CN116113693A - 用于胚胎干细胞扩增的组合物和方法 - Google Patents
用于胚胎干细胞扩增的组合物和方法 Download PDFInfo
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Abstract
本文提供了使用包括微载体的可悬浮的扩增复合物扩增人胚胎干的方法和组合物。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年8月10日提交的美国临时申请号63/063,942的权益，出于所有目的将其全部内容通过引用并入本文。
背景
人胚胎干细胞(hESC)具有自我更新的基本特性，这使它们成为无限的细胞来源，并使工业规模的细胞治疗计划成为可能。它们的多能发育潜力使它们成为大多数细胞治疗产品的细胞来源。
hESC临床应用的一个关键要求是提供大量hESC衍生的治疗性细胞。这些治疗性细胞的生产从在符合现行良好生产规范(cGMP)的情况下解冻合格细胞库(例如主细胞库(MCB)或工作细胞库(WCB))的细胞开始。细胞库的质量在hESC生物加工中起着重要作用，因为它影响解冻后hESC扩增、后续谱系特异性分化的效率和加工可重复性。
制造这样的细胞库是劳动密集型的，通常需要手动细胞操作，并且由于几种关键原材料例如饲养细胞、非重组基质、血清和其他的成分未完全确定的材料的使用，存在批次间变异。
概述
为了使此类细胞治疗计划成为现实，本文提供了用于产生GMP级hESC或人诱导多能干细胞(hiPSC)库的方法。
一方面，本公开内容提供了一种用于扩增和维持处于未分化、多能状态的人胚胎干细胞(hESC)的方法，该方法包括以下步骤：(a)在生长培养基中同时组合人胚胎干细胞、细胞外基质成分(ECM)和微载体以形成可悬浮的扩增复合物，和(b)将可悬浮的扩增复合物培养一段时间。
在一些实施方案中，微载体包含聚苯乙烯、交联葡聚糖、磁性颗粒、微芯片、纤维素、羟基化甲基丙烯酸酯、胶原蛋白、明胶、聚苯乙烯、塑料、玻璃、陶瓷、硅酮或其组合中的一种或多种。
在一些实施方案中，微载体是球形的、光滑的、大孔的、棒状的，或其组合。
在一些实施方案中，ECM包含基质胶、层粘连蛋白、玻连蛋白、胶原蛋白、它们的衍生物或其组合。在具体的实施方案中，ECM是人层粘连蛋白。在具体的实施方案中，人层粘连蛋白是人层粘连蛋白511E8片段。
在具体的实施方案中，微载体是未经包被的。
在一些实施方案中，微载体与鱼精蛋白或聚赖氨酸偶联。
在一些实施方案中，微载体是中性的或带负电的。在具体的实施方案中，微载体是中性的。在具体的实施方案中，微载体是带负电的。在具体的实施方案中，微载体是亲水的。
在一些实施方案中，将可悬浮的扩增复合物培养至少约一天。在一些实施方案中，将可悬浮的扩增复合物培养约一天至约十四天。
在一些实施方案中，收获可悬浮的扩增复合物的培养细胞并通过重复步骤(a)和(b)进一步扩增。
在一些实施方案中，收获可悬浮的扩增复合物的培养细胞并进一步分化。在一些实施方案中，可悬浮的扩增复合物的培养细胞通过改变生长培养基进一步分化。
在一些实施方案中，可悬浮的扩增复合物的培养细胞保持未分化和多能性。在一些实施方案中，未分化的细胞表达至少约80％的SSEA-5和TRA-1-60中的每一种。在一些实施方案中，未分化的细胞表达至少约70％的Oct-4和Nanog中的每一种。在一些实施方案中，未分化的细胞表达至少约80％的SSEA-5、至少约80％的TRA-1-60、至少约70％的Oct-4和至少约70％的Nanog。
另一方面，本公开内容提供了一种可悬浮的扩增复合物组合物，其包含人胚胎干细胞、细胞外基质成分(ECM)和微载体。
在一些实施方案中，组合物进一步包含生长培养基。
在一些实施方案中，微载体包含聚苯乙烯、交联葡聚糖、磁性颗粒、微芯片、纤维素、羟基化甲基丙烯酸酯、胶原蛋白、明胶、聚苯乙烯、塑料、玻璃、陶瓷、硅酮中的一种或多种。在一些实施方案中，微载体是球形的、光滑的、大孔的、棒状的或其组合。
在一些实施方案中，微载体包被有基质胶、层粘连蛋白、玻连蛋白、胶原蛋白、它们的衍生物或其组合。在一些实施方案中，层粘连蛋白是人层粘连蛋白。在具体的实施方案中，人层粘连蛋白是人层粘连蛋白511E8片段。
在一些实施方案中，微载体是未经包被的。
在一些实施方案中，微载体与鱼精蛋白或聚赖氨酸偶联。
在一些实施方案中，微载体是中性的或带负电的。在一些实施方案中，微载体是中性的。在一些实施方案中，微载体是带负电的。在一些实施方案中，微载体是亲水的。
附图的简要说明
图1显示沿MC(组
II MC，组B-Enhanced Attachment MC)上的P1传代的形态学评估。收获在MC上生长的细胞并在TC处理的T25培养瓶上接种以用于P2。
图2显示了在DC分化过程中从hESC扩展系统收获的细胞的形态。
图3显示了hESC扩增扩展系统过程。
图4显示了hESC扩展系统中细胞的形态。
图5显示了从hESC扩展系统中收获的细胞在重新接种为hESC2D培养物后的形态。
图6显示了hESC扩展系统在测试条件下的形态。
图7显示了hESC扩展系统在不同平台中的形态。
图8显示了具有不同iMatrix-511 E8浓度的hESC扩展系统的形态。
图9显示了hESC扩展系统在不同传代持续时间中的形态。
图10显示了在hESC扩展系统中培养的细胞在冷冻保存之前和解冻之后作为2D培养物的形态。
图11显示在hESC扩展系统中培养并作为2D培养物传代的细胞的培养参数和多能性标志物表达。
详述
本文的实施方案一般涉及用于扩增胚胎干细胞的方法、物质组合物和装置。
在阅读本描述之后，本领域技术人员将清楚如何在各种替代实施方案和替代应用中实施本公开内容。然而，在此将不描述本发明的所有各种实施方案。将理解，此处呈现的实施方案仅以示例的方式呈现，而不是限制。因此，各种替代实施方案的此详细描述不应被解释为限制本文所阐述的本公开内容的范围或广度。
在公开和描述本技术之前，应理解下文描述的方面不限于特定组合物、制备此类组合物的方法或其用途，因为它们当然可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定方面的目的，并且不旨在进行限制。
仅为了读者的方便而将详细描述分成不同的部分，并且在任何部分中发现的公开内容可以与在另一部分中的公开内容相结合。为了方便读者，说明书中可能会使用标题或副标题，其不旨在影响本公开内容的范围。
定义
如本文所用，除非上下文清楚地另有说明，否则单数形式“a”、“an”和“the”旨在也包括复数形式。
“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可以发生或不发生，并且该描述包括事件或情况发生的情况和不发生的情况。
当在数字表达例如温度、时间、数量、浓度等，包括范围)以及此类其他者包括范围之前使用时，术语“约”表示可能相差(+)或(-)10％、5％、1％或它们之间的任何子范围或子值的近似值。优选地，当关于数量使用时，术语“约”是指该数量可以变化+/-10％。
“包含”或“包括”旨在表示组合物和方法包括所列举的元素，但不排除其他元素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由......组成”应指排除对用于所述目的的组合具有任何重要意义的其他元素。因此，基本上由本文定义的元素组成的组合物不会排除不实质性影响要求保护的发明的基本和新颖特征的其他材料或步骤。“由......组成”应指排除其他成分和实质性方法步骤的超过痕量的元素。由这些过渡术语中的每一个定义的实施方案都在本公开内容的范围内。
“有效量”是相对于不存在组合物的情况足以使组合物实现规定目的的量(例如实现其施用的效果、治疗疾病、降低酶活性、增加酶活性、减少信号传导途径或减轻疾病或病症的一个或多个症状)。“有效量”的一个例子是足以促成治疗、预防或减轻疾病的一个或多个症状的量，其也可被称为“治疗有效量”。一个或多个症状的“减轻”(以及该短语的语法等同物)是指症状的严重程度或频率的降低，或症状的消除。药物的“预防有效量”(例如，本文所述的细胞)是当施用于受试者时将具有预期的预防效果(例如预防或延迟损伤、疾病、病理或病况的发作(或复发)，或减少损伤、疾病、病理或病况的发作(或复发)的可能性或其症状)的药物的量。完全的预防效果不一定通过一次剂量的施用出现，并且可能仅在一系列剂量的施用后出现。因此，可以在一次或多次施用中施用预防有效量。如本文所用，“活性降低量”是指相对于不存在拮抗剂的情况降低酶活性所需的拮抗剂的量。如本文所用，“功能破坏量”是指相对于不存在拮抗剂的情况破坏酶或蛋白质的功能所需的拮抗剂的量。确切的量将取决于治疗的目的，并且将由本领域技术人员使用已知技术确定(参见，例如，Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(vols.1-3,1992)；Lloyd,The Art,Scienceand Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar,Dosage Calculations(1999)；和Remington:The Science and Practice of Pharmacy,20th Edition,2003,Gennaro,Ed.,Lippincott,Williams&Wilkins)。
对于本文所述的任何组合物，治疗有效量最初可由细胞培养测定确定。目标浓度将是能够实现本文所述方法的活性组合物的那些浓度(例如，细胞浓度或数量)，如使用本文所述或本领域已知的方法测量的。
“对照”或“对照实验”按照其通俗的含义使用，并且是指其中将实验的受试者或试剂作为平行实验处理但省略了实验的程序、试剂或变量的实验。在某些情况下，对照被用作评估实验效果的比较标准。在一些实施方案中，对照是在不存在本文所述的组合物(包括实施方案和实施例)的情况下蛋白质的活性的测量。
“药学上可接受的赋形剂”和“药学上可接受的载体”是指有助于将活性剂施用于受试者并被受试者吸收并且可以包含在本公开内容的组合物中而不会对患者造成显著不利毒理学作用的物质。药学上可接受的赋形剂的非限制性实例包括水、NaCl、生理盐水溶液、乳酸林格氏液、普通蔗糖、普通葡萄糖、粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、包衣剂、甜味剂、调味剂、盐溶液(例如林格氏溶液)、醇、油、明胶、碳水化合物如乳糖、直链淀粉或淀粉、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷和色素等。这些制剂可以被灭菌，并且如果需要，可以与不会与本公开内容的组合物不利地反应的助剂(例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂和/或芳香物质等)混合。本领域技术人员将认识到其他药物赋形剂可用于本公开内容。
如本文所用，“细胞”是指执行足以保存或复制其基因组DNA的代谢或其他功能的细胞。可以通过本领域熟知的方法(包括例如完整膜的存在、通过特定染料染色、产生后代的能力或者在配子的情况下与第二个配子组合的能力以产生有活力的后代)鉴定细胞。细胞可包括原核和真核细胞。原核细胞包括但不限于细菌。真核细胞包括但不限于酵母细胞和源自植物和动物的细胞，例如哺乳动物、昆虫(例如，贪夜蛾)和人细胞。当细胞天然不粘附或经过处理(例如通过胰蛋白酶消化)以不粘附于表面时，它们可能是有用的。
如本文所用，“干细胞”是指能够在培养物中长时间保持未分化状态的细胞(例如，多能干细胞或多能干细胞)，直到被诱导以分化成具有特定、特化的功能的其他细胞类型(例如，完全分化的细胞)。在实施方案中，“干细胞”包括胚胎干细胞(ESC)、诱导多能干细胞(iPSC)、成体干细胞、间充质干细胞和造血干细胞。
如本文所用，“诱导性多能干细胞”或“iPSC”是可以通过体细胞的遗传操作从体细胞产生的细胞，例如通过使用转录因子例如Oct-3/4、Sox2、c-Myc和KLF4逆转录病毒转导体细胞例如成纤维细胞、肝细胞、胃上皮细胞[Yamanaka S,Cell Stem Cell.2007,1(1):39-49；Aoi T等人,Generation of Pluripotent Stem Cells from Adult Mouse Liver andStomach Cells.Science.2008Feb 14.(Epub ahead of print)；IH Park,Zhao R,West JA等人,Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with definedfactors.Nature 2008；451:141-146；KTakahashi,Tanabe K,Ohnuki M等人,Induction ofpluripotent stemcells from adult humanfibroblasts by definedfactors.Cell2007；131:861-872]。其他胚胎样干细胞可通过核转移至卵母细胞、与胚胎干细胞融合或核转移至受精卵(如果受体细胞在有丝分裂中停滞)来产生。此外，可以使用非整合方法，例如通过使用小分子或RNA来产生iPSC。
术语“胚胎干细胞”是指能够分化成所有三个胚胎胚层(即内胚层、外胚层和中胚层)的细胞或保持未分化状态的胚胎细胞。短语“胚胎干细胞”包括从妊娠后形成的胚胎组织(例如胚泡)在胚胎着床前(即着床前胚泡)获得的细胞，从着床后/原肠胚形成前阶段的胚泡获得的扩展的胚泡细胞(EBC)(参见WO2006/040763)和在妊娠期间的任何时间，优选在妊娠10周之前从胎儿的生殖器组织获得的胚胎生殖(EG)细胞。在实施方案中，胚胎干细胞是使用熟知的细胞培养方法获得的。例如，人胚胎干细胞可以从人胚泡中分离出来。
应当理解，商业上可获得的干细胞也可以用于本公开内容的方面和实施方案中。人ES细胞可以从NIH人胚胎干细胞登记处www.grants.nih.govstem_cells/或从其他hESC登记处购买。可商购的胚胎干细胞系的非限制性实例是HAD-C 102,ESI,BGO 1,BG02,BG03,BG04,CY12,CY30,CY92,CY1O,TE03,TE32,CHB-4,CHB-5,CHB-6,CHB-8,CHB-9,CHB-10,CHB-11,CHB-12,HUES 1,HUES 2,HUES 3,HUES 4,HUES 5,HUES 6,HUES 7,HUES 8,HUES 9,HUES10,HUES 11,HUES 12,HUES 13,HUES 14,HUES 15,HUES16,HUES 17,HUES 18,HUES 19,HUES 20,HUES 21,HUES 22,HUES 23,HUES 24,HUES 25,HUES 26,HUES 27,HUES 28,CyT49,RUES3,WAO 1,UCSF4,NYUES 1,NYUES2,NYUES3,NYUES4,NYUESS,NYUES6,NYUES7,UCLA 1,UCLA 2,UCLA 3,WA077(H7),WA09(H9),WA 13(H13),WA14(H14),HUES 62,HUES 63,HUES 64,CT I,CT2,CT3,CT4,MA135,Eneavour-2,WIBR 1,WIBR2,WIBR3,WIBR4,WIBRS,WIBR6,HUES 45,Shef 3,Shef 6,BINhem19,BJNhem20,SAGO 1,SAOO1。
如本文所用，术语“微载体”或“MC”是指允许贴壁细胞在动态或静态细胞培养物中生长并可在温和混合下保持悬浮的可悬浮支持基质。微载体可包括但不限于聚苯乙烯、表面改性聚苯乙烯、化学改性聚苯乙烯、交联葡聚糖、纤维素、丙烯酰胺、胶原蛋白、藻酸盐、明胶、玻璃、DEAE-葡聚糖或其组合。微载体可用生物支持基质包被，包括但不限于层粘连蛋白、基质胶、胶原蛋白、聚赖氨酸、聚L-赖氨酸、聚D-赖氨酸、玻连蛋白、纤连蛋白、腱生蛋白、葡聚糖、肽或其组合。许多不同类型的微载体是可商购的，包括但不限于HyQSphere(HyClone)、Hillex(SoloHill Engineering)和Low Concentration
II(Corning)品牌。微载体可以由交联葡聚糖例如Cytodex品牌(GE Healthcare)制成。微载体可以是球形和光滑的，可以具有微孔表面，例如CYTOPORE品牌(GE Healthcare)，和/或可以是棒状载体，例如DE-53(Whatman)。微载体可以浸渍有助于细胞与珠子的分离的磁性颗粒(例如，来自Global Cell Solutions的GEM颗粒)。基于芯片的微载体例如μHex产品(Nunc)为细胞生长提供了平坦的表面，同时保持了传统微载体的高表面体积比。微载体的特性可能显著影响扩增速率和细胞多潜能性(multipotency)或多能性(pluripotency)。
方法
一方面，本文提供了用于扩增和维持处于未分化、多能状态的人胚胎干细胞(hESC)的方法，该方法包括以下步骤：(a)在生长培养基中同时组合人胚胎干细胞、细胞外基质成分(ECM)和微载体以形成可悬浮的扩增复合物，和(b)将可悬浮的扩增复合物培养一段时间。
在一些实施方案中，收获可悬浮的扩增复合物的培养细胞并通过重复步骤(a)和(b)进一步扩增。
在一些实施方案中，收获可悬浮的扩增复合物的培养细胞并进一步分化。
人胚胎干细胞可以从人胚泡中分离出来。人胚泡通常获自人体内着床前胚胎或体外受精(IVF)胚胎。或者，可以将单细胞人胚胎扩增至胚泡阶段。对于人ES细胞的分离，透明带从胚泡中去除，并且内细胞团(ICM)通过以下程序分离：滋养外胚层细胞被裂解并通过轻柔吸移从完整的ICM中去除。然后将ICM铺板在含有使其能够生长的适当培养基的组织培养瓶中。9到15天后，ICM衍生的生长物通过机械解离或通过酶促降解解离成团块，然后将细胞重新铺板到新鲜组织培养基上。表现出未分化形态的集落通过微量移液器单独选择，机械分离成团块，然后重新铺板。产生的ES细胞随后每4-7天常规分割。有关制备人ES细胞的方法的更多详细信息，参考Reubinoff等人,Nat Biotechnol 2000,May:18(5):559；Thomson等人,[美国专利号5,843,780；Science 282:1145,1998；Curr.Top.Dev.Biol.38:133,1998；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7844,1995]；Bongso等人,[Hum Reprod 4:706,1989]；和Gardner等人,[Fertil.Steril.69:84,1998]。
此外，ES细胞可以从其他物种获得，包括小鼠(Mills and Bradley,2001)、金仓鼠[Doetschman等人,1988,Dev Biol.127:224-7]、大鼠[Iannaccone等人,1994,DevBiol.163:288-92]、兔子[Giles等人,1993,Mol Reprod Dev.36:130-8；Graves&Moreadith,1993,Mol Reprod Dev.1993,30 36:424-33]、几种家养动物物种[Notarianni等人,1991,JReprod Fertil Suppl.43:255-60；Wheeler 1994,Reprod Fertil Dev.6:563-8；Mitalipova等人,2001,Cloning.3:59-67]和非人灵长类物种(恒河猴和狨猴)[Thomson等人,1995,Proc Natl Acad Sci U S A.92:7844-8；Thomson等人,1996,BiolReprod.55:254-9]。
扩展的胚泡细胞(EBC)可从原肠胚形成前阶段受精后至少9天的胚泡中获得。在培养胚泡之前，透明带被消化[例如通过Tyrode酸性溶液(Sigma Aldrich，St Louis，MO，USA)]以暴露内细胞团。然后使用标准胚胎干细胞培养方法在受精后将胚泡作为完整胚胎在体外培养至少九天且不超过十四天(即原肠胚形成事件之前)。
制备ES细胞的另一种方法描述于Chung等人,Cell Stem Cell,Volume 2,Issue2,113-117,7February 2008。该方法包括在体外受精过程中从胚胎中去除单个细胞。胚胎在这个过程中没有被破坏。
EG(胚胎生殖)细胞是使用本领域技术人员已知的实验室技术从获自妊娠约8-11周的胎儿(在人胎儿的情况下)的原始生殖细胞制备的。生殖脊被解离并切成小部分，其然后通过机械解离分解成细胞。然后EG细胞在具有适当培养基的组织培养瓶中生长。每天更换培养基培养细胞，直到观察到与EG细胞一致的细胞形态，通常在7-30天或1-4代之后。有关制备人EG细胞的方法的更多详细信息，参见Shamblott等人,[Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:13726,1998]和美国专利号6,090,622。
另一种制备ES细胞的方法是通过孤雌生殖。胚胎在这个过程中也没有被破坏。
细胞可以在有或没有微载体的情况下在悬浮液中扩增或在单层中扩增。混合的细胞群在单层培养物或悬浮培养物中的扩增可以通过本领域技术人员熟知的方法修改为在生物反应器或多/超堆叠中的大规模扩增。
根据一些实施方案，扩增阶段进行至少一到二十周，例如至少一周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周，至少8周，至少9周甚至10周。在实施方案中，扩增阶段进行1周至10周，例如2周至10周、3周至10周、4周至10周或4周至8周。时间段可以是所述范围内的任何值或子范围，包括端点。
根据其他实施方案，混合的细胞群在扩增阶段至少传代一次，在扩增阶段至少传代两次，在扩增阶段至少传代三次，在扩增阶段至少传代四次，在扩增阶段至少传代五次，在扩增阶段至少传代六次，或在扩增阶段至少传代七次。
当酶法收集细胞时，可能继续扩增超过8代、超过9代和甚至超过10代(例如11-15代)。总细胞倍增的次数可以增加到大于30，例如31、32、33、34或更多。(参见国际专利申请公开号WO2017/021973，其全部内容通过引用并入本文)。
细胞外基质(ECM)是由为周围细胞提供结构和生化支持的细胞外大分子和矿物质(例如胶原蛋白、酶、糖蛋白和羟基磷灰石)组成的三维网络。由于多细胞性在不同的多细胞谱系中独立进化，因此ECM的组成在多细胞结构之间不同；然而，细胞粘附、细胞间通信和分化是ECM的常见功能。
动物细胞外基质包括间质基质和基底膜。间质基质存在于各种动物细胞之间(即，在细胞间隙中)。多糖和纤维蛋白的凝胶填充间质空间，并用作压缩缓冲器来抵抗施加在ECM上的压力。基底膜是各种上皮细胞位于其上的ECM的片状沉积物。动物中的每种类型的结缔组织具有一种类型的ECM：胶原纤维和骨矿物质包含骨组织的ECM；网状纤维和细胞间质(ground substance)包含疏松结缔组织的ECM；和血浆是血液的ECM。
在本公开内容的范围内使用的合适的细胞外基质组分可以包括但不一定限于基质胶、玻连蛋白、明胶、胶原蛋白I、胶原蛋白IV、层粘连蛋白(例如层粘连蛋白521)、纤连蛋白聚D-赖氨酸、它们的衍生物或其组合。在具体的实施方案中，人层粘连蛋白是人层粘连蛋白511E8片段。
在一些实施方案中，微载体可包含聚苯乙烯、交联葡聚糖、磁性颗粒、微芯片、纤维素、羟基化甲基丙烯酸酯、胶原蛋白、明胶、聚苯乙烯、塑料、玻璃、陶瓷或硅酮中的一种或多种。在一些实施方案中，微载体由聚苯乙烯、表面改性聚苯乙烯、化学改性聚苯乙烯、交联葡聚糖、纤维素、丙烯酰胺、胶原蛋白、藻酸盐、明胶、玻璃、DEAE-葡聚糖或其组合组成。在一些实施方案中，微载体由聚苯乙烯组成。在一些实施方案中，微载体由表面改性的聚苯乙烯组成。在一些实施方案中，微载体由化学改性的聚苯乙烯组成。在一些实施方案中，微载体由交联葡聚糖组成。在一些实施方案中，微载体由纤维素组成。在一些实施方案中，微载体由丙烯酰胺组成。在一些实施方案中，微载体由胶原组成。在一些实施方案中，微载体由藻酸盐组成。在一些实施方案中，微载体由明胶组成。在一些实施方案中，微载体由玻璃组成。在一些实施方案中，微载体由DEAE-葡聚糖组成。在一些实施方案中，微载体是未经包被的。
在一些实施方案中，微载体是经包被的。在实施方案中，微载体可以用基质胶、层粘连蛋白、玻连蛋白、胶原蛋白、它们的衍生物或其组合包被。在实施方案中，微载体可由聚赖氨酸、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、纤连蛋白、生腱蛋白、葡聚糖、肽或其组合包被。在一些实施方案中，微载体包被有层粘连蛋白。在一些实施方案中，微载体包被有基质胶。在一些实施方案中，微载体包被有胶原蛋白。在一些实施方案中，微载体包被有聚赖氨酸。在一些实施方案中，微载体包被有聚-L-赖氨酸。在一些实施方案中，微载体包被有聚-D-赖氨酸。在一些实施方案中，微载体包被有玻连蛋白。在一些实施方案中，微载体包被有纤连蛋白。在一些实施方案中，微载体包被有腱生蛋白。在一些实施方案中，微载体包被有葡聚糖。在一些实施方案中，微载体包被有肽。
在一些实施方案中，微载体可以是球形的、光滑的、大孔的、棒状的或其组合。在一些实施方案中，微载体可与鱼精蛋白或聚赖氨酸偶联。在一些实施方案中，微载体是球形的。在一些实施方案中，微载体是椭圆形的。在一些实施方案中，微载体是棒状的。在一些实施方案中，微载体是盘状的。在一些实施方案中，微载体是多孔的。在一些实施方案中，微载体是无孔的。在一些实施方案中，微载体是光滑的。在一些实施方案中，微载体是扁平的。
在一些实施方案中，微载体是中性的。在一些实施方案中，微载体是带负电的。在一些实施方案中，微载体是亲水的。
在一些实施方案中，微载体可具有25cm2,50cm2,75cm2,100cm2,125cm2,150cm2,175cm2,200cm2,225cm2,250cm2,500cm2,625cm2,750cm2,1,000cm2,1,250cm2,5,000cm2或7,500cm2的表面积。表面积可以是所述范围内的任何值或子范围，包括端点。
在具体的实施方案中，微载体经过表面处理以增强细胞附着，使细胞产率和活力最大化。微载体可以由USP VI级聚苯乙烯材料(它提供了一致性的平台)组成。在一些实施方案中，微载体在微载体上产生用于干细胞扩增的合成表面。增强的附着表面处理向微载体表面注入氧气以改善细胞附着。在一些实施方案中，微载体是无热原的。在一些实施方案中，微载体针对间充质干细胞应用进行了优化。在具体的实施方案中，珠子的大小可在125-212μm之间变化。在具体的实施方案中，微载体的密度可为1.026±0.004。在具体的实施方案中，微载体可以是360cm2/克。
在一些实施方案中，该方法包括将hESC与层粘连蛋白或其衍生物组合以改善与载体表面的细胞附着。在具体的实施方案中，层粘连蛋白是人层粘连蛋白511。作为替代实施方案，几种其他细胞外基质可用于细胞附着，例如包括但不一定限于玻连蛋白、纤连蛋白、胶原蛋白、基质胶或其衍生物。
在一些实施方案中，细胞可以培养一天、两天、三天、四天、五天、六天、七天、八天、九天、十天、十一天、十二天、十三天或十四天。
在一些实施方案中，细胞可以在10mL至3,000mL，例如约10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、100mL、250mL、500mL、750mL、1,000mL或3,000mL的工作体积中培养。体积可以是所述范围内的任何值或子范围，包括端点。
在一些实施方案中，培养的细胞可以进一步扩增。
在一些实施方案中，培养的细胞可以保持未分化。未分化的细胞可通过各种标志物(例如包括但不一定限于SSEA-5、TRA-1-60、Oct-4和Nanog)的表达来鉴定。在一些实施方案中，未分化的细胞表达SSEA-5。在一些实施方案中，未分化的细胞表达TRA-1-60。在一些实施方案中，未分化的细胞表达Oct-4。在一些实施方案中，未分化的细胞表达Nanog。在一些实施方案中，未分化的细胞表达SSEA-5和TRA-1-60。在一些实施方案中，未分化的细胞表达Oct-4和Nanog。在一些实施方案中，未分化的细胞表达SSEA-5、TRA-1-60、Oct-4和Nanog。
在一些实施方案中，细胞可以在饲养细胞条件培养基中培养。ES培养方法可以包括使用饲养细胞层，其分泌干细胞增殖所需的因子，同时抑制它们的分化。培养通常在固体表面例如包被有明胶或波形蛋白的表面上进行。示例性的饲养层包括人胚胎成纤维细胞、成人输卵管上皮细胞、原代小鼠胚胎成纤维细胞(PMEF)、小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、鼠胎儿成纤维细胞(MFF)、人胚胎成纤维细胞(HEF)、从人胚胎干细胞的分化获得的人成纤维细胞、人胎儿肌肉细胞(HFM)、人胎儿皮肤细胞(HFS)、人成人皮肤细胞、人包皮成纤维细胞(HFF)、人脐带成纤维细胞、从脐带或胎盘获得的人细胞和人骨髓基质细胞(hMSC)。可以将生长因子添加到培养基中以维持ESC处于未分化状态。此类生长因子包括bFGF和/或TGF。在另一个实施方案中，可以将试剂添加到培养基中以维持hESC处于原始未分化状态-参见例如Kalkan等人,2014,Phil.Trans.R.Soc.B,369:20130540。
1-4天后，hESC通常在支持性培养基(例如含有人血清白蛋白的
或NUT(+))中铺板在饲养细胞顶部之上。可以向培养基中添加其他因子以防止ESC例如bFGF和TGFI3的分化。一旦获得足够量的hESC，可以机械破坏细胞(例如通过使用无菌尖端或一次性无菌干细胞工具；14602Swemed)。或者，可以通过酶处理(例如胶原酶A或TrypLE Select)去除细胞。此过程可以重复几次以达到所需量的hESC。根据一些实施方案，在第一轮扩增之后，使用TrypLE Select去除hESC，并且在第二轮扩增之后，使用胶原酶A去除hESC。
无饲养细胞系统也已用于ES细胞培养，此类系统利用补充有血清替代物、细胞因子和生长因子(包括IL6和可溶性IL6受体嵌合体)的基质作为饲养细胞层的替代物。干细胞可以在存在培养基的情况下在固体表面例如细胞外基质(例如MATRIGELRTM、层粘连蛋白或玻连蛋白)上生长-例如Lonza L7系统、mTeSR、StemPro、XFKSR、E8、
)。与需要饲养细胞和干细胞的同时生长并可能导致混合细胞群的基于饲养层的培养物不同，在无饲养层系统上生长的干细胞很容易与表面分离。用于生长干细胞的培养基含有有效抑制分化和促进其生长的因子，例如MEF条件培养基和bFGF。
同样在本公开内容的范围内的是用于扩增和维持处于未分化状态的人胚胎干细胞(hESC)的方法，包括在非粘附表面上培养人多能干细胞以获得未分化的hESC群体，将未分化的hESC的所述群体与生长培养基中的微载体组合，并扩增所述细胞群。
非粘附细胞培养板的例子包括由Nunc制造的那些(例如Hydrocell目录号174912)等。在其他实施方案中，可以使用非粘附悬浮培养皿(例如Corning)。
根据一些实施方案，当细胞在非粘附基底(例如细胞培养板)上培养时，大气氧条件为20％。然而，也预期大气氧条件的操纵使得大气氧百分比小于约20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％或甚至小于约5％(例如1％-20％、1％-10％或0-5％)。根据其他实施方案，最初在正常大气氧条件下在非粘附基质上培养细胞，然后降低至低于正常大气氧条件。
在一些实施方案中，该方法还可以包括冷冻(例如冷冻保存)扩增的细胞群。适用于冷冻保存的培养基的实例包括但不限于90％人血清/10％DMSO、Media 3 10％(CS10)、Media 2 5％(CS5)和Media 12％(CS2)、Stem Cell Banker、PRIME XV°FREEZIS、
Trehalose等。
在进一步的实施方案中，冷冻保存培养基包含：嘌呤核苷(例如，腺苷)、支链葡聚糖(例如，葡聚糖40)、两性离子有机化学缓冲剂(例如，HEPES(N-(2-羟乙基)哌嗪EN'-(2E乙磺酸)))和细胞可耐受的极性非质子溶剂(例如，二甲亚砜(DMSO))。在更进一步的实施方案中，嘌呤核苷、支链葡聚糖、缓冲剂和极性非质子溶剂中的一种或多种通常被美国FDA认定为安全的。
在一些实施方案中，冷冻保存培养基还包含以下的一种或多种：糖酸(例如，乳糖酸)、一种或多种碱(例如，氢氧化钠、氢氧化钾)、抗氧化剂(例如，L-谷胱甘肽)、一种或多种卤化物盐(例如，氯化钾、氯化钠、氯化镁)、碱性盐(例如，碳酸氢钾)、磷酸盐(例如，磷酸钾、磷酸钠、磷酸钾)、一种或多种糖(例如，葡萄糖、蔗糖)、糖醇(例如甘露醇)和水。
在其他实施方案中，糖酸、碱、卤化物盐、碱式盐、抗氧化剂、磷酸盐、糖、糖醇中的一种或多种被美国FDA普遍认为是安全的。
DMSO可用作冷冻保护剂以防止冰晶的形成，冰晶可在冷冻保存过程中杀死细胞。在一些实施方案中，可冷冻保存的培养基包含约0.1％至约2％的DMSO(v/v)。在一些实施方案中，可冷冻保存的培养基包含约1％至约20％的DMSO。在一些实施方案中，可冷冻保存的培养基包含约2％的DMSO。在一些实施方案中，可冷冻保存的培养基包含约5％的DMSO。
在一些实施方案中，该方法可以进一步包括在包含分化剂的培养基中的粘附表面上培养扩增的细胞群以获得分化细胞。粘附基质或物质混合物的例子可以包括但不限于纤连蛋白、层粘连蛋白、聚D-赖氨酸、胶原蛋白和明胶。在一个实施方案中，在存在烟酰胺(例如0.01-100mM、0.1-100mM、0.1-50mM、5-50mM、5-20mM，例如10mM)和不存在激活素A的情况下进行分化。浓度可以是列举范围内的任何值或子范围，包括端点。
根据一些实施方案，最初在正常大气氧条件下在粘附基质上培养细胞，随后将氧气降低至低于正常大气氧条件。
根据一些实施方案，当细胞在粘附基质例如层粘连蛋白上培养时，大气氧条件为20％。它们可以被操纵以使得大气氧百分比小于约20％、15％、10％，更优选地小于约9％、小于约8％、小于约7％、小于约6％和更优选约5％(例如1％-20％、1％-10％或0-5％)。该量可以是所述范围内的任何值或子范围，包括端点。
在一些实施方案中，细胞在饲养细胞条件培养基中培养，如上文详细描述的。
在一些实施方案中，在不存在饲养细胞的情况下培养细胞。
在一些实施方案中，在初始扩增后，细胞可进一步扩增。
在一些实施方案中，细胞可培养一天、两天、三天、四天、五天、六天或七天。
在一些实施方案中，培养的细胞可以进一步扩增。
在一些实施方案中，收获可悬浮的扩增复合物的培养细胞并进一步分化。在一些实施方案中，可悬浮的扩增复合物的培养细胞通过改变生长培养基进一步分化。在一些实施方案中，可悬浮的扩增复合物的培养细胞保持未分化和多能性。
另外的实施方案
本公开内容提供以下示例性实施方案。
实施方案1-一种用于扩增和维持处于未分化、多能状态的人胚胎干细胞(hESC)的方法，该方法包括以下步骤：(a)在生长培养基中同时组合人胚胎干细胞、细胞外基质成分(ECM)和微载体以形成可悬浮的扩增复合物，和(b)将可悬浮的扩增复合物培养一段时间。
实施方案2-实施方案1的方法，其中微载体包括聚苯乙烯、交联葡聚糖、磁性颗粒、微芯片、纤维素、羟基化甲基丙烯酸酯、胶原蛋白、明胶、聚苯乙烯、塑料、玻璃、陶瓷、硅酮或其组合中的一种或多种。
实施方案3-实施方案1或2的方法，其中微载体是球形的、光滑的、大孔的、棒状的或其组合。
实施方案4-实施方案1至3中任一项的方法，其中ECM包括基质胶、层粘连蛋白、玻连蛋白、胶原蛋白、它们的衍生物或其组合。
实施方案5-实施方案1的方法，其中ECM是人层粘连蛋白。
实施方案6-实施方案5的方法，其中人层粘连蛋白是人层粘连蛋白511E8片段。
实施方案7-实施方案1至3中任一项的方法，其中微载体是未经包被。
实施方案8-实施方案1至7中任一项的方法，其中微载体与鱼精蛋白或聚赖氨酸偶联。
实施方案9-实施方案1至7中任一项的方法，其中微载体是中性的或带负电的。
实施方案10-实施方案9的方法，其中微载体是中性的。
实施方案11-实施方案9的方法，其中微载体带负电。
实施方案12-实施方案1至11中任一项的方法，其中微载体是亲水的。
实施方案13-实施方案1至12中任一项的方法，其中将可悬浮的扩增复合物培养至少约一天。
实施方案14-实施方案13的方法，其中将可悬浮的扩增复合物培养约1天至约14天。
实施方案15-实施方案1的方法，其中收获可悬浮的扩增复合物的培养细胞并通过重复步骤(a)和(b)进一步扩增。
实施方案16-实施方案1的方法，其中收获可悬浮的扩增复合物的培养细胞并进一步分化。
实施方案17-实施方案16的方法，其中可悬浮的扩增复合物的培养细胞通过改变生长培养基进一步分化。
实施方案18-实施方案1的方法，其中可悬浮的扩增复合物的培养细胞保持未分化和多能性。
实施方案19-实施方案16的方法，其中未分化的细胞表达至少约80％的SSEA-5和TRA-1-60中的每一种。
实施方案20-实施方案16的方法，其中未分化的细胞表达至少约70％的Oct-4和Nanog中的每一种。
实施方案21-实施方案16的方法，其中未分化的细胞表达至少约80％的SSEA-5、至少约80％的TRA-1-60、至少约70％的Oct-4和至少约70％的Nanog。
组合物
另一方面，本文提供包含人胚胎干细胞、细胞外基质成分(ECM)和微载体的可悬浮的扩增复合物组合物。
人胚胎干细胞、细胞外基质和微载体在本文别处详细描述。
扩增复合物范围可能变化。在下表中，复合物成分的范围以ECM组分的不同单位详细描述。
表1
ECM成分可以通过使用层粘连蛋白511E8片段的分子量(150KDa)以mol/cm2表示。
表2
ECM成分也可以通过使用分子量(150KDa)乘以阿伏加德罗数(6.022×1023)来表示分子数/cm2。
表3
在一些实施方案中，可以扩展以下规范参数：
hESC的#(细胞)-4,000-600,000个细胞/cm2微载体
层粘连蛋白511E8片段(μg/cm2微载体)–0.125μg/cm2或更高。
在一些实施方案中，组合物可进一步包含生长培养基。可根据本公开内容使用的可商购的基础培养基的非限制性实例包括
(对于ESC分化不含bFGF和TGF，对于ESC扩增具有bFGF和TGF)、NEUROBASALTM、KO-DMEM、DMEM、DMEM/F12、CELLGROTM干细胞生长培养基或X-VIVOTM。基础培养基可以补充有处理细胞培养物领域中已知的多种试剂。以下是对可包含在根据本公开内容使用的培养物中的各种补充物的非限制性参考：血清或含血清替代物的培养基，例如但不限于敲除血清替代物(KOSR)、NUTRIDOMA-CS、TCHTM、N2、N2衍生物或B27或组合；细胞外基质(ECM)成分，例如但不限于纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白和明胶。然后可以使用ECM来携带生长因子的TGFI3超家族的一个或多个成员；抗菌剂，例如但不限于青霉素和链霉素；和非必需氨基酸(NEAA)，已知在促进SC在培养物中的存活中起作用的神经营养因子，例如但不限于BDNF、NT3、NT4。
如上所述，微载体可包含聚苯乙烯、交联葡聚糖、磁性颗粒、微芯片、纤维素、羟基化甲基丙烯酸酯、胶原蛋白、明胶、聚苯乙烯、塑料、玻璃、陶瓷、硅酮中的一种或多种。在一些实施方案中，微载体由聚苯乙烯组成。在一些实施方案中，微载体由表面改性的聚苯乙烯组成。在一些实施方案中，微载体由化学改性的聚苯乙烯组成。在一些实施方案中，微载体由交联葡聚糖组成。在一些实施方案中，微载体由纤维素组成。在一些实施方案中，微载体由丙烯酰胺组成。在一些实施方案中，微载体由胶原组成。在一些实施方案中，微载体由藻酸盐组成。在一些实施方案中，微载体由明胶组成。在一些实施方案中，微载体由玻璃组成。在一些实施方案中，微载体由DEAE-葡聚糖组成。
如上所述，微载体可以是球形的、光滑的、大孔的、棒状的或它们的组合。
在一些实施方案中，微载体可用基质胶、层粘连蛋白、玻连蛋白、胶原蛋白、它们的衍生物或其组合包被。在一些实施方案中，层粘连蛋白是人层粘连蛋白511。
在一些实施方案中，微载体是未经包被的。
在一些实施方案中，微载体具有25cm2至7,500cm2，例如约25cm2,50cm2,75cm2,100cm2,125cm2,150cm2,175cm2,200cm2,225cm2,250cm2,500cm2,625cm2,750cm2,1,000cm2,1,250cm2,5,000cm2或7,500cm2的表面积。表面积可以是所述范围内的任何值或子范围，包括端点。
在一些实施方案中，微载体与鱼精蛋白或聚赖氨酸偶联。在一些实施方案中，微载体是中性的。在一些实施方案中，微载体是带负电的。在一些实施方案中，微载体是亲水的。
应当理解，本文描述的实例和实施方案仅用于说明目的，并且将向本领域技术人员提示根据其进行的各种修改或改变，并且其将被包括在本申请的精神和范围内以及所附权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请均出于所有目的通过引用整体并入本文。
另外的实施方案
本公开内容提供以下示例性实施方案。
实施方案22-包含人胚胎干细胞、细胞外基质组分(ECM)和微载体的可悬浮的扩增复合物组合物。
实施方案23-实施方案22的组合物，还包含生长培养基。
实施方案24-实施方案22或23的组合物，其中微载体包含聚苯乙烯、交联葡聚糖、磁性颗粒、微芯片、纤维素、羟基化甲基丙烯酸酯、胶原蛋白、明胶、聚苯乙烯、塑料、玻璃、陶瓷、硅酮中的一种或多种。
实施方案25-实施方案22至24中任一项的组合物，其中微载体是球形的、光滑的、大孔的、棒状的或其组合。
实施方案26-实施方案22至25中任一项的组合物，其中微载体包被有基质胶、层粘连蛋白、玻连蛋白、胶原蛋白、它们的衍生物或其组合。
实施方案27-实施方案26的组合物，其中层粘连蛋白是人层粘连蛋白。
实施方案28-实施方案27的组合物，其中人层粘连蛋白是人层粘连蛋白511E8片段。
实施方案29-实施方案22至28中任一项的组合物，其中微载体是未经包被的。
实施方案30-实施方案22至29中任一项的组合物，其中微载体与鱼精蛋白或聚赖氨酸偶联。
实施方案31-实施方案22至30中任一项的组合物，其中微载体是中性的或带负电的。
实施方案32-实施方案31的组合物，其中微载体是中性的。
实施方案33-实施方案31的组合物，其中微载体是带负电的。
实施方案34-实施方案22至29中任一项的组合物，其中微载体是亲水的。
实施例
实施例1：用于hESC扩增的方法
hESC产生的扩展是在许多生长平台上完成的。来自生长的hESC细胞悬浮液，或附着至2D培养瓶例如滚瓶、细胞工厂或3D中空纤维和大载体例如BioNocII和Fibra Cell盘。
完全受控和封闭的系统多年来一直用于简单的哺乳动物细胞生长。这些系统允许制造大量工业批次的抗体和蛋白质。这些系统中的大多数需要固有生长或经调整以适应作为单细胞悬浮生长的细胞。在悬浮液中扩增hESC的早期尝试并不成功，因为它们形成倾向于失去其多能性并自发分化的聚集体。经调整以适应作为单细胞悬浮液生长的hESC大多数时候损害遗传稳定性并导致核型异常。最近，这种方法得到了极大改进(AMIT Michal,ItzkvitzEldor Joseph Patent#EP2059586B1,US9040297B2)，他们的创新是在无血清、无血清替代物、无异源物质(xeno-free)、无饲养层和无蛋白质载体的情况下生长hESC而无需粘附至任何类型的基质或涂层。这在一定程度上是通过添加可溶性白细胞介素6受体(sIL6R，>10ng/ml)、可溶性白细胞介素6(IL6)、白血病抑制因子(LIF，1000-3000u/ml)以及bFGF、TGFb1和TGFb3来实现的。
一些研究已经使用微载体来生长hESC培养物。它们悬浮在溶液中同时为它们提供粘附细胞在其上生长的表面的特性使它们理想用于在封闭和受控环境中生长粘附细胞培养物。使用微载体用于大规模生产的一个潜在好处是与传统的静态培养过程相比，表面积与体积的比率大大增加，因此可以增加细胞密度，并减少所需的足迹。
许多不同类型的微载体(MC)是可商购的。MC可以由聚苯乙烯(例如HyQSphere(HyClone)和Hillex(SoloHill Engineering)品牌)制成，或由交联葡聚糖(例如Cytodex品牌(GE Healthcare))制成。虽然大多数微载体是球形和光滑的，但其他微载体具有大孔表面，例如Cytopore品牌(GE)和替代品，例如棒状载体，例如DE-53(Whatman)。其他技术进步包括将磁性颗粒注入可能有助于细胞与珠子(来自Global Cell Solutions的GEM颗粒)分离的MC，和为细胞生长提供了传统的平坦表面同时保持传统微载体的高表面体积比的基于芯片的微载体例如μHex产品(Nunc)。选择用于细胞扩增的微载体并非易事。微载体的不同特性可能显著影响扩增率、细胞多能性、执行能力(在hESC的情况下，其分化成不同谱系的能力)、遗传稳定性等。一些表面化学修饰可以改善细胞粘附。此类方法包括应用正电荷或负电荷以及可选的具有细胞外基质蛋白的涂层(Lam 2015BioResearch Open AccessVolume4.1,Cherian 2020Frontiers in Pharmacology Volume 11Article 654)。
2005-2007年发表了在搅拌悬浮液中在微载体上生长胚胎干细胞(ESC)的首次尝试(Fok等人,Stem Cells 2005；23:1333-1342,Abranches等人,Biotechnol.Bioeng.96(2007),pp.1211-1221,和Stefanie Terstegge&Oliver Brustle US20070264713A1)。2009年使用Cytodex 1、3和Solohil Plastic、Plastic plus和Hillex II证明了hESC在MC上的扩增和传代(Nelson,Janssen Biotech Inc,US20180265842A1,US9969972B2)，包括它们在MC上向定形内胚层和胰腺细胞或心肌细胞的分化(Oh等人,EP2479260B1)。大多数开发的工艺包括用基质胶包被MC，在某些情况下，层粘连蛋白或玻连蛋白被用作用胶原蛋白预包被的MC的涂层。一项研究使用
II包被的MC在受控环境中进行了hESC扩增(Corning，Silva 2015)。表4总结了这些研究的主要条件和结果。这些研究尚未推进到大型容器，但总的来说，它们建立了与静态培养瓶中的标准实践相当的结果。
但在本公开内容之前，尚待进行下一步的在受控环境中的大规模生产。
GMP级无饲养层和无血清hESC库以前从临床批准的hESC系(HADC102，H1)产生。此处，通过添加iMatrix-511-E8(No.2009-234583/PCTJP2010-067618/WO2011-043405,Miyazaki等人,2012Nat Commun.2012Dec 4；3:1236)合成片段到接种溶液中，将hESC在未包被的培养瓶上繁殖数代。该方法用于在MC上扩展hESC培养以用于开发扩展工艺。在一项概念验证研究中，在mTeSR加上补充有iMatrix-511-E8–0.125μgr/cm2的培养基中使用
II或Enhanced Attachment(Corning)MC在非粘附T25培养瓶中培养hESC(H1)。
作为涂层的人层粘连蛋白511(特别是iMatrix-511-E8(层粘连蛋白511的合成部分))与悬浮的那些特定的两个MC(其他的在POC研究中测试但失败)的组合(以允许hESC在培养系统扩增hESC)允许扩展规模。人层粘连蛋白511(特别是iMatrix E8)在这里首次用于在扩展系统中包被MC。以前的出版物教导了在层粘连蛋白包被的组织培养物上培养hESC，或者在具有各种底物的不同MC上培养hESC，这些底物通常涵盖所有蛋白质基质(基质胶、胶原蛋白、明胶、玻连蛋白、层粘连蛋白或其衍生物或组合)。
如上所详述的，当打算使用一次性生物反应器用于hESC扩增时，这种组合使得向大规模转移变得更加容易和线性。
另外一点，包被程序是利用iMatrix 511E8对hESC的高特异性完成的，它不被用作用于在细胞接种前预包被基底的试剂，而是通过简化工艺并将该试剂直接添加到接触MC之前的细胞悬液来使用。因此，当细胞被接种时，MC没有预包被，但在接种溶液中加入iMatrix511E8增强它们对那些特定MC的特异性附着。
根据目前的标准实践，微载体在细胞接种前进行包被。预包被步骤的持续时间变化很大，从在37℃下4小时到在4℃下一个月，并且很难控制包被程序以均匀地分布在所有表面上，因为MC在长期静态孵育中变得紧凑并且一些表面不易被包被，因为它与相邻的珠子接触。在MC平衡和细胞接种之前，在生长培养基中对MC的平衡步骤之前需要完全去除涂层溶液。由于层粘连蛋白涂层对低湿度的敏感性，涂层去除步骤是有风险的。如果层粘连蛋白变干，它改变其粘接性能。在具有大体积的扩展系统中，此步骤至关重要，因为它可能不仅影响接种的细胞的数量；它还可以改变细胞性质。
本公开内容相对于此前描述的hESC扩增系统和技术的创新是在单个步骤中成分的组合或接种，这允许hESC扩展系统的方便接种。特别地，本文所述的系统和方法包括如上所述的单步接种步骤，即，(a)在生长培养基中同时组合人胚胎干细胞、细胞外基质成分(ECM)和微载体以形成可悬浮的扩增复合物，和(b)将可悬浮的扩增复合物培养一段时间。例如，通过将所有相关材料混合在一起用于接种扩展系统(特定MC类型，具有细胞的iMatrix511 E8)，无需进行预包被和随后接种的另一个步骤。这还包括在GMP条件下在封闭和受控环境中扩增hESC。用于扩展系统的这些材料的特定组合允许容易和安全的GMP转化。
结果
接种在未经处理的T25(Corning)中在
II或Enhanced Attachment(Corning)MC上以20,000个细胞/cm2进行2小时。在接种步骤结束时，加入8ml mTeSR plus。每24小时更换80％的培养基，并监测乳酸水平和细胞形态(图1和表6)。在使用TrypLESelect接种后第4天进行收获。通过70μm过滤器过滤细胞以去除MC。细胞在CS10中冷冻保存。在TC处理的培养瓶上进行后续传代(P2)后，评估解冻细胞的多能性(表5，SSEA-5/TRA-1-60，Oct4/Nanog)。
表6中总结的研究结果表明，对于两种MC类型在不降低细胞多能性(SSEA-5/TRA-1-60>98％，％Oct-4/Nanog>84％)和自我更新(P1～4、P2～3中的群体倍增(PDL))的情况下实现了在MC上的有效hESC扩增。
表5.在MC上生长1代的hESC的多能性。
实施例2：制造能力和扩展计划
一个完全整合的团队将包括PD、QC、QA和制造。PSC技术的世界专家指导细胞分化为特定的功能谱系。将有一支经验丰富的团队用于在使用微载体的生物反应器中的工艺开发、配方和大规模产生。内部专业的cGMP产生能力包括1)两个独立的无尘室；2)生物反应器细胞产生(目前每批次50亿个细胞)；和3)填充/完成能力。
实施例3：用于扩展hESC扩增的系统
如上所述，根据本公开内容的教导，单一步骤中的成分的组合允许hESC扩展系统的方便接种。根据目前的标准实践，微载体在细胞接种前进行包被。预包被步骤的持续时间变化很大，从在37℃下4小时到在4℃下一个月，并且很难控制包被程序以均匀地分布在所有表面上，因为MC在长期静态孵育中变得紧凑并且一些表面不易被包被，因为它与相邻的珠子接触。在MC平衡和细胞接种之前，在生长培养基中对MC的平衡步骤之前需要完全去除涂层溶液。由于层粘连蛋白涂层对低湿度的敏感性，涂层去除步骤是有风险的。如果层粘连蛋白变干，它改变其粘接性能。在具有大体积的扩展系统中，此步骤至关重要，因为它可能不仅影响接种的细胞的数量，它还可以改变细胞性质。
本发明的创新点包括上文提及的接种步骤，将所有相关材料混合在一起用于接种扩展系统(特定MC类型，具有细胞的iMatrix511 E8)，无需进行预包被和接种的额外步骤。这还包括在GMP条件下在封闭和受控环境中扩增hESC。用于扩展系统的这些材料的特定组合实现容易和安全的GMP转化。
此处呈现的工艺(图3)涉及将hESC解冻和扩增为传统的无饲养层2D培养物。然后收获hESC并将其与补充至培养基的iMatrix-511 E8一起直接接种在MC上的hESC扩增扩展系统中。在扩展系统中的hESC扩增结束时，收获的细胞可以作为hESC多能库冷冻保存用于进一步扩增和/或直接继续用于启动分化。
为了评估细胞生长，可以评估几个参数：
1)乳酸测量-培养过程中培养基中乳酸浓度的增加与hESC培养期间的活细胞数量成线性关系。
2)形态学评估-在扩展系统中hESC扩增过程中观察到的珠子团块反映了培养物中的细胞生长。
3)传代参数-除了产率
参数外，细胞的收获密度(活细胞/cm2)。
其他hESC表征方法用于评估从hESC扩增扩展系统中收获的细胞-
1)多能性标志物表达-来自hESC扩增扩展系统培养的冷冻保存的收获细胞针对四种众所周知的多能性标志物(SSEA-5/TRA-1-60、Oct-4/Nanog)进行染色，并通过流式细胞术进行分析。这些标志物的高表达证实了从hESC扩展培养系统中收获的细胞的身份和多能性状态。
2)核型分析-在显影中，将细胞在从hESC扩展培养系统收获后进行培养并固定。采用吉姆萨显带法测试细胞核型，以确保遗传稳定性。
在几种类型的MC上hESC的培养
hESC从T培养瓶中收获，并在一个接种步骤中与补充至接种培养基的iMatrix-511E8一起接种到几种类型的MC上。细胞在hESC扩展系统中培养4天传代。在hESC扩增扩展系统中评估的MC类型详见表7。此外，测试了在其他类型的微型和大型载体(Pall SolohillStar-Plus,Pall Solohill
II,Pall Solohill Plastic,Pall SolohillPlastic Plus,ESCO BioNOC II,CelliGen Fibracell Disks,Advanced Biometrix
Type I Collagen Coated Beads,
3)上培养hESC(数据未显示)。在第一次筛选MC后，不再继续使用这些微型和大型载体。
表7.在hESC扩增扩展系统中测试的MC。
表7中呈现的两组的hESC扩增扩展系统的形态学评估如图4所示。
表8中呈现了第2天到第4天之间培养基中的乳酸升高以及收获密度、产率和在hESC扩增扩展系统中培养一次传代后细胞中多能性标志物的表达。
表8.在hESC扩展系统中培养的细胞的培养参数和多能性标志物表达。
接种用于进一步培养的收获的细胞的形态学评估如图5所示。细胞显示出典型的hESC形态学-组织为具有高细胞核与细胞质比例的致密细胞集落。
细胞在hESC扩增扩展系统条件下在Corning
II和CorningEnhanced Attachment MC上成功培养并产生多能hESC。
hESC扩增扩展系统的接种前的收获方法
如图3所示，整个过程涉及在接种至hESC扩增扩展系统之前将hESC培养为二维培养物。在hESC扩增扩展系统接种之前，使用了两种从传统无饲养层2D培养物的收获方法(非酶法-产生小细胞团，和酶法-产生单细胞)。两种收获方法都在上文提及的两种类型的MC上进行了测试。分组示于表9。
表9.hESC扩展系统中的测试条件(接种前MC类型和收获试剂的组合)。
表9中hESC扩增扩展系统培养的形态学评估显示在图6中。此外，来自所有组的细胞的培养参数和多能性标志物表达显示在表10中。
表10.在hESC扩展系统中培养的细胞的培养参数和多能性标记表达。
多能性标志物的表达(对于所有测试标志物>86％阳性)、培养过程中乳酸浓度升高、加上收获密度和产率表明，在hESC扩增扩展系统中接种前收获细胞是用ReLeSR以及TrypLE Select完成的。这两种方法都适用于在hESC扩增扩展系统中接种之前的hESC收获。
两种MC(Corning
II和Corning Enhanced Attachment)和两种收获方法(ReLeSR和TrypLE Select)都适用于hESC扩增扩展系统。此外，基于上面显示的数据，可以合理地假设培养用TrypLE Select从MC收获并在hESC扩增扩展系统中接种以用于额外传代的hESC是可行的。
用于hESC扩增扩展系统的培养平台
在hESC扩增扩展系统中的hESC扩增在不同的培养平台和不同的工作体积和MC表面积中进行了测试。表11中示出了几种培养平台的示例。
表11.用于在hESC扩展系统中培养的平台。
来自表11中平台的hESC扩增扩展系统的形态学评估如图7所示。
通过测量培养过程中的乳酸浓度来评估培养物生长。此外，计算了收获密度和产率。hESC的身份和多能性在培养结束时通过多能性标志物表达的流式细胞术分析进行评估。此外，在显影过程中，测试了从hESC扩增扩展系统收获的细胞的核型。结果总结在表12中。
表12.在hESC扩展系统中培养的细胞的培养参数和多能性标志物表达。
hESC在hESC扩增扩展系统中的生长是在不同MC表面积(25cm2、125cm2、250cm2、625cm2、1,250cm2和7,500cm2)和工作体积(10mL、50mL、100mL、250mL、500mL、3,000mL)下在几个培养容器(未处理的T25,0.1L PBS wheel,0.5L PBS wheel,3L PBS-MAG)中完成的。即使在改变培养容器和条件后，在hESC扩增扩展系统中的培养也能维持非常高的多能性标志物表达。
用于有效接种的iMatrix-511 E8浓度
hESC扩增扩展系统接种使用两种iMatrix-511 E8浓度进行。表13和图8总结了测试的条件和细胞生长(通过4天传代的第2天和第4天之间乳酸浓度的增加以及细胞-MC团块形成来评估)。
表13.在hESC扩展系统中接种期间的iMatrix-511 E8浓度。
当在接种期间使用0.125和0.250ug/cm2的iMatrix-511 E8时，实现了hESC在hESC扩增扩展系统中的扩增。此外，基于上面显示的数据，可以预测0.125-0.250ug/cm2的iMatrix-511 E8浓度将导致hESC在hESC扩增扩展系统中的高效生长。
hESC扩增扩展系统中MC上hESC的传代持续时间
为了允许在hESC扩增扩展系统中hESC培养的灵活性，对4天和5天传代进行了评估。进行了针对不同传代持续时间的hESC接种密度的调整。4天传代(组5.1)和5天传代(组5.2)后收获的hESC的收获密度、收获时的乳酸、形态学和多能性标志物表达的比较在表14和图9中示出。形态学评估和收获时的乳酸显示显示4天和5天传代培养之间的相似性。此外，多能性标志物表达在两组中都很高(对于所有标志物>89％)。
表14.在hESC扩展系统中培养的细胞的培养参数和多能性标志物表达。
对于4天和5天传代持续时间，完成了在hESC扩增扩展系统中的hESC培养。通过根据传代持续时间调整接种密度，hESC培养物达到了相似的乳酸浓度和收获密度。此外，通过调整接种密度，可以对于3-7天传代完成在hESC扩增扩展系统中在MC上培养hESC。
来自hESC扩增扩展系统中培养的细胞的hESC库的冷冻保存
从hESC扩增扩展系统收获的细胞被冷冻保存。然后，测试解冻细胞的多能性标志物表达，并将其接种用于作为2D传统无饲养层培养进行进一步培养。除了在hESC扩增扩展系统中培养后保持hESC形态外，解冻的细胞还显示出高多能性标志物表达(表15)。hESC扩增扩展系统中的培养参数和多能性标志物表达示于表15。图10显示了在hESC扩展培养系统中在MC上培养期间以及在解冻并接种在2D无饲养层传统培养瓶上用于随访之后2天和5天的细胞的形态学。
表15.在hESC扩展系统中培养的细胞的培养参数和多能性标志物表达。
完成了来自hESC扩增扩展系统细胞的hESC库的冷冻保存。除了在解冻的细胞的重新接种后保持为2D培养物的hESC典型形态作之外，细胞还显示出多能性标志物的高表达(对于所有测试的标志物>95％阳性)。
从hESC扩增扩展系统收获的细胞作为2D hESC培养物的进一步培养
从hESC扩增扩展系统收获的细胞可以进一步扩增为hESC 2D培养物。在下面的实例中，从hESC扩增扩展系统收获的细胞作为2D无饲养层传统培养被进一步培养。表16和图11中示出了培养参数(收获时的乳酸)以及在hESC扩增扩展系统中培养和作为2D培养物培养连续2代的细胞的形态。
表16.在hESC扩展系统中培养并进一步传代为2D培养物的细胞的培养参数和多能性标志物表达。
从hESC扩增扩展系统收获的细胞显示出高多能性标志物表达(对于所有测试标志物>94％)。此外，在两个2D进一步传代的培养物中观察到hESC的典型形态。完成了在iMatrix-511 E8直接包被的培养瓶上进一步培养从hESC扩增扩展系统收获的细胞。
从hESC扩增扩展收获的细胞的分化
多能干细胞的主要特征是分化成所有三个胚层的潜力。接种从hESC扩增扩展系统收获的细胞并根据已建立的方案将其分化为树突状细胞。分化结束时的树突细胞标志物表达示于表17中。
表17.从hESC扩展系统收获的细胞衍生的细胞的DC标志物表达。
沿树突状细胞分化过程中细胞的形态学评估如图2所示。
有效完成了从hESC扩增扩展系统收获的细胞向树突状细胞的分化。从hESC扩增扩展系统收获的细胞向任何谱系和细胞类型的分化可以假设能够在有或没有收获的情况下从hESC扩增扩展系统细胞实现。
Claims (34)
1.一种用于扩增和维持处于未分化、多能状态的人胚胎干细胞(hESC)的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在生长培养基中同时组合人胚胎干细胞、细胞外基质成分(ECM)和微载体以形成可悬浮的扩增复合物，和(b)将可悬浮的扩增复合物培养一段时间。
2.权利要求1的方法，其中所述微载体包括聚苯乙烯、交联葡聚糖、磁性颗粒、微芯片、纤维素、羟基化甲基丙烯酸酯、胶原蛋白、明胶、聚苯乙烯、塑料、玻璃、陶瓷、硅酮或其组合中的一种或多种。
3.权利要求1或2的方法，其中所述微载体是球形的、光滑的、大孔的、棒状的或其组合。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述ECM包括基质胶、层粘连蛋白、玻连蛋白、胶原蛋白、它们的衍生物或其组合。
5.权利要求1的方法，其中所述ECM是人层粘连蛋白。
6.权利要求5的方法，其中所述人层粘连蛋白是人层粘连蛋白511E8片段。
7.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述微载体是未经包被的。
8.权利要求1至7中任一项的方法，其中所述微载体与鱼精蛋白或聚赖氨酸偶联。
9.权利要求1至7中任一项的方法，其中所述微载体是中性的或带负电的。
10.权利要求9的方法，其中所述微载体是中性的。
11.权利要求9的方法，其中所述微载体是带负电的。
12.权利要求1至11中任一项的方法，其中所述微载体是亲水的。
13.权利要求1至12中任一项的方法，其中将所述可悬浮的扩增复合物培养至少约一天。
14.权利要求13的方法，其中将所述可悬浮的扩增复合物培养约一天至约十四天。
15.权利要求1的方法，其中收获可悬浮的扩增复合物的培养细胞并通过重复步骤(a)和(b)进一步扩增。
16.权利要求1的方法，其中收获可悬浮的扩增复合物的培养细胞并进一步分化。
17.权利要求16的方法，其中通过改变生长培养基进一步分化可悬浮的扩增复合物的培养细胞。
18.权利要求1的方法，其中所述可悬浮的扩增复合物的培养细胞保持未分化和多能性。
19.权利要求16的方法，其中未分化的细胞表达至少约80％的SSEA-5和TRA-1-60中的每一种。
20.权利要求16的方法，其中未分化的细胞表达至少约70％的Oct-4和Nanog中的每一种。
21.权利要求16的方法，其中未分化的细胞表达至少约80％的SSEA-5、至少约80％的TRA-1-60、至少约70％的Oct-4和至少约70％的Nanog。
22.一种可悬浮的扩增复合物组合物，其包含人胚胎干细胞、细胞外基质成分(ECM)和微载体。
23.权利要求22的组合物，其还包含生长培养基。
24.权利要求22或23的组合物，其中所述微载体包括聚苯乙烯、交联葡聚糖、磁性颗粒、微芯片、纤维素、羟基化甲基丙烯酸酯、胶原蛋白、明胶、聚苯乙烯、塑料、玻璃、陶瓷、硅酮中的一种或多种。
25.权利要求22至24中任一项的组合物，其中所述微载体是球形的、光滑的、大孔的、棒状的或其组合。
26.权利要求22至25中任一项的组合物，其中所述微载体包被有基质胶、层粘连蛋白、玻连蛋白、胶原蛋白、它们的衍生物或其组合。
27.权利要求26的组合物，其中所述层粘连蛋白是人层粘连蛋白。
28.权利要求27的组合物，其中所述人层粘连蛋白是人层粘连蛋白511E8片段。
29.权利要求22至28中任一项的组合物，其中所述微载体是未经包被的。
30.权利要求22至29中任一项的组合物，其中所述微载体与鱼精蛋白或聚赖氨酸偶联。
31.权利要求22至30中任一项的组合物，其中所述微载体是中性的或带负电的。
32.权利要求31的组合物，其中所述微载体是中性的。
33.权利要求31的组合物，其中所述微载体是带负电的。
34.权利要求22至29中任一项的组合物，其中所述微载体是亲水的。
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