CN107560917B - 一种微型器官的处理方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种微型器官的处理方法，包括：依次将固定后的微型器官在透析液Ⅰ中1～10℃透析2～5天，在透析液Ⅱ中‑40～‑15℃透析4～8h，所述透析液Ⅰ配方为1M Tris碱液中含10%的Triton‑X 100、2%的BSA以及0.05M的NaCl，pH 6.8；透析液Ⅱ配方为体积比为4:1的乙醇和二甲基亚砜。本发明是对微型器官进行定型和整体通透处理，保持其原有形态，实现器官和组织细胞结构形态不变而大分子物质能充分渗透到各个部位的目的。经过这样处理的微型器官可以利用分子物质的特异性结合反应，再通过相应的观察手段如荧光显微镜等，就可以准确、灵敏地在微型器官上对分子进行细胞或亚细胞定位、定性以及相对定量分析。本发明针对生物领域微小动物内部器官很小、难以实施组织切片技术的困境，发明了一种适合体内微型器官在分子和细胞水平上进行研究的方法。

Description

一种微型器官的处理方法

技术领域

本发明涉及组织器官的处理方法，特别涉及动物体内的微小组织器官。

技术背景

动物机体是各种组织器官的结合体，动物的生命活动必需依靠各个组织器官正常行使各自的生理学和生物学功能来维持。研究组织器官是深入认识动物以及控制和利用动物的前提基础和重要纽带。

医学诊断上常用的组织器官病理检测方法-组织化学，伴随分子及细胞生物学的发展，在生物领域升华为免疫组织化学。免疫组织化学是将抗原与抗体结合的免疫反应特异性和组织化学的可见性巧妙地结合起来，在细胞、亚细胞水平检测抗原物质，对其进行定位、定性及相对定量分析，从而可大大提高研究深度和水平。因此，免疫组织化学技术50年代以来得到快速发展并广泛应用各个研究领域。科学研究中通用的免疫组化技术是通过对保持原有形态的组织进行连续切片、以每张切片作为抗原-抗体特异性反应单元为基础来进行蛋白分子在组织中的定性、定位等分析的。但免疫组织化学实验包括固定→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→贴片→脱蜡→水化→抗原修复→抗体结合染色等多个环节，步骤繁琐，技术难度高，要想最终获得满意结果，需集扎实的技术理论和丰富的操作经验为一体方可如愿。稍有不慎，组织细胞发生变形或抗体分子渗透性不好，切片组织染色模糊，不能清楚观察结果。实践证明，对于一些肉眼下不易观察的微型组织器官，这个实验技术开展起来非常困难，尤其是内部组织器官，经过透明处理后光射反差小，可视度低，操作中容易造成1材料发生丢失、2包埋和切片时很难把控材料的位置和方向、3操作当时不可知切片组织是否缺损或完整，这样所获的切片组织在方向位置以及完整性上都不能确定。而免疫组化就是以连续组织切片和每张切片的完整性为基础来判断反应结果在器官中的具体位置进行定性、定位分析的。因而，实验中即使获得一些免疫染色效果好的切片，因不能在器官中进行具体定位而丧失其作用和意义，更不可能拿到全面可靠的结果了。所以，用现有的免疫组织化学手段对内部微型器官进行蛋白分子的定位定性分析，几乎不能获得成功。

地球上大部分动物属于外观尺寸较小的小型动物，如种类繁多的昆虫、绝大部分其它无脊椎动物以及少数离奇的脊椎动物等。通常，微小动物的器官很小，原本组织解剖学研究条件要求高，难度大，尤其是一些厚度小于1mm、肉眼下观察困难、最外层因非角质化或骨质化、一经透明处理后光射反差很小可视度趋近于0的内部微型器官(如不像家蚕幼虫体壁和头部等这样的外部组织器官，为了抵抗尖锐物损伤内部组织，最外层被角质化骨质化，经过透明处理后还保留一定的光射反差和可视度)，在分子水平上进行科学研究时，因没有合适可行的方法严重阻碍了相关研究，成为其深入研究的瓶颈。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对于动物体内的微型器官的处理方法，尤其是适用于动物内部器官的处理和研究，其厚度往往在1mm以下，而最外层为非角质化或骨质化的薄膜，柔软，不能抵抗尖锐物具的机械损伤。

本发明的目的是通过以下措施实现的：

一种微型器官的处理方法，包括：依次将固定后的微型器官在透析液Ⅰ中1～10℃透析2～5天，在透析液Ⅱ中-40～-15℃透析4～8h，所述透析液Ⅰ配方为1M Tris碱液中含10％的Triton-X 100、2％的BSA以及0.05M的NaCl，pH 6.8；透析液Ⅱ配方为体积比为4:1的乙醇和二甲基亚砜。本发明既可以增加了膜的通透性和渗透性，同时保持器官、细胞的原有形态和结构。

上述固定是采用4％的多聚甲醛(溶于0.1M PBS)在1～10℃中浸泡微型器官12～16h。

上述微型器官的处理方法，包括采用体积比为1:1000的Tween-20和0.01M PBS配置的处理液轻微震荡中浸泡微型器官4次，分别为固定前1次，固定后透析前1次，透析后2次。如此，可以提高反应的特异性识别，提高灵敏度，同时保持微型器官形态和结构的完好。

上述处理液处理步骤为两段式，每段采用处理液浸泡3-25min。

具体的，一种微型器官的处理方法，包括以下步骤：

(1)摘取新鲜的微型器官，在PBS中剔除粘附在上的其它杂物；

(2)用处理液分为两个阶段处理微型器官，每阶段3～5min；

(3)用多聚甲醛在1～10℃中固定微型器官12～16h；

(4)用处理液分为两个阶段处理微型器官，每阶段10～15min；

(5)将微型器官在透析液Ⅰ中1～10℃透析2～5天；

(6)将微型器官在透析液Ⅱ中-40～-15℃透析3～6h；

(7)用处理液分为两个阶段处理微型器官，每阶段10～15min；

(8)将微型器官进行免疫反应、原位杂交或细胞学其它操作(如分子物质渗透、染色反应等)；

(9)用处理液处理微型器官2-3次，每次处理分两个阶段，每段15～25min；

(10)依次放于50-100％乙醇浓度由低到高的梯度中各脱水5～30min。

有益效果

1.本发明是利用药物试剂之间的配合以及相应操作的配合对微型器官进行定型和整体通透处理，保持其原有形态，实现器官和组织细胞结构形态不变而大分子物质能充分渗透到各个部位的目的。经过这样处理的微型器官可以利用分子物质的特异性结合反应，再通过相应的观察手段如荧光显微镜等，就可以准确、灵敏地在微型器官上对分子进行细胞或亚细胞定位、定性以及相对定量分析。本发明针对生物领域微小动物内部器官很小、难以实施组织切片技术的困境，发明了一种适合体内微型器官在分子和细胞水平上进行研究的方法。

2.目前的组织化学研究，都需要通过组织切片来实现，切片的技术难度大，熟练程度要求高，是整个实验操作的核心和瓶颈。采用本发明进行免疫组织化学研究，不需要浸蜡→包埋→切片→脱蜡等多个繁琐环节，具有操作简便、省时、省力的明显优点。

3.本发明中材料不必经透明处理，其保持原有的光反射差异，可视度稳定，可控性好，不易丢失，容易成功。

4.本发明所有环节都是以整体器官进行，避免了局部破损或不同部位之间的操作误差，结果信息完整，可靠度高，部位之间可比性强，尤其是相对定量分析的准确度将大幅度提高。同时，结果具有整体器官的立体性和全貌性，对分析判断更有意义和价值。

5.本发明经过通透处理的微型器官渗透能力强，如利用抗体蛋白、核酸探针和细胞器特殊染料等，可以广泛应用于免疫反应、原位杂交以及细胞学等研究。

附图说明

图1.家蚕幼虫中枢神经上Bm5-HT 1A受体蛋白的定位分析。A-第3对胸部神经节放大；B-整个中枢神经系统。

图2.家蚕幼虫咽侧体anti-BmFAMET免疫实验。

图3.家蚕幼虫咽侧体细胞学观察。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只能用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容作出一些非本质的改进和调整。

实施例1家蚕幼虫内部微型器官的免疫反应

一种微型器官的处理方法，包括以下步骤：

(1)解剖家蚕幼虫，摘取目的微型器官，在PBS中剔除粘附在上的其它杂物；

(2)用处理液分两个阶段处理微型器官，每阶段在轻微震荡中浸泡4min，处理液配方为10μLTween-20，10mL 0.01M PBS；

(3)用4％的多聚甲醛(溶于0.1M PBS)在4℃中固定微型器官14h；

(4)用处理液分两阶段处理微型器官，每阶段在轻微震荡中浸泡12min，处理液配方为10μL Tween-20，10mL 0.01M PBS；

(5)将微型器官在透析液Ⅰ中4℃透析4天；透析液Ⅰ的配方：1M Tris 15mL，NaCl2.63g，Triton-X 1001.5mL，BSA 0.3g，pH 6.8；

(6)将微型器官在透析液Ⅱ中-20℃透析6h；透析液Ⅱ配方为乙醇80mL，DMSO20mL；

(7)用处理液分两阶段处理微型器官，每阶段在轻微震荡中浸泡12min；处理液配方为10μLTween-20，10mL 0.01M PBS；

(8)免疫反应实验

①将微型器官置于一抗中4℃孵育3～4天。抗体根据具体的效价用稀释液(10μLTween-20:10mL 0.1M PBS)稀释成目的浓度；

②清洗后，将微型器官放在被荧光标记的二抗(如Alexa Fluor 488)中，在黑暗避光下4℃孵育3～4天。二抗稀释倍数为1:1000～2000。

(9)用处理液处理微型器官2次，每次处理分两阶段，每阶段在轻微震荡中浸泡20min，处理液配方为10μLTween-20，10mL 0.01M PBS；

(10)将微型器官依次放于50％、60％、70％、80％、90％、100％浓度的乙醇中进行脱水，每个浓度脱水10min。

本发明中所述震荡采用的仪器型号为TS2000脱色摇床；震幅:回转半径15mm；震荡频率为30-40转/分。

向微型器官滴加抗淬灭剂在荧光显微镜下观察结果。

(1)家蚕幼虫中枢神经系统上Bm5-HT 1A受体蛋白的分析(如图1所示)

家蚕幼虫中枢神经系统是由神经索连接13对神经节纵贯躯体全长的微细实心组织，如果用常规免疫组织化学技术需要分段包埋切片进行观察，而且因透明处理后可视度低，不能控制切片方向和保证组织的完整性，虽耗大量时间精力却几乎不能获得完整可靠的实验结果。用本发明提供的方法既可以观察Bm5-HT 1A受体在家蚕幼虫中枢神经系统分布全貌(图1中B)，又可对各个神经节及不同部位的神经索的详细定位进行观察(图1中A)。

如：通过观察发现，在家蚕整个中枢神经系统中(包括神经索和13对神经节)均检测到Bm5-HT1A受体蛋白免疫阳性信号，其中脑、咽下神经节和第3对胸部神经节免疫信号更强，对于每个神经节，阳性信号主要集中在神经细胞而神经髓质比较少，其中与神经索连接处阳性信号最强，相连神经索上的信号随距离增加逐渐减弱。

(2)家蚕幼虫咽侧体上BmFAMET蛋白的分析(如图2所示)

家蚕幼虫咽侧体是头部内经心侧体与脑连接的乳白色实心椭圆体，由一层非细胞薄膜包裹腺细胞构成，4龄到5龄初期幼虫的咽侧体直径大约为50～100μM，肉眼下很难观察，如果用常规包埋切片的免疫组织化学技术几乎不能进行。用本发明提供的方法分析了不同生长发育时期家蚕幼虫咽侧体BmFAMET蛋白的定位和定量情况。因咽侧体太小，容易丢失，摘取脑-心侧体-咽侧体的复合体进行BmFAMET蛋白的抗原-抗体免疫试验。如图2，红色箭头指示咽侧体。A是anti-BmFAMET对4龄幼虫初期咽侧体免疫实验结果，B是anti-BmFAMET对5龄幼虫初期咽侧体免疫反应结果。结果显示，咽侧体腺细胞内的BmFAMET蛋白在4龄幼虫初期明显多于5龄幼虫初期。

实施例2家蚕幼虫咽侧体细胞学分析

一种微型器官的处理方法，包括以下步骤：

(1)解剖家蚕幼虫，摘取脑—心侧体—咽侧体复合体，在PBS中剔除粘附在上的其它杂物；

(2)用处理液分两个阶段处理微型器官，每阶段在轻微震荡中浸泡5min，处理液配方为10μLTween-20，10mL 0.01M PBS；

(3)用4％的多聚甲醛(溶于0.1M PBS)在4℃中固定微型器官15h；

(4)用处理液分两阶段处理微型器官，每阶段在轻微震荡中浸泡15min，处理液配方为10μL Tween-20，10mL 0.01M PBS；

(5)将微型器官在透析液Ⅰ中4℃透析3天；透析液Ⅰ的配方：1M Tris 15mL，NaCl2.63g，Triton-X 1001.5mL，BSA 0.3g，pH 6.8；

(6)将微型器官在透析液Ⅱ中-20℃透析5h；透析液Ⅱ配方为乙醇80mL，DMSO20mL；

(7)用处理液分两阶段处理微型器官，每阶段在轻微震荡中浸泡12min；处理液配方为10μLTween-20，10mL 0.01M PBS；

(8)用DAPI染色液染色30min～2h；

(9)用处理液处理微型器官3次，每次处理分两阶段，每阶段在轻微震荡中浸泡18min；处理液配方为10μLTween-20，10mL 0.01M PBS；

(10)将微型器官依次放于50％、60％、70％、80％、90％、100％浓度的乙醇中进行脱水，每个浓度脱水15min。

在荧光显微镜下观察结果，如图3所示。红色箭头指示腺细胞核染色的咽侧体。A.小小咽侧体；B.放大可统计细胞核的咽侧体。

DAPI是细胞核特异染色剂。家蚕幼虫咽侧体是由一层非结缔组织薄膜包裹腺细胞构成。经过通透处理的家蚕幼虫咽侧体腺细胞能被DAPI染色，由此可以观察腺细胞数目及细胞核体积，来分析随家蚕幼虫生长发育咽侧体的细胞学变化。

Claims (4)

1.一种微型器官的处理方法，包括：采用体积比为1:1000的Tween-20和0.01M PBS配置的处理液中轻微震荡微型器官4次，固定前1次，固定后透析前1次，透析后2次；依次将固定后的微型器官在透析液Ⅰ中1～10℃透析2～5天，在透析液Ⅱ中-40～-15℃透析4～8h，所述透析液Ⅰ配方为1M Tris碱液中含10%的Triton-X 100、2%的BSA 以及0.05M 的NaCl，pH6.8；透析液Ⅱ配方为体积比为4:1的乙醇和二甲基亚砜(DMSO)；所述微型器官是指动物体内的微型器官，厚度在1mm以下。

2.如权利要求1所述的微型器官的处理方法，所述固定是采用溶于0.1M PBS的4%多聚甲醛在1～10℃中浸泡微型器官12～16h。

3.如权利要求1或2所述微型器官的处理方法，所述处理液处理步骤为两段式，每段采用处理液浸泡3-25min。

4.如权利要求1所述微型器官的处理方法，包括以下步骤：

（1）摘取新鲜的微型器官，在PBS中剔除粘附在上的其它杂物；

（2）用处理液分为两个阶段处理微型器官，每阶段3～5min；

（3）用多聚甲醛在1～10℃中固定微型器官12～16h；

（4）用处理液分为两个阶段处理微型器官，每阶段10～15min；

（5）将微型器官在透析液Ⅰ中1～10℃透析2～5天；

（6）将微型器官在透析液Ⅱ中-40～-15℃透析4～8h；

（7）用处理液分为两个阶段处理微型器官，每阶段10～15 min；

（8）将微型器官进行免疫反应、原位杂交或细胞学其它操作；

（9）用处理液处理微型器官2-3次，每次处理分两个阶段，每段15～25 min；

（10）依次放于50-100%的乙醇浓度由低到高的梯度中脱水5～30min。