CN102428172A - 多潜能和多能细胞在微载体上的培养 - Google Patents

Abstract

本发明公开了体外培养多潜能或多能细胞的方法，所述方法包括将多潜能或多能细胞连接到多个微载体上以形成微载体-细胞复合物，以及在存在ROCK抑制剂的情况下在悬浮培养中培养所述微载体-细胞复合物。

Description

多潜能和多能细胞在微载体上的培养

技术领域

本发明涉及在存在ROCK抑制剂的情况下多潜能和多能细胞在微载体上的培养。

背景技术

与分化的细胞不同，干细胞具有分裂和自我更新或分化成在表型和功能上不同的子细胞的能力(Keller，Genes Dev.2005；19：1129-1155；Wobus和Boheler，Physiol Rev.2005；85：635-678；Wiles，Methods in Enzymology.1993；225：900-918；Choi等人，Methods Mol Med.2005；105：359-368)。

人胚胎干细胞(hESC)是具有分化成多种干细胞类型的多潜能细胞。干细胞(如胚胎干细胞(ESC))的多潜能性和它们从所有三种胚层分化成细胞的能力使它们成为多种疾病和组织创伤的再生疗法的理想细胞来源(Keller，Genes Dev.2005；19：1129-1155；Wobus和Boheler，Physiol Rev.2005；85：635-678)。

干细胞扩增至较大量需要传代一次或多次，这是细胞疗法的必要条件。

目前，通常将作为集落生长的干细胞(包括人胚胎干细胞，hESC)以2维(2D)生长的方式维持在塑料培养表面上。在2D培养中扩增至较大量将需要使用较大表面积。通过反复吸取使细胞传代的人工操作本质或酶促处理将这些2D集落破碎至较小尺寸将是不实际的。准备用于接种大表面积的众多平板可能经历操作错误。此外，将需要如(例如)Nunc托盘的极大的表面积。

因此，当前以2D集落培养在涂覆的塑料表面上使干细胞生长的方法不适合于放大并且进行培养的实验条件一般不适合于进行良好控制。现有技术包括在三维(“3D”)环境中培养干细胞的多种尝试，如在悬浮培养中的微载体上。除了小鼠胚胎干细胞在微载体上(Fernandes等人，2007；Abranches等人，2007；King和Miller，2007)以及在悬浮培养中使hESC作为拟胚体分化(Dang等人，2004；Fok和Zandstra，2005；Cameron等人，2006)的一些研究以外，在悬浮培养中尚没有长期、连续培养hESC的稳健方法。

在本领域中，已知胚胎干细胞能够在悬浮培养中作为“拟胚体”分化。这些拟胚体包含大量已分化的细胞。例如，Gerecht Nir等人(2004)描述了使用旋转壁生物反应器来培养拟胚体。Zandstra等人(2003)、Dang等人(2004)和Wartenberg等人(1998)还显示了使用搅拌系统的拟胚体培养。Dang和Zandstra(2005)以及King和Miller(2007)还报道了拟胚体悬浮培养。这些技术适合于培养包含分化干细胞的这些组织样拟胚体聚集体，但是不适合于未分化的干细胞。

Fok和Zandstra(2005)描述了用于未分化小鼠胚胎干细胞(mESC)增殖的搅拌悬浮培养系统。该搅拌悬浮培养系统包含微载体和聚集体培养物。在玻璃微载体上培养的小鼠胚胎干细胞具有与组织培养瓶对照可比较的群体倍增时间。一旦除去白血病抑制因子，mESC聚集体将发育为能够多谱系分化的拟胚体(EB)。在King和Miller(2005)中还描述了小鼠ESC的悬浮培养。然而，King和Miller(2005)说明“未分化人ESC(hESC)的扩增比mESC更困难并且尚未在搅拌培养中有过报道”。

US2007/0264713(Terstegge)公开了在微载体上培养人胚胎干细胞的尝试。将人胚胎干细胞与Cytodex3(Amersham)微载体一起引入到加入不同体积的条件培养基的旋转器或生物反应器中。在1小时中，以20-30rmp搅拌培养物30分钟。将该培养物维持10天至6周的不同时间。然而，任何培养物均从未进行传代或继代，而传代或继代是干细胞大规模连续生产的必要要求。在微载体上连续传代的表现以及以“优良”(指数)生长率进行继代的能力是干细胞大规模生产的必要要求。这一点在Terstegge等人的工作中未得到体现。

WO2008/004990描述了在不存在饲养细胞的情况下培养干细胞的尝试以及对微载体使用的考虑。它与其中未使用Matrigel的培养有关。WO2008/004990描述了带正电荷的表面在抑制干细胞分化方面的作用。

在Phillips等人，2008(Journal of Biotechnology 138(2008)24-32)的报道中报道了通过接种聚集体以及单细胞在微载体上培养hESC的尝试。开始，在5天内实现了3倍扩增，然而，随着每次连续传代，细胞扩增下降直至6周后细胞不能传代为止。

使用可商购微载体(如Cytodex 1和3)放大培养人胚胎干细胞(hESC)的先前尝试是不成功的。hESC培养物在载体上死亡或分化并且不能增殖(Oh & Choo，2006)。

Watanabe等人和Harb等人提议使用ROCK抑制剂Y-27632作为能够允许解离的人胚胎干细胞在2D培养中存活的因子(Watanabe等人，AROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.Nature Biotechnology Vol.25 No.6 p681-686 June 2007；WO 2008/035110；Harb等人，The Rho-Rock-myosin Signaling Axis Determines Cell-CellIntegrity of Self-Renewing Pluripotent Stem Cells.PLoS ONE 3(8)：e3001.doi：10：1371/journal.pone.0003001)。

还研究了使用ROCK抑制剂作为可以改善人胚胎干细胞冷冻保存的试剂(Xiangyun Li等人，ROCK inhibitor improves survival of cryopreservedserum/feeder-free single human embryonic stem cells.Human Reproduction，Vol.24，No.3pp.580-589，2009；Martin-lbanez等人，Novel cryopreservationmethod for dissociated human embryonic stem cells in the presence of aROCK inhibitor.Human Reproduction.Vol.23.No.12 pp.2744-2754，2008；Claassen等人，ROCK Inhibition Enhances the Recovery and Growth ofCryopreserved Human Embryonic Stem Cells and Human Induced PluripotentStem Cells.Molecular Reproduction & Development 2009)。然而，在所有情况下，它均用于在Matrigel上的人胚胎干细胞的2D培养的背景下使用。

使用Matrigel涂覆的微载体，我们先前已通过连续传代在灵长类未分化的多潜能细胞(包括人胚胎干细胞和人诱导性多潜能细胞)的悬液中实现了稳定和连续的生长(在Oh等人，2009中有部分报道，并且在2009年3月17日提交的美国专利申请US 61/069694、2008年10月31日提交的US 61/110256、2009年1月29日提交的US 61/148064和2009年2月27日提交的US 61/155940中进一步加以说明)。然而，迄今为止，使用不具有细胞外基质衍生材料的表面涂层的微载体尚未获得该结果。

自此，Lock等人已说明了hESC在Matrigel涂敷的微载体上的生长，但是没有进行传代(Lock等人，expansion and Differentiation of HumanEmbyronic Stem Cells to Endoderm Progeny in a MicrocarrierStirred-Suspension Culture.Tissue Engineering：Part A Vol.15，No.002009)而Nie等人研究了hESC在具有基质涂层或饲养细胞层的微载体上的生长(Nie等人，Scalable Culture and Cryopreservation of Human EmbyronicStem Cells on microcarriers.Biotechnol.Prog.，2009，Vol.25，No.1)。

发明内容

本发明人现已发现在存在ROCK的情况下在不具有基质涂层的微载体上可以成功培养和传代多潜能干细胞，并同时维持所培养和传代细胞的多潜能状态。

本发明提供了在存在ROCK抑制剂的情况下，在体外培养中稳定并且长期培养多潜能和多能细胞的方法。

使用这种方法，已经使人胚胎干细胞扩增并传代，并且所扩增和传代的人胚胎干细胞群体的多潜能性已维持超过了至少9次传代。

因此，本发明的一个方面涉及在悬浮培养中多潜能或多能细胞在微载体上的生长和增殖。该方法可以包括通过一次或多次传代的培养，并同时保持细胞在培养中各自的多潜能或多能状态。在存在ROCK抑制剂的情况下进行培养，其中ROCK抑制剂可以作为培养补充剂或添加剂加入到培养基中。

通过在培养中加入ROCK抑制剂，本发明人发现不是必须用基质(例如，细胞外基质材料)涂覆微载体表面。到目前为止，已经认为这是维持悬浮微载体培养的多潜能或多能细胞，特别是人或灵长类胚胎干细胞以及人或灵长类诱导性多潜能细胞的多潜能或多能状态的必要要求。

用多潜能或多能细胞接种微载体。然后，在悬浮培养中培养微载体-细胞复合物，优选地以扩增在培养中的多潜能或多能细胞的数目。培养的细胞可以传代，并且还可以将传代的细胞接种在微载体上，例如，用于进一步的培养或用于分化。

以这种方式，可以通过多次传代，例如，至少2次传代来获得多潜能或多能细胞，其中所培养和传代的细胞保持各自的多潜能或多能状态。使用这种方法，在每次传代之间的每个培养循环中，观察到了多潜能或多能细胞的增殖并且它可以维持多次传代(至少9次)。

这种培养法允许在体外培养中使多潜能或多能细胞连续生长和传代，借此提供了用于将多潜能或多能细胞扩增至治疗有用数目的方法。

尽管多潜能或多能细胞在微载体上的连续传代通常将是优选的，但是作为本发明方法的一部分，可以将多潜能或多能细胞从微载体上的培养中转移到其它培养系统(例如，2D集落培养)中，然后返回悬浮微载体培养。

在一些实施方式中，用基质涂覆微载体，优选地，用具有细胞外组分的基质。在一些实施方式中，所述微载体是带正电荷的。所述方法优选地包括在传代之前，在每个培养循环期间将多潜能或多能细胞连接至微载体的步骤。允许在未涂敷的微载体上进行一些培养循环，而在涂覆基质的微载体上进行其它循环。

尽管多潜能或多能细胞在微载体上的连续传代通常将是优选的，但是作为本发明方法的一部分，可以将培养的细胞从微载体上的培养中转移到其它培养系统(例如，2D集落培养)中，然后返回悬浮微载体培养。

本发明的另一个方面涉及在存在ROCK抑制剂的情况下，悬浮培养中的连接到微载体上的多潜能或多能细胞的分化。

在一些实施方式中，通过使用如上所述的微载体培养法可以使多潜能或多能细胞生长至分化所需的细胞密度。一旦获得所需的细胞密度，可以改变培养条件以诱导连接至微载体的多潜能或多能细胞的分化。对于分化来说，与用于多潜能或多能细胞生长的那些相比，可以使用相同或不同的微载体。类似地，在使用基质涂层的情况下，可以使用相同或不同的基质涂层。例如，具有第一涂层的第一微载体可以用于多潜能或多能细胞的生长和增殖而具有第二涂层的第二微载体可以用于那些细胞的分化。第二微载体可以是未涂覆的或可以是涂覆基质的表面。

对于多潜能或多能细胞的增殖以及对于它们的分化来说，微载体培养的使用具有以下优势：不再需要重新接种分化培养，增殖培养提供了大量用于分化的多潜能或多能细胞以及通过改变培养条件便于从增殖向分化转变。

在其它实施方式中，通过其它培养法(例如，通过2D集落培养)，可以使用于分化的多潜能或多能细胞生长至所需的细胞密度。然后，将那些细胞连接到微载体上并在存在ROCK抑制剂的情况下，在诱导多潜能或多能细胞分化的条件下，在悬浮培养中进行培养。

在一些实施方式中，可以将已经历分化的多潜能或多能细胞(但优选地，未终末分化)连接到微载体上并且在存在ROCK抑制剂的情况下，在诱导细胞分化的条件下，在悬浮培养中进行培养。

在本发明的方法中，优选地允许ROCK抑制剂接触正在培养或分化的细胞。还优选地允许ROCK抑制剂接触连接了或要连接细胞的微载体。为了允许这种接触，优选液体、流体、凝胶或其它可流动的培养基。

在本发明的一个方面，提供了体外培养多潜能或多能细胞的方法，该方法包括：

(i)将多潜能或多能细胞连接到多个微载体上以形成微载体-细胞复合物，和

(ii)在存在ROCK抑制剂的情况下，在悬浮培养中培养该微载体-细胞复合物。

在一些实施方式中，该方法还包括使来自(ii)的培养的细胞传代，其中传代后的细胞是多潜能或多能的。

在一些实施方式中，该方法还包括：

(iii)使来自(ii)的培养的细胞传代；和

(iv)经过(through)至少2次传代，重复步骤(i)-(iii)，

其中在步骤(iv)之后培养的细胞是多潜能或多能的。在一些实施方式中，在每个重复周期中，从先前重复周期的步骤(iii)的传代细胞中获得了步骤(i)的干细胞。

在步骤(iv)中，可以经过下列之一重复步骤(i)-(iii)：至少传代3次、至少传代4次、至少传代5次、至少传代6次、至少传代7次、至少传代8次、至少传代9次、至少传代10次、至少传代11次、至少传代12次、至少传代13次、至少传代14次、至少传代15次、至少传代16次、至少传代17次、至少传代18次、至少传代19次、至少传代20次、至少传代21次、至少传代22次、至少传代23次、至少传代24次、至少传代25次、至少传代30次、至少传代40次、至少传代50次、至少传代60次、至少传代70次、至少传代80次、至少传代90次、至少传代100次。

在一些实施方式中，在步骤(ii)中，将细胞培养足以使培养中的细胞数目扩增的一段时间。在一些实施方式中，在步骤(iv)后，至少60％的培养的细胞是多潜能或多能的。在一些实施方式中，在步骤(iv)后，至少60％的培养的细胞表达Oct4、SSEA4、TRA-1-60和Mab84中的一种、两种、三种或全部。

在一些实施方式中，在规定的传代次数后，增殖细胞优选地保留了多潜能或多能细胞的至少一种生物活性。该生物活性可以选自：(i)多潜能标志物的表达、(ii)细胞存活率、(iii)正常染色体组型，(iv)分化为内胚层、外胚层或中胚层的能力。该生物活性可以包括多潜能标志物的表达，其选自：OCT-4、SSEA-4、TRA-1-60和Mab84。

在一些实施方式中，该方法包括在无血清培养基、或干细胞条件培养基(stem cell conditioned media)或无饲养细胞的条件下培养细胞。无饲养细胞的条件可以包括在悬浮培养中的微载体上不存在涂覆的饲养细胞和/或悬浮培养中完全不存在饲养细胞。

在一些实施方式中，还将饲养细胞连接到微载体上。在一些实施方式中，培养还包括连接到与多潜能或多能细胞所连接的微载体不同的微载体上的饲养细胞(或，培养还包括将饲养细胞连接到与多潜能或多能细胞所连接的微载体不同的微载体上)。

根据本发明的方法可以包括传代至替代培养系统(例如，2D培养)或从替代培养系统传代。细胞可以(例如)冻融储存以有利于在培养系统之间转移。

在一些实施方式中，可以在其它颗粒/表面上将多潜能或多能细胞培养有限的一段时间。例如，在回到存在ROCK抑制剂的微载体上的培养之前，可以在替代培养系统(例如，在2D培养)中将来自步骤(ii)或(iii)的多潜能或多能细胞培养有限的传代次数(例如，小于5次，更优选地，小于3次，更优选地，1次)。

在其它实施方式中，在回到根据本发明的悬浮培养之前，可以从该培养法中除去多潜能或多能细胞并(例如，作为冷冻细胞)保存。可以在存在ROCK抑制剂的情况下保存(例如，冷冻)细胞。

在这些实施方式中，回到根据本发明的悬浮培养中不需要回到相同的培养中。根据本发明的悬浮培养甚至可以在不同的地理位置上继续，例如，在细胞冷冻和运输后。

根据本发明的方法还可以包括将人胚胎干细胞与微载体分离的步骤。

在一些实施方式中，该方法包括诱导从培养中获得的多潜能或多能细胞分化的步骤。因此，在一些实施方式中，该方法包括将微载体-细胞复合物置于诱导这些细胞分化的条件下。

在一些实施方式中，该方法包括将获自该培养法的多潜能或多能细胞与微载体分离并且在诱导这些细胞分化的条件下在非微载体培养中培养所述分离的细胞的步骤。

在一些实施方式中，该方法还包括获自该培养法的多潜能或多能细胞的体外分化，其包括：

(a)将获自该培养法的多潜能或多能细胞连接到多个第二微载体上以形成微载体-细胞复合物，

(b)在诱导细胞分化的条件下，在悬浮培养中培养来自(a)的微载体-细胞复合物。

该方法还可以包括：

(c)将获自步骤(b)的分化的细胞连接到多个第三微载体上以形成微载体-细胞复合物；和

(d)在诱导已分化细胞再分化的条件下，在悬浮培养中培养来自(c)的微载体-细胞复合物。

在一些实施方式中，分化培养条件包括在存在ROCK抑制剂的情况下培养细胞。

在其它实施方式中，分化培养条件包括在不存在ROCK抑制剂的情况下培养细胞。

提供了通过本发明方法获得的多潜能或多能细胞。还提供了通过本发明方法获得的分化细胞。在一些实施方式中，培养通过本发明方法获得的分化细胞以形成拟胚体。因此，还提供了由此所获得的拟胚体(embryoidbody)。

在本发明的一个方面，提供了使多潜能或多能细胞体外分化的方法，该方法包括将多潜能或多能细胞连接到多个微载体上以形成微载体-细胞复合物，其中微载体的表面未涂覆或涂覆了基质；和在存在ROCK抑制剂的情况下并且在诱导细胞分化的条件下，在悬浮培养中培养微载体-细胞复合物。

在本发明的另一个方面，提供了多潜能或多能细胞的悬浮培养，其中将所述细胞连接到多个微载体上，借此形成了微载体-细胞复合物，并且所述悬浮培养基包含ROCK抑制剂。

在一些实施方式中，提供了用于使多潜能或多能细胞增殖(包括悬浮培养)的容器(例如，生物反应器)或装置。所述悬浮培养可以是旋转悬浮培养(spinner suspension culture)。

在一些实施方式中，ROCK抑制剂以下列一种浓度存在于培养基中：至少1μM、至少2μM、至少3μM、至少4μM、至少5μM、至少6μM、至少7μM、至少8μM、至少9μM、至少10μM、至少15μM、至少20μM、至少30μM、至少40μM或至少50μM。ROCK抑制剂可以任选地以小于下列一种浓度存在于培养基中：100μM、90μM、80μM、70μM或60μM。

在本发明的其它方面，提供了ROCK抑制剂在多潜能或多能细胞的体外悬浮培养中的应用，其中这些细胞处于微载体-细胞复合物的形式。

在本发明的另一个方面，提供了ROCK抑制剂在体外悬浮培养的多潜能或多能细胞的分化中的应用，其中这些细胞处于微载体-细胞复合物的形式。

在本发明的其它方面，提供了使多潜能或多能细胞增殖的方法，该方法包括以下步骤：

(a)提供微载体；

(b)使多潜能或多能细胞连接至所述微载体；和

(c)使在其上连接有多潜能或多能细胞的微载体聚集以由此使多潜能或多能细胞增殖，

其中在步骤(a)、(b)或(c)的一个或多个步骤中或全部步骤中，将微载体和/或细胞与ROCK抑制剂接触。

在本发明的另一个方面，提供了使多潜能或多能细胞增殖的方法，该方法包括：

(a)提供连接至第一微载体的第一多潜能或多能细胞；

(b)提供连接至第二微载体的第二多潜能或多能细胞；

(c)使第一多潜能或多能细胞与第二多潜能或多能细胞接触以形成细胞聚集体；和

(d)在存在ROCK抑制剂的情况下，培养该聚集体以使多潜能或多能细胞增殖至少1代。

在本发明的另一个方面，提供了使多潜能或多能细胞增殖的方法，该方法包括以下步骤：

(a)提供其上连接了多潜能或多能细胞的第一微载体；

(b)使第一微载体与包含与其连接的第二多潜能或多能细胞的第二微载体接触以形成聚集体；和

(c)在存在ROCK抑制剂的情况下，培养该聚集体。

在本发明的另一个方面，提供了使多潜能或多能细胞增殖的方法，该方法包括以下步骤：

(a)提供具有与其连接的多潜能或多能细胞的多个微载体；

(b)使所述多个微载体聚集以形成聚集体；和

(c)在存在ROCK抑制剂的情况下，培养该聚集体。

在本发明的方面和实施方式中，ROCK抑制剂优选地选自：Y-27632、HA-1077(法舒地尔)、HA-1100(羟基法舒地尔)、H-1152、3-(4-吡啶基)-1H-吲哚、N-(4-吡啶基)-N′-(2，4，6-三氯苯基)脲、金硫葡糖(Aurothioglucose)、LY294002或其盐、碱、酯或前药。

在优选的实施方式中，所述微载体不具有基质涂层。

在其它实施方式中，微载体的表面可以涂覆基质。所述基质可以包括细胞外基质组分并且可以是MatrigelTm(BD Biosciences)、透明质酸、层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、胶原、弹性蛋白、硫酸乙酰肝素(硫酸肝素，heparan sulphate)、葡聚糖、硫酸葡聚糖、硫酸软骨素中的一种或多种。所述基质可以包括层粘连蛋白、I型胶原、硫酸乙酰肝素蛋白多糖和内功素1(entactin 1，内动蛋白1)的混合物。

在一些实施方式中，多潜能或多能细胞是干细胞，并且可以是胚胎干细胞、诱导性多潜能干细胞或成体干细胞。所述细胞可以是哺乳动物(例如，兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其它啮齿动物(包括来自啮齿目中任何动物的细胞)、猫、狗、猪、绵羊、山羊、牛、马、非人哺乳动物、非人灵长类)、灵长类或人。

在本发明的方面和实施方式中，所述微载体可以包括纤维素、葡聚糖、羟基化甲基丙烯酸酯、胶原、明胶、聚苯乙烯、塑料、玻璃、陶瓷、硅酮中的一种或多种或者由其组成。可替换地，微载体可以是大孔或微孔Carboseed微载体。

在一些实施方式中，微载体偶联了鱼精蛋白或聚赖氨酸。在一些实施方式中，微载体是带正电荷的。在一些实施方式中，微载体带有表面正电荷。在一些实施方式中，微载体是亲水性的。在一些实施方式中，微载体是杆状的。在其它实施方式中，微载体具有基本球形形状。

根据本发明的方法可以包括细胞培养的连续或间歇搅拌，例如，从约5至约200rpm、从约5至约150rpm、从约5至约100rpm、约30rpm或以上，或约50rpm或以上，或约100rpm或以上。可替换地，这些方法可以包括静态培养。

在一些实施方式中，搅拌速率或量的提高可以用于诱导细胞分化，然而较低的搅拌速率或量可以用于使多潜能或多能细胞群体扩增而不诱导显著分化。

为了培养多潜能或多能细胞群体而不诱导显著分化，可以采用从约5rpm至约100rpm、从约5rpm至约50rpm、从约5rpm至约40rpm、从约5rpm至约30rpm、从约5rpm至约25rpm、从约5rpm至约20rpm、从约5rpm至约15rpm、从约5rpm至约10rpm的转速对培养物进行搅拌。

对于显著分化的诱导来说，可以采用从约25rpm至约200rpm或以上的转速对培养物进行搅拌，例如，从约30rpm至约200rpm或以上、从约35rpm至约200rpm或以上、从约40rpm至约200rpm或以上、从约45rpm至约200rpm或以上、从约50rpm至约200rpm或以上、从约75rpm至约200rpm或以上、从约100rpm至约200rpm或以上。

细胞的显著分化可以包括至少约10％的培养的细胞分化的情况。可替换地，这可以是其中约15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％中至少之一的培养(或在培养中)的细胞分化的情况。

因此，本发明的方法可以包括以第一搅拌速率或量进行方法的第一部分以培养细胞并同时保持它们的多潜能或多能状态，然后进行其中以第二搅拌速率或量来培养细胞以使在培养中的细胞分化的第二部分。第一速率或量优选地小于第二速率或量。因此，该方法的第一部分可以使多潜能或多能细胞群体扩增而该方法的第二部分可以开始那些细胞的一些或全部向内胚层、外胚层或中胚层系分化的过程。

在本发明的其它方面，提供了对需要治疗的个体中的疾病进行治疗的方法，该方法包括根据本文所述的方法使多潜能或多能细胞增殖，产生分化的细胞或拟胚体并且将该多潜能或多能干细胞、分化的细胞或拟胚体施用到所述个体中。

具体实施方式

在以下所附说明中说明了本发明的一个或多个实施方式的详细信息，举例来说，包括本发明人对实施本发明所考虑的最佳方式的具体详细信息。对于本领域技术人员显而易见的是可以在不受这些具体详细信息的限制的情况下实践本发明。

结果总结

我们已开发了在不存在基质涂层(例如，Matrigel)的情况下，使用多种微载体(DE53、QA52、Tosoh、Cytodex 1、Cytodex 3)在存在ROCK抑制剂补充剂(例如，Y27632、HA1077(法舒地尔)或金硫葡糖)的情况下在微载体上培养hESC连续传代超过5次的方法。传代5次或5次以上后，hESC保持了它们的生长、最终细胞密度、多潜能标志物Oct4、Mab84和TRA-1-60的表达以及正常染色体组型。

这改善了我们在使用一系列微载体涂层的情况下使用微载体培养多潜能和多能细胞的早期工作(在Oh等人，2009中有部分报道并且在2009年3月17日提交的美国专利申请US 61/069694、2008年10月31日提交的US 61/110256、2009年1月29日提交的US 61/148064和2009年2月27日提交的US 61/155940中进一步说明，所有文献作为参考并入本文)。

由于不再需要用Matrigel、动物来源基质或其它细胞外基质组分涂覆微载体以实现多潜能hESC的扩增和分化，因此本发明方法是特别有前途的。这将有助于开发在研究、治疗和诊断应用中使用的扩增和分化hESC以及其它多潜能和多能细胞的符合GMP的方法。

具体地，我们已表明：

1、使用ROCK抑制剂Y-27632，在纤维素DE53微载体上将hESC长期培养9周(传代9次)(图1)。

2、使用ROCK抑制剂Y-27632，在球形Tosoh微载体上将hESC长期培养6周(传代6次)(图4)。

3、使用ROCK抑制剂Y-27632，将hESC在纤维素DE53、Tosoh、Cytodex 1和Cytodex 3微载体上长期培养5周(传代5次)之间的比较。

4、使用ROCK抑制剂Y-27632，在5至10周之间在纤维素DE53、QA52、Tosoh和Cytodex 3微载体上的hESC的正常染色体组型(图10和11)。

5、使用替代ROCK抑制剂HA1077(法舒地尔)和金硫葡糖，在纤维素DE53微载体上将hESC培养2周(图12-14)。

干细胞的悬浮培养和传代

我们先前已证明在具有基质涂层的颗粒上培养、增殖和传代灵长类和人干细胞和iPS细胞是可能的。具体地，我们已表明干细胞可以在悬浮培养中在基质涂覆的微载体上连续生长和传代。

我们现在描述了在存在ROCK抑制剂的情况下在悬液中使干细胞增殖的方法。所述增殖方法可以包括使干细胞生长、增殖、繁殖、培养、扩增或增加。如下所述，增殖的干细胞能够传代1次或以上。可以通过使用具有某些性质的微载体或颗粒实现这种增殖。微载体或颗粒可以包含电荷。微载体或颗粒可以任选地包含涂层。其它性质可以包括尺寸。

增殖干细胞的方法可以包括提供颗粒的步骤。所述颗粒可以是未涂覆的或可以包含涂覆其上的基质。它们可以具有正电荷。颗粒可以具有允许与其连接的灵长类或人干细胞聚集的尺寸。允许干细胞连接到所述颗粒上。允许在不同颗粒上生长的细胞彼此接触并形成聚集体。培养物传代至少1个传代。可以使用与载体连接的干细胞或与它们分离或分开的干细胞。它们可以以未分化或多潜能状态或以两种状态使用，或者可以分化成所需的细胞类型。它们可以用于形成拟胚体。

为了使颗粒支持连续生长，它们应具有与灵长类或人干细胞的尺寸相适应的尺寸，如10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、110μm、120μm、130μm、140μm、150μm、160μm、170μm、180μm、190μm、200μm、210μm、220μm、230μm、240μm、250μm等。灵长类或人干细胞在具有这种尺寸水平的颗粒上的培养将能够使细胞在其上生长以彼此聚集并支持连续生长。以下进一步详细说明了颗粒的适合组合物、形状和尺寸。

实施例显示可以将干细胞培养(如人胚胎干细胞2D集落培养)接种到微载体颗粒上并在存在ROCK抑制剂的情况下通过一次或多次传代来生长数代。可以通过如机械或酶促解离或两种方法组合的任何方式从表面移出而使干细胞传代。

在颗粒上，微载体颗粒培养物可以世代生长。可替换地或另外，培养物可以在常规2D培养上生长一代或多代。可以将在微载体上生长的人干细胞转移回到2D集落培养中，反之亦然。

本发明所述的方法是未分化形式的干细胞的有效增殖的可用方法。可以通过机械或酶促解离以1∶2至1∶10的分种率(比常规2D培养可能的比值要高)将微载体培养传代到微载体上。这使得能够以更快速的扩大培养来更有效地利用生物材料。

微载体培养中的细胞体积得率通常是2D集落对照的2至4倍。通过本发明所述的方法增殖的人干细胞的体积得率可以高达200万个细胞/毫升或以上。

本发明所述的方法能够使人干细胞在颗粒之间传代9次或以上，如下文中将进一步详细说明的。

本发明所述的方法能够使保持其多潜能特征的干细胞增殖。实施例显示根据本发明所述的方法和组合物所增殖的人胚胎干细胞能够维持干细胞的一种或多种生物学特征。因此，增殖的干细胞显示了对于5次或以上的传代多潜能标志物(Oct-4、Tra-1-60和mAb 84)的表达，这与作为2D集落培养所生长的干细胞等同，并且增殖的干细胞保留了正常染色体组型。

显著地，通过将干细胞锚定在微载体上，有可能在较大规模的转瓶中使细胞连续传代。

可以使用本发明所述的方法使任何干细胞增殖。这些可以包括灵长类干细胞，如猴、猿或人干细胞。所述干细胞可以包括胚胎干细胞或成体干细胞。所述干细胞可以包括诱导性多潜能干细胞。例如，所述干细胞可以包括人胚胎干细胞(hESC)。在下文中将进一步详细说明适合在本发明所述方法和组合物中使用的这些和其它干细胞。与已知的“2D”培养法相比，本发明所述的方法和组合物具有多种优势。所述颗粒在连接干细胞方面比2D集落培养基底更有效。出于这种及其它原因，悬浮培养的细胞能够更有效地传代。本发明所述的方法能够使干细胞冻融(冷冻和解冻)几个循环。它们可以直接在微载体上冷冻并融化到生长培养基(无论是常规平板培养或是在颗粒微载体上)中。在微载体上增殖的干细胞可以在符合GMP的无血清培养基中生长。

本发明所述的方法基本能够培养和维持未分化状态的干细胞，如胚胎干细胞。培养(例如，在微载体上)的或从其上分离的增殖的干细胞可以是部分或完全分化的。

增殖的干细胞可以用于形成拟胚体以备今后使用。与需要在拟胚体形成之前从2D生长表面上除去细胞的额外步骤的在先方法不同，可以简单地将在微载体上生长的干细胞转移到分化培养基中以直接形成拟胚体。

因此，本发明所述的方法和组合物能够使生长表面或基底上的干细胞定向分化而不需要将干细胞从生长表面或基底中除去。

本发明所述的方法和组合物能够使培养的干细胞扩增并放大至较大体积。放大至生物反应器或工业规模使得能够更高产地培养干细胞。在搅拌培养中，使干细胞能够在微载体上生长的能力意味着可以将培养放大至悬浮条件。可以使用如Wave生物反应器的可控生物反应器或搅拌培养。与当前锚定依赖性2维集落培养的限制相比，这使得细胞能够在较大的体积中扩增。在高达100升的生物反应器中进行大规模悬浮培养是有可能的。

ROCK抑制剂

根据本发明的方法涉及在存在ROCK抑制剂的情况下，多潜能或多能细胞的培养、生长、增殖、繁殖、群体扩增和/或分化。

ρ激酶(ρ-相关卷曲螺旋激酶或ROCK；GenBank登录号：No.NM_005406)、丝氨酸/苏氨酸激酶，用作ρ的靶蛋白(其中存在三种同种型ρA、ρB和ρC)并且已被鉴定为形成ρA诱导性应力纤维和局部粘附的介体。

最初ROCK I(可替换地，称为ROK b)和ROCK II(还被称为ρ激酶或ROK a)被分离出来作为ρA-GTP相互作用蛋白。这两种激酶在人中具有64％的整体同一性，其中催化激酶域中的同一性为89％。两种激酶均含有卷曲螺旋区(55％的同一性)和被C1保守区分开的血小板-白细胞C激酶底物同源性(PH)域(80％的同一性)。有关ROCK激酶抑制的综述，参见Olson等人(Current Opinion in Cell Biology 2008，20：242-248，其作为参考并入本文)。

通过下游靶蛋白的磷酸化作用，ROCK促进肌动蛋白-肌球蛋白-介导的收缩力的产生。ROCK使LIM激酶-1和激酶-2(LIMK1和LIMK2)在它们的激活环中的保守苏氨酸处发生磷酸化，从而提高了LIMK活力，并且随后使丝切蛋白磷酸化，从而阻断了它们的纤维型肌动蛋白切割活力。ROCK还直接使MLC磷酸酶的调控肌球蛋白轻链(MLC)和肌球蛋白结合亚基(MYPT1)磷酸化以抑制催化活力。ROCK的激活导致发生了促进作用力产生和形态变化的一系列事件。这些事件直接促使多个肌动蛋白-肌球蛋白介导的过程，如细胞运动、粘附、平滑肌收缩、轴突回缩和噬菌作用。另外，ROCK激酶在繁殖、分化、细胞凋亡和致癌性转化中起作用，尽管这些应答可以是细胞类型依赖性的。

在本说明书中，“ROCK抑制剂”是能够抑制ROCK I和/或ROCK II的分子、化合物、物质或组合物，并且优选地具有小于100μM的IC₅₀，更优选地，小于10μM，更优选地，小于1μM，并且更优选地，小于900nM或者小于或等于约800nM、700nM、600nM或500nM之一。在本发明中有用的ROCK激酶的IC₅₀可以与Y-27632的基本相同或更优(即，更小)或者在Y-27632的IC₅₀(500nM)之内，如在相同ROCK激酶测定中所测量的。

在本说明书中，“ROCK抑制剂”还指金硫葡糖和LY294002，其主要已知是NFκB和PI3激酶的抑制剂。照此，在本发明所述的方面和实施方式中的ROCK抑制剂的使用包括NFκB和/或PI3激酶的抑制剂的使用。

在本领域中，ROCK激酶抑制测定是熟知的。例如，

ROCK2激酶测定试剂盒#7508(Cell Signalling Technology，Inc.)和ROCK-II测定试剂盒产物No.R8163和R8164(Molecular Devices)。

在本发明的方法中，加入到培养中的ROCK抑制剂的量通常将考虑生产商的说明书和培养规模。例如，ROCK抑制剂的典型浓度将在10-50μM的范围内。可以将ROCK抑制剂定期加入到培养基中(例如，每日一次)以维持所需的浓度。

可以将ROCK抑制剂加入到培养基中从而使培养基中ROCK抑制剂的浓度为下列之一：至少1μM、至少2μM、至少3μM、至少4μM、至少5μM、至少6μM、至少7μM、至少8μM、至少9μM、至少10μM、至少15μM、至少20μM、至少30μM、至少40μM或至少50μM。ROCK抑制剂可以任选地以小于下列之一的浓度存在于培养基中：100μM、90μM、80μM、70μM或60μM。

ROCK抑制剂可以作为活性剂的盐、碱、酯或前体药物提供。

ROCK抑制剂的实例包括：

(A)Y-27632

Y-27632是ROCK I和ROCK II的高效、细胞可渗透、选择性和ATP竞争性抑制剂，其IC₅₀为约800nM并且具有结构(1)，如下：

Y-27632通常作为二盐酸化物[(R)-(+)-反式-N-(4-吡啶基)-4-(1-氨乙基)-环己烷羧酰胺.2HCl]生产和销售。

在下列发表的论文中对Y-27632进行了综述，所有文献作为参考并入本文：

·Calcium sensitization of smooth muscle mediated by a Rho-associatedprotein kinase in hypertension：M.Uehata，et al.；Nature 389，990(1997)

·Molecular dissection of the Rho-associated protein kinase(p160ROCK)-regulated neurite remodeling in neuroblastoma N1 E-115 cells：M.Hirose，et al.；J.Cell Biol.141，1625(1998)

·Signaling from Rho to the actin cytoskeleton through protein kinasesROCK and LIM-kinase：M.Maekawa，et al.；Science 285，895(1999)

·Specificity and mechanism of action of some commonly used proteinkinase inhibitors：S.P.Davies，et al.；Biochem.J.351，95(2000)

·Use and properties of ROCK-specific inhibitor Y-27632：S.Narumiya，et al.；Meth.Enzymol.325，273(2000)

·Pharmacological properties of Y-27632，a specific inhibitor ofrho-associated kinases：T.Ishizaki，et al.；Mol.Pharmacol.57，976(2000)

·A p160ROCK-specific inhibitor，Y-27632，attenuates rat hepatic stellatecell growth：H.Iwamoto，et al.；J.Hepatol.32，762(2000)

·Y-27632，an inhibitor of rho-associated protein kinase，suppressestumor cell invasion via regulation of focal adhesion and focal adhesion kinase：F.Imamura，et al.；Jpn.J.Cancer Res.91，811(2000)·The effect of a Rhokinase inhibitor Y-27632 on superoxide production，aggregation and adhesionin human polymorphonuclear leukocytes：A.Kawaguchi，et al.；Eur.J.Pharmacol.403，203(2000)

·Antagonism of Rho-kinase stimulates rat penile erection via a nitricoxide-independent pathway：K.Chitaley，et al.；Nat.Med.7，119(2001)

·Inhibition of intrahepatic metastasis of human hepatocellular carcinomaby Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632：M.Takamura，et al.；Hepatology 33，577(2001)

·Inhibition of high K+-induced contraction by the ROCKs inhibitorY-27632 in vascular smooth muscle：possible involvement of ROCKs in asignal transduction pathway：K.Sakamoto，et al.；J.Pharmacol.Sci.92，56(2003).

(B)HA-1077(法舒地尔)

HA-1077是肌球蛋白轻链激酶和Ca²⁺/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II的抑制剂。它抑制PKCβI、PKCβII和PKCζ的易位并且是具有抗血管痉挛性质的细胞可渗透Ca²⁺拮抗剂。它的分子量为约291.36。它通过与ATP竞争抑制ROCK。对于ROCK 1的IC₅₀为1.2mmmol/l，而对于ROCK2的IC₅₀为0.82mmol/l。它还对其它丝氨酸/苏氨酸激酶具有非特异性抑制作用，例如，对于PKA的IC₅₀为5.3mmol/l，对于PKCa的IC₅₀＞100mmol/l。该二盐酸化物具有结构(2)，如下：

在下列发表的论文中对HA-1077进行了综述，所有文献作为参考并入本文：

·The effects of an intracellular calcium antagonist HA 1077 on delayedcerebral vasospasm in dogs：O.Shibuya，et al.；Acta Neurochir.90，53(1988)

·Vasodilator actions of HA1077 in vitro and in vivo putatively mediatedby the inhibition of protein kinase：T.Asano，et al.；Br.J.Pharmacol.98，1091(1989).

(C)HA-1100(羟基法舒地尔)

HA-1100是起到ρ激酶(ROCK)的ATP竞争性和可逆性抑制剂作用的HA-1077的细胞可渗透羟基化代谢产物，它比MLCK、MRCKβ和PKC的选择性大大约100倍。分子量为约343.8。它对ROCK的选择性抑制作用比法舒地尔更强：对于ROCK 1的IC₅₀为0.73mmmol/l，而对于ROCK2的IC₅₀为0.72mmol/l。它还对其它丝氨酸/苏氨酸激酶具有非特异性抑制作用，例如，对于PKA的IC₅₀为37mmol/l，而对于PKCa的IC₅₀＞100mmol/l。该盐酸盐具有结构(3)，如下：

在下列发表的论文中对HA-1100进行了综述，所有文献作为参考并入本文：

·Rho-kinase-mediated pathway induces enhanced myosin light chainphosphorylations in a swine model of coronary artery spasm：H.Shimokawa，et al.；Cardiovasc.Res.43，1029(1999)

·Hydroxyfasudil，an active metabolite of fasudil，hydrochloride，relaxesthe rabbit basilar artery by disinhibition of myosin light chain phosphatase：K.Nakamura，et al.；J.Cereb.Blood Flow Metab.21，876(2001)

·Pravastatin enhanced BMP-2 and osteocalcin expression by inhibitionof Rho-associated kinase in human osteoblasts：K.Ohnaka，et al.；BBRC 287，337(2001)

·Antianginal effects of hydroxyfasudil，a Rho-kinase inhibitor，in acanine model of effort angina：T.Utsunomiya，et al.；Br.J.Pharmacol.134，1724(2001).

(D)H-1152(ρ激酶抑制剂I)

H-1152[(S)-(+)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹唑基)磺酰基]高哌嗪]是ρ激酶(ROCK)的细胞可渗透、高特异性、有效和ATP竞争性抑制剂(Ki＝1.6nM)。它比Y-27632的效力和选择性更强。K_i ROCK为1.6nM(K_iPKA：630nM，K_i PKC：9.27μM，K_i MLCK：10.1μM)。分子量为约392.3。H-1152的二盐酸化物具有结构(4)，如下：

在下列发表的论文中对HA-1152进行了综述，所有文献作为参考并入本文：

·Inhibition of rho-kinase-induced myristoylated alanine-rich C kinasesubstrate(MARCKS)phosphorylation in human neuronal cells by H-1152，anovel and specific Rho-kinase inhibitor：M.Ikenoya，et al.；J.Neurochem.81，9(2002)

·The novel and specific Rho-kinase inhibitor(S)-(+)-2-methyl-1-[(4-methyl-5-isoquinoline)sulfonyl]-homopiperazine as aprobing molecule for Rho-kinase-involved pathway：Y.Sasaki，et al.；Pharmacol.Ther.93，225(2002)

·New aspects of neurotransmitter release and exocytosis：Rho-kinase-dependent myristoylated alanine-rich C-kinase substratephosphorylation and regulation of neurofilament structure in neuronal cells：Y.Sasaki；J.Pharmacol.Sci.93，35(2003)

·Protein kinase A in complex with Rho-kinase inhibitors Y-27632，Fasudil，and H-1152P：structural basis of selectivity：C.Breitenlechner，et al.；Structure 11，1595(2003)βInvolvement of Rho-kinase in inflammatory andneuropathic pain through phosphorylation of myristoylated alanine-richC-kinase substrate(MARCKS)：S.Tatsumi，et al.；Neuroscience 131，491(2005)

·Rho-kinase mediates spinal nitric oxide formation by prostaglandin E2via EP3 subtype：S.Matsumura，et al.；BBRC 338，550(2005).

(E)3-(4-吡啶基)-1H-吲哚

3-(4-吡啶基)-1H-吲哚是ρ激酶(ROCK)的细胞可渗透、选择性和ATP竞争性抑制剂(IC₅₀＝25μM)，表明不如Y-27632有效并且具有结构(5)，如下：

在下列发表的论文中综述了3-(4-吡啶基)-1H-吲哚，所有文献作为参考并入本文：

·Screening for cell migration inhibitors via automated microscopyreveals a Rho-kinase inhibitor：J.C.Yarrow，et al.；Chem.Biol.12，385(2005)

·Scratch n′screen for inhibitors of cell migration：J.Soderholm & R.Heald；Chem.Biol.12，263(2005).

(F)N-(4-吡啶基)-N′-(2，4，6-三氯苯基)脲(ρ激酶抑制剂II)

N-(4-吡啶基)-N′-(2，4，6-三氯苯基)脲是ρ激酶(ROCK)的有效、选择性和ATP竞争性抑制剂(IC₅₀＝0.2μM)，其具有结构(6)，如下：

在下列发表的论文中综述了N-(4-吡啶基)-N′-(2，4，6-三氯苯基)脲，所有文献作为参考并入本文：

·Design and synthesis of Rho kinase inhibitors(I)：A.Takami，et al.；Bioorg.Med.Chem.12，2115(2004).

(G)金硫葡糖

金硫葡糖，也称为硫代葡萄糖金，其化学式为AuSC₆H₁₁O₅：

金硫葡糖是PKCiota-Par6相互作用抑制剂。破坏这种相互作用会破坏在肺非小细胞癌中转化生长所需的Rac1信号途径。IC₅₀：1μM。

金硫葡糖通过起IL-1功能性拮抗剂的作用来抑制诱导性NF-κB和AP-1活力。

金硫葡糖在降低由关节炎引起的炎症和肿胀方面的作用是已知的。并且已在成人或儿童类风湿性关节炎的早期治疗中使用。

包括金硫葡糖(ATG)在内的含金(I)化合物是几种含硒代半胱氨酸的酶的有效体外抑制剂。(Smith et al J Nutr.1999 Jan；129(1)：194-8)。金硫葡糖参与蛋白激酶C介导的抑制(Stallings-Mann M et al.A novelsmall-molecule inhibitor of protein kinase C blocks transformed growth ofnon-small cell lung cancer cells.Cancer Res 2006；66：1767-74和BeverlyA.Teicher.Protein Kinase C as a Therapeutic Target.Clin Cancer Res 2006；12(18)September 15，2006)。

通过起到IL-1功能性拮抗剂的作用，金硫葡糖已表现出对诱导性NF-κB和AP-1活力的抑制(Williams，D H；Jeffery，L J；Murray，E JBiochim-Biophys-Acta.1992 Oct 13；1180(1)：9-14)。

金硫葡糖还已表现出对TPA诱导性NF-κB核易位的抑制(YamashitaM et al.Inhibition of TPA-induced NF-kappaB nuclear translocation andproduction of NO and PGE2 by the anti-rheumatic gold compounds.J PharmPharmacol.2003 Feb；55(2)：245-51)。

(H)LY294002

LY294002具有结构(7)，如下：

LY294002(磷脂酰肌醇3激酶抑制剂)已表现出在体内作为磷脂酰肌醇3(PI3)激酶的高选择性抑制剂来起作用。以50μM的浓度使用，它特异地消除了PI3激酶活力(IC₅₀＝0.43μg/ml；1.40μM)，但不抑制其它脂肪和蛋白激酶，如PI4激酶、PKC、MAP激酶或c-Src(Vlahos，C.(1994)J.Biol.Chem.269，5241-5248)。

其它ROCK抑制剂包括Wf-536(Nakajima et al.，Cancer ChemotherPharmacol.52(4)：319-324(2003))和Y-30141(参见US 5478838)以及ROCK的反义核酸、ROCK的RNA干扰核酸(例如，siRNA)。

正电荷

颗粒或微载体可以在(例如)中性pH或生理学相关pH(如pH7.4或pH7.2)下包含正电荷。所述颗粒可以包括如阴离子交换树脂的色谱树脂。

正电荷的量可以是不同的，但在一些实施方式中，正电荷的量设计为足够高以使细胞能够连接到颗粒上。例如，在通过偶联胺(如季胺或叔胺)使颗粒带电的情况下，颗粒上的电荷可以对应于每克(颗粒)干材料具有约0.5至4毫当量的低离子交换容量，例如，每克(颗粒)干材料具有约1至3.5毫当量或每克(颗粒)干材料具有约1至2毫当量。

正电荷可以使颗粒pKa大于7(例如，大于7.4，例如，7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5或以上)。

可以通过(例如)以高达20mg/ml颗粒的浓度偶联硫酸鱼精蛋白或聚L-赖氨酸氢溴化物使颗粒衍生化。

不希望受理论的束缚，我们相信颗粒上存在正电荷有助于细胞与颗粒的连接。

颗粒可以通过本领域已知的任何方式携带正电荷。颗粒可以包含带正电荷的基团，或它可以衍生化以携带这些基团。

颗粒可以包含二乙氨乙基纤维素(DEAE-纤维素)或其衍生物。DEAE纤维素包含微晶粒状纤维素，其已被化学修饰从而使碳水化合物的-CH₂OH基团转化为可离子化的叔胺基基团。它在中性pH时带正电。

颗粒可以包括Sephadex珠，如DEAE-Sephadex。颗粒可以包括可以通过共价键交联的琼脂糖珠，如Sepharose(即，DEAE-Sepharose)。颗粒可以包括DEAE-Sephacel。DEAE-Sepharose、DEAE-Sephacel和DEAE-Sephadex可获自Sigma-Aldrich。颗粒可以包括Q-Sepharose FastFlow或S-Sepharose Fast Flow。Q-Sepharose的带电基团是携带非可滴定正电荷的季铵。

颗粒可以衍生化以携带正电荷。例如，颗粒可以包含连接其上的胺基。胺基可以是伯胺基、仲胺基、叔胺基或季胺基。可以通过将颗粒与含胺化合物偶联来将胺基连接到颗粒上。偶联方法在本领域是熟知的。例如，可以通过使用溴化氰将胺偶联到颗粒上。也可以使用交联剂。这些交联剂被分为含有两个相同的反应性基团的均双功能交联剂或具有两个不同的反应性基团的杂双功能交联剂。杂双功能交联剂允许顺序结合，从而使聚合反应最小化。偶联和交联剂可以获自多个生产商，例如，获自Calbiochem或Pierce Chemical Company。在偶联之前，可以使颗粒活化以提高其反应性。可以使用氯乙酸活化致密颗粒，然后使用EDAC/NHS-OH偶联。还可以使用己烷二异氰酸酯活化颗粒以提供伯胺基。可以结合任何杂双功能交联剂使用这些活化的颗粒。在某些实施方式中，使用二乙烯砜活化致密颗粒。这些活化的致密颗粒包含可以与(例如)肽上的氨基或巯基反应的部分。

还可以使用三氟代乙烷磺酰氯活化颗粒，从而提供能够与氨基或巯基反应的部分。还可以使用氯化氰活化颗粒，从而提供可以与氨基或巯基反应的部分。

Cytodex 1是基于用带正电荷的N，N-二乙氨基乙基基团取代的交联葡聚糖基质。带电基团分布在整个微载体基质上。

不带电颗粒

颗粒或微载体可以是不带电的，或者在(例如)中性pH或生理学相关pH(如pH7.4或pH7.2)为电中性。

不带电的颗粒的实例包括明胶或胶原颗粒。例如，Cytodex 3是由化学偶联至交联葡聚糖基质上的变性胶原的薄层组成的。

基质涂层

本发明的核心在于本发明人发现使用ROCK抑制剂使得能够在微载体上无基质涂层的情况下使多潜能和多能细胞在微载体上成功培养和传代。直到现在，认为多潜能和多能细胞的微载体培养需要微载体具有基质涂层，而本发明使无涂层微载体培养成为可能，这更符合GMP。因此，在多个实施方式中，微载体是未涂覆的，或者不具有基质涂层但是可以另外地涂覆或衍生化从而为微载体表面提供电荷。然而，在其它实施方式中，如下所述，有可能包含基质涂层。

因此，可以用基质涂覆颗粒，在本文件的背景下，所述基质是指连接到颗粒上(如在其表面上)的物质层(例如，薄层或薄膜)。基质可以包括能够支持细胞生长的生物学或相容的或生理学相关的基质。它可以包括用于细胞生长的基底。

基质可以包括细胞外基质(ECM)组分。可以使用ECM的任何已知组分，如能够支持干细胞生长的那些组分。在本领域中，细胞外基质组分是已知的，并且在(例如)Alberts等人，(2002)，Molecular Biology of the Cell的第四章中以及其中所引用的参考文献中有所说明。

可以通过传统方法将ECM组分连接或偶联或涂覆到颗粒上。例如，上述任何偶联剂和交联剂均可以用于将ECM组分偶联到颗粒上。

ECM组分可以包括大分子，如多糖、蛋白质、蛋白多糖、糖蛋白、糖胺聚糖(GAG)(通常以蛋白多糖的形式共价连接到蛋白质上)、纤维状蛋白质，包括弹性蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白、胶原(例如，I型胶原、III型胶原、IV型胶原、VI型胶原)等。

基质涂层可以包含糖胺聚糖(GAG)。糖胺聚糖包括由重复二糖单元组成的无支链多糖链。重复二糖中的两个糖中的一个始终是氨基糖(N-乙酰葡萄糖胺或N-乙酰半乳糖胺)，在大多数情况下，它是硫酸盐。第二个糖通常是糖醛酸(葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸)。

基质涂层可以包括透明质酸(hyaluronan)(还称为透明质酸(hyaluronic acid)或透明质酸盐)或其衍生物。透明质酸可以来源于多个来源，如牛玻璃体液。可以使用透明质酸的盐或碱，如透明质酸钠。这可以来源于链球菌属(streptococcus)。

基质涂层可以包含层粘连蛋白。基质涂层可以包含纤连蛋白。基质涂层可以包含玻连蛋白。

基质涂层可以包含(例如)GAG，如硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素和硫酸角质素，例如，像蛋白多糖一样连接至蛋白质。ECM组分可以包含聚集蛋白聚糖、核心蛋白聚糖等。

基质涂层可以包含乙酰肝素或其衍生物，如碱或盐。基质涂层可以包含硫酸乙酰肝素蛋白多糖。硫酸乙酰肝素蛋白多糖可以来源于多个来源，如牛肾。

基质涂层可以包含葡聚糖，如硫酸葡聚糖或硫酸葡聚糖钠。基质涂层可以包含纤连蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白或IV型胶原。基质涂层可以包含硫酸软骨素。

基质可以包含明胶、聚鸟氨酸或纤连蛋白的RGD结合域的结合基序。

基质涂层可以包含以多种比例混合的这些组分中任意两种或多种的混合物。基质涂层可以包含纯化的或基本纯化的ECM组分。基质组分可以包括部分纯化的ECM组分。它可以包括ECM提取物，如Matrigel。

细胞培养可以包括具有不同基质涂层的颗粒。例如，具有选自上述那些的第一基质涂层的第一颗粒群体和具有选自上述那些的第二涂层的第二颗粒群体。

Matrigel

可以用包括Matrigel在内的基质涂层涂覆颗粒。

Matrigel是小鼠肿瘤细胞分泌的凝胶状蛋白质混合物的商标名并且由BD Biosciences(Bedford，Massachusetts，USA)上市销售。该混合物类似于在多种组织中存在的复杂细胞外环境并且被细胞生物学家用作细胞培养的基底。

BD Matrigel^TM基质是从EHS小鼠肉瘤(富含ECM蛋白的肿瘤)中提取的溶解的基底膜制剂。其主要成分是层粘连蛋白(约56％)、然后是IV型胶原(约31％)、硫酸乙酰肝素蛋白多糖和内功素1(约8％)。在室温下，BD Matrigel^TM基质聚合以产生类似于哺乳动物细胞基底膜的生物学活性基质材料。

常规实验室程序是将小体积的冷却的(4℃)Matrigel分散到如塑料组织培养用实验室器皿的表面上。当在37℃(体温)培育时，Matrigel蛋白自组装，从而产生了覆盖所述表面的薄膜。

Matrigel提供了相对于细胞形态、生物化学功能、迁移或侵袭以及基因表达来说的生理学相关环境。

Matrigel刺激复杂细胞行为的能力是由其不均匀的成分所造成的。Matrigel的主要成分是结构蛋白，如层粘连蛋白和胶原，其为培养的细胞提供了它们在天然环境中会遇到的粘附肽序列。还提供了促进多种细胞类型分化和增殖的生长因子。Matrigel包含下列生长因子(浓度范围，平均浓度)：EGF(0.5-1.3ng/ml，0.7ng/ml)、bFGF(＜0.1-0.2pg/ml，未知)、NGF(＜0.2ng/ml，未知)、PDGF(5-48pg/ml，12pg/ml)、IGF-1(11-24ng/ml，16ng/ml)、TGF-β(1.7-4.7ng/ml，2.3ng/ml)。Matrigel含有多种少量的其它蛋白。

替代基质涂层

在一些实施方式中，在转移到具有不同(第二)基质涂层的颗粒上传代1次或更多次(例如，传代1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次或更多次)之前，可以在具有第一基质涂层的颗粒上培养细胞传代1次或更多次(例如，传代1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次或更多次)。任选地，然后可以将细胞转移到具有不同于第二涂层的基质涂层的颗粒上，例如，回到第一基质涂层或另一基质涂层或未涂覆颗粒。

颗粒组成

在本发明所述的方法和组合物中，将干细胞在颗粒或微载体上增殖。如本文档中所使用的术语，“颗粒”包括可以连接或生长干细胞的任何支持物。颗粒可以具有任何形状或构造，如下所述。

颗粒可以包括微载体，如IUPAC化学术语总目录(第二版，1992，第64卷，第160页)中所述的。

颗粒可以包括任何材料，只要它具有使它能够起到上述目的的物理性质，例如，作为干细胞的附着点或支持物。因此，出于此目的，颗粒可以包括坚硬、刚性、可锻、固体、多孔或另外的材料。它可以包括固体材料或半固体、凝胶等材料。

材料至少是反应性的以允许连接正电荷和/或基质涂层，或者能够通过活化剂使其具有反应性，但是另外可以包括一般的惰性物质。颗粒可以包括复合物，从而可以由不止一种材料组成该颗粒。例如，颗粒的芯可以包括与表面部分不同的材料。因此，颗粒的芯可以包括一般惰性材料，而表面部分可以包括对于连接或化学偶联基质或正电荷具有反应性的材料。颗粒可以是天然来源的或合成的。在本领域中，天然和合成材料以及用于获得它们的来源是熟知的。颗粒可以具有至少一些机械抗性，至少一些抗化学腐蚀能力或耐热处理能力，或者这些的任意组合。

在替代实施方式中，颗粒可以包括“非生物”物体，通过该术语表示不含或基本不含细胞材料的颗粒。因此，这种非生物或非细胞颗粒可以包括合成材料或非天然存在的材料。具有多种形状的多种颗粒在本领域中是已知的，并且包括(例如)多种类型的珠。颗粒的实施方式包括微珠，如琼脂糖珠、聚丙烯酰胺珠、硅胶珠等。例如，制备颗粒的材料可以包括塑料、玻璃、陶瓷、硅酮、明胶、葡聚糖、纤维素、羟基化甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯、胶原或其它材料。例如，颗粒可以由纤维素或衍生物制成，如DEAE-纤维素(如下所述)。颗粒可以包括纤维素、修饰的亲水珠和碳基微载体。

颗粒可以包括可商购的基质或载体，如珠或微珠。颗粒可以包括作为色谱基质用途出售的树脂，如阴离子交换树脂。

颗粒可以包括纤维素微载体。颗粒可以包括DE-52(Whatman)、DE-53(Whatman)或QA-52(Whatman)。颗粒可以包括亲水性微载体、羟基化甲基丙烯酸基质微载体或衍生化的亲水性珠微载体。颗粒可以包括TSKgel Tresyl-5Pw(Tosoh)或Toyopearl AF-Tresyl-650(Tosoh)。颗粒可以包括大孔或微孔Carboseed微载体，例如，SM1010(Blue Membranes)或SH1010(Blue Membranes)。

颗粒可以是葡聚糖基微载体。颗粒可以包括Cytodex 1(GEHealthcare)或Cytodex 3(GE Healthcare)。Cytodex 1是基于用带正电荷的N，N-二乙氨基乙基基团取代的交联葡聚糖基质。带电基团分布在整个微载体基质上。Cytodex 3是由化学偶联至交联葡聚糖基质上的变性胶原的薄层组成的。

颗粒可以是聚苯乙烯基微载体。颗粒可以包括Hillex或Hillex II(SoloHill Engineering，Inc)。Hillex和Hillex II是修饰的聚苯乙烯微载体，其具有阳离子三甲基铵涂层。

在允许细胞在其上生长之前，可以处理颗粒。这种处理可以设法实现更大的粘附性、电荷可用性、生物相容性等，如在本文档的其它部分中所述的。

如DE-53、DE-52和QA-52的纤维素微载体可以是杆状的。

细胞培养可以包括不止一种类型的颗粒的混合物。例如，第一颗粒群体(例如，致密形状颗粒)和第二颗粒群体(例如，细长形状颗粒)。在一些实施方式中，可以将第一细胞类型(例如，饲养细胞)连接到第一颗粒上，并且可以将第二细胞类型(例如，hESC)连接到第二颗粒上。每种颗粒类型可以具有相同或不同的基质涂层。任选地，一种或两种颗粒类型可以不具有基质涂层。

珠

适合使用的珠或微珠包括用于凝胶色谱的那些，例如，凝胶过滤介质，如Sephadex。这类适合的微珠包括珠尺寸为40-120μm的Sephadex G-10(Sigma Aldrich产品目录号27103-9)、珠尺寸40-120μm的Sephadex G-15(Sigma Aldrich产品目录号27104-7)、珠尺寸20-50μm的Sephadex G-25(Sigma Aldrich产品目录号27106-3)、珠尺寸20-80μm的Sephadex G-25(Sigma Aldrich产品目录号27107-1)、珠尺寸50-150μm的Sephadex G-25(Sigma Aldrich产品目录号27109-8)、珠尺寸100-300μm的Sephadex G-25(Sigma Aldrich产品目录号27110-1)、珠尺寸20-50μm的Sephadex G-50(Sigma Aldrich产品目录号27112-8)、珠尺寸20-80μm的Sephadex G-50(Sigma Aldrich产品目录号27113-6)、珠尺寸50-150μm的Sephadex G-50(Sigma Aldrich产品目录号27114-4)、珠尺寸100-300μm的Sephadex G-50(Sigma Aldrich产品目录号27115-2)、珠尺寸20-50μm的Sephadex G-75(Sigma Aldrich产品目录号27116-0)、珠尺寸40-120μm的Sephadex G-75(Sigma Aldrich产品目录号27117-9)、珠尺寸20-50μm的Sephadex G-100(Sigma Aldrich产品目录号27118-7)、珠尺寸40-120μm的Sephadex G-100(Sigma Aldrich产品目录号27119-5)、珠尺寸40-120μm的Sephadex G-150(Sigma Aldrich产品目录号27121-7)和珠尺寸40-120μm的SephadexG-200(Sigma Aldrich产品目录号27123-3)，只要它们在尺寸方面是相容的，如在本文档的其它部分中所解释的。

例如，还可以使用如在液相色谱中所使用的Sepharose珠。实例为Q-Sepharose、S-Sepharose和SP-Sepharose珠，例如，以Q Sepharose XL(产品目录号17-5072-01)、Q Sepharose XL(产品目录号17-5072-04)、QSepharose XL(产品目录号17-5072-60)、SP Sepharose XL(产品目录号17-5073-01)、SP Sepharose XL(产品目录号17-5073-04)和SP Sepharose XL(产品目录号17-5073-60)等获自Amersham Biosciences Europe GmbH(Freiburg，Germany)。

颗粒形状

颗粒可以包括适合细胞生长的任何形状，例如，紧凑(紧密)形状或细长形状。

紧凑形状

紧凑形状的实例一般为球形颗粒、椭圆形颗粒或粒状颗粒。

我们用“紧凑”表示一般不是细长的形状。换言之，“紧凑”形状是一般为非细长或不延伸的那些形状，或在任何一个方向上不延伸的那些形状。紧凑形状可以是一般不铺开，或者不长或不细长的一种形状。因此，这些“紧凑形状”一般具有一般可以是类似的或差别不大的线性尺寸。

因此，紧凑形状的任何两个尺寸的比值可以是5∶1或更小，如4∶1或更小，如3∶1、2.5∶1、2.4∶1、2.3∶1、2.2∶1、2.1∶1、2∶1、1.9∶1、1.8∶1、1.7∶1、1.6∶1、1.5∶1、1.4∶1、1.3∶1、1.2∶1、1.1∶1或更小。例如，没有两对尺寸可以具有5∶1或更大的比值。

在一些实施方式中，紧凑形状的最大尺寸(最长尺寸)小于紧凑形状的最小尺寸(最短尺寸)的五倍。在其它实施方式中，紧凑形状的最大尺寸(最长尺寸)并未明显大于最小尺寸(最短尺寸)，即，该形状是相对均一的。

如本文档中所使用的术语，“最大尺寸”应认为是表示长轴的长度，即，包含通过该颗粒可以画出的最长线的轴。类似地，“最小尺寸”是短轴的长度，它是包含通过该颗粒可以画出的最短线的轴。

本发明所述的紧凑颗粒包括其中线性尺寸大致相等或相当，或其中最大尺寸与最小尺寸的比值小于5∶1的规则形状。因此，以上的比值可以与最大尺寸与最小尺寸的比值有关。在一些实施方式中，两个尺寸(如最大尺寸与最小尺寸)的比值小于1.1∶1，如1∶1(即，规则或均一形状)。

因此，适用时，颗粒的长度可以小于其宽度或直径的5倍，如小于其宽度或直径的4倍，如小于3倍，如小于2倍或更小。

紧凑形状可以包括规则实心体、球体、球状体、扁球状体、扁平球状体、椭圆体、立方体、圆锥体、圆柱体或多面体。多面体包括简单多面体或正多面体。多面体包括(例如)六面体、含孔多面体(holyhedron)、长方体、三角多面体、五面体、十四面体、多面体、四角折纸形(tetraflexagon)、偏方三八面体、截多面体、网格球顶、七面体和六十面体。可以使用任何上述形状从而根据以上所提供的定义，它们是“紧凑的”。例如，在所述形状包括扁球状体的情况下，这种形状具有适当的扁率从而使该球状体是紧凑的而不是细长的。

在一些实施方式中，只要尺寸如以上所提供的，则紧凑形状可以包括气球形、雪茄形、香肠形、圆盘形、泪滴形、球形或椭圆形。紧凑形状还可以包括球形、立方体形、长方体形、瓦片形、卵形、椭圆体形、圆盘形、细胞形、药丸形、胶囊形、扁平圆柱形、豆形、水滴形、球形、豌豆形、颗粒形等。

细长形状

颗粒可以具有一般的细长形状。细长形状的实例一般为棒形颗粒、圆柱形颗粒或棍形颗粒。细长颗粒可以包括空心纤维。

我们用“细长”表示一般不紧凑的形状。换言之，“细长”形状是相对于另一个尺寸，在一个尺寸上一般地延伸的那些形状。细长形状可以是铺开的、长或细长的一种形状。因此，这些“细长形状”一般具有一般彼此相差达到一定程度的线性尺寸。

因此，细长形状的任何两个尺寸的比值可以为5∶1或以上，4∶1或以下，如1.1∶1或以上、1.2∶1或以上、1.3∶1或以上、1.4∶1或以上、1.5∶1或以上、1.6∶1或以上、1.7∶1或以上、1.8∶1或以上、1.9∶1或以上、2∶1或以上、2.1∶1或以上、2.2∶1或以上、2.3∶1或以上、2.4∶1或以上、2.5∶1或以上、3∶1或以上、4∶1或以上或5∶1或以上。

例如，任何两对尺寸可以具有5∶1或以上的比值。因此，在一些实施方式中，细长形状的最大尺寸大于细长形状最小尺寸的五倍。

因此，适用时，颗粒的长度可以大于其宽度或直径的2倍，如大于其宽度或直径的3倍，如大于4倍，如大于5倍或大于10倍。

对于在本发明方法中的使用来说，细长或杆形微载体是特别优选的。据观察它们提供了产生细胞-微载体聚集体的更好连接基质。同时未被理论限制或束缚，应认为与珠(球形)微载体相比，杆形微载体的长轴提供了良好的连接，这是由于可用于连接的较大表面积使细胞-载体能够在几小时内聚集并且在搅拌期间是稳定的。

颗粒尺寸

为了使颗粒支持连续生长，它们可以具有使细胞能够在颗粒上生长的尺寸。颗粒的尺寸还使细胞能够与在其它颗粒上生长的其它细胞聚集。例如，对于颗粒尺寸来说，它可能必须使得至少一个尺寸与灵长类或人干细胞的尺寸相容。

可以通过选择颗粒，使干细胞连接并生长，并且测定任何多个参数，如生长、活力、干细胞生物特征的保留、染色体组型等来经验性地选择颗粒尺寸。

举例来说，颗粒可以包括紧凑微载体，其具有一般球形或粒状形状。在这种情况下，紧凑微载体可以具有范围在约20μm至约250μm之间的尺寸。

紧凑微载体的尺寸范围的上限可以为约250μm、约240μm、约230μm、约220μm、约210μm、约200μm、约190μm、约180μm、约170μm、约160μm、约150μm、约140μm、约130μm、约120μm、约110μm、约100μm、约90μm、约80μm、约70μm、约60μm、约50μm、约40μm或约30μm。

紧凑微载体的尺寸范围的下限可以为约20μm、约30μm、40μm、约50μm、约60μm、约70μm、约80μm、约90μm、约100μm或约110μm。

紧凑微载体可以具有120μm至20μm、110μm至30μm、100μm至40μm、90μm至50μm、80μm至40μm、70μm至50μm或90至30μm、80至40μm、70至40μm、70至30μm、60至40μm、60至30μm、60至50μm、50至40μm、50至30μm、50至5μm、50至10μm、60至10μm、70至10μm、60至20μm、70至20μm之间的尺寸。

紧凑微载体可以具有约20μm、约30μm、40μm、约50μm、约60μm、约65μm、约70μm、约80μm、约90μm、约100μm、约110μm或约120μm的尺寸。

紧凑微载体的尺寸可以(例如)为约65μm。

该尺寸可以是微载体的直径。

紧凑颗粒可以(例如)包括亲水性微载体、羟基化甲基丙烯酸基质微载体或衍生化的亲水性珠状微载体，如TSKgel Tresyl-5Pw(Tosoh)或Toyopearl AF-Tresyl-650(Tosoh)。有关TSKgel Tresyl-5Pw的信息可以在：http://www.separations.us.tosohbioscience.com/Products/HPLCColumns/ByM  ode/Affinity/TSKgel+Tresyl-5PW.htm中查找到。

有关Toyopearl AF-Tresyl-650的信息可以在http://www.separations.us.tosohbioscience.com/Products/ProcessMedia/ByMo  de/AFC/ToyopearlAF-Tresyl-650.htm中查找到。

如另一个实例，颗粒可以包括具有一般杆形或圆柱形的细长微载体。在这种情况下，细长微载体可以具有范围在约400μm至约50μm之间的最大尺寸。

细长微载体的最大尺寸范围的上限可以为约2000μm、约1900μm、约1800μm、约1700μm、约1600μm、约1500μm、约1400μm、约1300μm、约1200μm、约1100μm、约1000μm、约900μm、约800μm、约700μm、约600μm、约500μm、约400μm、约390μm、约380μm、约370μm、约360μm、约350μm、约340μm、约330μm、约320μm、约310μm、约300μm、约290μm、约280μm、约270μm、约260μm、约250μm、约240μm、约230μm、约220μm、约210μm、约200μm、约190μm、约180μm、约170μm、约160μm、约150μm、约140μm、约130μm、约120μm、约110μm、约100μm、约90μm、约80μm、约70μm、约60μm或约50μm。

细长微载体的最大尺寸范围的下限可以为约20μm、约30μm、约40μm、约50μm、约60μm、约70μm、约80μm、约90μm、约100μm、约110μm、约120μm、约130μm、约140μm、约150μm、约160μm、约170μm、约180μm、约190μm、约200μm、约210μm、约220μm、约230μm、约240μm、约250μm、约260μm、约270μm、约280μm、约290μm、约300μm、约310μm、约320μm、约330μm、约340μm、约350μm、约360μm、约370μm、约380μm或约390μm。

细长微载体可以具有2000μm至20μm之间的最大尺寸，例如，400μm至50μm之间、390μm至60μm之间、380μm至70μm之间、370μm至80μm之间、360μm至90μm之间、350μm至100μm之间、340μm至110μm之间、330μm至120μm之间、320μm至130μm之间、310μm至140μm之间、300μm至150μm之间、290μm至160μm之间、280μm至170μm之间、270μm至180μm之间、260μm至190μm之间、250μm至200μm之间、240μm至210μm之间或230μm至220μm之间。细长微载体的最大尺寸可以(例如)为约190μm、200μm、210μm、220μm等。

细长微载体可以具有范围在10μm至50μm之间的最小尺寸。细长微载体可以具有约10μm、约15μm、约20μm、约25μm、约30μm、约35μm、约40μm或约45μm的最小尺寸。

细长微载体可以是圆柱形或杆形，其具有大致为圆形或椭圆形的横截面，其最小直径可以在约5μm至约50μm的范围内，例如，约10μm、约15μm、约20μm、约25μm、约30μm、约35μm、约40μm或约45μm中的一个。所述直径可以是以下范围之一：约5μm至20μm、约10μm至25μm、约15μm至30μm、约20μm至35μm、约25μm至40μm、约30μm至45μm、约35μm至50μm。

细长颗粒可以(例如)包括纤维素圆柱形微载体，如DE-52(Whatman)、DE-53(Whatman)或QA-52(Whatman)。

任何所给出的微载体的大小和尺寸在批次内或批次之间可以是不同的。例如，对于DE-53杆形纤维素微载体，我们测量了一批内的微载体的长度和直径并且发现载体长度可以在50至250μm之间(平均长度为130±50μm)而载体直径可以在17μm到至少50μm之间(平均直径为35±7μm)。

颗粒可以是多孔或无孔的。多孔颗粒使培养基能够在生长区域内或通过生长区域循环，并且这可以辅助细胞生长。例如，颗粒可以包括大孔或微孔carboseed微载体。颗粒可以包括SM1010(Blue Membranes)或SH1010(Blue Membranes)。

干细胞培养

例如，如在实施例中所说明的，可以在本发明所述的方法和组合物中使用培养干细胞的任何适合的方法。

可以使用任何适合的容器来根据本发明所述的方法和组合物使干细胞增殖。适合的容器包括在美国专利公开US2007/0264713(Terstegge)中所述的那些。

例如，容器可以包括生物反应器和旋转器。如在本文中所使用的术语，“生物反应器”是适合于(如)大规模培养真核细胞(例如，动物细胞或哺乳动物细胞)的容器。调控的生物反应器的典型培养体积在20ml至500ml之间。

生物反应器可以包括调控的生物反应器，其中可以控制或监视一种或多种条件，例如，氧分压。用于测量和调控这些条件的装置在本领域中是已知的。例如，氧电极可以用于氧分压。可以通过所选气体混合物(例如，空气或者空气和/或氧和/或氮和/或二氧化碳的混合物)的量和组成来调控氧分压。Bailey，J E.(Bailey，J E.，Biochemical Engineering Fundamentals，第二版，McGraw-Hill，Inc.ISBN 0-07-003212-2 Higher Education，(1986))或Jackson A T.(Jackson A T.，Verfahrenstechnik in der Biotechnologie，Springer，ISBN 3540561900(1993))说明了适合用于测量和调控氧分压的装置。其它适合的容器包括旋转器。旋转器是调控或未调控的生物反应器，其可以使用多种搅拌机构进行搅拌，如玻璃珠搅拌器、叶轮搅拌器及其它适合的搅拌器。旋转器的培养体积通常在20ml至500ml之间。滚瓶是由塑料或玻璃制成的圆形细胞培养瓶，具有400至2000cm²的培养面积。沿着这些烧瓶的整个内表面培养细胞；通过“滚动”运动(即，围绕它们自身各自的轴转动瓶)完成了用培养基对细胞的涂覆。

可替换地，培养可以静态的，即，不使用培养/培养基主动搅拌的情况。通过减少对培养的搅拌，可以允许形成细胞/微载体聚集体。虽然可以使用一些搅拌来促进培养基相对于培养细胞的分布和流动，但是可以应用这种搅拌从而基本上不破坏聚集体形成。例如，可以使用低rpm搅拌，例如，小于30rpm或小于20rpm。

传代增殖

本发明所述的方法和组合物可以包括培养期间的传代或分种(splitting)。这些方法可以包括连续或持续传代。

我们用“持续”或“连续”表示我们的方法使干细胞能够以使它们传代的方式在微载体上生长，例如，从它们正在生长的微载体上取下并转移到其它微载体或颗粒上，并且可以将该过程重复至少一次，例如，两次、三次、四次、五次等(如以下所说明的)。在一些情况下，该过程可以(例如)无限期地或无限地重复任意次数。最优选地，该过程重复5次或以上，例如，6次或以上、7次或以上、8次或以上、9次或以上、10次或以上、11次或以上、12次或以上、13次或以上、14次或以上、15次或以上、16次或以上、17次或以上、18次或以上、19次或以上、20次或以上、21次或以上、22次或以上、23次或以上、24次或以上、25次或以上。术语“持续”或“连续”还可以用于表示事件(如细胞生长)基本不被打断的延续。例如，我们的方法使干细胞能够扩增至任何所需的代数，而不需要终止生长或培养。

可以将培养的细胞从基底或烧瓶中分离，并通过稀释到组织培养基中并重新铺板来“分种”、继代培养或传代。

在颗粒上生长的细胞可以传代回到颗粒培养上。可替换地，它们可以传代回到传统(2D)培养上。可以将在平板上生长的组织培养细胞传代到颗粒培养上。在下文中将更详细地说明这些方法中的每一种。

术语“传代”一般可以表示取出细胞培养等份，完全或部分分离细胞，稀释并接种到培养基中的过程。可以重复传代一次或多次。所述等份可以包含细胞培养的全部或部分。所述等份中的细胞可以是完全、部分或没有汇合的。传代可以包括下列步骤顺序中的至少一些：吸取、清洗、胰酶消化、培育、移去、抑制、再接种和等分。可以使用Hedrick Lab，UC San Diego所发表的规程(http://hedricklab.ucsd.edu/Protocol/COSCell.html)。

可以通过任何适合的方法分离细胞，如在本领域中已知的机械或酶促方式。可以通过机械分离来分散细胞，例如，使用细胞刮刀或移液管。可以通过用适合的筛网尺寸进行筛分来分离细胞，如通过100微米或500微米筛网。可以通过酶促分离来使细胞分开，例如，通过用收获的胶原酶或trypLE处理。所述分离可以是完全的或部分的。

所述稀释可以是任何适合的稀释。细胞培养中的细胞可以以任何适合的比值分种(split)。例如，细胞可以以1∶2或以上、1∶3或以上、1∶4或以上或1∶5或以上的比值分种。细胞可以以1∶6或以上、1∶7或以上、1∶8或以上、1∶9或以上或1∶10或以上的比值分种。分种比可以是1∶10或以上。它可以是1∶11、1∶12、1∶13、1∶14、1∶15、1∶16、1∶17、1∶18、1∶19或1∶20或以上。分种比可以是1∶21、1∶22、1∶23、1∶24、1∶25或1∶26或以上。

因此，干细胞可以传代1次或以上。例如，干细胞可以传代2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25次或以上。干细胞可以传代25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95次或以上。干细胞可以在培养中无限期地增殖。

传代可以表示为细胞生长的代。我们的方法和组合物允许干细胞增殖1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25代或以上。干细胞可以生长25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95代或以上。

传代还可以表示为细胞倍增次数。我们的方法和组合物允许干细胞增殖至细胞倍增1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25次或以上。干细胞可以生长至细胞倍增25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95次或以上。

干细胞可以培养传代5次以上(5代或以上或细胞倍增5次或以上)、传代10次以上(10代或以上或细胞倍增10次或以上)、传代15次以上(15代或以上或细胞倍增15次或以上)、传代20次以上(20代或以上或细胞倍增20次或以上)、传代25次以上(25代或以上或细胞倍增25次或以上)、传代30次以上(30代或以上或细胞倍增30次或以上)、传代40次以上(40代或以上或细胞倍增40次或以上)、传代45次以上(45代或以上或细胞倍增45次或以上)、传代50次以上(50代或以上或细胞倍增50次或以上)、传代100次以上(100代或以上或细胞倍增100次或以上)、传代200次以上(200代或以上或细胞倍增200次或以上)、传代500次以上(500代或以上或细胞倍增500次或以上)、传代800次以上(800代或以上或细胞倍增800次或以上)。干细胞可以维持传代100、200、500次或以上(100、200、500代或以上或细胞倍增100、200、500次或以上)。

生长和产率

本发明所述的方法和组合物能够使干细胞大量生产。

所述方法可以使培养的干细胞指数生长。指数生长可以伴随或可以不伴随停滞期。指数生长可以构成培养细胞生长的一部分或基本生长期。评价指数生长的方法在本领域中是已知的。

例如，细胞的比生长速率可以按照下式计算：

$\mathrm{\μ}=\frac{(\ln x1-\ln x2)}{t1-t2}$

其中x＝细胞浓度，t＝时间。

与常规2D培养法(例如，平板培养)相比，本发明所述的方法和组合物可以使细胞生长的产率更大。例如，我们的方法的体积产率可以为1×10⁶个细胞/孔或以上，如2.5×10⁶个细胞/孔或以上，例如，3、4、5、6或7×10⁶个细胞/孔或以上。孔可以具有约3.5cm的直径或约9.5cm²的面积。我们的方法的体积产率可以为100万个细胞/ml或以上，如200万个细胞/ml或以上，250万个细胞/ml或以上、300万个细胞/ml或以上、350万个细胞/ml或以上，100万个细胞/ml或以上，如400万个细胞/ml或以上、450万个细胞/ml或以上、500万个细胞/ml或以上。

干细胞特征的维持

增殖的干细胞可以保留哺乳动物、灵长类或人干细胞的至少一种特征。干细胞可以在传代1次或多次后保留该特征。它们可以在传代多次后保留该特征。它们可以在如上所述的指明的传代次数后保留该特征。

该特征可以包括形态学特征、免疫组织化学特征、分子生物学特征等。该特征可以包括生物活力。

干细胞特征

通过我们的方法增殖的干细胞可以表现出任何下列干细胞特性。

干细胞可以表现出Oct4和/或SSEA-1和/或TRA-1-60和/或Mab84表达的提高。与未自我更新的干细胞相比，自我更新的干细胞可以表现出缩短的细胞周期。

干细胞可以表现出限定的形态。例如，在标准显微图像的平面中，人胚胎干细胞在图像平面中表现出高核/质比、明显的核以及具有难以辨别的细胞连接的紧凑集落形成。

干细胞的特征还可以在于如下文中进一步详细说明的表达的细胞标志物。

多潜能标志物的表达

所保留的生物活力可以包括一种或多种多潜能标志物的表达。

阶段特异性胚胎抗原(SSEA)是某些胚细胞类型的特征。SSEA标志物的抗体可获自Developmental Studies Hybridoma Bank(Bethesda Md.)。其它有用的标志物通过使用表示为Tra-1-60和Tra-1-81的抗体可检测(Andrews等人，Cell Lines from Human Germ Cell Tumors，in E.J.Robertson，1987，如上所述)。人胚胎干细胞通常是SSEA-1阴性的和SSEA-4阳性的。hEG细胞通常是SSEA-1阳性的。灵长类多潜能干细胞(pPS)的分化在体外导致SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81表达的缺失以及SSEA-1表达的提高。pPS细胞的特征还可以在于存在碱性磷酸酶活力，其可以通过用4％多聚甲醛固定，然后用Vector Red作为底物显像来进行检测，如生产商(Vector Laboratories，Burlingame Calif.)所述的。

胚胎干细胞通常还是端粒酶阳性的和OCT-4阳性的。可以使用可商购的试剂盒(TRAPeze.RTM.XK端粒酶检测试剂盒，产品目录号s7707；Intergen Co.，Purchase N.Y.；或TeloTAGGG.Tm.Telomerase PCR ELISA plus，产品目录号201389；Roche Diagnostics，Indianapolis)使用TRAP活力测定确定端粒酶活力(Kim等人，Science 266：2011，1997)。还可以通过RT-PCR在mRNA水平上评价hTERT表达。LightCycler TeloTAGGG.TM.hTERT定量试剂盒(产品目录号：3012344；Roche Diagnostics)可商购获得用于研究目的。

增殖的干细胞可以保留这些多潜能标志物中的任何一种或多种，其包括FOXD3、PODXL、碱性磷酸酶、OCT-4、SSEA-4、TRA-1-60和Mab84等。

可以通过本领域中任何已知的方式来实现标志物检测，例如，通过免疫学方法。可以使用组织化学染色、流式细胞术(FACS)、蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)等。

可以使用流动免疫细胞化学来检测细胞表面标志物。可以将(例如，固定的细胞或组织切片的)免疫组织化学可以被用于细胞内或细胞表面标志物。可以对细胞提取物实施蛋白质印记分析。酶联免疫测定可以用于细胞提取物或分泌到培养基中的产物。

出于此目的，可以使用获自商业来源的多潜能标志物的抗体。

可以从(例如)Chemicon International，Inc(Temecula，CA，USA)商购获得用于干细胞标志物鉴别的抗体，其包括阶段特异性胚胎抗原1和4(SSEA-1和SSEA-4)和肿瘤排斥抗原1-60和1-81(TRA-1-60，TRA-1-81)。使用单克隆抗体对这些抗原的免疫学检测已广泛用于鉴定多潜能干细胞(Shamblott M.J.等人，(1998)PNAS 95：13726-13731；Schuldiner M.等人，(2000).PNAS 97：11307-11312；Thomson J.A.等人，(1998).Science282：1145-1147；Reubinoff B.E.等人，(2000).Nature Biotechnology18：399-404；Henderson J.K.等人，(2002).Stem Cells 20：329-337；Pera M.等人，(2000).J.Cell Science 113：5-10)。

还可以通过RNA印迹分析、斑点印迹杂交分析或通过使用标准扩增方法中的序列特异性引物的反转录酶引发的聚合酶链反应(RT-PCR)在mRNA水平检测组织特异性基因产物的表达。本发明公开中列出的特定标志物的序列数据可以从公共数据库中获得，如GenBank(URLwww.ncbi.nlm.nih.gov：80/entrez)。参见美国专利No.5843780以获得详细信息。

基本上，所有增殖的细胞或它们的大部分可以表达所述标志物。例如，表达所述标志物的细胞百分比可以为50％或以上，60％或以上，70％或以上，80％或以上，90％或以上，93％或以上，95％或以上，97％或以上，98％或以上，99％或以上或基本上100％。

细胞存活率

生物活力可以包括传代指明次数后的细胞存活率。可以通过多种方式测定细胞存活率，例如，通过台盼蓝排斥法。活体染色规程如下。将适当体积的细胞悬液(20-200μL)置于适当的管中，加入等体积的0.4％的台盼蓝并轻轻混合，在室温下静置5分钟。将10μl染色细胞置于血球计中，并对活细胞(未染色)和死细胞(染色)计数。计算每个象限中未染色细胞的平均数，并乘以2×10⁴以将单位转换为细胞/毫升。活细胞的百分比为活细胞数除以死细胞和活细胞数之和。

细胞存活率可以为50％或以上、60％或以上、70％或以上、80％或以上、90％或以上、93％或以上、95％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上或基本上100％。

染色体组型

增殖的干细胞可以在增殖期间或在增殖之后保留正常的染色体组型。“正常”染色体组型是与该干细胞来源的亲本干细胞的染色体组型相同、相似或基本相似的染色体组型，或者是与之不同但并非以任何显著的方式不同的一种染色体组型。例如，不应有任何整体的异常，如易位、染色体丢失或缺失等。

可以通过多种方法评价染色体组型，例如，在光学显微镜下目视观测。可以制备并分析染色体组型，如在McWhir等人，(2006)、Hewitt等人，(2007)以及Gallimore和Richardson(1973)中所述的。还可以使用标准G带技术(在提供常规染色体组分型服务的多个临床诊断学实验室中可获得，如Oakland Calif.的Cytogenetics Lab)对细胞进行染色体组分型并与报道的干细胞染色体组型进行比较。

所有或大部分增殖的细胞可以保留正常的染色体组型。该比例可以是50％或以上、60％或以上、70％或以上、80％或以上、90％或以上、93％或以上、95％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上或基本上100％。

多潜能性

增殖的干细胞可以保留分化为所有三种细胞系即内胚层、外胚层和中胚层的能力。在本领域中，诱导干细胞分化为这些系中的每一种的方法是已知的并且可以用于测定增殖的干细胞的能力。

所有或大部分增殖的细胞可以保留该能力。这可以是50％或以上、60％或以上、70％或以上、80％或以上、90％或以上、93％或以上、95％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上或基本上100％的增殖的干细胞。

共培养和饲养细胞

我们的方法可以包括在存在或不存在共培养的情况下培养干细胞。术语“共培养”是指在一起生长的两种或更多种不同类型的细胞(例如，基质饲养细胞)的混合物。所述两种或更多种不同类型的细胞可以生长在相同表面(如颗粒或细胞容器表面)上或生长在不同表面上。不同类型的细胞可以生长在不同的颗粒上。

作为本文中所使用的术语，饲养细胞可以表示用于不同类型的细胞培养所使用或所需的细胞。在干细胞培养的背景下，饲养细胞具有保证ES-细胞多潜能性存活、繁殖和维持的功能。可以通过直接共培养饲养细胞来实现ES-细胞多潜能性。可替换地或另外，可以在培养基中培养饲养细胞以对培养基进行调节。所述条件培养基可以用于培养干细胞。

诸如培养皿的容器的内表面可以涂覆小鼠胚胎皮细胞的饲养层，其中所述小鼠胚胎皮细胞已经过处理从而它们将不会分裂。饲养细胞向培养基释放ES细胞生长所需的营养物。因此，在颗粒上生长的干细胞可以在这些涂层容器中生长。

饲养细胞本身可以在颗粒上生长。它们可以以对干细胞所述的类似方式接种到颗粒上。要增殖的干细胞可以与这些饲养细胞颗粒一起生长或与它们分开生长。因此，干细胞可以在这些饲养细胞涂覆的颗粒上的层上生长。另一方面，干细胞可以在单独的颗粒上生长。任何这些安排的任意组合也是可能的，例如，包含在颗粒上生长的饲养细胞、具有饲养细胞和干细胞的颗粒以及生长干细胞的颗粒的培养。这些组合可以在具有饲养层或不具有饲养层的容器中生长。生长饲养细胞的颗粒可以是涂覆基质涂层的或未涂覆基质涂层的。

不存在或不需要饲养细胞的安排也是可能的。例如，细胞可以在饲养细胞或干细胞调节的培养基(条件培养基)中生长。

培养基和饲养细胞

只要所获得的细胞具有所需特征并且可以进一步增殖，那么用于分离和增殖多潜能干细胞的培养基可以具有任意几种不同的配方。

适合来源如下：达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)，Gibco#11965-092；Knockout(引人注目)达尔伯克氏改良伊格尔培养基(KODMEM)，Gibco#10829-018；200mM L-谷氨酰胺，Gibco#15039-027；非必需氨基酸溶液，Gibco 11140-050；β-巯基乙醇，Sigma#M7522；人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，Gibco#13256-029。示例性的含血清胚胎干细胞(ES)培养基是由80％的DMEM(通常为KO DMEM)、20％非加热失活的成分明确的胎儿牛血清(FBS)、0.1mM的非必需氨基酸、1mM的L-谷氨酰胺和0.1mM的β-巯基乙醇制成的。过滤培养基，并在4℃储存不超过2周。无血清胚胎干细胞(ES)培养基是由80％的KO DMEM、20％的血清替代品、0.1mM的非必需氨基酸、1mM的L-谷氨酰胺和0.1mM的β-巯基乙醇制成的。有效的血清替代品为Gibco#10828-028。过滤培养基，并在4℃储存不超过2周。在使用前，将人bFGF加入至4ng/mL的最终浓度(Bodnar等人，Geron Corp，国际专利公开WO 99/20741)。所述培养基可以包括Knockout DMEM培养基(Invitrogen-Gibco，Grand Island，New York)，其中添加了10％的血清替代培养基(Invitrogen-Gibco，GrandIsland，New York)、5ng/ml FGF2(Invitrogen-Gibco，Grand Island，New York)和5ng/ml PDGF AB(Peprotech，Rocky Hill，New Jersey)。

可以在mEF培养基中增殖饲养细胞(使用时)，所述培养基含有90％的DMEM(Gibco#11965-092)、10％的FBS(Hyclone#30071-03)和2mM谷氨酰胺。在T150烧瓶(Corning#430825)中增殖MEF，每隔一天用胰蛋白酶使细胞以1∶2分开，保持细胞处于亚汇合。为了制备饲养细胞层，以抑制增殖但允许支持人胚胎干细胞的重要因子合成的剂量(约4000rad的γ辐射)辐照细胞。通过在37℃用每孔1ml 0.5％的明胶培育过夜来涂覆6孔培养板(如Falcon#304)，并且用每孔375000个辐照的mEF铺板。铺板后，饲养细胞层通常使用5h至4天。在接种pPS细胞前，用新鲜人胚胎干细胞(hES)培养基替换该培养基。

培养其它干细胞的条件是已知的，并且根据细胞类型可以适当优化。在所引用的参考文献中提供了上述部分中所提到的特定细胞类型的培养基和培养技术。

无血清培养基

本发明所述的方法和组合物可以包括在无血清培养基中培养干细胞。

术语“无血清培养基”可以包括不含血清蛋白(例如，胎牛血清)的细胞培养基。在本领域中，无血清培养基是已知的，并且在(例如)美国专利5631159和5661034中有所说明。无血清培养基可商购自(例如)Gibco-BRL(Invitrogen)。

无血清培养基可以是不含蛋白质的，其中它可能缺少未知成分的蛋白质、水解产物和组分。无血清培养基可以包括化学成分确定的培养基，其中所有成分具有已知的化学结构。化学成分确定的无血清培养基是有利的，这是因为它提供了完全成分确定的系统，该系统消除了可变性、改善了重现性和使表现更一致，并且降低了不确定试剂污染的可能性。它还可以不含动物来源的组分。

无血清培养基可以包括Knockout DMEM培养基(Invitrogen-Gibco，Grand Island，New York)。

无血清培养基可以以(例如)5％、10％、15％等的浓度添加一种或多种成分，如血清替代培养基。无血清培养基可以添加10％的血清替代培养基，所述血清替代培养基获自Invitrogen-Gibco(Grand Island，New York)。

其中培养了分离或解聚的胚胎干细胞的无血清培养基可以包含一种或多种生长因子。在本领域中，多种生长因子是已知的，包括FGF2、IGF-2、Noggin、激活素A、TGFβ1、HRG1β、LIF、S1P、PDGF、BAFF、April、SCF、FIt-3配基、Wnt3A等。生长因子可以在任何适合的浓度下使用，如1pg/ml至500ng/ml之间。

培养基补充剂

培养基可以添加一种或多种添加剂。例如，这些添加剂可以选自下列中的一种或多种：脂肪混合物、牛血清白蛋白(例如，0.1％的BSA)、大豆蛋白水解物。

干细胞

如本文中所使用的，术语“干细胞”是指分裂时面临两种发育选择的细胞：子细胞可以与原始细胞相同(自我更新)或者它们可以是更特化的细胞类型的祖代(分化)。因此，干细胞能够采取一种或其它途径(存在其中可以形成每种细胞类型之一的另一途径)。因此，干细胞是非终末分化的并且能够产生其它类型细胞的细胞。

如在本文中所提到的，干细胞可以包括全能干细胞、多潜能干细胞和多能干细胞。

一般说来，本文中所提到的干细胞(复数)可以包括单数(干细胞)。具体地，培养和分化干细胞的方法可以包括单细胞培养技术和聚集体培养技术。

在本发明中，干细胞培养可以是聚集体或单细胞。

全能干细胞

术语“全能”细胞是指具有成为成体中任何细胞类型的潜能的细胞，或胚外膜(例如，胎盘)的任何细胞。因此，唯一的全能细胞是受精卵以及通过其分裂所产生的大约前4个细胞。

多潜能干细胞

“多潜能干细胞”是真正的干细胞，其具有在体内产生任何分化细胞的潜能。然而，它们不能有助于产生源自胚胎滋养层的胚外膜。已发现了几种类型的多潜能干细胞。

胚胎干细胞

可以从囊胚泡的内细胞团(ICM)中分离胚胎干细胞(ES)，囊胚泡是植入发生时胚胎发育的一个阶段。

胚胎生殖细胞

可以从流产胎儿的生殖腺前体中分离胚胎生殖(EG)细胞。

胚胎恶性肿瘤细胞

可以从畸胎癌(在胎儿生殖腺中偶发的肿瘤)中分离胚胎恶性肿瘤(EC)细胞。与以上两种不同，它们通常是非整倍体。只能从胚胎或胎儿组织中分离出所有这三类多潜能干细胞并且它们可以培养生长。防止这些多潜能细胞分化的方法在本领域中是已知的。

成体干细胞

成体干细胞包括多种类型，其包括形成神经元、皮肤和血液的干细胞，它们是骨髓移植中的活性成分。后者的这些干细胞类型还是脐带来源的干细胞的主要特征。成体干细胞可以在实验室中和在体内成体为功能性、更特化的细胞类型，尽管细胞类型的确切数目受所选择的干细胞类型所限制。例如，成体干细胞可以是间质干细胞、造血干细胞、乳腺干细胞、内皮干细胞或神经干细胞。成体干细胞可以是多能的。

多能干细胞

多能干细胞是真正的干细胞，但是只可以分化为有限的类型。例如，骨髓含有导致产生所有血液细胞但是不能产生其它类型细胞的多能干细胞。多能干细胞是在成年动物中发现的。据认为体内每种器官(脑、肝)均含有它们，从而在这些器官中它们可以替代死细胞或受损细胞。

鉴定干细胞的方法在本领域中是已知的并且包括标准测定方法的使用，如克隆测定、流式细胞术、长期培养和分子生物学技术，例如，PCR、RT-PCR和DNA印记。

除形态差异外，人和鼠多潜能干细胞在多种细胞表面抗原(干细胞标志物)的表达方面是不同的。在本文的其它部分中说明了干细胞标志物及其检测方法(在“干细胞特征的维持”中)。

干细胞的来源

美国专利No.5851832报道了获自脑组织的多能神经干细胞。美国专利No.5766948报道了从新生大脑半球产生成神经细胞。美国专利No.5654183和5849553报道了哺乳动物神经嵴干细胞的使用。

美国专利No.6040180报道了从哺乳动物多能CNS干细胞培养体外产生分化神经元。WO 98/50526和WO 99/01159报道了神经上皮干细胞、少突神经胶质细胞-星形细胞前体和谱系限制性神经元前体的产生和分离。

美国专利No.5968829报道了获自胚胎前脑并且用包含葡萄糖、转铁蛋白、胰岛素、硒、黄体酮和几种其它生长因子的培养基培养的神经干细胞。

可以通过灌注胶原酶和透明质酸酶的适当组合，从人活组织检查或手术切除的组织中获得原代肝细胞培养。可替换地，EP 0953633 A1报道了通过制备切碎的人肝组织，在生长培养基中使浓缩的组织细胞再悬浮和扩增培养的细胞来分离肝细胞。生长培养基包含葡萄糖、胰岛素、转铁蛋白、T3、FCS和使肝细胞生长而不发生恶性转化的多种组织提取物。

肝脏中的细胞被认为含有特化细胞，其包括肝实质细胞、库柏法细胞(Kupffer cell)、窦内皮细胞和胆管上皮细胞以及前体细胞(称为“成肝细胞”或“卵圆细胞”)，它们具有分化为成体肝细胞或胆管上皮细胞的能力(L.E.Rogler，Am.J.Pathol.150：591，1997；M.Alison，Current Opin.CellBiol.10：710，1998；Lazaro等人，Cancer Res.58：514，1998)。

美国专利No.5192553报道了分离人新生儿或胎儿造血干细胞或祖细胞的方法。美国专利No.5716827报道了作为Thy-1阳性祖代的人造血细胞，以及使它们体外再生的适当生长培养基。美国专利No.5635387报道了培养人造血细胞及其前体的方法和设备。美国专利No.6015554说明了重建人淋巴样细胞和树突细胞的方法。

美国专利No.5486359报道了可以分化成不止一种结缔组织类型(如骨、软骨、腱、韧带和真皮)的细胞的人间质干细胞的均匀群体。它们获自骨髓或骨膜。还报道了用于扩增间质干细胞的培养条件。WO 99/01145报道了从用生长因子(如G-CSF或GM-CSF)处理的个体周围血液中分离的人间质干细胞。WO 00/53795报道了脂肪来源的干细胞和网格结构，其基本不含脂肪细胞和红血球。根据报道，可以扩增并培养这些细胞以产生激素和条件培养基。

可以使用任何脊椎动物种的干细胞。包括来自人；以及非人灵长类、家畜、牲畜以及如啮齿动物、小鼠、大鼠等的其它非人哺乳动物的干细胞。

在适合在本发明所述的方法和组合物中使用的干细胞中包括来源于妊娠后所形成的组织的灵长类或人多潜能干细胞，如在妊娠期间的任意时间采取的囊胚泡或者胎儿或胚胎组织。非限制性实例为原代培养或已建立的胚胎干细胞系。

胚胎干细胞

可以从灵长类物种成员的囊胚泡中分离胚胎干细胞(Thomson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：7844，1995)。可以使用Thomson等人(美国专利No.5843780；Science 282：1145，1998；Curr.Top.Dev.Biol.38：133 ff.，1998)和Reubinoff等人，Nature Biotech.18：399，2000所述的技术从人囊胚泡细胞制备人胚胎干细胞(hES)。

简要地，人囊胚泡可以获自人体内预植入胚胎。可替换地，可以使用体外受精(IVF)胚胎，或者可以将单细胞人胚胎扩增至囊胚泡阶段(Bongso等人，Hum Reprod 4：706，1989)。在G1.2和G2.2培养基中将人胚胎培养至囊胚泡阶段(Gardner等人，Fertil.Steril.69：84，1998)。选择发育的囊胚泡用于胚胎干细胞分离。通过短暂暴露于链霉蛋白酶(Sigma)从囊胚泡中除去透明带。通过免疫外科学分离了内细胞团，其中将囊胚泡暴露于1∶50的兔抗人脾细胞抗血清稀释液30分钟，然后用DMEM清洗5分钟，共清洗三次，并暴露于1∶5的豚鼠补体(Gibco)稀释液3分钟(参见Solter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72：5099，1975)。用DMEM再清洗2次之后，通过轻微吸取从完整内细胞团(ICM)中除去溶解的滋养外胚层细胞，并将ICM铺板在mEF饲养层上。

9至15天后，通过暴露于加入了1mM EDTA的不含钙和镁的磷酸盐缓冲盐水(PBS)、通过暴露于分散酶或胰蛋白酶或通过用微量吸液管机械分离将内细胞团来源的生长物分离成块；然后，在新鲜培养基中重新铺板在mEF上。在新鲜胚胎干细胞(ES)培养基中将分离的细胞重新铺板在mEF饲养层上，并观察集落形成。通过微量吸液管单独选择表现为未分化形态的集落，机械分离成块并重新铺板。胚胎干细胞样形态的特征在于紧凑的集落，其核质比明显较高并且核突出。然后，通常通过短暂胰酶消化、暴露于达尔伯克氏PBS(不含钙或镁并且加入2mM的EDTA)、暴露于IV型胶原酶(约200U/mL；Gibco)或通过用微量吸液管选择各个集落将所得的胚胎干细胞每1-2周分种一次。约50至100个细胞的块大小是最佳的。

胚胎生殖细胞

从最后的经期后约8-11周时采取的人胎儿材料中所存在的原生殖细胞中可以制备人胚胎生殖(hEG)细胞。在Shamblott等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13726，1998和美国专利No.6090622中说明了适合的制备方法。

简要地，用等渗缓冲液清洗生殖嵴，然后置于0.1mL 0.05％的胰蛋白酶/0.53mM EDTA钠溶液(BRL)中，并切成＜1mm³的块。然后，通过100/μL的尖头吸取组织以进一步使细胞解聚。将其在37℃培育约5分钟，然后加入约3.5mL的EG生长培养基。EG生长培养基为DMEM、4500mg/L的D-葡萄糖、2200mg/L mM碳酸氢钠；15％的胚胎干细胞(ES)专用胎牛血清(BRL)；2mM谷氨酰胺(BRL)；1mM丙酮酸钠(BRL)；1000-2000U/mL人重组白血病抑制因子(LIF，Genzyme)；1-2ng/ml人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，Genzyme)；和10μM毛喉萜(Forskolin)(10％DMSO中溶液)。在替代方法中，使用透明质酸酶/胶原酶/脱氧核糖核酸酶分离EG细胞。从胎儿材料上切下生殖腺原基或具有肠系膜的生殖嵴，用PBS清洗生殖嵴，然后置于0.1mL HCD消化溶液(0.01％V型透明质酸酶、0.002％脱氧核糖核酸酶I、0.1％IV型胶原酶，均获自Sigma，在EG生长培养基中制备)中。将组织切碎，并在37℃培育1h或过夜，在1-3mL EG生长培养基中再悬浮，并铺板在饲养层上。

用在无LIF、bFGF或毛喉萜的改良EG生长培养基中培养3天的亚汇合层饲养细胞制备了96孔组织培养板，并用5000rad的γ辐照失活。适合的饲养细胞是STO细胞(ATCC登录号No.CRL 1503)。将0.2mL原代生殖细胞(PGC)悬液加入到每个孔中。在EG生长培养基中7-10天后，进行第一次传代，将每个孔转移到先前用辐照STO小鼠成纤维细胞制备的24孔培养皿的一个孔中。培养细胞并每天更换培养基，直至观察到与EG细胞一致的细胞形态，这通常是在7-30天后或者在传代1-4次后。

诱导性多潜能干细胞

本发明所述的方法和组合物可以用于使诱导性多潜能干细胞增殖。

诱导性多潜能干细胞，通常缩写为iPS细胞或iPSC，是通过插入某些基因人工地从非多潜能细胞(通常是成体体细胞，例如，成纤维细胞、肺或B细胞)获得的一类多潜能干细胞。

在Takahashi，K.& Yamanaka(Induction of pluripotent stem cells frommouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.Cell 2006；126：663-676)、Yamanaka S等人(Yamanaka S等人，Induction of PluripotentStem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors.doi：10.1016/j.cell.2007.11.019和Yamanaka S等人，Generation ofgermline-competent induced pluripotent stem cells.Nature 2007；448：313-7)、Wernig M等人(In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotentES-cell-like state.Nature 2007；448：318-24)、Maherali N等人(Directlyreprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespreadtissue contribution.Cell Stem Cell 2007；1：55-70)和Thomson JA，Yu J等人(Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells.Science DOI：10.1126/science.1151526)和Takahashi等人(Induction ofpluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.Cell.(2007)131(5)：861-72)中综述并讨论了iPS细胞，以上所有参考文献作为参考并入本文。

通常通过将某些干细胞相关基因转染到非多潜能细胞(如成熟成纤维细胞)中获得了iPS细胞。通常通过病毒载体(如反转录病毒)实现转染。转染的基因包括主转录调节子Oct-3/4(Pouf51)和Sox2，尽管已表明其它基因提高了诱导效率。3-4周后，少量转染的细胞开始在形态和生物化学方面变得与多潜能干细胞类似，并且通常通过形态选择、倍增时间或通过报道基因和抗生素感染进行分离。

多潜能细胞的来源

本发明的一些方面和实施方式涉及多潜能细胞的使用。将胚胎干细胞和诱导性多潜能干细胞作为这类细胞的实例进行描述。

通常，胚胎干细胞来源于囊胚泡阶段胚胎的内细胞团(ICM)(Evans，M.J.和Kaufman，M.H.(1981).Establishment in culture of pluripotential cellsfrom mouse embryos.Nature 292，154-156.Martin，G.R.(1981).Isolation of apluripotent cell line from early mouse embryos cultured in mediumconditioned by teratocarcinoma stem cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78，7634-7638.Thomson，J.A.，Itskovitz-EIdor，J.，Shapiro，S.S.，Waknitz，M.A.，Swiergiel，J.J.，Marshall，VS.和Jones，J.M.(1998).Embryonic stem cell linesderived from human blastocysts.Science 282，1145-1147)。在分离胚胎干细胞时，这些方法可以导致胚胎的破坏。

现在，已提供了用于分离多潜能干细胞而不导致胚胎破坏的几种方法，例如，通过转化成体体细胞或生殖细胞。这些方法包括：

1、通过核移植重编程。该技术包括将核从体细胞转移到卵母细胞或接合子中。在一些情况下，这可以导致产生动物-人杂交细胞。例如，可以通过人体细胞与动物卵母细胞或接合子的融合或者人卵母细胞或接合子与动物体细胞的融合来产生这些细胞。

2、通过与胚胎干细胞融合重编程。该技术包括体细胞与胚胎干细胞的融合。该技术还可以导致产生动物-人杂交细胞，如以上1中所述。

3、通过培养自发重编程。该技术包括在长期培养后从非多潜能细胞产生多潜能细胞。例如，已通过原生殖细胞(PGC)的长期培养产生了多潜能胚胎生殖(EG)细胞(Matsui等人，Derivation of pluripotential embryonicstem cells from murine primordial germ cells in culture.Cell 70，841-847，1992，其作为参考并入本文)。还已报道了在骨髓来源细胞的延长培养后多潜能干细胞的发育(Jiang等人，Pluripotency of mesenchymal stem cellsderived from adult marrow.Nature 418，41-49，2002，其作为参考并入本文)。他们将这些细胞表示为多能成熟祖细胞(MAPC)。Shinohara等人还表明在来自幼鼠精巢的种系干细胞(GS)的培养过程中可以产生多潜能干细胞，他们将这些细胞称为多能种系干细胞(mGS)(Kanatsu-Shinohara等人，Generation of pluripotent stem cells from neonatal mouse testis.Cell 119，1001-1012，2004，其作为参考并入本文)。

4、通过限定因子重编程。例如，通过向小鼠胚胎或成熟成纤维细胞实施反转录病毒介导的转录因子(如Oct-3/4、Sox2、c-Myc和KLF4)的引入产生了iPS细胞，例如，如上所述。Kaji等人(Virus-free induction ofpluripotency and subsequent excision of reprogramming factors.Nature.Online publication 1 march 2009，其作为参考并入本文)还说明了单个多能表达载体的非病毒转染，其包含可以使小鼠和人成纤维细胞重编程的2A肽连接的c-Myc、Klf4、Oct4和Sox2编码序列。该非病毒载体产生的iPS细胞显示出多潜能标志物的稳健表达，这表明了通过体外分化测定从功能上确认的重编程状态和成熟嵌合小鼠的形成。它们成功地从稳健表达多潜能标志物的胚胎成纤维细胞建立了重编程的人细胞系。

Shinya Yamanaka在Strategies and New Developments in the Generaionof Patient-Specific Pluripotent Stem Cells(Cell Stem Cell 1，July 2007 ^a2007Elsevier Inc)中说明并讨论了方法1-4，该参考文献作为参考并入本文。

5、从单个卵裂球或活检的卵裂球获得了hESC系。参见KlimanskayaI，Chung Y，Becker S，Lu SJ，Lanza R.Human embryonic stem cell linesderived from single blastomeres.Nature 2006；444：512；Lei等人，Xeno-freederivation and culture of human embryonic stem cells：current status，problemsand challenges.Cell Research(2007)17：682-688；Chung Y，Klimanskaya I，Becker S等人，Embryonic and extraembryonic stem cell lines derived fromsingle mouse blastomeres.Nature.2006；439：216-219；Klimanskaya I，ChungY，Becker S等人，Human embryonic stem cell lines derived from singleblastomeres.Nature.2006；444：481-485；Chung Y，Klimanskaya I，Becker S等人，Human embryonic stem cell lines generated without embryo destruction.Cell Stem Cell.2008；2：113-117和Dusko Ilic等人(Derivation of humanembryonic stem cell lines from biopsied blastomeres on human feeders with aminimal exposure to xenomaterials.Stem Cells And Development-正式出版前的论文(paper in pre-publication))，所有参考文献作为参考并入本文。

6、从停止分裂并且不能体外发育成桑椹胚和囊胚泡的停育胚胎获得了hESC系。参见Zhang X，Stojkovic P，Przyborski S等人，Derivation ofhuman embryonic stem cells from developing and arrested embryos.StemCells 2006；24：2669-2676和Lei等人，Xeno-free derivation and culture ofhuman embryonic stem cells：current status，problems and challenges.CellResearch(2007)17：682-688，以上两篇参考文献作为参考并入本文。

7、单性生殖(或单性生殖)。该技术包括非受精卵的化学或电学刺激以导致它发育成可以从中获得胚胎干细胞的卵裂球。例如，参见Lin等人，Multilineage potential of homozygous stem cells derived from metaphase IIoocytes.Stem Cells.2003；21(2)：152-61，他们使用非受精的中期II期卵母细胞的化学激活来产生干细胞。

8、胎儿来源的干细胞。就潜能性而言，这些细胞处于胚胎和成体干细胞之间，并且可以用于获得多潜能或多能细胞。Chris H.Jo等人(Fetalmesenchymal stem cells derived from human umbilical cord sustain primitivecharacteristics during extensive expansion.Cell Tissue Res(2008)334：423-433，其作为参考并入本文)已成功地获得了表达多潜能标志物(包括Nanog、Oct-4、Sox-2、Rex-1、SSEA-3、SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81，通过β-半乳糖苷酶染色以及末端酶活力的一致表达显示了衰老的基本证据)的人脐带来源的胎儿间质干细胞(UC fMSC)。Winston Costa Pereira等人(Reproducible methodology for the isolation of mesenchymal stem cellsfrom human umbilical cord and its potential for cardiomyocyte generation JTissue Eng Regen Med 2008；2：394-399，其作为参考并入本文)从人脐带的华顿氏胶质中分离了纯间质干细胞群体。还在Troyer & Weiss(ConciseReview：Wharton′s Jelly-Derived Cells Are a primitive Stromal CellPopulation.Stem Cells 2008：26：591-599，其作为参考并入本文)中综述了来源于华顿氏胶质的间质干细胞。Kim等人(Ex vivo characteristics ofhuman amniotic membrane-derived stem cells.Cloning Stem Cells 2007Winter；9(4)：581-94，其作为参考并入本文)成功地从人羊膜中分离了人羊膜来源的间质细胞。脐带通常是丢弃的组织并且来源于该组织的干细胞不易于引起道德和伦理争议。

本发明包括从任何这些来源获得的或通过任何这些方法产生的多潜能或多能干细胞的使用。在一些实施方式中，已通过不导致胚胎破坏的方法获得了在本发明方法中使用的多潜能或多能细胞。更优选地，在一些实施方式中，已通过不导致人或哺乳动物胚胎破坏的方法获得了在本发明方法中使用的多潜能或多能细胞。照此，可以使用并非专门通过必须涉及破坏人胚胎(可以从中获得那些细胞)的方法制备的细胞实施本发明的方法。具体地，该可选的限制特别意欲考虑欧洲专利局扩大复审委员会2008年11月25日的决定G0002/06。

分化/拟胚体

通过使用本领域技术人员已知的分化技术，可以将培养的干细胞分化成任何适合的细胞类型。

我们说明了产生分化细胞的方法，该方法包括通过如本发明所述的方法使干细胞增殖，然后根据已知技术使所述干细胞分化。例如，我们提供了分化为外胚层、中胚层和内胚层以及分化为心肌细胞、脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞等的方法。我们还提供了通过这些方法可获得的拟胚体和分化细胞。还提供了由这些干细胞和分化细胞所制备的细胞系。

分化干细胞的方法在本领域中是已知的并且在(例如)Itskovitz-Eldor(J Itskovitz-Eldor，M Schuldiner，D Karsenti，A Eden，O Yanuka，M Amit，HSoreq，N Benvenisty.Differentiation of human embryonic stem cells intoembryoid bodies compromising the three embryonic germ layers.Mol Med.2000 Feb；6(2)：88-95)和Graichen等人，(2007)；Kroon等人，(2008)和Hay等人(2008.Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepaticendoderm requires ActivinA and Wnt3a signalling.PNAS Vol.105.No.3412310-12306)、WO 2007/030870、WO 2007/070964、Niebrugge等人(Generation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Mesoderm and CardiacCells Using Size-Specified Aggregates in an Oxygen-Controlled Bioreactor.Biotechnology and Bioengineering.Vol.102，no.2，February 1，2009)、RPassier等人(Serum free media in cocultures(FBS inhibits cardiomyocytesdifferentiation).Curr Opin Biotechnol.2005 Oct；16(5)：498-502.Review.StemCells.2005 Jun-Jul；23(6)：772-80)、P W Burridge等人(Defined medium withpolyvinyl alcohol(PVA)，Activin A and bFGF.Stem Cells.2007 Apr；25(4)：929-38.Epub 2006 Dec 21)、M A Laflamme等人(Culture sequentiallysupplemented with Activin A for 24h，and BMP 4 for 4 days.Nat Biotechnol.2007 Sep；25(9)：1015-24.Epub 2007 Aug 26)、L Yang等人(Defined mediumsupplemented with BMP4(1 day)，BMP4，Activin A and bFGF(days 1-4)，Activin A and bFGF(days 4-8)，and DKK1 and VEGF.Nature.2008 may 22；453(7194)：524-8.Epub 2008 Apr 23)和X Q Xu等人(SB203580(p38 mAPkinase inhibitor)PGI2(prostaglandin member accumulated in END2-CM).Differentiation.2008 Nov；76(9)：958-70.Epub 2008 Jun 13)中进行了说明。

培养的干细胞还可以用于形成拟胚体。拟胚体以及制备拟胚体的方法在本领域中是已知的。术语“拟胚体”是指在培养中所观察到的由悬浮胚胎干细胞生长所产生的球形集落。拟胚体是混合的细胞类型，并且特定细胞类型出现的分布和时机与胚胎内所观察到的对应。可以通过将胚胎干细胞铺板在培养基(如半固体培养基)上产生拟胚体。可以使用甲基纤维素培养基，如Lim等人，Blood 1997；90：1291-1299中所述。

可以使用(例如)Itskovitz-Eldor(2000)中所述的方法诱导胚胎干细胞形成拟胚体。拟胚体含有所有三种胚胎胚层细胞。

通过(例如)暴露于适当的诱导因素或环境变化，可以进一步诱导拟胚体以分化成不同的系。Graichen等人(2007)描述了通过操纵p38MAP激酶途径从人胚胎干细胞形成了心肌细胞。Graichen证明了通过以小于10微摩尔的浓度暴露于p38MAP激酶的特定抑制剂(如SB203580)诱导了心肌细胞形成。

分化细胞可以用于任何适合的目的，如在本领域中已知的再生疗法。

通过根据本发明的培养法和技术获得的干细胞可以用于分化成另一种细胞类型以在医疗方法中使用。因此，分化的细胞类型可以来源于通过本发明所述的培养法和技术所获得的随后允许其分化的干细胞。分化的细胞类型可以被认为是通过本发明所述的培养法和技术所获得的随后允许其分化的干细胞的产物。可以提供药物组合物，其包含这些分化细胞，任选地和可药用载体、佐剂或稀释剂。该药物组合物在医疗方法中可以是有用的。

微载体上的分化

根据我们的早期发现(参见2009年3月17日提交的美国专利申请US 61/069694、2008年10月31日提交的US 61/110256、2009年1月29日提交的US 61/148064和2009年2月27日提交的US 61/155940)，可以在悬浮培养期间在微载体上诱导干细胞，特别是胚胎干细胞和iPS分化。

胚胎干细胞可以诱导分化成三种原胚层：外胚层、内胚层和中胚层以及它们的衍生物。胚胎干细胞可以诱导形成拟胚体。因此，可以获得多种细胞类型和组织，例如，心肌细胞、心脏中胚层、肝细胞、肝内胚层、胰岛细胞、胰腺内胚层、胰岛素产生细胞、神经组织、神经外胚层，表皮组织、表面外胚层、骨、软骨、肌肉、韧带、腱或其它结缔组织。

以上说明了干细胞分化和拟胚体形成的方法，并且这些方法适用于微载体培养中干细胞的分化。

可以在存在或不存在ROCK抑制剂的情况下实施微载体培养期间干细胞分化的方法。例如，在根据本发明存在ROCK抑制剂的情况下，可以通过将细胞(和微载体)暴露于将诱导分化的培养条件来诱导微载体上增殖的干细胞分化。这些培养条件可以包括干细胞连续暴露于ROCK抑制剂(其可以与细胞增殖所用的ROCK抑制剂相同或不同)，或者这些培养条件可以不包括ROCK抑制剂。

在微载体培养期间，干细胞分化的方法可以要求微载体未涂覆或涂覆如上所述的基质涂层。例如，适合的涂层可以包括下列中的一种或多种：Matrigel、层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、透明质酸。

在微载体培养期间，干细胞分化的方法可以包括向培养基加入补充剂。例如，补充剂可以包括牛血清白蛋白、脂肪或Hy-Soy(Sigma-Aldrich，这是大豆蛋白的酶促水解产物)。

在微载体培养期间，干细胞分化的方法可以包括干细胞在2D培养或在3D悬浮微载体培养中的初始培养和增殖，以及随后在微载体培养期间的诱导分化。

用途

本发明所述的方法和组合物可以用于多种用途。

例如，可以作为干细胞简单培养的研究工具或实验室试剂来提供本发明所述的颗粒。它们可以用于扩增微载体上未分化的干细胞以产生分化细胞。该过程可以开发成为合同生产能力。干细胞可以扩增并任选地分化以用于药物测试。可以标记颗粒或微载体以用于不同培养基条件中干细胞的组合分化。通过本发明所述的方法增殖的干细胞可以用于多种在商业方面重要的研究、诊断和治疗目的。干细胞可以直接用于这些目的，或者可以使用本领域已知的方法分化为任意所选的细胞类型。祖细胞也可以来源于这些干细胞。对于相同的目的，可以代替或结合干细胞使用分化细胞或祖细胞或两者。因此，在本文中对干细胞所述的任何用途同样适用于来源于这些干细胞的祖细胞和分化细胞。类似地，分化细胞的任何用途将同样适用于对其来说它们是祖代或祖细胞的那些干细胞。

一般地，干细胞等的用途在本领域中是熟知的，但将在本发明中简要地进行说明。

治疗性用途

本发明所述的方法和组合物可以用于使干细胞增殖以用于再生疗法。可以扩增干细胞并直接施用于患者。它们可以用于在创伤后使受损组织再生。可以直接使用胚胎干细胞，或者它们可以用于产生外胚层、中胚层或内胚层祖细胞群以用于再生疗法。可以通过离体扩增制备祖细胞，或者可以将祖细胞直接施用给患者。它们还可以用于在创伤后使受损组织再生。

因此，造血祖细胞可以用于骨髓置换，而心脏祖细胞可以用于心力衰竭患者。皮肤祖细胞可以用于使患者皮移植物生长，而内皮祖细胞可以用于人工修复术(如支架或人工心脏)中的内皮化。

胚胎干细胞可以用作治疗退行性疾病的外胚层、中胚层或内胚层祖细胞的来源，所述退行性疾病如糖尿病、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病等。胚胎干细胞可以用作癌症免疫疗法的NK或树突细胞的中胚层或内胚层祖代的来源。

本发明所述的方法和组合物使得能够产生外胚层、中胚层或内胚层祖细胞，当然，使用本领域已知的方法可以使所述细胞进一步分化为终末分化的细胞类型。

因此，终末分化细胞的任何用途同样将与作为它们来源的那些外胚层、中胚层或内胚层祖细胞(或干细胞)有关。

通过本发明所述的方法和组合物产生的干细胞、外胚层、中胚层或内胚层祖细胞和分化细胞可以用于或用于制备治疗疾病的药物组合物。这种疾病可以包括通过再生疗法可治疗的疾病，其包括心力衰竭、骨髓病、皮肤病、烧伤、退行性疾病(如糖尿病、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病等)和癌症。

文库

例如，未分化和分化细胞群体可以用于制备对分化表型特异的抗体和cDNA文库。在Handbook of Experimental Immunology(Weir & Blackwell编辑)、Current Protocols in Immunology(Coligan等人编辑)和Methods ofImmunological Analysis(Masseyeff等人编辑，Weinheim：VCH VerlagsGmbH)中说明了在产生、纯化和修饰抗体中使用的一般技术以及它们在免疫测定和免疫分离方法中的使用。在RNA methodologies：A LaboratoryGuide for Isolation and Characterization(R.E.Farrell，Academic Press，1998)；cDNA Library Protocols(Cowell & Austin编辑，Humana Press)和Functional Genomics(Hunt & Livesey编辑，2000)中说明了制备mRNA和cDNA文库所涉及的一般技术。相对均质的细胞群体特别适合在药物筛选和治疗性应用中使用。

药物筛选

干细胞和分化细胞还可以用于筛选影响干细胞或分化细胞特征的因素(如溶剂、小分子药物、肽、多核苷酸等)或环境条件(如培养条件或操纵)。

干细胞可以用于筛选促进多潜能性或分化的因素。在一些应用中，分化细胞用于筛选在长期培养中促进这些细胞成熟或促进这些细胞增殖和维持的因素。例如，通过将它们加入到不同孔的细胞中，然后根据这些细胞进一步培养和使用的所需标准，确定所导致的任何表型变化来测试候选成熟因子或生长因子。

具体的筛选应用涉及药物研究中药物化合物的测试。读者一般参考标准教科书“药物研究中的体外方法(In vitro methods in PharmaceuticalResearch)”，Academic Press，1997和美国专利No.5030015，以及在本文的其它部分中有关药物筛选的一般说明。候选药物化合物活力的测定一般包括将干细胞或分化细胞与候选化合物混合，确定(与未处理的细胞或用惰性化合物处理的细胞相比)由该化合物所造成的细胞形态、标志物表型或代谢活力的任何变化，然后将化合物的作用与所观察到的变化相关联。

由于(例如)化合物设计对某些细胞类型具有药理学作用或者由于设计在其它方面具有作用的化合物可能具有意外的副作用，因此，可以进行筛选。可以(通过与细胞同时或顺序混合)组合测试两种或更多种药物以检测可能的药物-药物相互作用效果。在一些应用中，最初筛选了化合物的潜在毒性(Castell等人，第375-410页，“药物研究中的体外方法(In vitromethods in Pharmaceutical Research)”，Academic Press，1997)。在第一种情况下，可以通过对细胞活力、存活率、形态和某些标志物、受体或酶的表达或释放的影响来确定细胞毒性。可以通过测量DNA合成或修复确定药物对染色体DNA的影响。[³H]胸腺嘧啶或BrdU的掺入，特别是在细胞周期中计划外时间的掺入，或者高于细胞复制所需的水平，这与药物作用一致。不希望的作用还可以包括通过中期染色体图谱所确定的罕见的姐妹染色单体互换率。有关进一步的详细描述，读者请参考A.Vickers(第375-410页，“药物研究中的体外方法(In vitro methods in PharmaceuticalResearch)”，Academic Press，1997)。

组织再生

根据本发明所述的方法和组合物增殖的干细胞(和由此获得的分化细胞)可以用于治疗，例如，有需要个体患者中的组织重建或再生。可以以允许它们移植到预定的组织位点并且使功能缺陷区重建或再生的方式施用这些细胞。

由此获得的增殖干细胞或分化细胞可以用于组织工程，如用于皮肤移植物的生长。它们可以用于人工脏器或组织的生物工程或用于修复学，如支架。

分化细胞还可以用于有需要的人患者中的组织重建或再生。以允许它们移植到预定的组织位点并且使功能缺陷区重建或再生的方式施用这些细胞。例如，本发明所述的方法和组合物可以用于调节干细胞分化。分化细胞可以用于组织工程，如用于皮肤移植物的生长。干细胞分化的调节可以用于人工脏器或组织的生物工程或用于修复学，如支架。在另一个实例中，根据所治疗的疾病，直接将神经干细胞移植到中枢神经系统的实质或鞘内位点。以25000-500000个细胞/mu.L的密度，使用单细胞悬液或小聚集体进行移植(美国专利No.5968829)。如McDonald等人(Nat.Med.5：1410，1999)所述，可以在大鼠模型中对急性损伤的脊髓评价神经细胞移植物的效力。成功的移植物将在2-5周后显示在损伤处出现来源于移植物的细胞，其分化成星形细胞、少突神经胶质细胞和/或神经元，并沿脊髓从损伤端迁移，并且在门、协调性和负重方面得到改善。

某些神经祖细胞被设计用于治疗神经系统的急性或慢性损伤。例如，兴奋性毒性与多种病况有关，包括癫痫症、中风、局部缺血、杭廷顿氏舞蹈病、帕金森氏病和阿尔茨海默氏病。根据本发明所述的方法制备的某些分化细胞还可以适合于治疗髓鞘形成不良病，如佩-梅氏病、多发性硬化、脑白质病变、神经炎和神经病。富含少突神经胶质细胞或少突神经胶质细胞前体以促进髓鞘再生的细胞培养是适合于这些用途的。

可以在动物模型中评价使用我们的方法所制备的肝细胞和肝细胞前体修复肝损伤的能力。一个这种实例是腹膜内注射D-半乳糖胺所引起的损伤(Dabeva等人，Am.J.Pathol.143：1606，1993)。可以通过肝细胞标志物的免疫组织化学染色、生长组织中是否形成小管结构的显微测定以及修复肝特异性蛋白合成的治疗能力来确定治疗效力。通过直接施用或者作为在暴发性肝衰竭后受试者肝组织自身再生时提供临时肝功能的生物辅助装置的一部分，可以在疗法中使用肝细胞。

可以通过(例如)用特异性p38MAP激酶抑制剂SB203580调节MAP激酶途径来诱导干细胞分化从而制备心肌细胞，如Graichen等人(2007)中所述。可以在动物模型中评价这些心肌细胞对于心脏冷冻损伤的效力，如果不进行治疗冷冻损伤会导致55％的左心室壁组织成为瘢痕组织(Li等人，Ann.Thorac.Surg.62：654，1996；Sakai等人，Ann.Thorac.Surg.8：2074，1999；Sakai等人，J.Thorac.Cardiovasc.Surg.118：715，1999)。成功的治疗将减少瘢痕面积、限制瘢痕扩大和改善心脏功能，如通过收缩压、舒张压以及发展压所确定的。还可以在左前降支的远端部分使用栓塞线圈来建立心脏创伤模型(Watanabe等人，Cell Transplant.7：239，1998)，并且可以通过组织学和心脏功能评价治疗效力。可以在疗法中使用心肌细胞制剂以使心肌再生并治疗心功能不全(美国专利No.5919449和WO 99/03973)。

癌症

根据本发明所述的方法和组合物所增殖的干细胞和由此获得的分化细胞可以用于治疗癌症。

术语“癌症”和“癌性的”表示或说明哺乳动物中通常以无限制细胞生长为特征的生理状况。癌症的实例包括(但不局限于)癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。这些癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、胰癌、如成胶质细胞瘤和神经纤维瘤的胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌以及多种类型的头颈癌。其它实例为实体瘤癌，包括结肠癌、乳腺癌、肺癌和前列腺癌、包括白血病和淋巴瘤在内的造血系统恶性瘤、何杰金氏病、再生障碍性贫血、皮肤癌和常见腺瘤性息肉。其它实例包括脑肿瘤、结直肠肿瘤、乳腺肿瘤、子宫颈肿瘤、眼肿瘤、肝肿瘤、肺肿瘤、胰腺肿瘤、卵巢肿瘤、前列腺肿瘤、皮肤肿瘤、睾丸肿瘤、肿瘤、骨肿瘤、滋养层肿瘤、输卵管肿瘤、直肠肿瘤、结肠肿瘤、肾肿瘤、胃肿瘤和甲状旁腺肿瘤。还包括乳腺癌、前列腺癌、胰癌、结直肠癌、肺癌、恶性黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、卵巢癌、子宫颈癌和胆道癌。根据本发明所述的方法和组合物增殖并任选地分化的干细胞还可以结合抗癌剂(如内皮抑制素和血管增生抑制素)或细胞毒性剂或化疗剂使用。例如，如阿霉素、道诺霉素、顺铂、依托泊苷、红豆杉醇、泰索帝(taxotere)的药物和如长春新碱的生物碱和如甲氨蝶呤的抗代谢物。如本文所使用的，术语“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞破坏的物质。该术语旨在包括放射性同位素(例如，I、Y、Pr)、化疗剂和毒素，如细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素或它们的片段。

另外，该术语包括致癌基因产物/酪氨酸激酶抑制剂，如WO 94/22867中所公开的双环安沙霉素类；EP 600832中所公开的1，2-双(芳氨基)苯甲酸衍生物；EP 600831中所公开的6，7-二氨基-酞嗪-1-酮衍生物；EP 516598中所公开的4，5-双(芳氨基)-酞酰亚胺衍生物；或抑制酪氨酸激酶与含SH2的底物蛋白结合的肽(例如，参见WO 94/07913)。“化疗剂”是在癌症治疗中有用的化合物。化疗剂的实例包括阿霉素、多柔比星、5-氟尿嘧啶(5-FU)、阿糖胞苷(Ara-C)、环磷酰胺、塞替派、白消安、细胞毒素(Cytoxin)、红豆杉醇、甲氨蝶呤、顺铂、美法仑、长春碱、博莱霉素、依托泊苷、异环磷酰胺、丝裂霉素C、米托蒽醌、长春新碱、VP-16、长春瑞滨、卡铂、替尼泊苷、道诺霉素、洋红霉素、氨基蝶呤、放线菌素D、丝裂霉素、烟酰胺、埃斯培拉霉素(参见美国专利No.4675187)、美法仑以及其它相关氮芥类和内分泌疗法(如己烯雌酚(DES)、三苯氧胺、LHRH拮抗药物、黄体酮、抗黄体酮等)。

除非另外指明，本发明的实践将采用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些技术在本领域技术人员的能力范围之内。在以下文献中解释了这些技术。参见，例如，J.Sambrook，E F.Fritsch和T.Maniatis，1989，“分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：ALaboratory manual)”，第二版，1-3册，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel，F.M等人(1995以及定期增刊；“现代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)”，第9、13和16章，John Wiley& Sons，New York，N.Y.)；B.Roe，J.Crabtree和A.Kahn，1996，“DNA分离和测序：基本技术(DNA Isolation and Sequencing：EssentialTechniques)”，John Wiley & Sons；J.M.Polak和James O′D.McGee，1990，“寡核苷酸合成：实用方法(Oligonucleotide Synthesis：A PracticalApproach)”，Irl Press；D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg，1992，“酶学方法：DNA结构，部分A：酶学中DNA合成和物理分析方法(Methods ofEnzymology：DNA Structure Part A：Synthesis and Physical Analysis of DNAmethods in Enzymology)”，Academic Press；Edward Harlow，David Lane，EdHarlow编写的“使用抗体：实验室手册：便携实验指南，NO.I(UsingAntibodies：A Laboratory manual：Portable Protocol NO.I)”(1999，ColdSpring Harbor Laboratory Press，ISBN 0-87969-544-7)；Ed Harlow(编辑)、David Lane(编辑)的“抗体：实验室手册(Antibodies：A Laboratory manual)”(1988，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ISBN 0-87969-314-2)，1855；和Jane Roskams和Linda Rodgersand编辑的“实验室参考：实验室使用的配方、试剂和其它参考工具手册(Lab Ref：A Handbook of Recipes，Reagents，and Other Reference Tools for Use at the Bench)”，2002，Cold Spring HarborLaboratory，ISBN 0-87969-630-3。以上这些一般性教科书中的每一本均作为参考并入本文。

除明显不允许或明确要避免该组合的情况之外，本发明包括所述的方面和优选特征的组合。

本文所使用的章节标题仅是出于组织性的目的，而不应视作对所述主题内容的限制。

现在，通过举例并参考附图，将说明本发明的方面和实施方式。对于本领域技术人员来说，其它方面和实施方式将是显而易见的。本文中所提到的所有文献将作为参考并入本文。

附图说明

现在，将参考附图讨论说明本发明原理的实施方式和实验，其中：

图1.显示在不含Matrigel但是含有ROCK抑制剂的Y-27632的情况下，hESC在DE53纤维素微载体上连续9周传代的结果的图。没有ROCK抑制剂时，hESC在4周后不能传代。

图2.FACS分析。在不含Matrigel但含有ROCK抑制剂的情况下，多潜能标志物Oct4和mAb 84在微载体培养中在3周内稳定表达，其显示没有ROCK抑制剂时，标志物下调。

图3.显示在不含Matrigel但含有ROCK抑制剂的情况下，多潜能标志物Oct4、mAb 84和Tra-1-60在微载体培养中在9周内稳定表达的图。

图4.显示在不含Matrigel但是含有ROCK抑制剂Y-27632的情况下，hESC在球形聚赖氨酸涂覆的Tosoh微载体上连续6周传代的结果的图和FACS分析。没有ROCK抑制剂时，hESC在2周后不能传代。

图5.显示在不含Matrigel但含有Rock抑制剂Y-27632的情况下，hESC在纤维素DE53、Tosoh、Cytodex 1和Cytodex 3微载体上连续5周传代的结果的图。

图6.在不含Matrigel但含有Rock抑制剂Y-27632的情况下，hESC在纤维素DE53、Tosoh、Cytodex 1和Cytodex 3微载体上的显微照片。

图7.FACS分析。在不含Matrigel但含有Rock抑制剂Y-27632的情况下，在传代5次时(Passage 5，在第5传代)，纤维素、Tosoh、Cytodex1和Cytodex 3微载体上培养的hESC中Oct4和mAb 84的表达。

图8.在不含有Matrigel但含有Rock抑制剂Y-27632的情况下，纤维素微载体上的hESC的扫描电子显微照相(SEM)。

图9.在不含Matrigel但含有Rock抑制剂Y-27632的情况下，纤维素微载体上的hESC的SEM。

图10.分别在第8和第7传代，DE53和QA52纤维素微载体上培养的hESC的稳定染色体组型。

图11.分别在第10和第5传代，球形Tosoh和Cytodex 3微载体上培养的hESC的稳定染色体组型。

图12.显示在不含Matrigel的情况下，抑制剂HA1077和金硫葡糖支持纤维素微载体上传代0次和1次(在第0和第1传代)的hESC生长的图。

图13.FACS分析。在含有抑制剂HA1077和金硫葡糖的情况下，传代0次的hESC培养物的多潜能标志物Oct4和mAb 84的稳定表达。

图14.FACS分析。在含有抑制剂HA1077和金硫葡糖的情况下，传代1次(在第1传代)的hESC培养物的多潜能标志物Oct4和mAb 84的FACS的稳定表达。

图15.在含有替代ROCK抑制剂的情况下，微载体上的hESC的汇合培养(物)的显微照片。

图16.显示在含有ROCK抑制剂Y-27632的情况下，纤维素微载体上的长期hESC培养的影响的图。不含ROCK抑制剂时，Oct4和mAb 84下调，而含有ROCK抑制剂时，Oct4和mAb 84在9周内稳定表达。

图17.显示纤维素DE53、Tosoh、Cytodex 1和Cytodex 3微载体上hESC培养在含有和不含ROCK抑制剂(Y-27632)的情况下相比较的图。

图18.显示调控胚胎干细胞中基本细胞-细胞相互作用的ρ-Rock-肌球蛋白途径概要的简略图。虚线显示了在细胞完整性和细胞更新途径内或者之间可能的机制作用(来自Harb等人，The Rho-Rock-myosin SignalingAxis Determines Cell-Cell Integrity of Self-Renewing Pluripotent Stem Cells.PLoS ONE 3(8)：e3001.doi：10：1371/journal.pone.0003uu1)。

图19.显示在第0传代至第4传代，Matrigel涂覆的纤维素DE53微载体上的hESC细胞密度(百万个细胞/孔)相对于添加金硫葡糖的未涂覆微载体上的hESC细胞密度的图。

图20.FACS分析。在含有金硫葡糖的情况下，在第1、3和4传代的hESC培养物的多潜能标志物Oct4和mAb 84的表达。

图21.连续每天加入法舒地尔、羟基法舒地尔和金硫葡糖9周对hESC细胞扩增的支持作用。(A)显示连续每天加入法舒地尔、羟基法舒地尔和金硫葡糖9周对hESC细胞扩增的支持作用在细胞密度方面与对照DE53微载体相似的图。(B)显示与对照的90％相比，9周后多潜能标志物Tra-1-60的表达对于法舒地尔和羟基法舒地尔为约80％，对于金硫葡糖为60％的图。(C)显示与对照的55％相比，9周后多潜能标志物Oct4的表达对于法舒地尔和羟基法舒地尔为约30-40％，对于金硫葡糖为50％的图。

图22.显示在拟胚体形成后，对照微载体以及羟基法舒地尔处理的微载体培养的hESC中分化标志物的凝胶电泳结果的照片。包括多潜能基因Nanog和Oct4的表达。

图23.显示在拟胚体形成后，法舒地尔和金硫葡糖处理的微载体培养的hESC中分化标志物的凝胶电泳结果的照片。包括多潜能基因Nanog和Oct4的表达。

图24.(A)显示单剂量加入(10μM)法舒地尔、羟基法舒地尔、金硫葡糖和Y27632 ROCK抑制剂6周(每周传代1次，P)能够支持hESC细胞的扩增在细胞密度方面与对照DE53微载体(500万/孔)相似的图。(B)显示6周后(P6-每周传代1次)，对于法舒地尔和Y27632 ROCK抑制剂来说，多潜能标志物Tra-1-60的表达为约80％，对于金硫葡糖为70％，对于羟基法舒地尔为50％的图。

图25.显示6周后(P6-每周传代1次)，对于法舒地尔和羟基法舒地尔、金硫葡糖和Y27632 ROCK抑制剂来说，多潜能标志物Oct4的表达非常相似(为60％)的图。

图26.显示与对照(Matrigel)培养相比，在含有ROCK抑制剂(Y-27632(10μM))的情况下在Cytodex 1(5mg/孔，1mg/ml)和DE53(20mg/孔，4mg/ml)微载体上培养的hESC细胞系HES-2的细胞(接种密度0.8×10⁵个细胞/ml)具有相似的细胞浓度的图。

图27.与对照(Matrigel涂覆的微载体)培养相比，在含有ROCK抑制剂(Y-27632(10μM))的情况下在Cytodex 1(5mg/孔，1mg/ml)和DE53(20mg/孔，4mg/ml)微载体上培养的hESC细胞系HES-2的细胞(接种密度0.8×10⁵个细胞/ml)中多潜能标志物表达(Tra-1-60)。FACS分析显示(A)在第5传代，Cytodex 1+Y-27632(10μM)上的Tra-1-60的表达为约94％，(B)在第5传代，DE53+Matrigel上的表达为约88％和(C)在第5传代，DE53+Y-27632(10μM)上的表达为约92％。

图28.显示在含有Y-27632(10μM)的情况下，在无血清培养基mTeSR1中DE53微载体上培养的人iPS细胞(IMR90)传代12次期间的细胞密度的图。

图29.显示在含有Y-27632(10μM)的情况下，在mTeSR1培养基中DE53微载体上培养的人iPS细胞(IMR90)在传代12次期间的多潜能标志物(A)Oct4和(B)Tra-1-60的表达的图。

图30.在含有Y-27632(10μM)的情况下，在mTeSR1培养基中DE53微载体上培养的人iPS细胞(IMR90)在第12传代的(A)Oct4和(B)Tra-1-60的FACS分析。

实施例

下列实施例提供了在不使用细胞外基质但添加ROCK抑制剂(Y-27632、HA1077或法舒地尔和金硫葡糖)的情况下，人胚胎干细胞在多种微载体(DE53、QA52、Tosoh、Cytodex 1、Cytodex 3)上稳定、长期增殖的证据。在传代5次或以上之后，hESC保留了它们的生长、最终细胞密度、多潜能标志物Oct4、Mab 84和TRA-1-60的表达以及正常染色体组型。

实施例1人胚胎干细胞(hESC)

人胚胎干细胞系HES-2(46X，X)和HES-3(46X，X)获自ES CellInternational。将细胞以获自2D集落培养的200×200μm细胞块的悬液或以获自微载体培养的细胞-微载体聚集体冷冻并保存在液氮中。

实施例2细胞培养：2D集落培养

对于hESC的维持，可以将细胞在37℃/5％CO₂的条件下，在Matrigel涂覆的培养皿上培养(在4℃与Matrigel(Becton Dickinson)培育过夜，在冷KO-DMEM中以1∶30稀释)。通常，将细胞维持在具有1ml培养基的器官培养皿(OCD)中。

所使用的培养基为来自MEF饲养细胞的条件培养基、StemPro hESC无血清培养基(Invitrogen)或mTeSR-1无血清培养基(Cell Technologies)。每天更换培养基。通过用胶原酶(Choo等人，2004)或trypLE Express(Invitrogen)酶促处理或者通过使用StemPro EZPassage干细胞传代工具(Invitrogen)机械分离使静态集落培养物每周传代。

实施例3细胞培养：3D微载体培养

将获自分散的2D集落培养或直接获自液氮储存(获自2D集落培养的200×200μm的组织或以细胞-微载体聚集体的形式)的细胞悬液以0.1-0.3×10⁶/ml的浓度接种到微载体悬液(4mg/ml)上。

在一些实验中，为了确保培养更均一，在加入到微载体悬液中之前，将细胞接种物通过100和500μm的网筛过滤。在37℃/5％CO₂的条件下，在未附着的6孔皿(Corning)上在静态条件下或者以100或150rpm(IKA定轨振荡器)搅拌培养细胞。所使用的培养基为MEF-CM或成分确定的培养基。每天更换培养基。在用胶原酶或trypLE酶促处理后或者在通过反复吸取机械分离后，以1∶2至1∶10的分种率使培养每周传代。通过将汇合的细胞-微载体聚集体置于具有8ml培养基的Matrigel涂覆的6cm组织培养皿中并将细胞培养7天，完成了微载体培养向2D集落培养的继代(replate)。

实施例4旋转培养

将hESC以在5mg/ml微载体上3×10⁵个细胞/ml的密度接种到位于37℃和5％CO₂条件下的受控培养箱内部的硅化(Sigmacote，SL2Sigma-Aldrich)的100ml Bellco转瓶中，初始体积为25ml，不加搅拌。

加入新鲜条件培养基使反应器体积增加至50ml，并且在接种后以30rpm搅拌12小时。每天除去80％使用过的培养基并用新鲜条件培养基替换。每天取样用于细胞计数和代谢产物分析。

实施例5 在不存在Matrigel但存在ROCK抑制剂的情况下在微载体上的培养

材料和方法

用于微载体上hESC培养的条件培养基的制备

根据我们所发表的规程(protocol，试验方案)-Choo等人，2007(Identification of proteins from feeder conditioned medium that supporthuman embryonic stem cells.J.Biotechnol.130，320-328)制备了条件培养基。

hESC在DE53、QA52、Tosoh、Cytodex 1和Cytodex 3微载体上的接种

将hESC接种到未涂覆的微载体上并且按照实施例3和Oh等人，2009(Long term microcarrier suspension cultures of human embryonic stem cells，Stem Cell Research(2009))中的(试验)规程每周进行传代。

ROCK抑制剂的制备

Y-27632-10mM储液：将5mg溶解在1.48ml水中。

HA1077(法舒地尔)-10mM储液：将5mg溶解在1.37ml水中。

金硫葡糖(AuTG)-10mM储液：将5mg溶解在1.28ml水中。

所有化学品均购自Calbiochem。在将hESC接种到微载体上之前，将所有抑制剂在条件培养基中稀释至它们的最终工作浓度。

多潜能标志物的FACS鉴定

根据我们最近发表的论文Oh等人，2009(Long term microcarriersuspension cultures of human embryonic stem cells，Stem Cell Research(2009))进行了鉴定。

简要地，通过使用流式细胞术的免疫荧光法评价了hESC群体中胞外抗原TRA-1-60和胞内转录因子Oct-4的表达水平。使用胰蛋白酶或trypLE表达将细胞以单细胞悬液收集，通过40μm筛网(BD)滤过、固定、渗透(Caltag Laboratories)并与抗TRA-1-60的一抗(1∶50稀释，Chemicon，MAB4360/4381)和抗Oct-4的一抗(1∶20稀释，Santa Cruz)一起培育。

然后用1％的BSA/PBS清洗细胞，并且在黑暗中与1∶500稀释的FITC结合的山羊抗α小鼠抗体(DAKO)一起培育。培育后，再次用1％的BSA/PBS清洗细胞并将细胞再悬浮在该溶液中以用于在FACScan(BectonDickinson FACS Calibur)上进行分析。所有培育在室温下进行15分钟。

染色体组分型

在37℃/5％CO₂的条件下与1ml KO培养基稀释的秋水仙胺溶液一起培育15-16小时后，在细胞分裂中期停止hESC的活跃生长培养。细胞遗传学分析转交给KK妇幼医院(KK Women’s and Children’s Hospital，Singapore)的细胞遗传学实验室进行。

SEM

在新加坡分子细胞生物学研究所的SEM组进行了扫描电子显微照相。

结果

在以下讨论中，在下列标题下的内容中说明了无Matrigel的微载体上hESC的培养：

1.在具有ROCK抑制剂Y-27632的情况下，hESC在纤维素DE53微载体上长期培养9周。

2.在具有ROCK抑制剂Y-27632的情况下，hESC在球形Tosoh微载体上长期培养6周。

3.在具有ROCK抑制剂Y-27632的情况下，hESC在纤维素DE53、Tosoh、Cytodex 1和Cytodex 3微载体上长期培养的比较。

4.在具有ROCK抑制剂Y-27632的情况下，hESC在纤维素DE53上的扫描电子显微照片。

5.在具有ROCK抑制剂Y-27632的情况下，5至10周时的hESC在纤维素DE53、QA52、Tosoh和Cytodex 3微载体上的染色体组型。

6.在具有替代ROCK抑制剂HA1077(法舒地尔)和金硫葡糖的情况下，hESC在纤维素DE53微载体上培养2周。

在具有ROCK抑制剂Y-27632的情况下，hESC在纤维素DE53微载体上 长期培养9周

图1显示在具有以10μM添加的ROCK抑制剂Y-27632的情况下，hESC可以在纤维素DE53微载体上连续传代9周。在6孔板中(每个孔的体积为4ml)，所达到的细胞密度从300至750万/孔。然而，在没有ROCK抑制剂Y-27632的情况下，细胞数显著降低并且传代不能超过4周。hESC围绕微载体形成汇合聚集体。图2显示在不含Matrigel但含有ROCK抑制剂的情况下，微载体培养中的多潜能标志物Oct4和mAb 84在3周内稳定表达，但是不含ROCK抑制剂时，标志物显著下调。在不含Matrigel但含有ROCK抑制剂Y-27632的情况下，到第9周时微载体培养中的多潜能标志物Oct4、mAb 84和Tra-1-60的表达仍然稳健(图3)。

在具有ROCK抑制剂Y-27632的情况下，hESC在球形Tosoh微载体上长 期培养6周

图4显示在不含Matrigel但添加了ROCK抑制剂Y-27632的情况下，hESC在通过聚赖氨酸而已经带正电荷的球形Tosoh 65微米微载体上连续传代6周。细胞数的范围在300至500万/孔。传代4次时，多潜能标志物Oct4和Tra-1-60强烈表达。然而，在没有ROCK抑制剂Y-27632的情况下，细胞数在第2传代显著降低，并且所保留的细胞显示多潜能标志物Tra-1-60显著下调。

在具有ROCK抑制剂Y-27632的情况下，hESC在纤维素DE53、Tosoh、 Cytodex 1和Cytodex 3微载体上长期培养5周的比较

图5显示在不含Matrigel但含有ROCK抑制剂Y-27632的情况下，hESC在纤维素、Tosoh、Cytodex 1和Cytodex 3微载体上连续传代5周。具体地，传代5次时(在第5传代)，Cytodex 1和Cytodex 3上所获得的细胞数似乎较高，其范围在500至700万/孔，而纤维素和Tosoh微载体上达到400万/孔。显示了在不含Matrigel但含有ROCK抑制剂Y-27632的情况下，hESC在纤维素、Tosoh、Cytodex 1和Cytodex 3微载体上的照片(图6)。hESC群集在所有这些微载体培养上表现出汇合。图7显示在不含Matrigel但含有ROCK抑制剂Y-27632的情况下，传代5次时Cytodex1、Cytodex 3、纤维素和Tosoh微载体上培养的hESC的多潜能标志物Oct4和mAb 84的表达稳健。

在含有ROCK抑制剂Y-27632的情况下，hESC在纤维素DE53上的扫描 电子显微照片

图8显示在不含Matrigel但含有ROCK抑制剂Y-27632的情况下，hESC在纤维素微载体上的扫描电子显微照片(SEM)。hESC围绕纤维素微载体形成了紧密并且汇合的细胞聚集体。图9显示在不含Matrigel但含有ROCK抑制剂Y-27632的情况下，hESC在纤维素微载体上的SEM的第二个实例。

在含有ROCK抑制剂Y-27632的情况下，hESC在纤维素DE53、QA52、 Tosoh和Cytodex 3微载体上5至10周之间的染色体组型

图10显示分别在第8和第7传代时，DE53和QA52纤维素微载体上培养的hESC保留了稳定的染色体组型。类似地，图11显示分别在第10和第5传代时，球形聚赖氨酸涂覆的Tosoh和Cytodex 3微载体上培养的hESC的稳定染色体组型。

在具有替代ROCK抑制剂HA1077(法舒地尔)和金硫葡糖的情况下，hESC 在纤维素DE53微载体上培养2周

评价了其它类型的ROCK抑制剂，其包括：

1.HA1077(法舒地尔)：ROCK抑制剂

2.金硫葡糖：NF-κB抑制剂

3.LY 294002：P13K抑制剂

4.羟基法舒地尔：ROCK抑制剂

5.ρ激酶抑制剂I：ROCK抑制剂

6.ρ激酶抑制剂II：ROCK抑制剂

所使用的对照为涂覆有Matrigel的DE53微载体。还使用了空白，其包含加入到未涂覆的DE53中的0.02μl DMSO。

在不含Matrigel的情况下，传代0次和1次时，抑制剂HA1077(以10和40μM添加)和金硫葡糖(以10μM添加)支持hESC在纤维素微载体上稳健生长(图12)。细胞数达到600至900万/孔，这相当于使用Matrigel涂层的对照培养(在第1传代达到800万/孔)。图13和14显示与使用Matrigel涂层的对照相比，在含有抑制剂HA1077和金硫葡糖的情况下，传代0次和1次时hESC培养(物)的多潜能标志物Oct4和mAb 84的稳定表达。最后，图15显示在含有替代ROCK抑制剂金硫葡糖和HA1077(法舒地尔)的情况下，hESC在微载体上的汇合培养照片。

到目前为止，在存在金硫葡糖的情况下，我们已成功地将hESC传代4次，其能够强烈表达多潜能标志物Oct4和mAb 84(参见图19和20)。

该数据表明在含有ROCK抑制剂Y-27632的情况下，5种类型的微载体(均未涂覆)：纤维素DE53、QA52、Tosoh、Cytodex 1和Cytodex 3均能够支持hESC的长期培养。如HA1077(法舒地尔)和金硫葡糖的其它抑制剂也能够在不含有Matrigel的情况下支持hESC培养。

实施例6

对多种ROCK抑制剂(10μM)测试了它们在无基质的纤维素DE53微载体上支持hESC(HES-2)细胞培养的能力。这些多种ROCK抑制剂包括法舒地尔、羟基法舒地尔和金硫葡糖，并且将它们与对照(涂覆了Matrigel的DE53微载体)进行了比较。

对9周内(每周传代1次)连续添加ROCK抑制剂进行了测试，其结果显示在图21(A-C)中。每天连续添加法舒地尔、羟基法舒地尔和金硫葡糖9周能够支持hESC细胞扩增从而在细胞密度方面与对照DE53微载体相似(图21A)。与对照的90％相比，9周后对于法舒地尔和羟基法舒地尔来说，多潜能标志物Tra-1-60的表达为约80％，而金硫葡糖的为60％(图21B)。与对照的55％相比，9周后对于法舒地尔和羟基法舒地尔来说，多潜能标志物Oct4的表达为约30-40％，而金硫葡糖的为50％(图21C)。

单剂量加入法舒地尔、羟基法舒地尔、金硫葡糖和Y27632六周能够支持hESC(HES-2)细胞扩增从而在细胞密度方面与对照DE53微载体(500万/孔)相似(图24A)。6周后，对于法舒地尔和Y27632来说，多潜能标志物Tra-1-60的表达为约80％，对于金硫葡糖为70％，而对于羟基法舒地尔为50％(图24B)。6周后，对于法舒地尔和羟基法舒地尔、金硫葡糖以及Y27632 ROCK抑制剂来说，多潜能标志物Oct4的表达非常相似，为60％(图25)。

实施例7在具有ROCK抑制剂的情况下，iPS细胞在微载体上的培养

在含有Y-27632(10μM)的情况下，Cytodex 1和DE53微载体上培养的HES-2细胞显示出与对照培养(涂覆了Matrigel的Cytodex 1或DE53)类似的细胞浓度和多潜能标志物表达(Tra-1-60)(图26和图27)。

实施例8在具有ROCK抑制剂的情况下，iPS细胞在微载体上的培养

在具有20mg未涂覆DE53、5ml无血清培养基mTeSR1、4μl ROCK抑制剂(Y27632)[10μM]的6孔板的孔中培养了iPS IMR90细胞(1.6×10⁵个细胞/ml)。每天更换80％的培养基并加入抑制剂。

在传代12次期间，细胞密度稳定(图28)。在传代12次期间，Oct4和Tra-1-60的表达稳定(图29和图30)。

实施例9在不存在Matrigel的情况下，ROCK抑制剂如何维持hESC和hiPS微载体培养

我们证明在不存在Matrigel的情况下，在多种微载体(DE53、Cytodex和Tosoh)上，2种hESC(HES2和HES3)以及2种人iPS(IMR90和包皮(foreskin))细胞系可以维持10周以上，并同时保留它们的多潜能性。

在检验了使用ROCK抑制剂长期培养hESC的这种不常见现象的同时，通过对不使用Matrigel的ROCK抑制剂微载体培养、使用Matrigel的微载体培养和使用Matrigel的常规单层培养的微阵列研究，我们比较了基因表达并且发现使用ROCK抑制剂处理后，一组常见的141个基因的差异上调或下调超过2倍。

对Panther数据库(http://www.pantherdb.org/)中162条途径的途径基分析显示了富含差异表达的基因的5条相关途径。在这些途径中，与整联蛋白/胶原合成有关的几个基因、FOX转录因子和TGF-β基因上调，而多个钙粘素基因下调。

参考文献

Chin，A.C.P.，Fong，W.J.，Goh，L.T.，Philp，R.，Oh，S.K.，Choo，A.B.，2007.Identification of proteins from feeder conditioned medium that supporthuman embryonic stem cells.J.Biotechnol.130，320-328.

Oh，SKW，Chen AK，Mok Y，Chen X，Lim Um，Chin A，Choo ABH，andReuveny S.Long-term microcarrier suspension cultures of human embryonicstem cells.Stem Cell Research.2：219-230.2009.

本文中提到的每篇专利申请和专利，以及在以上每篇专利申请和专利中引用或参考的每篇文献，包括在每篇专利申请和专利(“申请引用文献”)的审查期间，以及在每篇专利申请和专利中以及在任何申请引用文献中引用或提到的任何产品的任何生产商的说明书或目录，均作为参考并入本文。此外，本文中引用的所有文献，以及在本文中引用的文献中引用或参考的所有文献，以及在本文中引用或提到的任何产品的任何生产商的说明书或目录均作为参考并入本文。

在不背离本发明范围和精神的前提下，对本发明所述的方法和系统的各种改变和变化将对本领域技术人员来说是显而易见的。尽管已结合具体的优选实施方式说明了本发明，但是应理解所主张的本发明不应过度受限于这些具体实施方式并且可以在本发明的范围内对其进行多种改变或添加。事实上，对实施本发明的所述形式的多种改变对于分子生物学或相关领域的那些技术人员来说是显而易见的，并且旨在包含于权利要求的范围内。此外，在不背离本发明的范围的情况下，可以将从属权利要求的特征与独立权利要求的特征进行多种组合。

Claims (48)

1.体外培养多潜能或多能细胞的方法，所述方法包括：

(i)将多潜能或多能细胞连接至多个微载体上以形成微载体-细胞复合物，以及

(ii)在存在ROCK抑制剂的情况下，在悬浮培养中培养所述微载体-细胞复合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述ROCK抑制剂选自：Y-27632、HA-1077(法舒地尔)、HA-1100(羟基法舒地尔)、H-1152、3-(4-吡啶基)-1H-吲哚、N-(4-吡啶基)-N′-(2，4，6-三氯苯基)脲、金硫葡糖、LY294002或其盐、碱、酯或前药。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法还包括使来自(ii)的所述培养的细胞传代，其中传代后的细胞为多潜能或多能的。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法还包括：

(iii)使来自(ii)的所述培养的细胞传代；和

(iv)经过至少2次传代，重复步骤(i)-(iii)，

其中，在步骤(iv)之后培养的细胞是多潜能或多能的。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述微载体不具有基质涂层。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述微载体的表面涂覆有基质。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述基质包括细胞外基质组分。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述基质包括MatrigelTM(BDBiosciences)、透明质酸、层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、胶原、弹性蛋白、硫酸乙酰肝素、葡聚糖、硫酸葡聚糖、硫酸软骨素中的一种或多种。

9.根据权利要求6所述的方法，其中所述基质包括层粘连蛋白、I型胶原、硫酸乙酰肝素蛋白多糖和内功素1的混合物。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述细胞为干细胞。

11.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述细胞为胚胎干细胞。

12.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述细胞为诱导性多潜能干细胞。

13.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述细胞为成体干细胞。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述细胞为哺乳动物、灵长类或人。

15.根据权利要求4至14中任一项所述的方法，其中在步骤(iv)中，经过下列之一重复步骤(i)-(iii)：至少传代3次、至少传代4次、至少传代5次、至少传代6次、至少传代7次、至少传代8次、至少传代9次、至少传代10次、至少传代11次、至少传代12次、至少传代13次、至少传代14次、至少传代15次、至少传代16次、至少传代17次、至少传代18次、至少传代19次、至少传代20次、至少传代21次、至少传代22次、至少传代23次、至少传代24次、至少传代25次、至少传代30次、至少传代40次、至少传代50次、至少传代60次、至少传代70次、至少传代80次、至少传代90次、至少传代100次。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述微载体包含纤维素、葡聚糖、羟基化甲基丙烯酸酯、胶原、明胶、聚苯乙烯、塑料、玻璃、陶瓷、硅酮中的一种或多种，或者由纤维素、葡聚糖、羟基化甲基丙烯酸酯、胶原、明胶、聚苯乙烯、塑料、玻璃、陶瓷、硅酮中的一种或多种组成。

17.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述微载体为大孔或微孔carboseed微载体。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述微载体偶联有鱼精蛋白或聚赖氨酸。

19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述微载体带正电荷。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述微载体带正表面电荷。

21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述微载体是亲水性的。

22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述微载体是杆状的。

23.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述微载体具有基本球形形状。

24.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中在步骤(ii)中，将所述细胞培养足以使在培养中的细胞的数目扩增的一段时间。

25.根据权利要求4至24中任一项所述的方法，其中在步骤(iv)之后，至少60％的在培养中的细胞是多潜能或多能的。

26.根据权利要求4至25中任一项所述的方法，其中在步骤(iv)之后，至少60％的在培养中的细胞表达Oct4、SSEA4、TRA-1-60和Mab84中的一种、两种、三种或全部。

27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述方法包括在无血清培养基、或干细胞条件培养基或无饲养细胞条件下培养所述细胞。

28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中还将饲养细胞连接到所述微载体上。

29.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述培养还包括连接到与所述多潜能或多能细胞所连接的微载体不同的微载体上的饲养细胞。

30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，还包括诱导获自所述培养的多潜能或多能细胞的分化。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述方法包括将所述微载体-细胞复合物置于诱导所述细胞分化的条件下。

32.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述方法包括将获自所述培养法的多潜能或多能细胞与所述微载体分离，并且在诱导所述细胞分化的条件下在非微载体培养中培养所述分离的细胞的步骤。

33.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，还包括获自所述培养法的多潜能或多能细胞的体外分化，其包括：

(a)将获自所述培养法的多潜能或多能细胞连接至多个第二微载体上以形成微载体-细胞复合物，

(b)在诱导所述细胞分化的条件下，在悬浮培养中培养来自(a)的所述微载体-细胞复合物。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述方法还包括：

(c)将获自步骤(b)的分化的细胞连接至多个第三微载体上以形成微载体-细胞复合物；和

(d)在诱导已分化细胞进一步分化的条件下，在悬浮培养中培养来自(c)的所述微载体-细胞复合物。

35.根据权利要求30至34中任一项所述的方法，其中所述分化培养条件包括在存在ROCK抑制剂的情况下培养所述细胞。

36.根据权利要求30至34中任一项所述的方法，其中所述分化培养条件包括在没有ROCK抑制剂的情况下培养所述细胞。

37.通过根据权利要求1至29中任一项所述的方法获得的多潜能或多能细胞。

38.通过根据权利要求30至36中任一项所述的方法获得的分化细胞。

39.根据权利要求30至36中任一项所述的方法，其中培养所述分化的细胞以形成拟胚体。

40.通过根据权利要求39所述的方法获得的拟胚体。

41.一种使多潜能或多能细胞体外分化的方法，所述方法包括将多潜能或多能细胞连接至多个微载体上以形成微载体-细胞复合物，其中所述微载体的表面未涂覆或涂覆有基质，以及在存在ROCK抑制剂的情况下和在诱导所述细胞分化的条件下，在悬浮培养中培养所述微载体-细胞复合物。

42.多潜能或多能细胞的悬浮培养，其中将所述细胞连接到多个微载体上，由此形成微载体-细胞复合物，并且所述悬浮培养基包含ROCK抑制剂。

43.根据权利要求42所述的悬浮培养，其中所述ROCK抑制剂以至少1μM的浓度存在于所述培养基中。

44.根据权利要求42所述的悬浮培养，其中所述ROCK抑制剂以至少10μM的浓度存在于所述培养基中。

45.根据权利要求42至44中任一项所述的悬浮培养，其中所述ROCK抑制剂选自：Y-27632、HA-1077(法舒地尔)、HA-1100(羟基法舒地尔)、H-1152、3-(4-吡啶基)-1H-吲哚、N-(4-吡啶基)-N′-(2，4，6-三氯苯基)脲、金硫葡糖、LY294002或其盐、碱、酯或前药。

46.ROCK抑制剂在多潜能或多能细胞体外悬浮培养中的应用，其中所述细胞处于微载体-细胞复合物的形式。

47.ROCK抑制剂在体外悬浮培养的多潜能或多能细胞的分化中的应用，其中所述细胞处于微载体-细胞复合物的形式。

48.根据权利要求46或权利要求47所述的应用，其中所述ROCK抑制剂选自：Y-27632、HA-1077(法舒地尔)、HA-1100(羟基法舒地尔)、H-1152、3-(4-吡啶基)-1H-吲哚、N-(4-吡啶基)-N′-(2，4，6-三氯苯基)脲、金硫葡糖、LY294002或其盐、碱、酯或前药。

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