JP6962814B2

JP6962814B2 - 間葉系幹細胞培養用培地、間葉系幹細胞の培養方法及び間葉系幹細胞

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Publication number: JP6962814B2
Application number: JP2017502532A
Authority: JP
Inventors: 芳史池山; 徹大久保; 浩之西田; 智博津田; 栄子宇野; 真代湯本
Original assignee: Rohto Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Rohto Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2015-02-27
Filing date: 2016-02-26
Publication date: 2021-11-05
Anticipated expiration: 2036-02-26
Also published as: WO2016136986A1; EP3263697B1; US20180066231A1; EP3263697A4; JPWO2016136986A1; EP3263697A1

Description

本発明は、間葉系幹細胞培養用培地、間葉系幹細胞の培養方法及び間葉系幹細胞に関する。

昨今、生体の細胞あるいは組織を利用した医薬品の開発や再生医療の研究が進み、注目されている。このうち、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞は、臓器再生技術として研究が加速されている。一方、骨髄幹細胞等体性幹細胞を抽出して利用する細胞療法は、再生医療の中でも病気による組織障害を改善・修復する本来の体性幹細胞の機能を利用するもので、より実現性の高いものとして注目され、研究が進められている。体性幹細胞は、一般的には、全ての臓器や組織に分化できるわけでなく特定の組織や臓器に分化する。体性幹細胞には様々な種類があり、間葉系幹細胞もそれらのうちのひとつである。

臍帯には、多種類の細胞のもとになる体性幹細胞が豊富に含まれている。例えばそこには臍帯血由来の造血幹細胞も含まれており、既に白血病や再生不良性貧血等の難治性血液疾患の治療に使われている。また、臍帯は、この他に、間葉系幹細胞に分類される細胞や、神経・筋肉・心臓・血管・骨・皮膚等、多様な細胞に分化できる能力を持つ多能性幹細胞様細胞等の様々な幹細胞を含んでいる。

一方、間葉系幹細胞の培養の為に様々な培地が開発されているが（例えば特許文献１及び２参照）、さらに、移植等による疾患の治療により適した幹細胞を、未分化性を保持したまま、大量に、効率的に、かつ長期に渡って培養できる培地の開発が望まれている。

米国特許公開２０１０００１５７１０号特開２０１０−０９４０６２号公報

本発明は、上記従来技術に鑑みてなされたものであり、間葉系幹細胞の未分化性を保持したまま、大量に、効率的に、かつ長期に渡って培養できる培地、特に間葉系幹細胞の中でもより臍帯幹細胞の培養に適した間葉系幹細胞培養用培地を提供することを目的とする。

本発明者らは前記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、動物細胞培養用基礎培地に、特定の成分を添加した培地が間葉系幹細胞の培養に適していることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明の要旨は以下の通りである。

（１）ＰＴＥＮ阻害剤、ｐ５３阻害剤、ｐ３８阻害剤、Ｗｎｔシグナル活性化剤及びＲＯＣＫ阻害剤からなる群より選択される少なくとも２種の成分と、動物細胞培養用基礎培地とを含有する、間葉系幹細胞培養用培地。
（２）ＰＴＥＮ阻害剤、ｐ５３阻害剤、ｐ３８阻害剤、Ｗｎｔシグナル活性化剤及びＲＯＣＫ阻害剤からなる群より選択される少なくとも３種の成分と、動物細胞培養用基礎培地とを含有する、（１）記載の間葉系幹細胞培養用培地。
（３）ＰＴＥＮ阻害剤、ｐ５３阻害剤、ｐ３８阻害剤、Ｗｎｔシグナル活性化剤及びＲＯＣＫ阻害剤を含有する、（１）又は（２）記載の間葉系幹細胞培養用培地。
（４）増殖因子及びステロイド性化合物からなる群より選択される少なくとも１種の成分をさらに含有する、（１）から（３）のいずれか記載の間葉系幹細胞培養用培地。
（５）前記ＰＴＥＮ阻害剤が、ＶＯ−ＯＨＰｉｃ、ＨＯＰｉｃ及びｐＶからなる群より選択される、（１）から（４）のいずれか記載の間葉系幹細胞培養用培地。
（６）前記ｐ５３阻害剤が、オルトバナジン酸ナトリウム、ピフィスリン−α及びＭＤＭ２タンパク質からなる群より選択される、（１）から（５）のいずれか記載の間葉系幹細胞培養用培地。
（７）前記ｐ３８阻害剤が、ＳＢ２０３５８０、ＳＢ２０２１９０、ＢＩＲＢ７９６、ＬＹ２２２８８２０、ＶＸ−７０２、ＰＨ−７９７８０４、ＴＡＫ―７１５、ＶＸ−７４５、及びＳｋｅｐｉｎｏｎｅ−Ｌからなる群より選択される、（１）から（６）のいずれか記載の間葉系幹細胞培養用培地。
（８）前記Ｗｎｔシグナル活性化剤が、ＬｉＣｌ又は補体分子Ｃ１ｑである、（１）から（７）のいずれか記載の間葉系幹細胞培養用培地。
（９）前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、Ｋ−１１５及び塩酸ファスジルからなる群より選択される、（１）から（８）のいずれか記載の間葉系幹細胞培養用培地。
（１０）（１）から（９）のいずれか記載の間葉系幹細胞培養用培地を用いて、間葉系幹細胞を培養する、間葉系幹細胞の培養方法。
（１１）（１）から（９）のいずれか記載の間葉系幹細胞培養用培地で培養された、ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５及びＣＤ１６６陽性である間葉系幹細胞。

本発明の間葉系幹細胞培養用培地を用いて間葉系幹細胞を培養すると、その未分化性を長期に渡って維持することができる。また、本発明の培地は、従来の培地に比べて、間葉系幹細胞を長期に渡って良好な細胞状態を維持しながら、より効率的に増殖させることができる。

本発明の培地で培養３日目の臍帯幹細胞及び脂肪由来幹細胞の写真である。本発明の培地による臍帯幹細胞及び脂肪由来幹細胞の増殖を示すグラフである。本発明の培地で培養８日目の臍帯幹細胞及び脂肪由来幹細胞の写真である。本発明の培地で培養８日目の脂肪由来幹細胞の細胞表面マーカー発現を示す図である。本発明の培地で培養８日目の臍帯幹細胞の細胞表面マーカー発現を示す図である。本発明の培地で培養１１日目の臍帯幹細胞の細胞表面マーカー発現を示す図である。本発明の培地による臍帯幹細胞の増殖を示すグラフである。本発明の培地で培養５日目の脂肪由来幹細胞の写真である。本発明の培地で培養５日目の臍帯幹細胞の写真である。本発明の培地で培養３週間目の臍帯幹細胞の細胞表面マーカー（ＣＤ１０５）発現を示す図である。本発明の培地又は従来の培地で培養して得られた臍帯由来間葉系幹細胞の、酸化ストレス耐性の比較を示す図である。本発明の培地による臍帯幹細胞の長期間培養での増殖を示すグラフである。本発明の培地による臍帯幹細胞の長期間培養での増殖を示すグラフである。本発明の培地で長期培養した臍帯幹細胞の写真である。本発明の培地による臍帯幹細胞の増殖を示すグラフである。本発明の培地による臍帯幹細胞の増殖を示すグラフである。

［間葉系幹細胞培養用培地］
本発明の間葉系幹細胞培養用培地は、ＰＴＥＮ阻害剤、ｐ５３阻害剤、ｐ３８阻害剤、Ｗｎｔシグナル活性化剤及びＲＯＣＫ阻害剤からなる群より選択される少なくとも２種の成分と、動物細胞培養用基礎培地とを含有する。本発明の培地は、これらの成分を含有することで、間葉系幹細胞の未分化性を長期に渡って維持しながら培養することができる。ここで「長期に渡って」とは、８日間以上であり、好ましくは１５日間以上であり、より好ましくは３０日間以上であり、さらに好ましくは５０日間以上であり、特に好ましくは６０日間以上である。また、本発明の培地は、間葉系幹細胞を長期に渡って良好な細胞状態を維持しながら、効率的に増殖させることができる。なお、細胞の状態が良好であるか否かは、細胞の形態、増殖速度等から当業者の技術常識に基づいて判断することができる。さらに予想もできなかった効果として、本発明の培地で培養することで、間葉系幹細胞の酸化ストレス耐性機能を向上させることができる。本発明の培地は、増殖因子及びステロイド性化合物からなる群より選択される少なくとも１種の成分をさらに含有することが好ましい。なお、本発明の培地は発明の効果を損なわない範囲でその他の成分を含有していてもよい。以下に、本発明の培地について説明する。

本明細書において、間葉系幹細胞とは、間葉系に属する細胞（骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等）への分化能を有し、当該能力を維持したまま増殖できる細胞を意味する。

本明細書において、臍帯幹細胞とは、臍帯及び臍帯関連組織並びに臍帯血に由来する幹細胞をいう。具体的には、臍帯とそれを囲む構造体由来の間葉系幹細胞であり、より具体的には臍帯、及び胎盤、羊膜、絨毛膜、脱落膜、卵膜、ワルトン膠質（ウォートンゼリー；Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓＪｅｌｌｙ）等の臍帯周辺の構造体、並びに臍帯血由来の間葉系幹細胞である。これらのうち、好ましくは、ワルトン膠質（ウォートンゼリー；Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓＪｅｌｌｙ）、羊膜由来の間葉系幹細胞であり、より好ましくはワルトン膠質（ウォートンゼリー；Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓＪｅｌｌｙ）由来の間葉系幹細胞である。また、本明細書において、脂肪幹細胞又は脂肪由来幹細胞とは、脂肪組織に由来する幹細胞をいう。具体的には、脂肪組織由来の間葉系幹細胞である。

（ＰＴＥＮ阻害剤）
本発明においてＰＴＥＮ阻害剤とは、ＰＴＥＮ（ＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅａｎｄＴｅｎｓｉｎＨｏｍｏｌｏｇＤｅｌｅｔｅｄｆｒｏｍＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅ１０）遺伝子、又はＰＴＥＮタンパク質の作用を阻害する機能を有するすべての物質をいう。ＰＴＥＮ遺伝子は、染色体上の１０ｑ２３．３に位置し、腫瘍抑制因子として同定されている。ＰＴＥＮタンパク質は広く全身の細胞に発現しており、イノシトールリン脂質であるフォスファチジルイノシトール３，４，５−トリフォスフェイト（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ３，４，５−ｔｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＰＩＰ３）の脱リン酸化反応を触媒する酵素として知られている。ＰＩＰ３は、ＰＩ３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）により細胞内で合成され、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）／ＡＫＴの活性化を引き起こす。ＰＴＥＮは、このＰＩＰ３の脱リン酸化反応を担い、フォスファチジルイノシトール４，５−ビスフォスフェイト（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ４，５−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＰＩＰ２）に変換する作用があるとされている。従って、ＰＴＥＮは、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ情報伝達系を負に制御する。ＰＴＥＮの活性が阻害されると、細胞内にＰＩＰ３が蓄積し、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ情報伝達系が活性化する。

本発明におけるＰＴＥＮ阻害剤としては、バナジウムを含む化合物が好ましく、例えばｐＶ（ｐｈｅｎｂｉｇ）（ジカリウムビスペロキソ（フェニルビグアニド）オキソバナデート）、ＨＯｐｉｃ（ｂｐＶ）（ジカリウムビスペロキソ（５−ヒドロキシピリジン−２−カルボキシル）オキソバナデート）、ＶＯ−ＯＨＰｉｃ三水和物（（ＯＣ−６−４５）Ａｑｕａ（３−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボキシラト−ｋａｐａＮ１，ｋａｐａＯ２）［３−（ヒドロキシ−ｋａｐａＯ）−２−ピペリジンカルボキシラト（２−）−ｋａｐａＯ２］オキソ−バナジン酸（１−），水素三水和物）等が挙げられる。これらのうち、ＶＯ−ＯＨＰｉｃ、ＨＯｐｉｃ、ｐＶがより好ましい。ＶＯ−ＯＨＰｉｃ、ＨＯｐｉｃ、ｐＶのいずれでも十分な効果が得られるが、ｐＶがさらに好ましい。これらは単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いることもできる。

本発明の間葉系幹細胞培養用培地におけるＰＴＥＮ阻害剤の培地中の濃度としては、本発明の効果の観点から、１０ｎＭ〜１０μＭが好ましく、５０ｎＭ〜１μＭがより好ましく、１００ｎＭ〜７５０ｎＭがさらに好ましく、２５０ｎＭ〜７５０ｎＭが特に好ましい。

（ｐ５３阻害剤）
本発明においてｐ５３阻害剤とは、ｐ５３遺伝子又はｐ５３タンパク質の作用を阻害する機能を有するすべての物質をいう。ｐ５３遺伝子は、染色体上の１７ｐ１３．１に位置し、腫瘍抑制遺伝子としても知られている。ｐ５３タンパク質は、転写因子として作用し、多様な生理活性を有する。

本発明におけるｐ５３阻害剤としては、例えばオルトバナジン酸ナトリウム、ピフィスリン−α、ＭＤＭ２タンパク質等が挙げられる。これらのうち、オルトバナジン酸ナトリウム、ピフィスリン−α、ＭＤＭ２タンパク質が好ましい。オルトバナジン酸ナトリウム、ピフィスリン−α、ＭＤＭ２タンパク質のいずれでも十分な効果が得られるが、ピフィスリン−αがより好ましい。これらは単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いることもできる。

本発明の間葉系幹細胞培養用培地におけるｐ５３阻害剤の濃度は、本発明の効果の観点から、１００ｎＭ〜１ｍＭであることが好ましく、５００ｎＭ〜５００μＭであることがより好ましく、１μＭ〜１００μＭであることがさらに好ましい。

（ｐ３８阻害剤）
本発明においてｐ３８阻害剤とは、ｐ３８遺伝子又はｐ３８タンパク質の作用を阻害する機能を有するすべての物質をいう。ｐ３８は、セリン/スレオニンキナーゼであるＭＡＰキナーゼ（Ｍｉｔｏｇｅｎ−ＡｃｔｉｖａｔｅｄＰｒｏｔｅｉｎＫｉｎａｓｅ）の１つである。ＭＡＰキナーゼは、外界刺激を伝達するシグナル分子、細胞増殖、分化、遺伝子発現、アポトーシス等への関与が明らかにされている。

本発明におけるｐ３８阻害剤としては、例えばＳＢ２０３５８０（Ｍｅｔｈｙｌ［４−［４−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）−１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌ−２−ｙｌ］ｐｈｅｎｙｌ］ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）、ＳＢ２０２１９０（４−［４−（４−Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）−１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌ−２−ｙｌ］ｐｈｅｎｏｌ）、ＢＩＲＢ７９６（Ｄｏｒａｍａｐｉｍｏｄ；１−［５−ｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌ−２−（４−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−ｐｙｒａｚｏｌｅ−３−ｙｌ］−３−［４−（２−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈｏｘｙ）−１−ｎａｐｈｔｈｙｌ］ｕｒｅａ）、ＬＹ２２２８８２０（５−［２−（１，１−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ）−５−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌ−４−ｙｌ］−３−（２，２−ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｙｌ）−３Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏ［４，５−ｂ］ｐｙｒｉｄｉｎ−２−ａｍｉｎｅｄｉｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、ＶＸ−７０２（２−（２，４−Ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−６−［（２，６−ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）（ａｍｉｎｏｃａｒｂｏｎｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｐｙｒｉｄｉｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ＰＨ−７９７８０４（Ｎ，４−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−３−［３−ｂｒｏｍｏ−４−［（２，４−ｄｉｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｙｌ）ｏｘｙ］−６−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｏｘｏ−１，２−ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ−１−ｙｌ］ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、ＴＡＫ−７１５（Ｎ−［４−［２−Ｅｔｈｙｌ−４−（３−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｔｈｉａｚｏｌｅ−５−ｙｌ］−２−ｐｙｒｉｄｙｌ］ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、ＶＸ−７４５（５−（２，６−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−［２，４−ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｔｈｉｏ］−６Ｈ−ｐｙｒｉｍｉｄｏ［１，６−ｂ］ｐｙｒｉｄａｚｉｎ−６−ｏｎｅ）、及びＳｋｅｐｉｎｏｎｅ−Ｌ（（２Ｒ）−３−［８−［（２，４−Ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ａｍｉｎｏ］−５−ｏｘｏ−５Ｈ−ｄｉｂｅｎｚｏ［ａ，ｄ］ｃｙｃｌｏｈｅｐｔｅｎｅ−３−ｙｌｏｘｙ］−１，２−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ）等が挙げられる。これらのうち、ＳＢ２０３５８０、ＳＢ２０２１９０、ＢＩＲＢ７９６、ＬＹ２２２８８２０、ＶＸ−７０２、ＰＨ−７９７８０４、ＴＡＫ―７１５、ＶＸ−７４５、Ｓｋｅｐｉｎｏｎｅ−Ｌが好ましい。ＳＢ２０３５８０、ＳＢ２０２１９０、ＢＩＲＢ７９６、ＬＹ２２２８８２０、ＶＸ−７０２、ＰＨ−７９７８０４、ＴＡＫ―７１５、ＶＸ−７４５、Ｓｋｅｐｉｎｏｎｅ−Ｌのいずれを用いても十分な効果が得られるが、ＳＢ２０３５８０、ＳＢ２０２１９０がより好ましく、ＳＢ２０３５８０がさらに好ましい。これらは単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いることもできる。

本発明の間葉系幹細胞培養用培地におけるｐ３８阻害剤の濃度としては、本発明の効果の観点から、１ｎＭ〜１μＭであることが好ましく、１０ｎＭ〜５００ｎＭであることがより好ましく、５０ｎＭ〜２５０ｎＭであることがさらに好ましい。

（Ｗｎｔシグナル活性化剤）
本発明においてＷｎｔシグナル活性化剤とは、Ｗｎｔシグナルを活性化させるすべての物質をいう。Ｗｎｔは、分泌性の細胞間シグナル伝達タンパク質で、細胞内シグナル伝達に関与している。このシグナル伝達経路は細胞の増殖や分化、運動、初期胚発生時の体軸形成や器官形成等の機能を制御している。Ｗｎｔシグナル経路では、Ｗｎｔが細胞に作用することにより、いくつかの別々の活性化される細胞内シグナル伝達機構が含まれる。Ｗｎｔシグナル経路にはβ−カテニンを介して遺伝子発現を制御するβ−カテニン経路、細胞の平面内極性を制御するＰＣＰ（ｐｌａｎａｒｃｅｌｌｐｏｌａｒｉｔｙ，平面内細胞極性）経路、Ｃａ２^＋の細胞内動員を促進するＣａ２^＋経路等が知られている。本明細書において、Ｗｎｔシグナル活性化剤とは、そのいずれの経路を活性化するものであってもよい。

本発明におけるＷｎｔシグナル活性化剤には、Ｗｎｔ−３ａのように、カテニン依存性の活性化剤、Ｗｎｔ−５ａのようにカテニン非依存性の活性化剤のいずれも含まれる。この他に、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、補体分子Ｃ１ｑ等を用いることもできる。これらのうち、Ｗｎｔ−３ａ、Ｗｎｔ−５ａ、ＬｉＣｌ、補体分子Ｃ１ｑが好ましく、いずれを用いても十分な効果が得られるが、ＬｉＣｌ、補体分子Ｃ１ｑがより好ましく、ＬｉＣｌがさらに好ましい。これらは単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いることもできる。

本発明の間葉系幹細胞培養用培地におけるＷｎｔシグナル活性化剤の濃度は、本発明の効果の観点から、１μＭ〜１０ｍＭであることが好ましく、１０μＭ〜１０ｍＭであることがより好ましく、１００μＭ〜１ｍＭであることがさらに好ましく、１００μＭ〜５００μＭであることが特に好ましい。

（ＲＯＣＫ阻害剤）
本発明においてＲＯＣＫ阻害剤とは、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）の作用を阻害するすべての物質をいう。Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）は、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質であるＲｈｏの標的タンパク質として同定されたセリン・スレオニンタンパク質リン酸化酵素である。Ｒｈｏキナーゼは、筋肉等の収縮、細胞増殖、細胞遊走及び他の遺伝子発現誘導等の生理機能に関与している。

本発明におけるＲＯＣＫ阻害剤としては、例えばＹ−２７６３２〔（Ｒ）−（＋）−ｔｒａｎｓ−Ｎ−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）−４−（１−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ・２ＨＣｌ・Ｈ_２Ｏ〕、Ｋ−１１５（リパスジル塩酸塩水和物）、Ｆａｓｕｄｉｌｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（塩酸ファスジル；〔ＨＡ１０７７／１−（５−Ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ）ｈｏｍｏｐｉｐｅｒａｚｉｎｅＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ〕）等が挙げられる。これらのうち、Ｙ−２７６３２、Ｋ−１１５、塩酸ファスジルが好ましく、これらのいずれを用いても十分な効果が得られるが、中でもＹ−２７６３２がより好ましい。

本発明の間葉系幹細胞培養用培地におけるＲＯＣＫ阻害剤の濃度としては、本発明の効果の観点から、１ｎＭ〜１０μＭであることが好ましく、１０ｎＭ〜１μＭであることがより好ましく、５０ｎＭ〜５００ｎＭであることがさらに好ましい。

本発明の間葉系幹細胞培養用培地は、これらのＰＴＥＮ阻害剤、ｐ５３阻害剤、ｐ３８阻害剤、Ｗｎｔシグナル活性化剤及びＲＯＣＫ阻害剤からなる群より選択される少なくとも２種の成分を含むが、本発明の効果の観点から、いずれか３種の成分を含むことが好ましく、いずれか４種の成分を含むことがより好ましく、５種全てを含むことがさらに好ましい。上記２種の成分の組み合わせとしては、上記５種の成分のいずれを組合わせてもよく、具体的には、ＰＴＥＮ阻害剤及びｐ５３阻害剤;ＰＴＥＮ阻害剤及びｐ３８阻害剤;ＰＴＥＮ阻害剤及びＷｎｔシグナル活性化剤;ＰＴＥＮ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤;ｐ５３阻害剤及びｐ３８阻害剤;ｐ５３阻害剤及びＷｎｔシグナル活性化剤;ｐ５３阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤;ｐ３８阻害剤及びＷｎｔシグナル活性化剤;ｐ３８阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤;Ｗｎｔシグナル活性化剤及びＲＯＣＫ阻害剤の組み合わせである。上記３種の成分の組み合わせとしては、上記５種の成分のいずれを組合わせてもよく、具体的には、ＰＴＥＮ阻害剤、ｐ５３阻害剤及びｐ３８阻害剤;ＰＴＥＮ阻害剤、ｐ５３阻害剤及びＷｎｔシグナル活性化剤；ＰＴＥＮ阻害剤、ｐ５３阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤；ＰＴＥＮ阻害剤、ｐ３８阻害剤及びＷｎｔシグナル活性化剤；ＰＴＥＮ阻害剤、ｐ３８阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤；ＰＴＥＮ阻害剤、Ｗｎｔシグナル活性化剤及びＲＯＣＫ阻害剤；ｐ５３阻害剤、ｐ３８阻害剤及びＷｎｔシグナル活性化剤；ｐ５３阻害剤、ｐ３８阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤；ｐ５３阻害剤、Ｗｎｔシグナル活性化剤及びＲＯＣＫ阻害剤；ｐ３８阻害剤、Ｗｎｔシグナル活性化剤及びＲＯＣＫ阻害剤の組み合わせである。上記４種の成分と組み合わせとしては、上記５種の成分のいずれを組合わせてもよく、具体的には、ＰＴＥＮ阻害剤、ｐ５３阻害剤、ｐ３８阻害剤及びＷｎｔシグナル活性化剤；ＰＴＥＮ阻害剤、ｐ５３阻害剤、ｐ３８阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤；ＰＴＥＮ阻害剤、ｐ５３阻害剤、Ｗｎｔシグナル活性化剤及びＲＯＣＫ阻害剤；ＰＴＥＮ阻害剤、ｐ３８阻害剤、Ｗｎｔシグナル活性化剤及びＲＯＣＫ阻害剤；ｐ５３阻害剤、ｐ３８阻害剤、Ｗｎｔシグナル活性化剤及びＲＯＣＫ阻害剤の組み合わせである。

（増殖因子）
本発明の幹細胞培養用培地における増殖因子としては、当業者に公知のいずれの増殖因子でも用いることができる。代表的には、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）等が挙げられるがこれに限定されず、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ又はＦＧＦ２）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）等が挙げられる。さらにアルブミン、トランスフェリン、ラクトフェリン、フェツイン等も例示される。これらは単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いることもできる。

本発明の間葉系幹細胞培養用培地における増殖因子の濃度としては、増殖因子の種類によって適宜適切な濃度が採用される。一般的には、本発明の効果の観点から、１ｎＭ〜１００ｍＭであることが好ましく、１０ｎＭ〜１０ｍＭであることがより好ましい。

（ステロイド性化合物）
本発明の幹細胞培養用培地におけるステロイド性化合物としては、当業者に公知のいずれのステロイド性化合物でも用いることができる。代表的には、エストラジオール、プロゲステロン、テストステロン、コルチゾン、コルチゾール、ハイドロコルチゾン等のステロイドホルモンを使用することができるが、これらに限定されない。これらは単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いることもできる。

本発明の間葉系幹細胞培養用培地におけるステロイド性化合物の濃度としては、ステロイド性化合物の種類によって適宜適切な濃度が採用される。一般的には、本発明の効果の観点から、０．１ｎＭ〜１ｍＭであることが好ましく、１ｎＭ〜１００μＭであることがより好ましく、１０ｎＭ〜１μＭであることがさらに好ましい。

（動物細胞培養用基礎培地）
本発明における動物細胞培養用基礎培地とは、動物細胞の培養に必須の炭素源、窒素源及び無機塩等を含有させた培地をいう。ここで、動物細胞とは、哺乳類細胞、特にはヒト細胞を指す。本発明における動物細胞培養用基礎培地は、培養して得られる細胞やその培養上清を動物（ヒトを含む）の疾患の治療のために用いる可能性を考慮すると、できるだけ生物由来原料を含まない培地（例えば、無血清培地）であることが好ましい。動物細胞培養用基礎培地には、必要に応じて、微量栄養促進物質、前駆物質等の微量有効物質を配合してもよい。このような動物細胞培養用基礎培地としては、当業者に公知の動物細胞培養用培地を使用することができる。具体的には、イーグル培地のような最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地α（ＭＥＭ−α）、間葉系細胞基礎培地（ＭＳＣＢＭ）、Ｈａｍ’ｓＦ−１２及びＦ−１０培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、Ｗｉｌｌｉａｍｓ培地Ｅ、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＣＤＢ培地、１９９培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｉｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ＭｃＣｏｙ改変培地等、これらの混合培地等が挙げられる。動物細胞培養培地として用いる場合には、特にはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地が好ましく用いられるがこれに限定されない。

動物細胞培養用基礎培地には、アミノ酸類、無機塩類、ビタミン類及び炭素源や抗生物質等の添加剤を添加することができる。これらの添加剤の使用濃度は特に限定されず、通常の動物細胞用培地に用いられる濃度で用いることができる。

アミノ酸類としては、例えば、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン等が挙げられる。

無機塩類としては、例えば、塩化カルシウム、硫酸銅、硝酸鉄（ＩＩＩ）、硫酸鉄、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等が挙げられる。

ビタミン類としては、例えば、コリン、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ４、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、ビタミンＢ１２、ビタミンＢ１３、ビタミンＢ１５、ビタミンＢ１７、ビタミンＢｈ、ビタミンＢｔ、ビタミンＢｘ、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＦ、ビタミンＫ、ビタミンＭ、ビタミンＰ等が挙げられる。

その他、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン等の抗生物質；グルコース、ガラクトース、フルクトース、スクロース等の炭素源；マグネシウム、鉄、亜鉛、カルシウム、カリウム、ナトリウム、銅、セレン、コバルト、スズ、モリブデン、ニッケル、ケイ素等の微量金属；β−グリセロリン酸、デキサメタゾン、ロシグリタゾン、イソブチルメチルキサンチン、５−アザシチジン等の幹細胞分化誘導剤；２−メルカプトエタノール、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｎ−アセチルシステイン等の抗酸化剤；アデノシン５’−一リン酸、コルチコステロン、エタノールアミン、インスリン、還元型グルタチオン、リポ酸、メラトニン、ヒポキサンチン、フェノールレッド、プロゲステロン、プトレシン、ピルビン酸、チミジン、トリヨードチロニン、トランスフェリン、ラクトフェリン、アルブミン、牛血清由来Ｆｅｔｕｉｎ、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ等の緩衝剤、Ｌｉｐｉｄ混合物、ＩＴＳＥ（インスリン、トランスフェリン、セレニウム、及びエタノールアミン）混合物等を添加してもよい。

本発明の間葉系幹細胞培養用培地としては、例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に、Ｌ−グルタミン、アスコルビン酸、ヒト組み換え型アルブミン、ウシ血清由来Ｆｅｔｕｉｎ、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、Ｌｉｐｉｄ混合液、ＩＴＳＥ混合液、トランスフェリン、ｂＦＧＦ、プロゲステロン、ハイドロコルチゾン、ＶＯ−ＯＨＰｉｃ、Ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ−α（ピフィスリン−α）、ＳＢ２０３５８０、塩化リチウム及びＹ−２７６３２を加えた培地；
ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に、Ｌ−グルタミン、アスコルビン酸、ヒト組み換え型アルブミン、ウシ血清由来Ｆｅｔｕｉｎ、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、Ｌｉｐｉｄ混合液、ＩＴＳＥ混合液、トランスフェリン、ｂＦＧＦ、プロゲステロン、ハイドロコルチゾン、ＶＯ−ＯＨＰｉｃ、Ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ−α（ピフィスリン−α）、ＳＢ２０３５８０を加えた培地；
ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に、Ｌ−グルタミン、アスコルビン酸、ヒト組み換え型アルブミン、ウシ血清由来Ｆｅｔｕｉｎ、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、Ｌｉｐｉｄ混合液、ＩＴＳＥ混合液、トランスフェリン、ｂＦＧＦ、プロゲステロン、ハイドロコルチゾン、塩化リチウム及びＹ−２７６３２を加えた培地；
ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に、Ｌ−グルタミン、アスコルビン酸、ヒト組み換え型アルブミン、ウシ血清由来Ｆｅｔｕｉｎ、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、Ｌｉｐｉｄ混合液、ＩＴＳＥ混合液、トランスフェリン、ｂＦＧＦ、プロゲステロン、ハイドロコルチゾン、ＶＯ−ＯＨＰｉｃ、Ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ−α（ピフィスリン−α）、ＳＢ２０３５８０及びＹ−２７６３２を加えた培地；
ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に、Ｌ−グルタミン、アスコルビン酸、ヒト組み換え型アルブミン、ウシ血清由来Ｆｅｔｕｉｎ、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、Ｌｉｐｉｄ混合液、ＩＴＳＥ混合液、トランスフェリン、ｂＦＧＦ、プロゲステロン、ハイドロコルチゾン、ＶＯ−ＯＨＰｉｃ、Ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ−α（ピフィスリン−α）、ＳＢ２０３５８０及び塩化リチウムを加えた培地；
ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に、Ｌ−グルタミン、アスコルビン酸、ヒト組み換え型アルブミン、ウシ血清由来Ｆｅｔｕｉｎ、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、Ｌｉｐｉｄ混合液、ＩＴＳＥ混合液、トランスフェリン、ｂＦＧＦ、プロゲステロン、ハイドロコルチゾン、ＶＯ−ＯＨＰｉｃ、ＳＢ２０３５８０、塩化リチウム及びＹ−２７６３２を加えた培地；
ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に、Ｌ−グルタミン、アスコルビン酸、ヒト組み換え型アルブミン、ウシ血清由来Ｆｅｔｕｉｎ、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、Ｌｉｐｉｄ混合液、ＩＴＳＥ混合液、トランスフェリン、ｂＦＧＦ、プロゲステロン、ハイドロコルチゾン、Ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ−α（ピフィスリン−α）、ＳＢ２０３５８０、塩化リチウム及びＹ−２７６３２を加えた培地；
ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に、Ｌ−グルタミン、アスコルビン酸、ヒト組み換え型アルブミン、ウシ血清由来Ｆｅｔｕｉｎ、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、Ｌｉｐｉｄ混合液、ＩＴＳＥ混合液、トランスフェリン、ｂＦＧＦ、プロゲステロン、ハイドロコルチゾン、ＶＯ−ＯＨＰｉｃ、Ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ−α（ピフィスリン−α）、塩化リチウム及びＹ−２７６３２を加えた培地；
ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に、Ｌ−グルタミン、アスコルビン酸、ヒト組み換え型アルブミン、ウシ血清由来Ｆｅｔｕｉｎ、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、Ｌｉｐｉｄ混合液、ＩＴＳＥ混合液、トランスフェリン、ｂＦＧＦ、プロゲステロン、ハイドロコルチゾンを含む基礎培地に、ＶＯ−ＯＨＰｉｃ及びＰｉｆｉｔｈｒｉｎ−α（ピフィスリン−α）；又はＶＯ−ＯＨＰｉｃ及びＳＢ２０３５８０；又はＶＯ−ＯＨＰｉｃ及び塩化リチウム；又はＶＯ−ＯＨＰｉｃ及びＹ−２７６３２；又はＰｉｆｉｔｈｒｉｎ−α（ピフィスリン−α）及びＳＢ２０３５８０；又はＰｉｆｉｔｈｒｉｎ−α（ピフィスリン−α）及び塩化リチウム；又はＰｉｆｉｔｈｒｉｎ−α（ピフィスリン−α）及びＹ−２７６３２；又はＳＢ２０３５８０及び塩化リチウム；又はＳＢ２０３５８０及びＹ−２７６３２；又は塩化リチウム及びＹ−２７６３２を加えた培地等が挙げられる。

本発明の培地の調製方法は、特に限定されず、従来公知の常法に従って調製することができる。例えば、室温で、又は必要に応じて加温して、動物細胞培養用基礎培地に上述した各成分を添加・混合して得られる。

本発明の培地は液体であることが好ましいが、必要に応じてゲル状としたり、寒天培地等の固形培地としてもよい。本発明の培地によれば、培養表面が表面処理されていない培養容器又は培養用担体に間葉系幹細胞を播種してインキュベートすることができる。

［間葉系幹細胞の培養方法］
本発明は、本発明の間葉系幹細胞培養用培地を用いて、間葉系幹細胞を培養する、間葉系幹細胞の培養方法も含む。本発明の培養方法は、本発明の間葉系幹細胞培養用培地を用いた培養方法であれば特に限定されず、従来と同様の方法が用いられる。通常、３０℃〜３７℃の温度、２％〜７％ＣＯ_２環境下、５％〜２１％Ｏ_２環境下で行われる。また、間葉系幹細胞の継代の時期及び方法もそれぞれの間葉系幹細胞に適していれば特に限定されず、間葉系幹細胞の形態を観察しながら、従来と同様に行うことができる。

［間葉系幹細胞］
本発明は、本発明の間葉系幹細胞培養用培地で培養して得られる、ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５及びＣＤ１６６陽性である間葉系幹細胞も含む。本発明の間葉系幹細胞培養用培地で培養して得られる間葉系幹細胞は、未分化性が維持されており、ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５及びＣＤ１６６を強く発現している。また、本発明の間葉系幹細胞培養用培地で培養して得られる間葉系幹細胞は、バイアビリティが高く、状態が良好である。さらに、予想もできなかった効果として、本発明の間葉系幹細胞培養用培地で培養して得られる間葉系幹細胞は、酸化ストレスに対する耐性が高いことが挙げられる。そのため、本発明の間葉系幹細胞を医薬品として種々の疾患の治療に有効に用いることができる。

本発明の間葉系幹細胞を医薬品として用いることができる疾患としては、例えば、軟骨分解、関節リウマチ、乾癬性関節炎、脊椎関節炎、変形性関節症、痛風、乾癬、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、うっ血性心不全、脳卒中、大動脈弁狭窄症、腎不全、狼瘡、膵炎、アレルギー、線維症、貧血、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、化学療法／放射線関連合併症、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、自己免疫性肝炎、Ｃ型肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、劇症肝炎、セリアック病、非特異性大腸炎、アレルギー性結膜炎、糖尿病性網膜症、シェーグレン症候群、ブドウ膜炎アレルギー性鼻炎、喘息、石綿症、珪肺、慢性閉塞性肺疾患、慢性肉芽腫性炎症、嚢胞性線維症、サルコイドーシス、糸球体腎炎、脈管炎、皮膚炎、ＨＩＶ関連悪液質、大脳マラリア、強直性脊椎炎、らい病、肺線維症、食道癌、胃食道逆流症、バレット食道、胃癌、十二指腸癌、小腸癌、虫垂癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、肛門癌、膵臓癌、肝臓癌、胆嚢癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、子宮癌、卵巣癌、乳癌、肺癌、甲状腺癌、線維筋痛等が挙げられる。

本発明の間葉系幹細胞を医薬品として用いる場合の投与方法としては、特に制限されないが、血管内投与（好ましくは静脈内投与）、腹腔内投与、腸管内投与、皮下投与等が好ましく、中でも、血管内投与がより好ましい。

本発明の間葉系幹細胞を医薬品として用いる場合の投与量としては、疾患の種類や、その症状の度合い、剤型、投与対象の体重等によって変わり得るが、１日当たり、間葉系幹細胞を１Ｘ１０^５個〜１Ｘ１０^９個の範囲で投与することができる。なお、本発明の間葉系幹細胞を医薬品として用いる場合の投与は、１日のうち１〜複数回に分けて行ってもよい。また、上記投与は、単回投与でもよいし、継続的に行ってもよい。継続的に行う場合は、例えば、３日に１回以上の頻度で、２回以上継続して投与することができる。

本発明の間葉系幹細胞を医薬品として用いる場合の投与対象となる哺乳動物としては、特に制限されないが、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等が好ましく、中でもヒトがより好ましい。また、本発明の間葉系幹細胞を医薬品として用いる場合は投与対象となる哺乳動物の種類と一致していることが、疾患に対するより安定して優れた予防及び／又は治療効果を得る観点から好ましい。

本発明には、上述した本発明の間葉系幹細胞を含む医薬品の製造方法も含まれる。本発明の間葉系幹細胞を含む医薬品の製造方法は、上述の間葉系幹細胞の培養方法に従って間葉系幹細胞を調製する工程、得られた間葉系幹細胞を薬学的に許容される保存液中に保存する工程を含む。また、本発明の間葉系幹細胞を含む医薬品の製造方法は、さらに、必要に応じて、本発明の間葉系幹細胞を投与用の緩衝液等に懸濁する工程を含んでもよい。

次に、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

＜間葉系幹細胞培養用培地の調製＞
下記表１に示す基本の処方１４−２−１培地（比較例１）を調製した。具体的には、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に下記表１に記載の成分を記載の濃度となるように添加した。

前記調製した１４−２−１培地に、下記表２に示す各成分を記載の濃度となるように添加して各培地（比較例１及び実施例１〜８）を調製した。この培地を臍帯幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞の培養に供した。

＜臍帯幹細胞及び脂肪由来間葉系幹細胞の培養と評価＞
（試験１）
臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ−ＭＳＣ；ＵｍｂｉｌｉｃａｌＣｏｒｄｄｅｒｉｖｅｄＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌＳｔｅｍＣｅｌｌｓＷｈａｒｔｏｎ’ｓＪｅｌｌｙ（ＨＭＳＣ−ＷＪ）、ＦＣ−００２０、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社）、及び脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＤ−ＭＳＣ；ＡｄｉｐｏｓｅｄｅｒｉｖｅｄＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌＳｔｅｍＣｅｌｌｓ、ＦＣ−００３４、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社）を、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社推奨培地にて馴化した後、５，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の密度でＣｅｌｌＢｉｎｄＦｌａｓｋに播種した。翌日、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社推奨培地又は実施例１の培地に培地交換した（１Ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ；６ｗｅｌｌｐｌａｔｅ）。３日後、それぞれ同様に播種し直し、さらに３日後（合計では６日後）、細胞数を計数した。同様にさらに２日間培養した（合計では８日間）細胞については形態と表面マーカーを解析した。８日目までの増殖率（播種した細胞が次の継代までに分裂した回数）を図２に示す。また、３日後、８日後の細胞写真をそれぞれ図１、図３に示す。さらに、８日後の細胞について、ＦＡＣＳにて細胞表面マーカー（脂肪由来間葉系幹細胞については、ＣＤ１０５及びＣＤ７３、臍帯由来間葉系幹細胞についてはＣＤ１０５及びＣＤ９０）の発現を解析した結果は、図４及び５に示す。

ＡＤ−ＭＳＣは、推奨培地と比べて、実施例１の培地を用いて培養した場合の方が細胞の増殖がよかった（図２）。また、細胞の形態については、培養３日目（図１）まではそれほど差がないものの、８日目（図３）になると、実施例１の培地を用いた場合の方がやや小ぶりで丸くなり、状態が良好なのに対して、推奨培地を用いた場合には細長い形態となり、状態がやや悪くなっていると判断された。しかし、表面マーカーの発現については、推奨培地で培養したＡＤ−ＭＳＣはＣＤ１０５、ＣＤ７３の発現ピークが高いまま１つであったのに対して、実施例１の培地で培養するとＣＤ１０５は一部の細胞においてその発現が低下し、発現ピークは２つとなった。またＣＤ７３は全体的に発現強度が低下した。ＡＤ−ＭＳＣの未分化性の維持には、推奨培地の方が適していると思われた。

一方、ＵＣ−ＭＳＣは、培養６日目において、実施例１の培地の方が増殖がよかった。細胞の形態については、図１及び図３に示すように実施例１の培地の方が、細胞が小ぶりかつ丸くなり状態がよかった。また、表面マーカーの発現についても、実施例１の培地で培養したものの方が、ＣＤ１０５、ＣＤ９０の発現ピークがより高くなり、未分化性をより維持できていると判断された。

（試験２）
臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ−ＭＳＣ；ＵｍｂｉｌｉｃａｌＣｏｒｄｄｅｒｉｖｅｄＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌＳｔｅｍＣｅｌｌｓＷｈａｒｔｏｎ’ｓＪｅｌｌｙ（ＨＭＳＣ−ＷＪ）、ＦＣ−００２０、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社）を、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社推奨培地にて馴化後、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社推奨培地又は実施例１の培地に培地交換した（１Ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ；６ｗｅｌｌｐｌａｔｅ）。２〜３日おきに継代を行い、培地交換から１１日目の細胞について、ＦＡＣＳにて細胞表面マーカー（ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、１０５及びＣＤ１６６）の発現を解析した。結果を図６に示す。

図６に示すように、ＵＣ−ＭＳＣの表面マーカーについては、推奨培地で培養したものに比べて、実施例１の培地で培養した方が、ＣＤ７３、ＣＤ９０、１０５及びＣＤ１６６の発現が高くなり、ＣＤ２９のピークはより均一になった。実施例１の培地で培養したものの方がＵＣ−ＭＳＣの未分化性を維持できていると判断された。

（試験３）
臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ−ＭＳＣ；ＵｍｂｉｌｉｃａｌＣｏｒｄｄｅｒｉｖｅｄＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌＳｔｅｍＣｅｌｌｓＷｈａｒｔｏｎ’ｓＪｅｌｌｙ（ＨＭＳＣ−ＷＪ）、ＦＣ−００２０、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社）、及び脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＤ−ＭＳＣ；ＡｄｉｐｏｓｅｄｅｒｉｖｅｄＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌＳｔｅｍＣｅｌｌｓ、ＦＣ−００３４、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社）を、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社推奨培地にて馴化した後、表２に記載の各培地中でそれぞれ５日間培養し（播種時７０，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）、細胞数を計数し、結果を図７にＰＤＬで示した。細胞写真は図８及び９に示す。さらに継代しながら培養を継続し、合計３週間、それぞれの培地中で培養した細胞の細胞表面マーカー（ＣＤ１０５）発現をＦＡＣＳにて解析した。その結果を図１０に示す。

実施例１の培地は、比較例１の培地と比べてＡＤ−ＭＳＣ、ＵＣ−ＭＳＣ共に細胞の形態をより良好に維持することができた。ＵＣ−ＭＳＣの表面マーカーについては、実施例１の培地の方がＣＤ１０５の発現が高く、ピークもシャープであり、未分化で均一な集団を維持できたことがわかる。
実施例２及び３の培地は、ＡＤ−ＭＳＣに比べてＵＣ−ＭＳＣの増殖を顕著に促進した。細胞の形態は、ＡＤ−ＭＳＣ、ＵＣ−ＭＳＣ共に良好であった。
実施例４の培地は、ＡＤ−ＭＳＣに比べてＵＣ−ＭＳＣの増殖をより促進した。細胞の形態は、ＡＤ−ＭＳＣ、ＵＣ−ＭＳＣ共に良好であった。しかし、ＵＣ−ＭＳＣの表面マーカー（ＣＤ１０５）については、ピークの幅がやや広く細胞集団の均一性がやや低下した。
実施例５及び６の培地は、ＡＤ−ＭＳＣに比べてＵＣ−ＭＳＣの増殖をより促進した。細胞の形態は、ＡＤ−ＭＳＣでやや細長くなったが、ＵＣ−ＭＳＣは良好であった。ＵＣ−ＭＳＣの表面マーカー（ＣＤ１０５）については、ピークもシャープであり、未分化で均一な集団を維持できたことがわかる。
実施例７の培地は、ＡＤ−ＭＳＣに比べてＵＣ−ＭＳＣの増殖を顕著に促進した。細胞の形態は、ＡＤ−ＭＳＣ、ＵＣ−ＭＳＣ共に良好であった。ＵＣ−ＭＳＣの表面マーカー（ＣＤ１０５）については、ピークの幅がやや広くなる傾向が見られた。
実施例８の培地は、ＡＤ−ＭＳＣに比べてＵＣ−ＭＳＣの増殖を顕著に促進した。細胞の形態は、ＡＤ−ＭＳＣ、ＵＣ−ＭＳＣ共に良好であった。ＵＣ−ＭＳＣの表面マーカー（ＣＤ１０５）については、ピークもシャープであり、未分化で均一な集団を維持できたことがわかる。
以上のように、ＰＴＥＮ阻害剤、ｐ５３阻害剤、ｐ３８阻害剤、Ｗｎｔシグナル活性化剤及びＲＯＣＫ阻害剤のうちのいずれか４種類を含む培地（実施例４〜８）は、ＡＤ−ＭＳＣ及びＵＣ−ＭＳＣの両方の細胞の形態を良好な状態に維持しながら培養することができた。また、ＡＤ−ＭＳＣに比べてＵＣ−ＭＳＣの増殖をより促進する傾向があった。さらに、上記５因子の全てを含む実施例１の培地とほぼ同程度にＵＣ−ＭＳＣを良好な状態で維持できると共に、未分化性を維持したまま培養することができた。また、ＰＴＥＮ阻害剤、ｐ５３阻害剤及びｐ３８阻害剤を含む実施例２の培地、Ｗｎｔシグナル活性化剤及びＲＯＣＫ阻害剤を含む実施例３の培地も、ＡＤ−ＭＳＣ、ＵＣ−ＭＳＣともに良好な形態を保ちながら、特にＵＣ−ＭＳＣの増殖を促進する効果があった。

（試験４）酸化ストレス耐性の誘導
（ＵＣ−ＭＳＣ；ＵｍｂｉｌｉｃａｌＣｏｒｄｄｅｒｉｖｅｄＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌＳｔｅｍＣｅｌｌｓＷｈａｒｔｏｎ’ｓＪｅｌｌｙ（ＨＭＳＣ−ＷＪ）、ＦＣ−００２０、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社；ＵＣ−ＭＳＣ；ＵｍｂｉｌｉｃａｌＣｏｒｄｄｅｒｉｖｅｄＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌＳｔｅｍＣｅｌｌｓＳｃｉｅｎＣｅｌｌ社；及びＵｍｂｉｌｉｃａｌＣｏｒｄｄｅｒｉｖｅｄＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌＳｔｅｍＣｅｌｌｓＡＴＣＣ社）を、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下、各社推奨培地にて馴化後、各社推奨培地又は実施例１の培地に培地交換した（０．３〜１Ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ；６ｗｅｌｌｐｌａｔｅ）。２〜３日おきに継代を行った細胞に対してＲｏｔｅｎｏｎｅを各濃度で処理した（０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭ）。４８時間後にＨｏｅｃｈｅｓｔ３３３５８で染色し、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓで核数を計測した。結果を図１１に示す。

図１１に示す通り、ＵＣ−ＭＳＣはＲｏｔｅｎｏｎｅ処理の濃度依存的に障害を受けて細胞数が減少するが、実施例１の培地で培養することにより、Ｒｏｔｅｎｏｎｅ処理による障害に対する耐性ができ酸化ストレスを受けにくい状態となり、細胞数の減少が抑えられる可能性が示唆された。

（試験５）長期間培養１
臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ−ＭＳＣ；ＵｍｂｉｌｉｃａｌＣｏｒｄｄｅｒｉｖｅｄＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌＳｔｅｍＣｅｌｌｓＷｈａｒｔｏｎ’ｓＪｅｌｌｙｃ−１２９７１、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ社）を、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ社推奨培地にて馴化した後、ＰｒｏｍｏＭｅｄｉａ（ｃ−３９８１０ｏｒｃ−２８０１９、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ社、表２の実施例１の培地で長期に渡って継代培養を続け、合計の細胞数を計数した結果を図１２に示す。

実施例１の培地による培養では、Ｐ１２まで（５０日間）継代培養を続けても、細胞の形態、増殖能力共に良好であった。一方、市販の培地であるＰｒｏｍｏＭｅｄｉａではＰ９以降、細胞を維持することができなかった。
（試験６）長期間培養２
臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ−ＭＳＣ；ＵｍｂｉｌｉｃａｌＣｏｒｄｄｅｒｉｖｅｄＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌＳｔｅｍＣｅｌｌｓＷｈａｒｔｏｎ’ｓＪｅｌｌｙ（ＨＭＳＣ−ＷＪ）、ＦＣ−００２０、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社）を、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社推奨培地にて馴化した後、表２の実施例１の培地又はＬｉｆｅＬｉｎｅ社推奨培地で長期に渡って継代培養を続けた。合計の細胞数を計数した結果を図１３に示す。

実施例１の培地による培養では、４５日間継代培養を続けても、細胞の形態、増殖能力共に良好であり、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社推奨培地との遜色は全くなかった。なお、細胞の形態については、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社推奨培地で長期培養した細胞（１６継代後、４日目）は細長い形状となるのに対して、実施例１の培地で長期培養した細胞（ＬｉｆｅＬｉｎｅ社推奨培地で７継代後に、実施例１の培地で９継代後、４日目）は紡錘型（ｓｐｉｎｄｌｅｓｈａｐｅ）の良好な形態を維持し続けていた（図１４）。合計の細胞数については、実施例１の培地での培養による方がより多くなり、実施例１の培地は間葉系幹細胞に対する増殖促進効果により優れていることがわかった（図１３）。

（試験７）
臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ−ＭＳＣ；ＵｍｂｉｌｉｃａｌＣｏｒｄｄｅｒｉｖｅｄＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌＳｔｅｍＣｅｌｌｓＷｈａｒｔｏｎ’ｓＪｅｌｌｙ（ＨＭＳＣ−ＷＪ）、ＦＣ−００２０、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社）を、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社推奨培地にて馴化した後、表２の実施例１、４〜８の培地で８日間培養し、細胞増殖に対する効果を比較した。細胞増殖に対する効果の比較は、Ｈｏｅｃｈｅｓｔ３３３４２で細胞を染色後、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓで撮影して細胞数を計数することにより行った。その結果を図１５に示す。

図１５に示す通り、ＰＴＥＮ阻害剤、ｐ５３阻害剤、ｐ３８阻害剤、Ｗｎｔシグナル活性化剤及びＲＯＣＫ阻害剤の５因子全てを含む実施例１の培地の結果（１００％）と比較したところ、ｐ５３阻害剤又はｐ３８阻害剤が含まれていない実施例６、８の培地で、増殖効果がわずかに低下している他は、上記５因子のうち１因子を除いても、ほぼ同程度のＵＣ−ＭＳＣの増殖効果が得られることがわかった。

（試験８）
臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ−ＭＳＣ；ＵｍｂｉｌｉｃａｌＣｏｒｄｄｅｒｉｖｅｄＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌＳｔｅｍＣｅｌｌｓＷｈａｒｔｏｎ’ｓＪｅｌｌｙ（ＨＭＳＣ−ＷＪ）、ＦＣ−００２０、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社）を、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社推奨培地にて馴化した後、下記表３の実施例９〜１８の培地及び、上記表２の実施例１の培地で５日間培養し、細胞増殖に対する効果を比較した。細胞増殖に対する効果の比較は、Ｈｏｅｃｈｅｓｔ３３３４２で細胞を染色後、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓで撮影して細胞数を計数することにより行った（細胞数／０．３６ｍｍ^２）。その結果を図１６に示す。

図１５に示す通り、ＰＴＥＮ阻害剤、ｐ５３阻害剤、ｐ３８阻害剤、Ｗｎｔシグナル活性化剤及びＲＯＣＫ阻害剤の５因子のうち、いずれか２因子を含む培地（実施例９〜１８）と、全てを含む実施例１の培地と比較したところ、５日間のＵＣ−ＭＳＣに対する増殖効果については、どの培地を使用してもほぼ同程度の効果が得られることがわかった。従って、ＰＴＥＮ阻害剤、ｐ５３阻害剤、ｐ３８阻害剤、Ｗｎｔシグナル活性化剤及びＲＯＣＫ阻害剤の５因子のうちのいずれか２種の因子を含む培地を用いると、ＵＣ−ＭＳＣに対する５日間培養の系では、十分優れた増殖促進効果が得られることがわかった。

Claims

ＰＴＥＮ阻害剤、ｐ５３阻害剤、ｐ３８阻害剤、Ｗｎｔシグナル活性化剤及びＲＯＣＫ阻害剤からなる群より選択される少なくとも４種の成分と、ｂＦＧＦと、ステロイド性化合物と、動物細胞培養用基礎培地とを含有し、ＰＴＥＮ阻害剤が、ＶＯ−ＯＨＰｉｃ、ＨＯＰｉｃ及びｐＶからなる群より選択され、ｐ５３阻害剤が、オルトバナジン酸ナトリウム、ピフィスリン−α及びＭＤＭ２タンパク質からなる群より選択され、ｐ３８阻害剤が、ＳＢ２０３５８０、ＳＢ２０２１９０、ＢＩＲＢ７９６、ＬＹ２２２８８２０、ＶＸ−７０２、ＰＨ−７９７８０４、ＴＡＫ―７１５、ＶＸ−７４５、及びＳｋｅｐｉｎｏｎｅ−Ｌからなる群より選択され、Ｗｎｔシグナル活性化剤が、ＬｉＣｌ又は補体分子Ｃ１ｑであり、ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、Ｋ−１１５及び塩酸ファスジルからなる群より選択される、臍帯由来間葉系幹細胞培養用培地。
前記ＰＴＥＮ阻害剤、ｐ５３阻害剤、ｐ３８阻害剤、Ｗｎｔシグナル活性化剤及びＲＯＣＫ阻害剤を含有する、請求項１記載の臍帯由来間葉系幹細胞培養用培地。
請求項１又は２記載の臍帯由来間葉系幹細胞培養用培地を用いて、臍帯由来間葉系幹細胞を培養する、臍帯由来間葉系幹細胞の培養方法。