CN105106240A - 一种新型干细胞制剂及其在血管介入治疗脑卒中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型干细胞制剂及其在血管介入治疗脑卒中的用途，并且提供了所述干细胞制剂中干细胞的制备方法和步骤，及其在用于制备治疗脑卒中患者的药物中的用途。本发明新型干细胞制剂移植后取得了优良效果，并且制备成本低廉，得到的细胞容易大量扩增，为脑卒中等神经系统疾病的治疗开辟了新的天地，为脑卒中患者带来了福音。该制剂的干细胞具有较高的分化程度，在血管介入治疗脑卒中时能促进病人神经功能恢复，提高细胞定植率，并且易于制备，便于应用，疗效较同类药物有明显提升。
Description
技术领域
本发明属于生物技术与再生医学领域，尤其涉及一种新型干细胞制剂及其在血管介入治疗脑卒中的用途。
背景技术
脑卒中是一种突然起病的脑血液循环障碍性疾病，是全球第二位致死原因和首位致残原因，约一半左右的幸存者永久残疾。中国疾病预防控制中心数据显示脑卒中也是我国首位致残原因和致死原因，我国脑卒中病人700多万，发病率每年上升8.7%，每年约有160万人死于脑卒中，死亡率为157/10万人。与其他国家相似，缺血性脑卒中是我国最常见的脑卒中类型，约占所有脑卒中的43-79%。因此脑卒中是现在以及将来很长一段时间内人类必须面对的重大公共卫生问题之一。
多数研究认为，脑卒中患者的救治需要快速恢复脑血流、抢救缺血脑组织，迄今唯一有效的治疗方法是血管再通。对于前循环大血管闭塞所致的缺血性卒中患者，采用新一代支架样取栓装置为主的多模式再通术的疗效优于标准的药物治疗（包括静脉溶栓）。此循证医学证据源于欧美澳等国家临床数据，而作为脑卒中已成为第一位致死和致残性疾病的中国却是旁观者。目前，关于急性缺血性脑卒中诊治方面的工作刚刚迎来春天，还有很多工作值得去做。研究发现脑组织如果长时间严重缺血缺氧，即使在后期恢复脑血流，仍会对脑组织造成不可逆转的损伤。因此，当前仍迫切需要研究针对缺血缺氧和（或）再灌注所致病理生理学事件的治疗策略。
近年来国内外多例研究发现，干细胞移植对缺血性脑卒中起到非常积极的作用。在动物、离体实验以及部分临床研究中，干细胞被证明对神经功能损伤有明显的保护和治疗作用。神经干细胞(nerualstemcell，NSC)是具有自我更新能力，并能转化为各种神经组织细胞(包括神经元、神经星形胶质细胞和少突胶质细胞等)的一类细胞。在遭受神经损伤或特定细胞因子存在的条件下，NSC能够被激活并分化为神经元或神经胶质细胞，参与损伤部位的修复。神经干细胞移植后能够在宿主脑内存活、迁移和分化为神经元和星形胶质细胞。NSC移植后能够明显减轻胶质瘫痕形成，增加内源性神经元和神经胶质细胞的前体细胞的存活率和功能，并且可通过释放可溶性因子和表达免疫相关受体促进旁路免疫调节从而改变病变周围的免疫环境。因此，以NSC移植为基础的治疗在多种缺血性脑卒中症状治疗中具有重要的临床应用价值。
目前，利用干细胞移植治疗脑卒中主要面临的问题就是，移植后的神经干细胞分化为神经细胞的程度仍然较低，对于患者的治疗效果有待进一步提升。本领域仍需要开辟新的方法和途径，以获得更好的具有临床效果的干细胞及制剂并用于脑卒中的治疗上，从而促进干细胞及其制剂的改良，进一步造福于人类神经系统疾病患者，改善其生活质量。
发明内容
为解决目前干细胞移植治疗脑卒中面临的问题，本发明的目的在于提供一种新型干细胞制剂及其在血管介入治疗脑卒中的用途。
经实验表明，以往的用脑卒中治疗的干细胞的常用诱导方法是在F12基础培养基中添加EGF成分，此种方法培养出来的干细胞分化程度较低，且不能保证NSC向预想的方向分化而影响治疗效果。本发明在此基础上进行改良制备的用于脑卒中治疗的干细胞，以免疫细胞化学染色的方法鉴定其标记物的表达，包括神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和神经微管相关蛋白-2（MAP-2），证实本发明可明显提高体外培养干细胞向NSC分化的程度，进而大大提升了对病人的治疗效果，并且制备成本低廉。配合血管介入法经股动脉注射施用，提高了细胞的定植率。
本发明还提供了一种用于脑卒中治疗的干细胞的制备方法及其用于制备治疗脑卒中患者的药物中的用途。
为了达到上述发明目的，达到上述技术效果，本发明采用了如下技术方案：
一种新型干细胞制剂及其在血管介入治疗脑卒中的用途，所述的干细胞是通过以下方法制备的，具体步骤如下：
步骤1，组织的制备和消化：无菌条件下制备1mm3大小左右的脐带组织匀浆，以无血清培养基定容，以1:1的体积比加入0.2%胶原酶Ⅱ，37℃，持续磁力搅拌下消化30分钟；然后继续加入终浓度为0.05%的胰蛋白酶-EDTA，在37℃环境中继续磁力搅拌消化30分钟后，加入10%体积的胎牛血清(FBS)终止消化；
步骤2，原始细胞的收集与原代细胞的培养：将上述步骤1的消化产物先后经100目及200目细胞筛过滤收集原始细胞，然后以1.0×105细胞/ml将细胞接种于细胞培养瓶中，置于37℃，5%CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养，培养4～5天后全量换液，弃去未贴壁细胞，以后每3～4天半量换液一次，即原代细胞培养，记为P0代细胞；
步骤3，原代细胞的传代与扩增：观察原代培养的细胞贴壁融合生长至80～90%时，吸弃培养瓶内原有培养液，吸取10ml0.01MPBS缓冲液轻轻加入培养瓶内洗涤两遍，弃去洗液，并用0.025%～0.05%的胰蛋白酶-EDTA进行消化3～6分钟，以1:3～1:4比例传代培养，记为P1代细胞；
步骤4，细胞传代与扩增：待细胞融合生长至80～90%时，重复上述步骤3操作进行洗涤和消化，传代比例为1:3，记为P2、P3、P4…代细胞；
步骤5，细胞预诱导：取P4～P6代细胞，当细胞贴壁生长融合至80～90%时，吸除培养瓶内原有培养液，取10ml0.01MPBS轻轻加入培养瓶内洗涤两遍，弃去洗液，加入0.025%～0.05%胰蛋白酶-0.01%EDTA消化液1.0ml，浸漫覆盖瓶底，倒置显微镜下观察见细胞呈圆形漂起时，加入1.0mlFBS中止胰蛋白酶消化；加入10ml0.01MPBS反复吹打冲洗，在室温下900rpm离心10分钟；弃去上清液后，加入10mlF12培养液重悬细胞，在T25cm2培养瓶中接种2×105细胞/ml，培养液保持5ml/瓶；置37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养6～8天，传代后第2天换液一次，以后每3天换液一次；
步骤6，细胞诱导：将上述步骤5细胞融合至80～90%时，操作同步骤5清洗、消化、终止消化后获得干细胞，在室温下900rpm离心10分钟，弃去上清液后，以2×105细胞/ml重新接种在T25cm2培养瓶中；培养液保持5ml/瓶；置37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养20天，传代后第2天换液一次，以后每3天换液一次；
步骤7，终产物干细胞的预处理：将上述步骤6培养的干细胞和培养液一起吸至离心管，1000rpm离心5分钟，弃上清；重悬细胞并用梯度吸管(管径由大到小)吹打，分散大的细胞团为单细胞或小的细胞团，按1:3～1:4传代；置37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养6～8天，传代后第2天换液一次，以后每3天换液一次，即获得终产物干细胞；
步骤8，终产物干细胞的处理：将步骤7预处理后的终产物干细胞用浓度为0.25%的胰酶消化，用相当于5倍胰酶消化液体积的不含血清的培养液来终止消化，1000rpm离心5分钟，以步骤7所用的细胞培养基重悬离心沉淀后的终产物干细胞，混匀后装入注射瓶中，无菌密封，其中，干细胞的浓度是1×106～1×107个/ml；
步骤9：用免疫细胞化学染色法对所得终产物干细胞进行鉴定，主要标志物为神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和神经微管相关蛋白-2（MAP-2），且细胞NSE的表达率为90%以上，GFAP和MAP-2表达结果为阴性；
其中：所述的步骤2中细胞培养瓶在细胞接种前用FBS进行包被，将FBS均匀浸润细胞培养瓶并置37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱孵育30分钟即为包被；
所述的步骤2中原代细胞培养所用的完全培养基为含20%FBS，2ng/ml表皮细胞生长因子(EGF)，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，25mM左旋谷氨酞胺(L-Glu)的F12完全培养液；
所述的步骤3～4中传代细胞培养所用的完全培养基为含10%FBS，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素的DMEM/F12完全培养液；
所述的步骤5中细胞培养所用的完全培养基为含10%人AB血清、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的F12完全培养液，并添加了50ng/ml成纤维细胞生长因子（bFGF）、100ng/ml成纤维细胞生长因子8（FGF8）、500ng/ml音猬因子（SHH）和10ng/ml白血病抑制因子（LIF）；
所述的步骤6中细胞培养所用的完全培养基为含含3%N2/B27（B27的成分为：2mmol/LL-谷氨酰胺、30nmol/L亚硒酸钠、20nmol/L孕酮、60μmol/L腐胺、100μg/ml转铁蛋白、25μg/ml胰岛素、质量分数为16%葡萄糖；N2的成分为：100μg/ml转铁蛋白、25μg/ml胰岛素、20nmol/L孕酮、60Lmol/L腐胺、30nmol/L亚硒酸钠。），100u/ml青霉素，100μg/ml链霉素的无血清neurobasalmedia，添加了50ng/mlbFGF，100ng/ml成纤维细胞生长因子（FGFs）和500ng/ml音猬因子（SHH）；
所述的步骤7中细胞培养所用的完全培养基为含10～20ng/ml表皮细胞生长因子(EGF)，0.2～0.4mg/ml三磷酸胞苷二钠(CTP)，3～5mmol/L氯化锂(LiCl)的F12细胞培养液，且不含酚红。
进一步的，所述的步骤7中细胞培养所用的完全培养基优选含15ng/ml表皮细胞生长因子(EGF)，0.3mg/ml三磷酸胞苷二钠(CTP)，4mmol/L氯化锂(LiCl)的F12细胞培养液，且不含酚红。
进一步的，所述的步骤8中干细胞的浓度优选5×106个/ml。
上述干细胞的制备方法可获得一种用于脑卒中治疗和具有制备治疗脑卒中患者的药物用途的干细胞。
一种新型干细胞制剂包含上述方法制备的浓度为1×106～1×107/ml的干细胞和含10～20ng/ml表皮细胞生长因子(EGF)、0.2～0.4mg/ml三磷酸胞苷二钠(CTP)及3～5mmol/L氯化锂(LiCl)的F12细胞培养液，不含酚红。
进一步的，所述的一种新型干细胞制剂中的干细胞的浓度优选5×106个/ml。
进一步的，所述的一种新型干细胞制剂中的F12细胞培养液含表皮细胞生长因子(EGF)、三磷酸胞苷二钠(CTP)及氯化锂(LiCl)的优选浓度分别是15ng/ml、0.3mg/ml和4mmol/L。
本发明的有益效果是：
本发明干细胞的制备方法可显著提高体外培养干细胞向神经元细胞分化的程度，主要标志物神经元特异性烯醇化酶（NSE）的表达率达90%以上，并且神经胶质细胞的主要标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和神经微管相关蛋白-2（MAP-2）表达结果为阴性。
本发明采用脐带源干细胞，具有取材方便，易于采集和运输，生物学特性稳定，免疫原性低，无异体排斥反应，避免了伦理争议，细胞数量多等优点，是自体与同种异基因移植的理想细胞来源；创新性的采用两种酶短时间消化脐带组织，优点就是方法相对简单，花费较少，酶消化法培养可以短时间内得到大量细胞；继而采用本发明的培养方法进行扩增和传代，并进一步诱导，得到的目的细胞纯度高；仅取第4-6代细胞进行目的细胞的诱导培养，是因为细胞扩增几代后，即可获得充足细胞，又能保证细胞的稳定性和细胞活力。
本发明在原代细胞消化及其传代时采用较低浓度的消化液进行消化，极大限度的降低了消化液对细胞的损伤，保证后序步骤细胞的稳定性和细胞活力；选用双重细胞筛过滤细胞可保证尽可能的除去细胞杂质并最大限度的获得细胞。
本发明在细胞制备的不同阶段，注重细节，所用方法是经过多次试验的得出的经验总结，包括培养体系的选择、培养时间的确定、血清的选择、细胞因子的添加等等，最终获得本发明优良的技术效果，保证细胞纯度和活性，增强细胞修复机体神经组织损伤的功效，可以有效的为科研和临床所用。
本发明在细胞的诱导过程中，创新性地联合应用三磷酸胞苷二钠(CTP)和氯化锂(LiCl)，配合表皮细胞生长因子(EGF)，其中：CTP是一种核酸类药物，其主要药效成分三磷酸胞苷在机体内参与核酸及磷脂的合成代谢，促进蛋白质的合成，可以调节和促进神经细胞、神经胶质细胞及血管壁细胞膜性结构的合成与构建，能够对抗由兴奋性氨基酸、自由基引起的神经细胞损伤，从而对上述细胞具有支持存活、增强活性、延缓死亡、提高细胞抗损伤、再生和修复能力，促进神经突起再生长，并改善支配血管的神经功能；锂盐LiCl中的锂可以上调神经营养因子的表达，促进中枢神经系统的神经发生，抑制促凋亡基因的表达，在缺血性和创伤性脑损伤中发挥保护作用，能促进神经干细胞的增殖、向神经元方向分化、合成分泌脑源性神经营养因子等；EGF是一种人体本身就能够产生的生物因子，应用极为安全，由53个氨基酸组成，具有自动感知功能双向调控的细胞因子组合物，在修复损伤的初期能因需要而加快细胞的增殖，当修复接近完善时能自动减慢细胞增生的速率。
本发明干细胞制剂及其制备过程联合CTP、LiCl和EGF与培养基使用，并采用合理浓度配比，即避免大量使用细胞因子，大大降低了制备成本，又可得到的大量的有效细胞，且获得的终产物干细胞分化程度明显高于其他方法制备的细胞；并联合应用于治疗脑卒中，取得了优良效果。
对病人的治疗效果大大提升，采纳47例脑卒中患者，治疗后一个月，注射本发明干细胞制剂的实验组患者、注射EGF干细胞制剂的对照组1患者、注射EGF和CTP干细胞制剂的对照组2患者、注射EGF和LiCl干细胞制剂的对照组3患者以及未进行干细胞移植的空白组患者，其欧洲卒中量表评分标准(ESS)、生活功能评分标准(BI)都有不同程度提高，各组间比较差异均无统计学意义。
治疗后三个月，实验组患者以及各对照组患者ESS、BI均显著提高，与同期空白组比较差异有统计学意义，但实验组患者与各对照组患者比较差异无统计学意义，各对照组患者之间比较差异无统计学意义。
治疗后六个月，空白组患者ESS、BI均未出现明显提高，实验组与对照组患者仍有明显恢复，与同期空白组比较差异有统计学意义。实验组评分较同期各对照组有显著提高，差异有统计学意义，不良反应少见。各对照组患者之间比较差异无统计学意义。
随着干细胞的培养和提取技术的不断进步，干细胞的应用和发展将会为脑卒中等神经系统疾病的治疗开辟新的天地。
具体实施方式
下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。
实施例一：提取制备人脐带干细胞
提取方法具体如下：
1.取健康孕妇剖宫产的新生儿脐带，供者肝炎病毒标志物、梅毒、HIV检测均阴性。供者对实验知情同意，经该院伦理委员会批准。
2.无菌条件下，将剖宫产新生儿的脐带从手术台上取下，浸入F12培养基中，4℃保存；超净台内从培养基中取出脐带，含有1×双抗和250μg/ml两性霉素的D-Hank'S液充分冲洗脐带外表面，并用20ml注射器分别插入两根脐静脉及一根脐动脉内反复冲洗，冲去脐静脉及动脉内的残存积血。
3.无菌条件下用组织剪将脐带组织剪碎成1mm3大小的组织块，将组织块(约30～40ml)移至内含一磁力搅拌子的100ml玻璃瓶中，加入0.2%胶原酶Ⅱ30～40ml(终浓度约为0.1%)，37℃，持续磁力搅拌下消化30分钟。
4.向胶原酶-组织块消化体系内加入终浓度为0.05%的胰酶-EDTA，在37℃环境中继续磁力搅拌消化30分钟后，加入10%体积的胎牛血清(fetalbovineserum，FBS)终止消化。
5.消化产物先后经100目及200目的细胞筛过滤，去除未消化的组织，收集滤液。
6.接种细胞前吸FBS3ml加入T75cm2型细胞培养瓶，置37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱孵育30分钟，对培养瓶进行包被。
7.弃包被液，用含20%FBS，2ng/ml表皮细胞生长因子(epidermalgrowthfactor，EGF)，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，25mM左旋谷氨酞胺(L-glutase，L-Glu)的F12完全培养液重悬消化分离所得细胞，吹打均匀，计数细胞。
8.调整细胞浓度为1.0×105细胞/ml，接种于包被后的T75cm2型细胞培养瓶中，置于37℃，5%CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养，相差显微镜动态观察。
9.培养4～5天后全量换液，弃去未贴壁细胞，以后每3～4天半量换液一次，即原代细胞培养，记为P0代细胞。
10.观察原代培养的细胞贴壁融合生长至80～90%时，吸弃培养瓶内原有培养液，吸取10ml0.01MPBS缓冲液轻轻加入培养瓶内洗涤两遍，弃去洗液，并用0.025%～0.05%的胰蛋白酶-EDTA进行消化3～6分钟，以1:3～1:4比例传代培养，所用的完全培养基为含10%FBS，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素的DMEM/F12完全培养液；记为P1代细胞。
11.待细胞融合生长至80～90%时，重复上述步骤3操作进行洗涤和消化，传代比例为1:3，仍用上述步骤11完全培养液，记为P2、P3、P4…代细胞。
实施例二：制备治疗脑卒中的干细胞及干细胞制剂
本实施例是在实施例一的基础上，对所提取的干细胞进行继续培养、诱导分化和鉴定。
1.取P4～P6代脐带干细胞，当细胞贴壁生长融合至80～90%时，吸除培养瓶内原有培养液，取10ml0.01MPBS轻轻加入培养瓶内洗涤两遍，弃去洗液。
2.加入0.025%～0.05%胰蛋白酶-0.01%EDTA消化液1.0ml，浸漫覆盖瓶底，倒置显微镜下观察见细胞呈圆形漂起时，加入1.0mlFBS中止胰蛋白酶消化。
3.加入10ml0.01MPBS反复吹打冲洗，在室温下900rpm离心10分钟；弃去上清液后，加入10mlF12重悬细胞，在T25cm2培养瓶中接种2×105个干细胞。
4.培养体系为含10%人AB血清、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的F12完全培养液，添加了50ng/mlbFGF、100ng/mlFGF8（成纤维细胞生长因子8）、500ng/mlSHH（音猬因子）和10ng/mlLIF（白血病抑制因子），总体积为5ml/瓶；置37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养6～8天，每3天换液一次。
5.将预诱导后的细胞加入0.025%～0.05%胰蛋白酶-0.01%EDTA消化液1.0ml，浸漫覆盖瓶底，倒置显微镜下观察见细胞呈圆形漂起时，加入1.0mlFBS中止胰蛋白酶消化。
6.加入10ml0.01MPBS反复吹打冲洗，在室温下900rpm离心10分钟；弃去上清液后，重悬细胞，重新接种在T25cm2培养瓶中。
7.培养体系为含3%N2/B27（B27的成分为：2mmol/LL-谷氨酰胺、30nmol/L亚硒酸钠、20nmol/L孕酮、60μmol/L腐胺、100μg/ml转铁蛋白、25μg/ml胰岛素、质量分数为16%葡萄糖。N2的成分为：100μg/ml转铁蛋白、25μg/ml胰岛素、20nmol/L孕酮、60μmol/L腐胺、30nmol/L亚硒酸钠。），100u/ml青霉素，100μg/ml链霉素的无血清neurobasalmedia，添加了50ng/mlbFGF，100ng/ml成纤维细胞生长因子（FGFs）和500ng/ml音猬因子（SHH），总体积为5ml/瓶；置37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养20天；传代后第2天换液一次，以后每3天换液一次。
8.将上述步骤培养液和诱导后的干细胞一起吸至离心管，1000rpm离心5分钟，弃上清。
9.加入添加了无血清培养基即含15ng/ml表皮细胞生长因子(EGF)，0.3mg/ml三磷酸胞苷二钠(CTP)，4mmol/L氯化锂(LiCl)的F12细胞培养液，且不含酚红；取梯度吸管(管径由大到小)吹打，分散大的细胞团为单细胞或小的细胞团，按1:3～1:4传代；置37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养6～8天，传代后第2天换液一次，以后每3天换液一次，即获得终产物干细胞。
10.对照实验：以F12细胞培养液，含15ng/mlEGF，0.3mg/mlCTP，4mmol/LLiCl细胞培养液培养的细胞作为实验组；对照组1：含15ng/mlEGF的F12细胞培养液；对照组2：含15ng/mlEGF，0.3mg/mlCTP的F12细胞培养液；对照组3：含15ng/mlEGF，4mmol/LLiCl的F12细胞培养液。
11.将预处理后的终产物干细胞用浓度为0.25%的胰酶消化，用相当于5倍胰酶量的不含血清的培养液来终止消化作用，1000rpm离心5min；用配好的终产物干细胞预处理细胞培养液悬浮离心沉淀的干细胞，混匀后装入注射瓶中，无菌密封，其中，干细胞的浓度是1×107个/ml。
12.用免疫细胞化学染色法对所得对照组以及实验组诱导所得干细胞进行鉴定：主要标志物为神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和神经微管相关蛋白-2（MAP-2）。
13.免疫细胞化学结果显示：对照组1的细胞NSE的表达率为76.465±6.98249%，对照组2的细胞NSE的表达率为77.314±7.31587%，对照组3的细胞NSE的表达率为79.285±6.43468%，实验组的细胞NSE的表达率为92.67±5.5908%。GFAP和MAP-2在各时间点均表达阴性。验证本发明所添加因子组合可明显提高干细胞向神经元样细胞的诱导率。
实施例三：观察干细胞治疗对患者肢体功能的修复作用
能使体内受损组织修复和再生是干细胞一个重要属性之一。我们采用介入治疗的方法，对患者实施股动脉注射，每7d移植1次，连续移植3次后，相较对照组肢体功能明显改善。
采纳47例脑卒中患者，治疗后一个月，注射本发明干细胞制剂的10名实验组患者、注射EGF干细胞制剂的8名对照组1患者、注射EGF和CTP干细胞制剂的10名对照组2患者、注射EGF和LiCl干细胞制剂的9名对照组3患者以及未进行干细胞移植的10名空白组患者，其欧洲卒中量表评分标准(ESS)、生活功能评分标准(BI)都有不同程度提高，各组间比较差异均无统计学意义。
治疗后三个月，实验组患者以及各对照组患者ESS、BI均显著提高，与同期空白组比较差异有统计学意义，但实验组患者与各对照组患者比较差异无统计学意义，各对照组患者之间比较差异无统计学意义。
治疗后六个月，空白组患者ESS、BI均未出现明显提高，实验组与对照组患者仍有明显恢复，与同期空白组比较差异有统计学意义；实验组评分较同期各对照组有显著提高，差异有统计学意义，不良反应少见。各对照组患者之间比较差异无统计学意义。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种新型干细胞制剂及其在血管介入治疗脑卒中的用途，其特征在于，所述的干细胞是通过以下方法制备的，具体步骤如下：
步骤1，组织的制备和消化：无菌条件下制备1mm3大小左右的脐带组织匀浆，以无血清培养基定容，以1:1的体积比加入0.2%胶原酶Ⅱ，37℃，持续磁力搅拌下消化30分钟；然后继续加入终浓度为0.05%的胰蛋白酶-EDTA，在37℃环境中继续磁力搅拌消化30分钟后，加入10%体积的胎牛血清(FBS)终止消化；
步骤2，原始细胞的收集与原代细胞的培养：将上述步骤1的消化产物先后经100目及200目细胞筛过滤收集原始细胞，然后以1.0×105细胞/ml将细胞接种于细胞培养瓶中，置于37℃，5%CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养，培养4～5天后全量换液，弃去未贴壁细胞，以后每3～4天半量换液一次，即原代细胞培养，记为P0代细胞；
步骤3，原代细胞的传代与扩增：观察原代培养的细胞贴壁融合生长至80～90%时，吸弃培养瓶内原有培养液，吸取10ml0.01MPBS缓冲液轻轻加入培养瓶内洗涤两遍，弃去洗液，并用0.025%～0.05%的胰蛋白酶-EDTA进行消化3～6分钟，以1:3～1:4比例传代培养，记为P1代细胞；
步骤4，细胞传代与扩增：待细胞融合生长至80～90%时，重复上述步骤3操作进行洗涤和消化，传代比例为1:3，记为P2、P3、P4…代细胞；
步骤5，细胞预诱导：取P4～P6代细胞，当细胞贴壁生长融合至80～90%时，吸除培养瓶内原有培养液，取10ml0.01MPBS轻轻加入培养瓶内洗涤两遍，弃去洗液，加入0.025%～0.05%胰蛋白酶-0.01%EDTA消化液1.0ml，浸漫覆盖瓶底，倒置显微镜下观察见细胞呈圆形漂起时，加入1.0mlFBS中止胰蛋白酶消化；加入10ml0.01MPBS反复吹打冲洗，在室温下900rpm离心10分钟；弃去上清液后，加入10ml完全培养液重悬细胞，在T25cm2培养瓶中接种2×105细胞/ml，培养液保持5ml/瓶；置37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养6～8天，传代后第2天换液一次，以后每3天换液一次；
步骤6，细胞诱导：将上述步骤5细胞融合至80～90%时，操作同步骤5清洗、消化、终止消化后获得干细胞，在室温下900rpm离心10分钟，弃去上清液后，以2×105细胞/ml重新接种在T25cm2培养瓶中；培养液保持5ml/瓶；置37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养20天，传代后第2天换液一次，以后每3天换液一次；
步骤7，终产物干细胞的预处理：将上述步骤6培养的干细胞和培养液一起吸至离心管，1000rpm离心5分钟，弃上清；重悬细胞并用梯度吸管(管径由大到小)吹打，分散大的细胞团为单细胞或小的细胞团，按1:3～1:4传代；置37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养6～8天，传代后第2天换液一次，以后每3天换液一次，即获得终产物干细胞；
步骤8，终产物干细胞的处理：将步骤7预处理后的终产物干细胞用浓度为0.25%的胰酶消化，用相当于5倍胰酶消化液体积的不含血清的培养液来终止消化，1000rpm离心5分钟，以步骤7所用的细胞培养基重悬离心沉淀后的终产物干细胞，混匀后装入注射瓶中，无菌密封，其中，干细胞的浓度是1×106～1×107个/ml；
步骤9：用免疫细胞化学染色法对所得终产物干细胞进行鉴定，主要标志物为神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和神经微管相关蛋白-2（MAP-2），且细胞NSE的表达率为90%以上，GFAP和MAP-2表达结果为阴性；
其中：步骤2中细胞培养瓶在细胞接种前用FBS进行包被，将FBS均匀浸润细胞培养瓶并置37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱孵育30分钟即为包被；
步骤2中原代细胞培养所用的完全培养基为含20%FBS，2ng/ml表皮细胞生长因子(EGF)，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，25mM左旋谷氨酞胺(L-Glu)的F12完全培养液；
步骤3～4中传代细胞培养所用的完全培养基为含10%FBS，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素的DMEM/F12完全培养液；
步骤5中细胞培养所用的完全培养基为含10%人AB血清、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的F12完全培养液，并添加了50ng/ml成纤维细胞生长因子（bFGF）、100ng/ml成纤维细胞生长因子8（FGF8）、500ng/ml音猬因子（SHH）和10ng/ml白血病抑制因子（LIF）；
步骤6中细胞培养所用的完全培养基为含3%N2/B27（B27的成分为：2mmol/LL-谷氨酰胺、30nmol/L亚硒酸钠、20nmol/L孕酮、60μmol/L腐胺、100μg/ml转铁蛋白、25μg/ml胰岛素、质量分数为16%葡萄糖；N2的成分为：100μg/ml转铁蛋白、25μg/ml胰岛素、20nmol/L孕酮、60μmol/L腐胺、30nmol/L亚硒酸钠），100u/ml青霉素，100μg/ml链霉素的无血清neurobasalmedia，添加了50ng/mlbFGF，100ng/ml成纤维细胞生长因子（FGFs）和500ng/ml音猬因子（SHH）；
步骤7中细胞培养所用的完全培养基为含10～20ng/ml表皮细胞生长因子(EGF)，0.2～0.4mg/ml三磷酸胞苷二钠(CTP)，3～5mmol/L氯化锂(LiCl)的F12细胞培养液，且不含酚红。
2.根据权利要求1所述的一种新型干细胞制剂及其在血管介入治疗脑卒中的用途，其特征在于，所述的干细胞制备的步骤7中细胞培养所用的完全培养基优选含15ng/ml表皮细胞生长因子(EGF)，0.3mg/ml三磷酸胞苷二钠(CTP)，4mmol/L氯化锂(LiCl)的F12细胞培养液，且不含酚红。
3.根据权利要求1所述的一种新型干细胞制剂及其在血管介入治疗脑卒中的用途，其特征在于，所述的干细胞制备的步骤8中干细胞的浓度优选5×106个/ml。
4.权利要求1所述的一种新型干细胞制剂及其在血管介入治疗脑卒中的用途，其特征在于，所述的一种新型干细胞制剂包含浓度为1×106～1×107/ml的干细胞和含10～20ng/ml表皮细胞生长因子(EGF)、0.2～0.4mg/ml三磷酸胞苷二钠(CTP)及3～5mmol/L氯化锂(LiCl)的F12细胞培养液，不含酚红。
5.根据权利要求4所述的一种新型干细胞制剂，其特征在于，所述的干细胞如权利要求1～3所说方法制备而成。
6.根据权利要求4所述的一种新型干细胞制剂，其特征在于，所述的干细胞的浓度优选5×106个/ml。
7.根据权利要求4所述的一种新型干细胞制剂，其特征在于，所述的F12细胞培养液含表皮细胞生长因子(EGF)、三磷酸胞苷二钠(CTP)及氯化锂(LiCl)的优选浓度分别是15ng/ml、0.3mg/ml和4mmol/L。
8.权利要求1～3所述的干细胞及其制备方法和用于制备治疗脑卒中患者的药物中的用途。
9.权利要求4～6所述的新型干细胞制剂在血管介入治疗脑卒中的用途。
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