CN104807788B - 一种用于监测血管重构现象的方法与试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于监测血管重构现象的方法，以及涉及相应的用于监测血管重构现象的试剂盒。本发明所述方法是将体外培养的血管平滑肌细胞进行因素处理而制备成细胞爬片；或者将血管组织制备成石蜡切片；用稀释的细胞核增殖抗原Ki67覆盖，染色，荧光显微镜观察。本发明突破了传统上对于血管重构现象只监视细胞增殖或者只监视细胞凋亡的方法，首次提出了一种新的用于监控血管重构现象的方法，同时对细胞增殖和细胞凋亡进行观察，能够更有效地对移植血管的病理生理变化进行干预研究。本发明所述试剂盒特异性高，适用于基础与临床研究中体外培养细胞爬片、细胞涂片和各类组织切片中的组织细胞同时出现细胞增殖、凋亡以及静息情况研究。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于监测血管重构现象的方法，以及涉及相应的用于监测血管重构现象的试剂盒。
背景技术
冠脉血管架桥是将病人自体静脉移植到冠状动脉替代原有病变的动脉血管的一种常见外科手术方法，是目前临床治疗因冠脉粥样硬化导致心肌梗死最重要手段之一。由于移植血管在一年内有15％、3～5年内有30％、5～10年内有50％的移植血管出现重阻塞，导致移植手术最终失败，给家庭、给社会以及经济造成很到损失。人们对于如何防止移植后血管重阻塞的机制迄今仍不清楚。
目前，人们普遍认为，移植血管组织重构主要是由于血管平滑肌细胞的增殖过多、死亡过少而形成，因而人们对移植血管的病理生理变化的干预研究要么只是监视细胞增殖及相应机制，要么只是观察血管组织的细胞死亡及机制。
发明内容
本发明突破了传统上对于血管重构现象只监视细胞增殖或者只监视细胞凋亡的方法，首次提出了一种新的用于监控血管重构现象的方法，同时对细胞增殖和细胞凋亡进行观察，能够更有效地对移植血管的病理生理变化进行干预研究。
本发明所述的用于监测血管重构现象的方法是基于发明人的最新研究成果，即血管重构(包括移植静脉动脉化以及移植静脉粥样硬化过程)并不只是过去人们认识的细胞过度增生而细胞凋亡抑制，而是细胞大量增生的同时，细胞凋亡也大量出现。本发明的实验结果表明：一部分细胞(原来存在于血管壁上的干细胞或成纤维细胞)接受外来刺激后立马开始分化和增生，继而开始合成大量的细胞外基质，分布到细胞外的血管膜上，使得血管壁快速增加变厚，以快速抗衡和适应外来压力对管壁的伤害。与此同时，原有的血管壁上的成熟的平滑肌细胞在突发外来伤害因素(如高血压产生的机械牵张力以及糖尿病高血糖产生的AGEs等)作用下，细胞出现损伤进而通过凋亡的形式而被清除。在通过凋亡清理完第一批受损伤细胞后，新生的细胞在经历了大量细胞外基质合成后亦会变得衰老，最终也会通过凋亡的形式而被清除。只要外来伤害因子持续存在，血管的细胞(干细胞等)会不断被激活而出现细胞的增殖和合成细胞外基质，血管也随之变厚，同时完成了功能的细胞亦会衰老并经由凋亡途径而被清除。如此出现了血管中既可见有细胞大量增殖，亦可见其它细胞出现大量凋亡。因而，细胞增殖越多，细胞调亡也就越多，最终血管重构速度也就越快。由此建立本发明所述的用于监测血管重构现象的方法，通过对细胞增殖和凋亡同时原位三重检测(增殖细胞、凋亡细胞和静息细胞)来更有效和更准确的监测血管重构现象。
根据本发明的一个具体实施方式所述的用于监测血管重构现象的方法，包括以下步骤：
A.体外培养的血管平滑肌细胞进行因素处理而制备成细胞爬片；
B.用清洗液清洗，加入固定液覆盖染色标本，置于-20℃固定10分钟；
C.用清洗液清洗，加入脱膜液覆盖染色标本，20-25℃孵育10分钟；
D.用清洗液清洗，加入封闭液覆盖染色标本，置于湿盒中孵育30分钟；
E.用含1％BSA的PBS缓冲液稀释细胞核增殖抗原Ki67，稀释浓度为1：200，将稀释好的液体覆盖染色标本，置于湿盒中4℃孵育过夜；
F.用清洗液清洗，加入Cy3标记荧光二抗，参考稀释浓度为1：200，置于湿盒内室温孵育2小时；
G.用清洗液清洗，加入预先配制的体积比为1：9的凋亡酶试剂和凋亡标记试剂，20-25℃保持1小时；
H.用稀释浓度为1：200的细胞核复染试剂进行复染，20-25℃染色10分钟，用清洗液清洗；
I.甘油封片，荧光显微镜观察。
根据本发明的另一个具体实施方式所述的用于监测血管重构现象的方法，包括以下步骤：
A.将血管组织制备成石蜡切片；
B.石蜡切片于60℃烤片2小时，依次置于二甲苯、100％乙醇、95％乙醇、75％乙醇、50％乙醇和去离子水中各3分钟；
C.用清洗液清洗，加入固定液覆盖染色标本，置于湿盒内孵育30分钟；
D.用清洗液清洗，加入封闭液覆盖染色标本，置于湿盒中孵育2小时；
E.使用含1％BSA的TBS缓冲液稀释细胞核增殖抗原Ki67，稀释浓度为1：200，将稀释好的液体覆盖染色标本，置于湿盒中4℃孵育过夜；
F.用清洗液清洗，加入Cy3标记荧光二抗，参考稀释浓度为1：200，置于湿盒内20-25℃孵育2小时；
G.用清洗液清洗，加入预先配制的体积比为1：9的凋亡酶试剂和凋亡标记试剂，20-25℃保持1小时；
H.用稀释浓度为1：200的细胞核复染试剂进行复染，20-25℃染色10分钟，用清洗液清洗；
I.甘油封片，荧光显微镜观察。
根据本发明所述的用于监测血管重构现象的方法的进一步特征，所述清洗液是PBS缓冲液。
根据本发明所述的用于监测血管重构现象的方法的进一步特征，在各步骤中用清洗液清洗时，至少清洗3次，每次清洗5分钟。
根据本发明所述的用于监测血管重构现象的方法的进一步特征，所述固定液是甲醇，在使用前置于-20℃预冷。
根据本发明所述的用于监测血管重构现象的方法的进一步特征，所述脱膜液是含有0.25％Triton X-100的PBS缓冲液。
根据本发明所述的用于监测血管重构现象的方法的进一步特征，所述封闭液是5％BSA。
根据本发明所述的用于监测血管重构现象的方法的进一步特征，所述凋亡酶试剂是末端脱氧核苷酸转移酶，所述凋亡标记试剂是核苷酸混合物。
根据本发明所述的用于监测血管重构现象的方法的进一步特征，所述细胞核复染试剂为DAPI，即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)。
本发明的另一目的是提供一种用于监测血管重构现象的试剂盒。
本发明所述的用于监测血管重构现象的试剂盒，包括：清洗液，为PBS缓冲液；固定液，为甲醇；脱膜液，为含有0.25％Triton X-100的PBS缓冲液；封闭液，为5％BSA；抗体：Ki67一抗，Cy3标记荧光二抗；抗体稀释液：含1％BSA的PBS缓冲液；含1％BSA的TBS缓冲液；凋亡酶试剂，为末端脱氧核苷酸转移酶；凋亡标记试剂，为核苷酸混合物；细胞核复染试剂，为DAPI。
目前用于监测血管重构现象的试剂盒只有以下两种：(1)检测细胞增殖的；(2)检测细胞凋亡的。本发明所述的试剂盒不同于现有的两种试剂盒，它能同时检测细胞增殖、细胞凋亡以及静息状态细胞，对增殖细胞、凋亡细胞和静息细胞进行原位三重检测。
本发明所述的试剂盒的应用范围包括：血管重构的调控，包括冠脉架桥后移植血管的病理生理变化以及诱导向动脉化的检测与观察。静脉移植到冠状动脉后在动脉压力作用下发生结构和功能的变化，在此过程中，血管壁的细胞会出现细胞大量增殖，并合成细胞外基质大量积存于管壁，于此同时，施行功能后的细胞继而大量凋亡。并且细胞增殖得越多，凋亡也就越多，结果是移植血管粥样硬化越快。本试剂盒可以检测到上述管壁细胞的变化，可同时显示增殖细胞、凋亡细胞以及静息细胞。
本发明所述的方法与试剂盒的检测原理是：细胞或组织在体内代谢产物的刺激作用下，会同时发生细胞增殖和凋亡，如果增殖信号强于凋亡信号，细胞向增殖通路发展，相反，则细胞凋亡，组织内的细胞增殖和凋亡最终将导致组织的结构重构，进而影响功能。本试剂盒首先通过细胞周期内Ki67抗原和细胞反应，标记增殖细胞，其次使用末端脱氧核苷酸转移酶和凋亡细胞进行反应，从而标记凋亡细胞，所有细胞核都可与DAPI结合，因而除了Ki67和凋亡阳性细胞外其余均为静息细胞。根据细胞核标记细胞计数细胞总数以及各种细胞在全部细胞中所占比分，进而做到同时观察细胞和组织内增殖、凋亡以及静息细胞数量和分布情况。
适用范围：基础与临床研究中体外培养细胞爬片、细胞涂片和各类组织切片中的组织细胞同时出现细胞增殖、凋亡以及静息情况研究。
特异性：本试剂盒主要标记细胞增殖周期中Ki67和凋亡过程中DNA双链片段，从而可以和细胞坏死以及由细胞毒性药物或辐射导致的DNA单链片段相鉴别，因此特异性较高。
检测时间：培养细胞因素处理后或血管移植后15～30小时，不包括细胞培养、刺激、动物模型制备、切片时间。
附图说明
图1是细胞爬片标本，图中红色箭头所指为Ki67阳性细胞(细胞增殖，红色)，绿色箭头为TUNEL阳性细胞(细胞凋亡，绿色)以及蓝色箭头所指静息细胞。
图2是移植静脉石蜡切片标本，图中红色箭头所指为Ki67阳性细胞(细胞增殖，红色)，绿色箭头为TUNEL阳性细胞(细胞凋亡，绿色)以及蓝色箭头所指静息细胞。
具体实施方式
实施例1：小鼠颈总动脉压诱导的静脉移植模型实验
1.材料：
显微止血钳、血管夹、聚乙烯套管、眼科镊、眼科剪。
2.方法：
手术器械消毒后，麻醉小鼠(10g/L戊巴比妥钠50mg/kg腹腔内注射)，同时给予硫酸阿托品1.7mg/kg肌注(3.4μL/g)以保持呼吸道顺畅。整个手术过程在体视显微镜下操作。取仰卧位，暴露颈部并固定于手术台上。从小鼠颈中部自下颌骨水平至胸骨顶端的纵行切口，剪除右侧胸骨乳突肌，尽可能长地分离右侧颈总动脉，8－0丝线在其中点两端结扎后，从中点处剪开。断端穿过聚乙烯套管，用显微止血夹钳夹血管和套管，去掉血管断端的结扎线，将部分血管外翻套于套管上，8－0丝线结扎固定。之后，截取供体小鼠隔上腔静脉作为移植静脉桥。方法为麻醉供鼠后取腹部正中切口，显露下腔静脉并注入100U/mL肝素盐溶液0.5mL。3min后，从横膈处开前胸廓，并向侧面剪开至胸廓内动脉，取约1cm上腔静脉，迅速放入100U/mL肝素盐溶液中漂洗。将游离的静脉段两端分别套于套管上，8－0丝线结扎固定后，剪去套管小柄，移除显微止血夹。动脉段及移植静脉如有明显充盈及搏动并保持5min不减弱视为手术成功。含抗生素(链青双抗100万单位/mL)的生理盐水冲洗手术区域后用6－0丝线间断缝合缝皮。供体静脉从截取到复流不超过15min，期间动作尽量轻柔从而避免手术外力损伤静脉。
3.结果分析：静脉移植到颈总动脉1、2、4周或8周后，取出该移植静脉，使用4％多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，经本试剂盒染色后，置荧光显微镜下观察。正常下腔静脉，血管壁未见有增殖和凋亡细胞，只有静息状态的细胞。而移植静脉可见管壁增厚，增殖细胞、凋亡细胞以及静息细胞同时存在。
按照以下步骤对石蜡切片进行染色：将石蜡切片于60℃烤片2小时，依次置于二甲苯、100％乙醇、95％乙醇、75％乙醇、50％乙醇和去离子水中各3分钟；用清洗液(例如，PBS缓冲液)清洗(例如，至少清洗3次，每次清洗5分钟)，加入固定液(例如，甲醇，在使用前置于-20℃预冷)覆盖染色标本，置于湿盒内孵育30分钟；再用清洗液(例如，PBS缓冲液)清洗(例如，至少清洗3次，每次清洗5分钟)，加入封闭液(例如，5％BSA)覆盖染色标本，置于湿盒中孵育2小时；使用含1％BSA的TBS缓冲液稀释细胞核增殖抗原Ki67，稀释浓度为1：200，将稀释好的液体覆盖染色标本，置于湿盒中4℃孵育过夜；用清洗液(例如，PBS缓冲液)清洗(例如，至少清洗3次，每次清洗5分钟)，加入Cy3标记荧光二抗，参考稀释浓度为1：200，置于湿盒内20-25℃孵育2小时；用清洗液(例如，PBS缓冲液)清洗(例如，至少清洗3次，每次清洗5分钟)，加入预先配制的体积比为1：9的凋亡酶试剂(例如，末端脱氧核苷酸转移酶)和凋亡标记试剂(例如，核苷酸混合物)，20-25℃保持1小时；用稀释浓度为1：200的细胞核复染试剂(例如，DAPI)进行复染，20-25℃染色10分钟，用清洗液(例如，PBS缓冲液)清洗(例如，至少清洗3次，每次清洗5分钟)。
将染色后的石蜡切片用甘油封片，荧光显微镜观察。发现细胞增殖和凋亡水平均有明显上升，Ki67和TUNEL表达明显增多。并可见增殖和凋亡细胞分布在血管的不同区域。
本实施例建立了将血管组织制备成石蜡切片，然后用于监测血管重构现象的方法。
实施例2：细胞培养后体外刺激诱导模型实验
1.材料
培养瓶，吸管，离心管，废液缸，75％酒精棉球，酒精灯，培养细胞，培养基(DMEM)，胎牛血清，0.125％胰蛋白酶，PBS液，CO2培养箱，显微镜，超净台。
2.方法
酶消化法传代细胞至牵拉板中，待细胞长至70％密度后，用无血清DMEM培养基饥饿细胞24h，给予机械力(SS)刺激1h后，继续培养23h，收取细胞进行荧光染色。
染色方法包括以下步骤：
A.体外培养的血管平滑肌细胞进行因素处理而制备成细胞爬片；
B.用清洗液(例如，PBS缓冲液)清洗(例如，至少清洗3次，每次清洗5分钟)，加入固定液(例如，甲醇，在使用前置于-20℃预冷)覆盖染色标本，置于-20℃固定10分钟；
C.用清洗液(例如，PBS缓冲液)清洗(例如，至少清洗3次，每次清洗5分钟)，加入脱膜液覆盖染色标本，20-25℃孵育10分钟；
D.用清洗液(例如，PBS缓冲液)清洗(例如，至少清洗3次，每次清洗5分钟)，加入封闭液(例如，5％BSA)覆盖染色标本，置于湿盒中孵育30分钟；
E.用含1％BSA的PBS缓冲液稀释细胞核增殖抗原Ki67，稀释浓度为1：200，将稀释好的液体覆盖染色标本，置于湿盒中4℃孵育过夜；
F.用清洗液(例如，PBS缓冲液)清洗(例如，至少清洗3次，每次清洗5分钟)，加入Cy3标记荧光二抗，参考稀释浓度为1：200，置于湿盒内室温孵育2小时；
G.用清洗液(例如，PBS缓冲液)清洗(例如，至少清洗3次，每次清洗5分钟)，加入预先配制的体积比为1：9的凋亡酶试剂(例如，末端脱氧核苷酸转移酶)和凋亡标记试剂(例如，核苷酸混合物)，20-25℃保持1小时；
H.用稀释浓度为1：200的细胞核复染试剂(例如，DAPI)进行复染，20-25℃染色10分钟，用清洗液清洗；
I.甘油封片，荧光显微镜观察。
3.结果分析：使用上述方法进行染色后，发现细胞增殖和凋亡有明显上升，即Ki67和TUNEL表达明显增多，同时可见仅有DAPI染色的细胞为静息细胞。
本实施例建立了将血管组织制备成细胞爬片，然后用于监测血管重构现象的方法。
实施例3：本发明所述的用于检测血管重构现象的试剂盒的制备
基于实施例1和实施例2的实验所建立的用于监测血管重构现象的方法，发明人研制出相关的用于检测血管重构现象的试剂盒，该试剂盒的组成见下表：
本试剂盒采用末端脱氧核苷酸转移酶法，可以不完全和细胞内断裂的双链DNA片段结合，从而对凋亡细胞进行检测。
本试剂盒采用细胞核增殖抗原Ki67作为检测细胞增殖情况的检测指标。这是因为：细胞周期可以通过检测DNA内容物和通过检测并关联细胞周期特异性细胞内靶点从而进行分析，Ki67在G1，S，G2和M期表达，但不存在于G0期。
实施例4：本发明所述的试剂盒的应用实例
体外培养的平滑肌细胞在相应因素处理后16h固定，或移植静脉血管数周后(依据实验要求)灌注取材、固定。采用实施例3所制备的试剂盒进行检测。
依照实施例1和实施例2所描述的方法，对增殖细胞、凋亡细胞以及静息细胞同时进行染色，染色后的细胞爬片或组织切片置于荧光显微镜下或者激光共聚焦显微镜下观察和拍照。红色光波长：550nm；绿色光波长：488nm；蓝色光波长：405nm。三者影像重叠加后可见三者细胞在同一视野下分布，可以了解和检测血管重构现象以及影像重构的因素。
检测结果如图1和图2所示。
图1是细胞爬片标本，图中红色箭头所指为Ki67阳性细胞(细胞增殖，红色)，绿色箭头为TUNEL阳性细胞(细胞凋亡，绿色)以及蓝色箭头所指静息细胞。如图1所示，静息培养的血管平滑肌细胞在机械力和AGE同时作用下可有同时诱导增殖细胞、凋亡细胞和静息细胞的存在：静息培养的血管平滑肌细胞经机械力和AGE联合作用后诱导细胞凋亡(绿色)的同时增殖(红色)，此外还有很多静息细胞存在(蓝色)。
图2是移植静脉石蜡切片标本，图中红色箭头所指为Ki67阳性细胞(细胞增殖，红色)，绿色箭头为TUNEL阳性细胞(细胞凋亡，绿色)以及蓝色箭头所指静息细胞。如图2所示，移植静脉中增殖细胞、凋亡细胞和静息细胞同时存在。移植静脉8周血管经石蜡包埋、组织切片、脱蜡、复性后，用Ki67(细胞增殖，红色)、TUNEL(细胞凋亡，绿色)以及DAPI(静息细胞，蓝色)三重染色。
血管在不同刺激条件下，发生的结构和功能变化，均视为血管重构。因此，本试剂盒可以检测血管中同时发生的细胞增殖和凋亡现象，从而对血管壁机构的变化进行监测。
Claims (10)
1.一种用于监测血管重构现象的方法，包括以下步骤：
A.体外培养的血管平滑肌细胞进行因素处理而制备成细胞爬片；
B.用清洗液清洗，加入固定液覆盖染色标本，置于-20℃固定10分钟；
C.用清洗液清洗，加入脱膜液覆盖染色标本，20-25℃孵育10分钟；
D.用清洗液清洗，加入封闭液覆盖染色标本，置于湿盒中孵育30分钟；
E.用含1％BSA的PBS缓冲液稀释细胞核增殖抗原Ki67，稀释浓度为1：200，将稀释好的液体覆盖染色标本，置于湿盒中4℃孵育过夜；
F.用清洗液清洗，加入Cy3标记荧光二抗，参考稀释浓度为1：200，置于湿盒内室温孵育2小时；
G.用清洗液清洗，加入预先配制的体积比为1：9的凋亡酶试剂和凋亡标记试剂，20-25℃保持1小时；
H.用稀释浓度为1：200的细胞核复染试剂进行复染，20-25℃染色10分钟，用清洗液清洗；
I.甘油封片，荧光显微镜观察。
2.一种用于监测血管重构现象的方法，包括以下步骤：
A.将血管组织制备成石蜡切片；
B.石蜡切片于60℃烤片2小时，依次置于二甲苯、100％乙醇、95％乙醇、75％乙醇、50％乙醇和去离子水中各3分钟；
C.用清洗液清洗，加入固定液覆盖染色标本，置于湿盒内孵育30分钟；
D.用清洗液清洗，加入封闭液覆盖染色标本，置于湿盒中孵育2小时；
E.使用含1％BSA的TBS缓冲液稀释细胞核增殖抗原Ki67，稀释浓度为1：200，将稀释好的液体覆盖染色标本，置于湿盒中4℃孵育过夜；
F.用清洗液清洗，加入Cy3标记荧光二抗，参考稀释浓度为1：200，置于湿盒内20-25℃孵育2小时；
G.用清洗液清洗，加入预先配制的体积比为1：9的凋亡酶试剂和凋亡标记试剂，20-25℃保持1小时；
H.用稀释浓度为1：200的细胞核复染试剂进行复染，20-25℃染色10分钟，用清洗液清洗；
I.甘油封片，荧光显微镜观察。
3.根据权利要求1或2所述的用于监测血管重构现象的方法，其特征在于：所述清洗液是PBS缓冲液。
4.根据权利要求1或2所述的用于监测血管重构现象的方法，其特征在于：在各步骤中用清洗液清洗时，至少清洗3次，每次清洗5分钟。
5.根据权利要求1或2所述的用于监测血管重构现象的方法，其特征在于：所述固定液是甲醇，在使用前置于-20℃预冷。
6.根据权利要求1所述的用于监测血管重构现象的方法，其特征在于：所述脱膜液是含有0.25％Triton X-100的PBS缓冲液。
7.根据权利要求1或2所述的用于监测血管重构现象的方法，其特征在于：所述封闭液是5％BSA。
8.根据权利要求1或2所述的用于监测血管重构现象的方法，其特征在于：所述凋亡酶试剂是末端脱氧核苷酸转移酶，所述凋亡标记试剂是核苷酸混合物。
9.根据权利要求1或2所述的用于监测血管重构现象的方法，其特征在于：所述细胞核复染试剂为DAPI。
10.一种用于监测血管重构现象的试剂盒，其特征在于，包括：
清洗液，为PBS缓冲液；
固定液，为甲醇；
脱膜液，为含有0.25％Triton X-100的PBS缓冲液；
封闭液，为5％BSA；
抗体：Ki67一抗，Cy3标记荧光二抗；
抗原：细胞核增殖抗原Ki67；
抗体稀释液：含1％BSA的PBS缓冲液；含1％BSA的TBS缓冲液；
凋亡酶试剂，为末端脱氧核苷酸转移酶；
凋亡标记试剂，为核苷酸混合物；
细胞核复染试剂，为DAPI。
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