KR20210027290A - 신경 줄기 세포 조성물 및 신경변성 장애를 치료하는 방법 - Google Patents

신경 줄기 세포 조성물 및 신경변성 장애를 치료하는 방법 Download PDF

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Abstract

신경변성 질환 및 CNS 장애, 예컨대 헌팅턴 병의 치료를 위한 줄기 세포 기반 요법이 본원에서 제공된다. 요법은 운동 결핍을 개선하였고 시냅스 변경(synaptic alteration)을 구제하였다. 세포는 전기생리학적으로 활성인 것으로 나타났고 운동 및 말기 인지 장애를 개선하는 것으로 나타났다.

Description

신경 줄기 세포 조성물 및 신경변성 장애를 치료하는 방법
신경변성 질환 및 CNS 장애, 예컨대 헌팅턴 병의 치료를 위한 줄기 세포 기반 요법이 본원에서 제공된다.
현재 중추 신경계 또는 말초 신경계에 영향을 미치는 많은 신경변성 장애에 대해 이용 가능한 질병 변경(disease-modifying) 치료는 없다. 일부는 인간 줄기 세포가 일부 신경변성 장애에 대해 가능한 치료 전략을 제공한다는 것을 제안하였다 (검토를 위해 Drouin-Ouellet, 2014; Golas and Sander, 2016; Kirkeby et al., 2017 참조).
예로서, 헌팅턴 병 (Huntington's disease: HD)은 헌팅틴(Huntingtin) 단백질 (HTT) 내에서 폴리글루타민 반복부위를 암호화하는 확장된 CAG 반복부위에 의해 유발되는 상염색체 우성 신경변성 질환이다 (The Huntington's Disease Collaborative Research Group, 1993). 불수의 운동, 점진적 지적 감퇴, 및 정신 장애가 일어나고 (Ross and Tabrizi, 2011), 신경병리학은 주로 선조체에서 중간 크기 가시 신경 (medium-sized spiny neuron: MSN)의 퇴화 및 피질의 위축을 수반한다 (Vonsattel and DiFiglia, 1998). 해당 분야에서 HD와 같은 신경변성 질환 및 장애에 대한 치료법을 찾을 필요가 있다. 본 개시물은 이 필요성을 충족시키고 또한 관련된 이점들을 제공한다.
인간 배아 줄기 세포 (hESC)로부터 인간 신경 줄기 세포 (hNSC)를 제조하는 방법이 본원에서 제공되며, 방법은 다음 단계를 포함하거나, 대안으로 근본적으로 그 단계들로 이루어지거나, 또는 추가로 그 단계들로 이루어진다:
a) 분화 배지에서 배양된 배양체 (embryoid body: EB)의 집단으로부터 적어도 하나의 줄기 세포 로제트(rosette)를 단리시키는 단계;
b) 일정 시간 동안 및 적어도 하나의 로제트의 생성을 제공하는 조건 하에서 단계 a)의 로제트로부터 단리된 적어도 하나의 개개의 세포를 배양하는 단계;
c) 개개의 세포를 단계 b)의 로제트로부터 개개의 세포로 단리시키는 단계; 및
d) 일정 시간 동안 및 hNSC의 밀집 집단의 생성을 제공하는 조건 하에서 단계 c)로부터 단리된 적어도 하나의 개개의 세포를 배양하는 단계.
일부 구체예에서, 로제트로부터 적어도 하나의 개개의 세포의 단리는 수동으로 수행된다. 또 다른 양태에서, 로제트로부터 적어도 하나의 개개의 세포의 단리는 효소를 이용하여 수행된다. 추가의 양태에서, 단계 a)의 로제트로부터 적어도 하나의 개개의 세포의 단리는 선택적으로 디지털 2차원 또는 3차원 이미지 인식 기술을 사용하여 디지털 방식으로 수행된다. 추가의 양태에서, 단계 c)의 적어도 하나의 개개의 세포의 단리는 효소를 이용하여 수행된다.
일부 구체예에서, 단계 a) 내지 c) 중 하나 이상은 2회 이상 수행되고 수동으로, 또는 선택적으로 디지털 2차원 또는 3차원 이미지 인식 기술을 사용하여 고처리량 방식으로 기계적으로 수행될 수 있다.
일부 구체예에서, 방법은 ESI-017로부터 배양체를 생성하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 EB 배지 내에서 초저 부착면 상에 배양체 (EB)를 배양하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 단계 a)에 더하여 EB가 오르니틴/라미닌 코팅된 표면 상에서 유효한 시간 동안 배양된 후 EB 배지를 N2 배지로 대체하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 EB가 단계 a)의 적어도 하나의 EB를 생산하기에 유효한 일정 시간 동안 EB 배지에서 배양된 후 EB 배지를 N2 배지로 대체하는 단계를 더 포함한다.
일부 구체예에서, 단계 c)에서 단리된 적어도 하나의 개개의 세포는 hNSC의 밀집 세포 집단을 생성하기 위해 N2 배지 내 오르니틴/라미닌 코팅된 플레이트 상에서 유효한 시간 동안 배양된다. 일부 구체예에서, 방법은 hNSC의 밀집 집단을 N2 배지의 유효량과 함께 배양하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 세포의 집단을 확장시키는 단계를 더 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 세포를 유전적으로 변형시키는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 세포는 전이유전자의 삽입에 의해 또는 CRISPR에 의한 변형에 의해 유전적으로 변형된다. 일부 구체예에서, 전이유전자는 ApiCCT1, 그것의 단편, 또는 그것들 각각의 동등물이고, 선택적으로 전이유전자는 세포에서 과발현된다.
일부 양태에서, 다음 단계를 포함하거나, 대안으로 근본적으로 그 단계들로 이루어지거나, 또는 추가로 그 단계들로 이루어진 방법에 의해 제조된 hNSC가 본원에서 제공된다:
a) 분화 배지에서 배양된 배양체 (EB)의 집단으로부터 적어도 하나의 줄기 세포 로제트를 단리시키는 단계;
b) 일정 시간 동안 및 적어도 하나의 로제트의 생성을 제공하는 조건 하에서 단계 a)의 로제트로부터 단리된 적어도 하나의 개개의 세포를 배양하는 단계;
c) 개개의 세포를 단계 b)의 로제트로부터 개개의 세포로 단리시키는 단계; 및
d) 일정 시간 동안 및 hNSC의 밀집 집단의 생성을 제공하는 조건 하에서 단계 c)로부터 단리된 적어도 하나의 개개의 세포를 배양하는 단계.
일부 구체예에서, hNSC는 BNDF를 발현한다. 일부 구체예에서, hNSC는 세포의 분화시 BNDF를 발현한다. 일부 구체예에서, 세포는 전이유전자의 삽입에 의해, 또는 CRISPR에 의해 유전적으로 변형된다.
일부 양태에서, 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 세포의 집단이 본원에서 제공된다. 또한 본원에서 기재된 방법에 따라 제조된 단리된 세포를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 구체예에서, 조성물은 담체를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 담체는 보존제 및/또는 동결방지제이다.
일부 양태에서, 전이유전자를 대상체에 전달하거나, 또는 필요로 하는 대상체에서 세포를 유전적으로 편집하는 방법이 본원에서 제공되며, 본원에서 기재된 방법에 따라 제조된 단리된 세포의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 구체예에서, 대상체는 인간이다.
일부 양태에서, 필요로 하는 대상체에서 신경변성 장애를 치료하거나 시냅스 연결을 향상시키는 방법이 본원에서 제공되며, 본원에서 기재된 방법에 따라 제조된 단리된 세포의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 구체예에서, 대상체는 인간이다. 일부 구체예에서, 신경변성 장애는 헌팅턴 병, 뇌졸중(stroke), 알츠하이머 병(Alzheimer's disease), 파킨슨 병(Parkinson's disease), 외상성 뇌 손상, 뇌 염증, 뇌졸중, 자가면역 장애, 예컨대 다발성 경화증(multiple sclerosis), 1차 또는 2차 진행형 다발성 경화증, 재발 완화형 다발성 경화증, 만성 척수 손상, 벨 마비(Bell's palsy), 경부 경추증(cervical spondylosis), 손목 터널 증후군(carpal tunnel syndrome), 뇌 또는 척수 종양, 말초 신경병증(peripheral neuropathy), 길랭-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 척수근 위축증(spinal muscular), 프리드리히 운동실조증(Freidrich's ataxia), 근위축성 측색 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 및 헌팅턴 무도병(Huntington chorea)의 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, hESC 및 본원에서 기재된 바와 같이 방법을 수행하기 위한 설명서를 포함하는 키트가 본원에서 제공된다.
일부 양태에서, 본원에서 기재된 방법에 따라 제조되고 동물에 이식된 hNSC를 갖는 비-인간 동물이 본원에서 제공된다. 일부 구체예에서, 동물은 쥐 또는 양이다.
도 1A - 1D: R6/2 마우스에 이식된 ESI-017 hNSC는 행동을 개선하고 미성숙 뉴런 및 성상세포로의 분화의 증거를 나타낸다. (A) 로타로드(Rotarod) 작업은 비-트랜스제닉(non-transgenic) 한 배 새끼 (NT)와 비교하여 R6/2 마우스에서의 결핍을 입증하였고, hNSC-처리된 R6/2 마우스는 비히클(vehicle)-처리된 (Veh) 마우스와 비교하여 이식 후 평균 대기 시간을 1주 (검은색 막대) 및 3주 (회색 막대)로 증가시켰다. (B) 폴 테스트(Pole test)는 NT와 비교하여 R6/2 마우스에서의 결핍을 입증한다. hNSC-처리된 R6/2 마우스는 이식 후 4주에 Veh 마우스보다 더 빠르게 내려오지만 (회색 막대) 이식 후 2주에는 그렇지 않았다 (검은색 막대). (C) 악력은 NT와 비교하여 R6/2 마우스에서의 결핍을 입증한다. hNSC-처리된 R6/2 마우스는 Veh 마우스와 비교하여 4주 후에 더 큰 그램 수의 힘을 나타내지만 (검은색 막대) 2주 후에는 그렇지 않았다 (회색 막대). (D) 면역조직화학법 (IHC). R6/2 마우스의 선조체에 이식된 hNSC (인간 마커 SC121)는 뉴런-제한된 전구물질 (더블코르틴 [DCX]), 및 성상세포 (SC121 및 GFAP)에 대한 마커와 공존한다. 일원(One-way) ANOVA에 이어서 사후(post hoc) 수행된 샤페(Scheffe), 본페로니(Bonferroni), 및 홀름(Holm) 다중 비교 계산과 함께 터키 HSD 테스트(Tukey's HSD test). *p < 0.05, **p < 0.01 (n = 15). 그래프는 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 2A - 2F: IHC는 R6/2 마우스에 이식된 ESI-017 hNSC가 분화된다는 것을 나타낸다. (A) R6/2 마우스에 이식된 hNSC (SC121)는 뉴런-제한된 전구물질 (더블코르틴 [DCX]) 및 성상세포 (SC121 및 GFAP)로 분화된다. (B) 분화를 보여주는 고배율 (633): R6/2 마우스에 이식된 hNSC (인간 핵 마커 Ku80)는 뉴런-제한된 전구물질 (DCX) 및 일부 성상세포 (Ku80 및 GFAP)로 분화된다. (C) hNSC (Ku80) 및 뉴런-제한된 전구물질 (DCX). (D) hNSC (Ku80) 및 뉴런-제한된 전구물질 (βIII-튜불린); DAPI로 나타난 마우스 세포 핵. (E) hNSC (Ku80) 및 뉴런-제한된 전구물질 (MAP-2); DAPI로 나타난 마우스 세포 핵. (F) hNSC (Ku80)는 분화된 유사분열 후 신경 세포 마커 (NeuN)와 공존하지 않는다.
도 3A - 3F: ESI-017 hNSC의 이식은 R6/2 마우스에서 피질선조체 과잉민감성(Cortico선조체 Hyper흥분성)을 감소시킨다. (A) 선조체에 기록된 바이오시틴-충전된 (화살표) hNSC 및 SC121을 이용한 IHC. 기준 자(scale bar), 20 mm. (B) 상부 추적: 자연 발화 hNSC의 세포-부착된 기록. 하부 추적: hNSC의 sEPSC 및 sIPSC. 기록들은 hNSC에서 자발적 내향 및 외향 시냅스 전류를 예시한다. (C) MSN에 기록된 sEPSC 및 sIPSC. (D) hNSC (SC121)의 클러스터 근처의 바이오시틴-충전된 MSN. 기준 자, 20 mm. (E) R6/2 MSN의 부분집단에서 sEPSC의 기록은 GABAA 수용체 안타고니스트, 비쿠쿨린 (10 mM)의 추가 이후 "간질성(epileptiform)" 활성을 나타낸다 (제1 추적). 이들 대진폭(large-amplitude) 흥분 이벤트에는 보통 고주파 소진폭(small-amplitude) sEPSC가 뒤따른다. hNSC 이식물을 가진 마우스에서 이들 이벤트는 주파수가 크게 감소하였다 (제2 추적). (F) "간질성" 활성을 가진 세포에서 (BIC 이후 6-8 min), hNSC-이식된 R6/2 군에 대해 누적 이벤트 간 구간 확률 분포가 비히클과 비교하여 우향 이동하였으며, 고주파 자발적 이벤트에서 상당한 감소에 상응한다 (p < 0.001, 이원(two-way) 반복 측정 ANOVA에 이어서 본페로니 사후 분석; *p < 0.05).
도 4A - 4B: 숙주의 신경 말단은 이식된 hNSC와 시냅스 접촉을 한다. (A) 시냅스 소포를 함유하는 라벨링되지 않은 신경 말단 (U-NT)은 근본적인 라벨링된 (SC121) hNSC 수상돌기 (L-DEND)와 시냅스-유사 접촉 (화살표)을 한다. 연결은 대칭적일 수 있다. (B) 시냅스 소포를 함유하는 라벨링되지 않은 신경 말단 (U-NT)은 근본적인 라벨링된 (SC121) hNSC 수상돌기 (L-DEND)와 비대칭 시냅스 접촉 (화살표)을 한다. 이 비대칭 접촉은 흥분성 시냅스 접촉을 제안한다.
도 5A - 5G: Q140 마우스에 이식된 ESI-017 hNSC는 행동을 개선하고 미성숙 뉴런 및 성상세포로의 분화의 증거를 나타낸다. (A) 세포 주사 이후 3개월에 운동 협응의 일시적 개선 (폴 작업). WT Veh (n = 20), Q140 Veh (n = 18), Q140 hNSC (n = 18). 본페로니 사후 테스트와 함께 일원 ANOVA: *p < 0.05, **p < 0.01. (B-D) 처리 후 5.5개월에 러닝 휠(running wheel) 결핍의 지속적인 개선 (군 당 n = 5). (B) 처리 후 5.5개월에 7.5개월령 수컷 WT 또는 Q140 마우스에서 2주 동안 평균 러닝 휠 회전/3 min/밤을 나타내는 그래프. 이원 ANOVA에 의한 비교: 군 효과 F = 52.93, p < 0.0001; 러닝 휠 효과의 밤 F = 17, p < 0.0001. 본페로니 사후 테스트: Q140 Veh와 비교하여 *p < 0.01, **p < 0.001, 및 ***p < 0.0001. (C) 2주 동안 밤에 전체 평균 러닝 휠 회전. 본페로니 사후 테스트와 함께 이원 ANOVA: *p < 0.01, **p < 0.001. (D) 세 군 사이에서 유의하지 않은 운동 학습의 기울기. (E 및 F) 새로운 물체 인식. hNSC는 Q140 마우스에서 처리 후 5개월에는 스니핑(sniffing) 시간 (E) 또는 발작 횟수 (F)의 변별도 지수에서의 결핍을 방지하였지만 3개월에는 그렇지 않았다. WT Veh n = 18, Q140 Veh n = 18, 및 Q140 hNSC n = 19. 본페로니 사후 테스트와 함께 일원 ANOVA: *p < 0.05, **p < 0.01. (G) 성상세포 (GFAP; b 및 c) 또는 뉴런-제한된 전구물질 (DCX; e 및 f)과 동시-발현하는 인간 특이적 항체 (HNA; a 및 d)로의 염색에 의한 Q140 마우스에서의 hNSC의 생존 및 분화. 기준 자, 20 mm. 모든 그래프는 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 6A - 6D: HD 마우스에 이식된 ESI-017 hNSC는 BDNF의 발현을 증가시켰다. (A) ESI-017 hNSC (Ku80)는 BDNF와의 공존을 나타낸다; 성상세포는 GFAP 양성으로 나타났다. (B) Veh-처리된 마우스는 BDNF 또는 hNSC를 나타내지 않았지만 GFAP를 갖는다. (C) 이식 후 6개월에 Q140 또는 WT 마우스의 선조체에서 ELISA에 의한 BDNF 수준. (D) Q140 마우스에서 hNSC 처리는 소교세포 활성화를 감소시켰다. 데이터는 평균 + 95% 신뢰 구간으로 표시된다 (군 당 n = 5). 막대는 각각의 직경의 세포의 퍼센트를 나타내고 회색 부분은 신뢰 구간을 나타낸다. WT Veh와 비교하여 유의한 선조체 소교세포 활성화가 Q140 Veh에서 관찰되었다. Q140 hNSC 마우스는 선조체에서 Q140 Veh 마우스와 비교하여 소교세포 활성화의 큰 감소를 나타냈다. 본페로니 사후 테스트와 함께 일원 ANOVA에 의해 *p < 0.05 및 **p < 0.01. 그래프는 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 7A - 7F: R6/2 마우스에 이식된 ESI-017 hNSC는 Q140 마우스에서 확산 응집체 및 봉입체의 감소를 유발하고 헌팅틴 응집체를 감소시킨다. (A 및 B) ESI-017 hNSC는 R6/2 마우스에서 확산 응집체 및 봉입체의 감소를 유발한다 (A에서 화살표). (A) 비-hNSC 핵 염색을 위해 니켈, HTT 마커 EM48, 및 크레실 바이올렛(cresyl violet)을 이용한 Ku80의 이미지. 입체논리적 평가는 StereoInvestigator를 사용하여 수행되었다. 53개의 목표 하에 윤곽을 추적하고 (파선, 왼쪽 패널의 예) 1003에서 계산한다. 선조체 전반에 걸쳐 6개의 절편에 대해 모든 세 번째 절편에서 계산하였으며 (40-mm 관상 절편) Ku80은 브레그마(bregma) 0.5 mm와 브레그마 _0.34 mm 사이에서 볼 수 있다. (B) 그래프는 응집체 또는 봉입체를 가진 세포의 퍼센트를 도시한다 (n = 4/군) 본페로니 사후 테스트와 함께 일원 ANOVA에 의한 **p < 0.01. (C 및 D) ESI-017 hNSC는 Q140 마우스에서 헌팅틴 응집체를 감소시킨다. (C) HTT 마커 EM48의 이미지 (화살표는 봉입체를 나타낸다). (D) HTT 염색된 핵 및 응집체는 응집체 유형/절편의 정량화를 위해 StereoInvestigator로 분석되었다. 데이터는 평균 ± SEM으로 나타난다 (n = 5/군). 본페로니 사후 테스트와 함께 일원 ANOVA에 의해 *p < 0.05. (E 및 F) hNSC 이식은 R6/2 마우스에서 불용성 단백질 축적을 조절한다. 선조체 용해물의 웨스턴 블롯은 세제-가용성 및 세제-불용성 분획으로 분리되었다. (E) R6/2는 NT와 비교하여 불용성 축적된 mHTT가 풍부하다. R6/2에서 hNSC 이식은 veh-처리된 동물과 비교하여 불용성 HMW 축적된 HTT의 유의한 감소를 초래한다. R6/2 선조체는 또한 NT와 비교하여 불용성 유비퀴틴-컨쥬게이션된 단백질이 풍부하다. R6/2 마우스에서 hNSC 이식은 veh 처리와 비교하여 유비퀴틴-변형된 불용성 컨쥬게이션된 단백질의 유의한 감소를 초래하며 veh 대조군과 비교하여 NT에서 유의한 효과가 없다. (F) mHTT 및 유비퀴틴에 대한 상대적인 단백질 발현의 정량. 값은 평균 ± SEM을 나타낸다. R6/2에서 상대적인 불용성 축적된 mHTT 및 유비퀴틴-컨쥬게이션된 단백질 발현에 대한 통계적 유의성은 일원 ANOVA에 이어서 본페로니 사후 테스트로 결정되었다 (n = 3/처리). *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. 그래프는 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 8A - 8D: 단색 유동 세포 분석법에 의해 ESI-017 hNSC의 특성화. (A) CD24, SOX1, SOX2, Nestin 및 Pax6 NSC 마커에 대해 양성인 ESI-017 hNSC 염색. 만능 마커 SSEA4에 대해 음성인 ESI-017 hNSC 염색. ESI-017 hNSC에 대한 핵형 분석이 수행되고 중기가 응축된 염색체의 김사(Giemsa) 염색에 의해 가시화된다. 최종 핵형은 46 XX 정상 프로파일과 함께 높은 유사분열 지수를 갖는 것으로 나타났다. (B) NSC 제조 공정의 흐름도: hNSC는 배양체 (EB) 형성에 의해 생성된 후 이어서, 생성된 EB를 폴리-오르니틴-라미닌 (폴리-O) 코팅된 플레이트에 평판배양되었으며 추후 신경 로제트가 형성되었다. 로제트는 수동으로 해부되고 그것들이 부착될 수 있는 신선한 폴리-O 플레이트로 옮겨진다. 확장된 신경 로제트는 효소를 이용하여 해부된 후 이어서, 신선한 폴리-O 플레이트에 평판배양된다. 세포는 밀집하도록 성장되고 효소를 이용하여 더 많은 폴리-O 플레이트로 계대배양된다. 충분한 수로 확장 이후 생성된 hNSC의 수확 및 냉동 보존이 수행된다. (C) 배양된 ESI-017 hNSC 면역세포화학은 신경 외배엽 줄기 세포 마커 Nestin에 대한 양성 NSC 염색 및 DAPI 핵 염색을 나타낸다. 기준 자는 30 μm와 같다. (D)는 로제트의 사진이다.
도 9: 움켜쥐는 행동: ESI-017 hNSC로 처리된 R6/2 마우스 (n=15)는 이식 후 지연된 움켜쥐는 행동을 나타낸다. 비-트랜스제닉 (NT) 마우스가 이 표현형을 입증하는 것은 아니다. 마우스는 매일 표현형에 대해 테스트되었고 그래프는 연구 과정에 걸쳐 움켜쥐는 각 군의 퍼센트를 도시한다. 움켜쥠 검정에서 유의성은 피셔 정확 확률 테스트 (Fisher's exact probability test).
도 10A - 10E: ESI-017의 저배율 면역조직화학법. hNSC 이식된 R6/2 마우스: R6/2 마우스에 이식된 hNSC (인간 마커 SC121)는 뉴런 제한된 전구물질 (더블코르틴 DCX)에 대한 마커와 공존한다. hNSC에 대해 스크리닝하기 위해서, IHC는 절편 #34, 37, 40, 43, 46, 및 49 (각각 브레그마 0.38mm, 0.26mm, 0.14mm, 0.02mm, -0.10mm, 및 -0.22mm와 동등함)에서 수행된다. S2는 다른 관상 절편과의 비교를 위해 도 1D에서 나타난 이미지의 재사용이다. R6/2 마우스 면역조직화학법에서 ESI-017 hNSC 이식물: (A) R6/2 마우스에 이식된 hNSC (인간 마커 Ku80)는 희소돌기 아교세포 마커 (Olig2)와 공존하지 않고 마우스 세포 핵은 DAPI로 나타난다. 분화를 나타내는 고배율 (63x): (B) hNSC (인간 핵 마커 Ku80 및 세포질 마커 SC121 블루)는 뉴런 제한된 전구물질 (BIII-튜불린)과의 공존을 나타낸다 (밝은 청색). (C) hNSC (인간 핵 마커 Ku80 및 세포질 마커 SC121)는 뉴런 제한된 전구물질 (MAP-2)과의 공존을 나타낸다. (D) hNSC (인간 핵 마커 Ku80)는 헌팅틴 마커 (EM48)와 공존하지 않는다. (E) S1-6은 절편 당 브레그마 1.70mm, 40um에서 시작하여 수거되고 면역염색된 관상 절편을 나타낸다.
도 11A - 11B: 선조체에 이식된 ESI-017 hNSC는 Q140 마우스에서의 개방 영역 테스트 또는 클라이밍(climbing) 케이지 테스트에서 결핍을 개선하지 않았다. 마우스는 이식 전 0.5개월에, 또는 이식 후 3 및 5개월에 (A) 15분 동안 개방 영역 테스트 및 (B) 5분 동안 클라이밍 케이지 테스트로 테스트되었다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다; Wt Veh (n=18), Q140 Veh (n=18), 및 Q140 hNSC (n=17). 비히클-처리된 Wt 마우스의 동일한 시점과 비교하여 본페로니 사후 테스트와 함께 이원 ANOVA *p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001.
도 12A - 12C: 시험관 내(in vitro) ESI-017 hNSC BDNF 발현. ESI-017 hNSC는 신경 줄기 세포 배지에서 배양되거나 (A) 또는 분화된 다음 (B) BDNF 인간 핵 마커 Ku80 및 더블코르틴 DCX에 대해 염색되었다. (C) 배양된 ESI-017 hNSC로부터의 RNA 수준을 비교하는 qPCR은 분화와 함께 증가된 BDNF 발현을 나타낸다. 비교를 위해 줄기 세포 마커 nestin은 분화와 함께 감소하였 DCX는 증가하였다.
도 13A - 13E: (A&B) Q140 마우스의 선조체에서 시냅토파이신 수준이 ESI-017 hNSC와 함께 증가하였다. (A) 이미지는 마이크로어레이(microarray) 스캐너로 촬영되었고 형광 강도에 대해 정량화되었다. 흰색 기준 자는 10 μm과 동일하다. (B) 데이터는 평균 ± SEM으로 나타나고 사용된 통계학적 테스트는 본페로니 사후 테스트와 함께 일원 ANOVA였다. *p<0.05, 군 당 n=5 마우스. R6/2 마우스에서 hNSC 처리는 소교세포 활성화를 변화시키지 않는다. 데이터는 평균 + 95% 신뢰 구간으로 표시된다 (군 당 n=5). 자는 각각의 직경의 퍼센트 세포를 나타내고 색깔이 있는 부분은 신뢰 구간을 나타낸다. (C) 비-트랜스제닉 대조군 (NT Veh)과 비교하여 비히클로 처리된 R6/2 마우스 (R6/2 Veh)에서 관찰된 유의한 선조체 소교세포 활성화. (D) NT + hNSC에 대해 NT + 비히클의 비교. (E) hNSC로 처리된 R6/2 마우스 (R6/2 NSC)는 R6/2 Veh 마우스와 비교하여 선조체에서 소교세포 활성화의 유의한 감소를 나타내지 않았다.
도 14: R6/2 마우스에서 인간 HTT 전이유전자 발현의 실시간 PCR. RPLPO (거대 리보솜 단백질) 내인성 대조군이 cDNA 샘플에서 유전자 발현 차이를 표준화하는데 사용되었다. 본페로니 사후 테스트와 함께 일원 ANOVA에 의해 결정된 바와 같이 유의함이 관찰되지 않았다.
도 15A-15F: R6/1 마우스는 5주령에 sApiCCT1 또는 mCherry 대조군을 발현하는 AAV의 양쪽 선조체내 주사가 제공되었다. 두 번의 별도의 실험에서, 마우스는 12x109개의 AAV2/1의 게놈 카피로 주사되었고 17주령에 수확되었다. (A) 개략도. (B,C) 아가로스 겔 전기영동에 이어서 웨스턴 블롯의 정량은 동물에서 올리고머 mHTT의 유의한 감소를 나타낸다. (D) 면역조직화학법은 sApiCCT1 (항-HA)의 발현을 나타낸다. (E) sApiCCT1 주사된 마우스는 입체학에 의해 가시적인 mHTT 봉입체 (항-EM48)에서 대략 40% 감소를 나타낸다. (F) sApiCCT1-AAV2/1로 주사된 마우스는 로타로드 운동 작업에 대한 개선을 나타낸다 *p<0.05, **p>0.01.
도 16A-16D: ESI-017 hNSC는 ApiCCT를 생산한다. (A) 0, 5, 10 또는 15의 MOI로 sApiCCT 렌티바이러스로 형질도입된 ESI-017 hNSC는 형질도입 이후 48시간 동안 배양되었고, 용해되고 HA 항체를 사용하여 웨스턴 블롯이 수행된 다음 스트리핑되고(strip) 로딩 대조군에 대해 알파-튜불린 항체로 재탐침되었다. (B) hNSC로부터 분비된 ApiCCT는 PC12 Htt14A2.6 세포로 들어간다. sApiCCT 렌티바이러스로 형질도입된 ESI-017 hNSC로부터의 조건 배지가 HTT-GFP를 발현하도록 EtOH 중의 폰아스테론에 의해 유도된 14A2.6 세포 또는 EtOH 단독으로 처리된 대조군에 적용되었다. ApiCCT1이 세포 용해물에서 검출되었으며, 이식 후 이웃의 세포에 의해 흡수될 수 있는 ApiCCT1의 분비된 형태를 발현하도록 hNSC를 조작하는 것의 실현 가능성을 지지한다. 웨스턴 블롯은 HA 항체를 사용하여 나타난다. MOI가 높아질수록, 처리된 PC12 세포 용해물에서 더 많은 양의 ApiCCT1이 검출된다. (C) hNSC로부터 분비된 ApiCCT1은 PC12 Htt14A2.6 세포에서 모노머 HTT를 변화시키지 않는다. sApiCCT 렌티바이러스로 형질도입된 ESI-017 hNSC로부터의 조건 배지가 폰아스테론-유도된 14A2.6 세포 또는 EtOH 단독으로 처리된 대조군에 적용되었다. 분비된 ApiCCT1로의 처리는 모노머 mHTT-GFP 전이유전자의 변화를 초래하지 않았다. GFP 항체를 사용한 웨스턴 블롯 다음에 스트리핑되고 로딩 대조군으로서 알파-튜불린에 대해 재탐침되었다. (D) hNSC로부터 분비된 ApiCCT1은 PC12 Htt14A2.6 세포에서 올리고머 HTT 종을 변화시킨다. sApiCCT1 렌티바이러스로 형질도입되고 폰아스테론-유도된 14A2.6 세포 또는 EtOH 단독으로 처리된 대조군에 적용된 ESI-017 hNSC로부터의 조건 배지는 가장 높은 MOI에서 올리고머 HTT의 감소를 유발하였다 (빨간 상자). GFP 항체를 사용하여 나타난 대표적인 샘플의 웨스턴 블롯.
도 17A 및 17B: IHC는 ApiCCT에 대한 바이러스로 형질도입되고 R6/2 마우스의 선조체에 이식된 ESI-017 hNSC가 ApiCCT를 발현한다는 것을 나타낸다. (A) R6/2 마우스에 이식된 hNSC (인간 핵 항원 [HNA])는 뉴런-제한된 전구물질 (더블코르틴 [DCX])로 분화되고 HA 태그된(tagged) ApiCCT (HA)를 발현한다. (B) A에서 나타난 하얀 상자 내 영역에서 촬영된 고배율 (95x)은 분화 및 ApiCCT 발현을 나타낸다: R6/2 마우스에 이식된 hNSC (HNA)가 뉴런-제한된 전구물질 (DCX)로 분화되고 HA 태그된 ApiCCT (HA)를 발현한다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시물이 속한 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 기재된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법, 디바이스, 및 재료가 이제 기재된다. 본원에서 인용된 모든 기술 및 특허 간행물은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 본원에서 어떠한 것도 본 발명이 선행 발명으로 인해 이러한 개시물에 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 출원 전반에 걸쳐 그리고 그 안에서 기술 및 특허 문헌은 인용에 참조된다. 이들 참고문헌 중 일부에 대해, 식별 인용은 청구범위 바로 앞에, 본 출원의 마지막에서 발견된다. 모든 간행물은 본 개시물이 속한 분야의 기술 수준을 더 충분하게 기재하기 위해 본 개시물에 참조로 포함된다.
본 개시물의 실시는, 달리 나타나지 않는 한, 통상적인 조직 배양 기술, 면역학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학 및 재조합 DNA를 이용할 것이며, 이것들은 해당 분야의 기술범위 내에 있다. 예를 들어, Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition; the series Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology; the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); MacPherson et al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press); MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach; Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5th edition; Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; U.S. Patent No. 4,683,195; Hames and Higgins eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986)); Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning; Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Herzenberg et al. eds (1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology; Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3rd edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press (2002)); Sohail (ed.) (2004) Gene Silencing by RNA Interference: Technology and Application (CRC Press).
범위를 포함한 모든 수명칭, 예를 들어, pH, 온도, 시간, 농도, 및 분자량은 적절한 경우 0.1 또는 1.0의 증분으로 (+) 또는 (-)로 달라지는 근사치이다. 항상 명시적으로 언급되는 것은 아니지만, 모든 수명칭이 용어 "약"에 의해 선행된다는 것을 이해해야 한다. 또한 항상 명시적으로 언급되는 것은 아니지만, 본원에서 기재된 시약들은 단지 예시이고 이러한 것들의 동등물이 해당 분야에 공지되어 있다는 것을 이해해야 한다.
명세서 및 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수형 "하나(a)", "하나(an)" 및 "그(the)"는 문맥상 달리 분명하게 나타나지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 예를 들어, 용어 "세포"는 복수의 세포를 포함하며, 그 혼합물을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는" 또는 "포함하다"는 조성물 및 방법이 나열된 요소를 포함하지만, 다른 것들을 배제하지 않는다는 것을 의미한다. "근본적으로 ~로 이루어진"은, 조성물 및 방법을 정의하는데 사용될 때, 언급된 목적을 위해 조합에 대해 임의의 근본적인 중요성의 다른 요소들을 배제하는 것을 의미해야 한다. 따라서, 조성물은 근본적으로 본원에서 정의된 요소들로 이루어진 조성물은 단리 및 정제 방법으로부터의 미량의 오염물질 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 예컨대 포스페이트 완충된 식염수, 보존제 등을 배제하지 않을 것이다. "~로 이루어진"은 다른 성분의 미량 이상의 요소 및 본 발명의 조성물을 투여하기 위한 실질적인 방법 단계 또는 조성물을 생산하거나 의도된 결과를 달성하기 위한 공정 단계를 배제하는 것을 의미해야 한다. 이들 전환 용어 각각에 의해 정의되는 구체예는 본 발명의 범위 내에 있다.
용어 "단리된"은 핵산, 예컨대 DNA 또는 RNA에 관하여 본원에서 사용된 바와 같이 거대분자의 자연 공급원에 존재하는, 각각 다른 DNA 또는 RNA로부터 분리된 분자를 지칭한다. 용어 "단리된 핵산"은 단편으로서 자연 발생하지 않고 자연 상태에서 발견되지 않는 핵산 단편을 포함하는 것을 의미한다. 용어 "단리된"은 또한 본원에서 다른 세포 단백질로부터 단리된 폴리펩타이드, 단백질 및/또는 숙주 세포를 지칭하는데 사용되고 정제된 폴리펩타이드 및 재조합 폴리펩타이드 둘 다를 포함하는 것을 의미한다. 다른 구체예에서, 용어 "단리된"은 구성성분, 세포 등으로부터 분리된 것을 의미하며, 여기서 세포, 조직, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 항체 또는 이것들의 단편(들)은 자연에서 일반적으로 연관성이 있다. 예를 들어, 단리된 세포는 유사하지 않은 표현형 또는 유전자형의 조직 또는 세포들로부터 분리된 세포이다. 당업자에게 분명한 것처럼, 비-자연 발생 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 항체 또는 이것들의 단편(들)은 그것을 자연 발생한 대응물과 구별하기 위해 "단리"를 필요로 하는 것은 아니다.
용어 "단리하는"은 조성물 또는 구성요소를 아주 밀접하거나 또는 그것에 부수하는 다른 것들로부터 분리하는 공정을 의도한다. 세포는 수동으로 (예를 들어, 피펫 또는 다른 도구를 사용하여 사람의 손으로), 화학적 작용제의 사용에 의한 효소에 의해 또는 세포 또는 로제트 형태학을 기반으로 하는 디지털 기술의 사용에 의한 디지털 방식으로 단리될 수 있다. 예를 들어, 2018년 5월 22일에 접속된 cellavision.com/en/introducing-digital-cell-morphology-by-cellavision 참조.
"분화 배지"는 미성숙 세포의 더 성숙한 표현형으로의 분화, 예를 들어, 배아 줄기 세포에서 신경 세포로의 분화를 촉진하는 인자, 예컨대 특정 성장 인자를 함유하는 세포 배양 배지를 의도한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "밀집 집단"은 인접한 세포와 근접하게 접촉되어 있는 세포의 집단을 의도한다.
"초저 부착면"은, 일부 양태에서, 친수성이고 중성으로 대전된, 공유 결합된 하이드로겔 층을 함유하는 세포 또는 조직 배양 표면을 의도한다. 단백질 및 다른 생체 분자가 소수성 또는 이온성 상호작용을 통해 폴리스티렌 표면에 수동적으로 흡착하기 때문에, 이 하이드로겔 표면은 이러한 힘을 통해 비특이적 고정을 자연적으로 억제하며, 따라서 후속적인 세포 부착을 억제한다. 이들 표면은 다양한 판매사, 예를 들어 Millipore-Sigma, Fisher-Scientific, 및 S-bio로부터 상업적으로 이용 가능하다. 세포 배양 플레이트 및 표면을 제조하기 위한 방법은 해당 분야에 공지되어 있다.
"전이유전자"는 세포, 조직 또는 유기체에 추가된 폴리뉴클레오타이드를 의도한다. 전이유전자의 예는 ApiCCT1이다.
"ApiCCT1"은 CCT1의 정점 도메인 및/또는 상기 CCT1의 정점 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 말한다 (Sontag, E. Proc Natl Acad Sci U S A.　2013　Feb 19;110(8):3077-82, 본원에 참조로 포함됨). CCT1은 TCP1 고리 복합체 (TRiC)로도 알려져 있는, 샤페로닌 함유 TCP1 복합체 (CCT)의 구성원인 분자 샤페론이다. 이 복합체는 두 개의 동일한 스태킹된(stacked) 고리로 이루어지며, 각각은 8개의 상이한 단백질을 함유한다. 폴딩되지 않은(unfolded) 폴리펩타이드는 복합체의 중앙 공동에 들어가서 ATP-의존적 방식으로 폴딩된다. 복합체는 액틴 및 튜불린을 포함하는 다양한 단백질을 폴딩시킨다. 일부 구체예에서, ApiCCT1은 크기가 20 kDa이다. 인간에서, TCP1-고리 복합체는 TCP1 유전자 (Entrez 유전자 6950)에 의해 암호화된다. TCP1 mRNA 및 단백질의 서열의 비-제한적 예는 본원에서 서열 번호: 1-4로 제공된다. 정점 도메인은 기질 결합에 수반된다 (Pappenberger, G. et al. J Mol Biol. 2002 May 17;318(5):1367-79, 본원에 참조로 포함됨). ApiCCT1의 서열의 비-제한적 예가 하기 제공된다 (서열 번호: 7):
Figure pct00001
"sApiCCT1"은 ApiCCT1의 분비된 버전을 말한다. sApiCCT의 핵산 서열 및 아미노산 서열의 비-제한적 예가 하기 제공된다. 밑줄 그어진 서열은 HA 태그에 상응한다. 일부 구체예에서, sApiCCT1은 태그를 포함하지 않는다.
sApiCCT1 mRNA (서열 번호: 8)
Figure pct00002
sApiCCT1 펩타이드 (서열 번호: 9)
Figure pct00003
본원에서 사용된 바와 같이, "BDNF"는 뇌 유래된 신경 영양 인자 (BDNF) 및 그것의 동등물 및/또는 BDNF를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 동등물을 의도한다. BDNF는 중추 신경계 및 말초 신경계의 뉴런에 작용하여, 기존의 뉴런의 생존을 지원하고, 새로운 뉴런 및 시냅스의 성장 및 분화를 장려하는 것을 돕는다. BDNF는 또한 학습, 기억, 및 고등 사고에 필수적인 해마(hippocampus), 피질, 및 기저 전뇌-영역에서 활성이다. 그것은 또한 망막, 운동 뉴런, 신장, 타액, 및 전립선에서 발현된다. BDNF 단백질은 BDNF 유전자 (Entrez 유전자: 627; mRNA: NM_001143805, NM_001143806, NM_001143807, NM_001143808, NM_001143809, NM_001143810, NM_001143811, NM_001143812, NM_001143813, NM_001143814, NM_001143815, NM_001143816, NM_001709, NM_170731, NM_170732, NM_170733, NM_170734, NM_170735)에 의해 암호화된다. BDNF mRNA 및 단백질 서열의 비-제한적 예는 본원에서 서열 번호: 5-6으로 제공된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "CRISPR"은 클러스터가 형성된 규칙적으로 반복되는 짧은 회문구조 반복 경로(clustered regularly interspaced short palindromic repeats pathway)에 의존적인 서열 특이적 유전자 조작 기술을 말한다. CRISPR은 유전자 편집 및/또는 유전자 조절을 수행하는 것뿐 아니라, 단순하게 단백질을 특정 게놈 위치로 표적화하는데 사용될 수 있다. 유전자 편집은 표적 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열이 폴리뉴클레오타이드 서열로의 결실, 삽입, 또는 염기 치환의 도입을 통해 변화하는 유전자 조작의 한 유형을 말한다. 일부 양태에서, CRISPR-매개된 유전자 편집은 비상동성 말단 접합 (nonhomologous end-joining: NHEJ) 또는 상동 재조합의 경로를 이용하여 편집을 수행한다. 유전자 조절은 특정 유전자 산물, 예컨대 단백질 또는 RNA의 생산을 증가시키거나 감소시키는 것을 말한다.
용어 "gRNA" 또는 "안내 RNA(guide RNA)"는 본원에서 사용된 바와 같이 CRISPR 기술을 이용한 수정을 위해 특정 유전자를 표적화하는데 사용되는 안내 RNA 서열을 말한다. 표적 특이성을 위해 gRNAs 및 공여체 치료적 폴리뉴클레오타이드를 디자인하는 기술은 해당 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, Doench, J., et al. Nature biotechnology 2014; 32(12):1262-7, Mohr, S. et al. (2016) FEBS Journal 283: 3232-38, 및 Graham, D., et al. Genome Biol. 2015; 16: 260.　 gRNA는 CRISPR RNA (crRNA) 및 트랜스(trans)-활성화 CRIPSPR RNA (tracrRNA)를 포함하는 융합 폴리뉴클레오타이드; 또는 CRISPR RNA (crRNA) 및 트랜스-활성화 CRIPSPR RNA (tracrRNA)를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나 또는 대안으로 근본적으로 그것들로 이루어지거나, 또는 추가로 그것들로 이루어진다. 일부 양태에서, gRNA는 합성에 의한 것이다 (Kelley, M. et al. (2016) J of Biotechnology 233 (2016) 74-83).　 본원에서 사용된 바와 같이, gRNA의 생물학적 동등물은 세포의 게놈의 특정 영역과 같은 특정 뉴클레오타이드 서열로 Cas9 또는 그것의 동등물을 안내할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 또는 표적화 분자를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
세포에서 CRISPR의 발현은 통상적인 CRISPR/Cas 시스템 및 세포 내 표적 유전자에 특이적인 안내 RNA를 사용하여 달성될 수 있다. 적합한 발현 시스템, 예를 들어, 렌티바이러스 또는 아데노바이러스 발현 시스템은 해당 분야에 공지되어 있다. CRISPR 편집 작제물이 내인성 유전자를 넉아웃시키거나(knock out) 또는 유전자에 넉인(knock in)시킬 때 둘 다에서 유용할 수 있다는 것이 추가로 인정된다. 따라서, CRISPR 시스템은 이러한 목적 중 하나 또는 둘 다를 달성하기 위해 디자인될 수 있다는 것이 인정된다.
당업자에게 공지된 바와 같이, 바이러스에는 6개의 클래스가 존재한다. DNA 바이러스가 클래스 I 및 II를 구성한다. RNA 바이러스 및 레트로바이러스가 나머지 클래스를 구성한다. 클래스 III 바이러스는 이중 가닥 RNA 게놈을 갖는다. 클래스 IV 바이러스는 양성 단일 가닥 RNA 게놈을 갖고, 자체로 mRNA 클래스 V 바이러스로 작용하는 게놈은 mRNA 합성을 위한 주형으로서 사용되는 음성 단일 가닥 RNA 게놈을 갖는다. 클래스 VI 바이러스는 양성 단일 가닥 RNA 게놈을 갖지만 복제뿐 아니라 mRNA 합성에서도 DNA 중간물을 갖는다. 레트로바이러스는 RNAd의 형태로 그들의 유전 정보를 가지고 있지만; 바이러스가 세포를 감염시키면, RNA는 DNA 형태로 역전사되며 이것은 감염된 세포의 게놈 DNA에 통합된다. 통합된 DNA 형태는 프로바이러스(provirus)라고 불린다.
용어 "폴리뉴클레오타이드", "핵산" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 교체 가능하게 사용되고 임의의 길이의 뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 또는 이것들의 유사체의 폴리머 형태를 말한다. 폴리뉴클레오타이드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고, 공지되든 또는 공지되지 않든, 임의의 기능을 수행할 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오타이드의 비-제한 예이다: 유전자 또는 유전자 단편 (예를 들어, 프로브, 프라이머, EST 또는 SAGE 태그), 엑손, 인트론, 전령 RNA (messenger RNA: mRNA), 전달 RNA(transfer RNA), 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지형(branched) 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체를 포함할 수 있다. 존재하면, 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형은 폴리뉴클레오타이드의 조립 전에 또는 후에 전달될 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 구성요소에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 폴리머화 이후에, 예컨대 라벨링 구성요소와의 컨쥬게이션에 의해 더 변형될 수 있다. 용어는 또한 이중 가닥 및 단일 가닥 분자 둘 다를 지칭한다. 달리 명시되거나 요구되지 않는 한, 폴리뉴클레오타이드인 본 발명의 임의의 구체예는 이중 가닥 형태를 구성하는 것으로 예측되거나 공지된 이중 가닥 형태 및 각각의 두 개의 상보적인 단일 가닥 형태 둘 다를 포함한다.
폴리뉴클레오타이드는 네 가지 뉴클레오타이드 염기, 아데닌 (A); 시토신 (C); 구아닌 (G); 티민 (T); 및 폴리뉴클레오타이드가 RNA일 때 티민 대신에 우라실 (U)의 특정 서열로 구성된다. 따라서, 용어 "폴리뉴클레오타이드 서열"은 폴리뉴클레오타이드 분자의 알파벳 표현이다. 이 알파벳 표현은 중앙 처리 장치를 가진 컴퓨터 내의 데이터베이스에 입력되어 기능유전체학 및 상동성 검색과 같은 생물정보학 용도로 사용될 수 있다.
"상동성" 또는 "동일성" 또는 "유사성"은 두 개의 펩타이드 사이 또는 두 개의 핵산 분자 사이의 서열 유사성을 말한다. 상동성은 비교 목적을 위해 정렬될 수 있는 각각의 서열 내 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교된 서열 내 위치가 동일한 염기 또는 아미노산에 의해 점유될 때, 분자는 상기 위치에서 상동성이다. 서열 간 상동성의 정도는 서열에 의해 공유되는 일치 또는 상동성 위치의 수의 함수이다. "무관한" 또는 "비-상동성" 서열은 본 발명의 서열 중 하나와 40% 미만의 동일성, 또는 대안으로 25% 미만의 동일성을 공유한다.
또 다른 서열에 대해 특정 퍼센트 (예를 들어, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%)의 "서열 동일성"을 갖는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 영역 (또는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 영역)은, 정렬될 때, 염기 (또는 아미노산)의 상기 퍼센트는 두 개의 서열을 비교하는데 있어서 동일한 것임을 의미한다. 이 정렬 및 퍼센트 상동성 또는 서열 동일성은 해당 분야에 공지된 소프트웨어 프로그램, 예를 들어, Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology에서 기재된 것들을 사용하여 결정될 수 있다. 바람직하게는, 기본 파라미터가 정렬에 사용된다. 한 가지 정렬 프로그램은 BLAST이며, 기본 파라미터를 사용한다. 특히, 프로그램은 BLASTN 및 BLASTP이며, 다음 기본 파라미터를 사용한다: 유전 암호 = 표준; 필터 = 없음; 가닥 = 둘 다; 컷오프(cutoff) = 60; 예상치 = 10; 매트릭스 = BLOSUM62; 설명 = 50개 서열; 분류 기준 = 높은 점수; 데이터베이스 = 비-다중, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS 번역 + SwissProtein + SPupdate + PIR. 이들 프로그램의 상세한 설명은 다음 인터넷 주소에서 발견될 수 있다: ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST.
동등한 또는 생물학적으로 동등한 핵산, 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 펩타이드는 참조 핵산, 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드 또는 펩타이드에 대해 적어도 80 % 서열 동일성, 또는 대안으로 적어도 85 % 서열 동일성, 또는 대안으로 적어도 90 % 서열 동일성, 또는 대안으로 적어도 92 % 서열 동일성, 또는 대안으로 적어도 95 % 서열 동일성, 또는 대안으로 적어도 97 % 서열 동일성, 또는 대안으로 적어도 98 % 서열 동일성을 갖는 것이다.
용어 "폴리뉴클레오타이드의 증폭"은 PCR, 결찰 증폭 (또는 리가제 연쇄 반응, LCR) 및 증폭 방법과 같은 방법들을 포함한다. 이러한 방법은 해당 분야에 ㄱ공지되어 있거나 널리 실시되고 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,683,195 및 4,683,202 및 Innis et al., 1990 (PCR에 대해); 및 Wu et al. (1989) Genomics 4:560-569 (LCR에 대해) 참조. 일반적으로, PCR 과정은 (i) DNA 샘플 (또는 라이브러리) 내 특정 유전자에 대한 프라이머의 서열-특이적 혼성체화, (ii) DNA 폴리머라제를 사용하여 다수의 라운드의 어닐링(annealing), 신장, 및 변성을 수반하는 후속적인 증폭, 및 (iii) 올바른 크기의 밴드에 대한 PCR 산물의 스크리닝으로 구성된 유전자 증폭 방법을 기재한다. 사용된 프라이머는 폴리머화의 시작을 제공하기에 충분한 길이 및 적절한 서열의 올리고뉴클레오타이드이며, 즉, 각각의 프라이머는 증폭되는 게놈 유전자좌의 각각의 가닥에 대해 상보적이도록 특이적으로 디자인된다.
PCR을 실행하기 위핸 시약 및 하드웨어는 상업적으로 이용 가능하다. 특정 유전자 영역으로부터 서열을 증폭시키는데 유용한 프라이머는 바람직하게는 표적 서열 또는 그것의 플랭킹(flanking) 영역 내 서열에 상보적이고 그것에 특이적으로 혼성체화한다. 증폭에 의해 생성된 핵산 서열은 직접적으로 시퀀싱될 수 있다. 대안으로, 증폭된 서열(들)은 서열 분석 전에 클로닝될 수 있다. 효소를 이용하여 증폭된 게놈 분절의 직접적인 클로닝 및 서열 분석을 위한 방법은 해당 분야에 공지되어 있다.
"유전자"는 전사 및 번역된 후 특정 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화할 수 있는 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임 (open reading frame: ORF)을 함유하는 폴리뉴클레오타이드를 말한다.
용어 "발현하다"는 유전자 산물의 생산을 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "발현"은 폴리뉴클레오타이드가 mRNA로 번역되는 공정 및/또는 전사된 mRNA가 이후에 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질로 번역되는 공정을 말한다. 폴리뉴클레오타이드가 게놈 DNA로부터 유래되면, 발현은 진핵 세포에서 mRNA의 스플라이싱(spliciing)을 포함할 수 있다.
"유전자 산물" 또는 대안으로 "유전자 발현 산물"은 유전자가 전사 및 번역될 때 생성된 아미노산 (예를 들어, 펩타이드 또는 폴리펩타이드)을 말한다.
"전사 조건 하에서"는 해당 분야에서 널리 이해되는 용어이고 폴리뉴클레오타이드 서열, 보통은 DNA 서열의 전사가 전사의 시작에 기여하거나, 또는 전사를 촉진하는 요소에 작동 가능하게 연결되는 것에 의존적이라는 것을 나타낸다. "작동 가능하게 연결된"은 폴리뉴클레오타이드가 세포에서 기능할 수 있게 하는 방식으로 배열되는 것을 의도한다. 한 양태에서, 본 발명은 다운스트림(downstream) 서열, 예를 들어, 자살 유전자, ApiCCT1, 그것의 단편, 예컨대 sApiCCT1, 또는 그것들 각각의 동등물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 제공한다.
용어 "암호화하다"는 폴리뉴클레오타이드에 적용된 바와 같이, 고유한 상태에서 또는 당업자에게 널리 공지된 방법에 의해 제조될 때, 폴리펩타이드 및/또는 그것의 단편에 대해 mRNA를 생산하기 위해 전사 및/또는 번역될 수 있는 경우 폴리펩타이드를 "암호화한다"고 하는 폴리뉴클레오타이드를 말한다. 안티센스(antisense) 가닥은 이러한 핵산의 보체이고, 암호화 서열은 그것들로부터 추론될 수 있다.
"프로브"는 폴리뉴클레오타이드 제조의 맥락에서 사용될 때 표적과 혼성체화함으로써 관심 샘플에 잠재적으로 존재하는 표적을 검출하기 위해 시약으로서 제공된 올리고뉴클레오타이드를 말한다. 보통, 프로브는 혼성체화 반응 전에 또는 그 이후에 검출 가능한 라벨 또는 라벨이 부착될 수 있는 수단을 포함할 것이다. 대안으로, "프로브"는 관심 샘플에 잠재적으로 존재하는 표적에 결합할 수 있는 생물학적 화합물, 예컨대 폴리펩타이드, 항체, 또는 이것들의 단편일 수 있다.
"검출 가능한 라벨" 또는 "마커"는 방사성 동위원소, 형광색소, 화학발광 화합물, 염료, 및 효소를 포함한 단백질을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 검출 가능한 라벨은 또한 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 항체 또는 조성물에 부착될 수 있다.
"프라이머"는 일반적으로 표적과 혼성체화하고, 그 이후 표적에 상보적인 폴리뉴클레오타이드의 폴리머화를 촉진함으로써 관심 샘플에 잠재적으로 존재하는 표적 또는 "주형"에 결합하는 자유 3'-OH 기를 가진 짧은 폴리뉴클레오타이드이다. "폴리머라제 연쇄 반응" ("PCR")은 복제 카피가 "업스트림(upstream)" 및 "다운스트림" 프라이머로 이루어진 "프라이머 쌍" 또는 "프라이머 세트", 및 폴리머화의 촉매, 예컨대 DNA 폴리머라제, 및 전형적으로 열 안정한 폴리머라제 효소를 사용하여 표적 폴리뉴클레오타이드로 만들어지는 반응이다. PCR을 위한 방법은 해당 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 MacPherson et al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press)에 교시되어 있다. 폴리뉴클레오타이드의 복제 카피를 생산하는 모든 공정, 예컨대 PCR 또는 유전자 클로닝은 본원에서 일괄적으로 "복제"라고 불린다. 프라이머는 또한 서던(Southern) 또는 노던(Northern) 블롯 분석과 같은 혼성체화 반응에서 프로브로서 사용될 수 있다. Sambrook and Russell (2001), infra.
"혼성체화"는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드가 반응하여 뉴클레오타이드 잔기의 염기 사이의 수소 결합을 통해 안정화된 복합체를 형성하는 반응을 말한다. 수소 결합은 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍 형성(base pairing), 훅스타인 결합(Hoogstein binding)에 의해, 또는 임의의 다른 서열-특이적인 방식으로 발생할 수 있다. 복합체는 두 개의 가닥을 포함할 수 있다. 듀플렉스(duplex) 구조를 형성하는 두 개의 가닥, 다중 가닥 복합체를 형성하는 세 개 이상의 가닥, 단일 자가 혼성체화 가닥, 또는 이것들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 혼성체화 반응은 더 광범위한 공정, 예컨대 PCR 반응의 시작, 또는 리보자임에 의한 폴리뉴클레오타이드의 효소적 분열에서 한 단계를 구성할 수 있다.
혼성체화 반응은 상이한 "엄중도(stringency)"의 조건 하에서 수행될 수 있다. 일반적으로, 낮은 엄중도 혼성체화 반응은 10 x SSC 또는 동등한 이온 강도/온도의 용액에서 약 40 ℃에서 수행된다. 중간 엄중도 혼성체화는 전형적으로 6 x SSC에서 약 50 ℃에서 수행되고, 고 엄중도 혼성체화 반응은 일반적으로 1 x SSC에서 약 60 ℃에서 수행된다. 엄중 혼성체화 조건의 추가적인 예는 다음을 포함한다: 약 25℃ 내지 약 37℃의 인큐베이션 온도의 낮은 엄중도; 약 6x SSC 내지 약 10x SSC의 혼성체화 완충액 농도; 약 0% 내지 약 25%의 포름아미드 농도; 및 약 4x SSC 내지 약 8x SSC의 세척 용액. 중간 혼성체화 조건의 예는 다음을 포함한다: 약 40℃ 내지 약 50℃의 인큐베이션 온도; 약 9x SSC 내지 약 2x SSC의 완충액 농도; 약 30% 내지 약 50%의 포름아미드 농도; 및 약 5x SSC 내지 약 2x SSC의 세척 용액. 고 엄중도 조건의 예는 다음을 포함한다: 약 55℃ 내지 약 68℃의 인큐베이션 온도; 약 1x SSC 내지 약 0.1x SSC의 완충액 농도; 약 55% 내지 약 75%의 포름아미드 농도; 및 약 1x SSC, 0.1x SSC, 또는 탈이온수의 세척 용액. 일반적으로, 혼성체화 인큐베이션 시간은 5분 내지 24시간이며, 1, 2회, 또는 그 이상의 세척 단계를 갖고, 세척 인큐베이션 시간은 약 1, 2, 또는 15분이다. SSC는 0.15 M NaCl 및 15 mM 시트레이트 완충액이다. 다른 완충액 시스템을 사용하는 SSC의 동등물이 이용될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 혼성체화 반응은 또한 당업자에게 널리 공지된 "생리학적 조건" 하에서 수행될 수 있다. 생리학적 조건의 비-제한적 예는 온도, 이온 강도, pH 및 세포에서 일반적으로 발견되는 Mg2 +의 농도이다.
혼성체화가 두 개의 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 사이에서 역평행 구성형태로 일어날 때, 반응은 "어닐링"이라고 불리며 상기 폴리뉴클레오타이드는 "상보적인" 것으로 기재된다. 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드는 혼성체화가 제1 폴리뉴클레오타이드와 제2 폴리뉴클레오타이드의 가닥들 중 하나의 사이에서 일어날 수 있는 경우 또 다른 폴리뉴클레오타이드에 대해 "상보적" 또는 "상동성"일 수 있다. "상보성" 또는 "상동성" (하나의 폴리뉴클레오타이드가 다른 폴리뉴클레오타이드와 상보적인 정도)은 일반적으로 수용되는 염기 쌍 형성 규칙에 따라 서로 수소 결합을 형성할 것으로 예상되는 반대 가닥에서의 염기의 비율에 관하여 정량화 가능하다.
용어 "번식시키다" 또는 "확장하다"는 세포 또는 세포의 집단을 성장시키는 것을 의미한다. 용어 "성장하는"은 또한 지원 배지, 영양소, 성장 인자, 지원 세포, 또는 원하는 세포의 수 또는 세포 유형을 얻기 위해 필요한 임의의 화학물질 또는 생물학적 화합물의 존재 하에서의 세포의 증식을 말한다.
용어 "배양하는"은 다양한 종류의 배지 상에서 또는 상기 배지에서 세포 또는 유기체의 시험관 내 번식을 말한다. 배양액에서 키워진 세포의 자손이 모 세포와 완전히 동일하지 않을 수도 있다는 것을 이해해야 한다 (즉, 형태학적으로, 유전적으로, 또는 표현형적으로).
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 벡터가, 세포 내에 배치될 때, 예를 들어, 형질전환 공정에 의해, 복제될 수 있는 온전한 레플리콘(replicon)을 포함하는 비-염색체 핵산을 말한다. 벡터는 바이러스성 또는 비-바이러스성일 수 있다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 바큘로바이러스, 변형된 바큘로바이러스, 파포바이러스, 또는 그렇지 않으면 변형된 자연 발생 바이러스를 포함한다. 핵산을 전달하기 위한 예시의 비-바이러스 벡터는 네이키드(naked) DNA; 단독 또는 양이온성 폴리머와 조합하여 양이온성 지질과 복합체 형성된 DNA; 음이온성 및 양이온성 리포솜; 어떤 경우에는 리포솜에 함유된, 양이온성 폴리머, 예컨대 이질적인 폴리리신, 한정된 길이의 올리고펩타이드, 및 폴리에틸렌 이민과 응축된 DNA를 포함하는 DNA-단백질 복합체 및 입자; 및 바이러스 및 폴리리신-DNA를 포함하는 3원 복합체의 사용을 포함한다.
"바이러스 벡터"는 생체 내(in vivo), 생체 외(ex vivo) 또는 시험관 내에서 숙주 세포로 전달되는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합에 의해 생산된 바이러스 또는 바이러스 입자로 정의된다. 바이러스 벡터의 예는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터 등을 포함한다. 알파바이러스 벡터, 예컨대 셈리키 삼림 바이러스(Semliki Forest virus)-기반 벡터 및 신드비스 바이러스(Sindbis virus)-기반 벡터가 또한 요전자 치료 및 면역치료에서 사용하기 위해 개발되었다. Schlesinger and Dubensky (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 5:434-439 및 Ying, et al. (1999) Nat. Med. 5(7):823-827 참조.
유전자 전달이 렌티바이러스 벡터에서 매개되는 양태에서, 벡터 작제물은 렌티바이러스 게놈 또는 그 일부, 및 치료 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 말한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "렌티바이러스 매개된 유전자 전달" 또는 "렌티바이러스 형질도입"은 동일한 의미를 가지고 유전자 또는 핵산 서열이 세포에 들어가고 그 게놈을 숙주 세포 게놈으로 통합시키는 바이러스에 의해 숙주 세포로 안정하게 전달되는 공정을 말한다. 바이러스는 정상적인 감염 메커니즘을 통해 숙주 세포로 들어가거나 세포에 들어가기 위해 상이한 숙주 세포 표면 수용체 또는 리간드에 결합하도록 변형될 수 있다. 레트로바이러스는 RNA의 형태로 유전 정보를 가지고 있지만; 바이러스가 세포를 감염시키면, RNA는 감염된 세포의 게놈 DNA로 통합되는 DNA 형태로 역전사된다. 통합된 DNA 형태는 프로바이러스라고 불린다. 본원에서 사용된 바와 같이, 렌티바이러스 벡터는 바이러스 또는 바이러스-유사 진입 메커니즘을 통해 외인성 핵산을 세포로 도입시킬 수 있는 바이러스 입자를 말한다. "렌티바이러스 벡터"는 다른 레트로바이러스 벡터와 비교하여 비-분열 세포를 형질도입시키는데 있어서 특정한 이점을 갖는, 해당 분야에 널리 공지된 레트로바이러스 벡터의 한 유형이다. Trono D. (2002) Lentiviral vectors, New York: Spring-Verlag Berlin Heidelberg 참조.
본 발명의 렌티바이러스 벡터는 온코레트로바이러스 (MLV를 함유하는 레트로바이러스의 부분군), 및 렌티바이러스 (HIV를 함유하는 레트로바이러스의 부분군)를 기반으로 하거나 이것들로부터 유래된다. 예는 모두 렌티바이러스 벡터 입자 생산 시스템을 위한 패키징(packaging) 및 벡터 구성요소로 분할된 ASLV, SNV 및 RSV를 포함한다. 본 발명에 따르는 렌티바이러스 벡터 입자는 유전적으로 또는 다른 방식으로 (예를 들어, 패키징 세포 시스템의 특이적 선택에 의해) 변화된 버전의 특정 레트로바이러스를 기반으로 할 수 있다.
본 발명에 따르는 벡터 입자가 특정 레트로바이러스를 "기반으로 한다"는 것은 벡터가 상기 특정 레트로바이러스로부터 유래된다는 것을 의미한다. 벡터 입자의 게놈은 백본으로서 상기 레트로바이러스의 구성요소를 포함한다. 벡터 입자는 역전사 및 통합 시스템을 포함하여, RNA 게놈과 호환 가능한 필수적인 벡터 구성요소를 함유한다. 보통 이것들은 특정 레트로바이러스로부터 유래된 gag 및 pol 단백질을 포함할 것이다. 따라서, 벡터 입자의 구조적 구성요소의 대부분은 일반적으로 상기 레트로바이러스로부터 유래될 것이지만, 그것들은 원하는 유용한 성질을 제공하기 위해 유전적으로 또는 다른 방식으로 변화될 수 있다. 하지만, 특정 구조적 구성요소 및 특히 env 단백질은 상이한 바이러스로부터 기원할 수 있다. 감염되거나 형질도입된 벡터 숙주 범위 및 세포 유형은 벡터 입자에게 상이한 특이성을 제공하기 위해 벡터 입자 생산 시스템에서 상이한 env 유전자를 사용함으로써 변화될 수 있다.
용어 "프로모터"는 특정 유전자의 전사를 시작하는 DNA의 영역을 말한다. 프로모터는 적절하게 전사를 시작하는데 필요한 프로모터의 최소한의 부분인 코어 프로모터를 포함하고 또한 전사 인자 결합 부위와 같은 조절 요소를 포함할 수 있다. 조절 요소는 전사를 촉진하거나 전사를 억제할 수 있다. 프로모터에서 조절 요소는 전사 활성화 물질 또는 전사 억제 물질에 대한 결합 부위일 수 있다. 프로모터는 구성성이거나 유도성일 수 있다. 구성성 프로모터는 항상 활성이고 및/또는 기저 전사 수준보다 높은 유전자의 전사를 지속적으로 지시하는 것을 말한다. 이러한 것들의 비-제한적 예는 포스포글리세레이트 키나제 1 (PGK) 프로모터; SSFV, CMV, MNDU3, SV40, Ef1a, UBC 및 CAGG를 포함한다. 유도성 프로모터는 세포에 추가되거나 세포에서 발현된 분자 또는 인자에 의해 유도될 수 있는 것이다. 유도성 프로모터는 유도의 부재시 여전히 기저 수준의 전사를 생산할 수 있지만, 유도는 전형적으로 훨씬 더 많은 단백질 생산으로 이어진다. 프로모터는 또한 조직 특이적일 수 있다. 조직 특이적 프로모터는 프로모터를 활성화시키기에 적절한 전사 인자를 가진 특정 세포 집단에서 단백질의 생산을 허용한다.
인핸서는 표적 서열의 발현을 증가시키는 조절 요소이다. "프로모터/인핸서"는 프로모터 및 인핸서 기능 둘 다를 제공할 수 있는 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드이다. 예를 들어, 레트로바이러스의 긴 말단 반복부위는 프로모터 및 인핸서 기능 둘 다를 함유한다. 인핸서/프로모터는 "내인성" 또는 "외인성" 또는 "이종성"일 수 있다. "내인성" 인핸서/프로모터는 게놈에서 주어진 유전자와 자연적으로 연결된 것이다. "외인성" 또는 "이종성" 인핸서/프로모터는 상기 유전자의 전사가 연결된 인핸서/프로모터에 의해 지시되도록 유전자 조작 (즉, 분자 생물학적 기술)에 의해 유전자와 병치된 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "줄기 세포"는 배양 중에 무기한의 기간 동안 분열되고 특수화된 세포를 발생시키는 능력을 가진 세포를 정의한다. 이 시점에 그리고 편의상, 줄기 세포는 체세포 (성인) 또는 배아로 분류된다. 체세포 줄기 세포는 스스로 재생되고 (클론성) 및 (특정 한계를 가지고) 분화되어 기원한 조직의 모든 특수화된 세포 유형을 수득할 수 있는 분화된 조직에서 발견된 미분화된 세포이다. 배아 줄기 세포는 다양한 특수화된 세포 유형이 될 가능성을 가진 배아의 원시성 (미분화된) 세포이다. 배아 줄기 세포는 수개월 내지 수년 동안 분화되지 않고 증식하는 것이 허용된 시험관 내 조건 하에서 배양된 것이다. 클론은 기원하는 세포와 유전적으로 동일한 세포주이며; 이 경우에, 줄기 세포이다.
"줄기 세포 로제트"는 확대 하에 꽃잎의 클러스터로 보이는 줄기 세포의 클러스터를 의도한다. 예를 들어, 도 8D 참조.
세포의 집단은 표현형 및/또는 유전자형이 동일하거나 (클론) 비-동일한 하나 이상의 세포의 컬렉션을 의도한다. 실질적으로 동질의 세포 집단은 사전 선택된 마커에 의해 측정된 바와 같이 적어도 70 %, 또는 대안으로 적어도 75 %, 또는 대안으로 적어도 80%, 또는 대안으로 적어도 85%, 또는 대안으로 적어도 90 %, 또는 대안으로 적어도 95 %, 또는 대안으로 적어도 98% 동일한 표현형을 갖는 집단이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "배아 줄기 세포"는 수정 이후에, 하지만 임신 말기 전에 형성된 조직으로부터 유래된 줄기 세포를 말하며, 임신 중 어느 시점에, 반드시 그러한 것은 아니지만 전형적으로는 대략 10-12주 임신 전에 취해진 전배아 조직 (예를 들어, 배반포), 배아 조직, 또는 태아 조직을 포함한다. 가장 빈번하게는, 배아 줄기 세포는 초기 배아 또는 배반포로부터 유래된 만능 세포이다. 배아 줄기 세포는, 제한되는 것은 아니지만, 인간 조직을 포함한 적합한 조직으로부터, 또는 확립된 배아 세포주로부터 직접 얻어질 수 있다. "배아-유사 줄기 세포"는 배아 줄기 세포의, 모두는 아니지만, 하나 이상의 특성을 공유하는 세포를 말한다.
신경 줄기 세포는 인간을 포함한 포유동물의 성체 중추 신경계로부터 단리될 수 있는 세포이다. 그것들은 뉴런을 생성하고, 축삭 돌출부 및 수지상 돌출부를 이동시키고 내보내고, 기존의 신경 회로에 통합되어 정상적인 뇌 기능에 기여하는 것으로 나타났다. 이 영역의 연구에 대한 리뷰는 Miller (2006) The Promise of Stem Cells for Neural Repair, Brain Res. Vol. 1091(1):258-264; Pluchino et al. (2005) Neural Stem Cells and Their Use as Therapeutic Tool in Neurological Disorders, Brain Res. Brain Res. Rev., Vol. 48(2):211-219; 및 Goh, et al. (2003) Adult Neural Stem Cells and Repair of the Adult Central Nervous System, J. Hematother. Stem Cell Res., Vol. 12(6):671-679에서 발견된다.
"분화"는 특수화되지 않은 세포가 심장, 간, 또는 근육 세포와 같이 특수한 세포의 특징을 획득하는 공정을 기재한다. "지시된 분화"는 특정 세포 유형으로의 분화를 유도하기 위한 줄기 세포 배양 조건의 조작을 말한다. "탈분화된"은 세포의 계통 내에서 덜 수임되는 위치로 되돌아가는 세포를 정의한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "분화하다 또는 분화된"은 세포의 계통 내에서 더 수임되는 ("분화된") 위치를 차지하는 세포를 정의한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "중배엽 (또는 외배엽 또는 내배엽) 계통으로 분화되는 세포"는 각각 특수한 중배엽, 외배엽 또는 내배엽 계통에 수임되는 세포를 정의한다. 중배엽 계통으로 분화되거나 특이적 중배엽 세포를 발생시키는 세포의 예는 지방 발생성, 평활근 발생성, 연골 발생성, 심장 발생성, 피부 발생성, 조혈성, 혈관 발생성, 근육 발생성, 신장 발생성, 비뇨생식 발생성, 골 발생성, 심막 발생성, 또는 기질성인 세포를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "분화하다 또는 분화된"은 세포의 계통 내에서 더 수임되는 ("분화된") 위치를 차지하는 세포를 정의한다. "탈분화된"은 세포의 계통 내에서 덜 수임되는 위치로 되돌아가는 세포를 정의한다. 유도된 만능 줄기 세포가 탈분화된 세포의 예이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 세포의 "계통"은 세포의 유전, 즉 그 선조 및 자손을 정의한다. 세포의 계통은 발달 및 분화의 유전적인 계획 내에 세포를 배치한다.
"다중 계통 줄기 세포" 또는 "다능성 줄기 세포"는 별개의 발달 계통으로부터 그 자체 및 적어도 두 개의 추가의 분화된 자손 세포를 재생산하는 줄기 세포를 말한다. 계통은 동일한 배엽 (즉, 중배엽, 외배엽 또는 내배엽)으로부터 유래되거나, 또는 상이한 배엽으로부터 유래될 수 있다. 다중 계통 줄기 세포의 분화로부터의 별개의 발달 계통을 가진 두 개의 자손 세포의 예는 근육 발생성 세포 및 지방 발생성 세포이다 (둘 다 중배엽 기원이지만 상이한 조직을 발생시킨다). 또 다른 예는 신경 발생성 세포 (외배엽 기원) 및 지방 발생성 세포 (중배엽 기원)이다.
"전구체" 또는 "전구 세포"는 특정 유형의 세포로 분화될 수 있는 능력을 가진 세포를 의미한다. 전구 세포는 줄기 세포일 수 있다. 전구 세포는 또한 줄기 세포보다 더 특이적일 수 있다. 전구 세포는 단능성 또는 다능성일 수 있다. 성체 줄기 세포와 비교하여, 전구 세포는 세포 분화의 후기에 있을 수 있다. 전구 세포의 예는, 제한 없이, 전구 신경 세포를 포함한다.
"단위생식형 줄기 세포"는 난자의 단위생식형 활성화로부터 발생한 줄기 세포를 말한다. 단위생식형 줄기 세포를 생성하는 방법은 해당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Cibelli et al. (2002) Science 295(5556):819 및 Vrana et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(Suppl. 1)11911-6 참조.
본원에서 사용된 바와 같이, "만능 세포"는 적어도 두 개의 별개의 (유전자형적으로 및/또는 표현형적으로) 추가로 분화된 자손 세포를 발생시킬 수 있는 덜 분화된 세포를 정의한다. 또 다른 양태에서, "만능 세포"는 비-만능 세포, 전형적으로는 성체 체세포로부터 인공적으로 유래된 줄기 세포인 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)를 포함하며 이것은 하나 이상의 줄기 세포 특이적 유전자의 발현을 유도함으로써 역사적으로 생산되었다. 이러한 줄기 세포 특이적 유전자는 옥타머 전사 인자의 패밀리, 즉, Oct-3/4; Sox 유전자의 패밀리, 즉, Sox1, Sox2, Sox3, Sox 15 및 Sox 18; Klf 유전자의 패밀리, 즉, Klf1, Klf2, Klf4 및 Klf5; Myc 유전자의 패밀리, 즉, c-myc 및 L-myc; Nanog 유전자의 패밀리, 즉, OCT4, NANOG 및 REX1; 또는 LIN28을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. iPSC의 예는 Takahashi et al. (2007) Cell advance online publication 20 November 2007; Takahashi & Yamanaka (2006) Cell 126:663-76; Okita et al. (2007) Nature 448:260-262; Yu et al. (2007) Science advance online publication 20 November 2007; 및 Nakagawa et al. (2007) Nat. Biotechnol. Advance online publication 30 November 2007에 기재되어 있다.
"배양체 또는 EB"는 후속적인 분화를 용이하게 하는 배양 중에 형성된 배아 줄기 세포의 3차원 (3D) 응집체이다. 현탁 배양액에서 키워질 때, EB 세포는 내장 내배엽의 외층에 의해 둘러싸인 세포의 작은 응집체를 형성한다. 성장 및 분화시, EB는 외배엽-유사 세포의 유동체-충전된 공동 및 내층을 가진 낭포성 배양체로 발달한다.
"조성물"은 활성 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 항체와, 불활성 (예를 들어, 검출 가능한 라벨)이든 활성 (예를 들어, 유전자 전달 비히클)이든, 또 다른 화합물 또는 조성물의 조합을 의미한다.
"약학적 조성물"은, 불활성 또는 활성이든, 조성물을 시험관 내, 생체 내 또는 생체 외에서 진단적 또는 치료적 사용에 적합하게 만드는 고체 지지체와 같은 담체와의 활성 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 항체의 조합을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 표준 약학적 담체, 예컨대 포스페이트 완충된 식염수 용액, 수, 및 에멀젼, 예컨대 유/수 또는 수/유 에멀젼, 및 다양한 유형의 습윤제 중 어느 것을 포함한다. 조성물은 또한 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있다. 담체, 안정화제 및 보조제의 예를 위해, Martin (1975) Remington's Pharm. Sci., 15th Ed. (Mack Publ. Co., Easton) 참조.
"대상체", "개체" 또는 "환자"는 본원에서 교체 가능하게 사용되고, 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 더 바람직하게는 인간을 말한다. 포유동물은 쥐, 래트, 토끼, 유인원, 소, 양, 돼지, 개, 고양이, 가축, 스포츠용 동물, 애완동물, 말, 및 영장류, 특히 인간을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 인간 치료에 유용한 것 외에도, 본 발명은 또한 포유동물, 설치류, 등을 포함하는, 신경변성 질환에 민감한 반려 포유동물, 이국의 동물 및 순화된 동물의 수의과적 치료에 유용하다. 한 구체예에서, 포유동물은 말, 개, 및 고양이를 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 인간은 18세 미만의 청소년 또는 유아이다.
"숙주 세포"는 특정 대상 세포뿐 아니라 그러한 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 말한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 후계 세대에서 특정 변형이 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은, 실제로는, 모 세포와 동일하지 않을 수도 있지만, 본원에서 사용된 용어의 범위 내에 여전히 포함된다.
질환을 "치료하는" 또는 "치료하다"는 다음을 포함한다: (1) 질환의 예방, 즉, 질환의 임상적 증상이 질환에 취약할 수 있지만 질환의 증상을 경험하거나 나타내지 않은 환자에서 발달하지 않게 하는 것; (2) 질환의 억제, 즉, 질환 또는 그것의 임상적 증상의 발달을 정지시키거나 감소시키는 것; 또는 (3) 질환의 완화, 즉, 질환 또는 그 임상적 증상의 퇴보를 유발하는 것.
용어 "고통받는"은 용어 "치료"와 관련하여 감염 또는 감염에 따르는 질환으로 진단되었거나 또는 이것들에 취약한 환자 또는 개체를 말한다. 환자는 또한 활성 또는 잠복 감염으로 인해 질환으로 "고통받을 위험이 있는" 것을 나타낼 수 있다. 이 환자는 특유의 질환 병리학이 발달하지 않았다.
"유효량"은 유익하거나 원하는 결과를 가져오기에 충분한 양이다. 유효량은 1회 이상의 투여, 도포 또는 투약으로 투여될 수 있다. 이러한 전달은 개개의 투약 단위가 사용되어야 하는 기간, 치료제의 생체이용률, 투여 경로, 등을 포함한 많은 변수에 의존적이다. 하지만, 임의의 특정 대상체에 대해 본 발명의 치료제의 특정 용량 수준은 이용되는 특정 화합물의 활성, 대상체의 나이, 체중, 일반적인 건강상태, 성별, 및 식이, 투여 시기, 배설률, 약물 조합, 및 치료되는 특정 장애의 심각도 및 투여 형태를 포함한 다양한 요인들에 의존적이라는 것을 이해해야 한다. 치료 투약량은 일반적으로 안전성 및 효능을 최적화하기 위해 적정될 수 있다. 전형적으로, 시험관 내 및/또는 생체 내 테스트로부터의 투약-효과 관계는 초기에 환자 투여를 위한 적절한 용량에 대해 유용한 지침을 제공할 수 있다. 일반적으로, 시험관 내에서 효과적인 것으로 발견된 농도와 비례하는 혈청 수준을 달성하기에 효과적인 화합물의 양을 투여하는 것이 바람직할 것이다. 이들 파라미터의 결정은 해당 분야의 기술범위 내에 있다. 이들 고려사항, 뿐만 아니라 효과적인 제제 및 투여 과정은 해당 분야에 널리 공지되어 있고 표준 교과서에 기재되어 있다. 이 정의에 따라, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료적 유효량"은 생체 외, 시험관 내 또는 생체 내에서 RNA 바이러스 복제를 억제하기에 충분한 양이다.
용어 투여는 제한 없이 경구, 비경구 (예를 들어, 근육내, 복강내, 정맥내, ICV, 낭내 주사 또는 주입, 피하 주사, 또는 이식), 비강 흡입 스프레이, 질, 직장, 혀밑, 요도 (예를 들어, 요도 좌제), 두개내, 또는 국부적 투여 경로 (예를 들어, 겔, 연고, 크림, 에어로졸, 등)에 의한 투여를 포함해야 하고 각각의 투여 경로에 적절한 통상적인 비-독성 약학적으로 허용 가능한 담체, 보조제, 부형제, 및 비히클을 함유하는 적합한 투약 단위의 제제에 단독으로 또는 함께 제제화될 수 있다. 본 발명은 투여 경로, 제제 또는 주입 일정에 제한되지 않는다.
헌팅턴 병 (HD)은 뇌에서 신경 세포의 점진적 고장 (변성)을 유발하는 유전 질환이다. 헌팅턴 병은 운동 및 인지 기능 상실, 뿐만 아니라 정신의학적 장애를 포함하는 개인의 생활 기능에 광범위한 영향을 미친다. HD의 증상을 치료하거나 개선하는 것은 환자의 정신의학적인 인지 또는 운동 기능을 개선하거나 이 유전 장애의 부작용을 감소시키는 것을 의도한다. 질환의 증상 및 과정은 당업자에게 공지되어 있으며, 2018년 5월 21에 접속된 mayoclinic.org/diseases-conditions/huntingtons-disease/symptoms-causes/syc-20356117 참조.
중추 신경계 (CNS) 질환 또는 장애는 뇌 또는 척소의 기능의 구조에 영향을 미치고, 뇌 또는 척수의 하나 이상의 부분의 변성을 초래할 수 있는 신경학적 장애의 군을 의도한다. 비-제한적 예는 HD, 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 외상성 뇌 손상, 뇌졸중, 자가면역 장애, 예컨대 다발성 경화증, 1차 또는 2차 진행형 다발성 경화증, 재발 완화형 다발성 경화증, 뇌 염증, 벨 마비, 경부 경추증, 손목 터널 증후군, 뇌 또는 척수 종양, 말초 신경병증, 길랭-바레 증후군, 척수근 위축증, 프리드리히 운동실조증, 근위축성 측색 경화증, 및 헌팅턴 무도병을 포함한다. CNS 손상의 증상을 치료 또는 개선하는 것은 선천적 또는 후천적인 질환, 손상 또는 장애의 부작용을 감소시키기 위해 환자의 신경 기능을 개선하는 것을 의도한다. 질환의 증상 및 과정은 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 2018년 5월 21일에 접속된 hopkinsmedicine.org/healthlibrary/conditions/nervous_system_disorders/overview_of_nervous_system_disorders_85,P00799 참조.
"신경변성 질환 또는 장애"는 신경계, 특히 CNS에서의 뉴런의 변성을 특징으로 하는 잘환 또는 표현형이다.
"시냅스 연결을 향상시키는 것"은 뉴런 또는 신경 수용체 사이의 연결을 촉진하는 것을 의도한다.
시냅스는 두 개의 신경 세포 사이의 접합부이며, 신경 전달 물질의 확산에 의해 충격이 통과하는 미세한 갭(gap)으로 이루어진다.
본 개시물을 수행하기 위한 방식
인간 배아 줄기 세포 (hESC)로부터 인간 신경 줄기 세포 (hNSC)를 제조하기 위한 방법이 본원에서 제공되며, 방법은 다음 단계를 포함하거나, 또는 대안으로 근본적으로 그 단계들로 이루어지거나, 또는 추가로 그 단계들로 이루어진다:
a) 분화 배지에서 배양된 배양체 (EB)의 집단으로부터 적어도 하나의 줄기 세포 로제트를 단리시키는 단계;
b) 일정 시간 동안 및 적어도 하나의 로제트의 생성을 제공하는 조건 하에서 단계 a)의 로제트로부터 단리된 적어도 하나의 개개의 세포를 배양하는 단계;
c) 개개의 세포를 단계 b)의 로제트로부터 개개의 세포로 단리시키는 단계; 및
d) 일정 시간 동안 및 hNSC의 밀집 집단의 생성을 제공하는 조건 하에서 단계 c)로부터 단리된 적어도 하나의 개개의 세포를 배양하는 단계.
한 양태에서, 로제트로부터 적어도 하나의 개개의 세포의 단리는 수동으로 수행된다. 또 다른 양태에서, 로제트로부터 적어도 하나의 개개의 세포의 단리는 효소를 이용하여 수행된다. 추가의 양태에서, 단계 a)의 로제트로부터 적어도 하나의 개개의 세포의 단리는 다음 중 하나 이상에 의해 수행된다: 수동으로, 효소를 이용하여, 및/또는 디지털 방식으로. 추가의 양태에서, 단계 c)의 적어도 하나의 개개의 세포의 단리는 효소를 이용하여 수행된다. 디지털 방식으로 3차원 또는 2차원 이미지를 식별하기 위한 방법 및 기술은 해당 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,689,043; 6,907,140; 및 5,020,112 참조.
한 구체예에서, 단계 a) 내지 c) 중 하나 이상은 2회 이상 수행되며, 수동으로, 또는 고처리량 방식으로 기계적으로 중 하나 또는 둘 다를 사용하여 수행될 수 있다. 추가의 양태에서, 로제트의 단리는 디지털 방식으로 수행된다. 디지털 방식으로 3차원 또는 2차원 이미지를 식별하기 위한 방법 및 기술은 해당 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,689,043; 6,907,140; 및 5,020,112 참조.
한 양태에서, 배양체는 세포주 ESI-017로부터 생성되며 BioTime으로부터 이용 가능하다 (esibio.com/esi-017-human-embryonic-stem-cell-line-46-xx/, 마지막으로 2018년 6월 6일에 접속됨).
본 개시물의 한 양태에서, 방법은 EB 배지 내에서 초저 부착면 상에 배양체 (EB)를 배양하는 단계를 더 포함한다. 또 다른 양태에서, 방법은 단계 a)에 더하여 EB가 오르니틴/라미닌 코팅된 표면 상에서 유효한 시간 동안 배양된 후 EB 배지를 N2 배지로 대체하는 단계를 더 포함한다. 대안으로, 방법은 EB가 단계 a)의 적어도 하나의 EB를 생산하기에 유효한 일정 시간 동안 EB 배지에서 배양된 후 EB 배지를 N2 배지로 대체하는 단계를 더 포함한다.
방법은 hNSC의 밀집 세포 집단을 생성하기 위해 N2 배지 내에서 오르니틴/라미닌 코팅된 플레이트 상에 유효한 기간 동안 배양된 단계 c)에서 단리된 적어도 하나의 개개의 세포를 가짐으로써 추가로 변형될 수 있다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 밀집 세포 집단은 상당한 수의 세포가 집단 내에서 서로 접촉되어 있는 것이다. 이 방법은 N2 배지의 유효량과 함께 hNSC의 밀집 집단을 배양함으로써 추가로 변형될 수 있다.
또한 본원에서 기재된 방법에 의해 제조된 세포 또는 세포의 집단이 제공된다. 신경 세포 및 분화된 세포는 BDNF를 생산하거나 또는 BDNF를 과발현한다.
집단의 세포는, 예를 들어, 전이유전자의 삽입에 의해 또는 CRISPR에 의해 확장되고 및/또는 유전적으로 변형될 수 있다. 한 양태에서, 전이유전자는 ApiCCT1, 그것의 단편, 예컨대 sApiCCT, 또는 그것들 각각의 동등물이다. 세포 및/또는 전이유전자는 선택적으로 검출 가능하게 라벨링될 수 있다. 전이유전자는 벡터에 전이유전자를 삽입하는 것에 의한 널리 공지되고 통상적인 재조합 기술을 사용하여 삽입될 수 있으며, 전이유전자는 조절 요소, 예컨대 프로모터 및 선택적으로, 인핸서 요소의 제어 하에 있다. 전이유전자를 함유하는 세포 및/또는 벡터는 검출 가능하게 라벨링될 수 있다. 하기 상세히 설명된 바와 같이, 전이유전자 sApiCCT는 hNSC의 특정 세포 집단에 삽입되어 치료제로서 이식될 때 hNSC 또는 조직에 추가의 보호를 제공한다. sApiCCT 전이유전자는 또한, 제한되는 것은 아니지만, 다른 배아 세포주, 태아 유래된 세포주, 중간엽 유래된 세포주, 신경 유래된 세포주, 뿐만 아니라 분화된 세포 유형을 포함하는 hESC 또는 다른 줄기 세포 유도체로 삽입될 수 있다.
이들 세포의 집단, 뿐만 아니라 세포를 포함하는 비-인간 동물이 추가로 제공된다. 집단은 실질적으로 동질하거나, 실질적으로 이질적이거나 또는 클론일 수 있다. 집단은 검출 가능하게 라벨링될 수 있다. 집단은 담체, 예컨대 약학적으로 허용 가능한 담체와 조합될 수 있다.
단리된 세포를 포함하는 조성물이, 예를 들어, 담체와 함께 추가로 제공된다. 추가의 양태에서, 조성물은 보존제 및/또는 동결방지제를 더 포함한다. 동결방지제의 비-제한적 예는 상업적으로 이용 가능한 DMSO, 글리세롤을 포함하며, 예를 들어, streck.com/collection/streck-cell-preservative/ 참조, 마지막으로 2018년 3월 22일 접속됨.
세포는 치료 방법에서 유용하다. 한 양태에서, 본원에서 기재된 바와 같이 세포, 집단 또는 조성물 중 하나 이상의 유효량을 투여함으로써 전이유전자를 대상체에 전달하거나, 또는 필요로 하는 대상체에서 세포를 유전적으로 편집하는 방법이 제공된다. 또 다른 양태에서, 세포, 집단 또는 조성물 중 하나 이상의 유효량을 대상체에게 투여함으로써 필요로 하는 대상체에서 신경변성 장애를 치료하거나 시냅스 연결을 향상시키는 방법이 제공된다. 또 다른 양태에서, 필요로 하는 대상체에서 신경변성 장애를 치료하거나 시냅스 연결을 향상시키거나 또는 CNS 손상을 치료하는 방법이 제공되며, 세포, 집단 또는 조성물 중 하나 이상의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 임의의 적절한 투여 방법이 사용될 수 있다. 이러한 것의 비-제한적 예는 본원에서 제공된다.
신경변성 장애의 비-제한적 예는 헌팅턴 병, 뇌졸중, CNS 손상, 만성 척수 손상, 척수 손상, 동맥류(aneurism), 수술, 동정맥 기형 (arteriovenous malformation: AVM), 방사선, 척수근 위축증, 프리드리히 운동실조증, 근위축성 측색 경화증 (ALS), 근육 경화증, 1차 또는 2차 진행형 다발성 경화증, 재발 완화형 다발성 경화증, 혈관성 치매(vascular dementia), 간질성 발작(epileptic seizures), 뇌혈관 연축(cerebral vasospasm), 알츠하이머 병, 급성 또는 외상성 뇌 손상, 뇌 염증, 및, 예를 들어, 심폐 정지 또는 거의 익사 또는 CNA 조직에 대한 급성 신체 손상에 기인하는 임의의 다른 CNS 손상 및 이것들의 조합의 결과로서 뇌의 저산소증(hypoxia)의 군으로부터 선택된다.
특정 구체예에서, CNS 손상은 뇌졸중에 의해 유발된 것이다. "뇌졸중"은 뇌에 혈액 공급 또는 산소의 장애로 인한 중추 신경계에 대한 물리적 손상에 기인하는 임의의 병태를 의미한다. 이것은 혈전증 또는 색전증에 의해 또는 출혈로 인해　유발된 허혈 (혈액 공급 또는 산소의 부족)에 의한 것일 수 있다.
키트
키트가 또한 제공된다. 한 양태에서, 키트는 hESC 및 본원에서 기재된 방법을 수행하기 위한 설명서를 포함한다. 추가의 양태에서, 키트는 본원에서 기재된 방법을 사용하여 제조된 신경 세포 및 사용설명서를 포함한다. 키트는 키트와 함께 제공된 설명서를 수행하기 위한 조성물 및 시약을 더 포함할 수 있다.
본원에 기재된 작용제는, 일부 구체예에서, 치료, 진단 또는 연구 용도에서의 사용을 용이하게 하기 위해 약학적 또는 진단적 또는 연구 키트로 조립될 수 있다. 한 양태에서, 키트는 hESC 및 본워에 기재된 방법을 수행하기 위한 설명서를 포함한다. 추가의 양태에서, 키트는 본원에 기재된 방법을 사용하여 제조된 신경 세포 및 사용 설명서를 포함한다. 키트는 키트와 함께 제공된 설명서를 수행하기 위한 조성물 및 시약을 더 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 사용 설명서를 더 포함한다. 구체적으로, 이러한 키트는 이들 작용제의 의도된 용도 및 적절한 사용법을 기재한 설명서와 함께 본원에 기재된 하나 이상의 작용제를 포함할 수 있다. 예로서, 한 구체예에서, 키트는 키트의 하나 이상의 구성요소를 혼합하고 및/또는 샘플을 분리 및 혼합하고 대상체에게 적용하기 위한 설명서를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 키트 내 작용제는 특정 용도 및 작용제의 투여 방법에 적합한 약학적 제제 및 투약 형태로 되어 있다. 연구 목적을 위한 키트는 다양한 실험을 실행하기 위한 적절한 농도 또는 양의 구성요소를 함유할 수 있다.
키트는 본원에 기재된 방법의 사용을 용이하게 하도록 디자인될 수 있으며 다양한 형태를 취할 수 있다. 키트의 조성물은 각각 적용 가능한 경우 액체 형태 (예를 들어, 용액), 또는 고체 형태 (예를 들어, 건조 분말)로 제공될 수 있다. 어떤 경우에, 조성물의 일부는, 예를 들어, 키트와 함께 제공될 수도 있고 제공되지 않을 수도 있는 적합한 용제 또는 다른 종 (예를 들어, 물 또는 세포 배양 배지)의 추가에 의해 구성 가능하거나 또는 그렇지 않으면 가공 가능할 수 있다 (예를 들어, 활성 성태로). 일부 구체예에서, 조성물은 보존 용액 (예를 들어, 냉동 보존 용액)으로 제공될 수 있다. 보존 용액의 비-제한적 예는 DMSO, 파라포름알데하이드, 및 CryoStor® (Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada)을 포함한다. 일부 구체예에서, 보존 용액은 메탈로프로테아제 억제자의 양을 함유한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "설명서"는 설명 및/또는 촉진의 구성요소를 정의할 수 있고, 전형적으로 청구된 방법 또는 조성물의 포장에 대해 또는 그것과 관련된 서면 설명서를 수반한다. 설명서는 또한 설명서가 키트와 연관성이 있다는 것을 사용자가 분명하게 인식할 수 있는 임의의 방식으로 제공되는 임의의 구두 또는 전자 설명서, 예를 들어, 시청각 (예를 들어, 비디오 테이프, DVD, 등), 인터넷, 및/또는 웹-기반 통신, 등을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 서면 설명서는 약제 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 조절하는 정부 기관에 의해 규정된 형태로 되어 있으며, 이 설명서는 또한 동물 투여에 대해 제조, 사용 또는 판매의 기관에 의한 승인을 반영할 수 있다.
일부 구체예에서, 키트는 하나 이상의 용기 내에 본원에 기재된 구성요소 중 임의의 하나 이상을 함유한다. 따라서, 일부 구체예에서, 키트는 본원에 기재된 작용제를 담은 용기를 포함할 수 있다. 작용제는 액체, 겔 또는 고체 (분말)의 형태로 되어 있을 수 있다. 작용제는 멸균 상태로 제조되고, 주사기에 포장되고 냉동된 상태로 운송될 수 있다. 대안으로 그것은 바이알 또는 다른 저장 용기에 담아질 수 있다. 제2 용기는 멸균 상태로 제조된 다른 작용제를 가질 수 있다. 대안으로, 키트는 사전 혼합되고 주사기, 바이알, 튜브, 또는 다른 용기에서 운송된 활성제를 포함할 수 있다. 키트는 작용제를 대상체에 투여하는데 필요한 구성요소, 예컨대 주사기, 국소 도포 디바이스, 또는 IV 바늘 튜브 및 백(bag) 중 하나 이상 또는 모두를 가질 수 있다.
본원에 기재된 치료법은 치료법에 적절한 환자를 확인하고 선택하기 위한 진단 기술과 조합될 수 있다. 예를 들어, 근 위축증 유전자에서 돌연변이를 확인하기 위한 유전학적 테스트가 제공될 수 있다. 따라서, 돌연변이를 가지고 있는 환자가 치료에 적합한 것으로 확인될 수 있다.
다음 실시예는 본 개시물을 예시하려는 의도이며, 제한하려는 것은 아니다.
실험 과정
ESI -017 hNSC의 생성 - 재료
설명 회사 카탈로그 번호 250 ml 최종 농도
KO DMEM/F-12 Life Technologies 12660-012 195 ml
GlutaMAXTM Life Technologies 35050-061 2.5 ml 1x
NEAA Life Technologies 11140-050 2.5 ml 1x
2-메르캅토에탄올 Life Technologies 21985-023 455 ul 0.2%
넉아웃 혈청 대체 (KSR) Life Technologies 10828-028 50 ml 20%
N2 배지 레시피
설명 회사 카탈로그 번호 50 ml 최종 농도
Cellgro DMEM/F12 Corning 15090-cv 48.8 mL
GlutaMAXTM Life Technologies 35050-061 0.5 mL 1x
N2 Life Technologies 17502-048 0.25 mL 0.5%
B27 Life Technologies 17504-044 0.5 mL 1%
bFGF (10ug/ml) Life Technologies PHG0021 0.1 mL 20ng/ml
냉동 보존 배지 레시피
설명 회사 카탈로그 번호 희석 최종 농도
N2 배지 스톡 NA 9부 90%
DMSO Sigma D1435-1L 1부 10%
추가적인 시약
설명 회사 카탈로그 번호 희석 최종 농도
쥐 라미닌 Sigma L2020-1MG PBS에서 10 ul/mL 10ug/ml
폴리-L-오르니틴 (폴리-L) Sigma P4957 PBS에서 1:3 25%
0.05% 트립신 Life Technologies 25300-054 1 ml/웰 100%
한정 트립신 억제자 (DTI) Life Technologies R-007-100 1 ml/웰 100%
용액 제조
제조
1. 스톡 폴리-L-오르니틴을 PBS-/-에서 1:3으로 희석함 (2부 PBS에 대해 1부 폴리-L)
2. 라미닌을 1ml PBS-/- 당 10 ul 스톡 라미닌 (10 ug/ml)으로 희석함
3. bFGF - 10ml 물에 100ug 바이알을 희석함 = 10ug/ml 또는 10 ng/ul
ESC로부터 NSC의 생성을 위한 과정
배양체 ( EB ) 형성을 위한 ESC의 계대배양 .
제1 일에, 분화된 콜로니를 ESC 배양물로부터 P1000 팁을 사용하여 수동으로 씻어냈다. ESC 배지를 ESC 배지에서 2 mL/웰의 EB 배지로 교환하였다. P1000 팁을 사용하여, ESC 콜로니를 앞뒤로 움직이면서 긁어내고 처음에는 웰을 가로질러 수평으로 긁어내고, 그 다음에는 수직으로 긁어냈다. 긁어낸 콜로니의 각 웰을 10 mL 혈청학적 피펫을 이용하여 초저 부착 6웰 플레이트의 한 웰로 옮겼다. ESC 플레이트의 웰을 EB 배지를 사용하여 P1000 마이크로피펫으로 씻어내고 추가로 초저 부착 6 웰 플레이트의 각 웰을 세척하여 3 mL/웰의 최종 부피를 제공하였다. EB 플레이트를 37℃ 및 5% CO2의 인큐베이터로 옮겼다. EB 플레이트를 제2 일 전체에 걸쳐 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 제3 일에, 절반의 EB 배지 교환을 수행하였다. 부유 콜로니를 웰의 중심으로 부드럽게 선회시켰다. P1000 마이크로피펫을 사용하여, 배지 1 ml를 각 웰에서 제거하고 폐기하였다. 신선한 EB 배지 1.5 mL를 다시 각 웰에 부드럽게 추가하였다. 그 다음에 플레이트(들)를 인큐베이터에 되돌려놓았다. 제4 일에, 아무런 조치를 하지 않았다. 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션하면서 계속해서 교반하였다. 제5 일에, ESC로부터 유래된 EB를 라미닌 코팅된 플레이트에 평판배양하였다. 6웰 플레이트에서 적절한 수의 웰을 PBS에서 1:3으로 희석된 폴리-L-오르니틴으로 실온에서 1시간 동안 코팅하였다. N2 배지를 표 2에 따라 제조하였다 (N2 배지는 제조 후 1주일 동안 양호하다). 1시간 후, 폴리-L-오르니틴 용액을 제거하고 폐기하였다. 웰을 PBS로 2회 세척하였다. 웰을 라미닌으로 코팅하고 PBS에서 1:100으로 실온에서 1시간 동안 희석하였다. EB의 현탁액을 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 각 웰에서 자체의 15 mL 원뿔형 튜브로 옮겼다. EB를 실온에서 15분 동안 현탁액 밖으로 정착시켰다. 코팅된 6웰 플레이트의 웰에 대하여, 라미닌을 빨아내고 폐기하였다. N2 배지 1 mL를 각 웰에 추가하였다. EB 배지를 각각의 15 mL 원뿔형 튜브로부터 빨아냈다. EB를 10 mL 혈청학적 피펫을 사용하여 N2 배지 2 mL에 부드럽게 재현탁시켰다. EB를 총 부피 3 mL에 대해 N2 배지 1 mL을 함유하는 코팅된 웰에 추가하였다. 플레이트를 부드럽게 앞뒤로 흔들어서 EB를 분포시키고 인큐베이터에 배치하였다. 제6 일 내지 제14 일에, 로제트 형성 및 평판배양된 EB의 단리 (Ros1, 라운드 1)를 수행하였다. 세포를 다음 4-6일에 걸쳐 검사하여 로제트의 형성을 체크하였다. 로제트를 형성의 질에 따라 임의의 시간에 선택하였다. 로제트가 아직 형성되지 않은 경우, 로제트가 나타날 때까지 격일마다 N2 배지를 교환하였다. 로제트를 선택하기 위해서, 12웰 플레이트를 PBS에 1:3으로 희석된 폴리-L-오르니틴으로 실온에서 1시간 동안 코팅하였다. 1시간 후, 폴리-L-오르니틴 용액을 제거하고 폐기하였다. 웰을 PBS로 3x 세척하였다. 그 다음에 웰을 PBS에 1:100으로 희석된 라미닌으로 실온에서 1시간 동안 코팅하였다. 필요한 경우, N2 배지의 병을 표 2에 따라 제조하였다. 1시간 후, 라미닌을 제거하고 1 mL N2 배지를 각 웰에 추가하여 촉촉하게 유지하고 로제트의 해부를 위해 인큐베이터에 저장하였다. 대략 제10 일 내지 제12 일에 로제트가 이전에 평판배양된 EB로부터 형성된 것을 볼 수 있다. 해부현미경 하에서, 로제트를 해부하였다. 1 mL 주사기에 부착된 18 게이지 바늘을 사용하여 로제트를 추적함으로써 해부하였다. 혼합물을 p200 마이크로피펫을 사용하여 N2 배지 내 라미닌 코팅된 플레이트로 옮겼다. 옮긴 후, 혼합물을 밤새도록 인큐베이터에 저장하고 Ros1로 라벨링하였다. 배지를 인큐베이터에 저장하는 동안 격일마다 교환하였다. 제15 일 내지 제18 일에, 로제트를 단일 세포로 해리시켰다. Ros1을 단리시킨 후 (라운드 1) 2 내지 3일에, 가장 깨끗한 로제트를 단일 세포로 해리시켰다. N2 배지를 각각의 원하는 웰에서 빨아내고, EDTA 중의 0.5 mL 0.05% 트립신을 각 웰에 추가하였다. 혼합물을 90초 동안 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 90초 이후, 0.5 mL의 DTI를 추가하였다. 1000 μL 마이크로피펫을 사용하여, 로제트를 웰에서 해리시키고, 각 웰의 부피를 자체의 15 mL 원뿔형 튜브에 추가하였다. 각 웰, 또는 "클론"을 모든 계대배양에 걸쳐 분리하여 유지하였다. 원뿔형 튜브를 1000 RPM에서 5분 동안 스핀 다운하였다(spin down). 상층액을 추가하고 폐기하였다. 각 펠릿을 신선한 N2 배지 1 mL에 재현탁시켰다. 각각의 1 mL 현탁액을 폴리-L/라미닌 코팅된 12웰 플레이트의 자체의 웰에 평판배양하였고 플레이트를 (NSC 계대배양 0)으로 라벨링하였다. 플레이트를 인큐베이터에 되돌려놓고 배양물을 모니터링하고, 배지를 신선한 N2 배지로 격일마다 교환하였다. 세포가 약 85% 밀집도에 도달했을 때 각각의 "클론"을 상기와 동일하지만, 1 mL 0.05% 트립신 및 1 mL DTI가 들어있는 과정을 사용하여 6웰 플레이트의 자체의 웰로 옮겼고, 배지를 3 mL N2 배지로 격일마다 교환하였다. 세포를 유지하고 106 세포/웰의 비율로 계대배양을 계속하거나, 또는 세포의 냉동 보존 (하기 논의됨)에 착수하였다.
NSC의 냉동 보존
냉동 보존 배지, 또는 냉동 배지를 표 3에 따라 제조하여, 냉동 배지를 사용 전에 항상 4℃에 냉각시킨다. NSC 플레이트를 인큐베이터로부터 회수하여 생물 안전 작업대 내에 배치시켰다. 오래된 배양 배지를 빨아내고 폐기물 용기에 폐기하였다. 0.05% 트립신 1 mL를 각 웰에 추가하고 37℃에서 90초 동안 인큐베이션하였다. 90초 후, 1 mL DTI를 각 웰에 추가하여 트립신을 비활성화시켰다. 1000 μL 피펫 팁을 사용하여, 혼합물을 위아래로 피펫팅하여 세포를 각 웰의 표면에서 씻어낸 다음 혼합물을 15 mL 원뿔현 튜브로 옮겼다. 15 mL 원뿔형 튜브를 1000 RPM에서 3분 동안 스핀 다운시켰다. 원뿔형 튜브를 생물 안전 작업대로 되돌려놓고 상층액을 빨아냈다. 세포를 5 mL의 신선한 N2 배양 배지에 재현탁시키고 0.4% 트리판 블루 및 혈구 계산기를 사용하여 세포 계수를 수행하였다. 세포를 테이블 탑(table top) 원심분리기에서 1000 rpm에서 3분 동안 스핀 다운하였다. 세포 농도가 3.0x106 세포/mL이 되도록 적절한 부피의 4℃ 냉동 배지를 세포에 추가하였다. 냉동 배지 중의 세포 현탁액 1 mL을 10 mL 혈청학적 피펫을 사용하여 각 냉동바이알에 추가하였다. 냉동 프로브에대해 세포가 없는 냉동 배지의 하나의 바이알을 구성하였다. 바이알을 단단히 막고 사전 냉각된 제어 속도 냉동고-냉동 랙(rack)으로 즉시 옮겼다. 프로브를 냉동 배지만을 함유하는 바이알에 삽입하고 랙에 위치시켰다. 바이알을 제어 속도 냉동고에서 사전 냉각된 -80℃ 완전히 라벨링된 냉동상자로 옮긴 다음 LN2 저장으로 즉시 옮겼다.
마우스
모든 과정은 NIH의 실험 동물의 관리 및 사용에 관한 지침 및 AAALAC 인가된 기관인 UCI 및 UCLA의 실험 동물 윤리 위원회(Institutional Animal Care and Use Committees)에 의해 승인된 동물 연구 프로토콜에 따랐다. R6/2 마우스 및 그것들의 NT 한 배 새끼 (Transgene 비-담체 C57Bl6/CBA)를 UCI (라인 6494, ~120 ± 5 CAG 반복) 또는 UCLA (라인 2810,~150 ± 5 CAG 반복)에서 유지된 번식 콜로니로부터 얻었다. 동형접합성 Q140 마우스 또는 WT (C57Bl6) 한 배 새끼를 UCLA의 번식 콜로니로부터 얻었으며, 과정을 수행하였다. 모든 마우스를 12/12-hr 명/암 일정에 적응 시켰으며 음식 및 물에 자유롭게 접근이 가능하였다. 마우스를 혼합된 처리군으로 적응시키고 단지 단독으로 러닝 휠에 적응된 군으로 분류하였다. CAG 반복 길이를 R6/2 마우스에 대해 확인하였고 (Laragen, Los Angeles, CA), Q140 마우스 주파수 분포는 크게 상이하지 않았다 (Hickey et al., 2012b). 결과 차이의 평가는 이전의 실험 및 HD 모델에 대해 공개된 결과 (Hickey et al., 2005; Hockly et al., 2003)를 기반으로 하였고, 전력 분석 (G Power [psycho.uni-duesseldorf.de/abteilungen/aap/gpower3/])을 적용하면 적용자를 행동에 대해 최소 n = 10 및 생화학적 분석에 대해 n = 4로 이끌었다.
hNSC 단리
hNSC의 사용은 UCI, UCLA, 및 UC Davis의 인간 줄기 세포 연구 감독 위원회 (Human Stem Cell Research Oversight Committee: hSCRO)에 의해 승인되었으며 세포는 Biotime ESI-017 hESC로부터 유래되었다. hESC 콜로니를 노긴(Noggin)이 들어있는 EB 배지로 옮기고, NP 배지로 전이시키고, 로제트를 해부하고, 해리시키고, hNSC 배지로 평판배양되어 hNSC를 생성하였다 (도 8B). 로제트를 수동으로 해부하고 NSC 배지 내 성장 인자-감소된 마트리겔(Matrigel)-코팅된 플레이트에 평판배양한 다음 Accutase를 사용하여 해리시키고 NSC 배지가 들어있는 폴리오르니틴/라미닌-코팅된 플레이트에 평판배양하였다.
이식 수술
hNSC 또는 veh의 양쪽 선조체내 주사를 브레그마에 관하여 입체 장치 및 좌표를 사용하여 수행하였다: 전후 방향, 0.00; 중외측, ±2.00; 배복 방향, -3.25. 마우스를 마취시키고, 입체 프레임에 배치시키고, 5-μL 해밀턴 미량주사기(Hamilton microsyringe) (33-게이지) 및 주사 속도 0.5 μL/min을 사용하여 100,000개의 hNSC/측면 (2 μL/주사) 또는 veh (20 ng/mL 인간 표피 성장 인자 [STEMCELL Technologies, #78003] 및 인간 섬유아세포 성장 인자 [STEMCELL, #78006]가 들어있는 2 μL 행크 평형 염 용액(Hank's balanced salt solution))으로 주사하였다. 상처를 봉합하고 마우스를 가열 패드가 있는 케이지에서 회복시켰다. 수술 전날 면역억제제를 모든 마우스에 투여하였고 내내 계속하였다.
행동 평가
R6/2
마우스를 반-무작위 방식으로 할당하고 6 내지 9주에 행동 테스트를 수행하였다. 연구원은 테스트 및 데이터 수집에 대한 유전자형 및 치료에 대해 맹목적이었다. 실험자 가변성을 최소화하기 위해, 단일 조사자가 각 테스트를 실행하였다. R6/2 마우스에서 Ochaba et al. (2016)에 의해 이전에 기재된 바와 같이 행동 작업을 수행하였다.
Q140
발정 주기가 러닝 활성에 영향을 주기 때문에 수컷만 사용한 러닝 휠을 제외하고 수컷과 암컷을 사용하였다. 유전자형 또는 처리는 실험자에게 공지되지 않았다. 암 주기에 실시되는 러닝 휠을 제외한 모든 테스트를 명 주기 동안 실행하였다. Q140 마우스에서 Hickey et al. (2008)에 의해 이전에 기재된 바와 같이 행동 작업을 수행하였다.
R6/2 뇌 슬라이스(slice)에서의 전기생리학
R6/2 (라인 2810, 150 ± 10 CAG 반복) 및 NT 한 배 새끼를 사용하여, 행동 실험에 사용된 6494 라인과 유사한 표현형을 발현시켰다 (Cummings et al., 2012). 과정은 Andre et al. (2011)에 의해 기재된 바와 같으며 본원에서 상세히 설명된 바와 같이 변형되었다.
면역조직화학법 및 전자 현미경
5주 동안 hNSC로 이식된 수컷 R6/2 마우스 (n = 3)를 마취시키고 EM 고정액 (0.1 M 포스페이트 완충액 [pH 7.4] 중의 2.5% 글루타르알데하이드, 0.5% 파라포름알데하이드, 및 0.1% 피크르산)으로 관류시켰다. 뇌를 EM 고정액으로 4℃에서 밤새도록 수거하고 비브라톰(vibratome) (Leica Microsystems)을 사용하여 60 mm에서 hNSC를 함유하는 선조체를 통해 일련으로 절편될 때까지 (브레그마의 +1.4 내지 +0.14 mm와 동등함) PBS에서 세척하였다 (Franklin and Paxinos, 2007). 디아미노벤지딘 (DAB) (Sigma, St Louis, MO) 및 EM을 위해 가공된 hNSC 항체 (Stem121, 1:100; StemCells) 조직을 사용한 선조체의 사전 임베딩된(embed) IHC는 이전에 기재된 바와 같고 (Spinelli et al., 2014; Walker et al., 2012), 선조체 슬라이스를 ACLAR의 두 장의 시트 사이에 평평하게 60 ℃ 오븐에서 밤새도록 임베딩하여 수지를 폴리머화하였다. hNSC를 함유하는 영역을 임베딩된 슬라이스로부터 미세해부하였고 얇은 절편화를 위해 블록에 초강력 접착제를 사용하였다.
JEOL 1400 전자 전달 현미경 (JEOL, Peabody, MA)에서 DAB-라벨링된 구조 (즉, hNSC-라벨링된 세포, 수상돌기)의 사진을 촬영하였다. DAB 라벨링은 얇은 절편 조직의 첨단 기술에 제한되지 않으며, 단지 DAB 라벨링을 나타내는 영역을 촬영하였다.
R6/2 마우스에서 생화학적, 분자적, 및 면역조직학적 분석
마우스를 펜토바비탈 과다복용으로 안락사시키고 0.01 M PBS로 관류시켰다. 선조체 및 피질을 좌반구로부터 해부하였고 제조사의 과정을 사용하여 TRIzol (Life Technologies, Grand Island, NY)에서 단리된 RNA, 및 단백질에 대해 순간 냉동시키거나 하기 기재된 바와 같이 균질화하였다. 다른 절반을 4% 파라포름알데하이드에서 사후 고정하고, 30% 수크로스에서 동결방지시키고, IHC를 위해 슬라이딩(sliding) 비브라톰 상에서 40 μm로 절단하였다. 절편을 3회 헹구고 블로킹 완충액 (PBS, 0.02% Triton X-100, 5% 염소 혈청)에 1hr 배치하고, 1차 항체를 4℃에서 밤새도록 (ON) 블로킹 완충액에 배치하였다. 절편을 헹구고, Alexa Fluor 2차 항체에서 1 hr 동안 인큐베이션하고, Fluoromount G (Southern Biotechnology)를 사용하여 장착하였다. 1차 항체는 보충 실험 과정에서 나열된다.
가용성/불용성 분획화
선조체 조직을 이전에 기재된 바와 같이 가공하였다 (Ochaba et al., 2016). 항체: 항-HTT (Millipore, #MAB5492; RRID: AB_347723) 및 항-유비퀴틴 (Santa Cruz Biotechnology, #sc-8017; RRID: AB_628423). NIH 프로그램 ImageJ의 소프트웨어 및 농도계 적용을 사용하여 밴드의 정량화를 수행하였다.
공초점 현미경 및 정량화
절편을 람다-섬광 효과 방식(lambda-strobing)을 사용하는 Bio-Rad Radiance 2100 공초점 시스템을 이용하여 이미지화하였다. 이미지는 단일 공초점 z 슬라이스 또는 z 스택(stack)을 나타낸다. 모든 불편(unbiased) 입체논리적 평가를 StereoInvestigator 소프트웨어 (MicroBrightField, Williston, VT)를 사용하여 수행하였다. 광학적 분별기 프로브를 사용하여 평균 세포, 확산 응집체, 및 봉입체 수를 추정하였다.
RNA 단리 및 실시간 qPCR
선조체를 TRIzol (Invitrogen)에 이어서, RNEasy Mini 키트 (Qiagen)로 균질화하였다. RIN 값은 각 샘플에 대해 >9였다 (Agilent Bioanalyzer). RT는 SuperScript III First-Strand Synthesis System (Invitrogen)과 함께 올리고(dT) 프라이머 및 전체 RNA 1 mg을 사용하였다. qPCR을 Vashishtha et al. (2013)에 의해 기재된 바와 같이 수행하였다.
Q140 마우스에서 생화학적, 분자적, 면역조직학적 분석
Q140 수컷을 경추 탈구 (n = 7 냉동됨) 또는 파라포름알데하이드 관류 (n = 5 IHC)에 의한 처리 후 6개월에 안락사시켰다.
IHC
마우스를 0.1 M PBS 및 4% 파라포름알데하이드로 관류시켰다. 뇌를 제거하고, 4% 파라포름알데하이드에서 밤새도록 사후 고정하고, 30% 수크로스에서 동결방지시키고, 냉동시키고, 관상 절편을 크라이오스탯(cryostat) (Leica CM, 1850)에서 40 μm로 관상 절편하였다. 절편을 실온에서 1 hr 동안 블로킹한 다음 1차 항체를 밤새도록 사용하였다. 수회 세척한 후, 절편을 Alexa Fluor 2차 항체에서 인큐베이션하고 DAPI로 대비염색하였다. HTT 응집체 및 소교세포의 정량화를 위한 IHC를 각각 Menalled et al. (2003) 및 Watson et al. (2012)에 의해 기재된 바와 같이 수행하였다.
HTT -염색된 핵 및 응집체
절편을 StereoInvestigator 5.00 소프트웨어 (Microbrightfield, Colchester, VT)로 분석하였다 (Hickey et al., 2012a). 그려진 선조체의 윤곽에 대하여, 소프트웨어는 200 x 200 μm의 격자를 놓고, 20 x 20 μm의 계수 프레임을 절편 당 각 유형의 응집체의 정량화에 사용하였다.
Q140 마우스의 선조체에서 IBA -1-양성 세포의 정량화
소교세포 직경 반영 활성화에 대해 기재된 바와 같이 StereoInvestigator 소프트웨어 (MicroBrightField)를 이용하는 Leica DM-LB 현미경을 사용하여 분석을 실시하였다 (Watson et al., 2012). 5x 배율에서 그려진 선조체의 윤곽에 대하여, 소프트웨어는 200 x 200 μm의 격자를 놓고, 왼쪽 상단 모서리에서 20 x 20 μm의 계수 프레임은 불편 샘플링 및 정량화를 허용한다.
Q140 마우스에 대한 생화학적 분석
ELISA를 위해 냉동된 선조체 가공을 제조사의 지시에 따라 Biosensis BDNF Rapid 키트 (Biosensis BEK-2211, SA, Australia)를 사용하여 수행하였다.
통계 분석
상이한 부분집합의 것인 전기생리학 및 EM 데이터를 제외하고 R6/2 마우스에 대한 결과는 단일 코호트의 것이며; 모두 동일한 배치(batch)의 세포를 사용하였다. 연구 전에 분석을 사용하여 숫자가 충분한 검정력을 갖는지 결정하였다 (상기 기재됨). 통계적 유의성은 엄격한 분석을 사용하여 기재된 바와 같이 달성되었다. 모든 결과는 재현 가능하다. 다수의 통계적 방법이 도면 범례에서 상기 추가로 상세히 설명된다. 유의성 수준: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. R6/2 마우스에서, 데이터는 평균 ± SEM으로 표현되고; 행동 작업에 대한 통계 테스트는 일원 ANOVA에 이어서 사후 샤페, 본페로니, 및 홀름 다중 비교와 함께 터키 HSD 테스트를 사용하였다. 데이터는 사용된 통계 테스트의 추정을 충족하고, 0.05 미만의 p 값은 유의한 것으로 간주되었다. 모든 마우스를 무작위로 할당하고 작업을 유전자형 및 처리에 대해 맹목적인 개체로 무작위 방식으로 수행하였다. 농도계 결과의 통계 비교를 일원 ANOVA에 이어서 본페로니 다중 비교 테스트로 수행하였다. EM48 입체논리적 연구로부터 응집체 수 비교를 위해 스튜던트 t 테스트(Student's t test)를 사용하였다. 움켜쥐기에서 유의성을 피셔 정확 확률에 의해 결정하였다. 본페로니 사후 테스트와 함께 일원 ANOVA를 사용하여 행동 및 사후(postmortem) 데이터에서 유의한 차이 (p < 0.05)에 대하여 Q140 마우스에 대한 통계 분석을 GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, San Diego, CA)을 사용하여 실시하였다. 이원 ANOVA에 이어서 본페로니 사후 테스트를 러닝 휠/3 min 테스트에서 평균 회전을 나타내는 그래프에서 사용하였고; 사용자 지정 MATLAB 기능을 사용하는 부트스트랩(bootstrap) 통계를 IBA-1 분석에 사용하였다. 그래프 상에서 모든 오차 막대는 SEM을 나타낸다.
hNSC 단리. 매일 (D) 배양 단계는 다음과 같다. D1: ESC 콜로니를 콜라게나제 IV를 사용하여 효소를 이용하여 "느슨하게 하였다". 콜로니를 웰에서 수동으로 긁어내서, 저 부착 플레이트로 옮기고 EB 배지 (ESC 배지 마이너스 bFGF)에서 밤새도록 배양하였다. D2: EB 배양 배지를 500ng/ml 노긴 플러스 10μM SB431542로 보충하고 2일 더 배양하였다. D4: 배지를 교환하였다. D5: EB를 동일한 배지에서 성장 인자 감소된 마트리겔 코팅된 6웰 플레이트에 평판배양하였다. D6: 배지를 교환하고 NP 배지를 사용하여 NPC 분화를 구동시켰다. 배지를 12일까지 2일마다 교환하였다. D12-14: 로제트를 해부현미경 하에서 시각적으로 단리시키고, 18 게이지 바늘을 사용하여 수동으로 해부하고, NSC 배지에서 성장 인자 감소된 마트리겔 코팅된 6웰 플레이트에 평판배양하였다. 2-3일 후, 로제트를 아큐타제를 사용하여 해리시키고 NSC 배지 플러스 Y27632 화합물이 들어있는 폴리오르니틴/라미닌 코팅된 플레이트에 평판배양하였다. ESI-017 hNSC 세포유전학적 분석에서는 세포가 핵형적으로 안정하다는 것을 발견하였으며 이상이 관찰되지 않았고 CD271 (Brilliant Violet 510--BD Horizon cat# 563451), CD24 (Brilliant Violet 711--BD Horizon cat# 563401), Pax6 (PE--BD Pharmingen cat#561552), Nestin (Alexa Fluor 647--BD Pharmingen cat#560341), SOX1 (PerCP CY5.5-- BD Pharmingen cat# 561549), SOX2 (V450--BD Horizon cat#561610), CD44 (APC-H7-- BD Pharmingen cat#560532), CD184 (PE-CY7--Biolegend cat#306514) 또는 SSEA4 (lexa Fluor 700--Invitrogen cat#SSEA429)에 대해 단색 유동 세포 분석을 수행하였다.
이식 수술. 정위 방법(stereotaxic) 장치 및 브레그마에 대해 다음 좌표를 사용하여 hNSC 또는 비히클의 양쪽 선조체내 주사를 수행하였다: AP: 0.00 ML: +/- 2.00, 및 DV - 3.25. 마우스를 정위 방법 프레임에 배치하고 5 μl 해밀턴 미량 주사기 (33-게이지) 및 0.5 μl/min의 주사 속도를 사용하여 측면 당 100,000개의 hNSC (2 μl/주사) 또는 대조군 처리로서 비히클 (20 ng/ml hEGF 및 hFGF와 함께 2 μl HBSS)로 주사하였다. R6/2 마우스를 아이소플루란으로 마취시키고, Q140 마우스를 나트륨 펜토바비탈 (멸균 0.9% 식염수 중의 60 mg/kg 넴부탈, i.p.)로 마취시켰다. 모든 마우스에 대해; 마취의 수술면을 유지하기 위해 마우스에 노즈 콘(nose cone)을 통해 아이소플루란 (100% 산소 중에 1-2%, 0.5L/min)을 투여하였고, 산소를 수술 내내 투여하였고 전자적으로 제어되는 가열 패드 상에서 마우스의 15 온도를 유지하고 직장 프로브 온도계 (Physitemp)를 사용하여 모니터링하였다. 뇌 절편 내 바늘 관의 가시화에 의해 표적화된 영역으로의 주사의 정확한 배치를 모든 동물에 대해 확인하였다. 두개골에 골 왁스를 사용하여 상처를 봉합하고 피부 접착제(dermabond) 또는 봉합사를 이용하여 닫았다. 마우스를 수술 후 마취로부터 회복될 때까지 개개의 케이지 내의 가열 패드에 위치시켰다. 면역억제 CSA의 단일 1일 용량을 hNSC 및 비히클 이식된 R6/2 및 비-트랜스제닉 마우스에 수술 다음 날에 시작하여 10 mg/kg의 농도로 i.p. 투여하였다. 마우스를 추가로 면역억제하기 위해서 CD4 항체 (BioXcell, Lebanon, NH)의 i.p. 1주일 용량의 추가적인 양생법을 10 mg/kg으로 제공하였다. Q140 마우스 또는 Wt 한 배 새끼는 전체 연구 동안 CSA의 지속적인 전달을 확인하기 위해 매달 교환되는 피하 삼투 미니펌프 (Alzet#1004)에 의해 투여되는 CSA (2mg/kg/일)에 의해 면역억제를 받았다. 미니펌프를 제거하고 대체하기 위한 수술은 다음과 같다. 마우스를 아이소플루란 (마취의 유도를 위해 100% 산소 중에 3% 및 유지를 위해 1.75%)으로 마취시킨다. 절개 부위를 살균한 후, 등쪽의 작은 절개를 통해 미니펌프를 제거하고 절개를 봉합하기 전에 새로운 미니펌프를 이식하였다.
R6/2: 마우스를 반-무작위 방식으로 군으로 할당하였다. 하기 나열된 행동 테스트를 작업에 따라 6, 7, 8, 또는 9주령에 수행하였다. 마우스의 체중을 매일 측정하였고 처리로 유의한 차이를 관찰할 수 없었다. 연구원은 실험 테스트 및 데이터 수집 동안에 어떤 마우스가 hNSC 이식되었는지에 대해 맹목적이다. 실험자 가변성을 최소화하기 위해, 단일 조사자가 각각의 행동 테스트를 실행하였다. 마우스를 난소 이식 암컷 마우스 (Jackson labs)를 사용하여 번식 콜로니로부터 얻었다.
로타로드 장치를 사용하여 앞다리와 뒷다리 운동 협응 및 균형을 측정하였고 마우스를 300s 동안 가속화 검정을 사용하여 3일 연속 테스트하였다. 로타로드 테스트를 격주마다 6주령 및 8주령에 2회 수행하였다. 폴 테스트를 위해서 마우스를 머리가 아래를 향하도록 하여 폴에 배치한 다음 폴의 길이 아래로 머리가 먼저 내려오게 하였다. 배치 시작점으로부터 내려오는 것을 총 16회 측정하였다. 폴 테스트를 격주마다 7주령 및 9주령에 2회 수행하였다. IITC Life Science 기구를 사용하여 디지털 힘 변환기를 통해 앞다리 접지력을 측정하였고, 유닛은 1 그램 단위로 판독값을 제공한다. 접지력을 7주령 및 9주령에 격주마다 2회 측정하였다.
Q140: 클라이밍 테스트 및 폴 테스트. 클라이밍 동안에 운동 협응 및 자발적 활성을 평가하기 위해서, 마우스를 와이어 실린더(wire cylinder) 케이지의 바닥에 배치하고 자발적 활성을 녹화하였다. 폴 테스트를 위해 각각의 마우스를 폴의 상단에 얼굴을 위로 하여 배치하고 몸 전체를 아래 위치를 향하게 회전시키고 각각의 홈 케이지로 폴을 내려오도록 타이밍을 맞추었다.
R6/2 마우스의 전기생리학
간략히 말하면, 마우스를 마취시키고, 고 수크로스-기반 슬라이싱(slicing) 용액으로 경심관류로 관류시킨 다음 관상 슬라이스 (300 μm)를 ACSF를 함유하는 인큐베이션 챔버로 옮겼다. MSN 및 NSC를 차등 간섭 대비 광학을 이용한 적외선 조명을 사용하여 가시화하였다. 모든 기록을 주사 부위 또는 그 주위에서 수행하였다 (기록된 MSN은 150-200um 사이에서 이식에 인접하다). 세포 가시화를 위해 바이오시틴을 패치 피펫에 추가하였다. 자발적 시냅스 후 전류를 표준 ACSF에서 전체 세포 구성형태로 기록하였다. 막 전류를 갭이 없는 방식으로 기록하였다. 세포를 +10mV에서 전압 클램핑하였고 자발적 억제 시냅스 후 전류 (sIPSC)를 ACSF에서 기록하였다. 자발적 흥분 시냅스 후 전류 (sEPSC)를 -70 mV (베이스라인)에서 및 GABAA 수용체 블로커(blocker), 비쿠쿨린 메토브로마이드 (Tocris, Minneapolis, MN)의 존재 하에 ACSF에서 기록하여 글루타민 흥분 이벤트를 분리하였다. 자발적 시냅스 전류를 MiniAnalysis 소프트웨어 (버전 6.0, Synaptosoft, Fort Lee, NJ)을 사용하여 분석하였다. 기록 후, 슬라이스를 고정한 다음 IHC 가공할 때까지 4℃에서 30% 수크로스로 옮겼다. 바이오시틴-충전된 기록된 세포 및 hNSC를 확인하기 위해서, 고정된 슬라이스를 세척하고, 투과시키고 4 h 동안 블로킹한 후 이어서, SC121 (1:1000, StemCells, Inc.)와 함께 인큐베이션하였다. 세척 후, 슬라이스를 염소, 항마우스 Alexa-488 (1:1000, Life Technologies, Carlsbad, CA Catalog #:A-11001)과 함께 인큐베이션하고 스트렙타비딘을 Alexa-594 (1:1000, Life Technologies Catalog #: S11227)와 컨쥬게이션하였다. 슬라이스를 세척하고, 장착하고 세포를 Zeiss LSM510 공초점 현미경으로 가시화하였다.
R6/2 마우스에서 생화학적, 분자적 및 면역조직학적 분석
공초점 현미경 및 정량화. 절편을 람다-섬광 효과 방식을 사용하는 Bio-Rad Radiance 2100 공초점 시스템으로 이미지화하였다. 이미지는 단일 공초점 Z-슬라이스 또는 Z 스택을 나타낸다. 모든 불편 입체논리적 평가를 StereoInvestigator 소프트웨어 (MicroBrightField, Williston, VT)를 사용하여 수행하였다. 광학 분별기 프로브를 사용하여 평균 세포 수, 확산 응집체 수 및 봉입체 수를 추정하였다. 보호 구역을 측정된 두께의 3%로 설정하였으며 광학 해부기는 최소 14μm 높이를 갖는다. 윤곽 추적을 5x 대물렌즈로 실행하고 계수를 100x 대물렌즈로 수행하였다. 각 절편에 대해, 추적을 대략 줄기 세포 패치의 가장자리로부터 70μm 떨어져서 실행하였다. 계수를 선조체 전반에 걸쳐 6개의 절편에 대해 제3 절편 (40μm 관상 절편)마다 실행하였으며 Ku80 라벨링된 세포는 브레그마 0.5 mm 내지 브레그마 -0.34mm에서 볼 수 있다. 단 하나의 뇌 반구에서 50x50 μm 계수 프레임 및 250x250 μm 샘플 격자를 사용하여 모든 계수를 수행하였다. 각각의 마우스에 대한 CE 값은 0.03 내지 0.06의 범위에 있다. 절편을 먼저 니켈이 들어있는 ABC 키트 및 DAB 기질 키트 (Vector Laboratories)를 사용하여 Ku80에 대해 염색한 다음, M48에 대해서는 ABC 및 DAB 키트만을 사용하여 염색하였다. 절편을 비-줄기 세포 핵 염색을 위해 크레실 바이올렛으로 염색하였다. 동일한 입체논리적 파라미터를 사용하여 비히클로 이식된 마우스에서 응집체 및 세포를 계수하였다. 이식된 R6/2 뇌 절편에서 Ku80 양성 세포의 이러한 입체논리적 평가를 사용하여, ESI-017 NSC 이식 생존수는 수컷 마우스 (n=3)에서 평균 63,975개의 세포 및 암컷 마우스 (n=3)에서 18,673개의 세포를 나타내며, 초기 이식된 세포와 64% (수컷) 및 18.6% (암컨) 동등하다. 마우스 (n=6, 3마리 수컷 및 3마리 암컷)에서 전체적인 평균 41,323개 세포가 존재하며 초기 이식된 세포의 ~41%와 동등하다. 이식된 세포 수에서 암컷과 수컷의 차이는 5주에 더 작은 암컷을 이식하는 기술적 어려움 때문일 수 있다.
IHC에 사용된 1차 항체; GFAP (Abcam ab4674), NeuN (Millipore MAB377), SC121 (STEM 121 인간 특이적 세포질 마커, Clontech AB-121-U-050), Ku80 (Abcam, Cambridge, United Kingdom ab80592), Doublecortin (Millipore AB2253), Olig2 (R&D Systems AF2418), BIIItubulin (Abcam ab107216), MAP-2, (Abcam ab5392), BDNF (Icosagen, 329-100) 및 EM48 (Millipore MAB5374).
RNA 단리 및 실시간 정량적 PCR. 뇌 조직을 TRIzol (Invitrogen)에서 균질화하고, 총 RNA를 RNEasy Mini 키트 (QIAGEN)를 사용하여 단리시켰다. 잔류 DNA를 제거하기 위해 DNase 처리가 RNEasy 과정에 포함되어 있다. RIN 값은 각각의 샘플에 대하여 > 9였다 (Agilent Bioanalyzer). 올리고 (dT) 프라이머 및 전체 RNA 1 μg을 사용하여 SuperScript III First-Strand Synthesis System (Invitrogen)을 사용하여 역전사를 수행하였다. 정량적 PCR (qPCR)을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였고 (Vashishtha, Ng et al. 2013) ddCT 값을 정량화하고 RPLPO에 대해 분석하였다. R6/2-Htt 전이유전자를 증폭시키는데 사용된 프라이머는 다음과 같다: oIMR1594: 5'-CCCCTCAGGTTCTGCTTTTA-3', oIMR1596: 5'-TGGAAGGACTTGAGGGACTC-3'; RPLPO 정방향: 5'-TGGTCATCCAGCAGGTGTTCGA-3', RPLPO 역방향: 5'- ACAGACACTGGCAACATTGCGG-3'. 사용된 다른 프라이머는 Nestin, F 5'TCAAGATGTCCCTCAGCCTGGA3' R 5'AAGCTGAGGGAAGTCTTGGAGC3' BDNF F 5'TATGCGCCGAAGCAAGTCTCCA3' R 5'CATCCAAGGACAGAGGCAGGTA3' 및 DCX As 5'GTAAAGCCAACCCTGTGTCG3' S 5'TCCGCTCCAAAATCTGACTC3'이었다.
Q140 마우스에서 면역조직학적 분석
IHC에 대해 사용된 1차 항체: HNA (Millipore MAB1281), DCX (abcam ab18723), GFAP (Dako Z033401), 또는 시냅토파이신 (Millipore 04-1019). HTT 응집체의 정량화를 위한 IHC는 기재된 바와 같이 단클론성 항체 EM48 (Millipore MAB5374)을 사용하였고 (Menalled et al., 2003) 소교세포는 기재된 바와 같이 토끼 항-Iba-1 (Wako 019-19741)을 사용하였다 (Watson et al., 2012). 세포 수에 대하여, HNA+ 세포를 6개의 관상 절편에서 전체 선조체 면적에 대해 계수하였다. 2100개의 HNA-라벨링된 세포를 19회 정량화하였고 상기 세포의 일부는 신경 (DCX, Abcam ab18723) 또는 신경교 마커 (GFAP, Dako Z033401)로 이중-라벨링되었다. 최종 수는 군 당 평균 5마리의 마우스 ± SEM으로 표시된다.
ESI -017 hNSC는 R6/2 마우스에 이식될 때 행동을 변형시키고, 생존하고, 분화한다.
HD의 트랜스제닉 모델에서 hNSC 이식의 효능을 평가하기 위해서, 출원인은 엑손-1 HTT R6/2 마우스 (rv120 CAG 반복)를 사용하였으며 (Cummings et al., 2012), 이것은 빠르게 진행되는 운동 및 대사 결핍 및 조기 사망 (rv12-14주)을 나타내고 (Mangiarini et al., 1996), 전임상 연구에서 치료 패러다임의 초기 평가를 제공할 수 있다 (Hickey and Chesselet, 2003; Hockly et al., 2003). ESI-017 hNSC Improve Behavior
GMP-등급 hNSC 라인에 대한 제조 공정 및 품질 관리의 도표가 도 8A 및 8V에 기재되어 있다. 유동 세포 분석법은 hNSC 증식 및 만능성 마커에 대해 적절한 염색을 나타낸다 (도 8A). 면역세포화학에서 신경 외배엽 줄기 세포 마커 Nestin에 대한 염색을 확인하였다 (도 8C). ESI-017 hNSC를 냉동된 앨리쿼트로 획득하였고 (UC Davis), 해동시키고, 주입 전에 GMP 시설과 동일한 배지 시약을 사용하여 계대배양하지 않고 배양하였다. 5주령 마우스를 반구 당 100,000개의 hNSC의 선조체내 입체 전달에 의해 투여하였다. 수컷 (M) 및 암컷 (F) R6/2 및 비-트랜스제닉 (NT) 나이-일치된 한 배 새끼 및 비히클 대조군 (veh)을 포함시켰다 (n = 8 R6/2 hNSC M, 6 R6/2 hNSC F, 7 NT hNSC M, 7 NT hNSC F, 7 R6/2 veh M, 6 R6/2 veh F, 8 NT veh M, 및 6 NT veh F). 면역억제제를 모든 마우스에 투여하였다. 행동 분석을 수행하고 마우스를 행동 테스트 직후인 9주령에 안락사시켰다.
Veh-처리된 마우스는 이전에 기재된 바와 같이 HD-관련된 행동을 발달시켰다 (Mangiarini et al., 1996). 간략히 말하면, R6/2 마우스의 행동은 5주령에 NT 마우스와 구별할 수 없다. 8주까지, 신경학적 이상은 진행성 정형화된 뒷다리 그루밍(grooming) 동작, 움켜쥠, 및 불규칙한 걸음걸이를 포함한다. 꼬리가 들어올려질 때 정상 마우스는 뒷다리와 앞다리 둘 다를 벌리고, 마우스가 다리를 복부에 고정시킨 경우 "움켜쥔" 것으로 간주된다. R6/2 움켜쥠의 발생의 지연을 모든 hNSC-처리된 마우스에서 관찰하였고; veh 처리된 마우스는 이식 후 3주까지 움켜쥐었다. hNSC 처리된 마우스는 이 시점에서 움켜쥐지 않았고, 안락사시 (이식 후 4주) 단지 50%의 hNSC-처리된 마우스에서만 움켜쥐었다 (도 9). 2회의 보행 검정을 수행하였다. 로타로드는 가속 회전 막대 상에서 걷는 능력을 테스트한다. hNSC-처리된 R6/2 마우스는
로타로드 성능에서 veh-처리된 R6/2 마우스보다 통계적으로 유의한 개선을 나타냈다 (이식 후 1주에 30% 개선, p < 0.01; 및 이식 후 3주에 19%, p < 0.05) (도 1A). 폴 테스트는 수직 빔에서 내려오는 동안의 시간을 비교하였다; R6/2 마우스는 NT 마우스와 비교하여 내려오는데 더 긴 대기 시간을 갖는다. R6/2 처리군 사이에서 통계적으로 유의한 (p = 0.02) 개선을 이식 후 4주에 관찰하였다 (25% 개선, 도 1B). 악력 단위를 또한 신경근 기능 및 운동 협응을 평가하는데 사용하였고, hNSC 처리는 이식 후 4주에 유의한 개선을 생산하였다 (p = 0.02, 16% 개선, 도 1C).
ESI -017 hNSC 생존, 이동, 및 분화
마우스를 이식 후 4주에 안락사시키고 뇌를 수거하였으며, 그 절반은 조직학을 위해 사후 고정하였고 절반은 생화학을 위해 순간 냉동시켰다. hNSC는 주로 바늘 자국 주위에서 클러스터를 형성하고 선조체 내에 남아있다 (도 1D); 일부는 피질 내에 있고 몇몇은 피질 영역과 선조체 영역 사이의 미세환경(niche) (뇌량/백질 신경로)으로 이동하였다 (도 10). 인간 마커 SC121 (세포질) 또는 Ku80 (핵)을 사용하여, 세포를 주로 조기 신경 마커 더블코르틴 (DCX) (SC121, 도 2A 노란색으로 병합됨; Ku80, 도 2B 및 2C)로 염색하였다. 일부 세포는 잠재적으로 성상 표현형 (신경교 섬유질 산성 단백질 [glial fibrillary acidic protein: GFAP])로 분화된다 (도 2B). 또한 잠재적으로 마우스 신경교 세포 흉터를 나타내는 이식 부위 주위에 비-인간 GFAP 양성 면역염색이 존재한다 (도 2A 및 2B). 뉴런 제한된 전구물질로의 hNSC의 분화를 βIII-튜불린 (도 2D 및 10B) 및 미소관-관련된 단백질 2 (MAP-2)로 확인하였지만 (도 2E 및 10C), NeuN와의 공존의 부족 (도 2F)은 유사분열 후 뉴런이 없다는 것을 시사한다. 한 반구에서 Ku80-양성 세포의 입체논리적 평가를 사용하여, hNSC 이식 생존 수는 평균 41,323개의 세포 (n = 6, 3마리 수컷 및 3마리 암컷)를 나타냈으며, 초기 이식된 100,000개 중 약 41%와 동등하다.
ESI -017 hNSC의 이식이 R6/2 마우스에서 피질선조체 과잉민감성을 방지한다
그 다음에 출원인은 전기생리학적 활성을 평가하였다. 수컷 및 암컷 마우스에서 5주에 선조체에 100,000개의 hNSC (n = 18) 또는 veh (n = 16)를 이식하였다. 출원인은 급성 뇌 슬라이스에서 이식 후 4-6주에 hNSC로부터 기록하였다 (도 3A 및 3B). hNSC는 미성숙 세포의 기본적인 신경 성질 특성, 숙주 MSN보다 훨씬 더 작은 막 용량 (hNSC 22.0 ± 1.8 pF, n = 31 대 MSN 71.3 ± 3.5 pF, n = 44; p < 0.001, 스튜던트 t 테스트) 및 훨씬 더 높은 막 입력 저항 (hNSC 2804.8 ± 203.0 MU 대 MSN 163.8 ± 15.1 MU; p < 0.001, 스튜던트 t 테스트)을 나타낸다. hNSC는 자발적 흥분 및 억제 시냅스 후 전류 (sEPSC 및 sIPSC)를 나타내며, 그것들은 숙주 조직 또는 다른 이식된 hNSC로부터 시냅스 입력을 받았다는 것을 나타낸다. 하지만, MSN과 비교하여, 주파수는 훨씬 더 낮았다. 일부 hNSC는 또한 자발적으로 활동 전위를 생성하였으며, 그것들은 숙주 뉴런 및 이웃의 hNSC에 영향을 미칠 수 있다는 것을 시사한다 (도 3B).
전기생리학적 변화는 NT 마우스와 비교하여 증상성 R6/2의 MSN에서 발생하며, 고유한 막 성질의 변화 및 감소된 흥분 시냅스 활성을 포함한다 (Cepeda et al., 2003, 2007). hNSC 이식은 R6/2 마우스에서 MSN의 막 성질, 평균 sEPSC 주파수 (1.1 ± 0.1 Hz 대 1.4 ± 0.2 Hz) 또는 평균 SIPSC 주파수를 크게 변화시키지 않았다. R6/2 마우스는 또한 외피 각추 세포 흥분성 및 간질성 방전 및 발작을 일으키는 경향의 증가를 나타낸다 (Cummings et al., 2009). 외피 과다흥분성은 대진폭 EPSC 및 고주파 파열의 발생에 의해 선조체 MSN에서 나타나며, 특히 sEPSC의 주파수 증가와 일치하는 GABAA 수용체의 확장된 폐쇄 이후 분명하다 (Cepeda et al., 2003; Cummings et al., 2009). 유사한 비율 (통계적으로 유의한 것은 아님)의 MSN이 veh 마우스 (28.6%, 16/56)와 비교하여 hNSC-이식된 마우스 (20.5%, 9/44)에서 증가된 피질선조체 흥분성을 나타냈다. 하지만, 이 집단 내에서 sEPSC 주파수의 증가는 hNSC로 이식된 R6/2 마우스에서는 일어나지 않았다. 이벤트 간 구간 플롯의 누적 확률 분포의 우향 이동이 일어났으며 (p < 0.001), hNSC가 GABAA 수용체가 차단될 때 피질에서 선조체로의 과다흥분성 입력을 감소시킬 수 있다는 것을 나타낸다 (도 3E 및 3F).
R6/2 마우스에서 숙주 조직은 이식된 ESI -017 hNSC와 잠재적으로 시냅스 접촉된다
출원인은 면역조직화학법 (IHC) 및 전자 현미경 (EM)을 이용하여 숙주의 신경 말단이 hNSC와 시냅스 접촉되는지를 검사하였다. 출원인은 이식되고 면역라벨링된 hNSC와 잠재적으로 대칭으로 시냅스 접촉된 숙주로부터 기원한 라벨링되지 않은 신경 말단의 예를 발견하였다 (도 4A). 신경 말단 내에서 몇몇 시냅스 소포는 시냅스 전 막에 매우 가까우며, 소포 방출의 잠재적인 영역을 나타낸다 (hNSC의 DAB 라벨링은 애매한 접촉이다). 이에 더하여, 출원인은 분명하게 비대칭 접촉된 숙주로부터 기원하는 라벨링되지 않은 신경 말단을 발견하였으며 (도 4B), 흥분 시냅스 접촉을 시사한다. 전체적으로, 출원인은 숙주로부터 유래된 라벨링되지 않은 신경 말단의 44.5% (n = 71)가 비대칭 접촉되지만 48.3% (n = 69)가 라벨링된 hNSC와 대칭 접촉된다는 것을 발견하였다. 숙주로부터 기원된 라벨링되지 않은 신경 말단의 나머지 7.2% (n = 11)는 라벨링된 hNSC에 병치되고, 그 접촉의 정확한 성질을 결정할 수 없었다 (비대칭 대 대칭).
ESI -017 hNSC는 Q140 넉인 마우스에서 행동, 생존, 및 분화를 구제한다.
그 다음에 출원인은 hNSC가 또한 느리게 진행되는 전장 HD 마우스 모델에서 결핍을 개선할 수 있는지를 결정하였다. Q140 마우스는 마우스 헌팅틴 유전자에 삽입된 140개의 반복 부위를 가진 변형된 마우스/인간 엑손 1을 발현한다 (Menalled et al., 2003). 동형접합성 마우스는 운동 테스트에서 1.5개월령에 클라이밍 결핍, 인지 결함 (Hickey et al., 2008; Simmons et al., 2009) 및 대략 4개월에 HTT의 가시적 응집체 (Menalled et al., 2003)로 조기 이상을 나타냈다. 선조체 위축증이 1년에 검출되며 35% 선조체 세포가 22개월에 손실된다 (Hickey et al., 2008). 군 당 24마리의 2개월령 동형접합성 수컷 및 암컷 마우스에 반구 당 100,000개의 hNSC를 주입하고, 입체적으로 선조체에 양쪽으로 전달하였으며, 대조군 나이-일치된 Q140 (n = 12/성별) 및 veh로 주사된 야생형 (WT) (n = 12/성별) 마우스였다. 모든 마우스를 면역억제시켰다. 행동 테스트를 1.5개월령에 (세포 이식 전) 시작하였고 마우스를 8개월, 이식 후 6개월에 안락사시켰다. 발정 주기가 러닝 활성에 영향을 미치기 때문에 수컷만이 사용된 러닝 휠을 제외하고 모든 마우스에서 행동 테스트를 수행하였다 (Hickey et al., 2008). 개방 필드에서 보행 활성의 조기 결핍, 뿐만 아니라 클라이밍 케이지 테스트에서 자발적 운동 활성의 감소를 Q140 마우스에서 관찰하였지만; hNSC 처리는 성능을 구제하지는 않았다 (도 11).
폴 테스트에서 veh-처리된 Q140 마우스는 WT 대조군 (p = 0.004)과 비교하여 회전하는데 더 오래 걸렸고; 그에 반해, hNSC 처리된 Q140 마우스는 대조군 Q140 마우스 (p = 0.04)보다 훨씬 더 양호했고 더 이상 WT와 크게 상이하지 않았으며, 이식 후 3개월에 유익한 효과를 나타낸다 (도 5A). Hickey et al. (2008)에 의해 보고된 바와 같이, 5.5개월령 수컷 Q140 마우스는 러닝 속도에서 엄청난 결핍을 나타냈으며 (3분 당 회전 수), 2주 동안 유의했다 (도 5B). 러닝 휠 결핍의 지속적인 개선을 hNSC-처리된 Q140 마우스로의 처리 후에 관찰하였으며, veh-처리된 마우스와 비교하여 평균 러닝 휠 활성의 점진적인 증가를 나타낸다 (도 5B 및 5C). 출원인은 hNSC 투여가 Q140 마우스에서 관찰된 운동 결핍 중 일부를 개선한다고 결론을 내렸다.
새로운 물체 인식 (NOR)은 학습 및 기억 둘 다를 필요로 하고 (인식) 유사한 것보다 새로운 물체를 조사하는 마우스의 성향의 이점을 취하는 피질-의존적 인지 테스트이다. Veh-주사된 Q140 마우스는 Simmons et al. (2009)에 의해 보고된 바와 같이 이식 후 3개월 및 5개월에 veh-주사된 WT 마우스와 비교하여 NOR에서 상당한 장애를 나타냈다 (각각 p = 0.003 및 p = 0.03). Q140 마우스에서 hNSC의 선조체 이식은 이식 후 5개월에 인지 장애를 구제하지만 (p = 0.03), 조기에는 그렇지 않다 (도 5E 및 5F).
veh- 및 hNSC-이식된 Q140 수컷 마우스의 부분집합 (각 군에 대해 n = 5)을 IHC 분석을 위한 처리 후 6개월에 안락사시켰다. 인간 핵-특이적 항체 (HNA)로 식별되는 hNSC는 이식 후 6개월에 선조체에 존재하였고 대부분 주사 영역에 국한되었다 (도 5Ga,b). 6개의 관상 절편에서 전체 선조체 면적에 걸쳐 계수된 HNA-양성 세포 및 DCX 또는 GFAP로 이중-라벨링된 세포의 수를 계산하였다 (군 당 5마리의 마우스로부터의 평균 데이터 ± SEM). 100,000개의 hNSC 중 대략 25%가 생존했으며 대부분 (84% ± 2%)은 GFAP 양성이고 (도 5Gb,c), 더 작은 비율 (16% ± 2%)이 DCX 양성이다 (도 5Ge,f).
ESI -017 hNSC 이식은 HD 마우스에서 BDNF 수준을 증가시킨다
신경 영양 성장 인자의 증가된 수준 및 후속적으로 증가된 시냅스 연결성은 NSC의 이식 후 관찰된 행동 개선에 원인이 있다 (Blurton-Jones et al., 2009). 게다가, 감소된 BDNF는 HD의 다수의 마우스 모델 및 인간 HD 뇌에 대해 입증되었다 (Zuccato et al., 2011). 그러므로, 발명자들은 신경 영양 효과에 대한 마커로서 BDNF 수준을 평가하였다. R6/2 hNSC 마우스에서, IHC 및 공초점 현미경은 DCX-양성 hNSC와 BDNF의 공존을 나타내며, 분화된 세포가 BDNF를 생산한다는 것을 시사한다 (도 6A). 실제로, 시험관 내에서 키워진 hNSC 및 분화된 hNSC는 DCX 양성이 된 이후에만 BDNF를 생산한다. Q140 hNSC 마우스에서, BDNF를 수컷 마우스의 부분집합 (n = 6/군)에서 ELISA에 의해 정량화하였다. 선조체 BDNF는 WT와 비교하여 Q140 마우스에서 감소하였지만, BDNF 수준의 상당한 증가를 veh와 비교하여 hNSC-처리된 것에서 관찰하였으며, 그것을 WT 수준까지 회복시켰다 (도 6C).
신경 영양 신호 전달이 시냅스 활성을 향상시킬 수 있다는 것을 고려하여, 발명자들은 모든 관류된 Q140 동물 (n = 5/군)의 선조체에서 이전에 기재된 마이크로어레이 스캐너를 사용한 IHC 및 정량화에 의해 시냅스 마커인 시냅토파이신의 수준을 검사하였다 (Richter et al., 2017). veh-처리된 Q140 마우스와 hNSC-처리된 Q140 마우스의 비교는 hNSC 마우스에서 시냅토파이신의 큰 증가를 나타냈다 (도 13A, 도 13B에서 정량화됨).
이들 결과는 이식된 hNSC가 BDNF를 포함하는, 증가된 신경 영양 효과에 의해 시냅스 연결성을 부분적으로 개선할 수 잇다는 것을 시사한다.
Q140 마우스에서 ESI -017 hNSC 처리는 소교세포 활성화를 감소시켰다
Q140 마우스 (n = 5/군)의 선조체 절편을 휴면 소교세포 및 반응 소교세포 둘 다를 식별하는 이온화된 칼슘-결합 어댑터 분자 1 (Iba-1) 항체로 염색하였다. 소교세포의 체세포 크기는 활성화 상태 세포 형태학과 연관성이 있고 (Watson et al., 2012) Iba1-양성 세포의 직경의 상당한 증가 (강력한 소교세포 반응)를 Q140 마우스의 선조체에서 관찰하였다. 이 반응은 hNSC에 의해 크게 감소되었다 (도 6D). hNSC-이식된 R6/2 마우스에서의 유사한 분석은 선조체에서 유의한 변화를 나타내지 않았고 (도 13) 상대적으로 국소화된 효과 또는 중간 수준의 활성화된 소교세포 때문일 수도 있다.
ESI -017 hNSC 이식은 mHTT 축적 및 응집체를 감소시킨다
HD 병리학의 홀마크(hallmark)는 변화된 단백질 항상성을 반영할 수 있는 HTT 봉입체의 존재이다. 그러므로, 발명자들은 R6/2 및 Q140 마우스의 뇌 절편에서 불편 입체논리적 평가를 수행하였다. R6/2 마우스에 대해, 절편을 먼저 Ku80에 대해 니켈-향상된 DAB (검은색)로 염색한 다음, HTT (EM48)에 대해 니켈이 없는 DAB를 사용하여 염색한 다음, 비-hNSC 핵 염색을 위해 크레실 바이올렛으로 대비염색하였다. 도 7A는 hNSC 이식물에 인접하게 입체학이 수행된 영역을 나타낸다; 이식물로부터 떨어진 영역은 돌연변이 HTT (mHTT) 축적 또는 응집체에서 유의한 차이를 나타내지 않았다. 결과는 hNSC로 이식된 R6/2 마우스가 veh와 비교하여 주사 부위 근처에서 확산 염색을 감소시키고 봉입체 수를 감소시킨다는 것을 나타낸다 (도 7A 및 7B).
응집체 수의 분명한 감소를 또한 Q140 마우스의 선조체에서 관찰하였다 (도 7C). 처리 후 6개월에, hNSC-처리된 Q140 마우스는 veh 처리된 마우스와 비교하여 확산 염색된 핵을 거의 갖지 않았고 (p = 0.0102) 신경망 응집체를 거의 갖지 않았지만 (p = 0.0239), 핵 봉입체 및 미세응집체의 감소를 나타내지 않았다 (각각 p = 0.0753 및 p = 0.372) (도 7D). 이 결과는 hNSC 전달이 HD-관련된 병리학을 조절한다는 것을 시사한다. R6/2 (도 10D) 또는 Q140 마우스에서 이식된 세포 또는 그 근처에서 봉입체의 획득이 관찰되지 않았다.
hNSC 이식은 mHTT 및 유비퀴틴화된 단백질의 병원체 축적을 감소시킨다
그 다음에 출원인은 R6/2 뇌에 축적되는 고분자량 (HMW) mHTT 종 및 유비퀴틴 변형된 단백질에 대한 hNSC 처리의 영향을 검사하였다. 이들 불용성 단백질의 감소는 R6/2 마우스에서 개선된 행동 결과에 상응한다 (Ochaba et al., 2016). hNSC 이식되고 이식되지 않은 NT 및 R6/2 선조체의 세제-불용성 분획의 평가는 veh-처리된 마우스와 비교하여 R6/2 선조체에서 축적된 mHTT 수준이 크게 증가하였고, R6/2 선조체에서 hNSC로의 처리가 불용성 HTT 축적을 약 70%만큼 감소시켰다는 것을 나타내며 (도 7E 및 7F), 이는 변화된 mHTT 전이유전자 mRNA 발현 때문이 아니었다 (도 14). 축적된 유비퀴틴-컨쥬게이션된 단백질은 또한 NT 마우스와 비교하여 R6/2 선조체에서 크게 증가하였고 hNSC 처리는 veh-처리된 마우스와 비교하여 R6/2 마우스 선조체에서 불용성 유비퀴틴-컨쥬게이션된 단백질을 감소시켰다 (도 7E 및 7F). 처리된 NT 마우스에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다.
CCT/TRiC (TCP1-고리 복합체) 샤페로닌은 새롭게 번역된 폴리펩타이드에 결합하고 이것을 폴딩시키는 올리고머 샤페론이다. CCT/TRiC 발현은 다수의 HD 모델 시스템에서 절단된 mHTT 응집을 방지한다 (Tam, S., et al., The chaperonin TRiC controls polyglutamine aggregation and toxicity through subunit-specific interactions. Nature Cell Biol, 2006. 8(10): p. 1155-1162). 한 서브유닛 CCT1의 과발현은 시험관 내 및 세포에서 응집을 억제하기에 충분하고, mHTT-매개된 세포 독성을 감소시킨다 (Tam, S., et al., The chaperonin TRiC blocks a huntingtin sequence element that promotes the conformational switch to aggregation. 2009. 16(12): p. 1279-1285). 두드러지게, 효모 CCT1의 20 kDa 정점 도메인 (ApiCCT1)은 시험관 내에서 재조합 mHTT의 응집을 억제하기에 충분하다. 출원인의 데이터는 재조합 ApiCCT1, ApiCCT1r이 세포에서 HD 표현형을 감소시킬 수 있고 (Sontag, E.M., et al., Exogenous delivery of chaperonin subunit fragment ApiCCT1 modulates mutant Huntingtin cellular phenotypes. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013. 110(8): p. 3077-82) HD 마우스 1차 뉴런의 동시-배양에서 BDNF 이동 결핍을 구제할 수 있다는 것을 나타낸다 (Zhao, X., et al., TRiC subunits enhance BDNF axonal transport and rescue striatal atrophy in Huntington's disease. Proc Natl Acad Sci U S A, 2016). 중요하게는, 이 외인성으로 적용된 ApiCCT1r이 배양된 세포 및 1차 뉴런의 시토졸에 흡수되어 효과를 발휘하며 (Sontag et al, Zhao et al), 단백질을 질환 조직에 전달할 수 있는 경우, ApiCCT1이 세포에 의해 흡수되고 유익한 효과를 나타낼 수 있다는 것을 시사한다. R6/1 선조체로의 ApiCCT1의 단일 직접 주사는 2주 후에도 검출되었고 고분자량 및 응집된 HTT의 수준을 감소시켰다. 더 최근의 예비 데이터에서, sApiCCT1의 바이러스-매개된 전달 또는 마우스 NSC 분비 ApiCCT1의 전달은 HD 마우스에서 생체 내에서 개선을 제공한다. 이들 데이터는 ApiCCT1의 지속적인 전달이 신경보호성일 수 있다는 것을 시사한다.
ApiCCT1의 바이러스- 매개된 전달은 생체 내에서 효율적이다.
생체 내에서 지속적인 sApiCCT1 전달을 평가하기 위해서, R6/1 마우스에서 mHTT 축적에 대한 효과에 대한 소규모 예비 연구에서 sApiCCT1의 AAV2/1-매개된 전달을 테스트하였으며, ~115 반복부위를 가진 인간 mHTT의 엑손 1을 발현하고 R6/2 [24] (도 15A의 작제물)보다 더 느린 질환 진행의 과정을 나타낸다. R6/2 마우스에서 표현형의 빠른 시작 및 AAV2/1이 충분한 발현에 도달하기 위한 2-3주 때문에, 질환 진행에서 조기에 바이러스의 전달은 병리학적 표현형의 최대 수정을 달성하기에 필수적일 수 있다. 그러므로 R6/1 마우스로의 양쪽 선조체내 주사 (sApiCCT1 또는 mCherry 대조군을 발현하는 AAV2/1의 12x109 게놈 카피)를 5주령에 수행하였고 17주령에 조직을 수확하였다. sApiCCT1로 주사된 동물은 올리고머 mHTT에서 대략 40%의 감소를 나타냈다 (도 15B&C). 입체학에 의한 분석은 또한 가시적인 봉입체의 대략 40% 감소를 나타냈지만 (도 15E), 이 효과는 아마도 동력 부족의 샘플 크기로 인해 통계적으로 유의하지 않았다. 이들 동물은 16주령에 움켜쥐기 행동의 상당한 개선을 나타냈고; 이 검정은 운동 장애의 지표이다 (데이터 미도시). 연구를 더 큰 샘플 크기 (~20 각각의 조건)로 반복하였다. AAV2/1-sApiCCT1로 주사된 동물은 10, 12, 및 14주에 운동 협응 및 균형을 측정하는 로타로드 작업의 상당한 개선을 나타냈다 (도 15F; 10 및 12주 데이터 미도시). 이들 동물은 또한 움켜쥐기 행동에서 개선을 나타냈으며, 이전 연구와 일치한다 (데이터 미도시). 종합해보면, 이들 연구는 지속적인 sApiCCT1의 전달이 HD 마우스에서 행동 결과를 개선하고 mHTT 병리학을 감소시키기에 충분하다는 것을 시사한다.
바이러스-형질도입된 hNSC는 Htt14A2 .6 PC12 세포에 들어가서 올리고머 mHTT 종에 영향을 미치는 분비된 ApiCCT1을 생산한다.
출원인은 형질도입에 대한 적절한 역가를 결정하고 ApiCCT 생산, 뿐만 아니라 돌연변이 HTT 응집에 대한 효과를 검사하기 위해 소규모 예비 연구를 수행하여 ESI-017 hNSC의 sApiCCT 렌티바이러스 형질도입을 테스트하였다. 간략히 말하면, ESI-017 hNSC를 6웰 플레이트에서 배양한 다음 0, 5, 10 및 15의 감염 다중도 (Multiplicity of Infection: MOI)로 sApiCCT 렌티바이러스로 형질도입하였다. 세포를 48시간 동안 배양하였고, 배지를 수거하고 단백질 분석을 위해 세포를 수확하였다. 도 16A는 HA 태그된 ApiCCT의 웨스턴 분석을 나타내고 형질도입된 ESI-017 hNSC가 ApiCCT를 생산하고 있고 바이러스 MOI가 증가함에 따라 상기 생산이 증가한다는 것을 나타낸다. 형질도입된 hNSC로부터 수거된 배지를 형질도입되고 분비된 ApiCCT가 이전에 기재된 바와 같이 이웃의 세포에 들어갈 수 있는지를 결정하기 위해 Htt14A2.6 PC12 세포 배지에 추가하였다 (Sontag PNAS, 2013). 유도인자, 폰아스테론의 존재시, 이들 세포는 48시간 내에 C 말단에서 증강 녹색 형광 단백질 (GFP)에 융합된, 절단된 형태의 확장된 반복 HTT 엑손 1 단백질 (103Qs)을 발현한다. 조건 배지의 유도 및 적용 후 48시간에, 세포를 세척하고, 수확하고 웨스턴 블롯을 수행하였다. 결과는 처리된 14A2.6 세포로부터의 세포 용해물이 ApiCCT이기에 적절한 분자량의 HA 태그된 단백질을 함유한다는 것을 나타낸다 (도 16B). ApiCCT의 조건 배지 전달이 특이적 돌연변이 헌팅틴 (mHTT) 응집 종에 대한 효과를 나타내는지를 평가하기 위해서, 출원인은 모노머, 가용성 HTT 단편의 수준이 변화되었는지를 먼저 평가하였다. 동일한 실험으로부터의 HTT 모노머 수준을 GFP에 대한 항체를 사용하여 웨스턴 분석에 의해 검사하였다 (도 16C). ApiCCT1은 mHTT의 모노머 수준의 발현을 변화시키지 않는 것으로 나타났으며, ApiCCT가 모노머 돌연변이 HTT (mHTT)의 정상 상태 수준을 변화시키지 않고 유도된 mHTT의 유전자 발현에 영향을 미치지 않는 것으로 보인다는 것을 시사한다. 불용성 HTT 응집체 및 mHTT 올리고머는 HD의 홀마크이다. 특히, 올리고머 mHTT 종은 영향을 받은 뉴런에서 독성의 공급원을 나타낼 수 있다. 그러므로, 출원인은 정제된 ApiCCT1 단백질의 직접적인 전달로 이전에 입증된 바와 같이 ApiCCT1의 전달이 이들 형태의 축적에 영향을 미치는지를 결정하기 위해 mHTT 올리고머를 측정하였다. SDS 아가로스 겔 전기영동 (AGE)을 사용하여 올리고머 종을 해결하였는데, 이 접근법이 mHTT의 가용성 미소섬유 올리고머를 우선적으로 해결하는 것으로 보이기 때문이다. 세포 용해물로부터의 동등한 양의 단백질을 SDS-AGE 겔에 로딩하였다. 농도계 측정값을 얻기 위해 ImageJ를 사용하여, ApiCCT1은 가장 높은 MOI에서만 mHTT 올리고머의 수준의 감소를 유발했다 (>10%) (도 16D). 하지만, 얼룩 길이는 MOI 10 및 15 둘 다에서 감소하였다. 이들 데이터는 hNSC로부터의 ApiCCT1 분비가 이웃의 세포에서 올리고머 mHTT의 형성을 감소시킬 수 있다는 것을 나타내며, 정제된 ApiCCT1에 대해 발표된 발명자들의 결과를 재현하였다. 이들 결과는 hNSC의 렌티바이러스 형질도입의 GMP 생산에 이용되는 방법을 검증하고 hNSC 전달의 가능성을 확립한다.
바이러스-형질도입된 hNSC는 마우스로 이식된 후 분비된 ApiCCT1을 생산한다
상기 기재된 바와 같이 ESI-017 hNSC를 UCI에서 배양하였다. hNSC를 MOI 15에서 48 hr 동안 렌티바이러스로 형질도입시킨 다음 상기 기재된 바와 같이 5주령 마우스로 이식하였다. 수컷 및 암컷 R6/2 및 비-트랜스제닉 나이-일치된 한 배 새끼 및 비히클 대조군이 포함되었다. 면역억제제를 모든 마우스에 투여하였다. 마우스를 9주령에 안락사시키고 뇌를 수거하였으며, 그 중 절반을 조직학을 위해 사후 고정하였고 절반은 생화학을 위해 순간 냉동하였다. hNSC-ApiCCT 이식된 세포는 hNSC에 대해 기재된 바와 유사한 IHC를 나타냈다 (도 17). 인간 핵 항원 마커 (HNA)를 사용하여, 세포는 주로 조기 신경 마커 더블코르틴 (DCX, 파란색)로 염색되었다 (도 17A 분홍색으로 병합됨). 일부 세포는 HA 태그된 ApiCCT를 발현한다 (도 17B).
논의
줄기 세포-기반 이식 전략은 재생 및 회복 메커니즘을 통해 병리학을 조절할 수 있는 능력에 기초한 신경변성 장애에 대한 유망한 접근법이다. HD 모델에서, 마우스-유래된 NSC는 유망한 결과를 나타내었지만 hNSC-기반 접근법은 엇갈린 성공을 거두었으며, 유전학 HD 마우스에서 독소 모델 및 제한된 신경 보호에서 강력한 효능을 나타냈다 (El-Akabawy et al., 2012; Golas and Sander, 2016). 본원에서 발명자들은 mHTT 단백질의 축적을 표적으로 하는 결핍 및 질병 변경 활성의 강력한 구제를 제공하는 GMP-등급 hNSC의 이식을 기재한다. ESI-017 hNSC는 R6/2 마우스에서 전기생리학적으로 활성이었지만 선조체 MSN 막 성질 또는 자발적 시냅스 활성에 대해서는 유의한 효과를 나타내지 않았다. 하지만, MSN의 부분집합에서, 비쿠쿨린으로 GABAA 수용체의 확장된 차단 이후 일반적으로 관찰된 sEPSC의 주파수의 증가가 일어나지 않았으며, 이식이 피질 과다흥분성을 감소시키는 것을 돕는다는 것을 시사한다. 출원인이 이 효과의 근본적인 메커니즘을 결정하지는 않았지만, 이식물 내부의 전기적 자극이 이웃의 세포에서 IPSC를 유도하며, 그것들이 억제라는 것을 시사한다. 초미세구조 데이터는 숙주가 잠재적으로 hNSC와 동일한 수의 대칭 (억제) 및)비대칭 (흥분) 시냅스 접촉을 한다는 것을 보여준다. 발명자들의 가정은 효과가 이식된 세포로부터 유래되고 R6/2 마우스에서 그것들이 주로 신경 계통을 따라 분화하고 있다는 것이다. 하지만, Q140 마우스를 포함하는 다른 실험에서는, 잠재적인 신경교 효과가 나타나며, 개선의 구동자가 아직 이해되지 않았음을 시사한다. 신경 손실이 질환의 후기까지 이들 마우스에서 일어나지 않은 것으로 고려하면, 선조체-특이적 이식은 BDNF와 같은 영양 인자를 통한 신경 보호를 통해 및 mHTT 종의 비정상적인 축적을 방지함으로써 작용하는 것으로 보인다. 하지만, 이식된 세포에서 전기생리학적 활성의 발견, 및 개선된 전기생리학적 결과를 촉진할 수 있는 인간 세포와 내인성 마우스 세포 간의 접촉은 재생 효과에 대한 기회가 있을 수도 있다는 것을 시사한다.
다른 선조 유형에 비해 NSC를 이식하는 것에 대한 근거는 여러 계통을 따라 분화할 수 있는 능력에 기초한다. R6/2 마우스에서, 세포는 조기 성상세포 또는 신경 분화의 증거를 나타냈으며; 대부분 뉴런-제한된 선조 마커 (DCX, βIII-튜불린, 및 MAP-2)로 동시-라벨링된다. hNSC는 전형적으로 마지막으로 분화하는데 수개월이 소요되기 때문에, 발명자들은 4주 시점에 이식된 세포의 부분적인 분화만을 관찰할 것으로 예상했다. 흥미롭게도, 시험관 내에서 이식 전에 극소수의 ESI-017 hNSC는 DCX 양성이었다. R6/2 마우스에서 세포 운명의 결과는 Q140 장기간 HD 모델에서의 발명자들의 결과 및 더 많은 세포가 성상세포가 되고 있는 hNSC를 사용하는 파킨슨 병 및 알츠하이머 병 (AD) 모델에서의 다른 연구와 대조적이지만 (Goldberg et al., 2017), 후자는 태아 NSC로부터 유래되며, 이것은 더 신경교 발생성인 경향이 있다. 이들 데이터는 질환 미세환경에 따라 상이한 반응이 존재할 수도 있으며, 면역억제 패러다임이 시방서에 영향을 미칠 수 있거나, 또는 인간 대 마우스 세포에 대해 특이적인 개발 단서 및 시기가 결과에 영향을 미친다는 것을 시사한다.
감소된 BDNF 수준이 HD 마우스 및 인간 HD 대상체에 존재하고 (Strand et al., 2007; Zuccato et al., 2011), HD 마우스에서 많은 효과적인 처리가 BDNF의 부수적인 증가를 나타낸다 (Ross and Tabrizi, 2011). 줄기 세포 이식을 통한 영양 인자 지원의 아이디어와 일치하게; GDNF를 발현하는 마우스 NSC의 생체 외 전달은 HD 마우스에서 운동 기능을 유지하고 신경 손실을 방지하며 (Ebert et al., 2010), BDNF가 AD 마우스 (Blurton-Jones et al., 2009) 또는 루이소체(Lewy body)를 이용한 치매의 모델 (Goldberg et al., 2015)로의 마우스 NSC 이식 이후 개선된 인지에 필요하였다. BDNF는 구심성 경로를 통해 선조체로 이동되어야 하며, HD에서 변화되는 피질선조체 경로를 포함한다 (Laforet et al., 2001). 선조체에 영양 지원을 공급함으로써, 피질선조체 경로가 피질에서 신호 BDNF 생산에 충분히 보존되거나 줄기 세포-유래된 BDNF가 선조체에서 다시 피질선조체 뉴런의 체세포로 역으로 수송되는 것이 가능하며, 이식 후 전기생리학적 활성의 개선으로 이어진다.
이식된 hNSC의 한 가지 작용 메커니즘은 잠재적으로 그 형성을 방지하거나 선택적 클리어런스(clearance) 메커니즘을 유도하여 비정상적인 mHTT 축적 및 응집체의 감소를 통해 이루어질 수 있다 (예를 들어, Chen et al., 2013). 발명자들은 특정 HMW 불용성 mHTT 종의 감소가 R6/2 마우스에서 개선된 행동 및 여러 분자 판독값의 표준화와 관련이 있다는 결과를 기재하였다 (Ochaba et al., 2016). mHTT 및 유비퀴틴화된 HMW 불용성 종의 병원성 축적의 감소는 HD 마우스에서 관찰되는 신경 기능 장애를 방지한다는 것은 타당하다.
응집체가 인간 HD 대상체에서 태아 세포 이식 연구에서 획득될 수 있다는 관찰 (Cicchetti et al., 2014)과 대조적으로 획득한 HD 표현형, 예컨대 봉입체의 증거가 마우스 모델에서 이식 과정 동안에 관찰되지 않았다는 것이 중요하다 (도 10). 분명한 단백질 번식 또는 획득된 병리학의 부족은 hNSC의 증가된 영양 신호전달의 결과이거나 또는 이식된 세포로의 단백질 번식을 촉진할 수 있는 환원성 mHTT 종의 결과일 수 있다. 대안으로, 세포가 병리학을 획득하는데 수년이 걸릴 수 있으며, 이것은 마우스 연구에 의해서는 나타나지 않는다.
요약하면, 발명자는 신경 집단으로 분화된, 생존한 HD 마우스에 이식된 hNSC는 손상된 조직을 보호하거나 회복시킬 수 있고 질환 진행, 감소된 병리학 및 보호 분자의 증가된 생산, 및 잠재적으로 형성된 주변 조직과의 접촉을 지연시킬 수 있다는 것을 나타내며, HD에 대한 장래의 치료 전략을 시사한다. 유전적으로 수정된 환자-유래된 NSC가 인간 뉴런 및 DARPP-32-양성 세포를 형성할 수 있다는 것을 나타내는 An et al. (2012)의 결과 및 본원에서 보고된 결과를 고려하면, 수정된 환자 세포를 사용한 자가 이식의 추가의 적용이 또한 실현 가능할 수 있다.
동등물
본 발명은 상기 구체예와 함께 기재되었지만, 상기 언급된 설명 및 예는 본 발명의 범위를 예시하려는 의도이며 제한하려는 것은 아니라는 것을 이해해야 한다. 본 발명의 범위 내의 다른 양태, 이점 및 변형은 본 발명이 속한 분야의 당업자에게 명백할 것이다.
이에 더하여, 본 발명의 특징 또는 양태가 마쿠쉬(Markush) 그룹에 관하여 기재된 경우, 당업자는 본 발명이 또한 마쿠쉬 그룹의 임의의 개개의 구성원 또는 구성원의 하위 집단에 관하여 기재된다는 것을 인정할 것이다.
본원에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고문헌은 각각이 개별적으로 참조로 포함된 것과 동일한 정도로 그 전문이 참조로 분명하게 포함되어 있다. 분쟁의 경우에, 정의를 포함하고 있는 본 명세서가 우선될 것이다. 본 명세서 전반에 걸쳐, 기술 문헌은 저자의 인용에 의해 참조되며, 전체 서지 사항은 하기 제공된다.
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Claims (37)

  1. 인간 배아 줄기 세포 (hESC)로부터 인간 신경 줄기 세포 (hNSC)를 제조하는 방법으로서, 방법은
    a) 분화 배지에서 배양된 배양체 (EB)의 집단으로부터 적어도 하나의 줄기 세포 로제트를 단리시키는 단계;
    b) 일정 시간 동안 및 적어도 하나의 로제트의 생성을 제공하는 조건 하에서 단계 a)의 로제트로부터 단리된 적어도 하나의 개개의 세포를 배양하는 단계;
    c) 개개의 세포를 단계 b)의 로제트로부터 개개의 세포로 단리시키는 단계; 및
    d) 일정 시간 동안 및 hNSC의 밀집 집단의 생성을 제공하는 조건 하에서 단계 c)로부터 단리된 적어도 하나의 개개의 세포를 배양하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  2. 제1 항에 있어서, 로제트로부터 적어도 하나의 개개의 세포의 단리는 수동으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1 항에 있어서, 로제트로부터 적어도 하나의 개개의 세포의 단리는 효소를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1 항에 있어서, 단계 a)의 로제트로부터 적어도 하나의 개개의 세포의 단리는 수동으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1 항 또는 제4 항에 있어서, 단계 c)의 적어도 하나의 개개의 세포의 단리는 효소를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1 항에 있어서, 단계 a) 내지 c) 중 하나 이상은 2회 이상 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1 항에 있어서, 단계 a) 내지 d) 중 적어도 하나는 수동으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1 항에 있어서, 단계 a) 내지 d) 중 적어도 하나는 기계적으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1 항에 있어서, 로제트의 단리는 디지털 방식으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1 항에 있어서, ESI-017로부터 배양체를 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제9 항 또는 제10 항에 있어서, EB 배지 내 초저 부착면에서 배양체 (EB)를 배양하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제11 항에 있어서, 단계 a)에 더하여 EB가 오르니틴/라미닌 코팅된 표면 상에서 유효한 시간 동안 배양된 후 EB 배지를 N2 배지로 대체하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12 항에 있어서, EB가 단계 a)의 적어도 하나의 EB를 생산하기에 유효한 일정 시간 동안 EB 배지에서 배양된 후 EB 배지를 N2 배지로 대체하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1 항에 있어서, 단계 c)에서 단리된 적어도 하나의 개개의 세포는 N2 배지 내 오르니틴/라미닌 코팅된 플레이트에서 유효한 기간 동안 배양되어 hNSC의 밀집 세포 집단을 생성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14 항에 있어서, N2 배지의 유효량으로 hNSC의 밀집 집단을 배양하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15 항에 있어서, 세포의 집단을 확장시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제1 항에 있어서, 세포를 유전적으로 변형시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제17 항에 있어서, 세포는 전이유전자의 삽입에 의해, 또는 CRISPR에 의한 변형에 의해 유전적으로 변형되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제18 항에 있어서, 전이유전자는 ApiCCT1, 그것의 단편, 또는 그것들 각각의 동등물이고, 선택적으로는 전이유전자는 세포에서 과발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제15 항 내지 제19 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조되고, 선택적으로 세포는 BNDF를 발현하는, hNSC.
  21. 제10 항의 방법에 의해 제조되는 hNSC로서, hNSC는 세포의 분화시 BNDF를 발현하는, hNSC.
  22. 제21 항에 있어서, 세포는 전이유전자의 삽입, 또는 CRISPR에 의해 유전적으로 변형된 것을 특징으로 하는 hNSC.
  23. 제18 항의 세포의 집단.
  24. 제20 항의 단리된 세포를 포함하는 조성물.
  25. 제24 항의 집단 및 담체를 포함하는 조성물.
  26. 제24 항 또는 제25 항에 있어서, 보존제 및/또는 동결방지제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  27. 전이유전자를 대상체에 전달하거나, 또는 필요로 하는 대상체에서 세포를 유전적으로 편집하는 방법으로서, 제20 항 또는 제21 항 중 어느 한 항의 세포의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  28. 제27 항에 있어서, 대상체는 포유동물인 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제28 항에 있어서, 대상체는 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 필요로 하는 대상체에서 신경변성 장애를 치료하거나 시냅스 연결을 향상시키는 방법으로서, 제20 항 또는 제21 항의 단리된 세포의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  31. 제30 항에 있어서, 신경변성 장애는 헌팅턴 병, 뇌졸중, 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 외상성 뇌 손상, 뇌 염증, 뇌졸중, 자가면역 장애, 예컨대 다발성 경화증, 1차 또는 2차 진행형 다발성 경화증, 재발 완화형 다발성 경화증, 만성 척수 손상, 벨 마비, 경부 경추증, 손목 터널 증후군, 뇌 또는 척수 종양, 말초 신경병증, 길랭-바레 증후군, 척수근 위축증, 프리드리히 운동실조증, 근위축성 측색 경화증, 및 헌팅턴 무도병의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제30 항 또는 제31 항에 있어서, 대상체는 포유동물인 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제32 항에 있어서, 대상체는 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
  34. hESC 및 제1 항 내지 제17 항 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 설명서를 포함하는 키트.
  35. 제20 항 또는 제21 항의 hESC 및 제1 항 내지 제17 항 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 설명서를 포함하는 키트.
  36. 동물에 이식된 제20 항 또는 제21 항의 hNSC를 갖는, 비-인간 동물
  37. 제36 항에 있어서, 동물은 쥐 또는 양인 것을 특징으로 하는 비-인간 동물.

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