JPWO2016136986A1 - 間葉系幹細胞培養用培地、間葉系幹細胞の培養方法及び間葉系幹細胞 - Google Patents
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Abstract
Description
(2)PTEN阻害剤、p53阻害剤、p38阻害剤、Wntシグナル活性化剤及びROCK阻害剤からなる群より選択される少なくとも3種の成分と、動物細胞培養用基礎培地とを含有する、(1)記載の間葉系幹細胞培養用培地。
(3)PTEN阻害剤、p53阻害剤、p38阻害剤、Wntシグナル活性化剤及びROCK阻害剤を含有する、(1)又は(2)記載の間葉系幹細胞培養用培地。
(4)増殖因子及びステロイド性化合物からなる群より選択される少なくとも1種の成分をさらに含有する、(1)から(3)のいずれか記載の間葉系幹細胞培養用培地。
(5)前記PTEN阻害剤が、VO−OHPic、HOPic及びpVからなる群より選択される、(1)から(4)のいずれか記載の間葉系幹細胞培養用培地。
(6)前記p53阻害剤が、オルトバナジン酸ナトリウム、ピフィスリン−α及びMDM2タンパク質からなる群より選択される、(1)から(5)のいずれか記載の間葉系幹細胞培養用培地。
(7)前記p38阻害剤が、SB203580、SB202190、BIRB796、LY2228820、VX−702、PH−797804、TAK―715、VX−745、及びSkepinone−Lからなる群より選択される、(1)から(6)のいずれか記載の間葉系幹細胞培養用培地。
(8)前記Wntシグナル活性化剤が、LiCl又は補体分子C1qである、(1)から(7)のいずれか記載の間葉系幹細胞培養用培地。
(9)前記ROCK阻害剤が、Y−27632、K−115及び塩酸ファスジルからなる群より選択される、(1)から(8)のいずれか記載の間葉系幹細胞培養用培地。
(10)(1)から(9)のいずれか記載の間葉系幹細胞培養用培地を用いて、間葉系幹細胞を培養する、間葉系幹細胞の培養方法。
(11)(1)から(9)のいずれか記載の間葉系幹細胞培養用培地で培養された、CD29、CD73、CD90、CD105及びCD166陽性である間葉系幹細胞。
本発明の間葉系幹細胞培養用培地は、PTEN阻害剤、p53阻害剤、p38阻害剤、Wntシグナル活性化剤及びROCK阻害剤からなる群より選択される少なくとも2種の成分と、動物細胞培養用基礎培地とを含有する。本発明の培地は、これらの成分を含有することで、間葉系幹細胞の未分化性を長期に渡って維持しながら培養することができる。ここで「長期に渡って」とは、8日間以上であり、好ましくは15日間以上であり、より好ましくは30日間以上であり、さらに好ましくは50日間以上であり、特に好ましくは60日間以上である。また、本発明の培地は、間葉系幹細胞を長期に渡って良好な細胞状態を維持しながら、効率的に増殖させることができる。なお、細胞の状態が良好であるか否かは、細胞の形態、増殖速度等から当業者の技術常識に基づいて判断することができる。さらに予想もできなかった効果として、本発明の培地で培養することで、間葉系幹細胞の酸化ストレス耐性機能を向上させることができる。本発明の培地は、増殖因子及びステロイド性化合物からなる群より選択される少なくとも1種の成分をさらに含有することが好ましい。なお、本発明の培地は発明の効果を損なわない範囲でその他の成分を含有していてもよい。以下に、本発明の培地について説明する。
本発明においてPTEN阻害剤とは、PTEN(Phosphatase and Tensin Homolog Deleted from Chromosome 10)遺伝子、又はPTENタンパク質の作用を阻害する機能を有するすべての物質をいう。PTEN遺伝子は、染色体上の10q23.3に位置し、腫瘍抑制因子として同定されている。PTENタンパク質は広く全身の細胞に発現しており、イノシトールリン脂質であるフォスファチジルイノシトール 3,4,5−トリフォスフェイト(phosphatidylinositol 3,4,5−trisphosphate;PIP3)の脱リン酸化反応を触媒する酵素として知られている。PIP3は、PI3キナーゼ(PI3K)により細胞内で合成され、プロテインキナーゼB(PKB)/ AKTの活性化を引き起こす。PTENは、このPIP3の脱リン酸化反応を担い、フォスファチジルイノシトール 4,5−ビスフォスフェイト(phosphatidylinositol 4,5−bisphosphate;PIP2)に変換する作用があるとされている。従って、PTENは、PI3K/AKT情報伝達系を負に制御する。PTENの活性が阻害されると、細胞内にPIP3が蓄積し、PI3K/AKT情報伝達系が活性化する。
本発明においてp53阻害剤とは、p53遺伝子又はp53タンパク質の作用を阻害する機能を有するすべての物質をいう。p53遺伝子は、染色体上の17p13.1に位置し、腫瘍抑制遺伝子としても知られている。p53タンパク質は、転写因子として作用し、多様な生理活性を有する。
本発明においてp38阻害剤とは、p38遺伝子又はp38タンパク質の作用を阻害する機能を有するすべての物質をいう。p38は、セリン/スレオニンキナーゼであるMAPキナーゼ (Mitogen−Activated Protein Kinase)の1つである。MAPキナーゼは、外界刺激を伝達するシグナル分子、細胞増殖、分化、遺伝子発現、アポトーシス等への関与が明らかにされている。
本発明においてWntシグナル活性化剤とは、Wntシグナルを活性化させるすべての物質をいう。Wntは、分泌性の細胞間シグナル伝達タンパク質で、細胞内シグナル伝達に関与している。このシグナル伝達経路は細胞の増殖や分化、運動、初期胚発生時の体軸形成や器官形成等の機能を制御している。Wntシグナル経路では、Wntが細胞に作用することにより、いくつかの別々の活性化される細胞内シグナル伝達機構が含まれる。Wntシグナル経路にはβ−カテニンを介して遺伝子発現を制御するβ−カテニン経路、細胞の平面内極性を制御するPCP(planar cell polarity, 平面内細胞極性)経路、Ca2+の細胞内動員を促進するCa2+経路等が知られている。本明細書において、Wntシグナル活性化剤とは、そのいずれの経路を活性化するものであってもよい。
本発明においてROCK阻害剤とは、Rhoキナーゼ(ROCK)の作用を阻害するすべての物質をいう。Rhoキナーゼ(ROCK)は、低分子量GTP結合タンパク質であるRhoの標的タンパク質として同定されたセリン・スレオニンタンパク質リン酸化酵素である。Rhoキナーゼは、筋肉等の収縮、細胞増殖、細胞遊走及び他の遺伝子発現誘導等の生理機能に関与している。
本発明の幹細胞培養用培地における増殖因子としては、当業者に公知のいずれの増殖因子でも用いることができる。代表的には、トランスフォーミング成長因子(TGF)、上皮成長因子(EGF)等が挙げられるがこれに限定されず、インスリン様成長因子(IGF)、神経成長因子(NGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、血小板由来成長因子(PDGF)、エリスロポエチン(EPO)、トロンボポエチン(TPO)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF又はFGF2)、肝細胞増殖因子(HGF)等が挙げられる。さらにアルブミン、トランスフェリン、ラクトフェリン、フェツイン等も例示される。これらは単独で用いてもよいし、2種以上を組み合わせて用いることもできる。
本発明の幹細胞培養用培地におけるステロイド性化合物としては、当業者に公知のいずれのステロイド性化合物でも用いることができる。代表的には、エストラジオール、プロゲステロン、テストステロン、コルチゾン、コルチゾール、ハイドロコルチゾン等のステロイドホルモンを使用することができるが、これらに限定されない。これらは単独で用いてもよいし、2種以上を組み合わせて用いることもできる。
本発明における動物細胞培養用基礎培地とは、動物細胞の培養に必須の炭素源、窒素源及び無機塩等を含有させた培地をいう。ここで、動物細胞とは、哺乳類細胞、特にはヒト細胞を指す。本発明における動物細胞培養用基礎培地は、培養して得られる細胞やその培養上清を動物(ヒトを含む)の疾患の治療のために用いる可能性を考慮すると、できるだけ生物由来原料を含まない培地(例えば、無血清培地)であることが好ましい。動物細胞培養用基礎培地には、必要に応じて、微量栄養促進物質、前駆物質等の微量有効物質を配合してもよい。このような動物細胞培養用基礎培地としては、当業者に公知の動物細胞培養用培地を使用することができる。具体的には、イーグル培地のような最小必須培地(MEM)、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、最小必須培地α(MEM−α)、間葉系細胞基礎培地(MSCBM)、Ham’s F−12及びF−10培地、DMEM/F12培地、Williams培地E、RPMI−1640培地、MCDB培地、199培地、Fisher培地、Iscove改変ダルベッコ培地(IMDM)、McCoy改変培地等、これらの混合培地等が挙げられる。動物細胞培養培地として用いる場合には、特にはDMEM/F12培地が好ましく用いられるがこれに限定されない。
DMEM/F−12培地に、L−グルタミン、アスコルビン酸、ヒト組み換え型アルブミン、ウシ血清由来Fetuin、炭酸水素ナトリウム、HEPES、Lipid混合液、ITSE混合液、トランスフェリン、bFGF、プロゲステロン、ハイドロコルチゾン、VO−OHPic、Pifithrin−α(ピフィスリン−α)、SB203580を加えた培地;
DMEM/F−12培地に、L−グルタミン、アスコルビン酸、ヒト組み換え型アルブミン、ウシ血清由来Fetuin、炭酸水素ナトリウム、HEPES、Lipid混合液、ITSE混合液、トランスフェリン、bFGF、プロゲステロン、ハイドロコルチゾン、塩化リチウム及びY−27632を加えた培地;
DMEM/F−12培地に、L−グルタミン、アスコルビン酸、ヒト組み換え型アルブミン、ウシ血清由来Fetuin、炭酸水素ナトリウム、HEPES、Lipid混合液、ITSE混合液、トランスフェリン、bFGF、プロゲステロン、ハイドロコルチゾン、VO−OHPic、Pifithrin−α(ピフィスリン−α)、SB203580及びY−27632を加えた培地;
DMEM/F−12培地に、L−グルタミン、アスコルビン酸、ヒト組み換え型アルブミン、ウシ血清由来Fetuin、炭酸水素ナトリウム、HEPES、Lipid混合液、ITSE混合液、トランスフェリン、bFGF、プロゲステロン、ハイドロコルチゾン、VO−OHPic、Pifithrin−α(ピフィスリン−α)、SB203580及び塩化リチウムを加えた培地;
DMEM/F−12培地に、L−グルタミン、アスコルビン酸、ヒト組み換え型アルブミン、ウシ血清由来Fetuin、炭酸水素ナトリウム、HEPES、Lipid混合液、ITSE混合液、トランスフェリン、bFGF、プロゲステロン、ハイドロコルチゾン、VO−OHPic、SB203580、塩化リチウム及びY−27632を加えた培地;
DMEM/F−12培地に、L−グルタミン、アスコルビン酸、ヒト組み換え型アルブミン、ウシ血清由来Fetuin、炭酸水素ナトリウム、HEPES、Lipid混合液、ITSE混合液、トランスフェリン、bFGF、プロゲステロン、ハイドロコルチゾン、Pifithrin−α(ピフィスリン−α)、SB203580、塩化リチウム及びY−27632を加えた培地;
DMEM/F−12培地に、L−グルタミン、アスコルビン酸、ヒト組み換え型アルブミン、ウシ血清由来Fetuin、炭酸水素ナトリウム、HEPES、Lipid混合液、ITSE混合液、トランスフェリン、bFGF、プロゲステロン、ハイドロコルチゾン、VO−OHPic、Pifithrin−α(ピフィスリン−α)、塩化リチウム及びY−27632を加えた培地;
DMEM/F−12培地に、L−グルタミン、アスコルビン酸、ヒト組み換え型アルブミン、ウシ血清由来Fetuin、炭酸水素ナトリウム、HEPES、Lipid混合液、ITSE混合液、トランスフェリン、bFGF、プロゲステロン、ハイドロコルチゾンを含む基礎培地に、VO−OHPic及びPifithrin−α(ピフィスリン−α);又はVO−OHPic及びSB203580;又はVO−OHPic及び塩化リチウム;又はVO−OHPic及びY−27632;又はPifithrin−α(ピフィスリン−α)及びSB203580;又はPifithrin−α(ピフィスリン−α)及び塩化リチウム;又はPifithrin−α(ピフィスリン−α)及びY−27632;又はSB203580及び塩化リチウム;又はSB203580及びY−27632;又は塩化リチウム及びY−27632を加えた培地等が挙げられる。
本発明は、本発明の間葉系幹細胞培養用培地を用いて、間葉系幹細胞を培養する、間葉系幹細胞の培養方法も含む。本発明の培養方法は、本発明の間葉系幹細胞培養用培地を用いた培養方法であれば特に限定されず、従来と同様の方法が用いられる。通常、30℃〜37℃の温度、2%〜7%CO2環境下、5%〜21%O2環境下で行われる。また、間葉系幹細胞の継代の時期及び方法もそれぞれの間葉系幹細胞に適していれば特に限定されず、間葉系幹細胞の形態を観察しながら、従来と同様に行うことができる。
本発明は、本発明の間葉系幹細胞培養用培地で培養して得られる、CD29、CD73、CD90、CD105及びCD166陽性である間葉系幹細胞も含む。本発明の間葉系幹細胞培養用培地で培養して得られる間葉系幹細胞は、未分化性が維持されており、CD29、CD73、CD90、CD105及びCD166を強く発現している。また、本発明の間葉系幹細胞培養用培地で培養して得られる間葉系幹細胞は、バイアビリティが高く、状態が良好である。さらに、予想もできなかった効果として、本発明の間葉系幹細胞培養用培地で培養して得られる間葉系幹細胞は、酸化ストレスに対する耐性が高いことが挙げられる。そのため、本発明の間葉系幹細胞を医薬品として種々の疾患の治療に有効に用いることができる。
下記表1に示す基本の処方14−2−1培地(比較例1)を調製した。具体的には、DMEM/F12培地に下記表1に記載の成分を記載の濃度となるように添加した。
(試験1)
臍帯由来間葉系幹細胞(UC−MSC;Umbilical Cord derived Mesenchymal Stem Cells Wharton’s Jelly(HMSC−WJ)、FC−0020、LifeLine社)、及び脂肪由来間葉系幹細胞(AD−MSC;Adipose derived Mesenchymal Stem Cells、FC−0034、LifeLine社)を、37℃、5%CO2の条件下、LifeLine社推奨培地にて馴化した後、5,000cells/cm2の密度でCellBind Flaskに播種した。翌日、LifeLine社推奨培地又は実施例1の培地に培地交換した(1X105cells/well;6well plate)。3日後、それぞれ同様に播種し直し、さらに3日後(合計では6日後)、細胞数を計数した。同様にさらに2日間培養した(合計では8日間)細胞については形態と表面マーカーを解析した。8日目までの増殖率(播種した細胞が次の継代までに分裂した回数)を図2に示す。また、3日後、8日後の細胞写真をそれぞれ図1、図3に示す。さらに、8日後の細胞について、FACSにて細胞表面マーカー(脂肪由来間葉系幹細胞については、CD105及びCD73、臍帯由来間葉系幹細胞についてはCD105及びCD90)の発現を解析した結果は、図4及び5に示す。
臍帯由来間葉系幹細胞(UC−MSC;Umbilical Cord derived Mesenchymal Stem Cells Wharton’s Jelly(HMSC−WJ)、FC−0020、LifeLine社)を、37℃、5%CO2の条件下、LifeLine社推奨培地にて馴化後、LifeLine社推奨培地又は実施例1の培地に培地交換した(1X105cells/well;6well plate)。2〜3日おきに継代を行い、培地交換から11日目の細胞について、FACSにて細胞表面マーカー(CD29、CD73、CD90、105及びCD166)の発現を解析した。結果を図6に示す。
臍帯由来間葉系幹細胞(UC−MSC;Umbilical Cord derived Mesenchymal Stem Cells Wharton’s Jelly(HMSC−WJ)、FC−0020、LifeLine社)、及び脂肪由来間葉系幹細胞(AD−MSC;Adipose derived Mesenchymal Stem Cells、FC−0034、LifeLine社)を、37℃、5%CO2の条件下、LifeLine社推奨培地にて馴化した後、表2に記載の各培地中でそれぞれ5日間培養し(播種時70,000cells/well)、細胞数を計数し、結果を図7にPDLで示した。細胞写真は図8及び9に示す。さらに継代しながら培養を継続し、合計3週間、それぞれの培地中で培養した細胞の細胞表面マーカー(CD105)発現をFACSにて解析した。その結果を図10に示す。
実施例2及び3の培地は、AD−MSCに比べてUC−MSCの増殖を顕著に促進した。細胞の形態は、AD−MSC、UC−MSC共に良好であった。
実施例4の培地は、AD−MSCに比べてUC−MSCの増殖をより促進した。細胞の形態は、AD−MSC、UC−MSC共に良好であった。しかし、UC−MSCの表面マーカー(CD105)については、ピークの幅がやや広く細胞集団の均一性がやや低下した。
実施例5及び6の培地は、AD−MSCに比べてUC−MSCの増殖をより促進した。細胞の形態は、AD−MSCでやや細長くなったが、UC−MSCは良好であった。UC−MSCの表面マーカー(CD105)については、ピークもシャープであり、未分化で均一な集団を維持できたことがわかる。
実施例7の培地は、AD−MSCに比べてUC−MSCの増殖を顕著に促進した。細胞の形態は、AD−MSC、UC−MSC共に良好であった。UC−MSCの表面マーカー(CD105)については、ピークの幅がやや広くなる傾向が見られた。
実施例8の培地は、AD−MSCに比べてUC−MSCの増殖を顕著に促進した。細胞の形態は、AD−MSC、UC−MSC共に良好であった。UC−MSCの表面マーカー(CD105)については、ピークもシャープであり、未分化で均一な集団を維持できたことがわかる。
以上のように、PTEN阻害剤、p53阻害剤、p38阻害剤、Wntシグナル活性化剤及びROCK阻害剤のうちのいずれか4種類を含む培地(実施例4〜8)は、AD−MSC及びUC−MSCの両方の細胞の形態を良好な状態に維持しながら培養することができた。また、AD−MSCに比べてUC−MSCの増殖をより促進する傾向があった。さらに、上記5因子の全てを含む実施例1の培地とほぼ同程度にUC−MSCを良好な状態で維持できると共に、未分化性を維持したまま培養することができた。また、PTEN阻害剤、p53阻害剤及びp38阻害剤を含む実施例2の培地、Wntシグナル活性化剤及びROCK阻害剤を含む実施例3の培地も、AD−MSC、UC−MSCともに良好な形態を保ちながら、特にUC−MSCの増殖を促進する効果があった。
(UC−MSC;Umbilical Cord derived Mesenchymal Stem Cells Wharton’s Jelly(HMSC−WJ)、FC−0020、LifeLine社;UC−MSC;Umbilical Cord derived Mesenchymal Stem Cells ScienCell社;及びUmbilical Cord derived Mesenchymal Stem Cells ATCC社)を、37℃、5%CO2の条件下、各社推奨培地にて馴化後、各社推奨培地又は実施例1の培地に培地交換した(0.3〜1X105cells/well;6well plate)。2〜3日おきに継代を行った細胞に対してRotenoneを各濃度で処理した(0nM、100nM、200nM、500nM、1μM)。48時間後にHoechest33358で染色し、ImageXpressで核数を計測した。結果を図11に示す。
臍帯由来間葉系幹細胞(UC−MSC;Umbilical Cord derived Mesenchymal Stem Cells Wharton’s Jellyc−12971、Promo cell社)を、37℃、5%CO2の条件下、Promo cell社推奨培地にて馴化した後、Promo Media(c−39810 or c−28019、Promo cell社、表2の実施例1の培地で長期に渡って継代培養を続け、合計の細胞数を計数した結果を図12に示す。
(試験6)長期間培養2
臍帯由来間葉系幹細胞(UC−MSC;Umbilical Cord derived Mesenchymal Stem Cells Wharton’s Jelly(HMSC−WJ)、FC−0020、LifeLine社)を、37℃、5%CO2の条件下、LifeLine社推奨培地にて馴化した後、表2の実施例1の培地又はLifeLine社推奨培地で長期に渡って継代培養を続けた。合計の細胞数を計数した結果を図13に示す。
臍帯由来間葉系幹細胞(UC−MSC;Umbilical Cord derived Mesenchymal Stem Cells Wharton’s Jelly(HMSC−WJ)、FC−0020、LifeLine社)を、37℃、5%CO2の条件下、LifeLine社推奨培地にて馴化した後、表2の実施例1、4〜8の培地で8日間培養し、細胞増殖に対する効果を比較した。細胞増殖に対する効果の比較は、Hoechest33342で細胞を染色後、ImageXpressで撮影して細胞数を計数することにより行った。その結果を図15に示す。
臍帯由来間葉系幹細胞(UC−MSC;Umbilical Cord derived Mesenchymal Stem Cells Wharton’s Jelly(HMSC−WJ)、FC−0020、LifeLine社)を、37℃、5%CO2の条件下、LifeLine社推奨培地にて馴化した後、下記表3の実施例9〜18の培地及び、上記表2の実施例1の培地で5日間培養し、細胞増殖に対する効果を比較した。細胞増殖に対する効果の比較は、Hoechest33342で細胞を染色後、ImageXpressで撮影して細胞数を計数することにより行った(細胞数/0.36mm2)。その結果を図16に示す。
Claims (11)
- PTEN阻害剤、p53阻害剤、p38阻害剤、Wntシグナル活性化剤及びROCK阻害剤からなる群より選択される少なくとも2種の成分と、動物細胞培養用基礎培地とを含有する、間葉系幹細胞培養用培地。
- PTEN阻害剤、p53阻害剤、p38阻害剤、Wntシグナル活性化剤及びROCK阻害剤からなる群より選択される少なくとも3種の成分と、動物細胞培養用基礎培地とを含有する、請求項1記載の間葉系幹細胞培養用培地。
- 前記PTEN阻害剤、p53阻害剤、p38阻害剤、Wntシグナル活性化剤及びROCK阻害剤を含有する、請求項1又は2記載の間葉系幹細胞培養用培地。
- 増殖因子及びステロイド性化合物からなる群より選択される少なくとも1種の成分をさらに含有する、請求項1から3のいずれか1項記載の間葉系幹細胞培養用培地。
- PTEN阻害剤が、VO−OHPic、HOPic及びpVからなる群より選択される、請求項1から4のいずれか1項記載の間葉系幹細胞培養用培地。
- 前記p53阻害剤が、オルトバナジン酸ナトリウム、ピフィスリン−α及びMDM2タンパク質からなる群より選択される、請求項1から5のいずれか1項記載の間葉系幹細胞培養用培地。
- 前記p38阻害剤が、SB203580、SB202190、BIRB796、LY2228820、VX−702、PH−797804、TAK―715、VX−745、及びSkepinone−Lからなる群より選択される、請求項1から6のいずれか1項記載の間葉系幹細胞培養用培地。
- 前記Wntシグナル活性化剤が、LiCl又は補体分子C1qである、請求項1から7のいずれか1項記載の間葉系幹細胞培養用培地。
- 前記ROCK阻害剤が、Y−27632、K−115及び塩酸ファスジルからなる群より選択される、請求項1から8のいずれか1項記載の間葉系幹細胞培養用培地。
- 請求項1から9のいずれか1項記載の間葉系幹細胞培養用培地を用いて、間葉系幹細胞を培養する、間葉系幹細胞の培養方法。
- 請求項1から9のいずれか1項記載の間葉系幹細胞培養用培地で培養された、CD29、CD73、CD90、CD105及びCD166陽性である間葉系幹細胞。
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