TWI395817B - 人類滋養層幹細胞及其應用 - Google Patents

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人類滋養層幹細胞及其應用

本發明係關於人類滋養層幹細胞之獨特製備方法及其用途。

哺乳類動物中，滋養層譜系細胞出現在發育的最早期。在小鼠中，滋養層譜系細胞為囊胚期(blastocyst stage)的滋養外胚層(trophectoderm)，以上皮細胞包圍著內層細胞質塊(inner cell mass,ICM)及囊胚腔(blastoceol)，形成一球狀的結構。受精卵著床後，內層細胞質塊將發育為胚胎本體(embryo proper)及胚胎外膜(extraembryonic membrane)，而滋養外胚層只能形成胎盤中支持胎兒的部位及滋養層巨細胞(trophoblast giant cells)。極性的滋養外胚層(滋養外胚層直接與內層細胞質塊接觸的地方)具增殖的能力且可形成胚胎外膜(extraembryonic ectoderm,ExE)、外胎盤椎(ectoplacental cone,EPC)，及早期胎體的次級巨細胞(secondary giant cell)；而其餘滋養外胚層部分則停止增殖並轉變為初級巨細胞(primary giant cell)。初級細胞培養(primary culture)及嵌合小鼠(chimeric rnice)的實驗顯示，胚胎外膜裡有幹細胞存在，這些幹細胞會進一步形成外胎盤椎以及多套染色體巨細胞(polyploid giant cell)。有證據更進一步地指出，這些細胞所具備的類幹細胞特徵，仰賴源自於內層細胞質塊的訊息，及後續源自於外胚層(epiblast)的訊息，因為當雙套染色體的滋養層細胞由胚胎環境中移出時，會轉變為巨細胞。儘管我們在這方面的知識累積不少，源自於胚胎的訊息仍未明瞭，而且也未能成功地 長期在實驗室中培養小鼠的滋養層幹細胞(U.S.Pat.No.6,330,349)。

幹細胞具有無限分裂及無限增殖的能力，科學家利用這兩種特性，由幹細胞中培養出人類所有的細胞種類，作為治療疾病及細胞替換的來源。事實上，細胞療法(cell therapy)具有治癒各種與細胞功能不全或細胞受損相關疾病的潛力，如中風、糖尿病、心臟病、脊椎損傷、癌症，及愛滋病等。利用幹細胞來治療疾病或修補受傷的組織，具有無限潛能，並已在科學界、醫界，及生技產業間造成一股轟動。

美國專利案2003104616號(U.S.Appl.No.2003104616)，成功地將多種哺乳動物來源的胚胎幹細胞(ES cell)培養於實驗室內。Evans、Kaufman(1981)及Martin(1981)，證明了直接由小鼠囊胚中的胚胎細胞，培養出永久細胞株的可能性。Thomson等人(1995及1996)則成功地由恆河猴及狨猴中培養出永久細胞株。許多實驗利用源自於家畜及實驗室動物著床前的胚胎，已成功地培養出多能分化細胞株(pluripotent cell line)，這些動物包含了牛(Evans et al.,1990)、豬(Evans et al.,1990,Notarianni et al.,1990)、綿羊與山羊(Meinecke-Tillmann and Meinecke,1996,Notarianni et al.,1991)、大白兔(Giles et al.,1993,Graves et al.,1993)、貂(Sukoyan et al.,1992)、大鼠、(Iannaccona et al.,1994)，及倉鼠(Doetschman et al.,1988)。最近Thomson等人(1998)及Reubinoff等人(2000)宣布，他們已培養出源自於人類的胚胎幹細胞株，而這些人類胚胎幹細胞株與恆河猴胚胎幹細胞株相似。

胚胎幹細胞存在於人類囊胚的內層細胞質塊中，此時期為受精後4-7日，胚胎發育的早期。囊胚期是早於著床期的胚胎發育階段，而囊胚包含兩部分：

1.滋養外胚層(trophectoderm)：為外層，包覆胚胎的外膜。

2.內層細胞質塊(inner cell mass,ICM)：此部分形成胚胎本體。

在正常的胚胎發育中，胚胎幹細胞在第7天後即消失，而3層胚胎組織層開始形成。由囊胚內層細胞質塊取出的胚胎幹細胞可在實驗室內培養，若給予適當的條件，細胞可無限增生。這種處於未分化階段的胚胎幹細胞，保留了分化為3胚胎組織層內所有細胞的能力。胚胎發育的最後，內層細胞質塊的細胞將發育為所有的胚胎組織。在整個胚胎形成的過程中，只有在靠近第1週結尾時，可以自囊胚的內層細胞質塊中取得胚胎幹細胞。

自囊胚中分離胚胎幹細胞並於實驗室內培養，完全仰賴於取得的囊胚的完整性及其狀態。簡言之，較大且具有明顯內層細胞質塊的囊胚，較易由中取得胚胎幹細胞。目前已有許多分離內層細胞質塊的方法，用來建立胚胎幹細胞株。較常見的方法是讓囊胚自然地在母體內發育，之後以顯微手術(microsurgery)及免疫手術(immunosurgery)方式取出。

基因表現及功能性實驗結果顯示，FGF4及fgfr-2與滋養層細胞增殖有關。由於FGF4與fgfr-2表現出可交互作用的區域，表示滋養層組織可能是胚胎FGF訊息的標的物。不具FGF4及fgfr-2的小鼠表現出類似圍著床致死性表型(peri-implantation lethal phenotype)，這可能導因於內層細胞質塊及內胚層衍生物的缺損。儘管如此，此現象仍然符合FGF4透過fgfr-2作用在滋養層上，以維持滋養層細胞增生能力的可能性。最近的研究也證實此可能性，因為抑制FGF訊息傳遞會遏止內層細胞質塊與外胚層細胞的分裂。

在人類中，人類胚胎幹細胞(human embryonic stem cell,hES)是由最早期胚胎發育中，囊胚的內層細胞殖塊中產生(J.A.Thomson etal.,Science,282,1145(1998))。人類胚胎幹細胞出現在受精後約4-5天，具有再生的能力，並且可以產生體內所有不同種類的細胞。人類生殖幹細胞(human embryonic germ stem,hEG)，則取自於受精後5-9週的胎兒原生殖脊(primordial germ ridge)，也具有多能分化(pluripotency)的能力(M.J.Shamblott et al.,Proc.Natl.Acad Sci.USA,95,13726(1998))。在實驗室內培養，人類胚胎幹細胞與人類生殖幹細胞都可自行產生胎體(embryoid bodies,EBs)，其胎體由構成三層基礎胚胎層的細胞所組成(M.Amit et al.,Dev.Biol.,227,271,(2000)；M.J.Shambloott et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,98,113,(2001))，因此造就了此細胞運用於細胞基礎療法的無限潛能(K.Hochedlinger and R.Jaenisch,N.Engl.J.Med.,349,275(2003))。

比較起來，關於人類囊胚中滋養外胚層的研究較少，大部分人類滋養層幹細胞的知識來源，都是以小鼠為主的實驗。在小鼠中，滋養外胚層的亞型(subtypes)會在圍著床時期開始形成三種不同的滋養層細胞層。覆蓋在內層細胞質塊上的外胚層會繼續分裂並形成極性的滋養外胚層，之後會發育為胚胎外膜，在此處會有一群雙套染色體的細胞，之後會發育為成熟的絨毛尿囊胎盤(chorioallantoic placenta)(A.J.Copp,J.Embryol.Exp.Morphol.,51,109(1979))。在這模式中，胚胎外膜成為滋養層幹細胞株的可能來源(J.Rossant and W. Tamura-Lis,J.Embryol.Exp.Morphol.,62,217(1981)。而關於人類的研究中，人類滋養層幹細胞可能在胎盤發育後期產生，而不在囊胚期(J.Rossant,Stem Cells 19,477(2001))；另一實驗則暗示了，不可能有人類滋養層幹細胞的存在，即使有，也只可能源自於滋養葉胞層(cytotrophoblast layer)(T.Kunath et al.,in：Tophoblast stem cells,chapter 12,in：Stem Cel lBiology,D.R.Msrshak,R.L.Gardner,D.Gottlieb,Eds.(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York.2001),pp.267-287)。

下列為現存細胞株的缺點：

1.使用餵養細胞(feeder cell)與人類胚胎幹細胞(human embryonic stem cell,hESC)株一併培養，會產生混合的細胞群，而使人類胚胎幹細胞需要與餵養細胞分離，這樣子便無法大量培養人類胚胎幹細胞。

2.人類胚胎幹細胞會被餵養細胞的轉錄物質污染而無法用於商業用途，只 能用於研究。

美國專利案第2003104616號(U.S.Appl.No.2003104616)中Geron建立一新的培養人類胚胎幹細胞株的方式，其培養時不需要餵養細胞(XU et.al 2001)。他的細胞株是培養在一種胞外基質(extracellular matrix)上，並以特定的培養液培養，細胞則以未分化的狀態在這樣的生長環境中成長。以此方式培養，細胞不具有源自於培養環境中，其它癌細胞的異種組合物(xenogenic component)，相同地，產生出的人類胚胎幹細胞及其衍生物也適合作為商業用途。在培養的過程，不需要餵養細胞來支持人類胚胎幹細胞的生存，而繼代培養亦可以機器進行。然而，這方式主要的缺點為，內層細胞質塊以免疫手術方式分離，而胚胎幹細胞的最初來源培養在含有異種組合物的餵養層上，這增加了細胞被源自於動物的病毒或細菌污染的可能性。

名詞定義：

基因療法(Gene therapy)：應用基因以及遺傳工程技術，來治療遺傳疾病或慢性疾病。目前已有許多基因療法技術，但都處於實驗性階段。兩個基本的基因療法方式，分別稱為體內(in vivo)基因療法以及體外(ex vivo)基因療法。體內基因療法是將以遺傳工程改造過的基因，直接注入病患體 以遺傳工程改造其基因後，再置回病患體內。

免疫不全疾病(Immunodeficient disease)：醫學上，免疫不全係指一種狀態，其中患者的免疫系統抵抗傳染病的能力低下，或者完全不具抵抗之能力。大多數的免疫不全疾病為先天性或後天得來。

神經系統疾病(Nervous system disease)：係指特徵為漸進性的神經原喪失之任何狀態，此狀態肇因於個體中樞神經系統中細胞之死亡。

腫瘤(Tumor)：腫瘤包含不正常的癌細胞，其與淋巴癌(lymphoma)、血癌(leukemia)、漿細胞病(plasma cell dyscrasias)、多發性骨髓瘤(multiple myeloma)、澱粉樣變性病(amyloidosis)、眾所周知的血液腫瘤(hematopoietic tumors)、結腸癌(colorectal cancer)、卵巢癌(ovarian cancer)、骨癌(bone cancer)、腎癌(renal cancer)、乳癌(breast cancer)、胃癌(gastric cancer)、胰臟癌(pancreatic cancer)，或黑色素癌(melanoma)相關。

本發明提供一種人類滋養層幹細胞之分離製劑，其中，滋養層幹細胞來自子宮外孕輸卵管中之胚胎。人類滋養層幹細胞可於體外培養並無限增殖，且其型態為未分化細胞。人類滋養層幹細胞保有潛在性多元分化之能力，且本發明所製備之人類滋養層幹細胞，可在體外或體內，誘發成滋養層譜系細胞。因此，本發明亦涉及以誘導方式，使純化之滋養層幹細胞(於 體外培養較佳)分化為滋養層譜系細胞；此已分化細胞，以表現滋養層譜系細胞基因標誌為特徵(如：胎盤外側錐體(EPC)中的雙套染色體滋養層細胞，以及早期胎體中的次級巨細胞)。於一實施例中，所純化出的滋養層細胞，亦包含滋養層譜系細胞中的雙套染色體滋養層細胞。

分離出的細胞表現SSEA-1、SSEA-3，以及SSEA-4標誌，具多能性分化能力，以及正常染色體組型，其中細胞之染色體無任何變異。於一實施例中，細胞具有表現Oct4、fgfr-2、以及FGF4基因標誌的特徵。

分離出的人類滋養層幹細胞，於體外後續培養，仍具有正常染色體組型，其細胞染色體端粒長度不變，不會隨實驗室內繼代培養而變短。

於較佳實施例中，人類滋養層幹細胞能分化成為一會表現CD44及CD90細胞表面標誌的間葉幹細胞，且可進一步誘導分化成不同種類的細胞。於較佳實施例中，細胞分化為內胚層、中胚層，以及/或外胚層之衍生物。於更佳實施例中，衍生物為骨母細胞(osteoblast)、軟骨細胞(chondrocyte)、肌原細胞(myocyte)、脂肪細胞(adipocyte)，以及/或神經原幹細胞(neural stem cell)。為分化為不同功能的細胞種類，基因會有不同之調控。於較佳實施例中，基因調控是由bFGF引發。

人類滋養層幹細胞可做為人類細胞分化、基因療法，或細胞基礎療 法之模式。

人類滋養層幹細胞，可以細胞中導入突變(mutation)基因或轉殖基因(transgene)的方式加以修飾。於細胞中插入或刪除突變基因，可採用常規的技術進行；於細胞中置入轉殖基因，可採用傳統技術進行，例如：磷酸鈣或氯化鈣共同沉澱法、DEAE-dextran轉染法、微脂粒轉染法、電穿孔法，或顯微注射法。合適的細胞轉型或轉染方法，可在Sambrook等人的著作(Molecular Cloning：A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory press(1989))，或其他實驗教科書中找到。舉例而言，轉殖基因可用合適之載體送入細胞，包含但不受限於酵母菌質體(cosmid)、細菌質體(plasmid)，或經過修飾之病毒(modified virus)(例如：無法正常複製的反轉錄病毒、腺病毒、以及腺相關病毒)。利用常規的方式，包含在單層產病毒細胞上培養細胞，可使轉染容易且有效率地進行。

本發明之人類滋養層幹細胞，可用於生產與人類胎盤相關之生長激素、賀爾蒙等物質。本發明所製備之細胞或細胞株，亦可用於生產治療物，如人類絨毛膜性腺激素(human Chorionic Gonadotropin,hCG)。

本發明之人類滋養層幹細胞，可作為篩選滋養層分化時期所表現之基因或此時期之必須基因。可應用的篩選方式包含代表性差異顯示分析法(Representational Difference Analysis,RDA)，或如SA-lacZ之基因捕獲法 (gene trapping)。基因捕獲法可用於引發顯性突變(dominant mutation)(例如：剔除基因產物中的特定區域)，顯性突變將影響滋養層細胞分化的能力或活性，也使分化時期所表現之基因，或分化之必須基因，易於辨識。

本發明亦提供一種取得人類幹細胞之方法，係包含：(a)取得子宮外孕輸卵管中之胚胎，及(b)取得胚胎絨毛狀滋養層中的幹細胞；其中，人類幹細胞，係指如前文所述之人類滋養層幹細胞。胚胎取自於未剝離之子宮外孕處。於較佳實施例中，未剝離之子宮外孕處，係處於受精未超過六週之狀態。而絨毛狀滋養層，包含細胞滋養層(cytotrophoblastic layer)。

本發明亦提供一種用於治療之組合，係包含：(a)一種人類滋養層幹細胞之分離製劑，及(b)一種緩衝溶液；其中，人類幹細胞，係指如前文所述之人類滋養層幹細胞。組合中緩衝溶液之作用，在於維持幹細胞之生物活性。舉例但非限制，緩衝溶液為生理食鹽水、磷酸鹽緩衝溶液(PBS)，及培養液。

此組合可進一步包含一種治療性化合物。舉例非限制，此化合物為藥物、化學物，以及抗體。於一實施例中，治療性化合物為免疫抑制劑或免疫支持劑。

本發明之組合可用於治療疾病，包含免疫不全疾病、神經系統疾病、 造血系統疾病，或腫瘤。本發明之組合可用於移植、注射，或外用。

本發明進一步提供一種監控避孕狀態之方法，係包含分析子宮內膜中bFGF、Oct4、fgfr-2，以及/或FGF4之濃度；其中，避孕狀態係指受精卵著床及胎盤形成。

本發明進一步提供一種組合物，用於治療習慣性流產以及/或體外受精失敗病患；此組合物係包含調控bFGF、Oct4、fgfr-2，以及FGF4濃度之單株抗體、拮抗劑，以及其他抑制劑；其中，治療包含以bFGF弱化Oct4及fgfr-2的表現，且體外受精失敗係指經常性體外受精失敗。

本發明進一步提供一個用於處理或預防癌症的方法，係包含對有此需求之動物投以有效劑量之單株抗體、拮抗劑，以及其他抑制劑，以達到調控bFGF、Oct4、fgfr-2，以及FGF4之濃度。於一實施例中，動物為哺乳動物；於一較佳實施例中，動物為人類。

本發明之方法，可用於處理或預防癌症(cancer)，其中，癌症係指腫瘤(carcinoma)。再者，腫瘤係指腺癌(adenocarcinoma)或絨毛膜癌(choriocarcinoma)。於一較佳實施例中，絨毛膜癌係為惡性融合細胞瘤(syncytioma malignum)。

本發明進一步提供一種組合，用於處理一種神經系統疾病；本組合包含人類滋養層幹細胞，而其中人類滋養層幹細胞係由子宮外孕輸卵管中之胚胎所取得。此神經系統疾病為神經退化性疾病；神經退化性疾病，係指特徵為漸進性神經原喪失之任何狀態，此狀態肇因於個體中樞神經系統中細胞之死亡。於一較佳實施例中，神經退化性疾病為帕金森氏症(Parkinson’s disease)、杭丁頓氏舞蹈症(Huntington’s disease)、阿茲海默症(Alzheimer’s disease)、肌萎縮性脊髓側索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)、多發性系統退化症(multiple system atrophy)、路易氏體失智症(Lewy body dementia)、週邊感覺神經病變(peripheral sensory neuropathy)、或脊椎損傷(spinal cord injury)。於一更佳實施例中，神經退化性疾病為帕金森氏症。

本發明之組合可進一步包含一種緩衝溶液，此緩衝溶液用於維持人類滋養層幹細胞之生物活性。舉例但非限制，緩衝溶液為生理食鹽水、磷酸鹽緩衝液(PBS)，以及培養液。

本發明之組合可進一步包含一個治療性化合物。舉例非限制，此化合物為藥物、化學物，以及抗體。

本發明進一步提供一種方法，用於處理或預防一種神經退化疾病，係包含對一病患投以有效劑量之滋養層幹細胞。滋養層幹細胞是由子宮外孕輸卵管之滋養葉絨毛中所取得；於一較佳實施例中，神經退化性疾病為 帕金森氏症、抗丁頓氏舞蹈症、阿茲海默症，或化學藥劑引發之神經損傷。

投藥方式為經由注射、移植，或外科手術的方式。

於一實施例中，病患為動物。於一較佳實施例中，動物為人類。

本發明亦提供一種組合，用於處理糖尿病；此組合係包含如前文所述之人類滋養層幹細胞。此組合進一步包含一種藥學上可接受之藥物載體，其藥物載體用於維持幹細胞之生物活性。舉例但非限制，藥物載體為生理食鹽水、PBS，以及培養液。

本發明之組合可經由注射、移植，或外科手術之方式投藥。熟知本技術者能斷定組合物使用之濃度或劑量。

以下實施例是用來呈現而非限制本發明的各個面向與特色。

實施例一、由滋養葉絨毛分離人類滋養層幹細胞及其初級培養(primary culture)

使用腹腔鏡由女性生殖器官(圖10 a)取得八個合適的樣本(受孕4-5週)，此樣本將用在細胞培養以及免疫組織化學染色。將新鮮的絨毛(圖10 b)以手工方式弄碎、沖洗，以不含bFGF的培養液培養。細胞在分化之前，只有少量的胚胎體會在培養的第一天出現(圖1a)，一週之後，胚胎體的數目降低至30-40個，其型態特徵與前人研究結果相同(M.Amit et al.,Dev.Biol.,227,271,(2000)；M.J.Shambloott et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,98,113,(2001))。

以腹腔鏡手術由未剝離之子宮外孕輸卵管妊娠塊中取得早期滋養葉絨毛(產科週數：6-7週)(圖10 a)，馬上以生理食鹽水(37℃)清洗絨毛組織，以除去血液，並將組織以顯微方式在不含血清之α-MEM培養液(minimum essential medium modification α-MEM,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)中弄碎，以避免胚胎其餘部分污染樣本。將絨毛切成非常小塊，放入15 ml錐形管中，於室溫下置放3分鐘(圖10 b及c)。以1500 rpm離心6分鐘，除去上清液，之後，於沉澱物中加入trypsin/EDTA(Sigma-Aldrich)，使最終濃度為0.025%，並於37℃作用40分鐘。加入內含10%小牛血清之α-MEM培養液以停止分解作用，並再次清洗樣本。將沉澱物懸浮於8 ml，內含20%小牛血清(HyClone,Logan,Utah)以及1% penicillin/streptomycin之α-MEM培養液，最後將樣本種入10 cm培養皿中，置於37℃、5%二氧化碳的培養箱內培養。

胚胎體(EBs)於培養第二天後形成，一週後胚胎體的數目可能會上升至30-40個。收集胚胎體，以前文所述之胰蛋白酶(trypsin)分解，並再次培養。約7-10天會形成一層像纖維母細胞的細胞層。保存細胞的方法為以胰蛋白酶分解細胞，並用PBS清洗2次，加入10% DMSO/FBS(Sigma-Aldrich)，並將細胞至於液態氮中保存。

在培養中，胚胎體傾向於貼附在培養皿上，與源自於人類生殖幹細胞的細胞相反，這些細胞傾向於懸浮在培養液中(B.Gerami-Naini et al.,Endocrinology,145,1517(2004)；L.Cheng,H.Hammond,Z.Ye,X.Zhan,G.Dravid,Stem Cells,21,131(2003))。導致此差異的原因，目前尚未明瞭；我們認為，細胞貼附可能與滋養層細胞著床的特性有關。之後以胰蛋白酶分解胚胎體，並且再次培養，所收集到的細胞不是馬上用於實驗就是以液態氮保存，保存之細胞使用前需解凍。

細胞培養時，先將保存的細胞解凍，再以調配好的α-MEM培養液培養。培養液內含有20%小牛血清、1% penicillin-streptornycin，以及10 ng/mlbFGF(CytoLab Ltd,Rehovot,Israel)，或者不含bFGF；而細胞培養在37℃、5%二氧化碳的環境中。第三日後更換培養液，之後，每三日更換一半的培養液。當細胞長滿培養皿90-95%時，以胰蛋白酶分解並且繼代培養。繼代培養至第五代後，測試細胞分化為多種特定型態細胞的能力，以確定細胞多元且多能的分化能力。培養液中的hCG濃度以特定的免疫放射測定套組 測定(Diagnostic Products,Los Angeles,CA)。

實施例二、已分化的人類滋養層幹細胞之免疫細胞化學分析

將第6代的細胞，以基礎培養液(含20% FBS及10 ng/ml bFGF的α-MEM培養液)培養在3.5 cm的培養皿中。當細胞長滿70%時，依不同分化的需要，置換成不同的培養液。並分別在藥物誘導後第7、14、21，以及第28天，評估細胞分化。為使細胞進行成骨分化，要以特別調配之培養液培養(Table 1)。

HBS溶液之配製 將867 g之氯化鈉溶於80 ml Milli Q水中，加入2 ml之HEPES(GIBCO HEPES Buffer solution cat. No.：15630-080)，調整至pH 7.4，以0.2 μm濾膜過濾，並於4℃保存。

一週更換兩次培養液，每一培養皿中放2 ml的培養液，以此細胞進行免疫細胞化學染色。(A)以Alizarin red S(AR-S)分析細胞化學礦物基質(cytochemical mineral matrix)，以確定其中含鈣(S1)：以PBS漂洗細胞，而後以冰的70%乙醇固定一小時，之後再以去離子水漂洗，以40 mM AR-S(pH 4)於室溫下作用10分鐘，之後，以水漂洗細胞五次，再以PBS清洗細 胞15分鐘，以除去非特定的AR-S染劑。(B)Kossa染色(S2)：以10%甲醛固定細胞一小時，與2%的硝酸銀溶液(w/v)於黑暗中作用10分鐘，以去離子水清洗，之後於亮光下曝曬15分鐘。(C)以商業套組(Sigma-Aldrich)分析鹼性磷酸酶活性(alkaline phosphatase activity)(S3)。(D)軟骨生成分化(chondrogenic differentiation)(S4)是以特定的培養液(Table 1)誘發，並以Alcian blue(Sigma-Aldrich)染色法在酸性環境下以確定：以4%甲醛在室溫下固定細胞15分鐘，以PBS清洗細胞數次，將細胞與含1% Alcian blue的0.1 N氯化氫(pH 1.0)作用30分鐘，最後再以0.1 N氯化氫清洗5分鐘，以除去過多的染劑。(E)肌原生成分化(myogenic differentiation)(S4)是以特定的培養液(Table 1)誘發四週，並以免疫細胞化學染色法確定肌球蛋白重鏈的存在：以PBS漂洗細胞兩次，4%甲醛固定細胞20分鐘，再以PBS清洗細胞數次，之後，將細胞與含3%過氧化氫的PBS作用10分鐘，以除去內部的過氧化氫酶活性，再與阻隔緩衝液(blocking buffer：PBS containing 10% HS,0.1% Triton X-100)額外作用60分鐘，以阻斷非特性區域的染色。以阻隔緩衝液清洗細胞三次，每次5分鐘，將細胞與含有單株抗體的阻隔緩衝液作用1小時，其單株抗體對骨骼肌肌球蛋白重鏈(Vector Laboratories)具特異性。再以阻隔緩衝液清洗細胞，並以VectaStain ABC套組(Vector Laboratories)測定。(F)脂肪細胞分化(adipogenic differentiation)(S5)是以特定的培養液(Table 1)誘發，並以oil red O染色確定：細胞以4%甲醛/1%鈣於室溫下固定60分鐘，以70%乙醇清洗。之後與2%的oil red O試劑於室溫下作用5分鐘，以70%乙醇洗去過多的染劑，接著再以蒸餾水清洗數次。本分析法是 利用oil red O作為胞內脂質囤積量的指示劑。

免疫組織化學法偵測SSEA-1(Chemicon,D3P013A)、SSEA-3(Chemicon,24040550)，以及SSEA-4(Chemicon,24080406)是利用LSAB套組(Dako,k0697)以及Double AB套組(Dako,k3466)，並以山羊血清(Dako,x0907)作為阻斷抗原。去石臘組織上的SSEA-1及SSEA-4染色程序如下：1)以TBS溶液(tris-phosphate buffer saline,TBS)漂洗組織。2)以過氧化氫清潔組織10分鐘。3)與山羊血清作用30分鐘。4)加入一級抗體，並作用至隔天。5)以TBS溶液漂洗。6)以streptavidin處理20分鐘。7)以biotin染色(20分鐘)。8)以TBS溶液清洗。9)以DAB處理(10分鐘)，並以Mayer hematoxylin復染。至於SSEA-3的染色，程序相同，但有一額外步驟：將組織放入檸檬酸溶液中，以高壓鍋加熱15分鐘，以使組織上的抗原露出，此步驟須在步驟1與2之間進行。最後結果，SSEA-1、SSEA-3，以及SSEA-4會分別出現在細胞質內、細胞核膜，以及細胞膜上。然而，有少數培養的細胞，SSEA-4染色會呈現在細胞質內與細胞膜上。

首先，利用幹細胞必定表現的細胞表面標誌，來偵測細胞培養中的幹細胞。第一次繼代培養後，將細胞以中性的4%甲醛固定，然後以免疫細胞化學法，偵測幹細胞的表面標誌：特定時期的胚胎抗原SSEA-1、SSEA-3，及SSEA-4。實驗結果呈陽性反應，證實有多能分化的幹細胞存在。一些巨大細胞(giant cells)會在細胞質中表現SSEA-1(圖1c)，在細胞核 膜上表現SSEA-3(圖1 d)，在細胞質及細胞膜兩者表現SSEA-4(圖1 e)。此細胞大且圓，且細胞核與細胞質的比例為1：1。

進一步檢驗SSEA是否表現於子宮外孕絨毛狀組織中，以確認免疫組織化學法偵測SSEA的正確性。在絨毛中，所有表現SSEA的細胞都位於Langhans氏層(Langhans layer)(內層)，而此處的SSEA-1表現於細胞質中(圖1 f)。表現SSEA的細胞亦存在鬆軟的中胚層基質(mesodermal stroma)、微血管內皮細胞，以及腔內間隙(圖10 b)。SSEA染色染上的細胞亦可見於輸卵管內腔組織(圖10 c)。SSEA-3及SSEA-4分別出現在細胞核膜以及細胞膜上(圖1 g及h)(表1)。

鑒於SSEA表現在Langhans氏層，進一步以免疫染色法測定人類絨毛性腺激素(hCG)，作為滋養層細胞存在的依據；因為只有合體滋養層(syncytiotrophoblast)(外層)表現hCG，而Langhans氏層內並不會。Langhans氏層內不表現hCG，暗示人類滋養層細胞與合體滋養層細胞不同。為進一步證實此發現，以抗體及流式細胞儀測定SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4，及Thy-1的表現。在三種細胞株(PV 02、PV 06、PV 07)中，SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4，及Thy-1的表現，於每10,000個細胞中，分別佔6.8±1.5%、43.2±4.9%、53.2±0.8%，及94.3±1.8%(圖1 b)。若以免疫細胞化學法測定，可在細胞質與細胞膜上觀察到SSEA-4存在，但以免疫組織染色法測定，則只有在細胞膜上有SSEA-4表現。此實驗結果很可能反映，細胞的細胞質與 細胞膜處於不同的生長階段。

在足月胎盤中，表現SSEA的細胞不存在末端絨毛，但存在較大絨毛幹的內絨毛基質中(圖1 i及j)。SSEA-3則散佈在融合細胞芽(syncytial sprouts)(圖1 k)。綜合實驗結果，本發現提供證明，在早期的間葉絨毛(mesenchymal villi)，人類滋養層細胞位於細胞滋養層(cytotrophoblast)處，並且表現所有的SSEA表面標誌。

因為表現SSEA-1的細胞，可在子宮外孕輸卵管組織的靜脈中觀察到(圖11)，所以我們必須澄清，源自於臍帶血的間葉幹細胞(mesenchymal stem cell)^16-18與人類滋養層細胞的關係。為此，我們檢驗表現SSEA的細胞是否出現在足月胎盤，靠近胎盤與臍帶連結處的血管中。大量表現SSEA-1(圖1 m)、SSEA-3(圖1 n)，及SSEA-4(圖1 o)的細胞存在臍帶靜脈中，但不存於臍帶動脈中。

實驗結果引發另一問題，是否這些細胞具有多能分化能力，如同hES/hEG細胞，可分化為多種特定型態的細胞。我們根據不同的分化，將細胞培養於不同的α-MEM培養液中。以放射免疫測定法在第一次繼代培養(PV 07細胞株)及第二次繼代培養(PV 02細胞株)後檢測hCG，但並未在培養液中偵測到hCG。第六次繼代培養後，以不同的藥物(表1)誘發細胞分化成成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌原細胞，及神經細胞，並分別在藥 物誘發後第7、14、21，及28天以免疫細胞化學法來評定其分化(12)。

實驗結果顯示，偵測成骨細胞的Alizarin red S染色、von Kossa染色，以及鹼性磷酸酶測定皆呈陽性反應(圖2 b、c及d)，偵測軟骨細胞的Alician blue染色也呈陽性反應(圖2 e)，偵測肌原細胞的肌球蛋白重鏈染色也呈陽性反應(圖2 f)，偵測脂肪細胞的oil red O染色及胞內脂肪形成測定也呈陽性反應(圖2 g)。此結果說明，細胞具有間葉性的多能分化能力，給予特定的藥物，可分化為特定型態的細胞。

實施例三

RT-PCR

以TRIzol套組(Invitrogen,Carlsbad,CA)，依照廠商說明書，由不同代的人類滋養層細胞(10⁵至10⁶)以及足月胎盤組織中抽取RNA。反轉錄實驗使用1 μg之RNA，RT反應則以Ready-to-Go、RT-PCR Beads套組(Amersham Biosciences,Buckinghamshire,UK)進行。將1 μg之RNA反轉錄為cDNA，取等同於0.2 μg RNA的cDNA產物進行PCR放大。所使用的引子(primer)列於表2。

表2 RT-PCR使用的引子序列

反應產物以1.5%瓊脂電泳及溴化乙錠(ethidium bromide)染色進行分析。以β2-microglobulin的引子及其產物作為cDNA的正對照組，來確定所有的程序，甚至是將產物注入膠體的步驟，皆正確無誤。每次的PCR反應中，另以水作為cDNA的對照組。水的實驗結果，每次皆呈陰性反應。

RT-PCR實驗中，使用許多不同的引子，來確定培養細胞(PV 02第四代)中的基因表現。所使用的引子包含：osteopontin及osteocalcin引子，來證明成骨細胞的基因表現；perlecan及collagen type II引子，來證明軟骨細胞的基因表現；myogenin及myoD1引子，來證明肌原細胞的基因表現；PPARγ-2及adiposin引子，來證明脂肪細胞的基因表現(12)(表2)。實驗結果顯示，細胞在誘導後7日內，即表現所有上述的基因(圖2 i)，在這些基因中，myoD1在第7日有很強的表現。另外，細胞(PV 02第五代、PV 07第三及第四代)的神經分化則以維生素甲酸(retinoic acid)誘導，並以流式細胞儀進行偵測。神經細絲(neurofilament)、GFAP，及nestin的基因表現，可 在誘發後第4日偵測到。神經細絲的表現(最強的)及GFAP的表現，會持續上升至第10日，之後便減弱。在誘導後的前10日內，可測到微弱的nestin基因表現，但在第14日後，此基因表現便消失(圖2 h)。實驗結果再次確定了，細胞於未分化的狀態下，具有類似hES/hEG細胞，間葉性多元分化的能力。

實施例四、染色體及端粒長度分析

將人類滋養層細胞與0.1 μg/ml的秋水仙胺(colcemid)作用3小時，以胰蛋白酶處理後，懸浮細胞於0.075 mol/L的氯化鉀溶液中，於37℃作用20分鐘，接著再以3：1比例的methanol/acetic acid固定細胞。細胞分裂中期的染色體則由培養在25 cm培養瓶中的人類滋養層細胞抽取，方法依照標準程序，並在G-banding染色(S7)後分析；人類染色體組型則在細胞遺傳學專家將染色體染色後進行分析。

即使端粒酶(telomerase)活性存在，並不表示端粒的長度會穩定不變，且當幹細胞受到刺激而產生祖源細胞(progenitor cell)(S8)時，端粒酶活性會增加，因此，我們選擇測定端粒長度，來確定人類滋養層細胞在繼代培養(S9)中，端粒是否會變短。將細胞培養在10 cm培養皿中，抽取遺傳DNA，以Hinf I及Rsa I限制酶分解DNA，再進行1%瓊脂電泳。接著，將DNA片段轉移至Hybond N+尼龍膜(Amersham)上，在65℃與探針(probe, TTAGGG repeats)雜交，其中探針以α-32P-dCTP標示，標示則使用Ready-To-Go labeling beads(Amersham Biosciences,UK)。端粒長度的評估，是以南方墨點法(Southem blot)，分析以限制酶分解後的遺傳DNA末端限制片段(terminal restriction fragments,TRFs)的長度。所得到的TRFs具有一致的端粒重複序列(TTAGGG)及退化性重複序列(degenerate repeats)，但不具有染色體次端粒末端區。限制酶處理後，以電泳將DNA片段分離，並進行墨點法。用與端粒重複序列互補，且有標示的核酸序列，與DNA雜交，使TRFs可見於膜上，最後，比較TRFs與標準DNA的長度，即可得知TRFs的長度分佈。實驗結果顯示，第三代及第七代人類滋養層細胞(PV 02細胞株)的端粒長度，分別為8.0 kb及7.8 kb。先前有報導說，端粒的長度會隨著體外細胞分裂的次數或體內老化(S10,S11)而減短。雖然在目前並未觀察到顯著性的端粒長度縮減，但我們並不能排除四代的繼代培養後，端粒長度縮減200 bp的可能性，而此縮減可能是先前端粒長度已不同，或細胞與細胞間的端粒長度縮減速度不同；這方面還需要進一步的實驗證實。

以動物體內實驗檢視，是否細胞具有如hES一樣，產生良性畸胎瘤(teratoma)的能力。將培養的第三代PV 02細胞株(10⁴-10⁵)，以皮下注射方式打入免疫缺陷小鼠(SCID mice)(n=4)的後大腿處。組織病理實驗結果顯示，在注射後第8到10週，即產生黏液狀細胞嵌合反應(圖3 a)，此顯示細胞在胚胎形成時具有類似hES細胞的特性。在這之間，我們分析細胞第3代、第10代，及第15代的染色體(46XY)，結果皆具正常且一致的染色體組型 (12)(圖3 b)。而且我們也測量第3代與第7代細胞(PV02)的染色體端粒長度，結果顯示，其染色體端粒長度分別為8.0 kb及7.8 kb(12)；既然染色體長度沒有縮短，那麼持續的細胞培養，細胞內的遺傳訊息並不會遺失(圖3 c)。經由以上對染色體型組及端粒長度的觀察，相信人類滋養層幹細胞存在於早期滋養葉絨毛，且展現類似hES/hEG細胞的特性。這也暗示了，人類滋養層幹細胞可能為人類臍帶血幹細胞的祖源細胞。而且，源於臍帶血的間葉幹細胞(mesenchymal stem cells)及人類滋養層幹細胞，在基因表現及多元分化的能力上皆具有相同的特性；因此，本發明可應用在細胞培養、組織移植、藥物發明，及基因療法等領域。

接下來實驗的目的，是要確認人類滋養層幹細胞在細胞培養中具多能分化的能力。Oct 4為一轉錄分子(transcription factor)，且為決定多能分化能力的關鍵。先前的報告指出，Oct 4缺陷的胚胎仍能發育至囊胚期，但內層細胞質塊細胞不具有多能分化的能力，導致原胚生殖細胞(primordial germ cell)進入細胞凋亡(apoptosis)，而不會分化成滋養外胚層(J.Kehler et al.,EMBO Rep.,5,1078(2004))；相反的，內層細胞質塊細胞不會沿著胚胎外滋養層分化(J.Nicholas etal.,Cell,95,379(1998))。其他的研究報告則暗示，人類(B.Gerami-Naini et al.,Endocrinology,145,1517(2004))及小鼠(J.Rossant,Stem Cells,19,477(2001))的胚胎幹細胞，經由改變培養的條件以及Oct 4的表現量，可以轉變成滋養層譜系細胞。這結果衍伸出有趣的假設，寫成方程式Oct4 ON=ES，Oct4 OFF=TS，且扮演重要角色(J.Rossant,Stem Cells, 19,477(2001))。不僅如此，以纖維母細胞生長因子4(fibroblast growth factor 4,FGF 4)處理囊胚，可以增加滋養外胚層細胞數目(N.Chai et al.,Dev.Biol.,198,105(1998))。以RT-PCR檢測人類滋養層細胞中相關的基因Oct 4、fgfr-2，及FGF4的表現，發現第六代人類滋養層幹細胞(PV 07細胞株)表現Oct 4、fgfr-2，及FGF4(圖3 d)，而fgfr-2的表現只有在胎盤組織中，Oct 4及FGF4則否。由於加入bFGF到人類滋養層幹細胞中可抑制Oct 4及fgfr-2的表現量，這顯示bFGF與基因開關的調節有關。

實施例五

帕金森氏症及人類滋養層幹細胞移植的動物模式

以免疫細胞化學法進行TH分析：

以三聚甲醛(4%)固定細胞，PBS清洗細胞，加入0.1M PBS，於4℃的環境下放置隔夜。加入阻隔溶液(50 ml 0.1 M PBS,0.05 g sodium azide,1% horse serum,and 10% Triton X-100)，室溫下作用1小時後，再次清洗細胞。加入一級抗體(Sigma)：TH-2(1：200稀釋)或TH-16(1：200稀釋)，作用2小時，之後以PBS清洗。加入以FITC或PE標示之anti-mouse IgG(Sigma)，作用1小時，再以PBS將細胞徹底洗淨，之後進行免疫螢光分析。

以F1B-GFP報導質體(reporter plasmid)轉染人類滋養層幹細胞：

F1B-GFP報導質體由Dr.Chiu,I.M.提供。簡言之，將人類滋養層幹細胞以F1B-GFP及pSV2neo(比例10：1，總體積50 μl)一同轉染。將此DNA混合物緩慢地加入含有30 μl DOTAP微脂粒轉染溶劑(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)，以及70 μl HBS(Gibco,867 g HaCl in 80 ml Milli Q water+2 ml 1M HEPES solution,pH 7.4,at 4 oC)的100 μl DOTAP溶液中，並於室溫下作用15分鐘。以PBS清洗細胞，再將細胞與此DNA混合物溶液作用，經過24小時後，以G418(400 μg/ml)(Roche Applied Science)篩選穩定表現基因的細胞株，並且培養細胞2-3週，直至細胞群落形成。將對G418有抵抗性的細胞混合在一起並使其溶解，以西方墨點法(Western blot)分析細胞溶解物，其中用辨識GFP的單株抗體(Stratagene,La jolla,CA)來量化轉染細胞表現GFP的比例。在後續的細胞培養中，感染的人類滋養層幹細胞以甲醇固定(10分鐘)，用免疫螢光法檢測GFP在其中的表現；本實驗細胞轉染成功的比例在95%以上。

帕金森氏症及人類滋養層幹細胞移植的大鼠模式

使用Sprague-Dawley大鼠(250-350g)作為以6-OHDA傷害大鼠的半側帕金森氏症(PD)動物模式，本實驗流程為台大醫學院醫學倫理委員會認可。手術步驟先前已敘述過，簡而言之，以水化氯醛(chloral hydrate)(4%, 1cc/100 gm of body weight)麻醉大鼠，注入6-hydroxydopamine(Sigma)到右側中前腦束(median forebrain bundle)(AP 2.8/Lat 2.2/Dep 8.0 mm)，注射的速率為1 μg/0.5 μl/min，持續8分鐘(injection pump：CMA 100)，以造成實體定位損傷(stereotaxic lesion)；10分鐘後移除導管。兩週後進行細胞移植，移植後20分鐘進行apormorphine誘發的旋轉測試(25mg/kg,s.c.)，並紀錄大鼠旋轉的次數，五分鐘內旋轉數目超過25次的才被列入實驗紀錄，並分別在第0、3、6、9、12週測定。大鼠分為三組，組a的大鼠注射含質體，但不經過誘發的人類滋養層幹細胞；組b的大鼠注射含質體，且已誘發的人類滋養層幹細胞；組c的大鼠則注射PBS，作為對照組。細胞由右側橫狀體兩處注入(第一處：AP+1/Lat+2.7/Dep 6.4 mm；第二處：AP+0/Lat+2.7/Dep 6.4 mm)。

動物體內功能性測試，是檢驗源自人類滋養層幹細胞的中性幹細胞，在帕金森氏症中是否扮演重要角色。以F1B-GFP報導質體轉染人類滋養層幹細胞，成功率達95%以上(圖4 a)，我們運用特定的單株抗體偵測tyrosine hydroxylase-2或-16的存在。免疫細胞化學實驗中觀察到，受誘發的幹細胞表現TH-2的比例超過95%(圖4 b)，且帶有F1B-GFP報導質體的人類滋養層幹細胞，在誘發後TH-16的表現也超過95%(圖4 c、d、e)。帕金森氏症的動物模式常被用來評斷移植物，植入到橫狀體後產生的效果(Dunnett,S.B.& Bjorklund,Nature 399,A32-A39(1999)。所以，6-OHDA單測注射到大鼠的中前腦束(圖4 f、g、h，上面)，會造成永久性傷害黑質體 緻密區(SN pars compacta)(snc)的產多巴胺神經(Iancu,R.et al.,Behav Brain Res 162,1-10(2005))(圖4 f、g，下面)。兩週後，我們將有誘發及無誘發的轉染人類滋養層幹細胞(圖4 g、圖4 h)，植入橫狀體區域內；磷酸緩衝溶液則作為對照組(圖4 f)。之後進行apormorphine誘發的旋轉測試，方法如前文所述²⁸。實驗結果顯示，植入未誘發的人類滋養層幹細胞後，對側旋轉(contralateral rotations)的總數大大地減少(圖4 k)，且最後在第12週時，減少至基準點(25 turns/5 min)(Repeated-measure ANOVA test：p=0.001)。在維生素甲酸誘發組中，最好的康復期是在第六週(p<0.05)。然而，在第12週，誘發組及對照組並未有任何差異。所有的大鼠在第18週後即殺掉，其腦部切片接著進行免疫組織染色以及免疫細胞化學實驗，分析黑質紋狀體路徑(nigrostriatal pathway)的轉染人類滋養層幹細胞。受損的紋狀體區及黑質體緻密區中，誘發的人類滋養層幹細胞及對照組細胞，皆偵測不到TH(圖4 f、g)。但有一個重要的意外發現，在不誘發的人類滋養層幹細胞組中，受損的紋狀體區及黑質體緻密區中有TH存在(圖4 h)。轉染的人類滋養層幹細胞及TH存在於受損的紋狀體區(圖4 i)及黑質體緻密區中(圖4 j)，這提供直接證據，證明所移植的人類滋養層幹細胞，不但能在原位，在這特殊的微環境中，分化成產多巴胺神經細胞，還可以修復6-OHDA所造成的功能性傷害。此發現與先前一致認為，6-OHDA所造成的傷害為永久性的觀念相抵觸。相反地，人類滋養層幹細胞有能力循著黑質紋狀體路徑，往上游移動，就如同大自然中，鮭魚回流一樣。然而，這是如何達成的，仍有待進一步釐清。我們的發現證明了，人類滋養層幹細胞可做為hES及hEG的替代品， 以規避使用胚胎幹細胞作為人類幹細胞研究，及以基因及細胞療法所延伸的道德倫理難題，

實施例六

(A)人類滋養層幹細胞分化為類β-胰島細胞之方法

人類滋養葉絨毛由早期子宮外孕(懷孕6-8週)輸卵管中取得，其純化方法同前文所述。β-胰島細胞的分化，採用兩步驟的實驗方式，基本上是利用葡萄糖誘發胰島素分泌(Wilcox G.,Clin Biochem Rev.,2005；26：19-39)。簡言之，細胞(1.4 x 10⁵)在LDMEM-mn培養液中，於37℃，5% CO²的環境下作用24小時，使其進行前誘導，LDMEM-mn培養液為含有1 mM β-mercaptoethanol(Sigma)、10 mM nicotinamide(Sigma)的基礎DMEM培養液(5.5 mM glucose,Gibco)。之後的誘導是將細胞養於HDMEM-mn培養液中，HDMEM-mn培養液為含有15 mM glucose、1 mM β-mercaptoethanol、10 mM nicotinamide的HDMEM培養液(Gibco)。

(B)人類滋養層幹細胞分化為類β-胰島細胞之證據

細胞培養

在誘導之前，將人類滋養層幹細胞(1.4 x 10⁵、PV 07、第五代細胞)培養於基礎DMEM培養液(Gibco)中兩天，使其狀態穩定。進行前誘導之前，細胞的型態呈現長型的紡垂狀(圖5 a)，接著，更換為LDMEM-mn培養液培養24小時，進行前誘導。第6小時時，細胞會凝聚在一起，形成不同的多囊體(圖5 b)。細胞的型態，逐漸由紡垂狀改變為圓形及/或橢圓形，且最後，前誘導24小時後，趨向於形成多個分散的葡萄狀細胞群(圖5 c)。當換成高葡萄糖狀態培養液，如以HDMEM-mn培養液培養6小時，獨特的葡萄狀細胞群會再第3小時後出現。細胞群聚顯示了，作用6小時後，細胞會趨向於連結在一起，形成一網狀結構(圖5 d)。誘導6小時是基於先前的經驗，人類滋養層幹細胞在高葡萄糖環境中(20-22 mM)8-10小時即死亡；造成細胞損害的原因可能為葡萄糖毒性作用(glucotoxicity)。獨特的葡萄狀細胞群聚可能為，胰臟形成的初期階段。實驗結果顯示，已分化的人類滋養層幹細胞具有分泌胰島素的能力，在突然給予大量葡萄糖後，具有葡萄糖誘發性胰島素釋放的特徵(圖5 h)。在此期間，於不同時間點收集少量(0.5 ml)的細胞培養液，以放射免疫分析法來測量胰島素的含量，並以商業套組(Diagnostic Products Corp.,Los Angeles,CA)，依照說明書指示進行實驗。結果顯示，在給予大量葡萄糖誘導後，培養液中有非常少量的胰島素存在，這反映了先前於人類β-胰島細胞觀察到的分泌方式(José et al.,The Journal of Physiology(1999),520.2,pp.473-483)，胰島素以兩種形式存在細胞內，初形成的以及儲存的形式。

將細胞培養液換回基礎DMEM培養液，培養18小時。我們發現，纖維組織母細胞產物會由葡萄狀細胞群聚中產生(圖5 e)；培養第2及第4天後此去分化的現象更為明顯(圖5f、g)，但此去分化的機制目前仍不明瞭；目前實驗中細胞分化及去分化的型態，非常獨特且具重複性。

本發現使人類滋養層幹細胞，不只可作為研究早期胰臟生長中β-胰島細胞的模式，來研究胰臟內分泌中，已分化的β-胰島細胞的訊息傳遞是如何調節胰島素，還可作為研究胰臟功能不全的分子階段疾病產生模式。最近的報告指出，在鼠科動物中，副甲狀腺素相關蛋白(parathyroid hormone-related protein)可調節次級滋養層巨細胞的改變，此細胞分化時也會著床進入子宮(El-Hashash and Kimber,Dev.Biol.2005Dec 19；[Epub ahead of print])。實驗結果暗示了，在人類滋養層幹細胞分化及去分化期間，胰島素可能扮演著調節細胞改變的重要角色。另一份報告揭露，在第一型糖尿病中，Notch路徑為β-胰島細胞的媒介物，抑制細胞分化作用於細胞分裂上，但無法抑制已分化終結的β-胰島細胞(Darville MI et al.,Biochem Biophys Res Commun.,2006；339：1063-8)。人類滋養層幹細胞的去分化現象，可作為進一步研究第一型糖尿病中Notch路徑的模式，甚至，細胞去分化現象可引發抗癌效應，使細胞對於癌症具有抵抗性(Scott RE et al.,Differentiation.,2005；73：294-302)，但此現象的分子機轉尚不明瞭。人類滋養層幹細胞的去分化現象，也可用來研究癌症機轉。

類β-胰島細胞中胰島素相關基因的表現

為進一步確定與人類β-胰島細胞在生物特徵上的相似性，我們以RT-PCR方法，分析人類滋養層幹細胞中與胰神經內分泌活性相關基因的表現；使用的引子序列如表3所列。

RT-PCR實驗方法如前文所述，實驗的對象包含胰島素(β-胰島細胞所表現)、Pdx-1(β-胰島細胞的轉錄分子)、somatostatin(delta-胰島細胞所表現)、CK19(胰島細胞以及導管細胞的前驅物)、neurogenin(神經再生相關、4種胰臟內分泌細胞的共同前驅物)、neurofilament(神經細胞的結構蛋白)、nestin(中間蛋白絲(intermediate filament)的結構蛋白)、CD133(確定神經幹細胞轉變為神經原及膠質細胞(glial cell))、MAP-2(樹突(dendrite)特定蛋白)、MPB(間膠質細胞(oligodendrocyt)所產生，圍繞在髓鞘的蛋白)、GFAP(星狀細胞(astrocyte)特定蛋白)，及Oct-4(細胞增殖的獨特轉錄分子)。實驗結果(圖6)顯示，誘導後Pdx-1、neurogenin，及nestin即表現。CK19、somatostatin、neurofilament、CD133、MAP-2，及Oct-4在藥物誘導後，和對照組比較有較強的基因表現。然而，GFAP及MPB在本實驗中不表現。這些結果顯示，已分化的類胰島細胞表現大多數的基因，與人類胰島相似，為一複雜的神經內分泌器官。

表3 引子序列

類β-胰島細胞中胰島素相關蛋白之免疫細胞化學分析

為進一步釐清此想法，將已分化的人類滋養層幹細胞培養在六孔的玻片上，以37℃、5%CO₂的環境培養24小時。細胞貼附於玻片後，進行免疫細胞化學實驗。以PBS清洗細胞，以4%三聚甲醛於4℃固定細胞隔夜，加入0.4% Triton X-100作用20分鐘，使細胞穿孔。為減少非特異性的抗體結合，細胞先與阻隔溶液(10% BSA in PBS)作用20分鐘，再與一級抗體作用60分鐘；所使用的一級抗體為：goat anti-insulin(1：100 dilution,Santa Cruz)、rabbit anti-glucagon(1：50 dilution,Santa Cruz)、goat anti-IGF1(1：50 dilution,Santa Cruz)、mouse anti-tau(1：50 dilution,Santa Cruz)、goat anti-MAP-2(1：50 dilution,Santa Cruz)，及goat anti-amylase(1：50 dilution,Santa Cruz)抗體。之後以PBS-Tween 20緩衝溶液清洗細胞3次，每次5分鐘，再加入二級抗體作用60分鐘；所使用的二級抗體為：anti-goat IgG Texas red-conjugated antibody(1：500,dilution,Santa Cruz)、anti-rabbit IgG FITC-conjugated antibody(1：500 dilution,Santa Cruz)、anti-goat IgG FITC-conjugated antibody(1：500,dilution,Santa Cruz)、anti-mouse IgG FITC-conjugated antibody(1：500,dilution,Santa Cruz)。再次以PBS-Tween 20緩衝溶液清洗細胞3次，每次5分鐘，最後加入100ng/ml DAPI(Sigma)作用10分鐘復染細胞，使細胞核便於辨認，並以螢光顯微鏡(Provis,Olympus)檢驗螢光強度。實驗結果再次確定，人類滋養層幹細胞可分化為類胰島細胞，並且表現胰島素、類胰島素生長因子(insulin-like growth factor-1,IGF-1)、升糖素(glucagon)、澱粉水解酵素(amylase)、tau，及MAP-2(圖7)。

(C)實驗室內以膠原模式建立3D的β-胰島組織

根據細胞培養時觀察到的細胞形變化，我們了解，突然將人類滋養層幹細胞由低葡萄糖(5.5 mM)環境換至高葡萄糖(15 mM)環境，會對及造成壓力。為避免這種效應，我們以膠原(collagen)為基質(matrix)的Transwell培養皿(Corning Incorp.,Corning,NY)培養細胞，進行此實驗的2個理由如下：1.此方法可以探究人類滋養層幹細胞在增殖時的，侵入基質的能力；2.此方法可以知道，在誘導後，培養在膠原基質上，是否會促進類胰島細 胞的生長。因此，我們以vitrogen膠原(1：5 dilution,Cohesion,Palo Alto.CA)與大鼠尾巴膠原(3 mg/ml of buffer solution,c7661,Sigma)以1：1(v/w)的比例混合於酸性的溶液(0.012 N HCl)中，並覆蓋(1.5 ml)在Transwell培養皿的上層20至30分鐘，以形成一層膠層。測試時，Transwell培養皿(直徑2.4 cm,孔洞大小0.4 μm)下層放HDMEN-mn培養液(葡萄糖18 mM)，上層放LDMEN-mn培養液(葡萄糖5.5 mM)。在前測試中，大約在4小時，葡萄糖濃度達到平衡狀態，其濃度為455 mg/dl；因此我們先將有誘發及無誘發的人類滋養層幹細胞(5 X 10⁵)培養在膠原體上，再移到Transwell中，實驗方法同前文所述。受藥物誘發(圖8 a)與未誘發(圖8 b)的人類滋養層幹細胞，皆在4小時達到葡萄糖濃度平衡。兩者包埋在膠原裡的細胞皆形成3-D的細胞團塊(圖8 c)，且我們收集兩者的細胞培養液，以放射免疫分析法測定其中胰島素的含量。每個膠塊皆以4%三聚甲醛在4℃下固定至隔夜，並以免疫組織化學法分析其中的胰島素。

組織學實驗結果顯示，未受藥物誘發的對照組膠塊中，紡錘狀的細胞在增殖時呈現出細胞核濃染(hyperchromatic nuclei)的狀態，且細胞核與細胞質皆具有空泡(vaculoles)，除此之外，並顯現了一種不成熟的外觀，其為約10層的細胞與大量胞外基質所組成的條狀薄片的結構(圖9 a)。細胞垂直排列，上層呈現平坦，像傘狀外觀。中間區域的細胞隨意且不規則地排列，而最下層靠近膠原的細胞呈垂直排列，顯示細胞可以穿過膠原體。

然而，受藥物誘發的人類滋養層幹細胞膠塊中，細胞組合物較為緊密，且細胞分化良好，此由較少的細胞質空洞與細胞基質可以證明(圖9 b)，這種3-D結構的形成機轉目前尚不清楚；不過，近期的研究顯示類胰島素生長因子1(insulin-like growth factor-1)可以刺激瓣狀偽足(lamellipodia)的形成，並促進滋養層貼附於胞外基質，這是透過活化那些在著床時必須被活化的吸附分子(adhesion molecular)(Kabir-Salmani et al.,2002)。本實驗中，細胞培養液中的胰島素以放射免疫化學法測定，含量約為15-27 mIU/ml之間。

免疫組織化學分析的實驗結果顯示，未受藥物誘發的人類滋養層幹細胞，細胞質內不具有胰島素(圖9 c)。然而，在受藥物誘發的人類滋養層幹細胞內，胰島素明顯地存在於細胞質中(圖9 d)。正常的胰臟組織(圖9 e)及胰島瘤(圖5 f)作為實驗正對照組。更重要的是，此實驗證明了人類滋養層幹細胞，在體外可形成類胰島組織，這暗示了，人類滋養層幹細胞可產生β-胰島組織，在未來可提供人類第一型糖尿病的臨床應用。

以證實人類滋養層幹細胞可以分化為類β-胰島細胞，並具分泌胰島素的能力。結合人類滋養層幹細胞分化與去分化的獨特生物特性與3-D細胞模式，可作為下列的研究平台：(1)作為研究細胞分化表現型機制的平台，例如研究第一型糖尿病中胰臟的生長、評估藥物在早期胚胎著床的效應、研究胎盤功能發展與胎盤功能不全的關係、糖尿病懷孕、巨大胎兒症 (macrosomnia)、早期懷孕流產(early pregnancy loss)、遺傳病變(genetic abnormalities)，及絨毛膜癌(choriocarcinoma)。(2)胰組織及/或器官的建立，可作為移植治療第一型糖尿病的組織或器官來源。

圖1 為早期間葉絨毛(mesenchymal villi)及足月胎盤(term placenta)中的人類滋養層幹細胞。(a)為滋養層細胞中的tEBs。(b)以流式細胞儀分析tEBs中SSEAs與Thy-1的表現。以免疫細胞化學法分析，SSEA-1表現於細胞質中(c)，SSEA-3表現於細胞核中(d)，SSEA-4表現於細胞膜上(e)。以免疫組織化學法分析，早期滋養葉胞層中，SSEA-1主要表現在細胞膜上，少數表現在細胞質中(f)，SSEA-3表現於細胞核中(d)，SSEA-4表現於細胞膜上(h)。SSEA-1表現於足月絨毛中(i)，SSEA-3(j)與SSEA-4(k)表現於未成熟的中間絨毛基質(intermediate villous stroma)。SSEA-1表現於輸卵管組織靜脈中的細胞(l)及臍帶靜脈中(m)。SSEA-3(n)與SSEA-4(o)表現於臍帶靜脈中的細胞。

圖2 為人類滋養層幹細胞於實驗室中分化為三胚胎層中的特定細胞。(a)以流式細胞儀分析源自於tEBs的間葉幹細胞(mesenchymal stem cell)，間葉幹細胞表現CD 44及CD 90(上圖)，造血幹細胞(hematopoietic stem cell)表現CD 34及CD 4(下圖)。成骨分化(osteogenic differentiation)以下列染色法確定：Alizarin red S染色法(b)、von Kossa染色法(c)，及鹼性磷酸酶活性染色 (alkaline phosphatase activity stain)(d)；軟骨生成以Alician blue染色法確定(e)；骨骼肌生成以肌球蛋白重鏈染色法(myosin heavy chain stain)確定(f)；脂肪生成以Oil red O染色法確定(g)。(h)為神經幹細胞：以流式細胞儀測定(上圖)neurofilament(左圖)、nestin(中間)，及GFAP(右圖)。以藥物誘導後第10日neurofilament及GFAP的反應達到高峰，而nestin的反應較微弱(下圖)。(i)為以RT-PCR分析基因表現：osteopontin及osteocalcin基因表現證明成骨細胞存在；perlecan及collagen type II表現證明軟骨細胞存在；myoD1表現證明肌原細胞存在；PPARγ-2及adipsin表現證明脂肪細胞存在；PDX-1表現證明β-胰島細胞存在；偵測到的基因在誘導後7日表現。

圖3為人類滋養層幹細胞在體內的特徵與功能。(a)人類滋養層幹細胞在SCID小鼠中引發嵌合反應(chimeric reaction)；肌肉纖維(空心箭頭)中有(上方)針徑(needle tract,NT)及(下方)怪異的細胞(黑色箭頭)。(b)為人類滋養層幹細胞的46個正常染色體組型(XY)。(c)為人類滋養層幹細胞第3代的端粒長度(8.0 kb)及第7代的端粒長度(7.8 kb)。(d)以RT-PCR分析人類滋養層幹細胞的功能；lane 1：初級培養的人類滋養層幹細胞表現Oct4、fgfr-2，及FGF4；lane 2：加入bFGF(10 ng/ml)於人類滋養層幹細胞(第6代)中，Oct4及fgfr-2的表現量降低；lane 3：人類滋養層幹細胞(第6代)中不加bFGF；lane 4：fgfr-2只在足月胎盤細胞中表現；β2-microglobulin為實驗中cDNA的正對照組。

圖4為人類滋養層幹細胞產生之神經幹細胞功能評定。(a)為轉染的人類滋養層幹細胞，表現F1B-FGP(綠色)。(b)為受到誘導的神經幹細胞，表現TH-2-FITC(綠色)。(c)受到誘導的神經幹細胞，表現F1B-FGP(綠色)。(d)為F1B-FGP轉染的人類滋養層幹細胞，表現TH-16-PE(紅色)。(e)為受誘導的神經幹細胞，同時表現TH-16-PE(紅色)及轉染的F1B-FGP(綠色)。以大鼠進行單側(右側)，6-OHDA損傷之帕金森氏症疾病模式，以免疫組織化學方式分析6-OHDA所造成的損傷，結果顯示，與產生反應(深咖啡色)的對照組區域比較，受傷的紋狀體區(striatum)(str，上方，f)、丘腦下核(subthalamic nucleus)(stn，下方，g)，及黑質體緻密區(substantia nigra compacta)(snc，下方，未顯示)，偵測不到TH存在。(f)C組，以PBS處理(gr.c)，(g)B組，以誘導的、轉染FGP的人類滋養層幹細胞處理(gr.b)，(h)A組，以未誘導的、轉染FGP的人類滋養層幹細胞處理(gr.a)，在受損的紋狀體區(上方，右)有TH存在。免疫螢光法檢測發現，FGP轉染的人類滋養層幹細胞(green)群，散落在先前受損的紋狀體區(i)中，而黑質體緻密區(substantia nigra compacta)也有FGP轉染的人類滋養層幹細胞(green)群存在(j)。箭頭所指處為針徑(needle tract)。(k)為apomorphine誘發的旋轉測試結果。半側帕金森氏症大鼠，以誘發轉染FGP之人類滋養層幹細胞處理(gr.b，實心三角形)，也以未誘發轉染FGP之人類滋養層幹細胞處理(gr.a，實心圓形)。注射PBS為對照組(gr.c)。再以ANOVA重複測試後，以LSD post hoc比較，實驗具實質意義(*：p<0.05)，第6週時，p=0.037(a vs. c)與p=0.008(b vs. c)；第9週時，p=0.019(a vs. c)；第12週時，p=0.005(a vs. c)與p=0.018(a vs. b)。

圖5為人類滋養層幹細胞在藥物誘導後，細胞轉變為類胰島細胞時分化及去分化的型態。(a)為藥物誘導前，呈現纖維母細胞的型態。(b)為以LDMEM-mn培養液前誘導6小時，呈現多囊特徵，(c)為前誘導24小時後，形成葡萄狀細胞群聚。(d)為以HDMEM-mn培養液誘導6小時，葡萄狀細胞群聚更為明顯。細胞中纖維母細胞產物在第18小時形成(e)，培養於基礎培養液第48小時(f)及第96小時(g)，細胞呈現去分化的狀態。(h)為已分化的人類滋養層幹細胞分泌至培養液中的胰島素，以HDMEM-mn培養液誘導6小時後，可達測量高峰。

圖6為以RT-PCR偵測受藥物誘導及未誘導的人類滋養層幹細胞，分泌胰島素相關的神經內分泌組合物結果。每一欄左側為前誘導的細胞，右側為誘導30小時的細胞。

圖7為已分化的人類滋養層幹細胞中，胰島素相關蛋白的免疫細胞化學實驗結果。細胞內偵測到(a)胰島素、(b)類胰島素生長因子1(IGF-1)、(c)升糖素(glucagon)、(d)澱粉水解酵素(amylase)、(e)tau，及(f)MAP-2。

圖8為Transwell培養皿中人類滋養層幹細胞的葡萄糖平衡狀態。(a)為藥物誘導的人類滋養層幹細胞，而(b)為未誘導的人類滋養層幹細胞，作為實驗對照。(c)箭頭所指為膠原基質上所形成的3-D細胞團塊，約7mm。

圖9為組織中的胰島素，產生自藥物誘導的人類滋養層幹細胞。大約10層的細胞層作為組織染色(hematoxylin eosin stain)對象，其細胞層產生自(a)未誘導的人類滋養層幹細胞，作為實驗對照組，(b)誘導的人類滋養層幹細胞。對照組無胰島素反應(c)，實驗組則有(d)。作為胰島素染色的正對照組為正常的胰臟組織(e)及胰島瘤(insulinoma)(f)。

圖10為腹腔鏡觀察到的子宮外孕，受孕處在輸卵管(a，左)，約七週大；切碎的滋養葉絨毛用來進一步製備成細胞株(a，右)。(b)及(c)為免疫組織化學法，分析SSEA在滋養葉絨毛及輸卵管組織的表現。(b)為表現SSEA-1的細胞，存在於鬆軟的中胚層基質(黑箭頭)、微血管壁(白箭號)，及微血管內腔(白箭頭)。SSEA-3及SSEA-4則不表現。(c)為SSEA-1，表現於輸卵管組織中的細胞(咖啡色)。

<110> 李昭男 李東穎 李育達

<120> 人類滋養層幹細胞及其應用

<130> KP-10105

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<170> PatentIn version 3.5

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Claims (19)

1. 一種人類滋養層幹細胞之分離製劑，其滋養層幹細胞來自子宮外孕輸卵管中之滋養層組織，其中該滋養層幹細胞表現SSEA-1、SSEA-3與SSEA-4標誌以及Oct 4、fgfr-2與FGF4之基因標誌，並且具多能性分化能力，以及正常染色體組型。
2. 根據申請專利範圍第1項之製劑，人類滋養層幹細胞保有潛在性多元分化之能力。
3. 根據申請專利範圍第1項之製劑，細胞於體外後繼培養至第15代時，仍具有正常染色體組型。
4. 根據申請專利範圍第1項之製劑，其中該人類滋養層幹細胞能分化成為一會表現CD44以及CD90細胞表面標誌的間葉幹細胞。
5. 根據申請專利範圍第1項之製劑，可做為人類細胞分化、基因療法，或細胞基礎療法的模型。
6. 根據申請專利範圍第1項之製劑，其細胞可分化為內胚層、中胚層，以及/或外胚層之衍生物。
7. 根據申請專利範圍第6項之製劑，其衍生物為成骨細胞、軟骨細胞、肌原細胞、脂肪細胞，以及/或神經原幹細胞。
8. 根據申請專利範圍第6項之製劑，其細胞基因有不同之調控。
9. 根據申請專利範圍第8項之製劑，基因調控是由bFGF引發。
10. 一種用於治療或預防一神經退化性疾病之藥學組成物，係包含如申請專利範圍第1項的人類滋養層幹細胞之分離製劑。
11. 根據申請專利範圍第10項之藥學組成物，其中該神經退化性疾病為帕金森氏症、抗丁頓氏舞蹈症、阿茲海默症或化學藥劑引發之神經損傷。
12. 根據申請專利範圍第10項之藥學組成物，其可進一步包含一種選自於由下列所構成之群組中的緩衝溶液：生理食鹽水、PBS以及培養液。
13. 根據申請專利範圍第12項之藥學組成物，其中該緩衝溶液用於維持人類滋養層幹細胞之生物活性。
14. 根據申請專利範圍第10項之藥學組成物，其可進一步包含一種選自於由下列所構成之群組中的治療性化合物：藥物、化學物以及抗體。
15. 根據申請專利範圍第10項之藥學組成物，其投藥方式為經由注射、移植，或外科手術。
16. 一種用於治療糖尿病之藥學組成物，係包含如申請專利範圍第1項的人類滋養層幹細胞之分離製劑。
17. 根據申請專利範圍第16項之藥學組成物，其可進一步包含一藥學上可接受之藥物載體。
18. 根據申請專利範圍第17項之藥學組成物，其中該藥學上可接受之藥物載體用於維持幹細胞之生物活性。
19. 根據申請專利範圍第16項之藥學組成物，其投藥方式係經由注射、移植，或外科手術。