JPWO2017038784A1 - Ｒｏｒ１陽性の間葉系幹細胞及びその調製方法、ｒｏｒ１陽性の間葉系幹細胞を含む医薬組成物及びその調製方法、並びにｒｏｒ１陽性の間葉系幹細胞を用いる疾患の予防又は治療方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、各種疾患に対して優れた治療効果を奏する新規の間葉系幹細胞及びその間葉系幹細胞を含んだ新規の医薬組成物、並びにそれらの調製方法を提供することを目的とする。
本発明は、ＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞である。上記ＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞は、ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５及びＣＤ１６６陽性であること、臍帯又は脂肪由来であることが好ましい。

Description

本発明は、ＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞及びその調製方法、ＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞を含む医薬組成物及びその調製方法、並びにＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞を用いる疾患の予防又は治療方法に関する。

近年、生体の細胞又は組織を利用した医薬品の開発や、再生医療の研究が進み、注目されている。このうち、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞は、臓器再生技術又は創薬スクリーニングツールとして研究が加速されている。一方、骨髄、脂肪組織、臍帯等から体性幹細胞（間葉系幹細胞）を分離して利用する細胞療法は、再生医療の中でも、病気等によって損傷を受けた組織を修復するための体性幹細胞の本来の機能を利用するものであるため、より実現性の高いものとして注目され、研究が進められている。体性幹細胞（間葉系幹細胞）は、一般的には、全ての臓器や組織に分化できるわけでなく特定の組織や臓器に分化することが知られている。

また、体性幹細胞（間葉系幹細胞）は、上述のような損傷を受けた組織を修復させる効果だけでなく、各種疾患に対する治療効果を有することも知られている。例えば、臍帯組織に由来する体性幹細胞（間葉系幹細胞）には、移植提供者に対して組織適合性不適合な移植受容者における、逆免疫反応（ＧＶＨＤ）を抑制する効果があること（特許文献１参照）、特定の臍帯組織由来間葉系幹細胞は、パーキンソン病の治療のために使用できること（特許文献２参照）、さらに、特定の臍帯組織由来間葉系幹細胞には、循環器系の疾患に対する治療効果があること（特許文献３参照）が知られている。しかし、これらの間葉系幹細胞の治療効果は、十分とは言えない。

特表２００９−５１９９７８号公報 特表２００８−５２５４８９号公報 特表２００７−５２８７０５号公報

本発明は、上記状況に鑑みてなされたものであり、各種疾患に対して優れた治療効果を奏する新規の間葉系幹細胞及びその間葉系幹細胞を含んだ新規の医薬組成物、それらの調製方法、並びにＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞を用いる疾患の予防又は治療方法を提供することを目的とする。

本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ある特定の間葉系幹細胞を含む医薬組成物が、各種疾患に対して優れた治療効果を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。

（１）ＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞。
（２）ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５及びＣＤ１６６陽性である、（１）記載の間葉系幹細胞。
（３）臍帯又は脂肪由来である、（１）又は（２）記載の間葉系幹細胞。
（４）（１）から（３）のいずれか記載の間葉系幹細胞及び／又はその培養上清を含む、医薬組成物。
（５）医薬組成物がＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞を含む場合、ＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞の比率が、医薬組成物の含む間葉系幹細胞全体の７０％以上である、（４）記載の医薬組成物。
（６）医薬組成物がＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞を含む場合、ＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞の比率が、医薬組成物の含む間葉系幹細胞全体の９０％以上である、（４）又は（５）記載の医薬組成物。
（７）癌、前癌性症状、炎症性疾患、免疫疾患、神経変性疾患、代謝疾患、心血管疾患、脳血管障害、骨疾患、胃腸疾患、肺疾患、肝疾患及び腎疾患からなる群より選択される疾患の予防又は治療のために用いられる、（４）から（６）のいずれか記載の医薬組成物。
（８）上皮若しくは内皮のバリア機能の低下に起因する疾患、又はＩＬ−１が関与する疾患の予防又は治療のために用いられる、（４）から（７）のいずれか記載の医薬組成物。
（９）バリア機能の低下が、上皮又は内皮細胞層におけるタイトジャンクション機能の低下に起因する、（８）記載の医薬組成物。
（１０）癌細胞の浸潤及び／又は転移を抑制するために用いられる、（４）から（６）のいずれか記載の医薬組成物。
（１１）ミトコンドリアトランスファー剤である、（４）から（１０）のいずれか記載の医薬組成物。
（１２）ＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞を誘導、濃縮又は分離選別する工程を含む、ＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞の調製方法。
（１３）ＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞を誘導、濃縮又は分離選別する工程を含む、疾患の予防又は治療のために用いられる医薬組成物の調製方法。
（１４）疾患が、癌、前癌性症状、炎症性疾患、免疫疾患、神経変性疾患、代謝疾患、心血管疾患、脳血管障害、骨疾患、胃腸疾患、肺疾患、肝疾患及び腎疾患からなる群より選択される、（１３）記載の医薬組成物の調製方法。
（１５）ＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞を用いる、癌、前癌性症状、炎症性疾患、免疫疾患、神経変性疾患、代謝疾患、心血管疾患、脳血管障害、骨疾患、胃腸疾患、肺疾患、肝疾患及び腎疾患からなる群より選択される疾患の予防又は治療方法。

ＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞は、マクロファージ等の免疫細胞からの炎症性サイトカイン産生を抑制する作用、バリア機能亢進作用、遊走能、ミトコンドリアトランスファー能に優れると共に、酸化ストレスに対する耐性もあり、ダメージを受け難い細胞である、といった特性を有する。また、ＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞の培養上清も同様の機能を有する。そのため、ＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞及び／又はその培養上清を含む本発明の医薬組成物は、癌、前癌性症状、炎症性疾患、免疫疾患、神経変性疾患、代謝疾患、心血管疾患、脳血管障害、骨疾患、胃腸疾患、肺疾患、肝疾患、腎疾患等の種々の疾患に対する優れた治療効果を示す。

ＲＯＲ１陽性間葉系幹細胞の遊走能を示す図である。 ＲＯＲ１陽性間葉系幹細胞の酸化ストレス耐性を示す図である。 ＲＯＲ１陽性間葉系幹細胞のミトコンドリアトランスファー能を示す図である。 ＲＯＲ１陽性間葉系幹細胞の慢性閉塞性肺疾患のヒト気管支平滑筋細胞に対するミトコンドリアトランスファー能を示す図である。 ＲＯＲ１陽性間葉系幹細胞のヒト心筋細胞に対するミトコンドリアトランスファー能を示す図である。 ＲＯＲ１陽性間葉系幹細胞の培養上清の抗炎症効果を示す図である。 推奨培地又は処方培地で培養７日目の臍帯由来間葉系幹細胞及び８日目の脂肪由来間葉系幹細胞の写真である。 推奨培地又は処方培地で培養８日目の臍帯由来間葉系幹細胞の細胞表面マーカーを示す図である。 推奨培地又は処方培地で培養８日目の脂肪由来間葉系幹細胞のＲＯＲ１発現を示す図である。 推奨培地又は処方培地で培養８日目の脂肪由来間葉系幹細胞の細胞表面マーカー発現を示す図である。 推奨培地又は処方培地で培養８日目の臍帯由来間葉系幹細胞の細胞表面マーカー発現を示す図である。 推奨培地又は処方培地で培養１１日目の臍帯由来間葉系幹細胞の細胞表面マーカー発現を示す図である。 推奨培地又は処方培地で培養１１日目の臍帯由来間葉系幹細胞の細胞表面マーカー発現を示す図である。 処方培地で培養した臍帯由来間葉系幹細胞と、推奨培地で培養した臍帯由来間葉系幹細胞の遺伝子発現の比較を示す図である。 処方培地又は推奨培地で培養して得られた臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清中のデコリン、オステオプロテゲリン、ＭＭＰ１の濃度を示す図である。 処方培地又は推奨培地で培養して得られた臍帯由来間葉系幹細胞の、酸化ストレス耐性の比較を示す図である。 処方培地又は推奨培地で培養して得られた臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清のバリア機能亢進活性を示す図である。 処方培地又は推奨培地で培養して得られた臍帯由来間葉系幹細胞の炎症性サイトカイン産生抑制効果を示す図である。 処方培地で培養した間葉系幹細胞（脂肪由来及び臍帯由来）と、推奨培地で培養した間葉系幹細胞（脂肪由来及び臍帯由来）の骨細胞への分化の様子を示した写真の図である。 処方培地で培養した間葉系幹細胞（脂肪由来及び臍帯由来）と、推奨培地で培養した間葉系幹細胞（脂肪由来及び臍帯由来）の脂肪細胞への分化の様子を示した写真である。 ＲＯＲ１陽性間葉系幹細胞培養上清の、癌細胞遊走抑制作用を示す図である。 ＲＯＲ１陽性間葉系幹細胞培養上清の、酸化ストレス耐性を示す図である。 ＲＯＲ１陽性間葉系幹細胞の慢性閉塞性肺疾患のヒト気管支平滑筋細胞に対するミトコンドリアトランスファー能を示す図である。 ＲＯＲ１陽性間葉系幹細胞のヒト心筋細胞に対するミトコンドリアトランスファー能を示す図である。

本発明のＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞は、ＩＬ−６等の炎症性サイトカインの産生抑制作用、バリア機能亢進作用、遊走能、ミトコンドリアトランスファー能に優れると共に、酸化ストレスに対する耐性もあり、ダメージを受け難い細胞である、といった特性を有する。また、未分化性を維持していると同時に、分化条件下では目的の機能を有する細胞に効率よく分化することができる。また、ＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞の培養上清も同様の機能を有する。従って、このようなＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞及び／又はその培養上清を含む本発明の医薬組成物は、種々の疾患に対する優れた治療効果を奏する。以下に、本発明におけるＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞、それを含む医薬組成物等について説明する。

［ＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞］
本発明において間葉系幹細胞とは、骨細胞、心筋細胞、軟骨細胞、腱細胞、脂肪細胞等の間葉系に属する細胞への分化能を有し、この分化能を維持したまま増殖できる細胞を意味する。例えば骨髄、脂肪、血液、骨膜、真皮、臍帯、胎盤、羊膜、絨毛膜、脱落膜、筋肉、子宮内膜、真皮、歯小嚢、歯根膜、歯髄、歯胚等由来の間葉系幹細胞が挙げられ、好ましくは臍帯由来、脂肪由来、骨髄由来の間葉系幹細胞であり、より好ましくは臍帯由来、脂肪由来の間葉系幹細胞であり、さらに好ましくは臍帯由来の間葉系幹細胞である。ここで、「由来」とは、上記細胞が、供給源である組織から獲得され、成長、或いはｉｎ ｖｉｔｒｏで操作された細胞であることを示す。なお、本発明のＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞は、上記間葉系幹細胞の集合体であり、互いに異なる特性を有する複数種の間葉系幹細胞が含まれていてもよいし、実質的に均一な間葉系幹細胞の集合体であってもよい。

本発明における間葉系幹細胞は、被検体由来である自家性細胞であってもよいし、同種の別の対象に由来する他家性細胞であってもよい。好ましくは他家性細胞である。

「ＲＯＲ１陽性」とは、間葉系幹細胞がＲＯＲ１遺伝子を発現していること、若しくはＲＯＲ１タンパクを発現していること、又はその両方を発現していることをいう。間葉系幹細胞におけるＲＯＲ１遺伝子発現の有無、ＲＯＲ１タンパク発現の有無は当業者に知られた通常の方法により確認することができる。例えば、ＲＯＲ１遺伝子発現については、常法により細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを単離後、ｃＤＮＡを合成し、ＲＯＲ１用のプライマーを使用してリアルタイムＰＣＲによるＲＯＲ１ｍＲＮＡの発現解析を行うことで確認できる。また、ＲＯＲ１タンパクの細胞表面上の発現については、ＲＯＲ１タンパクに特異的に結合する抗体を用いたＦＡＣＳ解析により確認することができる。その際、上記抗体と同じアイソタイプの抗体を陰性対照として用いる。ＲＯＲ１は、チロシンキナーゼ活性を有する膜貫通型受容体であり、中枢神経系において神経突起の伸長を制御する分子である。Ｉ型の膜タンパクであり、細胞表面受容体ＲＯＲサブファミリーに属する。ＲＯＲ１は、癌細胞の転移に関与する分子として、研究が進められている。また、最近、ＲＯＲ１が卵巣癌幹細胞上に発現していることが判明し、癌の組織浸潤において関与している可能性が示唆されている。さらに、ＲＯＲ１／２はＮｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌシグナルを駆動するＷｎｔ５の受容体として働いていることが明らかとなっており、Ｆｚｄを奪い合うことで、Ｃａｎｏｎｉｃａｌ経路を阻害する可能性も示唆されている。本発明の間葉系幹細胞集団においてＲＯＲ１の発現が上昇、又はＲＯＲ１陽性細胞の比率が増加していることの効果として、Ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ経路の活性化、すなわちＣａｎｏｎｉｃａｌ経路の阻害を介して、骨分化能が向上していること等が挙げられる。

本発明のＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞は、ＲＯＲ１陽性であるという特徴に加えて、例えば、成長特徴（例えば、継代から老化までの集団倍加能力、倍加時間）、核型分析（例えば、正常な核型、母体系統又は新生児系統）、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ分析）による表面マーカー発現、免疫組織化学及び／又は免疫細胞化学（例えば、エピトープ検出）、遺伝子発現プロファイリング（例えば、遺伝子チップアレイ；逆転写ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、従来型ＰＣＲ等のポリメラーゼ連鎖反応）、ｍｉＲＮＡ発現プロファイリング、タンパク質アレイ、サイトカイン等のタンパク質分泌（例えば、血漿凝固解析、ＥＬＩＳＡ、サイトカインアレイ）、代謝産物（メタボローム解析）、本分野で知られている他の方法等によって、特徴付けられてもよい。本発明におけるＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞は、例えば、以下のような特徴を有する。

（表面マーカーの発現）
本発明におけるＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞は、未分化性の指標となるＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５及びＣＤ１６６を発現している。

（遺伝子発現）
本発明におけるＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞は、ＲＯＲ１遺伝子に加えて、他の遺伝子発現の有無によって特徴付けられてもよい。本発明のＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞が発現している遺伝子としては、例えば、ＭＴ１Ｘ、ＮＩＤ２、ＣＰＡ４、ＤＫＫ１、ＡＮＫＲＤ１、ＴＩＭＰ３、ＭＭＰ１、オステオプロテゲリン（Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ；ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）、ＩＧＦＢＰ５、ＳＬＣ１４Ａ１等が挙げられる。さらに、Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ ２， ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ（ＳＯＤ２）、Ｇｌｕｔａｒｅｄｏｘｉｎ（ＧＬＲＸ）、Ｈｅｍｅ ｏｘｙｇｅｎａｓｅ（ｄｅｃｙｃｌｉｎｇ）−１（ＨＭＯＸ−１）、Ｃｏｌｌａｇｅｎ，ｔｙｐｅ ＩＶ，ａｌｐｈａ（ＣＯＬＡ４Ａ）、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ １、及びＭｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ５（ＭＦＡＰ５）、Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ （Ｃ−Ｃ ｍｏｔｉｆ） ｌｉｇａｎｄ ２（ＣＣＬ２）、Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ （Ｃ−Ｃ ｍｏｔｉｆ） ｌｉｇａｎｄ ７（ＣＣＬ７）、ｉｎｈｉｂｉｎ， ｂｅｔａ Ａ（ＩＮＨＢＡ）、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｔｅｔｒａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｐｅａｔｓ １（ＩＦＩＴ１）、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １， ａｌｐｈａ（ＩＬ−１α）、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １， ｂｅｔａ（ＩＬ−１β）、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ １（ＥＤＮ１）、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｉ２ （ｐｒｏｓｔａｃｙｃｌｉｎ） ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＰＴＧＩＳ）、Ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １（ＳＦＲＰ１）等を挙げることもできる。本発明におけるＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞は、ＭＴ１Ｘ、ＮＩＤ２、ＣＰＡ４、ＤＫＫ１、ＡＮＫＲＤ１、ＴＩＭＰ３、ＭＭＰ１、オステオプロテゲリン（Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ；ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）、ＩＧＦＢＰ５及びＳＬＣ１４Ａ１からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を発現していることが好ましい。より好ましくは２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、さらに好ましくは６種以上、７種以上、８種以上、９種以上の、特に好ましくは、上記の全ての遺伝子を発現している。

また、本発明におけるＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞は、ＭＴ１Ｘ、ＮＩＤ２、ＣＰＡ４、ＤＫＫ１、及びＡＮＫＲＤ１からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子が高発現であってもよい。好ましくは２種以上、３種以上、より好ましくは４種以上、さらに好ましくは上記の全ての遺伝子が高発現である。また、本発明におけるＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞は、Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ ２， ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ（ＳＯＤ２）、Ｇｌｕｔａｒｅｄｏｘｉｎ（ＧＬＲＸ）、Ｈｅｍｅ ｏｘｙｇｅｎａｓｅ（ｄｅｃｙｃｌｉｎｇ）−１（ＨＭＯＸ−１）、Ｃｏｌｌａｇｅｎ，ｔｙｐｅ ＩＶ，ａｌｐｈａ（ＣＯＬＡ４Ａ）、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ １、又はＭｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ５（ＭＦＡＰ５）の遺伝子が高発現であってもよい。さらに、ＴＩＭＰ３、ＭＭＰ１、オステオプロテゲリン（Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ；ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）、ＩＧＦＢＰ５、及びＳＬＣ１４Ａ１からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子が低発現であってもよい。好ましくは２種以上、３種以上、より好ましくは４種以上、さらに好ましくは上記の全ての遺伝子が低発現である。また、本発明におけるＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞は、Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ （Ｃ−Ｃ ｍｏｔｉｆ） ｌｉｇａｎｄ ２（ＣＣＬ２）、Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ （Ｃ−Ｃ ｍｏｔｉｆ） ｌｉｇａｎｄ ７（ＣＣＬ７）、ｉｎｈｉｂｉｎ， ｂｅｔａ Ａ（ＩＮＨＢＡ）、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｔｅｔｒａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｐｅａｔｓ １（ＩＦＩＴ１）、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １， ａｌｐｈａ（ＩＬ−１α）、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １， ｂｅｔａ（ＩＬ−１β）、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ １（ＥＤＮ１）、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｉ２ （ｐｒｏｓｔａｃｙｃｌｉｎ） ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＰＴＧＩＳ）、又はＳｅｃｒｅｔｅｄ ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １（ＳＦＲＰ１）の遺伝子が低発現であってもよい。ここで、遺伝子が高発現又は低発現とは、ＲＯＲ１陰性の従来の間葉系幹細胞と比較して、各遺伝子発現が増強している場合又は低下している場合をいう。具体的には、例えば、臍帯由来間葉系幹細胞としてＬｉｆｅＬｉｎｅ社のＵＣ−ＭＳＣ（Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｃｏｒｄ ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ Ｊｅｌｌｙ（ＨＭＳＣ−ＷＪ）、ＦＣ−００２０）を用いた場合、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社の推奨培地で培養した場合の各遺伝子発現強度と比較することができる。

なお、このときの各遺伝子の発現は、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、細胞から常法によりｍＲＮＡを調製し、発現の有無や程度を確認したい遺伝子についてｑＲＴ−ＰＣＲを行い、それぞれの遺伝子発現を解析することができる。

ＭＴ１Ｘは、システインリッチな低分子量タンパクであり（分子量５００〜１４，０００Ｄａ）、ゴルジ体の膜に局在している。ＭＴ１Ｘの機能の詳細は不明であるが、抗酸化タンパクとして、酸化ストレスに対する防御機構に関与している可能性が示唆されている。また、ＭＴ１Ｘは細胞の未分化性の指標となるタンパクであるとも言われている。本発明のＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞がＭＴ１Ｘを発現していることの効果として、細胞が酸化ストレス耐性を獲得していることが挙げられ、疾患の治療に用いる場合に、よりダメージに強い細胞である点で好ましい。

ＮＩＤ２は、ラミニンγ１鎖に結合し、ラミニンをＩＶ型コラーゲンに結びつけることで基底膜の形成と維持に関与しているタンパクである。中枢神経組織内におけるほとんどの基底膜に発現している。本発明のＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞がＮＩＤ２を発現していることの効果としては、筋肉細胞（特に、骨格筋、心筋）への分化能が向上している可能性が考えられる。

ＣＰＡ４は、タンパク質のＣ末端アミノ酸を切断するタンパク分解酵素のひとつである。また、ＣＰＡ４は前立腺癌マーカーとしても知られるタンパクであり、癌の悪性度に比例して発現が上昇することが知られている。活発に増殖する未分化性の高い細胞において発現が上昇している傾向があることから、本発明のＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞がＣＰＡ４を発現していることは、本発明のＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞が未分化性及び増殖性が高いことを示唆していると言える。

ＡＮＫＲＤ１は、間葉系幹細胞の他、心筋、平滑筋、線維芽細胞、肝星細胞等に発現しているタンパクであり、分化の過程や、ストレスに関与して作用する転写因子である。多くの心疾患に関与していることが判明している。また、創傷治癒過程にある線維芽細胞や肝障害時の肝星細胞において発現が上昇すること、ＡＮＫＲＤ１を欠失させたマウスでは傷の治りが遅れること等が知られている（Ｓｕｓａｎ Ｅ． Ｓａｍａｒａｓ ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １８５， Ｎｏ． １， Ｊａｎｕａｒｙ ２０１５， Ｉｎｇｅ Ｍａｎｎａｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２０１５）。また、ＭＭＰ１０，１３等の細胞外基質分解酵素の発現を制御する核内因子である（Ｋａｒｉｎｎａ Ａｌｍｏｄｏｖａｒ−Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ． ＭＣＢ ２０１４）。よって、本発明のＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞がＡＮＫＲＤ１を発現していることの効果としては、心筋細胞への分化能向上や創傷治癒効果亢進、線維化組織の細胞外基質のリモデリングに関与する等の可能性が考えられる。

ＤＫＫ１は、Ｗｎｔシグナル阻害剤として機能するタンパクであり、Ｃａｎｏｎｉｃａｌ経路の抑制化に寄与していると考えられている。そのため、骨分化に関しては促進的方向に作用して骨分化能を向上させる。骨粗しょう症においては発現が低下することが知られている。一方、細胞の未分化性維持及び増殖には良い影響を与えていると考えられており、胎児発達にも寄与していることも知られている。

ＴＩＭＰ３（Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ３）は、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１３の活性化を抑制する。さらに、ＭＭＰ３はその他の多くのＭＭＰの活性化に関与していることから、ＴＩＭＰ３は広範なＭＭＰの抑制因子として機能する。また、ＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ２への結合を抑制することで血管新生を抑制することや、アポトーシス促進シグナルとして働くことが知られている。

ＭＭＰ１（Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ １）は、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型コラーゲンを対象に分解するタンパク質である。主要なＥＣＭを対象にしていることから、細胞分裂や細胞遊走の際に働くことが知られている。炎症反応によって発現が増加することが知られており、炎症時の組織破壊やリモデリングに関与している。

オステオプロテゲリン（Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ；ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）は、破骨細胞分化因子（ＲＡＮＫＬ）のデコイ受容体で、ＲＡＮＫを介したＮＦ−κＢシグナルの活性化を阻害する。骨芽細胞、線維芽細胞、肝細胞などから産生され、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化を阻害する。オステオプロテゲリンの局所投与により骨形成が促進されたり、逆にノックダウンにより骨粗鬆症を生じるという報告がある。

ＩＧＦＢＰ−５は、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）結合タンパク質で、ほとんどのＩＧＦはＩＧＦＢＰと結合した状態で存在している。ＩＧＦＢＰの機能として、ＩＧＦシグナルを増強することが挙げられる。また、ＴＮＦＲ１の遺伝子発現を促進するほか、ＴＮＦＲ１タンパク質に対してアンタゴニスト的に働くことで、ＴＮＦαシグナルを抑制することが知られている。また、乳癌細胞で、ＩＧＦＢＰ−５が細胞接着、生存率の増加を促進し、細胞遊走を抑制することが報告されている。

ＳＬＣ１４Ａ１は、尿素トランスポーターであり、腎臓で発現が高く、細胞内の尿素濃度のコントロールを行っている。間葉系幹細胞でも発現していることは示されており、特に軟骨分化時に発現低下することが報告されている。

ＳＯＤ２はＲＯＳ（活性酸素）消去酵素、ＧＬＲＸは酸化還元酵素、ＨＭＯＸ−１は抗酸化酵素、ＣＯＬＡ４Ａは基底膜を構成するタンパク、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ １及びＭＦＡＰ５はマトリックス形成に関与するタンパクである。また、ＣＣＬ２、ＣＣＬ７、ＩＮＨＢＡ、ＩＦＩＴ１、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＥＤＮ１、ＰＴＧＩＳは炎症に関連するタンパク、ＳＦＲＰ１はｗｎｔシグナル抑制に関与するタンパクである。

（マイクロＲＮＡ発現）
本発明のＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞は、ｍｉＲＮＡの発現の有無によってさらに特徴付けられてもよい。本発明のＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞が発現しているｍｉＲＮＡとしては、例えば、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０３−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８２−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ−５ｐ等が挙げられる。本発明のＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０３−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８２−５ｐ、及びｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ−５ｐからなる群より選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡを発現していることが好ましい。より好ましくは２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上の、さらに好ましくは７種以上、８種以上、９種以上、１０種以上、１１種以上、１２種以上の、特に好ましくは、上記の全てのマイクロＲＮＡを発現している。

また、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−５０３−５ｐからなる群より選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡが低発現となる傾向であり、かつｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８２−５ｐ、及びｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ−５ｐからなる群より選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡが高発現となる傾向であることが好ましい。ここで、マイクロＲＮＡが低発現とは、ＲＯＲ１陰性の間葉系幹細胞と比較して、低発現であることをいう。また、逆にマイクロＲＮＡが高発現とは、ＲＯＲ１陰性の間葉系幹細胞と比較して、高発現であることをいう。具体的には、例えば、臍帯由来間葉系幹細胞としてＬｉｆｅＬｉｎｅ社のＵＣ−ＭＳＣ（Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｃｏｒｄ ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ Ｊｅｌｌｙ（ＨＭＳＣ−ＷＪ）、ＦＣ−００２０）を用いた場合、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社の推奨培地で培養した場合の各マイクロＲＮＡ発現強度を基準とすることができる。

なお、このときのマイクロＲＮＡの発現は、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、細胞から常法によりｍＲＮＡを調製し、ｑＲＴ−ＰＣＲもしくは市販のマイクロＲＮＡアレイ等により、細胞中のマイクロＲＮＡ発現を解析することができる。マイクロＲＮＡの発現量の判定は、処方培地で培養して得られた細胞における各種マイクロＲＮＡ発現量を、従来の培地や推奨培地等で培養して得られた細胞におけるそれぞれのマイクロＲＮＡ発現量で除した値（Ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ値）を算出して行うことができる。

（サイトカイン分泌）
本発明のＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞は、サイトカイン分泌の有無によってさらに特徴付けられてもよい。本発明のＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞が分泌しているサイトカインとしては、例えば、デコリン、オステオプロテゲリン、ＭＭＰ１等が挙げられる。本発明のＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞は、デコリン、オステオプロテゲリン及びＭＭＰ１からなる群より選択される少なくとも１種のサイトカインを分泌していることが好ましく、少なくとも２種のサイトカインを分泌していることがより好ましく、３種全てのサイトカインを分泌していることがさらに好ましい。

また、本発明のＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞は、デコリンの分泌量が多く、かつオステオプロテゲリン及びＭＭＰ１の分泌量が少ないことが好ましい。ここで、各因子の分泌量が多い又は少ない、の判断は、ＲＯＲ１陰性の間葉系幹細胞におけるそれぞれの因子の産生量（培養上清中の濃度）と比較することにより行うことができる。

なお、サイトカインの分泌量（培養上清中の濃度）は、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ法等が挙げられる。

デコリンは、スモールロイシンリッチプロテオグリカンファミリーで最もよく知られている因子の一つである。生体内ではユビキタスに発現し、コラーゲン線維の集合や細胞の増殖などに関与していることが知られている。本発明のＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞においてデコリンの分泌が上昇していることの効果としては、炎症部位、損傷部位における組織修復効果、組織における細胞増殖促進効果等が期待できる。

オステオプロテゲリン（Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ；ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）は、遺伝子発現の項において記載した通り、破骨細胞分化因子（ＲＡＮＫＬ）のデコイ受容体で、ＲＡＮＫを介したＮＦ−κＢシグナルの活性化を阻害する。骨芽細胞、線維芽細胞、肝細胞などから産生され、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化を阻害する。オステオプロテゲリンの局所投与により骨形成が促進されたり、逆にノックダウンにより骨粗鬆症を生じるという報告がある。

ＭＭＰ１（Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ １）は、遺伝子発現の項において記載した通り、間質コラゲナーゼであり、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型コラーゲンのへリックス部位を特異的に切断し、組織破壊や組織再構築に関与する酵素である。本発明のＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞においてＭＭＰ１の分泌が、ＲＯＲ１陰性細胞と比較して低いことの効果としては、炎症部位、損傷部位における組織修復効果等が期待できる。

（分化の方向性）
本発明におけるＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞は、骨、脂肪、軟骨への優れた分化能を有する。それぞれの分化能については、当業者に公知の分化誘導条件により上記間葉系幹細胞集団を培養して、判断することができる。

骨細胞への分化誘導法としては、従来から用いられている誘導方法を用いることができ、特に限定されないが、典型的には、以下のような方法により誘導できる。即ち、本発明におけるＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞を数日間培養した後、培地中にＦＢＳ等の血清、デキサメタゾン、β−グリセロールホスフェート（β−ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、アスコルビン酸−２−ホスフェート（ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ−２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が含まれた分化培養液に懸濁して播種する。なお、上記分化培養液としては、市販の骨細胞分化用培地を用いてもよい。このような市販の骨分化用培地としては、例えば、ＯｓｔｅｏＬｉｆｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｍｅｄｉｕｍ （Ｌｉｆｅｌｉｎｅ， ＬＭ−００２３）、Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ （タカラバイオ社，Ｄ１２１０９）等が挙げられる。骨分化のための培養では、分化培養用播種から２４時間〜７２時間程度の後に培地交換を行い、以後、３〜４日毎に培地交換を行い、２週間〜１ヶ月程度培養する。

脂肪細胞への分化誘導方法としては、従来から用いられている誘導方法を用いることができ、特に限定されないが、典型的には、レチノイン酸を添加した培養液で数日間浮遊培養した後、インシュリン及びトリヨードサイロニン（Ｔ３）を添加した培養液で培養する。また、従来この種の細胞の培養に用いられる培養条件を利用することができ、例えば、培地の種類、組成物の内容、組成物の濃度、及び培養温度等に関して特に制限はない。また、培養期間は、典型的には２１日を超えない期間培養をするのが好ましいが、３０日〜４０日程度培養を継続することも可能である。具体的には、以下のような方法により脂肪細胞を誘導できる。即ち、本発明におけるＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞を数日間培養した後、脂肪細胞分化用培地に懸濁してクラボウ分化プロトコール推奨細胞密度にて播種する。上記分化用培地としては、例えば、ヒト間葉系幹細胞用脂肪細胞分化用培地：ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ ＤｆＫｔ−１ （Ｌｉｆｅｌｉｎｅ， ＬＬ−００５０）、 ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ ＤｆＫｔ−２ （Ｌｉｆｅｌｉｎｅ ， ＬＬ−００５９）、Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（タカラバイオ社，Ｄ１２１０７）等が挙げられる。脂肪分化のための培養では、分化培養用播種から２４〜７２時間程度の後に培地交換を行い、以後、３〜４日毎に培地交換を行い、２週間〜１ヶ月程度培養する。

軟骨細胞への分化誘導法としては、従来から用いられている誘導方法を用いることができ、特に限定されないが、典型的には、本発明におけるＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞をコラーゲンゲル等と混合してゲル化し、ＤＭＥＭ等の培地に、デキサメタゾン、アスコルビン酸−２−ホスフェート、ピルビン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ）、ＴＧＦ−β３（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−β３）、ＩＴＳプラスプレミックス（ＩＴＳ ｐｌｕｓ ｐｒｅｍｉｘ）（インシュリン、トレンスフェリン、亜セレン酸の混合物）が含まれた分化培養液を添加して培養することができる。１週に２〜３回程度培養液を交換しながら３週間程度培養する。具体的には、以下のような方法により軟骨細胞を誘導できる。即ち、本発明におけるＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞を数日間培養した後、軟骨分化用培地に懸濁して、クラボウ分化プロトコール推奨細胞密度にて、マイクロマス法を用いて播種する。上記軟骨分化用培地としては、例えば、ＣｈｏｎｄｒｏＬｉｆｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｍｅｄｉｕｍ （Ｌｉｆｅｌｉｎｅ， ＬＭ−００２３）、Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ ｗ／ｏ Ｉｎｄｕｃｅｒｓ（タカラバイオ社，Ｄ１２１１０）等が挙げられる。その後、３〜４日毎に培地交換を行い、２週間〜１ヶ月程度培養する。

上記の分化誘導方法にて得られた細胞は、生化学的アプローチ或いは形態観察により分化した細胞の種類を確認することができる。例えば、顕微鏡による細胞観察、種々の細胞染色法、ハイブリダイゼーションを用いたノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法等のさまざまな確認方法によって分化した細胞の種類を特定することができる。

脂肪細胞、骨細胞及び軟骨細胞は、その細胞の形状からは判定が困難であるが、細胞内脂質を染色する（例えばＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色法により赤く染色できる。）ことにより脂肪細胞の存在を確認することができる。また、細胞をアリザリンレッド（Ａｌｉｚａｒｉｎ ｒｅｄ）染色を行うことにより骨細胞の存在を確認することができる。また、アルシアンブルー（Ａｌｃｉａｎ ｂｌｕｅ）染色、サフラニンＯ染色、又はトルイジンブルー染色を行うことにより軟骨細胞の存在を確認することができる。

本発明のＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞は、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞への分化能を有するが、特に脂肪細胞への分化能が、推奨培地によって培養された間葉系幹細胞集団と比較して顕著に向上している。

（酸化ストレス耐性）
本発明のＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞は、ＲＯＲ１陰性の間葉系幹細胞と比較して、ロテノン、Ｈ_２Ｏ_２等による酸化ストレスによるダメージを受けにくい。即ち、ＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞と、ＲＯＲ１陰性の間葉系幹細胞に対して、同じ濃度のロテノン、Ｈ_２Ｏ_２で処理し、細胞のＶｉａｂｉｌｉｔｙ（％）を比較すると、ＲＯＲ１陰性の間葉系幹細胞は、濃度依存的にＶｉａｂｉｌｉｔｙが顕著に低下するのに対して、本発明のＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞は、Ｖｉａｂｉｌｉｔｙの低下が抑えられ、細胞によっては、ほぼ１００％のＶｉａｂｉｌｉｔｙとなる場合もある。

（細胞遊走能及び癌細胞遊走抑制能）
本発明のＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞は、ＲＯＲ１陰性の間葉系幹細胞と比較して、遊走能に優れる。また、本発明のＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞の培養上清は、ＲＯＲ１陰性の間葉系幹細胞の培養上清と比較して、癌細胞の遊走を抑制する活性が高い。即ち、本発明のＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞は、遊走能に優れるため作用部位に適切に移動することができ、さらに作用部位においてはＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞が、又はそれらが産生する因子によって例えば癌細胞等の遊走を抑制することで、癌細胞の浸潤、転移を抑制することができると考えられる。

（ミトコンドリアトランスファー能）
本発明において「ミトコンドリアトランスファー能」とは、細胞がミトコンドリアを他の細胞に移行させることができる能力、或いはミトコンドリア自身が他の細胞に移行する能力をいい、複数の細胞を共培養した場合に、受容側の細胞全体のうちミトコンドリアのトランスファーを受けた細胞の割合（％）でその程度を表す。なお、ここでトランスファーされるミトコンドリアとしては、ミトコンドリア自体の他、ミトコンドリアが含むミトコンドリア遺伝子（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、及び各種タンパク、並びにこれらと他のタンパクや小胞体等の他の器官との複合体も挙げられる。特定の細胞がミトコンドリアトランスファー能に優れる場合、各種疾患に対する治療効果、老化等に伴う症状の回復効果等が期待できる。

本発明のＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞は、ミトコンドリアトランスファー能に優れ、ミトコンドリア機能障害、ミトコンドリア活性の低下等が起こっている細胞に対してミトコンドリアをトランスファーすることによって、それぞれの疾患や老化・ストレス等に伴う症状に対して優れた効果を奏する。本発明のＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞からミトコンドリアトランスファーを受け得る細胞（受容側の細胞）としては、特に限定されないが、例えば、心筋細胞、肺胞上皮細胞、腎尿細管細胞、アストロサイト、気管支平滑筋細胞、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞、免疫性細胞（マクロファージ等）、表皮幹細胞、真皮線維芽細胞、角結膜上皮幹細胞等が挙げられ、中でも心筋細胞、真皮線維芽細胞、気管支平滑筋細胞、特に疾患や老化・ストレス等によって機能が低下したこれらの細胞が好ましい細胞として挙げられる。

［ＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞の調製］
ＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞の調製方法は特に限定されないが、例えば以下のようにして調製することができる。すなわち、臍帯、脂肪組織、骨髄等の組織から、当業者に公知の方法に従って、間葉系幹細胞を分離、培養し、ＲＯＲ１に特異的に結合する抗ＲＯＲ１抗体を用いて、ＲＯＲ１陽性細胞をセルソーター、磁気ビーズ等で分離することにより取得することができる。また、後述する培地を用いる培養により、間葉系幹細胞におけるＲＯＲ１発現を誘導することで、ＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞を取得することもできる。この誘導によって得られる細胞集団において、細胞集団の７０％以上がＲＯＲ１陽性であることが好ましく、８０％以上がＲＯＲ１陽性であることがより好ましく、９０％以上がＲＯＲ１陽性であることがさらに好ましく、実質的にＲＯＲ１陽性の均一な細胞集団であることが特に好ましい。以下に、ＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞の調製方法を具体的に説明する。

本発明におけるＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞の調製方法としては、例えば以下のような方法を用いることができる。すなわち、（Ａ）間葉系幹細胞を含む組織を、酵素等で処理する工程、（Ｂ）上記酵素処理により得られた細胞懸濁液を適切な培養培地に懸濁して付着培養を行う工程、（Ｃ）浮遊細胞を除去する工程、（Ｄ）間葉系幹細胞を培養する工程等を含む方法により、間葉系幹細胞を取得、培養することができる。各工程について以下に、詳細に説明する。

（Ａ）間葉系幹細胞を含む組織を、酵素等で処理する工程において、臍帯等の間葉系幹細胞を含む組織は、生理食塩水（例えばリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ））等を用いて、攪拌して沈降させること等により洗浄する。この操作により、上記組織に含まれる夾雑物を組織から除去することができる。残存する細胞は、さまざまなサイズの塊として存在するので、細胞そのものの損傷を最小限に抑えながら解離させるため、洗浄後の細胞塊を、細胞間結合を弱めるか、又は細胞間結合を破壊する酵素（例えばコラゲナーゼ、ディスパーゼ、トリプシン等）で処理することが好ましい。使用する酵素の量及び処理期間は、使用される条件に依存して変わるが、当技術分野の技術常識の範囲で行うことができる。このような酵素処理に代えて、又は併用して、細胞塊を、機械的な攪拌、超音波エネルギー、熱エネルギー等の他の処理法で分解することができるが、細胞の損傷を最小限に抑えるため、酵素処理のみで行うことが好ましい。酵素を用いた場合、細胞に対する有害な作用を最小限に抑えるために、酵素による処理後は、培地等を用いて酵素を失活させることが望ましい。

上記工程により得られる細胞懸濁物は、凝集状の細胞のスラリー又は懸濁物、並びに各種夾雑細胞、例えば赤血球、平滑筋細胞、内皮細胞、及び線維芽細胞を含む。したがって、続いて凝集状態の細胞とこれらの夾雑細胞を分離、除去してもよいが、後述する浮遊細胞等除去工程により、除去可能であることから、当該分離、除去は割愛しても良い。夾雑細胞を分離、除去する場合、細胞を上清と沈殿に強制的に分ける遠心分離によって達成することができる。得られた夾雑細胞を含む沈殿は、適切な溶媒に懸濁させる。懸濁状の細胞には、赤血球を含む恐れがあるが、後述する個体表面への接着による選択により、赤血球は除外されるため、溶解する工程は必ずしも必要ではない。赤血球を選択的に溶解する方法として、例えば、塩化アンモニウムによる溶解による高張培地又は低張培地中でのインキュベーション等、当技術分野で周知の方法を使用することができる。溶解後、例えば濾過、遠心沈降、又は密度分画によって溶解物を所望の細胞から分離してもよい。

次に（Ｂ）上記酵素処理により得られた細胞懸濁液を適切な培養培地に懸濁して付着培養を行う工程において、懸濁状の細胞において、間葉系幹細胞の純度を高めるために、１回もしくは連続して複数回洗浄し、遠心分離し、培地に再懸濁してもよい。この他にも、細胞を、細胞表面マーカープロファイルを基に、又は細胞のサイズ及び顆粒性を基に分離しても良い。この工程において、ＲＯＲ１タンパクを発現している細胞のみを、セルソータ―、磁気ビーズ等を用いた免疫学的手法により選択的に分離してもよい。

再懸濁において用いる培地は、間葉系幹細胞を培養できる培地であれば、特に限定されないが、例えば、動物細胞用の基礎培地に、血清及び／又は血清代替物等を添加して作製することができる。また、間葉系幹細胞の培養に適した培地として市販されているものを用いてもよい。なお、本発明においては間葉系幹細胞やその培養上清を動物（ヒトを含む）の疾患の治療のために用いるため、できるだけ生物由来原料を含まない培地（例えば、無血清培地）であることが好ましい。特に異種由来成分を含まない（ゼノフリー）培地が好ましい。

上記基礎培地の組成は、培養するべき細胞の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、イーグル培地のような最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地α（ＭＥＭ−α）、間葉系細胞基礎培地（ＭＳＣＢＭ）、Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２及びＦ−１０培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、Ｗｉｌｌｉａｍｓ培地Ｅ、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＣＤＢ培地、１９９培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｉｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ＭｃＣｏｙ改変培地等が挙げられる。

血清は、例えば、ヒト血清、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウシ血清、仔ウシ血清、ヤギ血清、ウマ血清、ブタ血清、ヒツジ血清、ウサギ血清、ラット血清等があるがこれらに限定されない。血清を用いる場合、基礎培地に対して、０．５％〜１５％、好ましくは、５％〜１０％を添加しても良い。
基礎培地に加える上記血清代替物としては、例えば、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオールグリセロール等が挙げられる。

上記基礎培地には、必要に応じて、さらにアミノ酸、無機塩類、ビタミン類、増殖因子、抗生物質、微量金属類、幹細胞分化誘導剤、抗酸化剤、炭素源、塩、糖、糖前駆体、植物由来加水分解物、サーファクタント、アンモニア、脂質、ホルモン、緩衝剤、指示薬、ヌクレオシド、ヌクレオチド、酪酸、有機物、ＤＭＳＯ、動物由来生成物、遺伝子誘導剤、細胞内ｐＨの調節剤、ベタイン、浸透圧保護剤、鉱物、等の物質を添加しても良いが、これらの物質に限定されない。これらの物質の使用濃度は特に限定されず、通常の哺乳動物細胞用培地に用いられる濃度で用いることができる。

上記アミノ酸としては、例えば、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン等が挙げられる。

上記無機塩類としては、例えば、塩化カルシウム、硫酸銅、硝酸鉄（ＩＩＩ）、硫酸鉄、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等が挙げられる。

上記ビタミン類としては、例えば、コリン、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ４、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、ビタミンＢ１２、ビタミンＢ１３、ビタミンＢ１５、ビタミンＢ１７、ビタミンＢｈ、ビタミンＢｔ、ビタミンＢｘ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＦ、ビタミンＫ、ビタミンＭ、ビタミンＰ等が挙げられる。

その他、基礎培地に添加できる具体的な物質としては、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、内皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）等の増殖因子；ペニシリン、ストレプトマイシン、ネオマイシン硫酸塩、アンホテリシンＢ、ブラストサイジン、クロラムフェニコール、アモキシシリン、バシトラシン、ブレオマイシン、セファロスポリン、クロルテトラサイクリン、ゼオシン及びピューロマイシン等の抗生物質；グルコース、ガラクトース、フルクトース、スクロース等の炭素源；マグネシウム、鉄、亜鉛、カルシウム、カリウム、ナトリウム、銅、セレン、コバルト、スズ、モリブデン、ニッケル、ケイ素等の微量金属；β−グリセロリン酸、デキサメタゾン、ロシグリタゾン、イソブチルメチルキサンチン、５−アザシチジン等の幹細胞分化誘導剤；２−メルカプトエタノール、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｎ−アセチルシステイン等の抗酸化剤；アデノシン５’−一リン酸、コルチコステロン、エタノールアミン、インスリン、還元型グルタチオン、リポ酸、メラトニン、ヒポキサンチン、フェノールレッド、プロゲステロン、プトレシン、ピルビン酸、チミジン、トリヨードチロニン、トランスフェリン、ラクトフェリン等が挙げられる。

本発明における間葉系幹細胞に好適な無血清培地としては、市販の無血清培地が挙げられる。例えば、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社、Ｌｏｎｚａ社、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社、Ｖｅｒｉｔａｓ社、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｃｏｒｎｉｎｇ社及びＲｏｈｔｏ社等から間葉系幹細胞用として予め調製された培地として提供されているもの等が挙げられる。

続いて、間葉系幹細胞を分化させずに培養容器等の固体表面上で、上述の適切な培地を使用して、適切な細胞密度及び培養条件で培養する。固体表面を有する培養容器の形状は特に限定されないが、シャーレやフラスコ等が好適に用いられる。本発明における間葉系幹細胞の培養条件は、それぞれの間葉系幹細胞に適した方法であれば特に限定されず、従来と同様の方法が用いられる。通常、３０℃〜３７℃の温度、２％〜７％ＣＯ_２環境下、５％〜２１％Ｏ_２環境下で行われる。また、間葉系幹細胞の継代の時期及び方法もそれぞれの細胞に適していれば特に限定されず、細胞の様子を見ながら、従来と同様に行うことができる。

（Ｃ）浮遊細胞を除去する工程において、培養容器の固体表面に非付着状態の浮遊細胞及び細胞の破片等を除去し、生理食塩水（例えばリン酸緩衝食塩水；ＰＢＳ）等を用いて付着細胞を洗浄する。本発明では、最終的に培養容器の固体表面に付着した状態で留まる細胞を、間葉系幹細胞の細胞集団として選択することができる。

次に、（Ｄ）間葉系幹細胞を培養する工程を行う。培養方法は、それぞれの細胞に適した方法であれば特に限定されず、従来と同様の方法が用いられる。通常、３０℃〜３７℃の温度、２％〜７％ＣＯ_２環境下、５％〜２１％Ｏ_２環境下で行われる。また、間葉系幹細胞の継代の時期及び方法もそれぞれの間葉系幹細胞に適していれば特に限定されず、間葉系幹細胞の形態を観察しながら、従来と同様に行うことができる。培養に用いる培地としては、工程（Ｂ）と同様のものを用いることができる。なお、細胞の全培養期間に渡って無血清培地等を用いて行われてもよい。

上記（Ｄ）工程の培養によって得られた間葉系幹細胞から、ＲＯＲ１タンパクを発現している細胞のみを、セルソータ―、磁気ビーズ等を用いた免疫学的手法により選択的に分離することで、ＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞を取得することができる。

なお、上記（Ｂ）工程以降の工程において、例えば以下の培地を採用することにより、間葉系幹細胞におけるＲＯＲ１発現を誘導し、効率的にＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞を取得することもできる。

［ＲＯＲ１発現誘導（間葉系幹細胞用の特定培地）］
ＲＯＲ１発現誘導し、ＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞を効率的に取得するために用いる特定の培地（以下、「処方培地」ともいう）としては、ＰＴＥＮ阻害剤、ｐ５３阻害剤、ｐ３８阻害剤、Ｗｎｔシグナル活性化剤及びＲＯＣＫ阻害剤からなる群より選択される少なくとも２種の成分と、動物細胞培養用基礎培地とを含有する培地を挙げることができる。処方培地は、これらの成分を含有することで、間葉系幹細胞においてＲＯＲ１の発現を誘導又は促進すると共に、間葉系幹細胞の未分化性を長期に渡って維持しながら培養することができる。また、処方培地は、間葉系幹細胞を長期に渡って良好な細胞状態を維持しながら、効率的に増殖させることができる。さらに、処方培地は、増殖因子及びステロイド性化合物からなる群より選択される少なくとも１種の成分をさらに含有することが好ましい。以下に、処方培地が含む成分について詳細に説明する。

（ＰＴＥＮ阻害剤）
本発明においてＰＴＥＮ阻害剤とは、ＰＴＥＮ（Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ａｎｄ Ｔｅｎｓｉｎ Ｈｏｍｏｌｏｇ Ｄｅｌｅｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １０）遺伝子、又はＰＴＥＮタンパク質の作用を阻害する機能を有するすべての物質をいう。ＰＴＥＮ遺伝子は、染色体上の１０ｑ２３．３に位置し、腫瘍抑制因子として同定されている。ＰＴＥＮタンパク質は広く全身の細胞に発現しており、イノシトールリン脂質であるフォスファチジルイノシトール ３，４，５−トリフォスフェイト（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ３，４，５−ｔｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＰＩＰ３）の脱リン酸化反応を触媒する酵素として知られている。ＰＩＰ３は、ＰＩ３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）により細胞内で合成され、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）／ ＡＫＴの活性化を引き起こす。ＰＴＥＮは、このＰＩＰ３の脱リン酸化反応を担い、フォスファチジルイノシトール ４，５−ビスフォスフェイト（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ４，５−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＰＩＰ２）に変換する作用があるとされている。従って、ＰＴＥＮは、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ情報伝達系を負に制御する。ＰＴＥＮの活性が阻害されると、細胞内にＰＩＰ３が蓄積し、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ情報伝達系が活性化する。

本発明におけるＰＴＥＮ阻害剤としては、例えばｐＶ（ｐｈｅｎｂｉｇ）（ジカリウムビスペロキソ（フェニルビグアニド）オキソバナデート）、ｂｐＶ（ＨＯｐｉｃ）（ジカリウムビスペロキソ（５−ヒドロキシピリジン−２−カルボキシル）オキソバナデート）、ＶＯ−ＯＨＰｉｃ三水和物（（ＯＣ−６−４５） Ａｑｕａ （３−ヒドロキシ−２−ピペリジンカルボキシラト−ｋａｐａＮ１，ｋａｐａＯ２）［３−（ヒドロキシ−ｋａｐａＯ）−２−ピペリジンカルボキシラト（２−）−ｋａｐａＯ２］オキソ−バナジン酸（１−）， 水素三水和物）等が挙げられる。これらは単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いることもできる。

処方培地におけるＰＴＥＮ阻害剤の培地中の濃度としては、本発明の効果の観点から、１０ｎＭ〜１０μＭが好ましく、５０ｎＭ〜１μＭがより好ましく、１００ｎＭ〜７５０ｎＭがさらに好ましく、２５０ｎＭ〜７５０ｎＭが特に好ましい。

（ｐ５３阻害剤）
本発明においてｐ５３阻害剤とは、ｐ５３遺伝子又はｐ５３タンパク質の作用を阻害する機能を有するすべての物質をいう。ｐ５３遺伝子は、染色体上の１７ｐ１３．１に位置し、腫瘍抑制遺伝子としても知られている。ｐ５３タンパク質は、転写因子として作用し、多様な生理活性を有する。

本発明におけるｐ５３阻害剤としては、例えばオルトバナジン酸ナトリウム、ピフィスリン−α、ＭＤＭ２タンパク質等が挙げられる。これらは単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いることもできる。

処方培地におけるｐ５３阻害剤の濃度は、本発明の効果の観点から、１００ｎＭ〜１ｍＭであることが好ましく、５００ｎＭ〜５００μＭであることがより好ましく、１μＭ〜１００μＭであることがさらに好ましい。

（ｐ３８阻害剤）
本発明においてｐ３８阻害剤とは、ｐ３８遺伝子又はｐ３８タンパク質の作用を阻害する機能を有するすべての物質をいう。ｐ３８は、セリン／スレオニンキナーゼであるＭＡＰキナーゼ （Ｍｉｔｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ）の１つである。ＭＡＰキナーゼは、外界刺激を伝達するシグナル分子、細胞増殖、分化、遺伝子発現、アポトーシス等への関与が明らかにされている。

本発明におけるｐ３８阻害剤としては、例えばＳＢ２０３５８０（Ｍｅｔｈｙｌ［４−［４−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）−１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌ−２−ｙｌ］ｐｈｅｎｙｌ］ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）、ＳＢ２０２１９０（４−［４−（４−Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）−１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌ−２−ｙｌ］ｐｈｅｎｏｌ）、ＢＩＲＢ７９６（Ｄｏｒａｍａｐｉｍｏｄ；１−［５−ｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌ−２−（４−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−ｐｙｒａｚｏｌｅ−３−ｙｌ］−３−［４−（２−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈｏｘｙ）−１−ｎａｐｈｔｈｙｌ］ｕｒｅａ）、ＬＹ２２２８８２０（５−［２−（１，１−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ）−５−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌ−４−ｙｌ］−３−（２，２−ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｙｌ）−３Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏ［４，５−ｂ］ｐｙｒｉｄｉｎ−２−ａｍｉｎｅ ｄｉｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、ＶＸ−７０２（２−（２，４−Ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−６−［（２，６−ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）（ａｍｉｎｏｃａｒｂｏｎｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｐｙｒｉｄｉｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ＰＨ−７９７８０４（Ｎ，４−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−３−［３−ｂｒｏｍｏ−４−［（２，４−ｄｉｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｙｌ）ｏｘｙ］−６−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｏｘｏ−１，２−ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ−１−ｙｌ］ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、ＴＡＫ−７１５（Ｎ−［４−［２−Ｅｔｈｙｌ−４−（３−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｔｈｉａｚｏｌｅ−５−ｙｌ］−２−ｐｙｒｉｄｙｌ］ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、ＶＸ−７４５（５−（２，６−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−［２，４−ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｔｈｉｏ］−６Ｈ−ｐｙｒｉｍｉｄｏ［１，６−ｂ］ｐｙｒｉｄａｚｉｎ−６−ｏｎｅ）、及びＳｋｅｐｉｎｏｎｅ−Ｌ（（２Ｒ）−３−［８−［（２，４−Ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ａｍｉｎｏ］−５−ｏｘｏ−５Ｈ−ｄｉｂｅｎｚｏ［ａ，ｄ］ｃｙｃｌｏｈｅｐｔｅｎｅ−３−ｙｌｏｘｙ］−１，２−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ）等が挙げられる。これらは単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いることもできる。

処方培地におけるｐ３８阻害剤の濃度としては、本発明の効果の観点から、１ｎＭ〜１μＭであることが好ましく、１０ｎＭ〜５００ｎＭであることがより好ましく、５０ｎＭ〜２５０ｎＭであることがさらに好ましい。

（Ｗｎｔシグナル活性化剤）
本発明においてＷｎｔシグナル活性化剤とは、Ｗｎｔシグナルを活性化させるすべての物質をいう。Ｗｎｔは、分泌性の細胞間シグナル伝達タンパク質で、細胞内シグナル伝達に関与している。このシグナル伝達経路は細胞の増殖や分化、運動、初期胚発生時の体軸形成や器官形成等の機能を制御している。Ｗｎｔシグナル経路では、Ｗｎｔが細胞に作用することにより、いくつかの別々の活性化される細胞内シグナル伝達機構が含まれる。Ｗｎｔシグナル経路にはβ−カテニンを介して遺伝子発現を制御するβ−カテニン経路、細胞の平面内極性を制御するＰＣＰ（ｐｌａｎａｒ ｃｅｌｌ ｐｏｌａｒｉｔｙ， 平面内細胞極性）経路、Ｃａ２^＋の細胞内動員を促進するＣａ２^＋経路等が知られている。本明細書において、Ｗｎｔシグナル活性化剤とは、そのいずれの経路を活性化するものであってもよい。

本発明におけるＷｎｔシグナル活性化剤には、Ｗｎｔ−３ａのように、カテニン依存性の活性化剤、Ｗｎｔ−５ａのようにカテニン非依存性の活性化剤のいずれも含まれる。この他に、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、補体分子Ｃ１ｑ等を用いることもできる。これらは単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いることもできる。

処方培地におけるＷｎｔシグナル活性化剤の濃度は、本発明の効果の観点から、１μＭ〜１０ｍＭであることが好ましく、１０μＭ〜１０ｍＭであることがより好ましく、１００μＭ〜１ｍＭであることがさらに好ましく、１００μＭ〜５００μＭであることが特に好ましい。

（ＲＯＣＫ阻害剤）
本発明においてＲＯＣＫ阻害剤とは、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）の作用を阻害するすべての物質をいう。Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）は、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質であるＲｈｏの標的タンパク質として同定されたセリン・スレオニンタンパク質リン酸化酵素である。Ｒｈｏキナーゼは、筋肉等の収縮、細胞増殖、細胞遊走及び他の遺伝子発現誘導等の生理機能に関与している。

本発明におけるＲＯＣＫ阻害剤としては、例えばＹ−２７６３２〔（Ｒ）−（＋）−ｔｒａｎｓ−Ｎ−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）−４−（１−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ・２ＨＣｌ・Ｈ_２Ｏ〕、Ｋ−１５５（リパスジル塩酸塩水和物）、Ｆａｓｕｄｉｌ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ〔ＨＡ１０７７／１−（５−Ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ）ｈｏｍｏｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ〕等が挙げられる。

処方培地におけるＲＯＣＫ阻害剤の濃度としては、本発明の効果の観点から、１ｎＭ〜１０μＭであることが好ましく、１０ｎＭ〜１μＭであることがより好ましく、５０ｎＭ〜５００ｎＭであることがさらに好ましい。

処方培地は、これらのＰＴＥＮ阻害剤、ｐ５３阻害剤、ｐ３８阻害剤、Ｗｎｔシグナル活性化剤及びＲＯＣＫ阻害剤からなる群より選択される少なくとも２種の成分を含むが、本発明の効果の観点から、３種の成分を含むことが好ましく、４種の成分を含むことがより好ましく、５種全てを含むことがさらに好ましい。

（増殖因子）
処方培地における増殖因子としては、当業者に公知のいずれの増殖因子でも用いることができる。代表的には、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）等が挙げられるがこれに限定されず、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ又はＦＧＦ２）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）等が挙げられる。さらにアルブミン、トランスフェリン、ラクトフェリン、フェツイン等も例示される。これらは単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いることもできる。

処方培地における増殖因子の濃度としては、増殖因子の種類によって適宜適切な濃度が採用される。一般的には、本発明の効果の観点から、１ｎＭ〜１００ｍＭであることが好ましく、１０ｎＭ〜１０ｍＭであることがより好ましい。

（ステロイド性化合物）
処方培地におけるステロイド性化合物としては、当業者に公知のいずれのステロイド性化合物でも用いることができる。代表的には、エストラジオール、プロゲステロン、テストステロン、コルチゾン、コルチゾール、ハイドロコルチゾン等のステロイドホルモンを使用することができるが、これらに限定されない。これらは単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いることもできる。

処方培地におけるステロイド性化合物の濃度としては、ステロイド性化合物の種類によって適宜適切な濃度が採用される。一般的には、本発明の効果の観点から、０．１ｎＭ〜１ｍＭであることが好ましく、１ｎＭ〜１００μＭであることがより好ましく、１０ｎＭ〜１μＭであることがさらに好ましい。

（動物細胞培養用基礎培地）
本発明における動物細胞培養用基礎培地とは、動物細胞の培養に必須の炭素源、窒素源及び無機塩等を含有させた培地をいう。ここで、動物細胞とは、哺乳類細胞、特にはヒト細胞を指す。本発明における動物細胞培養用基礎培地は、培養して得られる細胞やその培養上清を動物（ヒトを含む）の疾患の治療のために用いる可能性を考慮すると、できるだけ生物由来原料を含まない培地（例えば、無血清培地）であることが好ましい。動物細胞培養用基礎培地には、必要に応じて、微量栄養促進物質、前駆物質等の微量有効物質を配合してもよい。このような動物細胞培養用基礎培地としては、当業者に公知の動物細胞培養用培地を使用することができる。具体的には、イーグル培地のような最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地α（ＭＥＭ−α）、間葉系細胞基礎培地（ＭＳＣＢＭ）、Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２及びＦ−１０培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、Ｗｉｌｌｉａｍｓ培地Ｅ、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＣＤＢ培地、１９９培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｉｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ＭｃＣｏｙ改変培地等、これらの混合培地等が挙げられる。動物細胞培養培地として用いる場合には、特にはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地が好ましく用いられるがこれに限定されない。

動物細胞培養用基礎培地には、アミノ酸類、無機塩類、ビタミン類及び炭素源や抗生物質等の添加剤を添加することができる。これらの添加剤の使用濃度は特に限定されず、通常の動物細胞用培地に用いられる濃度で用いることができる。

アミノ酸類としては、例えば、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン等が挙げられる。

無機塩類としては、例えば、塩化カルシウム、硫酸銅、硝酸鉄（ＩＩＩ）、硫酸鉄、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等が挙げられる。

ビタミン類としては、例えば、コリン、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ４、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、ビタミンＢ１２、ビタミンＢ１３、ビタミンＢ１５、ビタミンＢ１７、ビタミンＢｈ、ビタミンＢｔ、ビタミンＢｘ、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＦ、ビタミンＫ、ビタミンＭ、ビタミンＰ等が挙げられる。

その他、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン等の抗生物質；グルコース、ガラクトース、フルクトース、スクロース等の炭素源；マグネシウム、鉄、亜鉛、カルシウム、カリウム、ナトリウム、銅、セレン、コバルト、スズ、モリブデン、ニッケル、ケイ素等の微量金属；β−グリセロリン酸、デキサメタゾン、ロシグリタゾン、イソブチルメチルキサンチン、５−アザシチジン等の幹細胞分化誘導剤；２−メルカプトエタノール、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｎ−アセチルシステイン等の抗酸化剤；アデノシン５’−一リン酸、コルチコステロン、エタノールアミン、インスリン、還元型グルタチオン、リポ酸、メラトニン、ヒポキサンチン、フェノールレッド、プロゲステロン、プトレシン、ピルビン酸、チミジン、トリヨードチロニン、トランスフェリン、ラクトフェリン、アルブミン、牛血清由来Ｆｅｔｕｉｎ、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ等の緩衝剤、Ｌｉｐｉｄ混合物、ＩＴＳＥ（インスリン、トランスフェリン、セレニウム、及びエタノールアミン）混合物等を添加してもよい。

処方培地としては、例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に、Ｌ−グルタミン、アスコルビン酸、ヒト組み換え型アルブミン、ウシ血清由来Ｆｅｔｕｉｎ、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、Ｌｉｐｉｄ混合液、ＩＴＳＥ混合液、トランスフェリン、ｂＦＧＦ、プロゲステロン、ハイドロコルチゾン、ＶＯ−ＯＨＰｉｃ、Ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ−α（ピフィスリン−α）、ＳＢ２０３５８０、塩化リチウム及びＹ−２７６３２を加えた培地；
ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に、Ｌ−グルタミン、アスコルビン酸、ヒト組み換え型アルブミン、ウシ血清由来Ｆｅｔｕｉｎ、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、Ｌｉｐｉｄ混合液、ＩＴＳＥ混合液、トランスフェリン、ｂＦＧＦ、プロゲステロン、ハイドロコルチゾン、ＶＯ−ＯＨＰｉｃ、Ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ−α（ピフィスリン−α）、ＳＢ２０３５８０を加えた培地；
ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に、Ｌ−グルタミン、アスコルビン酸、ヒト組み換え型アルブミン、ウシ血清由来Ｆｅｔｕｉｎ、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、Ｌｉｐｉｄ混合液、ＩＴＳＥ混合液、トランスフェリン、ｂＦＧＦ、プロゲステロン、ハイドロコルチゾン、塩化リチウム及びＹ−２７６３２を加えた培地；
ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に、Ｌ−グルタミン、アスコルビン酸、ヒト組み換え型アルブミン、ウシ血清由来Ｆｅｔｕｉｎ、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、Ｌｉｐｉｄ混合液、ＩＴＳＥ混合液、トランスフェリン、ｂＦＧＦ、プロゲステロン、ハイドロコルチゾン、ＶＯ−ＯＨＰｉｃ、Ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ−α（ピフィスリン−α）、ＳＢ２０３５８０及びＹ−２７６３２を加えた培地；
ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に、Ｌ−グルタミン、アスコルビン酸、ヒト組み換え型アルブミン、ウシ血清由来Ｆｅｔｕｉｎ、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、Ｌｉｐｉｄ混合液、ＩＴＳＥ混合液、トランスフェリン、ｂＦＧＦ、プロゲステロン、ハイドロコルチゾン、ＶＯ−ＯＨＰｉｃ、Ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ−α（ピフィスリン−α）、ＳＢ２０３５８０及び塩化リチウムを加えた培地；
ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に、Ｌ−グルタミン、アスコルビン酸、ヒト組み換え型アルブミン、ウシ血清由来Ｆｅｔｕｉｎ、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、Ｌｉｐｉｄ混合液、ＩＴＳＥ混合液、トランスフェリン、ｂＦＧＦ、プロゲステロン、ハイドロコルチゾン、ＶＯ−ＯＨＰｉｃ、ＳＢ２０３５８０、塩化リチウム及びＹ−２７６３２を加えた培地；
ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に、Ｌ−グルタミン、アスコルビン酸、ヒト組み換え型アルブミン、ウシ血清由来Ｆｅｔｕｉｎ、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、Ｌｉｐｉｄ混合液、ＩＴＳＥ混合液、トランスフェリン、ｂＦＧＦ、プロゲステロン、ハイドロコルチゾン、Ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ−α（ピフィスリン−α）、ＳＢ２０３５８０、塩化リチウム及びＹ−２７６３２を加えた培地；
処方培地の例示としては、例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に、Ｌ−グルタミン、アスコルビン酸、ヒト組み換え型アルブミン、ウシ血清由来Ｆｅｔｕｉｎ、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、Ｌｉｐｉｄ混合液、ＩＴＳＥ混合液、トランスフェリン、ｂＦＧＦ、プロゲステロン、ハイドロコルチゾン、ＶＯ−ＯＨＰｉｃ、Ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ−α（ピフィスリン−α）、塩化リチウム及びＹ−２７６３２を加えた培地等が挙げられる。

処方培地の調製方法は、特に限定されず、従来公知の常法に従って調製することができる。例えば、室温で、又は必要に応じて加温して、動物細胞培養用基礎培地に上述した各成分を添加・混合して得られる。

処方培地は液体であることが好ましいが、必要に応じてゲル状、寒天培地等の固形状の培地としてもよい。処方培地によれば、培養表面が表面処理されている、又は表面処理されていない培養容器若しくは培養用担体に間葉系幹細胞を播種してインキュベートすることができる。

［ＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞の培養上清の調製］
本発明におけるＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞培養上清としては、上述したＲＯＲ１陽性間葉系幹細胞を培養して得られる上清であれば特に限定されない。例えば、上述のＲＯＲ１陽性間葉系幹細胞を、通常、３０℃〜３７℃の温度、２％〜７％ＣＯ_２環境下、５％〜２１％Ｏ_２環境下で、適切な細胞密度、適切な培地中にてさらに培養する。培養は、細胞の全培養期間に渡って無血清培地を用いて行われてもよい。ここで、用いる無血清培地については、上記ＲＯＲ１陽性間葉系幹細胞の項での説明を適用できる。

培養上清の回収時期としては、細胞の状態を勘案して適切な回数の継代を行った後、通常その１日後〜５日後、好ましくは１日後〜４日後、より好ましくは１日後〜３日後、さらに好ましくは２日後〜３日後に行う。培養上清は、１回のみの回収でもよいし、複数日に渡って複数回回収してもよい。

なお、本明細書におけるＲＯＲ１陽性間葉系幹細胞の培養上清とは、ＲＯＲ１陽性間葉系幹細胞が増殖又は生存し得る条件の下、ＲＯＲ１陽性間葉系幹細胞が増殖又は生存し得る培養液で培養して得られた培養液（培養後の培養液）から細胞等を除去したものを意味するが、このような培養上清から、例えば、残存培地成分（培養前の培養液の成分のうち、培養後の培養液中に残存している成分）、培養液の水分などの、本発明の効果に寄与しない成分の少なくとも一部をさらに除去したものも、便宜上、本明細書におけるＲＯＲ１陽性間葉系幹細胞の培養上清に含まれるものとする。なお、簡便性の観点からは、培養後の培養液から間葉系幹細胞を除去したものをそのまま培養上清として用いることが好ましい。

本発明におけるＲＯＲ１陽性間葉系幹細胞の培養上清は、例えば含まれるサイトカイン、ｍｉＲＮＡ等の核酸、代謝産物等によって特徴付けられてもよい。

［医薬組成物］
本発明の医薬組成物は、ＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞及び又はその培養上清を含むことを特徴とする。ＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞は、ＩＬ−６等の炎症性サイトカインの産生抑制作用、バリア機能亢進作用、遊走能、ミトコンドリアトランスファー能に優れると共に、酸化ストレスに対する耐性もあり、ダメージを受け難い細胞である、といった特性を有する。また、未分化性を維持していると同時に、分化条件下では目的の機能を有する細胞に効率よく分化することができる。このようなＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞を含む本発明の医薬組成物は、種々の疾患に対する優れた予防又は治療効果を奏する。本発明の医薬組成物は、本発明の効果を損なわない範囲で、ＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞に加えて、その他の成分を含んでいてもよい。

本発明の医薬組成物は、間葉系幹細胞集団を含み、この一部又は全部がＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞である。ＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞については、上述の通りである。本発明の医薬組成物が含む間葉系幹細胞集団のうちＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞が占める割合は高いほど好ましい。上記割合は、５０％以上であることが好ましく、７０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることが特に好ましく、９９％以上であることが最も好ましい。

［医薬組成物の調製方法］
本発明は、ＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞を誘導、濃縮又は分離選別する工程を含む、疾患の予防又は治療のために用いられる医薬組成物の調製方法も含む。上記疾患としては、癌、前癌性症状、炎症性疾患、免疫疾患、神経変性疾患、代謝疾患、心血管疾患、脳血管障害、骨疾患、胃腸疾患、肺疾患、肝疾患及び腎疾患からなる群より選択される疾患が挙げられる。

本発明の医薬組成物の調製方法は、ＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞を誘導、濃縮又は分離選別する工程を含む。上記ＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞を誘導する工程で採用される方法としては、間葉系幹細胞におけるＲＯＲ１発現を誘導、増強できる方法であれば特に限定されない。例えば、上述の処方培地を用いて間葉系幹細胞におけるＲＯＲ１タンパクの発現を誘導する方法も好ましい方法として例示される。上記処方培地を用いた培養によると、間葉系幹細胞集団の６０％以上をＲＯＲ１陽性細胞に誘導することができ、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは実質的に均一なＲＯＲ１陽性細胞とすることができる。

また、ＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞を濃縮、分離選別する工程で採用される方法としては、例えば、上述のような、ＲＯＲ１を特異的に認識する抗体を用い、セルソーター、磁気ビーズ等を用いる方法が挙げられる。これらの方法によると、ＲＯＲ１タンパクを細胞表面に発現している間葉系幹細胞を選択的に濃縮、分離選別することができる。

本発明の医薬組成物は、上述の「ＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞を誘導、濃縮又は分離選別する工程」により取得した、ＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞及び／又はその培養上清に加えて、本発明の効果を損なわない範囲であれば、ＲＯＲ１陰性の間葉系幹細胞、その他の細胞を含んでいてもよく、その用途や形態に応じて、常法に従い、薬学的に許容される担体や添加物を含有させてもよい。このような担体や添加物としては、例えば、等張化剤、増粘剤、糖類、糖アルコール類、防腐剤（保存剤）、殺菌剤又は抗菌剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、キレート剤、油性基剤、ゲル基剤、界面活性剤、懸濁化剤、結合剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、発泡剤、流動化剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、溶解補助剤、抗酸化剤、甘味剤、酸味剤、着色剤、呈味剤、香料又は清涼化剤等が挙げられるが、これらに限定されない。代表的な成分として例えば次の担体、添加物等が挙げられる。

［本発明のＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞及びそれを含む医薬組成物の用途］
本発明の医薬組成物は種々の疾患の予防及び／又は治療に使用することができ、限定的に解釈されないが、例えば以下に説明する作用、機能等に基づいた用途が好ましいものとして挙げられる。

（培養上清のバリア機能亢進作用）
本発明におけるＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞の培養上清は、ＲＯＲ１陰性の従来の間葉系幹細胞の培養上清と比較して、より優れた細胞のバリア機能亢進効果を示す。即ち、本発明におけるＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞の培養上清は、炎症によって障害を受けた細胞のバリア機能を回復させる顕著な効果を有するため、本発明のＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞及びそれを含む医薬組成物は、炎症に関連する疾患の治療に好適に用いることができる。また、ＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞又はその培養上清は、化粧品用組成物、食品用組成物等としても用いることもできる。

（抗炎症効果）
本発明におけるＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞は、炎症状態において、マクロファージからの炎症性サイトカインの産生を抑制する効果を有する。この効果は、ＲＯＲ１陰性の従来の間葉系幹細胞と比較して、有意に高いものである。そのため、本発明のＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞及びそれを含む医薬組成物は、炎症に関連する疾患の治療に好適に用いることができる。また、ＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞又はその培養上清は、化粧品用組成物、食品用組成物等としても用いることもできる。

（抗腫瘍効果）
本発明のＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞は、ＲＯＲ１陰性の間葉系幹細胞と比較して、遊走能に優れる。また、本発明のＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞の培養上清は、ＲＯＲ１陰性の間葉系幹細胞の培養上清と比較して、癌細胞の遊走を抑制する活性が高い。即ち、本発明のＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞は、遊走能に優れるため作用部位に適切に移動することができ、さらに作用部位においては例えば癌細胞等の遊走を抑制することで、癌細胞の浸潤、転移を抑制することができると考えられる。従って、本発明のＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞を含む医薬組成物、及び本発明のＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞の培養上清を含む医薬組成物は、抗腫瘍効果を奏する医薬として好適に用いられる。

（ミトコンドリアトランスファー剤としての作用）
本発明のＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞は、ミトコンドリアトランスファー能に優れ、ミトコンドリア機能障害、ミトコンドリア活性の低下等が起こっている細胞に対してミトコンドリアをトランスファーすることによって、それぞれの疾患や老化・ストレス等に伴う症状に対して優れた効果を奏する。従って、本発明のＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞又はその培養上清を含む医薬組成物は、ミトコンドリア機能障害、ミトコンドリア活性の低下等が起こっている細胞に対してミトコンドリアをトランスファーすることによって、それぞれの疾患や老化・ストレス等に伴う症状を改善、治療及び／又は予防するためのミトコンドリアトランスファー剤として、好適に用いられる。このような疾患及び症状としては、特に限定されないが、例えば、心筋細胞、肺胞上皮細胞、腎尿細管細胞、アストロサイト、気管支平滑筋細胞、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞、免疫性細胞（マクロファージ等）、表皮幹細胞、真皮線維芽細胞、角結膜上皮幹細胞等に関連する疾患及び症状が挙げられ、中でも心筋細胞、真皮線維芽細胞、気管支平滑筋細胞に関連する疾患及び症状に好適に用いられる。

本発明のＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞及びそれを含む医薬組成物を細胞医薬品として用いることができる疾患としては、例えば、軟骨分解、関節リウマチ、乾癬性関節炎、脊椎関節炎、変形性関節症、痛風、乾癬、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、うっ血性心不全、脳梗塞、脳卒中、大動脈弁狭窄症、腎不全、狼瘡、膵炎、アレルギー、線維症、貧血、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、化学療法／放射線関連合併症、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、自己免疫性肝炎、Ｃ型肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、劇症肝炎、セリアック病、非特異性大腸炎、アレルギー性結膜炎、糖尿病性網膜症、シェーグレン症候群、ブドウ膜炎アレルギー性鼻炎、喘息、石綿症、珪肺、慢性閉塞性肺疾患、慢性肉芽腫性炎症、嚢胞性線維症、サルコイドーシス、糸球体腎炎、脈管炎、皮膚炎、ＨＩＶ関連悪液質、大脳マラリア、強直性脊椎炎、らい病、肺線維症、線維筋痛、食道癌、胃食道逆流症、バレット食道、胃癌、十二指腸癌、小腸癌、虫垂癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、肛門癌、膵臓癌、肝臓癌、胆嚢癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、子宮癌、卵巣癌、乳癌、肺癌、甲状腺癌等が挙げられる。

本発明の医薬組成物を医薬品として用いる場合の投与方法としては、特に制限されないが、血管内投与（好ましくは静脈内投与）、腹腔内投与、腸管内投与、皮下投与等が好ましく、中でも、血管内投与がより好ましい。

本発明の医薬組成物の用量（投与量）は、患者の状態（体重、年齢、症状、体調等）、及び本発明の医薬組成物の剤形等によって異なり得るが、十分な予防又は治療効果を奏する観点から、その量は多い方が好ましく、一方、副作用を抑制する観点からはその量は少ない方が好ましい傾向にある。通常、成人に投与する場合には、細胞数として、５ｘ１０²〜１ｘ１０^１２個／回、好ましくは１ｘ１０^４〜１ｘ１０^１１個／回、より好ましくは１ｘ１０^５〜１ｘ１０^１０個／回である。なお、本用量を１回量として、複数回投与してもよく、本用量を複数回に分けて投与しても良い。また、通常、成人に投与する場合には、体重当たりの細胞数として、１ｘ１０〜５ｘ１０^１０個／ｋｇ、好ましくは１ｘ１０^２〜５ｘ１０^９個／ｋｇ、より好ましくは１ｘ１０^３〜５ｘ１０^８個／ｋｇである。なお、本用量を１回量として、複数回投与してもよく、本用量を複数回に分けて投与しても良い。

本発明は、ＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞、又はＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞を含む医薬組成物を用いることを特徴とする、疾患の予防又は治療方法を含む。上記疾患としては、例えば、癌、前癌性症状、炎症性疾患、免疫疾患、神経変性疾患、代謝疾患、心血管疾患、脳血管障害、骨疾患、胃腸疾患、肺疾患、肝疾患、腎疾患等が挙げられる。

次に、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

＜ＲＯＲ１陽性間葉系幹細胞の調製＞
臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ−ＭＳＣ；Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｃｏｒｄ ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ Ｊｅｌｌｙ（ＨＭＳＣ−ＷＪ）、ＦＣ−００２０、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社）を、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社推奨培地にて馴化し、常法に従って、同培地にて継代培養を行ったＵＣ−ＭＳＣを以下の実験に用いた。

上記ＵＣ−ＭＳＣを６７００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２で播種し、４日間培養後、−ＰＢＳ（−）で２回洗浄して０．０２５％トリプシンを用いて細胞を回収した。２００Ｇ、５ｍｉｎ、４℃で遠心し、１％ＢＳＡ／Ｄ−ＰＢＳ溶液で細胞を再懸濁した。ＰＥ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＲＯＲ１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ＃ ５６４４７４）又はＭｏｕｓｅ ＩｇＧ２ｂ ＰＥ， ｋ ｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ＃ ４０１２０８）をそれぞれ５ｕｌ／１００ｕｌの濃度で添加し、１時間反応させた。１％ＢＳＡ／Ｄ−ＰＢＳ溶液で細胞を３回洗浄し、１％ＢＳＡ／Ｄ−ＰＢＳで再懸濁してＳＯＮＹ ＳＨ８００Ｚにてセルソーティングを行った。各細胞群を、上記推奨培地を用いて１〜３×１０^４／ｃｍ^２で６ｗｅｌｌプレート又は９６ｗｅｌｌプレートに播種した。
得られたＲＯＲ１陽性ＭＳＣ（Ｒ ｐｏｓｉ）、ＲＯＲ１陰性ＭＳＣ（Ｒ ｎｅｇａ）、必要に応じて、ＲＯＲ１陽性ＭＳＣとＲＯＲ１陰性ＭＳＣとを１：１の割合で混ぜた細胞（Ｒ ｍｉｘ）、ソーティングを行っていないＭＳＣ（Ｒ ソートなし）を用いて、以下の試験を行った。なお、本試験においてＲＯＲ１陽性ＭＳＣとして回収した細胞集団には、一部ＲＯＲ１陰性ＭＳＣも含まれ得る。

（細胞遊走試験）
上記ソーティングによって得られたＲＯＲ１陽性ＭＳＣ、ＲＯＲ１陰性ＭＳＣを、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社推奨培地にて更に２日間培養し、常法によりトリプシン処理して細胞を回収した。回収した細胞はＤＭＥＭ／Ｆ１２（０．２％ ＦＢＳ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）、１％ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（ｇｉｂｃｏ社、１５２４０−０６２）含有）に懸濁し、２４ｗｅｌｌ ボイデンチャンバー（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、３４２２）の上部ウェルに約３．０×１０^４ｃｅｌｌｓずつ２００μＬの培地で播種した。下部ウェルにはＤＭＥＭ／Ｆ１２（１０％ ＦＢＳ、１％Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ含有）を５５０μＬ加え、３７℃、５％炭酸ガス及び９５％空気の環境下で５時間培養した。培養後、培地を上部ウェル下部ウェル両方から除き、ＰＢＳ（−）にて洗浄した後、下部ウェルに−３０℃に冷却したメタノール（Ｗａｋｏ社、１３４−０１８３３）を５００μＬ加え、−３０℃にて１０分静置した。メタノールを除き、ＰＢＳ（−）にて洗浄した後、下部ウェルに１％クリスタルバイオレット溶液（グラム染色液Ｉ（武藤化学社、４１１３１）を２０％エタノール／水で２倍希釈したもの）を５００μＬ加え、室温にて１０分染色した。上部ウェルを取り出し、流水中で洗浄した後、メンブレンの上側に残っている細胞を、綿棒を用いて完全に取り除いた。メンブレンを、メスを用いて切り取り、９６ｗｅｌｌプレートのウェルへ入れ、１％ ＳＤＳ水溶液 ５０μＬを加えて細胞を溶解させた。メンブレンを取り除き、プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社）にて吸光度（５９０ｎｍ、対照波長６５０ｎｍ）を測定した。この測定値は、上部ウェルから下部ウェルに遊走した細胞数に比例する値である。結果を図１に示す。

図１に示すとおり、ＲＯＲ１陽性ＭＳＣ（Ｒ ｐｏｓｉ）は、陰性ＭＳＣ（Ｒ ｎｅｇａ）と比較して、遊走能が顕著に高いことがわかった。

（酸化ストレス耐性試験）
上記の方法によって得られたＲＯＲ１陽性ＭＳＣ（Ｒ ｐｏｓｉ）、ＲＯＲ１陰性ＭＳＣ（Ｒ ｎｅｇａ）、ＲＯＲ１陽性ＭＳＣとＲＯＲ１陰性ＭＳＣとを１：１の割合で混ぜた細胞（Ｒ ｍｉｘ）、ソーティングを行っていないＭＳＣ（Ｒ ソートなし）のそれぞれを、細胞密度を合わせて再播種し、２日後に図３に示す各濃度のＨ_２Ｏ_２／ＨＢＳＳ溶液で１時間処理し、元の培地に戻して２４時間後の細胞数を、ヘキスト３３３４２による核染色及びその蛍光画像解析により比較した。

図２に示す通り、ＵＣ−ＭＳＣはＨ_２Ｏ_２／ＨＢＳＳ溶液処理により障害を受けて細胞数が減少するが、ＲＯＲ１陽性ＭＳＣ（Ｒ ｐｏｓｉ）は、ＲＯＲ１陰性ＭＳＣ（Ｒ ｎｅｇａ）及びソーティングを行っていないＭＳＣ（Ｒ ソートなし）と比較して、Ｈ_２Ｏ_２／ＨＢＳＳ溶液処理による障害に対する耐性が有意に高く、酸化ストレスを受けにくい状態となり、細胞数の減少が抑えられることが示唆された。

（ミトコンドリアトランスファー試験）
上記の方法によって得られたＲＯＲ１陽性ＭＳＣ（Ｒ ｐｏｓｉ）、ＲＯＲ１陰性ＭＳＣ（Ｒ ｎｅｇａ）、必要に応じてＲＯＲ１陽性ＭＳＣとＲＯＲ１陰性ＭＳＣとを１：１の割合で混ぜた細胞（Ｒ ｍｉｘ）、ソートを行っていないＭＳＣ（Ｒ ソートなし）のそれぞれを、６ｗｅｌｌプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ， Ｃｅｌｌ Ｂｉｎｄ ３３３５）に１Ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した。２日後、細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ（クラボウ，ＨＫ−３１２０）で処理して剥がし、播種し直した。ミトコンドリアの供給側となるＵＣ−ＭＳＣ細胞のフラスコにミトコンドリア染色試薬（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ ＦＭ（Ｍ７５１４ ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をＨＢＳＳ（＋）で１／１，０００希釈したもの）を添加して３０分、ミトコンドリアの受容側となる細胞のフラスコに細胞質染色試薬（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＣｅｌｌＴｒａｃｅＴＭＦａｒ Ｒｅｄ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃ３４５６４ ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をＨＢＳＳ（＋）で１／７，０００希釈したもの）を添加し１時間、３７℃でインキュベートした。染色後、各培地に置換して３７℃で一晩培養し、翌日、ＨＢＳＳ（＋）で３回洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡにて細胞を剥離した。剥離した細胞をＨＢＳＳ（＋）で洗浄し、両方の細胞をそれぞれ２，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるようにプレート（９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）に播種して共培養を開始した。翌日、核染色試薬をＰＢＳ（−）で１／１０００希釈し、ｗｅｌｌ内培地と置換した。１５分室温放置後、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓで画像撮影した（１６視野／ｗｅｌｌ）。細胞カウントプログラム＊で解析し、ミトコンドリアトランスファー率を計算した。結果を図３〜５に示す。

受容側の細胞としては、以下の細胞を用いた。
・上記方法にて調製したＲＯＲ１陽性ＭＳＣ及びＲＯＲ１陰性ＭＳＣ
・ＢＳＭＣ−ＣＯＰＤ細胞（慢性閉塞性肺疾患のヒト気管支平滑筋細胞；Ｂｒｏｎｃｈｉａｌ Ｓｍｏｏｔｈ Ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅ（Ｌｏｎｚａ ００１９５２７４）；なお、ＢＳＭＣ−ＣＯＰＤ細胞の培養には、ＳｍＧＭＴＭ−２培地＋ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（Ｌｏｎｚａ ＣＣ−３１８２）＋１％Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｇｉｂｃｏ社）を用いた。
・ＨＣＭ（ヒト心筋細胞）：Ｈｕｍａｎ Ｃａｒｄｉａｃ Ｍｙｏｃｙｔｅｓ（ＨＣＭ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ））；なお、ＨＣＭの培養には、Ｍｙｏｃｙｔｅ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ，Ｃ−２２１７０），Ｍｙｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｐａｃｋ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ，Ｃ−３９２７０）を用いた。

細胞カウントプログラム＊での解析は以下のように行った。
（１）ＤＡＰＩフィルター等の核染色を認識するフィルターで観察し、核を認識、計測させる（＝細胞数の測定）。
（２）Ｃｙ５フィルター等の受容側細胞染色を認識するフィルターで観察し、ミトコンドリアを受け取る側の細胞（受容側）である細胞質を認識、計測させる（例えば、Ｒｅｄ染色された細胞＝受容側）。
（３）ミトコンドリア染色を認識するフィルターで観察し、ミトコンドリアを持つ細胞（供給側）を認識、計測させる（例えば、ｇｒｅｅｎ染色された細胞＝供給側）。
（４）下記計算式により、ミトコンドリアトランスファー率（％）を算出することができる。また、（１）の細胞数を計測することで薬剤の細胞毒性を評価することができる。
計算式：（（２）かつ（３）の細胞数／（２）の細胞数）×１００

図３に示すとおり、ＲＯＲ１陽性（Ｐｏｓｉ）ＭＳＣは、ＲＯＲ１陰性（Ｎｅｇａ）ＭＳＣや、ソートを行っていないＭＳＣと比較して、ミトコンドリアトランスファー能が顕著に高いことがわかった。また、図４に示すとおり、ＢＳＭＣ−ＣＯＰＤ細胞（慢性閉塞性肺疾患のヒト気管支平滑筋細胞）へのミトコンドリアトランスファー率は、ＲＯＲ１陽性ＭＳＣが、ＲＯＲ１陰性ＭＳＣと比較して、顕著に高いことがわかった。更に図５に示すとおり、ＨＣＭ（ヒト心筋細胞）へのミトコンドリアトランスファー率は、ＲＯＲ１陽性ＭＳＣが、ＲＯＲ１陰性ＭＳＣと比較して、顕著に高いことがわかった。

以上の試験結果から、ＲＯＲ１陽性ＭＳＣは、ＲＯＲ１陰性ＭＳＣと比較して、遊走能に優れると共に、酸化ストレスに対しての耐性が強いことがわかった。また、ＲＯＲ１陽性ＭＳＣは、慢性閉塞性肺疾患のヒト気管支平滑筋細胞株であるＢＳＭＣ−ＣＯＰＤ細胞、ヒト心筋細胞株であるＨＣＭ細胞に対して、自身のミトコンドリアをトランスファーする率が高いことから、慢性閉塞性肺疾患、心疾患の治療又は予防のために有効であると考えられる。また、上記疾患以外にも、ミトコンドリア機能障害、ミトコンドリア活性の低下等が関連する疾患や老化等に伴う症状に対して、広く用いることができると考えられる。

（抗炎症効果）
上記の方法によって得られたＲＯＲ１陽性ＭＳＣ、陰性ＭＳＣのそれぞれを、０．２％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で４８時間培養し、培養上清を回収して以下の試験に用いた。

染色試薬Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭの０．５ｍＭ ＤＭＳＯ溶液を１０％ＦＣＳ ＤＭＥＭにて１，０００倍希釈したものを準備した。マウスマクロファージ細胞株Ｒａｗ２６４．７にＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭ含有培地を添加し５％ＣＯ_２、３７℃にて３時間の前培養を行ったのち、５ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで４８ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種した。

翌日、培養上清を１／２量添加し、４時間後にＬＰＳを１００ｎｇ／ｍＬとなるように添加した。１７−１８時間後、培養上清を回収した。培養上清中のＩＬ−６量をＥＬＩＳＡ（ｍＩＬ−６ＥＬＩＳＡ，Ｒ＆Ｄ Ｄｕｏｓｅｔ ＤＹ４０６−０５）により測定した。なお、培養上清回収後、予めＲａｗ２６４．７に取り込ませたＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭの蛍光値を測定し、割り戻すことでＩＬ−６量の細胞数補正を行った。結果を図６に示す。

図６に示すように、ＲＯＲ１陽性ＭＳＣの培養上清を添加すると、ＲＯＲ１陰性ＭＳＣの培養上清を添加した場合と比較して、マクロファージ細胞株Ｒａｗ２６４．７が産生する炎症性サイトカインであるＩＬ−６産生がより抑制された。

＜ＲＯＲ１発現細胞の誘導＞
（処方培地の調製）
下記表１に示す基本の培地を調製した。具体的には、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に下記表１に記載の成分を記載の濃度となるように添加した

上記調製した基本の培地に、ＬｉＣｌ（Ｗｎｔ活性化剤）２５０μＭ、Ｙ−２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤）１００ｎＭ、Ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ−ａ（ｐ５３阻害剤）１０μＭ、ＶＯ−ＯＨ Ｐｉｃ（ＰＴＥＮ阻害剤）５００ｎＭ、ＳＢ２０３５８０（ｐ３８阻害剤）１００ｎＭとなるように、各成分を添加して処方培地を調製した。この培地を臍帯由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞の培養に供し、ＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞を誘導した。なお、対照としては、従来公知の間葉系幹細胞用の培地であるＬｉｆｅＬｉｎｅ社の推奨培地を使用した。

＜臍帯由来間葉系幹細胞及び脂肪由来間葉系幹細胞の培養と評価＞
（試験１）
臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ−ＭＳＣ；Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｃｏｒｄ ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ Ｊｅｌｌｙ（ＨＭＳＣ−ＷＪ）、ＦＣ−００２０、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社；Ｐｒｉｍａｒｙ Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｃｏｒｄ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ； Ｎｏｒｍａｌ Ｈｕｍａｎ、ＰＣＳ−５００−０１０、ＡＴＣＣ社；Ｈｕｍａｎ Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ （ＨＵＭＳＣ）、７５３０、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ社）、及び脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＤ−ＭＳＣ；Ａｄｉｐｏｓｅ ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、ＦＣ−００３４、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社）を、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社推奨培地にて馴化した後、５，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の密度でＣｅｌｌＢｉｎｄ Ｆｌａｓｋに播種した。翌日、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社推奨培地又は処方培地に交換した（１Ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ；６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）。３日後、それぞれ同様に播種し直し合計で７日間（ＵＣ−ＭＳＣ）又は８日間（ＡＤ−ＭＳＣ）培養した細胞の形態を図７に示す。同様にさらに２日間（合計では８日間）培養した細胞について、ＦＡＣＳにてＲＯＲ１を含む各種細胞表面マーカーを解析した（図８；ＵＣ−ＭＳＣ、図９；ＡＤ−ＭＳＣ、図９はＲＯＲ１発現のみ）。図中、白抜きは推奨培地で培養した細胞の、グレーは処方培地で培養した細胞の各種細胞表面マーカー発現を示している。また、ＵＣ−ＭＳＣ、ＡＤ−ＭＳＣの８日間培養後の細胞については、ＦＡＣＳにて細胞表面マーカーの発現を解析し、結果を、図１０（ＡＤ−ＭＳＣ）及び１１（ＵＣ−ＭＳＣ）に示す。

ＡＤ−ＭＳＣは、推奨培地と比べて、処方培地を用いた場合の方がやや小ぶりで丸くなり、状態が良好なのに対して、推奨培地を用いた場合には細長い形態となり、状態がやや悪くなっていると判断された。しかし、表面マーカーの発現については、推奨培地で培養したＡＤ−ＭＳＣはＣＤ１０５、ＣＤ７３の発現ピークが高いまま１つであったのに対して、実施例１の培地で培養するとＣＤ１０５は一部の細胞においてその発現が低下し、発現ピークは２つとなった。またＣＤ７３は全体的に発現強度が低下した（図１０）。ＡＤ−ＭＳＣの未分化性の維持には、推奨培地の方が適していると思われた。

一方、ＵＣ−ＭＳＣは、細胞の形態については、図７に示すように処方培地の方が、細胞が小ぶりかつ丸くなり状態がよかった。また、図８及び９に示す通り、処方培地で８日間培養したＵＣ−ＭＳＣ及びＡＤ−ＭＳＣは、推奨培地で培養したそれぞれの細胞と比較してＲＯＲ１陽性の割合が顕著の増加し、さらにＲＯＲ１の発現強度も高くなっていた。また、図８、図１０及び１１に示す通り、処方培地で培養したものの方が、ＣＤ１０５、ＣＤ７３の発現ピークがより高くなり、未分化性をより維持できていると判断された。

（試験２）
臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ−ＭＳＣ；Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｃｏｒｄ ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ Ｊｅｌｌｙ（ＨＭＳＣ−ＷＪ）、ＦＣ−００２０、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社）を、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社推奨培地にて馴化後、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社推奨培地又は処方培地に交換した（１Ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ；６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）。２〜３日おきに継代を行い、培地交換から１１日目の細胞について、ＦＡＣＳにて細胞表面マーカー（ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、１０５及びＣＤ１６６）の発現を解析した。結果を図１２、１３に示す。

図１２、１３に示すように、ＵＣ−ＭＳＣの表面マーカーについては、推奨培地で培養したものに比べて、処方培地で培養した方が、ＣＤ７３及びＣＤ１６６の発現が高くなり、ＣＤ２９のピークはより均一になった。処方培地で培養したものの方がＵＣ−ＭＳＣの未分化性を維持できていると判断された。

（試験３）細胞内のｍＲＮＡ発現
臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ−ＭＳＣ；Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｃｏｒｄ ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ Ｊｅｌｌｙ（ＨＭＳＣ−ＷＪ）、ＦＣ−００２０、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社；Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｃｏｒｄ ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ社；又はＵｍｂｉｌｉｃａｌ Ｃｏｒｄ ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ＡＴＣＣ社）を、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下、各社推奨培地にて馴化後、各社推奨培地又は処方培地に培地交換した（１Ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ；６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）。２〜３日おきに継代を行い培養した細胞を回収し、常法によりｍＲＮＡを分離した。具体的には、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（７４１０９、ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを単離し、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ ｋｉｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒ（ＦＳＱ−３０１、東洋紡社）を用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを鋳型にＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（ＲＲ０３９Ａ、ＴａＫａＲａ社）を用いて、ＲＯＲ１、ＭＴ１Ｘ、ＮＩＤ２、ＡＮＫＲＤ１、ＣＰＡ４、ＤＫＫ１のそれぞれの遺伝子についてのプライマーを使用することで、リアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現解析を行った。また、内在性コントロール遺伝子としてＧＡＰＤＨ及び１８ｓを使用して発現量補正を行った。結果を図１４に示す。

ＵＣ−ＭＳＣを処方培地で培養して得られた細胞においては、上記それぞれの推奨培地で培養した細胞と比較して、ＲＯＲ１、ＡＮＫＲＤ１、ＣＰＡ４、ＤＫＫ１の遺伝子発現が上昇していた（図１４）。なお、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社及びＡＴＣＣ社のＵＣ−ＭＳＣにおいては、ＭＴ１Ｘ、ＮＩＤ２の遺伝子発現も、上記４遺伝子の発現と同様に、処方培地で培養した方が、それぞれの推奨培地で培養した場合に比べて、遺伝子発現の上昇が見られた。

（試験４）細胞内のｍｉＲＮＡ発現量
臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ−ＭＳＣ；Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｃｏｒｄ ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ Ｊｅｌｌｙ（ＨＭＳＣ−ＷＪ）、ＦＣ−００２０、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社）を、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社推奨培地にて馴化後、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社推奨培地又は処方培地に培地交換した（１Ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ；６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）。２〜３日おきに継代を行い、培地交換から８日目の細胞を回収した。回収した細胞から上記試験７と同様の方法によりｍＲＮＡを調製し、ｍｉＲＮＡアレイ（ｍｉＳｃｒｉｐｔ ｍｉＲＮＡ ＰＣＲ ａｒｒａｙ；ＭＩＨＳ−１０５Ｚ及びＭＩＨＳ−１１７Ｚ（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ＆ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ及びＦｉｂｒｏｓｉｓ、ＱＩＡＧＥＮ社製）により、細胞中のｍｉＲＮＡ発現を解析した。結果の解析は、処方培地で培養して得られた細胞における各種ｍｉＲＮＡ発現量を推奨培地で培養して得られた細胞におけるそれぞれのｍｉＲＮＡ発現量で除した値（Ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ値）により行った。同様の実験を２回行った。

合計で約１５０種のｍｉＲＮＡについて解析した結果、処方培地で培養したＵＣ−ＭＳＣは、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８２−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０３−５ｐを発現していた。また、処方培地で培養したＵＣ−ＭＳＣは、推奨培地で培養したＵＣ−ＭＳＣと比較して発現が特に増加する傾向にあるｍｉＲＮＡとしては、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８２−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ−５ｐが挙げられ、発現が特に低下する傾向にあるｍｉＲＮＡとして、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、 ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０３−５ｐが挙げられた。

（試験５）培養上清へのサイトカイン分泌
（ＵＣ−ＭＳＣ；Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｃｏｒｄ ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ Ｊｅｌｌｙ（ＨＭＳＣ−ＷＪ）、ＦＣ−００２０、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社）を、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社推奨培地にて馴化後、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社推奨培地又は処方培地に交換した（１Ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ；６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）。それぞれの培地に変えてから８日間培養後に播種し直し、翌日０．２％ＦＢＳ含有ＤＭＡＭ／Ｆ１２に交換し、２日後（４８時間後）、培養上清を回収した。回収した培養上清中のＤｅｃｏｒｉｎ、Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ、ＭＭＰ１量をＥＬＩＳＡにて測定した。結果を図１５示す。

図１５に示す通り、処方培地で培養したＵＣ−ＭＳＣの培養上清中には、Ｄｅｃｏｒｉｎ、Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ、ＭＭＰ１が含まれており、推奨培地で培養したＵＣ−ＭＳＣの培養上清と比較して、Ｄｅｃｏｒｉｎの含有量が多く、逆にＯｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ及びＭＭＰ１の含有量は少なかった。

（試験６）酸化ストレス耐性の誘導
（ＵＣ−ＭＳＣ；Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｃｏｒｄ ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ Ｊｅｌｌｙ（ＨＭＳＣ−ＷＪ）、ＦＣ−００２０、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社；ＵＣ−ＭＳＣ；Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｃｏｒｄ ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ社；及びＵｍｂｉｌｉｃａｌ Ｃｏｒｄ ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ＡＴＣＣ社）を、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下、各社推奨培地にて馴化後、各社推奨培地又は処方培地に培地交換した（０．３〜１Ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ；６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）。２〜３日おきに継代を行った細胞に対してＲｏｔｅｎｏｎｅを各濃度で処理した（０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭ）。４８時間後にＨｏｅｃｈｅｓｔ３３３５８で染色し、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓで核数を計測した。結果を図１６に示す。

図１６に示す通り、ＵＣ−ＭＳＣはＲｏｔｅｎｏｎｅ処理濃度依存的に障害を受けて細胞数が減少するが、処方培地で培養することにより、Ｒｏｔｅｎｏｎｅ処理による障害に対する耐性ができ酸化ストレスを受けにくい状態となり、細胞数の減少が抑えられる可能性が示唆された。

（試験７）培養上清のバリア機能亢進作用
臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ−ＭＳＣ；Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｃｏｒｄ ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ Ｊｅｌｌｙ（ＨＭＳＣ−ＷＪ）、ＦＣ−００２０、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社）を、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社推奨培地にて馴化後、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社推奨培地又は処方培地に交換した（１Ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ；６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）。それぞれの培地に変えてから８日間培養後に、培地を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地、２ｍｌ／ｗｅｌｌに交換した。１日後に培養上清（Ｓｕｐ−１）を回収し、新しい培地を２ｍｌ／ｗｅｌｌ注ぎ、培養を継続した。さらに２４時間後に再び培養上清（Ｓｕｐ−２）を回収した。

ヒト結腸癌由来細胞株Ｃａｃｏ−２を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地で継代培養し、継代数３回目の細胞を本実験に用いた。Ｃａｃｏ−２を、トランスウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ ＃３４６０）に５ｘ１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、翌日、細胞がトランスウェルに付着していることを確認し、培地を除去した。上記臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清（Ｓｕｐ−１）を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地で１０倍希釈したものをトランスウェルに添加した。翌日、培地を除去し、上記臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清（Ｓｕｐ−２）を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地で４倍希釈したものを添加した。さらに、ＩＬ−１βを１．５ｎｇ／ｍｌとなるよう添加し、さらに２０時間培養した後、ＴＥＲ（経上皮電気抵抗値）を測定した。同じ条件で培養したＣａｃｏ−２の細胞数（吸光度）を細胞増殖アッセイキット（ＷＳＴ−８、＃３４３−０７６２３、同仁化社）により測定し、得られたＴＥＲを細胞数で除した値をＴＥＲ値（ＴＥＲ Ｖａｌｕｅ）として図１７に示した。

図１７に示すように、ＩＬ−１β処理によりＣａｃｏ−２細胞の細胞間バリア強度（ＴＥＲ値）の低下が起こる。それに対して、処方培地で培養したＵＣ−ＭＳＣの培養上清を添加すると、推奨培地で培養したＵＣ−ＭＳＣの培養上清を添加した場合と比較して、ＴＥＲ値がより回復した。この結果から、処方培地で培養したＲＯＲ１陽性のＵＣ−ＭＳＣの培養上清は、優れたバリア機能亢進効果を示すことがわかった。

（試験８）抗炎症効果
臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ−ＭＳＣ；Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｃｏｒｄ ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ Ｊｅｌｌｙ（ＨＭＳＣ−ＷＪ）、ＦＣ−００２０、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社）を、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社推奨培地にて馴化後、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社推奨培地又は処方培地に交換した（１Ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ；６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）。それぞれの培地に変えてから８日間培養後の細胞を以下の試験に用いた。

染色試薬Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭの０．５ｍＭ ＤＭＳＯ溶液を１０％ＦＣＳ ＤＭＥＭにて１，０００倍希釈したものを準備した。マウスマクロファージ細胞株Ｒａｗ２６４．７にＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭ含有培地を添加し５％ＣＯ_２、３７℃にて３時間の前培養を行ったのち、５ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで４８ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種した。

翌日、上記推奨培地又は処方培地で８日間培養したＵＣ−ＭＳＣを、５ｘ１０^３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように添加し、ＵＣ−ＭＳＣとＲａｗ２６４．７との共培養を開始した。共培養開始から４時間後にＬＰＳを１００ｎｇ／ｍＬとなるように添加した。１７−１８時間後、培養上清を回収した。培養上清中のＩＬ−６量をＥＬＩＳＡ（ｍＩＬ−６ＥＬＩＳＡ，Ｒ＆Ｄ Ｄｕｏｓｅｔ ＤＹ４０６−０５）により測定した。なお、培養上清回収後、予めＲａｗ２６４．７に取り込ませたＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭの蛍光値を測定し、割り戻すことでＩＬ−６量の細胞数補正を行った。結果を図１８に示す。

図１８に示すように、ＵＣ−ＭＳＣとの共培養により、マクロファージ細胞株Ｒａｗ２６４．７が産生する炎症性サイトカインであるＩＬ−６産生が抑制された。また、その抑制効果は、推奨培地で培養したＵＣ−ＭＳＣよりも、処方培地で培養したＲＯＲ１陽性のＵＣ−ＭＳＣの方が有意に高かった。

（試験９）骨分化能について
臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ−ＭＳＣ；Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｃｏｒｄ ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ Ｊｅｌｌｙ（ＨＭＳＣ−ＷＪ）、ＦＣ−００２０、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社）、及び脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＤ−ＭＳＣ；Ａｄｉｐｏｓｅ ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、ＦＣ−００３４、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社）を、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社推奨培地にて馴化後、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社推奨培地又は処方培地に交換した（１Ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ；６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）。２〜３日おきに継代を行い、継代数８の細胞を準備した。継代数８の両ＭＳＣを各２枚のＣｅｌｌ ＢＩＮＤ Ｔ−７５ ｆｌａｓｋに７０００ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２で播種し、両ＭＳＣ１枚は翌日に処方培地へ交換し、残り１枚は推奨培地のまま９０−１００％コンフルエントに達するまで培養を継続した。継代数９にて再度継代し、Ｔ−７５ ｆｌａｓｋ４枚ずつとなるようにまき直し、群分け後８日（継代数１０）の細胞を下記の分化試験に供した。
群分け後８日目に、各群ごとに細胞を回収し、クラボウ分化プロトコール推奨細胞密度にて、骨細胞分化用培地（ヒト間葉系幹細胞用 骨細胞分化用培地：ＯｓｔｅｏＬｉｆｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｍｅｄｉｕｍ （Ｌｉｆｅｌｉｎｅ， ＬＭ−００２３））を用いて、２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ （ｃｅｌｌｂｉｎｄ， ３３３７， Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種した。骨分化のための培養では、分化培養用播種から４８時間後に培地交換を行い、以後、２８日まで３−４日ごとに培地交換を行った。染色方法としては、播種後２１日目以降に、染色するｗｅｌｌをＰＢＳで１回洗浄した後、無水エタノールを添加し３０分間室温で置くことで細胞の固定を行った。無水エタノールを吸引し、クリーンベンチ内で約３０分間静置、乾燥させた。２％アリザリンレッド溶液を添加し、１５分間室温で静置した後、ＤＷ（蒸留水）で２回洗浄し、乾燥させた。染色写真は顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７０）を用いて撮影した。 アリザリンレッド染色の結果を図１９に示す。

図１９に示す通り、処方培地で培養したＵＣ−ＭＳＣ、ＡＤ−ＭＳＣは、推奨培地で培養した場合と比較して、骨への分化能が高くなることがわかった。

（試験１０）脂肪分化能について
分化実験に供する間葉系幹細胞の調製は試験９と同様の方法により行った。
群分け後８日目に、各群ごとに細胞を回収し、クラボウ分化プロトコール推奨細胞密度にて、分化培地｛ヒト間葉系幹細胞用 脂肪細胞分化用培地：ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ ＤｆＫｔ−１ （Ｌｉｆｅｌｉｎｅ， ＬＬ−００５０） ｏｒ ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ ＤｆＫｔ−２ （Ｌｉｆｅｌｉｎｅ ， ＬＬ−００５９）を用いて、２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ （ｃｅｌｌｂｉｎｄ， ３３３７， Ｃｏｒｎｉｎｇ）、に播種した。脂肪分化のための培養では、分化培養用播種から４８時間後に培地交換を行い、以後、２８日まで３−４日ごとに培地交換を行った。染色方法としては、播種後２１日目以降に、染色するｗｅｌｌをＰＢＳで１回洗浄した後、４％ （ｖ／ｖ） パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液で培地を少し残すようにしながら２回洗浄した。４％ （ｖ／ｖ） パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液を再度添加し、２０分間室温で静置した。その後、培地を少し残すようにしながら、ＤＷ（蒸留水）で２回洗浄し、１００％イソプロパノールで１回洗浄した。ＤＷ（蒸留水）で６０％に希釈したオイルレッドＯ染色原液を添加し、３０分間３７℃で静置後、完全に吸引した。その後６０％イソプロパノールを添加し、１０秒ほど待ち、ＤＷ（蒸留水）を加えた。ＤＷ（蒸留水）で２回洗浄後、顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７０）で写真撮影した。なお、ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ ＤｆＫｔ−１のＡｄｉｐｏＬｉｆｅ ＢＭ （１００ｍｌ）を１５ｍｌと８５ｍｌに分け、１５ｍｌにはＤｉｆＦａｃｔｏｒ １ （１ｍｌ）を加えてＡＤ−ＭＳＣ用の分化開始培地とし、８５ｍｌにはＤｉｆＦａｃｔｏｒ ２ （５ｍｌ）を加えてＡＤ−ＭＳＣ用の分化維持培地とした。また、ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ ＤｆＫｔ−２のＡｄｉｐｏＬｉｆｅ ＢＭ （１００ｍｌ） にＤｉｆＦａｃｔｏｒ ３ （１０ｍｌ）を加えてＵＣ−ＭＳＣ用の分化培地とした。 オイルレッドＯ染色の結果を図２０に示す。

図２０に示す通り、処方培地で培養したＵＣ−ＭＳＣは、推奨培地で培養したＵＣ−ＭＳＣと比較して、脂肪細胞への分化能が高いことがわかった。一方、ＡＤ−ＭＳＣでは、推奨培地で培養したＡＤ−ＭＳＣの方が脂肪細胞への分化能がやや高いことがわかった。

（試験１１）軟骨分化能について
分化実験に供する間葉系幹細胞の調製は試験９と同様の方法により行った。
群分け後８日目に、各群ごとに細胞を回収し、クラボウ分化プロトコール推奨細胞密度にて、分化培地（ヒト間葉系幹細胞用 軟骨細胞分化用培地：ＣｈｏｎｄｒｏＬｉｆｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｍｅｄｉｕｍ （Ｌｉｆｅｌｉｎｅ， ＬＭ−００２３））を用いて、２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ （３５２７， Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種した。軟骨分化のための培養では、マイクロマス法で播種を行った。具体的には、回収した細胞を各維持培地で１．６ ｘ １０^７ ｃｅｌｌｓ／ｍｌに濃縮し、２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ （３５２６， Ｃｏｒｎｉｎｇ）に５ｕｌずつ４ｄｒｏｐｓ／ｗｅｌｌで滴下し、２時間３７℃， ５％ＣＯ２で静置した後、５００ｕｌ／ｗｅｌｌで軟骨分化培地を添加した。その後、２１日まで３日ごとに培地交換を行った。染色方法としては、播種後２１日目以降に、染色するｗｅｌｌをＰＢＳで１回洗浄した後、１０％中性緩衝ホルマリン液を添加し、３０分間室温で置くことで細胞の固定を行った。その後、ＤＷ（蒸留水）で１回洗浄し、３％酢酸を添加し、１分間静置した。アルシアンブルー染色液を添加後２０分間室温で静置した後、染色液を吸引し、３％酢酸を添加して３分間待った。最後にＤＷ（蒸留水）で２回洗浄し、デジタルカメラで撮影した。

上記試験の結果、処方培地で培養した細胞と、推奨培地で培養した細胞の、軟骨への分化能の差異は明確ではなかったものの、処方培地で培養した場合には、細胞が小さな塊を作ったのに対して、推奨培地で培養した場合には扁平なままプレートに張り付いている細胞が多かった。

＜ＲＯＲ１陽性ＭＳＣの機能の検討＞
上記処方培地による培養によって得られる細胞集団から、ＲＯＲ１陽性ＭＳＣ（Ｆ ｐｏｓｉ）及びＲＯＲ１陰性ＭＳＣの細胞（Ｆ ｎｅｇａ）をソーティングにより分離し、必要に応じて、ＲＯＲ１陽性ＭＳＣとＲＯＲ１陰性ＭＳＣとを１：１の割合で混ぜた細胞（Ｆ ｍｉｘ）、ソーティングを行っていないＭＳＣ（Ｆ ソートなし）を用いて、それぞれの機能を検討した。以下、詳細に説明する。

臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ−ＭＳＣ；Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｃｏｒｄ ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ Ｊｅｌｌｙ（ＨＭＳＣ−ＷＪ）、ＦＣ−００２０、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社）を、上記処方培地にて培養して、ＲＯＲ１陽性ＭＳＣを多く含む細胞集団を得た。得られた細胞集団から、ＲＯＲ１陽性ＭＳＣ、及びＲＯＲ１陰性ＭＳＣをソーティングにより得た。具体的には、処方培地で培養して得られたＭＳＣにＰＥ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＲＯＲ１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ＃ ５６４４７４）又はＭｏｕｓｅ ＩｇＧ２ｂ ＰＥ， ｋ ｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ＃ ４０１２０８）をそれぞれ５ｕｌ／１００ｕｌの濃度で添加し、１時間反応させた。１％ＢＳＡ／Ｄ−ＰＢＳ溶液で細胞を３回洗浄し、１％ＢＳＡ／Ｄ−ＰＢＳで再懸濁してＳＯＮＹ ＳＨ８００Ｚにてセルソーティングを行った。各細胞群、並びに必要に応じて、ＲＯＲ１陽性ＭＳＣとＲＯＲ１陰性ＭＳＣとを１：１の割合で混ぜた細胞（Ｆ ｍｉｘ）、及びソーティングを行っていないＭＳＣ（Ｆ ソートなし）を、上記処方培地を用いて１〜３×１０^４／ｃｍ^２で６ｗｅｌｌプレート又は９６ｗｅｌｌプレートに播種し、以下の試験に用いた。

（細胞遊走試験）
上記にて得られたＲＯＲ１陽性ＭＳＣ（Ｆ ｐｏｓｉ）、ＲＯＲ１陰性ＭＳＣ（Ｆ ｎｅｇａ）のそれぞれを、０．２％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で４８時間培養し、培養上清を回収し、それぞれの培養上清の、癌細胞遊走抑制能を比較した。癌細胞としてはＢ１６マウスメラノーマ細胞を用いた。具体的には、サブコンフルエントまで培養したＢ１６マウスメラノーマ細胞を、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ液（Ｇｉｂｃｏ社）を用いて回収した。回収した細胞はＤＭＥＭ／Ｆ１２（０．２％ ＦＢＳ、１％ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ 含有）に懸濁し、２４ｗｅｌｌ ボイデンチャンバー（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、３４２２）の上部ウェルに約４．０×１０^４ｃｅｌｌｓずつ２００μＬの培地で播種した。下部ウェルには上記で作製した各ＭＳＣ培養上清を５５０μＬ加え、３７℃、５％炭酸ガス及び９５％空気の環境下で６時間培養した。その後の処理は、図１の実験と同様に行った。結果を図２１に示す。

図２１に示すとおり、ＲＯＲ１陽性ＭＳＣの培養上清は、陰性ＭＳＣの培養上清と比較して、癌細胞（Ｂ１６マウスメラノーマ細胞）の遊走抑制能が有意に高いことがわかった。したがって、ＲＯＲ１陽性ＭＳＣ及び／又はその培養上清は、癌細胞の浸潤、転移を抑制する優れた効果を奏すると考えられ、これらを含む医薬組成物は、癌の治療、予防に有効であることが示唆された。

（酸化ストレス耐性試験）
上記の方法によって得られたＲＯＲ１陽性ＭＳＣ（Ｆ ｐｏｓｉ）、ＲＯＲ１陰性ＭＳＣ（Ｆ ｎｅｇａ）、ＲＯＲ１陽性ＭＳＣとＲＯＲ１陰性ＭＳＣとを１：１の割合で混ぜた細胞（Ｆ ｍｉｘ）、ソーティングを行っていないＭＳＣ（Ｆ ソートなし）のそれぞれを、細胞密度を合わせて再播種し、２日後に各濃度のＨ_２Ｏ_２／ＨＢＳＳ溶液（０、１００、２００、４００μＭ）で１時間処理し、ＨＢＳＳ（＋）で２回洗浄後、元の培地に戻して２４時間後の細胞数を、ヘキスト３３３４２（Ｄｏｊｉｎｄｏ＃Ｈ３４２；１μｇ／ｍｌにて５〜１０分）染色後の蛍光画像解析により比較した。

図２２に示す通り、ＵＣ−ＭＳＣはＨ_２Ｏ_２／ＨＢＳＳ溶液処理により障害を受けて細胞数が減少するが、ＲＯＲ１陽性ＭＳＣ（Ｆ ｐｏｓｉ）は、ＲＯＲ１陰性ＭＳＣ（Ｆ ｎｅｇａ）と比較して、Ｈ_２Ｏ_２／ＨＢＳＳ溶液処理による障害に対する耐性が有意に高く、また、ＲＯＲ１陽性ＭＳＣとＲＯＲ１陰性ＭＳＣとを１：１の割合で混ぜた細胞（Ｆ ｍｉｘ）やソーティングを行っていないＭＳＣ（Ｆ ソートなし）と比較しても十分に高い傾向があり、酸化ストレスをより受けにくい状態となり、細胞数の減少が抑えられることが示唆された。

（ミトコンドリアトランスファー試験）
上記の方法によって得られたＲＯＲ１陽性ＭＳＣ（Ｆ ｐｏｓｉ）、ＲＯＲ１陰性ＭＳＣ（Ｆ ｎｅｇａ）、ＲＯＲ１陽性ＭＳＣとＲＯＲ１陰性ＭＳＣとを１：１の割合で混ぜた細胞（Ｆ ｍｉｘ）のそれぞれを、６ｗｅｌｌプレートに播種し、上述のミトコンドリアトランスファー試験と同様の方法を用いて、それぞれの細胞のミトコンドリアトラスファー能を比較した。受容側の細胞としては、以下の細胞を用いた。
・ＮＨＤＦ細胞（ヒト皮膚線維芽細胞）：Ｈｕｍａｎ Ｄｅｒｍａｌ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ（ＫＵＲＡＢＯ ＫＦ−４００９）；なお、ＮＨＤＦ細胞の培養には、ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ １１９９５−０６５）培地＋１０％ＦＣＳ＋１％ＡＢ＊を用いた
・ＢＳＭＣ−ＣＯＰＤ細胞（慢性閉塞性肺疾患のヒト気管支平滑筋細胞；Ｂｒｏｎｃｈｉａｌ Ｓｍｏｏｔｈ Ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅ（Ｌｏｎｚａ ００１９５２７４）；なお、ＢＳＭＣ−ＣＯＰＤ細胞の培養には、ＳｍＧＭＴＭ−２培地＋ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（Ｌｏｎｚａ ＣＣ−３１８２）＋１％Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｇｉｂｃｏ社）を用いた。
・ＨＣＭ（ヒト心筋細胞）：Ｈｕｍａｎ Ｃａｒｄｉａｃ Ｍｙｏｃｙｔｅｓ（ＨＣＭ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ））；なお、ＨＣＭの培養には、Ｍｙｏｃｙｔｅ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ，Ｃ−２２１７０），Ｍｙｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｐａｃｋ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ，Ｃ−３９２７０）を用いた。

図２３及び２４に示すとおり、ＢＳＭＣ−ＣＯＰＤ細胞（慢性閉塞性肺疾患のヒト気管支平滑筋細胞）、ＨＣＭ（ヒト心筋細胞）へのミトコンドリアトランスファー率は、ＲＯＲ１陽性ＭＳＣ（Ｆ ｐｏｓｉ）が、ＲＯＲ１陰性ＭＳＣ（Ｆ ｎｅｇａ）やＲＯＲ１陽性ＭＳＣとＲＯＲ１陰性ＭＳＣとを１：１の割合で混ぜた細胞（Ｆ ｍｉｘ）と比較して、顕著に高いことがわかった。また、データは示していないが、ＮＨＤＦ細胞（ヒト皮膚線維芽細胞）へのミトコンドリアトランスファー率は、ＲＯＲ１陽性ＭＳＣ（Ｆ ｐｏｓｉ）が、ＲＯＲ１陰性ＭＳＣ（Ｆ ｎｅｇａ）やＲＯＲ１陽性ＭＳＣとＲＯＲ１陰性ＭＳＣとを１：１の割合で混ぜた細胞（Ｆ ｍｉｘ）と比較して十分に高い傾向が見られた。

以上の試験結果から、ＲＯＲ１陽性ＭＳＣは、癌細胞の遊走抑制能に優れると共に、酸化ストレスに対しての耐性が強いことがわかった。また、ＲＯＲ１陽性ＭＳＣは、ヒト皮膚線維芽細胞であるＮＨＤＦ細胞、慢性閉塞性肺疾患のヒト気管支平滑筋細胞株であるＢＳＭＣ−ＣＯＰＤ細胞、ヒト心筋細胞株であるＨＣＭ細胞に対して、自身のミトコンドリアをトランスファーする率が顕著に高いことから、線維症、慢性閉塞性肺疾患、心疾患の治療又は予防のために有効であると考えられる。また、上記疾患以外にも、ミトコンドリア機能障害、ミトコンドリア活性の低下等が関連する疾患や老化等に伴う症状に対して、広く用いることができると考えられる。

Claims (15)

1. ＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞。
2. ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５及びＣＤ１６６陽性である、請求項１記載の間葉系幹細胞。
3. 臍帯又は脂肪由来である、請求項１又は２記載の間葉系幹細胞。
4. 請求項１から３のいずれか１項記載の間葉系幹細胞及び／又はその培養上清を含む、医薬組成物。
5. 医薬組成物がＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞を含む場合、ＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞の比率が、医薬組成物の含む間葉系幹細胞全体の７０％以上である、請求項４記載の医薬組成物。
6. 医薬組成物がＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞を含む場合、ＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞の比率が、医薬組成物の含む間葉系幹細胞全体の９０％以上である、請求項４又は５記載の医薬組成物。
7. 癌、前癌性症状、炎症性疾患、免疫疾患、神経変性疾患、代謝疾患、心血管疾患、脳血管障害、骨疾患、胃腸疾患、肺疾患、肝疾患及び腎疾患からなる群より選択される疾患の予防又は治療のために用いられる、請求項４から６のいずれか１項記載の医薬組成物。
8. 上皮若しくは内皮のバリア機能の低下に起因する疾患、又はＩＬ−１が関与する疾患の予防又は治療のために用いられる、請求項４から７のいずれか１項記載の医薬組成物。
9. バリア機能の低下が、上皮又は内皮細胞層におけるタイトジャンクション機能の低下に起因する、請求項８記載の医薬組成物。
10. 癌細胞の浸潤及び／又は転移を抑制するために用いられる、請求項４から６のいずれか１項記載の医薬組成物。
11. ミトコンドリアトランスファー剤である、請求項４から１０のいずれか１項記載の医薬組成物。
12. ＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞を誘導、濃縮又は分離選別する工程を含む、ＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞の調製方法。
13. ＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞を誘導、濃縮又は分離選別する工程を含む、疾患の予防又は治療のために用いられる医薬組成物の調製方法。
14. 上記疾患が、癌、前癌性症状、炎症性疾患、免疫疾患、神経変性疾患、代謝疾患、心血管疾患、脳血管障害、骨疾患、胃腸疾患、肺疾患、肝疾患及び腎疾患からなる群より選択される、請求項１３記載の調製方法。
15. ＲＯＲ１陽性の間葉系幹細胞を用いる、癌、前癌性症状、炎症性疾患、免疫疾患、神経変性疾患、代謝疾患、心血管疾患、脳血管障害、骨疾患、胃腸疾患、肺疾患、肝疾患及び腎疾患からなる群より選択される疾患の予防又は治療方法。