CN107064137A - 一种无创的皮肤创面采样观察及分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种无创的皮肤创面采样观察及分析方法，运用载玻片粘取患者创面组织脱落细胞，给予固定，染色，之后对贴片进行分析。本发明的观察分析方法，实行工艺简单、操作方便，无需特别的仪器和设备；使用方便且安全，便于在基层医疗网络推广。同时，它又具有科学性和先进性，它利用一个简单的操作，就可以达到从组织水平，细胞水平和分子水平对患者在治疗过程中疗效的观察，创面的愈合做到客观和科学的记录和判断。避免了医生在认知水平上的差异，也便于在医科生教学传授；更能做到病例在治疗过程中的系统记录，便于不同病例的对照和分析；也有利与对新药的疗效评判，这些优点是现今临床上不具备的。
Description
技术领域
本发明涉及一种无创、简便易行且易于推广运用的临床创面采样观察及分析方法，其可应用于各种原因引起的体表损伤以及皮肤溃烂、压疮等创面伤情情况，以及创面治疗修复的效果情况。
背景技术
当前，创面伤情以及修复效果尚无确切客观的评价方法，通常凭借医生的肉眼观察，根据经验判断治疗效果，尚缺乏准确的客观的评价系统和标准，它不仅存在临床医生之间的认知差异，也很难对患者进行横向的比较，更无法判断治疗过程中表皮组织的变化。申请号201010219014.4的中国专利公开了一种对皮肤创面综合检测的方法，包括：获得一三维测量尺的标准值；拍摄采集目标图像信息，所述目标图像包括皮肤创面部分图像和所述三维测量尺图像；获得所述三维测量尺的标准值与所述目标图像中所述三维测量尺图像的校准偏差，根据所述校准偏差对所述目标图像中所述皮肤创面部分图像进行还原，获得所述皮肤创面部分图像的实际信息；将所述皮肤创面部分图像的实际信息上传到一数据库中保存。该方法能准确记录皮肤创面数据特征，方便医生对患者皮肤创面进行随访和诊疗。然而该方法仅仅停留在对创面的颜色、形状及大小等表面特征的观察检测，患者创面治疗过程中，组织细胞增殖、坏死、自噬与凋亡，及其相关Bio-Marker分子分析的有效方法至今欠缺，急待发明一种简单无创易行的皮肤创面损伤和修复效果的观察方法，以便用于治疗过程中实时客观地评估皮肤损伤的分子机制和手术或者药物疗效的评判。
发明内容
基于上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种无创的皮肤创面采样观察及分析方法，包括以下步骤：
步骤1，皮肤组织脱落细胞贴片制备：运用载玻片粘取患者创面组织脱落细胞，给予固定，染色；
步骤2，对贴片进行分析。
如上所述的一种无创的皮肤创面采样观察及分析方法，步骤2中的分析的方法为下列方法中的一种或多种：
分析方法1：以DAPI行细胞核染色，观察创面组织细胞核型的变化，初步判断组织坏死，凋亡或增殖状况；
分析方法2：进行细胞骨架染色，分析细胞完整性，修复细胞朝损伤组织爬行的能力，进一步判断组织修复能力的好坏；
分析方法3：从细胞增殖情况，凋亡与自噬水平等方面进一步评估创面修复效果。
如上所述的一种无创的皮肤创面采样观察及分析方法，所述的步骤1和2具体为：
1）清洗创面，清理创面分泌物，随后运用注射用生理盐水湿润的棉签进行采样，对于表面平整的创面，以棉签在创面匀速转动粘取脱落细胞；对于窦道或者深凹创面，将棉签深入创面内部转动采样；将取样后的棉签轻轻在载玻片表面转动以转移脱落细胞至载玻片，防止来回搓揉；
2）样本转移至载玻片后，立即以3.7%多聚甲醛固定样本，PBS漂洗后进行免疫染色；
3）用预冷无菌PBS缓冲液洗涤1次，5min；
4）0.5%Trition-100室温透化处理；
5）用已预冷无菌PBS缓冲液漂洗1次，5min；
6）若采用分析方法一，直接转入步骤 13）；
7）若采用分析方法二、三，则予2%BSA, 37℃封闭30min；
8）若采用分析方法二时通过F-actin分析，此处需滴加相应荧光或其他标记的鬼笔环肽，转入步骤12）；
9）若采用分析方法二但不通过F-actin分析时，或采用分析方法三分析，此处需分别滴加一抗，阴性对照组添加同型IgG，4℃过夜；
10）次日取出，37℃孵育1h，无菌PBS缓冲液洗涤3次，每次5min；
11）若采用分析方法二但不通过F-actin分析时，或采用分析方法三分析，此处需滴加相应荧光或其他标记的二抗，37℃孵育1h；
12）无菌PBS缓冲液洗涤3次，每次5min；
13）DAPI复染3min，无菌PBS缓冲液漂洗3次，每次5min；
14）封片，荧光显微镜下观察结果并进行图像采集。
如上所述的一种无创的皮肤创面采样观察及分析方法，所述的一抗为以2% BSA配制的Tubulin/PCNA/ Bcl-2/Bax/Cyclin-D1/c-Myc/LC3/Beclin-1等；所述的二抗为与一抗对应的FITC/PE抗兔/鼠IgG1:1000。
实施本发明的有益效果：通过无创粘取皮肤组织脱落细胞，进行包括但不限于免疫荧光染色等技术方法，对患者创面修复情况进行详细分析，以便实时评估皮肤损伤患者严重程度或手术、药物治疗效果。本发明的观察分析方法，实行工艺简单、操作方便，无需特别的仪器和设备；使用方便且安全，便于在基层医疗网络推广。同时，它又具有科学性和先进性，它利用一个简单的操作，就可以达到从组织水平，细胞水平和分子水平对患者在治疗过程中疗效的观察，创面的愈合做到客观和科学的记录和判断。避免了医生在认知水平上的差异，也便于在医科生教学传授；更能做到病例在治疗过程中的系统记录，便于不同病例的对照和分析；也有利与对新药的疗效评判，这些优点是现今临床上不具备的。
附图说明
图1为案例1说明图；
图2为案例2说明图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
本发明实质上是皮肤组织脱落细胞贴片制备与分析方法： 运用载玻片粘取患者创面组织脱落细胞，给予固定，染色，进而综合分析创面情况。分析方法具体为以下三种：
分析方法1：以DAPI（2,6-Diisopropylaniline）行细胞核染色，观察创面组织细胞核型的变化，初步判断组织坏死，凋亡或增殖状况。DAPI 为一种荧光染料，可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用，可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光，显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞核或凋亡小体，荧光显微镜观察细胞标记的效率几乎为100 %。DAPI染色可用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。DAPI也常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色。细胞经固定后用DAPI染色3分钟，在荧光显微镜下可以看到细胞核的形态变化：
a、 核型完整，染色质均匀，有或没有一定数量成对出现的细胞核，提示正常细胞并伴有/不伴有增殖；
b、 染色质固缩，向外周聚集，形成周边化，提示凋亡；
c、 染色质进一步固缩，形成很多颗粒物质或着色明亮的比正常核更小的圆形凋亡小体，提示凋亡；
d、 细胞核破裂形成线状或碎片，核解体，提示坏死。
分析方法2：进行细胞骨架染色，分析细胞完整性，修复细胞朝损伤组织爬行的能力，进一步判断组织修复能力的好坏。细胞在病理情况下常常会出现细胞骨架系统异常，常表现为微管减少和解聚，细胞骨架异常可增强细胞的运动能力。研究表明，微丝束及其末端黏着斑的破坏以及肌动蛋白小体的出现，与细胞的浸润和转移特性有关。优选地，此处可通过F-actin分析， F-actin的稳定性对于防止细胞内液外漏具有重要意义，或者通过此法进行其他分析，例如Tubulin 染色分析，观察细胞移动情况。
分析方法3：从细胞增殖情况，凋亡与自噬水平等方面进一步评估创面修复效果。进行增殖抗原PCNA、凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax、细胞周期相关蛋白Cyclin-D1，c-Myc以及自噬相关蛋白LC3,Beclin-1的染色分析。
本发明中皮肤组织脱落细胞贴片制备与分析的具体实施步骤包括：
1. 清洗创面，清理创面分泌物，随后运用注射用生理盐水湿润的棉签进行采样，对于表面平整的创面，以棉签在创面匀速转动粘取脱落细胞；对于窦道或者深凹创面，将棉签深入创面内部转动采样。将取样后的棉签轻轻在载玻片表面转动以转移脱落细胞至玻片，防止来回搓揉；
2.样本转移至玻片后，立即以3.7%多聚甲醛固定样本，PBS漂洗后进行免疫染色；
3.用预冷无菌PBS缓冲液洗涤1次，5min；
4.0.5%Trition-100室温透化处理；
5.用已预冷无菌PBS缓冲液漂洗1次，5min；
6. 若采用分析方法一，直接转入步骤 13；
7. 采用分析方法二、三，则予2%BSA， 37℃封闭30min；
8. 若采用分析方法二时通过F-actin分析，此处需滴加相应荧光或其他标记的鬼笔环肽，转入步骤12；
9. 若采用分析方法二（以F-actin分析以外的方式），或分析方法三，则分别滴加一抗（以2%BSA配制，Tubulin/PCNA/ Bcl-2/ Bax/ Cyclin-D1/ c-Myc/ LC3/ Beclin-1等），阴性对照组添加同型IgG，4℃过夜；
10. 次日取出，37℃孵育1h，无菌PBS缓冲液洗涤3次，每次5min；
11. 若采用分析方法二（以F-actin分析以外的方式），或分析方法三，滴加相应荧光或其他标记的二抗（如FITC/PE抗兔/鼠IgG1:1000）,37℃孵育1h；
12. 无菌PBS缓冲液漂洗3次，每次5min；
13. 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）复染3min，无菌PBS缓冲液漂洗3次，每次5min；
14. 封片，荧光显微镜下观察结果并进行图像采集。
运用本发明观察患者创面修复状况的实施案例：
案例1：糖尿病足患者创面脱落细胞分析：样本来自糖尿病足患者，取样行DAPI染色，观察脱落细胞核型的变化。
糖尿病足患者创面脱落细胞分析：样本来自糖尿病足患者，取样行DAPI染色，观察脱落细胞核型的变化。图1为糖尿病足患者患处皮肤脱落细胞核型观察：A.坏死的组织；B.发生核碎裂的脱落细胞（箭头所示）；C，D 逐步修复的创面组织 （DAPI染色，荧光显微镜下观察，bar=50μm）。
具体步骤：
1）清洗创面，清理创面分泌物，随后运用注射用生理盐水湿润的棉签进行采样，对于表面平整的创面，以棉签在创面匀速转动粘取脱落细胞；对于窦道或者深凹创面，将棉签深入创面内部转动采样；将取样后的棉签轻轻在特制（专用）的载玻片表面转动以转移脱落细胞至载玻片，防止来回搓揉；
2）样本转移至载玻片后，立即以3.7%多聚甲醛固定样本，PBS漂洗后进行免疫染色；
3）用预冷无菌PBS缓冲液洗涤1次，5min；
4）0.5%Trition-100室温透化处理；
5）用已预冷无菌PBS缓冲液漂洗1次，5min；
6）DAPI染色3min，无菌PBS缓冲液漂洗3次，每次5min；
7）封片，荧光显微镜或普通光学显微镜下观察结果并进行图像采集。
图1为糖尿病足患者患处皮肤脱落细胞核型观察：A.坏死的组织；B.发生核碎裂的脱落细胞（箭头所示）；C，D 逐步修复的创面组织 （DAPI染色，荧光显微镜下观察，bar=50μm）。
案例2：开水烫伤患者治疗21天后，皮肤组织F-actin染色，DAPI复染，提示创面修复状况良好，如图2（DyLight 550 标记的鬼笔环肽标记及DAPI染色，荧光显微镜下观察，bar=50μm）。
具体步骤：
1）清洗创面，清理创面分泌物，随后运用注射用生理盐水湿润的棉签进行采样，对于表面平整的创面，以棉签在创面匀速转动粘取脱落细胞；对于窦道或者深凹创面，将棉签深入创面内部转动采样；将取样后的棉签轻轻在载玻片表面转动以转移脱落细胞至载玻片，防止来回搓揉；
2）样本转移至载玻片后，立即以3.7%多聚甲醛固定样本，PBS漂洗后进行免疫染色；
3）用预冷无菌PBS缓冲液洗涤1次，5min；
4）0.5%Trition-100室温透化处理；
5）用已预冷无菌PBS缓冲液漂洗1次，5min；
6）5μg/ml DyLight 550 标记的鬼笔环肽室温染色60min；
7）无菌PBS缓冲液洗涤3次，每次5min；
8）DAPI染色3min，无菌PBS缓冲液漂洗3次，每次5min；
9）封片，荧光显微镜或普通光学显微镜下观察结果并进行图像采集。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种无创的皮肤创面采样观察及分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，皮肤组织脱落细胞贴片制备：运用载玻片粘取患者创面组织脱落细胞，给予固定，染色；
步骤2，对贴片进行分析。
2.如权利要求1所述的一种无创的皮肤创面采样观察及分析方法，其特征在于，步骤2中的分析的方法为下列方法中的一种或多种：
分析方法1：以DAPI行细胞核染色，观察创面组织细胞核型的变化，初步判断组织坏死，凋亡或增殖状况；
分析方法2：进行细胞骨架染色，分析细胞完整性，修复细胞朝损伤组织爬行的能力，进一步判断组织修复能力的好坏；
分析方法3：从细胞增殖情况，凋亡与自噬水平等方面进一步评估创面修复效果。
3.如权利要求1或2所述的一种无创的皮肤创面采样观察及分析方法，其特征在于，所述的步骤1和2具体为：
1）清洗创面，清理创面分泌物，随后运用注射用生理盐水湿润的棉签进行采样，对于表面平整的创面，以棉签在创面匀速转动粘取脱落细胞；对于窦道或者深凹创面，将棉签深入创面内部转动采样；将取样后的棉签轻轻在载玻片表面转动以转移脱落细胞至载玻片，防止来回搓揉；
2）样本转移至载玻片后，立即以3.7%多聚甲醛固定样本，PBS漂洗后进行免疫染色；
3）用预冷无菌PBS缓冲液洗涤1次，5min；
4）0.5%Trition-100室温透化处理；
5）用已预冷无菌PBS缓冲液漂洗1次，5min；
6）若采用分析方法一，直接转入步骤 13）；
7）若采用分析方法二、三，则予2%BSA, 37℃封闭30min；
8）若采用分析方法二时通过F-actin分析，此处需滴加相应荧光或其他标记的鬼笔环肽，转入步骤12）；
9）若采用分析方法二但不通过F-actin分析时，或采用分析方法三分析，此处需分别滴加一抗，阴性对照组添加同型IgG，4℃过夜；
10）次日取出，37℃孵育1h，无菌PBS缓冲液洗涤3次，每次5min；
11）若采用分析方法二但不通过F-actin分析时，或采用分析方法三分析，此处需滴加相应荧光或其他标记的二抗，37℃孵育1h；
12）无菌PBS缓冲液洗涤3次，每次5min；
13）DAPI复染3min，无菌PBS缓冲液漂洗3次，每次5min；
14）封片，荧光显微镜下观察结果并进行图像采集。
4.如权利要求3所述的一种无创的皮肤创面采样观察及分析方法，其特征在于，所述的一抗为以2% BSA配制的Tubulin/PCNA/ Bcl-2/Bax/Cyclin-D1/c-Myc/LC3/Beclin-1；所述的二抗为与一抗对应的FITC/PE抗兔/鼠IgG1:1000。
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