CN102712695B - 能够诱导细胞死亡的ror1生物抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过特异性结合ROR1、其结构域或编码ROR1的核苷酸分子而诱导细胞死亡的抗体和siRNA分子。本发明还提供了涉及本发明的抗体和siRNA分子的方法和本发明的抗体和siRNA分子的用途。

Description

能够诱导细胞死亡的ROR1生物抑制剂
本发明涉及抑制ROR1的生物分子。特别地，本发明提供了能够通过特异性结合ROR1、其结构域或编码ROR1的核苷酸分子而诱导细胞死亡的诸如抗体和siRNA分子的抑制剂。 
本发明的工作受到了第HEALTH-F5-2008-200755号补助协议下欧盟第七框架计划FP7/2007-2013/的资助。 
慢性淋巴细胞白血病(CLL)是以B淋巴细胞(B细胞)的异常瘤性增殖为特征的白细胞癌症。CLL的B细胞的活化和成熟期不同于正常B细胞，并且其尤其为来源于具有不同免疫球蛋白重链可变区(IgVH)基因突变的经受过抗原的B细胞(Chiorazzi N et al.,N Engl J Med 2005;352:804-15)。与基因未突变的患者相比，具有突变IgVH基因的CLL患者具有较好的预后(Damle RN et al.,Blood 1999;94:1840-7;Hamblin TJ et al.,Blood 1999;94:1848-54)。 
全球基因表达谱型研究揭示了在突变和未突变的白血病B细胞中部分不同但整体重叠的表达谱，这提示具有共同的表型(Klein U et al.,J Exp Med2001;194:1625-38;Rosenwald A et al.,J Exp Med 2001;194:1639-47)。 
基因表达谱型研究显示CLL细胞中的孤儿受体酪氨酸激酶(RTK)ROR1增加43.8倍(Klein U et al.,J Exp Med 2001;194:1625-38)。Ror1是与肌肉特异性激酶(MUSK)和Trk神经营养素受体相关的孤儿受体RTK家族的成员(Glass DJ,et al.,Cell 1996;85:513-23;Masiakowski P et al.,J Biol Chem 1992;267:26181-90;Valenzuela DM et al.,Neuron 1995;15:573-84)。 
Ror受体是参与信号转导、细胞-细胞相互作用、细胞增殖调节、分化、细胞代谢以及存活的细胞表面受体(Masiakowski P et al.,Biol Chem1992;267:26181-90;Yoda A et al.,J Recept Signal Transduct Res 2003;23:1-15)。它们在不同的物种(例如，人类、小鼠、果蝇以及秀丽隐杆线虫)之间在进化上高度保守。 
人类ROR1基因具有2814bp的编码区，预计具有937个氨基酸，蛋白大小为105kDa，包括Ig样结构域、富含半胱氨酸的结构域、三环结构域、酪氨酸激酶结构域以及富含脯氨酸的结构域(图1)(Yoda A et al.,J Recept  Signal Transduct Res 2003;23:1-15)。 
ROR1位于染色体区1p31.3(http://www.ensembl.org)，该区域在恶性血液病中不常见到染色体畸变(图2)。人ROR1在心脏、肺脏以及肾脏中都有表达，但在胎盘、胰腺以及骨骼肌中的表达较少(Reddy UR et al.,Oncogene1996;13:1555-9)。ROR1最初克隆自成神经细胞瘤细胞系(Masiakowski P et al.,J Biol Chem 1992;267:26181-90)，之后从胎儿脑库分离出缺乏完整细胞外结构域但含有跨膜结构域的较短形式。已经报道，在胎儿和成人中枢神经系统中、人白血病、淋巴细胞系中以及源自神经外胚层的多种人癌症中均存在截短的Ror1(t-Ror1)基因(Reddy URet al.,Oncogene 1996;13:1555-9)。还已描述了包含内含子7的一短部分的来自外显子1-7的较短转录物，预计长度为393个氨基酸，分子量为44kDa (Ensembl ID;ENSG00000185483)。 
在本发明的第一方面，提供了ROR1的生物抑制剂。 
生物抑制剂可为多种形式，且包括不同的作用方式。生物抑制是指ROR1的量或作用降低，并且这种降低可通过暴露于(接触)生物抑制剂而引起。例如，所述抑制剂可通过与ROR1或编码ROR1的核苷酸序列结合而直接发挥作用。或者，所述抑制剂可通过阻止ROR1与正常情况下其与之相互作用的分子的相互作用(例如通过阻断受体)、隔离与ROR1结合或相连的分子、阻止ROR1或其结合物插入诸如细胞膜的膜中而起作用。 
优选地，所述生物抑制剂特异结合ROR1的细胞外结构域、ROR1的细胞内结构域或编码ROR1的核苷酸序列。 
所述生物抑制剂合适地是抗体、干扰核酸分子或可溶性受体中的一种。 
在一种实施方式中，所述生物抑制剂是抗体。抗体指完整的抗体及其抗原结合片段。此类片段在下文有定义。 
抗体包含通过二硫键连接在一起的Mr为50,000-70,000的两个相同的多肽(称为“重链”)，其中各自与Mr为25,000的相同多肽(称为“轻链”)对之一连接。不同抗体分子重链各N末端之间和不同抗体分子各轻链之间具有相当大的序列可变性，因此，这些区域被称为“可变区”。相反，不同抗体分子重链各C末端之间和不同抗体分子各轻链之间具有相当大的序列相似性，因此，这些区域被称为“恒定区”。 
抗原结合部位由重链和轻链对的可变域中的高可变区形成。高可变区还 被称为互补决定区(CDR)，其决定抗体对于配体的特异性。重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通常包含三个CDR，其中各CDR侧邻为具有较小可变性的序列(称为框架区(FR))。 
抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)参与抗原识别，这由早期的胰蛋白酶消化实验首先发现。进一步的确认通过对啮齿类动物抗体“人源化”而实现。啮齿类动物源性可变域可与人源性的恒定域融合，使得所产生的抗体保留啮齿类动物亲本抗体的抗原特异性(Morrison et al.,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81,6851-6855)。 
抗原特异性由可变域赋予且不依赖于恒定域这一事实是通过包括均含有一个或多个可变域的抗体片段的细菌表达的试验而得知的。这些分子包括Fab样分子(Better et al.,1988,Science,240:1041)，Fv分子(Skerra et al.,1988,Science,240,1038)，其中的VH和VL配对结构域通过柔性寡肽连接的单链Fv(ScFv)分子(Bird et al.,1988,Science 242:423;Huston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:5879)，以及包含分离的V结构域的单结构域抗体(dAb)(Ward et al.,1989Nature 341,544)。涉及保留抗体片段的特异性结合位点的所述抗体片段合成的技术的综述见Winter et al.,1991,Nature,349,293-299。 
为了生产多克隆抗体，可通过一次或多次注射天然蛋白、其合成变体或衍生物而对合适的宿主动物(例如，兔、山羊、小鼠或其他哺乳动物)进行免疫接种。合适的免疫原性制剂可含有，例如，天然存在的免疫原性蛋白，表现为免疫原性蛋白的化学合成多肽，或重组表达的免疫原性蛋白。另外，所述蛋白可与已知在被免疫接种的哺乳动物中具有免疫原性的第二蛋白结合。此类免疫原性蛋白的实例包括但不限于钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白以及大豆胰蛋白酶抑制剂。该制剂可进一步包含佐剂。用于提高免疫应答的多种佐剂包括但不限于弗氏佐剂(完全和不完全弗氏佐剂)，矿物凝胶(例如，氢氧化铝)，表面活性物质(例如，溶血卵磷脂、普卢兰尼克多元醇(pluronic polyol)、聚阴离子、肽、油乳剂、二硝基酚等)，可用于人的佐剂，例如卡介苗和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)或相似的免疫刺激剂。可应用的其他佐剂实例包括MPL-TDM佐剂(单磷酰脂质A\合成的海藻糖dicorynomycolate(trehalose dicorynomycolate))。 
针对所述免疫原性蛋白的多克隆抗体分子可分离自哺乳动物(例如，来自 血液)和通过本领域熟知的技术进一步纯化，例如使用蛋白A或蛋白G的亲和层析(其初步产生了免疫血清的IgG级分)。接着，或者可选择地，可将作为所寻找的免疫球蛋白的靶标的特异性抗原或其表位固定于柱子上以通过免疫亲和层析纯化免疫特异性抗体。免疫球蛋白的纯化的讨论见例如D.Wilkinson(The Scientist,published by The Scientist,Inc.,Philadelphia Pa.,Vol.14,No.8(Apr.17,2000),pp.25-28)。 
本文所使用的术语“单克隆抗体或单抗”(mAb)或“单克隆抗体组合物”是指仅含有由独特的轻链基因产物和独特的重链基因产物组成的一种分子类别的抗体分子的抗体分子群。特别地，单克隆抗体的互补决定区(CDR)在该抗体分子群的所有分子中均相同。由此，MAb含有能够与抗原的特定表位(通过对其的独特结合亲和力而表征)发生免疫相互作用的抗原结合部位。 
所述抗体可为人或人源化抗体或其片段。 
所述抗体可为包含scFv分子或Fab分子的片段。 
“ScFv分子”指其中的VH和VL配对结构域经柔性寡肽而连接的分子。 
使用具有抗原结合活性的抗体片段的优点是非完整抗体的数倍。片段的较小尺寸可导致药理特性改进，例如较好的固体组织穿透性。完整抗体的效应子功能，例如互补结合，被去除。Fab、Fv、ScFv以及dAb抗体片段均可在大肠杆菌(E.coli)中表达并分泌，从而易于产生大量所述片段。 
完整抗体和F(ab')2片段为“二价体”。“二价体”是指所述抗体和F(ab')2片段具有两个抗原结合部位。相比之下，Fab、Fv、ScFv以及dAb片段为单价，仅具有一个抗原结合部位。 
用于生成、分离和使用针对目的抗原或其表位的抗体的方法为相关领域技术人员熟知。例如，可使用本领域已知的标准方法在合适的宿主动物(例如，小鼠、兔或山羊)中产生抗体，并将其用作粗的抗血清或对其进行纯化，例如通过亲和纯化而纯化。具有目的特异性的抗体也可使用熟知的分子生物学方法产生，所述方法包括从重组抗体分子库筛选，或将互补决定区(CDR)接枝(grafting)或改组(shuffling)至合适的框架区上。人抗体可选自重组库和/或通过使用熟知的分子生物学技术将来自非人抗体的CDR接枝至人框架区上而产生。 
本发明一种实施方式的抗体可具有图17、18以及19中显示的序列。 
细胞外结构域是指延伸超过细胞膜表面的生物分子部分，其中所述生物分子整合/包埋在细胞膜中。所述生物分子的实例是具有结合配体的细胞外部分的受体。如果受体的多肽链跨过双层数次，则外部结构域可包含数个伸出细胞膜的“环”。任何一个环或它们的组合都可形成配体的结合部位。 
优选地，抗体结合的细胞外结构域具有选自下述的氨基酸序列： 
WNISSELNKDSYLTL， 
RSTIYGSRLRIRNLDTTDTGYFQ， 
YMESLHMQGEIENQI， 
CQPWNSQYPHTHTFTALRFP。 
可选地，抗体结合的细胞内结构域具有氨基酸序列NKSQKPYKIDSKQAS。 
合适地，当抗体特异性结合ROR1分子或其结构域时，其在表达ROR1的细胞中诱导细胞死亡。 
优选地，生物抑制剂导致表达ROR1的细胞死亡。细胞死亡包括所有形式的细胞死亡，包括细胞凋亡、坏死以及自体吞噬性细胞死亡。 
细胞凋亡(程序性细胞死亡，I型)是指细胞通过系统性去除内容物而蓄意破坏自身的过程，而去除的内容物则随后被周围细胞摄取。 
自体吞噬性细胞死亡(也称为细胞质性细胞死亡或程序性细胞死亡，II型)的特征为形成大的空泡，其在细胞核被破坏之前以特定的顺序吞噬细胞器。 
坏死为过早的细胞死亡，其在没有细胞及其组成部分的受控制的系统性去除的情况下发生。通常，坏死的特征是细胞器破裂及诸如溶菌酶的酶化合物外漏，其随后破坏邻近细胞并导致其坏死。 
抗体可用于治疗中——例如，可将包含治疗性抗体的药物导入受治疗者以调节所述受治疗者的免疫应答。例如，对受治疗者中的抗原具有特异性的治疗性抗体将刺激针对所述抗原的免疫应答，由此诱导和/或促进免疫应答并有助于痊愈。用于向有需要的患者施用治疗性抗体的方法为本领域熟知。 
在一种可选的实施方式中，生物抑制剂可为干扰核酸分子，包括siRNA、反义RNA以及dsRNA。 
优选地，干扰核酸分子是能够与编码ROR1或其片段或变体的核苷酸序列杂交的反义多核苷酸。 
“多核苷酸”包括DNA(脱氧核糖核酸)和/或RNA(核糖核酸)的单链和/或双链分子及其衍生物。“编码多核苷酸”包括其序列可经翻译以形成所需多肽的多核苷酸。 
目前还已经发现，可使用siRNA(小干扰RNA分子)诱导血管发生抑制。 
RNA干扰(RNAi)是用于沉默特定基因的天然机制。基因为细胞提供了制造蛋白的指令，并且当基因被沉默时，细胞停止制造由所述基因指定的蛋白。RNA干扰最初在植物中发现，但RNAi机制理解中的首个关键突破来自对线虫的研究。这发生于1998年，当时认识到双链RNA(dsRNA)在RNAi中具有关键作用。使用siRNA体内沉默基因的第一个证据公布于2002年(McCaffrey，A.P.,Meuse,L.,Pham,T.T.,Conklin,D.S.,Hannon,G.J.and Kay，M.A.(2002)RNA interference in adult mice.Nature(London)418,38–39)，之后是Song et al.的出版物，其表明siRNA可用于治疗性干预。该研究揭示了靶向Fas的RNA干扰保护小鼠免于暴发性肝炎(Song,E.,Lee,S.K.,Wang,J.et al.(2003)Nat.Med.9,347–351)。 
siRNA分子可为单链(ss)或双链(ds)。siRNA分子可使用构建体来递送，该构建体当被递送至靶细胞时能够表达siRNA分子。 
“小干扰RNA”或“短干扰RNA”或“siRNA”或“短发夹RNA”或“shRNA”是与靶核酸序列互补的双链RNA分子。双链RNA分子是通过第一RNA部分和第二RNA部分之间的互补配对而形成的。各部分的长度通常小于30个核苷酸(例如，29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10个核苷酸)。在一些实施方式中，各部分的长度为19至25个核苷酸。在一些siRNA分子中，RNA分子的第一和第二互补部分为发夹结构的“茎”。这两部分可通过连接序列连接，而连接序列可形成发夹结构中的“环”。所述连接序列的长度可不同。在一些实施方式中，所述连接序列的长度可为5、6、7、8、9、10、11、12或13个核苷酸。代表性的连接序列是5'-TTC AGA AGG-3'，但也可以使用多个序列中的任一者用于连接所述第一和第二部分。第一和第二部分互补，但可以不完全对称，这是由于发夹结构可含有3'或5'悬突核苷酸(例如，1、2、3、4、或5个核苷酸的悬突)。 
许多研究者都证明了RNA分子可有效抑制mRNA聚积。siRNA介导的 核酸表达抑制是特异性的，这是因为siRNA和所靶向的核酸之间的甚至单个碱基错配也可破坏RNA干扰的作用。siRNA通常并不引发抗病毒应答。 
合适地，siRNA与编码ROR1细胞外结构域的核苷酸序列或编码ROR1细胞内结构域的核苷酸序列互补。 
优选地，siRNA分子具有下表显示的siRNA序列： 
在本发明的第二方面，提供了编码第一方面的生物抑制剂的核苷酸序列。 
术语“核苷酸序列”或“核酸”或“多核苷酸”或“寡核苷酸”可互换使用，并且是指核苷酸的杂聚物或这些核苷酸的序列。这些术语也指基因组来源或合成来源的DNA或RNA，其可以是单链的或双链的并且可以为正义链或反义链，或者指肽核酸(PNA)或任何DNA样或RNA样物质。在本发明的序列中，A是腺嘌呤，C是胞嘧啶，T是胸腺嘧啶，G是鸟嘌呤，N是A、C、G或T(U)。可预期是，当所述多核苷酸是RNA时，在本发明提供的序列中的T(胸腺嘧啶)用U(尿嘧啶)取代。通常，本发明提供的核酸片段可由基因组片段和短的寡核苷酸连接子组装而成，或由一系列寡核苷酸组装而成，或由单独的核苷酸组装而成，从而产生能在重组转录单元中表达的合成核酸，所述重组转录单元包含来源于微生物或病毒操纵子或真核基因的调控元件。 
在本发明的第三方面，提供了含有本发明第二方面所述的核苷酸序列的表达载体。 
典型的原核载体质粒为：pUC18、pUC19、pBR322以及pBR329，可获自Biorad实验室(Richmond,CA,USA)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540以及pRIT5，可获自Pharmacia(Piscataway,NJ,USA)；pBS载体、Phagescript载体、Bluescript载体、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A，可获自Stratagene Cloning Systems(La Jolla,CA 92037,USA)。 
典型的哺乳动物细胞载体质粒为pSVL，可获自Pharmacia(Piscataway,NJ, USA)。该载体使用SV40晚期启动子来驱动克隆基因的表达，最高表达水平见于产生T抗原的细胞，例如COS-1细胞。可诱导的哺乳动物表达载体的实例是pMSG，也可获自Pharmacia(Piscataway,NJ,USA)。该载体使用小鼠乳腺瘤病毒长末端重复序列的糖皮质激素诱导型启动子来驱动克隆基因的表达。 
可用的酵母质粒载体是pRS403-406和pRS413-416，并且通常可获自Stratagene Cloning Systems(La Jolla,CA 92037,USA)。质粒Plasmids pRS403、pRS404、pRS405以及pRS406是酵母整合质粒(YIp)，并且引入了酵母选择性标记HIS3、TRP1、LEU2以及URA3。质粒pRS413-416是酵母着丝粒质粒(YCp)。 
本领域技术人员熟知的方法可用于构建含有编码序列和例如合适的转录或翻译控制的表达载体。所述方法中的一个包括通过均聚物尾连接。均聚物polydA (或polydC)尾通过末端脱氧核苷酸转移酶而被添加至待克隆的DNA片段上暴露的3’OH基团上。然后，该片段能够退火至添加在线性化质粒载体末端的polydT (或polydG)尾。退火后留有的空隙可通过DNA聚合酶填充，游离末端可通过DNA连接酶连接。 
另一种方法包括通过粘性末端连接。相配的粘性末端可通过合适的限制性酶的作用而在DNA片段和载体上生成。这些末端将通过互补碱基配对而迅速退火，并且遗留的缺口可通过DNA连接酶的作用而闭合。 
另一种方法使用称为连接子和适体的合成分子。带钝端的DNA片段通过细菌噬菌体T4DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合物I而生成，其中，所述酶去除突出的3’末端并填充凹陷的3’末端。可通过T4 DNA连接酶将合成的连接子、含有所限定的限制性酶的识别序列的钝端双链DNA的片段与钝端DNA片段连接。然后使用合适的限制性酶对其进行消化以产生粘性末端，并将其与具有相配末端的表达载体连接。适体也是含有用于连接的一个钝端且还具有一个预先形成的粘性末端的化学合成的DNA片段。 
含有多个限制性内切核酸酶位点的合成连接子可自许多来源商购获得，包括国际生物技术公司(New Haven,CN,USA)。 
对本发明编码多肽的DNA进行修饰的期望方式是使用Saiki et al(1988)Science 239,487-491所公开的聚合酶链式反应。在该方法中，待酶促扩增的DNA侧邻两个特异性寡核苷酸引物，所述引物自身会引入至所扩增的DNA 中。所述特异性引物可含有可用于利用本领域已知的方法向表达载体中克隆的限制性内切酶识别位点。 
在本发明的第四方面，提供了包含本发明第二和第三方面所述的核苷酸序列或表达载体的宿主细胞。 
然后在合适的宿主中表达DNA以产生包含本发明化合物的多肽。因此，可根据基于本文包含的教导进行适当修饰的已知技术，使用编码构成本发明化合物的多肽的DNA构建表达载体，然后使用该表达载体转化合适的宿主细胞，用以表达和产生本发明的多肽。此类技术包括公开于下述文献中的技术：1984年4月3日授予Rutter等人的美国专利第4,440,859号；1985年7月23日授予Weissman的美国专利第4,530,901号；1986年4月15日授予Crowl的美国专利第4,582,800号；1987年6月30日授予Mark等人的美国专利第4,677,063号；1987年7月7日授予Goeddel的美国专利第4,678,751号；1987年11月3日授予Itakura等人的美国专利第4,704,362号；1987年12月1日授予Murray的美国专利第4,710,463号；1988年7月12日授予Toole,Jr.等人的美国专利第4,757,006号；1988年8月23日授予Goeddel等人的美国专利第4,766,075号；以及1989年3月7日授予Stalker的美国专利第4,810,648号，这些文献均通过引用并入本文。 
编码构成本发明化合物的多肽的DNA可与许多种其他DNA序列连接，用于向合适的宿主中引入。伴侣DNA将取决于宿主的性质，向宿主引入DNA的方式，以及是否需要游离基因的维持或整合。 
通常，以合适的方向和正确的表达阅读框将所述DNA插入到表达载体，例如质粒中。如有必要，所述DNA可连接有由期望宿主识别的合适的转录和翻译调控核苷酸序列，虽然表达载体通常具有这种调控。因此，所述DNA插入物可以可操作地与合适的启动子连接。细菌启动子包括大肠杆菌lacI和lacZ启动子、T3和T7启动子、gpt启动子，噬菌体λPR和PL启动子、phoA启动子和trp启动子。真核启动子包括CMV即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、SV40早期和晚期启动子以及逆转录病毒LTR的启动子。其他合适的启动子是本领域技术人员已知的。表达载体还期望含有用于起始和终止转录的位点，和在转录区中用于翻译的核糖体结合位点(WO 98/16643)。 
然后，通过标准技术将载体导入宿主。通常，并非所有宿主都被载体转化， 因此需要选择经转化的宿主细胞。一种选择技术包括向表达载体中引入具有任何必要控制元件的DNA序列标记，该标记在经转化的细胞中编码选择性特征。这些标记包括用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶、G418或新霉素抗性，以及用于在大肠杆菌及其他细菌中培养的四环素、卡那霉素或氨苄霉素抗性基因。或者，用于此类选择性特征的基因可存在于用于共转化目的宿主细胞的其他载体上。 
然后，根据本文公开的教导，在本领域技术人员已知的合适条件下将已经转化有本发明的重组DNA的宿主细胞培养足够的时间，以允许多肽的表达，然后可回收所表达的多肽。 
可通过熟知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化本发明的多肽，所述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀法、酸提取法、阳离子或阴离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水相互作用色谱法、亲和层析、羟基磷灰石色谱法以及凝集素色谱法。更优选地，采用高效液相色谱法(“HPLC”)进行纯化。 
已知多种表达系统，包括(但不限于)采用以下的系统：转化有例如重组细菌噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体的细菌(例如，大肠杆菌和芽孢杆菌(Bacillus subtilis))；转化有例如酵母载体的酵母(例如，酿酒酵母(Saccaromyces cerevisiae))；转化有例如病毒表达载体(杆状病毒)的昆虫细胞系统；转化有例如病毒或细菌表达载体的植物细胞系统；转化有例如腺病毒表达载体的动物细胞系统。 
所述载体可包括原核复制子，例如Col E1 ori，用于在原核细胞中增殖，即便所述载体用于在其他非原核细胞类型中表达也是如此。所述载体还可包含合适的启动子，例如能够在转化有所述载体的细菌宿主细胞(例如大肠杆菌)中指导基因表达(转录和翻译)的原核启动子。 
启动子是由允许RNA聚合酶结合和发生转录的DNA序列形成的表达调控元件。与示例细菌宿主相容的启动子序列通常在含有用于插入本发明的DNA片段的合适限制性位点的质粒载体中提供。 
在本发明的第五方面，提供了本发明第一方面所述的生物抑制剂在诱导细胞死亡中的用途。 
在本发明的第六方面，提供了在一种或多种细胞中诱导细胞死亡的方法，该方法包括将表达ROR1的细胞与本发明第一方面所述的生物抑制剂相接触。 
在本发明的第七方面，提供了本发明的第一方面所述的生物抑制剂，其用在医药中。 
在本发明的第八方面，提供了本发明第一方面所述的生物抑制剂，其用于治疗下述疾病：慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤、慢性髓性白血病、多发性骨髓瘤、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、黑素瘤、肺癌、结直肠癌、胶质母细胞瘤、胰腺癌以及肝细胞癌。 
“治疗”包括以下含义：表现待治疗的疾病特征的多种癌细胞的数量被减少和/或进一步地癌细胞的生长被延迟和/或阻止和/或癌细胞被杀死。 
可使用基于世界卫生组织(WHO)对造血和淋巴组织的肿瘤的分类而在实施例1中列出的标准，鉴定慢性淋巴细胞白血病。 
在本发明的第九方面，提供了本发明第一方面所述的生物抑制剂在制备治疗下述疾病的药物中的用途：慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤、慢性髓性白血病、多发性骨髓瘤、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、黑素瘤、肺癌、结直肠癌、胶质母细胞瘤、胰腺癌以及肝细胞癌。 
本发明的生物抑制剂可用于制备可用于治疗下述疾病的药物组合物(药物)：慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤、慢性髓性白血病、多发性骨髓瘤、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、黑素瘤、肺癌、结直肠癌、胶质母细胞瘤、胰腺癌以及肝细胞癌。 
在本发明的第十方面，提供了治疗疾病的方法，该方法包括将本发明第一方面所述的生物抑制剂施用于受治疗者，其中所述疾病选自慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤、慢性髓性白血病、多发性骨髓瘤、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、黑素瘤、肺癌、结直肠癌、胶质母细胞瘤、胰腺癌以及肝细胞癌。 
“受治疗者”是指包括人在内的所有动物。受治疗者的实例包括人、牛、犬、猫、山羊、绵羊以及猪。术语“患者”是指患有需要治疗的病症的受治疗者。 
待治疗的疾病可为进行性的，即，所述疾病随时间恶化(即，不稳定或不改善)。在CLL的情况下，如果符合下述标准则认为患者患有进行性疾病： 前3个月发生疾病相关性贫血(血红蛋白<100g/l)，血小板减少(<100x109/l)和/或脾/肝/淋巴结大小增加和/或血淋巴细胞计数增加超过2倍，否则，则认为患者为非进行性的。 
在本发明的第十一方面，提供了药物组合物，其包含本发明第一方面所述的生物抑制剂和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。 
实施例描述了制备药物制剂的一些方法，然而，本领域技术人员应理解，最合适的制剂取决于许多因素，包括给药途径、患者类型(例如，患者年龄、体重/大小)。 
优选地，所述药物组合物在表达ROR1的细胞中诱导细胞死亡。 
在第十二方面，提供了试剂盒，其包含： 
(i)本发明第一方面所述的生物抑制剂或本发明第十一方面所述的药物组合物； 
(ii)用于施用所述抗体、siRNA或药物组合物的装置；以及 
(iii)使用说明书； 
具体实施方式
本发明的实施方式在下述编号段落中描述。 
1.ROR1的生物抑制剂。 
2.段落1中所述的生物抑制剂，其中，所述抑制剂特异性结合ROR1的细胞外结构域、ROR1的细胞内结构域或编码ROR1的核苷酸序列。 
3.段落1或2中所述的生物抑制剂，其中，所述抑制剂选自抗体、干扰核酸分子或可溶性受体。 
4.段落3中所述的生物抑制剂，其中，所述抗体是完整抗体或其片段。 
5.前述任何段落中所述的生物抑制剂，其中，当所述生物抑制剂与ROR1或编码ROR1的核苷酸序列特异性结合时，其在表达ROR1的细胞中诱导细胞死亡。 
6.段落1至4中任何一段落中所述的生物抑制剂，其中，所述生物抑制剂所结合的细胞外结构域具有氨基酸序列WNISSELNKDSYLTL。 
7.段落1至4中任何一段落中所述的生物抑制剂，其中，所述生物抑制剂所结合的细胞内结构域具有氨基酸序列NKSQKPYKIDSKQAS。 
8.段落1至5任何一段落中所述的生物抑制剂，其中，所述干扰核酸分子是干扰RNA分子，例如siRNA、反义RNA或dsRNA。 
9.段落1至5和8任何一段落中所述的生物抑制剂，其中所述干扰核酸分子与编码ROR1的核苷酸序列或其片段或变体互补。 
10.段落9中所述的生物抑制剂，其中，所述干扰核酸是能够与编码ROR1的核苷酸序列或其片段或变体杂交的反义多核苷酸。 
11.段落9或10中所述的生物抑制剂，其中，所述干扰核酸与编码ROR1的细胞外结构域的核苷酸序列或编码ROR1的细胞内结构域的核苷酸序列互补。 
12.段落5至7中任何一段落中所述的生物抑制剂，其中，所述干扰核酸是具有选自AAUGAACCAAAGAAUAACAUC、AAAAAUCUAUAAAGGCCAUCU或AACAUGUCAAUUCCAAAUCAU的序列的siRNA。 
13.编码前述段落中任一段落所述的生物抑制剂的核苷酸序列。 
14.包含段落13中所述的核苷酸序列的表达载体。 
15.包含段落13或14中所述的核苷酸序列或表达载体的宿主细胞。 
16.段落1至12中所述的生物抑制剂在诱导细胞的细胞死亡中的用途。 
17.在一种或多种细胞中诱导细胞死亡的方法，其包括将表达ROR1的细胞与段落1至12中所述的生物抑制剂相接触。 
18.段落1至12中所述的生物抑制剂，其用于医药中。 
19.段落1至12中所述的生物抑制剂，其用于治疗选自下述的疾病：慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤、慢性髓性白血病、多发性骨髓瘤、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、黑素瘤、肺癌、结直肠癌、胶质母细胞瘤、胰腺癌以及肝细胞癌。 
20.段落1至12中所述的生物抑制剂在制备治疗下述疾病的药物中的用途：慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤、慢性髓性白血病、多发性骨髓瘤、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、黑素瘤、肺癌、结直肠癌、胶质母细胞瘤、胰腺癌以及肝细胞癌。 
21.治疗疾病的方法，其包括将段落1至12所要求保护的生物抑制剂施用药于受治疗者，其中，所述疾病选自慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞 白血病、急性髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤、慢性髓性白血病、多发性骨髓瘤、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、黑素瘤、肺癌、结直肠癌、胶质母细胞瘤、胰腺癌以及肝细胞癌。 
22.段落19至21所要求保护的生物抑制剂、用途或方法，其中，所述疾病是进行性疾病。 
23.段落19至22所要求保护的生物抑制剂、用途或方法，其中，所述疾病是慢性淋巴细胞白血病。 
24.药物组合物，其包含段落1至12所述的生物抑制剂和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。 
25.权利要求18中所要求保护的药物组合物，其在表达ROR1的细胞中诱导细胞死亡。 
26.试剂盒，其包含： 
(i)段落1至12中所要求保护的生物抑制剂或段落24或25中所要求保护的药物组合物； 
(ii)用于施用所述生物抑制剂或药物组合物的装置；以及 
(iii)使用说明书。 
27.基本如本文实施例和附图所述的生物抑制剂。 
28.基本如本文实施例和附图所述的生物抑制剂的用途。 
29.基本如本文实施例和附图所述的使用生物抑制剂的方法。 
30.基本如本文实施例和附图所述的药物组合物。 
31.基本如本文实施例和附图所述的试剂盒。 
实施例 
下述实施例体现了本发明的多个方面。应理解，实施例中所使用的特定抗体和/或抗原用于描述本发明的原理，并非旨在限制其范围。 
以下参考附图对实施例进行描述： 
图1-ROR1基因和Ror1蛋白的示意图。 
人ROR-1基因具有2814bp的编码区，预计序列为937个氨基酸，蛋白质大小为105kDa，包含Ig样结构域、富含半胱氨酸的结构域、三环结构域、酪氨酸激酶结构域以及富含脯氨酸的结构域。 
图中标记了N-Ror1-Ig(RSTIYGSRLRIRNLDTTDTGYFQ)、N-Ror1-CRD(YMESLHMQGEIENQI)、N-Ror1-KNG(CQPWNSQYPHTHTFTALRFP)、C-Ror1-17、C-Ror1-904(NKSQKPYKIDSKQAS)(Y)的抗体识别位点的位置以及下述蛋白结构域：免疫球蛋白样结构域(Ig)、富含半胱氨酸的结构域(CRD)、三环结构域(Kr)、跨膜结构域(TM)、酪氨酸激酶结构域(TK)、富含丝氨酸和苏氨酸的结构域(S/T)以及富含脯氨酸的结构域(P)。 
图2-标记B-CLL中过表达的基因的部分的人染色体1图谱。 
图3-CLL细胞与对照供体中的ROR1基因表达(RT-PCR)。 
阳性对照=克隆至pGEM-T easy载体中的PCR产物。 
阴性对照=无模板的反应混合物。 
图4-ROR1基因表达：需要PMA/离子霉素(ionomycin)诱导在正常淋巴细胞中表达。 
在培养48小时后，在活化(PMA/离子霉素)的正常B淋巴细胞和T淋巴细胞、扁桃体B细胞和白血病CLL细胞中的Ror1表达的代表实例。通过定量实时PCR测定所述表达。倍数增加为相对于零时观察到的水平。组成型表达Ror1 mRNA的CLL细胞和扁桃体B细胞不能进一步活化，而强活化信号诱导正常B细胞和T细胞中的Ror1基因表达。 
*=组成型表达ROR1且不能被进一步活化的CLL细胞和扁桃体B细胞。 
图5-CLL细胞和健康对照中的Ror1蛋白表达(蛋白质印迹)。 
所有三种抗体均显示了105kD的条带。C-Ror-1-904还检测到了估计的Ror-1的130kDA变体。剥离印迹，并使用β-肌动蛋白抗体染色，以显示所上样的样品。 
图6-在两名CLL患者和健康供体中与CD19相比Ror1的细胞表面染色强度。 
该图显示了进行性和非进行性CLL患者的白血病细胞和以及健康供体的PBMC的Ror1(M-Ror-1com)和CD19的细胞表面染色。 
图7-多克隆抗体的特异性对照。 
上图：使用可商购获得的抗Ror-1多克隆抗体(N-Ror-1com)的蛋白质印迹分析。两种抗体均与相同的37kDA条带反应。在大肠杆菌中表达Ror-1蛋白 的重组细胞外部分，并将上清浓缩30倍。 
下图：使用系列稀释的代表胞质区的可商购获得的重组Ror-1蛋白并使用本发明人的兔多克隆抗体c-Ror-1-904检测的蛋白质印迹。[Ror-c-1-904抗体不与Ror-1蛋白的重组细胞外部分反应(数据未显示)]。 
图8-活化的正常B细胞中的Ror1蛋白未被磷酸化。 
正常B细胞的PMA/离子霉素活化诱导未被磷酸化的Ror-1蛋白的表达。图A=使用PMA/离子霉素活化并使用抗Ror1单克隆抗体检测的经纯化的正常外周B细胞的细胞裂解物的免疫印迹。 
图B=经纯化的正常血液B细胞的免疫沉淀(使用抗Ror1单克隆抗体)，其中所述B细胞使用PMA/离子霉素活化，不使用(-)或使用(+)过钒酸盐(阳性对照，用以诱导磷酸化)处理，使用PY99单克隆抗体染色，并使用N-ROr1再检测。 
PMA/离子霉素活化的B细胞未显示任何自磷酸化。 
图9-Ror1蛋白在CLL细胞中被组成型地磷酸化。 
CLL患者的代表性试验。使用磷酸酪氨酸单克隆抗体(PY99)对蛋白磷酸化进行的免疫印迹。使用抗Ror1单克隆抗体使细胞裂解物进行免疫沉淀。使用PY99抗体检测磷酸化，随后剥离并使用N-Ror1多克隆抗体再检测。 
图10-抗Ror1单克隆抗体诱导CLL细胞凋亡(膜联蛋白(Annexin)-V/PI)(1号CLL患者)。 
针对Ror-1受体的外部结构域的抗Ror-1单克隆抗体诱导CLL细胞凋亡。患者之间的细胞凋亡模式不同。 
CRD=富含半胱氨酸的结构域，KNG=三环结构域，Ig=免疫球蛋白结构域。 
图11-抗Ror-1单克隆抗体诱导CLL细胞凋亡(膜联蛋白-V/PI)(2号CLL患者)。 
针对Ror-1受体的外部结构域的抗Ror-1单克隆抗体诱导CLL细胞凋亡。患者之间的细胞凋亡模式不同。 
CRD=富含半胱氨酸的结构域，KNG=三环结构域，Ig=免疫球蛋白结构域。 
图12-抗Ror1 IgG抗体在CLL细胞的ADCC中诱导细胞毒性。 
使用抗Ror1单克隆抗体和EHEB CLL细胞系作为靶标，正常健康供体PBMC作为效应细胞的ADCC(18小时)。 
使用抗Ror1单克隆抗体和CLL细胞作为靶标，同基因NK细胞作为效应细胞的ADCC(18小时)。使用来自三名不同患者的结果。 
图13-抗Ror1 IgG抗体诱导源自肺癌的肿瘤细胞系(A549)和前列腺癌的肿瘤细胞系(DU145)的细胞死亡。 
与对照抗体相比，使用KNG抗体和交联抗体处理A549肺癌细胞系和DU145前列腺癌细胞系诱导显著的细胞死亡。 
图14-使用抗Ror-1IgG抗体的体内处理耗尽了移植至SCID小鼠中的原代CLL细胞。 
将来自严重受影响的CLL患者的PBMC移植至SCID小鼠中。使用抗ROR单克隆抗体的处理完全耗尽了来自小鼠腹腔(peritoneum)的人细胞。 
图15-通过RT-PCR测定的CLL中Ror-1 mRNA的siRNA下调。 
根据实时定量PCR测定，siRNA介导CLL细胞中Ror-1 mRNA的下调。 
图16-Ror-1的siRNA沉默诱导CLL细胞凋亡。 
siRNA介导的Ror-1沉默导致CLL细胞的特异性凋亡。三种不同患者的结果(使用三种不同的siRNA构建体)。 
图17-抗Ror1 Ig24(克隆2A4)抗体的VL和VH序列。 
图18-抗Ror1 CRD16(克隆1C11)抗体的VL和VH序列。 
图19-抗Ror1 KNG20(克隆4C10)抗体的VL和VH序列。 
图20-健康供体的PBMC细胞表面染色。 
使用六种抗ROR1抗体2A4、1C11、4A7、3B8、1D8以及4C10进行。 
图21-CLL淋巴细胞的细胞表面染色。 
使用六种抗ROR1抗体2A4、1C11、4A7、3B8、1D8以及4C10进行。 
图22-对CLL患者和健康供体的用抗ROR1抗体的细胞染色频率进行比较。 
图23-对进行性和非进行性CLL疾病的用抗ROR1抗体的细胞染色频率进行比较。 
图24-抗Ror1单克隆抗体诱导CLL细胞凋亡(膜联蛋白-V/PI)。 
六种抗ROR1抗体2A4、1C11、4A7、3B8、1D8以及4C10的比较。 
图25-CLL细胞中的PARP裂解。 
凝胶显示了与利妥昔单抗(rituximab)、鼠抗体和无抗体对照相比响应抗ROR1抗体的裂解的PARP。 
实施例1-Ror1特异性抗体的产生 
抗Ror1抗体的产生 
针对表1所描述的四种合成肽生成小鼠单克隆抗体。免疫级肽购自Thermo Electron Corporation(GmbH,Ulm,Germany)。根据经较小修饰的标准方案，使用结合有钥孔血蓝蛋白(KLH)的肽产生小鼠单克隆抗体(mAb)(Kohler and Milstein C,(1975)Nature 256pp495-7)。 
使用无关肽和蛋白以及转染有Ror1基因的COS-7细胞系通过ELISA测定法测定所产生的单克隆抗体的特异性。 
表1.用于产生单克隆抗体的Ror1肽 
免疫原性肽的制备 
通过将1mg肽与5mg KLH混合在1.03ml去离子水中而制备肽和KLH(Sigma)，之后，将400μl PBS添加至所述KLH和肽溶液中。混合2分钟后，添加1.2μl的25%戊二醛。在室温下振荡混合物1小时。将结合肽储存在-20°C备用。进行相同的操作以使肽与BSA结合。 
为了检查结合的效率，将肽-KLH和肽-BSA各10μl与5μl样品缓冲液混合，煮沸2-5分钟，并在冰上冷却。使用10%SDS-PAGE凝胶、mini-PROTEAN电泳仪器(Bio-Rad)于100mA电泳1小时。使用考马斯亮蓝R-250(Sigma)对凝胶进行染色。结合和不结合KLH和BSA的泳动变化表现了结合效率。 
免疫方案 
针对每种肽的免疫接种，使用4只BALB/c小鼠。每只小鼠均间隔两周免疫接种5次。第一次免疫接种通过腹腔内(intra peritoneal)注射体积不超过100μl量且比例为1:1的100μg肽结合物与完全弗氏佐剂的混合物而进行。将50μg肽-KLH与不完全弗氏佐剂混合，用于接下来的免疫接种。 
在最后一次免疫接种前一周，通过尾部纵向切口收集血液。制备血清，并使用ELISA检测特异性抗体。在细胞融合前三天，静脉内注射无任何佐剂的20μg KLH-肽。 
血清ELISA 
使用含20μg/ml免疫接种肽的PBS包被各孔。将ELISA板在37℃温育1小时，之后在4℃下过夜温育。次日，使用PBS/Tween缓冲液洗涤板3次，每次5分钟，使用2.5%BSA在37℃封闭1.5小时，之后再次使用PBS/吐温缓冲液洗涤3次。 
使用PBS系列稀释(1:100、1:250、1:500、1:1000、1:2000)血清。将100μl总体积添加至各孔，并在37℃下温育1.5小时，之后洗板。将100μl以1:1000稀释的结合有HRP的兔抗小鼠Ig用作二抗。洗涤之后，向各孔添加100μl四甲基联苯胺(TMB)底物，并在暗处于室温下温育板。15分钟后，通过向各孔添加30μl终止溶液(0.16M硫酸)终止反应。使用ELISA读板仪检测在450nm处的光密度(OD)。具有充分抗体应答的小鼠准备用于融合和产生杂交瘤。 
杂交瘤的产生 
使用小鼠骨髓瘤SP2/0细胞系产生杂交瘤。将细胞培养于含有10%FBS的RPMI(GIBCO)中，直至达到>70%汇合。 
细胞融合前一天，通过5ml RPMI腹腔灌洗(peritoneal lavage)分离鼠BALB/C的腹腔(peritoneal)巨噬细胞。使用RPMI洗涤所分离的腹腔液体两次。将细胞在含有20%FBS的RPMI中于37℃、5%CO2下温育24-48小时。在无菌条件下去除经免疫接种的小鼠的脾脏。为了获得单细胞悬液，从不同角度将10ml的RPMI注射至脾脏。使用RPMI洗涤所收集的细胞10分钟，并在1000rpm下离心。 
选择50ml无菌Falcon管，将SP2/0细胞与脾细胞以1:10的比例(1个SP2/0和10个脾脏细胞)混合。在RPMI中洗涤混合物两次。在混合的同时，将800μl预温的(37℃)50%PEG 1500(Sigma)缓慢添加至细胞沉淀中。在添加PEG紧后，添加20ml预温的RPMI。在500rpm下洗涤细胞两次。将选择性HAT培养基添加至沉淀(2x106个细胞/ml)，并将细胞接种至96孔板中。在37℃、5%CO2下温育细胞，每天检查细胞生长和集落形成。5-10天后出现集落。一旦集落直径达到1mm，通过ELISA检查针对免疫接种肽的抗体的存在。在温育两周后，每孔收集100μl的上清，并使用仅肽、KLH-肽、BSA-肽以及仅KLH作为包被抗原进行ELISA测定。 
抗体纯化 
通过亲和层析基于单克隆抗体的同种型来对其进行纯化。对于IgG亚类，使用Hi-Trap蛋白G柱(Pharmacia Biotech)。简言之，在含有10%FBS的RPMI中培养杂交瘤，每36小时收集一次上清。无菌过滤(45nm)上清，并在上样至蛋白G柱上之前通过添加10xPBS缓冲将pH调节至7.5。 
使用pH2.7的0.1mol/l甘氨酸进行洗脱。使用pH9.0的1mol/l Tris缓冲液将所洗脱的抗体的pH调节至7.0。使用pH7.5的PBS对所洗脱的抗体进行透析。除了亲和柱为Sepharose 4B-兔抗小鼠IgM以外，纯化IgM抗体的方法与纯化IgG抗体的方法相同。 
所产生的三种单克隆抗体的序列见图17-19。抗Ror1 Ig24(克隆2A4)抗体的VL和VH序列见图17。抗Ror1 CRD16(克隆1C11)抗体的VL和VH序列见图19。抗Ror1 KNG20(克隆4C10)抗体的VL和VH序列见图19。 
实施例2-细胞的分离 
患者 
采用世界卫生组织(WHO)对于造血和淋巴组织肿瘤的分类(Harris NL et al.,Histopathology 2000;36:69-86)。CLL(n=100)的诊断基于免疫表型分型(CD5+/CD19+/CD23+/IgM+)和外周血中存在>5.0x109/l淋巴细胞。 
根据以下认为患有CLL的患者患有进行性疾病：NCI委员会国家癌症研究中心的修改标准-受资助的工作组的慢性淋巴细胞白血病指南：修改的诊 断和治疗指南，Cheson B et al,Blood 87,4990-4997,1996，如果在前3个月发生疾病相关性贫血(血红蛋白<10.0g/dl)、血小板减少(<100x109/l)和/或脾/肝/淋巴结大小增加和/或血淋巴细胞计数增加2倍。当不符合这些标准时，则认为患者患有非进行性疾病。 
从患有CLL的患者收集肝素化或含柠檬酸盐化的外周血或骨髓，还从正常健康供体抽取血液(n=10)。所有样品均在知情同意下并经当地伦理委员会批准而收集。 
血单核细胞、粒细胞、B淋巴细胞和T淋巴细胞的分离 
如先前文献中的描述(Rezvany MR et al.,Br J Haematol2000;111:608-17)，使用Ficoll-Hypaque(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)密度梯度离心分离外周血单核细胞(PBMC)和骨髓单核细胞(BMMC)。 
从Ficoll-Hypaque密度梯度离心后的红细胞层顶部收集粒细胞。通过在冷水中低渗，裂解红细胞。根据免疫细胞学估计，超过98%的有核细胞为粒细胞(数据未显示)。 
切除扁桃体组织，并使其通过金属网，通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心制备扁桃体单核细胞的悬液(Rezvany MR et al.,Br J Haematol2000;111:608-17)。 
使用MACS珠(Miltenyi Biotec GmbH,Bergisch Gladbach,Germany)根据制造商的说明书通过阴性选择从PBMC纯化T淋巴细胞和B淋巴细胞。 
还使用尼龙羊毛纯化法富集白血病B细胞和扁桃体单核细胞(Rezvany MR et al.,Br J Haematol 2000;111:608-17)。使用针对CD3、CD19以及CD14(BD Biosciences,San Jose,CA,USA)的结合单克隆抗体(MAb)的直接免疫荧光和流式细胞术(FACSCalibur BD Biosciences)分析所分离的单核细胞的纯度。 
结果 
所有CLL患者的PBMC(n=100)和BMMC(n=2)均在mRNA水平上表达ROR1。ROR1还在正常扁桃体B细胞(2/2)中微弱表达，但不在健康供体 PBMC(0/10)、分离的正常B细胞(0/6)和T细胞(0/3)或富集的血粒细胞(0/10)中表达(表2)。 
表2.CLL患者和健康对照供体中的ROR1基因表达(RT-PCR) 
*纯度>90% 
**纯度>98% 
PBMC=外周血单核细胞，BMMC=骨髓单核细胞 
实施例3-RT-PCR扩增 
ROR1的RT-PCR和RT-QPCR扩增 
使用ROR1特异性引物(表3)进行RT-PCR扩增。扩增模式包括使用Ampli Taq Gold DNA聚合酶(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)在95℃下变性5分钟，94℃、60℃、72℃各30秒，35个循环。 
如早期文献(Mikaelsson E et al.,Blood 2005;105:4828-35)中所述进行实时定量PCR(RT-QPCR)。扩增模式包括使用Ampli Taq Gold DNA聚合酶(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)95℃下变性5分钟，94℃、60℃、72℃各30秒，35个循环。其他细节见Mikaelsson et al,Blood 105,4828,2005。 
表3.用于ROR1 PCR扩增和定量的引物和探针 
S=正义，AS=反义，Q=蓝-6-FAM,9=TAMRA,P1-P8=图1中的引物编号，g.b.=基因库 
结果 
健康供体和CLL患者的代表性RT-PCR试验示于图3。 
实施例4-测序 
克隆免疫球蛋白V(D)J重排和ROR1的测序 
使用来自PBMC的cDNA，并使用共有的VH家族引物作为正义引物和恒定的μ链引物作为反义引物，通过PCR进行免疫球蛋白V(D)J重排的扩增。先前文献已详细描述了该方法(Kokhaei P et al.,Exp Hematol 2007;35:297-304;Willems P,et al.,Belgium-Dutch Hematology-Oncology Group.Blood2000;96:63-70)。扩增包括使用Ampli Taq Gold DNA聚合酶在95℃下变性5分钟，94℃30秒、60℃30秒、72℃30秒，40个循环。使用CH基因家族特异性引物(见Kokhaei et al,Exp Hematol 2007,35,297)。 
通过RT-PCR单独扩增ROR1基因的细胞外结构域和细胞内结构域。扩增模式包括使用CLL患者的cDNA利用Ampli Taq Gold DNA聚合酶(Mikaelsson et al,Blood 2005,105,4828)在95℃下变性5分钟，94℃、60℃、72℃各30秒，35个循环。将PCR产物克隆至pGEM-T easy载体(Promega,Madison,WI,USA)并测序。对于细胞外结构域，正义引物：ATGAATAACATCACCACGTCTCTGGGCC；反义引物：CTCCTTGGAATCCTTTGAATCGCA。对于细胞内结构域，正义引物：TTCTTCATTTGCGTCTGTCG；反义引物：CTGGCTCGGGAACATGTAAT。通过目测将序列与ROR1基因(Ensembl ID;ENSG00000185483)进行比较。 
ROR1基因的测序 
如上所述，分离CLL患者的PBMC，制备总RNA并合成cDNA。ROR1特异性引物经设计而扩增截短的t-Ror1(引物P9和P10)，包括Ig、CRD以及三环结构域的细胞外结构域(引物P5和P6)，以及激酶结构域(引物P7和P8)。将PCR 产物克隆至pGEM-T easy载体(Promega)，并使用T7、Sp6以及基因特异性引物进行测序(表3)。 
结果 
在10名CLL患者中对所克隆的ROR1基因的细胞外激酶结构域和胞质激酶结构域进行突变分析，结果显示无较大的基因组畸变。仅见到非常少的点突变(沉默突变)(数据未显示)。使用引物P9和P10检测截短ROR1(t-Ror1)的PCR扩增未产生任何扩增物(数据未显示)。对于截短Ror的序列，正义引物：CCAAAGGACCTTCTGCAGTGGAA，反义引物：TCTCATTCCAGCACTCTGTCATGAGG。 
实施例5-ROR1的表达 
健康供体的B淋巴细胞和T淋巴细胞的活化以及B-CLL细胞 
将CLL细胞、分离的正常T细胞和B细胞以及扁桃体B细胞(4x106个细胞/孔)在含2ml补充有10%人AB血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和2mML-谷氨酰胺的DMEM培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)的6孔培养板中于37℃、具有5%CO2的潮湿空气中培养48小时，并使用25ng/ml PMA+1ug/ml离子霉素(Sigma,St.Louis,MO,USA)刺激。 
在培养48小时后，收获细胞，分离RNA，并制备cDNA。使用上文所述引物和条件通过实时定量PCR(RT-QPCR)分析ROR1的表达。β-肌动蛋白表达用作内源性对照以对ROR1表达进行定量。 
抗Ror1抗体的产生和特异性检测 
针对来自人Ror1的第904-918氨基酸NKSQKPYKIDSKQAS的合成肽制备兔抗人Ror1多克隆抗体(命名为C-Ror1-904抗体)。 
根据Hay H(J Clin Lab Immunol 1989;29:151-5)的改良方法制备多克隆抗体。使用125μg于完全弗氏佐剂中乳化的KLH-肽(Sigma.St.Louis,MO,USA)肌肉内(intramuscularly)注射小于6月龄的兔。在注射前收集血清样品，用于之后的滴定。间隔2周给予加强注射(每次125μg，乳化于不完全佐剂中)。在第4次注射后，在ELISA中检测血清中是否存在抗所述肽的抗体。使用另 外两次免疫接种对具有最高抗体滴度的兔进行加强免疫。使用结合有肽的活化的Sepharose 4B柱(Pharmacia,Uppsala,Sweden)对血清进行亲和纯化。将洗脱的抗体利用PBS(0.15M.pH7.2)透析，并储存在-20℃直至使用。 
免疫级肽购自Thermo Electron公司(GmBH,Ulm,Germany)。结合有钥孔血蓝蛋白(KLH)的肽用于产生多克隆抗体。通过亲和纯化对所述多克隆抗体进行纯化。 
使用代表Ror1的细胞内区的分子量为约70kD的重组蛋白(Carna Biosciences,Inc.,Chuo-ku,Kobe,Japan)用于C-Ror1-904多克隆抗体的特异性对照。 
简言之，使用人全长cDNA克隆EN1031_D08Ror1基因(Origene Technologies,Inc.,Rockville,Maryland,USA)作为模板对所述区进行PCR扩增。将PCR产物克隆至pGEM-T easy载体，亚克隆至pcDNA3.1+载体(Invitrogen)并转化至大肠杆菌菌株Origami(Invitrogen)中。通过DNA测序证明了插入物的完整性。 
在筛选框架内克隆之后，收集24小时培养细菌的上清，并使用Amicon Ultra-15离心过滤单元(分离>10kDa的多肽)(Millipore Corporation,Bedford,MA,USA)浓缩30倍。使浓缩的重组蛋白进行蛋白质印迹，并使用抗Ror1抗体(山羊抗Ror1多克隆抗体(N-Ror1com)(R&D systems,Inc.,Minneapolis,MN,USA))检测，以测定特异反应性。 
蛋白质印迹 
在蛋白质印迹中使用山羊抗Ror1多克隆抗体(N-Ror1com)(R&D systems)以及本实验室制备的抗体(C-Ror1-904)。 
在含有1%Triton X-100、50mM Tris-HCl(pH7.4)、150mM NaCl、5mMEDTA和1%蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)的缓冲液中裂解细胞。根据制造商的说明书通过Thermo Scientific BCA蛋白测试试剂盒(Thermo Scientific,Rockford,IL,USA)检测蛋白浓度。在10%Bis-Tris SDS-PAGE凝胶(Invitrogen)上于120V、还原条件下对50μg细胞裂解物电泳3小时。 
电泳后，在小型转印槽(Invitrogen)中将分离的蛋白转移至Immobilon-PVDF膜(Millipore Corporation)上。在室温下使用加有0.05%吐温 20、5%脱脂奶粉的PBS(PBS-T)封闭所述膜。所有免疫染色均在补充有5%脱脂奶粉的PBS-T中进行。使用抗Ror1抗体的合适稀释液在4℃过夜温育滤膜。 
使用PBS-T充分洗涤后，在室温下将滤膜与结合有过氧化物酶的山羊抗兔免疫球蛋白(DakoCytomation,Glostrup,Denmark)一起温育1.5小时，之后洗涤并使用ECL化学发光检测检测系统(GE Healthcare)显影。 
表面染色和流式细胞术 
通过流式细胞术(FACSCalibur BD Biosciences)，使用N-Ror1com(一抗)、结合有PE的抗-CD3抗体(BD Biosciences,San Jose,CA,USA)、结合有PE-Cy5的抗-CD19抗体(e-Bioscience,San Diego,CA,USA)、结合有FITC的抗-CD19抗体(BioLegend,San Diego,CA,USA)、结合有FITC的猪抗山羊IgG抗体(二抗)(Southern biotech,Birmingham,AL,USA)和小鼠血清(封闭血清)(DakoCytomation)分析细胞。 
如文献所述(Rezvany MR et al.,Br J Haematol 2001;115:263-71)，进行CLL细胞和正常PBMC的表面染色。简言之，用PBS洗涤2x106个细胞，并使用无血清RPMI(Invitrogen)在37℃预温育1小时，之后使用RPMI洗涤三次。添加1μg抗-Ror1抗体(N-Ror1com)(R&D systems)并在+4℃下温育30分钟。 
使用FACS缓冲液(PBS,0.1%叠氮化钠和0.5%FBS)洗涤细胞两次。添加FITC猪抗山羊IgG(1:100)(Southern biotech)并在+4℃下再温育30分钟。通过添加10μl 10%小鼠血清进行封闭，之后在+4℃下温育20分钟。然后将CD3和CD19抗体添加至细胞并在+4℃温育30分钟。最后使用FACS缓冲液洗涤细胞，并用添加1%多聚甲醛的PBS固定。 
使用CellQuest软件程序(BD Biosciences)测定CD19群中Ror1+细胞的百分数。 
结果 
抗体的特异性对照 
与可商购获得的多克隆抗体相比，亲和纯化的抗体表明亲和纯化的抗体特异性识别Ror1(图7)。 
活化细胞中的ROR1表达 
之后，分析ROR1是否可能在体外活化之后被诱导。使用PMA/离子霉素培养CLL细胞、正常B淋巴细胞和T淋巴细胞48小时，以提供强活化信号。组成型表达Ror1 mRNA的CLL细胞和正常扁桃体B细胞不能被进一步活化。 
相比之下，在体外活化的正常B细胞和T细胞中观察到ROR1 mRNA表达提高15-25倍。代表性试验示于图4。活化的正常B细胞还在蛋白水平表达Ror1(蛋白质印迹)(图8)。 
Ror1蛋白表达 
分析CLL(n=18)中Ror1蛋白的表达。细胞裂解物的蛋白质印迹分析证明，所有CLL样品中均存在两个Ror1特异条带，估计分别为105kDa和130kDa大小(图5)。 
可商购获得的抗体(N-Ror1com)显示没有检测到估测的130kDa的Ror1变体。 
进行性和非进行性CLL患者中Ror1的表面表达示于图6、20、21、22和23以及表4中。 
所述图显示了抗-ROR1抗体优选结合来自CLL患者的细胞而不与来自健康患者的细胞结合。所有抗体均能够结合CLL细胞，但特异于CRD的抗体显示具有特殊的用途。与非进行性疾病患者相比，患有进行性疾病的患者中对于Ror1的细胞表面染色显著较强，与具有突变IgVH基因的患者相比，IgVH基因未突变的患者中对于Ror1的细胞表面染色也显著较强。 
表4.与IgVH突变状态和临床期相关的CLL患者(n=18)中ROR1的蛋白表达 
M=突变，UM=未突变，MFI=平均荧光密度 
表达Ror1的CD19+CLL细胞的频率不同(71±5%)(平均值±SEM)(范围：36-92%)。在进行性和非进行患者之间或在IgVH突变例和未突变例之间无差异(表3)。平均荧光强度(MFI)在10和45之间变化，平均MFI值为20。进行性患者和非进行患者之间无统计学差异。CD19的相应平均MFI为26(范围为9-48)。健康供体(n=10)的正常B细胞(CD19+)为Ror1阴性(<0.1%)。 
实施例6-SiRNA 
siRNA 
使用专有算法和制造商网站上可获得的软件(Dharmacon,Inc.Lafayette,CO)将本研究中使用的siRNA设计成靶向Ror-1基因。设计了靶标向Ror-1开放阅读框的不同区域的三条siRNA。 
表5.靶标基因ROR1 
三条siRNA独立或组合(集合)使用。将来自大量CLL患者的PBMC以每孔100,000个细胞的密度铺于含Opti-MEM ITM低血清培养基的48孔微孔板中。以0.15μL/孔的终浓度使用 转染试剂(Mirus Bio Corporation,Madison,WI,USA)用SMARTpool siRNA试剂(100nM终浓度)转染细胞。 
未处理细胞和使用siCONTROL非靶向siRNA库(Dharmacon)转染的细胞用作阴性对照。使用siGLO RISC-FreeTM siRNA(Dharmacon)(一种经化学修饰以阻止RISC复合物摄取的荧光标记非靶标向siRNA)在试验前确定转染效率。转染细胞4小时，然后将其转移至表达结合膜的hCD40L的NIH-3T3成纤维细胞的单层培养物。细胞在RPMI+10%胎牛血清中再培养24-48小时。 
使用Ror-1特异性引物，通过标准RT-PCR检测基因沉默，或通过q-PCR对其进行定量(使用上文所述参数)。管家基因β-肌动蛋白和/或RPLP0用于标准化。将使用非靶标向siRNA对照转染的细胞中的基因表达认为是100%，相对于对照计算Ror-1 siRNA处理的细胞中的基因表达。 
在培养24或48小时后收集siRNA或对照转染的细胞并检测细胞凋亡。使用FITC标记的膜联蛋白-V和碘化丙啶(PI)对细胞进行染色，并通过流式细胞术进行分析。认为膜联蛋白-V或PI阳性或双阳性细胞为凋亡。 
结果 
CLL细胞的siRNA处理诱导了非常显著的Ror1基因下调(沉默)(图15)和在65-70%之间变化的肿瘤细胞凋亡(图16)。 
实施例7-细胞毒性试验 
使用Ror1单克隆抗体的细胞毒性测定 
解冻冷冻的CLL细胞并进行Ficoll分离，以获得活细胞。在该测定中使用Ror CRD(IgM)、Ror KNG(IgG1)以及Ror Ig24(IgM)单克隆抗体。使用10μg/ml抗体，将其稀释于AIM-V培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)(补充有L-谷氨酰胺、硫酸链霉素以及硫酸庆大霉素)并添加至24孔板中。 
向各孔中添加1x106个CLL细胞。使用流式细胞术在37℃温育18和36小时后用BD膜联蛋白-V/PI细胞凋亡测定试剂盒(B-D)分析细胞。使用冷PBS洗涤细胞两次，并以1x106个细胞/ml的浓度将其重悬于结合缓冲液中。将100μl细胞悬液(1x105个细胞)转移至5ml FACS管中。分别添加5μl的膜联蛋白V-FITC和PI。在黑暗中于室温(25℃)下温育细胞15分钟。向各管中添加400μl的结合缓冲液，通过流式细胞术分析细胞。 
抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)标准微细胞毒性测定 
沉淀2x106个靶标细胞(CLL系EHEB)，并以每106个细胞100μl 10mCi/ml的51Cr进行重悬。在37℃下温育细胞1小时。使用AIM-V培养基洗涤细胞三次，并将其重悬于AIM-V培养基(2.5x105/ml)，将20μl(50x103)的细胞悬液添加至96孔V形底微滴定板(Nunc,Cole-Parmer Instrument,Illinois,USA)中。 
以0.1ml的体积添加不同数量的效应细胞(健康供体的PBMC)，以实现所需的25:1、12.5:1以及6.25:1的效应细胞/靶标细胞(E/T)比例。 
添加抗体KNG(小鼠IgG1)，浓度为10μg/ml。将抗体稀释于AIM-V培养基中，并以0.1ml的体积进行添加，以实现每孔中200μl的终体积。 
对于自然的51Cr-释放对照，仅添加0.2ml的AIM-V培养基至靶细胞。通过添加0.2ml的1%NP-40测定最大释放。在37℃下温育4、18以及36小时后，以200xg离心培养板5分钟，移取0.1ml的上清用于在伽马计数仪中进行计数。 
结果 
针对所述外部受体的不同结构域的抗体单独在ADCC中诱导细胞死亡。单独抗体的细胞毒性在15-50%之间变化，并且在ADCC中，在最高的效应细胞与靶标细胞比例观察到一些较强的杀伤(图10、11、12、24以及25)。 
实施例8-抗Ror-1 mAb对来自实体瘤的癌细胞系的体外作用 
前列腺癌细胞系DU145和肺癌细胞系A459已经在先前被检测为Ror1表达阳性。因此，可以检测使用抗Ror1 MAb对这些细胞系的处理是否可诱导与原代CLL细胞相似的细胞死亡。 
在含有10%FCS(Invitrogen)的DMEM(Invitrogen)中对细胞系进行传代。试验前，收集细胞并以7000个细胞/孔的密度与2μg/ml或20μg/ml的抗-Ror1抗体KNG、20μg/ml的对照抗体、仅培养基或作为阳性对照的3倍浓缩的细胞生长抑制剂紫杉醇(Paclitaxel)(5,0.5,0.05mg/ml)一起再接种。另外，如所示以5摩尔过量添加交联抗体。在37℃、5%CO2下于潮湿气氛中温育细胞48小时。为了测定存活率，根据制造商的说明书使用ATP含量定量试剂盒 Luminescent Cell Viability Assay,Promega)，该试剂盒反映了具有代谢活性的细胞数量并由此反映活细胞的数量。 
结果 
交联的KNG抗体在A549和DU145细胞系中诱导细胞死亡，图13(A和B)。结果显示Ror1是许多种癌类型治疗的潜在靶标。 
实施例9-抗Ror-1mAb的体内效应 
使用Ficoll Hypaque技术从严重受影响的CLL患者的外周血分离PBMC。对于细胞进行CD19-PE和CD5-APC(BD)染色以对CLL细胞进行计数，观察到CLL细胞为PBMC的80%左右。相比之下，仅1.5%为T细胞。另外，对细胞进行Ror-1表达的染色(结合有FITC的1A8抗体)，发现Ror-1表达也存在于ca 80%的细胞上。之后，将150x106个细胞腹腔内(intraperitoneally)和静脉内注射至C.B.17.SCID小鼠中。在转移后第1、3以及6天，使用两种不同的抗-Ror mAb 1A8和KNG或无关的阴性对照mAb以10mg/kg通过腹腔内注射处理小鼠。 
在第7天处死小鼠，并使用8ml PBS腹腔内灌洗而收集腹腔内细胞。对于从腹腔回收的细胞进行抗人CD45-FITC(BD)抗体染色。 
结果 
两种抗-ROR1 mAb均完全耗尽了来自经注射小鼠的腹腔的CLL细胞(图14)。这与对照MAb所观察到的结果鲜明对比，显示使用抗-Ror1抗体的处理特异性地耗尽了异种移植体内模型中的原代人CLL细胞。 
实施例10-ROR1磷酸化 
分离PBMC和B细胞，并在10ml RPMI-1640中于冰上保持10分钟。如先前文献(Lu Y et al:J Biol Chem 2003;278:40057)所述，进行过钒酸盐(Sigma)刺激。简言之，制备2ml的1mM新鲜过钒酸盐溶液(1μl H2O2+99μlpH7.4的20mM HEPES,20μl钒酸盐和1880μl dH2O)，之后添加至细胞。将2ml过钒酸盐溶液添加至含有所述细胞的10ml RPMI-1640培养基中。将细胞于冰上温育1小时。 
然后将细胞在1500rpm、4°C离心5分钟并在1ml冰冷的PBS中洗涤1次。将1ml含有20mM Tris(pH7.5)、0.5%Triton X-100、0.15M NaCl、0.5%脱氧胆酸以及10mM EDTA的裂解缓冲液添加至细胞沉淀。在使用前还向裂解缓冲液中蛋白酶抑制剂[1%抑肽酶(Trasylol)、1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)]和100μM钒酸盐(Sigma)，并在冰上温育10分钟。在使用于裂解缓冲液中之前，将钒酸盐在95℃下加热5分钟。将细胞裂解物转移至1.5ml Eppendorf管中，并在4℃以最大速度离心10分钟。将上清转移至新管。通过加入2-5μgMabF3C6抗体至上清中并在4℃于旋转下温育1小时。 
将等体积的蛋白G Sepharose(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)和细胞裂解物(40:40μl)进行混合，并在4℃下旋转温育过夜。使用1ml裂解缓冲液洗涤蛋白G Sepharose微珠三次。将15μl还原上样缓冲液添加至微珠，并根据制造商的说明书使用PY99抗磷酸酪氨酸抗体(Santa Cruz Biotechnology,CA,USA)进行蛋白质印迹。使用N-Ror1抗体对磷酸化蛋白进行再检测。 
在siRNA试验中使用了添加至转染有CD40L的成纤维细胞单层的白血病细胞。这是保持CLL细胞存活的常规途径。还使用了正常B细胞的CD40L刺激，这不诱导正常B细胞中的Ror1表达。 
结果 
正常B细胞不表达Ror1，但强的非生理信号(PMA离子霉素)诱导Ror1表达(图8)。然而，生理刺激(CD40L)显示不诱导正常B细胞中的Ror1表达，也不改变CLL细胞中的Ror1表达。 
CLL中的Ror1被组成型地磷酸化(图9)，这表明该受体酪氨酸激酶可能不参与CLL的病理生理过程。然而，正常B细胞中诱导的Ror蛋白表达未被磷酸化(图8)。 
实施例11–优选的药物制剂和给药模式和剂量 
本发明的多肽、多核苷酸以及抗体可使用可注射的缓释药物递送系统来递送，其经特别设计以减少注射的频率。此类系统的一个实例是Nutropin Depot，其将重组人生长激素(rhGH)包裹在可生物降解的微球中，一经注射，便在持续长的时间缓慢释放rhGH。 
本发明的多肽、多核苷酸和抗体可通过将药物直接释放至所需部位的手术植入装置给药。例如，Vitrasert将更昔洛韦直接释放至眼中以治疗CMV视网膜炎。该毒性剂至疾病部位的直接应用实现了有效的治疗，而无药物的显著全身副作用。 
电穿孔治疗(EPT)系统也可用于给药。向细胞递送脉冲电场的装置增加了细胞膜对药物的穿透性，导致细胞内药物递送的显著增强。 
还可通过电引入(electroincorporation，EI)递送本发明的多肽、多核苷酸和抗体。当皮肤表面上直径达30微米的小颗粒受到与用于电穿孔中使用的相同或类似的电脉冲时，发生EI。在EI中，这些颗粒被驱动穿过角质层，并进入皮肤的较深层。所述颗粒可负载或包被药物或基因，或能够仅充当在皮肤中产生使药物能够由此进入的孔的“子弹”。 
给药的可选方法是热敏性ReGel注射系统。在低于体温的情况下，ReGel是可注射液体，而在体温情况下，其立即形成凝胶储库，该凝胶储库缓慢溶蚀并溶成已知安全的可生物降解聚合物。活性药物随生物聚合物的溶化而长时间递送。 
本发明的多肽、多核苷酸和抗体可通过“特洛伊肽(Trojan peptide)”引入到细胞中。这是一类被称作“穿膜肽(penetratin)”的多肽，其具有转位性质，并且能够携带亲水化合物跨过质膜。该系统可以引导寡肽靶向细胞质和细胞核，并 且具有非细胞类型特异性和高效性(Derossi et al.(1998),Trends Cell Biol.,8,84-87)。 
优选地，本发明的药物制剂是包含日剂量或单位、日亚剂量或其适合的小部分的活性成分的单位剂型。 
本发明的多肽、多核苷酸和抗体可通过任何胃肠外途径施用，其可以是剂型为药学上可接受的剂型且包含活性成分的药物制剂形式，其中任选地，所述活性成分是无毒的有机酸或无机酸，或有机碱或无机碱，加成盐的形式。根据待治疗的病症和患者，以及给药途径，所述组合物可以以不同剂量给药。 
在对人的治疗中，本发明的多肽、多核苷酸和抗体可以单独给药，但通常与根据预期给药途径和标准制药实践而选择的合适的药物赋形剂、稀释剂或载体混合给药。 
本发明的多肽、多核苷酸和抗体也可以经胃肠外给药，例如经静脉内、动脉内、腹腔内、鞘内、心室内、胸骨内、颅内、肌肉内或皮下给药，或者通过输注技术给药。其最好以无菌水溶液的形式使用，所述无菌水溶液可包含其他物质，例如，足以使所述溶液与血液等渗的盐或葡萄糖。如果必要，所述水溶液应经过适当的缓冲(优选缓冲至pH3-9)。可通过本领域技术人员熟知的标准制药技术容易地在无菌条件下制备适合的胃肠外制剂。 
适合胃肠外施用的制剂包括含水和无水的无菌注射溶液，其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂以及使所述制剂与目标受者血液等渗的溶质；还包括含水和无水的无菌悬液，其可包含助悬剂和增稠剂。所述制剂可以存在于单位剂量或多剂量的容器中，例如密封的安瓿和小瓶中，并且可在冷冻干燥(冻干)的条件下贮存，仅需要在临用前添加无菌液体载体，例如注射用水。即用型注射溶液和悬液可以由此前描述的各种无菌粉末、颗粒和片剂制备。 
通常，对于人，口服或胃肠外施用本发明的多肽、多核苷酸和抗体是优选的途径，其最为便利。 
为了兽医应用，根据通常的兽医实践将本发明的多肽、多核苷酸和抗体以适合的可接受制剂来给药，兽医可确定对具体动物最适合的给药方案和施用途径。 
本发明的药物组合物的制剂可便利地以单位剂型提供，并且可通过药学领域熟悉的方法制备。这样的方法包括将活性成分与构成一种或多种附加成 分的载体缔合的步骤。通常，通过将活性成分与液体载体或细化的固体载体或这二者均匀和紧密地缔合并且如有必要使产品成形而制备所述制剂。 
优选的单位剂量制剂是含活性成分的日剂量或单位、日亚剂量或其适合的小部分的制剂。 
本发明的优选递送系统可包括浸透了本发明的多肽、多核苷酸和抗体的水凝胶，这优选在棉球上进行，所述棉球可插入宫颈并且一旦对雌性生殖系统产生了合适的宫颈成熟或其他所需效应则被取出。 
应理解，除了上文特别提到的组分之外，本发明的制剂还可包含与所述制剂类型相关的本领域常规的其他试剂。 
实施例12-示例性药物制剂 
尽管可以单独施用本发明多肽、多核苷酸和抗体，但优选将其与一种或多种可接受的载体一起作为药物制剂提供。载体必须是“可接受的”，表示其与本发明化合物相容且对受者无害。通常，载体为无菌且无热原质的水或盐水。 
以下实施例例示了其中的活性成分为本发明的多肽、多核苷酸和抗体的本发明的药物组合物。 
实施例12A-注射制剂
活性成分                          0.200 
无菌，无热原质磷酸盐缓冲液(pH7.0) 至10ml 
将活性成分溶解在大部分磷酸盐缓冲液(35-40℃)中，随后补足体积并通过无菌微孔滤器过滤至无菌的10ml琥珀色玻璃瓶中(1类)，并用无菌封闭物(closure)和瓶盖(overseal)密封。 
实施例12B-肌内注射剂
将活性成分溶解在三缩四乙二醇(glycofurol)中。随后加入苯甲醇并溶解，并加水至3ml。随后将混合物通过无菌微孔滤器过滤，并密封在无菌的3ml玻璃瓶(1类)中。 

Claims (10)

1.ROR1生物抑制剂，其能够在表达ROR1的细胞中诱导细胞死亡，其中所述生物抑制剂是抗体，并且其中所述生物抑制剂所结合的细胞外结构域具有选自以下的氨基酸序列：RSTIYGSRLRIRNLDTTDTGYFQ、YMESLHMQGEIENQI和CQPWNSQYPHTHTFTALRFP，并且其中，VH和VL区的序列为图17、18和19中任一图所示的氨基酸序列。 
2.编码权利要求1所述的生物抑制剂的核苷酸序列。 
3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其是图17、18或19所示的任一序列。 
4.包含权利要求2或3所述的核苷酸序列的表达载体。 
5.包含权利要求2或3所述的核苷酸序列或权利要求4所述的表达载体的宿主细胞 。
6.根据权利要求1所述的生物抑制剂在制备治疗选自下述的疾病的药物中的用途：慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤、慢性髓性白血病、多发性骨髓瘤、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、黑素瘤、肺癌、结直肠癌、胶质母细胞瘤、胰腺癌以及肝细胞癌。 
7.根据权利要求6所述的用途，其中，所述疾病是进行性疾病。 
8.根据权利要求6所述的用途，其中，所述疾病是慢性淋巴细胞白血病。 
9.药物组合物，其包含权利要求1所述的生物抑制剂和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。 
10.试剂盒，其包含： 
(i)权利要求1所述的生物抑制剂或权利要求9所述的药物组合物； 
(ii)用于进行所述生物抑制剂或药物组合物给药的装置；以及 
(iii)使用说明书。 
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