CN109517791A

CN109517791A - 强化自噬脐带间充质干细胞条件培养基的制备及在血管生成中的应用

Info

Publication number: CN109517791A
Application number: CN201811543842.6A
Authority: CN
Inventors: 王现伟; 王文亚; 李晓; 张帆; 殷国田; 张芬熙; 崔朝初
Original assignee: Xinxiang Medical University
Current assignee: Xinxiang Medical University
Priority date: 2018-12-17
Filing date: 2018-12-17
Publication date: 2019-03-26
Anticipated expiration: 2038-12-17
Also published as: CN109517791B

Abstract

本发明公开了一种强化自噬的脐带间充质干细胞（UCMSCs）条件培养基的制备及应用，属于间充质干细胞应用技术领域。本发明利用雷帕霉素诱导UCMSCs自噬，而后制备强化自噬的UCMSCs条件培养基，并通过脐静脉内皮细胞成管实验筛选促血管生成效果最好的条件培养基，通过体内外实验比较强化自噬的UCMSCs条件培养基与未诱导自噬的UCMSCs条件培养基的促血管生成效应。实验结果表明：与对照组相比，各组条件培养基均具有促血管生成效应，其中以100nM雷帕霉素强化自噬的UCMSCs条件培养基促血管生成效应最为明显，其效果明显优于未诱导自噬UCMSCs条件培养基。本发明的制备工艺过程简单且成本低廉，实验结果表明制得的强化自噬的UCMSCs条件培养基可有效促进体内外新生血管的生成。

Description

强化自噬脐带间充质干细胞条件培养基的制备及在血管生成中的应用

技术领域

本发明属于间充质干细胞应用技术领域，具体涉及强化自噬的人脐带间充质干细胞条件培养基的制备及在血管生成中的应用。

背景技术

脐带间充质干细胞（Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells，UCMSCs）是存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，具有高效增殖和多向分化潜能，在特定条件下可向骨、软骨、神经和心肌等多种功能细胞分化。由于UCMSCs易于获得，来源广泛，且遗传背景稳定，已成为再生医学研究和应用的种子细胞之一。研究显示：移植到体内且定向分化的UCMSCs并不能弥补组织器官损伤所丢失的功能细胞，其对组织器官的修复作用主要归因于强大的外分泌功能，其可通过分泌多种细胞因子（如：TGF-β、IGF、FGF、VEGF、HGF等）及细胞间信息物质（如：外泌体和microRNAs等）调控细胞的增殖、分化和代谢等功能。

血管生成是组织器官损伤后修复的前体。损伤的组织器官内血管生成的速度和数量决定创面愈合和组织器官修复的效果。已有文献报道：培养UCMSCs的条件培养基中可检测出促血管生长因子VEGF-A，但是这种条件培养基仅仅能促进血管内皮细胞增殖，而促成管效应较弱，这严重阻碍UCMSCs条件培养基的应用前景。当前，有部分课题组尝试通过基因修饰技术改善UCMSCs的外分泌功能而提高UCMSCs条件培养基的促血管生成效应以及其在它方面应用的效率。但是，采用基因修饰技术提高UCMSCs条件培养基的应用效率存在成本高和操作难等技术问题，且在未来应用上也受伦理学限制。我们认为：通过改善UCMSCs自身生理活性和代谢功能也是有效提高其外分泌功能的潜在途径。

自噬（autophagy）是维持细胞稳态的一个重要生理过程，其在细胞代谢和功能发挥中起关键作用。研究表明：自噬可让衰老的造血干细胞年轻化，并促进造血干细胞代谢。也有研究表明：诱导自噬可增强牙周膜干细胞的外分泌效应（包括：炎症因子、细胞因子和血管生成素等）。但是，目前并未见有强化自噬的UCMSCs条件培养基制备的报道或应用实例，其在体内外对血管生成的影响也不清楚。

发明内容

制备一种成本低廉的强化自噬的UCMSCs条件培养基，并结合体内外实验筛选出高效促进血管生成的优化条件培养基，提高UCMSCs条件培养基的应用效率和扩宽应用范围。

本发明所采取的技术方案如下：

（1）制备强化自噬的UCMSCs条件培养基：将UCMSCs接种于培养瓶中，待其汇合至70%时，在37℃、5% CO₂饱和湿度的培养箱中用含有不同剂量（0nM、100nM、1μM、10μM）雷帕霉素的培养基孵育细胞6小时，弃去上清；PBS缓冲液漂洗细胞3次，然后加入DMEM培养基在37℃、5%CO₂饱和湿度的培养箱中孵育24小时，收集上清。将收集的条件培养基储存于-80冰箱待用。DMEM完全培养基的组成：10% FBS、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素。自噬鉴定结果显示：100nM、1μM和10μM雷帕霉素均可增强UCMSCs自噬，且具有剂量效应。

（2）促血管效应优化条件培养基的筛选：利用上述条件培养基预培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）24小时；消化后，将上述细胞（1×10⁴/孔）接种于Matrigel预处理的96孔板中，用不同的条件培养基再培养3小时。3小时后显微镜下观察HUVECs成管状态并拍照，Image J软件分析各组细胞的成管图像数据。结果显示：与对照组（未预培养干细胞的新鲜基础培养基）相比，未经雷帕霉素处理的（即：0nM组）UCMSCs条件培养和经100nM、1μM和10μM雷帕霉素诱导培养的UCMSCs条件培养基均可促进HUVECs 成管；其中以100nM雷帕霉素诱导UCMSCs自噬后的条件培养基促血管生成效应最为明显，设为优化条件培养基。

（3）动物实验验证优化条件培养基体内促血管成长效应：分别向各组小鼠皮下注射混有HUVECs（10⁵）Matrigel 200μL，每天向Matrigel周围分别注射未经雷帕霉素（0nM组）诱导UCMSCs自噬的和经100nM雷帕霉素强化自噬的UCMSCs条件培养基；1周后HE及免疫荧光分析各组动物Matrigel内血管生成状况。结果显示：经100nM雷帕霉素增强自噬的UCMSCs条件培养基在体内的促血管效应也明显优于未诱导自噬的UCMSCs条件培养基。此外，在小鼠皮下注射未混有HUVECs的Matrigel，连续注射优化条件培养基也可明显促进血管生成，且优于未诱导自噬的UCMSCs条件培养基。

本发明所述的强化自噬UCMSCs的条件培养基在体内外均可促进新生血管生成，其促血管生成效应明显优于未经诱导自噬的UCMSCs条件培养基。

本发明的制备工艺过程简单且成本低廉，实验结果表明制得的强化自噬人脐带间充质干细胞的条件培养基在体内外可有效促进血管生成。

附图说明

图1：不同浓度（0nM、100nM、1μM、10μM）雷帕霉素诱导后UCMSCs自噬状态，免疫荧光指示自噬标记分子LC3B的表达。

图2A：对照组（新鲜基础培养基）、未强化自噬UCMSCs的条件培养基（0nM组）和经100nM、1μM和10μM雷帕霉素强化自噬后的UCMSCs条件培养基对HUVECs体外血管生成的影响；图2B：上述各组成管图像的统计学分析结果。

图3A1和图3A2：小鼠皮下注射混有HUVECs的Matrigel，并每天注射未诱导自噬（0nM）和经100nM强化自噬UCMSCs的条件培养基1周，HE染色检测Matrigel 内血管生成的效果；图3B1-3B3和图3B4-3B6：小鼠皮下注射混有HUVECs的Matrigel，并每天注射未诱导自噬（0nM）和经100nM强化自噬UCMSCs的条件培养基1周，免疫荧光检测Matrigel 中内皮细胞标记分子CD31的表达和微血管生成状态。

图4A1和4A2：小鼠皮下注射未混有HUVECs的Matrigel，并每天注射未诱导自噬（0nM）和经100nM强化自噬UCMSCs的条件培养基，HE染色检测 Matrigel 内血管生成的效果；图4B1-4B3和图4B4-4B6：小鼠皮下注射未混有HUVECs的Matrigel，并每天注射未强化自噬（0nM）和经100nM强化自噬的条件培养基1周，免疫荧光检测Matrigel 中内皮细胞标记分子CD31的表达和微血管生成状态。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。

实施例

1、UCMSCs的获取与培养

脐带间充质干细胞（UCMSCs）由健康足月分娩孕妇的脐带分离，由河南省干细胞与生物治疗工程研究中心提供。复苏第2代UCMSCs，使用DMEM完全培养基（含10% FBS、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素），放于37℃、5% CO₂饱和湿度的培养箱中培养。24小时后首次换液，以后每3天换液1次，待细胞生长至90%左右汇合时，用0.25%胰蛋白酶（Amrescao公司）消化细胞，按1:2消化传代培养，倒置显微镜观察细胞生长形态。

2、UCMSCs自噬的诱导培养及自噬水平鉴定

将UCMSCs接种于24孔培养板，待细胞生长至70%左右汇合时，分别用含有不同浓度（0nM、100nM、1μM、10μM）雷帕霉素的完全培养基在37℃、5% CO₂饱和湿度的培养箱中孵育6小时；弃去上清，PBS缓冲液漂洗3次/5分钟；4%多聚甲醛固定细胞20分钟，PBS缓冲液漂洗3次/5分钟；0.3% Triton X-100透膜15分钟，PBS缓冲液漂洗3次/5分钟；山羊血清室温封闭40分钟，然后向细胞滴加兔抗人LC3B抗体（1:200稀释），4℃孵育过夜；PBS缓冲液漂洗3次/5分钟，然后添加荧光素Cy3标记的山羊抗兔二抗IgM（1:500稀释），室温避光孵育1小时；PBS缓冲液漂洗3次/5分钟；5mg/L DAPI室温孵育10分钟，PBS漂洗3次/5分钟；滴加荧光防淬灭剂，置于倒置荧光显微镜观察拍照。阴性对照为PBS代替一抗工作液，其余步骤相同。

自噬鉴定结果显示：100nM、1μM和10μM雷帕霉素均可增强UCMSCs自噬，且具有剂量依赖效应。

3、制备强化自噬的UCMSCs条件培养基

将UCMSCs接种于培养瓶中，待其生长至70%汇合时，用含有不同剂量雷帕霉素（0nM、100nM、1μM、10μM）的培养基在37℃、5% CO₂饱和湿度的培养箱中孵育细胞6小时，弃去上清；PBS缓冲液漂洗细胞3次，然后加入DMEM完全培养基在37℃、5% CO₂饱和湿度的培养箱中孵育24小时，收集上清。将收集到的条件培养基储存于-80冰箱待用。DMEM完全培养基的成分：10% FBS、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素。

4、HUVECs的培养

人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs）购于中国科学院昆明细胞库。复苏第3代HUVECs，使用DMEM细胞完全培养基（10% FBS、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素），放于37℃、5% CO₂饱和湿度的培养箱中培养。24小时后首次换液，以后每3天换液1次，待细胞生长至90%左右汇合时，用0.25%胰蛋白酶（Amrescao公司）消化细胞，按1:2消化传代培养，倒置显微镜观察细胞生长形态。

5、促血管效应优化条件培养基的筛选

利用上述条件培养基预培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）24小时，消化后将上述细胞（1×10⁴/孔）接种于Matrigel预处理的96孔板中，应用不同的条件培养基再培养3小时。 3小时后显微镜下观察细胞成管效果并拍照，Image J软件分析各组细胞的成管状态。结果显示：与对照组（未培养干细胞的基础培养基）相比，各组条件培养｛未经雷帕霉素诱导（0nM组）和经100nM、1μM和10μM雷帕霉素强化自噬UCMSCs的条件培养基｝均可促进HUVECs 成管，其中以100nM雷帕霉素诱导自噬UCMSCs的条件培养基促血管生成效应最为明显。

6、动物实验验证优化条件培养基体内促血管生成效应

分别向各组小鼠皮下注射混有HUVECs（10⁵）Matrigel 200μL，每天分别向小鼠皮下（Matrigel周围）注射两种未经雷帕霉素诱导（0nM组）和经100nM雷帕霉素强化自噬UCMSCs的条件培养基；1周后HE及免疫荧光分析各组动物Matrigel内血管生成状况。结果显示：经100nM雷帕霉素强化自噬UCMSCs的条件培养基体内促血管效应也明显优于未经雷帕霉素诱导的UCMSCs条件培养基。此外，在小鼠皮下注射未混有HUVECs的Matrigel，连续注射UCMSCs自噬优化后的条件培养基也可明显促进血管生成，且优于未诱导自噬UCMSCs的条件培养基。

以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。

Claims

1.强化自噬的人脐带间充质干细胞条件培养基的制备方法，其特征在于具体步骤为：将UCMSCs接种于培养瓶中，待其汇合至70%时，用含有不同浓度雷帕霉素的细胞培养基在37℃、体积分数5% CO₂饱和湿度的培养箱中孵育6小时；弃去上清，PBS缓冲液漂洗3次，然后加入DMEM完全培养基在37℃、体积分数5% CO₂饱和湿度的培养箱中孵育24小时，收集上清，-80℃冰箱待用，其中DMEM完全培养基的组成为10wt% FBS、100U/mL青霉素和100 U /mL链霉素。

2.根据权利要求1所述的强化自噬的人脐带间充质干细胞条件培养基的制备方法，其特征在于：所述含有雷帕霉素的细胞完全培养基中雷帕霉素的摩尔浓度为100nM。

3.根据权利要求1或2所述的方法制得的强化自噬的人脐带间充质干细胞条件培养基在制备促进血管生长药物中的应用。