，也可以向肿瘤部位或癌症器官局部施用。
本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含能够复制的寨卡病毒以及所述病毒的稳定剂或载体。可以将药物组合物用于治疗神经癌细胞。稳定剂可以是用于病毒制剂的任何稳定剂，优选在室温或在冷藏储存(如在1℃至8℃)下获得至少3个月的保质期。示例性的稳定剂可以是碳水化合物(US 8,142,795 B2)，包括二糖(US 6,231,860 B1)或血清蛋白(如白蛋白)(US 6,210,683 B1)或包含Mg2+和Ca2+离子的盐(US 3,915,794 A)或谷氨酸和精氨酸(US 4,337,242 A)或其组合。当然，将调节稳定剂的浓度以达到稳定作用，如使感染性病毒保持在溶液中至少14天或更长时间，如2-3个月或更长时间。组合物还可以包含增敏剂，以除去或减少患者的免疫系统对癌症的保护作用。示例性的增敏剂是IFN抑制剂(Russell等，2012，如上所述)或检查点抑制剂(WO 2017/120670 A1)。寨卡病毒可以是野生型病毒，这可能需要隔离患者以防止旁观者感染，或者寨卡病毒可以是减毒的，以降低其感染能力和旁观者传染。由于寨卡病毒在除了癌症患者以外的健康人(孕妇除外)中仅会引起轻度感染，因而寨卡病毒可以是野生型的。因此，在这种情况下，使用寨卡病毒治疗的患者不能是妊娠的女性。
药物组合物可以包含载体。如在本文中所使用的，“载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、载剂、包衣、稀释剂、等渗和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、混悬剂、分散剂、胶体等。此类介质和试剂用于药物活性成分的用途是本领域熟知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分是不相容的，否则考虑将其用于治疗组合物中。也可以将补充活性成分掺入组合物中。在一个实施方式中，包含载体的组合物适于胃肠外施用，例如血管内(静脉内或动脉内)、腹膜内或肌内施用。药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。此类介质和试剂用于药物活性成分的用途是本领域熟知的。除非任何常规介质或试剂与病毒载体或核酸分子是不相容的，否则考虑将其用于本发明的药物组合物中。
适于注射用的药物形式包括无菌水溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末(US 5,466,468，其全部内容通过引用并入本文)。在所有情况下，这种形式应是无菌的并且应是易于注射程度的流体。其在生产和贮存条件下应是稳定的，并且应防止微生物(如细菌和真菌)的污染作用。组合物还可以包含抗细菌和/或抗真菌剂或其他防腐剂以增加保质期。当然，无菌或存在上述物质不能影响寨卡病毒的溶瘤能力。因此，无菌性不包括除去寨卡病毒或使其失活。同样地，防腐剂不能是针对寨卡病毒防腐的。
组合物还可以包含抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯，α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
示例性组合物可以包含所有这些成分的组合，如寨卡病毒、病毒稳定剂(优选PEG)、载体和抗氧化剂，优选还包含增敏剂。组合物可以是无菌的，除了存在寨卡病毒以外，其将仍具有感染性，和/或包含对寨卡病毒无害的防腐剂。
待治疗的患者可以是已诊断出患有神经元癌症或神经癌症，如神经母细胞瘤或胶质母细胞瘤。例如，患者可以患有神经胶质瘤(神经胶质细胞瘤)，例如脑胶质瘤、少突星形细胞瘤、脉络丛乳头状瘤、室管膜瘤、星形细胞瘤(毛细胞星形细胞瘤、多形胶质母细胞瘤)、胚胎发育不良的神经上皮肿瘤、少突胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、原始神经外胚层肿瘤；神经上皮瘤样肿瘤，例如神经节细胞瘤、神经母细胞瘤、非典型畸胎瘤样横纹肌瘤、视网膜母细胞瘤、嗅神经母细胞瘤；或者神经鞘瘤，例如神经纤维瘤(神经纤维肉瘤、神经纤维瘤病)、许旺氏细胞瘤、神经鞘瘤、听神经瘤、神经瘤。任何此类肿瘤也可以通过本发明的3D组织培养物或类器官来建模。而且，本发明治疗神经癌细胞的方法可以包括诊断或检测神经癌细胞，然后用根据本发明的寨卡病毒治疗细胞。用寨卡病毒的治疗可以采取预防性措施，如隔离患者，以防止其他对象(特别是人)进一步感染。
本发明还涉及一种用于提供根据本发明的组织培养物的试剂盒。所述试剂盒可以包含(i)转染载体，其包含癌基因转基因或用于破坏肿瘤抑制基因的构建体，(ii)3D生物相容性基质，优选地还包含(iii)组织分化剂、干细胞培养基、核转染培养基或其组合。所述试剂盒可以用于本发明的方法。优选地，试剂盒包含如上文所公开的本发明方法的任何其他化合物或手段。特别优选地，试剂盒还包含如上文所公开的标记物以标记突变的细胞。标记物优选表达标记物，如荧光蛋白。上文已对3D基质进行了详细描述——优选地，其包含胶原水凝胶或本文所公开的任何其他实施方式。试剂盒还优选地包含分化剂、干细胞培养基、核转染培养基或其组合。此类培养基是本领域公知的，并且通常包含一种或多种下述成分：
分化剂：如上所述的任何一种分化因子，优选神经元分化因子，这些都适于产生神经元3D组织培养物；
干细胞培养基：N2补充剂、B27补充剂、胰岛素、2-巯基乙醇、谷氨酰胺、非必需氨基酸或其任意组合(参见WO 2014/090993 A1)；
核转染培养基：例如，经Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)或其他营养素和矿物质来源、谷氨酰胺以及FCS或其他血清或血清替代品(亦参见US 7,732,175 B2)；DMEM或其他营养素来源优选在培养基80-95w.-％范围内。FCS或其他血清或血清替代品优选占培养基的5-20w.-％。核转染剂培养基应适合于核转染，优选用于电穿孔。
除了这些成分以外，试剂盒还可以包含适宜的容器，如容纳其成分的小瓶或药瓶，优选每种成分或培养基分别保存。
在以下附图和实施例中进一步说明本发明，但不限于本发明的这些实施方式。
附图说明
图1：基因组编辑构建体核转染进入脑类器官的神经干细胞/前体细胞(NS/PC)中。a，脑类器官系统的培养系统示意图和核转染策略。显示了每个阶段的示例性图像。在神经诱导阶段结束时和即将埋入matrigel以启动肿瘤发生之前将EB电穿孔。EB，类胚体；bFGF，碱性成纤维细胞生长因子；hESC，人胚胎干细胞；hiPSC，人诱导的多能干细胞；RA，视黄酸。b，免疫荧光照片显示，在神经诱导阶段结束时，在EB中核转染的细胞(GFP，绿色)是NS/PC(SOX1，红色；N-CAD，红色；NES，红色；箭头的头部)，而不是中胚层细胞(BRA，红色；FOXF1，红色；完整箭头)或内胚层细胞(SOX17，红色；CD31，红色；完整箭头)。N-CAD：N-CADHERIN；NES：NESTIN；BRA：BRACHYURY。比例尺：b，上图：200μm；下图：100μm。
图2：在类器官中的克隆诱变导致肿瘤过度生长。核转染后1天(b)和1个月(c)的类器官的免疫荧光照片(a)和GFP荧光强度定量。结果表明，核转染后1天所有组的EB含有相似量的核转染细胞，而来自四组包含MYC、CDKN2A-/CDKN2B-/EGFROE/EGFRvIIIOE、NF1-/PTEN-/p53-、EGFRvIII/PTEN-/CDK2A-的类器官，在核转染后1个月的脑类器官中显示出显著的GFP+细胞过度生长。比例尺：a：1天：200μm；1个月：500μm。
图3：MYCOE和GBM-样肿瘤性脑类器官具有独特的转录谱和细胞性质。a，来自CTRL类器官的正常细胞与来自不同肿瘤性脑类器官组的肿瘤细胞之间前500个可变基因的主成分分析(PCA)。b，维恩图显示了相对于CTRL类器官(聚类1；n＝3)，聚类2(MYCOE，n＝3)和聚类3(GBM-1，GBM-2，GBM-3，n＝7)之间差异表达基因的重叠(DESeq，经校正的p值<0.05)。重叠的p值通过超几何检验计算。c，KEGG通路富集分析显示了聚类2与聚类3的肿瘤性脑类器官之间信号传导途径的差异。d，热图显示了选自人原代CNS-PNET和GBM肿瘤之间的差异表达基因在聚类2与聚类3之间(来自一次实验的聚类2的n＝3和聚类3的n＝7)的差异表达基因(经校正的绝对log2fc值>1或<-1且经校正的p值<0.05)的标准化表达水平。热图由log2(每千碱基千级转录本，TPM)转换的数据创建，该数据使用“中位数中心基因/行”和“标准化基因/行”功能进行行(基因)标准化，以便以样品之间的相对表达报告数据。e，核转染后4个月对照组和肿瘤组DAPI(蓝色)和GFP(绿色)染色的低放大倍数图像。f-k，来自CTRL、MYCOE和GBM-1的4月龄类器官的代表性免疫荧光图像和定量结果。染色进行了6次独立实验，其具有相似结果。定量在来自3次独立实验的类器官上进行。使用单因素ANOVA结合Dunnett检验进行统计学分析。数据以平均值±SD，样本量和值以及经校正p值的详细情况见源数据。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。比例尺：c：100μm。
图4：肿瘤类器官在肾包膜下异种移植后的扩增情况。a，肾包膜异种移植程序示意图。将2月龄肿瘤类器官植入裸小鼠的肾包膜中，并且在1.5个月后收集组织。b，亮视场和免疫荧光照片显示，肿瘤类器官扩增，而对照类器官大量吸收。c，在肾包膜中肿瘤类器官的H&E染色照片。完整箭头指向胶质细胞，箭头的头部指向神经元。d，植入的类器官上胶质细胞标记物GFAP、前体标记物SOX1和细胞周期标记物Ki67的免疫组化照片。e，植入的MYCOE类器官的H&E染色照片显示出MYCOE肿瘤具有CNS-PNET-样组织病理学特征。f，神经元标记物MAP2的免疫组化照片显示，MYCOE肿瘤几乎不分化为神经元。比例尺：b：500mm；c，d，f：200μm和50μm(插图)；e：1000μm；e’，e”，e”’：50μm。
图5：GBM肿瘤性脑类器官显示出GBM侵袭特征。a-c，在GBM-1肿瘤性脑类器官中肿瘤-正常界面的代表性图像。图像是至少3次独立实验的代表性结果。d，在GBM样肿瘤性脑类器官中GFAP的免疫组化染色。图像是至少2次独立的肾植入的代表性结果。黑色虚线表示植入的肿瘤性脑类器官与小鼠肾之间的边界。红色虚线表示肾小管。箭头的头部表示侵入的肿瘤细胞。e，4月龄类器官GBM侵袭性相关基因的分层聚类分析(CTRL类器官n＝3；肿瘤性脑类器官，MYCOE n＝4，GBM-1n＝4，GBM-2n＝4，GBM-3n＝4，)每组均为3个独立的培养物)。热图由log2(TPM)转换的数据创建，该数据使用“中位数中心基因/行”和“标准化基因/行”功能进行行(基因)标准化，以便以样品之间的相对表达报告数据。f，GBM-1组肿瘤性脑类器官的代表性免疫荧光染色，显示了间充质标记物和侵袭性标记物；还显示了GFP。图像是2次独立实验的代表性结果。比例尺：a，1000mm；b和c，200mm；d，25μm；f：100μm。
图6：使用脑肿瘤性类器官模型研究潜在的脑肿瘤疗法。a，b，图像(a)和FACS分选(b)测定定量显示了，与给予DMSO相比，EGFR抑制剂阿法替尼能够减少GBM-1(n＝6)和GBM-3(n＝3)肿瘤性脑类器官中的大部分GFP+肿瘤细胞，但是显示出对MYCOE和GBM-2肿瘤性脑类器官中的肿瘤细胞没有影响。将药物处理组中GFP+细胞占总细胞的百分比标准化至GFP+细胞占DMSO处理的肿瘤性脑类器官的百分比。使用未配对的双尾Student t检验对定量结果进行统计学分析。c，ZIKV感染和实验设置的示意图。d，假处理或使用ZIKV处理的CTRL类器官，以及使用ZIKV处理的MYCOE和GBM-1肿瘤性脑类器官的GFP和ZIKV的免疫荧光图像。e，ZIKV感染率的定量结果表明，与CTRL类器官或肿瘤性脑类器官的非肿瘤细胞相比，所有肿瘤性脑类器官组的GFP+肿瘤细胞具有显著更高的感染率。使用单因素ANOVA结合Dunnett检验对定量结果进行统计学分析。f，假处理或ZIKV处理的CTRL类器官，以及使用ZIKV处理的MYCOE和GBM-1肿瘤性脑类器官的神经前体标记物MUSASHI1(MSI1)的免疫荧光图像。g，假处理或ZIKV处理的CTRL类器官，以及使用ZIKV处理的MYCOE和GBM-1肿瘤性脑类器官的凋亡标记物活化的Caspase3(CASP3)的免疫荧光图像。h，CASP3+凋亡细胞百分比的定量结果表明，与假处理肿瘤区以及假处理或ZIKV处理的非肿瘤区CTRL-ZIKV相比，在肿瘤区中ZIKV感染诱导显著更多的细胞凋亡。使用单因素ANOVA结合Dunnett检验对定量结果进行统计学分析。i，通过分析在4dpi时暴露于CTRL和肿瘤性脑类器官上清液的ZIKV感染的Vero细胞的百分比来量化子代ZIKV的产量。与CTRL类器官的上清液相比，暴露于肿瘤性脑类器官组的上清液后显著更多的Vero细胞感染。使用单因素ANOVA结合Dunnett检验对定量结果进行统计学分析。j，在0、6和14dpi时假处理或暴露于ZIKV后，MYCOE组肿瘤性脑类器官的落射荧光图像。k，在14dpi时假处理后在不同肿瘤性脑类器官组中GFP+肿瘤细胞群的FACS分选分析。将ZIKV处理组中GFP+细胞占总细胞的百分比标准化至GFP+细胞占假处理的肿瘤性脑类器官的百分比。使用未配对的双尾Student t检验对定量结果进行统计学分析。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。比例尺：a，d，f，g，j，1000μm。
图7：将基因畸变引入脑类器官中的神经干细胞/前体细胞中的策略。a，引入癌基因扩增和/或肿瘤抑制基因突变/缺失的基因组编辑技术的示意图。将睡美人转座子系统用于将癌基因表达和GFP表达元件整合至基因组中。将CRISPR-Cas9系统用于诱导肿瘤抑制基因的突变/缺失。b，通过在连续冷冻切片上的免疫荧光染色对核转染后1天的EB中核转染细胞的细胞性质进行定量。结果表明100％的GFP+细胞是SOX1+(n＝402)、N-CADHERIN+(N-CAD)(n＝451)和NESTIN+(NES)(n＝433)的神经干细胞/前体细胞。GFP+细胞均不是BRACHYURY+(BRA)(n＝398)或FOXF1+(n＝356)中胚层细胞，或SOX17+(n＝328)或CD31+(n＝267)内胚层细胞。c，d，核转染后1天解离的EB中贴壁细胞培养物的免疫荧光图像(c)和定量结果(d)。结果表明100％的GFP+细胞是SOX1+(n＝549)、N-CADHERIN+(N-CAD)(n＝403)和NESTIN+(NES)(n＝461)神经干细胞/前体细胞。GFP+细胞均不是BRACHYURY+(BRA)(n＝474)或FOXF1+(n＝402)中胚层细胞，或SOX17+(n＝334)或CD31+(n＝415)内胚层细胞。比例尺：c，50μm。
图8：通过基因组编辑计数引入的基因畸变的验证。a，RNA-seq和RT-PCR分析表明，来自MYCOE的肿瘤性脑类器官的肿瘤细胞显示出较高的MYC表达水平。b，在来自GBM-1肿瘤性脑类器官的肿瘤细胞中靶向CDKN2A和CDKN2B基因座的CRISPR-Cas9的三个示例性序列。RNA-seq和RT-PCR分析表明，来自GBM-1肿瘤性脑类器官的肿瘤细胞显示出较高的EGFR和EGFRvIII表达水平。c，在来自GBM-2肿瘤性脑类器官的肿瘤细胞中靶向NF1、PTEN和TP53基因座的CRISPR-Cas9的三个示例性序列。d，在来自GBM-3肿瘤性脑类器官的肿瘤细胞中靶向CDKN2A和PTEN基因座的CRISPR-Cas9的三个示例性序列。RNA-seq和RT-PCR分析表明，来自GBM-3肿瘤性脑类器官的肿瘤细胞显示出较高的EGFRvIII表达水平，但是EGFR没有显示出这样的结果。
图9：低放大倍数图像显示出4月龄肿瘤性类器官显示出脑肿瘤亚型特异性的细胞性质。a，核转染后1天和4个月对照和肿瘤组的免疫荧光照片证实了基因破坏的肿瘤起始能力。b，核转染后4个月对照和肿瘤组DAPI(蓝色)和GFP(绿色)染色的免疫荧光照片。c-h，神经元标记物HuC/D(c)、前体标记物SOX2(d，红色)、细胞周期标记物Ki67(e，红色)、CNS-PNET标记物CD99(f，红色)，以及神经胶质标记物S100β(h，红色)和GFAP(g，红色)的免疫荧光照片和定量结果。比例尺：a：上图：200μm，下图：1000μm；b-g：1000μm。
图10：高放大倍数图像显示出1月龄肿瘤性类器官显示出脑肿瘤亚型特异性的细胞性质。a，核转染后1天和1个月对照和肿瘤组的免疫荧光照片证实了基因破坏的肿瘤起始能力。b，核转染后1个月对照和肿瘤组DAPI(蓝色)和GFP(绿色)染色的免疫荧光照片。c-e，神经元标记物HuC/D(c，红色)、前体标记物SOX2(c，青色)、细胞周期标记物Ki67(d，红色)，以及神经胶质标记物S100β(e，红色)的免疫荧光照片和定量结果。比例尺：a：上图：200μm，下图：1000μm；b，1000μm；c-h：100μm。
图11：低放大倍数图像显示出1月龄肿瘤性类器官显示出脑肿瘤亚型特异性的细胞性质。a，核转染后1天和1个月对照和肿瘤组的免疫荧光照片证实了基因破坏的肿瘤起始能力。b，核转染后1个月对照和肿瘤组DAPI(蓝色)和GFP(绿色)染色的免疫荧光照片。c-e，神经元标记物HuC/D(c，红色)、前体标记物SOX2(c，青色)、细胞周期标记物Ki67(d)，以及神经胶质标记物S100β(e)的免疫荧光照片和定量结果。比例尺：a：上图：200μm，下图：1000μm；b-h：1000μm。
图12：肿瘤性脑类器官的体内扩增。将MYCOE组和GBM-1组的肿瘤性脑类器官植入肾包膜中。在异种移植后1周和1.5个月对移植肾进行分析，以评价肿瘤性脑类器官的体内扩增情况。
图13：药物检测测定表明肿瘤性类器官具有药物筛选潜能。a，在肿瘤性类器官上基于荧光素酶测定的药物筛选策略的示意图。b，相对荧光素酶活性的定量结果表明，在GBM1(CDKN2A-/CDKN2B-/EGFROE/EGFRvIIIOE)肿瘤性类器官中EGFR抑制剂阿法替尼和厄洛替尼显著降低荧光素酶的活性(CTRL组：n＝3；DMSO：n＝9；Canertinib：n＝9；培利替尼：n＝8；阿法替尼：n＝9；吉非替尼：n＝10；厄洛替尼：n＝9)。以标准化的荧光素酶活性表示。使用单因素ANOVA结合Dunnett检验对定量结果进行统计学分析。**，p<0.01。
图14：ZIKV对神经细胞不同亚型的各种趋向性。a，b，GFP(绿色)、ZIKV(洋红色)以及不同神经细胞亚型标记物，包括神经前体标记物SOX2(青色)和MSI1(青色)、神经胶质标记物S100β(青色)和神经元标记物HuC/D(青色)三重染色，以及代表肿瘤细胞的ZIKV(洋红色)和GFP(绿色)双重染色的免疫荧光图像和定量结果。结果表明，与其他非肿瘤神经细胞类型相比，显著更多的GFP+肿瘤细胞与ZIKV染色共定位。此外，SOX2+和MSI1+非肿瘤前体细胞的ZIKV感染率显著高于HuC/D+非肿瘤神经元，这与此前的观察结果一致。c,d，在不同肿瘤性脑类器官组的肿瘤内不同细胞类型ZIKV感染率的免疫荧光图像和定量结果。结果表明肿瘤区域内的细胞类型趋向性。使用单因素ANOVA结合Dunnett检验对定量结果进行统计学分析。*，p<0.05；***，p<0.001。比例尺：a，c，100μm。
图15：肿瘤性脑类器官产生更多ZIKV子代。a，在4dpi时暴露于CTRL和肿瘤性脑类器官上清液的ZIKV感染的Vero细胞的免疫荧光图像。使用DAPI(蓝色)对细胞染色，将ZIKV染色为绿色。b，qPCR分析表明，与ZIKV感染后的CTRL类器官相比，在肿瘤性脑类器官中具有显著更多的ZIKV基因表达。将肿瘤性脑类器官的ZIKV vRNA水平标准化为CTRL类器官的ZIKV vRNA水平。使用单因素ANOVA结合Dunnett检验对定量结果进行统计学分析。***，p<0.001。比例尺：100μm。
图16：在肿瘤性脑类器官的肿瘤区域中ZIKV感染导致显著更多的细胞凋亡。a，ZIKV感染的非肿瘤和肿瘤区域，以及假处理的非肿瘤和肿瘤区域中细胞凋亡标记物CASP3(红色)的免疫荧光图像。使用DAPI(蓝色)对细胞核染色，和使用GFP(绿色)染色，以表示肿瘤细胞。b，假处理后和在ZIKV感染后6dpi和14dpi时MYCOE肿瘤性脑类器官的ZIKV染色和细胞凋亡标记物CASP3的免疫荧光图像。比例尺：a，100μm；b，1000μm。
实施例
实施例1：材料和方法
1.1治疗构建体和材料
对于过表达构建体，基于睡美人转座酶系统，使用来自pCAGEN(Addgene目录号：11160；Matsuda和Cepko,2004,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,101,16–22)的CAG启动子替代了来自pCMV(CAT)T7-SB100(Addgene目录号：34879；Mátés等，2009,Nat Genet,41,753–61)的CMV启动子。将来自pT2/LTR7-GFP(Addgene目录号：62541；Wang等，2014,Nature 516,405–9)的IRDR-R和IRDR-L序列克隆进入pCAGEN以产生pCAG-GS/IR。从人cDNA中扩增用于过表达的cDNA，并将其克隆至pCAG-GS/IR的MCS中。借助于睡美人转座酶SB100X(pCAG-SB100X)，将CAG-GFP和CAG-癌基因整合至类器官中细胞的基因组中。为引入基因突变，将肿瘤抑制基因的短向导RNA克隆至CRISPR/Cas9载体pX330-U6-嵌合_BB-CBh-hSpCas9(Addgene目录号：42230；Ran等，2013,Nat Protoc,8,2281–308)中。所有克隆引物列于表1中。
表1：用于将癌基因克隆至睡美人构建体中的引物
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1.2人胚胎干细胞(hESC)和人诱导的多能干细胞(iPSC)培养物
从WiCell获得无饲养(FF)H9 hESC，经验证其核型正常且无污染。以无饲养方式，在Matrigel(Corning，hESC-经认证的基质)包被的培养板上使用mTeSR培养基(StemcellTechnologies)培养FF H9 hESC。从WiCell获得依赖于饲养(FD)的H9 hESC，经验证其无污染。根据WiCell的方案，在经CF-1-γ-照射的小鼠胚胎干细胞(MEF)(GSC-6001G，GlobalStem)上培养FD H9 hESC。常规检查所有细胞系均为支原体阴性。将所有干细胞保持在37℃下、5％CO2培养箱中。如先前所述(Lancaster等，2013,Nature,501,373-9)，使用标准程序来培养和分裂hESC。所有hESC均使用Infinium PsychArray-24试剂盒(Illumina)进行了验证。
1.3脑类器官的产生
如此前所述(Lancaster等，2013Nature 501,373–379；WO 2014/090993 A1；其均通过引用并入本文)，培养脑类器官。简言之，为了制备EB(类胚体)，将hESCs/hiPSC胰蛋白酶消化成单细胞，并将9,000个细胞接种至超低结合96孔板(Corning)的各孔中，各孔中含有含低浓度碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，4ng/ml)和50μM Rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂(Calbiochem)的人ES培养基。连续6天，每3天饲喂一次EB，然后将其转移至神经诱导培养基中以形成神经上皮组织。在神经诱导培养基中5-7天后，将EB埋入Matrigel(Corning)液滴中，并在不含维生素A的分化培养基(Diff-A)中培养。最后，将EB液滴转移到含维生素A的分化培养基(Diff+A)的10cm平皿中，并在定轨摇床上培养。每周更换培养基。
1.4类器官的核转染以诱导基因突变/扩增
为了引发脑肿瘤，在神经诱导培养结束时和在Matrigel包埋即将开始之前，我们在神经上皮细胞上引入了肿瘤抑制基因突变和/或癌基因扩增。简言之，收集10-15个EB，将其重悬在含有质粒的核转染试剂(人干细胞NucleofectorTM试剂盒，Lonza)中，并转移至核转染小瓶中。根据生产厂商的方案进行核转染。电穿孔后，将EB小心转移至含神经诱导培养基的6cm平皿中，并在37℃的培养箱中培养4小时。然后，将核转染的EB包埋入Matrigel中，并如所述的进行类器官培养。选择GFP+细胞显著过度生长的肿瘤性脑类器官进行进一步研究，其中样品是随机分配的。
1.5解离EB的贴壁细胞
核转染后1天，在37℃下将EB用胰酶消化20min，以制备单细胞悬液。然后，将细胞接种在聚-D-赖氨酸和层粘连蛋白包被的盖玻片上，所述盖玻片上含具有ROCK抑制剂的神经诱导培养基，在37℃下、5％CO2培养箱中培养。次日进行进一步的免疫荧光染色和分析。
1.6RNA-seq分析
在核转染后40天和4个月收集对照和肿瘤组的类器官，并在37℃、振荡条件下用胰酶消化半小时。根据示例性门控策略分选GFP+细胞，并根据生产厂商的说明书使用RNeasyMicro试剂盒(Qiagen)分离总RNA。使用RNA6000Nano Chip(Agilent Technologies)分析RNA的浓度和质量。根据生产厂商的方案，使用SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA试剂盒(TaKaRa)富集信使RNA(mRNA)。使用用于Illumina的NEB Next Ultra Directional RNA文库制备试剂盒(NEB)制备文库。对条形码样品进行多重处理，并在HighSeq 2500(Illumina)上对50bp SE进行测序。在VBCF NGS Unit(www.vbcf.ac.at)进行mRNA样品的分离、文库制备和测序。
通过将BWA(v0.7.12)与已知rRNA序列(RefSeq)进行比对，针对核糖体RNA筛选非链读数。将减去rRNA的读数与智人基因组(hg38)的TopHat(v2.1.1)进行比对。启用微外显子检索。此外，提供了基因模型GTF(UCSC，2015_01，hg38)。为了进行下游分析掩盖基因组上的rRNA基因座。使用Kallisto(v0.43.0)对比以每千碱基每百万转录本(TPM)估算比对的读数。而且，使用HTSeq(v0.6.1；交叉-非空)计数比对读数，使用DESeq2(v1.12.4)对基因进行差异表达分析。
在生物信息学分析之前，根据基因组编辑操纵检查癌基因的表达，并将GBM-3肿瘤性脑类器官组的一个4月龄样品从进一步分析中排除，因为其无法诱导EGFRvIII过表达。
使用来自CTRL类器官的正常细胞与来自不同肿瘤性脑类器官组的肿瘤细胞之间的前500个可变基因进行PCA。对聚类2或聚类3与CTRL之间的差异表达基因进行维恩图超几何检验，以及对聚类2与聚类3之间的差异表达基因进行KEGG通路富集分析，其中经校正的绝对log2fc值>0.5和经校正的p值<0.05。通过R语言进行维恩图超几何检验。使用DAVID生物信息学分析KEGG通路富集情况(david.ncifcrf.gov)(Huang等，2009,Nature Protocol,4,44-57)。使用MeV(Saeed等，2003,BioTechniques 34,374–8)产生RNA-seq的热图。对于肿瘤亚型基因谱图的热图(图3c)，从人原代肿瘤转录组分析(Sturm等，2016,Cell,164,1060-1072)的差异表达基因列表(经校正的绝对log2fc值>1和经校正的p值<0.05)中选择聚类2和聚类3(经校正的绝对log2fc值>1或<-1和经校正的p值<0.05)之间的差异表达基因。对于GBM侵袭性相关基因的分层聚类分析的热图(图5e)，从任何单个GBM组对比CTRL类器官选择差异表达基因，其中经校正的绝对log2fc值>0.5和经校正的p值<0.05。热图由log2(TPM)转换的数据创建，该数据使用“中位数中心基因/行”和“标准化基因/行”功能进行行(基因)标准化，以便以样品之间的相对表达报告数据。
1.7对通过SB和CRISPR/Cas9引入的基因组改变的验证
为了检测是否基因组编辑技术确实改变了肿瘤细胞中的基因组，对GFP+肿瘤细胞进行FACS分选，针对基因分型和RNA进行基因组DNA分离，以验证癌基因的表达。使用RNeasyMicro试剂盒(Qiagen)分离RNA，并根据此前的描述(Bagley等，2017,Nature Methods,14,743-751)合成cDNA。使用表2中列出的引物对MYC、EGFR/EGFRvIII和TBP进行RT-PCR。根据生产厂商的说明书，使用DNeasy血液&组织试剂盒(Qiagen)分离基因组DNA。使用表3中列出的引物扩增CRISPR/Cas9靶向的肿瘤抑制基因的基因组基因座。根据生产厂商的说明书，将PCR产物插入T载体(Promega)中。每个基因培养96个集落用于测序。
表2：RT-PCR的引物
Figure BDA0002407220270000361
表3：用于将肿瘤抑制基因向导RNA克隆至CRISPR-Cas9构建体的引物
Figure BDA0002407220270000362
Figure BDA0002407220270000371
1.8肾包膜下移植
所有操作均按照动物保护机构的指导原则进行。简言之，用氯胺酮溶液麻醉成年MF1 nu/nu雄性小鼠(8至12周)。用70％酒精消毒手术部位后，切开一个1.5-2cm的切口，小心地将肾脏外置。使用移液器尖端将肾包膜切开2-4mm，并使用钝头玻璃巴斯德移液管制作移植物的包膜口袋。将每组的2月龄类器官分别小心地植入肾包膜下方。然后将肾脏轻轻地放回腹膜后腔。在外置期间，通过使用含青霉素/链霉素的PBS使肾脏保持水化。异种移植1.5个月后收集肾脏以用于进一步分析。
1.9免疫荧光和免疫组化
对于免疫荧光染色，使用4％多聚甲醛(PFA)在4℃下将组织固定过夜。将组织在30％蔗糖中脱水过夜，包埋在组织-Tek(VWR)中，然后以16μm冷冻切片。对于免疫荧光染色，在室温下(RT)，在含0.25％Triton X-100和4％正常驴血清(NDS)的PBS中，将切片封闭和透化。在4℃下，在含0.1％Triton-X-100和4％NDS的PBS中将切片与一抗共同孵育。用PBS洗涤3次(10min)后，将切片与在含0.1％Triton-X-100和4％NDS的PBS中的二抗和DAPI连续孵育，以观察免疫染色。免疫荧光使用的一抗和二抗列于表4和表5中。使用共聚焦显微镜(Zeiss LSM 780)捕获图像。使用Fiji对来自3个独立的肿瘤性类器官制备物的图像进行定量。
表4：一抗
Figure BDA0002407220270000372
Figure BDA0002407220270000381
表5：二抗
Figure BDA0002407220270000382
为了进行组织学和免疫组化染色，将组织在4％多聚甲醛中固定过夜。使用PBS洗涤固定的组织，通过浸入梯度升高的乙醇(70％、90％和100％乙醇)脱水，在石蜡中包埋，切成2至5μm的厚度。在Microm HMS 740自动染色机中，通过常规的苏木素和伊红(H&E)方案对切片进行染色。使用Leica Bond III自动免疫染色机进行免疫组化。在本研究中使用的一抗和二抗列于表4和表5中。使用Zeiss Axioskop 2MOT显微镜审查载玻片，并使用SPOTInsight数码相机获取图像。还使用Pannoramic 250Flash II扫描仪(3D Histech)扫描载玻片。使用Pannoramic Viewer软件(3D Histech)审查数字化的载玻片并获取图像。由经董事会认证的兽医比较病理学家(A.K.)审查载玻片。
1.10在肿瘤性类器官上进行药物检测
为了进行药物检测，首先使肿瘤性类器官生长2个月，然后用药物处理40天。应用EGFR抑制剂阿法替尼(www.selleckchem.com，目录号：S1011)、厄洛替尼(www.selleckchem.com，目录号：S7786)、吉非替尼(www.selleckchem.com，目录号：S1025)、Canertinib(www.selleckchem.com，目录号：S1019)和培利替尼(Sigma-Aldrich，目录号：257933-82-7)(终浓度1μM)，并将DMSO作为对照。药物处理后，用胰酶消化肿瘤性类器官以制备单细胞制备物，随后进行FACS分选分析。计数总细胞数，以评价药物的细胞毒性。
1.11ZIKV原种的生产和感染
将ZIKV毒株(H/PF/2013)在Vero细胞中传代以建立病毒原种。简言之，使用MOI0.1的ZIKV感染Vero细胞(保持在含10％胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺的DMEM培养基中)，并将其在37℃下、在5％CO2湿润气氛下孵育。在感染后3天，收集感染细胞的细胞上清液，并在1500rpm下离心10min进行纯化，以除去细胞碎片。将非感染细胞的上清液作为假处理。将上清液分装并在-80℃下保存。为确定病毒滴度，使用系列稀释的ZIKV原种感染在96孔板中融合的Vero细胞。对于每个稀释液，在8个平行孔中进行测定，最后一列96孔板作为无病毒的细胞对照。将细胞在37℃下、在5％CO2湿润气氛下孵育。在感染后5天，通过显微镜检查出现的细胞病变作用(CPE)。由在细胞培养物中诱导的CPE计算TCID50。所有ZIKV实验均在生物安全2级以上(BSL2+)的屏障中进行。为了感染类器官，将在Diff+A培养基中培养的130至160日龄的CTRL或肿瘤性类器官转移至6或10cm平皿中。在Diff+A培养基中将ZIKV原种和等体积的假处理稀释至0.5x10^6个TCID50颗粒/ml，并将2ml经稀释的原种/类器官(共计10^6个TCID50颗粒/类器官)加入平皿中，在37℃下、在5％CO2湿润气氛下在定轨摇床上孵育。每4天更换一次培养基。在ZIKV研究中进行的所有实验均至少独立地进行3次。
1.12统计学分析
使用GraphPad Prism 7进行统计学分析。除了涉及基于NGS方法的那些以外，使用未配对的双尾Student t检验针对在所有实验中两个实验组之间的显著性对定量结果进行统计学分析。接受的统计学上显著的阈值为p<0.05。
实施例2：在类器官中的克隆诱变诱导肿瘤过度生长
脑肿瘤的特征是多种DNA畸变，这会导致癌基因过表达或肿瘤抑制基因功能丧失(McLendon等，2008,Nature,455,1061-8)。重要的是，最近对脑癌亚型的重新分类包括将DNA畸变作为定义特征(Louis等，2016,Acta Neuropathol,131,803-20)，强调了对基因定义的人类脑癌模型的需求。为了再现多种肿瘤发生事件，我们将睡美人(SB)转座子介导的基因插入与基于CRISPR/Cas9的诱变作用相结合。在matrigel包埋之前，通过电穿孔将编码(1)SB转座酶、(2)翼侧为SB反向重复序列(IR)的GFP、(3)翼侧为IR的任何癌基因和(4)表达Cas9核酸酶的多种质粒的质粒的组合与一个或多个向导RNA(gRNA)一起引入脑类器官中(图7)。在方案的这一阶段(图1a)，神经诱导完成并且神经干细胞和祖细胞(NS/PC)在类胚体(EB)表面上扩增。pCAG-GFP核转染后24h的EB免疫染色表明，100％GFP+细胞为SOX2+、N-CADHERIN+(N-CAD+)和NESTIN+(NES+)的NS/PCs(图1b和图7b-d)。GFP+细胞均不是BRACHYURY+(BRA+)或FOXF1+中胚层细胞，或SOX17+或CD31+内胚层细胞(图1b和图7b-d)。因而，电穿孔的质粒仅能递送至NS/PC中，其通常被认为是脑癌的起源细胞(Chen等，2012,Cell,149,36–47)。
为了探讨是否能够在脑类器官中诱导肿瘤样过度生长，我们检测了在GBM中观察到的18种单基因突变或扩增以及15种最常见的临床相关组合(McLendon等，2008,Nature,455,1061-8)(表6)。在大部分携带CAG-GFP插入的电穿孔细胞中，将GFP强度用于量化携带基因异常的细胞的增殖。电穿孔后1天，所有组的EB均含有相似量的GFP+细胞(图2a，b)。然而，1个月后，在携带MYC-扩增(MYCOE)的类器官中，以及在携带CDKN2A-/CDKN2B-/EGFROE/EGFRvIIIOE、NF1-/PTEN-/p53和EGFRvIIIOE/CDKN2A-/PTEN-的类器官中观察到了GFP+细胞的明显过度生长(图2a，c)。因为这些基因畸变的组合是在GBM中常见的，所以我们分别将其称为GBM-1、GBM-2和GBM-3。因而，脑类器官可用于检测在同一来源细胞内诱导的不同基因畸变的肿瘤发生能力。
表6：遗传畸变
Figure BDA0002407220270000401
Figure BDA0002407220270000411
缩写
GBM：胶质母细胞瘤；
CNS-PNET：中枢神经系统原始神经外胚层肿瘤；
MB：髓母细胞瘤
AT/RT：非典型畸胎样/横纹肌样瘤
为了证实基因组编辑技术确实改变了肿瘤细胞中的基因组，分析了癌基因和/或CRISPR靶向区域序列的表达，并且结果证实了不同组的肿瘤细胞均携带预计的基因突变/扩增(图8a-d)。因而，可以将脑类器官作为检测在同一细胞来源中诱导的不同基因畸变的肿瘤发生能力的平台。
实施例3：MYCOE和GBM样肿瘤具有独特的转录谱
为检测脑瘤样类器官是否类似于不同脑肿瘤亚型，我们通过FACS在分离的GFP+细胞上进行了转录组分析。组间基因表达差异的主成分分析(PCA)鉴定出了三个不同的聚类。聚类1包括仅包含CAG-GFP的所有对照(CTRL)类器官和靶向tdTomato的对照gRNA(图3a)。聚类2包括携带MYCOE构建体的类器官，而聚类3包括携带存在于GBM(GBM-1、GBM-2、GBM-3)中的遗传畸变的类器官。重要的是，在MYCOE组中失调的大部分基因不同于在GBM组中失调的那些(图3b)，这证实了PCA分析的结果。通过DAVID生物信息学工具(Huang等，2009,NatureProtocol,4,44–57)进行的KEGG通路分析证实了聚类3中类器官中的神经胶质瘤标签，并且显示出PI3K-Akt、Rap1、ErbB、HIF1、NF-κB和雌激素信号传导通路的上调，其也与GBM相关(Gutmann等，1997,Oncogene,15,1611–6；Clark等，2012,NEO,14,420–IN13；Mayer等，2012,Int.J.Oncol.,41,1260–70；Puliyappadamba等，2014,Mol Cell Oncol,1,e963478)(图3C)。在来自聚类2的类器官中，我们检测到代谢通路和细胞周期基因的上调，但也检测到已知与MYC相关的Hippo、WNT、TGFβ和p53信号传导途径(Rogers等，2012,British Journal ofCancer,107,1144–52；Hutter等，2017,Genes,8,107–19；Atkins等，2016,Curr.Biol.,26,2101–13)(图3c)。此外，MYCOE组显示出上皮发育标签的上调，提示出现了来源于神经上皮细胞的CNS-PNET-样肿瘤。
为了证实类器官肿瘤与原发性肿瘤组织的相似性，我们针对其在肿瘤性类器官中的表达检测了CNS-PNET与GBM之间的基因表达差异(Sturm等，2016,Cell 164,1060–72)。分层聚类表明，来自MYCOE组的肿瘤性类器官显示出较强的CNS-PNET标签。聚类3的类器官显示出GBM基因的上调(图3d)，我们在下文中将该聚类称为GBM组。综上所述，我们的观察结果表明，我们通过在同一来源的细胞中诱导不同的基因修饰，成功建立了可再现两种亚型脑肿瘤的肿瘤性类器官。
实施例4：MYCOE和GBM类器官肿瘤具有不同的细胞性质。
为了表征MYCOE和GBM肿瘤性类器官的细胞性质，我们在核转染后4个月检测了特异性CNS-PNET和GBM标记物。CNS-PNET的特征是具有未分化的SOX2+细胞和CD99高表达(Rocchi等，2010,J.Clin.Invest.,120,668–80)，而神经胶质标记物S100β和GFAP以及增殖标记物Ki67是用于诊断GBM的。
在CTRL类器官中，大部分GFP+细胞是HuC/D+神经元(图3f和图9c)，而仅少部分GFP+细胞保持SOX2(图3g和图9d)和Ki67+(图3h和图9e)，以及在GFP+细胞中基本上不存在神经胶质标记物S100β(图3j和图9h)和GFAP(图3k和图9g)。在MYCOE组中，极少的GFP+细胞是HuC/D+(图3f和图9c)，或表达神经胶质标记物S100β(图3j和图9h)或GFAP(图3k和图9g)。而相反的是，大部分GFP+细胞是SOX2+(图3g和图9d)，以及几乎半数的细胞表达Ki67(图3h和图9e)。此外，大部分MYCOE/GFP+细胞表达高水平的CD99抗原(图4i和图9f)，这进一步证实了其具有CNS-PNET-样的细胞性质。在与GBM相关的组中，GFP+区是S100β+(图3j和图9h)和GFAP+(图3k和图9g)阳性的神经胶质细胞，并且仅含有少量HuC/D+神经元(图3f和图9c)。与CTRL类器官相比，我们还检测到更多的SOX2+(图3g和图9d)和Ki67+(图3h和图9e)细胞，其也存在于GBM肿瘤的核心部位中(Schmitz等，2007,British Journal of Cancer,96,1293–301)。此外，在GBM相关组的GFP+区中显示出了CD99水平升高(图4i和图9f)，在GBM组织中也报告了该特征(Seol等，2012,Genes&Cancer,3,535–49)。
我们还考察了不同组类器官肿瘤组织的组织排布。在CTRL类器官中，位于玫瑰花样皮质区域脑室带(以虚线标记)的GFP+细胞表达SOX2和Ki67，而GFP+/HuC/D+神经元位于基底皮质区中(图3e-k和图9b-g)。在MYCOE组中，GFP+细胞既形成大片细胞又形成小的玫瑰花样结构(图3e-k和图9b-g)，这也经常在CNS-PNET组织中观察到。而相反的是，GBM组显示出混乱的结构，破坏了有序的皮质结构(图3e-k和图9b-g)。值得注意的是，1月龄对照类器官和肿瘤性类器官的染色与4月龄类器官显示出相似的细胞性质趋势和相同的组织学特征(图10a-e和图11a-e)。
因而，通过产生不同的遗传畸变而诱导的肿瘤性类器官，从相同来源的细胞开始，重现并建立了CNS-PNET或GBM的细胞性质和组织形态结构。
实施例5：肿瘤性类器官的肾包膜下移植
为了证实类器官肿瘤能够在体内生长，我们将其植入了免疫缺陷小鼠的肾脏包膜下腔，这种环境能够为植入的细胞提供充足的血液供应(图4a)。在对照组中，5个类器官中有4个在6周之内吸收，剩余的一个类器官减少为仅一小簇细胞(图4b)，这些细胞失去了细胞性和结构细节(图4c)。而相反的是，在15个肿瘤性类器官中有13个保留了下来，并且通常扩增至甚至突破了肾包膜(图4b和图12)。抑制的MYCOE组类器官大量增殖，通常侵入了邻近的肾皮质。其形成了与CNS-PNET非常相似的细胞片和玫瑰花样结构(图4c，e’，e”)。免疫组化分析显示，很多神经上皮区域是NS/PC标记物SOX1阳性(图4d)，但是神经胶质标记物GFAP(图4d)或神经元标记物MAP2(图4f)阳性的细胞非常少，表明其是原始的低分化状态。相反的是，GBM组显示出神经胶质标记物GFAP、NS/PC标记物SOX1和细胞周期标记物Ki67的高表达(图4d)。GBM-1和GBM-3类器官显示出神经胶质(箭头的头部)肿瘤样扩增(图4c)，而GBM-2显示出神经胶质(箭头的头)肿瘤样增殖，并伴有成熟神经元外观的其他细胞(完整的箭头)，这让人联想到神经胶质瘤(图4c)。因而，在裸鼠中肾移植后，肿瘤性类器官能够在体内移植和扩增并保持其亚型性质。
实施例6:GBM-样肿瘤性脑类器官适于研究肿瘤与正常组织之间的相互作用
与诸如2D细胞培养物或3D肿瘤球的体外脑肿瘤模型相比，本发明的肿瘤性脑类器官的显着特征是通过在脑类器官培养过程中在极小部分细胞中引入基因畸变来引发肿瘤。这不仅模拟了人体内肿瘤的发生，而且导致混合结构，该结构包含彼此相邻的肿瘤组织和正常组织。这一优势使该方法成为研究某些基本肿瘤生物学问题(如侵袭性)的理想平台，侵袭性是GBM患者高死亡率的主要原因之一。
已知GBM广泛浸润至相邻的脑实质。在GBM进展过程中，上皮-间质转化(EMT)赋予肿瘤细胞必要的迁移和侵袭能力。因此，在GBM中观察到了诱导EMT的转录因子高表达，这也可能激活了其间质特征。关于侵袭性，GBM肿瘤细胞与细胞外基质(ECM)之间的相互作用也涉及很多蛋白酶，包括基质金属蛋白酶。
为了评估是否肿瘤性脑类器官能够用于研究GBM的侵袭性，我们在GBM样肿瘤性脑类器官中评价了肿瘤和正常细胞的界面。我们观察到在正常区域内的GFP+肿瘤细胞存在侵袭性(图5a-c)。在GBM组肿瘤性脑类器官的肾脏异种移植物中也观察到了破坏肾包膜的肿瘤细胞的小浸润灶(图5d)。为分析GBM组肿瘤细胞的侵袭性，进一步进行了RNA-seq分析以比较在4月龄类器官的肿瘤细胞和正常细胞中侵袭相关基因的表达。分层聚类分析表明，与CTRL类器官相比，不同GBM组的肿瘤细胞均具有更高表达水平的GBM侵袭性基因，分别包括EMT相关的转录因子(TGFβ、TGFβ1I1、STAT3、SNAI2、ZEB1、ZEB2)、迁移相关受体(CXCR4)、胞外基质分子(ITGA5)、蛋白酶(PLAU、CTSB、ADAM10、ADAM17、MMP2、MMP14)(图5e)。此外，与CTRL类器官中的正常细胞相比，GBM组的肿瘤细胞表现出很多抑制肿瘤侵袭的基因下调，如基质金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP2、TIMP3)和紧密连接成分(CLDN1、CLDN2、CLDN3、OCLN)(图5e)。为了证实RNA-seq的结果，使用针对间质标记物波形蛋白(VIM)、侵袭相关蛋白酶尿激酶(PLAU)和基质金属蛋白酶2(MMP2)的抗体进行了免疫染色。结果表明，与周围正常组织相比，在肿瘤性脑类器官的肿瘤细胞中全部那些GBM侵袭性基因均具有更高的表达水平(图5f)。有趣的是，与GBM组相比，在MYCOE肿瘤性脑类器官中大部分与侵袭相关的基因下调(图5e)，这与同星形胶质瘤相比，胚胎肿瘤的局部浸润趋势较低相关。
这些观察结果证实了来自GBM组肿瘤性脑类器官的肿瘤细胞的侵袭性，并且提示使用肿瘤性脑类器官研究在肿瘤和正常细胞之间界面上的致癌突变性质和侵袭性细胞行为的巨大潜力。
实施例7：筛选EGFR抑制剂以减少肿瘤生长
为了评价肿瘤性脑类器官在人类脑肿瘤临床前研究中的潜在用途，我们检测了使用该模型进行靶向药物检测的适用性。由于我们的方法通过引入确定的基因畸变启动肿瘤发生，因而将肿瘤性脑类器官用于靶向药物检测是可能的。为了对此进行检验，我们使用了一种目前在GBM的临床试验(ClinicalTrials.gov NCT编号：NCT02423525)中使用的EGFR抑制剂阿法替尼进行概念验证。给药40天后，阿法替尼显著减少GBM-1组和GBM-3组中的肿瘤细胞数量(图6a，b)，但是其对MYCOE组和GBM-2组未显示出影响(图6a，b)。这与仅GBM-1和GBM-3类器官主要由EGFR过度激活驱动的事实相一致。因而，肿瘤性脑类器官可用于测试化合物对源自特定驱动基因突变的肿瘤的作用。
为了将这种方法用于大规模筛选，我们改进了肿瘤性脑类器官系统，使其包含萤火虫荧光素酶来测量肿瘤尺寸(图13a)。将5个不同EGFR抑制剂，包括已批准用于不同类型癌症的阿法替尼、厄洛替尼和吉非替尼，和实验药物Canertibib和培利替尼用于来自GBM-1组的类器官，其主要由EGFR信号传导所驱动。给药40天后，阿法替尼和厄洛替尼显著降低萤火虫荧光素酶的活性，而其他抑制剂仅具有非显著性作用(图13b)。因而，这些结果表明我们的模型能够鉴定不同化合物的有效性并适于进行药物筛选。
实施例8：寨卡病毒的肿瘤趋向性和溶瘤作用
肿瘤性脑类器官含有正常和肿瘤组织，这使其成为评估肿瘤趋向性和溶瘤病毒疗法有效性的理想模型。在本研究中，我们检测了亲神经性ZIKV进行概念验证。在胚胎中，ZIKV感染神经前体，导致大量细胞凋亡和严重的胎儿小头畸形(Qian等，2016,Cell,165,1238–54；Tang等，2016,Cell Stem Cell,18,587–90)。在成年人中，该病毒仅引起轻度症状，并且其与严重疾病如格林巴利综合征的联系是有争议的(Silva和Souza,2016,Rev.Soc.Bras.Med.Trop.,49,267-73)。最近的研究表明ZIKV能够特异性感染GBM干细胞(Zhu等，2017,J.Exp.Med.,214,2843-57)，其与NS/PC具有相似之处(Ward等，2007,Annu.Rev.Pathol.Mech.Dis.,2,175-89)。
在本研究中，我们使用了大于4月龄的类器官，其主要由分化的神经元和神经胶质细胞组成(Pasca等，2015,Nature Methods,12,671-8；Renner等，2017,EMBO J,36,1316-29)(图6c)。感染后(dpi)6天，对照片的免疫荧光分析和定量分析表明在GFP+肿瘤区域中存在广泛的ZIKV感染，而在GFP-非肿瘤区域几乎没有感染(图6d，e)。有趣的是，在肿瘤区域中的ZIKV+细胞表达神经前体标记物MUSASHI1(MSI1)(图6f)，其在神经胶质瘤中也是高表达的(Kaneko等，2000,Dev.Neurosci.,22,139-53；Fox等，2015,Annu.Rev.Cell Dev.Biol.,31,249-67)。对在非肿瘤区域和GFP+肿瘤细胞的不同神经细胞亚型中的ZIKV感染率进行比较表明，发现ZIKV对肿瘤细胞的趋向性比其他神经细胞更高，甚至包括非肿瘤区域中的NS/PC(图14a，b)。对肿瘤区域中ZIKV感染的细胞亚型进行进一步定量后发现，GBM类器官组织中大部分ZIKV感染的细胞是SOX2+、MSI1+NS/PC或S100+神经胶质细胞，而不是HuC/D+神经元，这与此前的工作是一致的(Zhu等，2017,J.Exp.Med.,214,2843-57)(图14c，d)。在MYCOE肿瘤性脑类器官中，ZIKV感染的细胞主要是SOX2+和MSI1+NS/PC(图14c，d)。此外，由于已经发现MSI1促进ZIKV复制(Chavali等，2017,Science,357,83-8)，因而我们对CTRL和肿瘤性脑类器官产生的ZIKV颗粒进行了比较。该实验表明，在4dpi时，肿瘤性脑类器官的子代ZIKV产率显著高于CTRL类器官(图6i和图15a，b)。
接下来，我们检测了是否ZIKV感染能够在肿瘤性脑类器官中引起肿瘤细胞凋亡。我们染色了凋亡标记物活化的Caspase3(CASP3)，并发现在类器官中ZIKV感染的肿瘤区域中大部分是CASP3+，而非肿瘤区域和CTRL类器官，以及暴露于假处理的肿瘤性脑类器官含有明显较少的CASP3+细胞(图6g，h和图16)。在MYCOE组中，ZIKV的溶瘤作用是特别显着的，甚至可以通过落射荧光分析观察到(图6j)。为了进一步证实ZIKV感染与非肿瘤细胞相比更偏向于在肿瘤细胞中诱导细胞毒性，我们测量了14dpi时在肿瘤性脑类器官中的GFP+细胞组分。与暴露于假处理的肿瘤性脑类器官的比例相比，在暴露于ZIKV的肿瘤性脑类器官中GFP+细胞的比例显著降低(图6k)，表明ZIKV对肿瘤细胞显示出趋向性，并且在PNET和GBM肿瘤性脑类器官中显著减少肿瘤细胞的数量，而对正常细胞的损伤较小。
实施例9：重现和比较
为了重现在人脑癌患者中的遗传畸变，我们能够在脑类器官中诱导肿瘤样过度增殖。肿瘤性类器官显示出很多癌症特征，如细胞性质、癌症通路特异性转录组谱以及能够在体内扩增和侵袭。我们检测了3个突变体的组合，其诱导神经胶质定向分化和异常过度生长，表明其具有神经胶质肿瘤样性质。而且，通过过表达MYC，我们能够产生显示出与人CNS-PNET(Sturm等，2016,Cell,164,1060-70；Ellison等，2012,Neuropathology)具有非常相似的组织病理学特征、细胞性质和转录组标签的肿瘤性类器官，CNS-PNET是一种迄今为止尚无成功的动物或体外模型的肿瘤。有趣且值得注意的是，仅MYC的扩增就可以在很短的时间内在脑类器官中引发CNS-PNET样肿瘤形成，而其在动物模型中则需要更长时间且发生率较低(Momota等，2008,Oncogene,27,4392–401)。
与此前的GBM培养物模型(Hubert等，2016,Cancer Res,76:2465–77)不同的是，肿瘤性脑类器官可以对癌症测序项目中确定的基因组畸变进行功能分析，且均在相同的遗传背景下进行。通过在由患者iPS细胞起始的类器官中引入基因组畸变，还能够将肿瘤性类器官用于检测个体患者对驱动突变的不同组合的敏感性。与胶质母细胞瘤细胞系不同的是，肿瘤性类器官在某种程度上模拟了体内的结构组织排布。其在同一培养物中含有肿瘤细胞和正常细胞，以使得能够分析转化的和未转化的细胞之间的相互作用。对于药物筛选，这种特殊情况允许对抗肿瘤作用进行分析，并在同一系统中进行安全性测试。像所有类器官系统一样，肿瘤性类器官由于缺乏脉管系统而受到限制，因此无法观察到GBM的某些特征，如肾小球状血管增生和血管周围栅栏状坏死。共培养类器官系统(如针对小胶质细胞产生的)(Muffat等，2016,Nat Med,22,1358-67)能够克服这些局限性。
我们的结果将ZIKV添加到溶瘤病毒列表中，这些溶瘤病毒可用于以最小程度破坏非肿瘤组织的方式选择性靶向肿瘤细胞。已在人多形性胶质母细胞中检测了多种不同病毒属和科的病毒，并考虑将其用于针对GBM的临床应用(Russell等，2012,Nat Biotechnol.,30,658–70)。ZIKV是一种胎儿亲神经性病毒，在发育的胎儿中其能够靶向神经祖细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞前体和少量神经元(Qian等，2016,Cell,165,1238–54)。有趣的是，我们的数据表明，ZIKV的肿瘤趋向性不能简单地用未成熟祖细胞的丰度来解释，因为在非肿瘤区或CTRL类器官中的一部分MSI1+细胞未被感染。在成人中，ZIKV感染的影响较轻微，只有极少的疑似并发症(Li等，2016,Neuron,92,949-58)。因而，ZIKV的临床应用应当是可行的。无论如何，我们的结果证实了脑肿瘤性类器官模型在检测非常规治疗性方法方面具有强大的功能。
序列表
<110> IMBA-莫利库尔生物技术研究所
<120> 肿瘤类器官模型
<130> r73278
<150> EP 17190447.7
<151> 2017-09-11
<160> 40
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 2
gacaccggtt tacgcacaag agttccgtag 30
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<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
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gacggcgcgc ccgccaccat gcgaccctcc gggacg 36
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 4
gacaccggtt catgctccaa taaattcact g 31
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
gacggcgcgc ccgccaccat ggggacttcc catccggcgt tc 42
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
gacaccggtt tacaggaagc tgtcttccac cag 33
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<220>
<223> 引物
<400> 7
gacggcgcgc ccgccaccat ggctacctct cgatatgagc 40
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<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 8
gacaccggtt cactccggat taccttcatc c 31
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 9
gacggcgcgc ccgccaccat gtgcaatacc aacatgtctg 40
<210> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 10
gacaccggtc taggggaaat aagttagcac 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 11
cattttggca aagaattccc tcgataccgg gggcgcgccc gccaccatgg ctcgtacaaa 60
gcagactgc 69
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<212> DNA
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<220>
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cgggaatgct agcaatcatt ggttgatcag ctttgttacc ggtttaagca cgttctccac 60
gtatg 65
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caccgtcccg ggcagcgtcg tgcac 25
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<212> DNA
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aaacgtgcac gacgctgccc gggac 25
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<211> 25
<212> DNA
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caccgacgga gtcaaccgtt tcggg 25
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<212> DNA
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<400> 16
aaaccccgaa acggttgact ccgtc 25
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<220>
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caccgaactt gtcttcccgt cgtgt 25
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aaacacacga cgggaagaca agttc 25
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caccgtcgac gctaggatct gactg 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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aaaccagtca gatcctagcg tcgac 25
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<211> 25
<212> DNA
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<220>
<223> 引物
<400> 23
caccgcggtg gcggccgttt ttcgg 25
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<212> DNA
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<400> 24
aaacccgaaa aacggccgcc accgc 25
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<212> DNA
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caccgaaatt ccgagtttcg agcga 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 26
aaactcgctc gaaactcgga atttc 25
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<212> DNA
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<223> 引物
<400> 27
caccgagaac ctcggaacat acgg 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引物
<400> 28
aaacccgtat gttccgaggt tctc 24
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caccgcagat agtcccggtc cggcg 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 30
aaaccgccgg accgggacta tctgc 25
<210> 31
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
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caccgaaaca gctcgttgta ccgct 25
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 32
aaacagcggt acaacgagct gtttc 25
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tcggattctc tgctctcctc 20
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<212> DNA
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<400> 35
cgggctctgg aggaaaag 18
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<400> 36
gcccttcgca cttcttacac 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
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gggcaccact ccactgtatc 20
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<212> DNA
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<400> 38
cgaagtgcaa tggtctttag g 21
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ttggtcatga tactgctgat tgc 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 40
ccttccacaa agtccctatt gc 22

Claims (15)

1.一种产生在非癌组织中生长的癌症人工3D组织培养物的方法，所述方法包括下述步骤：提供多能干细胞或祖细胞的聚集体，在3D生物相容性基质中培养和扩增所述干细胞或祖细胞，其中使所述细胞分化以便将所述聚集体发展成所需尺寸的组织培养物；其中在任何所述步骤期间或在组织培养中通过表达癌基因和/或通过抑制肿瘤抑制基因使所述细胞的至少一部分经历致癌作用，并且还包括使具有表达的癌基因或抑制的肿瘤抑制基因的所述细胞发展成癌细胞的步骤。
2.一种对候选基因或试剂筛选其对致癌作用的影响的方法，所述方法包括产生人工3D组织培养物，所述方法包括下述步骤：提供多能干细胞或祖细胞的聚集体，在3D生物相容性基质中培养和扩增所述干细胞或祖细胞，其中使所述细胞分化以便将所述聚集体发展成所需尺寸的组织培养物；其中在任何所述步骤期间或在组织培养中通过表达或抑制所述候选基因或通过使用所述候选试剂处理所述细胞使所述细胞的至少一部分经历致癌作用，并且还包括在使它们发展成癌细胞的条件下培养所述细胞的步骤。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中将所述多能干细胞分化成神经细胞和/或所述组织发育成类器官。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述3D生物相容性基质是凝胶，优选胶原凝胶和/或水凝胶。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述细胞的聚集体和/或3D基质在悬浮培养物中培养。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述癌基因、肿瘤抑制基因或候选基因选自CDKN2A、CDKN2B、CDKN2C、NF1、PTEN、p53、ATRX、RB1、CDK4、CDK6、MDM2-B、EGFR、EGFRvIII、PDGFRA、H3F3A、MYC、SMARB1、PTCH1、CTNNB1、MET、RTK、FGFR1、FGFR2、FGFR3、PI3-激酶、PIK3CA、PIK3R1、PIK3C2G、PIK3CB、PIK3C2B、PIK3C2A、PIK3R2、PTEN、BRAF、MDM2、MDM4、MDM1、IDH1、IDH2；优选地选自MYC、CDKN2A、CDKN2B、EGFR、EGFRvIII、NF1、PTEN、p53；或其组合，如(i)CDKN2A、CDKN2B、EGFR和EGFRvIII，(ii)NF1、PTEN和p53，或(iii)EGFRvIII、CDKN2A和PTEN。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中致癌作用是在所述多能干细胞已被刺激进行组织特异性分化，如神经分化之后，优选地在所述干细胞在3D生物相容性基质中扩增之前，和/或其中致癌作用是所述基因的重组修饰，优选通过引入用于表达所述癌基因的转基因或用于抑制所述肿瘤抑制基因的基因抑制构建体，特别优选地，其中通过核转染，如电穿孔将所述转基因或构建体引入细胞中。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，还包括鉴定在所述组织培养物中的癌细胞的步骤。
9.一种人工3D组织培养物，所述培养物包含非癌组织和癌组织，其中所述癌组织过表达癌基因和/或具有抑制的肿瘤抑制基因，其中所述组织(i)是可以通过根据权利要求1至8中任一项所述的方法获得的；和/或(ii)至少在所述癌组织的细胞中包含转基因或用于抑制肿瘤抑制基因的构建体；和/或(iii)包含3D生物相容性基质，优选凝胶、胶原凝胶或水凝胶。
10.根据权利要求9所述的组织培养物，其中所述组织培养物包含神经组织且其中所述癌组织是神经组织肿瘤。
11.根据权利要求9或10所述的组织培养物，其中非癌组织至少在所述组织的核心并且所述癌组织至少在所述组织的表面。
12.一种对候选化合物或试剂或条件检测或筛选致癌作用或其对癌组织的影响的方法，所述方法包括将权利要求1至8中任一项所述的方法中的细胞或组织与所述候选化合物或试剂接触或者将其暴露于所述条件，或者将权利要求9至11中任一项所述的组织与所述候选化合物或试剂接触或者将其暴露于所述条件；并且保持对所述接触的组织进行培养，并观察与未与所述候选化合物或试剂接触或者暴露于所述条件的所述组织相比在所述组织中的任何改变。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述候选试剂包含病毒，优选黄病毒，或者其中所述候选化合物包含生物分子，如蛋白或核酸。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述条件包括培养环境的差异，优选减少或增加营养素，如葡萄糖、脂肪或脂肪酸，或者改变氧化还原电位或改变温度。
15.用于提供根据权利要求1至8中任一项所述的组织培养物的试剂盒，所述试剂盒包含(i)转染载体，其包含癌基因转基因或用于破坏肿瘤抑制基因的构建体，(ii)3D生物相容性基质，优选地还包含(iii)组织分化剂、干细胞培养基、核转染培养基或其组合。
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