JP6998768B2 - Ror1陽性の間葉系幹細胞及びその調製方法、ror1陽性の間葉系幹細胞を含む医薬組成物及びその調製方法、並びにror1陽性の間葉系幹細胞を用いる疾患の予防又は治療方法 - Google Patents
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Description
(2)CD29、CD73、CD90、CD105及びCD166陽性である、(1)記載の間葉系幹細胞。
(3)臍帯又は脂肪由来である、(1)又は(2)記載の間葉系幹細胞。
(4)(1)から(3)のいずれか記載の間葉系幹細胞及び/又はその培養上清を含む、医薬組成物。
(5)医薬組成物がROR1陽性の間葉系幹細胞を含む場合、ROR1陽性の間葉系幹細胞の比率が、医薬組成物の含む間葉系幹細胞全体の70%以上である、(4)記載の医薬組成物。
(6)医薬組成物がROR1陽性の間葉系幹細胞を含む場合、ROR1陽性の間葉系幹細胞の比率が、医薬組成物の含む間葉系幹細胞全体の90%以上である、(4)又は(5)記載の医薬組成物。
(7)癌、前癌性症状、炎症性疾患、免疫疾患、神経変性疾患、代謝疾患、心血管疾患、脳血管障害、骨疾患、胃腸疾患、肺疾患、肝疾患及び腎疾患からなる群より選択される疾患の予防又は治療のために用いられる、(4)から(6)のいずれか記載の医薬組成物。
(8)上皮若しくは内皮のバリア機能の低下に起因する疾患、又はIL-1が関与する疾患の予防又は治療のために用いられる、(4)から(7)のいずれか記載の医薬組成物。
(9)バリア機能の低下が、上皮又は内皮細胞層におけるタイトジャンクション機能の低下に起因する、(8)記載の医薬組成物。
(10)癌細胞の浸潤及び/又は転移を抑制するために用いられる、(4)から(6)のいずれか記載の医薬組成物。
(11)ミトコンドリアトランスファー剤である、(4)から(10)のいずれか記載の医薬組成物。
(12)ROR1陽性の間葉系幹細胞を誘導、濃縮又は分離選別する工程を含む、ROR1陽性の間葉系幹細胞の調製方法。
(13)ROR1陽性の間葉系幹細胞を誘導、濃縮又は分離選別する工程を含む、疾患の予防又は治療のために用いられる医薬組成物の調製方法。
(14)疾患が、癌、前癌性症状、炎症性疾患、免疫疾患、神経変性疾患、代謝疾患、心血管疾患、脳血管障害、骨疾患、胃腸疾患、肺疾患、肝疾患及び腎疾患からなる群より選択される、(13)記載の医薬組成物の調製方法。
(15)ROR1陽性の間葉系幹細胞を用いる、癌、前癌性症状、炎症性疾患、免疫疾患、神経変性疾患、代謝疾患、心血管疾患、脳血管障害、骨疾患、胃腸疾患、肺疾患、肝疾患及び腎疾患からなる群より選択される疾患の予防又は治療方法。
本発明において間葉系幹細胞とは、骨細胞、心筋細胞、軟骨細胞、腱細胞、脂肪細胞等の間葉系に属する細胞への分化能を有し、この分化能を維持したまま増殖できる細胞を意味する。例えば骨髄、脂肪、血液、骨膜、真皮、臍帯、胎盤、羊膜、絨毛膜、脱落膜、筋肉、子宮内膜、真皮、歯小嚢、歯根膜、歯髄、歯胚等由来の間葉系幹細胞が挙げられ、好ましくは臍帯由来、脂肪由来、骨髄由来の間葉系幹細胞であり、より好ましくは臍帯由来、脂肪由来の間葉系幹細胞であり、さらに好ましくは臍帯由来の間葉系幹細胞である。ここで、「由来」とは、上記細胞が、供給源である組織から獲得され、成長、或いはin vitroで操作された細胞であることを示す。なお、本発明のROR1陽性の間葉系幹細胞は、上記間葉系幹細胞の集合体であり、互いに異なる特性を有する複数種の間葉系幹細胞が含まれていてもよいし、実質的に均一な間葉系幹細胞の集合体であってもよい。
本発明におけるROR1陽性の間葉系幹細胞は、未分化性の指標となるCD29、CD73、CD90、CD105及びCD166を発現している。
本発明におけるROR1陽性の間葉系幹細胞は、ROR1遺伝子に加えて、他の遺伝子発現の有無によって特徴付けられてもよい。本発明のROR1陽性の間葉系幹細胞が発現している遺伝子としては、例えば、MT1X、NID2、CPA4、DKK1、ANKRD1、TIMP3、MMP1、オステオプロテゲリン(Osteoprotegerin;TNFRSF11B)、IGFBP5、SLC14A1等が挙げられる。さらに、Superoxide dismutase 2, mitochondrial(SOD2)、Glutaredoxin(GLRX)、Heme oxygenase(decycling)-1(HMOX-1)、Collagen,type IV,alpha(COLA4A)、Fibronectin 1、及びMicrofibrillar associated protein 5(MFAP5)、Chemokine (C-C motif) ligand 2(CCL2)、Chemokine (C-C motif) ligand 7(CCL7)、inhibin, beta A(INHBA)、Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1(IFIT1)、Interleukin 1, alpha(IL-1α)、Interleukin 1, beta(IL-1β)、Endothelin 1(EDN1)、Prostaglandin I2 (prostacyclin) synthase(PTGIS)、Secreted frizzled-related protein 1(SFRP1)等を挙げることもできる。本発明におけるROR1陽性の間葉系幹細胞は、MT1X、NID2、CPA4、DKK1、ANKRD1、TIMP3、MMP1、オステオプロテゲリン(Osteoprotegerin;TNFRSF11B)、IGFBP5及びSLC14A1からなる群より選択される少なくとも1種の遺伝子を発現していることが好ましい。より好ましくは2種以上、3種以上、4種以上、5種以上、さらに好ましくは6種以上、7種以上、8種以上、9種以上の、特に好ましくは、上記の全ての遺伝子を発現している。
本発明のROR1陽性の間葉系幹細胞は、miRNAの発現の有無によってさらに特徴付けられてもよい。本発明のROR1陽性の間葉系幹細胞が発現しているmiRNAとしては、例えば、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-503-5p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-132-3p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-328-3p、hsa-miR-382-5p、hsa-let-7d-5p等が挙げられる。本発明のROR1陽性の間葉系幹細胞は、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-503-5p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-132-3p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-328-3p、hsa-miR-382-5p、及びhsa-let-7d-5pからなる群より選択される少なくとも1種のマイクロRNAを発現していることが好ましい。より好ましくは2種以上、3種以上、4種以上、5種以上、6種以上の、さらに好ましくは7種以上、8種以上、9種以上、10種以上、11種以上、12種以上の、特に好ましくは、上記の全てのマイクロRNAを発現している。
本発明のROR1陽性の間葉系幹細胞は、サイトカイン分泌の有無によってさらに特徴付けられてもよい。本発明のROR1陽性の間葉系幹細胞が分泌しているサイトカインとしては、例えば、デコリン、オステオプロテゲリン、MMP1等が挙げられる。本発明のROR1陽性の間葉系幹細胞は、デコリン、オステオプロテゲリン及びMMP1からなる群より選択される少なくとも1種のサイトカインを分泌していることが好ましく、少なくとも2種のサイトカインを分泌していることがより好ましく、3種全てのサイトカインを分泌していることがさらに好ましい。
本発明におけるROR1陽性の間葉系幹細胞は、骨、脂肪、軟骨への優れた分化能を有する。それぞれの分化能については、当業者に公知の分化誘導条件により上記間葉系幹細胞集団を培養して、判断することができる。
本発明のROR1陽性の間葉系幹細胞は、ROR1陰性の間葉系幹細胞と比較して、ロテノン、H2O2等による酸化ストレスによるダメージを受けにくい。即ち、ROR1陽性の間葉系幹細胞と、ROR1陰性の間葉系幹細胞に対して、同じ濃度のロテノン、H2O2で処理し、細胞のViability(%)を比較すると、ROR1陰性の間葉系幹細胞は、濃度依存的にViabilityが顕著に低下するのに対して、本発明のROR1陽性の間葉系幹細胞は、Viabilityの低下が抑えられ、細胞によっては、ほぼ100%のViabilityとなる場合もある。
本発明のROR1陽性の間葉系幹細胞は、ROR1陰性の間葉系幹細胞と比較して、遊走能に優れる。また、本発明のROR1陽性の間葉系幹細胞の培養上清は、ROR1陰性の間葉系幹細胞の培養上清と比較して、癌細胞の遊走を抑制する活性が高い。即ち、本発明のROR1陽性の間葉系幹細胞は、遊走能に優れるため作用部位に適切に移動することができ、さらに作用部位においてはROR1陽性の間葉系幹細胞が、又はそれらが産生する因子によって例えば癌細胞等の遊走を抑制することで、癌細胞の浸潤、転移を抑制することができると考えられる。
本発明において「ミトコンドリアトランスファー能」とは、細胞がミトコンドリアを他の細胞に移行させることができる能力、或いはミトコンドリア自身が他の細胞に移行する能力をいい、複数の細胞を共培養した場合に、受容側の細胞全体のうちミトコンドリアのトランスファーを受けた細胞の割合(%)でその程度を表す。なお、ここでトランスファーされるミトコンドリアとしては、ミトコンドリア自体の他、ミトコンドリアが含むミトコンドリア遺伝子(DNA、RNA)、及び各種タンパク、並びにこれらと他のタンパクや小胞体等の他の器官との複合体も挙げられる。特定の細胞がミトコンドリアトランスファー能に優れる場合、各種疾患に対する治療効果、老化等に伴う症状の回復効果等が期待できる。
ROR1陽性の間葉系幹細胞の調製方法は特に限定されないが、例えば以下のようにして調製することができる。すなわち、臍帯、脂肪組織、骨髄等の組織から、当業者に公知の方法に従って、間葉系幹細胞を分離、培養し、ROR1に特異的に結合する抗ROR1抗体を用いて、ROR1陽性細胞をセルソーター、磁気ビーズ等で分離することにより取得することができる。また、後述する培地を用いる培養により、間葉系幹細胞におけるROR1発現を誘導することで、ROR1陽性の間葉系幹細胞を取得することもできる。この誘導によって得られる細胞集団において、細胞集団の70%以上がROR1陽性であることが好ましく、80%以上がROR1陽性であることがより好ましく、90%以上がROR1陽性であることがさらに好ましく、実質的にROR1陽性の均一な細胞集団であることが特に好ましい。以下に、ROR1陽性の間葉系幹細胞の調製方法を具体的に説明する。
基礎培地に加える上記血清代替物としては、例えば、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3’-チオールグリセロール等が挙げられる。
ROR1発現誘導し、ROR1陽性の間葉系幹細胞を効率的に取得するために用いる特定の培地(以下、「処方培地」ともいう)としては、PTEN阻害剤、p53阻害剤、p38阻害剤、Wntシグナル活性化剤及びROCK阻害剤からなる群より選択される少なくとも2種の成分と、動物細胞培養用基礎培地とを含有する培地を挙げることができる。処方培地は、これらの成分を含有することで、間葉系幹細胞においてROR1の発現を誘導又は促進すると共に、間葉系幹細胞の未分化性を長期に渡って維持しながら培養することができる。また、処方培地は、間葉系幹細胞を長期に渡って良好な細胞状態を維持しながら、効率的に増殖させることができる。さらに、処方培地は、増殖因子及びステロイド性化合物からなる群より選択される少なくとも1種の成分をさらに含有することが好ましい。以下に、処方培地が含む成分について詳細に説明する。
本発明においてPTEN阻害剤とは、PTEN(Phosphatase and Tensin Homolog Deleted from Chromosome 10)遺伝子、又はPTENタンパク質の作用を阻害する機能を有するすべての物質をいう。PTEN遺伝子は、染色体上の10q23.3に位置し、腫瘍抑制因子として同定されている。PTENタンパク質は広く全身の細胞に発現しており、イノシトールリン脂質であるフォスファチジルイノシトール 3,4,5-トリフォスフェイト(phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate;PIP3)の脱リン酸化反応を触媒する酵素として知られている。PIP3は、PI3キナーゼ(PI3K)により細胞内で合成され、プロテインキナーゼB(PKB)/ AKTの活性化を引き起こす。PTENは、このPIP3の脱リン酸化反応を担い、フォスファチジルイノシトール 4,5-ビスフォスフェイト(phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate;PIP2)に変換する作用があるとされている。従って、PTENは、PI3K/AKT情報伝達系を負に制御する。PTENの活性が阻害されると、細胞内にPIP3が蓄積し、PI3K/AKT情報伝達系が活性化する。
本発明においてp53阻害剤とは、p53遺伝子又はp53タンパク質の作用を阻害する機能を有するすべての物質をいう。p53遺伝子は、染色体上の17p13.1に位置し、腫瘍抑制遺伝子としても知られている。p53タンパク質は、転写因子として作用し、多様な生理活性を有する。
本発明においてp38阻害剤とは、p38遺伝子又はp38タンパク質の作用を阻害する機能を有するすべての物質をいう。p38は、セリン/スレオニンキナーゼであるMAPキナーゼ (Mitogen-Activated Protein Kinase)の1つである。MAPキナーゼは、外界刺激を伝達するシグナル分子、細胞増殖、分化、遺伝子発現、アポトーシス等への関与が明らかにされている。
本発明においてWntシグナル活性化剤とは、Wntシグナルを活性化させるすべての物質をいう。Wntは、分泌性の細胞間シグナル伝達タンパク質で、細胞内シグナル伝達に関与している。このシグナル伝達経路は細胞の増殖や分化、運動、初期胚発生時の体軸形成や器官形成等の機能を制御している。Wntシグナル経路では、Wntが細胞に作用することにより、いくつかの別々の活性化される細胞内シグナル伝達機構が含まれる。Wntシグナル経路にはβ-カテニンを介して遺伝子発現を制御するβ-カテニン経路、細胞の平面内極性を制御するPCP(planar cell polarity, 平面内細胞極性)経路、Ca2+の細胞内動員を促進するCa2+経路等が知られている。本明細書において、Wntシグナル活性化剤とは、そのいずれの経路を活性化するものであってもよい。
本発明においてROCK阻害剤とは、Rhoキナーゼ(ROCK)の作用を阻害するすべての物質をいう。Rhoキナーゼ(ROCK)は、低分子量GTP結合タンパク質であるRhoの標的タンパク質として同定されたセリン・スレオニンタンパク質リン酸化酵素である。Rhoキナーゼは、筋肉等の収縮、細胞増殖、細胞遊走及び他の遺伝子発現誘導等の生理機能に関与している。
処方培地における増殖因子としては、当業者に公知のいずれの増殖因子でも用いることができる。代表的には、トランスフォーミング成長因子(TGF)、上皮成長因子(EGF)等が挙げられるがこれに限定されず、インスリン様成長因子(IGF)、神経成長因子(NGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、血小板由来成長因子(PDGF)、エリスロポエチン(EPO)、トロンボポエチン(TPO)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF又はFGF2)、肝細胞増殖因子(HGF)等が挙げられる。さらにアルブミン、トランスフェリン、ラクトフェリン、フェツイン等も例示される。これらは単独で用いてもよいし、2種以上を組み合わせて用いることもできる。
処方培地におけるステロイド性化合物としては、当業者に公知のいずれのステロイド性化合物でも用いることができる。代表的には、エストラジオール、プロゲステロン、テストステロン、コルチゾン、コルチゾール、ハイドロコルチゾン等のステロイドホルモンを使用することができるが、これらに限定されない。これらは単独で用いてもよいし、2種以上を組み合わせて用いることもできる。
本発明における動物細胞培養用基礎培地とは、動物細胞の培養に必須の炭素源、窒素源及び無機塩等を含有させた培地をいう。ここで、動物細胞とは、哺乳類細胞、特にはヒト細胞を指す。本発明における動物細胞培養用基礎培地は、培養して得られる細胞やその培養上清を動物(ヒトを含む)の疾患の治療のために用いる可能性を考慮すると、できるだけ生物由来原料を含まない培地(例えば、無血清培地)であることが好ましい。動物細胞培養用基礎培地には、必要に応じて、微量栄養促進物質、前駆物質等の微量有効物質を配合してもよい。このような動物細胞培養用基礎培地としては、当業者に公知の動物細胞培養用培地を使用することができる。具体的には、イーグル培地のような最小必須培地(MEM)、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、最小必須培地α(MEM-α)、間葉系細胞基礎培地(MSCBM)、Ham’s F-12及びF-10培地、DMEM/F12培地、Williams培地E、RPMI-1640培地、MCDB培地、199培地、Fisher培地、Iscove改変ダルベッコ培地(IMDM)、McCoy改変培地等、これらの混合培地等が挙げられる。動物細胞培養培地として用いる場合には、特にはDMEM/F12培地が好ましく用いられるがこれに限定されない。
DMEM/F-12培地に、L-グルタミン、アスコルビン酸、ヒト組み換え型アルブミン、ウシ血清由来Fetuin、炭酸水素ナトリウム、HEPES、Lipid混合液、ITSE混合液、トランスフェリン、bFGF、プロゲステロン、ハイドロコルチゾン、VO-OHPic、Pifithrin-α(ピフィスリン-α)、SB203580を加えた培地;
DMEM/F-12培地に、L-グルタミン、アスコルビン酸、ヒト組み換え型アルブミン、ウシ血清由来Fetuin、炭酸水素ナトリウム、HEPES、Lipid混合液、ITSE混合液、トランスフェリン、bFGF、プロゲステロン、ハイドロコルチゾン、塩化リチウム及びY-27632を加えた培地;
DMEM/F-12培地に、L-グルタミン、アスコルビン酸、ヒト組み換え型アルブミン、ウシ血清由来Fetuin、炭酸水素ナトリウム、HEPES、Lipid混合液、ITSE混合液、トランスフェリン、bFGF、プロゲステロン、ハイドロコルチゾン、VO-OHPic、Pifithrin-α(ピフィスリン-α)、SB203580及びY-27632を加えた培地;
DMEM/F-12培地に、L-グルタミン、アスコルビン酸、ヒト組み換え型アルブミン、ウシ血清由来Fetuin、炭酸水素ナトリウム、HEPES、Lipid混合液、ITSE混合液、トランスフェリン、bFGF、プロゲステロン、ハイドロコルチゾン、VO-OHPic、Pifithrin-α(ピフィスリン-α)、SB203580及び塩化リチウムを加えた培地;
DMEM/F-12培地に、L-グルタミン、アスコルビン酸、ヒト組み換え型アルブミン、ウシ血清由来Fetuin、炭酸水素ナトリウム、HEPES、Lipid混合液、ITSE混合液、トランスフェリン、bFGF、プロゲステロン、ハイドロコルチゾン、VO-OHPic、SB203580、塩化リチウム及びY-27632を加えた培地;
DMEM/F-12培地に、L-グルタミン、アスコルビン酸、ヒト組み換え型アルブミン、ウシ血清由来Fetuin、炭酸水素ナトリウム、HEPES、Lipid混合液、ITSE混合液、トランスフェリン、bFGF、プロゲステロン、ハイドロコルチゾン、Pifithrin-α(ピフィスリン-α)、SB203580、塩化リチウム及びY-27632を加えた培地;
処方培地の例示としては、例えば、DMEM/F-12培地に、L-グルタミン、アスコルビン酸、ヒト組み換え型アルブミン、ウシ血清由来Fetuin、炭酸水素ナトリウム、HEPES、Lipid混合液、ITSE混合液、トランスフェリン、bFGF、プロゲステロン、ハイドロコルチゾン、VO-OHPic、Pifithrin-α(ピフィスリン-α)、塩化リチウム及びY-27632を加えた培地等が挙げられる。
本発明におけるROR1陽性の間葉系幹細胞培養上清としては、上述したROR1陽性間葉系幹細胞を培養して得られる上清であれば特に限定されない。例えば、上述のROR1陽性間葉系幹細胞を、通常、30℃~37℃の温度、2%~7%CO2環境下、5%~21%O2環境下で、適切な細胞密度、適切な培地中にてさらに培養する。培養は、細胞の全培養期間に渡って無血清培地を用いて行われてもよい。ここで、用いる無血清培地については、上記ROR1陽性間葉系幹細胞の項での説明を適用できる。
本発明の医薬組成物は、ROR1陽性の間葉系幹細胞及び又はその培養上清を含むことを特徴とする。ROR1陽性の間葉系幹細胞は、IL-6等の炎症性サイトカインの産生抑制作用、バリア機能亢進作用、遊走能、ミトコンドリアトランスファー能に優れると共に、酸化ストレスに対する耐性もあり、ダメージを受け難い細胞である、といった特性を有する。また、未分化性を維持していると同時に、分化条件下では目的の機能を有する細胞に効率よく分化することができる。このようなROR1陽性の間葉系幹細胞を含む本発明の医薬組成物は、種々の疾患に対する優れた予防又は治療効果を奏する。本発明の医薬組成物は、本発明の効果を損なわない範囲で、ROR1陽性の間葉系幹細胞に加えて、その他の成分を含んでいてもよい。
本発明は、ROR1陽性の間葉系幹細胞を誘導、濃縮又は分離選別する工程を含む、疾患の予防又は治療のために用いられる医薬組成物の調製方法も含む。上記疾患としては、癌、前癌性症状、炎症性疾患、免疫疾患、神経変性疾患、代謝疾患、心血管疾患、脳血管障害、骨疾患、胃腸疾患、肺疾患、肝疾患及び腎疾患からなる群より選択される疾患が挙げられる。
本発明の医薬組成物は種々の疾患の予防及び/又は治療に使用することができ、限定的に解釈されないが、例えば以下に説明する作用、機能等に基づいた用途が好ましいものとして挙げられる。
本発明におけるROR1陽性の間葉系幹細胞の培養上清は、ROR1陰性の従来の間葉系幹細胞の培養上清と比較して、より優れた細胞のバリア機能亢進効果を示す。即ち、本発明におけるROR1陽性の間葉系幹細胞の培養上清は、炎症によって障害を受けた細胞のバリア機能を回復させる顕著な効果を有するため、本発明のROR1陽性の間葉系幹細胞及びそれを含む医薬組成物は、炎症に関連する疾患の治療に好適に用いることができる。また、ROR1陽性の間葉系幹細胞又はその培養上清は、化粧品用組成物、食品用組成物等としても用いることもできる。
本発明におけるROR1陽性の間葉系幹細胞は、炎症状態において、マクロファージからの炎症性サイトカインの産生を抑制する効果を有する。この効果は、ROR1陰性の従来の間葉系幹細胞と比較して、有意に高いものである。そのため、本発明のROR1陽性の間葉系幹細胞及びそれを含む医薬組成物は、炎症に関連する疾患の治療に好適に用いることができる。また、ROR1陽性の間葉系幹細胞又はその培養上清は、化粧品用組成物、食品用組成物等としても用いることもできる。
本発明のROR1陽性の間葉系幹細胞は、ROR1陰性の間葉系幹細胞と比較して、遊走能に優れる。また、本発明のROR1陽性の間葉系幹細胞の培養上清は、ROR1陰性の間葉系幹細胞の培養上清と比較して、癌細胞の遊走を抑制する活性が高い。即ち、本発明のROR1陽性の間葉系幹細胞は、遊走能に優れるため作用部位に適切に移動することができ、さらに作用部位においては例えば癌細胞等の遊走を抑制することで、癌細胞の浸潤、転移を抑制することができると考えられる。従って、本発明のROR1陽性の間葉系幹細胞を含む医薬組成物、及び本発明のROR1陽性の間葉系幹細胞の培養上清を含む医薬組成物は、抗腫瘍効果を奏する医薬として好適に用いられる。
本発明のROR1陽性の間葉系幹細胞は、ミトコンドリアトランスファー能に優れ、ミトコンドリア機能障害、ミトコンドリア活性の低下等が起こっている細胞に対してミトコンドリアをトランスファーすることによって、それぞれの疾患や老化・ストレス等に伴う症状に対して優れた効果を奏する。従って、本発明のROR1陽性の間葉系幹細胞又はその培養上清を含む医薬組成物は、ミトコンドリア機能障害、ミトコンドリア活性の低下等が起こっている細胞に対してミトコンドリアをトランスファーすることによって、それぞれの疾患や老化・ストレス等に伴う症状を改善、治療及び/又は予防するためのミトコンドリアトランスファー剤として、好適に用いられる。このような疾患及び症状としては、特に限定されないが、例えば、心筋細胞、肺胞上皮細胞、腎尿細管細胞、アストロサイト、気管支平滑筋細胞、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞、免疫性細胞(マクロファージ等)、表皮幹細胞、真皮線維芽細胞、角結膜上皮幹細胞等に関連する疾患及び症状が挙げられ、中でも心筋細胞、真皮線維芽細胞、気管支平滑筋細胞に関連する疾患及び症状に好適に用いられる。
臍帯由来間葉系幹細胞(UC-MSC;Umbilical Cord derived Mesenchymal Stem Cells Wharton’s Jelly(HMSC-WJ)、FC-0020、LifeLine社)を、37℃、5%CO2の条件下、LifeLine社推奨培地にて馴化し、常法に従って、同培地にて継代培養を行ったUC-MSCを以下の実験に用いた。
得られたROR1陽性MSC(R posi)、ROR1陰性MSC(R nega)、必要に応じて、ROR1陽性MSCとROR1陰性MSCとを1:1の割合で混ぜた細胞(R mix)、ソーティングを行っていないMSC(R ソートなし)を用いて、以下の試験を行った。なお、本試験においてROR1陽性MSCとして回収した細胞集団には、一部ROR1陰性MSCも含まれ得る。
上記ソーティングによって得られたROR1陽性MSC、ROR1陰性MSCを、LifeLine社推奨培地にて更に2日間培養し、常法によりトリプシン処理して細胞を回収した。回収した細胞はDMEM/F12(0.2% FBS(MP Biomedicals社)、1% Antibiotic-Antimycotic(gibco社、15240-062)含有)に懸濁し、24well ボイデンチャンバー(Corning社、3422)の上部ウェルに約3.0×104cellsずつ200μLの培地で播種した。下部ウェルにはDMEM/F12(10% FBS、1%Antibiotic-Antimycotic含有)を550μL加え、37℃、5%炭酸ガス及び95%空気の環境下で5時間培養した。培養後、培地を上部ウェル下部ウェル両方から除き、PBS(-)にて洗浄した後、下部ウェルに-30℃に冷却したメタノール(Wako社、134-01833)を500μL加え、-30℃にて10分静置した。メタノールを除き、PBS(-)にて洗浄した後、下部ウェルに1%クリスタルバイオレット溶液(グラム染色液I(武藤化学社、41131)を20%エタノール/水で2倍希釈したもの)を500μL加え、室温にて10分染色した。上部ウェルを取り出し、流水中で洗浄した後、メンブレンの上側に残っている細胞を、綿棒を用いて完全に取り除いた。メンブレンを、メスを用いて切り取り、96wellプレートのウェルへ入れ、1% SDS水溶液 50μLを加えて細胞を溶解させた。メンブレンを取り除き、プレートリーダー(Molecular Probe社)にて吸光度(590nm、対照波長650nm)を測定した。この測定値は、上部ウェルから下部ウェルに遊走した細胞数に比例する値である。結果を図1に示す。
上記の方法によって得られたROR1陽性MSC(R posi)、ROR1陰性MSC(R nega)、ROR1陽性MSCとROR1陰性MSCとを1:1の割合で混ぜた細胞(R mix)、ソーティングを行っていないMSC(R ソートなし)のそれぞれを、細胞密度を合わせて再播種し、2日後に図3に示す各濃度のH2O2/HBSS溶液で1時間処理し、元の培地に戻して24時間後の細胞数を、ヘキスト33342による核染色及びその蛍光画像解析により比較した。
上記の方法によって得られたROR1陽性MSC(R posi)、ROR1陰性MSC(R nega)、必要に応じてROR1陽性MSCとROR1陰性MSCとを1:1の割合で混ぜた細胞(R mix)、ソートを行っていないMSC(R ソートなし)のそれぞれを、6wellプレート(CORNING, Cell Bind 3335)に1X105cells/wellで播種した。2日後、細胞をトリプシン/EDTA(クラボウ,HK-3120)で処理して剥がし、播種し直した。ミトコンドリアの供給側となるUC-MSC細胞のフラスコにミトコンドリア染色試薬(molecular probes MitoTracker(登録商標) Green FM(M7514 life technologies)をHBSS(+)で1/1,000希釈したもの)を添加して30分、ミトコンドリアの受容側となる細胞のフラスコに細胞質染色試薬(invitrogen CellTraceTMFar Red Cell Proliferation Kit(C34564 life technologies)をHBSS(+)で1/7,000希釈したもの)を添加し1時間、37℃でインキュベートした。染色後、各培地に置換して37℃で一晩培養し、翌日、HBSS(+)で3回洗浄し、トリプシン/EDTAにて細胞を剥離した。剥離した細胞をHBSS(+)で洗浄し、両方の細胞をそれぞれ2,000cells/wellとなるようにプレート(96well plate)に播種して共培養を開始した。翌日、核染色試薬をPBS(-)で1/1000希釈し、well内培地と置換した。15分室温放置後、ImageXpressで画像撮影した(16視野/well)。細胞カウントプログラム*で解析し、ミトコンドリアトランスファー率を計算した。結果を図3~5に示す。
・上記方法にて調製したROR1陽性MSC及びROR1陰性MSC
・BSMC-COPD細胞(慢性閉塞性肺疾患のヒト気管支平滑筋細胞;Bronchial Smooth Muscle cell Chronic Obstructive Pulmonary Disease(Lonza 00195274);なお、BSMC-COPD細胞の培養には、SmGMTM-2培地+BulletKit(Lonza CC-3182)+1%Antibiotic-Antimycotic(Gibco社)を用いた。
・HCM(ヒト心筋細胞):Human Cardiac Myocytes(HCM(PromoCell));なお、HCMの培養には、Myocyte Basal Medium(PromoCell,C-22170),Myocyte Growth Medium Supplement Pack(PromoCell,C-39270)を用いた。
(1)DAPIフィルター等の核染色を認識するフィルターで観察し、核を認識、計測させる(=細胞数の測定)。
(2)Cy5フィルター等の受容側細胞染色を認識するフィルターで観察し、ミトコンドリアを受け取る側の細胞(受容側)である細胞質を認識、計測させる(例えば、Red染色された細胞=受容側)。
(3)ミトコンドリア染色を認識するフィルターで観察し、ミトコンドリアを持つ細胞(供給側)を認識、計測させる(例えば、green染色された細胞=供給側)。
(4)下記計算式により、ミトコンドリアトランスファー率(%)を算出することができる。また、(1)の細胞数を計測することで薬剤の細胞毒性を評価することができる。
計算式:((2)かつ(3)の細胞数/(2)の細胞数)×100
上記の方法によって得られたROR1陽性MSC、陰性MSCのそれぞれを、0.2%FBS-DMEM/F12培地中で48時間培養し、培養上清を回収して以下の試験に用いた。
(処方培地の調製)
下記表1に示す基本の培地を調製した。具体的には、DMEM/F12培地に下記表1に記載の成分を記載の濃度となるように添加した
(試験1)
臍帯由来間葉系幹細胞(UC-MSC;Umbilical Cord derived Mesenchymal Stem Cells Wharton’s Jelly(HMSC-WJ)、FC-0020、LifeLine社;Primary Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells; Normal Human、PCS-500-010、ATCC社;Human Umbilical Mesenchymal Stem Cells (HUMSC)、7530、ScienCell社)、及び脂肪由来間葉系幹細胞(AD-MSC;Adipose derived Mesenchymal Stem Cells、FC-0034、LifeLine社)を、37℃、5%CO2の条件下、LifeLine社推奨培地にて馴化した後、5,000cells/cm2の密度でCellBind Flaskに播種した。翌日、LifeLine社推奨培地又は処方培地に交換した(1X105cells/well;6well plate)。3日後、それぞれ同様に播種し直し合計で7日間(UC-MSC)又は8日間(AD-MSC)培養した細胞の形態を図7に示す。同様にさらに2日間(合計では8日間)培養した細胞について、FACSにてROR1を含む各種細胞表面マーカーを解析した(図8;UC-MSC、図9;AD-MSC、図9はROR1発現のみ)。図中、白抜きは推奨培地で培養した細胞の、グレーは処方培地で培養した細胞の各種細胞表面マーカー発現を示している。また、UC-MSC、AD-MSCの8日間培養後の細胞については、FACSにて細胞表面マーカーの発現を解析し、結果を、図10(AD-MSC)及び11(UC-MSC)に示す。
臍帯由来間葉系幹細胞(UC-MSC;Umbilical Cord derived Mesenchymal Stem Cells Wharton’s Jelly(HMSC-WJ)、FC-0020、LifeLine社)を、37℃、5%CO2の条件下、LifeLine社推奨培地にて馴化後、LifeLine社推奨培地又は処方培地に交換した(1X105cells/well;6well plate)。2~3日おきに継代を行い、培地交換から11日目の細胞について、FACSにて細胞表面マーカー(CD29、CD73、CD90、105及びCD166)の発現を解析した。結果を図12、13に示す。
臍帯由来間葉系幹細胞(UC-MSC;Umbilical Cord derived Mesenchymal Stem Cells Wharton’s Jelly(HMSC-WJ)、FC-0020、LifeLine社;Umbilical Cord derived Mesenchymal Stem Cells Sciencell社;又はUmbilical Cord derived Mesenchymal Stem Cells ATCC社)を、37℃、5%CO2の条件下、各社推奨培地にて馴化後、各社推奨培地又は処方培地に培地交換した(1X105cells/well;6well plate)。2~3日おきに継代を行い培養した細胞を回収し、常法によりmRNAを分離した。具体的には、RNeasy Mini Kit(74109、QIAGEN社)を用いてtotal RNAを単離し、ReverTra Ace qPCR RT kit Master Mix with gDNA Remover(FSQ-301、東洋紡社)を用いて逆転写を行い、cDNAを合成した。合成したcDNAを鋳型にTaKaRa Ex Taq(RR039A、TaKaRa社)を用いて、ROR1、MT1X、NID2、ANKRD1、CPA4、DKK1のそれぞれの遺伝子についてのプライマーを使用することで、リアルタイムPCRによる遺伝子発現解析を行った。また、内在性コントロール遺伝子としてGAPDH及び18sを使用して発現量補正を行った。結果を図14に示す。
臍帯由来間葉系幹細胞(UC-MSC;Umbilical Cord derived Mesenchymal Stem Cells Wharton’s Jelly(HMSC-WJ)、FC-0020、LifeLine社)を、37℃、5%CO2の条件下、LifeLine社推奨培地にて馴化後、LifeLine社推奨培地又は処方培地に培地交換した(1X105cells/well;6well plate)。2~3日おきに継代を行い、培地交換から8日目の細胞を回収した。回収した細胞から上記試験7と同様の方法によりmRNAを調製し、miRNAアレイ(miScript miRNA PCR array;MIHS-105Z及びMIHS-117Z(inflammatory response & autoimmunity及びFibrosis、QIAGEN社製)により、細胞中のmiRNA発現を解析した。結果の解析は、処方培地で培養して得られた細胞における各種miRNA発現量を推奨培地で培養して得られた細胞におけるそれぞれのmiRNA発現量で除した値(Fold change値)により行った。同様の実験を2回行った。
(UC-MSC;Umbilical Cord derived Mesenchymal Stem Cells Wharton’s Jelly(HMSC-WJ)、FC-0020、LifeLine社)を、37℃、5%CO2の条件下、LifeLine社推奨培地にて馴化後、LifeLine社推奨培地又は処方培地に交換した(1X105cells/well;6well plate)。それぞれの培地に変えてから8日間培養後に播種し直し、翌日0.2%FBS含有DMAM/F12に交換し、2日後(48時間後)、培養上清を回収した。回収した培養上清中のDecorin、Osteoprotegerin、MMP1量をELISAにて測定した。結果を図15示す。
(UC-MSC;Umbilical Cord derived Mesenchymal Stem Cells Wharton’s Jelly(HMSC-WJ)、FC-0020、LifeLine社;UC-MSC;Umbilical Cord derived Mesenchymal Stem Cells ScienCell社;及びUmbilical Cord derived Mesenchymal Stem Cells ATCC社)を、37℃、5%CO2の条件下、各社推奨培地にて馴化後、各社推奨培地又は処方培地に培地交換した(0.3~1X105cells/well;6well plate)。2~3日おきに継代を行った細胞に対してRotenoneを各濃度で処理した(0nM、100nM、200nM、500nM、1μM)。48時間後にHoechest33358で染色し、ImageXpressで核数を計測した。結果を図16に示す。
臍帯由来間葉系幹細胞(UC-MSC;Umbilical Cord derived Mesenchymal Stem Cells Wharton’s Jelly(HMSC-WJ)、FC-0020、LifeLine社)を、37℃、5%CO2の条件下、LifeLine社推奨培地にて馴化後、LifeLine社推奨培地又は処方培地に交換した(1X105cells/well;6well plate)。それぞれの培地に変えてから8日間培養後に、培地を10%FCS含有DMEM/F-12培地、2ml/wellに交換した。1日後に培養上清(Sup-1)を回収し、新しい培地を2ml/well注ぎ、培養を継続した。さらに24時間後に再び培養上清(Sup-2)を回収した。
臍帯由来間葉系幹細胞(UC-MSC;Umbilical Cord derived Mesenchymal Stem Cells Wharton’s Jelly(HMSC-WJ)、FC-0020、LifeLine社)を、37℃、5%CO2の条件下、LifeLine社推奨培地にて馴化後、LifeLine社推奨培地又は処方培地に交換した(1X105cells/well;6well plate)。それぞれの培地に変えてから8日間培養後の細胞を以下の試験に用いた。
臍帯由来間葉系幹細胞(UC-MSC;Umbilical Cord derived Mesenchymal Stem Cells Wharton’s Jelly(HMSC-WJ)、FC-0020、LifeLine社)、及び脂肪由来間葉系幹細胞(AD-MSC;Adipose derived Mesenchymal Stem Cells、FC-0034、LifeLine社)を、37℃、5%CO2の条件下、LifeLine社推奨培地にて馴化後、LifeLine社推奨培地又は処方培地に交換した(1X105cells/well;6well plate)。2~3日おきに継代を行い、継代数8の細胞を準備した。継代数8の両MSCを各2枚のCell BIND T-75 flaskに7000 cells/cm2で播種し、両MSC1枚は翌日に処方培地へ交換し、残り1枚は推奨培地のまま90-100%コンフルエントに達するまで培養を継続した。継代数9にて再度継代し、T-75 flask4枚ずつとなるようにまき直し、群分け後8日(継代数10)の細胞を下記の分化試験に供した。
群分け後8日目に、各群ごとに細胞を回収し、クラボウ分化プロトコール推奨細胞密度にて、骨細胞分化用培地(ヒト間葉系幹細胞用 骨細胞分化用培地:OsteoLife Complete Osteogenesis Medium (Lifeline, LM-0023))を用いて、24well plate (cellbind, 3337, Corning)に播種した。骨分化のための培養では、分化培養用播種から48時間後に培地交換を行い、以後、28日まで3-4日ごとに培地交換を行った。染色方法としては、播種後21日目以降に、染色するwellをPBSで1回洗浄した後、無水エタノールを添加し30分間室温で置くことで細胞の固定を行った。無水エタノールを吸引し、クリーンベンチ内で約30分間静置、乾燥させた。2%アリザリンレッド溶液を添加し、15分間室温で静置した後、DW(蒸留水)で2回洗浄し、乾燥させた。染色写真は顕微鏡(Olympus IX70)を用いて撮影した。 アリザリンレッド染色の結果を図19に示す。
分化実験に供する間葉系幹細胞の調製は試験9と同様の方法により行った。
群分け後8日目に、各群ごとに細胞を回収し、クラボウ分化プロトコール推奨細胞密度にて、分化培地{ヒト間葉系幹細胞用 脂肪細胞分化用培地:AdipoLife DfKt-1 (Lifeline, LL-0050) or AdipoLife DfKt-2 (Lifeline , LL-0059)を用いて、24well plate (cellbind, 3337, Corning)、に播種した。脂肪分化のための培養では、分化培養用播種から48時間後に培地交換を行い、以後、28日まで3-4日ごとに培地交換を行った。染色方法としては、播種後21日目以降に、染色するwellをPBSで1回洗浄した後、4% (v/v) パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液で培地を少し残すようにしながら2回洗浄した。4% (v/v) パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液を再度添加し、20分間室温で静置した。その後、培地を少し残すようにしながら、DW(蒸留水)で2回洗浄し、100%イソプロパノールで1回洗浄した。DW(蒸留水)で60%に希釈したオイルレッドO染色原液を添加し、30分間37℃で静置後、完全に吸引した。その後60%イソプロパノールを添加し、10秒ほど待ち、DW(蒸留水)を加えた。DW(蒸留水)で2回洗浄後、顕微鏡(Olympus IX70)で写真撮影した。なお、AdipoLife DfKt-1のAdipoLife BM (100ml)を15mlと85mlに分け、15mlにはDifFactor 1 (1ml)を加えてAD-MSC用の分化開始培地とし、85mlにはDifFactor 2 (5ml)を加えてAD-MSC用の分化維持培地とした。また、AdipoLife DfKt-2のAdipoLife BM (100ml) にDifFactor 3 (10ml)を加えてUC-MSC用の分化培地とした。 オイルレッドO染色の結果を図20に示す。
分化実験に供する間葉系幹細胞の調製は試験9と同様の方法により行った。
群分け後8日目に、各群ごとに細胞を回収し、クラボウ分化プロトコール推奨細胞密度にて、分化培地(ヒト間葉系幹細胞用 軟骨細胞分化用培地:ChondroLife Complete Chondrogenesis Medium (Lifeline, LM-0023))を用いて、24well plate (3527, Corning)に播種した。軟骨分化のための培養では、マイクロマス法で播種を行った。具体的には、回収した細胞を各維持培地で1.6 x 107 cells/mlに濃縮し、24well plate (3526, Corning)に5ulずつ4drops/wellで滴下し、2時間37℃, 5%CO2で静置した後、500ul/wellで軟骨分化培地を添加した。その後、21日まで3日ごとに培地交換を行った。染色方法としては、播種後21日目以降に、染色するwellをPBSで1回洗浄した後、10%中性緩衝ホルマリン液を添加し、30分間室温で置くことで細胞の固定を行った。その後、DW(蒸留水)で1回洗浄し、3%酢酸を添加し、1分間静置した。アルシアンブルー染色液を添加後20分間室温で静置した後、染色液を吸引し、3%酢酸を添加して3分間待った。最後にDW(蒸留水)で2回洗浄し、デジタルカメラで撮影した。
上記処方培地による培養によって得られる細胞集団から、ROR1陽性MSC(F posi)及びROR1陰性MSCの細胞(F nega)をソーティングにより分離し、必要に応じて、ROR1陽性MSCとROR1陰性MSCとを1:1の割合で混ぜた細胞(F mix)、ソーティングを行っていないMSC(F ソートなし)を用いて、それぞれの機能を検討した。以下、詳細に説明する。
上記にて得られたROR1陽性MSC(F posi)、ROR1陰性MSC(F nega)のそれぞれを、0.2%FBS-DMEM/F12培地中で48時間培養し、培養上清を回収し、それぞれの培養上清の、癌細胞遊走抑制能を比較した。癌細胞としてはB16マウスメラノーマ細胞を用いた。具体的には、サブコンフルエントまで培養したB16マウスメラノーマ細胞を、0.25%トリプシン/EDTA液(Gibco社)を用いて回収した。回収した細胞はDMEM/F12(0.2% FBS、1% Antibiotic-Antimycotic 含有)に懸濁し、24well ボイデンチャンバー(Corning社、3422)の上部ウェルに約4.0×104cellsずつ200μLの培地で播種した。下部ウェルには上記で作製した各MSC培養上清を550μL加え、37℃、5%炭酸ガス及び95%空気の環境下で6時間培養した。その後の処理は、図1の実験と同様に行った。結果を図21に示す。
上記の方法によって得られたROR1陽性MSC(F posi)、ROR1陰性MSC(F nega)、ROR1陽性MSCとROR1陰性MSCとを1:1の割合で混ぜた細胞(F mix)、ソーティングを行っていないMSC(F ソートなし)のそれぞれを、細胞密度を合わせて再播種し、2日後に各濃度のH2O2/HBSS溶液(0、100、200、400μM)で1時間処理し、HBSS(+)で2回洗浄後、元の培地に戻して24時間後の細胞数を、ヘキスト33342(Dojindo#H342;1μg/mlにて5~10分)染色後の蛍光画像解析により比較した。
上記の方法によって得られたROR1陽性MSC(F posi)、ROR1陰性MSC(F nega)、ROR1陽性MSCとROR1陰性MSCとを1:1の割合で混ぜた細胞(F mix)のそれぞれを、6wellプレートに播種し、上述のミトコンドリアトランスファー試験と同様の方法を用いて、それぞれの細胞のミトコンドリアトラスファー能を比較した。受容側の細胞としては、以下の細胞を用いた。
・NHDF細胞(ヒト皮膚線維芽細胞):Human Dermal Fibroblast(KURABO KF-4009);なお、NHDF細胞の培養には、DMEM(Gibco 11995-065)培地+10%FCS+1%AB*を用いた
・BSMC-COPD細胞(慢性閉塞性肺疾患のヒト気管支平滑筋細胞;Bronchial Smooth Muscle cell Chronic Obstructive Pulmonary Disease(Lonza 00195274);なお、BSMC-COPD細胞の培養には、SmGMTM-2培地+BulletKit(Lonza CC-3182)+1%Antibiotic-Antimycotic(Gibco社)を用いた。
・HCM(ヒト心筋細胞):Human Cardiac Myocytes(HCM(PromoCell));なお、HCMの培養には、Myocyte Basal Medium(PromoCell,C-22170),Myocyte Growth Medium Supplement Pack(PromoCell,C-39270)を用いた。
Claims (10)
- ROR1陽性の臍帯又は脂肪由来間葉系幹細胞。
- CD29、CD73、CD90、CD105及びCD166陽性である、請求項1記載の間葉系幹細胞。
- 請求項1又は2記載の間葉系幹細胞及び/又はその培養上清を含み、上記培養上清が、上記間葉系幹細胞を0.2%FBS-DMEM/F12培地中で48時間培養して回収されたものである、医薬組成物。
- 医薬組成物がROR1陽性の間葉系幹細胞を含む場合、ROR1陽性の間葉系幹細胞の比率が、医薬組成物の含む間葉系幹細胞全体の70%以上である、請求項3記載の医薬組成物。
- 医薬組成物がROR1陽性の間葉系幹細胞を含む場合、ROR1陽性の間葉系幹細胞の比率が、医薬組成物の含む間葉系幹細胞全体の90%以上である、請求項3又は4記載の医薬組成物。
- 癌、前癌性症状、炎症性疾患、免疫疾患、神経変性疾患、代謝疾患、心血管疾患、脳血管障害、骨疾患、胃腸疾患、肺疾患、肝疾患及び腎疾患からなる群より選択される疾患の予防又は治療のために用いられる、請求項3から5のいずれか1項記載の医薬組成物。
- 上皮若しくは内皮のバリア機能の低下に起因する疾患、又はIL-1が関与する疾患の予防又は治療のために用いられる、請求項3から6のいずれか1項記載の医薬組成物。
- バリア機能の低下が、上皮又は内皮細胞層におけるタイトジャンクション機能の低下に起因する、請求項7記載の医薬組成物。
- 癌細胞の浸潤及び/又は転移を抑制するために用いられる、請求項3から5のいずれか1項記載の医薬組成物。
- ミトコンドリアトランスファー剤である、請求項3から9のいずれか1項記載の医薬組成物。
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