CN110898077A - 一种干细胞组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明一种干细胞组合物及其在痛风疾病上的应用，具体涉及乳牙间充质干细胞及没食子酸的组合物，及该组合物在痛风上的应用。干细胞组合物包括：乳牙间充质干细胞和没食子酸及稳定剂。乳牙间充质干细胞同没食子酸混合后的细胞组合物对痛风具有良好的治疗和缓解效果，降低痛风进展中痛疼，关节肿胀等，且该组合物从根本上修复机体细胞功能，降低患者复发几率。

Description

一种干细胞组合物及其应用

技术领域：

本发明涉及生物技术领域，具体涉及干细胞组合物及其在疾病上的应用，更具体涉及干细胞组合物在痛风疾病上的应用。

背景技术：

干细胞被普遍定义为能自我更新和多系分化的克隆形成细胞，根据细胞来源可将干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞。当受精卵分裂发育成胚泡时，内层细胞团的细胞即为胚胎干细胞。胚胎干细胞具有全能性，可以自我更新并具分化为体内所有组织的能力，但是对其的研究利用牵涉到一定的伦理问题。成体干细胞来自成年动物的许多组织和器官，在特定的条件下，成体干细胞能够进行一定的程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。在口腔中也发现了多种干细胞，例如上皮内的干细胞、牙髓中的干细胞和牙周膜中的干细胞等，还有与牙齿相关组织有关的间充质干细胞。他们不仅有自我更新能力，还能多系分化成各种组织。利用患者的自体干细胞，可分化为包括培养牙本质、牙髓在内的各种组织，为口腔颌面外科的损伤修复提供了无限可能。

剥落乳牙牙髓干细胞(SHED：stem cells from exfoliated deciduous teeth)是从人类乳牙牙髓中分离出来的具有较强增殖能力和多向分化潜能的成体间充质干细胞，有学者又称为未成熟的牙髓干细胞(immature dental pulp stem cells)。SHED不仅表达STRO-1、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、MUC18、CD146和CD166等间充质干细胞标志，还表达胚胎干细胞标志(Oct4和Nanog)、阶段特异性胚胎抗原(SSEA-3和SSEA-4)以及肿瘤识别抗原(TRA-1-60和TRA-A-81)等。与牙髓干细胞相比，脱落乳牙干细胞增殖活性高、群体倍增时间短、克隆形成能力强，细胞中MMP1、TIMP1、MMP2、TIMP2和IL-6等炎性因子表达水平较高。多向分化能力与DPSC相似，包括成骨、成牙本质、成脂、成软骨、成肌等，而SHED细胞的成血管、成神经分化能力强于DPSC。由于其可表达多种神经细胞标志，在神经诱导培养基诱导下，βⅢ-tubulin、GAD等神经细胞标志性蛋白的表达水平上调，细胞突起较多，形成类似神经干细胞的球样集落。在血管内皮生长因子的刺激下，脱落乳牙干细胞可表达VEGF2、CD31、血管内皮钙粘蛋白等血管内皮标志性蛋白，形成毛细血管。此外SHED细胞还具有诱导周边宿主分化形成骨形成细胞的特性。体内移植实验可以形成牙本质牙髓样组织、成牙本质样细胞及骨样组织，但不能形成完整牙髓牙本质复合体样结构。以上提示了SHED是一类更为原始、属于发育早期的干细胞。

痛风是一种由于嘌呤生物合成代谢增加，尿酸产生过多或因尿酸排泄不良而致血中尿酸升高，尿酸盐结晶沉积在关节滑膜、滑囊、软骨及其他组织中引起的反复发作性炎性疾病。它是由于单钠尿酸盐结晶(MSU)或尿酸在细胞外液形成超饱和状态，使其晶体在组织中沉积而造成的一组异源性疾病。本病以关节液和痛风石中可找到有双折光性的单水尿酸钠结晶为其特点。其临床特征为：高尿酸血症及尿酸盐结晶、沉积所致的特征性急性关节炎、痛风石、间质性肾炎，严重者见关节畸形及功能障碍，常伴尿酸性尿路结石。病因分为原发性和继发性两大类。

在现有的痛风治疗方案中，经常有以下几种药物治疗方法：1、抑制尿酸生成；2、促尿酸排泄物；3、新型降尿酸药；4、碱性药物：在降尿酸治疗的同时简化尿酸。目前有报道称可以采用干细胞治疗痛风。各种治疗方法有效的同时也有其欠缺的地方。

发明内容

针对上述所述问题，本发明公开了一种干细胞组合物及其在痛风疾病上的应用，具体涉及乳牙间充质干细胞及没食子酸的组合物，该组合物在痛风上的应用。

所述干细胞组合物包括：乳牙间充质干细胞和没食子酸及稳定剂。

其中干细胞组合物中乳牙间充质干细胞为1-2.5*10¹⁰个/ml。

上述没食子酸的浓度为0.5-50μg/ml。

其中所述稳定剂选用枸橼酸。

其中上述稳定剂不仅包含枸橼酸，可以包括其他可以稳定组合物体系的其他稳定剂或缓冲剂等。

干细胞与没食子酸在无菌条件下混合，将没食子酸加入干细胞液中，并在37℃水浴锅中孵育10-30Min，并通过常规方法混匀细胞组合物，后分装细胞组合物于容器中。

上述干细胞组合物在痛风上的应用。

进一步的，上述所述痛风为在进行西药、中药及其结合治疗后治疗效果不佳、容易复发的痛风。

其中上述乳牙间充质干细胞的获得方法如下

培养基：无血清完全培养基I：含DMEM基础培养基，2mM/L L-谷氨酰胺，4％Ultroser G溶液，充分混匀，4℃冰箱保存。

无血清完全培养基II:含DMEM基础培养基，2mM/L L-谷氨酰胺，10％KnockOut SR血清替代物，10ng/ml EGF，10ng/ml bFGF。

培养方法：

1)新鲜剥落的乳牙采用Masako Miura等的分离办法，用I型胶原酶消化后，过滤离心获得间充质干细胞进行原代培养，培养基为无血清完全培养基Ⅱ与无血清完全培养基Ⅰ的混合培养基，培养周期7-14天；

2)将培养有P0代乳牙间充质干细胞的T75方瓶中的细胞原始培养基吸弃，加入DPBS洗涤一次；

3)加入0.25％的胰蛋白酶消化4-10分钟后用无血清完全培养基Ⅱ重悬细胞；

4)将细胞悬液转移至无菌离心管中，200-500G，20℃，离心5-10分钟；

5)离心后去上清，使用无血清完全培养基Ⅱ以5×10⁴cells/ml接种于新的T25方瓶中，然后再加入培养基Ⅰ，用移液管反复吹打混匀，然后将方瓶放置于二氧化碳培养箱中，在37℃，5％二氧化碳浓度中培养直至细胞汇合度为80％-90％；

6)在细胞达到上述汇合度时，将方瓶从二氧化碳培养箱转移至生物安全柜中，吸弃原始培养基，加入DPBS洗涤一次，弃DPBS；

7)加入胰蛋白酶37℃消化4-10分钟；

8)消化结束后用无血清完全培养基Ⅱ重悬细胞，并将细胞悬液转移至无菌离心管中，400G，20℃，离心5分钟，离心结束后去上清；

9)用无血清完全培养基Ⅱ以5×10⁴cells/ml接种于新的方瓶中，然后再加入培养基Ⅰ，用移液管反复吹打混匀，然后将方瓶放置于二氧化碳培养箱中，在37℃，5％二氧化碳浓度中培养直至细胞汇合度为80％-90％；

10)在细胞再次达到上述汇合度时，将方瓶从二氧化碳培养箱转移至生物安全柜中，吸弃原始培养，加入DPBS洗涤一次，弃DPBS；

11)加入胰蛋白酶37℃消化4-10分钟后用无血清完全培养基Ⅱ重悬细胞，并将细胞悬液转移至无菌离心管中，400-600G，20℃，离心5-10分钟，离心结束后去上清；

12)用无血清完全培养基Ⅱ以5.5×10⁴cells/ml接种于新的方瓶中，然后再加入培养基Ⅰ，用移液管反复吹打混匀后将方瓶放置于二氧化碳培养箱中，在37℃，5％二氧化碳浓度中培养直至细胞汇合度为80％-90％。

其中上述无血清完全培养基Ⅱ与无血清完全培养基Ⅰ的使用比例为1-5:1。

本发明所用原料和试剂除有特殊说明外，均市售可得。

由于采用上述的技术方案，本发明的有益效果是：

(1)乳牙间充质干细胞同没食子酸混合后的细胞组合物对痛风具有良好的治疗和缓解效果，降低痛风进展中痛疼，关节肿胀等，且该组合物从根本上修复机体细胞功能，降低患者复发几率；

(2)稳定剂的加入可以增加没食子酸与乳牙间充质干细胞体系的稳定性，促进乳牙间充质干细胞活性的保持；

(3)乳牙间充质干细胞组合物共同作用于患者，相较于单独疗法可大幅度降低治疗成本，获得有效的治疗效果，简化了在临床治疗过程；

(4)乳牙间充质干细胞组合物对已经治疗的患者中产生耐药或者不敏感的患者有较好的效果，可以为临床治疗方案提供参考。

具体实施方式：

下面结合具体的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。应理解，所描述的实施例是本发明一部分实施例，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1乳牙间充质干细胞细胞的获得

无血清完全培养基I：含DMEM基础培养基，2mM/L L-谷氨酰胺，4％Ultroser G溶液，充分混匀，4℃冰箱保存。

无血清完全培养基II:含DMEM基础培养基，2mM/L L-谷氨酰胺，10％KnockOut SR血清替代物，10ng/ml EGF，10ng/ml bFGF。

培养方法：

1)新鲜剥落的乳牙采用Masako Miura等的分离办法，用I型胶原酶消化后，过滤离心获得间充质干细胞进行原代培养，培养基为4.5ml无血清完全培养基Ⅱ与1.5ml无血清完全培养基Ⅰ的混合培养基，培养周期7-14天；

2)将培养有P0代乳牙间充质干细胞的T75方瓶中的细胞原始培养基吸弃，加入5mlDPBS洗涤一次；

3)加入0.8ml 0.25％的胰蛋白酶消化4分钟后用无血清完全培养基Ⅱ重悬细胞；

4)将细胞悬液转移至无菌离心管中，400G，20℃，离心5分钟；

5)离心后去上清，使用无血清完全培养基Ⅱ以5×10⁴cells/ml接种于新的T25方瓶中,共接种4ml，然后再加入1ml培养基Ⅰ，用移液管反复吹打混匀，然后将方瓶放置于二氧化碳培养箱中，在37℃，5％二氧化碳浓度中培养直至细胞汇合度为80％-90％；

6)在细胞达到上述汇合度时，将方瓶从二氧化碳培养箱转移至生物安全柜中，吸弃原始培养基，加入5ml DPBS洗涤一次，弃DPBS；

7)加入0.4ml胰蛋白酶37℃消化4分钟；

8)消化结束后用无血清完全培养基Ⅱ重悬细胞，并将细胞悬液转移至无菌离心管中，400G，20℃，离心5分钟，离心结束后去上清；

9)用无血清完全培养基Ⅱ以5×10⁴cells/ml接种于新的方瓶中,共接种3.8ml，然后再加入1.2ml培养基Ⅰ，用移液管反复吹打混匀，然后将方瓶放置于二氧化碳培养箱中，在37℃，5％二氧化碳浓度中培养直至细胞汇合度为80％-90％；

10)在细胞再次达到上述汇合度时，将方瓶从二氧化碳培养箱转移至生物安全柜中，吸弃原始培养，加入5ml DPBS洗涤一次，弃DPBS；

11)加入0.4ml胰蛋白酶37℃消化4分钟后用无血清完全培养基Ⅱ重悬细胞，并将细胞悬液转移至无菌离心管中，400G，20℃，离心5分钟，离心结束后去上清；

12)用无血清完全培养基Ⅱ以5.7×10⁴cells/ml接种于新的方瓶中，共接种3.5ml，然后再加入1.5ml培养基Ⅰ，用移液管反复吹打混匀后将方瓶放置于二氧化碳培养箱中，在37℃，5％二氧化碳浓度中培养直至细胞汇合度为80％-90％。

在细胞培养扩增过程中，当细胞汇合度为80％-90％时检测细胞数量，总数可达约46亿，完全满足临床应用需要。

实施例2干细胞组合物对细胞痛风模型IL-1β的影响

研究表明，痛风是一种典型的自身炎症性疾病，在诱导动物产生痛风的模型中伴随有多种炎性因子的释放，如白细胞介素-6、白细胞介素-8、肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)等，其中IL-1β是单钠尿酸盐(monosodium urate，MSU)诱导的痛风模型中产生的主要炎性因子。在痛风病理发展的过程中，活化的核转录因子κB(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)能启动和调节许多与炎症免疫反应相关的免疫介质、黏附分子的基因表达，上调IL-1β等炎性细胞因子的转录，产生更多的IL-1β，而IL-1β可再次激活NF-κB产生级联反应，引起炎症反应的持续放大，加重病情。

(1)大鼠骨髓巨噬细胞的分离、培养及处理

CO₂处死大鼠后，消毒条件下，取股骨和胫骨，彻底清除肌肉和其他组织，用7号针头在股骨和胫骨的两端打孔，用PBS冲洗出全部骨髓细胞，然后用4号针头制备成细胞悬浮液，室温下以1000×g速率离心5min，洗涤后，计算骨髓细胞数，用含有20％巨噬细胞集落刺激因子、2mmol/L的谷氨酸盐、0.1mmol/L非必需氨基酸、100mg/mL链霉素、10％高温灭活的胎牛血清的DMEM培养基调整细胞浓度为1×10⁶个/mL,并按照4mL/孔的量接种到无菌6孔塑料培养板中，于37℃、CO₂含量为5％的培养箱中培养3d，换液去除悬浮细胞，加入同种培养液继续培养，直至培养板底部皿盖片上铺满椭圆形巨噬细胞。当细胞浓度达到2×10⁶个/mL时，把单核巨噬细胞转移到不含血清的组织培养盘中，用250μg/mLMSU结晶诱导细胞6h，空白对照细胞不做处理。

(2)干细胞组合物作用于细胞

在无菌操作下，分别使用没食子酸、秋水仙碱、干细胞、干细胞组合物加入上述MSU结晶诱导后的细胞培养板中，每组设置5平行孔，分别在37℃恒温培养箱中孵育3h，更换新鲜DMEM培养基，继续培养48h。

(3)ELISA法测定诱导细胞中各组对IL-1β分泌量的影响

以MSU结晶诱导细胞6h后，更换新的DMEM培养基，加药培养48h后，以Lysis Buffer裂解细胞，10000×g离心10min，取上清液，待用。按照IL-1β浓度测定试剂盒的说明书步骤测定IL-1β浓度。测OD450值，作标准曲线的直线回归方程，计算样品浓度。将组别分为空白对照组(细胞不做处理)、MSU诱导组(MSU单独处理细胞)、阳性对照秋水仙碱+MSU组、没食子酸+MSU组、干细胞+MSU组、干细胞组合物+MSU组，分别检测IL-1β含量，步骤如上所述，后进行数据分析，其中取5次实验结果的平均值，检测结果如表1所示：IL-1β浓度测定(pg/ml)

由以上实验结果可以得出：在MSU结晶诱导巨噬细胞后，MSU诱导组中IL-1β浓度升高最多，其构建的细胞痛风模型成功且炎症因子升高；在细胞痛风模型下，分别进行了阳性药物组，没食子酸组，干细胞治疗组和干细胞组合物治疗组，其中干细胞组合物组和阳性药物组在短时间均呈现出较好的降低IL-1β浓度的效果，干细胞组也起到很好的降低IL-1β浓度的效果，但是没食子酸同干细胞组合后的组合物对降低IL-1β浓度的效果相较于干细胞组更好，没食子酸起到促进组合物组发挥作用，起到更好的降低IL-1β浓度效果，从而从实验组可以推测组合物组可以更好的应用于痛风治疗中。

后续开展了大鼠痛风模型构建及治疗，在实验中发现：干细胞组合物组对大鼠关节肿胀度缓解最好，干细胞组、阳性用药物组均可以很好的缓解大鼠关节肿胀，但是没食子酸组和MSU结晶诱导组缓解大鼠关节肿胀效果非常小。且干细胞组合物组、干细胞组、阳性用药物组同时均可以降低大鼠的疼痛和焦躁不安的情况，并且干细胞组合物组、干细胞组对于再次经MSU结晶诱导痛风可明显降低大鼠复发几率，大鼠痛风模型很难建立，以此说明干细胞组合物组、干细胞组可以大大降低痛风几率；而没食子酸组和MSU结晶诱导组表现效果不好，且经过阳性用药物后的大鼠再次经MSU结晶诱导后痛风发病快，容易复发。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (9)

1.一种干细胞组合物，其特征在于：所述干细胞组合物包括：乳牙间充质干细胞和没食子酸及稳定剂。

2.根据权利要求1所述干细胞组合物，其特征在于：其中干细胞组合物中乳牙间充质干细胞为1-2.5*10¹⁰个/ml。

3.根据权利要求2所述干细胞组合物，其特征在于：其中干细胞组合物中乳牙间充质干细胞为2*10¹⁰个/ml。

4.根据权利要求1所述干细胞组合物，其特征在于：所述没食子酸的浓度为0.5-50μg/ml。

5.根据权利要求3所述干细胞组合物，其特征在于：所述没食子酸的浓度为15-25μg/ml。

6.根据权利要求1所述干细胞组合物，其特征在于：所述稳定剂选用枸橼酸。

7.根据权利要求4所述干细胞组合物，其特征在于：上述稳定剂不仅包含枸橼酸，可以包括其他可以稳定组合物体系的其他稳定剂或缓冲剂等。

8.权利要求1-5任一权利要求的干细胞组合物的应用，其特征在于：干细胞组合物在痛风上的应用。

9.根据权利要求6所述的干细胞组合物的应用，其特征在于：上述所述痛风为在进行西药、中药及其结合治疗后治疗效果不佳、容易复发的痛风。