KR20110137805A - 마이크로캐리어 상의 다분화성 및 다능성 세포의 배양 방법 - Google Patents

마이크로캐리어 상의 다분화성 및 다능성 세포의 배양 방법 Download PDF

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Abstract

다분화성 또는 다능성 세포를 다수의 마이크로캐리어에 부착시켜 마이크로캐리어-세포 복합체를 형성시키는 단계, 및 마이크로캐리어-세포 복합체를 ROCK 억제제의 존재하에 현탁 배양으로 배양하는 단계를 포함하는, 시험관내에서 다분화성 또는 다능성 세포의 배양 방법이 기술된다.

Description

마이크로캐리어 상의 다분화성 및 다능성 세포의 배양 방법{Culture of Pluripotent and Multipotent Cells on Microcarriers}
발명의 분야
본 발명은 ROCK 억제제의 존재하에서 마이크로캐리어(Microcarrier) 상의 다분화성 및 다능성 세포의 배양 방법에 관한 것이다.
발명의 배경
분화된 세포와 다르게 줄기세포는 분할하여 표현형적으로 및 기능적으로 상이한 딸 세포(daughter cell)로 자체 재생되거나 분화하는 능력을 갖는다[참조: Keller, Genes Dev. 2005;19:1129-1155; Wobus and Boheler, Physiol Rev. 2005;85:635-678; Wiles, Methods in Enzymology. 1993;225:900-918; Choi et al, Methods Mol Med. 2005;105:359-368].
사람 배아 줄기세포(hESC)는 각종의 줄기세포 유형으로 분화하는 능력을 갖는 다분화성 세포이다. 배아 줄기세포(ESC)와 같은 줄기세포의 다분화성 및 모든 3개의 배엽 층(germ layer)으로부터 세포로 분화하는 이들의 능력은 이들이 많은 질병 및 조직 손상에 대한 재생 치료요법을 위한 이상적인 공급원이 되도록 한다[참조: Keller, Genes Dev. 2005;19:1129-1155; Wobus and Boheler, Physiol Rev. 2005;85:635-678].
하나 이상의 계대(passage)를 필요로 하는, 줄기세포를 다량으로 증량(expansion)시키는 것은 세포 치료요법을 위한 전제조건이다.
현재, 콜로니(colony)로서 성장하는 줄기세포(사람 배아 줄기세포, hESC를 포함함)는 2차원(2D) 성장시 플라스틱 배양물 표면에서 일반적으로 유지된다. 2D 배양에 있어 더 큰 양으로의 확장은 넓은 표면적의 사용을 필요로 할 것이다. 반복된 피펫팅 또는 효소 처리로 이들 2D 콜로니를 더 작은 크기로 분쇄함으로써 세포를 계대배양하는 수동 특성은 비실용적이 될 것이다. 큰 표면적을 씨딩(seeding)하기 위해 다수의 플레이트를 제조하는 것은 취급상의 에러(handling error)의 대상이 될 수 있다. 더구나, 예를 들면, 눈크 트레이(Nunc tray)와 같은 매우 큰 표면적이 필요할 수 있다.
따라서, 피복된 플라스틱 표면에서의 2D 콜로니 배양과 같이 줄기 세포를 성장시키는 현재의 방법은 대량생산에는 적합하지 않으며, 배양이 수행되는 실험 조건은 일반적으로 양호한 조절을 위해서는 적합하지 않다. 선행기술은 현탁 배양 속의 마이크로캐리어 위에서와 같은, 3차원("3D") 환경에서 줄기세포를 배양하기 위한 다수의 시도를 포함한다. 마이크로캐리어 상의 마우스 배아 줄기세포[참조: Fernandes et al., 2007; Abranches et al., 2007; King and Miller, 2007) 및 배아유사세포덩어리(embryoid body)로서 현탁 배양물 속에서 분화하는 hESC[참조: Dang et al., 2004; Fok and Zandstra, 2005; Cameron et al., 2006]의 몇몇의 연구를 제외하고는, 현탁 배양액 속에서 hESC의 장기간, 연속 배양의 강력한 방법이 존재하지 않는다.
당해 기술분야에는 "배아유사세포덩어리"로서 분화되는 배아 줄기세포가 공지되어 있다. 이러한 배아유사세포덩어리는 이미 분화된 세포의 덩어리를 포함한다. 예를 들면, 문헌[참조: Gerecht Nir et al (2004)]에는 배아유사세포덩어리를 배양시키기 위한 회전-벽 생물반응기(rotating-wall bioreactor)의 용도가 기술되어 있다. 배아유사세포덩어리 배양은 또한 문헌[참조: Zandstra et al (2003), Dang et al (2004) 및 Wartenberg et al (1998)]에 의해 교반 시스템을 이용하는 것으로 나타내어져 있다. 배아유사세포덩어리 현탁 배양은 또한 문헌[참조: Dang and Zandstra (2005) 및 King and Miller (2007)]에 보고되어 있다. 이러한 기술은 분화된 줄기 세포를 포함하는 이들 조직형 배아유사세포덩어리 응집물을 배양하는 데 적합하지만, 분화되지 않은 줄기세포에는 적합하지 않다.
문헌[참조: Fok and Zandstra (2005)]에는 분화되지 않은 마우스 배아 줄기세포(mESC)의 증식을 위한 교반된 현탁액 배양 시스템이 기술되어 있다. 교반된 현탁액 배양 시스템은 마이크로캐리어 및 응집물 배양물로 구성되어 있다. 유리 마이크로캐리어 위에서 배양된 마우스 배아 줄기세포는 조직 배양 플라스크 대조군과 비교할만한 군집 배가시간(population douling times)을 가졌다. 백혈병 억제 인자의 제거시, mESC 응집체는 다중직계성 분화할 수 있는 배아유사세포덩어리(EB)로 발달하였다. 마우스 ESC의 현탁 배양액은 또한 문헌[참조: King and Miller (2005)]에 기술되어 있다. 그러나, 문헌[참조: King and Miller (2005)]에는, "분화되지 않은 사람 ESC(hESC)의 확장은 mESC에서 보다 더 어렵고, 교반된 배양물에서는 아직 보고되지 않았다"라고 언급되어 있다.
US2007/0264713(Terstegge)에는, 마이크로캐리어 상에서 사람 배아 줄기세포를 배양하기 위한 시도가 기술되어 있다. 사람 배아 줄기세포는 각종 용적의 조건화된 배지와 함께 스피너(Spinner) 또는 생물반응기(bioreactor) 속으로 Cytodex3 (Amersham) 마이크로캐리어와 함께 도입된다. 배양물은 1시간 내에 20 내지 30 rpm에서 30분 동안 교반한다. 배양물을 10일 내지 6주 사이에 각종 시간 동안 유지시킨다. 그러나, 줄기세포의 대규모 연속 생산을 위한 필수적인 요건인, 계대배양되거나 부차 배양된(sub-cultured) 배양물들 중의 어느 것도 어떠한 시간에서도 존재하지 않았다. 마이크로캐리어 상의 '양호한'(지수적) 성장 속도와 함께 부차 배양을 위한 능력 및 연속 계대배양의 입증은 줄기세포의 대량생산을 위한 필수 요건이다. 이는 데르스테그(Terstegge) 등의 작업에 의해 입증되지 않았다.
국제 출원 공개 제WO2008/004990호는 공급자 세포의 부재하에서 줄기세포를 배양하기 위한 시도를 기술하고 마이크로캐리어의 사용을 고려한다. 이는 마트리겔(Matrigel)을 사용하지 않는 배양과 관련되어 있다. 국제 출원 공개 제WO2008/004990호는 줄기세포 분화의 억제시 양성으로 하전된 표면의 효과를 기술하고 있다.
문헌[참조: Phillips et al., 2008 (Journal of Biotechnology 138 (2008) 24-32]에서는 응집체 뿐만 아니라 단일 세포도 씨딩시킴으로써 마이크로캐리어 위에서 hESC를 배양하기 위한 시도가 보고되어 있다. 초기에, 3배 확장이 5일에 걸쳐 달성되었으나, 세포가 6주를 초과하여 계대접종될 수 없을 때까지 각각의 연속적인 계대접종 세포 확장이 감소되었다.
사람 배아 줄기 세포(hESC)의 대규모 배양을 위해 Cytodex 1 및 3과 같은 시판되는 마이크로캐리어를 사용하는 앞서의 시도는 성공적이지 않았다. hESC 배양물은 사멸하거나 캐리어 상에서 분화하였으며 증식할 수 없었다(참조: Oh & Choo, 2006).
ROCK 억제제 Y-27632가 와타나베(Watanabe) 등 및 하브(Harb) 등에 의해 2D 배양에서 해리된 사람 배아 줄기세포의 생존을 허용할 수 있는 인자로서 제안되어 왔다[참조: Watanabe et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology Vol. 25 No. 6 p681-686 June 2007. WO 2008/035110. Harb et al. The Rho-Rock-Myosin Signaling Axis Determines Cell-Cell Integrity of Self-Renewing Pluripotent Stem Cells. PLoS ONE 3(8): e3001. doi:10:1371/journal.pone.0003001].
ROCK 억제제는 또한 사람 배아 줄기 세포의 냉동보존을 증진시킬 수 있는 제제로 시험되어 왔다(참조: Xiangyun Li et al. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Human Reproduction, Vol.24, No.3 pp.580-589, 2009. Martin-Ibanez et al. Novel cryopreservation method for dissociated human embryonic stem cells in the presence of a ROCK inhibitor. Human Reproduction. Vol. 23. No.12 pp.2744-2754, 2008. Claassen et al. ROCK Inhibition Enhances the Recovery and Growth of Cryopreserved Human Embryonic Stem Cells and Human Induced Pluripotent Stem Cells. Molecular Reproduction & Development 2009). 그러나, 모든 경우에서, 이는 마트리겔 위에서 사람 배아 줄기 세포의 2D 배양의 내용에서 사용에 대해 지적되어 있다.
마트리겔 속에 피복된 마이크로캐리어를 사용하여, 본 발명자들은 이미 사람 배아 줄기 세포 및 사람 유도된 다분화성 세포를 포함하는 영장류로부터 분화되지 않은 다분화성 세포의 현탁액 속에서 연속적인 계대배양을 통한 안정하고 연속적인 성장을 달성하였다(참조: Oh 등에 의해 2009년 부분적으로 보고되고 2009년 3월 17일자로 출원된 미국 특허출원 제US 61/069,694호, 2008년 10월 31일자로 출원된 제US 61/110,256호, 2009년 1월 29일자로 출원된 제US 61/148,064호 및 2009년 2월 27일자로 출원된 제US 61/155,940호에 추가로 기술됨). 그러나, 지금까지, 당해 결과는 세포외 매트릭스 기원한 물질의 표면 피복을 가지지 않는 마이크로캐리어를 사용하여 수득되지 않았다.
이후로, 룩(Lock) 등은 마트리겔 피복된 마이크로캐리어 위에서 계대배양없이 hESC의 성장을 기술하였고(참조: Lock et al. expansion and Differentiation of Human Embyronic Stem Cells to Endoderm Progeny in a Microcarrier Stirred-Suspension Culture. Tissue Engineering: Part A Vol. 15, No. 00, 2009), 니이(Nie) 등은 매트릭스 피복물 또는 공급자 세포 층을 갖는 마이크로캐리어 위에서 hESC의 성장을 시험하였다(참조: Nie et al. Scalable Culture and Cryopreservation of Human Embyronic Stem Cells on Microcarriers. Biotechnol. Prog., 2009, Vol. 25, No.1).
발명의 요약
본 발명에 이르러, 본 발명자들은, 다분화성 줄기 세포가 배양되고 계대배양된 세포의 다분화성 상태를 유지하면서, 매트릭스 피복을 가지지 않는 마이크로캐리어 위에서 ROCK 억제제의 존재하에 성공적으로 배양되고 계대배양될 수 있음을 밝혀냈다.
본 발명은 ROCK 억제제의 존재하에서 시험관내 배양시 다분화성 및 다능성 세포를 안정하고 장기간 배양하는 방법을 제공한다.
당해 방법을 사용하여, 사람 배아 줄기 세포가 증량되고 계대배양되며, 증량되고 계대배양된 사람 배아 줄기 세포 집단의 다분화성이 적어도 계대배양 9회를 초과하여 유지되었다.
따라서, 본 발명의 하나의 국면은 현탁 배양시 마이크로캐리어 위에서 다분화성 또는 다능성 세포의 성장 및 증식에 관한 것이다. 당해 방법은 배양물 속에서 세포의 각각의 다분화성 또는 다능성 상태를 유지하면서 1회 또는 다수의 계대배양을 통한 배양을 포함할 수 있다. 당해 배양은 배양 배지에 배양 보충물 또는 첨가제로서 가해질 수 있는 ROCK 억제제의 존재하에서 수행된다.
배양물 속에 ROCK 억제제를 포함시킴으로 인해, 본 발명자들은, 매트릭스, 예를 들면, 세포외 매트릭스 물질 속에서 마이크로캐리어의 표면을 피복시키는 것이 필수적이지 않음을 밝혀냈다. 지금까지, 이는 특히 사람 또는 영장류 배아 줄기 세포 및 사람 또는 영장류 유도된 다분화성 세포의 마이크로캐리어-배양된 다분화성 또는 다능성 세포의 다분화성 또는 다능성 상태를 유지하기 위한 필수적 요건으로 고려되어 왔다.
마이크로캐리어는 다분화성 또는 다능성 세포와 함께 씨딩된다. 이후에, 마이크로캐리어-세포 복합체는 현탁 배양으로 배양되어, 바람직하게는 배양물 속에 다수의 다분화성 또는 다능성 세포로 증량된다. 배양된 세포는 계대배양될 수 있고, 계대배양된 세포는 또한 예를 들면, 추가 배양 또는 분화를 위해 마이크로캐리어 위에 씨딩될 수 있다.
이러한 방식으로, 다분화성 또는 다능성 세포는 다수의 계대배양, 예를 들면, 적어도 2회의 계대배양을 통해 취해질 수 있으며, 배양되고 계대배양된 세포는 각각의 다분화성 또는 다능성 상태를 유지한다. 당해 방법을 사용하여 다분화성 또는 다능성 세포의 증식을 계대배양 사이의 각각의 배양 주기 동안 관측하여 많은(적어도 9회) 계대배양에 걸쳐 유지시킬 수 있다.
당해 배양 방법은 시험관내 배양으로 다분화성 또는 다능성 세포의 연속적인 성장 및 계대배양을 허용함으로써 다분화성 또는 다능성 세포를 치료학적으로 유용한 수로 증량시키는 방법을 제공한다.
비록 마이크로캐리어상의 다분화성 또는 다능성 세포의 연속 계대배양이 흔히 본 발명의 방법의 일부로서 바람직할 것이지만, 다분화성 또는 다능성 세포를 마이크로캐리어 위의 배양물로부터 다른 배양 시스템, 예를 들면, 2D 콜로니 배양으로 이전시킨 후, 다시 현탁 마이크로캐리어 배양으로 되돌릴 수 있다.
일부 양태에서, 마이크로캐리어는 바람직하게는 세포외 성분을 갖는 매트릭스 속에서 피복된다. 일부 양태에서, 마이크로캐리어는 양성으로 하전된다. 당해 방법은 바람직하게는 다분화성 또는 다능성 세포를 마이크로캐리어에 계대배양 전 배양의 각각의 주기 동안 부착시키는 단계를 포함한다. 배양의 일부 주기를 피복되지 않은 마이크로캐리어 위에서 및 다른 것을 매트릭스 피복된 마이크로캐리어 위에서 착수하는 것이 허용된다.
비록 마이크로캐리어 위에서 다분화성 또는 다능성 세포의 연속 계대배양이 흔히 본 발명의 방법의 일부로서 바람직할 것이라고 해도, 배양된 세포는 마이크로캐리어 위에서의 배양으로부터 다른 배양 시스템, 예를 들면, 2D 콜로니 배양으로 이전 된 후, 다시 현탁 마이크로캐리어 배양으로 이전될 수 있다.
본 발명의 추가의 국면은 ROCK 억제제의 존재하에서 현탁 배양시 마이크로캐리어에 부착된 다분화성 또는 다능성 세포의 분화에 관한 것이다.
일부 양태에서, 다분화성 또는 다능성 세포는 위에서 기술한 마이크로캐리어 배양 방법을 사용함으로써 분화에 요구되는 세포 밀도로 성장시킬 수 있다. 필요한 세포 밀도가 수득되면 배양 조건을 변화시켜 마이크로캐리어에 부착된 다분화성 또는 다능성 세포의 분화를 유도할 수 있다. 분화를 위해, 동일하거나 상이한 마이크로캐리어를 다분화성 또는 다능성 세포의 성장에 사용된 것과 비교하여 사용할 수 있다. 유사하게, 매트릭스 피복이 사용된 경우, 동일하거나 상이한 매트릭스 피복을 사용할 수 있다. 예를 들어, 제1의 피복물을 가진 제1의 마이크로캐리어를 다분화성 또는 다능성 세포의 성장 및 증식을 위해 사용할 수 있고 제2의 피복물을 가진 제2의 마이크로캐리어를 이들 세포의 분화에 사용할 수 있다. 제2의 마이크로캐리어는 피복되지 않거나 매트릭스 속에서 표면 피복될 수 있다.
다분화성 또는 다능성 세포의 증식 및 이들의 분화 둘다를 위한 마이크로캐리어 배양의 사용은 분화 배양물의 재-씨딩에 대한 필요성을 피하는 장점,분화를 위한 많은 수의 다분화성 또는 다능성 세포를 제공하는 증식 배양의 장점, 및 배양 조건을 변화시킴으로써 증식으로부터 분화까지 변화시키는 편리성을 갖는다.
다른 양태에서, 분화를 위한 다분화성 또는 다능성 세포를 성장시켜 다른 배양 방법, 예를 들면, 2D 콜로니 배양에 의해 요구되는 세포 밀도로 성장시킬 수 있다. 이후에, 이들 세포를 마이크로캐리어에 부착시키고 현탁 배양물 속에서 ROCK 억제제의 존재하에 다분화성 또는 다능성 세포의 분화를 유도하는 조건하에서 배양한다.
일부 양태에서, 이미 분화를 겪은(그러나 바람직하게는 말기 분화가 아닌) 다분화성 또는 다능성 세포를 마이크로캐리어에 부착시키고 ROCK 억제제의 존재하에 세포의 분화를 유도하는 조건하에서 현탁 배양으로 배양할 수 있다.
본 발명의 방법에서, ROCK 억제제는 바람직하게는 배양되거나 분화되는 세포를 접촉하도록 한다. ROCK 억제제는 또한 바람직하게는, 세포가 부착되거나, 이에 부착될 마이크로캐리어에 부착되도록 한다. 이러한 부착을 허용하기 위해서는, 액체, 유체, 겔 또는 다른 유동성 배양 배지가 바람직하다.
본 발명의 하나의 국면에서, 시험관내에서 다분화성 또는 다능성 세포를 배양하는 방법이 제공되며, 당해 방법은
(i) 다분화성 또는 다능성 세포를 다수의 마이크로캐리어에 부착시켜 마이크로캐리어-세포 복합체를 형성시키는 단계, 및
(ii) 마이크로캐리어-세포 복합체를 현탁 배양물 속에서 ROCK 억제제의 존재하에 배양하는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 당해 방법은 단계 (ii)로부터 배양된 세포를 계대배양함을 추가로 포함하며, 여기서, 계대배양 후 세포는 다분화성 또는 다능성이다.
일부 양태에서, 당해 방법은
(iii) 단계 (ii)로부터의 배양된 세포를 계대배양하는 단계; 및
(iv) 단계 (i) 내지 (iii)을 적어도 2회 계대배양을 통해 반복하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서, 단계 (iv) 후의 배양물 속의 세포는 다분화성 또는 다능성이다. 일부 양태에서, 각각의 반복 주기에서, 단계 (i)의 줄기 세포는 앞서의 반복 주기의 단계 (iii)의 계대배양된 세포로부터 수득된다.
단계 (iv)에서, 단계 (i) 내지 (iii)은 적어도 3회 계대배양, 적어도 4회 계대배양, 적어도 5회 계대배양, 적어도 6회 계대배양, 적어도 7회 계대배양, 적어도 8회 계대배양, 적어도 9회 계대배양, 적어도 10회 계대배양, 적어도 11회 계대배양, 적어도 12회 계대배양, 적어도 13회 계대배양, 적어도 14회 계대배양, 적어도 15회 계대배양, 적어도 16회 계대배양, 적어도 17회 계대배양, 적어도 18회 계대배양, 적어도 19회 계대배양, 적어도 20회 계대배양, 적어도 21회 계대배양, 적어도 22회 계대배양, 적어도 23회 계대배양, 적어도 24회 계대배양, 적어도 25회 계대배양, 적어도 30회 계대배양, 적어도 40회 계대배양, 적어도 50회 계대배양, 적어도 60회 계대배양, 적어도 70회 계대배양, 적어도 80회 계대배양, 적어도 90회 계대배양, 적어도 100회 계대배양 중 하나를 통해 반복될 수 있다.
일부 양태에서, 단계 (ii)에서, 세포는 배양물 속의 세포의 수를 증량시키기에 충분한 기간 동안 배양된다. 일부 양태에서, 단계 (iv) 이후, 배양물 속의 세포의 적어도 60%는 다분화성 또는 다능성이다. 일부 양태에서, 단계 (iv) 후, 배양물 속의 세포의 적어도 60%는 Oct4, SSEA4, TRA-1-60 및 Mab84 중 1개, 2개, 3개 또는 모두를 발현한다.
일부 양태에서, 계대배양된 세포는 바람직하게는 기술된 수의 계대배양 후 적어도 하나의 다분화성 또는 다능성 세포의 생물학적 활성을 보유한다. 생물학적 활성은 (i) 전분화능 마커의 발현, (ii) 세포 생존능; (iii) 정상 핵형, (iv) 내배엽, 외배엽 또는 중배엽으로 분화하는 능력으로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다. 생물학적 활성은 OCT-4, SSEA-4, TRA-1-60 및 Mab84로 이루어진 그룹 중에서 선택된 전분화능 마커의 발현을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 당해 방법은 세포를 혈청이 없는 배지, 또는 줄기 세포 조건화된 배지, 또는 공급자 세포가 없는 조건하에서 배양함을 포함한다. 공급자 세포가 없는 조건은 현탁 배양물 속에 존재하는 마이크로캐리어 위에 피복된 공급자 세포의 부재 및/또는 현탁 배양물로부터의 공급자 세포의 완전한 부재를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 공급자 세포는 또한 마이크로캐리어에 부착된다. 일부 양태에서, 배양물은 또한 다분화성 또는 다능성 세포가 부착된 마이크로캐리어와는 상이한 마이크로캐리어에 부착된 공급자 세포를 포함한다.
본 발명에 따른 방법은 다른 배양 시스템, 예를 들면, 2D 배양으로 또는 이로부터의 계대배양함을 포함할 수 있다. 세포는 배양 시스템들 사이의 이전을 용이하게 하기 위하여, 예를 들면, 동결시키고 해동시킬 수 있다.
일부 양태에서, 다분화성 또는 다능성 세포는 제한된 기간 동안 다른 입자/표면에서 배양될 수 있다. 예를 들면, 단계 (ii) 또는 (iii)으로부터의 다분화성 또는 다능성 세포는 ROCK 억제제의 존재하에서 마이크로캐리어 위에서의 배양으로 복귀(return)되기 전에 제한된 수의 계대배양(예를 들면, 5회 미만, 보다 바람직하게는 3회 미만, 보다 바람직하게는 1회) 동안 다른 배양 시스템(예를 들면, 2D 배양)으로 배양될 수 있다.
다른 양태에서, 다분화성 또는 다능성 세포는 배양 방법으로부터 제거되어 본 발명에 따른 현탁 배양으로 복귀되기 전에 저장(예를 들면, 동결된 세포로서)될 수 있다. 세포는 ROCK 억제제의 존재하에서 저장(예를 들면, 동결)될 수 있다.
이러한 양태에서, 본 발명에 따라 현탁 배양으로의 복귀는 동일한 배양으로의 복귀를 필요로 하지 않는다. 본 발명에 따른 현탁 배양은 예를 들면, 세포의 동결 및 전달 후 심지어 상이한 지리적 위치에서 지속될 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 마이크로캐리어로부터 사람 배아 줄기 세포를 분리하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 당해 방법은 배양물로부터 수득된 다분화성 또는 다능성 세포의 분화를 유도하는 단계를 포함한다. 따라서, 일부 양태에서, 당해 방법은 세포의 분화를 유도하는 조건하에서 마이크로캐리어-세포 복합체를 위치시킴을 포함한다.
일부 양태에서, 당해 방법은 마이크로캐리어로부터 배양 방법으로 수득한 다분화성 또는 다능성 세포를 분리하는 단계 및 세포의 분화를 유도하는 조건하에 분리된 세포를 비-마이크로캐리어 배양으로 배양하는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 당해 방법은 또한,
(a) 배양 방법으로부터 수득된 다분화성 또는 다능성 세포를 다수의 제2의 마이크로캐리어에 부착시켜 마이크로캐리어-세포 복합체를 형성시키는 단계,
(b) 단계 (a)로부터의 마이크로캐리어-세포 복합체를 세포의 분화를 유도하는 조건하에 현탁 배양으로 배양하는 단계를 포함하는, 배양 방법으로부터 수득된 다분화성 또는 다능성 세포의 시험관내 분화를 추가로 포함한다.
당해 방법은 또한
(c) 단계 (b)로부터 수득된 분화된 세포를 다수의 제3의 마이크로캐리어에 부착시켜 마이크로캐리어-세포 복합체를 형성시키는 단계; 및
(d) 단계 (c)로부터의 마이크로캐리어-세포 복합체를 이미 분화된 세포의 추가의 분화를 유도하는 조건하에서 현탁 배양으로 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 분화를 위한 배양 조건은 ROCK 억제제의 존재하에서 세포를 배양함을 포함한다.
다른 양태에서, 분화를 위한 배양 조건은 ROCK 억제제의 부재하에서 세포를 배양함을 포함한다.
본 발명의 방법으로 수득된 다분화성 또는 다능성 세포(들)이 제공된다. 본 발명의 방법으로 수득된 분화된 세포(들)이 또한 제공된다. 일부 양태에서, 본 발명의 방법으로 수득된 분화된 세포는 배양되어 배아유사세포덩어리를 형성한다. 따라서, 이렇게 수득된 배아유사세포덩어리가 또한 제공된다.
본 발명의 하나의 국면에서, 시험관내에서 다분화성 또는 다능성 세포를 분화하는 방법이 제공되며, 당해 방법은 다분화성 또는 다능성 세포를 다수의 마이크로캐리어에 부착시켜 마이크로캐리어-세포 복합체를 형성시키는 단계(여기서, 마이크로캐리어의 표면은 피복되지 않거나 매트릭스 속에서 피복된다), 및 마이크로캐리어-세포 복합체를 ROCK 억제제의 존재 및 세포의 분화를 유도하는 조건하에서 현탁 배양으로 배양하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 국면에서, 다분화성 또는 다능성 세포의 현탁 배양이 제공되며, 여기서, 세포는 다수의 마이크로캐리어에 부착됨으로써 마이크로캐리어-세포 복합체를 형성하며 현탁 배양 배지는 ROCK 억제제를 함유한다.
일부 양태에서, 현탁 배양물을 함유하는 다분화성 또는 다능성 세포를 증식시키기 위한 용기, 예를 들어, 생물반응기, 또는 장치가 제공된다. 현탁 배양은 스피너 현탁 배양(spinner suspension culture)일 수 있다.
일부 양태에서, ROCK 억제제는 적어도 1μm, 적어도 2μm, 적어도 3μm, 적어도 4μm, 적어도 5μm, 적어도 6μm, 적어도 7μm, 적어도 8μm, 적어도 9μm, 적어도 10μm, 적어도 15μm, 적어도 20μm, 적어도 30μm, 적어도 40μm, 또는 적어도 50μm 중의 하나의 농도로 배양 배지 속에 존재한다. ROCK 억제제는 100μm, 90μm, 80μm, 70μm, 또는 60μm 중 하나 미만의 농도로 배양 배지 속에 임의로 존재할 수 있다.
본 발명의 추가의 국면에서, 다분화성 또는 다능성 세포의 시험관내 현탁 배양시 ROCK 억제제의 용도가 제공되며, 여기서, 세포는 마이크로캐리어-세포 복합체의 형태이다.
본 발명의 여전히 다른 국면에서, 시험관내 현탁 배양시 다분화성 또는 다능성 세포의 분화에 있어서 ROCK 억제제의 용도가 제공되며, 여기서, 세포는 마이크로캐리어-세포 복합체의 형태로 존재한다.
본 발명의 추가의 국면에서, 다분화성 또는 다능성 세포의 증식 방법이 제공되며, 당해 방법은:
(a) 마이크로캐리어를 제공하는 단계;
(b) 다분화성 또는 다능성 세포가 마이크로캐리어에 부착되도록 하는 단계; 및
(c) 마이크로캐리어를 이에 부착된 다분화성 또는 다능성 세포와 응집시킴으로써 다분화성 또는 다능성 세포를 증식시키는 단계를 포함하며, 여기서, 단계 (a), (b) 또는 (c) 중 하나 이상, 또는 모두에서 마이크로캐리어 및/또는 세포는 ROCK 억제제와 접촉된다.
본 발명의 다른 국면에서, 다분화성 또는 다능성 세포를 증식시키는 방법이 제공되며, 당해 방법은:
(a) 제1의 마이크로캐리어에 부착된 제1의 다분화성 또는 다능성 세포를 제공하는 단계;
(b) 제2의 마이크로캐리어에 부착된 제2의 다분화성 또는 다능성 세포를 제공하는 단계;
(c) 제1의 다분화성 또는 다능성 세포가 제2의 다분화성 또는 다능성 세포와 접촉하도록 함으로써 세포의 응집체를 형성시키는 단계; 및
(d) ROCK 억제제의 존재하에서 응집체를 배양하여 적어도 1회의 계대배양 동안 다분화성 또는 다능성 세포를 증식시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 여전히 다른 국면에서, 다분화성 또는 다능성 세포를 증식시키는 방법이 제공되며, 당해 방법은:
(a) 다분화성 또는 다능성 세포가 부착된 제1의 마이크로캐리어를 제공하는 단계;
(b) 제1의 마이크로캐리어가 제2의 다분화성 또는 다능성 세포가 부착된 제2의 마이크로캐리어와 접촉하도록 함으로써 응집체를 형성시키는 단계; 및
(c) ROCK 억제제의 존재하에서 응집체를 배양하는 단계를 포함한다.
본 발명의 여전히 다른 국면에서, 다분화성 또는 다능성 세포를 증식시키는 방법이 제공되며, 당해 방법은:
(a) 다분화성 또는 다능성 세포가 부착된 다수의 마이크로캐리어를 제공하는 단계;
(b) 다수의 마이크로캐리어를 응집시켜 응집체를 형성시키는 단계; 및
(c) ROCK 억제제의 존재하에 응집체를 배양하는 단계를 포함한다.
기술된 국면 및 양태에서, ROCK 억제제는 바람직하게는 Y-27632, HA-1077(파수딜), HA-1100(하이드록시파수딜), H-1152, 3-(4-피리딜)-1H-인돌, N-(4-피리딜)-N'-(2,4,6-트리클로로페닐)우레아, 아우로티오글루코즈, LY294002 또는, 이의 염, 염기, 에스테르 또는 전구약물 중에서 선택된다.
바람직한 양태에서, 마이크로캐리어는 매트릭스 피복을 갖지 않는다.
다른 양태에서, 마이크로캐리어의 표면은 매트릭스 속에서 피복될 수 있다. 매트릭스는 세포외 매트릭스 성분을 포함할 수 있고, MatrigelTM[제조원: 비디 바이오사이언시스(BD Biosciences)], 하이알루론산, 라미닌, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 콜라겐, 엘라스틴, 헤파란 설페이트, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 콘드로이틴 설페이트 중의 하나 이상일 수 있다. 매트릭스는 라미닌, 콜라겐 I, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 및 엔탁틴 1의 혼합물을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 다분화성 또는 다능성 세포는 줄기 세포이며, 배아 줄기 세포, 유도된 다분화성 줄기 세포 또는 성인 줄기 세포일 수 있다. 이들 세포는 포유동물[예를 들면, 토끼, 기나아 피그, 랫트, 마우스 또는 기타 설치류(다른 쥐목내의 특정 동물로부터의 세포 포함), 고양이, 개, 돼지, 양, 염소, 소, 말, 비-사람 포유동물, 비-사람 영장류], 영장류 또는 사람일 수 있다.
기술된 국면 및 양태에서, 마이크로캐리어는 셀룰로즈, 덱스트란, 하이드록실화된 메타크릴레이트, 콜라겐, 젤라틴, 폴리스티렌, 가소제, 유리, 세라믹, 실리콘 중의 하나 이상을 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다. 이와는 달리, 마이크로캐리어는 거대다공성(macroporous) 또는 미세다공성(microporous) 카보씨드(carboseed) 마이크로캐리어일 수 있다.
일부 양태에서, 마이크로캐리어는 프로타민 또는 폴리라이신과 커플링된다. 일부 양태에서, 마이크로캐리어는 양성으로 하전된다. 일부 양태에서, 마이크로캐리어는 양성 표면 전하를 갖는다. 일부 양태에서, 마이크로캐리어는 친수성이다. 일부 양태에서, 마이크로캐리어는 막대-형이다. 다른 양태에서, 마이크로캐리어는 실질적으로 구형(spherical-shape)를 갖는다.
본 발명에 따른 방법은 세포 배양물의 예를 들면, 약 5 내지 약 200 rpm, 약 5 내지 약 150 rpm, 약 5 내지 약 100 rpm, 약 30 rpm 이상 또는 약 50 rpm 이상, 또는 약 100 rpm 이상의 연속적이거나 간헐적인 교반을 포함할 수 있다. 이와는 달리, 당해 방법은 정적 배양을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 교반 속도 또는 양에 있어서의 증가를 사용하여 세포의 분화를 유도할 수 있는 반면, 교반의 보다 느린 속도 또는 양은 상당한 분화를 유도하지 않으면서 다분화성 또는 다능성 세포 집단을 확장시킬 수 있다.
상당한 분화를 유도하지 않으면서 다분화성 또는 다능성 세포 집단을 배양하기 위해서, 배양물을 약 5 rpm 내지 약 100 rpm, 약 5 rpm 내지 약 50 rpm, 약 5 rpm 내지 약 40 rpm, 약 5 rpm 내지 약 30 rpm, 약 5 rpm 내지 약 25 rpm, 약 5 rpm 내지 약 20 rpm, 약 5 rpm 내지 약 15 rpm, 또는 약 5 rpm 내지 약 10 rpm에서 교반할 수 있다.
상당한 분화의 유도를 위해, 배양물을 약 25 rpm 내지 약 200 rpm 이상, 예를 들면, 약 30 rpm 내지 약 200 rpm 이상, 약 35 rpm 내지 약 200 rpm 이상, 약 40 rpm 내지 약 200 rpm 이상, 약 45 rpm 내지 약 200 rpm 이상, 약 50 rpm 내지 약 200 rpm 이상, 약 75 rpm 내지 약 200 rpm 이상, 약 100 rpm 내지 약 200 rpm 이상에서 교반할 수 있다.
세포의 상당한 분화는, 배양물 중 세포의 적어도 약 10%가 분화하는 상태를 포함할 수 있다. 이와는 달리, 이는 배양물 중 세포의 약 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50% 중 적어도 하나가 분화하는 경우일 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법은 방법의 제1 부분을 교반의 제1 속도 또는 양으로 수행하여 세포를 배양하면서 이들의 다분화성 또는 다능성 상태를 유지한 후 세포를 교반의 제2 속도 또는 양에서 배양함으로써 배양물 속의 세포가 분화되도록 하는 제2 부분을 수행함을 포함할 수 있다. 제1 속도 또는 양은 바람직하게는 제2 속도 또는 양보다 적다. 따라서, 당해 방법의 제1 부분은 다분화성 또는 다능성 세포의 집단을 확장시킬 수 있으며 방법의 제2 부분은 내배엽, 외배엽 또는 중배엽 계통으로 이들 세포중 일부 또는 모두의 분화 방법을 시작할 수 있다.
본 발명의 추가의 국면에서, 치료가 요구되는 개인에서 질병을 치료하는 방법이 제공되며, 당해 방법은 본원에 기술된 방법에 따라 다분화성 또는 다능성 세포를 증식시키고, 분화된 세포 또는 배아유사세포덩어리를 생산하고, 다분화성 또는 다능성 줄기 세포, 분화된 세포 또는 배아유사세포덩어리를 개인에게 투여함을 포함한다.
본 발명의 하나 이상의 양태들 세부사항은 실시예의 방식에 의해, 본 발명을 수행하기 위해 본 발명자가 고려한 최상의 방식의 특정 세부사항을 포함하는 하기 기술과 함께 나타낸다. 당해 분야의 숙련가에게는, 본 발명이 이들 특정 세부사항에 한정되지 않고 실시될 수 있음이 명백할 것이다.
결과의 요약
본 발명자들은 매트릭스 피복, 예를 들면, 마트리겔의 부재하에서 마이크로캐리어 위에서 hESC를 5회 이상의 연속 계대배양 동안 각종의 마이크로캐리어[DE53, QA52, 도쇼(Tosoh), Cytodex 1, Cytodex 3]를 사용하여 ROCK 억제제 보충제[예를 들면, Y27632, HA1077(파수딜) 또는 아우리오티오글루코즈]의 존재하에서 배양하는 방법을 개발하였다. hESC는 5회 이상의 계대배양 후 자체의 성장, 최종 세포 밀도, 다분화성 마커 Oct4, Mab 84, 및 TRA-1-60의 발현, 및 정상 핵형을 보유하였다.
이는 광범위한 마이크로캐리어 피복을 사용하여 다분화성 및 다능성 세포를 배양하기 위한 마이크로캐리어의 용도에 있어서의 본 연구자들의 앞서의 연구를 개선시킨다[모두 본원에 참조로 혼입된 문헌(Oh et al 2009)에 부분적으로 보고되고 2009년 3월 17일자로 출원된 미국 특허출원 제US 61/069,694호, 2008년 10월 31일자로 출원된 제US 61/110,256호, 2009년 1월 29일자로 출원된 제US 61/148,064호 및 2009년 2월 27일자로 출원된 제US 61/155,940호에 추가로 기술되어 있다].
본 방법은 특히 마트리겔, 동물 기원한 매트릭스 또는, 다른 세포외 매트릭스 성분내 마이크로캐리어를 피복하는 필요성을 피하여, 다분화성 hESC의 확장 및 분화를 달성할 수 있으므로 특히 유망하다. 이는 연구, 치료학적 및 진단학적 적용에서 사용하기 위한, hESC 뿐만 아니라 다른 다분화성 및 다능성 세포를 확장 및 분화시키는 GMP 순응 방법을 개발하는데 보조할 것이다.
특히, 본 발명자들은:
1. 셀룰로즈 DE53 마이크로캐리어 위에서 9주(9회 계대배양) 동안 ROCK 억제제 Y-27632를 사용한 hESC의 장기간 배양(도 1).
2. 구형 도쇼 마이크로캐리어 위에서 6주(6회 계대배양) 동안 ROCK 억제제 Y-27632를 사용한 hESC의 장기간 배양(도 4).
3. 셀룰로즈 DE53, 도쇼, Cytodex 1 및 Cytodex 3 마이크로캐리어 위에서 5주(5회 계대배양) 동안 ROCK 억제제 Y-27632를 사용한 hESC의 장기간 배양의 비교(도 5).
4. 셀룰로즈 DE53, QA52, Tosoh, 및 Cytodex 3 마이크로캐리어 위에서 5 내지 10 주 사이에 ROCK 억제제 Y-27632를 사용한 hESC의 정상 핵형(도 10 및 11).
5. 셀룰로즈 DE53 마이크로캐리어 위에서 2주 동안 대체 ROCK 억제제, HA1077(파수딜) 및 아우로티오글루코즈를 사용한 hESC의 배양(도 12 내지 14)를 입증하였다.
줄기 세포의 현탁 배양 및 계대배양
본 발명자들은, 영장류 및 사람 줄기 세포 및 iPS 세포를 매트릭스 피복을 가진 입자 위에서 배양하고, 증식시키며, 계대배양할 수 있음을 이미 입증하였다. 특히, 본 발명자들은, 줄기 세포가 현탁 배양시 매트릭스-피복된 마이크로캐리어 위에서 연속적으로 성장하여 계대배양될 수 있음을 밝혔다.
본 발명자들은 이제 ROCK 억제제의 존재하에서 현탁액 속에서 줄기 세포를 증식시키는 방법을 기술한다. 증식 방법은 줄기 세포를 성장시키거나, 번식시키거나, 증식시키거나, 배양하거나, 확장하거나 증가시킴을 포함할 수 있다. 증식하는 줄기 세포는 하기 기술한 바와 같이, 1회 이상의 계대배양 동안 계대배양될 수 있다. 이러한 증식은 특정의 특성을 가진 마이크로캐리어 또는 입자의 사용을 통해 달성할 수 있다. 마이크로캐리어 또는 입자는 전하를 포함할 수 있다. 마이크로캐리어 또는 입자는 임의로 피복을 포함할 수 있다. 추가의 특성은 크기를 포함할 수 있다.
줄기 세포를 증식시키는 방법은 입자를 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 입자는 피복되지 않거나 이에 피복된 매트릭스를 포함할 수 있다. 이들은 양 전하를 가질 수 있다. 입자는 이에 부착된 영장류 또는 사람 줄기 세포의 응집을 허용하는 크기를 지닐 수 있다. 줄기 세포가 입자에 부착되도록 한다. 상이한 입자 위에서 성장하는 세포는 서로 접촉하여 응집체를 형성하도록 한다. 배양은 적어도 1회 계대배양 동안 계대배양된다. 줄기 세포는 캐리어에 부착된 상태로 사용하거나 이들로부터 탈착하거나 분리하여 사용할 수 있다. 이들은 분화되지 않은 상태 또는 다분화성 상태 또는 둘다로 사용될 수 있거나, 바람직한 세포 유형으로 분화될 수 있다. 이들을 사용하여 배아유사세포덩어리를 형성할 수 있다.
입자가 연속 성장을 지지하도록 하기 위하여, 입자는 영장류 또는 사람 줄기 세포의 치수와 부합되는 크기, 예를 들면, 10μm, 20μm, 30μm, 40μm, 50μm, 60μm, 70μm, 80μm, 90μm, 100μm, 110μm, 120μm, 130μm, 140μm, 150μm, 160μm, 170μm, 180μm, 190μm, 200μm, 210μm, 220μm, 230μm, 240μm, 250μm 등의 크기를 가져야 한다. 이러한 순서의 크기를 가진 입자 위에서 영장류 또는 사람 줄기 세포의 배양은, 세포가 이 위에서 성장하여 서로 응집하고 연속 성장을 지지할 수 있을 것이다. 적합한 조성, 입자의 형태 및 크기는 하기에 보다 상세히 기술되어 있다.
실시예들은, 사람 배아 줄기 세포 2D 콜로니 배양물과 같은 줄기 세포 배양물을 마이크로캐리어 입자 위에 접종하여 ROCK 억제제의 존재하에 수 세대 동안 1회 이상의 계대배양을 사용하여 성장시킬 수 있음을 나타낸다. 줄기 세포는 기계적 또는 효소적 해리와 같은 특정 수단, 또는 방법 둘다의 조합에 의해 표면으로부터 제거(dislodging)하여 계대배양할 수 있다.
마이크로캐리어 입자 배양물은 입자 위에서 세대에 걸쳐 성장시킬 수 있다. 이와는 달리, 또는 추가로, 배양물은 통상의 2D 배양으로 이들 사이의 하나 이상의 세대 동안 성장시킬 수 있다. 마이크로캐리어 위에서 성장하는 사람 줄기 세포는 2D 콜로니 배양으로 다시 이전시키고 역으로 이전시킬 수 있다.
본원에 기술된 방법은 분화되지 않은 형태의 줄기 세포의 효율적인 번식을 위해 유용한 방법이 되도록 한다. 마이크로캐리어 배양물은 통상의 2D 배양의 경우 가능한 것보다 높은, 1 내지 2 및 1 내지 10의 분할 비로 기계적 또는 효소적 해리에 의해 마이크로캐리어 위로 계대배양될 수 있다. 이는 배양물의 보다 신속한 확장과 함께 생체물질의 보다 효율적인 이용이 가능하도록 한다.
마이크로캐리어 배양에서 세포의 용적 수율은 통상적으로 2D 콜로니 대조군의 2 내지 4배 이상이다. 본원에 기술된 방법에 의해 번식된 사람 줄기 세포의 용적 수율은 2백만개 이하의 세포/ml 이상일 수 있다.
본원에 기술된 방법은 하기에 보다 상세히 기술된 바와 같이, 입자로부터 입자로 9회의 계대배양 이상 동안 사람 줄기 세포의 계대배양이 가능하도록 한다.
본원에 기술된 방법은 자체의 다분화성 특성을 보유하는 줄기 세포의 번식이 가능하다. 하기 실시예는, 본원에 기술된 방법 및 조성물에 따라 번식된 사람 배아 줄기 세포가 줄기 세포의 하나 이상의 생물학적 특성을 유지할 수 있음을 나타낸다. 따라서, 번식된 줄기 세포는, 2D 콜로니 배양과 같이 성장한 줄기 세포와 동등한 5회 이상의 계대배양 동안 다분화성 마커, Oct-4, Tra-1-60 및 mAb 84의 발현을 나타내며, 정상 핵형을 유지한다.
의미있게도, 마이크로캐리어 위에 줄기 세포를 정착시킴으로써, 대규모 스피너 플라스크(spinner flask) 속에서 세포를 일련 계대배양하는 것이 가능하다.
어떠한 줄기 세포도 본원에 기술된 방법을 사용하여 번식시킬 수 있다. 이들은, 원숭이, 유인원 또는 사람 줄기 세포와 같은 영장류 줄기 세포를 포함할 수 있다. 줄기 세포는 배아 줄기 세포 또는 성인 줄기 세포를 포함할 수 있다. 줄기 세포는 유도된 다분화성 줄기 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 줄기 세포는 사람 배아 줄기 세포(hESC)를 포함할 수 있다. 본원에 기술된 방법 및 조성물에서 사용하기에 적합한 이들 및 다른 줄기 세포는 하기에 보다 상세히 기술되어 있다.
본원에 기술된 방법 및 조성물은 공지된 "2D" 배양 방법보다 다양한 장점을 가진다. 입자는 2D 콜로니 배양 기질보다 줄기 세포를 부착시키는데 있어서 보다 효율적이다. 이러한 및 다른 이유로 인해, 현탁 배양된 세포는 보다 효과적으로 계대배양될 수 있다. 본원에 기술된 방법은, 줄기 세포가 수회의 주기에 걸쳐 동결 및 해동되도록 한다. 이들은 마이크로캐리어 위에서 직접 동결되어 성장 배지(전통적인 플레이트 배양 또는 미립자 마이크로캐리어에 상관없이) 위에서 해동될 수 있다. 마이크로캐리어 위에서 번식된 줄기 세포는 GMP 순응성인 혈청이 없는 배지 속에서 성장시킬 수 있다.
본원에 기술된 방법은, 필수적으로 분화되지 않은 상태의 배아 줄기 세포와 같은 줄기 세포의 배양 및 유지가 가능하다. 번식된 줄기 세포는 배양물(예를 들면, 마이크로캐리어 위의) 속에서 부분적으로 또는 전체적으로 분화될 수 있다.
번식된 줄기 세포를 사용하여 추가로 사용하기 위한 배아유사세포덩어리를 형성시키는데 사용할 수 있다. 마이크로캐리어 위에서 성장하는 줄기 세포는 단순히 분화 배지로 이전시켜 배아유사세포덩어리 형성 전에 2D 성장하는 표면으로부터 세포를 제거하는 추가의 단계가 요구되는, 선행 기술의 방법과는 대조적으로, 배아유사세포덩어리를 직접 형성시킬 수 있다.
따라서, 본원에 기술된 방법 및 조성물은, 성장하는 표면 또는 기질 위에서 줄기 세포를 이들로부터의 제거없이 직접 분화시킬 수 있다.
본원에 기술된 방법 및 조성물은 배양된 줄기 세포를 보다 큰 용적으로 확장시키고 확대시킬 수 있다. 생물반응기 또는 산업 규모로의 확대는 줄기 세포의 보다 생산적인 배양이 가능하도록 한다. 교반된 배양으로 마이크로캐리어 위에서 줄기 세포를 성장시키는 능력은, 배양을 현탁 조건으로 확대시킬 수 있음을 의미한다. 웨이브 생물반응기(Wave Bioreactor)와 같은 조절된 생물반응기 또는 교반된 배양을 사용할 수 있다. 이는 세포가 정착 의존적인 2차원 콜로니 배양의 현재의 제한과 비교하여 보다 큰 용적으로 확장될 수 있도록 한다. 100 리터까지의 생물반응기 속에서 대규모 현탁 배양이 가능하다.
ROCK 억제제
본 발명에 따른 방법은 ROCK 억제제의 존재하에서 다분화성 또는 다능성 세포의 배양, 성장, 번식, 증식, 집단 확장 및/또는 분화에 관한 것이다.
Rho 키나제[Rho-관련된 코일드-코일(coiled-coil) 키나제 또는 ROCK; 진뱅크(GenBank) 수탁 번호: NM_005406], 세린/트레오닌 키나제는 Rho(이중 3개의 동형 RhoA, RhoB 및 RhoC가 존재한다)에 대한 표적 단백질로서 제공되며 RhoA-유도된 스트레스 섬유(stress fiber) 및 중심 부착의 형성의 매개인자로서 특징화되어 왔다.
ROCK I(달리는 ROK b로 명명됨) 및 ROCK II(또는 Rho 키나제 또는 ROK a로 공지됨)는 RhoA-GTP 상호작용 단백질로서 원래 분리되었다. 2개의 키나제는 촉매 키나제 도메인내에서 89% 동질성과 함께 사람에서 64%의 전체 동질성을 갖는다. 키나제 둘다는 C1 보존된 영역(80% 동질성)으로 분할된 코일드-코일 영역((55% 동질성) 및 플렉스트린 상동성(pleckstrin homology)(PH) 도메인을 함유한다. ROCK 키나제 억제의 고찰을 위해 문헌[참조: Olson et al (Current Opinion in Cell Biology 2008, 20:242-248]을 참조한다.
ROCK는 하부 표적 단백질의 인산화를 통해 액틴-미오신 매개된 수축력 생성을 촉진한다. ROCK는 이들의 활성 루프내 보존된 트레오닌에서 LIM 키나제-1 및 키나제-2(LIMK1 및 LIMK2)를 인산화하여, LIMK 활성을 증가시키고, 이들의 팍틴(Factin)-제공 활성을 차단하는, 코필린 단백질의 후속적인 인산화를 증가시킨다. ROCK는 또한 조절성 미오신 경쇄(MLC) 및 MLC 포스파타제의 미오신-결합 소단위(MYPT1)를 직접 인산화하여 촉매 활성을 억제한다. ROCK 활성화는 힘 생성 및 형태학적 변화를 촉진하는 일련의 현상을 초래한다. 이들 현상은 세포 운동성, 부착, 평활근 수축, 신경돌기 수축(neurite retraction), 및 포식작용과 같은 다수의 액틴-미오신 매개된 과정에 직접 기여한다. 또한, ROCK 키나제는, 비록 이들 반응이 세포형-의존성일 수 있다고 해도, 증식, 분화, 세포자멸사 및 종양혈성 형질전환에서 역활을 담당한다.
본 명세서에서, "ROCK 억제제"는 ROCK I 및/또는 ROCK II를 억제할 수 있고, 바람직하게는 100μm 미만, 보다 바람직하게는 10μm 미만, 여전히 보다 바람직하게는 1μm 미만 및 여전히 보다 바람직하게는 900nM 미만 또는 약 800nM, 700nM, 600nM, 또는 500nM 중 하나와 동등한 IC50을 가질 수 있는 분자, 화합물, 물질 또는 조성물이다. 본 발명에 유용한 ROCK 키나제는, 동일한 ROCK 키나제 검정에서 측정한 것으로서, 실질적으로 Y-27632의 IC50과 동일하거나 이보다 우수한 IC50 또는 500nM내의 Y-27632의 IC50을 가질 수 있다.
본 명세서에서, "ROCK 억제제"는 또한 NFKappa B 및 PI3 키나제의 억제제로 원칙적으로 공지된 아우로티오글루코즈 및 LY294002를 말한다. 이로서, 본원에 기술된 국면 및 양태에서, ROCK 억제제의 사용은 NFKappaB 및/또는 PI3 키나제 억제제의 사용을 포함한다.
ROCK 키나제 억제 검정은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, HTScan® ROCK2 키나제 검정 키트 #7508[제조원; 세포 시그날링 테크놀로지, 인코포레이티드(Cell Signalling Technology, Inc.)], 및 ROCK-II 검정 키트 제품 번호 R8163 및 R8164[제조원: 몰레큘러 디바이시즈(Molecular Devices)]가 있다.
본 발명의 방법에서, 배양물에 가해진 ROCK 억제제의 양은 일반적으로 제조업자의 지시 및 배양물의 크기를 고려할 것이다. 예를 들어, ROCK 억제제의 대표적인 농도는 10 내지 50μm 범위내일 것이다. ROCK 억제제는 배양 배지에, 예를 들면, 매일 규칙적으로 가함으로써 바람직한 농도를 유지시킬 수 있다.
ROCK 억제제를 배양 배지에 가하여 배양 배지 중 ROCK 억제제의 농도가 적어도 1μm, 적어도 2μm, 적어도 3μm, 적어도 4μm, 적어도 5μm, 적어도 6μm, 적어도 7μm, 적어도 8μm, 적어도 9μm, 적어도 10μm, 적어도 15μm, 적어도 20μm, 적어도 30μm, 적어도 40μm, 또는 적어도 50μm 중 하나가 되도록 할 수 있다. ROCK 억제제는 임의로 배양 배지 속에 100μm, 90μm, 80μm, 70μm, 또는 60μm 중 하나 미만의 농도로 배양 배지에 존재할 수 있다.
ROCK 억제제는 활성제의 염, 염기, 에스테르 또는 전구약물로서 제공될 수 있다.
ROCK 억제제의 예는 다음을 포함한다:
(A) Y-27632
Y-27632는, IC50이 약 800nM이고 다음과 같은 구조식 1을 갖는 ROCK I 및 ROCK II의 매우 강력하고, 세포 침투성이고, 선택성이며 ATP 경쟁적인 억제제이다:
Figure pct00001

Y-27632는 디하이드로클로라이드 [(R)-(+)-트랜스-N-(4-피리딜)-4-(1-아미노에틸)-사이클로헥산카복스아미드.2HCl]로서 일반적으로 제조되어 시판된다.
Y-27632는 다음의 공개된 논문에서 고찰되며, 이들 모두는 본원에 참조로 혼입되어 있다:
- Calcium sensitization of smooth muscle mediated by a Rho-associated protein kinase in hypertension: M. Uehata, et al.; Nature 389, 990 (1997);
- Molecular dissection of the Rho-associated protein kinase (p160ROCK)-regulated neurite remodeling in neuroblastoma N1E-115 cells: M. Hirose, et al.; J. Cell Biol. 141, 1625 (1998);
- Signaling from Rho to the actin cytoskeleton through protein kinases ROCK and LIM-kinase: M. Maekawa, et al.; Science 285, 895 (1999);
- Specificity and mechanism of action of some commonly used protein kinase inhibitors: S.P. Davies, et al.; Biochem. J. 351, 95 (2000);
- Use and properties of ROCK-specific inhibitor Y-27632: S. Narumiya, et al.; Meth. Enzymol. 325, 273 (2000);
- Pharmacological properties of Y-27632, a specific inhibitor of rho-associated kinasess: T. Ishizaki, et al.; Mol. Pharmacol. 57, 976 (2000);
- A p160ROCK-specific inhibitor, Y-27632, attenuates rat hepatic stellate cell growth: H. Iwamoto, et al.; J. Hepatol. 32, 762 (2000);
- Y-27632, an inhibitor of rho-associated protein kinase, suppresses tumor cell invasion via regulation of focal adhesion and focal adhesion kinase: F. Imamura, et al.; Jpn. J. Cancer Res. 91, 811 (2000);
- The effect of a Rho kinanse inhibitor Y-27632 on superoxide production, aggregation and adhesion in human polymorphonuclear leukocytes: A. Kawaguchi, et al.; Eur. J. Pharmacol. 403, 203 (2000);
- Antagonism of Rho-kinase stimulates rat penile erection via a nitric oxide-independent pathway: K. Chitaley, et al.; Nat. Med. 7, 119 (2001);
- Inhibition of intrahepatic metastasis of human hepatocellular carcinoma by Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632: M. Takamura, et al.; Hepatology 33, 577 (2001);
- Inhibition of high K+-induced contraction by the ROCKs inhibitor Y-27632 in vascular smooth muscle: possible involvement of ROCKs in a signal transduction pathway: K. Sakamoto, et al.; J. Pharmacol. Sci. 92, 56 (2003).
(B) HA -1077 ( Fasudil ; 파수딜 )
HA-1077는 미오신 경쇄 키나제 및 Ca2 +/칼모둘린-의존성 단백질 키나제 II의 억제제이다. 이는 PKCβI, PKCβII and PKCζ의 전위를 억제하고 항혈관경축 특성을 갖는 세포 투과성 Ca2 + 길항제(antagonist)이다. 이는 분자량이 약 291.36이다. 이는 ATP와 경쟁함으로써 ROCK를 억제한다. ROCK1에 대한 IC50은 1.2 mmmol/l이고 ROCK2에 대한 IC50은 0.82mmol/l이다. 이는 또한 기타 세린/트레오닌 키나제에 대한 비특이적 억제 효과, 예를 들면, PKA에 대한 IC50은 5.3mmol/l이고 PKCa에 대한 IC50 은 >100mmol/l이다. 디하이드로클로라이드는 다음 구조식 2를 갖는다:
Figure pct00002
HA-1077은 본원에서 참고문헌으로 포함되는 다음의 공개된 논문들에서 검토된다:
- The effects of an intracellular calcium antagonist HA 1077 on delayed cerebral vasospasm in dogs: O. Shibuya, et al.; Acta Neurochir. 90, 53 (1988);
- Vasodilator actions of HA1077 in vitro and in vivo putatively mediated by the inhibition of protein kinase: T. Asano, et al.; Br. J. Pharmacol. 98, 1091 (1989).
(C) HA -1100 ( HydroxyFasudil; 하이드록시 파수딜 )
HA-1100은 MLCK, MRCKβ 및 PKC에 비하여 약 100배 큰 선택성을 갖는 Rho 키나제 (ROCK)의 ATP-경쟁성 및 가역성 억제제로서 작용하는 HA-1077의 세포 침투성, 하이드록실화된 대사물질이다. 분자량은 약 343.8이다. 이는 파수딜 보다 ROCK에 대한 더 큰 선택성 억제제를 갖는다: ROCK1에 대한 IC50은 0.73 mmmol/l이고 ROCK2에 대한 IC50은 0.72mmol/l이다. 이는 또한 기타 세린/트레오닌 키나제에 대한 비-특이성 억제 효과를 가지며, 예를 들면, PKA에 대한 IC50은 37mmol/l이고 PKCa에 대한 IC50은 >100mmol/l이다. 하이드로클로라이드는 다음 구조식 (3)을 갖는다:
Figure pct00003
HA-1100은 본원에서 참고문헌으로 포함되는 다음 공개 논문에서 검토된다:
- Rho-kinase-mediated pathway induces enhanced myosin light chain phosphorylations in a swine model of coronary artery spasm: H. Shimokawa, et al.; Cardiovasc. Res. 43, 1029 (1999);
- Hydroxyfasudil, an active metabolite of fasudil hydrochloride, relaxes the rabbit basilar artery by disinhibition of myosin light chain phosphatase: K. Nakamura, et al.; J. Cereb. Blood Flow Metab. 21, 876 (2001);
- Pitavastatin enhanced BMP-2 and osteocalcin expression by inhibition of Rho-associated kinase in human osteoblasts: K. Ohnaka, et al.; BBRC 287, 337 (2001);
- Antianginal effects of hydroxyfasudil, a Rho-Kinase inhibitor, in a canine model of effort angina: T. Utsunomiya, et al.; Br. J. Pharmacol. 134, 1724 (2001).
(D) H-1152 ( Rho Kinase Inhibitor I; Rho 키나제 억제제 I)
H-1152[(S)-(+)-2-메틸-1-[(4-메틸-5-이소퀴놀리닐)설포닐]호모피페라진]은 Rho 키나제(ROCK)(Ki=1.6nM)의 세포 투과성, 고 특이성, 잠재성 및 ATP-경쟁성 억제제이다. 이는 Y-27632보다 더 잠재성이고 더 선택성이다. Ki ROCK은 1.6nM(Ki PKA:630nM, Ki PKC:9.27μM, Ki MLCK: 10.1μM)이다. 분자량은 약 392.3이다. H-1152의 디하이드로클로라이드는 다음 구조식 (4)를 갖는다:
Figure pct00004
HA-1152는, 모두 본원에서 참고문헌으로 포함되는 다음 공개 논문에서 검토된다:
- Inhibition of rho-kinase-induced myristoylated alanine-rich C kinase substrate (MARCKS) phosphorylation in human neuronal cells by H-1152, a novel and specific Rho-kinase inhibitor: M. Ikenoya, et al.; J. Neurochem. 81, 9 (2002);
- The novel and specific Rho-kinase inhibitor (S)-(+)-2-methyl-1-[(4-methyl-5-isoquinoline)sulfonyl]-homopiperazine as a probing molecule for Rho-kinase-involved pathway: Y. Sasaki, et al.; Pharmacol. Ther. 93, 225 (2002);
- New aspects of neurotransmitter release and exocytosis: Rho-Kinase-dependent myristoylated alanine-rich C-kinase substrate phosphorylation and regulation of neurofilament structure in neuronal cells: Y. Sasaki; J. Pharmacol. Sci. 93, 35 (2003);
- Protein kinase A in complex with Rho-kinase inhibitors Y-27632, Fasudil, and H-1152P: structural basis of selectivity: C. Breitenlechner, et al.; Structure 11, 1595 (2003);
Involvement of Rho-kinase in inflammatory and neuropathic pain through phosphorylation of myristoylated alanine-rich C-kinase substrate (MARCKS): S. Tatsumi, et al.; Neuroscience 131, 491 (2005);
Rho-kinase mediates spinal nitric oxide formation by prostaglandin E2 via EP3 subtype: S. Matsumura, et al.; BBRC 338, 550 (2005).
(E) 3-(4-피리딜)-1H-인돌
3-(4-피리딜)-1H-인돌은 Y-27632보다 적은 잠재성인 것으로 나타나고 다음 구조식 (5)을 갖는 Rho 키나제 (ROCK) (IC50=25μM)의 세포 투과성, 선택성 및 ATP-경쟁성 억제제이다:
Figure pct00005
3-(4-피리딜)-1H-인돌
3-(4-피리딜)-1H-인돌은, 모두 본원에서 참고문헌으로 포함되는 다음 공개 논문에서 검토된다:
- Screening for cell migration inhibitors via automated microscopy reveals a Rho-kinase inhibitor: J.C. Yarrow, et al.; Chem. Biol. 12, 385 (2005);
- Scratch n' screen for inhibitors of cell migration: J. Soderholm & R. Heald; Chem. Biol. 12, 263 (2005).
(F) N-(4-피리딜)-N'-(2,4,6-트리클로로페닐)우레아( Rho 키나제 억제제 II )
N-(4-피리딜)-N'-(2,4,6-트리클로로페닐)우레아는 다음 구조식 (6)을 갖는 Rho 키나제 (ROCK) (IC50=0.2μm)의 잠재성, 선택성 및 ATP-경쟁성 억제제이다:
Figure pct00006
N-(4-피리딜)-N'-(2,4,6-트리클로로페닐)우레아
N-(4-피리딜)-N'-(2,4,6-트리클로로페닐)우레아는 본원에서 참고문헌으로 포함되는 다음 공개 논문에서 검토된다:
- Design and synthesis of Rho Kinase inhibitors (I): A. Takami, et al.; Bioorg. Med. Chem. 12, 2115 (2004).
(G) 아우로티오글루코즈
금 티오클루코즈로서도 공지된 아우로티오글루코즈는 일반식 AuSC6H11O5를 갖는다:
Figure pct00007
아우로티오글루코즈는 PKCiota-Par6 상호작용 억제제이다. 이러한 상호작용의 중단은 비-소세포 폐암에서 형질전환된 성장을 위해 필요한 Rac1 시그날링 경로를 붕괴시킨다. IC50: 1 μM.
아우로티오글루코즈는 IL-1 작용성 길항제로서 작용함으로써 유도된 NF-kB 및 AP-1 활성을 억제한다.
아우로티오글루코즈는 관절염으로 인한 염증 및 팽윤을 감소시키는 데 있어서의 이의 작용에 대하여 공지되어 있다. 그리고, 성인 또는 청소년 류마티스 관절염의 초기 단계의 치료에 사용되어 왔다.
아우로티오글루코즈(ATG)를 포함하는 금(I)-함유 화합물은 수개의 셀레노시스테인-함유 효소의 시험관내 억제제에서 강력하다[참조: Smith et al J Nutr. 1999 Jan;129(1):194-8]. 아우로티오글루코즈는 단백질 키나제 C 매개된 억제에서 관련된다[참조: Stallings-Mann M et al. A novel small-molecule inhibitor of protein kinase C blocks transformed growth of non-small cell lung cancer cells. Cancer Res 2006; 66:1767-74 and Beverly A.Teicher. Protein kinase C as a Therapeutic Target. Clin Cancer Res 2006;12(18) September 15, 2006].
아우로티오글루코즈는 IL-1 작용성 길항제로서 작용함으로써 유도된 NF-kB 및 AP-1 활성을 억제하는 것으로 나타났다[참조: Williams, D H : Jeffery, L J : Murray, E J Biochim-Biophys-Acta. 1992 Oct 13; 1180(1): 9-14].
아우로티오글루코즈는 또한 TPA-유도된 NF-카파B 핵 전위를 억제하는 것으로 나타났다[참조: Yamashita M et al. Inhibition of TPA-induced NF-kappaB nuclear translocation and production of NO and PGE2 by the anti-rheumatic gold compounds. J Pharm Pharmacol. 2003 Feb;55(2):245-51].
(H) LY294002
LY294002는 다음 구조식 (7)을 갖는다:
Figure pct00008
LY294002(포스파티딜이노시톨 3 키나제 억제제)는 포스파티딜이소시톨 3(PI3) 키나제의 고도로 선택적인 억제제로서 생체내에서 작용하는 것으로 밝혀졌다. 50μM의 농도에서 사용되면, 이는 PI3 키나제 활성(IC50=0.43㎍/ml; 1.40μM)을 특이적으로 폐지시켰지만 PI4 키나제, PKC, MAP 키나제 또는 c-Src와 같은 다른 지질 및 단백질 키나제를 억제하지 않았다[참조: Vlahos, C. (1994) J. Biol. Chem. 269, 5241-5248).
다른 ROCK 억제제는 Wf-536[참조: Nakajima et al., Cancer Chemother Pharmacol. 52(4): 319-324 (2003)] 및 Y-30141(참조: US 5478838), 및 ROCK용 안티센스 핵산, ROCK용 RNA 방해 핵산(예를 들면, siRNA)을 포함한다.
양성 전하
입자 또는 마이크로캐리어는 예를 들면, 중성 pH 또는, pH 7.4 또는 pH 7.2와 같은 생리학적으로 관련된 pH에서 양성 전하를 포함할 수 있다. 입자는 음이온 교환 수지와 같은 크로마토그래피 수지를 포함할 수 있다.
양성 전하의 양은 변할 수 있지만, 일부 양태에서 세포가 입자에 부착하기에 충분히 많아야 하는 것이 요구된다. 예를 들면, 입자를 4급 또는 3급 아민과 같은 아민과 커플링시켜 하전시키는 경우, 입자 상의 전하는 건조 물질(입자의)의 그람 당 약 0.5 내지 4 밀리-당량, 예를 들면, 무수 물질(입자의)의 그람 당 약 1 내지 3.5 밀리-당량 또는 무수 물질(입자의)의 그람 당 약 1 내지 2 밀리-당량의 의 소 이온 교환능에 상응할 수 있다.
양성 전하는, 입자의 pKa가 7 초과(예를 들면, 7.4보다 큰, 예를 들면, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5 이상)이도록 하는 것일 수 있다.
입자는 예를 들면 20mg/ml 입자 이하의 농도에서 프로타민 설페이트 또는 폴리-L-라이신 하이드로브로마이드에 커플링시켜 유도체화할 수 있다. 이론에 얽메이지 않고, 본 발명자들은, 입자 위의 양성 전하의 존재가 이에 대한 세포의 부착을 보조하는 것으로 믿고 있다.
입자는 당해 분야에 공지된 어떠한 수단을 통해서도 양성 전하를 수반할 수 있다. 입자는 양성으로 하전된 그룹을 포함할 수 있거나, 이는 이들을 수반하도록 유도체화될 수 있다.
입자는 디에틸아미노에틸-셀룰로즈(DEAE-셀룰로즈) 또는 이의 유도체를 포함할 수 있다. DEAE-셀룰로즈는, 화학적으로 개질되어 탄수화물의 -CH2OH 그룹이 이온화가능한 3급 아민 그룹으로 전환될 수 있도록 하는 미세과립 셀룰로즈를 포함한다. 이는 중성 pH에서 양성으로 하전된다.
입자는 DEAE-세파덱스와 같은 세파덱스 비드를 포함할 수 있다. 입자는 세파로즈(즉, DEAE-세파로즈)와 같은 공유적으로 가교-결합될 수 있는 아가로즈 비드를 포함할 수 있다. 입자는 DEAE-세파셀을 포함할 수 있다. DEAE-세파로즈, DEAE-세파셀 및 DEAE-세파덱스는 시그마-알드리히(Sigma-Aldrich)로부터 시판된다. 입자는 Q-세파로즈 패스트 플로우(Q-Sepharose Fast Flow) 또는 S-세파로즈 패스트 플로우를 포함할 수 있다. Q-세파로즈의 하전된 그룹은 적정불가능한 양성 전하를 수반하는 4급 아민이다.
입자는 양성 전하를 수반하기 위해 유도체화될 수 있다. 예를 들어, 입자는 이에 부착된 아민 그룹을 포함할 수 있다. 아민 그룹은 1급 아민 그룹, 2급 아민 그룹, 3급 아민 그룹 또는 4급 아민 그룹일 수 있다. 아민 그룹은 입자를 아민 함유 화합물과 커플링시켜 입자에 부착시킬 수 있다. 커플링 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 아민은 시아노겐브로마이드를 사용하여 입자에 커플링시킬 수 있다. 가교결합제를 또한 사용할 수 있다. 이들은 2개의 동일한 반응성 그룹을 함유하는 단독이기능성 가교결합제, 또는 2개의 상이한 반응성 그룹과의 이종이기능성 가교결합제로 분할된다. 이종이기능성 가교결합제는 순차적인 접합(conjugation), 중합화의 최소화를 허용한다. 커플링 및 가교결합 시약은 다수의 제조업자, 예를 들면, 칼바이오켐(Calbiochem) 또는 피어스 케미칼 캄파니(Pierce Chemical Company)로부터 수득할 수 있다. 입자는 커플링 전에 활성화시켜 이의 반응성을 증가시킬 수 있다. 압착 입자는 클로로아세트산을 사용한 후 EDAC/NHS-OH를 사용하여 커플링시킴으로서 활성화시킬 수 있다. 입자는 또한 헥산 디 이소시아네이트를 사용하여 활성화시킴으로써 1급 아미노 그룹을 수득할 수 있다. 이러한 활성화된 입자는 특정의 헤테로이기능성 가교결합제와 함께 사용할 수 있다. 특정 양태에서 압착 입자는 디비닐 설폰을 사용하여 활성화시킨다. 이러한 활성화된 압착 입자는 예를 들면, 펩타이드 위에서 아미노 또는 티올 그룹과 반응할 수 있는 잔기를 포함한다.
입자는 또한 트레실 클로라이드를 사용하여 활성화시켜 아미노 또는 티올 그룹과 반응할 수 있는 잔기를 제공할 수 있다. 입자는 또한 시아노겐 브로마이드를 사용하여 활성화시켜서 아미노 또는 티올 그룹과 반응할 수 있는 잔기를 제공할 수 있다.
Cytodex 1은 양성으로 하전된 N,N-디에틸아미노에틸 그룹으로 치환된 가교-결합된 덱스트란 매트릭스를 기초로 한다. 하전된 그룹은 마이크로캐리어 매트릭스 전반에 걸쳐 분산된다.
하전되지 않은 입자
입자 또는 마이크로캐리어는 하전되지 않거나, 예를 들면, 중성 pH 또는, pH 7.4 또는 pH 7.2와 같은 생리학적으로 관련된 pH에서 중성으로 하전될 수 있다.
하전되지 않은 입자의 예는 젤라틴 또는 콜라겐 입자를 포함한다. 예를 들어, Cytodex 3은 가교-결합된 덱스트란의 매트릭스에 화학적으로 커플링된 변성된 콜라겐의 박층으로 이루어진다.
매트릭스 피복
ROCK 억제제의 사용이 본 발명자들에 의해 마이크로캐리어 위에서의 매트릭스 피복의 부재하에서 마이크로캐리어 위의 다분화성 및 다능성 세포의 성공적인 배양 및 계대배양이 가능함이 발견된 것이 본 발명의 중추이다. 지금까지, 다분화성 및 다능성 세포의 마이크로캐리어 배양은, 마이크로캐리어가 매트릭스 피복물을 가져야 하는 것으로 고려되어 왔으며, 본 발명은 GMP 순응도를 위해 보다 더 처리가능한 피복되지 않은 마이크로캐리어 배양에 대한 가능성을 열었다. 따라서, 많은 양태에서, 마이크로캐리어는 피복되지 않거나 매트릭스 피복을 가지지 않지만 또한 피복되거나 유도체화되어 마이크로캐리어의 표면에 전하를 제공할 수 있다. 그러나, 하기 기술한 바와 같이, 다른 양태에서, 매트릭스 피복을 포함하는 것도 가능하다.
따라서, 입자는 본원의 내용에서 이의 표면 위와 같은 입자에 부착된 물질의 층(예를 들면, 박층 또는 필름)을 언급하는, 매트릭스로 피복될 수 있다. 매트릭스는 세포의 성장을 지지할 수 있는 생물학적으로 또는 혼용적으로 또는 생리학적으로 관련된 매트릭스를 포함할 수 있다. 이는 세포 성장을 위한 기질을 포함할 수 있다.
매트릭스는 세포외 매트릭스(ECM)의 성분을 포함할 수 있다. 줄기 세포의 성장을 지지할 수 있는 것들과 같은 ECM의 공지된 성분들 중 어느 것도 사용할 수 있다. 세포외 매트릭스의 성분은 당해 분야에 공지되어 있으며 예를 들면, 문헌[참조: Alberts et al (2002), Molecular Biology of the Cell, Chapter IV] 및 이에 인용된 문헌들에 기술되어 있다.
ECM 성분은 통상의 수단을 통해 입자에 부착되거나 커플링되거나 피복될 수 있다. 예를 들어, 위에서 기술된 커플링 시약 및 가교결합제 중 어느 것도 ECM 성분을 입자에 커플링시키는데 사용할 수 있다.
ECM 성분은 다당류, 단백질, 프로테오글리칸, 당단백질, 프로테오글리칸의 형태로 단백질에 공유결합하는 것으로 일반적으로 밝혀진, 글리코사미노글리칸(GAG), 엘라스틴, 피브로넥틴 및 라미닌을 포함하는 섬유 단백질, 콜라겐(예를 들면, 콜라겐 I, 콜라겐 III, 콜라겐 IV, 콜라겐 VI) 등과 같은 거대분자를 포함할 수 있다.
매트릭스 피복은 글루코사미노글리칸(GAG)을 포함할 수 있다. 글리코사미노글리칸은 반복되는 이당류 단위로 구성된 측쇄된 다당류 쇄를 포함한다. 반복되는 이당류 내 2개의 당 중 하나는 항상 아미노 당 (N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)이며, 이는 대부분의 경우 황산염화되어 있다. 제2 당은 일반적으로 우론산(글루쿠론산 또는 이두론산)이다.
매트릭스 피복은 하이알루로난(또한 하이알루론산 또는 하이알루로네이트로 불림) 또는 이의 유도체를 포함할 수 있다. 하이알루론산은 소 유리체액으로부터와 같은 임의의 수의 공급원으로부터 기원할 수 있다. 하이알루론산 나트륨과 같은, 하이알루론산의 염 또는 염기를 사용할 수 있다. 이는 스트렙토코쿠스로부터 기원할 수 있다.
매트릭스 피복은 라미닌을 포함할 수 있다. 매트릭스 피복은 피브로넥틴을 포함할 수 있다. 매트릭스 피복은 비트로넥틴을 포함할 수 있다.
매트릭스 피복은 예를 들면, 프로테오글리칸과 같은 단백질에 결합된 것으로서, 콘드로이틴 설페이트, 데르마탄 설페이트, 헤파란 설페이트 및 케라탄 설페이트와 같은 GAG를 포함할 수 있다. ECM 성분은 아그레칸, 데코린 등을 포함할 수 있다.
매트릭스 피복은 헤파란 또는, 염기 또는 염과 같은 이의 유도체를 포함할 수 있다. 매트릭스 피복은 헤파란 설페이트 프로테오글리칸을 포함할 수 있다. 헤파란 설페이트 프로테오글리칸을 소 신장으로부터와 같은 특정한 수의 공급원으로부터 기원할 수 있다.
매트릭스 피복은 덱스트란 설페이트 또는 덱스트란 설페이트 나트륨과 같은 덱스트란을 포함할 수 있다. 매트릭스 피복은 피브로넥틴, 라미닌, 니도겐(nidogen) 또는 제IV형 콜라겐을 포함할 수 있다. 매트릭스 피복은 콘드리이틴 설페이트를 포함할 수 있다.
매트릭스는 젤라틴, 폴리오미틴, 또는 피브로넥틴의 RGD 결합 도메인의 결합 모티프를 포함할 수 있다.
매트릭스 피복은 다양한 비율의 이들 성분들의 특정의 2개 이상의 혼합물을 포함할 수 있다. 매트릭스 피복은 ECM의 정제되거나 실질적으로 정제된 성분을 포함할 수 있다. 매트릭스 성분은 ECM의 부분 정제된 성분을 포함할 수 있다. 이는 마트리겔과 같은 ECM 추출물을 포함할 수 있다.
세포 배양은 상이한 매트릭스 피복을 갖는 입자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 제1의 입자 집단은 위에서 기술된 것들로부터 선택된 제1의 매트릭스 피복을 가지며 제2이 입자 집단은 위에서 기술된 것들로부터 선택된 제2의 피복을 가진다.
매트리겔
입자는 마트리겔을 포함하는 매트릭스 피복으로 피복될 수 있다.
마트리겔은 마우스 종양 세포에 의해 분비되고 비디 바이오사이언시스(BD Biosciences: 미국 매사츄세츠주 베드포드 소재)에 의해 시판되는 젤라틴성 단백질 혼합물에 대한 상표명이다. 당해 혼합물은 많은 조직에서 발견된 복잡한 세포외 환경과 유사하며 세포 배양을 위한 기질로서 세포 생물학자들에 의해 사용된다.
BD MatrigelTM 매트릭스는 EHS 마우스 육종, ECM 단백질이 풍부한 종양으로부터 추출된 가용화된 기저 막 제제이다. 이의 주요 성분은 라미닌(약 56%)이며, 이어서 콜라겐 IV(약 31%), 헤파란 설페이트 프로테오글리칸, 및 엔탁틴 1(약 8%)이다. 실온에서, BD MatrigelTM 매트릭스는 중합되어 포유동물 세포 기저 막과 유사한 생물학적으로 활성인 매트릭스 물질을 생산한다.
일반적인 실험실적 가정은 소 용적의 급냉(4℃)시킨 마트리겔을 플라스틱 조직 배양 랩웨어(labware)와 같은 표면 위에 분산시키는 것이다. 37℃(체온)에서 항온처리하는 경우, 마트리겔 단백질은 자체-조립되어 표면을 덮은 박막을 생산한다.
마트리겔은 세포 형태학, 생화학적 기능, 이주 또는 침입, 및 유전자 발현과 관련된 생리학적 관련 환경을 제공한다.
복잡한 세포 거동을 시뮬레이션하는 마트리겔의 능력은 이의 이질성 조성물의 결과이다. 마트리겔의 주요 성분은, 이들이 자체의 천연 환경에서 직면하는 부착 펩타이드 서열을 지닌 배양된 세포에 존재하는 라미닌 및 콜라겐과 같은 구조 단백질이다.
또한 많은 세포 유형의 분화 및 증식을 촉진하는 성장 인자들이 존재한다. 마트리겔은 다음 성장 인자를 포함한다(농도 범위, 평균 농도): EGF(0.5 내지 1.3 ng/ml, 0.7 ng/ml), bFGF(< 0.1 내지 0.2 pg/ml, 알려지지 않음), NGF (< 0.2 ng/ml, 알려지지 않음), PDGF (5 내지 48 pg/ml, 12 pg/ml), IGF-1(11-24 ng/ml, 16 ng/ml), TGF-β(1.7 내지 4.7 ng/ml, 2.3 ng/ml). 마트리겔은 다수의 다른 단백질을 소량으로 함유한다.
대체 매트릭스 피복
일부 양태에서, 세포는 1회 이상의 계대 배양(예를 들면 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10회 이상의 계대배양)을 위해 제1의 매트릭스 피복을 갖는 입자 위에서 배양한 후, 1회 이상의 계대배양(예를 들면 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10회 이상의 계대배양) 동안 상이한(제2의) 매트릭스 피복을 갖는 입자로 이전시킬 수 있다. 임의로, 이후에 세포를 제2의 피복, 예를 들면, 제1의 매트릭스 피복으로 다시 또는 다른 매트릭스 피복 또는 피복되지 않은 입자와는 상이한 매트릭스 피복을 갖는 입자로 이전시킬 수 있다.
입자 조성물
본원에 기술된 방법 및 조성물에서, 줄기 세포는 입자 또는 마이크로캐리어 위에서 번식한다. 본 서류에서 사용된 용어로서, "입자"는, 줄기 세포가 부착하거나 성장할 수 있는 특정 지지체를 포함한다. 입자는 하기 기술된 바와 같은 특정의 형태 또는 구조일 수 있다.
입자는 화학 용어의 IUPAC 개요서(IUPAC Compendium of Chemical Terminology)(2nd Edition, 1992, Vol. 64, p. 160)에 기술된 바와 같은 마이크로캐리어를 포함할 수 있다.
입자는, 예를 들어 이들이 줄기 세포에 대한 부착 또는 지지 점으로서, 위에서 기술된 바와 같은 이의 목적을 제공하도록 하는 물리적 특성을 갖는 한, 어떠한 물질도 포함할 수 있다. 따라서, 입자는 이러한 목적을 위해 뻣뻣하고, 단단하며, 가단성 있고(malleable), 고체이며, 다공성 등인 물질을 포함할 수 있다. 이는 고체 물질, 또는 반-고체, 겔 등의 물질을 포함할 수 있다.
물질은 양성 전하의 부착 및/또는 매트릭스 피복을 허용하도록 적어도 반응성이거나, 활성인자에 의해 반응성이 되도록 할 수 있지만, 기타의 경우 일반적으로 불활성 물질을 포함할 수 있다. 입자는 복합체를 포함함으로써 하나 이상의 물질이 입자를 제조할 수 있도록 할 수 있다. 예를 들면, 입자의 코어는 표면 위치로부터의 상이한 물질을 포함할 수 있다. 따라서, 입자의 코어는 일반적으로 불활성 물질을 포함할 수 있지만, 표면 부위는 매트릭스 또는 양성 전하의 부착 또는 화학적 커플링을 위해 반응성인 물질을 포함할 수 있다. 입자는 천연 기원이거나 합성일 수 있다. 이들을 수득하기 위한 천연 및 합성 물질 및 공급원은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 입자는 적어도 일부의 기계적 내성, 화학적 공격 또는 열 처리, 또는 이들의 특정 조합에 대한 적어도 일부의 내성을 가질 수 있다.
대안적인 양태에서, 입자는 "비-생물학적" 대상을 포함할 수 있고, 이러한 용어에 의해, 본 발명자들은 세포 물질로부터 유리되거나 실질적으로 유리된 입자를 의미한다. 따라서, 이러한 비-생물학적 또는 비-세포 입자는 합성 물질, 또는 비-천연적으로 존재하는 물질을 포함할 수 있다. 다양한 형태의 각종 입자가 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, 다양한 종류의 비드를 포함한다. 입자의 양태는 아가로즈 비드, 폴리아크릴아미드 비드, 실리카 겔 비드 등과 같은 마이크로비드를 포함한다. 예를 들면, 입자가 제조되는 물질은 가소제, 유리, 세라믹, 실리콘, 젤라틴, 덱스트란, 셀룰로즈, 하이드록실화된 메타크릴레이트, 폴리스티렌, 콜라겐 또는 기타를 포함할 수 있다. 예를 들면, 입자는 DEAE-셀룰로즈(하기 기술된 바와 같은)와 같은 셀룰로즈 또는 유도체로 제조될 수 있다. 입자는 셀룰로즈, 개질된 친수성 비드 및 탄소계 마이크로캐리어를 포함할 수 있다.
입자는 비드 또는 마이크로비드와 같은 상업적으로 시판되는 매트릭스 또는 캐리어를 포함할 수 있다. 입자는 음이온 교환 수지와 같은 크로마토그래피 매트릭스로서의 용도로 시판되는 수지를 포함할 수 있다.
입자는 셀룰로즈 마이크로캐리어를 포함할 수 있다. 입자는 DE-52[제조원: 화트만(Whatman)], DE-53(화트만) 또는 QA-52(화트만)을 포함할 수 있다. 입자는 친수성 마이크로캐리어, 하이드록실화된 메타크릴성 매트릭스 마이크로캐리어 또는 유도체화된 친수성 비드화된 마이크로캐리어를 포함할 수 있다. 입자는 TSKgel Tresyl-5Pw[제조원: 도쇼(Tosoh)] 또는 Toyopearl AF-Tresyl-650(제조원: 도쇼)를 포함할 수 있다. 입자는 거대다공성 또는 미세다공성 카보씨드 마이크로캐리어, 예를 들면, SM1010[제조원: 블루 멤브레인즈(Blue Membranes)] 또는 SH1010(제조원: 블루 멤브레인즈)를 포함할 수 있다.
입자는 덱스트란계 마이크로캐리어일 수 있다. 입자는 Cytodex 1[제조원: 지이 헬쓰케어(GE Healthcare)] 또는 Cytodex 3(제조원: 지이 헬쓰케어)를 포함할 수 있다. Cytodex 1은 양성으로 하전된 N,N-디에틸아미노에틸 그룹으로 치환된 가교-결합된 매트릭스를 기초로 한다. 하전된 그룹은 마이크로캐리어 매트릭스 전반에 걸쳐 분포된다. Cytodex 3은 가교-결합된 덱스트란의 매트릭스에 화학적으로 커플링된 변성된 콜라겐의 박층으로 이루어진다.
입자는 폴리스티렌계 마이크로캐리어일 수 있다. 입자는 Hillex 또는 Hillex II[제조원: 솔로힐 엔지니어링, 인코포레이티드(SoloHill Engineering, Inc.)]를 포함할 수 있다. Hillex 및 Hillex II는 양이온성 트리메틸 암모늄 피복을 갖는 개질된 폴리스티렌 마이크로캐리어이다.
입자는 세포가 위에서 성장하기 전에 처리될 수 있다. 이러한 처리는 본 서류에서 또한 기술된 바와 같이, 보다 우수한 부착, 전하의 이용가능성, 생적합성 등을 달성하기 위해 추구될 수 있다.
DE-53, DE-52 및 QA-52와 같은 셀룰로즈 마이크로캐리어는 막대-형일 수 있다.
세포 배양은 1개 이상의 입자 유형의 혼합물을 포함할 수 있다. 예를 들면, 제1 입자 집단(예를 들면, 압축형 입자) 및 제2 입자 집단(예를 들면, 신장형 입자)일 수 있다. 일부 양태에서, 제1의 세포 유형, 예를 들어, 공급자 세포는 제1 입자에 부착될 수 있으며, 제2 세포 유형, 예를 들어, hESC는 제2의 입자에 부착될 수 있다. 각각의 입자 유형은 동일하거나 상이한 매트릭스 피복을 가질 수 있다. 임의로 입자 유형 1개 또는 둘다는 매트릭스 피복을 가지지 않을 수 있다.
비드
사용하기에 적합한 비드 또는 마이크로비드는 겔 크로마토그래피에 사용되는 것들, 예를 들면, 세파덱스와 같은 겔 여과 매질을 포함한다. 이러한 종류의 적합한 마이크로비드는, 이들이 본 서류에서 또한 설명한 바와 같이, 크기의 측면에서 상용성인 한, 비드 크기가 40 내지 120㎛인 세파덱스 G-10[시그마 알드리히(Sigma Aldrich) 제품 번호 27,103-9), 비드 크기가 40 내지 120㎛인 세파덱스 G-15(시그마 알드리히 제품 번호 27,104-7), 비드 크기가 20 내지 50㎛인 세파덱스 G-25(시그마 알드리히 제품 번호 27,106-3), 비드 크기가 20 내지 80㎛인 세파덱스 G-25(시그마 알드리히 제품 번호 27,107-1), 비드 크기가 50 내지 150㎛인 세파덱스 G-25 (시그마 알드리히 제품 번호 27,109-8), 비드 크기가 100 내지 300㎛인 세파덱스 G-25(시그마 알드리히 제품 번호 27,110-1), 비드 크기가 20-50㎛인 세파덱스 G-50(시그마 알드리히 제품 번호 27,112-8), 비드 크기가 20-80㎛인 세파덱스 G-50(시그마 알드리히 제품 번호 27,113-6), 비드 크기가 50-150㎛인 세파덱스 G-50(시그마 알드리히 제품 번호 27,114-4), 비드 크기가 100-300㎛인 세파덱스 G-50(시그마 알드리히 제품 번호 27,115-2), 비드 크기가 20-50㎛인 세파덱스 G-75(시그마 알드리히 제품 번호 27,116-0), 비드 크기가 40-120㎛인 세파덱스 G-75(시그마 알드리히 제품 번호 27,117-9), 비드 크기가 20-50㎛인 세파덱스 G-100(시그마 알드리히 제품 번호 27,118-7), 비드 크기가 40-120㎛인 세파덱스 G-100(시그마 알드리히 제품 번호 27,119-5), 비드 크기가 40-120㎛인 세파덱스 G-150(시그마 알드리히 제품 번호 27,121-7), 및 비드 크기가 40-120㎛인 세파덱스 G-200(시그마 알드리히 제품 번호 27,123-3)을 포함한다.
예를 들면, 액체 크로마토그래피에서 사용된 세파로즈 비드를 또한 사용할 수 있다. 예에는 예를 들면, 아머샴 바이오사이언시즈 유럽 게엠베하(Amersham Biosciences Europe GmbH)(독일 브라이부르크 소재)로부터 Q 세파로즈 XL(제품 번호 17-5072-01), Q 세파로즈 XL(제품 번호 17-5072-04), Q 세파로즈 XL(제품 번호 17-5072-60), SP 세파로즈 XL(제품 번호 17-5073-01), SP 세파로즈 XL(제품 번호 17-5073-04) 및 SP 세파로즈 XL(제품 번호 l 17-5073-60) 등으로 시판되는 Q-세파로즈, S-세파로즈 및 SP-세파로즈 비드가 있다.
입자 형태
입자는 세포 성장에 적합한 어떠한 형태, 예를 들면, 압착 형태 또는 신장 형태를 포함할 수 있다.
압착 형태
압착 형태의 예는 일반적으로 구체 형태의 입자, 타원체 형태의 입자 또는 과립 형태의 입자이다.
"압착"은, 본원에서는, 일반적으로 신장되지 않는 형태를 의미한다. 다른 말로, "압착" 형태는 일반적으로 신장되지 않거나 연장되지 않는, 또는 어떠한 치수로도 연장되지 않는 형태이다. 압착 형태는 일반적으로 퍼지지 않는 것, 또는 길거나 막대형이 아닌 것일 수 있다. 따라서, 이러한 "압착 형태"는 일반적으로 유사할 수 있거나 다량에 의해 상이하지 않은 선형 치수를 지닌다.
따라서, 압착 형태의 어떠한 2개의 치수의 비는 3:1, 2.5:1, 2.4:1, 2.3:1, 2.2:1, 2.1:1, 2:1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 또는 미만과 같은, 4:1 미만과 같은, 5:1 미만일 수 있다. 예를 들어, 치수의 2개 쌍이 5:1 이상이 비를 가지지 않을 수 있다.
일부 양태에서, 압착 형태의 가장 긴 치수는 압착 형태의 가장 짧은 치수의 5배 미만이다. 다른 양태에서, 압착 형태의 가장 긴 치수는 가장 짧은 치수보다 상당히 크지 않은 데, 즉, 형태는 비교적 균일하다.
용어 "가장 긴 치수"는 본 서류에서 주요 축, 즉, 입자 전체에서 도시될 수 있는 최대 선을 함유하는 축을 의미하기 위해 취해져야 한다. 유사하게, "가장 짧은 치수"는 입자 전체로 도시될 수 있는 가장 짧은 선을 함유하는 축인, 작은 축의 길이이다.
선형 치수가 대략 동일하거나 비교가능한, 또는 최단 치수에 대한 최장 치수가 5:1 미만인 정규 형태가 본원에 기술된 압착 입자에 포함된다. 따라서, 상기 비는 최단 치수에 대한 최장 치수의 비에 관한 것일 수 있다. 일부 양태에서, 2개 치수의 비(최단 치수에 대한 최장 치수와 같은)는 1:1(즉, 정규 또는 균일한 형태)과 같이 1.1:1 미만이다.
따라서, 적용가능한 경우, 입자의 길이는 4x 미만의 이의 너비 또는 면적과 같은, 3x 미만과 같은, 2x 미만과 같은 또는 그 이하와 같은 5x 미만의 이의 너비 또는 면적일 수 있다.
압착 형태는 정규 고체, 구체, 회전타원체, 편구면, 납작한 회전타원체, 타원체, 정육면체, 원뿔체, 원기둥체 또는 다면체를 포함할 수 있다. 다면체는 단순한 다면체 또는 정규 다면체를 포함한다. 다면체는 예를 들면, 육면체, 홀리헤드론(holyhedron), 직육면체, 델타헤드론(deltahedron), 펜타헤드론(pentahedron), 테트라데카헤드론(tetradecahedron), 폴리헤드론(polyhedron), 테트라플렉사곤(tetraflexagon), 트라페조헤드론(trapezohedron), 절단된 다면체, 측지선 돔(geodesic dome), 칠면체 및 헥세콘타헤드론(hexecontahedron)을 포함한다. 어떠한 상기 형태도, 이들이 위에서 제공한 정의에 따라 "압착"되도록 사용될 수 있다. 예를 들면, 형태가 편구면을 포함하는 경우, 이는 적절한 편원을 가짐으로써 구면이 압착되며 신장되지 않도록 한다.
일부 양태에서, 압착 형태는, 치수가 위에서 제공된 바와 같은 한, 풍선 형태, 담배 형태, 소시지 형태, 디스크 형태, 눈물방울 형태, 볼 형태 또는 타원형 형태를 포함할 수 있다. 압착 형태는 또한 구체 형태, 정육면체 형태, 직육면체 형태, 타일 형태, 난형 형태, 타원형 형태, 디스크 형태, 셀 형태, 알약 형태, 캡슐 형태, 편평한 원통 형태, 콩 형태, 점적 형태, 구상 형태, 완두콩 현태, 펠렛 형태 등을 포함할 수 있다.
신장 형태
입자는 일반적으로 신장 형태를 가질 수 있다. 신장 형태의 예는 일반적으로 막대형 입자, 원통형 입자, 또는 막대기형 입자이다. 신장 입자는 중공 섬유를 포함할 수 있다.
"신장"은, 본 발명자들에 의해 일반적으로 압착되지 않는 형태를 의미한다. 다시 말해서, "신장" 형태는 일반적으로 다른 것에 대해 하나의 치수로 연장되는 것이다. 신장 형태는 길게 또는 막대기같이 확장되는 것일 수 있다. 따라서, 이러한 "신장 형태"는 일반적으로 다른 것으로부터 보다 큰 정도 또는 보다 적은 정도로 상이한 선형 치수를 일반적으로 지닌다.
따라서, 신장 형태의 특정의 2개의 치수의 비는 5:1 이상, 4:1 또는 미만 예를 들어, 1.1:1 이상, 1.2:1 이상, 1.3:1 이상, 1.4:1 이상, 1.5:1 이상, 1.6:1 이상, 1.7:1 이상, 1.8:1 이상, 1.9:1 이상, 2:1 이상, 2.1:1 이상, 2.2:1 이상, 2.3:1 이상, 2.4:1 이상, 2.5:1 이상, 3:1 이상, 4:1 이상, 또는 5:1 이상일 수 있다.
예를 들어, 어떠한 2개 쌍의 치수도 5:1 이상의 비를 가질 수 있다. 따라서, 일부 양태에서, 신장 형태의 가장 긴 치수는 신장 형태의 가장 짧은 면적의 5배 이상이다.
따라서, 적용될 수 있는, 입자의 길이는 3x 이상의 이의 너비 또는 직경과 같은, 4x 이상과 같은, 5x 이상과 같은 또는 10x 이상과 같은, 2x 이상의 이의 너비 또는 직경일 수 있다.
신장 또는 막대-형 마이크로캐리어는 본 발명의 방법에서 사용하기에 특히 바람직하다. 이들은 세포-마이크로캐리어 응집체의 생성을 위한 보다 우수한 부착 매트릭스를 제공하는 것으로 관측된다. 이론에 제한되거나 얽메이는 것은 아니지만, 막대-형 마이크로캐리어의 긴 축은 교반 동안 안정한 수 시간내에 세포-담체 응집을 가능하도록 하는 부착에 이용될 수 있는 큰 표면적으로 인하여 비드(구체의) 마이크로캐리어와 비교하여 우수한 부착을 제공한다.
입자 크기
입자가 연속 성장을 지지하기 위해서, 이들은 세포가 입자 위에서 성장하도록 하는 크기를 가질 수 있다. 입자의 크기는 또한 세포가 다른 입자 위에서 성장하는 다른 세포와 응집하도록 할 수 있다. 예를 들어, 이는, 입자의 크기가 적어도 하나의 치수가 영장류 또는 사람 줄기 세포의 치수와 화합되도록 하는데 필수적일 수 있다.
입자의 크기는 입자를 선택하여, 줄기 세포가 이 위에 부착하여 성장하도록 하고, 줄기 세포의 성장, 생존능, 생물학적 특성의 보유, 핵형 등과 같은 다수의 매개 변수 중 어느 것을 검정함으로써 실험적으로 선택할 수 있다.
예로서, 입자는 일반적으로 구체 또는 과립 형태를 갖는 압착 마이크로캐리어를 포함할 수 있다. 이 경우, 압착 마이크로캐리어는, 치수가 약 20㎛ 내지 약 250㎛의 범위일 수 있다.
압착 마이크로캐리어의 치수 범위의 상한은 약 250μm, 약 240μm , 약 230μm, 약 220μm, 약 210μm, 약 200μm, 약 190μm, 약 180μm, 약 170μm, 약 160μm, 약 150μm, 약 140μm, 약 130μm, 약 120μm, 약 110μm, 약 100μm, 약 90μm, 약 80μm, 약 70μm, 약 60μm , 약 50μm, 약 40μm 또는 약 30μm일 수 있다.
압착 마이크로캐리어의 치수 범위의 하한은 약 20μm, 약 30μm, 40μm, 약 50μm, 약 60μm, 약 70μm, 약 80μm, 약 90μm, 약 100μm 또는 약 110μm일 수 있다.
압착 마이크로캐리어는, 치수가 120μm 내지 20μm, 110μm 내지 30μm, 100μm 내지 40μm, 90μm 내지 50μm, 80μm 내지 40μm, 70μm 내지 50μm 또는 90 내지 30μm, 80 내지 40μm, 70 내지 40μm, 70 내지 30μm, 60 내지 40μm, 60 내지 30μm, 60 내지 50μm, 50 내지 40μm, 50 내지 30μm, 50 내지 5μm, 50 내지 10μm, 60 내지 10μm, 70 내지 10μm, 60 내지 20μm, 70 내지 20μm일 수 있다.
압착 마이크로캐리어는, 치수가 약 20μm, 약 30μm, 40μm, 약 50μm, 약 60μm, 약 65μm, 약 70μm, 약 80μm, 약 90μm, 약 100μm, 약 110μm 또는 약 120mm일 수 있다.
압착 마이크로캐리어의 치수는 예를 들면, 약 65mm일 수 있다.
면적은 마이크로캐리어의 직경일 수 있다.
압착 입자는 예를 들면, 친수성 마이크로캐리어, 하이드록실화된 메타크릴성 매트릭스 마이크로캐리어 또는 유도체화된 친수성 비드화된 마이크로캐리어, 예를 들면, TSKgel Tresyl-5Pw(제조원: 도소) 또는 Toyopearl AF-Tresyl-650(제조원: 도소)일 수 있다. TSKgel Tresyl-5Pw에 대한 정보는 http://www.separations.us.tosohbioscience.com/Products/HPLCColumns/ByMode/Affinity/TSKgel+ Tresyl -5 PW . htm에서 찾을 수 있다.
Toyopearl AF - Tresyl-650에 대한 정보는 http://www.separations.us.tosohbioscience.com/Products/ProcessMedia/ByMode/AFC/Toyopearl AF - Tresyl -650. htm에서 찾을 수 있다.
다른 예로서, 입자는 일반적으로 막대-형 또는 원통 형을 갖는 신장 마이크로캐리어를 포함할 수 있다. 이 경우, 신장 마이크로캐리어는, 최장 치수가 약 400 μm 내지 약 50 μm 범위일 수 있다.
신장 마이크로캐리어의 최장 치수의 범위의 상한치는 약 2000μm, 약 1900μm, 약 1800μm, 약 1700μm, 약 1600μm, 약 1500μm, 약 1400μm, 약 1300μm, 약 1200μm, 약 1100μm, 약 1000μm, 약 900μm, 약 800μm, 약 700μm, 약 600μm, 약 500μm, 약 400μm, 약 390μm, 약 380μm, 약 370μm, 약 360μm, 약 350μm, 약 340μm, 약 330μm, 약 320μm, 약 310μm, 약 300μm, 약 290μm, 약 280μm, 약 270μm, 약 260μm, 약 250μm, 약 240μm, 약 230μm, 약 220μm, 약 210μm, 약 200μm, 약 190μm, 약 180μm, 약 170μm, 약 160μm, 약 150μm, 약 140μm, 약 130μm, 약 120μm, 약 110μm, 약 100μm, 약 90μm, 약 80μm, 약 70μm, 약 60μm 또는 약 50μm일 수 있다.
신장 마이크로캐리어의 최장 치수의 범위의 하한치는 약 20μm, 약 30μm, 약 40μm, 약 50μm, 약 60μm, 약 70μm, 약 80μm, 약 90μm, 약 100μm, 약 110μm, 약 120μm, 약 130μm, 약 140μm, 약 150μm, 약 160μm, 약 170μm, 약 180μm, 약 190μm, 약 200μm, 약 210μm, 약 220μm, 약 230μm, 약 240μm, 약 250μm, 약 260μm, 약 270μm, 약 280μm, 약 290μm, 약 300μm, 약 310μm, 약 320μm, 약 330μm, 약 340μm, 약 350μm, 약 360μm, 약 370μm, 약 380μm 또는 약 390μm일 수 있다.
신장 마이크로캐리어는, 최장 치수가 2000μm 내지 20μm, 예를 들면, 400μm 내지 50μm, 390μm 내지 60μm, 380μm 내지 70μm, 370μm 내지 80μm, 360μm 내지 90μm, 350μm 내지 100μm, 340μm 내지 110μm, 330μm 내지 120μm, 320μm 내지 130μm, 310μm 내지 140μm, 300μm 내지 150μm, 290μm 내지 160μm, 280μm 내지 170μm, 270μm 내지 180μm, 260μm 내지 190μm, 250μm 내지 200μm, 240μm 내지 210μm 또는 230μm 내지 220μm 일 수 있다. 신장 마이크로캐리어의 최장 치수는 예를 들면, 약 190μm, 200μm, 210μm, 220μm 등일 수 있다.
신장 마이크로캐리어는, 가장 짧은 치수가 10μm 내지 50μm의 범위일 수 있다. 신장 마이크로캐리어는, 가장 짧은 치수가 약 10μm, 약 15μm, 약 20μm, 약 25μm, 약 30μm, 약 35μm, 약 40μm 또는 약 45μm일 수 있다.
신장 마이크로캐리어는 대략 원형 또는 타원체 단면을 갖는 원통형 또는 막대형일 수 있으며, 이의 최단 치수는 약 5μm 내지 약 50μm의 범위, 예를 들면, 약 10μm, 약 15μm, 약 20μm, 약 25μm, 약 30μm, 약 35μm, 약 40μm, 또는 약 45μm 중 하나일 수 있다. 직경은 약 5μm 내지 20μm, 약 10μm 내지 25μm, 약 15μm 내지 30μm, 약 20μm 내지 35μm, 약 25μm 내지 40μm, 약 30μm 내지 45μm, 약 35μm 내지 50μm 중의 하나일 수 있다.
신장 입자는 예를 들면, DE-52(제조원: 화트만), DE-53(제조원: 화트만) 또는 QA-52(제조원: 화트만)과 같은 셀룰로즈 원통형 마이크로캐리어를 포함할 수 있다.
어떠한 제공된 마이크로캐리어의 크기 및 치수도 뱃치(batch)내에서 또는 뱃치 사이에서 변할 수 있다. 예를 들어, DE-53 막대-형 셀룰로즈 마이크로캐리어의 경우, 본 발명자들은 뱃치내에서 마이크로캐리어의 길이 및 직경을 측정하였고, 캐리어의 길이가 50 내지 250μm(130 ± 50 μm의 평균 길이)일 수 있고 캐리어의 직경은 17μm 내지 적어도 50μm(35 ± 7 μm의 평균 직경) 사이일 수 있다.
입자는 다공성이거나 비-다공성일 수 있다. 다공성 입자는 배지가 성장하는 부위내에서 및 이를 통해 순환할 수 있도록 하며 이는 세포 성장을 보조할 수 있다. 예를 들어, 입자는 거대다공성 또는 미세다공성 카보씨드 마이크로캐리어를 포함할 수 있다. 입자는 SM1010[제조원: 블루 멤브레인즈(Blue Membranes)] 또는 SH1010(제조원: 블루 멤브레인즈)를 포함할 수 있다.
줄기 세포의 배양
예를 들면, 실시예에 나타낸 바와 같이, 줄기 세포를 배양하는 어떠한 적합한 방법도 본원에 기술된 방법 및 조성물에 사용할 수 있다.
어떠한 적합한 용기도 사용하여 본원에 기술된 방법 및 조성물에 따라 줄기 세포를 번식시킬 수 있다. 적합한 용기는 미국 특허 공개 제US2007/0264713호(Terstegge)에 기술된 것들을 포함한다.
용기는 예를 들면, 생물반응기 및 스피너(spinner)를 포함할 수 있다. 본 서류에 사용된 용어로서 "생물반응기"는 진핵 세포, 예를 들면, 동물 세포 또는 포유동물 세포의 대규모와 같은 배양에 적합한 용기이다. 조절된 생물반응기의 대표적인 배양 용적은 20 ml 내지 500 ml이다.
생물반응기는, 하나 이상의 조건, 예를 들면, 산소 분압이 조절되거나 모니터링될 수 있는 조절된 생물반응기를 포함할 수 있다. 이들 조건을 측정하고 조절하기 위한 장치는 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 산소 전극을 산소 분압을 위해 사용할 수 있다. 산소 분압은 선택된 가스 혼합물(예를 들면, 공기 또는 공기 및/또는 산소 및/또는 질소 및/또는 이산화탄소의 혼합물)의 양 및 조성을 통해 조절될 수 있다. 산소 분압을 측정하고 조절하기에 적합한 장치는 문헌[참조: Bailey, J E. (Bailey, J E., Biochemical Engineering Fundamentals, second edition, McGraw-Hill, Inc. ISBN 0-07-003212-2 Higher Education, (1986)) or Jackson A T. Jackson A T., Verfahrenstechnik in der Biotechnologie, Springer, ISBN 3540561900 (1993)]에 기술되어 있다. 다른 적합한 용기는 스피너를 포함한다. 스피너는 가스 볼 교반기, 임펠러 교반기(impeller agitator) 및 기타 적합한 교반기와 같은 각종의 교반기 메카니즘을 사용하여 교반시킬 수 있는 조절되거나 조절되지 않는 생물반응기이다. 스피너의 배양 용적은 전형적으로 20 ml 내지 500 ml이다. 롤러 병(roller bottle)은, 배양 면적이 400 내지 2000 cm2인 가소제 또는 유리로 제조된 원형 세포 배양 플라스크이다. 세포는 이들 플라스크의 전체 내부 표면을 따라 배양하며; 세포는 "롤링" 운동에 의해, 즉, 병을 이들 자체의 개별 축에 대해 회전시킴으로써 배양 배지로 피복시킨다.
이와는 달리, 배양은 정적으로, 즉, 배양물/배양물 배지의 활성적인 교반을 사용하지 않는 경우일 수 있다. 배양물의 교반을 감소시킴으로써, 세포/마이크로캐리어의 응집물이 형성될 수 있다. 일부 교반을 사용하여 배양된 세포 위로 배양 배지의 분산 및 유동을 권장할 수 있지만, 이는 응집체 형성을 실질적으로 파괴하지 않도록 적용될 수 있다. 예를 들면, 낮은 rpm의 교반, 예를 들면, 30rpm 미만 또는 20rpm 미만을 사용할 수 있다.
계대배양을 사용한 증식
본원에 기술된 방법 및 조성물은 배양 동안 계대 또는 분할(splitting)을 포함할 수 있다. 당해 방법은 연속 또는 계속 계대를 포함할 수 있다.
"계속" 또는 "연속"은, 본 발명자들에 의해, 본 발명자들의 방법이 줄기 세포를 계대될 수 있도록 하는 방식, 예를 들면, 이들이 성장하는 마이크로캐리어로부터 제거되어 다른 마이크로캐리어 또는 입자로 이전되는 양식으로 마이크로캐리어 위에서 줄기 세포의 성장을 가능하도록 하며, 당해 공정을 적어도 1회, 예를 들면, 2회, 3회, 4회, 5회 등(하기 나타낸 바와 같음)으로 반복할 수 있음을 의미한다. 일부 경우에, 이는 특정 횟수, 예를 들면, 무한 또는 유한으로 반복할 수 있다. 가장 바람직하게는 공정은 5회 이상, 예를 들면, 6회 이상, 7회 이상, 8회 이상, 9회 이상, 10회 이상, 11회 이상, 12회 이상, 13회 이상, 14회 이상, 15회 이상, 16회 이상, 17회 이상, 18회 이상, 19회 이상, 20회 이상, 21회 이상, 22회 이상, 23회 이상, 24회 이상, 25회 이상 반복된다. 용어 "계속" 또는 "연속"은 또한 세포 성장과 같은 현장의 실질적으로 차단되지 않은 연장을 의미하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명자들의 방법은 줄기 세포를 성장 또는 배양을 종결할 필요없이, 특정 수의 바람직한 세포까지 연장시킬 수 있다.
배양물 속 세포는 기질 또는 플라스크로부터 해리될 수 있으며, 조직 배양 배지내로 희석시키고 재플레이팅시킴에 의해 "쪼개지고", 부배양(subculturing)되거나 계대될 수 있다.
입자 위에서 성장하는 세포는 입자 배양물 위로 다시 계대될 수 있다. 이와는 달리, 이들은 통상의(2D) 배양물 위에 다시 계대배양될 수 있다. 플레이트 위에서 성장하는 조직 배양 세포는 입자 배양물 위에 계대배양될 수 있다. 이들 방법들 각각은 하기에 보다 상세히 기술되어 있다.
용어 "계대"는 일반적으로 세포 배양물의 분취량을 취하여, 세포를 완전히 또는 부분적으로 해리하고, 희석시키며 배지내로 접종하는 과정을 말할 수 있다. 계대는 1회 이상 반복될 수 있다. 분취량은 세포 배양물의 전체 또는 일부를 포함할 수 있다. 분취량의 세포는 완전히 합치성이거나, 부분적으로 합치성이거나, 합치성이 아닐 수 있다. 계대는 다음 순서의 단계들 중 적어도 일부를 포함할 수 있다: 통기, 세정, 트립신처리, 항온처리, 제거(dislodging), 퀀칭(quenching), 재-씨딩 및 분취. 헤드릭 랩(Hedric Lab)(미국 샌디에고 유씨 소재)이 발표한 프로토콜을 사용할 수 있다(http://hedricklab.ucsd.edu/Protocol/COSCell.html).
세포는 당해 분야에 공지된 기계적 또는 효소적 수단과 같은 특정의 적합한 수단으로 해리시킬 수 있다. 세포는 예를 들면, 세포 스크래퍼(cell scraper) 또는 피펫을 사용하여 기계적 해리로 분해할 수 있다. 세포는 100 마이크론 또는 500 마이크론 체(sieve)를 통해서와 같이, 적합한 체 크기를 통해 걸러서 분해할 수 있다. 세포는 효소적 해리에 의해, 예를 들면, 콜라게나제 또는 수거된 trypLE를 사용하여 처리함으로서 분할할 수 있다. 해리는 완전하거나 부분적일 수 있다.
희석은 임의의 적합한 희석일 수 있다. 세포 배양물 속의 세포는 어떠한 적합한 비율에서도 분할될 수 있다. 예를 들어, 세포는 1:2 이상, 1:3 이상, 1:4 이상 또는 1:5 이상의 비율에서 분할될 수 있다. 세포는 1:6 이상, 1:7 이상, 1:8 이상, 1:9 이상 또는 1:10 이상의 비율에서 분할될 수 있다. 분할 비는 1:10 이상일 수 있다. 이는 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19 또는 1:20 이상일 수 있다. 분할 비는 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25 또는 1:26 이상일 수 있다.
따라서, 줄기 세포는 1회 계대 이상 동안 계대배양될 수 있다. 예를 들어, 줄기 세포는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25회 계대 이상 계대배양될 수 있다. 줄기 세포는 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95회 계대 이상 계대배양될 수 있다. 줄기 세포는 배양물 속에서 무기한으로 증식될 수 있다.
계대는 세포 성장의 세대로서 표현될 수 있다. 본 발명자들의 방법 및 조성물은, 줄기 세포가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 세대 이상 번식하도록 한다. 줄기 세포는 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 이상의 세대 동안 성장할 수 있다.
계대는 또한 세포 배가의 수로서 표현될 수 있다. 본 발명자들의 방법 및 조성물은, 줄기 세포가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25회 이상의 세포 배가 동안 증식하도록 한다. 줄기 세포는 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 이상의 세포 배가 동안 성장할 수 있다.
줄기 세포는 5회 이상, 10회 이상, 15회 이상, 20회 이상, 25회 이상, 30회 이상, 40회 이상, 45회 이상, 50회 이상, 100회 이상, 200회 이상, 500회 이상 800회 이상의 계대, 세대 또는 세포 배가 동안 배양될 수 있다. 줄기 세포는 100, 200, 500회 이상의 계대, 세대 또는 세포 배가 동안 유지될 수 있다.
성장 및 생산성
본원에 기술된 방법 및 조성물은 줄기 세포를 대량으로 생산할 수 있다.
당해 방법은 배양물 속에서 줄기 세포를 기하급수적으로 성장시킬 수 있다. 기하급수적 성장은 대수기에 의해 달성되거나 달성되지 않을 수 있다. 기하급수적 성장은 배양물 속에서 세포 성장의 일부 또는 실질적인 기간을 형성할 수 있다. 기하급수적 성장을 평가하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
예를 들면, 세포의 특이적인 성장 속도는 다음 수학식으로 확인할 수 있다:
Figure pct00009
상기 수학식에서
x는 세포 농도이고,
t는 시간이다.
본원에 기술된 방법 및 조성물은 전통적인 2D 배양 방법(예를 들면, 플레이트 위에서 배양)과 비교하여 세포 성장의 보다 큰 생산성이 가능하게 할 수 있다. 예를 들면, 본 방법의 용적 생산성은 1 x 106 세포/웰(well) 이상일 수 있고, 예를 들면, 2.5 x 106 세포/웰 이상, 예를 들면, 3, 4, 5, 6 또는 7 x 106 세포/웰 이상일 수 있다. 웰은, 직경이 약 3.5cm이거나 면적이 약 9.5cm2일 수 있다. 본 발명자의 방법의 용적 생산성은 1백만개의 세포/ml 이상, 예를 들면, 2백만개 세포/ml 이상, 2.5백만개 세포/ml 이상, 3백만개 세포/ml 이상, 3.5백만개 세포/ml, 1백만개 세포/ml 이상, 예를 들면, 4백만개 세포/ml 이상, 4.5백만개 세포/ml 이상, 5백만개 세포/ml 이상일 수 있다.
줄기 세포 특성의 유지
번식된 줄기 세포는 포유동물, 영장류 또는 사람 줄기 세포의 적어도 하나의 특성을 유지할 수 있다. 줄기 세포는 하나 이상의 계대배양 후 특징을 보유할 수 있다. 이들은 다수의 계대배양 후에도 특성을 유지할 수 있다. 이들은 위에서 기술한 바와 같이 언급된 수의 계대배양 후에도 특성을 유지할 수 있다.
당해 특성은 형태학적 특성, 면역조직화학적 특성, 분자 생물학적 특성 등을 포함할 수 있다. 특성은 생물학적 활성을 포함할 수 있다.
줄기 세포 특성
본 발명자들의 방법에 의해 번식된 줄기 세포는 다음 줄기 세포 특성 중 어느 것도 나타낼 수 있다.
줄기 세포는 Oct4 및/또는 SSEA-1 및/또는 TRA-1-60 및/또는 Mab84의 증가된 발현을 나타낼 수 있다. 자가-재생되는 줄기 세포는 자가-재생되지 않은 줄기 세포와 비교하여 보다 짧은 세포 주기를 나타낼 수 있다.
줄기 세포는 정의된 형태학을 나타낼 수 있다. 예를 들면, 2차원의 표준 현미경 영상에서, 사람 배아 줄기 세포는 영상의 평면에 높은 핵/세포질 비율, 우세한 핵소체, 및 식별가능한 세포 연결이 불량한 압착 콜로니 형성을 나타낸다.
줄기 세포는 또한 하기에 추가로 기술된 바와 같이 발현된 세포 마커에 의해 특징화될 수 있다.
다분화능 마커의 발현
보유되는 생물학적 활성은 하나 이상의 다분화능 마커의 발현을 포함할 수 있다.
단계-특이적인 배아 항원(SSEA)은 특정의 배아 세포 유형의 특징이다. SSEA 마커에 대한 항체는 기관[Developmental Studies Hybridoma Bank(미국 매릴랜드 베쎄스다 소재)]로부터 입수가능하다. 다른 유용한 마커는 Tra-1-60 및 Tra-1-81로 지정된 항체를 사용하여 검출가능하다(참조: Andrews et al., Cell Lines from Human Germ Cell Tumors, in E. J. Robertson, 1987, supra). 사람 배아 줄기 세포는 대표적으로 SSEA-1 음성 및 SSEA-4 양성이다. hEG 세포는 대표적으로 SSEA-1 양성이다. 영장류 다분화성 줄기 세포(pPS)의 시험관내 분화는 SSEA-4, Tra-1-60, 및 Tra-1-81 발현의 손실 및 SSEA-1의 증가된 발현을 초래한다. pPS 세포는 또한 알칼린 포스파타제 활성의 존재에 의해 특성화될 수 있으며, 이는 세포를 4% 포름알데하이드로 고정시킨 후, 제조업자[벡터 래보러토리즈(Vector Laboratories), 미국 캘리포니아주 부를링가임 소재]에 의해 기술된 바와 같이, 기질로서 Vector Red로 전개(developing)시켜 검출할 수 있다.
배아 줄기 세포는 또한 통상적으로 텔로머라제 양성이고 OCT-4 양성이다. 텔로머라제 활성은 TRAP 활성 검정(참조: Kim et al., Science 266:2011, 1997)을 사용하여, 시판되는 키트[TRAPeze.RTM. XK 텔로머라제 검출 키트, 제품번호 s7707; 제조원: 뉴욕주 퍼쉐즈 소재의 인터젠 코포레이션(Intergen Co.); 또는 TeloTAGGG.TM. 텔로머라제 PCR ELISA 플러스, 제품번호 2,013,89; 제조원: 인디아나폴리스 소재의 로슈 디아그노스틱스(Roche Diagnostics)]를 사용하여 측정할 수 있다. hTERT 발현은 또한 mRNA 수준에서 RT-PCR에 의해 평가할 수 있다. 광사이클러(LightCycler) TeloTAGGG.TM. hTERT 정량 키트(제품번호 3,012,344; 로슈 디아그노스틱스)는 조사 목적을 위해 시판된다.
FOXD3, PODXL, 알칼린 포스파타제, OCT-4, SSEA-4, TRA-1-60 및 Mab84 등을 포함하는 상기한 다분화능 마커들 중 하나 이상은 번식된 줄기 세포에 의해 보유될 수 있다.
마커의 검출은 예를 들면, 면역학적으로 당해 분야에 공지된 어떠한 수단을 통해서도 달성할 수 있다. 조직화학적 염색, 유동 세포분석법(FACS), 웨스턴 블롯, 효소-결합된 면역검정(ELISA) 등을 사용할 수 있다.
유동 면역세포화학을 사용하여 세포-표면 마커를 검출할 수 있다. 면역조직화학(예를 들면, 고정된 세포 또는 조직 단면의 면역조직화학)을 세포내 또는 세포-표면 마커용으로 사용할 수 있다. 웨스턴 블롯 분석은 세포 추출물에서 수행할 수 있다. 효소-결합된 면역검정은 세포 추출물 또는 배지내로 분비된 생성물에 대해 사용할 수 있다.
당해 목적을 위해, 공급업자로부터 이용가능한 다분화능 마커에 대한 항체를 사용할 수 있다.
단계-특이적인 배아 항원 1 및 4(SSEA-1 및 SSEA-4) 및 종양 거부 항원 1-60 및 1-81(TRA-1-60, TRA-1-81)을 포함하는 줄기 세포 마커의 확인을 위한 항체는 예를 들면, 케미콘 인터네셔널, 인코포레이티드(Chemicon International, Inc.; 미국 캘리포니아주 테메쿨라 소재)로부터 상업적으로 구입할 수 있다. 모노클로날 항체를 사용한 이들 항원의 면역학적 검출을 광범위하게 사용하여 다분화성 줄기 세포를 특성화하여 왔다[참조: Shamblott M.J. et. al. (1998) PNAS 95: 13726-13731; Schuldiner M. et. al. (2000). PNAS 97: 11307-11312; Thomson J.A. et. al. (1998). Science 282: 1145-1147; Reubinoff B.E. et. al. (2000). Nature Biotechnology 18: 399-404; Henderson J.K. et. al. (2002). Stem Cells 20: 329-337; Pera M. et. al. (2000). J. Cell Science 113: 5-10.].
조직-특이적인 유전자 생성물의 발현은 또한 mRNA 수준에서 노던 블롯 분석(Northern blot analysis), 도트-블롯 하이브리드화 분석(dot-blot hybridization analysis), 또는 리버스 트랜스크립타제 개시된 폴리머라제 쇄 반응(RT-PCR)에 의해 서열-특이적인 프라이머를 사용하여 표준 증폭 방법으로 검출할 수 있다. 본 기재내용에 나열된 특수 마커에 대한 서열 데이타는 진뱅크(GenBank)(URL www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez)와 같은 공지된 데이타베이스로부터 입수할 수 있다(추가의 세부사항에 대해서는 미국 특허 제5,843,780호 참조).
실질적으로 모든 번식된 세포, 또는 이들의 실질적인 비율은 마커(들)을 발현할 수 있다. 예를 들면, 마커 또는 마커들을 발현하는 세포의 퍼센트는 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 실질적으로 100%일 수 있다.
세포 생존능
생물학적 활성은 기술된 수의 계대배양 후 세포 생존능을 포함할 수 있다. 세포 생존능은 트립판 블루 배출에 의해 각종 방법으로 검정할 수 있다. 생체 염색을 위한 프로토콜은 다음과 같다. 적합한 용적의 세포 현탁액(20 내지 200μL)을 적절한 튜브 속에 두고, 동 용적의 0.4% 트립판 블루를 가하고 온화하게 혼합하여, 실온에서 5분 동안 정치시킨다. 염색된 세포 10μl를 혈구 계산기 속에 두고 생존 세포(염색되지 않은 세포) 및 사멸한 세포(염색된 세포)의 수를 계수한다. 사분면에서 염색되지 않은 세포의 평균 수를 계산하고 2 x 104을 최종 세포/ml에 곱한다. 생존 세포의 퍼센트는 사멸된 세포 및 생존 세포의 수로 나눈 생존 세포의 수이다.
세포의 생존능은 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 실질적으로 100%일 수 있다.
핵형
번식된 줄기 세포는 번식 동안 또는 번식 후에 정상의 핵형을 보유할 수 있다. "정상의" 핵형은 줄기 세포가 기원한 모 줄기 세포가 핵형 또는 이로부터 변화되지만 어떠한 실질적인 방식이 아닌 것과 동일하거나, 유사하거나 또는 실질적으로 유사한 핵형이다. 예를 들어, 전좌, 염색체 손실, 결실 등과 같은 어떠한 전체의 비정상은 존재하지 않아야 한다.
핵형은 다수의 방법, 예를 들면, 광학 현미경하에서 가시적으로 평가할 수 있다. 핵형은 문헌[참조: McWhir et al. (2006), Hewitt et al. (2007), 및 Gallimore and Richardson (1973)]에 기술된 바와 같이 제조하고 분석할 수 있다. 세포는 또한 표준 G-밴딩 기술[캘리포니아주 오클랜드 소재의 사이토제네틱스 랩(Cytogenetics Lab)과 같은 정규의 핵형 서비스를 제공하는 많은 임상 진단 실험실에서 이용가능함]을 사용하여 핵형화하고 발표된 줄기 세포 핵형과 비교할 수 있다.
번식된 세포의 모두 또는 실질적인 부분은 정상의 핵형을 보유할 수 있다. 이들 비율은 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 실질적으로 100%일 수 있다.
다분화능
번식된 줄기 세포는 모든 3개의 세포 계통, 즉, 내배엽, 외배엽 및 중배엽으로 분화하기 위한 능력을 보유할 수 있다. 줄기 세포가 이들 계통 각각으로 분화하도록 유도하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며 번식된 줄기 세포의 능력을 평가하는데 사용될 수 있다.
번식된 세포의 모든 또는 실질적인 부분은 당해 능력을 보유할 수 있다. 이는 번식된 줄기 세포의 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 실질적으로 100%일 수 있다.
공-배양 및 공급자
본 발명자들의 방법은 줄기 세포를 공-배양물의 존재 또는 부재하에 배양함을 포함할 수 있다. 용어 "공-배양"은 예를 들면, 기질 공급자 세포와 함께 성장하는 2개 이상의 상이한 종류의 세포의 혼합물을 말한다. 2개 이상의 상이한 종류의 세포는 입자 또는 세포 용기 표면과 같은 동일한 표면, 또는 상이한 표면 위에서 성장할 수 있다. 상이한 종류의 세포는 상이한 입자 위에서 성장할 수 있다. 본 서류에 사용된 용어로서 공급자 세포는 상이한 유형의 세포의 배양에 사용되거나 요구되는 세포를 의미할 수 있다. 줄기 세포 배양의 측면에서, 공급자 세포는 생존, 증식 및, ES-세포 다분화능의 유지를 보장하는 기능을 갖는다. ES-세포 다능성은 공급자 세포를 직접 공-배양함으로써 달성할 수 있다. 이와는 달리, 또는 추가로, 공급자 세포는 이를 조건화하기 위해 배지 속에서 배양할 수 있다. 조건화된 배지는 줄기 세포를 배양하기 위해 사용될 수 있다.
배양 디쉬(culture dish)와 같은 용기의 내부 표면은 이들이 분할되지 않도록 처리된 마우스 배아 피부 세포의 공급자 층으로 피복시킬 수 있다. 공급자 세포는 ES 세포 성장에 요구되는 배양 배지내로 영양분을 방출한다. 따라서, 입자 위에서 성장하는 줄기 세포는 이러한 피복된 용기 속에서 성장할 수 있다.
공급자 세포는 자체로 입자 위에서 성장할 수 있다. 이들은 줄기 세포에 대해 기술된 바와 유사한 방식으로 입자 위에서 씨딩될 수 있다. 번식될 줄기 세포는 이러한 공급자 입자와 함께 또는 이들과 별도로 성장시킬 수 있다. 따라서, 줄기 세포는 이러한 공급자 세포 피복된 입자 위에서 층위로 성장할 수 있다. 다른 한편, 줄기 세포는 별도의 입자 위에서 성장할 수 있다. 이러한 배열 중 어느 것의 어떠한 조합, 예를 들면, 입자 위에서 성장한 공급자 세포, 공급자 세포와 줄기 세포를 지닌 입자, 및 줄기 세포가 성장하는 입자를 포함하는 배양물이 가능하다. 이들 조합은 공급자 층이 있거나 없는 용기 속에서 성장할 수 있다. 공급자 세포가 성장하는 입자는 매트릭스 피복으로 피복시키거나 피복시키지 않을 수 있다.
공급자 세포가 부재하거나 필요하지 않은 배열이 또한 가능하다. 예를 들어, 세포는 공급자 세포 또는 줄기 세포에 의해 조건화된 배지(조건화된 배지) 속에서 성장시킬 수 있다.
배지 및 공급자 세포
다분화성 줄기 세포를 분리하고 번식시키기 위한 배지는, 수득된 세포가 바람직한 특성을 가지며, 추가로 번식될 수 있는 한, 몇가지 상이한 제형들 중의 하나를 가질 수 있다.
적합한 공급원은 다음과 같다: 둘베코 변형 이글 배지[Dulbecco's modified Eagles medium (DMEM)], Gibco#11965-092; 녹아웃 둘베코 변형 이글 배지[Knockout Dulbecco's modified Eagles medium (KO DMEM)], Gibco#10829-018; 200 mM L-글루타민, Gibco#15039-027; 비-필수 아미노산 용액, Gibco 11140-050; 베타-머캅토에탄올, Sigma#M7522; 사람 재조합체 기본 섬유모세포 성장 인자(bFGF), Gibco#13256-029. 예시적인 혈청-함유 배아 줄기(ES) 배지는 80% DMEM(전형적으로 KO DMEM), 열 불활성화되지 않은 20% 정의된 태아 소 혈청(FBS), 0.1 mM 비-필수 아미노산, 1 mM L-글루타민, 및 0.1 mM 베타-머캅토에탄올.
배지를 여과하고 4℃에서 2주 이하 동안 저장한다. 혈청-무 배아 줄기(ES) 배지는 80% KO DMEM, 20% 혈청 대체물, 0.1 mM 비-필수 아미노산, 1 mM L-글루타민, 및 0.1 mM 베타-머캅토에탄올로 이루어진다. 유효한 혈청 대체물은 Gibco#10828-028이다. 배지를 여과하고 4℃에서 2주 이하 동안 저장한다. 사용 직전에, 사람 bFGF를 4 ng/mL의 최종 농도로 가한다(참조: Bodnar et al., Geron Corp, 국제 특허 공개 제WO 99/20741호).
배지는 10% 혈청 대체 배지(제조원: 미국 뉴욕 그랜드 아이슬랜드 소재의 인비트로겐-기브코), 5ng/ml FGF2(제조원: 미국 뉴욕 그랜드 아이슬랜드 소재의 인비트로겐-기브코) 및 5ng/ml PDGF AB(제조원: 미국 뉴저지 록키 힐 소재의 페프로테크(Peprotech)]가 보충된 녹아웃 DMEM 배지[제조원: 미국 뉴욕 그랜드 아이슬랜드 소재의 인비트로겐-기브코(Invitrogen-Gibco)]를 포함할 수 있다.
공급자 세포(사용될 경우)는 90% DMEM(Gibco#11965-092), 10% FBS(Hyclone#30071-03), 및 2 mM 글루타민을 함유하는 mEF 배지 속에서 번식시킬 수 있다. mEF는 T150 플라스크(Coming#430825) 속에서 번식시켜, 트립신을 사용하여 매 격일로 세포를 1:2로 쪼개어 세포를 아합치상태(subconfluent)로 유지시킨다. 공급자 세포 층을 제조하기 위하여, 세포를 증식을 억제하나 사람 배아 줄기 세포를 지지하는 중요한 인자의 합성을 허용하는 조사량(약 4000 rad의 감마 조사)에서 조사한다. 6개-웰 배양 플레이트(예를 들면, Falcon#304)는 37℃에서 1 mL의 0.5% 젤라틴/웰과 함께 밤새 항온처리함으로서 피복시키고 375,000 조사된 mEF/웰을 플레이팅한다. 공급자 세포 층은 통상적으로 5시간 내지 4일 동안 플레이팅 후 사용한다. 배지는 pPS 세포를 씨딩하기 직전에 새로운 사람 배아 줄기(hES) 배지로 교체한다.
다른 줄기 세포를 배양하는 조건도 알려져 있으며, 세포 유형에 따라 적절하게 최적화할 수 있다. 앞서의 단락에서 언급된 특수 세포 유형에 대한 배지 및 배양 기술은 인용된 문헌에 제공되어 있다.
혈청이 없는 배지
본원에 기술된 방법 및 조성물은 혈청이 없는 배지 속에서 줄기 세포를 배양함을 포함할 수 있다.
용어 "혈청이 없는 배지"는 혈청 단백질, 예를 들면, 태 송아지 혈청이 없는 세포 배양 배지를 포함할 수 있다. 혈청이 없는 배지는 당해 분야에 공지되어 있으며 예를 들면, 미국 특허 제5,631,159호 및 제5,661,034호에 기술되어 있다. 혈청이 없는 배지는 예를 들면, Gibco-BRL(제조원: 인비트로겐)로부터 시판된다.
혈청이 없는 배지는 단백질이 없을 수 있는데, 즉, 이는 단백질, 가수분해물 및 알려지지 않은 조성의 성분들을 결여할 수 있다. 혈청이 없는 배지는, 모든 성분들이 공지된 화학 구조를 갖는 화학적으로 정의된 배지를 포함할 수 있다. 화학적으로 정의된 혈청이 없는 배지는, 가변성을 제거하는 완전히 정의된 시스템을 제공하여 개선된 재생산능 및 보다 일관된 수행능, 및 우연한 제제에 의한 오염 가능성의 감소를 허용하므로 유리하다. 이에는 또한 동물 기원한 성분이 없을 수 있다.
혈청이 없는 배지는 녹아웃 DMEM 배지(제조원: 뉴욕 그랜드 아이슬랜드 소재의 인비트로겐-기브코)를 포함할 수 있다.
혈청이 없는 배지는 혈청 교체 배지와 같은 하나 이상의 성분으로 예를 들면, 5%, 10%, 15% 등의 농도에서 보충시킬 수 있다. 혈청이 없는 배지는 인비트로겐-기브코(뉴욕 그랜드 아이슬랜드 소재)로부터 10% 혈청 교체 배지로 보충시킬 수 있다. 해리되거나 분해된 배아 줄기 세포가 배양되는 혈청이 없는 배지는 하나 이상의 성장 인자를 포함할 수 있다. FGF2, IGF-2, 노긴(Noggin), 액티빈(Activin) A, TGF 베타 1, HRG1 베타, LIF, S1P, PDGF, BAFF, 에이프릴(April), SCF, Flt-3 리간드, Wnt3A 및 기타의 것을 포함하는, 다수의 성장 인자들이 당해 분야에 공지되어 있다. 성장 인자(들)은 1pg/ml 내지 500ng/ml와 같은 어떠한 적합한 농도로도 사용될 수 있다.
배지 보충물
배양 배지는 하나 이상의 첨가제로 보충시킬 수 있다. 예를 들어, 이들은 지질 혼합물, 소 혈청 알부민(예를 들면, 0.1% BSA), 대두 단백질의 가수분해물 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다.
줄기 세포
본 서류에 사용된 것으로서, 용어 "줄기 세포"는 분할시 2개의 발달 선택에 직면해있는 세포를 말한다: 딸 세포는 원래의 세포(자가-재생)와 동일할 수 있거나, 이들은 보다 분화된 세포 유형(분화)의 후대세포일 수 있다. 따라서, 줄기 세포는 하나 또는 다른 경로(각각의 세포 유형 중 하나가 형성될 수 있는 추가의 경로가 존재한다)를 채택할 수 있다. 따라서, 줄기 세포는 말단으로 분화되지 않고 다른 유형의 세포를 생산할 수 있는 세포이다.
본 서류에서 언급된 것으로서 줄기 세포는 분화전능성(totipotent) 줄기 세포, 다분화성 줄기 세포 및 다능성 줄기 세포를 포함할 수 있다. 일반적으로, 본원에서 줄기 세포(다수)에 대한 참조는 단일(줄기 세포)를 포함할 수 있다. 특히, 줄기 세포를 배양하고 분화시키는 방법은 단일 세포 및 응집 배양 기술을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 줄기 세포는 응집체 또는 단일 세포의 것일 수 있다.
분화전능성 줄기 세포
용어 "분화전능성" 세포는 성인 체내 어떠한 세포 유형, 또는 배아외 막(예를 들면, 태반) 중의 어떠한 세포가 되는 가능성을 가진 세포를 말한다. 따라서, 유일하게 분화전능성인 세포는 수정란 및 4일란이거나 이의 분해로 생산된 세포이다.
다분화성 줄기 세포
"다분화성 줄기 세포"는 체내에서 어떠한 분화된 세포를 제조하는 가능성을 지닌 진정한 줄기 세포이다. 그러나, 이들은 영양 아층으로부터 기원하는 배아외 막을 제조하는데 기여할 수 없다. 몇가지 유형의 다분화성 줄기 세포가 발견되었다.
배아 줄기 세포
배아 줄기(ES) 세포는 이식이 일어나는 경우 배아 발달의 단계에 있는, 배반포의 내부 세포 질량(ICM)으로부터 분리될 수 있다.
배아 생식 세포
배아 생식(EG) 세포는 유산된 태아내에서 전구체로부터 생식샘으로 분리될 수 있다.
배아 암종 세포
배아 암종(EC) 세포는 태아의 생식샘에서 때때로 발생하는 종양인, 기형암종으로부터 분리할 수 있다. 처음 2개와는 달리, 이들은 일반적으로 홑배수체이다. 이러한 유형의 다분화성 줄기 세포 중 3개 모두는 단지 배아 또는 태아 조직으로부터만 분리될 수 있으며 배양물 속에서 성장시킬 수 있다. 분화로부터 이들 다분화능 세포를 방지하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
성인 줄기 세포
성인 줄기 세포는 골수 이식에서 활성 성분인 신경원성, 피부 및 혈액 형성 줄기 세포를 포함하는 광범위한 유형을 포함한다. 이들 후자의 줄기 세포 유형은 또한 제대-기원한 줄기 세포의 중요한 특징이다. 성인 줄기 세포는, 비록 정확한 수의 세포 유형이 선택된 줄기 세포의 유형에 의해 제한된다고 해도, 실험실 및 체내 둘다에서 기능성인, 보다 분화된 세포 유형으로 성숙될 수 있다. 예를 들어, 성인 줄기 세포는 중간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 유선 줄기 세포, 내피 줄기 세포, 또는 신경원성 줄기 세포일 수 있다. 성인 줄기 세포는 다능성일 수 있다.
다능성 줄기 세포
다능성 줄기 세포는 진정한 줄기 세포이지만, 제한된 수의 유형으로만 분화될 수 있다. 예를 들어, 골수는 혈액의 모든 세포를 생성하지만 다른 유형의 세포는 생성하지 않는 다능성 줄기 세포를 함유한다. 다능성 줄기 세포는 성체 동물에서 발견된다. 사멸되거나 손상된 세포를 교체할 수 있는 경우 체내 어떠한 기관(뇌, 간)도 이들을 함유하는 것으로 고려된다.
줄기 세포를 특성화하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 클론 검정, 유동 세포분석, 장기간 배양 및 분자생물학적 기술, 예를 들면, PCR, RT-PCR 및 서던 블롯팅(Southern blotting)과 같은 표준 검정 방법의 사용을 포함한다.
형태학적 차이 외에, 사람 및 쥐 다분화성 줄기 세포는 다수의 세포 표면 항원(줄기 세포 마커)의 이들의 발현에 있어 상이하다. 줄기 세포에 대한 마커 및 이들의 검출 방법은 또한 본 서류에서 ("줄기 세포 특성의 유지"하에) 기술되어 있다.
줄기 세포의 공급원
미국 특허 제5,851,832호는 뇌 조직으로부터 수득된 다능성 신경원성 줄기 세포를 보고하고 있다. 미국 특허 제5,766,948호는 신생 대뇌 반구로부터 신경모세포의 생산을 보고하고 있다. 미국 특허 제5,654,183호 및 제5,849,553호는 포유동물 신경능선 줄기 세포의 용도를 보고하고 있다.
미국 특허 제6,040,180호는 포유동물 다능성 CNS 줄기 세포의 배양물로부터 분화된 신경원의 시험관내 생성을 보고하고 있다. 국제 출원 공개 제WO 98/50526호 및 국제 출원 공개 제WO 99/01159호는 신경상피 줄기 세포, 희소돌기아교세포-별아교세포 전구체, 및 계통-제한된 신경원성 전구체의 생성 및 분리를 보고하고 있다.
미국 특허 제5,968,829호는 배아 전뇌로부터 입수하여 글루코즈, 트랜스페린, 인슐린, 셀레늄, 프로게스테론 및 몇가지 다른 성장 인자를 포함하는 배지와 함께 배양한 신경원성 줄기 세포를 보고하고 있다.
원시 간 세포 배양물은 사람 생검 또는, 콜라게나제 및 하이알루로니다제의 적절한 조합을 사용한 관류에 의해 외과적으로 절개한 조직으로부터 수득할 수 있다. 이와는 달리, 제EP 0 953 633 A1호는 잘게 썬 사람 간 조직을 제조하고, 농축된 조직 세포를 성장 배지 속에 재현탁시키고, 이들 세포를 배양물 속에서 확장시킴으로써 간 세포를 분리하는 것을 보고하고 있다. 성장 배지는 글루코즈, 인슐린, 트랜스페린, T3, FCS, 및 간세포가 악성 형질전환없이 성장하도록 하는 다양한 조직 추출물을 포함한다.
간에서 세포는 간 실질 세포, 쿠퍼 세포(Kuffer cell), 굴 내피 및 담즙관 상피, 및 또한 성숙한 간세포 또는 담즙 상피 세포 둘다로 분화하는 능력을 갖는 전구체 세포("간모세포" 또는 "난 세포"로 언급됨)를 포함하는 특수화된 세포를 함유하는 것으로 고려된다(참조: L. E. Rogler, Am. J. Pathol. 150:591, 1997; M. Alison, Current Opin. Cell Biol. 10:710, 1998; Lazaro et al., Cancer Res. 58:514, 1998).
미국 특허 제5,192,553호는 사람 신생아 또는 태아 조혈 줄기 또는 후대 세포를 분리하는 방법을 보고하고 있다. 미국 특허 제5,716,827호는 Thy-1 양성 후대세포인 사람 조혈 세포, 및 이들을 시험관내에서 재생시키기에 적절한 성장 배지를 보고하고 있다. 미국 특허 제5,635,387호는 사람 조혈 세포 및 이들의 전구체를 배양하는 방법 및 장치를 보고하고 있다. 미국 특허 제6,015,554호는 사람 림프구 및 가지돌기 세포를 재구성하는 방법을 기술하고 있다.
미국 특허 제5,486,359호는 골, 연골, 힘줄, 인대 및 진피와 같은 하나 이상의 연결 조직 형태의 세포로 분화할 수 있는 사람 중배엽 줄기 세포의 동종 집단을 보고하고 있다. 이들은 골수 또는 골막으로부터 수득된다. 또한, 중배엽 줄기 세포를 확장시키는데 사용된 배양 조건이 보고되어 있다. 국제 출원 공개 제WO 99/01145호는 G-CSF 또는 GM-CSF와 같은 성장 인자로 처리한 개인의 말초 혈액으로부터 분리한 사람 중배엽 줄기 세포를 보고하고 있다. 국제 출원 공개 제WO 00/53795호는 지방 세포 및 적색 세포가 실질적으로 없는, 지방세포-기원한 줄기 세포 및 격자를 보고하고 있다. 보고된 이들 세포를 확장하고 배양하여 호르몬 및 조건화된 배양 배지를 생산할 수 있다.
어떠한 척추동물 종의 줄기 세포도 사용할 수 있다. 사람으로부터의 줄기 세포 뿐만 아니라, 비-사람 영장류, 애완 동물, 가축, 및 설치류, 마우스, 랫트 등과 같은 기타 비-사람 포유동물로부터의 줄기 세포도 포함된다.
본원에 기술된 방법 및 조성물에서 사용하기에 적합한 줄기 세포 중에는 임신 동안 특정 시기에 취한 주머니배, 태아 또는 배아 조직과 같이, 임신 후 형성된 조직으로부터 기원한 영장류 또는 사람 다분화성 줄기 세포가 있다. 비-제한적 예는 배아 줄기 세포의 원시 배양물 또는 확립된 계통(line)이다.
배아 줄기 세포
배아 줄기 세포는 영장류 종의 구성원으로부터의 주머니배로부터 분리할 수 있다(참조: Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844, 1995). 사람 배아 줄기(hES) 세포는 톰슨(Thomson) 등의 문헌(참조: 미국 특허 제5,843,780호; Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998) 및 문헌(Reubinoff et al, Nature Biotech. 18:399,2000)에 기술된 기술을 사용하여 사람 주머니배 세포로부터 제조할 수 있다.
요약하면, 사람 주머니배를 사람으로부터 생체내 착상전 배아로부터 수득할 수 있다. 이와는 달리, 시험관내 수정된(IVF) 배아를 사용하거나, 또는 하나의 세포 사람 배아를 주머니배 단계로 확장시킬 수 있다(참조: Bongso et al., Hum Reprod 4: 706, 1989). 사람 배아를 G1.2 및 G2.2 배지 속에서 주머니배 단계로 배양한다(참조: Gardner et al., Fertil. Steril. 69:84, 1998). 발달한 주머니배를 배아 줄기 세포 분리를 위해 선택한다. 투명대를 주머니배로부터 프로나제(제조원; 시그마)에 약간 노출시켜 제거한다. 내부 세포 덩어리를 면역외과학으로 분리하며, 여기서, 주머니배는 1:50 희석의 토끼 항-사람 비장 세포 항혈청에 30분 동안 노출시킨 다음, 5분 동안 DMEM 속에서 3회 세척하고, 1:5 희석의 기니아 피그 보충물(제조원: 기브코)에 3분 동안 노출시킨다(참조: Solter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:5099, 1975). DMEM 속에서 추가로 2회 세척한 후, 분해된 영양외배엽 세포를 완전한 내부 세포 덩어리(ICM)로부터 온화하게 피펫팅하여 제거하고, ICM을 mEF 공급기 층 위에 플레이팅한다.
9 내지 15일 후, 내부 세포 덩어리-기원한 외부성장물(outgrowth)을 칼슘 및 마그네슘이 없는 포스페이트-완충된 염수(PBS)와 1 mM EDTA에 노출시키거나, 디스파제 또는 트립신에 노출시키거나, 마이크로피펫으로 기계적 해리시켜 덩어리(clump)로 해리시킨 후, 새로운 배지 속의 mEF 위에 재플레이팅한다. 해리된 세포를 새로운 배아 줄기(ES) 배지 속에서 mEF 공급자 층 위에 재플레이팅하고 콜로니 형성에 대해 관측한다. 분화되지 않은 형태학을 입증하는 콜로니를 마이크로피펫으로 개별적으로 선택하고, 덩어리로 기계적으로 해리시키고, 재플레이팅한다. 배아 줄기 세포-유사 형태학은 명백하게 높은 핵 대 세포질 비 및 우세한 핵형을 지닌 압착 콜로니로서 특성화된다. 이후에, 수득되는 배아 줄기 세포를 통상적으로 매 1 내지 2주마다 간단하게 트립신처리하고, 둘베코 PBS(칼슘 또는 마그네슘이 없고 2 mM EDTA가 있음) 에 노출시키거나, 제IV 형 콜라게나제(약 200 U/mL; 제조원: 기브코)에 노출시키거나 마이크로피펫으로 개별 콜로니를 선택함으로써 통상적으로 쪼갠다. 약 50 내지 100개 세포의 덩어리 크기가 적당하다.
배아 배 세포
사람 배아 배(hEG) 세포는 최종 월경 주기 후 약 8 내지 11주에 취한 사람 태아 물질 속에 존재하는 원시 배 세포로부터 제조할 수 있다. 적합한 제조 방법은 문헌(참조: Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998 및 미국 특허 제6,090,622호)에 기술되어 있다.
요약하면, 생식기능성을 등장성 완충액으로 세정한 후, 0.1 mL의 0.05% 트립신/0.53 mM 나트륨 EDTA 용액(BRL)내에 두고 <1 mm3 양(chunk)으로 절단한다. 이후에, 조직을 100/μL 팁을 통해 피펫팅하여 세포를 추가로 분해한다. 이를 37℃에서 약 5분 동안 항온처리한 후, 약 3.5 mL의 EG 성장 배지를 가한다. EG 성장 배지는 DMEM, 4500 mg/L D-글루코즈, 2200 mg/L mM 중탄산나트륨; 15% 배아 줄기(ES)적임의 태아 송아지 혈청(BRL); 2 mM 글루타민 (BRL); 1 mM 피루브산나트륨(BRL); 1000 내지 2000 U/mL 사람 재조합체 백혈병 억제 인자[LIF, 제조원: 겐자임(Genzyme)]; 1 내지 2 ng/ml 사람 재조합체 기본 섬유모세포 성장 인자(bFGF, 제조원: 겐자임); 및 10 μM 포스콜린(10% DMSO 중)이다. 대안적 시도에서, EG 세포는 하이알루로니다제/콜라게나제/DNAse를 사용하여 분리한다. 장간막을 갖는 생식샘 아날라겐 또는 생식기능선을 태아 물질로부터 제거하고, 생식기능선을 PBS로 세정한 후, 0.1 ml의 HCD 소화 용액(0.01% 하이알루로니다제 제V형, 0.002% DNAse I, 0.1% 콜라게나제 제IV형, 모두 EG 성장 배지 속에서 제조한 시그마로부터 구입)에 둔다. 조직을 잘께 썰고 1시간 동안 또는 밤새 37℃에서 항온처리하고, 1 내지 3 mL의 EG 성장 배지 속에 재현탁시키고, 공급자 층 위에 플레이팅한다.
96-웰 조직 배양 플레이트를 LIF, bFGF 또는 포르스콜린이 없는 변형된 EG 성장 배지 속에서 3일 동안 배양하고, 5000 rad γ-조사로 불활성화시킨 공급자 세포의 아-합치성 층을 사용하여 제조한다. 적합한 공급자는 STO 세포(ATCC 수탁 번호 제CRL 1503호)이다. 0.2 mL의 원시 배 세포(PGC) 현탁액을 웰 각각에 가한다. 제1 계대배양을 7 내지 10일 후에 EG 성장 배지 속에서 수행하고, 각각의 웰을 조사된 STO 마우스 섬유모세포로 미리 제조한 24-웰 배양 디쉬의 하나의 웰에 이전한다. 세포를 매일 배지를 교체하면서, EG 세포와 일치하는 세포 형태가 관측될 때까지, 통상적으로 7 내지 30일 후 또는 1 내지 4회 계대배양 후까지 배양한다.
유도된 다분화성 줄기 세포
본원에 기술된 방법 및 조성물을 유도된 다분화성 줄기 세포의 번식을 위해 사용할 수 있다.
일반적으로 iPS 세포 또는 iPSC로 약칭되는, 유도된 다분화성 줄기 세포는 비-다분화성 세포, 통상적으로 성체 체세포, 예를 들면, 섬유모세포, 폐 또는 B 세포로부터 특정 유전자를 삽입함으로써 인공적으로 기원하는 다분화성 줄기 세포의 유형이다.
iPS 세포는 모두 본원에 참조로 혼입된 문헌[참조: Takahashi, K. & Yamanaka(Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 2006;126:663-676), Yamanaka S, et al(Yamanaka S, et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. doi:10.1016/j.cell.2007.11.019, and Yamanaka S, et al. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature 2007;448:313-7), Wernig M, et. al. (In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature 2007;448:318-24), Maherali N, et. al. (Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell 2007;1:55-70) and Thomson JA, Yu J, et al. (Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells. Science DOI: 10.1126/science.1151526) and Takahashi et al., (Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. (2007) 131(5):861-72.]에서 고찰되고 논의되어 있다.
iPS 세포는 특정의 줄기 세포-관련 유전자를 성체 섬유모세포와 같은 비-다분화성 세포내로 형질감염시켜 통상적으로 기원한다. 형질감염은 통상적으로 레트로바이러스와 같은 바이러스 벡터를 통해 달성한다. 형질감염된 유전자는, 비록 다른 유전자도 유도 효능을 향상시키는 것이 제안되어 있다해도, 마스터 전사 조절인자(master transcriptional regulator) Oct-3/4(Pouf51) 및 Sox2를 포함한다. 3 내지 4주 후에, 작은 수의 형질감염된 세포는 다분화성 줄기 세포와 형태학적으로 및 생화학적으로 유사해지기 시작하며, 통상적으로 형태학적 선택, 배가 시간을 통해, 또는 리포터 유전자 및 항생제 형질감염을 통해 분리된다.
다분화성 세포의 공급원
본 발명의 일부 국면 및 양태는 다분화성 세포의 용도에 관한 것이다. 배아 줄기 세포 및 유도된 다분화성 줄기 세포는 이러한 세포의 예로서 기술되어 있다.
배아 줄기 세포는 전통적으로 주머니배 단계 배아의 내부 세포 덩어리(ICM)로부터 기원한다[참조: Evans, M.J., and Kaufman, M.H. (1981). Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature 292, 154-156. Martin, G.R. (1981). Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 7634-7638. Thomson, J.A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S.S., Waknitz, M.A., Swiergiel, J.J., Marshall, V.S., and Jones, J.M. (1998). Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282, 1145-1147]. 배아 줄기 세포를 분리하는데 있어서, 이들 방법은 배아의 파괴를 유발시킬 수 있다.
현재, 예를 들면, 성체 체세포 또는 배 세포를 형질전환시킴으로써 배아의 파괴를 초래하지 않는 몇가지 방법이 다분화성 줄기 세포의 분리를 위해 제공된다. 이들 방법은 다음을 포함한다:
1. 핵 전달에 의한 재프로그래밍. 당해 기술은 체세포로부터의 핵을 난모세포 또는 접합체내로 이전함을 포함한다. 일부 상황에서, 이러한 기술은 동물-사람 하이브리드 세포의 창조를 초래할 수 있다. 예를 들어, 세포는 사람 체세포와 동물 난모세포 또는 접합체의 융합에 의해 또는 사람 난모세포 또는 접합체와 동물 체세포의 융합에 의해 창조될 수 있다.
2. 배아 줄기 세포와의 융합에 의한 재프로그래밍. 당해 기술은 체세포와 배아 줄기 세포의 융합을 포함한다. 당해 기술은 또한 상기 1에서와 같이 동물-사람 하이브리드 세포의 창조를 초래할 수 있다.
3. 배양에 의한 자발적인 재-프로그래밍. 당해 기술은 장기간 배양 후 비-다분화성 세포로부터 다분화성 세포의 생성을 포함한다. 예를 들면, 다분화성 배아 배(EG) 세포는 원시 배 세포(PGC)의 장-기간 배양에 의해 생성되었다(참조: 본원에서 참조로 혼입된 문헌: Matsui et al., Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture. Cell 70, 841-847, 199). 골수-기원한 세포의 장기간 배양 후 다분화성 줄기 세포의 발달 또한 보고되어 있다(참조: 본원에 참조로 혼입된 문헌, Jiang et al., Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature 418, 41-49, 2002). 이들은 이들 세포를 다능성 성체 후대 세포(MAPC)로 지정하였다. 시노하라(Shinohara) 등은 또한, 다분화성 줄기 세포가 신생아 마우스 고환으로부터의 배선 줄기(GS) 세포의 배양 과정 동안 생성될 수 있음을 입증하였으며, 이들은 이를 다능성 배선 줄기(mGS) 세포로 지정하였다(참조: 본원에 참조로 혼입된 문헌, Kanatsu-Shinohara et al., Generation of pluripotent stem cells from neonatal mouse testis. Cell 119, 1001-10012, 2004).
4. 정의된 인자에 의한 재프로그래밍. 예를 들면, 전사 인자(예를 들면, Oct-3/4, Sox2, c-Myc, 및 KLF4)의 마우스 배아 또는 성체 섬유모세포내로의 예를 들면, 위에서 기술된 바와 같은, 레트로바이러스-매개된 도입에 의한 iPS 세포의 생성. 가지(Kaji) 등은 또한 문헌(참조: 본원에서 참조로 혼입된 문헌, Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors. Nature. Online publication 1 March 2009)에서 마우스 및 사람 섬유모세포 둘다를 재프로그래밍할 수 있는 2A 펩타이드와 연결된 c-Myc, Klf4, Oct4 및 Sox2의 암호화 서열을 포함하는, 단일의 다단백질 발현 벡터의 비-바이러스성 형질감염을 기술하고 있다. 이러한 비-바이러스 벡터를 사용하여 생산한 iPS 세포는 다분화성 마커의 풍부한 발현을 나타내며, 이는 시험관내 분화 검정 및 성체 키메라 마우스의 형성에 의해 기능적으로 확인된 재프로그램화된 상태를 나타낸다. 이들은 다분화능 마커의 풍부한 발현으로 배아 섬유모세포로부터 재프로그램화된 사람 세포주를 확립하는데 성공하였다.
방법 1 내지 4는 본원에서 참조로 혼입된 문헌[참조: Shinya Yamanaka in Strategies and New Developments in the Generation of Patient-Specific Pluripotent Stem Cells (Cell Stem Cell 1, July 2007 a2007 Elsevier Inc]에 기술되고 논의되어 있다.
5. 단일 분할세포 또는 생검된 분할세포로부터 hESC 세포주의 유도체화[참조: 모두 본원에 참조로 혼입된 문헌, Klimanskaya I, Chung Y, Becker S, Lu SJ, Lanza R. Human embryonic stem cell lines derived from single blastomeres. Nature 2006; 444:512, Lei et al Xeno-free derivation and culture of human embryonic stem cells: current status, problems and challenges. Cell Research (2007) 17:682-688, Chung Y, Klimanskaya I, Becker S, et al. Embryonic and extraembryonic stem cell lines derived from single mouse blastomeres. Nature. 2006;439:216-219. Klimanskaya I, Chung Y, Becker S, et al. Human embryonic stem cell lines derived from single blastomeres. Nature. 2006;444:481-485. Chung Y, Klimanskaya I, Becker S, et al. Human embryonic stem cell lines generated without embryo destruction. Cell Stem Cell. 2008;2:113-117 and Dusko Ilic et al (Derivation of human embryonic stem cell lines from biopsied blastomeres on human feeders with a minimal exposure to xenomaterials. Stem Cells And Development - paper in pre-publication].
6. 분해가 중지된 억제된 배아로부터 수득되고 시험관내에서 상실배 및 주머니배로 발달하는데 실패한 hESC 세포주[참조: 둘다 본원에 참조로 혼입된 문헌, Zhang X, Stojkovic P, Przyborski S, et al. Derivation of human embryonic stem cells from developing and arrested embryos. Stem Cells 2006; 24:2669-2676 및 Lei et al Xeno-free derivation and culture of human embryonic stem cells: current status, problems and challenges. Cell Research (2007) 17:682-688].
7. 파르토게네시스(Parthogenesis)(또는 처녀생식). 당해 기술은 수정란을 화학적 또는 전기적으로 자극시켜 이것이 배아 줄기 세포가 기원할 수 있는 분할세포로 발달하도록 함을 포함한다. 예를 들면, 수정되지 않은 중기 II 난모세포를 화학적 활성화시켜 줄기 세포를 생산함을 포함하는 문헌[참조: Lin et al. Multilineage potential of homozygous stem cells derived from metaphase II oocytes. Stem Cells. 2003;21(2):152-61]을 참조한다.
8. 태아 기원의 줄기 세포. 이들 세포는 가능성의 측면에서 배아 및 성체 줄기 세포 사이에 있으며 다분화성 또는 다능성 세포를 유도하는데 사용될 수 있다. 다분화능의 마커를 발현하는 사람 제대-기원한 태아 중간엽 줄기 세포(UC fMSC)(Nanog, Oct-4, Sox-2, Rex-1, SSEA-3, SSEA-4, Tra-1-60, 및 Tra-1-81, β-갈락토시다제 염색 및, 텔로머라제 활성의 지속적인 발현에 의해 입증되는 노화의 최소 증거 포함)는 크리스 에이치. 조(Chris H. Jo) 등(참조: 본원에 참조로 혼입된 문헌, Fetal mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord sustain primitive characteristics during extensive expansion. Cell Tissue Res (2008) 334:423-433)에 의해 성공적으로 유도되었다. 윈스톤 코스타 페레이라(Winston Costa Pereira) 등은 문헌(참조: Reproducible methodology for the isolation of mesenchymal stem cells from human umbilical cord and its potential for cardiomyocyte generation J Tissue Eng Regen Med 2008; 2: 394-399, 본원에 참조로 혼입됨)은 사람 제대의 와튼 젤리(Wharton's jelly)로부터 중간엽 줄기 세포의 순수한 집단을 분리하였다. 와튼 젤리로부터 기원한 중간엽 줄기 세포는 또한 문헌[참조: Troyer & Weiss (Concise Review: Wharton's Jelly-Derived Cells Are a primitive Stromal Cell Population. Stem Cells 2008:26:591-599, 본원에 참조로 혼입됨]에서 고찰된다. 김(Kim) 등은 문헌[참조: Ex vivo characteristics of human amniotic membrane-derived stem cells. Cloning Stem Cells 2007 Winter;9(4):581-94, 본원에 참조로 혼입]에서 사람 양막으로부터 사람 양막-기원한 중배엽 세포를 분리하는데 성공하였다. 제대는 일반적으로 폐기되는 조직이며 당해 조직으로부터 기원한 줄기 세포는 도덕적이거나 윤리적인 목적에는 매력적이지 않은 경향이 있어 왔다.
본 발명은 이들 방법들 중 어느 것에 의해 창조되거나 이들 공급원 중 어느 것으로부터 수득된 다분화성 또는 다능성 줄기 세포의 용도를 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명의 방법에 사용된 다분화성 또는 다능성 세포는 배아의 파괴를 유발하지 않는 방법에 의해 수득되었다. 보다 바람직하게는 일부 양태에서, 본 발명의 방법에 사용된 다분화성 또는 다능성 세포는 사람 또는 포유동물 배아의 파괴를 유발하지 않는 방법으로 수득되어 왔다. 이와 같이, 본 발명의 방법은 이들 세포가 기원할 수 있는 사람 배아의 파괴를 필수적으로 포함하는 방법에 의해 전적으로 제조되지 않는 세포를 사용하여 수행할 수 있다. 이러한 임의의 제한은 유럽 특허청의 확장된 상고 법원(Enlarged Board of Appeal of the European Patent Office)의 2008년 11월 25일자 판결 G0002/06을 고려하여 상세히 의도된다.
분화/배아유사세포덩어리
배양된 줄기 세포는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 분화 기술을 사용함으로써 어떠한 적합한 세포 유형으로도 분화될 수 있다.
본 발명자들은 분화된 세포를 생산하는 방법을 기술하며, 당해 방법은 본원에 기술된 바와 같은 방법에 의해 줄기 세포를 번식시킨 후, 당해 줄기 세포를 공지된 기술에 따라 분화시킴을 포함한다. 예를 들어, 본 발명자들은 외배엽, 중배엽 및 내배엽 뿐만 아니라, 심근세포, 지방세포, 연골세포 및 골세포 등으로 분화시키는 방법을 제공한다. 본 발명자들은 또한 이러한 방법으로 수득가능한 배아유사세포덩어리 및 분화된 세포를 제공한다. 이러한 줄기 세포 및 분화된 세포로부터 제조된 세포주를 또한 제공한다.
줄기 세포를 분화시키는 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며 예를 들면, 문헌[참조: Itskovitz-Eldor (J Itskovitz-Eldor, M Schuldiner, D Karsenti, A Eden, O Yanuka, M Amit, H Soreq, N Benvenisty. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 2000 Feb ;6 (2):88-95) and Graichen et al (2007), Kroon et al (2008) and Hay et al (2008. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signalling. PNAS Vol. 105. No.34 12310-12306.), WO 2007/030870, WO 2007/070964, Niebrugge et al (Generation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Mesoderm and Cardiac Cells Using Size-Specified Aggregates in an Oxygen-Controlled Bioreactor. Biotechnology and Bioengineering. Vol.102, no.2, February 1, 2009.), R Passier et al. (Serum free media in cocultures (FBS inhibits cardiomyocytes differentiation). Curr Opin Biotechnol. 2005 Oct;16(5):498-502. Review. Stem Cells. 2005 Jun-Jul;23(6):772-80), P W Burridge et al. (Defined Medium with polyvinyl alcohol (PVA), Activin A and bFGF. Stem Cells. 2007 Apr;25(4):929-38. Epub 2006 Dec 21.), M A Laflamme et al. (Culture sequentially supplemented with Activin A for 24 h, and BMP 4 for 4 days. Nat Biotechnol. 2007 Sep;25(9):1015-24. Epub 2007 Aug 26.), L Yang et al. (Defined medium supplemented with BMP4 (1 day), BMP4, Activin A and bFGF (days 1-4), Activin A and bFGF (days 4-8), and DKK1 and VEGF. Nature. 2008 May 22;453(7194):524-8. Epub 2008 Apr 23.), and X Q Xu et al. (SB203580 (p38 MAP 키나제 inhibitor) PGI2 (prostaglandin member accumulated in END2-CM). Differentiation. 2008 Nov;76(9):958-70. Epub 2008 Jun 13]에 기술되어 있다.
배양된 줄기 세포는 또한 배아유사세포덩어리의 형성에 사용될 수 있다. 배아유사세포덩어리, 및 이를 제조하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 용어 "배아유사세포덩어리"는 현탁액 속에서 배아 줄기 세포의 성장에 의해 생산된 배양물 속에서 관측된 회전타원체 콜로니를 말하다. 배아유사세포덩어리는 혼합된 세포 유형이며, 특수한 세포 형태의 외형의 분포 및 시기는 배아내에서 관측된 것에 상응한다. 배아유사세포덩어리는 배아 줄기 세포를 반-고체 배지와 같은 배지 위에 플레이팅함으로써 생성시킬 수 있다. 메틸셀룰로즈 배지를 문헌(참조: Lim et al, Blood. 1997;90:1291-1299)에 기술된 바와 같이 사용할 수 있다.
배아 줄기 세포는 예를 들면 문헌[참조:Itskovitz-Eldor (2000)]에 기술된 방법을 사용하여 배아유사세포덩어리를 형성하도록 유도시킬 수 있다. 배아유사세포덩어리는 모든 3개의 배아 배 층의 세포를 함유한다.
배아유사세포덩어리는 또한 적절한 유도 인자 또는 환경 변화에 노출시킴으로써 상이한 계통으로 분화하도록 유도시킬 수 있다. 문헌[참조: Graichen et al (2007)]은 p38MAP 키나제 경로의 조작에 의해 사람 배아 줄기 세포로부터 심근세포의 형성을 기술하고 있다. 그라이켄(Graichen)은 10 마이크로몰 미만에서 SB203580와 같은 p38 MAP 키나제의 특수 억제제에 노출시킴으로써 줄기 세포로부터 심근세포 형성의 유도를 입증하고 있다.
분화된 세포는 당해 분야에 공지된 바와 같이, 재생 치료요법과 같은 특정의 적합한 목적으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 배양 방법 및 기술을 통해 수득된 줄기 세포를 사용하여 의학적 치료 방법에서 사용하기 위한 다른 세포 유형으로 분화시킬 수 있다. 따라서, 분화된 세포 유형은 후속적으로 분화되도록 허용하는 본원에 기술된 배양 방법 및 기술에 의해 수득된 줄기 세포로부터 기원할 수 있다. 분화된 세포는 후속적으로 분화되도록 허용되는 본원에 기술된 배양 방법 및 기술에 의해 수득된 줄기 세포의 생성물로 고려될 수 있다. 약제학적 조성물은 이러한 분화된 세포를 임의로 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제 또는 희석제와 함께 포함하도록 제공될 수 있다. 이러한 약제학적 조성물은 의학적 치료 방법에 유용할 수 있다.
마이크로캐리어의 분화
본 발명자들의 앞서의 발견(참조: 2009년 3월 17일자로 출원된 미국 특허출원 제US 61/069,694호, 2008년 10월 31일자로 출원된 제US 61/110,256호, 2009년 1월 29일자로 출원된 제US 61/148,064호 및 2009년 2월 27일자로 출원된 제US 61/155,940호)에 따라서, 줄기 세포, 특히 배아 줄기 세포 및 iPS를 도입하여 마이크로캐리어 위에서 현탁 배양 동안 분화시킬 수 있다.
배아 줄기 세포는 3개의 원시 배 층: 외배엽, 내배엽 및 중배엽 및 이들의 유도체로 분화하도록 유도할 수 있다. 배아 줄기 세포는 배아유사세포덩어리를 형성하도록 유도시킬 수 있다. 따라서, 광범위한 세포 유형 또는 조직, 예를 들면, 심근세포, 심장 중배엽, 간세포, 간세포 내배엽, 췌장섬 세포, 췌장 내배엽, 인슐린 생산 세포, 신경 조직, 신경외배엽, 상피 조직, 표면 외배엽, 골, 연골, 근육, 인대, 힘줄 또는 다른 연결 조직을 수득할 수 있다.
줄기 세포의 분화 방법 및 배아유사세포덩어리의 형성 방법은 위에 기술되어 있으며 마이크로캐리어 배양시 줄기 세포의 분화에 적용가능하다.
마이크로캐리어 배양 동안 줄기 세포의 분화 방법은 ROCK 억제제의 존재 또는 부재하에 수행할 수 있다. 예를 들어, 마이크로캐리어 위에서 ROCK 억제제의 존재하에 본 발명에 따라 번식된 줄기 세포는 세포(및 마이크로캐리어)를, 분화를 유도할 배양 조건에 노출시켜 분화하도록 유도할 수 있다. 이러한 배양 조건은 줄기 세포를 ROCK 억제제(이는 세포의 번식에 사용된 ROCK 억제제와 동일하거나 상이할 수 있다)에 지속적으로 노출시킴을 포함할 수 있거나, 배양 조건은 ROCK 억제제를 배제할 수 있다.
마이크로캐리어 배양 동안 줄기 세포의 분화 방법은 마이크로캐리어가 위에서 기술한 바와 같이 매트릭스 피복 속에서 피복되거나 피복되지 않음을 필요로 할 수 있다. 예를 들면, 적합한 피복은 마트리겔, 라미닌, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 하이알루론산 중의 하나 이상을 포함할 수 있다.
마이크로캐리어 배양 동안 줄기 세포의 분화 방법은 배양 배지에 보충물을 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 보충물은 소 혈청 알부민, 지질 또는 하이-소이(Hy-Soy)[제조원: 시그마-알드리히(Sigma-Aldrich)-이는 대두 단백질의 효소 가수분해물이다]를 포함할 수 있다.
마이크로캐리어 배양 동안 줄기 세포의 분화 방법은 2D 배양 또는 3D 현탁액 마이크로캐리어 배양 동안 줄기 세포를 초기 배양하고 증식시킨 후 마이크로캐리어 배양 동안 분화를 유도함을 포함할 수 있다.
용도
본원에 기술된 방법 및 조성물은 각종 수단을 위해 사용될 수 있다.
예를 들어, 본원에 기술된 입자들은 줄기 세포의 보다 단순한 배양을 위한 실험실 시약 또는 조사 도구로서 제공될 수 있다. 이들은 분화된 세포를 생성시키기 위한 마이크로캐리어 위에서 분화되지 않은 줄기 세포의 확장을 위해 사용할 수 있다. 이는 축소 제조능으로 발전시킬 수 있다. 줄기 세포는 확장시키고 임의로 약물 시험시 사용하기 위해 분화시킬 수 있다. 입자 또는 마이크로캐리어는 상이한 배지 조건에서 줄기 세포의 조합적 분화를 위해 표지시킬 수 있다. 본원에 기술된 방법으로 번식된 줄기 세포는 각종의 상업적으로 중요한 조사, 진단 및 치료학적 목적으로 사용될 수 있다. 줄기 세포는 이들 목적을 위해 직접 사용될 수 있거나, 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 특정한 선택된 세포 유형으로 분화시킬 수 있다. 후대 세포는 또한 줄기 세포로부터 기원시킬 수 있다. 분화된 세포 또는 후대 세포, 또는 이들 둘다는 동일한 목적으로 줄기 세포 대신, 또는 이와 함께 사용될 수 있다. 따라서, 본 서류에서 줄기 세포에 대해 기술된 어떠한 용도도 후대 세포 및 줄기 세포로부터 기원한 분화된 세포에 대해 동등하게 적용된다. 유사하게, 분화된 세포의 어떠한 용도도, 이들이 후대세포가 되는 줄기 세포, 또는 후대 세포에 동등하게 적용될 것이다.
줄기 세포 등에 대한 용도는 일반적으로 당해 분야에 잘 공지되어 있으나, 본원에 간략하게 기술할 것이다.
치료학적 용도
본원에 기술된 방법 및 조성물을 사용하여 재생 치료요법을 위한 줄기 세포를 증식시킬 수 있다. 줄기 세포는 확장되어 환자에게 직접 투여될 수 있다. 이들은 외상 후 손상된 조직의 재증식을 위해 사용될 수 있다. 배아 줄기 세포는 직접 사용될 수 있거나, 또는 재생 치료요법을 위해 외배엽, 중배엽 또는 내배엽 후대 세포 집단을 생성시키는데 사용될 수 있다. 후대 세포는 생체외 확장에 의해 제조될 수 있거나 환자에게 직접 투여될 수 있다. 이들은 또한 외상 후 손상된 조직의 재증식을 위해 사용될 수 있다.
따라서, 조혈 후대 세포는 골수 치환을 위해 사용될 수 있는 반면, 심장 후대 세포는 심부전 환자를 위해 사용될 수 있다. 피부 후대 세포는 환자를 위한 피부 이식 및 스텐트(stent) 또는 인공 심장과 같은 인공 보철물의 내피화(endothelization)를 위한 내피 후대 세포를 성장시키기 위해 사용될 수 있다.
배아 줄기 세포는 당뇨병, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease) 등과 같은 변성 질환의 치료를 위한 외배엽, 중배엽 또는 내배엽 후대 세포의 공급원으로서 사용될 수 있다. 배아모양 줄기 세포는 NK용 중배엽 또는 내배엽 후대세포 또는, 암용 면역치료요법을 위한 수지상 세포의 공급원으로서 사용될 수 있다.
본원에 기술된 방법 및 조성물은 말단 분화된 세포 유형으로 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 추가로 분화시키기 위해 사용되는 과정일 수 있는, 외배엽, 중배엽 또는 내배엽 후대 세포의 생산을 가능하도록 한다.
따라서, 말단 분화된 세포의 특정 용도는 이들이 공급원이 되는 외배엽, 중배엽 또는 내배엽 후대 세포(또는 줄기 세포)에 동등하게 부착될 것이다.
본원에 기술된 방법 및 조성물에 의해 생산된 줄기 세포, 외배엽, 중배엽 또는 내배엽 후대 세포 및 분화된 세포는 질병의 치료를 위한 약제학적 조성물을 위해, 또는 이의 제조를 위해 사용할 수 있다. 이러한 질병은 심부전, 골수 질환, 피부병, 화상, 당뇨병, 알츠하이머병, 파킨슨병 등과 같은 변성 질환 및 암을 포함하는 재생 치료요법으로 치료가능한 질병을 포함할 수 있다.
라이브러리(library)
예를 들어, 분화되지 않은 세포 및 분화된 세포의 집단을 사용하여 분화된 표현형에 대해 특이적인 항체 및 cDNA 라이브러리를 제조할 수 있다. 면역검정 및 면역분리 방법에서 항체를 생성시키고, 정제하며 변형시키는데 사용된 일반적인 기술 및 이들의 용도는 문헌[참조: Handbook of Experimental Immunology (Weir & Blackwell, eds.); Current Protocols in Immunology (Coligan et al., eds.); 및 Methods of Immunological Analysis (Masseyeff et al., eds., Weinheim: VCH Verlags GmbH)]에 기술되어 있다. mRNA 및 cDNA 라이브러리의 제조시 포함된 일반적인 기술은 문헌[참조: RNA Methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and Characterization (R. E. Farrell, Academic Press, 1998); cDNA Library Protocols (Cowell & Austin, eds., Humana Press); 및 Functional Genomics (Hunt & Livesey, eds., 2000)]에 기술되어 있다. 비교적 동질성인 세포 집단이 약물 스크리닝 및 치료학적 적용에서 사용하기에 특히 적합하다.
약물 스크리닝
줄기 세포 및 분화된 세포를 또한 사용하여 인자들(예를 들면, 용매, 소 분자 약물, 펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 등) 또는, 줄기 세포 또는 분화된 세포의 특성에 영향을 미치는 환경 조건(예를 들면, 배양 조건 또는 조작)에 대해 스크리닝할 수 있다.
줄기 세포를 사용하여 다분화능 또는 분화를 촉진하는 인자들에 대해 스크리닝할 수 있다. 일부 적용에서, 분화된 세포를 사용하여 장기간 배양시 이러한 세포의 성숙을 촉진하거나, 이러한 세포의 증식 및 유지를 촉진하는 인자들을 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 후보물 성숙화 인자 또는 성장 인자들은 이들을 상이한 웰에서 세포에 가한 후 추가의 배양 및 세포의 사용을 위해 요구되는 기준에 따라, 수득되는 특정의 표현형 변화를 측정함으로써 시험한다.
특수한 스크리닝 적용은 약물 연구시 약제학적 화합물의 시험에 관한 것이다. 독자는 일반적으로 표준 교재 "In vitro Methods in Pharmaceutical Research", Academic Press, 1997, 및 미국 특허 제5,030,015호, 및 본원에 또한 기술되어 있는 약물 스크리닝의 일반적인 기술을 참조한다. 후보 약제학적 화합물의 활성의 평가는 일반적으로 줄기 세포 또는 분화된 세포를 후보물 화합물과 합하고, (처리되지 않은 세포 또는 불활성 화합물로 처리된 세포와 비교하여,) 화합물에 기여할 수 있는 세포의 형태학, 마커 표현형, 또는 대사 활성에 있어서의 어떠한 변화도 측정한 후, 화합물의 효과를 관측된 변화의 연관시킴을 포함한다.
스크리닝은 예를 들면, 화합물이 특정의 세포 유형에서 약리학적 효과를 지니도록 설계되거나, 화합물이 의도되지 않은 부작용을 가질 수 있는 다른 곳에서 효과를 가지도록 설계되므로, 수행될 수 있다. 2개 이상의 약물을 함께(세포를 동시에 또는 연속적으로 합함으로써) 시험하여 가능한 약물-약물 상호작용 효과를 검출할 수 있다. 일부 적용에서, 화합물은 초기에 잠재적인 독성에 대해 스크리닝된다(참조: Castell et al., pp. 375-410 in "In vitro Methods in Pharmaceutical Research," Academic Press, 1997). 세포독성은 처음 예에서 세포 생활력, 생존률, 형태학 및, 특정 마커, 리포터 또는 효소의 발현 또는 방출에 있어서의 효과에 의해 측정될 수 있다. 염색체 DNA에 있어서 약물의 효과는 DNA 합성 또는 복구를 측정함으로써 측정할 수 있다. 특히 세포 주기에서 계획되지 않은 횟수 또는 세포 복제에 요구되는 수준 이상에서 [3H]티미딘 또는 BrdU 혼입은 약물 효과와 일치한다. 원치않는 효과는 또한 중기 확산에 의해 측정된, 자매 염색분체 교환(sister chromatid exchange)의 특수한 비율을 포함할 수 있다. 독자는 추가의 정교화를 위해 문헌[참조: A. Vickers (PP 375-410 in "In vitro Methods in Pharmaceutical Research," Academic Press, 1997]을 참조한다.
조직 재생
본원에 기술된 방법 및 조성물에 따라 번식된 줄기 세포(및 이로부터 기원한 분화된 세포)를 이를 필요로 하는 개개 환자에서 치료요법, 예를 들면, 조직 재구성 또는 재생을 위해 사용할 수 있다. 세포는 이들을 의도된 조직 부위로 이식하여 기능적으로 결손된 부위를 재구성하거나 재생하도록 하는 방식으로 투여될 수 있다.
번식된 줄기 세포 또는 이로부터 기원한 분화된 세포를 피부 이식편의 성장을 위해서와 같이 조직 가공에 사용할 수 있다. 이들은 인공 기관 또는 조직, 또는 스텐트와 같은 보철물에 사용할 수 있다.
분화된 세포는 또한 이를 필요로 하는 사람 환자에서 조직 재구성 또는 재생을 위해 사용할 수 있다. 세포는 이들이 의도된 조직 부위로 이식되어 기능적으로 결손된 부위를 재구성하거나 재생하도록 하는 방식으로 투여된다. 예를 들면, 본원에 기술된 방법 및 조성물을 사용하여 줄기 세포의 분화를 조절할 수 있다. 분화된 세포는 피부 이식편의 성장을 위한 것과 같은 조직 가공에 사용할 수 있다. 줄기 세포 분화의 조정을 인공 기관 또는 조직의 생가공, 또는 스텐트와 같은 보철물에 사용할 수 있다. 다른 예에서, 신경 줄기 세포는 치료하는 질병에 따라 중추 신경계의 실질 또는 수막공간내 부위내에 직접 이식된다. 이식은 단일 세포 현탁액 또는 소 응집체를 25,000 내지 500,000 세포/mu.L의 밀도로 사용하여 수행한다(참조: 미국 특허 제5,968,829호). 신경 세포 이식편의 효능은 문헌[참조: McDonald et al. (Nat. Med. 5:1410, 1999)]에 의해 기술된 바와 같이 급성으로 손상된 척수에 대해 랫트 모델에서 평가할 수 있다. 성공적인 이식편은 2 내지 5주 후 병변내에 존재하여, 별아교세포, 희소돌기아교세포 및/또는 신경원으로 분화하고 병변이 있는 말단으로부터의 척수를 따라 이주하는 이식편-기원한 세포, 및 관문(gate) 및 협조 및 체중-부하(weight-bearing)에 있어서의 개선을 나타낼 것이다.
특정의 신경 후대 세포는 신경계에 대한 급성 또는 만성 손상의 치료를 위해 설계된다. 예를 들어, 흥분독성은 간질, 뇌졸증, 허혈, 헌팅톤병(Huntington's disease), 파킨슨병 및 알츠하이머병을 포함하는 각종 상태에 관련되어 있다. 본원에 기술된 방법에 따라 제조된 것으로서 특정의 분화된 세포는 또한 펠리체우스-메르츠바허병(Pelizaeus-Merzbacher diseae), 다발경화증, 백색질형성장애, 신경염 및 신경병증과 같은 수초형성장애 질환을 치료하는데 적절할 수 있다. 이들 목적을 위해, 재수초형성을 촉진하기 위해 희소돌기아교세포 또는 희소돌기아교세포 전구체가 강화된 세포 배양이 적절하다.
본 발명자들의 방법을 사용하여 제조한 간세포 및 간세포 전구체는 간 손상을 복구하는 능력에 대해 동물 모델에서 평가할 수 있다. 하나의 이러한 예는 D-갈락토사민의 복강내 주사에 의해 유발된 손상이다(참조: Dabeva et al., Am. J. Pathol. 143:1606, 1993). 치료 효능은 간 세포 마커에 대한 면역조직화학 염색, 성장하는 조직에서 세관 구조가 형성되는지의 여부의 현미경적 측정, 및 간-특이적인 단백질의 합성을 복원하는 치료의 능력에 의해 측정할 수 있다. 간 세포는 직접적인 투여에 의해 치료요법에서, 또는 일시적인 간 기능을 제공하는 생보조 장치(bioassist device)의 일부로서 사용될 수 있는 반면, 대상체의 간 조직은 전격간기능상실 후 자가 재생된다.
심근세포는 문헌[참조: Graichen et al (2007)]에 기술된 바와 같이, 예를 들면, 특이적인 p38 MAP 키나제 억제제인 SB203580을 사용한 MAP 키나제 경로의 조절에 의해 줄기 세포의 분화를 유도함으로써 제조할 수 있다. 이러한 심근세포의 효능은 좌심실 벽 조직의 55%가 치료 부재하에서 반흔 조직이 되도록 하는, 심장 동결손상(cryoinjury)용 동물 모델에서 평가할 수 있다(참조: Li et al., Ann. Thorac. Surg. 62:654, 1996; Sakai et al., Ann. Thorac. Surg. 8:2074, 1999, Sakai et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 118:715, 1999). 성공적인 치료는 반흔 부위를 감소시키고, 반흔 확장을 제한하며, 수축기, 확장기 및 발전된 압력에 의해 측정된 것으로서 심장 기능을 개선시킬 것이다. 심장 손상은 또한 좌전 하방 동맥의 근접한 부위에서 색전 코일(embolization coil)을 사용하여 모델화할 수 있으며(참조: Watanabe et al., Cell Transplant. 7:239, 1998), 치료 효능은 조직학 및 심장 기능으로 평가할 수 있다. 심근세포 제제를 치료요법에서 사용하여 심장 근육을 재생시키고 불충분한 심장 기능을 치료할 수 있다(참조: 미국 특허 제5,919,449호 및 제WO 99/03973호).
암
본원에 기술된 방법 및 조성물에 따라 번식된 줄기 세포 및 이로부터 기원한 분화된 세포를 암의 치료에 사용할 수 있다.
용어 "암" 및 "암성"은 조절되지 않은 세포 성장에 의해 통상적으로 특성화된 포유동물에서 생리학적 상태를 말하거나 기술한다. 암의 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 암의 보다 특수한 예는 편평 세포암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 위장암, 췌장암, 아교모세포종 및 신경섬유종증가 같은 아교 세포 종양, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양(hepatoma), 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁매막 암종, 침샘 암종, 신장암(kidney cancer, renal cancer), 전립샘 암, 외음 암, 갑상샘 암, 간 암종 및 각종 유형의 두부 및 경부 암을 포함한다. 추가의 예는 결장암, 유방암, 폐암 및 전립샘암을 포함하는 고형 종양암, 백혈병 및 림프종을 포함하는 조혈 악성종양, 호지킨병(Hodgkin's disease), 재생불량빈혈, 피부암 및 가족성 샘종 폴립증이 있다. 추가의 예는 뇌 신생물, 결장직장 신생물, 유방 신생물, 자궁경부 신생물, 눈 신생물, 간 신생물, 폐 신생물, 췌장 신생물, 난소 신생물, 전립샘 신생물, 피부 신생물, 고환 시생물, 신생물, 골 신생물, 영양막 신생물, 난관 신생물, 직장 신생물, 결장 신생물, 신장 신생물, 위 신생물 및 부갑상샘 신생물을 포함한다. 유방암, 전립샘암, 췌장암, 결장직장암, 폐암, 악성 흑색종, 백혈병, 림프종, 난소암, 자궁경부암 및 담관 암종 또한 포함된다. 본원에 기술된 방법 및 조성물에 따라 번식되고 임의로 분화된 줄기 세포는 또한 엔도스타틴 및 안지오스타틴과 같은 항암제 또는, 세포독성제 또는 화학치료요법제와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 아드리아마이신, 다우노마이신, 시스-백금, 에토포시드, 탁솔, 탁소테레 및, 빈크리스틴과 같은 알칼로이드와 같은 약물, 및 메토트렉세이트와 같은 항대사물질과 함께 사용될 수 있다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제하거나 방지하고/하거나 세포의 파괴를 유발하는 물질을 말한다. 당해 용어는 방사활성 동위원소(예를 들면, I, Y, Pr), 화학치료제, 및 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소와 같은 독소, 또는 이의 단편을 포함하는 것으로 의도된다.
또한, 당해 용어는 국제 출원 공개 제WO 94/22867호에 기술된 비사이클릭(bicyclic) 안사마이신과 같은 종양유전자 생성물/타이로신 키나제 억제제; 제EP 600832호에 기재된 1,2-비스(아릴아미노)벤조산 유도체; 제EP 600831호에 기재된 6,7-디아미노-프탈라진-1-온 유도체; 제EP 516598호에 기재된 4,5-비스(아릴아미노)-프탈이미드 유도체; 또는 SH2-함유 기질 단백질에 대한 타이로신 키나제의 결합을 억제하는 펩타이드(참조: 예를 들면, 국제 출원 공개 제WO 94/07913호)를 포함한다. "화학치료제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학치료제의 예는 아드리아마이신, 독소루비신, 5-플루오로우라실(5-FU), 사이토신 아라비노사이드(Ara-C), 사이클로포스파미드, 티오테파, 부설판, 사이톡신, 탁솔, 메토트렉세이트, 시스플라틴, 멜팔란, 빈블라스틴, 블레오마이신, 에토포시드, 이포스파미드, 미토마이신 C, 미톡산트론, 빈크리스틴, VP-16, 비노렐빈, 카르보플라틴, 테니포시드, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신, 니코틴아미드, 에스페라미신(참조: 미국 특허 제4,675,187호), 멜팔란 및 다른 관련 질소 무스타드, 및 엔도크린 치료요법[예를 들면, 디에틸스틸베스트롤(DES), 타목시펜, LHRH 길항 약물, 프로게스틴, 항-프로게스틴 등]을 포함한다.
본 발명의 실시는 달리 나타내지 않는 한, 화학, 분자생물학, 미생물학, 재조합체 DNA 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이며, 이들은 당해 분야의 통상의 기술자의 능력내에 있다. 이러한 기술은 문헌[참조: 예를 들면, J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James O'D. McGee, 1990, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; Using Antibodies : A Laboratory Manual : Portable Protocol NO. I by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7); Antibodies : A Laboratory Manual by Ed Harlow (Editor), David Lane (Editor) (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-314-2), 1855; 및 Lab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench, Edited Jane Roskams and Linda Rodgers, 2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3]에 설명되어 있다. 이들 일반서 각각은 본원에 참조로 혼입되어 있다.
본 발명은, 이러한 조합이 명확히 허용될 수 없거나 표현적으로 피해야 하는 경우를 제외하고는, 기술된 측면 및 바람직한 특징의 조합을 포함한다.
본원에서 사용된 부제는 단지 구조화 목적이며 기술된 주제를 한정하는 것으로 고려되어서는 안된다.
본 발명의 국면 및 양태를 이제 첨부된 도면을 참조로 하여, 실시예의 방법으로 설명할 것이다. 추가의 국면 및 양태는 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 본 내용에서 언급된 모든 서류는 본원에 참조로 혼입된다.
본 발명의 원리를 설명하는 양태 및 실시예를 이제 첨부된 도면을 참조로 하여 논의할 것이며, 여기서:
도 1. 마트리겔의 부재하에서 그러나 ROCK 억제제 Y-27632의 존재하에서 DE53 셀룰로즈 마이크로캐리어 위에서 hESC를 9주 연속 계대배양한 결과를 나타내는 도표. ROCK 억제제의 부재하에서, hESC는 4주 후 계대배양될 수 없다.
도 2. FACS 분석. 마트리겔의 부재하에서 그러나 ROCK 억제제의 존재하에서 마이크로캐리어 배양시 3주에 걸친 다분화성 마커 Oct4 및 mAb 84의 안정한 발현은 ROCK 억제제의 부재하에서 마커의 하향 조절을 나타낸다.
도 3. 마트리겔의 부재하에서 그러나 ROCK 억제제의 존재하에서 마이크로캐리어 배양시 9주에 걸친 다분화성 마커 Oct4, mAb 84 및 Tra-1-60의 안정한 발현을 나타내는 도표.
도 4. 마트리겔의 부재하에서 그러나 ROCK 억제제 Y-27632의 존재하에서 구체의 폴리라이신 피복된 도쇼 마이크로캐리어 위에서 hESC를 6주 연속 계대배양한 결과를 나타내는 도표 및 FACS 분석. ROCK 억제제의 부재하에서, hESC는 2주 후 계대배양될 수 없다.
도 5. 마트리겔의 부재하에서 그러나 ROCK 억제제 Y-27632의 존재하에서 셀룰로즈 DE53, 도쇼, Cytodex 1 및 Cytodex 3 마이크로캐리어 위에서 hESC를 5주 연속 계대배양한 결과를 나타내는 도표.
도 6. 마트리겔의 부재하에서 그러나 ROCK 억제제 Y-27632의 존재하에서 셀룰로즈 DE53, 도쇼, Cytodex 1 및 Cytodex 3 마이크로캐리어 위에서 hESC의 현미경사진.
도 7. FACS 분석. 마트리겔의 부재하에서 그러나 ROCK 억제제 Y-27632의 존재하에서 5회 계대배양시 셀룰로즈, 도쇼, Cytodex 1 및 Cytodex 3 마이크로캐리어 위에서 배양된 hESC에 있어서 Oct4 및 mAb 84 발현.
도 8. 마트리겔의 부재하에서 그러나 ROCK 억제제 Y-27632의 존재하에서 셀룰로즈 마이크로캐리어 위에서 hESC의 주사 전자 현미경 사진(SEM).
도 9. 마트리겔의 부재하에서 그러나 ROCK 억제제 Y-27632의 존재하에서 hESC 셀룰로즈 마이크로캐리어의 SEM.
도 10. 8회 및 7회 각각의 계대배양에서 DE53 및 QA52 셀룰로즈 마이크로캐리어 위에서 배양된 hESC의 안정한 핵형.
도 11. 10회 및 5회 각각의 계대배양에서 구체의 도쇼 및 Cytodex 3 마이크로캐리어 위에서 배양된 hESC의 안정한 핵형.
도 12. 0회 및 1회 계대배양에서 마트리겔의 부재하에 셀룰로즈 마이크로캐리어 위에서 hESC의 성장을 지지하는 억제제 HA1077 및 아우로티오글루코즈를 나타내는 도표.
도 13. FACS 분석. 0회 계대배양에서 억제제 HA1077 및 아우로티오글루코즈와의 hESC 배양의 다분화성 마커 Oct4 및 mAb 84의 안정한 발현.
도 14. FACS 분석. 1회 계대배양에서 억제제 HA1077 및 아우로티오글루코즈와의 hESC 배양의 다분화성 마커 Oct4 및 mAb 84의 FACS의 안정한 발현.
도 15. 대안의 ROCK 억제제의 존재하에서 마이크로캐리어 위에서 hESC의 합치성 배양의 현미경사진.
도 16. ROCK 억제제 Y-27632이 존재하에서 셀룰로즈 마이크로캐리어 위에서 장기간 hESC 배양의 효과를 나타내는 도표. ROCK 억제제의 부재하에서 Oct4 및 mAb 84의 하향 조절 및 ROCK 억제제의 존재하에서 9주에 걸친 Oct4 및 mAb 84의 안정한 발현.
도 17. ROCK 억제제(Y-27632)의 존재 및 부재하에서 셀룰로즈 DE53, 도쇼, Cytodex 1 및 Cytodex 3 마이크로캐리어 위에서 hESC 배양의 비교를 나타내는 도표.
도 18. 배아 줄기 세포에서 기본 세포-세포 상호작용을 조절하는 Rho-Rock-미오신 경로의 요약을 나타내는 도표. 점선은 세포 통합성 및 세포 재생 경로내에서 또는 이들 사이에서 잠재적인 기계적 작용을 나타낸다[참조: Harb et al. The Rho-Rock-Myosin Signaling Axis Determines Cell-Cell Integrity of Self-Renewing Pluripotent Stem Cells. PLoS ONE 3(8): e3001. doi:10:1371/journal.pone.0003001].
도 19. 0회 계대배양 내지 4회 계대배양시 아우로티오글루코즈의 첨가와 함께 매트리겔 피복된 셀룰로즈 DE53 마이크로캐리어 대 피복되지 않은 마이크로캐리어 위에서 hESC의 세포 밀도(백만개 세포/웰)를 나타내는 도표.
도 20. FACS 분석. 1, 3 및 4회의 계대배양시 아우로티오글루코즈와 함께 hESC 배양의 다분화성 마커 Oct4 및 mAb 84의 발현.
도 21. hESC 세포 확장의 지지시 파수딜, 하이드록시파수딜 및 아우로티오글루코즈의 9주 동안 매일 연속 첨가의 효과. (A) 대조군 DE53 마이크로캐리어와 유사한 세포 밀도로 hESC 세포 확장의 지지시 파수딜, 하이드록시파수딜 및 아우로티오글루코즈의 9주 동안의 매일 연속 첨가의 효과를 나타내는 도표. (B) 다분화성 마커 Tra-1-60의 발현이 90%의 대조군과 비교하여, 9주 후 파수딜 및 하이드록시파수딜의 경우 약 80%이고 아우로티오글루코즈의 경우 60%임을 나타내는 도표. (C) 다분화성 마커 Oct4가 55%의 대조군과 비교하여, 9주 후 파수딜 및 하이드록시파수딜의 경우 약 30 내지 40%이고 아우로티로글루코즈의 경우 50%임을 나타내는 도표.
도 22. 대조군 마이크로캐리어 대 하이드록시파수딜 처리된 마이크로캐리어 배양된 hESC에서 배아유사세포덩어리 형성 후 분화 마커에 대한 겔 전기영동의 결과를 나타내는 사진. 다분화성 유전자 Nanog 및 Oct4의 발현을 포함한다.
도 23. 파수딜 및 아우로티오글루코즈 처리된 마이크로캐리어 배양된 hESC에 있어서 배아유사세포덩어리 형성 후 분화 마커에 대한 겔 전기영동의 결과를 나타내는 사진. 다분화성 유전자 Nanog 및 Oct4의 발현을 포함한다.
도 24. (A) 파수딜, 하이드록시파수딜, 아우로티오글루코즈 및 Y27632 ROCK 억제제의 6주 동안(주당 1회 계대배양, P)의 단일 투여량 첨가(10μm)가 대조군 DE53 마이크로캐리어(5 백만/웰)와 유사한 세포 밀도까지 hESC 세포 확장을 지지할 수 있음을 나타내는 도표. (B) 다분화성 마커 Tra-1-60의 발현이 6주 후[P6 - 주당 1회 계대배양(P)] 파수딜 및 Y27632 ROCK 억제제의 경우 약 80%, 아우로글루코즈의 경우 70% 및 하이드록시파수딜의 사용시 50%임을 나타내는 도표.
도 25. 다분화성 마커 Oct4의 발현이 6 주 후 60%에서 파수딜 및 하이드록시파수딜, 아우로티오글루코즈 및 Y27632 ROCK 억제제의 경우 매우 유사함을 나타내는 도표.
도 26. ROCK 억제제 (Y-27632 (10μM))의 존재하에서 Cytodex 1 (5mg/웰, 1mg/ml) 및 DE53 (20mg/웰, 4mg/ml) 마이크로캐리어 위에서 배양한 hESC 세포주 HES-2(씨딩 밀도 0.8x105 세포/ml)로부터의 세포가 대조군(마트리겔) 배양과 비교하여 유사한 세포 농도를 가짐을 나타내는 도표.
도 27. ROCK 억제제 (Y-27632 (10μM))의 존재하에서 Cytodex 1 (5mg/웰, 1mg/ml) 및 DE53 (20mg/웰, 4mg/ml) 마이크로캐리어 위에서 배양한 hESC 세포주 HES-2(씨딩 밀도 0.8x105 세포/ml)로부터의 세포에서 다분화성 마커 발현(Tra-1-60)을 대조군(마트리겔 피복된 마이크로캐리어) 배양과 비교하였다. Tra-1-60의 발현이 (A) 5회 계대배양시 Cytodex 1 및 Y-27632 (10μM) 위에서 ~94%이고, (B) 5회 계대배양시 DE53 및 마트리겔이 ~88%이며, (C) 5회 계대배양시 DE53 및 Y-27632(10μm)이 ~92%임을 나타내는 FACS 분석.
도 28. 혈청이 없는 배지 mTeSR1 속에서 Y-27632 (10μM)의 존재하에 DE53 마이크로캐리어 위에서 배양된 사람 iPS 세포(IMR90)의 12회 계대배양에 걸친 세포 밀도를 나타내는 도표.
도 29. mTeSR1 배지 속에서 Y-27632 (10μM)의 존재하에 DE53 마이크로캐리어 위에서 배양된 사람 iPS 세포(IMR90)에 의한 12회 게대배양에 걸친 다분화성 마커 (A) Oct4 및 (B) Tra-1-60의 발현을 나타내는 도표.
도 30. mTeSR1 배지 속에서 Y-27632 (10μM)의 존재하에 DE53 마이크로캐리어 위에서 배양된 사람 iPS 세포(IMR90)에 있어서 (A) Oct4 및 (B) Tra-1-60의 12회 계대배양시 FACS 분석.
실시예
다음 실시예는 세포외 매트릭스를 사용하지 않지만, ROCK 억제제(Y-27632, HA1077 또는 파수딜, 및 아우로티오글루코즈)가 보충된 각종의 마이크로캐리어(DE53, QA52, 도쇼, Cytodex 1, Cytodex 3) 위에서 사람 배아 줄기 세포의 안정하고, 장기간의 번식의 증거를 제공한다. hESC는 5회 이상의 계대배양 후 자체의 성장, 최종 세포 밀도, 다분화성 마커 Oct4, mAb 84 및 TRA-1-60의 발현, 및 정상 핵형을 보유한다.
실시예 1 사람 배아 줄기 세포( hESC )
사람 배아 줄기 세포주, HES-2 (46 X, X), 및 HES-3 (46 X, X)를 제조업체(ES Cell International)로부터 입수한다. 세포를 2D 콜로니 배양으로부터 수득된 200x200 μm 세포 응괴의 현탁액으로서 또는 마이크로캐리어 배양으로부터 수득된 세포-마이크로캐리어 응집체로서 액체 질소 속에 동결시켜 저장한다.
실시예 2 세포 배양: 2D 콜로니 배양
hESC의 유지를 위해, 세포는 마트리겔-피복된 배양 접시[4℃에서 마트리겔(제조원: 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson)과 함께 밤새 항온처리하고, 냉 KO-DMEM 속에 희석시킨, 1:30 희석] 위에서 37℃/5% CO2에서 배양시킬 수 있다. 세포는 1ml의 배지가 들어있는 기관 배양 접시(OCD) 속에서 통상적으로 유지시킨다.
사용된 배지는 MEF 공급자로부터 조건화된 배지(CM), StemPro hESC 혈청이 없는 배지[제조원: 인비트로겐(Invitrogen)] 또는 mTeSR-1 혈청이 없는 배지[제조원: 셀 테크놀로지즈(Cell Technologies)]이다. 배지를 매일 교환한다. 정적 콜로니 배양을 콜라게나제(참조: Choo et al, 2004) 또는 trypLE Express(제조원: 인비트로겐)을 사용한 효소 처리 또는 StemPro EZPassage Stem Cell Passaging Tool(제조원: 인비트로겐)을 사용한 기계적 해리에 의해 매주 계대배양한다.
실시예 3 세포 배양 : 3D 마이크로캐리어 배양
분산된 2D 콜로니 배양으로부터 또는 액체 질소 저장(2D 콜로니 배양 또는 세포-마이크로캐리어 응집체로서 수득된 200 x 200 μm 조직)으로부터 직접 수득된 세포 현탁액을 마이크로캐리어 현탁액(4 mg/ml) 위에서 0.1 내지 0.3 x 106/ml의 농도로 씨딩한다.
일부 시험에서, 보다 균질성인 배양물을 보증하기 위하여, 세포 접종물을 마이크로캐리어 현탁액에 첨가하기 전에 100 및 500 μm 그물 체(mesh sieve)를 통해 스크리닝한다. 세포를 정적 조건하에서 비 부착 6개 웰 접시[제조원: 코닝(Corning)] 위에서 37℃/5% CO2로 배양하거나 100 또는 150 rpm[IKA 오비탈 진탕기(Orbital Shaker)]으로 교반한다. 사용된 배지는 MEF-CM 또는 정의된 배지이다. 배지는 매일 교환한다. 배양을 콜라게나제 또는 trypLE으로 효소 처리하거나 1:2 내지 1:10의 분할 비로 반복된 피펫팅에 의해 기계적 해리하면서 매주 계대배양한다. 마이크로캐리어 배양을 2D 콜로니 배양으로 교체하는 것은 배지 8ml가 들어있는 마트리겔 피복된 6cm의 조직 배양 페트리디쉬 위에 합치성 세포-마이크로겔 응집체를 두고 세포를 7일 동안 배양함으로써 수행한다.
실시예 4 스피너 배양
hESC는 실리콘처리된(Sigmacote, SL2 시그마-알드리히) 100 ml의 벨코 스피너 플라스크에 3 x 105 세포/ml의 밀도로 5 mg/ml의 마이크로캐리어에, 25ml의 최초 용적으로 37℃ 및 5% CO2로 조절된 항온처리기 내에서 교반하지 않고 씨딩한다.
반응기 용적은 새로이 조건화된 배지를 사용하여 50ml로 증가시키고 접종 후 30 rpm에서, 12시간 동안 교반한다. 소비된 배지의 80%를 매일 제거하고 새로이 조건화된 배지로 교체한다. 매일 시료를 세포 계수 및 대사물질 분석을 위해 취한다.
실시예 5 마트리겔의 부재 및 ROCK 억제제의 존재하에서 마이크로캐리어 위에서의 배양
물 질 및 방법
마이크로캐리어 위에서 hESC 배양을 위한 조건화된 배지의 제조
조건화된 배지는 본 발명자들의 공개된 프로토콜-문헌[참조: Choo et al., 2007 (Identification of proteins from feeder conditioned medium that support human embryonic stem cells. J. Biotechnol. 130, 320-328)]에 따라 제조하였다.
DE53 , QA52 , 도쇼 , Cytodex 1 및 Cytodex 3 마이크로캐리어 위에서 hESC의 씨딩
hESC를 피복되지 않은 마이크로캐리어 위에 씨딩하고 실시예 3의 프로토콜 및 문헌[참조: Oh et al., 2009 (Long term microcarrier suspension cultures of human embryonic stem cells, Stem Cell Research (2009)]의 프로토콜에 따라 매주 계대배양하였다.
ROCK 억제제의 제조
Y-27632 - 10mM 스톡의 경우: 물 1.48ml 속에 5mg을 용해한다.
HA1077(파수딜) - 10mM 스톡의 경우: 물 1.37ml 속에 5mg을 용해한다. 아우로티오글루코즈(AuTG) - 10mM 스톡의 경우: 물 1.28 ml 속에 5mg을 용해한다.
모든 화학물질은 칼바이오켐(Calbiochem)으로부터 구입하였다. 모든 억제제는 마이크로캐리어 위에서 hESC를 공급하기 전에 조건화된 배지 속에서 이들의 최종 작업 농도로 희석시켰다.
다분화성 마커의 FACS 특성화
특성화는 문헌[참조: Oh et al., 2009 (Long term microcarrier suspension cultures of human embryonic stem cells, Stem Cell Research (2009))]에 의해 본 발명자의 최근 논문에 따라 수행하였다.
요약하면, hESC 집단에서 세포외 항원 TRA-1-60 및 세포내 전사 인자, Oct-4의 발현 수준을 유동 세포측정법을 사용하여 면역형광성으로 평가한다. 세포를 트립신 또는 trypLE 발현을 사용하여 단일 세포 현탁액으로서 수거하고, 40 μm 체(BD)를 통해 여과하고, 고정시키며, 투과시키며[제조원: 칼태그 래보러토리즈(Caltag Laboratories)], TRA-1-60[1:50 희석, 제조원: 케미콘(Chemicon), MAB4360/4381] 및 Oct-4[1:20 희석, 산타 크루즈(Santa Cruz)]에 대한 1차 항체와 함께 항온처리한다.
이후에, 세포를 1% BSA/PBS로 세척하고, 암실에서 염소 α-마우스 항체 FITC-접합된(DAKO)의 1:500 희석을 사용하여 항온처리한다. 항온처리 후, 세포를 다시 세척하고 FACScan(Becton Dickinson FACS Calibur) 위에서 분석하기 위해 1% BSA/PBS 속에 재현탁시켰다. 모든 배양은 실온에서 15분 동안 수행한다.
핵형분석
hESC의 활성적으로 성장하는 배양물을 1ml의 KO-배지 속에 희석시킨 콜세미드 용액(colcemid solution)과 함께 37℃ C/5% CO2로 15 내지 16시간 동안 항온처리한 후 중기상에서 정지시킨다. 세포유전학 분석을 KK 여성 및 어린이 병원(Women's and Children's Hospital, 싱가포르 소재)에 위탁한다.
SEM
주사 전자 현미경 사진을 기관[인슈티튜트 오브 몰레큘러 셀 바이올러지(Institute of Molecular Cell Biology), 싱가포르 소재]의 SEM 단위에서 수행하였다.
결과
다음 논의에서, 마트리겔이 없는 마이크로캐리어 위에서 hESC의 배양은 다음 제목하에 나타낸다:-
1. ROCK 억제제 Y-27632의 존재하에서 9주 동안 셀룰로즈 DE53 마이크로캐리어 위에서 hESC의 장기간 배양.
2. ROCK 억제제 Y-27632의 존재하에서 6주 동안 구체의 도쇼 마이크로캐리어 위에서 hESC의 장기간 배양.
3. ROCK 억제제 Y-27632의 존재하에서 5주 동안 셀룰로즈 DE53, 도쇼, Cytodex 1 및 Cytodex 3 마이크로캐리어 위에서 hESC의 장기간 배양의 비교.
4. ROCK 억제제 Y-27632의 존재하에서 셀룰로즈 DE53 위에서 hESC의 주사 전자 현미경사진.
5. ROCK 억제제 Y-27632이 존재하에서 5 내지 10주 사이의 셀룰로즈 DE53, QA52, 도쇼 및 Cytodex 3 마이크로캐리어 위에서 hESC의 핵형.
6. 대안의 ROCK 억제제, HA1077(파수딜) 및 아우로티오글루코즈의 존재하에서 2주 동안 셀룰로즈 DE53 마이크로캐리어 위에서 hESC의 배양.
ROCK 억제제 Y-27632의 존재하에서 9주 동안 셀룰로즈 DE53 마이크로캐리어 위에서 hESC의 장기간 배양
도 1은, hESC를 10μM에서 보충된 ROCK 억제제 Y-27632의 존재하에서 셀룰로즈 DE53 마이크로캐리어 위에서 9주 동안 연속적으로 계대배양할 수 있음을 나타낸다. 달성된 세포 밀도는 6개 웰 플레이트(각각의 웰 용적은 4ml이다) 속에서 3 내지 7.5 백만/웰로 변한다. 그러나, ROCK 억제제 Y-27632의 부재하에서, 세포 수는 급격하게 줄며 4주를 초과하여 계대배양될 수 없다. hESC는 마이크로캐리어 주변에서 합치성 응집체를 형성한다. 도 2는 마트리겔의 부재하에서 그러나 ROCK 억제제의 존재하에서 마이크로캐리어 배양물 속에서 3주에 걸쳐 다분화성 마커 Oct4 및 mAb 84의 안정한 발현을 나타내나 ROCK 억제제의 부재하에서 마커의 현저한 하향 조절을 나타낸다. 9주째까지, 다분화성 마커 Oct4, mAb 84 및 Tra-1-60의 발현은 마트리겔의 부재하에서 그러나 ROCK 억제제 Y-27632의 존재하에서 마이크로캐리어 배양물 속에 여전히 풍부하다(도 3).
ROCK 억제제 Y-27632의 존재하에서 6주 동안 구체의 도쇼 마이크로캐리어 위에서 hESC의 장기간 배양
도 4는 마트리겔의 부재하에서 그러나 Rock 억제제 Y-27632이 보충되고 폴리라이신을 사용하여 양성으로 하전시킨 구체의 도쇼 65 마이크론 마이크로캐리어 위에서 hESC의 6주 연속 계대배양을 나타낸다. 세포 수는 3 내지 5백만/웰의 범위이다. 다분화성 마커 Oct4, 및 Tra-1-60은 계대배양 4에서 강력하게 발현되다. 그러나, ROCK 억제제 Y-27632의 부재하에서, 2회 계대배양시 급격하게 떨어진 세포 수 및 남아있는 세포 종류는 다분화성 마커 Tra-1-60의 상당한 하향 조절을 나타낸다.
ROCK 억제제 Y-27632의 존재하에서 5주 동안 셀룰로즈 DE53 , 도쇼, Cytodex 1 및 Cytodex 3 마이크로캐리어의 장기간 배양의 비교
도 5는 마트리겔의 부재하에서 그러나 Rock 억제제 Y-27632의 존재하에서 셀룰로즈, 도쇼, Cytodex 1 및 Cytodex 3 마이크로캐리어 위에서 5주 연속 계대배양하는 hESC를 나타낸다. 특히, Cytodex 1 및 Cytodex 3 마이크로캐리어 위에서 달성된 세포 수는 5 내지 7백만/웰의 범위보다 높은 것으로 나타나나, 셀룰로즈 및 도쇼 마이크로캐리어는 5회 계대배양에서 4백만/웰을 달성하였다. 마트리겔의 부재하에서 그러나 Rock 억제제 Y-27632의 존재하에서 셀룰로즈, 도쇼, Cytodex 1 및 Cytodex 3 마이크로캐리어 위의 hESC의 사진을 나타낸다(도 6). hESC 무리는 모든 이들 마이크로캐리어 배양에서 합치성을 나타낸다. 도 7은, 마트리겔의 부재하에 그러나 Rock 억제제 Y-27632의 존재하에서 5회 계대배양시 Cytodex 1, Cytodex 3, 셀룰로즈 및 도쇼 마이크로캐리어 위에서 배양된 다분화성 마커 Oct4 및 mAb 84의 풍부한 발현이 존재함을 나타낸다.
ROCK 억제제 Y-27632의 존재하에서 셀룰로즈 DE53 위에서 hESC의 주사 전자 현미경사진
도 8은 마트리겔의 부재하에서 그러나 Rock 억제제 Y-27632의 존재하에서 셀룰로즈 마이크로캐리어 위에서 hESC의 주사 전자 현미경사진(SEM)을 나타낸다. hESC는 셀룰로즈 마이크로캐리어를 둘러싼 세포의 단단하고 합치성인 응집체를 형성한다. 도 9는 마트리겔의 부재하에서 그러나 Rock 억제제 Y-27632의 존재하에서 셀룰로즈 마이크로캐리어 위에서 hESC의 SEM의 제2 예를 나타낸다.
ROCK 억제제 Y-27632의 존재하에서 5 내지 10주 사이에 셀룰로즈 DE53 , QA52 , 도쇼, 및 Cytodex 3 마이크로캐리어 위에서 hESC의 핵형
도 10은 DE53 및 QA52 셀룰로즈 마이크로캐리어 위에서 배양된 hESC가 8회 및 7회 계대배양 각각에서 안정한 핵형을 유지함을 나타낸다. 유사하게, 도 11은 10회 및 5회 계대배양 각각에서 구체의, 폴리라이신 피복된 도쇼 및 Cytodex 3 마이크로캐리어 위에서 배양된 hESC의 안정한 핵형을 나타낸다.
대안의 ROCK 억제제, HA1077(파수딜) 및 아우로티오 글루코즈의 존재하에서 2주 동안 셀룰로즈 DE53 마이크로캐리어 위에서 hESC의 배양
다음을 포함하는 다른 유형의 Rock 억제제를 평가하였다:
1. HA1077(파수딜): ROCK 억제제
2. 아우로티오글루코즈: NF-κB 억제제
3. LY 294002: P13K 억제제
4. 하이드록시파수딜: ROCK 억제제
5. Rho 키나제 억제제 I: ROCK 억제제
6. Rho 키나제 억제제 II: ROCK 억제제
사용된 대조군은 마트리겔이 피복된 DE53 마이크로캐리어이었다. 피복되지 않은 DE53 속에서 스파이크된 0.02μl의 DMSO를 포함하는 블랭크를 또한 사용하였다.
억제제 HA1077(10 및 40 μm에서 보충됨) 및 아우로티오글루코즈(10 μm에서)는 0 및 1회의 계대배양에서 마트리겔의 부재하에 셀룰로즈 마이크로캐리어 위에서 hESC의 풍부한 성장을 지지한다(도 12). 세포 수는 1회 계대배양시 8백만/웰을 달성하는 마트리겔 피복을 갖는 대조군 배양과 동일한 6 내지 9백만/웰 사이에 이른다. 도 13 및 도 14는 마트리겔 피복을 갖는 대조군과 비교하여 0회 및 1회 계대배양시 억제제 HA1077 및 아우로티오글루코즈의 존재하에서 hESC 배양의 다분화성 마커 Oct4 및 mAb 84의 안정한 발현을 나타낸다. 최종적으로, 도 15는 대안의 ROCK 억제제, 아우로티오글루코즈 및 HA1077(파수딜)의 존재하에 마이크로캐리어 위에서 hESC의 합치성 배양의 사진을 나타낸다.
지금까지, 본 발명자들은 다분화성 Oct4 및 mAb84의 지속된 강력한 발현과 함께, 4회 계대배양을 통해 아우로티오글루코즈의 존재하에서 hESC를 성공적으로 계대배양하였다(참조: 도 19 및 20).
당해 데이타는, 모두 피복되지 않은, 5개 유형의 마이크로캐리어: 셀룰로즈 DE53, QA52, 도쇼, Cytodex 1 및 Cytodex 3이 ROCK 억제제 Y-27632의 존재하에서 장기간 배양시 hESC를 지지할 수 있음을 입증한다. HA1077(파수딜) 및 아우로티오글루코즈와 같은 다른 억제제도 또한 마트리겔의 부재하에서 hESC 배양을 지지할 수 있다.
실시예 6
ROCK 억제제(10μm에서)의 범위를 매트릭스가 없는 셀룰로즈 DE53 마이크로캐리어 위에서 hESC (HES-2) 세포 배양을 허용하는 이들의 능력에 대해 시험하였다. 이들은 파수딜, 하이드록시파수딜 및 아우로티오글루코즈를 포함하였으며, 대조군(마트리겔이 피복된 DE53 마이크로캐리어)와 비교하였다.
ROCK 억제제의 연속 첨가를 9주에 걸쳐(주당 1회 계대배양) 시험하고, 결과를 도 21(A-C)에 나타내었다. 9주 동안 파수딜, 하이드록시파수딜 및 아우로티오글루코즈의 매일 연속 첨가는 대조군 DE53 마이크로캐리어와 유사한 세포 밀도로 hESC 세포 확장을 지지할 수 있다(도 21a). 다분화성 마커 Tra-1-60의 발현은 90%의 대조군과 비교하여, 9주 후 파수딜 및 하이드록시파수딜의 경우 약 80%이었고 아우로티오글루코즈의 경우 60%였다(도 21b). 다분화성 마커 Oct4의 발현은 55%의 대조군과 비교하여, 9주 후 파수딜 및 하이드록시파수딜의 경우 약 30 내지 40%이었고 아우로티오글루코즈의 경우 50%이었다(도 21c).
파수딜, 하이드록시파수딜, 아우로티오글루코즈 및 Y27632의 6주 동안의 단일 투여량 첨가는 대조군 DE53 마이크로캐리어(5백만/웰)와 유사한 세포 밀도로 hESC(HES-2) 세포 확장을 지지할 수 있었다(도 24a). 다분화성 마커 Tra-1-60의 발현은 6주 후 파수딜 및 Y27632의 경우 약 80%, 아우로티오글로코즈의 경우 70% 및 하이드록시파수딜의 경우 50%이었다(도 24b). 다분화성 마커 Oct4의 발현은 파수딜 및 하이드록시파수딜, 아우로티오글루코즈 및 Y27632 ROCK 억제제의 경우 6주 후 60%로 매우 유사하였다(도 25).
실시예 7 마이크로캐리어 위에서 ROCK 억제제의 존재하에서 iPS 세포의 배양
Y-27632(10μM)의 존재하에서 Cytodex 1 및 DE53 마이크로캐리어 위에서 배양된 HES-2 세포는 대조군 배양(마트리겔 속에 피복된 Cytodex 1 또는 DE53)으로서 유사한 세포 농도 및 다분화성 마커 발현(Tra-1-60)을 나타내었다(도 26 및 도 27).
실시예 8 마이크로캐리어 위에서 ROCK 억제제의 존재하에 iPS 세포의 배양
iPS IMR90 세포(1.6x105개 세포/ml)를 20mg의 피복되지 않은 DE53, 5ml의 혈청이 없는 배지 mTeSR1, 4μl의 ROCK 억제제(Y27632)[10μM]의 존재하에서 6-웰 플레이트의 웰 속에서 배양하였다. 80% 배지 교체 및 억제제의 첨가를 매일 수행하였다.
세포 밀도는 12회 계대배양에 걸쳐 안정하였다(도 28). Oct4 및 Tra-1-60 발현은 12회 계대배양에 걸쳐 안정하였다(도 29 및 도 30).
실시예 9 ROCK 억제제가 마트리겔의 부재하에서 hESC 및 hiPS 마이크로캐리어 배양을 유지하는 방법은?
본 발명자들은, 2개의 hESC(HES2 및 HES3) 및 2개의 사람 iPS(IMR90 및 포피) 세포주가 각종의 마이크로캐리어(DE53, Cytodex 및 도쇼) 위에서 마트리겔의 부재하에 10주 이상 동안 유지되면서 이들의 다분화능을 유지할 수 있음을 입증하였다.
ROCK 억제제의 존재하에서 hESC의 장기간 배양의 이러한 일반적이지 않은 현상을 시험하는 동안, 본 발명자들은 마트리겔의 부재하에서의 ROCK 억제제 마이크로캐리어 배양 대 마트리겔의 존재하에서 마이크로캐리어 배양 및 마트리겔 존재하에서 통상적인 단층 배양의 미세배열 연구에 의해 유전자 발현을 비교하고, 141개 유전자의 일반적인 세트가 ROCK 억제제를 사용한 처리시 2-배 이상 차등적으로 상향- 또는 하향-조절되었음을 밝혀냈다(데이타를 도시화하지 않음).
판터 데이타베이스(Panther database)(http://www.pantherdb.org/)에서 162개 경로에 있어 경로-기준 분석은, 차등적으로 발현된 유전자가 강화된 5개의 관련 경로를 나타내었다. 이들 경로내에서, 인테그린/콜라겐 합성, FOX 전사 인자 및 TGF-베타 유전자와 관련된 수개의 유전자가 상향조절된 반면, 다수의 카드헤린 유전자는 하향-조절되었다.
참조 문헌:
- Chin, A.C.P., Fong, W.J., Goh, L.T., Philp, R., Oh, S.K., Choo, A.B., 2007. Identification of proteins from feeder conditioned medium that support human embryonic stem cells. J. Biotechnol. 130, 320-328;
- Oh, SKW, Chen AK, Mok Y, Chen X, Lim UM, Chin A, Choo ABH, and Reuveny S. Long-term microcarrier suspension cultures of human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 2: 219-230. 2009.
본 원에서 언급된 특허출원 및 특허의 각각 및, 특허출원 및 특허("특허출원 인용 서류")의 각각의 진행 과정에서 뿐만 아니라, 상기 특허출원 및 특허 각각에서 인용되거나 참조된 각각의 서류 및, 특허출원 및 특허 각각 및 특정의 특허츨원 인용된 서류에서 인용되거나 언급된 특정 제품에 대한 특정 제조업자의 지시사항 또는 카탈로그는 본원에 의해 참조로 본원에 혼입된다. 또한, 본 내용에서 인용된 모든 서류 및 본 내용에서 인용된 서류내에서 인용되거나 언급된 모든 서류, 및 본 내용에서 인용되거나 언급된 특정 제품에 대한 특정 제조업자의 지시사항 또는 카탈로그는 본원에 의해 참조로 본원에 혼입된다.
본 발명의 기술된 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변화는 본 발명의 영역 및 취지에 벗어남이 없이 당해 분야의 숙련가에게 자명할 것이다. 비록 본 발명이 특정의 바람직한 양태와 관련하여 기술되어 있다고 해도, 청구된 발명은 이러한 특정 양태에 과도하게 한정되지 않아야 하며, 이에 대한 많은 변형 및 첨가가 본 발명의 영역내에서 이루어질 수 있음을 이해하여야 한다. 실제로, 분자 생물학 또는 관련 분야에서 숙련가에게 명백한 본 발명을 수행하기 위한 기술된 방식의 각종 변형은 특허청구범위의 영역내에 있는 것으로 의도된다. 또한, 다음 종속항들의 특징의 각종 조합도 본 발명의 영역으로부터 벗어남이 없이 독립항의 특징과 함께 이루어질 수 있다.

Claims (48)

  1. (i) 다분화성 또는 다능성 세포를 다수의 마이크로캐리어에 부착하여 마이크로캐리어-세포 복합체를 형성시키는 단계, 및
    (ii) 마이크로캐리어-세포 복합체를 ROCK 억제제의 존재하에서 현탁 배양으로 배양하는 단계를 포함하는, 시험관내에서 다분화성 또는 다능성 세포를 배양하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, ROCK 억제제가 Y-27632, HA-1077(파수딜), HA-1100(하이드록시파수딜), H-1152, 3-(4-피리딜)-1H-인돌, N-(4-피리딜)-N'-(2,4,6-트리클로로페닐)우레아, 아우로티오글루코즈, LY294002 또는 이의 염, 염기, 에스테르 또는 전구약물로부터 선택되는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 (ii)로부터 배양된 세포를 계대배양함을 추가로 포함하며, 여기서, 계대배양 후 세포는 다분화성 또는 다능성인 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    (iii) 단계 (ii)로부터의 배양된 세포를 계대배양하는 단계; 및
    (iv) 적어도 2회의 계대배양을 통해 단계 (i) 내지 (iii)을 반복하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서, 단계 (iv) 후 배양물내 세포가 다분화성 또는 다능성인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 마이크로캐리어가 매트릭스 피복을 갖지 않는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 마이크로캐리어의 표면이 매트릭스 속에 피복되는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 매트릭스가 세포외 매트릭스 성분을 포함하는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 매트릭스가 MatrigelTM(제조원: 비디 바이오사이언시스), 하이알루론산, 라미닌, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 콜라겐, 엘라스틴, 헤파란 설페이트, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 콘드로이틴 설페이트 중의 하나 이상을 포함하는 방법.
  9. 제6항에 있어서, 매트릭스가 라미닌, 콜라겐 I, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 및 엔탁틴 1의 혼합물을 포함하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포가 줄기 세포인 방법.
  11. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포가 배아 줄기 세포인 방법.
  12. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포가 유도된 다분화성 줄기 세포인 방법.
  13. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포가 성인 줄기 세포인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포가 포유동물, 영장류 또는 사람 세포인 방법.
  15. 제4항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 (iv)에서, 단계 (i) 내지 (iii)이 적어도 3회 계대배양, 적어도 4회 계대배양, 적어도 5회 계대배양, 적어도 6회 계대배양, 적어도 7회 계대배양, 적어도 8회 계대배양, 적어도 9회 계대배양, 적어도 10회 계대배양, 적어도 11회 계대배양, 적어도 12회 계대배양, 적어도 13회 계대배양, 적어도 14회 계대배양, 적어도 15회 계대배양, 적어도 16회 계대배양, 적어도 17회 계대배양, 적어도 18회 계대배양, 적어도 19회 계대배양, 적어도 20회 계대배양, 적어도 21회 계대배양, 적어도 22회 계대배양, 적어도 23회 계대배양, 적어도 24회 계대배양, 적어도 25회 계대배양, 적어도 30회 계대배양, 적어도 40회 계대배양, 적어도 50회 계대배양, 적어도 60회 계대배양, 적어도 70회 계대배양, 적어도 80회 계대배양, 적어도 90회 계대배양, 적어도 100회 계대배양 중의 하나를 통해 반복되는 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 있어서, 마이크로캐리어가 셀룰로즈, 덱스트란, 하이드록실화된 메타크릴레이트, 콜라겐, 젤라틴, 폴리스티렌, 가소제, 유리, 세라믹 및 실리콘 중 하나 이상을 포함하거나 이들로 이루어지는 방법.
  17. 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 있어서, 마이크로캐리어가 거대다공성(macroporous) 또는 미세다공성(microporous) 카보씨드(carboseed) 마이크로캐리어인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, 마이크로캐리어가 프로타민 또는 폴리라이신과 커플링되는 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 있어서, 마이크로캐리어가 양성으로 하전되는 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중의 어느 한 항에 있어서, 마이크로캐리어가 양성 표면 전하를 갖는 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중의 어느 한 항에 있어서, 마이크로캐리어가 친수성인 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, 마이크로캐리어가 막대-형인 방법.
  23. 제1항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, 마이크로캐리어가 실질적으로 구형을 갖는 방법.
  24. 제1항 내지 제24항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii)에서 세포를 충분한 시간 동안 배양하여 배양물 속의 세포의 수를 확장시키는 방법.
  25. 제4항 내지 제24항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 (iv) 후에 배양물 중 세포의 적어도 60%가 다분화성 또는 다능성인 방법.
  26. 제4항 내지 제25 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 (iv) 후에 배양물 중 세포의 적어도 60%가 Oct4, SSEA4, TRA-1-60 및 Mab84 중 1개, 2개, 3개 또는 모두를 발현하는 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포를 혈청이 없는 배지, 또는 줄기 세포 조건화된 배지, 또는 공급자 세포가 없는 조건하에서 배양함을 포함하는 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중의 어느 한 항에 있어서, 공급자 세포가 또한 마이크로캐리어에 부착되는 방법.
  29. 제1항 내지 제27항 중의 어느 한 항에 있어서, 배양이, 다분화성 또는 다능성 세포가 부착된 마이크로캐리어와는 상이한 마이크로캐리어에 부착된 공급자 세포를 추가로 포함하는 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중의 어느 한 항에 있어서, 배양으로부터 수득된 다분화성 또는 다능성 세포의 분화를 유도하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 방법은 마이크로캐리어-세포 복합체를 세포의 분화를 유도하는 조건하에 위치시킴을 포함하는 방법.
  32. 제1항 내지 제30항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 마이크로캐리어로부터 배양 방법으로부터 수득한 다분화성 또는 다능성 세포를 분리하는 단계 및 세포의 분화를 유도하는 조건하에서 비-마이크로캐리어 배양시 분리된 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
  33. 제1항 내지 제29항 중의 어느 한 항에 있어서,
    (a) 배양 방법으로부터 수득한 다분화성 또는 다능성 세포를 다수의 제2 마이크로캐리어에 부착시켜 마이크로캐리어-세포 복합체를 형성시키는 단계,
    (b) 단계 (a)로부터의 마이크로캐리어-세포 복합체를 세포의 분화를 유도하는 조건하에서 현탁 배양으로 배양하는 단계를 포함하는, 배양 방법으로 수득한 다분화성 또는 다능성 세포의 시험관내 분화를 추가로 포함하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 방법은
    (c) 단계 (b)로부터 수득한 분화된 세포를 다수의 제3의 마이크로캐리어에 부착시켜 마이크로캐리어-세포 복합체를 형성시키는 단계; 및
    (d) 단계 (c)로부터 마이크로캐리어-세포 복합체를 이미 분화된 세포의 추가의 분화를 유도하는 조건하에서 현탁 배양으로 배양하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  35. 제30항 내지 제34항 중의 어느 한 항에 있어서, 분화를 위한 배양 조건이 세포를 ROCK 억제제의 존재하에서 배양함을 포함하는 방법.
  36. 제30항 내지 제34항 중의 어느 한 항에 있어서, 분화를 위한 배양 조건이 ROCK 억제제의 부재하에서 세포를 배양함을 포함하는 방법.
  37. 제1항 내지 제29항 중의 어느 한 항에 따른 방법으로 수득된 다분화성 또는 다능성 세포(들).
  38. 제30항 내지 제36항 중의 어느 한 항에 따른 방법으로 수득된 분화된 세포(들).
  39. 제30항 내지 제36항 중의 어느 한 항에 있어서, 분화된 세포를 배양하여 배아유사세포덩어리(embryoid body)를 형성시키는 방법.
  40. 제39항에 따른 방법으로 수득된 배아유사세포덩어리.
  41. 다분화성 또는 다능성 세포를, 표면이 피복되지 않거나 매트릭스 속에 피복된, 다수의 마이크로캐리어에 부착시켜 마이크로캐리어-세포 복합체를 형성시키는 단계, 및 마이크로캐리어-세포 복합체를 ROCK 억제제의 존재하에서 및 세포의 분화를 유도하는 조건하에 현탁 배양으로 배양하는 단계를 포함하는, 시험관내에서 다분화성 또는 다능성 세포를 분화시키는 방법.
  42. 세포를 다수의 마이크로캐리어에 부착시킴으로써 마이크로캐리어-세포 복합체를 형성시키고 현탁 배양 배지가 ROCK 억제제를 함유하는, 다분화성 또는 다능성 세포의 현탁 배양물.
  43. 제42항에 있어서, ROCK 억제제가 적어도 1μM의 농도로 배양 배지 속에 존재하는 현탁 배양물.
  44. 제42항에 있어서, ROCK 억제제가 배양 배지 속에 적어도 10μM의 농도로 존재하는 현탁 배양물.
  45. 제42항 내지 제44항 중의 어느 한 항에 있어서, ROCK 억제제가 Y-27632, HA-1077(파수딜), HA-1100(하이드록시파수딜), H-1152, 3-(4-피리딜)-1H-인돌, N-(4-피리딜)-N'-(2,4,6-트리클로로페닐) 우레아, 아우로티오글루코즈, LY294002 또는 이의 염, 염기, 에스테르 또는 전구약물 중에서 선택되는 현탁 배양물.
  46. 세포가 마이크로캐리어-세포 복합체의 형태인, 다분화성 또는 다능성 세포의 시험관내 현탁 배양시 ROCK 억제제의 용도.
  47. 세포가 마이크로캐리어-세포 복합체의 형태인, 시험관내 현탁 배양시 다분화성 또는 다능성 세포의 분화에 있어서 ROCK 억제제의 용도.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서, ROCK 억제제가 Y-27632, HA-1077(파수딜), HA-1100(하이드록시파수딜), H-1152, 3-(4-피리딜)-1H-인돌, N-(4-피리딜)-N'-(2,4,6-트리클로로페닐) 우레아, 아우로티오글루코즈, LY294002 또는 이의 염, 염기, 에스테르 또는 전구약물로부터 선택되는 용도.
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150050962A (ko) * 2013-11-01 2015-05-11 건국대학교 산학협력단 하이브리드 줄기세포 및 전능성 줄기세포의 생존율을 높이는 방법
WO2020080561A1 (ko) * 2018-10-15 2020-04-23 (주)메디톡스 만능성 줄기세포 배양용 배지 및 그를 이용한 배양 방법
KR102120378B1 (ko) * 2019-07-04 2020-06-08 연세대학교 산학협력단 암 오가노이드의 제조 방법 및 이의 용도
KR20210102041A (ko) * 2020-02-10 2021-08-19 주식회사 마이크로바이오틱스 모낭조직 배양액을 포함하는 탈모의 예방 또는 치료용 조성물

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0222846D0 (en) * 2002-10-03 2002-11-06 Choo Yen Cell culture
US9458431B2 (en) * 2008-03-17 2016-10-04 Agency For Science, Technology And Research Microcarriers for stem cell culture
US8895300B2 (en) 2008-11-04 2014-11-25 Viacyte, Inc. Scalable primate pluripotent stem cell aggregate suspension culture and differentiation thereof
JP5902092B2 (ja) 2009-10-19 2016-04-13 セルラー ダイナミクス インターナショナル， インコーポレイテッド 心筋細胞の生成
TWI419970B (zh) * 2010-11-11 2013-12-21 Univ Nat Taiwan 使成體幹細胞產生為一球體細胞群體的方法
WO2012104087A2 (en) * 2011-02-02 2012-08-09 Cellmade Sas Cell culture device
US20140106448A1 (en) * 2011-04-29 2014-04-17 Tissuetech, Inc. Methods of isolating cells
US20130064799A1 (en) * 2011-06-01 2013-03-14 Tariq M. Rana Methods for promoting cell reprogramming
US8940294B2 (en) 2012-03-02 2015-01-27 Tissuetech, Inc. Methods of isolating and culturing stem cells
MY171710A (en) * 2012-07-24 2019-10-24 Nissan Chemical Ind Ltd Culture medium composition, and method for culturing cell or tissue using said composition
AU2013248265B2 (en) * 2012-11-08 2018-11-01 Viacyte, Inc. Scalable primate pluripotent stem cell aggregate suspension culture and differentiation thereof
CN103031270A (zh) * 2013-01-05 2013-04-10 绍兴文理学院 胆管上皮细胞的高效扩增和培养方法
US9822336B2 (en) 2013-04-16 2017-11-21 Universiteit Maastricht Blastoid, cell line based artificial blastocyst
CN103305453A (zh) * 2013-05-23 2013-09-18 侯亚义 一种脐带间充质干细胞的微载体培养系统
WO2015008275A1 (en) * 2013-07-17 2015-01-22 Kadimastem Ltd Methods for large scale generation of stem cells
WO2015156586A1 (ko) * 2014-04-07 2015-10-15 한양대학교 산학협력단 적혈구계 세포의 인 비트로 확장
WO2015195780A1 (en) * 2014-06-17 2015-12-23 Lieber Institute For Brain Development Assay for cell specification in self-renewing human pluripotent stem cells
FR3032202B1 (fr) 2015-02-03 2018-12-07 Maco Pharma Matrice sous forme de bille comme support cellulaire
EP3263697B1 (en) * 2015-02-27 2021-03-31 Rohto Pharmaceutical Co., Ltd. Culture medium for culturing mesenchymal stem cell, method for culturing mesenchymal stem cell, and mesenchymal stem cell
EP3438248A4 (en) * 2016-03-30 2019-11-06 Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. CULTURAL MEDIUM OF NATIVE PLURIPOTENT STEM CELLS AND METHOD FOR CULTURING PLURIPOTENT STEM CELLS
CN106282094B (zh) * 2016-10-13 2018-11-27 吴欣怡 人皮肤来源的前体细胞诱导分化为角膜内皮样细胞的方法
FR3059009B1 (fr) * 2016-11-23 2018-12-07 Universite de Bordeaux Microcompartiment cellulaire et procedes de preparation
CN110452869A (zh) * 2016-11-26 2019-11-15 中国科学院大连化学物理研究所 一种高通量形成拟胚体的微阵列芯片的制备方法与应用
US20200283726A1 (en) * 2017-11-21 2020-09-10 Georgetown University Process for continuous cell culture of gpscs
SG11202104197PA (en) * 2018-10-24 2021-05-28 Hebecell Corp Methods and systems for manufacturing hematopoietic lineage cells
AU2020373099A1 (en) * 2019-10-30 2022-05-19 The General Hospital Corporation High-throughput culture of iPSC-derived alveolar cells
KR102458606B1 (ko) * 2020-03-06 2022-10-25 경희대학교 산학협력단 마이크로캐리어 기반 4차원 세포 배양기 및 이를 이용한 세포배양 모니터링 방법
CA3190791A1 (en) * 2020-08-10 2022-02-17 Lineage Cell Therapeutics, Inc. Compositions and methods for embryonic stem cell expansion
CN112843338B (zh) * 2021-02-08 2022-05-20 康膝生物医疗(深圳)有限公司 一种制备含胶原蛋白的间充质干细胞注射剂的方法
CN113201488A (zh) * 2021-05-13 2021-08-03 圣美基因科技(北京)有限公司 一种间充质干细胞大规模培养方法
CN113388582A (zh) * 2021-06-21 2021-09-14 香港再生医学有限公司 促使iPSC分化为外周神经干细胞的方法及培养基和系统
WO2023123299A1 (en) * 2021-12-31 2023-07-06 Beijing Theraxyte Bioscience Co., Ltd. Compositions and methods for culturing stem cells
CN115747197B (zh) * 2023-01-06 2023-04-21 中国肉类食品综合研究中心 可食用3d打印生物墨水及制备方法和在培育肉中的应用

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5858747A (en) 1994-07-20 1999-01-12 Cytotherapeutics, Inc. Control of cell growth in a bioartificial organ with extracellular matrix coated microcarriers
DK1007631T4 (da) 1997-07-14 2009-04-27 Osiris Therapeutics Inc Hjertemuskelregeneration ved anvendelse af mesenkymale stamceller
EP1448053A4 (en) 2001-10-02 2005-03-09 Becton Dickinson Co PROLIFERATION AND DIFFERENTIATION OF STEM CELLS BY EXTRACELLULAR MATRIX AND OTHER MOLECULES
EP1649007A4 (en) 2003-07-17 2008-05-14 Gamida Cell Ltd PROCESS FOR THE EX-VIVO EXPANSION OF STEM / PROVIDER CELLS
US20080026460A1 (en) 2006-06-20 2008-01-31 Palecek Sean P Method for culturing stem cells
WO2005065354A2 (en) 2003-12-31 2005-07-21 The Burnham Institute Defined media for pluripotent stem cell culture
DE102004043256B4 (de) 2004-09-07 2013-09-19 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Skalierbarer Prozess zur Kultivierung undifferenzierter Stammzellen in Suspension
WO2006084040A2 (en) * 2005-02-04 2006-08-10 Massachusetts Institute Of Technology Engineering vascularized muscle tissue
WO2006091921A2 (en) 2005-02-25 2006-08-31 Drexel University Super-sparger microcarrier beads and precision extrusion deposited poly-epsilon-caprolactone structures for biological applications
US20070077649A1 (en) 2005-09-06 2007-04-05 Sammak Paul J Transplantable cell growth niche and related compositions and methods
GB2444686B (en) 2005-09-12 2010-08-25 Es Cell Int Pte Ltd Differentiation of pluripotent stem cells using p38 MAPK inhibitors or prostaglandins
GB2447191B (en) 2005-12-22 2011-08-03 Es Cell Int Pte Ltd Direct differentiation of cardiomyocytes from human embryonic stem cells
US20080009064A1 (en) 2006-07-06 2008-01-10 Vincent Ronfard Temperature-Responsive Microcarrier
GB2454386B (en) 2006-07-06 2011-07-06 Es Cell Int Pte Ltd Method for embryonic stem cell culture on a positively charged support surface
WO2008015682A2 (en) 2006-08-02 2008-02-07 Technion Research & Development Foundation Ltd. Methods of expanding embryonic stem cells in a suspension culture
JP2008099662A (ja) 2006-09-22 2008-05-01 Institute Of Physical & Chemical Research 幹細胞の培養方法
JP5419279B2 (ja) * 2007-01-17 2014-02-19 ウィスコンシン アラムニ リサーチ ファンデーション 改良された幹細胞の培養
DK2173863T3 (en) * 2007-06-29 2019-01-21 Fujifilm Cellular Dynamics Inc Automated method and apparatus for embryonic stem cell culture
US20110143433A1 (en) 2008-03-17 2011-06-16 Agency For Science, Technology And Research Microcarriers for Stem Cell Culture
JP2011514169A (ja) 2008-03-17 2011-05-06 エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ 幹細胞培養のためのマイクロキャリア
US8828720B2 (en) 2008-03-17 2014-09-09 Agency For Science, Technology And Research Microcarriers for stem cell culture
US8691569B2 (en) 2008-03-17 2014-04-08 Agency For Science, Technology And Research Microcarriers for stem cell culture
WO2009139703A1 (en) 2008-05-15 2009-11-19 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Method for cell expansion
CA2729121C (en) 2008-06-30 2019-04-09 Centocor Ortho Biotech Inc. Differentiation of pluripotent stem cells
CN107267442A (zh) 2008-11-20 2017-10-20 詹森生物科技公司 微载体上的多能干细胞培养

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150050962A (ko) * 2013-11-01 2015-05-11 건국대학교 산학협력단 하이브리드 줄기세포 및 전능성 줄기세포의 생존율을 높이는 방법
WO2020080561A1 (ko) * 2018-10-15 2020-04-23 (주)메디톡스 만능성 줄기세포 배양용 배지 및 그를 이용한 배양 방법
KR102120378B1 (ko) * 2019-07-04 2020-06-08 연세대학교 산학협력단 암 오가노이드의 제조 방법 및 이의 용도
KR20210102041A (ko) * 2020-02-10 2021-08-19 주식회사 마이크로바이오틱스 모낭조직 배양액을 포함하는 탈모의 예방 또는 치료용 조성물
WO2021162206A1 (ko) * 2020-02-10 2021-08-19 주식회사 마이크로바이오틱스 모낭조직 배양액을 포함하는 탈모의 예방 또는 치료용 조성물

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