CN110478368A - 脐带间充质干细胞条件培养基的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及脐带间充质干细胞条件培养基的用途，具体地，本发明涉及人脐带间充质干细胞条件培养基或由其制得的冻干粉对于卵巢损伤、卵巢衰老等的保护作用。

Description

脐带间充质干细胞条件培养基的用途

技术领域

本发明涉及脐带间充质干细胞条件培养基的用途，具体地，本发明涉及人脐带间充质干细胞条件培养基或由其制得的冻干粉对于卵巢损伤、卵巢衰老等的保护作用。

背景技术

干细胞是一类具有自我复制能力及多向分化潜能的未分化的细胞,具有再生人体各种组织器官的潜在功能，因此又被医学界称为“万能细胞”。多项研究证实干细胞在特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，不仅如此，干细胞经过连续传代培养和冷冻保存后仍能保存最初的多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于抵抗衰老、器官移植、疾病治疗以及免疫系统自身修复等方面。近年来，干细胞移植治疗卵巢功能不全已被认为是一项新的有效的治疗措施。骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞、羊膜间充质干细胞、脐带间充质干细胞等多种干细胞已被证明可以改善卵巢功能。

然而，直接使用干细胞治疗具有储存和运输不便以及免疫排斥方面的缺点。另外，干细胞容易分化成其它基质细胞，可能促进肿瘤细胞转移和刺激上皮-间质细胞转化。

间充质干细胞分泌的微囊泡和外泌体中含细胞因子、生长因子、miRNA、mRNAs等多种成分。这些因子可短期或长期参与细胞交流、细胞信号转导、细胞或组织代谢改变等生理过程中。体外培养间充质干细胞时，微囊泡及多种蛋白质直接分泌到培养基中，称为条件培养基(conditioned medium,CM)。目前尚没有将间充质干细胞的条件培养基用于治疗卵巢功能不全的报道。

发明内容

本发明的发明人出人意料地发现，间充质干细胞特别是人脐带间充质干细胞的条件培养基可用于改善卵巢功能，因而特别适合用于制备治疗卵巢功能不全的药物，由此完成了本发明。

本发明第一方面涉及脐带间充质干细胞的条件培养基用于制备改善卵巢功能的制剂的用途。

本发明第二方面涉及一种用于改善卵巢功能的药物组合物，其包含脐带间充质干细胞的条件培养基或其冻干粉和药学上可接受的载体。

本发明第三方面涉及一种改善卵巢功能的方法，所述方法包括给予有需要的受试者有效量的脐带间充质干细胞培养物的条件培养基或者含有脐带间充质干细胞的条件培养基的药物组合物或制剂的步骤。

以下对本发明的上述方面做详细描述。

在本说明书中，术语“脐带间充质干细胞(Umbilical Cord-derived MesenchymalStem Cells，UCMSCs)”是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，具有高效增殖和多向分化潜能，在特定条件下可向骨、软骨、神经和心肌等多种功能细胞分化。由于UCMSCs易于获得，来源广泛，且遗传背景稳定，已成为再生医学研究和应用的种子细胞之一。研究显示：移植到体内且定向分化的UCMSCs并不能弥补组织器官损伤所丢失的功能细胞，其对组织器官的修复作用主要归因于强大的外分泌功能，其可通过分泌多种细胞因子(如：TGF-β、IGF、FGF、VEGF、HGF等)及细胞间信息物质(如：外泌体和microRNAs等)调控细胞的增殖、分化和代谢等功能。

在本发明的实施方式中，“脐带间充质干细胞条件培养基(UCMSC-CM)”是指体外培养人脐带间充质干细胞时，微囊泡及多种蛋白质直接分泌到培养基中，由此形成的培养液。

在本发明的实施方案中，还包括制备上述条件培养基的方法，该方法包括以下步骤：

1)在适合培养脐带间充质干细胞的培养基中培养人脐带间充质干细胞；

2)当细胞汇合度达到约80％时将培养基弃去，以无菌PBS洗涤细胞；

3)将细胞接种在无血清培养基中，继续培养24小时；

4)通过离心除去细胞和细胞碎片，收集培养液，即得到脐带间充质干细胞条件培养基。

在本发明的方法中所使用的脐带间充质干细胞(UCMSC)可以是使用任何适当的方法从新生儿脐带血中分离的间充质干细胞。分离方法是本领域技术人员已知的。优选地，使用第3代UCMSC来制备条件培养基。因此，本发明所制备的条件培养液来自第4-6代UCMSC。

在本发明中，适合培养脐带间充质干细胞的培养基为本领域所公知的，例如选自MEM培养基、DMEM培养基和DMEM：F12培养基。在本发明的一个具体实施方案中，所述适合培养间充质干细胞的培养基为α-MEM培养基。本领域公知，MEM培养基的配方并不是固定不变的，根据不同的培养需求可能有不同的加减变化，例如可参考http://www.thermofisher.com/cn/zh/home.html中对相关产品的描述。在本发明的一个具体实施方案中，所述适合培养间充质干细胞的培养基为Thermo Fisher公司旗下的GBICO产品DMEM/F-12培养基。

在本发明的制备脐带间充质干细胞条件培养基的步骤3)中，将脐带间充质干细胞的培养基更换为无血清培养基，以避免包含于血清中的生长因子干扰和改变由来自脐带间充质干细胞分泌的特定的因子发挥的作用。在本发明的一个实施方案中，其中所述的无血清培养基是商业上可获得的，例如可以使用MSC SFM(Thermo Fisher)。

在本发明的优选实施方案中，在将培养基更换为无血清培养基时，优选进行浓缩操作，即加入的无血清培养基的量约为用于培养脐带间充质干细胞的有血清培养基的量的60％。例如，如果初始在100mm培养皿中的10ml培养基中来培养脐带间充质干细胞，则在将有血清培养基更换为无血清培养基时，加入约6ml无血清培养基。

为了从来自脐带间充质干细胞获得的条件培养基中除去细胞，可以使用任何已知的方法。例如，本发明可以使用适当的多孔性的过滤复合物过滤条件培养基以除去细胞组分。或者，可通过离心实现将条件培养基与细胞分离，并且导致细胞本身的沉降。因此，在本发明优选的实施方式中，通过过滤或离心或二者的组合进行本发明的条件培养基与细胞组分的分离。分离方法的选择是本领域技术人员已知的。

本发明提供了脐带间充质干细胞条件培养基用于制备改善卵巢功能的制剂的用途。

在本说明书中，术语“早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency,POI)”指女性在40岁以前出现卵巢功能减退，主要表现为月经异常(闭经、月经稀发或频发)、促性腺激素水平升高(FSH>25U/L)、雌激素水平波动性下降。其临床症状包括(1)月经稀发/闭经至少4个月，(2)两次相隔4周FSH水平升高(>25IU/L)。POI女性自然怀孕几率很低，骨质疏松、血脂异常及心血管病的发生风险升高，严重危害了患病女性的身心健康。

本发明人发现，脐带间充质干细胞条件培养基对卵巢损伤具有保护作用。由此，本发明提供了脐带间充质干细胞条件培养基的医学用途和包含其的药物组合物。

在本发明的一个实施方案中，其中所述的间充质干细胞条件培养基在冻干后制成冻干粉。在施用之前，可以将所述冻干粉溶解在溶剂中。

在本发明的一个实施方案中，其中所述溶剂可以为任何可以溶解上述冻干粉并且适合药用的溶剂。在发明的一个实施方案中，其中所述的药物组合物或制剂还含有药学上可接受的辅料，例如载体或赋形剂。

本发明还涉及药物组合物，其包含脐带间充质干细胞的条件培养基或其冻干粉和药学上可接受的载体。

在本发明的一个实施方案中，其中所述药物组合物用于改善卵巢功能，修复卵巢损伤，例如用于减少卵泡闭锁并保护生育力，减少卵巢细胞凋亡。

本发明还涉及本发明所述的组合物在制备用于改善卵巢功能和修复卵巢损伤，例如用于减少卵泡闭锁并保护生育力，减少卵巢细胞凋亡的药物中的用途。

在本发明中，所述的间充质干细胞来源于哺乳动物，优选来源于人。所述的间充质干细胞条件培养基可用于自体或异体，优选用于自体。

发明的有益效果

本发明的发明人通过实验证明，脐带间充质干细胞条件培养基可以有效修复卵巢损伤，例如用于减少卵泡闭锁并保护生育力，减少卵巢细胞凋亡。

本发明采用的是脐带间充质干细胞，其组织来源充足，受环境因素影响低，取材方便快捷，无需较大创伤，即可提取出大量脐带间充质干细胞。

本发明可以采用自体或异体的脐带间充质干细胞，无需担忧免疫排斥反应及炎症反应，产品稳定性及安全性较高。

附图说明

图1A.小鼠卵巢损伤模型下H&E染色结果图。Control为对照组；Cs为顺铂组。黑色箭头所示为始基卵泡。

图1B.P9小鼠卵巢中始基卵泡、初级卵泡和次级卵泡计数。Control为对照组；Cs为顺铂组。(n＝6)，***P<0.001。

图2A.P9小鼠卵巢H&E染色和DDX4免疫荧光结果图。绿色荧光为细胞质；黑色箭头指示始基卵泡。Control为对照组；Cs为顺铂组；CM为条件培养基组；Cs+CM为顺铂+条件培养基组。Scale bars:50μm。

图2B.P9小鼠体内卵巢中始基卵泡、初级卵泡和次级卵泡计数。Control为对照组；Cs为顺铂组；CM为条件培养基组；Cs+CM为顺铂+条件培养基组。(n＝4)，***P<0.001。

图2C.小鼠体内卵巢形态观察。Control为对照组；Cs为顺铂组；CM为条件培养基组；Cs+CM为顺铂+条件培养基组。

图2D.小鼠体内卵巢培养H&E染色结果图。Control为对照组；Cs为顺铂组；CM为条件培养基组；Cs+CM为顺铂+条件培养基组。

图2E.小鼠血清AMH检测结果。Control为对照组；Cs为顺铂组；CM为条件培养基组；Cs+CM为顺铂+条件培养基组。(n＝9)，*P<0.05。

图3A.小鼠卵巢体外培养H&E染色结果图。Control为对照组；CM为条件培养基组。Scale bars 20μm。

图3B.小鼠卵巢体外培养中始基卵泡、初级卵泡和次级卵泡计数。(n＝4)，*P<0.05。

图4A.小鼠卵巢体外培养6h时TUNEL凋亡染色结果图及凋亡细胞数量统计。Control为对照组；Cs为顺铂组；CM为条件培养基组；Cs+CM为顺铂+条件培养基组。Scalebars:20μm。*P<0.05。

图4B.小鼠卵巢体外培养12h时TUNEL凋亡染色结果图及凋亡细胞数量统计。Control为对照组；Cs为顺铂组；CM为条件培养基组；Cs+CM为顺铂+条件培养基组。Scalebars:20μm。*P<0.05。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。DMEM/F-12培养基购自Thermo Fisher公司旗下的Gbico品牌。所用的顺铂购自Sigma公司。

实施例1.UCMSC-CM的制备

UCMSC(第3代)由中科院动物研究所北京干细胞库提供和鉴定。将UCMSC接种在100mm培养皿中，加10ml UCMSC培养基(DMEM/F12,10％FBS,GlutaMAX,penicillin-streptomycin,4ng/ml basic FGF)中培养，当细胞融合度达到80％时，弃去培养基，无菌PBS洗3遍，每个100mm培养皿加入6ml无血清培养基(DMEM/F12)，将细胞置于37℃，5％CO2细胞培养箱中24小时，培养结束后将培养液收集并离心，1500rpm，离心5分钟去除细胞碎片，分装于1ml离心管中，存放于-80℃备用，收集的条件培养基UCMSC-CM来自第4-6代UCMSC。

实施例2.小鼠卵巢损伤模型的建立

出生5天(P5)的小鼠卵巢主要由原始卵泡和初级卵泡组成，而原始卵泡和初级卵泡对有毒试剂极其敏感，因此小鼠出生后5天是研究化疗药物诱导不成熟卵泡死亡机制的理想时间。对P5小鼠予以单次腹腔注射顺铂，顺铂注射剂量为5mg/kg体重，对照组小鼠注射等量生理盐水，注射顺铂或生理盐水后4天颈部脱臼处死小鼠，收集卵巢并进行固定包埋切片(图1A)。

结果：相比于对照组，顺铂处理组卵巢中原始卵泡明显减少(图1B)。因此，在接下来的小鼠体内实验中我们选用5mg/kg体重的顺铂剂量。

实施例3.UCMSC-CM在小鼠体内对顺铂所致卵巢损伤的保护作用

为探究人脐带间充质干细胞条件培养基对顺铂所致小鼠卵巢损伤的保护作用，出生5天(P5)的CD-1小鼠(购自斯贝福(北京)实验动物科技有限公司，母鼠喂养)80只，称量体重约2.8g。将P5小鼠分成四组，空白对照组：普通培养基连续腹腔注射4天；顺铂组：处理第一天予以5mg/kg体重的顺铂剂量单次腹腔注射，之后普通培养基连续腹腔注射3天；条件培养基组：条件培养基连续腹腔注射4天；顺铂+条件培养基组：处理第一天予以5mg/kg体重的顺铂剂量单次腹腔注射，之后条件培养基连续腹腔注射3天。

为观察条件培养基对顺铂所致小鼠卵巢损伤的短期保护作用，四天后颈部脱臼处死小鼠，收集各组小鼠卵巢进行H&E染色和DDX4免疫荧光染色(图2A)。

为进一步观察条件培养基对顺铂所致小鼠卵巢损伤的长期保护作用，于8周时颈部脱臼处死小鼠，收集各组小鼠卵巢和血清，进行H&E染色和AMH激素测定。

免疫组化过程：

免疫组化试剂盒购自中山金桥生物技术有限公司，具体操作如下：

1)将卵巢切片置于玻片架上，按下列步骤进行处理：

二甲苯10分钟×3次；

100％酒精5分钟×3次；

95％酒精5分钟×1次；

85％酒精5分钟×1次；

75％酒精5分钟×1次；

PBS 5分钟×3次；

2)抗原修复：将柠檬酸钠4.5ml和柠檬酸三钠20.5ml加入到225ml双蒸水中，混匀，放入微波炉中，高火5分钟沸腾修复液，待修复液刚停止沸腾时将切片放入，继续低火15-20分钟，结束后放于室温自然冷却，PBS洗3次，每次5分钟。

3)阻断内源性过氧化物酶：加入适量的内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育10分钟，之后用PBS洗3次，每次5分钟。

4)封闭：滴加适量的封闭用正常山羊血清工作液，室温孵育60分钟，孵育结

束后弃去血清，勿洗。

5)一抗：一抗按照抗体说明书用1×PBS进行稀释，根据组织大小滴加适量的一抗稀释液，4℃过夜或37℃60分钟，孵育结束后用PBS洗3次，每次5分钟。

6)二抗：滴加适量的生物素标记山羊抗兔IgG聚合物，室温孵育30分钟，之后用PBS洗3次，每次5分钟。

7)滴加适量的辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育10-15分钟，之后用PBS洗3次，每次5分钟。

8)显色：加入适量的新鲜配制的DAB显色液，在显微镜下观察，即使终止显色反应。

9)复染：用自来水冲洗玻片，苏木素染色液孵育2-3分钟，自来水冲洗10分钟，1％盐酸酒精分化2-3秒、0.1％氨水返蓝2分钟。

10)梯度脱水：75％酒精5分钟，85％酒精5分钟，95％酒精5分钟，100％酒精10分钟×3次。

11)透明：二甲苯10分钟×3次。

12)中性树脂封片，置于通风橱中晾干。

H&E染色过程：

1)将卵巢切片置于玻片架上，按下列步骤进行处理：

二甲苯10分钟×3次；

100％酒精5分钟×3次；

95％酒精5分钟×1次；

85％酒精5分钟×1次；

75％酒精5分钟×1次；

PBS 5分钟×3次；

2)将卵巢切片放入苏木精水溶液中染色5-10分钟。

3)自来水冲洗多余染色液，约10分钟。

4)分色、返蓝：1％盐酸酒精分化2-3秒，0.1％氨水返蓝2分钟。

5)伊红染色液染色2分钟。

6)梯度脱水：75％酒精5分钟，85％酒精5分钟，95％酒精5分钟，100％酒精10分钟×3次。

7)透明：二甲苯10分钟×3次。

8)中性树脂封片，置于通风橱中晾干。

免疫荧光过程：

1)将卵巢切片置于玻片架上，按下列步骤进行处理：

二甲苯10分钟×3次；

100％酒精5分钟×3次；

95％酒精5分钟×1次；

85％酒精5分钟×1次；

75％酒精5分钟×1次；

PBS 5分钟×3次；

2)抗原修复：将柠檬酸钠4.5ml和柠檬酸三钠20.5ml加入到225ml双蒸水中，混匀，放入微波炉中，高火5分钟沸腾修复液，待修复液刚停止沸腾时将切片放入，继续低火15-20分钟，结束后放于室温自然冷却，PBS洗3次，每次5分钟。

3)用石蜡笔圈出组织轮廓，并加适量0.2％Triton 100通透15-30分钟，PBS清洗3次，每次5分钟。

4)3％BSA室温封闭1小时，勿洗。

5)用3％BSA按抗体说明书稀释一抗，加适量一抗稀释液到组织上，4℃过夜。

6)PBS清洗3次，每次5分钟。

7)用PBS稀释FITC标记的二抗，终浓度为20μg/ml，室温孵育1小时。

8)PBS清洗3次，每次5分钟。

9)用PBS稀释DAPI，加适量DAPI稀释液到组织上，室温孵育15分钟。

10)PBS清洗3次，每次5分钟，封片后镜下观察。

AMH ELISA检测过程：

小鼠血清AMH检测使用CUSABIO试剂盒，采用竞争酶联免疫法检测AMH含量。具体操作如下：

1)将各种试剂移至室温，平衡30分钟。

2)将酶标板取出，设一个空白对照孔，加入相应标准品50μl，其余检测孔直接加待测样本50μl。

3)每孔加入酶结合物50μl(空白对照孔除外)，再按同样的顺序加入抗体50μl，充分混匀，贴上不干胶封片，37℃放置1小时。

4)洗板，将洗涤液注满各孔，静置30秒甩干，重复三次。

5)每孔加显色剂A液50μl，显色剂B液50μl，振荡混匀后37℃避光显色15分钟，每孔加终止液50μl。

6)用酶标仪在450nm波长处检测各孔OD值，在反应终止后10分钟内检测。

结果：与对照组相比，顺铂处理组小鼠卵巢中原始卵泡显著减少，而顺铂+条件培养基组小鼠卵巢中原始卵泡的减少明显低于顺铂组(图2B)。

从卵巢大体看，顺铂+条件培养基组小鼠卵巢小于空白对照组和条件培养基组，但明显比顺铂组小鼠卵巢大(图2C)。H&E染色结果显示顺铂组小鼠卵巢中生长卵泡明显少于顺铂+条件培养基组(图2D)，顺铂组小鼠的血清AMH水平也低于顺铂+条件培养基组(图2E)。

实施例4.UCMSC-CM在体外对顺铂所致小鼠卵巢损伤的保护作用

在小鼠体内研究人脐带间充质干细胞条件培养基对顺铂所致卵巢损伤的保护作用的同时，我们对体外培养小鼠卵巢展开了研究。

卵巢体外培养过程：

出生5天的CD-1小鼠，颈部脱臼处死后剪开腹部，用无菌眼科剪、眼科镊将卵巢小心取出，放入平衡好的卵巢分离培养液(L15培养基,10％FBS,penicillin-streptomycin)中，在体视显微镜下将卵巢周围组织去除干净，无菌PBS清洗三遍，放入普通培养基组(DMEM/F12,10％FBS,GlutaMAX,penicillin-streptomycin,ITS,N-acetyl-L-cysteine)和条件培养基组(实施例1制备的UCMSC-CM,10％FBS,GlutaMAX,penicillin-streptomycin,ITS,N-acetyl-L-cysteine)，两组分别给予0，2，4μg/ml顺铂处理，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中，培养4天，然后收集卵巢，进行石蜡切片和H&E染色。

卵巢石蜡切片过程：

1)组织固定：将卵巢用预冷PBS洗净，放于4％多聚甲醛中固定(固定时间依卵巢大小而定，8周小鼠卵巢4℃固定过夜，出生5天的小鼠卵巢4℃固定4小时)。

2)组织脱水：分别在30％、50％、70％、80％、90％、100％、100％酒精中各脱水1小时。

3)组织透明：卵巢在100％酒精/二甲苯(1:1)中透明10分钟，再放到二甲苯中透明(具体时间根据卵巢大小而定，8周小鼠卵巢透明10分钟，出生5天的小鼠卵巢透明5分钟)，以组织块完全透明为宜。

4)浸蜡：提前将二甲苯/石蜡(1:1)、石蜡放于65℃烤箱中融化，将透明的卵巢在二甲苯/石蜡(1:1)、石蜡中各浸蜡1小时。

5)包埋：在包埋盒底先铺上一定厚度的石蜡液体，置于热台，用镊子将组织放入，调整好方向，将包埋盒置于凉台，使底部略微凝固，继续浇上石蜡，放上切片托，放于冷台，直至整个蜡块成型，待石蜡彻底凝固后，将蜡块从包埋盒中取出。

6)组织切片：把刀片固定在刀片架上，将蜡块在切片机上夹紧，调整切片台位置，以5μm厚度切片，蜡片切成后将切片放入42℃水中，用载玻片捞起，45℃烤片过夜。

结果：当给予2μg/ml顺铂处理时，脐带间充质干细胞条件培养基可以在一定程度上保护原始卵泡，而当给予4μg/ml顺铂处理时，脐带间充质干细胞条件培养基则不能保护原始卵泡。因此，在后续的体外实验中我们选用2μg/ml顺铂浓度(图3A和B)。

实施例5.UCMSC-CM对体外培养小鼠卵巢细胞凋亡的影响

卵母细胞和颗粒细胞的凋亡都会导致卵泡闭锁，我们发现脐带间充质干细胞条件培养基可以减少卵泡闭锁，因此我们研究了人脐带间充质干细胞条件培养基对体外培养小鼠卵巢细胞凋亡的影响。将P5小鼠分成四组，分别为空白对照组、顺铂组、UCMSC-CM条件培养基组、顺铂+UCMSC-CM条件培养基组，顺铂处理剂量为2μg/ml。分别于培养6小时和12小时后收集卵巢，石蜡切片后进行TUNEL凋亡染色。

卵巢颗粒细胞的分离和培养过程：

给21日龄的CD-1小鼠腹腔注射5IU的PMSG，48小时后颈椎脱臼处死小鼠，75％酒精消毒两遍，在腹部做倒T形切口，暴露腹腔内容物，拨开肠管，找到双角子宫，顺着子宫找到双侧卵巢，游离并摘除卵巢，将卵巢放入M199培养基中，在体视显微镜下用26G针头刺破卵泡，收集卵泡液，用枪头轻柔反复吹打，用40μm筛网过滤，离心收集沉淀，1500rpm，5分钟，向沉淀中加入适量PBS重悬沉淀，重复2-3次，然后用颗粒细胞培养液重悬细胞放入培养皿中，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中。

TUNEL检测过程：

TUNEL检测试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司，具体操作如下：

1)石蜡组织切片脱蜡水化过程同免疫组化和免疫荧光操作。

2)PBS清洗切片，用石蜡笔小心圈出待检测样品轮廓。

3)按1:100的比例，用PBS稀释2mg/ml的蛋白酶K溶液，使其终浓度为20μg/ml，每个样本上滴加适量20μg/ml的蛋白酶K溶液，使溶液覆盖全部样本区域，室温孵育20分钟。

4)用PBS洗样本2-3次。

5)阳性对照的处理：按1：10的比例用去离子水稀释10×DNase I Buffer，滴加适量的1×DNase I Buffer到以通透的样本上，室温孵育5分钟，向1×DNase I Buffer中加入DNase I(1U/μl)，使其终浓度为10U/ml。弃去样本上的1×DNase I Buffer，加入适量的含10U/ml DNase I的缓冲液，室温孵育10分钟。弃去含DNase I的缓冲液，将组织切片在装有去离子水的染色缸中彻底洗3-4次。

6)标价及检测：按1：5的比例用去离子水稀释5×Equilibration Buffer，滴加适量的1×Equilibration Buffer覆盖待检样品区域，室温孵育30分钟，平衡细胞的同时冰上解冻BrightRed Labeling Mix，参照表4配制用于所有样本的TdT孵育缓冲液。

7)吸去组织上的1×Equilibration Buffer，加入适量的TdT孵育缓冲液。

8)用封口膜覆盖组织，置于湿盒中，37℃孵育60分钟，避免光照。

9)移除封口膜，将切片置于PBS溶液中洗3次，每次5分钟。

10)用PBS稀释DAPI，加适量DAPI稀释液到组织上，室温孵育15分钟。

11)PBS清洗3次，每次5分钟，封片后镜下观察。

结果：TUNEL结果显示经顺铂处理后，凋亡细胞明显增多，顺铂组的凋亡细胞数目显著多于顺铂+条件培养基组，体外培养6小时时凋亡的细胞主要是颗粒细胞，凋亡细胞在6小时到12小时之间显著增加，体外培养12小时时颗粒细胞和卵母细胞凋亡均明显增多(图4A和B)。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (13)

1.脐带间充质干细胞条件培养基用于制备改善卵巢功能或修复卵巢损伤的制剂的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述制剂用于减少卵泡闭锁，保护生育力，和/或减少卵巢细胞凋亡。

3.根据权利要求1所述的用途，其中所述卵巢损伤是“早发性卵巢功能不全(prematureovarian insufficiency,POI)。

4.用于改善卵巢功能或修复卵巢损伤的药物组合物，其包含脐带间充质干细胞条件培养基和药学上可接受的载体。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其中改善卵巢功能包括减少卵泡闭锁，保护生育力，和/或减少卵巢细胞凋亡。

6.根据权利要求4所述的药物组合物，其中所述卵巢损伤是“早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency,POI)。

7.根据权利要求4所述的药物组合物，其中所述脐带间充质干细胞是冻干粉的形式。

8.根据权利要求1-3任一项所述的用途或权利要求4-7任一项所述的药物组合物，其中所述的间充质干细胞来源于哺乳动物，优选来源于人。

9.制备间充质干细胞条件培养基的方法，其包括以下步骤：

1)在适合培养脐带间充质干细胞的培养基中培养人脐带间充质干细胞；

2)当细胞汇合度达到约80％时将培养基弃去，以无菌PBS洗涤细胞；

3)将细胞接种在无血清培养基中，继续培养24小时；

4)通过离心除去细胞和细胞碎片，收集培养液，即得到脐带间充质干细胞条件培养基。

10.根据权利要求9所述的方法，其中使用从新生儿脐带血中分离并培养的第3代UCMSC来制备条件培养基。

11.根据权利要求9所述的方法，其中所述的适合培养脐带间充质干细胞的培养基选自添加了血清的MEM培养基、DMEM培养基和DMEM/F12培养基。

12.根据权利要求9所述的方法，其中所述的无血清培养基选自DMEM/F12和MSC SFM。

13.根据权利要求9所述的方法，其中在步骤3)中，优选进行浓缩操作，即加入的无血清培养基的量约为步骤1)中用于培养脐带间充质干细胞的有血清培养基的量的60％。