KR102120378B1 - 암 오가노이드의 제조 방법 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 암 세포와 신경능선 세포(neural crest cell)를 공배양(co-culture)하는 단계를 포함하는 암 오가노이드의 제조 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 방법에 의하는 경우 실제 암 조직과 유사한 형태와 크기를 가지는 3차원 암 오가노이드를 제작할 수 있으며, 그 수율도 혁신적으로 개선할 수 있게 되었다. 더욱이, 본 발명에 따라 제조된 암 오가노이드를 이용하는 경우 암의 병태 생리 규명이나, 특정 암 환자에 대한 연구를 가능하게 할 뿐만 아니라, 암 치료를 위한 항암제를 선별하는 데에도 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에 의하는 경우 실제 암 조직과 유사한 형태와 크기를 가지는 3차원 암 오가노이드를 제작할 수 있으며, 그 수율도 혁신적으로 개선할 수 있게 되었다. 더욱이, 본 발명에 따라 제조된 암 오가노이드를 이용하는 경우 암의 병태 생리 규명이나, 특정 암 환자에 대한 연구를 가능하게 할 뿐만 아니라, 암 치료를 위한 항암제를 선별하는 데에도 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 암 오가노이드의 제조 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
암 연구에서는 환자의 특성을 잘 나타내는 암 모델이 중요하다. 지금까지 생체 내(in vitro)에서 주로 이용되었던 암 모델은 암 세포주이다. 암 세포주는 환자의 암 조직에서 유래한 암 세포를 2차원 배양으로 적응시켜 만든 모델로, 실험적으로 다루기 쉬울 뿐만 아니라, 한꺼번에 많은 유전적, 약물학적 스크리닝을 하기에 적합하다는 장점이 있다. 그러나, 암 조직에서 암 세포로 구축되는 성공률이 저조하며, 환자 유래 암 세포를 긴 시간 동안 2차원 계대 배양한 결과, 환자의 암에서 나타나는 이질성이나 돌연변이와 같은 조직학적 구조들에서 발생할 수 있는 특성이 사라지므로, 이질성을 잃은 세포주를 이용하여 면역결핍 쥐에 주입하여 암 모델을 만들더라도 원래 환자의 특성을 나타낼 수 없다는 문제점이 있다.
암 세포주의 이러한 단점을 보완하는 모델로서, 생체 내(in vivo)를 기반으로 하는 환자 유래 암 이식모델(PDX: patient-derived xenograft)이 개발되었다. PDX 모델은 환자의 암 조직 일부를 직접적으로 면역결핍 쥐에 이식하는 방법을 사용한다. 상기 모델에서는 환자 암 조직에서 나타나는 구조, 전이 및 다양한 유전자 발현이 잘 나타날 뿐만 아니라, 임상에서의 약물 반응성을 미리 예측할 수 있는 모델로 평가된다. 그러나, PDX 모델을 성공시키는데 짧게는 2개월에서 길게는 6개월의 시간이 소요된다는 단점이 있어, PDX 모델은 환자 맞춤형 항암제를 테스트하는 목적으로서 적합하지 못하다는 판정을 받았다. 뿐만 아니라, 상기 PDX 모델은 이종간의 오염이 발생하는 단점이 있으며, 특정 환자의 암 모델 유지 및 이용을 위하여 여러 계대를 거쳐 배양하면서, 본래 인간의 조직 환경을 점점 잃게 되는 문제가 나타났다.
이에 최근에는 암 환자로부터 분리한 암 조직을 이용하여 암 오가노이드를 제작하려는 시도가 있지만, 일반적으로 암 세포, 특히 대장암 세포는 배아줄기세포나 유도만능줄기세포 혹은 성체줄기세포보다 기관(organ)의 크기와 구조를 개발하는데 어려움이 있었다. 또한, 기존에 대장암 세포주를 이용한 오가노이드 개발 방법은 암 조직만을 포함한 조직으로서, 실제 생체 내(in vivo) 상황을 모사하는데 한계가 있었고, 조직 분화성이 낮아서 대장암 오가노이드의 제작 수율이 낮고 크기가 불량한 단점이 있었다.
본 발명의 일 목적은 암 조직과 유사한 형태와 오가노이드로서 충분한 크기를 가지는 3차원 암 오가노이드를 높은 수율로 배양하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 방법에 따라 제작된 암 오가노이드가 이종 이식된 동물 모델을 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에서 제공하는 암 오가노이드 및/또는 이종 이식 동물 모델을 이용하여 항암제 스크리닝 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에서 제공하는 암 오가노이드 및/또는 이종 이식 동물 모델을 이용하여 항암제 치료 효능 분석 방법을 제공하고자 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 암 오가노이드(organoid)를 제조하는 방법과 이에 의해 제조된 암 오가노이드의 다양한 용도에 관한 것이다.
암 오가노이드의 제조 방법
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 암 세포와 신경능선 세포(neural crest cell)를 공배양(co-culture)하는 단계를 포함하는 암 오가노이드의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 "오가노이드(Organoid)"는 줄기세포나 장기 기원 세포로부터 분리한 세포를 3D 배양법으로 다시 응집·재조합하여 만들어진 세포집합체를 의미하는 것으로, 서스펜션 세포 배양물로부터 형성된 오가노이드 또는 세포 클러스터를 포함할 수 있다. 상기 오가노이드는 소형 유사 장기, 장기 유사체, 유사 장기로도 명명될 수 있다. 상기 오가노이드는 구체적으로 기관 또는 조직을 구성하는 여러 종류의 세포들 중 하나 이상의 세포 종류를 포함하며, 조직 또는 기관의 형태와 기능을 재현할 수 있어야 한다.
본 명세서 내 "암 조직" 및 "암 세포"는 "종양 조직" 및 "종양 세포"와 동일한 개념으로 사용된다.
상기한 바와 같이 본 발명의 배양 방법에서는 암 세포와 신경능선 세포(neural crest cell)를 공배양(co-culture)하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 암 세포는 암 환자로부터 채취한 세포로, 상기 "암"은 포유류에서 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장으로 특징 지어진 생리적 상태를 나타내거나 가리킨다. 본 발명에서 상기 암은 그 발생 부위에 따라 대장암, 췌장암, 갑상선암, 유방암, 담도암, 담낭암, 식도암, 위암, 뇌암, 직장암, 폐암, 방광암, 신장암, 난소암, 전립선암, 자궁암, 두경부암, 피부암, 혈액암 또는 간암 등 일 수 있으나, 바람직하게는 대장암일 수 있다.
본 발명에서 상기 암 세포와 상기 신경능선 세포의 공배양 시 이들 세포를 0.01~100:1, 바람직하게는 0.1~10:1의 세포수의 비율로 혼합하여 배양할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 공배양 시 사용되는 배양 배지는 특별히 제한하지 않으나, 예를 들면 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), a-MEM(Alpha Modification of Eagle's Medium), F12(Nutrient Mixture F-12), RPMI 1640, 윌리암 배지 E(Williams' s medium E), 맥코이 5A(McCoy' s 5A) 및 DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 배양 배지를 사용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 배지에 B27 보충제(supplement), N2 보충제 및 G5 보충제 중 적어도 하나를 추가로 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 공배양 시 사용되는 배양 배지에 골 형성 단백질(Bone morphogenetic protein, BMP); Wnt 신호 활성자(Wnt signaling activator); 및 성장 인자(growth factor) 중 적어도 하나를 추가로 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 골 형성 단백질로는 BMP 패밀리 단백질에 속하는 한 구체적인 종류를 특별히 제한하지는 않으나, 예를 들어 BMP1, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8, BMP9 및 BMP10로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 바람직하게는 BMP4일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 Wnt 신호 활성자는 CHIR99021, BIO((2'Z,3'E)-6-Bromoindirubin-3'-oxime), BIO-아세톡심((2'Z,3'E)-6-Bromoindirubin-3'-acetoxime), 3F8(5-Ethyl-7,8-dimethoxy-H-pyrrolo[3,-4-c]isoquinoline-1,3(2H)-dione), A070722(1-(7-Methoxyquinoiin-4-yl)-3-[6-(tr-ifluoromethyl)pyridin-2-yl]urea), AR-A014418(N-[(4-Methoxyphenyl)methyl]-N'-(5-ni-tro-2-thiazolyl)urea), SB216763(3-(2,4-Dichlorophenyl)-4-(1-methyl-1H-indol-3-yl)-1H-pyrrole-2,5-dione), SB415286(3-[(3-Chloro-4-hydroxyphenyl)amino]-4-(2-nitrophenyl)-1H-pyrrole-2,5-dione), TC-G24(N-(3-Chioro-4-methylphenyl)-5-(4-ni-trophenyl)-1,3,4-oxadiazol-2-amine), TCS2002(2-ethyl-5-[3-[4-(methylsulfinyi)ph-enyl]-5-benzofuranyi]-1,3,4-oxadiazole) 및 TWS119(3-[[6-(3-Aminophenyl)-7H-pyrrolo[2,-3-d]pyrimidin-4-yl]oxyphenol ditrifluoroacetate)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 CHIR99021일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 성장 인자는 염기성 섬유아세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor; bFGF), 상피세포 성장 인자(epidermal growth factor; EGF) 및 인슐린-유사 성장 인자-1(Insulin-like growth factor-1; IGF-1)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 상피세포 성장 인자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 배지 조성물 내에 상기 골 형성 단백질은 1 내지 50 ng/ml, 1 내지 30 ng/ml, 5 내지 20 ng/ml 또는 5 내지 15 ng/ml의 양으로 포함될 수 있다.
본 발명에서 상기 배지 조성물 내에 상기 Wnt 신호 활성자는 0.1 내지 15 μM, 1 내지 10 μM, 2 내지 8 μM 또는 5 내지 7 μM의 양으로 포함될 수 있다.
본 발명에서 상기 성장 인자는 10 내지 1000 ng/ml, 50 내지 500 ng/ml, 60 내지 200 ng/ml 또는 80 내지 120 ng/ml의 양으로 포함될 수 있다.
본 발명에서 상기 공배양 시 5일 내지 30일 동안, 바람직하게는 10일 내지 20일 동안 계대 배양을 수행할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 공배양 시 1회 내지 10회, 바람직하게는 2회 내지 5회 계대 배양을 수행할 수 있다.
본 발명에서 상기 공배양은 5 부피% CO2 및 37 ℃의 온도 조건 하에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 신경능선 세포(neural crest cell)는 신경 상피 세포(neuroepithelium)와 성장 중인 배아의 예비 표피(prospective epidermis) 사이에서 형성되며 이동이 많은 다능성 세포 집단에 속한다. 배아 주변의 광범위한 이동에 따라, 신경능선 세포 또한 다양한 종류의 세포로 분화하게 되는데, 예를 들면, 말초 신경계의 뉴런, 교질 세포에서 색소 세포까지, 섬유아세포에서 평활근 세포까지, 혹은 상아질모세포에서 지방 세포까지 분화될 수 있다. 많은 세포 수의 신경능선 세포가 이동하는데, 이때 상기 이동은 화학주성(chemotaxis), 운동(locomotion)의 접촉-억제 및 세포 수집 등의 다양한 기작에 의해 조절된다.
본 발명에서 상기 신경능선 세포는 외배엽성 세포로부터 분화 유도된 것일 수 있다. 구체적으로는, 상기 외배엽성 세포를 액티빈(activin) 억제제 및 Wnt 신호 활성자(Wnt signaling activator) 중 적어도 하나의 존재 하에서 배양하여 신경능선 세포(neural crest cell)로 분화를 유도할 수 있다.
본 발명에서 상기 액티빈 억제제로는 SB431542, 폴리스타틴(Follistatin), A8301, DMH1, K02288 및 SB505124로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 Wnt 신호 활성자는 CHIR99021, BIO((2'Z,3'E)-6-Bromoindirubin-3'-oxime), BIO-아세톡심((2'Z,3'E)-6-Bromoindirubin-3'-acetoxime), 3F8(5-Ethyl-7,8-dimethoxy-H-pyrrolo[3,-4-c]isoquinoline-1,3(2H)-dione), A070722(1-(7-Methoxyquinoiin-4-yl)-3-[6-(tr-ifluoromethyl)pyridin-2-yl]urea), AR-A014418(N-[(4-Methoxyphenyl)methyl]-N'-(5-ni-tro-2-thiazolyl)urea), SB216763(3-(2,4-Dichlorophenyl)-4-(1-methyl-1H-indol-3-yl)-1H-pyrrole-2,5-dione), SB415286(3-[(3-Chloro-4-hydroxyphenyl)amino]-4-(2-nitrophenyl)-1H-pyrrole-2,5-dione), TC-G24(N-(3-Chioro-4-methylphenyl)-5-(4-ni-trophenyl)-1,3,4-oxadiazol-2-amine), TCS2002(2-ethyl-5-[3-[4-(methylsulfinyi)ph-enyl]-5-benzofuranyi]-1,3,4-oxadiazole) 및 TWS119(3-[[6-(3-Aminophenyl)-7H-pyrrolo[2,-3-d]pyrimidin-4-yl]oxyphenol ditrifluoroacetate)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 신경능선 세포로의 분화 시 배양 배지는 특별히 제한하지 않으나, 예를 들면 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), a-MEM(Alpha Modification of Eagle's Medium), F12(Nutrient Mixture F-12), RPMI 1640, 윌리암 배지 E(Williams' s medium E), 맥코이 5A(McCoy' s 5A) 및 DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 배양 배지를 사용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 신경능선 세포로의 분화 시 배양 기간은 12 시간 내지 6 일, 24 시간 내지 5 일, 2 일 내지 4 일, 또는 3 일 내지 4 일 동안 수행되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에서 상기 외배엽성 세포는 줄기 세포로부터 분화 유도된 것일 수 있다. 구체적으로는, 상기 줄기 세포를 골 형성 단백질(Bone morphogenetic protein, BMP) 억제제, 액티빈(activin) 억제제 및 Wnt 신호 활성자(Wnt signaling activator) 중 적어도 하나의 존재 하에서 배양하여 외배엽성 세포로 분화를 유도할 수 있다.
본 발명에서 상기 "줄기 세포(stem cell)"는 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능 줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)로 분류할 수 있다. 또한, 본 발명에서 상기 줄기세포는 세포학적 유래에 따라 수정란에서 유래하는 배아 줄기세포(embryonic stem cells)와 성체 내에 존재하는 각 기관에서 유래하는 성체 줄기세포(adult stem cells)로 나눌 수 있다. 본 발명에서 상기 줄기 세포로는 인간 배아 줄기세포(hESC)를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 골 형성 단백질 억제제로는 LDN-193189(4-(6-(4-(piperazin-1-yl)phenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl)quinoline), 도르소몰핀(Dorsomorphin; 6-[4-(2-piperidin-1-yl-ethoxy)phenyl]-3-pyridin-4-yl-pyrazolo[1,5-a]pyrimidine) 및 노긴(Noggin)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 액티빈 억제제로는 SB431542, 폴리스타틴(Follistatin), A8301, DMH1, K02288 및 SB505124로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 Wnt 신호 활성자는 CHIR99021 , BIO((2'Z,3'E)-6-Bromoindirubin-3'-oxime), BIO-아세톡심((2'Z,3'E)-6-Bromoindirubin-3'-acetoxime), 3F8(5-Ethyl-7,8-dimethoxy-H-pyrrolo[3,-4-c]isoquinoline-1,3(2H)-dione), A070722(1-(7-Methoxyquinoiin-4-yl)-3- [6-(tr-ifluoromethyl)pyridin-2-yl]urea), AR-A014418(N-[(4-Methoxyphenyl)methyl]-N'-(5-ni-tro-2-thiazolyl)urea), SB216763(3-(2,4-Dichlorophenyl)-4-(1-methyl-1H-indol-3-yl)-1H-pyrrole-2,5-dione), SB415286(3-[(3-Chloro-4-hydroxyphenyl)amino]-4-(2-nitrophenyl)-1H-pyrrole-2,5-dione), TC-G24(N-(3-Chioro-4-methylphenyl)-5-(4-ni-trophenyl)-1,3,4-oxadiazol-2-amine), TCS2002(2-ethyl-5-[3-[4-(methylsulfinyi)ph-enyl]-5-benzofuranyi]-1,3,4-oxadiazole) 및 TWS119(3-[[6-(3-Aminophenyl)-7H-pyrrolo[2,-3-d]pyrimidin-4-yl]oxyphenol ditrifluoroacetate)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 외배엽성 세포로의 분화 시 배양 배지는 특별히 제한하지 않으나, 예를 들면 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), a-MEM(Alpha Modification of Eagle's Medium), F12(Nutrient Mixture F-12), RPMI 1640, 윌리암 배지 E(Williams' s medium E), 맥코이 5A(McCoy' s 5A) 및 DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 배양 배지를 사용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 여기서 상기 배지에 넉아웃 혈청 대체제(Knock out serum replacement)를 추가로 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 외배엽성 세포로의 분화 시 배양 기간은 특별히 제한하지 않으나, 예를 들면 6 시간 내지 6 일, 12 시간 내지 4 일, 24 시간 내지 3일, 또는 1일 내지 2일 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
암 오가노이드
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 방법으로 제작된 암 오가노이드에 관한 것이다.
본 발명에 따른 암 오가노이드는 암 환자로부터 채취한 암 조직 일부를 3차원 배양한 것으로서, 구축된 환자 유래 암 오가노이드 라인을 보관하거나, 지속적으로 배양하여 대량 제작할 수 있다.
암 동물 모델
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 방법으로 제작된 암 오가노이드가 이종 이식된 동물 모델에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 "동물 모델"은 질환 동물 모델을 의미한다. 구체적으로, 동물 모델은 인간의 질병과 유사한 상태의 질병에 걸리거나 선천적으로 그 질병에 걸리도록 만들어낸 동물 모델일 수 있다. 본 명세서에서 동물 모델은 알레르기성 호흡기 질환의 동물 모델일 수 있다. 또한, 본 발명의 알레르기성 호흡기 질환의 동물 모델로 이용될 수 있는 동물은 인간을 제외한 포유 동물로, 예를 들면, 래트, 마우스, 모르모트, 햄스터, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 양 및 염소로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, 보다 바람직하게는 마우스일 수 있다.
항암제의 스크리닝 방법
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 암 오가노이드 또는 동물 모델을 이용하여 항암제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 "스크리닝"이란, 여러 물질로 이루어진 후보군으로부터 목적으로 하는 어떤 특정한 성질을 갖는 물질을 특정한 조작 또는 평가 방법으로 선별하는 것이다.
본 발명에서 제공하는 스크리닝 방법은 우선, 본 발명에서 제공하는 암 오가노이드 또는 동물 모델에 항암제 후보 물질을 처리하는 단계를 포함할 수 있다.
여기서, 상기 후보 물질은 천연 화합물, 합성 화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사 산물 및 생활성 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 상기 동물 모델에 항암제 후보 물질을 처리하는 경우 구강, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 비강 내, 장관, 국소, 설하 또는 직장 등을 통해 투여할 수 있으나, 동물 모델의 종류에 따라 적절한 방법으로 선택하여 투여할 수 있다.
본 발명에서는 상기 후보 물질을 처리한 암 오가노이드 또는 동물 모델에서 암 관련 바이오마커의 발현 수준의 변화를 확인하거나, 미세 혈관 밀도를 측정하거나, 혹은 암 세포의 증식, 성장, 침윤성 또는 전이성의 변화를 육안으로 관찰하거나 또는 캘리퍼스와 같은 도구를 이용하여 측정하는 단계를 수행할 수 있다.
본 발명의 일 실시예로, 상기 후보 물질에 의하여 일반적으로 암 조직에서 발현 수준이 감소 또는 증가된 바이오마커의 발현 수준이 증가 또는 감소하였거나, 암 세포의 증식, 성장, 침윤성 또는 전이성 등이 감소한 경우 상기 후보 물질을 항암제로서 효능을 갖는다고 결정할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예로, 상기 후보 물질에 의하여 암의 발병이 예방되거나, 치료되거나, 대조군 물질에 비하여 예후가 증진된 경우에 상기 후보 물질을 항암제로서 효능을 갖는다고 결정할 수 있다.
본 발명의 방법에 의하는 경우 실제 암 조직과 유사한 형태와 크기를 가지는 3차원 암 오가노이드를 제작할 수 있으며, 그 수율도 혁신적으로 개선할 수 있게 되었다. 더욱이, 본 발명에 따라 제조된 암 오가노이드를 이용하는 경우 암의 병태 생리 규명이나, 특정 암 환자에 대한 연구를 가능하게 할 뿐만 아니라, 암 치료를 위한 항암제를 선별하는 데에도 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 준비예 1에서 인간 배아 줄기세포로부터 외배엽성 세포로의 분화를 유도하기 위한 실험 설계도를 나타낸 것이다.
도 2는 준비예 1에서 외배엽성 세포로의 분화 유도 후 2일 경과하였을 때 얻어진 세포에서 NESTIN 및 OTX2의 발현 수준의 변화를 확인한 결과를 그래프로 나타낸 것이다. 이때 도 2의 각 마커별 그래프에서 왼쪽 열은 대조군을 나타내고, 오른쪽 열은 분화 유도된 세포의 결과를 나타낸 것이며, 여기서 상기 대조군은 인간 배아 줄기세포에 해당한다.
도 3은 준비예 1에서 외배엽성 세포로부터 신경능선 세포로의 분화를 유도하기 위한 실험 설계도를 나타낸 것이다.
도 4는 준비예 1에서 신경능선 세포로의 분화 유도 후 4일 경과하였을 때 얻어진 세포에서 ZIC1, SOX10 및 FOXD3의 발현 수준의 변화를 확인한 결과를 그래프로 나타낸 것이다. 이때 도 4의 각 마커별 그래프에서 왼쪽 열은 대조군을 나타내고, 오른쪽 열은 분화 유도된 세포의 결과를 나타낸 것이며, 여기서 상기 대조군은 인간 배아 줄기세포에 해당한다.
도 5는 준비예 1에서 신경능선 세포로의 분화 유도 후 4일 경과 후 세포를 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다. 여기서 스케일 바(scale bar)는 200 um에 해당한다.
도 6은 실시예 1에서 대장암 세포와 신경능선 세포의 공배양을 통해 대장암 오가노이드를 제작하기 위한 실험 설계도를 나타낸 것이다.
도 7은 평가예 1에서 실시예 1 및 비교예 2에서 제작한 오가노이드에서 β-카테닌(β-catenin), c-Myc 및 STAT3의 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다. 이때 도 7의 각 마커별 그래프에서 왼쪽 열은 비교예 2의 장관 오가노이드(HCO)의 결과를 나타내고, 오른쪽 열은 실시예 1의 대장암 오가노이드(SW480)의 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 평가예 2에서 실시예 1 및 비교예 1의 오가노이드를 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다. 이때 도 8의 윗 행은 실시예 1의 대장암 오가노이드(SW480+NC(+))의 사진이고, 아랫 행은 비교예 1의 대장암 오가노이드(SW480+NC(-))의 사진이다.
도 9는 평가예 3에서 실시예 1에서 제작한 오가노이드에서 DEFA5, Villin, CHGA 및 MUC4를 면역 형광 염색한 뒤 현미경으로 촬영한 사진을 나타낸 것이다.
도 10은 평가예 3에서 실시예 1에서 제작한 오가노이드에서 DEFA5, Villin, CHGA, MUC2, MUC3 및 MUC4의 발현 수준의 변화를 확인한 결과를 그래프로 나타낸 것이다. 이때 도 10의 각 마커별 그래프에서 왼쪽 열은 대조군인 인간 배아 줄기세포(hESC)의 결과를 나타내고, 오른쪽 열은 실시예 1의 대장암 오가노이드(Cancer Organoid)의 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 준비예 1에서 외배엽성 세포로의 분화 유도 후 2일 경과하였을 때 얻어진 세포에서 NESTIN 및 OTX2의 발현 수준의 변화를 확인한 결과를 그래프로 나타낸 것이다. 이때 도 2의 각 마커별 그래프에서 왼쪽 열은 대조군을 나타내고, 오른쪽 열은 분화 유도된 세포의 결과를 나타낸 것이며, 여기서 상기 대조군은 인간 배아 줄기세포에 해당한다.
도 3은 준비예 1에서 외배엽성 세포로부터 신경능선 세포로의 분화를 유도하기 위한 실험 설계도를 나타낸 것이다.
도 4는 준비예 1에서 신경능선 세포로의 분화 유도 후 4일 경과하였을 때 얻어진 세포에서 ZIC1, SOX10 및 FOXD3의 발현 수준의 변화를 확인한 결과를 그래프로 나타낸 것이다. 이때 도 4의 각 마커별 그래프에서 왼쪽 열은 대조군을 나타내고, 오른쪽 열은 분화 유도된 세포의 결과를 나타낸 것이며, 여기서 상기 대조군은 인간 배아 줄기세포에 해당한다.
도 5는 준비예 1에서 신경능선 세포로의 분화 유도 후 4일 경과 후 세포를 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다. 여기서 스케일 바(scale bar)는 200 um에 해당한다.
도 6은 실시예 1에서 대장암 세포와 신경능선 세포의 공배양을 통해 대장암 오가노이드를 제작하기 위한 실험 설계도를 나타낸 것이다.
도 7은 평가예 1에서 실시예 1 및 비교예 2에서 제작한 오가노이드에서 β-카테닌(β-catenin), c-Myc 및 STAT3의 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다. 이때 도 7의 각 마커별 그래프에서 왼쪽 열은 비교예 2의 장관 오가노이드(HCO)의 결과를 나타내고, 오른쪽 열은 실시예 1의 대장암 오가노이드(SW480)의 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 평가예 2에서 실시예 1 및 비교예 1의 오가노이드를 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다. 이때 도 8의 윗 행은 실시예 1의 대장암 오가노이드(SW480+NC(+))의 사진이고, 아랫 행은 비교예 1의 대장암 오가노이드(SW480+NC(-))의 사진이다.
도 9는 평가예 3에서 실시예 1에서 제작한 오가노이드에서 DEFA5, Villin, CHGA 및 MUC4를 면역 형광 염색한 뒤 현미경으로 촬영한 사진을 나타낸 것이다.
도 10은 평가예 3에서 실시예 1에서 제작한 오가노이드에서 DEFA5, Villin, CHGA, MUC2, MUC3 및 MUC4의 발현 수준의 변화를 확인한 결과를 그래프로 나타낸 것이다. 이때 도 10의 각 마커별 그래프에서 왼쪽 열은 대조군인 인간 배아 줄기세포(hESC)의 결과를 나타내고, 오른쪽 열은 실시예 1의 대장암 오가노이드(Cancer Organoid)의 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
[준비예 1] 신경능선 세포로의 분화 유도
1. 줄기세포로부터 외배엽성 세포로의 분화 유도
도 1은 상기 인간 배아 줄기세포로부터 외배엽성 세포로의 분화를 유도하기 위한 실험 설계도로, 상기 도 1에서 보는 바와 같이 10% 넉아웃 혈청 대체제(Knock out serum replacement)를 포함하는 DMEM F-12 배지에 인간 배아 줄기세포를 접종 및 배양하였다. LDN(100nm), SB431542 및 CHIR99021을 2일간 처리하였다.
2일 경과 후 외배엽성 세포로의 분화가 유도되었는지 확인하기 위하여 하기 표 1의 프라이머를 이용하여 qRT-PCR을 통해 외배엽성 관련 마커인 NESTIN 및 OTX2의 발현 수준의 변화를 확인하여 그 결과를 도 2에 나타내었다. 단, 대조군은 인간 배아 줄기세포에 해당한다.
도 2에서 보는 바와 같이, 2일간 분화 유도 후 외배엽성 마커인 NESTIN 및 OTX2의 발현 수준은 현저히 증가하였는 바, 인간 배아 줄기세포로부터 외배엽성 세포로의 분화가 안정적으로 유도되었음을 확인할 수 있었다.
| 유전자 | 정방향 | 역방향 |
| NESTIN | 5'-ATAGAGGGCAAAGTGGTAAGCAG-3’ | 5'-TTCTAGTGTCTCATGGCTCTGGTT-3’ |
| OTX2 | 5'-GACCACTTCGGGTATGGACT-3’ | 5'-TGGACAAGGGATCTGACAGT-3’ |
2. 외배엽성 세포로부터 신경능선 세포로의 분화 유도
도 3은 상기 외배엽성 세포로부터 신경능선 세포로의 분화를 유도하기 위한 실험 설계도로, 상기 도 3에서 보는 바와 같이 넉아웃 혈청 대체제(Knock out serum replacement)나 소혈청을 포함하지 않는 DMEM F-12 배지에 상기 외배엽성 세포를 접종 및 배양하였다. 이때 SB431542 10 uM 및 CHIR-99021 3 uM을 4일간 처리하였다. 분화 개시 후 4일이 경과하였을 때 하기 표 2의 프라이머를 이용하여 qRT-PCR을 통해 신경능선 세포의 초기 마커인 ZIC1과, 성숙기 마커인 SOX10 및 FOXD3의 발현 수준을 측정하여 그 결과를 도 4에 나타내었다. 대조군으로는 인간 배아 줄기세포를 사용하였다. 또한, 분화 개시 후 4일 째에 세포를 현미경으로 관찰한 사진을 도 5에 나타내었다.
도 4에서 보는 바와 같이, 4일간 분화 유도 후 신경능선 세포의 초기 마커인 ZIC1과, 성숙기 마커인 SOX10 및 FOXD3의 발현 수준이 현저히 증가하였고, 도 5에서 보는 바와 같이 신경능선 세포의 형상을 확인할 수 있었으므로, 외배엽성 세포로부터 신경능선 세포로 안정적으로 분화가 유도되었음을 확인할 수 있었다.
| 유전자 | 정방향 | 역방향 |
| ZIC1 | 5'-GTCCTACACGCATCCCAGTT-3’ | 5'-GCGATAAGGAGCTTGTGGTC-3’ |
| SOX10 | 5'-CTCACTGCCCTGATGACCCA-3’ | 5'-CAGCCCCTCATCTTTCAGTGT-3’ |
| FOXD3 | 5'-GACATGTTCGACAACGGCAG-3’ | 5'-CTGTAAGCGCCGAAGCTCTG-3’ |
[실시예 1] 대장암 오가노이드의 제작
도 6은 대장암 세포주와 상기 준비예 1에서 유도된 신경능선 세포의 공배양을 통한 대장암 오가노이드를 제작하기 위한 실험 설계도로, 상기 도 6에서 보는 바와 같이 B27 보충제가 첨가된 DMEM F-12 배지에 BMP4 10 ng/ml, EGF 100 ng/ml 및 CHIR-99021 6 uM을 첨가하였다. 이후 상기 배지에 SW480 대장암 세포주와 상기 준비예 1에서 유도된 신경능선 세포를 각각 1.2 X 106 세포로 1:1의 세포수의 비율로 혼합하여 5 부피% CO2 및 37 ℃의 온도 조건 하에서 15일간 계대 배양을 수행하였다. 계대 배양을 3회 반복하여 대장암 오가노이드를 제작하였다.
[비교예 1] 대장암 오가노이드의 제작
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 제작하되, 신경능선 세포와의 공배양 없이 배지에 SW480 대장암 세포주만을 접종 및 배양하여 대장암 오가노이드를 제작하였다.
[비교예 2] 장관 오가노이드의 제작
1. 줄기세포로부터 내배엽성 세포로의 분화 유도
인간 배아 줄기세포로부터 내배엽성 세포로의 분화를 유도하기 위해 액티빈 A(100ng/ml) 및 CHIR-99021(3uM)를 첨가한 RPMI1640 배지에 배아줄기세포를 200,000 세포수로 접종한 뒤 배양하며 내배엽성 세포로의 분화를 유도하였다. 분화 기간은 총 3일로, 2일 째에 상기 배지에 FBS를 0.2중량% 첨가하고, 3일 째에 상기 배지에 FBS를 2중량%의 양으로 첨가하였으며, 1일 째에 보충제로 B27 보충제를 첨가하였다.
2. 내배엽성 세포로부터 후장(hind gut) 세포의 분화 유도
상기 내배엽성 세포로부터 후장 세포의 분화를 유도하기 위하여 FBS 2 중량%, FGF4(500ug/ml) 및 CHIR-99021(3uM)를 첨가한 DMEM F-12 배지에 상기 내배엽성 세포를 접종한 뒤 4일 동안 분화를 유도하였다. 분화 유도 기간이 도과하자 스페로이드(spheroids) 형상의 후장 세포가 얻어졌고, 웰당 30개의 스페로이드가 형성되었다.
3. 후장 세포로부터 대장 오가노이드의 유도
DMEM F/12 미디어에 B27 보충제를 첨가한후 BMP4(10ng/ml), EGF(100ng/ml), CHIR-99021(3uM)을 첨가하여 마트리젤을 통한 3차원 배양을 진행하였다.
미디어는 2일간격으로 교체하며, 7일 내지 10일 간격으로 계대하여 약 1개월간 배양된 대장 오가노이드를 대조군으로 사용하였다.
[평가예 1]
하기 표 3의 프라이머를 이용하여 qRT-PCR을 통해 상기 실시예 1 및 비교예 2에서 제작한 오가노이드에서 대표적인 암 유전자(oncogene)인 β-카테닌(β-catenin), c-Myc 및 STAT3의 발현 수준을 확인하여 그 결과를 도 7에 나타내었다.
| 유전자 | 정방향 | 역방향 |
| β-catenin | 5'-CAAACTGTTTTGAAAATCCA-3’ | 5'-CGAGTCATTGCATACTGTCC-3’ |
| c-Myc | 5'-TACCCTCTCAACGACAGCAG-3’ | 5'-TCTTGACATTCTCCTCGGTG-3’ |
| STAT3 | 5'-AGCAGCACCTTCAGGATGTC-3’ | 5'-GCATCTTCTGCCTGGTCACT-3’ |
상기 도 7에서 보는 바와 같이, 비교예 2에서 제작한 장관 오가노이드에 비하여 실시예 1에서 제작한 대장암 오가노이드에서는 암 유전자인 β-카테닌(β-catenin), c-Myc 및 STAT3의 발현 수준이 현저히 증가한 것을 확인할 수 있었다.
[평가예 2]
상기 실시예 1 및 비교예 1에서 각기 제작된 오가노이드의 형태와 크기를 비교하기 위하여, 상기 실시예 1 및 비교예 1의 오가노이드를 현미경으로 관찰한 사진을 도 8에 나타내었다.
도 8에서 보는 바와 같이, 상기 실시예 1에서 대장암 세포주와 신경능선 세포를 공배양하여 얻어진 대장암 오가노이드가, 상기 비교예 1에서 대장암 세포주만을 이용하여 얻어진 대장암 오가노이드에 비하여 3차원 형상을 유지하며 크기도 현저히 큰 것을 확인할 수 있었다.
[평가예 3]
상기 실시예 1에서 제작된 오가노이드에서 대장 상피 세포의 마커인 DEFA5, Villin, CHGA 및 MUC4를 면역 형광 염색하였다. 구체적으로 상기 오가노이드를 4% PFA로 고정한 뒤, PBS에서 0.5% BSAin 0.5% Triton X100을 이용하여 세척 후 투과(permeabilization)시킨 후 상기 마커에 특이적인 항체를 이용하여 블러킹(blocking)하며 4℃에서 밤새 배양한 뒤 2차 항체를 추가하여 역시 4℃에서 밤새 배양하였다. 이후 현미경으로 촬영한 사진을 도 9에 나타내었다. 또한, 하기 표 4의 프라이머를 이용하여 qRT-PCR을 이용해 DEFA5, Villin, CHGA, MUC2, MUC3 및 MUC4 각 마커의 발현 수준을 측정해 그 결과를 도 10에 나타내었다. 단, 도 10에서 대조군으로는 인간 배아 줄기세포를 사용하였다.
| 유전자 | 정방향 | 역방향 |
| DEFA5 | 5'-ACC CAG AAG CAG TCT GGG GAA GA-3’ | 5'-GGT GGC TCT TGC CTG AGA ACC TGA-3’ |
| Villin | 5'-TAG CTG TGG TTG TAA AGC AGT ACC-3’ | 5'-GGT ATC ATC TTT CTG AAG GAA TAG G-3’ |
| CHGA | 5'-CGG TTT TGA AGA TGA ACT CTC AG-3’ | 5'-GCT CTT CCA CCG CCT CTT-3’ |
| MUC2 | 5'-TGT AGG CAT CGC TCT TCT CA-3’ | 5'-GAC ACC ATC TAC CTC ACC CG-3’ |
| MUC3 | 5'-CCT CAT TGC AAA CTT CAC TC-3’ | 5'-AGC CCA CAT TTT CTG TAC TG-3’ |
| MUC4 | 5'-CGC GGT GGT GGA GGC GTT CTT-3’ | 5'-GAA GAA TCC TGA CAG CCT TCA-3’ |
도 9 및 10에서 보는 바와 같이, 실시예 1에서 제작한 대장암 오가노이드에서 대장 상피 세포의 마커들(DEFA5, Villin, CHGA, MUC2, MUC3 및 MUC4)이 발현되는 것을 확인할 수 있었다.
Claims (15)
- 암 세포와 신경능선 세포(neural crest cell)를 공배양(co-culture)하는 단계를 포함하는 암 오가노이드의 제조 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 암은 대장암, 췌장암, 갑상선암, 유방암, 담도암, 담낭암, 식도암, 위암, 뇌암, 직장암, 폐암, 방광암, 신장암, 난소암, 전립선암, 자궁암, 두경부암, 피부암, 혈액암 또는 간암인, 제조 방법. - 제1항에 있어서,
상기 공배양 시 상기 암 세포와 상기 신경능선 세포는 0.01~100:1의 세포수의 비율로 혼합되어 배양되는, 제조 방법. - 1항에 있어서,
상기 공배양은 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), a-MEM(Alpha Modification of Eagle's Medium), F12(Nutrient Mixture F-12), RPMI 1640, 윌리암 배지 E(Williams' s medium E), 맥코이 5A(McCoy' s 5A) 및 DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 배양 배지에서 수행되는, 제조 방법. - 제4항에 있어서,
상기 배양 배지는 B27 보충제(supplement), N2 보충제 및 G5 보충제 중 적어도 하나를 추가로 더 포함하는, 제조 방법. - 제4항에 있어서,
상기 배양 배지에 골 형성 단백질(Bone morphogenetic protein, BMP); Wnt 신호 활성자(Wnt signaling activator); 및 성장 인자(growth factor) 중 적어도 하나를 추가로 더 포함하는, 제조 방법. - 제6항에 있어서,
상기 골 형성 단백질은 BMP1, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8, BMP9 및 BMP10로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 제조 방법. - 제6항에 있어서,
상기 Wnt 신호 활성자는 CHIR99021, BIO((2'Z,3'E)-6-Bromoindirubin-3'-oxime), BIO-아세톡심((2'Z,3'E)-6-Bromoindirubin-3'-acetoxime), 3F8(5-Ethyl-7,8-dimethoxy-H-pyrrolo[3,-4-c]isoquinoline-1,3(2H)-dione), A070722(1-(7-Methoxyquinoiin-4-yl)-3-[6-(tr-ifluoromethyl)pyridin-2-yl]urea), AR-A014418(N-[(4-Methoxyphenyl)methyl]-N'-(5-ni-tro-2-thiazolyl)urea), SB216763(3-(2,4-Dichlorophenyl)-4-(1-methyl-1H-indol-3-yl)-1H-pyrrole-2,5-dione), SB415286(3-[(3-Chloro-4-hydroxyphenyl)amino]-4-(2-nitrophenyl)-1H-pyrrole-2,5-dione), TC-G24(N-(3-Chioro-4-methylphenyl)-5-(4-ni-trophenyl)-1,3,4-oxadiazol-2-amine), TCS2002(2-ethyl-5-[3-[4-(methylsulfinyi)ph-enyl]-5-benzofuranyi]-1,3,4-oxadiazole) 및 TWS119(3-[[6-(3-Aminophenyl)-7H-pyrrolo[2,-3-d]pyrimidin-4-yl]oxyphenol ditrifluoroacetate)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 제조 방법. - 제6항에 있어서,
상기 성장 인자는 염기성 섬유아세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor; bFGF), 상피세포 성장 인자(epidermal growth factor; EGF) 및 인슐린-유사 성장 인자-1(Insulin-like growth factor-1; IGF-1)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 제조 방법. - 제1항에 있어서,
상기 공배양은 5일 내지 30일 동안 계대 배양하여 수행되는, 제조 방법. - 제10항에 있어서,
상기 계대 배양은 1회 내지 10회 수행되는, 제조 방법. - 제1항에 있어서,
상기 신경능선 세포는 외배엽성 세포로부터 분화 유도된 것인, 제조 방법. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 제조 방법으로 제조된 암 오가노이드.
- 제13항의 오가노이드가 이종 이식된 동물 모델.
- 제13항의 오가노이드를 이용하여 이용하여 항암제를 스크리닝하는 방법.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| WO2023239048A1 (ko) * | 2022-06-08 | 2023-12-14 | 차의과학대학교 산학협력단 | 암 미세환경 모사 췌장암 오가노이드의 제조방법 및 이의 용도 |
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-
2019
- 2019-07-04 KR KR1020190080670A patent/KR102120378B1/ko active IP Right Grant
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