CN106459920A - 治疗及检测癌症的组合物及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及治疗及检测癌症的组合物及方法。本文揭示包含结合至SSEA‑4之抗体或其抗原结合片段的医药组合物，以及其使用方法。使用方法包括(但不限于)癌症疗法及诊断。本发明之抗体可结合至某些癌细胞表面。本文所揭示之抗体之例示性标靶可包括癌瘤，诸如脑癌、肺癌、乳癌、口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆管癌、胰脏癌、结肠癌、肾癌、子宫颈癌、卵巢癌及/或前列腺癌中之彼等癌瘤。

Description

治疗及检测癌症的组合物及方法
技术领域
本发明涉及治疗及检测癌症的组合物及方法。本文揭示结合至Globo H、SSEA-3及/或SSEA-4的抗体，以及相关组合物及使用方法。使用方法包括(但不限于)癌症疗法及诊断。
背景技术
在恶性神经胶质瘤中占60％至70％的多形性胶质母细胞瘤(GBM)为最具侵袭性形式的神经胶质瘤且为成人中最常见的原发性脑肿瘤(1)。尽管许多疗法(包括手术及化学疗法或放射疗法)可用于GBM，但GBM患者的预后及存活率仍不良，其中值存活率为14至15个月(2)。已知GBM对大部分抗癌药物具有抗药性且极具浸润性，从而限制了完全手术切除，且因此大部分患者即使在多种疗法之后仍出现肿瘤复发或进展。由于死亡率高，因此已提出新颖的治疗方法(诸如免疫疗法及基因疗法)用于治疗GBM(3)。
糖基化改变为癌细胞的特征，且若干种聚糖结构为熟知的肿瘤标记(4,5)。此等异常变化包括以下方面的总体增强：N连接型聚糖的分支化(6)及唾液酸含量(7)，及某些聚糖抗原决定基(诸如唾液酸基刘易斯x(sialyl Lewis x，sLex)、唾液酸基Tn(sTn)、刘易斯y(Ley)、Globo H及聚唾液酸)的过度表达(8-10)。许多肿瘤亦展现某些醣脂(特定而言，神经节苷脂、唾液酸连接至聚糖链的鞘醣脂(GSL))的表达增强。神经节苷脂通常在神经系统中观测到，且发现在肿瘤中提高，尤其与恶性疾病有关的复杂神经节苷脂(11)。
已报导人类神经胶质瘤显示神经节苷脂的表达(12-18)。由于一些神经胶质瘤相关性神经节苷脂在正常组织中极少表达或甚至不存在(19)，因此其适于靶向疗法(20)。因此，发现新的神经胶质瘤相关性GSL将为开发针对神经胶质瘤的新疗法提供新标靶。
红血球系列中的GSL的特征为Galα1-4Gal键联至乳糖苷基神经酰胺，且此键联由乳糖苷基神经酰胺4-α-半乳糖苷基转移酶(A4GALT)催化。虽然脂酰鞘胺醇三已糖苷(Gb3Cer)及红血球糖苷脂(Gb4Cer)构成P血型系统的基础(21)，但半乳糖苷基红血球糖苷脂(Gb5Cer)及唾液酸基半乳糖苷基红血球糖苷脂(唾液酸基Gb5Cer、SGG、MSGG)(分别亦称为阶段特异性胚胎抗原-3(SSEA-3)及SSEA-4)(22)广泛用作定义人类胚胎干细胞的细胞表面标记。红血球系列GSL亦已在肿瘤中观测到，Globo H(海藻糖基Gb5Cer)在许多上皮细胞癌症中过度表达，诸如卵巢癌、胃癌、前列腺癌、肺癌、乳癌及胰脏癌(23)；SSEA-3、SSEA-4及Globo H不仅表达于乳癌细胞上，而且表达于乳癌干细胞上(24,25)。此外，观测到SSEA-4及二唾液酸苷基半乳糖苷基红血球糖苷脂(二唾液酸苷基Gb5Cer，DSGG)在肾细胞癌中的大量表达(26)，但红血球系列GSL是否表达于GBM上仍未知。
极感兴趣的是鉴别与癌症有关及/或预测癌症的聚糖标记，及开发针对此等标记的用于诊断及治疗广泛范围的癌症的抗体。
发明内容
本发明是基于如下发现：多形性胶质母细胞瘤(GBM)及其干细胞上存在多种聚糖标记。其中，GD2、GM2、GM1、GD1a、GT1b、A2B5、Tf、Tn、Globo H、SSEA3、SSEA4、CD24、CD44及CD90受到高度表达。一个惊人的发现为，表达于GBM及许多其他类型的癌症上、但不表达于正常细胞上的SSEA-4可充当开发治疗性抗体及疫苗的标靶。
本文所揭示的方法包括利用电池表面标记GD2、SSEA4及CD133及可使干细胞与其他细胞分离的流式细胞术使干细胞自GBM肿瘤细胞分离、富集及自行再生的方法。本文揭示包含分离的GD2+SSEA4+CD133+GBM干细胞群的组合物。
本发明亦基于如下发现：Globo H、SSEA-3及SSEA-4异常表达于广泛范围的癌症中，但不表达于正常细胞上。表达Globo H、SSEA-3及SSEA-4的癌症细胞包括(但不限于)脑癌、肺癌、乳癌、口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆管癌、胰脏癌、结肠癌、肾癌、子宫颈癌、卵巢癌及前列腺癌。
三重靶向Globo H、SSEA-3及SSEA-4的抗体、双重靶向Globo H及SSEA-3的抗体，及抗SSEA-4抗体已开发且揭示于本文中。本发明的抗体可用于治疗、诊断或用作研究工具。
抗体可靶向的细胞包括癌瘤，诸如脑癌、肺癌、乳癌、口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆管癌、胰脏癌、结肠癌、肾癌、子宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌中的那些细胞。
因此，本发明的一态样提供三重靶向Globo H、SSEA3及SSEA-4的分离抗体。三重靶向抗体特异性结合至Fucα1→2Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1(Globo H六醣)及Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1(SSEA-3五醣)及Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1(SSEA-4六醣)。在一个实例中，三重靶向抗体为mAb651。
本发明的另一态样提供双重靶向Globo H及SSEA3的分离抗体。双重靶向抗体特异性结合至Fucα1→2Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1(Globo H六醣)及Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1(SSEA-3五醣)。在一个实例中，双重靶向抗体为mAb 273。
在又一态样中，本发明提供对SSEA-4具有特异性的分离抗体。抗SSEA-4抗体结合至Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1(SSEA-4六醣)。在一些实例中，抗体能够结合Neu5Gcα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1(SSEA-4六醣的类似物)。优选地，抗体不为小鼠IgG3(例如mAb MC-831-70)，且抗体不为小鼠IgM(例如抗RM1)。抗体的实例包括(但不限于)mAb 45及48。
本发明的另一态样提供对SSEA-4具有特异性的分离抗体及其片段。抗SSEA-4抗体结合至Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1(SSEA-4六醣)及Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1(SSEA-4六醣的片段)。在一些实例中，抗体能够结合至Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galβ1。在一些实例中，抗体能够结合至Neu5Gcα2→3Galβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1(SSEA-4六醣的类似物)。在一个实例中，抗体为mAb 46。
在一个态样中，本发明提供分离抗体或其抗原结合片段，包含如表I(图16)中所列、分别选自(i)至(iii)的H-CDR1、H-CDR2及H-CDR3：
(i)选自SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:56的H-CDR1；
(ii)选自SEQ ID NO:54或SEQ ID NO:58的H-CDR2；
(iii)选自SEQ ID NO:60或SEQ ID NO:63的H-CDR3；
且包含分别选自(iv)至(vi)的L-CDR1、L-CDR2及L-CDR3：
(iv)选自SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:70的L-CDR1；
(v)选自SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:72的L-CDR2；及
(vi)选自SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:77的L-CDR3。
在某些实施例中，分离抗体或抗原结合片段进一步包含如表I(图16)中所列、分别选自(i)至(iv)的H-FR1、H-FR2、H-FR3及H-FR4：
(i)选自SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:55的H-FR1；
(ii)选自SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:57的H-FR2；
(iii)选自SEQ ID NO:59或SEQ ID NO:62的H-FR3；
(iv)选自SEQ ID NO:61或SEQ ID NO:64的H-FR4；
且包含分别选自(v)至(viii)的L-FR1、L-FR2、L-FR3及L-FR4：
(v)选自SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:69的L-FR1；
(vi)选自SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:71的L-FR2；
(vii)选自SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:76的L-FR3；
(viii)选自SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:78的L-FR4。
在某些其他实施例中，分离抗体或抗原结合片段可视情况或替代地改包含与SEQID NO:51至78中的任一者的氨基酸序列不同的氨基酸序列，不同之处为少于三个保守性氨基酸取代。
16.在一个态样中，本发明亦提供分离的抗SSEA4人类化抗体或其抗原结合片段，包含如表II(图16)中所列、分别选自(i)至(iii)的H-CDR1、H-CDR2及H-CDR3：
(i)具有序列SEQ ID NO:80的H-CDR1；
(ii)具有序列SEQ ID NO:82的H-CDR2；
(iii)具有序列SEQ ID NO:90的H-CDR3；
且包含分别选自(iv)至(vi)的L-CDR1、L-CDR2及L-CDR3：
(iv)具有序列SEQ ID NO:99的L-CDR1；
(v)具有序列SEQ ID NO:101的L-CDR2；及
(vi)具有序列SEQ ID NO:109的L-CDR3。
在某些实施例中，分离抗体或抗原结合片段进一步包含如表I中所列、分别选自(i)至(iv)的H-FR1、H-FR2、H-FR3及H-FR4：
(i)选自SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85或SEQ ID NO:87的H-FR1；
(ii)选自SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86或SEQ ID NO:88的H-FR2；
(iii)选自SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94或SEQ ID NO:96的H-FR3；
(iv)选自SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95或SEQ ID NO:97的H-FR4；且包含分别选自(v)至(viii)的L-FR1、L-FR2、L-FR3及L-FR4：
(v)选自SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104或SEQ ID NO:106的L-FR1；
(vi)选自SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:105或SEQ ID NO:107的L-FR2；
(vii)选自SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113或SEQ ID NO:114的L-FR3；
(viii)选自SEQ ID NO:110或SEQ ID NO:112的L-FR4。
在某些实施例中，分离抗体或抗原结合片段可视情况或替代地改包含与SEQ IDNO:79至114中的任一者的氨基酸序列不同的氨基酸序列，不同之处为少于十个保守性氨基酸取代。
本文所述的例示性抗体可具有以下一或多个特征：
a)为重组抗体、单株抗体、嵌合抗体、人类化抗体、人类抗体、抗体片段、双特异性抗体、单特异性抗体、单价抗体、IgG1抗体、IgG2抗体，抗体衍生物；b)为人类、鼠类、人类化或嵌合抗体、抗原结合片段，或抗体衍生物；c)为单链抗体片段、多抗体、Fab片段，及/或免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、IgE、IgD同型及/或其亚类；d)具有一或多个以下特征：(i)介导癌细胞的ADCC及/或CDC；(ii)诱导及/或促进癌细胞发生细胞凋亡；(iii)抑制靶细胞癌细胞的增殖；(iv)诱导及/或促进癌细胞发生吞噬；及/或(v)诱导及/或促进细胞毒性剂的释放；e)不结合非癌细胞、非肿瘤细胞、良性癌细胞及/或良性肿瘤细胞上所表达的抗原。
在一些实例中，本文所述的任一种抗体可通过噬菌体呈现抗体文库或单一B细胞(利用患者B细胞或康复患者或健康人士的B细胞)、以Fab或单链形式产生。
在另一态样中，本发明提供治疗方法，包括向需要此治疗的个体投与治疗有效量的包括一或多种本文所述抗体的组合物。
在一些实施例中，需要治疗的个体(例如人类患者)经诊断患有、怀疑患有癌症或处于癌症的风险中。癌症实例包括(但不限于)脑癌、肺癌、乳癌、口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆管癌、胰脏癌、结肠癌、肾癌、子宫颈癌、卵巢癌及前列腺癌。在一些实施例中，癌症为脑癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌或胰脏癌。在一些优选实施例中，癌症为脑癌或多形性胶质母细胞瘤(GBM)癌症。
在一些实施例中，抗体能够靶向表达Globo H、SSEA-3及SSEA-4的癌细胞。在一些实施例中，抗体能够靶向癌细胞上的Globo H及SSEA。在一些实施例中，抗体能够靶向癌症中的SSEA。
因此，例示性抗体为针对Globo H、SSEA-3及SSEA-4的三重靶向抗体。在一些实施例中，抗体为针对Globo H及SSEA-3的双重靶向抗体与抗SSEA-4抗体的混合物。在一些实施例中，抗体为针对Globo H、SSEA-3及SSEA-4的三重靶向抗体与抗SSEA-4抗体的混合物。在一些实施例中，抗体为抗Globo H、抗SSEA-3及抗SSEA-4抗体的混合物。在一些实施例中，抗体为抗Globo H与抗SSEA-4抗体的混合物。在一些实施例中，抗体为抗SSEA-4抗体。
治疗可减小肿瘤尺寸、消除恶性细胞、预防癌转移、预防复发、减少或杀死播散性癌症、延长存活期及/或延长肿瘤癌症进展的时间。
在一些实施例中，治疗进一步包含在所述投与抗体之前、期间或之后投与另一种疗法。在一些实施例中，另一种疗法是用化学治疗剂治疗。在一些实施例中，另一种疗法为辐射疗法。
此外，本发明提供一种诊断个体的癌症的方法，包含(a)将包括一或多种单株抗体的组合物施加于获自个体的细胞或组织样品，这些单株抗体侦测由GM3、GM2、GM1、GD1、GD1a、GD3、GD2、GT1b、A2B5、LeX、sLeX、LeY、SSEA-3、SSEA-4、Globo H、TF、Tn、sTn、CD44、CD24、CD45、CD90、CD133组成之一组标记的表达；(b)分析单株抗体与细胞或组织样品的结合；及(c)将此结合与正常对照值比较，以确定个体中癌症的存在。
用于侦测及诊断的癌症实例包括(但不限于)脑癌、肺癌、乳癌、口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆管癌、胰脏癌、结肠癌、肾癌、子宫颈癌、卵巢癌及前列腺癌。在一些实施例中，癌症为脑癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌或胰脏癌。
在一些实施例中，标记是由GD2、GM2、GM1、GD1a、GT1b、A2B5、Tf、Tn、Globo H、SSEA3、SSEA4、CD24、CD44及CD90组成。在一些实施例中，组合物包括能够侦测GD2、GM2、GM1、GD1a、GT1b、A2B5、Tf、Tn、Globo H、SSEA3、SSEA4、CD24、CD44及CD90的多种单株抗体。
在一些实施例中，标记是由Globo H、SSEA-3及SSEA-4组成。在一些实施例中，抗体为针对Globo H、SSEA-3及SSEA-4的三重靶向抗体。在一些实施例中，抗体为针对Globo H及SSEA-3的双重靶向抗体与抗SSEA-4抗体的混合物。在一些实施例中，抗体为抗Globo H、抗SSEA-3与抗SSEA-4抗体的混合物。
在一些实施例中，癌症为脑癌或多形性胶质母细胞瘤(GBM)癌症，且抗体为抗SSEA-4单株抗体。
本发明的另一态样提供一种对人类患者中的肿瘤进行分期及/或确定预后的方法，所述方法包含：(a)将包括一或多种抗体的组合物施加于获自患者的细胞或组织样品，这些抗体侦测由SSEA-3、SSEA-4及Globo H组成的标记的表达；(b)分析单株抗体与细胞或组织样品的结合；(c)将测试样品中的标记表达量与参考样品中的表达量进行比较；及(d)根据步骤(c)中鉴别的结果来确定患者肿瘤的分期及/或预后。
在一些实施例中，癌症为脑癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌或胰脏癌。在一些优选实施例中，癌症为脑癌或GBM。
在一些实施例中，标记是由Globo H、SSEA-3及SSEA-4组成。在一些实施例中，抗体为针对Globo H、SSEA-3及SSEA-4的三重靶向抗体。在一些实施例中，抗体为针对Globo H及SSEA-3的双重靶向抗体与抗SSEA-4抗体的混合物。在一些实施例中，抗体为抗Globo H、抗SSEA-3与抗SSEA-4抗体的混合物。
在一些实施例中，癌症为脑癌或多形性胶质母细胞瘤(GBM)癌症，且抗体为抗SSEA-4单株抗体。
在又一态样中，本发明提供医药组合物用于治疗癌症，诸如脑癌、肺癌、乳癌、口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆管癌、胰脏癌、结肠癌、肾癌、子宫颈癌、卵巢癌及前列腺癌等。医药组合物包含此等抗体中的任一者或编码其的核酸及医药学上可接受的载剂，及这些医药组合物用于制造供治疗癌症用的药剂的用途。
本发明的一或多个实施例的细节阐述于以下描述中。本发明的其他特征或优点自以下诸图及实施方式以及随附申请专利范围将显而易见。
附图说明
图1.抗SSEA-4mAb针对GBM细胞株的结合特征。(A)红血球系列GSL的生物合成示意图。SSEA-3(SSEA-4及Globo H的前驱物)是由红血球糖苷脂合成。糖苷键联及图形符号系经标记(Glc：葡萄糖；Gal：半乳糖；GalNAc：N-乙酰基半乳胺糖；Fuc：海藻糖；NeuAc：N-乙酰基神经胺糖酸)。(B)GBM细胞系经Alexa Fluor 488结合的MC813-70染色且染色强度系使用流式细胞术分析。除SVG p12(其为经SV40大T抗原转型的正常人类胎儿神经胶质细胞株)之外，所检查的全部细胞为GBM细胞株。经MC813-70染色的细胞及同型对照组的直方图分别以灰色及白色显示。
图2.抗体的聚糖结合概况。玻璃载片上的聚糖微数组与Alexa Flour 647结合的抗体(10μg/mL)相互作用且用数组扫描仪在635nm下读取。数据系以平均值±SD呈现。(A)mAb 273的结合概况；(B)mAb 651的结合概况；(C)mAb VK9的结合概况；(D)mAb Mbr1的结合概况；(E)mAb 45的结合概况；(F)mAb 46的结合概况；(G)mAb 48的结合概况；(H)MC813-70的结合概况。
图3.来自GBM细胞株的神经节苷脂的HPTLC免疫染色及MALDI-MS概况。(A)用HPTLC盘上分离神经节苷脂且用MC813-70mAb侦测。分别使用来自2012Ep(人类胚胎癌瘤细胞株)及YAC-1(小鼠淋巴瘤细胞株)的神经节苷脂充当SSEA-4及GM1b的阳性对照物。具有不同脂肪酸链长度的SSEA-4系以两个闭合带形式迁移。(B)使自DBTRG GBM细胞萃取的神经节苷脂发生全甲基化且通过MALDI-MS加以分析。DBTRG细胞中的主要神经节苷脂为GM3(m/z＝1371.9)、GM2(m/z＝1617.0)、Neu5Ac-(n)Lc4/Gg4Cer(m/z＝1821.1)，及Neu5Ac2-(n)Lc4/Gg4Cer(m/z＝2182.3)。尽管信号相对较弱，然亦观测到SSEA-4(Neu5Ac-Hex4-HexNAc-Cer，m/z＝2025.2)。聚糖部分相同、但脂肪酰基含量不同的神经节苷脂用括号标示。
图4.GBM中的SSEA-4的表达图谱。正常脑组织(A)及GBM(B)在经MC-813-70免疫组织化学染色之后的代表性影像。图B中的插图显示小矩形区域的放大图像。比例尺：100μm。(C)SSEA-4IHC的统计结果。GBM样品的染色强度分级如下：0 (阴性，i)、1+(弱，ii)、2+(中度，iii)及3+(强，iv)。比例尺：100μm。I级(n＝15)，II级(n＝31)、III级(n＝24)、IV级(GBM，n＝55)样品及正常脑组织(n＝19)系在IHC之后用苏木精(hematoxylin)进行对比染色。组织染色强度分级如下：0(阴性)、1+(弱)、2+(中度)及3+(强)。
图5.抗SSEA-4的补体依赖性细胞毒性(CDC)作用。
(A)MC813-70对GBM的作用。GBM细胞株经20μg/mL兔补体处理以观测MC813-70诱导的细胞溶解。MC813-70的CDC活性系利用乳酸脱氢酶(LDH)释放分析来量测，如「材料及方法」中所述。数据系以平均值±SD显示。(B)活体外mAb 273对MCF-7的作用。(C)活体外mAb46及48对人类胰脏癌细胞BxPC3的作用。将肿瘤细胞的等分试样(104个细胞)与80μL不同浓度的抗体一起在20μL作为补体源的人类血清或兔血清存在下、在37℃培育2小时。添加7-胺基-放线菌素D(7-AAD)之后，测定肿瘤细胞群内的细胞毒性。
图6.抗SSEA-4对DBTRG肿瘤生长的抑制作用。雄裸鼠在第0天、在右侧腹接种DBTRG细胞，在第11、15及19天腹膜内投与MC813-70或小鼠IgG3同型对照物(每剂200μg)，且在第31天处死。在不同时间点量测每一组(n＝3)的肿瘤体积且以平均值±SD显示。依据双向ANOVA获得P＝0.001。
图7.抗体与癌细胞的结合。(A)乳癌细胞MCF-7经mAb 273染色。(B)胰脏癌细胞(HPAC及BxPC3)及乳癌细胞MCF-7经mAb 45染色。(C)胰脏癌细胞(HPAC及BxPC3)及乳癌细胞MCF-7经mAb 46染色。(D)胰脏癌细胞(HPAC及BxPC3)及乳癌细胞MCF-7经mAb 48染色。此等细胞系经Alexa Fluor 488结合的抗体染色且染色强度系使用流式细胞术分析。经mAb及同型对照物染色的细胞分别以蓝色及红色显示。
图8.mAb 45、mAb 46及mAb 48氨基酸序列的比较。多序列比对时，ClustalW系使用渐进式比对方法。
图9.人类IgG抗体表达载体。
图10.通过噬菌体呈现的人类原生scFv文库，针对SSEA-4进行的生物淘选。选择结合至SSEA-4、经噬菌体呈现的scFv。利用经噬菌体呈现的人类原生scFv文库选择结合至与SSEA-4-PEG结合的戴诺珠粒的噬菌体。相较于第一轮，第五轮生物淘选之后的噬菌体回收率增加。在生物淘选过程中，使用PBS(A)及含有0.01％Tween20的PBS(B)作为洗涤缓冲液系统。
图11.通过ELISA筛选结合至SSEA-4、经噬菌体呈现的scFv。
经由可展现不同结合的ELISA筛选经随机选择的噬菌体纯系。(A)群落选自PBS洗涤组。(B至D)群落选自PBST0.01洗涤组。发现八种噬菌体纯系对于SSEA-4-BSA具有优良的结合活性(A490≧0.2)。对照噬菌体用作阴性对照(Neg.)。市售抗SSEA-4mAb(MC813-70)用作阳性对照(Pos)。A490：490nm吸亮度。
图12.抗SSEA-4噬菌体纯系针对红血球系列聚糖的结合活性的比较。进行ELISA以检查抗SSEA-4噬菌体纯系与SSEA-4-BSA、Globo H-BSA及SSEA-3-BSA的结合。市售抗SSEA-4小鼠单株抗体(MC813-70)及对照噬菌体(Con-phage)分别用作阳性及阴性对照。pMC48为翁博士实验室(Dr.Wong's Lab)产生的经噬菌体呈现的scFv形式的抗SSEA-4小鼠mAb。A490：490nm吸亮度。
图13.通过ELISA对p2-78hAb的结合活性的分析。(A)利用库马斯蓝染色(coomassie blue staining)、通过SDS-PAGE分析IgG纯度。(B)进行ELISA以检查1μg/mL抗SSEA-4hAb与聚糖的结合，如图所示。市售抗SSEA-4小鼠单株抗体(MC813-70；0.5μg/mL)及正常人类IgG(NHIgG)分别用作阳性及阴性对照。H.C.：重链。L.C.：轻链。A490：490nm吸亮度。
图14.通过聚糖数组分析p2-78hAb的结合活性。
(A)市售IgM抗体MC631(5μg/mL)用作阳性对照。(B)p2-78hAb(7.5μg/mL)识别SSEA4、唾液酸基-SSEA4、SSEA4Gc及Gb5(SSEA3)，及GloboH。
图15.hMC48scFv噬菌体纯系的结合分析。
通过ELISA检查人类化MC48纯系的结合活性。人类化MC48变异体的第3种scFv噬菌体纯系可以剂量依赖性方式结合至SSEA-4(A)，但不结合至BSA对照蛋白(B)。
具体实施方式
因此，提供用于诊断及治疗广泛范围的癌症的针对标记的抗体方法及组合物。三重靶向Globo H、SSEA-3及SSEA-4的抗体、双重靶向Globo H及SSEA-3的抗体，及抗SSEA-4抗体已开发且揭示于本文中。使用方法包括(但不限于)癌症疗法及诊断。本文所述的抗体可结合至广泛范围的表达Globo H、SSEA3及SSEA-4的癌细胞，藉此有助于癌症诊断及治疗。抗体可靶向的细胞包括癌瘤，诸如脑癌、肺癌、乳癌、口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆管癌、胰脏癌、结肠癌、肾癌、子宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌等癌症中的那些细胞。
定义
除非另有说明，否则本发明的实施将采用此项技术范围内的习知分子生物学、微生物学、重组DNA及免疫学技术。参见例如Molecular Cloning A Laboratory Manual,第2版,Sambrook,Fritsch及Maniatis编(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)；DNACloning,第I及II卷(D.N.Glover编,1985)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986)；B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；the treatise,Methods InEnzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.)；Gene Transfer Vectors For MammalianCells(J.H.Miller及M.P.Calos编,1987,Cold Spring Harbor Laboratory)；Methods InEnzymology,第154及155卷(Wu等人编),Immunochemical Methods In Cell AndMolecular Biology(Mayer及Walker编,Academic Press,London,1987)；Antibodies:ALaboratory Manual,Harlow及Lane s(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988)；及Handbook Of Experimental Immunology,第I-IV卷(D.M.Weir及C.C.Blackwell编,1986)。
如本文所使用，术语「聚糖」系指多醣或寡醣。聚糖在本文中亦用于指糖结合物的碳水化合物部分，诸如醣蛋白、糖脂、醣肽、醣蛋白质组、肽聚糖、脂多醣或蛋白聚糖。聚糖通常仅由单醣之间的O-糖苷键联组成。举例而言，纤维素为由β-1,4-连接型D-葡萄糖组成的聚糖(或更特定而言，葡聚糖)，且甲壳素为由β-1,4-连接型N-乙酰基-D-葡糖胺组成的聚糖。聚糖可为单醣残基的同型聚合物或异型聚合物，且可为线性或分支的。可发现聚糖连接至蛋白质，如醣蛋白及蛋白聚糖中。其通常发现于细胞外表面上。O连接型及N连接型聚糖在真核生物中很常见，而且可发现于原核生物中(然而不常见)。发现N连接型聚糖连接至序列子中的天冬酰胺的R族氮(N)。序列子为Asn-X-Ser或Asn-X-Thr序列，其中X为除坚果糖之外的任何氨基酸。
如本文所使用，术语「抗原」定义为能够引发免疫反应的任何物质。
如本文所使用，术语「免疫原性」系指免疫原、抗原或疫苗刺激免疫反应的能力。
如本文所使用，术语「CD1d」系指各种人类抗原呈递细胞表面上所表达的醣蛋白的CD1(分化丛集1)家族的一员。CD1d呈递的脂质抗原活化天然杀手T细胞。CD1d具有供糖脂抗原结合于其中的较深抗原结合凹槽。树突状细胞上所表达的CD1d分子可结合及呈递醣脂，包括α-GalCer类似物，诸如C34。
如本文所使用，术语「抗原决定基」定义为抗原分子的一部分，此部分接触抗体或T细胞受体的抗原结合位点。
如本文所使用，术语「疫苗」系指含有抗原的制剂，其由完整致病生物体(杀死或减毒)或这些生物体的组分(诸如蛋白质、肽或多醣)组成，用于赋予针对这些生物体所致的疾病的免疫力。疫苗制剂可为天然的、合成的或通过重组DNA技术获得。
如本文所使用，术语「抗原特异性」系指细胞群的一种特性，其使得特定抗原或抗原片段的供应引起特异性细胞增殖。
如本文所使用，术语「特异性结合」系指结合对(例如抗体与抗原)之间的相互作用。在各种情形下，特异性结合可以约10-6莫耳/公升、约10-7莫耳/公升或约10-8莫耳/公升或小于10-8莫耳/公升的亲和力常数体现。
「经分离」抗体为已鉴别且与其天然环境的组分分离及/或自其天然环境的组分中回收的抗体。其自然环境的污染物成分为干扰抗体研究、诊断性或治疗性使用的物质，且可包括酶、激素及其他蛋白性或非蛋白性溶质。在一个实施例中，抗体(1)纯化至抗体纯度大于95wt％，如通过例如洛瑞方法(Lowry method)所测定，且在有些实施例中超过99wt％；(2)纯化的程度足以通过使用例如旋杯式测序仪获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基；或(3)纯化至均质，此系通过使用例如库马斯蓝或银染剂、在还原或非还原条件下进行SDS-PAGE所达成。由于抗体天然环境中的至少一种组分将不存在，因此分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将由至少一个纯化步骤来制备。
如本文所用，词组「实质上相似」、「实质上相同」、「等效」或「实质上等效」表示两个数值(例如一者与一分子相关且另一者与参考分子/比较分子相关)之间具有足够高的相似度，从而使熟习此项技术者认为在依据这些值(例如Kd值、抗病毒作用等)量度的生物学特征的背景下，所述两个值之间的差异具有极小或不具有生物学及/或统计学显著性。所述两个值之间的差异例如为参考/比较分子的值的小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％及/或小于约10％。
如本文所用，词组「实质上减少」或「实质上不同」表示两个数值(通常，一者与一种分子相关且另一者与参考/比较分子相关)之间的差异程度足够大，使得熟习此项技术者认为在依据这些值(例如Kd值)所量度的生物学特征的背景下，两值之间的差异具有统计学显著性。所述两个值之间的差异例如为参考/比较分子的值的大于约10％、大于约20％、大于约30％、大于约40％及/或大于约50％。
「结合亲和力」一般系指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合搭配物(例如抗原)间的非共价相互作用的总强度。除非另有说明，否则如本文所使用的「结合亲和力」系指反映结合对(例如抗体与抗原)成员之间1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其搭配物Y的亲和力一般可由解离常数(Kd)表示。可通过此项技术中已知的常用方法(包括本文所述的方法)量测亲和力。低亲和力抗体一般与抗原缓慢结合且倾向于容易解离，而高亲和力抗体一般与抗原结合较快且倾向于保持较长时间结合。此项技术中已知多种量测结合亲和力的方法，这些方法中的任一者均可用于达成本发明的目的。以下描述特定说明性实施例。
在一个实施例中，根据本发明的「Kd」或「Kd值」系通过放射性标记抗原结合性分析(RIA)量测，所述分析利用所关注的抗体的Fab形式及其抗原执行，如以下分析所述。Fab对抗原的溶液结合亲和力系通过在滴定系列的非标记抗原的存在下用最小浓度的(125I)标记抗原平衡Fab、接着用涂有抗Fab抗体的孔盘捕捉结合抗原来量测(Chen等人,(1999)J.MolBiol293:865-881)。为建立分析条件，用50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/ml捕捉抗-Fab抗体(Cappel Lab)将微量滴定盘(Dynex)涂布隔夜，且随后在室温下(约23℃)用PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白阻断两至五小时。在非吸附性盘(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与所关注的Fab的连续稀释液混合(例如，符合Presta等人,(1997)Cancer Res.57:4593-4599中对抗VEGF抗体、Fab-12的评估)。随后培育所关注的Fab隔夜；然而，培育可持续一段较长的时间(例如65小时)以确保达到平衡。此后，在室温下将混合物转移至捕捉盘中用于培育(例如1小时)。随后移除溶液且用含0.1％Tween-20的PBS洗涤盘8次。当盘干燥时，添加150微升/孔的闪烁体(MicroScint-20；Packard)，且盘用Topcount伽玛计数器(Packard)计数十分钟。选择提供小于或等于20％最大结合的各Fab的浓度用于竞争性结合分析。根据另一个实施例，Kd或Kd值系通过使用表面电浆子共振分析、在25℃使用固定有抗原、约10个反应单位(RU)的CM5芯片的BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,N.J.)来量测。简而言之，根据供货商的说明书用N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)及N-羟基丁二酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5,BIAcore Inc)。用10mM乙酸钠(pH 4.8)将抗原稀释至5μg/ml(约0.2μM)，随后以5微升/分钟的流速注射以使偶合蛋白质达成约10个反应单位(RU)。继注射抗原之后，注射1M乙醇胺以阻断未反应基团。在每个实验中，活化斑点且乙醇胺阻断而不固定蛋白质，以用于参考性扣除。在动力学量测中，在25℃，以约25μl/min的流速注射Fab于含0.05％Tween 20的PBS(PBST)中的两倍连续稀释液(0.78nM至500nM)。使用简单的一比一朗格缪尔结合模型(one-to-one Langmuir binding model)(评估软件3.2版)、通过同时拟合结合及解离感测图谱来计算结合速率(kon)及解离速率(koff)。以koff/kon比率来计算平衡解离常数(Kd)。参见例如Chen,Y.等人,(1999)J.Mol Biol 293:865-881。若通过上述表面电浆子共振分析法得到的结合速率超过106M-1s-1，则结合速率可使用荧光淬灭技术测定，所述技术系量测PBS(pH 7.2)中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)在25℃、在浓度递增的抗原存在下的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的增加或减少，如用光谱仪(诸如具有搅拌式比色管的止流装备型光谱亮度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-Aminco光谱亮度计(ThermoSpectronic))所量测。
根据本发明的「结合速率」或「kon」亦可使用上述相同表面电浆子共振技术、在25℃使用具有约10个反应单位(RU)的固定有抗原的CM5芯片的BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)来测定。简而言的，根据供货商的说明书，用N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)及N-羟基丁二酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5,BIAcore Inc)。用10mM乙酸钠(pH 4.8)将抗原稀释至5μg/ml(约0.2μM)，随后以5微升/分钟的流速注射以使偶合蛋白质达成约10个反应单位(RU)。继注射抗原之后，注射1M乙醇胺以阻断未反应基团。在动力学量测中，在25℃，以约25μl/min的流速注射Fab于含0.05％Tween 20的PBS(PBST)中的两倍连续稀释液(0.78nM至500nM)。使用简单的一比一朗格缪尔结合模型(评估软件3.2版)、通过同时拟合结合及解离感测图谱来计算结合速率(kon)及解离速率(koff)。以比率koff/kon来计算平衡解离常数(Kd)。参见例如Chen,Y.等人,(1999)J.Mol Biol 293:865-881。然而，若通过上述表面电浆子共振分析法得到的结合速率超过106M-1s-1，则结合速率可使用荧光淬灭技术测定，所述技术系量测PBS(pH 7.2)中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)在25℃、在浓度递增的抗原存在下的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的增加或减少，如用光谱仪(诸如具有搅拌式比色管的止流装备型光谱亮度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-Aminco光谱亮度计(ThermoSpectronic))所量测。
如本文所使用的术语「载体」意指能够转运所连接的另一核酸分子的核酸分子。一类载体为「质粒」，其系指其他DNA区段可接合于其中的环状双股DNA环。另一类载体为噬菌体载体。另一种类型的载体为病毒载体，其中可将其他DNA区段接合至病毒基因组。某些载体能够在引入这些载体的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体及游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)可在引入宿主细胞之后整合至宿主细胞基因组中，且从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够引导其操作性连接的基因的表达。在本文中将此等载体称为「重组表达载体」(或简称为「重组载体」)。一般而言，适用于重组DNA技术中的表达载体通常呈质粒形式。在本说明书中，由于质粒为最常用的载体形式，故「质粒」与「载体」可互换使用。
如本文中可互换使用的「聚核苷酸」或「核酸」系指任何长度的核苷酸的聚合物，且包括DNA及RNA。核苷酸可为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基及/或其类似物，或可通过DNA或RNA聚合酶或合成反应并入聚合物中的任何受质。聚核苷酸可包含经修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。若存在，则可在装配聚合物之前或之后对核苷酸结构进行修饰。核苷酸序列可间杂有非核苷酸组分。聚核苷酸可在合成之后进一步修饰，诸如与标记结合。其他类型的修饰包括例如一或多种天然存在的核苷酸经类似物的「帽」取代；核苷酸间修饰，诸如具有不带电荷键联的那些物(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酸、胺基甲酸酯等)及具有带电荷键联的那些物(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、含有侧接部分的那些物(诸如蛋白(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、ply-L-离胺酸等)、具有嵌入剂的那些物(例如吖啶(acridine)、补骨脂素(psoralen)等)、含有螯合剂的那些物(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)、含有烷化剂的那些物、具有经修饰的键联的那些物(例如α变旋异构体核酸等)，以及聚核苷酸的未修饰形式。另外，通常存在于糖中的任何羟基均可例如经膦酸酯基、磷酸酯基置换，经标准保护基团保护或经活化以制备与其他核苷酸的其他键联；或可与固体或半固体支撑物结合。5'及3'末端OH可经磷酸化或经1至20个碳原子的胺或有机封端基部分取代。其他羟基亦可相对于标准保护基加以衍生。聚核苷酸亦可含有此项技术中通常已知的核糖或脱氧核糖类似形式，包括例如2'-O-甲基-核糖、2'-O-烯丙基核糖、2'-氟-核糖或2'-迭氮基-核糖、碳环形糖类似物、α-变旋异构体糖、差向异构体糖(诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖(lyxoses)、哌喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖(sedoheptuloses))、非环形类似物及基本核苷类似物，诸如甲基核糖核苷。一或多个磷酸二酯键联可经替代性键联基置换。这些替代性连接基团包括(但不限于)其中磷酸酯基经P(O)S(「硫代酸酯基」)、P(S)S(「二硫代酸酯基」)、(O)NR2(「酰胺化物」)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2(「甲缩醛」)置换的实施例，其中每个R或R'独立地为H或视情况含有醚(-O-)键联的经取代或未经取代的烷基(1-20个C)、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳醛基。聚核苷酸中并非所有键需要相同。上述描述适用于本文中所提及的所有聚核苷酸，包括RNA及DNA。
如本文中所使用，「寡核苷酸」泛指通常为单股、通常为合成的短聚核苷酸，其长度通常(但不一定)小于约200个核苷酸。术语「寡核苷酸」及「聚核苷酸」并不相互排除。上文有关聚核苷酸的描述同样且完全适用于寡核苷酸。
「抗体」(Ab)及「免疫球蛋白」(Ig)为具有相同结构特征的醣蛋白。虽然抗体对于特定抗原展现结合特异性，但免疫球蛋白包括抗体与通常缺乏抗原特异性的其他抗体样分子。后一类多肽例如由淋巴系统在低含量下及由骨髓瘤在高含量下产生。
术语「抗体」与「免疫球蛋白」在广义上可互换使用，且包括单株抗体(例如全长或完整单株抗体)、多株抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体，只要其展现出所需的生物活性即可)，且亦可包括某些抗体片段(如本文更详细地描述)。抗体可为嵌合抗体、人类抗体、人类化抗体及/或亲和力成熟抗体。
抗体的「可变区」或「可变域」系指抗体的重链或轻链的胺基末端域。这些域通常为抗体的最易变部分且含有抗原结合位点。
术语「可变」系指抗体间可变域的某些部分的序列广泛不同且这些部分用于各特定抗体对其特定抗原的结合及特异性的事实。然而，可变性在整个抗体可变域中并非均匀分布。其集中于轻链与重链可变域中称为互补决定区(CDR)或高变区的三个区段。可变域的较高保守度部分称为构架(FR)。天然重链及轻链的可变域各包含四个通过三个CDR所连接(形成环连接)、主要采用β-片状构型(在有些状况中形成β-片状结构的一部分)的FR区。各链中的CDR由FR区紧密连在一起且与来自其它链的CDR一起参与抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,National Institute of Health,Bethesda,Md.(1991))。恒定域不直接涉及抗体与抗原的结合，但展现各种效应功能，诸如使抗体参与抗体依赖性细胞毒性。
木瓜蛋白酶消化抗体产生两个称为「Fab」片段的相同抗原结合片段，各具有单一抗原结合位点；及一残余「Fc」片段，其名称反映其易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点且仍能够与抗原交联的F(ab')2片段。
「Fv」为含有完整抗原识别位点及结合位点的最小抗体片段。在双链Fv种类中，此区域系由一个重链可变域与一个轻链可变域非共价紧密结合的二聚体组成。在单链Fv种类中，一个重链可变域与一个轻链可变域可经柔性肽连接符共价连接，从而使轻链与重链可以与双链Fv种类中的结构类似的「二聚」结构结合。在此构型中，各可变域的3个CDR相互作用以界定VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。总体而言，六个CDR赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使单个可变域(或包含仅三个对抗原具有特异性的CDR的一半Fv)亦具有识别及结合抗原的能力，但亲和力比整个结合位点低。
Fab片段亦含有轻链恒定域及重链第一恒定域(CH1)。Fab'片段与Fab片段不同之处在于在重链CH1域的羧基末端处添加包括一或多个来自抗体铰链区的半胱胺酸的数个残基。Fab'-SH在本文中指代恒定域的半胱胺酸残基带有游离硫醇基的Fab'。F(ab')2抗体片段最初系以彼此间具有铰链半胱胺酸的Fab'片段对形式产生。亦已知抗体片段的其他化学偶合。
来自任何脊椎动物种的抗体(免疫球蛋白)的「轻链」基于其恒定域的氨基酸序列可归类为两种明显不同类型(称作κ及λ)之一。
抗体(免疫球蛋白)视其重链的恒定域的氨基酸序列而定可归为不同类。免疫球蛋白有五种主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等类别中数个类别可进一步分成亚类(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ及μ。不同类别的免疫球蛋白的亚单元结构及三维构型已熟知且一般性描述于例如Abbas等人,Cellular and Mol.Immunology,第4版(2000)中。一种抗体可为由所述抗体与一或多种其他蛋白质或肽共价或非共价结合所形成的较大融合分子的一部分。
术语「全长抗体」、「完整抗体」及「整个抗体」在本文中可互换地使用，其系指实质上呈完整形式的抗体，而非如下定义的抗体片段。这些术语尤其系指具有含有Fc区的重链的抗体。
「抗体片段」仅包含完整抗体的一部分，其中所述部分保留当存在于完整抗体中时通常与彼部分相关的功能中的至少一种功能，及大部分或全部功能。在一个实施例中，抗体片段包含完整抗体的抗原结合位点且因此保留结合抗原的能力。在另一个实施例中，抗体片段(例如包含Fc区域者)保留当存在于完整抗体中时通常与Fc区域相关的至少一个生物学功能，诸如FcRn结合、抗体半衰期调节、ADCC功能及补体结合。在一个实施例中，抗体片段为活体内半衰期实质上类似于完整抗体的单价抗体。举例而言，所述抗体片段可包含连接至Fc序列的抗原结合臂，其能够将活体内稳定性赋予所述片段。
如本文所用的术语「单株抗体」系指自一群实质上均质的抗体(亦即构成所述群体的个别抗体为相同的，除了少量存在的可能天然存在的突变外)获得的抗体。因此，修饰语「单株」表示不为离散抗体的混合物形式的抗体的特征。所述单株抗体通常包括包含结合标靶的多肽序列的抗体，其中标靶结合多肽序列系通过包括自多个多肽序列中选择单一标靶结合多肽序列的方法获得。举例而言，选择方法可为自多个纯系(诸如融合瘤纯系库、噬菌体纯系库或重组DNA纯系库)中选择独特纯系。应了解，所选靶向结合序列可经进一步修改，例如以改良对标靶的亲和力、使靶向结合序列人类化、改良其在细胞培养中的产生、减少其活体内免疫原性、形成多特异性抗体等，且包含所修改的靶向结合序列的抗体亦为本发明的单株抗体。与通常包括针对不同决定子(抗原决定基)的不同抗体的多株抗体制剂相比，单株抗体制剂中的各单株抗体系针对抗原上的单个决定子。除其特异性之外，单株抗体制剂有利之处亦在于其通常未被其他免疫球蛋白污染。修饰语「单株」指示抗体系自一群实质上均质的抗体获得的特征，且并不应解释为需要通过任何特定方法来产生抗体。举例而言，根据本发明使用的单株抗体可通过多种技术产生，包括例如融合瘤方法(例如Kohler等人,Nature,256:495(1975)；Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold SpringHarbor Laboratory Press,第2版,1988)；Hammerling等人,于:Monoclonal Antibodiesand T-Cell hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981))；重组DNA方法(参见例如美国专利第4,816,567号)；噬菌体呈现技术(参见例如Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(34):12467-12472(2004)；及Lee等人,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004)，及用于在具有人类免疫球蛋白基因座的一部分或全部或编码人类免疫球蛋白序列的基因的动物中产生人类或人类样抗体的技术(参见例如WO98/24893；WO96/34096；WO96/33735；WO91/10741；Jakobovits等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993)；Jakobovits等人,Nature362:255-258(1993)；Bruggemann等人,Year inImmunol.7:33(1993)；美国专利第5,545,807号、第5,545,806号、第5,569,825号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,661,016号；Marks等人,Bio.Technology 10:779-783(1992)；Lonberg等人,Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-813(1994)；Fishwild等人,Nature Biotechnol.14:845-851(1996)；Neuberger,NatureBiotechnol.14:826(1996)及Lonberg及Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。
本文的单株抗体特定包括「嵌合」抗体，其中一部分重链及/或轻链与得自特定物种或属于特定抗体种类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而所述(这些)链的其余部分与得自另一物种或属于另一抗体种类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源；以及这些抗体的片段，只要其展现出所需生物学活性即可(美国专利第4,816,567号；及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。
「人类化」形式的非人类(例如鼠科)抗体为含有自非人类免疫球蛋白获得的最小序列的嵌合抗体。在一个实施例中，人类化抗体为人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体高变区的残基置换为获自具有所要特异性、亲和力及/或容量的非人类种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物)的高变区的残基。在一些情况下，人类免疫球蛋白的构架区(FR)残基经相应非人类残基置换。此外，人类化抗体可包含受体抗体或供者抗体中未见的残基。进行此等修饰以进一步改善抗体效能。一般而言，人类化抗体将包含实质上所有至少一个且通常两个可变域，其中所有或实质上所有高变环对应于非人类免疫球蛋白的高变环，且所有或实质上所有FR为人类免疫球蛋白序列的FR。人类化抗体视情况亦将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)(通常为人类免疫球蛋白恒定区)的至少一部分。欲知详情,参见Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。亦参见以下评论文章及其中引用的参考文献：Vaswani及Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions 23:1035-1038(1995)；Hurle及Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)。
术语「高变区」、「HVR」或「HV」在用于本文中时系指抗体可变域中序列高变且/或形成结构上界定的环的区域。一般而言，抗体包含六个高变区；三个在VH中(H1、H2、H3)，且三个在VL中(L1、L2、L3)。本文中使用且包含许多有关高变区的描绘。Kabat互补决定区(CDR)系基于序列可变性且使用最常见(Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。Chothia另外指出结构环的位置(Chothia及Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM高变区代表Kabat CDR与Chothia结构环之间的折衷，且为Oxford Molecular的AbM抗体建模软件所用。「接触」高变区系基于可用复杂晶体结构的分析。来自此等高变区中的每一者的残基如下标示。
环Kabat AbM Chothia接触
L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55
L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B
(Kabat编号)
H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35
(Chothia编号)
H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
高变区可包含如下「扩展的高变区」：VL中的24-36或24-34(L1),46-56或50-56或49-56(L2)及89-97或89-96(L3)以及VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)及93-102、94-102或95-102(H3)。可变域残基系根据Kabat等人(同上)关于这些定义中的每一者所述编号。
「构架」或「FR」残基为除如本文所定义的高变区残基外的那些可变域残基。
术语「如Kabat中的可变域残基编号」或「如Kabat中的氨基酸位置编号」及其变化形式系指Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991)中用于编译抗体的重链可变域或轻链可变域的编号系统。使用所述编号系统，实际的线性氨基酸序列可含有更少或其他氨基酸，相当于缩短或插入可变域的FR或HVR。举例而言，重链可变域可包括H2的残基52之后的单一氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)及重链FR残基82之后的插入残基(例如根据Kabat的残基82a、82b及82c等)。可通过将抗体序列与「标准」Kabat编号序列的同源区比对，来测定指定抗体中残基的Kabat编号。
「单链Fv」或「scFv」抗体片段包含抗体的VH及VL域，其中此等域存在于单一多肽链中。一般而言，scFv多肽另外包含VH与VL结构域之间使scFv能够形成抗原结合所需结构的多肽连接符。欲回顾scFv，参见Pluckthun,于The Pharmacology of MonoclonalAntibodies,第113卷中,Rosenburg及Moore编,Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)。
术语「双功能抗体」系指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，这些片段包含与相同多肽链(VH-VL)中的轻链可变域(VL)连接的重链可变域(VH)。通过使用过短而无法使同一链上两个域之间配对的连接符，这些域被迫与另一链的互补域配对且产生两个抗原结合位点。双功能抗体更完整地描述于例如EP 404,097；WO 93/11161；及Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中。
「人类抗体」为具有与人类所产生的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列且/或使用本文所揭示的制造人类抗体的任何技术制得的抗体。人类抗体的此定义尤其排除包含非人类抗原结合残基的人类化抗体。
「亲和力成熟」抗体为一种抗体，其一或多个HVR中的一或多处改变使得抗体对抗原的亲和力改良(与不具有那些改变的亲本抗体相比)。在一个实施例中，亲和力成熟抗体对靶抗原具有奈莫耳浓度(nanomolar)或甚至皮莫耳浓度(picomolar)亲和力。亲和力成熟抗体可由此项技术中已知的程序制备。Marks等人,Bio/Technology 10:779-783(1992)描述通过VH及VL域改组实现的亲和力成熟。CDR及/或构架残基的随机突变诱发描述于Barbas等人,Proc Nat.Acad.Sci.USA 91:3809-3813(1994)；Schier等人,Gene169:147-155(1995)；Yelton等人,J.Immunol.155:1994-2004(1995)；Jackson等人,J.Immunol.154(7):3310-9(1995)；及Hawkins等人,J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。
「阻断」抗体或「拮抗剂」抗体为抑制或降低所结合的抗原的生物活性的抗体。某些阻断抗体或拮抗剂抗体实质上或完全地抑制抗原的生物活性。
如本文中所使用的「促效剂抗体」为一种模拟所关注多肽的至少一种功能活性的抗体。
「病症」为受益于本发明抗体治疗的任何病状。此包括慢性及急性病症或疾病，包括使哺乳动物易患所述病症的那些病理性病状。本文中欲治疗的病症的非限制性实例包括癌症。
术语「细胞增殖性病症」及「增殖性病症」系指与某种程度的异常细胞增殖相关的病症。在一个实施例中，细胞增殖病症为癌症。
如本文所使用的「肿瘤」系指所有赘生性细胞(恶性或良性)的生长及增殖，及所有癌前及癌细胞及组织。如本文中所引述，术语「癌症」「癌变」、「细胞增殖性病症」、「增殖性病症」及「肿瘤」并非互相排斥的。
术语「癌症」及「癌性」系指或描述哺乳动物体内通常以不受调控的细胞生长/增殖为特征的生理病况。癌症的实例包括(但不限于)癌瘤、淋巴瘤(例如霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)及非霍奇金氏淋巴瘤)、母细胞瘤、肉瘤及白血病。这些癌症的更特定实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰脏癌、胶质母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、白血病及其他淋巴组织增生性病症，以及各种类型的头颈癌。
如本文所使用的「治疗」系指试图改变所治疗的个体或细胞的自然过程的临床干预，且可出于预防的目的或临床病理学过程中进行。理想的治疗效果包括防止疾病发作或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理性后果、防止或减缓炎症及/或组织/器官伤害、降低疾病行进速度、改善或减缓疾病状态及症状缓解或预后改良。在一些实施例中，使用本发明的抗体推迟疾病或病症的发展。
「个体(individual)」或「个体(subject)」为脊椎动物。在某些实施例中，脊椎动物为哺乳动物。哺乳动物包括(但不限于)农畜(诸如牛)、运动型动物、宠物(诸如猫、狗及马)、灵长类动物、小鼠及大鼠。在某些实施例中，脊椎动物为人类。
用于治疗目的的「哺乳动物」系指归类为哺乳动物的任何动物，包括人类、家畜及农畜，及动物园动物、运动型动物或宠物动物，诸如犬、马、猫、牛等。在某些实施例中，哺乳动物为人类。
「有效量」系指有效达成所需治疗或预防结果所必需的剂量及时间量。
本发明的物质/分子的「治疗有效量」可根据诸如以下因素而变：个体的疾病状态、年龄、性别及体重，以及所述物质/分子在个体中诱发所要反应的能力。治疗有效量亦为一种治疗有益效应超过所述物质/分子的任何毒性或有害效应的量。「预防有效量」系指有效达成所需预防结果所必需的剂量及时间量。由于预防剂量系在患病之前或在患病早期的个体中使用，因此预防有效量通常(但不一定)小于治疗有效量。
如本文所用的术语「细胞毒性剂」系指一种抑制或阻止细胞功能及/ 或引起细胞破坏的物质。所述术语意欲包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu的放射性同位素)；化学治疗剂，例如甲胺蝶呤、阿霉素(adriamicin)、长春花生物碱(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide)、阿霉素(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、道诺霉素(daunorubicin)或其他插入剂、酶及其片段(诸如核酸分解酶、抗生素及毒素，诸如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶促活性毒素，包括其片段及/或变体)，以及下文所揭示的各种抗瘤剂或抗癌剂。其他细胞毒性剂在下文中描述。杀肿瘤剂可摧毁肿瘤细胞。
「化学治疗剂」为可用于治疗癌症的化合物。化学治疗剂的实例包括：烷化剂，诸如噻替派(thiotepa)及环磷酰胺；烷基磺酸盐类，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类，诸如苯唑多巴(benzodopa)、卡巴醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)及尤利多巴(uredopa)；伸乙基亚胺类及甲基密胺类，包括六甲蜜胺(altretamine)、三伸乙基密胺(triethylenemelamine)、三伸乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三伸乙基硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)及三甲密胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰类(acetogenins)(尤其布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone))；Δ-9-四氢大麻酚(delta-9-tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol,))；β-拉帕酮(beta-lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙碱(colchicine)；桦木酸(betulinic acid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物拓朴替康(topotecan)CPT-11(伊诺替康(irinotecan；)、乙酰基喜树碱(acetylcamptothecin)、斯考普莱叮(scopolectin)及9-胺基喜树碱)；苔藓虫素(bryostatin)；卡利斯塔叮(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)及比折来新合成类似物)；足叶草毒素(podophyllotoxin)；足叶草酸(podophyllinic acid)；替尼泊甙(teniposide)；念珠藻环肽(cryptophycin)(尤其念珠藻环肽1及念珠藻环肽8)；海兔毒素(dolastatin)；多卡米辛(duocarmycin)(包括合成类似物，KW-2189及CB 1-TM1)；艾榴素(eleutherobin)；盘克斯塔叮(pancratistatin)；沙考的汀(sarcodictyin)；海绵素(spongistatin)；氮芥类，诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlomaphazine)、环磷酰胺、雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺、二氯甲二乙胺、盐酸二氯甲二乙胺氧化物(mechlorethamineoxide hydrochloride)、美法仑、新氮芥(novembichin)、胆固醇苯乙酸氮芥(phenesterine)、松龙苯芥(prednimustine)、氯乙环磷酰胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；硝基脲，诸如亚硝脲氮芥(carmustine)、氯脲霉素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、环己亚硝脲(lomustine)、嘧啶亚硝脲(nimustine)及拉宁司汀(ranimnustine)；抗生素，诸如烯二炔抗生素(例如，卡奇霉素(calicheamicin)，尤其卡奇霉素γ1及卡奇霉素ω1(参见，例如，Agnew,Chem Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994))；达米辛(dynemicin)，包括达米辛A；艾斯帕米辛(esperamicin)；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)发色团及相关色蛋白烯二炔抗生素发色团)、克拉斯米辛(aclacinomysins)、放线菌素(actinomycin)、奥斯拉米辛(authramycin)、重氮丝胺酸(azaserine)、博莱霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、卡拉比辛(carabicin)、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、克罗米辛(chromomycinis)、放线菌素(dactinomycin)、道诺霉素、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-侧氧-L-正白胺酸、阿霉素(包括吗啉并-阿霉素(morpholino-doxorubicin)、氰基吗啉并-阿霉素(cyanomorpholino-doxorubicin)、2-吡咯并-阿霉素及脱氧阿霉素(deoxydoxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycins)(诸如丝裂霉素C)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、泼非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、奎那霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，诸如甲胺蝶呤及5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)(5-FU)；叶酸类似物，诸如傣诺特呤(denopterin)、甲胺蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、噻咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如环胞苷(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿核苷(floxuridine)；雄性激素，诸如二甲睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺剂，诸如胺基苯乙哌啶酮(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如夫罗林酸(frolinic acid)；醋葡内酯(aceglatone)；醛磷酰胺葡糖甙(aldophosphamide glycoside)；胺基果糖酸(aminolevulinic acid)；伊利卢拉(eniluracil)；胺苯吖啶(amsacrine)；倍思塔布(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；埃达曲克(edatraxate)；得弗伐胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾弗利散(elfornithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；乙环氧啶(etoglucid)；硝酸镓(galliumnitrate)；羟基脲(hydroxyurea)；香菇糖(lentinan)；罗尼达宁(lonidainine)；美登素类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)及胺沙托辛(ansamitocins)；丙脒腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫比达摩(mopidanmol)；硝拉维林(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；凡那明(phenamet)；比柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(2-ethylhydrazide)；普鲁苄肼(procarbazine)；多醣复合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)；丙亚胺(razoxane)；根霉菌素(rhizoxin)；西佐糖(sizofiran)；螺锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonicacid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙基胺；单端孢霉烯族毒素(trichothecenes)(尤其T-2毒素、弗纳库林A(verracurin A)、杆孢菌素A(roridin A)及胺癸叮(anguidine))；乌拉坦(urethan)；去乙酰长春酰胺(vindesine)氮烯唑胺(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；双溴丙基哌嗪(pipobroman)；甲托辛(gacytosine)；阿糖胞苷(arabinoside)(「Ara-C」)；噻替派；紫杉醇(taxoids)，例如太平洋紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)；不含Cremophor、白蛋白经工程改造的太平洋紫杉醇奈米微粒调配物ABRAXANETM(AmericanPharmaceutical Partners,Schaumberg,Ill.)及多西他赛(doxetaxel)(Rorer,Antony,France)；克罗南布(chloranbucil)；吉西他滨(gemcitabine)6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲胺蝶呤；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)及卡铂(carboplatin)；长春花碱(vinblastine)铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)奥沙利铂(oxaliplatin)；卢考弗文(leucovovin)；长春瑞宾(vinorelbine)诺凡特龙(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素；胺基蝶呤；伊班膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟胺酸(difluorometlhylornithine)(DMFO)；类视色素类，诸如视黄酸(retinoic acid)；卡培他滨(capecitabine)以上任一种治疗剂的医药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及以上两种或两种以上治疗剂的组合，诸如CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱与泼尼松龙(prednisolone)的混合治疗的缩写)及FOLFOX(奥沙利铂(oxaliplatin)(ELOXATINTM)与5-FU及卢考弗文组合治疗方案的缩写)。
三重靶向Globo H、SSEA3及SSEA-4的抗体
本发明的一态样提供三重靶向Globo H、SSEA3及SSEA-4的新颖抗体。三重靶向抗体特异性结合至Fucα1→2Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1(Globo H六醣)及Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1(SSEA-3五醣)及Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1(SSEA-4六醣)。在一个实例中，三重靶向抗体为mAb651。
mAb 651为融合瘤细胞株产生的小鼠单株抗体。本文所述的三重靶向抗体可含有与抗体MC651相同的VH及VL链。与MC651结合至相同抗原决定基的抗体亦属于本发明的范畴内。
表1抗体MC651的氨基酸及核苷酸序列
双重靶向Globo H及SSEA3的抗体
本发明的一态样提供双重靶向Globo H及SSEA3的新颖抗体。双重靶向抗体特异性结合至Fucα1→2Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1(Globo H六醣)及Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1(SSEA-3五醣)。在一个实例中，双重靶向抗体为mAb273。
mAb 273为融合瘤细胞株产生的小鼠单株抗体。本文所述的双重靶向抗体可含有与抗体MC273相同的VH及VL链。与MC273结合至相同抗原决定基的抗体亦属于本发明的范畴内。
表2.抗体MC273的氨基酸及核苷酸序列
对SSEA4具有特异性的抗体
本发明的一态样提供对SSEA-4具有特异性的新颖抗体。抗SSEA-4抗体结合至Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1(SSEA-4六醣)。在一些实例中，抗体能够结合Neu5Gcα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1(SSEA-4六醣的类似物)。优选地，抗体不为小鼠IgG3(例如mAb MC-831-70)，且抗体不为小鼠IgM(例如抗RM1)。抗体的实例包括(但不限于)mAb 45及48。
单株抗体MC45为融合瘤细胞株产生的抗SSEA-4小鼠单株抗体。本文所述的抗SSEA-4抗体可含有与抗体MC45相同的VH及VL链。与MC45结合至相同抗原决定基的抗体亦属于本发明的范畴内。
表3.抗体MC45的氨基酸及核苷酸序列
单株抗体MC48系由融合瘤细胞株产生。本文所述的抗SSEA-4抗体可含有与抗体MC48相同的VH及VL链。与MC48结合至相同抗原决定基的抗体亦属于本发明的范畴内。
表4.抗体MC48的氨基酸及核苷酸序列
对SSEA4具有特异性的抗体及其片段
本发明的一态样提供结合至SSEA-4的新颖抗体及其片段。抗SSEA-4抗体结合至Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1(SSEA-4六醣)及Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1(SSEA-4六醣的片段)。在一些实例中，抗体能够结合至Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galβ1。在一些实例中，抗体能够结合至Neu5Gcα2→3Galβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1(SSEA-4六醣的类似物)。在一个实例中，抗体为mAb 46。
单株抗体MC46系由融合瘤细胞株产生。本文所述的抗SSEA-4抗体可含有与抗体MC46相同的VH及VL链。与MC46结合至相同抗原决定基的抗体亦属于本发明的范畴内。
表5.抗体MC46的氨基酸及核苷酸序列
「MC45抗体」或「mAb 45」或「来自纯系MC45的抗体」系指由纯系45表达的抗体或以其他方式合成、但具有相同CDR及视情况存在的与纯系MC45所表达的抗体相同的构架区的抗体。类似地，抗体MC46(mAb 46或纯系46)、MC48(mAb 48或纯系48)、MC273(mAb 273或纯系273)、MC651(mAb651或纯系651)及其类似物系指由相应纯系表达的抗体及/或以其他方式合成、但具有相同CDR及视情况存在的与参考抗体相同的构架区的抗体。
表6.结合抗原决定基及抗体同型的比较
本文所述的任一种抗体可为全长抗体或其抗原结合片段。在一些实例中，抗原结合片段为Fab片段、F(ab')2片段或单链Fv片段。在一些实例中，抗原结合片段为Fab片段、F(ab')2片段或单链Fv片段。在一些实例中，分离抗体为人类抗体、人类化抗体\嵌合抗体或单链抗体。
本文所述的任一种抗体具有以下一或多种特征：
a)为重组抗体、单株抗体、嵌合抗体、人类化抗体、人类抗体、抗体片段、双特异性抗体、单特异性抗体、单价抗体、IgG1抗体、IgG2抗体，或抗体衍生物；b)为人类、鼠类、人类化或嵌合抗体、抗原结合片段，或抗体衍生物；c)为单链抗体片段、多抗体、Fab片段，及/或免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、IgE、IgD同型及/或其亚类；d)具有一或多个以下特征：(i)介导癌细胞的ADCC及/或CDC；(ii)诱导及/或促进癌细胞发生细胞凋亡；(iii)抑制癌细胞的靶细胞增殖；(iv)诱导及/或促进癌细胞的吞噬；及/或(v)诱导及/或促进细胞毒性剂的释放；e)特异性结合肿瘤相关性碳水化合物抗原，所述抗原为肿瘤特异性碳水化合物抗原；f)不结合非癌细胞、非肿瘤细胞、良性癌细胞及/或良性肿瘤细胞上所表达的抗原；及/或g)特异性结合癌症干细胞及正常癌细胞上所表达的肿瘤相关性碳水化合物抗原。
优选地，抗体结合至其相应抗原具有特异性。术语「特异性」一般用于其中指结合对中的一员对除其特异性结合搭配物之外的分子不显示任何显著性结合的情形，例如与除本文中所指定者外的任何其他分子具有小于约30％、优选20％、10％或1％交叉反应性。
抗体适合以高亲和力(低KD值)结合至其标靶抗原决定基，且KD优选在奈莫耳浓度或低于奈莫耳浓度的范围内。亲和力可通过此项技术中已知的方法(诸如表面电浆子共振)量测。
例示性抗体制剂
能够结合至本文所述的Globo H抗原决定基及SSEA-4抗原决定基的例示性抗体可通过此项技术中已知的任何方法产生。参见例如Harlow及Lane,(1988)Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York。
宿主动物免疫接种及融合瘤技术
针对抗Globo H及抗SSEA-4抗体的例示性多株抗体可通过自针对血清中所需抗体的增加所检查的免疫哺乳动物收集血液及通过任何习知方法将血清与血液分离来制备。多株抗体包括含有多株抗体的血清，且可自血清分离含有多株抗体的溶离份。
通常在宿主动物(例如兔、小鼠、马或山羊)中，通过皮下(sc)或腹膜内(ip)多次注射相关抗原及佐剂来产生多株抗体。其可适用于使用双官能剂或衍生剂(例如顺丁烯二酰亚胺基苯甲酰基磺基丁二酰亚胺酯(经由半胱胺酸残基结合)、N-羟基丁二酰亚胺(经由离胺酸残基)、戊二醛、丁二酸酐、SOCl2等)使相关抗原与在待免疫的物种中具有免疫原性的蛋白质(例如匙孔螺血氰蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白，或大豆胰蛋白酶抑制剂)结合。
任何哺乳动物可用抗原免疫以便产生所需抗体。一般而言，可使用啮齿目、兔形目或灵长类动物。啮齿目动物包括例如小鼠、大鼠及仓鼠。兔形目动物包括例如兔。灵长类动物包括例如狭鼻猴(旧世界猴)，诸如食蟹猕猴、恒河猴、狒狒及黑猩猩。
用抗原将动物免疫的方法在此项技术中已知。腹膜内注射或皮下注射抗原为哺乳动物标准免疫方法。更特定而言，可将抗原稀释且悬浮于适量磷酸盐缓冲盐水(PBS)、生理盐水等物中。必要时，可将抗原悬浮液与适量的标准佐剂(诸如弗氏完全佐剂(Freund'scomplete adjuvant))混合，制成乳液，接着投与哺乳动物。通过将1mg或1μg肽或结合物(分别用于兔或小鼠)与3个体积的弗氏不完全佐剂合并而使动物针对抗原、免疫原性结合物或衍生物免疫。
动物可通过每4至21天数次投与与适量弗氏不完全佐剂混合的抗原来加打直至效价平稳。动物通过在多处皮下注射含有1/5至1/10原始量的肽或结合物的弗氏完全佐剂来加打。7至14天后将动物放血且分析血清的抗体效价。免疫接种亦可使用适当载剂。如上免疫接种之后，通过标准方法检查血清中所需抗体含量的增加。优选地，动物系用相同抗原、但与不同蛋白质结合及/或经由不同交联试剂结合的结合物加打。结合物亦可以蛋白质融合物形式在重组细胞培养物中产生。同样，诸如明矾的聚集剂适用于增强免疫反应。
在过去二十至三十年期间，已开发出可制备供人类活体内治疗应用的嵌合、人类化或人类抗体的多种方法。使用最多且经证实的方法为使用融合瘤方法制备小鼠mAb，接着通过将mAb的VH及VL域及恒定域转化成人类VH及VL域的最高同源人类构架区以及所需人类γ免疫球蛋白同型及子类的恒定区而使mAb发生人类化。临床上使用的许多mAb(诸如Xolair)为人类γ1、κ同型及子类的人类化mAb且使用此方法制备。
在一些实施例中，抗体可通过习知融合瘤技术产生。Kohler等人,Nature,256:495(1975).在融合瘤方法中，小鼠或其他适当宿主动物(诸如仓鼠)如上文所述进行免疫以诱发淋巴细胞产生或能够产生特异结合至用于免疫的蛋白质的抗体。或者，淋巴细胞可于活体外使免疫。
为制备单株抗体，自经抗原免疫的哺乳动物收集免疫细胞且如上文所述检查血清中所需抗体的含量增加，且进行细胞融合。用于细胞融合的免疫细胞优选获自脾脏。待与上述免疫细胞融合的其他优选亲本细胞包括例如哺乳动物的骨髓瘤细胞，及更佳具有通过药物选择融合细胞的获得性特性的骨髓瘤细胞。
优选的骨髓瘤细胞为有效融合，使所选抗体产生细胞稳定高量产生抗体且对诸如HAT培养基的培养基敏感的骨髓瘤细胞。其中，优选骨髓瘤细胞株为鼠类骨髓瘤细胞株，诸如来源于MOPC-21及MPC-11小鼠肿瘤的骨髓瘤细胞株，此等肿瘤购自沙克研究所细胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,Calif.USA)；及获自美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection,Rockville,Md.USA)的SP-2细胞。已描述用于产生人类单株抗体的人类骨髓瘤及小鼠-人类杂骨髓瘤细胞株(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。
上述免疫细胞及骨髓瘤细胞可根据已知方法融合，例如Milstein等人的方法(Galfre等人,Methods Enzymol.73:3-46,1981)。接着使用适当融合剂(诸如聚乙二醇)使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成融合瘤细胞(Goding, Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,第59-103页(Academic Press,1986))。通过细胞融合获得的所得融合瘤可通过将其在标准选择培养基(诸如HAT培养基(含有次黄嘌呤、胺基喋呤及胸苷的培养基)中培养来选择。细胞培养物典型地在HAT培养基中持续数日至数周(足以允许除所需融合瘤(非融合细胞)之外的所有其他细胞死亡的时间)。接着，进行标准限制稀释，以筛选及选殖产生所需抗体的融合瘤细胞。
由此制备的融合瘤接种且生长于适合培养基中，所述培养基优选含有一或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。举例而言，若亲本骨髓瘤细胞缺乏酵素次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于融合瘤的培养基典型地包括次黄嘌呤、胺基蝶呤及胸苷(HAT培养基)，这些物质会阻止缺乏HGPRT的细胞生长。
分析融合瘤细胞生长于其中的培养基中针对抗原的单株抗体的产生情况。优选地，融合瘤细胞所产生的单株抗体的结合特异性系通过免疫沈淀法或通过活体外结合分析来测定。利用酶联免疫吸附分析(ELISA)、酶免疫分析(EIA)、放射免疫分析(RIA)及/或免疫荧光法量测吸亮度可用于量测本发明抗体的抗原结合活性。在ELISA中，使本发明的抗体固定于盘中，将本发明的蛋白质施加至盘中，接着施加含有所需抗体的样品，诸如抗体产生细胞或纯化抗体的培养上清液。接着，施加可识别一次抗体且经酶(诸如碱性磷酸酶)标记的二次抗体，且对盘进行培育。接着，洗涤之后，向盘中添加酶受质，诸如对硝基苯基磷酸盐，且量测吸亮度以评估样品的抗原结合活性。此方法中可使用蛋白质片段，诸如C末端或N末端片段。可利用BIAcore(Pharmacia)评估本发明抗体的活性。单株抗体的结合亲和力可例如通过Munson等人,Anal.Biochem.,107:220(1980)的史卡查分析(Scatchard analysis)测定。
利用任一种习知方法(包括上述方法)可鉴别及选择产生结合至本文所述的抗原决定基的抗体的融合瘤细胞用于进一步表征。
鉴别产生具有所需特异性、亲和力及/或活性的抗体的融合瘤细胞后，可通过有限稀释程序次选殖纯系并通过标准方法生长(Goding,Monoclonal Antibodies:Principlesand Practice,第59-103页(Academic Press,1986))。适用于此目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。由次纯系分泌的单株抗体宜通过习知免疫球蛋白纯化程序与培养基、腹水或血清分离，这些纯化程序诸如蛋白A-琼脂糖、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。
此外，融合瘤细胞可以腹水性肿瘤形式活体内生长于动物中。举例而言，所得融合瘤可随后移植于小鼠的腹腔中且收获腹水。
所得单株抗体可通过例如硫酸铵沈淀、蛋白质A或蛋白质G管柱、DEAE离子交换层析或与本发明的蛋白质偶合的亲和性管柱加以纯化。本发明的抗体不仅可用于纯化及侦测本发明的蛋白质，而且可用作本发明蛋白质的促效剂及拮抗剂的候选物。此外，此抗体可应用于抗体治疗与本发明的蛋白质相关的疾病。
重组技术
由此获得的单株抗体亦可使用基因工程改造技术、以重组方式制备(参见例如Borrebaeck C.A.K.及Larrick J.W.Therapeutic Monoclonal Antibodies,英国MacMillan Publishers LTD出版,1990)。编码抗体的DNA可自免疫细胞(诸如产生抗体的融合瘤或免疫淋巴细胞)选殖，插入适当载体中且引入宿主细胞中以制备重组抗体。本发明亦提供如上文所述制备的重组抗体。
当所得抗体欲投与人体时(抗体疗法)，优选使用人类抗体或人类化抗体减少免疫原性。举例而言，具有人类抗体基因谱系的转殖基因动物可经选自蛋白质、表达蛋白质的细胞或其溶胞物的抗原免疫。接着自动物收集抗体产生细胞且与骨髓瘤细胞融合以获得融合瘤，由其可制备针对蛋白质的人类抗体。或者，产生抗体的免疫细胞(诸如免疫淋巴细胞)可通过致癌基因不朽化且用于制备单株抗体。
编码单株抗体的DNA可容易使用习知程序(例如通过使用能够特异性结合至编码鼠类抗体重链及轻链的基因的寡核苷酸探针)分离及测序。融合瘤细胞用作所述DNA的优选来源。DNA一经分离，则可置放于表达载体中，接着转染至宿主细胞(诸如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)中(否则不产生免疫球蛋白)，以在重组宿主细胞中达成单株抗体的合成。关于细菌中重组表达编码抗体的DNA的评论文章包括Skerra等人,Curr.Opinion in Immunol.,5:256-262(1993)及Pluckthun,Immunol.Rev.,130:151-188(1992)。
编码由上述融合瘤细胞产生的抗体的DNA可经由常规技术遗传修饰，以产生经基因工程改造的抗体。经基因工程改造的抗体(诸如人类化抗体、嵌合抗体、单链抗体及双特异性抗体)可经由例如习知重组技术产生。接着可修饰DNA，例如通过用人类重链及轻链恒定域编码序列取代同源鼠类序列(Morrison等人,(1984)Proc.Nat.Acad.Sci.81:6851)或通过将非免疫球蛋白多肽编码序列的全部或一部分与免疫球蛋白编码序列共价连接。以此方式可制备具有靶抗原的结合特异性的基因工程改造抗体，诸如「嵌合」或「融合」抗体。
为制备「嵌合抗体」所开发的技术在此项技术中已熟知。参见例如Morrison等人,(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81,6851；Neuberger等人,(1984)Nature 312,604；及Takeda等人,(1984)Nature 314:452。
典型地，用这些非免疫球蛋白多肽取代抗体恒定域，或用其取代抗体的具有一个抗原结合位点的可变域以形成嵌合二价抗体，所述嵌合二价抗体包含一个对抗原具有特异性的抗原结合位点及另一个对不同抗原具有特异性的抗原结合位点。
亦可使用合成蛋白质化学中的已知方法(包括涉及交联剂的那些方法)活体外制备嵌合或融合抗体。举例而言，可使用双硫键交换反应或通过形成硫醚键来构筑免疫毒素。适用于此目的的试剂的实例包括亚胺基硫醇酯(iminothiolate)及甲基-4-巯基丁酰亚胺酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)。
用于使非人类抗体发生人类化的方法在此项技术中已熟知。一般而言，人类化抗体中已引入一或多个来自非人类来源的氨基酸残基。此等非人类氨基酸残基通常称为「输入」残基，其通常取自「输入」可变域。人类化可基本上根据Winter及同事的方法(Jones等人,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536(1988))，通过用啮齿动物CDR或CDR序列取代人类抗体的相应序列来执行。因此，这些「人类化」抗体为嵌合抗体(美国专利第4,816,567号)，其中实质上少于完整的人类可变域经来自非人类物种的相应序列取代。实务上，人类化抗体通常为其中一些CDR残基及可能的一些FR残基经来自啮齿动物抗体的类似位点的残基取代的人类抗体。
选择可用于制备人类化抗体的人类可变域(轻链与重链)对于减少抗原性而言非常重要。根据所谓的「最佳拟合」方法，对照已知人类可变域序列的整个文库来筛选啮齿动物抗体的可变域序列。接着将与啮齿动物序列最接近的人类序列视作人类化抗体的人类构架(FR)(参见Sims等人,J.Immunol.,151:2296(1993)；Chothia等人,J.Mol.Biol.,196:901(1987))。另一方法使用自具有特定轻链或重链子群的所有人类抗体的共同序列获得的特定构架。相同构架可用在若干种不同人类化抗体(Carter等人,Proc.Natl.Acad Sci.USA,89:4285(1992)；Presta等人,J.Immnol.,151:2623(1993))。
更重要的是，抗体经人类化而保持对于抗原的高亲和力及其它有利生物特性。为实现所述目标，根据一个优选方法，通过使用亲本及人类化序列的三维模型分析亲本序列及各种设想的人类化产物的方法来制备人类化抗体。三维免疫球蛋白模型普遍可得且为熟习此项技术者熟知。可以取得说明及呈现所选择的候选免疫球蛋白序列的可能三维构形结构的计算机程序。检视这些呈现即可分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能角色，亦即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以此方式，可从接受者及输入序列中选择及组合FR残基，以便获得所需抗体特征，诸如提高对标靶抗原的亲和力。一般而言，CDR残基直接且最实质涉及影响抗原结合。
或者，现在可产生一种转殖基因动物(例如小鼠)，其在免疫后，能够在不产生内源免疫球蛋白的情况下产生全人类抗体谱系。举例而言，已描述嵌合及生殖系突变小鼠中缺失抗体重链连接区(JH)基因的纯合子时，会导致完全抑制内源抗体产生。将人类生殖系免疫球蛋白基因数组转移至此等生殖系突变体小鼠体内时，将会在抗原激发后引起人类抗体的产生。参见例如Jakobovits等人,Proc.Natl.Acad.Sci USA,90:2551(1993)；Jakobovits等人,Nature,362:255(1993)；Bruggermann等人,Year in Immunol.,7:33(1993)。人类抗体亦可来源于噬菌体呈现文库(Hoogenboom等人,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991))。
编码本文所述的抗Globo H及抗SSEA-4抗体(包括重链、轻链或两者)的任一种核酸、包含一或多种核酸的载体(诸如表达载体)及包含一或多个载体的宿主细胞亦属于本发明的范畴内。在一些实例中，载体包含核苷酸序列编码如本文所述的抗Globo H抗体的重链可变区或轻链可变区的核酸。在一些实例中，载体包含核苷酸序列编码如本文所述的抗SSEA-4抗体的重链可变区或轻链可变区的核酸。在其他实例中，载体包含编码重链可变区与轻链可变区的核苷酸序列，其表达可通过单一启动子或两个各别启动子控制。此处亦提供用于制备如本文所述的抗Globo H及抗SSEA-4抗体中的任一者的方法，例如经由此章节中所述的重组技术制备。
用于制备抗体的其他技术
在其他实施例中，完全人类抗体可通过使用已经工程改造以表达特定人类免疫球蛋白的市售小鼠获得。经设计以产生更合需要(例如完全人类抗体)或更稳固的免疫反应的转殖基因动物亦可用于产生人类化或人类抗体。这些技术的实例为得自Amgen,Inc.(Fremont,Calif.)的XenomouseRTM及得自Medarex,Inc.(Princeton,N.J.)的HuMAb-MouseRTM及TC MouseTM。在另一替代例中，抗体可通过噬菌体呈现技术以重组方式制得。参见例如美国专利第5,565,332号；第5,580,717号；第5,733,743号；及第6,265,150号；及Winter等人,(1994)Annu.Rev.Immunol.12:433-455。或者，可使用噬菌体呈现技术(McCafferty等人,(1990)Nature 348:552-553)，利用来自未免疫供者的免疫球蛋白可变(V)域基因谱系活体外产生人类抗体及抗体片段。
完整抗体(全长抗体)的抗原结合片段可经由常规方法制备。举例而言，F(ab')2片段可通过胃蛋白酶消化抗体分子来产生，且Fab片段可通过将F(ab')2片段的二硫桥键还原来产生。
或者，可自使用McCafferty等人,Nature,348:552-554(1990)；Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)及Marks等人,J.Mol Biol.,222:581-597(1991)中所述的技术所产生的抗体噬菌体文库(例如单链抗体噬菌体文库)分离出本文所述的抗Globo H及抗SSEA-4抗体。后续公开案描述通过链改组(Marks等人,Bio/Technology,10:779-783(1992))以及组合感染及活体内重组作为构筑极大噬菌体文库的策略(Waterhouse等人,Nuc.Acids.Res.21:2265-2266(1993))来产生高亲和力(nM范围)人类抗体。因此，这些技术为用于分离单株抗体的传统单株抗体融合瘤技术的可行替代方案。
如本文所述获得的抗体可纯化至均质。举例而言，抗体的分离及纯化可根据一般蛋白质所用的分离及纯化方法进行。举例而言，可通过对管柱层析(诸如亲和层析)、过滤、超过滤、盐析、透析、SDS聚丙烯酰胺胶凝电泳、等电聚焦及其他(Antibodies:A LaboratoryManual.Harlow及David Lane编,Cold Spring Harbor Laboratory,1988)(但不限于此)进行适当选择及组合使用来分离及单离抗体。如上获得的抗体的浓度可通过吸光度量测、酶联免疫吸附分析(ELISA)等来测定。除亲和性层析之外的例示性层析包括例如离子交换层析、疏水性层析、凝胶过滤、逆相层析、吸附层析法及其类似方法(Strategies for ProteinPurification and Characterization:A Laboratory Course Manual.Daniel R.Marshak等人编,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1996)。可通过液相层析(诸如HPLC、FPLC)执行层析程序。
抗体可使用此项技术中熟知的方法表征。举例而言，一种方法为鉴别抗原所结合的抗原决定基，或「抗原决定基定位」。此项技术中已知许多对蛋白质上的抗原决定基位置进行定位及表征的方法，包括求解抗体-抗原复合物的晶体结构、竞争分析、基因片段表达分析及基于合成肽的分析，如例如Harlow及Lane,Using Antibodies(a LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1999)的第11章中所述。在另一实例中，抗原决定基定位可用于测定抗体所结合的序列。抗原决定基可为线性抗原决定基，亦即包含于单区段氨基酸中，或通过可不一定包含于单区段(初级结构线性序列)中的氨基酸的三维相互作用形成的构形抗原决定基。不同长度(例如至少4-6个氨基酸长)的肽可经分离或合成(例如以重组方式)且用于抗体的结合分析。在另一实例中，抗体所结合的抗原决定基可在系统性筛选中通过使用来源于靶抗原序列的重迭肽且测定抗体的结合来确定。根据基因片段表达分析，编码靶抗原的开放阅读框架可随机地或依据特定遗传构造加以片段化且测定抗原的所表达片段与待测试的抗体的反应性。基因片段可例如通过PCR产生，接着在放射性氨基酸存在下活体外转录且转译成蛋白质。抗体与经放射性标记的抗原片段的结合接着通过免疫沈淀及凝胶电泳法来测定。某些抗原决定基亦可通过使用在噬菌体粒子(噬菌体文库)表面上所呈现的随机肽序列的大型文库来鉴别。或者，可在简单结合分析中测试重迭肽片段所定义文库与测试抗体的结合。
在另一实例中，可进行抗原结合域的突变诱发、域交换实验及丙胺酸扫描突变诱发以鉴别抗原决定基结合所需、足够及/或需要的残基。举例而言，域交换实验可使用靶抗原突变体进行，其中候选抗体的结合抗原决定基中的多个残基已经来自紧密相关、但抗原性不同的蛋白质(诸如神经营养蛋白家族的另一成员)的序列置换(交换)。通过评估抗体与突变体标靶蛋白质的结合，可评估特定抗原片段对抗体结合的重要性。
或者，可使用已知可结合至相同抗原的其他抗体来进行竞争分析，以判定一种抗体(例如本文所述的MC45抗体)是否与其他抗体结合至相同抗原决定基。竞争分析为熟习此项技术者所熟知。
适合的例示性通用抗体制备方法的其他态样
用动物(例如小鼠、兔、山羊、绵羊或马)产生单株及多株抗体及其片段的方法在此项技术中已熟知。参见例如Harlow及Lane,(1988)Antibodies:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York。术语「抗体」包括完整免疫球蛋白分子以及其片段，诸如Fab、F(ab')2、Fv、scFv(单链抗体)及dAb(域抗体；Ward等人,(1989)Nature,341,544)。
本文所揭示的组合物可与熟习此项技术者经阅读本发明而可鉴别的其他活性剂、载剂、媒剂、赋形剂或助剂一起包括于医药组合物中。
医药组合物优选包含至少一种医药学上可接受的载剂。在这些医药组合物中，本文所揭示的组合物形成「活性化合物」，亦称为「活性剂」。如本文所用，措辞「医药学上可接受的载剂」包括与投药相容的溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂及抗真菌剂、等张剂及吸收延迟剂及其类似物。组合物中亦可并入补充性活性化合物。医药组合物经调配以与其预定投药途径可兼容。投药途径的实例包括非经肠，例如静脉内、皮内、皮下、经口(例如吸入)、经皮(局部)、经黏膜及直肠投药。用于非经肠、皮内或皮下施用的溶液或悬浮液可包括以下组分：无菌稀释剂，例如注射用水、生理食盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；及张力调节剂，例如氯化钠或右旋糖。可用酸或碱(诸如盐酸或氢氧化钠)调节pH。非经肠制剂可密封在由玻璃或塑料制成的安瓿、抛弃式注射器或多剂量小瓶中。
提供包含至少一种抗SSEA-3/SSEA-4/Globo H抗体或至少一种包含编码抗SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H抗体的序列的聚核苷酸的组合物。在某些实施例中，组合物可为医药组合物。如本文所使用，组合物包含一或多种结合至一或多种SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H的抗体及/或一或多种包含编码一或多种结合至一或多种SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H的抗体的序列的聚核苷酸。此等组合物可进一步包含此项技术中熟知的适合载剂，诸如医药学上可接受的赋形剂，包括缓冲剂。
亦提供经分离的抗体及聚核苷酸。在某些实施例中，经分离的抗体及聚核苷酸为实质上纯的。
在一个实施例中，抗SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H抗体为单株抗体。在另一个实施例中，提供抗SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H抗体的片段(例如Fab、Fab'-SH及F(ab')2片段)。此等抗体片段可通过诸如酶促消化的传统方式产生，或可通过重组技术产生。此等抗体片段可为嵌合抗体、人类化抗体或人类抗体。此等片段可用于达成下文所述的诊断及治疗目的。
此项技术中已知用于产生噬菌体呈现文库、自其获得所关注的抗体的多种方法。一种产生所关注的抗体的方法系经由使用噬菌体抗体文库，如Lee等人,J.Mol.Biol.(2004),340(5):1073-93中所述。
本发明的抗SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H抗体可通过使用组合文库筛选具有所需活性的合成抗体纯系来产生。原则上，通过筛选含有呈现融合至噬菌体鞘蛋白的抗体可变区(Fv)的各种片段的噬菌体的噬菌体文库来选择合成抗体纯系。通过对所需抗原进行亲和层析来筛选此等噬菌体文库。使表达能够与所需抗原结合的Fv片段的纯系吸附至抗原且从而与文库中非结合纯系分离。接着将结合纯系自抗原溶离，且可通过额外的抗原吸附/溶离循环进一步富集。本发明的任一种抗SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H抗体可如下获得：设计适合的抗原筛选程序以选择所关注的噬菌体纯系，随后使用来自所关注的噬菌体纯系的Fv序列及Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,NIHPublication 91-3242,Bethesda Md.(1991),第1-3卷中所述的适合恒定区(Fc)序列建构全长抗SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H抗体纯系。
抗体的抗原结合域系由两个具有约110个氨基酸的可变(V)区形成，两个可变区各来自轻链(VL)及重链(VH)，两者均存在三个高变环或互补决定区(CDR)。可变域可以单链Fv(scFv)片段(其中VH与VL经由柔性短肽共价键联)或Fab片段(其中VH与VL各与恒定域融合且发生非共价相互作用)形式功能性地呈现于噬菌体上，如Winter等人,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所述。如本文所使用，scFv编码噬菌体纯系及Fab编码噬菌体纯统称为「Fv噬菌体纯系」或「Fv纯系」。
VH与VL基因谱系可通过聚合酶链反应(PCR)分别选殖，且在噬菌体文库中随机重组，接着可搜寻抗原结合纯系，如Winter等人,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所述。来自免疫来源的文库提供抗免疫原的高亲和力抗体而无需构筑融合瘤。或者，天然文库经选殖可向广范围的非自体抗原以及自体抗原提供单一来源的人类抗体而无需任何免疫作用，如Griffiths等人，EMBO J,12:725-734(1993)所述。最后，天然文库亦可通过自干细胞选殖未经重排的V-基因片段并使用含有随机序列的PCR引物编码高变CDR3区及完成活体外重排来合成获得，如Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。
使用丝状噬菌体通过与少量鞘蛋白pIII融合来呈现抗体片段。这些抗体片段可作为单链Fv片段呈现，其中VH域与VL域通过柔性多肽间隔基连接于同一多肽链上，例如如Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)中所述；或作为Fab片段呈现，其中一链与pIII融合而另一链分泌进入细菌性宿主细胞周质内，在周质内通过置换野生型鞘蛋白中的一部分组装呈现于噬菌体表面上的Fab-鞘蛋白结构，例如如Hoogenboom等人,Nucl.AcidsRes.,19:4133-4137(1991)中所述。
大体而言，编码抗体基因片段的核酸可自由人类或动物采集的免疫细胞获得。若需要偏向且有利于抗SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H纯系的文库，则个体用SSEA-3/SSEA-4/GLOBOH免疫以产生抗体反应，且回收脾脏细胞及/或循环B细胞或其他外周血液淋巴细胞(PBL)用于文库建构。在一个实施例中，偏重于抗人类SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H纯系的人类抗体基因片段文库如下获得：在携有功能性人类免疫球蛋白基因数组(且缺乏功能性内源性抗体产生系统)的转殖基因小鼠中产生抗人类SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H抗体反应)，从而使SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H免疫接种产生B细胞，这些B细胞产生针对SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H的人类抗体。产生人类抗体的转殖基因小鼠的产生描述于下文中。
抗SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H反应性细胞群的额外富集可通过使用适于分离表达SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H特异性抗体的B细胞的筛选程序来达成，例如通过细胞分离联合SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H亲和层析或细胞吸收至经荧光染料标记的SSEA-3/SSEA-4/GLOBOH、随后的流动活化式细胞分选(FACS)。
或者，使用来自未免疫供者的脾脏细胞及/或B细胞或其他PBL可更好地呈现可能抗体谱系，且亦允许使用其中SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H不具抗原性的任何动物(人类或非人类)物种建构抗体文库。对于合并活体外抗体基因构造的文库而言，自个体收获干细胞以提供编码未经重排的抗体基因区段的核酸。所关注的免疫细胞可自多种动物物种获得，诸如人类、小鼠、大鼠、兔类、狼、犬、猫、猪、牛、马及鸟类物种等。
自所关注的细胞中回收编码抗体可变基因区段(包括VH及VL区段)的核酸并扩增。在重排VH及VL基因文库的情况下，所要DNA可如下获得：自淋巴细胞中分离基因组DNA或mRNA，随后利用与重排VH及VL基因的5'端及3'端匹配的引物进行聚合酶链反应(PCR)，如Orlandi等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),86:3833-3837(1989)中所述，从而获得用于表达的各种V基因文库。V基因可利用编码成熟V-域的外显子的5'端处的反向引物以及定位于J-片段内的正向引物、自cDNA及基因组DNA扩增，如Orlandi等人,(1989)及Ward等人,Nature,341:544-546(1989)中所述。然而，自cDNA扩增时，亦可使反向引物定位于前导外显子中，如Jones等人,Biotechnol.,9:88-89(1991)中所述，且正向引物亦可定位于恒定区内，如Sastry等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),86:5728-5732(1989)。为使互补性最大化，可将简并整合入引物中，如Orlandi等人(1989)或Sastry等人(1989)中所述。在某些实施例中，文库多样性系通过使用靶向各V-基因家族的PCR引物最大化，以便扩增存在于免疫细胞核酸样品中的所有可利用的VH与VL排列，例如如Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)的方法中所述，或如Orum等人,Nucleic Acids Res.,21:4491-4498(1993)中所述。将经扩增的DNA选殖入表达载体中时，可在一端处作为标记的PCR引物内引入稀少的限制性位点，如Orlandi等人(1989)中所述；或利用标记引物进行进一步PCR扩增，如Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)中所述。
合成性重排的V基因谱系可于活体外自V基因区段获得。人类VH-基因片段中的大部分已选殖且测序(报导于Tomlinson等人,J.Mol.Biol.,227:776-798(1992)中)，且已绘出图谱(报导于Matsuda等人,Nature Genet.,3:88-94(1993)中)；可使用这些选殖片段(包括H1与H2环的所有主要构形)以及编码各种序列及长度的H3环的PCR引物产生各种VH基因谱系，如Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)中所述。亦可获得所有序列多样性集中于单倍长的长H3环的VH谱系，如Barbas等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4457-4461(1992)中所述。人类Vκ及Vλ区段已选殖且测序(报导于Williams及Winter,Eur.J.Immunol.,23:1456-1461(1993)中)且可用于获得合成性轻链谱系。基于一定范围的VH与VL折迭及L3与H3长度的合成V基因谱系将编码具有大量结构多样性的抗体。扩增编码V-基因的DNA之后，生殖系V-基因区段可根据Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)之方法活体内重排。
可以数种方式通过将VH与VL基因谱系组合来建构抗体片段谱系。各种谱系可建立于不同载体中，且在活体外重组载体，例如如Hogrefe等人,Gene,128:119-126(1993)中所述，或活体内通过组合感染，例如Waterhouse等人,Nucl.Acids Res.,21:2265-2266(1993)中所述的loxP系统。活体内重组方法利用Fab片段的双链性质来克服大肠杆菌转型效率对文库大小的限制。分别选殖原生VH及VL谱系，一者选殖至噬菌粒中且另一者选殖至噬菌体载体中。接着通过噬菌体感染含有噬菌粒的细菌来组合两个文库，从而使各细胞含有不同组合且文库大小仅受所存在的细胞数量(约1012个纯系)限制。两载体均含有活体内重组信号，从而使VH与VL基因重组于单一复制子上并共包装于噬菌体病毒粒子中。此等巨大文库提供大量具有良好亲和性(约10-8M的Kd-1)的多种抗体。
或者，这些谱系可依序选殖入同一载体中，例如如Barbas等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:7978-7982(1991)中所述；或通过PCR组装在一起且接着选殖，例如如Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)中所述。亦可使用PCR组装将VH及VL DNA与编码柔性肽间隔子的DNA连接以形成单链Fv(scFv)谱系。在又一种技术中，「细胞内PCR组装」用于在淋巴细胞内通过PCR组合VH及VL基因，接着选殖所连接基因的纯系谱系，如Embleton等人,Nucl.Acids Res.,20:3831-3837(1992)中所述。
筛选文库通过此项技术已知的任何技艺来完成。举例而言，SSEA-3/SSEA-4/GLOBOH标靶可用于涂布吸收盘的各孔，在附着于吸收盘或用于细胞分选的宿主细胞上表达，或与生物素结合以便涂有抗生蛋白链菌素的珠粒捕捉，或在此项技术中已知用于淘选噬菌体呈现文库的任何其他方法中使用。
噬菌体文库样品与固定的SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H在适于至少一部分噬菌体粒子与吸附剂结合的条件下接触。一般而言，对包括pH值、离子强度、温度及其类似条件的条件进行选择以模拟生理条件。将结合固相的噬菌体洗涤且接着通过酸溶离，例如如Barbas等人,Proc.Natl.Acad.Sci USA,88:7978-7982(1991)中所述；或通过碱溶离，例如如Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)中所述，或通过SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H抗原竞争，例如用类似于Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)的抗原竞争方法的程序。可在单轮选择中富集20-1,000倍的噬菌体。此外，可使所富集的噬菌体在细菌培养物中生长并经历另一轮选择。
选择效率视许多因素而定，包括洗涤期间的解离动力学及单一噬菌体上的多个抗体片段能否同时与抗原接合。具有快速解离动力学(及弱结合亲和力)的抗体可通过使用短时间洗涤、多价噬菌体呈现及抗原于固相中的高涂布密度予以保留。高密度不仅经由多价相互作用使噬菌体稳定，且亦有利于使已解离的噬菌体再结合。选择具有缓慢解离动力学(及良好结合亲和力)的抗体可通过使用长时间洗涤及单价噬菌体呈现(如Bass等人,Proteins,8:309-314(1990)及WO 92/09690中所述)及低抗原涂布密度(如Marks等人,Biotechnol.,10:779-783(1992)中所述)促进。
可在对于SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H具有不同亲和力、甚至稍微不同的亲和力的噬菌体抗体之间作出选择。然而，所选抗体的随机突变(例如如上述一些亲和力成熟技术中所进行)可能产生许多突变体，其大部分结合至抗原且少数具有较高亲和性。在有限SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H的情况下，稀少的高亲和力噬菌体可竞争胜出。为保留所有的较高亲和性突变体，噬菌体可与过量的经生物素标记的SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H一起培育，但经生物素标记的SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H的莫耳浓度低于SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H的目标莫耳浓度亲和常数。接着可通过涂布抗生蛋白链菌素的顺磁珠粒捕捉高亲和力结合噬菌体。此「平衡捕捉」允许根据抗体的结合亲和力以敏感性选择抗体，所述敏感性允许使具有仅两倍高亲和力的突变体纯系与具有较低亲和力的大量过量噬菌体分离。亦可操控用于洗涤与固相结合的噬菌体的条件以基于解离动力学进行区分。
可根据活性选择抗SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H纯系。在一个实施例中，本发明提供阻断SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H配位体与SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H之间结合、但不阻断SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H配位体与第二蛋白质之间结合的抗SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H抗体。对应于这些抗SSEA-3/SSEA-4GLOBO H抗体的Fv纯系可如下选择：(1)自如上文章节B(I)(2)中所述的噬菌体文库分离出抗SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H纯系，且视情况扩增所分离的噬菌体纯系群(通过使所述群体在适合的细菌宿主中生长)；(2)根据分别需要阻断及非阻断活性来选择SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H及第二蛋白质；(3)使抗SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H噬菌体纯系吸附至所固定的SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H；(4)使用过量的第二蛋白质溶离可识别SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H结合决定子的任何非所需纯系，这些SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H结合决定子与第二蛋白质的结合决定子重迭或共享；及(5)将步骤(4)之后保持吸附的纯系溶离。视情况，具有所要阻断/非阻断特性的纯系可进一步通过将本文中所述的选择程序重复一或多次来富集。
编码本发明的Fv纯系的DNA易使用习知程序分离且测序(例如使用设计成能自融合瘤或噬菌体DNA模板特定扩增编码所关注的重链及轻链编码区的寡核苷酸引物)。DNA一经分离，则置于表达载体内，接着转染至宿主细胞(诸如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)中(否则不产生免疫球蛋白)，以于重组宿主细胞中达成所需单株抗体的合成。关于在细菌中重组表达编码抗体的DNA的评论文章包括Skerra等人,Curr.Opinion in Immunol.,5:256(1993)及Pluckthun,Immunol.Revs,130:151(1992)。
可将编码本发明Fv纯系的DNA与编码重链及/或轻链恒定区的已知DNA序列(例如适当的DNA序列可由Kabat等人(同上文)获得)组合以形成编码全长或部分长度重链及/或轻链的纯系。应了解，为达成此目的，可使用任何同型的恒定区，包括IgG、IgM、IgA、IgD及IgE恒定区，且此等恒定区可由任何人类或动物物种获得。如本文所使用的定义「嵌合」及「融合」抗体中包括自一种动物(诸如人类)物种的可变域DNA获得且接着与另一动物物种的恒定区DNA融合以形成「融合体」(全长重链及/或轻链)编码序列的Fv纯系。在一个实施例中，源自人类可变DNA的Fv纯系系与人类恒定区DNA融合以形成所有人类全长或部分长度重链及/或轻链的编码序列。
由原生文库所产生的抗体(天然的或合成的)可具有中度亲和力(约106至107M-1的Kd-1)，但亲和力成熟亦可通过建构第二文库及自第二文库中再选择来进行活体外模拟，如Winter等人(1994)(同上)中所述。举例而言，可通过使用易错聚合酶(Leung等人,Technique 1:11-15(1989)中报导)、使用Hawkins等人,J.Mol.Biol.,226:889-896(1992)的方法或Gram等人,Proc.Natl.Acad.Sci USA,89:3576-3580(1992)的方法在活体外随机引入突变。另外，亲和力成熟可如下进行：使所选个别Fv纯系中的一或多个CDR发生随机突变(例如使用PCR、使用携有跨越所关注的CDR的随机序列的引物)且筛选较高亲和力纯系。WO 9607754(1996年3月14日公开)描述一种诱导免疫球蛋白轻链的互补决定区发生突变以建立轻链基因文库的方法。其他有效方法为将通过噬菌体呈现所选择的VH域或VL域与获自未免疫供者的天然存在的V域变异体谱系重组且以数轮链改组来筛选较高亲和力，如Marks等人,Biotechnol.,10:779-783(1992)中所述。此技术可产生亲和力在10-9M范围内的抗体及抗体片段。
产生抗SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H抗体的其他方法
产生及评估抗体亲和力的其他方法在此项技术中已熟知且描述于例如Kohler等人,Nature 256:495(1975)；美国专利第4,816,567号；Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,第59-103页(Academic Press,1986；Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987；Munson等人,Anal.Biochem.,107:220(1980)；Engels等人,Agnew.Chem.Int.Ed.Engl.,28:716-734(1989)；Abrahmsen等人,EMBO J.,4:3901(1985)；Methods in Enzymology,第44卷(1976)；Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)。
通用方法
一般而言，本发明提供亲和力成熟的SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H抗体。此等抗体对于SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H具有增强的亲和力及特异性。亲和力及灵敏性的增强使得待应用的本发明分子及方法具有以下益处：(a)本发明分子的灵敏性增强及/或(b)本发明的分子紧密结合SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H。
在一个实施例中，SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H抗体适用于治疗其中需要部分或完全阻断一或多种SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H活性的SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H介导性病症。在一个实施例中，本发明的抗SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H抗体系用于治疗癌症。
本发明的抗SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H抗体允许用简单的常规生物分子分析(诸如免疫沈淀、ELISA或免疫显微术)对抗原决定基进行灵敏的特异性侦测，而无需质谱或基因操作。此又在观测及阐明此等路径正常作用与侦测此等路径何时作用异常方面提供显著优势。
本发明的SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H抗体亦可用于确定在疾病的发展及发病机制中的作用。举例而言，如上文所述，本发明的SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H抗体可用于确定TACA在正常情况下受到短暂表达是否可与一或多种疾病病况有关。
本发明的SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H抗体可进一步用于治疗其中一或多种SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H受到异常调节或发生异常作用的疾病，而不干扰对于本发明的抗SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H抗体不具特异性的SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H的正常活性。
在另一态样中，本发明的抗SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H抗体可用作侦测各种细胞类型及组织中的癌症状态的试剂。
在又一态样中，本发明抗SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H抗体适用于开发阻断活性模式类似于本发明的目标抗体的SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H拮抗剂。举例而言，本发明的抗SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H抗体可用于确定及鉴别具有相同SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H结合特征及/或SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H路径阻断能力的其他抗体。
在另一实例中，本发明的抗SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H抗体可用于鉴别与本文中所例示的抗体结合实质上相同的SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H抗原决定子(包括线性及构形抗原决定基)的其他抗SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H抗体。
本发明的抗SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H抗体可用于基于涉及SSEA-3/SSEA-4/GLOBOH的生理学路径的分析中，以筛选SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H的小分子拮抗剂，这些拮抗剂在阻断一或多种结合搭配物结合至SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H方面展现与抗体类似的药理学作用。
抗体的产生可使用此项技术中的常规技能达成，包括本文所述的那些技术，诸如融合瘤技术及筛选结合分子的噬菌体呈现文库。这些方法已良好确立于此项技术中。
简言的，本发明的抗SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H抗体可通过使用组合文库筛选具有所需活性的合成抗体纯系来产生。原则上，通过筛选含有呈现融合至噬菌体鞘蛋白的抗体可变区(Fv)的各种片段的噬菌体的噬菌体文库来选择合成抗体纯系。通过对所需抗原进行亲和层析来筛选此等噬菌体文库。使表达能够与所需抗原结合的Fv片段的纯系吸附至抗原且因此使其与文库中非结合纯系分离。接着将结合纯系自抗原溶离，且可通过额外的抗原吸附/溶离循环进一步富集。本发明的任一种抗SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H抗体可如下获得：设计适合的抗原筛选程序以选择所关注的噬菌体纯系，随后使用来自所关注的噬菌体纯系的Fv序列及Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,NIHPublication 91-3242,Bethesda Md.(1991),第1-3卷中所述的适合恒定区(Fc)序列建构全长抗SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H抗体纯系。
在一个实施例中，本发明的抗SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H抗体为单株抗体。亦涵盖于本发明的范畴内的为本文所提供的抗SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H抗体的抗体片段，诸如Fab、Fab'、Fab'-SH及F(ab')2片段，及其变异体。此等抗体片段可通过诸如酶促消化的传统方式产生，或可通过重组技术产生。这些抗体片段可为嵌合抗体片段、人类抗体片段或人类化抗体片段。这些片段适用于本文中所述的实验性目的、诊断性目的及治疗性目的。
单株抗体可获自实质上均质的抗体群，亦即组成所述群体的个别抗体相同，除少量存在的可能天然发生的突变之外。因此，修饰语「单株」表示并非离散抗体的混合物形式的抗体的特征。
本发明的抗SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H单株抗体可使用此项技术中已知的多种方法产生，包括首次由Kohler等人,Nature,256:495(1975)描述的融合瘤方法，或替代地可改通过重组DNA方法产生(例如美国专利第4,816,567号)。
载体、宿主细胞及重组方法
为重组产生本发明的抗体，分离编码所述抗体的核酸且将其插入可复制的载体中用于进一步选殖(DNA的扩增)或表达。容易地分离编码抗体的DNA且使用习知程序(例如通过使用能够与编码抗体重链及轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)进行测序。可利用多种载体。载体的选择部分地视待使用的宿主细胞而定。宿主细胞包括(但不限于)原核生物来源或真核生物来源(通常哺乳动物)的细胞。应了解为达成此目的可使用任何同型的恒定区，包括IgG、IgM、IgA、IgD及IgE恒定区，且此等恒定区可由任何人类或动物物种获得。
使用原核宿主细胞产生抗体
载体建构
可使用标准重组技术获得编码本发明抗体的多肽组分的聚核苷酸序列。可自产生抗体的细胞(诸如融合瘤细胞)中分离所需聚核苷酸序列并进行测序。或者，可使用核苷酸合成器或PCR技术合成聚核苷酸。在获得编码多肽的序列后，将其插入能够在原核宿主中复制并表达异源聚核苷酸的重组载体中。对于本发明而言可使用可用且为此项技术中所知的多种载体。对于适当载体的选择将主要视插入载体中的核酸的大小及经载体转型的特定宿主细胞而定。各载体视其功能(异源聚核苷酸扩增或表达或两者)及其与其所驻留的特定宿主细胞的兼容性而定含有多种组分。载体组分通常包括(但不限于)：复制起点(尤其当将载体插入原核细胞中时)、选择标记基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸插入及转录终止序列。
一般而言，含有源自与宿主细胞兼容的物种的复制子及控制序列的质粒载体与此等宿主联合使用。载体通常具有复制位点以及能够于经转型细胞中提供表型选择的标记序列。举例而言，大肠杆菌典型地使用pBR322(一种源自大肠杆菌种的质粒)转型。pBR322含有编码安比西林(ampicillin，Amp)及四环素(tetracycline，Tet)抗性的基因，且因此提供鉴别经转型细胞的简易方式。pBR322、其衍生物或其他微生物质粒或噬菌体亦可含有或经修饰以含有可由微生物使用以供表达内源蛋白质的启动子。用于表达特定抗体的pBR322衍生物的实例详细描述于Carter等人的美国专利第5,648,237号中。
此外，含有与宿主微生物兼容的复制子及控制序列的噬菌体载体可作为转型载体联合此等宿主使用。举例而言，诸如λGEMTM-11的噬菌体可用于制造可用以转型易感宿主细胞(诸如大肠杆菌LE392)的重组载体。
本发明的表达载体可包含两种或两种以上编码各多肽组分的启动子-顺反子对。启动子为位于调节其表达的顺反子上游(5')的未经转译的调控序列。原核启动子通常分为两类：诱导型及组成型。诱导型启动子为在其对培养条件的改变(例如养分存在与否或温度改变)作出响应的控制下起始顺反子以增加量转录的启动子。
大量可由多种潜在宿主细胞所别的启动子已为吾人所熟知。可通过经限制酶消化将所选择的启动子自源DNA移除且将所分离的启动子序列插入本发明的载体中而使所述启动子以可操作方式连接至编码轻链或重链的顺反子DNA。可使用天然启动子序列与多种异源启动子指导目标基因的扩增及/或表达。在一些实施例中，因与天然目标多肽启动子相比，异源启动子一般允许经表达的目标基因达成较快转录及较高产率，故而使用异源启动子。
适用于原核宿主的启动子包括PhoA启动子、β-半乳糖酶及乳糖启动子系统、色胺酸(trp)启动子系统及杂交启动子(诸如tac或trc启动子)。然而，在细菌中具有功能性的其他启动子(诸如其他已知的细菌或噬菌体启动子)亦适用。其核苷酸序列已公开，从而使得熟练工作者能够可操作地使用连接符或接附子将这些核苷酸序列与编码标靶轻链及重链的顺反子接合(Siebenlist等人(1980)Cell 20:269)，以提供任何必需的限制位点。
在本发明的一态样中，重组载体内的各顺反子均包含引导经表达的多肽跨膜移位的分泌信号序列组分。一般而言，信号序列可为载体的组分，或其可为插入载体中的标靶多肽DNA的一部分。出于本发明的目的所选择的信号序列应为可由宿主细胞识别及处理(亦即由信号肽酶裂解)的信号序列。对于不识别及处理异源多肽的原生信号序列的原核宿主细胞而言，信号序列经选自例如由以下组成的群的原核信号序列取代：碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或热稳定性肠毒素II(STII)前导序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA及MBP。在本发明的一个实施例中，用于表达系统的两种顺反子中的信号序列为STII信号序列或其变异体。
在另一态样中，本发明的免疫球蛋白的产生可于宿主细胞的细胞质中发生，且因此无需各顺反子内均存在分泌信号序列。就此而言，免疫球蛋白的轻链及重链系在细胞质内表达、折迭并组装形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株(例如大肠杆菌trxB-菌株)提供有利于二硫键形成的细胞质条件，藉此允许经表达的蛋白质次单元正确折迭及组装。Proba及Pluckthun Gene,159:203(1995)。
本发明的抗体亦可使用其中所表达的多肽成分的数量比可调节的表达系统来产生，以使本发明的经分泌及正确组装的抗体的产量最大化。所述调节可至少部分地通过同时调节多肽成分的转译强度来完成。
一种调节转译强度的技术揭示于Simmons等人的美国专利第5,840,523号中。其利用顺反子内的转译起始区(TIR)的变异体。对于指定TIR，可以一系列转译强度形成一系列氨基酸或核酸序列变异体，从而提供针对特定链的所要表达量据以调节此因子的便利方式。TIR变异体可通过习知突变诱发技艺产生，这些技艺产生可改变氨基酸序列的密码子变化。在某些实施例中，核苷酸序列变化为静默的。TIR改变可包括例如Shine-Dalgarno序列的编号或间隔改变，以及信号序列改变。一种产生突变信号序列的方法为在编码序列的起始端产生「密码子库」，其不改变信号序列的氨基酸序列(亦即变化沉默)。此可通过修改各密码子的第三核苷酸位置来完成；此外有些氨基酸(诸如白胺酸、丝胺酸及精胺酸)具有多个可增加制库复杂性的第一及第二位置。此突变诱发方法详细描述于Yansura等人(1992)METHODS:A Companion to Methods in Enzymol.4:151-158中。
在一个实施例中，可以一系列针对其中的各顺反子的TIR强度产生一组载体。此有限组载体可提供各链的表达量比较以及各种TIR强度组合下所要抗体产品的产量。TIR强度可通过定量报导基因的表达量来测定，如Simmons等人的美国专利第5,840,523号所详述。基于转译强度比较，选择所需个别TIR以组合于本发明的表达载体构筑体中。
适于表达本发明抗体的原核宿主细胞包括古细菌(Archaebacteria)及真细菌(Eubacteria)，诸如革兰氏阴性(Gram-negative)或革兰氏阳性生物体。适用细菌的实例包括埃希氏杆菌属(Escherichia)(例如大肠杆菌)、杆菌属(例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis))、肠道细菌、假单胞菌属种类(例如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)、黏质沙雷菌(Serratia marcescans)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、志贺杆菌属(Shigella)、根瘤菌属(Rhizobia)、透明颤菌(Vitreoscilla)或副球菌属(Paracoccus)。在一个实施例中，使用革兰氏阴性细胞。在一个实施例中，本发明使用大肠杆菌细胞作为宿主。大肠杆菌菌株的实例包括菌株W3110(Bachmann,Cellular and Molecular Biology,第2卷(Washington,D.C.:AmericanSociety for Microbiology,1987),第1190-1219页；ATCC寄存号27,325)及其衍生物，包括具有基因型W3110ΔfhuA(ΔtonA)ptr3lac Iq lacL8ΔompTΔ(nmpc-fepE)degP41kanR的菌株33D3(美国专利第5,639,635号)。其他菌株及其衍生物(诸如大肠杆菌294(ATCC 31,446)、大肠杆菌B、大肠杆菌λ1776(ATCC 31,537)及大肠杆菌RV308(ATCC 31,608))亦为适用的。此等实例具例示性，而非限制性。具有所定义基因型的任一种上述细菌的衍生物的建构方法已知于此项技术中且描述于例如Bass等人,Proteins,8:309-314(1990)中。一般需要考虑复制子在细菌细胞中的可复制性来选择适当细菌。举例而言，当使用熟知的质粒(诸如pBR322、pBR325、pACYC 177或pKN410)提供复制子时，大肠杆菌、沙雷氏菌或沙门氏菌菌种可适用作宿主。宿主细胞通常应分泌最少量的蛋白水解酶，且细胞培养物中宜并入其他蛋白酶抑制剂。
抗体产生
宿主细胞经上述表达载体转型且于适当时经改质以便诱导启动子、选择转型体或扩增编码所需序列的基因的习知营养培养基中培养。
转型意谓将DNA引入原核宿主中使得DNA可作为染色体外组件或由染色体整合体复制。视所使用的宿主细胞而定，使用适于此等细胞的标准技术进行转型。使用氯化钙进行钙处理一般用于含有实质性细胞障壁的细菌细胞。另一种转型方法系采用聚乙二醇/DMSO。所使用的另一种技术为电穿孔。
用以产生本发明的多肽的原核细胞于此项技术中已知且适于培养所选宿主细胞的培养基中生长。合适培养基的实例包括溶菌肉汤(luria broth，LB)外加必需的营养补充物。在一些实施例中，培养基亦含有基于表达载体的构筑而选择的选择剂，以选择性地允许含有所述表达载体的原核细胞生长。举例而言，将安比西林(ampicillin)添加至培养基中以使表达安比西林抗性基因的细胞生长。
亦可包括除碳、氮及无机磷酸盐来源外的任何必需补充物，其单独或以与另一种补充物或培养基(诸如，复合氮源)的混合物的形式以适当浓度引入。视情况，培养基可含有一或多种选自由以下各者组成之群的还原剂：麸胱甘肽、半胱胺酸、胱胺、巯基乙酸酯、二硫赤藓糖醇及二硫苏糖醇。
将原核宿主细胞在合适的温度下培养。对于大肠杆菌生长而言，例如生长在包括(但不限于)约20℃至约39℃、约25℃至约37℃范围内的温度下及约30℃的温度下发生。培养基的pH可为约5至约9范围内的任何pH，此主要视宿主生物体而定。对于大肠杆菌而言，pH可为约6.8至约7.4，或约7.0。
若本发明的表达载体中使用诱导型启动子，则在适于活化所述启动子的条件下诱导蛋白质表达。在本发明的一态样中，PhoA启动子用于控制多肽转录。因此，将经转型的宿主细胞于磷酸盐限制性培养基中培养以进行诱导。在一个实施例中，所述磷酸盐限制培养基为C.R.A.P培养基(参见例如Simmons等人,J.Immunol.Methods(2002),263:133-147)。如此项技术中所知，可根据所用载体构筑体使用多种其他诱导剂。
在一个实施例中，本发明的经表达多肽分泌至宿主细胞的周质中且自其回收。蛋白质回收通常包含一般通过诸如渗透压冲击、超音波处理或溶解的方式使微生物碎裂。一旦细胞碎裂，则可通过离心或过滤来移除细胞碎片或全细胞。蛋白质可例如通过亲和树脂层析进一步纯化。或者，可将蛋白质输送至培养基中且在其中进行分离。可将细胞自培养物中移除，且将培养物上清液过滤且浓缩以进一步纯化所产生的蛋白质。可使用诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及西方墨点分析的通常已知的方法进一步分离经表达的多肽且加以鉴别。
在本发明的一态样中，通过酦酵方法大量生产抗体。可利用多种大规模馈料分批酦酵程序来产生重组蛋白。大型酦酵具有至少1000公升的容量，例如约1,000至100,000公升容量。这些酦酵器使用搅拌器叶轮分配氧及营养物，尤其葡萄糖(普通碳/能量来源)。小规模酦酵一般系指在容量不超过约100公升且可在约1公升至约100公升范围内的酦酵器中进行的酦酵。
在酦酵过程中，通常在细胞已于合适条件下生长至所需密度(例如，OD550为约180-220，在此阶段细胞处于稳定期早期)后开始诱导蛋白质表达。如此项技术中已知且如上文所述，可根据所用载体构筑体使用多种诱导剂。可在诱导的前使细胞生长较短的时期。通常诱导细胞约12-50小时，不过可使用更长或更短的诱导时间。
为改良本发明的多肽的产率及质量，可改变多种酦酵条件。举例而言，为改良分泌的抗体多肽的适当组装及折迭，可使用过度表达伴侣蛋白(chaperone protein)的额外载体共转型宿主原核细胞，这些伴侣蛋白诸如Dsb蛋白(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD及/或DsbG)或FkpA(具有伴侣蛋白活性的肽基脯胺酰基顺,反-异构酶)。已证实伴侣蛋白促进细菌宿主细胞中所产生的异源蛋白质的适当折迭及溶解性。Chen等人,(1999)J Bio Chem274:19601-19605；Georgiou等人,美国专利第6,083,715号；Georgiou等人,美国专利第6,027,888号；Bothmann及Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.275:17100-17105；Ramm及Pluckthun(2000)J.Biol.Chem. 275:17106-17113；Arie等人,(2001)Mol.Microbiol.39:199-210。
为使所表达的异源蛋白质(尤其对蛋白水解敏感的蛋白质)的蛋白水解降至最低，某些缺乏蛋白水解酶的宿主菌株可用于本发明。举例而言，宿主细胞菌株可经修饰以实现编码已知细菌蛋白酶(诸如，蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其组合)的基因中的基因突变。一些大肠杆菌蛋白酶缺乏性菌株可利用且描述于例如Joly等人,(1998),同上；Georgiou等人,美国专利第5,264,365号；Georgiou等人,美国专利第5,508,192号；Hara等人,Microbial Drug Resistance,2:63-72(1996)。
在一个实施例中，缺乏蛋白水解酶且经过度表达一或多种伴侣蛋白的质粒转型的大肠杆菌菌株用作本发明的表达系统中的宿主细胞。
抗体纯化
在一个实施例中，本文中所产生的抗体蛋白质可进一步纯化以获得适用于其他分析及使用的实质性均质制剂。可使用此项技术中已知的标准蛋白纯化方法。以下程序例示合适纯化程序：免疫亲和或离子交换管柱上溶离、乙醇沈淀、逆相HPLC、在二氧化硅上或在阳离子交换树脂(诸如DEAE)上层析、层析聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沈淀，及使用例如Sephadex G-75进行的凝胶过滤。
在一态样中，使用固相上固着的蛋白质A免疫亲和纯化本发明的抗体产物。蛋白质A为来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureas)的41kD细胞壁蛋白质，其以高亲和力结合至抗体的Fc区。Lindmark等人,(1983)J.Immunol.Meth.62:1-13。固定蛋白质A的固相可为包含玻璃或二氧化硅表面的管柱，或可控微孔玻璃管柱或硅酸管柱。在一些应用中，将管柱涂上试剂，诸如甘油，以尽可能防止污染物的非特定黏着。
作为纯化的第一步骤，可将如上文所述来源于细胞培养物的制剂施加于蛋白质A固定的固相上以允许所关注的抗体特异性结合至蛋白质A。接着洗涤固相，以移除非特异性结合至固相的污染物。最后，通过溶离自固相回收所关注的抗体。
使用真核宿主细胞产生抗体
载体组分一般包括(但不限于)以下一或多者：信号序列、复制起点、一或多个标记基因、增强子组件、启动子及转录终止序列。
(i)信号序列组分
用于真核宿主细胞中的载体亦可含有信号序列或在所关注的成熟蛋白或多肽的N末端具有特异性裂解位点的其他多肽。所选异源信号序列通常为可通过宿主细胞识别及处理(亦即，通过信号肽酶裂解)的信号序列。在哺乳动物细胞表达中，可用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹gD信号。
此前驱区的DNA在阅读框架中与编码抗体的DNA接合。
(ii)复制起点
一般而言，哺乳动物表达载体无需复制起点组分。举例而言，通常可使用SV40起点仅因为其含有早期启动子。
(iii)选择基因组分
表达及选殖载体可含有选择基因，亦称为可选标记物。典型的选择基因编码具有以下功能的蛋白质(a)赋予对于抗生素或其他毒素(例如安比西林、新霉素(neomycin)、甲胺喋呤或四环素)的抗性；(b)补充营养缺陷(必要时)；或(c)提供不能自复合培养基获得的关键养分。
选择流程的一实例利用药物使宿主细胞的生长停滞。经异源基因成功转型的那些细胞产生呈现药物抗性的蛋白质且因此在选择方案中存活。此显性选择的实例使用药物新霉素、霉酚酸及湿霉素(hygromycin)。
适用于哺乳动物细胞的可选标记物的另一实例为允许鉴别能够吸收抗体核酸的细胞的可选标记物，诸如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白-I及金属硫蛋白-II(优选为灵长类动物金属硫蛋白基因)、腺苷脱胺酶、鸟胺酸脱羧酶等。
举例而言，经DHFR选择基因转型的细胞可首先通过在含有甲胺蝶呤(Mtx)、DHFR的竞争性拮抗剂的培养基中培养所有转型体来鉴别。适当的宿主细胞(当使用野生型DHFR时)包括例如缺乏DHFR活性的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株(例如ATCC CRL-9096)。
或者，可通过在含有针对可选标记物的选择剂(诸如胺基糖苷抗生素，例如康霉素(kanamycin)、新霉素或G418)的培养基中进行细胞生长来选择经编码抗体、野生型DHFR蛋白及另一可选标记物(诸如胺基糖苷3'-磷酸转移酶(APH))的DNA序列转型或共转型的宿主细胞(尤其是含有内源DHFR的野生型宿主)。参见美国专利第4,965,199号。
(iv)启动子组分
表达载体及选殖载体一般含有由宿主生物体识别且可操作地连接至编码所关注的多肽(例如抗体)的核酸的启动子。已知用于真核生物的启动子序列。实际上所有真核基因均具有位于转录起始位点上游约25至30个碱基处的富AT区。发现于多种基因的转录起始处上游70至80个碱基处的另一序列为CNCAAT区，其中N可为任何核苷酸。大部分真核基因的3'端处为AATAAA序列，所述序列可为poly A尾添加至编码序列的3'端的信号。所有此等序列均适于插入真核表达载体中。
在哺乳动物宿主细胞中自载体转录抗体多肽可通过例如如下启动子控制：获自病毒(诸如多形瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头状瘤病毒、鸟肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、B型肝炎病毒及猿猴病毒40(SV40))的基因组的启动子、异源哺乳动物启动子(例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)或热休克启动子，限制条件为这些启动子与宿主细胞系统兼容。
SV40病毒的早期及晚期启动子宜以亦含有SV40病毒复制起点的SV40限制片段形式获得。人类巨细胞病毒的立即早期启动子宜以HindIII E限制片段形式获得。在哺乳动物宿主中使用牛乳头状瘤病毒作为载体表达DNA的系统揭示于美国专利第4,419,446号中。此系统的变体描述于美国专利第4,601,978号中。关于人类β-干扰素cDNA在来自单纯性疱疹病毒的胸苷激酶启动子控制下于小鼠细胞中的表达，亦参见Reyes等人,Nature 297:598-601(1982)。或者，可使用劳斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)的长末端重复序列作为启动子。
(v)增强子组件组分
由高级真核细胞转录编码本发明的抗体多肽的DNA通常通过将增强子序列插入载体内来增强。现已知源自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白及胰岛素)的许多增强子序列。然而，吾人通常使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括复制起点后侧的SV40增强子(bp100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后侧的多瘤病毒增强子及腺病毒增强子。关于用于活化真核启动子的增强组件，亦参见Yaniv,Nature 297:17-18(1982)。增强子可在抗体多肽编码序列的5'或3'位置处剪接至表达载体中，但优选位于始于启动子的5'位点。
(vi)转录终止组分
用于真核宿主细胞中的表达载体通常亦含有终止转录及稳定mRNA所必需的序列。此等序列通常可自真核或病毒DNA或cDNA的5'且有时3'非转译区获得。此等区含有转录为编码抗体的mRNA的非转译部分中的多聚腺嘌呤化片段的核苷酸区段。一种适用的转录终止组分为牛生长激素多聚腺嘌呤化区。参见WO94/11026及其中所揭示的表达载体。
(vii)宿主细胞的选择及转型
适用于选殖或表达本文载体中的DNA的宿主细胞包括本文所述的较高等真核生物细胞，包括脊椎动物宿主细胞。使脊椎动物细胞在培养物(组织培养物)中繁殖已成为一种常规程序。适用哺乳动物宿主细胞株的实例为经SV40转型的猴肾CV1细胞株(COS-7，ATCCCRL 1651)；人类胚肾细胞株(293细胞或经次选殖以供在悬浮培养物中生长的293细胞，Graham等人,J.Gen Virol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO,Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980))；小鼠睾丸支持细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人类子宫颈癌瘤细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人类肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人类肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；及人类肝癌细胞株(Hep G2)。
宿主细胞经用于产生抗体的上述表达或选殖载体转型且于经改质以适于诱导启动子、选择转型体或扩增编码所需序列的基因的习知营养培养基中培养。
(viii)培养宿主细胞
用于产生本发明抗体的宿主细胞可于多种培养基中培养。市售培养基，诸如汉氏F10(Ham's F 10，Sigma)、最低必需培养基(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)及杜贝可氏改良型伊格尔氏培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)(Sigma)，适用于培养宿主细胞。此外，以下文献中所述的任一种培养基可用作这些宿主细胞的培养基：Ham等人,Meth.Enz.58:44(1979)；Barnes等人,Anal.Biochem.102:255(1980)；美国专利第4,767,704号；第4,657,866号；第4,927,762号；第4,560,655号；或第5,122,469 号；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利Re.30,985。任何此等培养基均可视需要补充激素及/或其他生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁及磷酸盐)、缓冲液(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷及胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCINTM药物)、示踪元素(定义为无机化合物，通常以在微莫耳浓度范围内的最终浓度存在)及葡萄糖或等效能源。亦可包括熟习此项技术者已知的合适浓度的任何其他必需补充剂。培养条件(诸如温度、pH值及其类似条件)为先前选用于表达的宿主细胞所用的条件，且为一般熟习此项技术者显而易知。
(ix)抗体纯化
当使用重组技术时，抗体可于细胞内产生或直接分泌至培养基中。若抗体系在细胞内产生，则作为第一步骤，一般移除微粒碎片(宿主细胞或溶胞片段)，例如通过离心或超滤来移除。在抗体分泌至培养基中的情形下，通常首先使用市售蛋白质浓缩过滤器(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)浓缩此等表达系统的上清液。在任何前述步骤中可包括诸如PMSF的蛋白酶抑制剂以抑制蛋白水解，且可包括抗生素以防止外来污染物生长。
由细胞所制备的抗体组合物可使用例如羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析及亲和层析加以纯化，亲和层析为公认的纯化技艺。亲和试剂(诸如蛋白质A)作为亲和配位体的适用性视存在于抗体中的任何免疫球蛋白Fc域的种类及同型而定。蛋白质A可用于纯化基于人类γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等人,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。推荐蛋白质G用于所有小鼠同型及人类γ3(Guss等人,EMBO J.5:15671575(1986))。虽然亲和配位体所连接的受质最常为琼脂糖，但可利用其他受质。与用琼脂糖可达成的流速及处理时间相比，机械稳定性受质(诸如可控微孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯)流速更快且处理时间更短。若抗体包含CH3域，则Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)适用于纯化。亦可利用其他蛋白质纯化技术，诸如离子交换柱溶离、乙醇沈淀、逆相HPLC、二氧化硅层析、肝素SEPHAROSETM层析、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬胺酸管柱)层析、层析聚焦、SDS-PAGE及硫酸铵沈淀，此视欲回收的抗体而定。
任何初步纯化步骤之后，若需要，则使用pH在约2.5-4.5之间的溶离缓冲液，使包含所关注的抗体及污染物的混合物经受进一步纯化步骤，例如低pH值疏水性相互作用层析，一般在低盐浓度下(例如约0-0.25M盐)执行。
应了解，一般而言，制备供研究、测试及临床用途中使用的抗体的技艺及方法、符合上述及/或熟习此项技术者认为对所关注的特定抗体适当的技艺及方法已良好确立于此项技术中。
活性分析
本发明抗体的物理/化学特性及生物功能可通过此项技术中已知的各种分析来表征。
经纯化抗体可通过一系列分析进一步表征，包括(但不限于)N末端测序、氨基酸分析、非变性尺寸排除高压液相层析法(HPLC)、质谱分析法、离子交换层析法及木瓜酶消化法。
需要时，分析抗体的生物活性。在一些实施例中，测试本发明抗体的抗原结合活性。此项技术中已知且本文中可使用的抗原结合分析包括(不限于)使用诸如西方墨点法的技术的任何直接或竞争性结合分析、放射免疫分析、ELISA(酶联免疫吸附分析)、「夹层」免疫分析、免疫沈淀分析、荧光免疫分析、化学发光免疫分析、奈米粒子免疫分析、适体免疫分析及蛋白质A免疫分析。
抗体片段
本发明涵盖抗体片段。在某些情形下，宜使用抗体片段而非使用完整抗体。较小尺寸的片段允许快速清除且对于实体肿瘤的近接可改良。
已开发出各种技术用于产生抗体片段。传统上，这些片段可经由完整抗体的蛋白水解消化获得(参见例如Morimoto等人,Journal of Biochemical and BiophysicalMethods 24:107-117(1992)；及Brennan等人,Science,229:81(1985))。然而，这些片段现在可由重组宿主细胞直接产生。Fab、Fv及ScFv抗体片段皆可表达于大肠杆菌中并自大肠杆菌中分泌，从而容易产生大量此等片段。可自上文所讨论的抗体噬菌体文库中分离抗体片段。或者，Fab'-SH片段可自大肠杆菌直接回收且化学偶合而形成F(ab')2片段(Carter等人,Bio/Technology 10:163-167(1992))。根据另一方法，F(ab')2片段可直接自重组宿主细胞培养物中分离。美国专利第5,869,046号中描述包含救助受体结合抗原决定基残基且活体内半衰期延长的Fab及F(ab')2片段。用于产生抗体片段的其他技术对于熟练从业者而言显而易见。在其他实施例中，所选抗体为单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利第5,571,894号及第5,587,458号。Fv及sFv为具有完整结合位点、缺乏恒定区的唯一种类；因此，其在活体内使用期间适用于减少非特异性结合。可建构sFv融合蛋白以在sFv的胺基末端或羧基末端产生效应蛋白的融合物。参见Antibody Engineering,Borrebaeck编,同上。抗体片段亦可为「线性抗体」，例如如美国专利第5,641,870号中所述。这些线性抗体片段可为单特异性或双特异性的。
人类化抗体
本发明包括人类化抗体。此项技术中已知将非人类抗体人类化的各种方法。举例而言，人类化抗体中可引入一或多个来自非人类来源的氨基酸残基。此等非人类氨基酸残基通常称为「输入」残基，其通常系自「输入」可变域取得。人类化可基本上遵循Winter及同事的方法(Jones等人,(1986)Nature 321:522-525；Riechmann等人,(1988)Nature 332:323-327；Verhoeyen等人,(1988)Science 239:1534-1536)，通过用高变区序列取代人类抗体的相应序列来进行。因此，这些「人类化」抗体为嵌合抗体(美国专利第4,816,567 号)，其中实质上少于完整的人类可变域经来自非人类物种的相应序列取代。实务上，人类化抗体通常为人类抗体，其中某些高变区残基及可能的一些FR残基经来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基取代。
选择用于产生人类化抗体的人类可变域(轻链与重链)对于减少抗原性可为重要的。根据所谓的「最佳拟合」方法，对照已知人类可变域序列的完整文库筛选啮齿动物抗体的可变域序列。与啮齿动物的序列最接近的人类序列接着当作人类化抗体的人类构架(Sims等人,(1993)J.Immunol.151:2296；Chothia等人,(1987)J.Mol.Biol.,196:901)。另一方法系使用源自具有轻链或重链的特定亚群的所有人类抗体的共同序列的特定框架。若干种不同人类化抗体可使用相同构架(Carter等人,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285；Presta等人,(1993)J.Immunol.,151:2623)。
通常更需要使抗体在保持对抗原的高亲和力及其他良好生物特性下人类化。为达成此目标，根据一种方法，通过使用亲本序列及人类化序列的三维模型分析亲本序列及各种概念上的人类化产物的方法来制备人类化抗体。三维免疫球蛋白模型普遍可得且为熟习此项技术者熟知。可获得说明及呈现所选择的候选免疫球蛋白序列的可能三维构形结构的计算机程序。对这些呈现的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列起作用过程中可能的作用，亦即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以此方式，可自接受者及输入序列选择FR残基并与接受者及输入序列组合以便获得所需抗体特征，诸如对标靶抗原的亲和力增加。一般而言，高变区残基直接且极实质上涉及影响抗原结合。
人类抗体
本发明的人类抗SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H抗体可通过如上文所述将选自人类源噬菌体呈现文库与已知人类恒定域序列组合来建构。或者，本发明的人类单株抗SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H抗体可通过融合瘤方法产生。用于产生人类单株抗体的人类骨髓瘤及小鼠-人类杂骨髓瘤细胞株已描述于例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；及Boerner等人,J.Immunol.,147:86(1991)。
现在可产生免疫后能够在不产生内源免疫球蛋白的情况下产生全人类抗体谱系的转殖基因动物(例如小鼠)。举例而言，已描述嵌合及生殖系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合子缺失导致对于内源抗体产生的完全抑制。将人类生殖系免疫球蛋白基因数组转移至此等生殖系突变体小鼠体内将会于抗原激发后引起人类抗体的产生。参见例如Jakobovits等人,Proc.Natl.Acad.Sci USA,90:2551(1993)；Jakobovits等人,Nature,362:255(1993)；Bruggermann等人,Year in Immunol.,7:33(1993)。
亦可使用基因改组自非人类(例如啮齿动物)抗体获得人类抗体，其中人类抗体具有与初始非人类抗体类似的亲和力及特异性。根据此方法(其亦称「抗原决定基印记法」)，通过如上所述的噬菌体呈现技术所获得的非人类抗体片段的重链或轻链可变区经人类V域基因谱系置换，形成非人类链/人类链scFv或Fab嵌合体的群体。以抗原进行选择可导致非人类链/人类链嵌合scFv或Fab的分离，其中人类链恢复移除初级噬菌体呈现纯系中的相应非人类链时损坏的抗原结合位点，亦即抗原决定基决定(印模)对于人类链搭配物的选择。当重复所述方法以置换剩余非人类链时，获得人类抗体(参见1993年4月1日公开的PCT WO93/06213号)。与传统通过CDR移植人类化非人类抗体不同，此技术提供不具有非人类来源的FR或CDR残基的完整人类抗体。双特异性抗体
双特异性抗体为对至少两种不同抗原具有结合特异性的单株抗体。在某些实施例中，双特异性抗体为人类或人类化抗体。在某些实施例中，结合特异性的一系针对包括特定离胺酸键联的SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H且另一者系针对任何其他抗原。在某些实施例中，双特异性抗体可结合至具有两个不同离胺酸键联的两种不同SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H。可制备全长抗体或抗体片段形式的双特异性抗体(例如F(ab')2双特异性抗体)。
此项技术中已知制造双特异性抗体的方法。传统上，双特异性抗体的重组产生系基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两个重链具有不同特异性(Milstein及Cuello,Nature,305:537(1983))。由于免疫球蛋白重链及轻链的随机分配，此等融合瘤(四源融合瘤)产生10种不同抗体分子的潜在混合物，其中仅一种具有正确双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当繁琐，且产物产率较低。类似程序揭示于1993年5月13日公开的WO 93/08829中及Traunecker等人,EMBO J.,10:3655(1991)中。
根据不同实施例，具有所要结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变域系与免疫球蛋白恒定域序列融合。此融合例如系对于免疫球蛋白重链恒定域，包含铰链、CH2及CH3区的至少部分。在某些实施例中，含有为轻链结合所需的位点的第一重链恒定区(CH1)存在于这些融合体中的至少一者中。将编码免疫球蛋白重链融合体及(若需要)免疫球蛋白轻链的DNA插入单独表达载体中，且将其共转染至适当的宿主生物体中。当在构建中所使用的三个多肽链的不等比率提供最佳产率时，此提供在实施例中调整三个多肽片段的相互比例的极大灵活性。然而，当等比率的至少两个多肽链的表达造成高产率或当比率并非特别重要时，可能将两个或全部三个多肽链的编码序列插入一表达载体中。
在所述方法之一实施例中，双特异性抗体由在一臂中具有第一结合特异性的杂交免疫球蛋白重链与在另一臂中(提供第一结合特异性)的杂交免疫球蛋白重链-轻链对组成。已发现由于免疫球蛋白轻链仅存在于一半双特异性分子中提供一种简便的分离方式，故此不对称结构促进所需双特异性化合物与非所需的免疫球蛋白链组合的分离。此方法揭示于WO 94/04690中。关于产生双特异性抗体的其他细节，参见例如Suresh等人,Methodsin Enzymology,121:210(1986)。
根据另一方法，一对抗体分子间的界面可经工程改造以使自重组细胞培养物回收的杂二聚体的百分比最大化。所述界面包含抗体恒定域的CH3域的至少一部分。以此方法，使第一抗体分子界面之一或多条小氨基酸侧链经较大侧链(例如酪胺酸或色胺酸)置换。通过用较小氨基酸侧链(例如丙胺酸或苏胺酸)置换较大氨基酸侧链而于第二抗体分子的界面上产生具有与较大侧链相同或类似尺寸的补偿「空穴」。此提供使杂二聚体的产率增加超过其他不合需要的最终产物(诸如同二聚体)的机制。
双特异性抗体包括交联或「杂结合」抗体。举例而言，呈异源结合物形式的抗体中之一者可与抗生物素蛋白偶合，另一者与生物素偶合。举例而言，已提出这些抗体使免疫系统细胞靶向非所需的细胞(美国专利第4,676,980号)，且用于治疗HIV感染(WO 91/00360、WO 92/00373及EP 03089)。异源结合抗体可使用任何便利的交联方法制备。适合交联剂以及许多交联技术在此项技术中为熟知的且揭示于美国专利第4,676,980号中。
文献中亦已描述自抗体片段产生双特异性抗体的技术。举例而言，可使用化学键联制备双特异性抗体。Brennan等人,Science,229:81(1985)描述一种其中完整抗体经蛋白质裂解而产生F(ab')2片段的程序。在二硫醇错合剂亚砷酸钠存在下还原此等片段以稳定邻近二硫醇且防止分子间二硫键形成。接着将所产生的Fab'片段转化为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。接着通过用巯基乙胺还原将Fab'-TNB衍生物之一再转化为Fab'-硫醇，且与等莫耳量的另一Fab'-TNB衍生物混合以形成双特异性抗体。所产生的双特异性抗体可用作用于选择性固定酶的试剂。
近期进展已促进自大肠杆菌中直接回收Fab'-SH片段，这些片段可经化学偶合形成双特异性抗体。Shalaby等人,J.Exp.Med.,175:217-225(1992)描述了完全人类化双特异性抗体F(ab')2分子的制备。各Fab'片段分别自大肠杆菌中分泌且经受活体外定向化学偶合以形成双特异性抗体。由此形成的双特异性抗体能够与过度表达HER2受体的细胞及正常人类T细胞结合，且亦触发人类细胞毒性淋巴细胞对人类乳房肿瘤目标的溶解活性。
亦已描述多种直接由重组细胞培养物制备及分离双特异性抗体片段的技术。举例而言，已使用白胺酸拉链产生双特异性抗体。Kostelny等人,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992)。通过基因融合将来自Fos及Jun蛋白质的白胺酸拉链肽连接至两种不同抗体的Fab'部分。抗体同二聚体在铰链区还原而形成单体，且接着再氧化而形成抗体杂二聚体。此方法亦可用于产生抗体同二聚体。Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)所述的「双功能抗体」技术已提供一种用于制造双特异性抗体片段的替代机制。这些片段包含经连接符连接至轻链可变域(VL)的重链可变域(VH)，所述连接符过短而使相同链上的两个结构域之间无法配对。因此，迫使一个片段的VH及VL域与另一片段的互补VL及VH域配对，藉此形成两个抗原结合位点。亦已报导另一种通过使用单链Fv(sFv)二聚体来制备双特异性抗体片段的策略。参见Gruber等人,J.Immunol.,152:5368(1994)。
具有两价以上的抗体亦考虑在内。举例而言，可制备三特异性抗体。Tutt等人,J.Immunol.147:60(1991)。
多价抗体
多价抗体可比二价抗体更快地由表达抗体所结合的抗原的细胞内化(及/或异化)。本发明的抗体可为具有三个或三个以上抗原结合位点的多价抗体(IgM类别的抗体除外)(例如四价抗体)，多价抗体可通过重组表达编码抗体多肽链的核酸容易地产生。多价抗体可包含二聚化域及三个或三个以上抗原结合位点。二聚域优选包含(或包括)Fc区或铰链区。在此情形下，抗体将包含一Fc区及Fc区胺基末端的三个或三个以上抗原结合位点。在一实施例中，多价抗体例如包含(或包括)三个至约八个或四个抗原结合位点。多价抗体包含至少一个多肽链(例如，两个多肽链)，其中多肽链包含两个或两个以上的可变域。举例而言，多肽链可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1为第一可变域，VD2为第二可变域，Fc为Fc区的一条多肽链，X1及X2表示氨基酸或多肽，且n为0或1。举例而言，多肽链可包含VH-CH1-柔性连接符-VH-CH1-Fc区链或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文中的多价抗体可进一步包含至少两个(例如四个)轻链可变域多肽。本文的多价抗体可例如包含约两个至约八个轻链可变域多肽。本文所涵盖的轻链可变域多肽包含轻链可变域且视情形进一步包含CL域。抗体变异体
在一些实施例中，本发明涵盖本文所述的抗体的氨基酸序列修饰。举例而言，可需要改良抗体的结合亲和力及/或其他生物学特性。抗体的氨基酸序列变异体可通过将适当的核苷酸改变引入抗体核酸中或通过肽合成来制备。此等修饰包括(例如)抗体氨基酸序列内的残基缺失及/或插入及/或取代。可进行缺失、插入及取代的任何组合以获得最终构筑体，其限制条件为最终构筑体具有所需的特征。可在制造序列时将氨基酸变化引入目标抗体氨基酸序列中。
一种适用于鉴别抗体的作为优选突变诱发位置的某些残基或区域的方法称为「丙胺酸扫描突变诱发」，如Cunningham及Wells(1989)Science,244:1081-1085所描述。在本文中，鉴别出一个残基或一组标靶残基(例如带电荷残基，诸如arg、asp、his、lys及glu)且用中性或带负电荷的氨基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)置换以影响氨基酸与抗原的相互作用。随后，通过在取代位点处或为取代位点引入其他变异体以改进证明对取代具有功能敏感性的那些氨基酸位置。因此，虽然引入氨基酸序列变异的位点经预先确定，但突变的性质自身无需预先确定。举例而言，为分析特定位点的突变的效能，在靶密码子或区执行ala扫描或随机突变且针对所需的活性筛选所表达的免疫球蛋白。
氨基酸序列插入物包括长度为一个残基至含有一百个或更多残基的多肽的胺基及/或羧基未端融合体，以及具有单个或多个氨基酸残基的序列内插入物。未端插入物的实例包括具有N末端甲硫胺酰基残基的抗体或与细胞毒素多肽融合的抗体。抗体分子的其他插入变异体包括抗体的N末端或C末端与酶(例如对于ADEPT而言)或延长抗体的血清半衰期的多肽的融合体。
另一类变异体为氨基酸取代变异体。这些变异体在抗体分子中具有至少一个经不同残基替换的氨基酸残基。最引人关注的取代突变位点包括高变区，但亦涵盖FR变化。保守性取代显示于表A中「优选取代」标题下。若这些取代导致生物活性变化，则可引入更多实质性变化(如表A命名为「例示性取代」，或下文参考氨基酸类别进一步所述)，且筛选产物。
表A
原始残基 例示性取代 优选取代
Ala(A)Val；Leu；Ile Val
Arg(R)Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N)Gln；His；Asp,Lys；Arg Gln
Asp(D)Glu；Asn Glu
Cys(C)Ser；Ala Ser
Gln(Q)Asn；Glu Asn
Glu(E)Asp；Gln Asp
Gly(G)Ala Ala
His(H)Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I)Leu；Val；Met；Ala；Leu
Phe；正白胺酸
Leu(L)正白胺酸；Ile；Val；Ile
Met；Ala；Phe
Lys(K)Arg；Gln；Asn Arg
Met(M)Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F)Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P)Ala Ala
Ser(S)Thr Thr
Thr(T)Val；Ser Ser
Trp(W)Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y)Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V)Ile；Leu；Met；Phe；Leu
Ala；正白胺酸
对抗体生物学特性的实质修饰可通过选择取代来实现，这些取代在其维持以下各物的作用方面显著不同：(a)取代区域中多肽骨架的结构，例如折迭或螺旋构形；(b)分子靶点处的电荷或疏水性；或(c)侧链体积。氨基酸可根据其侧链特性的相似性来分类(于A.L.Lehninger,Biochemistry,第2版,第73-75页,Worth Publishers,New York(1975))：
·(1)非极性:Ala(A),Val(V),Leu(L),Ile(I),Pro(P),Phe(F),Trp(W),Met(M)
·(2)不带电荷极性:Gly(G),Ser(S),Thr(T),Cys(C),Tyr(Y),Asn(N),Gln(O)
·(3)酸性:Asp(D),Glu(E)
·(4)碱性:Lys(K),Arg(R),His(H)。
或者，天然存在的残基可基于共同的侧链特性分类：
(1)疏水性:正白胺酸,Met,Ala,Val,Leu,Ile；
(2)中性亲水性:Cys,Ser,Thr,Asn,Gln；
(3)酸性:Asp,Glu；
(4)碱性:His,Lys,Arg；
(5)影响链取向的残基:Gly,Pro；
(6)芳族性:Trp,Tyr,Phe。
非保守性取代将需要将此等类别中之一者的成员换成另一类别。亦可将这些经取代的残基引入保守性取代位点中或引入其余(非保守性)位点中。
一种类型的取代变异体涉及取代亲本抗体(例如人类化抗体或人类抗体)之一或多个高变区残基。通常，所得选用于进一步开发的变异体相对于产生其的亲本抗体具有经改良的生物特性。产生这些取代变异体的适宜方法涉及使用噬菌体呈现的亲和力成熟。简而言之，使数个高变区位点(例如6-7个位点)突变，于各位点处产生所有可能的氨基酸取代。使由此所产生的抗体以与封装于各粒子内的噬菌体鞘蛋白(例如，M13的基因III产物)的至少部分融合的形式由丝状噬菌体粒子呈现。接着针对如本文所揭示的抗体的生物学活性(例如结合亲和力)筛选噬菌体呈现的变异体。为鉴别用于修饰的候选高变区位点，可执行扫描诱变(例如丙胺酸扫描)以鉴别对抗原结合作用显著的高变区残基。或者或另外，其可有益于分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴别抗体与抗原之间的接触点。根据此项技术已知的技术，包括本文详述的那些技术，这些接触残基及相邻残基为取代候选物。一旦产生这些变异体，则所述组变异体使用此项技术中已知的技艺(包括本文中所述的那些技艺)经受筛选，且在一或多个相关分析中可选择具有优良特性的抗体用于进一步开发。
编码抗体的氨基酸序列变异体的核酸分子系由多种此项技术已知的方法制备。这些方法包括(但不限于)自天然来源分离(在天然存在的氨基酸序列变异体的情况下)，或由早期制备的变异体或抗体的非变异体形式的寡核苷酸介导(或定点)的突变诱发、PCR突变诱发及卡匣突变诱发制备。
可能需要将一或多个氨基酸修饰引入本发明的免疫球蛋白多肽的Fc区，从而产生Fc区变体。Fc区变异体可包含在一或多个氨基酸位置(包括铰链半胱胺酸位置)处包含氨基酸修饰(例如取代)的人类Fc区序列(例如人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。
免疫结合物
在另一态样中，本发明提供免疫结合物或抗体-药物结合物(ADC)，包含抗体与细胞毒性剂(诸如化学治疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素，或其片段))的结合或与放射性同位素的结合(亦即，放射性结合物)。
抗体-药物结合物用于局部递送细胞毒性或细胞生长抑制剂(亦即杀死或抑制肿瘤细胞的药物)以便治疗癌症的用途(Syrigos及Epenetos(1999)Anticancer Research19:605-614；Niculescu-Duvaz及Springer(1997)Adv.Drg Del.Rev.26:151-172；美国专利第4,975,278号)允许将药物部分靶向递送至肿瘤且聚集于细胞内，其中全身性投与此等未结合的药剂可能对正常细胞以及设法消除的肿瘤细胞产生不可接受的毒性程度(Baldwin等人,(1986)Lancet pp.(1986年3月15日):603-05；Thorpe,(1985)「Antibody CarriersOf Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review,」于Monoclonal Antibodies'84:Biological And Clinical Applications,A.Pinchera等人(编),第475-506页)。藉此设法使功效最大而毒性最小。已报导多株抗体与单株抗体适用于此等策略中(Rowland等人,(1986)Cancer Immunol.Immunother.,21:183-87)。这些方法中使用的药物包括道诺霉素、阿霉素、甲胺蝶呤及长春地辛(Rowland等人,(1986),同上)。抗体-毒素结合物中所用的毒素包括细菌性毒素(诸如白喉毒素(diphtheria toxin))、植物毒素(诸如蓖麻毒素(ricin))、小分子毒素(诸如格尔德霉素(geldanamycin))(Mandler等人,(2000)Jour.ofthe Nat.Cancer Inst.92(19):1573-1581；Mandler等人,(2000)Bioorganic&Med.Chem.Letters 10:1025-1028；Mandler等人,(2002)Bioconjugate Chem.13:786-791)、类美登素(maytansinoids)(EP 1391213；Liu等人,(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:8618-8623)及卡奇霉素(calicheamicin)(Lode等人,(1998)Cancer Res.58:2928；Hinman等人,(1993)Cancer Res.53:3336-3342)。这些毒素可通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制的机制来实现其细胞毒性及细胞抑制作用。有些细胞毒性药物当与大抗体或蛋白质受体配位体结合时易变成非活性的或弱活性的。
抗体衍生物
本发明的抗体可进一步修饰成含有此项技术中已知且易获得的其他非蛋白部分。在一个实施例中，适于衍生化抗体的部分为水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括(但不限于)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三恶烷、乙烯/顺丁烯二酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)，及葡聚糖或聚(N-乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛可因其于水中的稳定性而有利于制造。聚合物可具有任何分子量，且可分支或不分支。与抗体连接的聚合物的数目可改变，且若连接超过一种聚合物，则这些聚合物可为相同或不同分子。一般而言，用于衍生作用的聚合物的数目及/或类型可基于包括(但不限于)以下的考虑因素来确定：待改良的抗体的具体特性或功能，抗体衍生物是否在限定条件下用于治疗等。
在另一个实施例中，提供抗体与可通过曝露于辐射来选择性加热的非蛋白部分的结合物。在一实施例中，非蛋白部分为奈米碳管(Kam等人,Proc.Natl.Acad.Sci.102:11600-11605(2005))中。此辐射可具有任一波长，且包括(但不限于)不损伤一般细胞但能将非蛋白部分加热至可杀死抗体-非蛋白部分近侧的细胞的温度的波长。
医药调配物
包含本发明抗体的治疗性调配物系通过将具有所要纯度的抗体与任选生理学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂混合、以水溶液、冻干或其他干燥调配物的形式制备供储存(Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.编(1980))。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所使用的剂量及浓度下对接受者无毒性，且包括缓冲液，诸如磷酸盐、柠檬酸盐、组胺酸及其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸及甲硫胺酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苯甲基氯化铵、氯化六羟季铵、氯化苯甲烃铵、苄索氯铵、苯酚、丁醇或苯甲醇、对羟基苯甲酸烷酯(诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯啶酮；氨基酸，诸如甘胺酸、麸酰胺酸、天冬酰胺酸、组胺酸、精胺酸或离胺酸；单醣、双醣及其他醣，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属错合物(例如Zn-蛋白错合物)；及/或非离子界面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
本文中的调配物亦可含有一种以上为治疗特定适应症所需的活性化合物，包括(但不限于)具有彼此无不利影响的补充活性的那些物。这些分子适合以可有效地达成预期目的量的组合存在。
亦可将活性成分截留于例如通过凝聚技术或通过界面聚合所制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊))中、截留于胶状药物递送系统(例如脂质粒、白蛋白微球、微乳液、奈米粒子及奈米胶囊)中或截留于巨乳液中。这些技术揭示于Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980)中。
欲用于活体内投药的调配物必须无菌。其可容易经由无菌过滤膜过滤来实现。
可制备持续释放型制剂。持续释放型制剂的适当实例包括含有本发明免疫球蛋白的固体疏水性聚合物的半渗透性受质，这些受质呈成形物品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放型受质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利第3,773,919号)、L-麸胺酸与γ乙基-L-麸胺酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物(诸如LUPRON DEPOTTM)(由乳酸-乙醇酸共聚物与乙酸亮丙立德(leuprolide acetate)组成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然聚合物(诸如乙烯-乙酸乙烯酯及乳酸-乙醇酸)使分子能够释放100天，但某些水凝胶释放蛋白质的时间更短。当经囊封抗体长时间保留于体内时，其可能因暴露于37℃下的湿度而变性或聚集，导致生物活性丧失且可能使免疫原性发生变化。视所涉及的机制而定，可设计合理策略以达成稳定化。举例而言，若发现聚集机制为经硫基-二硫化物互换形成分子间S-S键，则可通过修饰硫氢基残基、自酸性溶液冻干、控制水分含量、使用适当添加剂及开发特定聚合物受质组合物来达成稳定。
用途
本发明的抗体可用于例如活体外、离体及活体内治疗方法中。本发明的抗体可用作部分地或完全地阻抑活体外、离体及/或活体内特定抗原活性的拮抗剂。此外，本发明的抗体中的至少一部分可中和获自其他种的抗原活性。因此，本发明的抗体可用于例如在含有抗原的细胞培养物中、在具有可与本发明的抗体交叉反应的抗原的人类个体或其他哺乳动物个体(例如黑猩猩、狒狒、狨猴、食蟹猴及恒河猴、猪或小鼠)中抑制特定活性抗原。在一个实施例中，本发明的抗体可通过使所述抗体与抗原接触、使得抗原活性被抑制而用来抑制抗原活性。在一个实施例中，抗原为人类蛋白质分子。
在一个实施例中，本发明的抗体可用于抑制罹患抗原活性有害的病症的个体中的抗原的方法，所述方法包含将本发明的抗体投与个体以便抑制个体中的抗原活性。在一个实施例中，抗原为人类蛋白质分子且个体为人类个体。或者，个体可为表达与本发明抗体结合的抗原的哺乳动物。此外，个体可为已引入(例如通过投与抗原或通过表达抗原转殖基因)抗原的哺乳动物。可将本发明的抗体投与人类个体用于治疗目的。此外，本发明的抗体可投与表达与抗体交叉反应的抗原的非人类哺乳动物(例如灵长类动物、猪或小鼠)用于兽医学目的或用作人类疾病的动物模型。关于后者，这些动物模型可适用于评估本发明抗体的治疗功效(例如测试投药的剂量及时程)。本发明的抗体可用于治疗、抑制、延迟与SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H及SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H化蛋白质的异常表达及/或活性有关的疾病、病症或病状的进展、预防/延迟其复发、改善或预防此等疾病、病症或病状，包括(但不限于)癌症、肌肉病症、泛素路径相关性遗传病症、免疫/发炎病症、神经病症，及其他泛素路径相关性病症。
在一个态样中，本发明的阻断性抗体对SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H具有特异性。
在某些实施例中，向患者投与包含本发明抗体与细胞毒性剂结合的免疫结合物。在一些实施例中，免疫结合物及/或其所结合的抗原被细胞表面上表达一或多种与SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H有关的蛋白质的细胞内化，从而增强免疫结合物杀死与其结合的靶细胞的治疗功效。在一个实施例中，细胞毒性剂靶向或干扰靶细胞中的核酸。这些细胞毒性剂的实例包括本文中所注明的任一种化学治疗剂(诸如类美登素或卡奇霉素)、放射性同位素或核糖核酸酶或DNA核酸内切酶。
本发明的抗体在治疗中可单独使用或与其他组合物组合使用。举例而言，本发明的抗体可与其他抗体及/或佐剂/治疗剂(例如类固醇)共投药。举例而言，本发明抗体可与消炎剂及/或防腐剂组合于治疗方案中，例如用于治疗本文所述的任何疾病，包括癌症、肌肉病症、泛素路径相关性遗传病症、免疫/发炎病症、神经病症及其他泛素路径相关性病症。上文注明的这些组合疗法包括组合投药(其中两种或超过两种药剂包括于同一或各别调配物中)，及分开投药，在此情况下，本发明抗体的投与可在佐剂疗法投与之前及/或之后进行。
本发明的抗体(及辅助治疗剂)可通过任何适当方式(包括非经肠、皮下、腹膜内、肺内及鼻内)投药，且若需要局部治疗，则为病灶内投药。非经肠输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下投药。另外，适当地通过脉冲输注来投与抗体，尤其剂量降低的抗体。部分地视投药是否为短暂或长期而定，可通过任何适当途径(例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射)给药。
在制备及投与抗体时可考虑本发明的抗体的结合靶的位置。当结合靶为细胞内分子时，本发明的某些实施例提供一种抗体或其抗原结合片段，供引入结合靶位置所在的细胞中。在一实施例中，本发明的抗体可作为胞内抗体表达于细胞内。如本文中所使用的术语「胞内抗体」系指如以下文献中所述的可于细胞内表达且能够选择性结合靶分子的抗体或其抗原结合部分：Marasco,Gene Therapy 4:11-15(1997)；Kontermann,Methods 34:163-170(2004)；美国专利第6,004,940号及第6,329,173号；美国专利申请公开案第2003/0104402号，及PCT公开案第WO2003/077945号。胞内抗体的细胞内表达系通过将编码所需抗体或其抗原结合部分的核酸(缺乏野生型前导序列及通常与编码所述抗体或抗原结合片段的基因有关的分泌信号)引入靶细胞中来实现。可使用将核酸引入细胞内的任一种标准方法，包括(但不限于)：微量注射、弹道注射、电穿孔、磷酸钙沈淀、脂质体及利用逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒及携有所关注的核酸的牛痘载体的转染法。可将编码本发明全部或一部分抗SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H抗体之一或多种核酸递送至靶细胞，从而表达能够在细胞内结合至SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H且调节一或多种SSEA-3/SSEA-4/GLOBO H介导性细胞路径的一或多种胞内抗体。
在其他实施例中，提供内化抗体。抗体可具有增强递送抗体至细胞内的某些特性，或经修饰可具有这些特性。达成此目的的技术系此项技术中已知者。举例而言，已知抗体的阳离子化有助于其吸收至细胞中(参见例如美国专利第6,703,019号)。亦可利用脂质转染或脂质体将抗体递送至细胞内。当使用抗体片段时，特异性结合标靶蛋白质的结合域的最小抑制片段通常为有利的。举例而言，可依据抗体的可变区序列来设计保留结合标靶蛋白质序列的能力的肽分子。这些肽可化学合成及/或通过重组DNA技术产生。参见例如Marasco等人,Proc.Natl.Acad.Sci USA,90:7889-7893(1993)。
可通过此项技术中已知的方法增强调节性多肽进入靶细胞内。举例而言，某些序列(诸如那些来源于HIV Tat或触角足突变同源域蛋白质的序列)能够导引异源蛋白质跨越细胞膜高效吸收。参见例如Chen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999),96:4325-4329。
当结合靶位于脑内时，本发明的某些实施例提供可穿越血脑障壁的抗体或其抗原结合片段。某些神经变性疾病与血脑障壁的通透性增大相关，以便易将抗体或抗原结合片段引入脑内。当血脑障壁保持完整时，存在此项技术已知的输送分子穿越血脑障壁的若干种方法，包括(但不限于)物理方法、基于脂质的方法以及基于受体及通道的方法。
输送抗体或抗原结合片段穿越血脑障壁的物理方法包括(但不限于)完全规避血脑障壁法或在血脑障壁内形成开孔。规避方法包括(但不限于)直接注入脑内(参见例如Papanastassiou等人,Gene Therapy 9:398-406(2002))、间质性输注/对流增强性递送(参见例如Bobo等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:2076-2080(1994))及将递送装置植入脑内(参见例如Gill等人,Nature Med.9:589-595(2003)；及Gliadel WafersTM,GuildfordPharmaceutical)。在障壁内形成开孔的方法包括(但不限于)超音波法(参见例如美国专利公开案第2002/0038086号)、渗透压法(例如投与高张性甘露糖醇(Neuwelt,E.A.,Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation,第1及2卷,PlenumPress,N.Y.(1989)))、通过例如舒缓激肽或渗透剂A-7的渗透法(参见例如美国专利第5,112,596号、第5,268,164号、第5,506,206号及第5,686,416号)，以及用含有编码抗体或抗原结合片段的基因的载体转染跨越血脑障壁的神经元(参见例如美国专利公开案第2003/0083299号)。
输送抗体或抗原结合片段穿越血脑障壁的基于脂质的方法包括(但不限于)：将抗体或抗原结合片段囊封于脂质体内，这些脂质体系与结合血脑障壁的血管内皮上的受体的抗体结合片段偶合(参见例如美国专利申请公开案第20020025313)，及以低密度脂蛋白粒子(参见例如美国专利申请公开案第20040204354号)或脱脂蛋白E(参见例如美国专利申请公开案第20040131692号)涂布抗体或抗原结合片段。
输送抗体或抗原结合片段穿越血脑障壁的基于受体及通道的方法包括(但不限于)使用糖皮质激素阻断剂增强血脑障壁的通透性(参见例如美国专利申请公开案第2002/0065259号、第2003/0162695号及第2005/0124533号)；活化钾通道(参见例如美国专利申请公开案第2005/0089473号)、抑制ABC药物转运子(参见例如美国专利申请公开案第2003/0073713号)；用运铁蛋白涂布抗体且调节一或多种运铁蛋白受体的活性(参见例如美国专利申请公开案第2003/0129186号)，及使抗体发生阳离子化(参见例如美国专利第5,004,697号)。
本发明的抗体组合物以符合良好医疗实务的方式调配、定剂量及投药。在此背景下考虑的因素包括所治疗的特定病症、所治疗的特定哺乳动物、个别患者的临床病状、病症的起因、药剂的递送位点、投药方法、投药时程及从业医生已知的其他因素。抗体无需但视情况可与一或多种当前用于预防或治疗所述病症的药剂一起调配。此等其他药剂的有效量视存在于调配物中的本发明的抗体的量、病症或治疗的类型及上文所讨论的其他因素而定。这些药剂通常以相同剂量且利用本文中所述的投药途径使用，或以本文中所述剂量的约1％至99％使用，或以任意剂量且凭经验/临床上确定为适当的任何途径使用。
对于预防或治疗疾病，本发明的抗体(当单独使用或与诸如化学治疗剂的其他剂组合使用时)的适当剂量视待治疗的疾病类型、抗体类型、疾病严重程度及病程、抗体投药是否为预防性或治疗性目的、过去治疗、患者临床史及对抗体的反应及主诊医师的判断而定。抗体适于一次性或经一系列治疗投与至患者。视疾病类型及严重程度而定，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)抗体可为投与患者的初始候选剂量，不论例如通过一或多次分开投药，或通过连续输注。一种典型日剂量可在约1μg/kg至100mg/kg或超过100mg/kg的范围内，此视上文所提及的因素而定。对于历经数天或更长时间的重复投药，视病状而定，治疗通常可持续至疾病症状的所要抑制发生为止。抗体的一种例示性剂量在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。因此，可将约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg之一或多个剂量(或其任何组合)投与患者。这些剂量可间歇地投与，例如每周或每三周(例如使得患者接受约二至约二十或例如约六个剂量的抗体)。可投与最初较高负荷剂量，接着可投与一或多个较低剂量。例示性给药方案包含投与约4mg/kg的初始负荷剂量的抗体，随后投与约2mg/kg的每周维持剂量的抗体。然而，其他给药方案可为适用的。此疗法的进程易于通过习知技术及分析监测。
制品
在本发明的另一态样中，提供一种含有可用于治疗、预防及/或诊断上述病症的物质的制品。所述制品包含容器及附于所述容器上或与所述容器关联的标签或药品说明书。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可由诸如玻璃或塑料的各种材料形成。所述容器容纳单独组合物或与另一种有效治疗、预防及/或诊断病状的组合物的组合，且所述容器可具有无菌接取口(例如所述容器可为静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺孔的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂为本发明的抗体。卷标或药品说明书指示所述组合物用于治疗所选病状。此外，所述制品可包含(a)内含组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体；及(b)内含组合物的第二容器，其中所述组合物包含另一种细胞毒性剂或治疗剂。本发明的实施例中的制品可进一步包含药品说明书，所述药品说明书指示组合物可用于治疗特定病状。或者或另外，所述制品可进一步包含含有医药学上可接受的缓冲液(诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)及葡萄糖溶液)的第二(或第三)容器。其可进一步包括就商业及使用者观点而言所需的其他物质，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针及注射器。
在某些实施例中，所治疗的个体为哺乳动物。在某些实施例中，个体为人类。在某些实施例中，个体为驯养动物，诸如狗、猫、牛、猪、马、绵羊或山羊。在某些实施例中，个体为伴侣动物，例如狗或猫。在某些实施例中，个体为家畜动物，诸如牛、猪、马、绵羊或山羊。在某些实施例中，个体为动物园动物。在另一个实施例中，个体为研究动物，诸如啮齿动物、狗或非人类灵长类动物。在某些实施例中，个体为非人类转殖基因动物，诸如转殖基因小鼠或转殖基因猪。
医药组合物及调配物
制备如本文所述的抗体之后，可制备「冻干前调配物」。用于制备调配物的抗体优选为基本上纯的且宜为基本上均质的(亦即不含污染蛋白质等)。「基本上纯的」蛋白质意谓以组合物总重量计，组合物包含至少约90wt％、优选至少约95wt％蛋白质。「基本上均质」蛋白质意谓以组合物总重量计，组合物包含至少约99wt％蛋白质。在某些实施例中，蛋白质为抗体。
考虑所需剂量体积、投药模式等来确定冻干前调配物中抗体的量。在所选蛋白质为完整抗体(全长抗体)的情况下，约2mg/mL至约50mg/mL、优选约5mg/mL至约40mg/mL且最佳约20至30mg/mL为例示性起始蛋白质浓度。蛋白质一般存在于溶液中。举例而言，蛋白质可存在于约pH 4-8且优选约pH 5-7的pH缓冲溶液中。例示性缓冲剂包括组胺酸、磷酸盐、Tris、柠檬酸盐、丁二酸盐及其他有机酸。缓冲液浓度可为约1mM至约20mM，或约3mM至约15mM，此视例如缓冲液及调配物(例如复原调配物)的所需等张性而定。优选缓冲剂为组胺酸，原因在于如下文所表明，此缓冲剂可具有冻干保护特性。丁二酸盐显示为另一种适用缓冲剂。
向冻干前调配物中添加冻干保护剂。在优选实施例中，冻干保护剂为非还原糖，诸如蔗糖或海藻糖。冻干前调配物中冻干保护剂的量一般应使得当复原时，所得调配物具有等张性。然而，高张性复原调配物亦可为适合的。此外，冻干保护剂的量不得太低，太低致使冻干时蛋白质发生不可接受量的降解/聚集。在冻干保护剂为糖(诸如蔗糖或海藻糖)且蛋白质为抗体的情况下，冻干前调配物中的例示性冻干保护剂浓度为约10mM至约400mM，且优选为约30mM至约300mM，且最佳为约50mM至约100mM。
每种蛋白质与冻干保护剂组合均选择蛋白质与冻干保护剂的比率。在抗体为所选蛋白质且糖(例如蔗糖或海藻糖)为用于产生具有高蛋白质浓度的等张性复原调配物的冻干保护剂的情况下，冻干保护剂与抗体的莫耳比可为约100至约1500莫耳冻干保护剂比1莫耳抗体，且优选为约200至约1000莫耳冻干保护剂比1莫耳抗体，例如约200至约600莫耳冻干保护剂比1莫耳抗体。
在本发明的优选实施例中，已发现需要向冻干前调配物中添加界面活性剂。或者或另外，可向冻干调配物及/或复原调配物中添加界面活性剂。例示性界面活性剂包括非离子界面活性剂，诸如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20及聚山梨醇酯80)；泊洛沙姆(poloxamer)(例如泊洛沙姆188)；曲拉通(Triton)；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂基硫酸钠；辛基糖苷钠；月桂基-、肉豆蔻基-、亚油醇基-或硬脂酰基-磺基甜菜碱；月桂基-、肉豆蔻基-、亚油醇基-或硬脂酰基-肌胺酸；亚油醇基-、肉豆蔻基-或鲸蜡基-甜菜碱；月桂酰胺基丙基-、椰油酰胺基丙基-、亚油酰胺基丙基-、肉豆蔻酰胺基丙基-、棕榈酰胺基丙基-或异硬脂酰胺基丙基-甜菜碱(例如月桂酰胺基丙基)；肉豆蔻酰胺基丙基-、棕榈酰胺丙基-或异硬脂酰胺基丙基-二甲胺；甲基椰油酰基牛磺酸钠或甲基油醇牛磺酸二钠；及MONAQUATTM系列(Mona Industries,Inc.,Paterson,N.J.)；聚乙二醇、聚丙二醇，及乙二醇与丙二醇的共聚物(例如Pluronics,PF68等)；等。界面活性剂添加量应使得在复原之后，其减少复原蛋白质的聚集且将微粒形成减至最少。举例而言，界面活性剂可以约0.001-0.5％的量且优选以约0.005-0.05％的量存在于冻干前调配物中。
在本发明的某些实施例中，使用冻干保护剂(诸如蔗糖或海藻糖)与增积剂(例如甘露醇或甘胺酸)的混合物制备冻干前调配物。增积剂可允许产生均一冻干饼而其中无过多囊袋等。
其他医药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂，诸如Remington'sPharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980)中所述的那些物，可包括于冻干前调配物(及/或冻干调配物及/或复原调配物)中，限制条件为其对调配物的所需特征无不利影响。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所使用的剂量及浓度下对接受者无毒且包括：其他缓冲剂；防腐剂；共溶剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸及甲硫胺酸；螯合剂，诸如EDTA；金属错合物(例如Zn-蛋白质错合物)；生物可降解聚合物，诸如聚酯；及/或成盐平衡离子，诸如钠。
本文所述的医药组合物及调配物优选为稳定的。「稳定」调配物/组合物为储存时其中抗体基本上保持其物理及化学稳定性及完整性的调配物/组合物。用于量测蛋白质稳定性的各种分析技术可在此项技术中获得且回顾于Peptide and Protein DrugDelivery,247-301,Vincent Lee编,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs.(1991)及Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90(1993)。稳定性可在所选温度下、针对所选时段加以量测。
欲用于活体内投药的调配物必须无菌。此容易在冷冻干燥及复原之前或之后经无菌过滤膜过滤实现。或者，可通过例如将除蛋白质的成分在约120℃热压处理约30分钟来使整个混合物达成无菌性。
蛋白质、冻干保护剂及其他可选组分混合在一起之后，将调配物冻干。许多不同冻干器可用于此目的，诸如(Hull,USA)或(Leybold-Heraeus,Germany)冻干器。通过冷冻调配物且随后使冷冻内容物中的冰在适于初步干燥的温度下升华来实现冻干。在此条件下，产物温度低于调配物的共晶点或塌陷温度。典型地，在适合压力(范围典型地为约50至250毫托)下，初步干燥的搁板温度在约-30至25℃范围内(限制条件为在初步干燥期间产物保持冷冻状态)。干燥所需时间主要由容纳样品的容器(例如玻璃瓶)的调配物、尺寸及类型及液体体积决定，且可在几小时至数日范围内(例如40-60小时)。二次干燥阶段可在约0-40℃下执行，此主要视容器的类型及尺寸以及所用蛋白质类型而定。然而，本文中发现二次干燥步骤可能并非必需的。举例而言，在冻干的整个水移除阶段期间，搁板温度可为约15-30℃(例如约20℃)。二次干燥必需的时间及压力为产生适合冻干饼的时间及压力，此视例如温度及其他参数而定。二次干燥时间系由产物中的所需残余水分含量决定且典型地采用至少约5小时(例如10-15小时)。压力可与初步干燥步骤期间所用的压力相同。冻干条件可根据调配物及小瓶尺寸而变化。
在一些情况下，可能需要将蛋白质调配物在其中进行蛋白质复原的容器中冻干，以避免转移步骤。在此情况下，容器可为例如3、5、10、20、50或100cc小瓶。作为一般性提议，冻干将产生水分含量小于约5％且优选小于约3％的冻干调配物。
在所需阶段，典型地为向患者投与蛋白质时，冻干调配物可用稀释剂复原，使得复原调配物中的蛋白质浓度为至少50mg/mL，例如约50mg/mL至约400mg/mL，更佳为约80mg/mL至约300mg/mL，且最佳为约90mg/mL至约150mg/mL。在意欲皮下递送复原调配物的情况下，复原调配物中的此等高蛋白质浓度视为特别适用的。然而，对于其他投药途径(诸如静脉内投药)而言，可能需要降低复原调配物中的蛋白质浓度(在复原调配物中例如约5-50mg/mL，或约10-40mg/mL蛋白质)。在某些实施例中，复原调配物中的蛋白质浓度显著高于冻干前调配物。举例而言，复原调配物中之蛋白质浓度可为冻干前调配物的约2-40倍，优选3-10倍且最佳3-6倍(例如至少3倍或至少4倍)。
复原一般在约25℃温度下进行以确保完全的水合作用，然而需要时可采用其他温度。复原所需的时间将视例如稀释剂类型、赋形剂及蛋白质的量而定。例示性稀释剂包括无菌水、注射用抑菌水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲生理食盐水)、无菌生理食盐水溶液、林格氏溶液或右旋糖溶液。稀释剂视情况含有防腐剂。例示性防腐剂已描述如上，其中芳族醇(诸如苯甲醇或苯酚)为优选防腐剂。防腐剂用量系通过评估与蛋白质及防腐剂功效测试兼容的不同防腐剂浓度来确定。举例而言，若防腐剂为芳族醇(诸如苯甲醇)，则其可以约0.1-2.0％且优选约0.5-1.5％、但最佳约1.0-1.2％的量存在。优选地，复原调配物在每个小瓶中的尺寸>10μm的粒子少于6000个粒子。
治疗应用
本文描述治疗方法，包括向需要此治疗的个体投与治疗有效量的包括一或多种本文所述抗体的组合物。
在一些实施例中，需要治疗的个体(例如人类患者)经诊断患有、怀疑患有癌症或处于癌症的风险中。癌症的实例包括(但不限于)脑癌、肺癌、乳癌、口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆管癌、胰脏癌、结肠癌、肾癌、子宫颈癌、卵巢癌及前列腺癌。在一些实施例中，癌症为脑癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌或胰脏癌。在一些优选实施例中，癌症为脑癌或多形性胶质母细胞瘤(GBM)癌症。
在优选实施例中，抗体能够靶向表达Globo H、SSEA-3及S SEA-4的癌细胞。在一些实施例中，抗体能够靶向癌细胞上的Globo H及SSEA。在一些实施例中，抗体能够靶向癌症中的SSEA。
因此，抗体为针对Globo H、SSEA-3及SSEA-4的三重靶向抗体。在一些实施例中，抗体为针对Globo H及SSEA-3的双重靶向抗体与抗SSEA-4抗体的混合物。在一些实施例中，抗体为针对Globo H、SSEA-3及SSEA-4的三重靶向抗体与抗SSEA-4抗体的混合物。在一些实施例中，抗体为抗Globo H、抗SSEA-3及抗SSEA-4抗体的混合物。在一些实施例中，抗体为抗Globo H与抗SSEA-4抗体的混合物。在一些实施例中，抗体为抗SSEA-4抗体。
治疗可减小肿瘤尺寸、消除恶性细胞、预防癌转移、预防复发、减少或杀死播散性癌症、延长存活期及/或延长肿瘤癌症进展的时间。
在一些实施例中，治疗进一步包含在所述投与抗体之前、期间或之后投与另一种疗法。在一些实施例中，另一种疗法系用化学治疗剂治疗。在一些实施例中，额外疗法为放射疗法。
本发明的方法尤其有利于治疗及预防早期肿瘤，藉此防止进展至较晚期，从而降低与晚期癌症有关的发病率及死亡率。本发明的方法亦有利于预防肿瘤复发或肿瘤再生长，例如原发肿瘤移除之后持续存在的潜伏肿瘤，或有利于减少或预防肿瘤发生。
在一些实施例中，如本文所揭示的方法适用于治疗或预防癌症，例如其中癌症具有Globo H、SSEA-3及/或SSEA-4表达增强的特征。在一些实施例中，癌症包含癌症干细胞。在一些实施例中，癌症为癌前期，及/或恶性癌症及/或抗治疗性癌症。在一些实施例中，癌症为脑癌。
对于本发明的方法而言，癌症可为实体肿瘤，例如乳癌、结肠直肠癌、直肠癌、肺癌、肾细胞癌、神经胶质瘤(例如多形性星形细胞瘤、多形性寡树突状星形细胞瘤、多形性寡树突状神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤(GBM))、肾癌、前列腺癌、肝癌、胰脏癌、软组织肉瘤、类癌瘤、头颈癌、黑色素瘤及卵巢癌。在一个实施例中，癌症为脑癌或GBM。为实施本文所揭示的方法，有效量的含有至少一种本文所述抗体的上述医药组合物/调配物可经由适合途径(诸如静脉内投药(例如快速注射或连续输注一段时间)、肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、经口、吸入或局部途径)投与需要治疗的个体(例如人类)。包括喷嘴式喷雾器及超音式喷雾器的用于液体调配物的市售喷雾器适用于投药。液体调配物可直接雾化且冻干粉末可在复原之后雾化。或者，抗体可使用氟碳调配物及定剂量吸入器气溶胶化，或以冻干且经研磨的粉末形式吸入。
通过本文所述的方法治疗的个体可为哺乳动物，更佳为人类。哺乳动物包括(但不限于)农畜、运动型动物、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、小鼠及大鼠。需要治疗的人类个体可为患有癌症、处于罹患癌症的风险中或怀疑患有癌症的人类患者，包括(但不限于)脑癌、肺癌、乳癌、口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆管癌、胰脏癌、结肠癌、肾癌、子宫颈癌、卵巢癌及前列腺癌。患有癌症的个体可通过常规医学检查来鉴别。
如本文所使用，「有效量」系指对个体产生治疗作用所必需的各活性剂(单独或与一或多种其他活性剂组合)的量。如熟习此项技术者所认知，有效量可变化，此视以下而定：所治疗的特定病状、病状严重程度、个别患者参数(包括年龄、身体状况、体型、性别及体重)、治疗持续时间、并行疗法(若存在)的性质、特定投药途径，及健康从业者的知识及专长范围内的类似因素。此等因素已为一般技术者熟知且可仅用常规实验便可解决。通常优选使用个别组分或其组合的最大剂量，亦即根据合理医学判断的最高安全剂量。然而一般技术者应了解，患者因医疗原因、心理原因或实际上任何其他原因可坚持较低剂量或可耐受剂量。
诸如半衰期的经验性考虑因素一般将有助于确定剂量。举例而言，与人类免疫系统兼容的抗体(诸如人类化抗体或完全人类抗体)可用于延长抗体半衰期且防止抗体受宿主的免疫系统攻击。投药频率可加以确定且在治疗过程中加以调整，且通常(但不一定)基于癌症的治疗及/或抑制及/或改善及/或延迟。或者，本文所述抗体的持续连续释放型调配物可为适当的。达成持续释放的各种调配物及装置在此项技术中已知。
在一个实例中，如本文所述抗体的剂量用于已给与一或多次抗体投药的个体的剂量可凭经验确定。给与个体递增剂量的抗体。为评估抗体功效，疾病(例如癌症)的指标可遵循常规实务。
一般而言，投与本文所述的任一种抗体的初始候选剂量可为约2mg/kg。出于本发明的目的，典型日剂量的范围可为约0.1μg/kg至3μg/kg至30μg/kg至300μg/kg至3mg/kg至30mg/kg至100mg/kg或大于100mg/kg，此视上述因素而定。对于数日或更长时间的重复投药而言，视病状而定，持续治疗直至症状达成所需抑制或直至达成足以减缓癌症或其症状的治疗程度。例示性给药方案包含投与约2mg/kg抗体的初始剂量，随后为每周约1mg/kg抗体的维持剂量，或随后为每隔一周约1mg/kg的维持剂量。然而，视从业者所希望达成的药物动力学衰减模式而定，其他给药方案亦可能适用。举例而言，涵盖一周给药一至四次。在一些实施例中，可使用约3μg/mg至约2mg/kg(诸如约3μg/mg、约10μg/mg、约30μg/mg、约100μg/mg、约300μg/mg、约1mg/kg，及约2mg/kg)范围内的剂量。在一些实施例中，给药频率为每周、每2周、每4周、每5周、每6周、每7周、每8周、每9周或每10周一次；或每月、每2个月或每3个月或更长时间一次。此疗法的进程易于通过习知技术及分析监控。给药方案(包括所用抗体)可随时间改变。
出于本发明的目的，本文所述抗体的适当剂量视以下而定：所用特定抗体(或其组合物)、癌症的类型及严重程度、投与抗体是否用于预防或治疗目的、先前疗法、患者临床病史及对抗体的反应，及主治医师的判断。本文所述的抗体在预选时间段内基本上可连续投与或可以一系列间隔剂量投与，例如在出现癌症之前、期间或之后。
如本文所使用，术语「治疗」系指将包括一或多种活性剂的组合物施用于或投与患有癌症、癌症症状、癌症素因的个体，目的为治疗、治愈、减轻、改变、补救、改善、改良或影响癌症、癌症症状或癌症素因。
减轻癌症包括延迟癌症发展或进展，或降低癌症严重程度。减轻癌症不一定需要治愈性结果。如其中所用，「延迟」癌症发展意谓推迟、阻碍、减缓、阻滞、稳定及/或推迟癌症进展。此延迟可为不同时间长度，此视癌症病史及/或所治疗的个体而定。「延迟」或缓解癌症发展或延迟癌症发作的方法为，与不使用所述方法相比，在指定时间范围内使出现癌症之一或多种症状的机率(风险)降低及/或在指定时间范围内降低症状程度的方法。这些比较通常系基于使用足以得到统计学显著结果的许多个体进行的临床研究。
癌症的「发展」或「进展」意谓癌症的初始显现及/或随后发生的进展。癌症发展可为可侦测的且使用此项技术中熟知的标准临床技术评估。然而，发展亦指可能侦测不到的进展。出于本发明的目的，发展或进程系指症状的生物学过程。「发展」包括出现、复发及发作。如本文所使用，癌症的「发作」或「发生」包括初始发作及/或复发。
视所治疗的疾病类型或疾病部位而定，可利用医药技术中的一般技术者已知的习知方法将医药组合物投与个体。此组合物亦可经由其他习知途径投与，例如经口、非经肠、通过吸入喷雾、局部、直肠、鼻、颊内、阴道或经由植入式储集器投与。如本文所用的术语「非经肠」包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内及颅内注射或输注技术。另外，其可经由可注射储槽式投药途径投与个体，诸如使用1个月、3个月或6个月储存物可注射或可生物降解材料及方法。
可注射组合物可含有各种载剂，诸如植物油、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、乙醇及多元醇(甘油、丙二醇、液体聚乙二醇及其类似物)。对于静脉内注射而言，可通过滴注方法投与水溶性抗体，藉此输注含有抗体及生理学上可接受的赋形剂的医药调配物。生理学上可接受的赋形剂可包括例如5％右旋糖、0.9％生理盐水、林格氏溶液或其他适合赋形剂。肌内制剂(例如抗体的适合可溶性盐形式的无菌调配物)可于医药赋形剂(诸如注射用水、0.9％生理盐水或5％葡萄糖溶液)中溶解且投与。
诊断应用
本文描述一种诊断个体的癌症的方法，包含(a)将包括一或多种单株抗体的组合物施加于获自个体的细胞或组织样品，这些单株抗体侦测由GM3、GM2、GM1、GD1、GD1a、GD3、GD2、GT1b、A2B5、LeX、sLeX、LeY、SSEA-3、SSEA-4、Globo H、TF、Tn、sTn、CD44、CD24、CD45、CD90、CD133组成之一组标记的表达；(b)分析单株抗体与细胞或组织样品的结合；及(c)将此结合与正常对照值比较，以确定个体中癌症的存在。
用于侦测及诊断的癌症实例包括(但不限于)脑癌、肺癌、乳癌、口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆管癌、胰脏癌、结肠癌、肾癌、子宫颈癌、卵巢癌及前列腺癌。在一些实施例中，癌症为脑癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌或胰脏癌。
在一些实施例中，标记系由GM2、GM1、GD1a、GT1b、A2B5、Tf、Tn、Globo H、SSEA3、SSEA4、CD24、CD44及CD90组成。在一些实施例中，组合物包括能够侦测GM2、GM1、GD1a、GT1b、A2B5、Tf、Tn、Globo H、SSEA3、SSEA4、CD24、CD44及CD90的多种单株抗体。
在一些实施例中，抗体能够侦测表达Globo H、SSEA-3及SSEA-4的癌细胞。在一些实施例中，抗体能够侦测癌细胞上的Globo H及SSEA。在一些实施例中，抗体能够侦测癌症中的SSEA。在一些实施例中，癌症为脑癌或多形性胶质母细胞瘤(GBM)癌症，且抗体为抗SSEA-4单株抗体。
Globo H、SSEA-3及/或SSEA-4特异性单株抗体可于活体外及活体内诊断性分析中单独或组合使用以侦测表达Globo H、SSEA-3及SSEA-4的癌细胞(例如GBM、某些实体肿瘤细胞，及如本文中所指明的造血系癌细胞)。举例而言，可自患者获得样品(例如血液样品或组织活体检查)且与针对Globo H、SSEA-3及SSEA-4的三重靶向抗体或Globo H/SSEA-3双重靶向抗体与抗SSEA-4的组合接触，且可通过侦测抗体结合来确定患者样品中表达Globo H、SSEA-3及SSEA-4的癌细胞的存在。抗体结合可直接加以侦测(例如其中抗体本身经标记)或通过使用第二侦测剂(诸如二次抗体)加以侦测。可侦测标记可与本发明抗体直接或间接(例如经由螯合剂或连接符)结合。
在一些实施例中，使Globo H、SSEA-3及/或SSEA-4特异性单株抗体与得自患有或怀疑患有癌症的个体的生物样品接触且测定抗体与样品中细胞的结合，此时高于或低于正常抗体结合均表明所述个体患有癌症。在一些实施例中，生物样品为血液样品或血液部分(例如血清、血浆、血小板、红血球、白血球)。在一些实施例中，生物样品为得自例如疑似肿瘤部位或已知患病的组织的组织样品(活组织检查)，例如以确定已知肿瘤的边界。在一些实施例中，生物样品获自发炎部位。
典型地进行活组织检查以获得组织样品，亦即非流体细胞类型。所应用的活组织检查技术将视待评估的组织类型(例如乳房、皮肤、结肠、前列腺、肾脏、肺、膀胱、淋巴结、肝脏、骨髓、呼吸道或肺)而定。在癌症的情况下，技术亦将视肿瘤的尺寸及类型(例如实体、悬浮或血液)及其他因素而定。活组织检查技术论述于例如Harrison's Principles ofInternal Medicine,Kasper等人编,第16版,2005,第70章及整个第V中。
本发明诊断性分析中可使用侦测抗体与样品中的细胞结合的任何方法。侦测抗体结合的方法在此项技术中已熟知，例如流式细胞术、荧光显微法、ELISA等。在一些实施例中，方法包含在测定步骤之前制备用于侦测的生物样品。举例而言，可将细胞(例如白血球)的亚群与个体样品的其余部分(例如其他血液组分)分离或可使组织中的细胞悬浮以便更容易侦测。
在一些实施例中，测定样品中表达Globo H/SSEA-3/SSEA-4的细胞的百分率且与对照样品对比，例如得自已知患有癌症的个体或个体群的样品(阳性对照)或得自已知不患有癌症的个体或个体群的样品(正常非疾病，或阴性对照)。在一些实施例中，对照为针对指定组织所建立的Globo H/SSEA-3/SSEA-4表达的标准范围。高于或低于表达Globo H/SSEA-3/SSEA-4的细胞的正常百分率，或表达量较高或较低，均表明个体患有癌症。
在一个实施例中，提供一种套组，用于侦测生物样品(诸如血液样品或组织样品)中的Globo H、SSEA-3及SSEA-4。举例而言，为确诊个体的癌症，可进行活组织检查以获得组织样品用于组织学检查。或者，可获得血液样品以侦测Globo H、SSEA-3及SSEA-4的存在。用于侦测多肽的套组典型地包含一或多种特异性结合Globo H、SSEA-3及SSEA-4的抗体，诸如本文所揭示的任一种抗体。在另一实施例中，抗体系经标记(例如经荧光、放射性或酶促标记标记)。
在一个实施例中，套组包括揭示一或多种特异性结合Globo H、SSEA-3及SSEA-4的抗体的使用方式的说明性材料。说明性材料可呈书面形式、电子形式(诸如计算机磁盘或光盘)或可为可见的(诸如视讯档案)。套组亦可包括促进据以设计套组的特定应用的其他组分。因此，举例而言，套组可另外含有侦测标记的方式(诸如用于酶促标记的酶受质、侦测荧光标记的过滤器组、适当的第二标记(诸如二次抗体)，或其类似物)。套组可另外包括缓冲液及常用于实施特定方法的其他试剂。此等套组及适当内容物为熟习此项技术者所熟知。
测定细胞表面标记的存在或不存在的方法在此项技术中已熟知。举例而言，抗体可与其他化合物结合，包括(但不限于)酵素、磁性珠粒、胶态磁性珠粒、半抗原、荧光染料、金属化合物、放射性化合物或药物。抗体亦可用于免疫分析中，诸如(但不限于)放射免疫分析(RIA)、酶联免疫吸附分析(ELISA)或免疫组织化学分析。抗体亦可用于荧光活化细胞分选(FACS)。FACS系采用多个彩色通道、低角度及钝角光散射侦测信道及阻抗信道以及其他程度更复杂的侦测来分离或分选细胞(参见美国专利第5,061,620号)。此等分析中可使用结合至Globo H、SSEA-3及SSEA-4的任一种单株抗体，如本文所揭示。因此，抗体可用于习知免疫分析中，包括(但不限于)ELISA、RIA、FACS、组织免疫组织化学、西方墨点或免疫沈淀。
对肿瘤进行分期及/或确定预后的方法
本发明的另一态样提供一种对人类患者中的肿瘤进行分期及/或确定预后的方法，所述方法包含：(a)将包括一或多种抗体的组合物施加于获自患者的细胞或组织样品，这些抗体侦测由SSEA-3、SSEA-4及Globo H组成的标记的表达；(b)分析单株抗体与细胞或组织样品的结合；(c)将测试样品中的标记表达量与参考样品中的表达量进行比较；及(d)根据步骤(c)中鉴别的结果来确定患者肿瘤的分期及/或预后。
在一些实施例中，癌症为脑癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌或胰脏癌。在一些优选实施例中，癌症为脑癌或GBM。
在一些实施例中，抗体能够侦测表达Globo H、SSEA-3及S SEA-4的癌细胞。在一些实施例中，抗体能够侦测癌细胞上的Globo H及SSEA。在一些实施例中，抗体能够侦测癌症中的SSEA。在一些实施例中，癌症为脑癌或多形性胶质母细胞瘤(GBM)癌症，且抗体为抗SSEA-4单株抗体。在一些实施例中，当癌症为脑癌或GBM时，抗体为抗SSEA-4。
干细胞的分离及富集
本发明的另一态样提供GBM干细胞的分离，且更特定言之，对标记GD2+SSEA4+CD133+呈阳性的GBM干细胞的分离。本文所揭示的方法包括利用电池表面标记GD2、SSEA4及CD133及可使干细胞与其他细胞分离的流式细胞术使干细胞自GBM肿瘤细胞分离、富集及自行再生的方法。本文揭示包含分离的GD2+SSEA4+CD133+GBM干细胞群的组合物。
积累的证据显示，块状肿瘤可具有较小的细胞亚群，称为癌症起始细胞或癌症干细胞样细胞(CSC)。在免疫缺乏小鼠中，其具有不良分化、自行再生能力及起始肿瘤的特征。因此，前瞻性鉴别CSC及自块状肿瘤分离CSC为开发治疗性范例的关键。尽管许多报导CSC富集已通过分选CD133、A2B5、SSEA-1或整合素阳性癌细胞而达成，但此等细胞的身分仍不明确且此等标记在CSC中的作用仍不清楚。
许多特定聚糖据报导其分布于肿瘤细胞表面上且能够调节肿瘤增殖、癌转移及血管生成。此意味着肿瘤上的聚糖可充当功能性生物标记，其可为癌症的治疗性标靶。为寻找GBM的CSC中的聚糖相关标记，首先在补充有EGF及FGF的神经基质培养基中培养各种神经胶质瘤细胞株以富集干细胞样细胞。为了解决此问题，使用在流式细胞术中染色的一组可利用抗体聚糖相关分子在观测神经球样细胞的表面上的表达。有趣的是，GD2(b系列双唾液酸神经节苷脂)显著地表达于自不同GBM细胞株培养的神经球的表面上。已发现GD2显著地表达于神经母细胞瘤、黑色素瘤及一些其他肿瘤中。值得注意的是，GD2分布在神经元、皮肤黑素细胞及感觉神经纤维中受到限制。因此，GD2在正常组织中的受限表达使得其适合作为治疗性标靶。此外，若干报导指示GD2亦呈递于小鼠及人类神经干细胞表面上。最重要的是，GD2可鉴别乳癌干细胞。基于此等发现，假设GD2可充当鉴别神经胶母细胞瘤干细胞(GSC)的标记，或与准确识别有限GSC的当前标记组合。
为了理解GD2与SSEA4及CD133的组合是否可更特异性地确定GBM干细胞群，对GD2+SSEA4+CD133+群体的自行再生能力及致瘤性与其他群体进行比较。
GBM肿瘤的细胞于单细胞悬浮液中解离且经抗GD2抗体(BD)、抗SSEA4(Biolegend)、抗CD133(Miltenyi Biotec)标记。此等经标记细胞接着使用FACS Aria II流式细胞仪(BD)进行物理分选。为了侦测自行再生能力，解离GBM肿瘤细胞，染色且涂铺于96孔盘中。计算直径逾100um的神经球的数量。对于致瘤性而言，将不同数目个细胞(包括10,000至10个细胞)皮下或颅内注入免疫缺乏小鼠中。观测到GD2+SSEA4+CD133+群体中肿瘤的发作显著地快于其他群体。
无需进一步详细描述，咸信熟习此项技术者可基于上文描述最大程度地利用本发明。因此，以下特定实施例应仅视作说明性的，而不以任何方式限制本发明的其余部分。本文中引用的所有公开案以引用的方式并入用于本文中提及的目的或主题。
实例1：流式细胞术对GBM细胞株上的聚糖抗原决定基的分析
利用流式细胞术分析各种聚糖抗原决定基在四种人类GBM细胞株：G5T、LN-18、U-138及U-251中的表达量。所检查的聚糖抗原决定基包括O连接型聚糖(Tn、sTn、TF)、刘易斯抗原(Lex、Ley及sLex)、复杂神经节苷脂[GM2、GM1、GD1a、GD3、GD2、GT1b及A2B5(c系列神经节苷脂)]，及红血球系列GSL(SSEA-3、SSEA-4及Globo H；图1A)。本发明人的结果显示此等四种GBM细胞株中大部分高量表达Tn、TF、Lex及Ley，低量表达sLex，且不表达sTn(表7)。另外，此等四种GBM细胞株对于本发明人所检查的全部神经节苷脂均呈阳性。关于红血球系列GSL的表达量，U-251显示抗SSEA-4抗体、MC813-70及G5T的染色弱，U-138及LN-18显示MC813-70的染色强度高(图1B)。在此等四种细胞株中，仅观测到G5T上出现抗SSEA-3抗体MC631的阳性染色，且无一者显示抗Globo H抗体VK9的阳性染色(表7)。本发明人进一步研究红细胞系列GSL在更多GBM细胞株中的表达模式，且发现在17种GBM细胞株中，九者显示强MC813-70染色信号(SSEA-4hi)；三者为弱染色(SSEA-4lo)，且五者未被MC813-70染色(图1A)。17种细胞株中，九者对于MC631染色呈阳性且六者对于VK9染色呈阳性。SVG p12(一种不朽化人类胎儿神经胶质细胞)显示极弱的MC813-70染色信号，但无MC631或VK-9染色信号(图1)。此等结果表明所检查的GBM细胞株中大部分被抗SSEA-4抗体阳性染色(使用MC813-70作为实例)。
实例2：核验GBM癌细胞中的SSEA-4表达
为了排除抗SSEA-4抗体可结合至GBM细胞中的糖蛋白上的扩展核心1O-聚糖的可能性，在用抗SSEA-4抗体MC813-70染色之前，用甲醇处理DBTRG细胞以移除脂质。甲醇处理后，如流式细胞术及免疫荧光显微法所分析，MC813-70的免疫反应性消失，表明MC813-70的免疫反应性系针对糖脂，而非糖蛋白。为了证实GBM细胞表面上存在SSEA-4抗原决定基，进一步对经α2,3-唾液酸酶处理的DBTRG细胞进行MC631染色，且结果显示当用α2,3-唾液酸酶处理时，细胞变为MC813-70阴性及MC631阳性，证明GBM细胞表达SSEA-4。
为了进一步核验SSEA-4的表达，接着使用阴离子交换层析法纯化神经节苷脂(具有唾液酸的糖脂)，纯化神经节苷脂在HPTLC盘上显色，且通过苔黑酚-H2SO4染剂或免疫墨点法目测。得自三种不同GBM细胞株的纯化神经节苷脂展现具有丰裕GM3、GM2、Neu5Ac-(n)Lc4/Gg4Cer及Neu5Ac2-(n)Lc4/Gg4Cer的类似模式。与流式细胞术分析结果一致，MC813-70识别TLC上的得自DBTRG及D54MG的两种神经节苷脂(由于脂肪酸链长不同)，但不识别GBM8901细胞(图3A)。GBM神经节苷脂的免疫反应性双色带位置与自2102Ep细胞(已知可高量表达SSEA-4糖脂的胚胎癌瘤细胞(22))纯化的神经节苷脂相同(图3A，泳道4)。通过YAC-1细胞中的MC813-70侦测到显色距离比MC813-70阳性糖脂更短的双色带(图3A，泳道5)，其中GM1b为主要神经节苷脂(29)，证明MC813-70具有针对GM1b的弱交叉反应性。使用MC631的免疫墨点法已揭露其亦可以低于MC813-70的亲和力识别MC813-70阳性糖脂。为了检查MC813-70阳性糖脂上的唾液酸数目，在不同盐条件下溶离神经节苷脂且使用MC813-70进行免疫墨点法。结果证明MC813-70反应性神经节苷脂发生单唾液酸化，因为在低盐条件下所溶离的溶离份出现两条色带。接着使用唾液酸酶阐明此MC813-70反应性单唾液酸神经节苷脂上的唾液酸的键联。在TLC盘上显色的神经节苷脂经α2,3-唾液酸酶或使唾液酸的所有键联裂解的唾液酸酶处理，且在MC813-70及MC631存在下进行墨点分析。结果显示唾液酸酶处理之后，MC813-70免疫反应性消失，而MC631可在类似于MC813-70反应性二重峰的位置侦测到强信号，表明存在α2,3-连接型唾液酸。
亦通过MALDI-MS分析法来分析DBTRG细胞的神经节苷脂(图3B)。光谱以若干主峰为主导，此等峰由于神经酰胺(Cer)部分的预期非均质性而以信号丛集存在。基于主要分子离子的m/z值，如相对于与神经鞘胺醇及脂肪酰基链组合的己糖(Hex)、N-乙酰基己糖胺(HexNAc)或NeuAc残基的全甲基化所拟合，指定相应的神经节苷脂概况。与HPTLC结果一致，MS分析揭露DBTRG细胞中神经节苷脂的主要种类为GM3、GM2、Neu5Ac-(n)Lc4/Gg4Cer及Neu5Ac2-(n)Lc4/Gg4Cer。亦侦测到代表SSEA-4、但强度低的Neu5Ac-Hex4-HexNAc-Cer信号(m/z＝2025.2)，反映DBTRG细胞中存在SSEA-4。此等资料证明MC813-70反应性神经节苷脂为SSEA-4，且SSEA-4尽管为总神经节苷脂的次要组分，但表达于GBM细胞中。
实例3：SSEA-4表达于GBM组织中
SSEA-4为广泛用于干细胞的标记，但关于SSEA-4在GBM组织以及正常脑组织中的表达的信息未知。为了了解SSEA-4是否过度表达于临床GBM样品中，除GBM细胞株之外，通过免疫组织化学法分析人类组织微数组上的I级至IV级星形细胞瘤及正常脑组织中的SSEA-4表达(图4)。发现55个GBM组织样品中有38个(69％)对于MC813-70染色呈阳性，且约一半GBM样品被强烈染色(≥2+)。如阳性样品中所示，SSEA-4位于GBM细胞的质膜上。此外，约55％低等级星形细胞瘤样品被MC813-70弱染色(评分为1+)，且SSEA-4强度分数与星形细胞瘤的等级正相关。相反，大部分正常脑组织呈SSEA-4阴性。结果显示SSEA-4高度表达于肿瘤中，尤其GBM肿瘤中。
实例4：抗SSEA-4介导针对GBM细胞株的CDC
为了测试靶向SSEA-4是否引发GBM细胞的补体依赖性细胞毒性(CDC)，用MC813-70及兔补体处理GBM细胞株，且通过侦测因细胞死亡所致的乳酸脱氢酶释放量来评估CDC程度。图5显示在补体存在下，mAb MC813-70使活GBM细胞数目明显减少。观测到SSEA-4hi GBM细胞株出现显著CDC：DBTRG出现71.7％细胞毒性，LN-229出现46.6％细胞毒性，G5T出现67％细胞毒性且LN-18细胞出现65.4％细胞毒性。MC813-70介导的CDC未杀死低表达或不表达SSEA-4的两种GBM细胞株：Hs683及U87。因此，MC813-70介导的CDC的位准与SSEA-4在各GBM细胞株中的表达量正相关。
实例5：抗SSEA-4活体内抑制脑肿瘤生长
为检验MC813-70是否能够活体内抑制GBM肿瘤生长，当肿瘤生长至可触知的凸块(注射后第11天，15-30mm3)时，将MC813-70投与皮下注射DBTRG细胞的裸小鼠中。MC813-70(200μg)腹膜内给与各小鼠，每四天1次，总共3次，并行注射无关小鼠IgG3(同型对照)用于比较。实验揭露投与MC813-70可抑制DBTRG肿瘤生长(图6)。经MC813-70处理的三只小鼠中的两只中的DBTRG肿瘤生长受到完全抑制，且抗体处理停止之后，第三只小鼠出现肿瘤。与接受MC813-70处理的小鼠相比，注射小鼠IgG3的对照组中的DBTRG肿瘤侵袭性地生长(第31天的平均肿瘤体积为184mm3)。此等数据表明MC813-70能够活体内抑制表达SSEA-4的GBM肿瘤生长，此抑制可能经由CDC及抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
实例6：Globo H、SSEA3及SSEA-4于各种癌细胞株上的表达
已报导SSEA-4表达于肾癌(26)、基底样肺癌(30)、上皮卵巢癌(31)、乳癌(25)及口腔癌(32)。此处，通过流式细胞术分析SSEA-3、Globo H及SSEA-4于各种癌细胞株上的表达量。如表7中所示，已检查总共134种癌细胞株(17种脑癌细胞株、20种肺癌细胞株、23种乳癌细胞株、13种口腔癌细胞株、2种食道癌细胞株、6种胃癌细胞株、10种肝癌细胞株、5种胆管癌细胞株、8种胰脏癌细胞株、7种结肠癌细胞株、6种肾癌细胞株、4种子宫颈癌细胞株、9种卵巢癌细胞株及4种前列腺癌细胞株)。
表7.Globo H、SSEA-3及SSEA-4于各种癌细胞株上的表达。
表
8.红血球系列GSL于癌细胞株上的表达的概述
红血球系列GSL的表达系通过流式细胞术测定。在流式细胞术中逾15％总细胞呈阳性的那些细胞株标记为阳性。
发现SSEA-4表达于癌细胞株的每种类型中(134种癌细胞株中的96种)。Globo H亦表达于许多癌细胞株(134种中的88种)，优先表达于肺、乳房、胰脏、结肠、胃、口腔、肝脏、肾脏癌细胞株中。亦观测到许多癌细胞株(134种中的70种)同时表达SSEA-4及Globo H。另一方面，SSEA-3的表达总是位于SSEA-4的高表达之后，表明SSEA-4及Globo H为癌细胞上的主要红血球系列GSL。
为了核实SSEA-4的身分，纯化来自九种MC813-70阳性细胞株以及TF1a(一种MC813-70阴性白血病细胞株)的神经节苷脂，且在HPTLC盘上进行免疫染色。如所预期，在此等九种癌细胞株中侦测到SSEA-4，但在TF1a中未侦测到，且强度与几何平均荧光强度非常相关，如通过流式细胞术所检查。此等结果揭露SSEA-4可表达于多种癌细胞株中且可充当多种癌症类型的潜在标靶。
实例7：聚糖相关分子于癌细胞及干细胞样癌细胞上的表达
对于干细胞样癌细胞而言，自ATCC收集8种神经胶母细胞瘤细胞株且在具有NSM的超低附接盘(Corning)中维持，NSM系由神经基质培养基(Invitrogen)、B27补充物(invitrogen)以及人类重组bFGF及EGF(各20ng/ml；Upstate)组成。培养基每3天更新一次且所有细胞在37℃、在5％CO2及增湿氛围中培养。
检查各种标记在LN18、U138、U251、DBTRG及G5T细胞株及其神经球上的表达概况。检查总共22种标记，包括17种聚糖(GM3、GM2、GM1、GD1a、GD3、GD2、GT1b、A2B5、LeX、sLeX、LeY、SSEA-3、SSEA-4、Globo H、TF、Tn及sTn)及5种糖蛋白(CD44、CD24、CD45、CD90、CD133)。内部产生抗Globo H单株抗体。对标记具有特异性的其他抗体购自下列供货商。CD133/1及CD133/2为针对CD133糖蛋白的不同抗原决定基的抗体。
将细胞(1×105)再悬浮于50μL含有不同浓度抗体的FACS缓冲液(1％BSA/PBS溶液)中且在冰上培育30分钟。必要时用FACS缓冲液洗涤两次之后，将细胞与Alexa488标记的山羊抗小鼠或FITC-抗兔抗体(1:100；Jackson ImmunoResearch)一起在冰上培育30分钟，随后在FACSCalibur系统(BD Biosciences)上分析。
在神经节苷脂表达图谱中，发现GD2具有绝对优势且一致地表达于5种GBM神经球细胞中。然而，在新乳糖系列路径中，LeX(一种用于多能干细胞的熟知标记)未显示此等群组之间的任何显著差异。此外，GM2、GM1、GD1a、GT1b、A2B5、Tf、Tn、SSEA3、SSEA4、CD24、CD44及CD90高度表达于5种GBM细胞中。有趣的是，在红血球系列中，SSEA4充分地表达于亲本细胞、而非神经球细胞中，表明SSEA4可充当GBM细胞的治疗性标靶。
表9：聚糖及糖蛋白于癌细胞及干细胞样癌细胞上的表达
实例8：通过GD2与SSEA-4及CD133富集GBM干细胞
为了了解GD2与SSEA4及CD133的组合是否更特异性地确定GBM干细胞群，对GD2+SSEA4+CD133+群体与其他群体的自行再生能力及致瘤性进行比较。
使GBM肿瘤细胞在单细胞悬浮液中解离且经抗GD2抗体(BD)、抗SSEA4(Biolegend)、抗CD133(Miltenyi Biotec)标记。接着使用FACS Aria II流式细胞仪(BD)对此等经标记细胞进行物理分选。为了侦测自行再生能力，将GBM肿瘤细胞解离，染色且涂铺于96孔盘中。计算直径逾100um的神经球的数目。对于致瘤性而言，将不同数目个细胞(包括10,000-10个细胞)皮下或颅内注入免疫缺乏小鼠中。观测到GD2+SSEA4+CD133+群体中的肿瘤发作显著快于其他群体。
实例9：产生抗Globo H单株抗体
利用融合瘤方法开发对Globo H具有特异性的mAb。6至8周龄的雌性BALB/c小鼠用Globo H疫苗皮下免疫3次。以2周间隔时间给与三次免疫。每种疫苗含有2μg Globo H。通过以4,000×g离心10分钟来获得所有血清。通过聚糖微数组来分析血清反应。最后腹膜内加打2μg Globo H，且3天后，使用免疫小鼠脾细胞产生融合瘤。
如下筛选分泌具有所需抗原结合活性的抗体的融合瘤细胞。通过与4μg/mL中性链亲和素一起于碳酸盐缓冲液(0.1M，pH 9.6)中在4℃培育隔夜来涂布微量滴定盘。各孔用含有1％BSA的PBS(pH＝7.3)阻断1小时且与4μg/mL GloboH-生物素一起培育1小时。抗血清在不同稀释度下、在37℃维持1小时。洗涤之后，配位体结合的抗体通过HRP与山羊抗小鼠IgG特异性Fcγ片段的1:10,000结合物(Jackson ImmunoResearch)侦测且在37℃培育1小时，随后与TMB受质一起培育。在450nm测定OD。选择阳性纯系用于进一步表征。在此研究中，鉴别特异性结合至Globo H的出两种例示性纯系mAb273及651。小鼠单株同型分型系使用IsoQuick试纸条及套组(sigma,I9535)。添加融合瘤培养基至反应瓶中。将试纸条插入样品中，确保试纸条直立。样品将沿着试纸条上行。进行最终解释之前，允许试纸条显色5分钟。
利用分泌抗体的融合瘤纯系、通过PCR扩增mAb 273及651的VH及VL基因区段。对由此获得的基因区段测序以测定mAb 273及651的VH及VL序列，其显示于表1及表2中。
实例10：产生抗SSEA-4单株抗体
利用融合瘤方法开发对SSEA-4具有特异性的mAb。6至8周龄的雌性BALB/c小鼠用SSEA-4疫苗皮下免疫3次。以2周间隔时间给与三次免疫。每种疫苗含有2μg SSEA-4。通过以4,000×g离心10分钟来获得所有血清。通过聚糖微数组来分析血清反应。最后腹膜内加打2μg SSEA-4，且3天后，使用免疫小鼠脾细胞产生融合瘤。
如下筛选分泌具有所需抗原结合活性的抗体的融合瘤细胞。通过与4μg/mL中性链亲和素一起于碳酸盐缓冲液(0.1M，pH 9.6)中在4℃培育隔夜来涂布微量滴定盘。各孔用含有1％BSA的PBS(pH＝7.3)阻断1小时且与4μg/mL SSEA-4-生物素一起培育1小时。抗血清在37℃、在不同稀释度下维持1小时。洗涤之后，配位体结合的抗体通过HRP与山羊抗小鼠IgG或IgM抗体的1:10,000结合物(Jackson ImmunoResearch)侦测且在37℃培育1小时，随后与TMB受质一起培育。在450nm测定OD。选择阳性纯系用于进一步表征。在此研究中鉴别出特异性结合至SSEA-4的两种例示性纯系45、46及48。小鼠单株同型分型系使用IsoQuick试纸条及套组(sigma,I9535)。添加融合瘤培养基至反应瓶中。将试纸条插入样品中，确保试纸条直立。样品沿着试纸条上行。进行最终解释之前，允许试纸条显色5分钟。
利用分泌抗体的融合瘤纯系、通过PCR扩增mAb 45、46及48的VH及VL基因区段。对由此获得的基因区段测序以测定mAb 45、46及48的VH及VL序列，其显示于表3至5中。
实例11：产生嵌合抗体
利用分泌抗体的融合瘤纯系、通过PCR扩增mAb 273及651的VH及VL基因区段。对由此获得的基因区段测序以测定mAb 273及651的VH及VL序列，其显示于表1及2中。将重链及轻链可变区选殖入图10所示的人类IgG1抗体表达载体中。VH系使用酶切位点BsiWI及ApaI，且VL系使用酶切位点BsPEI及NheI。将载体短暂转染至293F或CHO-S细胞中。纯化重组嵌合Ab且在结合分析且补体依赖性肿瘤细胞溶胞分析中进一步研究。
利用分泌抗体的融合瘤纯系、通过PCR扩增mAb 46及48的VH及VL基因区段。对由此获得的基因区段测序以测定mAb 46及48的VH及VL序列，其显示于表3及表5中。将重链及轻链可变区选殖至如图10所示的人类IgG1抗体表达载体中。VH系使用酶切位点BsiWI及ApaI，且VL系使用酶切位点BsPEI及NheI。将载体短暂转染至293F或CHO-S细胞中。纯化重组嵌合Ab且在结合分析及补体依赖性肿瘤细胞溶胞分析中进一步研究。
实例12：通过聚糖数组对抗体进行的结合分析
对mAb 273及651及抗SSEA-4(mAb 45、46及48)进行聚糖结合研究，如下文所述。合成152种化学合成聚糖且点样于聚糖微数组上。聚糖数组与抗体在不同稀释度下、在37℃培育1小时。接着载片各用0.05％Tween 20/PBS缓冲液(PBST)洗涤3次。接着，将Cy5与山羊抗小鼠IgM或IgG抗体的结合物添加至载片中。最后，用PBST洗涤载片3次。将微数组载片干燥，随后使用微数组荧光芯片读取器(4000B；Genepix)、在635nm下扫描。通过软件GenePixPro-6.0(Axon Instruments)分析数据。此研究所得结果显示于图2中。
mAb 273能够结合Globo H六醣抗原决定基Fucα1→2Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1(聚糖数组上的#53)，及区段Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1(聚糖数组上的#57)。mAb 651识别聚糖抗原决定基Fucα1→2Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1 (聚糖数组上的#53)、Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1(聚糖数组上的#57)及Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1(聚糖数组上的#12)。
mAb 45能够结合SSEA-4六醣抗原决定基Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1(聚糖数组上的#12)，及类似物Neu5Gcα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1(聚糖数组上的#49)。mAb 46结合至Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1(聚糖数组上的#12)、Neu5Gcα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1(聚糖数组上的#49)、Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1(聚糖数组上的#11)及Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galβ1(聚糖数组上的#10)。mAb 48能够结合Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1(聚糖数组上的#12)及Neu5Gcα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→4Galβ1→4Glcβ1(聚糖数组上的#49)。
聚糖微数组亦用于研究MC813-70的结合特异性。如图2(H)中所示，发现在聚糖微数组上的152种化学合成聚糖中，MC813-70识别Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1(聚糖数组上的#12)及Neu5Gcα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1(聚糖数组上的#49)。MC813-70不结合GM1b(聚糖数组上的#104)或GD 1a(聚糖数组上的#106)。
亦使用聚糖数组测定表面上具有SSEA-4六醣的MC45、MC48及MC813-70的解离常数，且MC45、48及813的Kd值显示如下。此等结果显示此等mAb对于SSEA-4具有高度特异性。
实例13：通过流式细胞术分析抗体与癌细胞的结合
检查mAb 273及抗SSEA-4(mAb 45、46及48)与癌细胞株的结合。将细胞(1×105)再悬浮于100μL含有不同浓度抗体的FACS缓冲液(1％BSA/PBS溶液)中且在冰上培育30分钟。用FACS缓冲液洗涤两次之后，细胞与649标记的山羊抗小鼠抗体(1:100；JacksonImmunoResearch)一起在冰上培育30分钟，随后在FACSCalibur系统(BD Biosciences)上分析。结果显示于图7A-D中。乳癌细胞MCF-7用mAb 273染色(图7A)。胰脏癌细胞(HPAC及BxPC3)及乳癌细胞MCF-7用mAb 45染色(图7B)。胰脏癌细胞(HPAC及BxPC3)及乳癌细胞MCF-7用mAb 46染色(图7C)。胰脏癌细胞(HPAC及BxPC3)及乳癌细胞MCF-7用mAb 48染色(图7D)。
实例14：抗体介导补体依赖性细胞毒性(CDC)
检查mAb 273介导表达Globo H的细胞的CDC的能力。MCF-7细胞在人类血清存在下作为补体来源。通过添加存活率探针7-AAD来评估细胞死亡。基于7-AAD量测结果，使用FACScan流式细胞仪计算比溶胞百分率。抗体在40μg/mL显示约30％杀死活性。如图5(B)中所示，mAb 273可成功地介导表达Globo H的细胞的补体依赖性细胞毒性。
检查mAb 46及48介导表达SSEA-4的细胞的CDC的能力。智人胰腺癌细胞(BxPC3)在兔血清存在下作为补体来源。通过添加存活率探针7-AAD来评估细胞死亡。基于7-AAD量测结果，使用FACScan流式细胞仪计算比溶胞百分率。抗体在40μg/mL显示约20％杀死活性。如图5(C)中所示，mAb 46及48成功地介导表达SSEA-4的细胞的CDC。
材料及方法
试剂。抗Lex、抗sLex及抗GD2抗体购自BD Biosciences(Franklin Lakes,NJ)。抗GD1a、抗GT1b及Alexa 488抗A2B5抗体购自Millipore(Billerica,MA)。抗GM1及抗GM2抗体购自Calbiochem(Merck,Darmstadt,Germany)。抗Ley及抗sTn抗体购自Abcam(Cambridge,UK)。抗TF抗体购自Thermo Scientific(Waltham,MA)。抗Tn抗体购自DakoCytomation(Glostrup,Denmark)。荧光标记或纯化的MC813-70及MC631购自Biolegend(San Diego,CA)。MC813-70腹水购自Developmental Studies Hybridoma Bank,University of Iowa。以下段落中描述此等抗体在个别实验中的使用。
细胞培养。U-251、U-138、LN-18、T98、LN-229、U87、U-373、Hs683、D54MG、GBM8401、GBM8901、G5T、G9T、SNB75、A172及SF126细胞在补充有10％FBS(Biological Industries,Israel)的高葡萄糖DMEM(Life Technologies,Carlsbad,CA)中常规性地维持。DBTRG细胞在具有10％FBS的RPMI 1640(Life Technologies)中维持。
流式细胞术。细胞(1×105)在冰上用存于50μL FACS缓冲液(具有1％FBS的PBS溶液)中的0.5μg Alexa Flour 488与抗SSEA-3mAb结合物(MC-631)、抗SSEA-4mAb(MC813-70)或别藻蓝蛋白(APC)与抗Globo H mAb结合物(VK9，Philip O.Livingston(MemorialSloan-Kettering Cancer Center,New York,NY)馈赠)染色30分钟。对于凝集素染色而言，将细胞在冰上、在含有生物素化凝集素的凝集素结合缓冲液[1％BSA、0.5×Carbo-Free阻断缓冲液(Vector Laboratories,Burlingame,CA)、2mM MgCl2、2mM CaCl2]中培育30分钟。用凝集素结合缓冲液洗涤两次之后，将细胞与抗生蛋白链菌素-APC(在FACS缓冲液中1:500稀释；Biolegend)一起在冰上培育30分钟。用200μL FACS缓冲液洗涤两次之后，将细胞再悬浮于200μL含有1μg/mL碘化丙锭(PI)的FACS缓冲液中且进行分析。在具有FACSDiva软件(BDBiosciences)的FACSCanto(BD Biosciences)上进行数据撷取，且使用FlowJo软件(TreeStar,Ashland,OR)进行数据分析。闸选活细胞(PI阴性)用于分析。甲醇洗涤时，细胞在室温下洗涤并用含有4％多聚甲醛的PBS固定15分钟，随后在甲醇中培育10分钟，随后用特异性抗体染色。
免疫荧光染色。细胞在组织培养塑料室载片(Nunc,Roskilde,Denmark) 上涂铺隔夜以允许发生足够的附接，在室温下用4％多聚甲醛固定15分钟，用PBS洗涤3次，接着用含有3％BSA的PBS阻断。细胞接着与10μg/mL mAb MC813-70(Biolegend)一起培育隔夜，用PBS洗涤3次且在室温下与5μg/mL FITC与抗小鼠IgG结合物(eBioscience,San Diego,CA)一起培育2小时。细胞核用Hoechst 33342(2μg/mL,Life Technologies)对比染色。通过OlympusIX71显微镜获得所有影像。
免疫组织化学。对于正常脑样品及GBM样品中的MC813-70染色而言，测试三个不同组织微数组载片(Biomax,Rockville,MD)，包含总共19个正常脑切片及55个GBM切片。载片在56℃干燥1小时，在二甲苯中脱蜡且在分级醇中复水，随后在室温下用阻断缓冲液[含有2％阻断试剂(Roche,Basel,Switzerland)、0.1％TritonX-100的PBS]处理30分钟。载片接着与mAb MC813-70(10μg/mL，于阻断缓冲液中)一起在4℃培育隔夜。用PBST轻缓地洗涤之后，用SuperSensitiveTM聚合物-HRP IHC侦测系统(BioGenex,Fremont,CA)侦测样品的免疫反应性，且载片用苏木精对比染色且备妥以便装片。
聚糖数组制造。微数组系通过机器人针脚(SMP3；TeleChem International Inc.,Sunnyvale,CA)打印(BioDot；Cartesian Technologies,Irvine,CA)，其中每个样点沈积约0.6nL。将含有含胺聚糖的打印缓冲液(300mM磷酸钠，pH 8.5，0.01％TritonX-100)点样于N-羟基丁二酰亚胺(NHS)活化玻璃载片上。各种聚糖以100μM、一式四份打印或以50μM、一式六份打印，以便测定Kd。允许打印载片在80％湿度下培育30分钟，随后干化隔夜。通过将载片在SuperBlock(PBS)阻断缓冲液(Pierce,Appleton,WI)中浸没1小时来阻断剩余NHS基团。
Ab结合分析。MAb MC813-70Alexa Fluor 647(Biolegend)于100μL PBS-B-T(pH7.4，具有3％BSA及0.05％Tween-20)中制备且涂覆以覆盖网格。在湿腔室中培育30分钟之后，用PBST及去离子水冲洗载片且吹干。载片在genepix 4300A(Molecular device,Sunnyvale,CA)中、在635nm下扫描。通过GenePix Pro-6.0(Molecular Devices)分析资料。
唾液酸酶处理。洗涤细胞且以1×107个细胞/毫升再悬浮于PBS缓冲液中。细胞在500mUα2,3唾液酸酶(NEB,Ipswich,MA)/106细胞/100μL存在或不存在下、在37℃培育1小时，且用FACS缓冲液洗涤两次，随后进行表面染色及流式细胞术。唾液酸酶处理效率是利用识别α2,3-连接型唾液酸的生物素化朝鲜槐(Maackia amurensis)凝集素II(MAL II；Vector Laboratories)来量测。
鞘醣脂的萃取。收获细胞(4×107)，用PBS洗涤且于水中均质化。每3个体积的均质物中添加8个体积甲醇及4个体积氯仿且样品在浴式音波处理器中培育30分钟。以3000×g离心15分钟之后，集结粒用4:8:3氯仿/甲醇/水反复萃取，且合并的上清液在氮气流下干燥。接着将总脂质萃取物溶解于氯仿/甲醇/水(30/60/8，v/v/v)中，且基于阴离子交换层析，通过DEAE-Sephadex A-25(GE Healthcare,Buckinghamshire,UK)纯化神经节苷脂。收集含有中性糖脂的未结合流过物且干燥。用氯仿/甲醇/水(30/60/8，v/v/v)洗涤之后，用氯仿/甲醇/NaCl水溶液(0.02M、0.2M及0.8M，逐步地)(30/60/8，v/v/v)溶离神经节苷脂，随后用Sep-Pak C18滤筒(Waters,Milford,MA)脱盐。在氮气下干燥萃取物且将神经节苷脂残余物以及中性糖脂残余物再溶解于100μL氯仿/甲醇(2/1，v/v)中。
高效薄层层析。在玻璃堆积、经硅胶60预涂的高效薄层层析(HPTLC)盘(Merck)上分离GSL。分别地，神经节苷脂于氯仿/甲醇/水(120/85/20，v/v/v)中层析且中性GSL于氯仿/甲醇/水(120/70/17，v/v/v)中层析，各补充有2mM CaCl2。出于分析目的，GSL用含有0.3％苔黑酚的3M H2SO4染色，接着转移至预热盘(110℃)中直至出现蓝紫色斑点。出于制备型目的，神经节苷脂用含有0.02％樱草素(Sigma,St.Louis,MO)的丙酮/水(4/1，v/v)染色。在紫外光下用铅笔标记神经节苷脂斑点且用吸附式刮刀(Sigma)自盘刮下且在音波处理下用氯仿/甲醇/水(30/60/8，v/v/v)萃取神经节苷脂10分钟。通过离心移除二氧化硅，再次再萃取，且将合并的上清液干燥且再溶解于甲醇中。
TLC免疫染色。如上文所述在HPTLC盘上分离GSL。层析之后，将TLC盘风干，浸没于含有2.1％聚(甲基丙烯酸异丁酯)(Sigma)的己烷/氯仿(42:8，v/v)中3次且在37℃的PBS中浸渍隔夜。将盘干燥，在室温下用PBS阻断30分钟且在室温下与MC813-70或MC-631(5μg/mL)反应2小时。轻缓地用PBST(0.05％Tween-20)洗涤3次，将盘与生物素化二次抗体(1μg/mL)一起培育1小时，随后与抗生蛋白链菌素碱性磷酸酶(1:1000；Millipore)一起培育。用PBST洗涤之后，TLC盘用NBT/BCIP(Thermo Scientific)显色。通过蒸馏水洗涤来中止反应且将盘风干。
MALDI-MS分析及MS/MS分析。全甲基化聚糖的MALDI-MS分析是使用2,5-二羟基苯甲酸(DHB)作为基质(10mg/mL)、在ABI 4700Proteomics分析仪(Applied Biosystems,Foster City,CA)中进行。利用低能及高能碰撞诱导式解离的MALDI-MS/MS测序是如上文所述使用DHB基质、在Q/TOF Ultima MALDI(Waters Micromass)及4700Proteomics分析仪中操作。
补体依赖性细胞毒性(CDC)分析。使用CytoTox 非放射性细胞毒性分析套组(Promega,Fitchburg,WI)，通过乳酸脱氢酶(LDH)释放分析对抗SSEA4(MC813-70)mAb的CDC活性进行量测。将细胞(1×104)涂铺于96孔盘的各孔中且生长隔夜之后，用PBS洗涤两次。接着将细胞与1μg MC813-70或小鼠IgG3同型对照物一起在50μL不含酚红、具有兔补体的DMEM或RPMI(1:5稀释度；Life Technologies)中培育。在37℃、5％CO2保温箱中培育1小时之后，通过量测LDH释放于培养上清液中的量来测定细胞溶解程度。通过套组所提供的溶胞溶液溶解细胞来测定最大LDH释放。比溶胞百分率是根据方程式计算：溶胞％＝[实验性释放-自发性释放]/[最大释放-自发释放]×100。
活体内肿瘤生长。BALB/cAnN.Cg-Foxn1nu/CrlNarl小鼠购自实验室动物中心(中国台湾)且在特定的无病原体条件下维持。每日监测动物健康状况。根据中央研究院实验动物及使用委员会(Academia Sinica Institutional Animal Care and UtilizationCommittee)，依照国内及国际法规及政策来执行涉及动物及其照护的程序。将DBTRG细胞(1×107/250μL PBS)皮下注入小鼠(8至10周龄)的侧腹区域中以产生异种移植模型。第11、15及19天，各小鼠腹膜注射200μg MC813-70(自腹水中纯化)或小鼠IgG3同型对照物Ab。使用光标测径规，通过量测长度(L)及宽度(W)来测定肿瘤尺寸，且肿瘤体积是以1/2×LW2计算(mm3)。
实例15.例示性噬菌体呈现生物淘选程序
经由在室温下非特异性结合PEG结合的羧基戴诺磁珠(Invitrogen)1小时来扣减含有2.5×1010个纯系的噬菌体呈现人类原生scFv文库(Lu等人,2011)，且随后与SSEA-4-PEG固定的戴诺珠粒一起在4℃培育1小时。用PBS或含有0.01％Tween 20的PBS(PBST0.01)洗涤之后，通过在37℃用大肠杆菌TG1细胞感染0.5小时来回收结合至SSEA-4-PEG-戴诺珠粒的噬菌体。连续稀释一些感染细胞以测定效价，且其他细胞通过M13KO7噬菌体救援且扩增。测定所救援噬菌体效价之后，进行下一轮生物淘选。在第四轮及第五轮生物淘选中，随机选择噬菌体纯系进行培养以供ELISA筛选。
所选噬菌体纯系的ELISA筛选
为了侦测抗原识别，微孔盘(Nunc)分别用0.2μg/ml SSEA-4-BSA、Globo H-BSA、SSEA-3-BSA及BSA涂布。所选噬菌体纯系在含有3％BSA的PBS中1:2稀释且添加至各孔中。盘在室温下培育1小时，用PBST0.1洗涤，且与辣根过氧化酶(HRP)结合的小鼠抗M13噬菌体抗体(GE Healthcare)一起培育。再次洗涤盘，且添加OPD及H2O2。用3N HCl终止反应之后，使用微定量盘式读取器(型号680，BioRad)、使用490nm量测吸亮度。自ELISA阳性噬菌体纯系萃取噬菌粒，以通过自动测序来鉴别scFv编码区。
抗SSEA-4人类IgG的建构及表达
利用AgeI及NheI位点将所选scFv的VH区域选殖入含有信号肽及人类免疫球蛋白γ1重链恒定区的经修饰的表达载体pcDNA5-FRT-γ1中。利用AgeI及EcoRV位点将所选scFv的VL区域选殖入含有信号肽及人类免疫球蛋白κ轻链恒定区的经修饰的表达载体p-κ-HuGs中。两种质粒均转染于FreeStyle293细胞(Invitrogen)中且在37℃的无血清培养基中连续培育1周以产生人类抗体。
抗SSEA-4人类IgG的纯化
收集培养基，离心且使用0.45μm孔径膜过滤。接着对上清液进行蛋白质G管柱层析(GE Healthcare)以便纯化抗SSEA-4人类IgG。溶离物相对于PBS透析之后，依旧使用库马斯蓝染色、通过SDS-PAGE分析来检查抗体。通过布拉福试剂(Bradford reagent)(ThermoScientific)及分光亮度计来评估抗体浓度。
MC48的人类化
两种人类基因(GenBank寄存号Q9UL73及AY577298)分别最类似于MC48VH及VL。本发明人使MC48的三个序列发生人类化，包括由Q9UL73基因的经修饰的构架(FR)1至FR4组成的第1个人类化MC48(hMC48)VH及由来自寄存号AY577298的四个FR组成的第1个hMC48VL；第2个hMC48VH FRs，其后为来自PDB的1YY8，而第2个hMC48VL与第1个序列相同；以及第3个hMC48VH序列(Q9UL73基因的经修饰的FR1、FR2及FR4)及第3个hMC48VL(相对于人类AY577298基因而言变化的FR2及FR4)。所有此等人类化序列均为MC48的VH及VL的保守性CDR1至CDR3。
建构人类化MC48变异体的单链片段可变区(scFv)
对人类化MC48序列(VH-GGGGSGGGGSGGGGS-VL)的scFv形式进行基因合成(基因组学)且通过Sfi I及Not I(Fermentas)切割。凝胶萃取之后，将消化产物选殖至pCANTAB-5E噬菌粒(GE Healthcare)中。
产生人类化MC48(hMC48)scFv噬菌体纯系。
使hMC48变异体噬菌粒转型至TG1大肠杆菌中且在含有100μg/ml安比西林及2％葡萄糖的2×YT培养基(BD Pharmingen)中回收且在37℃通过M13KO7辅助噬菌体(NEB)救援1小时。以1,500×g离心10分钟之后，将此等集结粒再悬浮于含有100μg/ml安比西林及50μg/ml康霉素的2×YT培养基中隔夜以产生scFv-噬菌体。
通过ELISA对hMC48scFv噬菌体纯系进行的结合分析
将SSEA-4-BSA以0.2μg/ml的浓度涂布于ELISA盘上。洗涤及阻断之后，连续稀释的噬菌体在室温下培育1.5小时。洗涤之后，在室温下历时1小时添加1:1000稀释的HRP与抗M13抗体结合物(GE Healthcare)。接着，液体受质3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)显色且用3N HCl封端。在450nm量测光学密度。
结果
鉴别结合至SSEA-4的经噬菌体呈现的scFv
为了结合至SSEA-4的抗体，使用含有2×1010个成员的噬菌体呈现人类原生scFv文库，其如吾人的先前报导所述建立(Lu等人,2011)。此文库中首先移除结合戴诺珠粒的噬菌体，接着通过SSEA-4-PEG与戴诺珠粒结合物选择结合SSEA-4的噬菌体。在生物淘选期间使用两种缓冲液系统：PBS及含有0.01％Tween20的PBS(PBST0.01)。五轮亲和力选择之后，第五轮的噬菌体回收率增加，分别为使用PBS及PBST0.01系统的第一轮的约55倍及80倍(图1)。随机选择噬菌体纯系且通过ELISA测试SSEA-4结合(图2)。发现七个纯系特异性结合至SSEA-4-BSA，但不结合至BSA对照蛋白质。通过对所有8个个别纯系测序，鉴别出两种含有不同人类VH及VL编码区的独特抗SSEA-4噬菌体纯系(p1-52及p2-78)(表1)。
为了检查所述两种噬菌体纯系的特异性及结合亲和力，使用与红血球系列聚糖(包括SSEA-4-BSA、Globo H-BSA及SSEA-3-BSA)相同的噬菌体效价进行比较性ELISA(图12)。p2-78噬菌体纯系与SSEA-4-BSA及SSEA-3-BSA的结合强，且与Globo H-BSA的结合稍微较弱。然而，本发明人发现p1-52噬菌体纯系对于SSEA-4-BSA的结合活性极弱。因此，集中于p2-78纯系用于进一步研究。
为了建立针对SSEA-4的完全人类抗体(hAb)，本发明人分别对p2-78scFv的VH及VL编码序列进行分子工程改造而形成人类IgG1主链。使用FreeStyle 293表达系统产生抗SSEA-4p2-78hAb，接着经由蛋白质G琼脂糖管柱纯化。使用库马斯蓝染色、通过SDS-PAGE分析来检查抗体纯度(图13A)。结果显示抗体纯度超过95％。随后进行ELISA以研究p2-78hAb对于红血球系列聚糖的结合活性(图13B)。发现p2-78hAb结合至SSEA-4及SSEA-3，但不结合至Globo H，表明p2-78的人类IgG形式保持其亲本scFv形式识别SSEA-4的结合抗原决定基的活性。
使用含有203种不同聚糖的聚糖数组来进一步证实p2-78hAb的特异性。结果显示p2-78hAb识别SSEA4、唾液酸基-SSEA4、SSEA4Gc及Gb5(SSEA3)(图14B)。有趣的是，p2-78hAb亦识别GloboH，类似于ELISA分析结果(图12)。使用市售IgM抗体MC631作为阳性对照物(图14A)。
开发人类化MC48mAb
非人类化鼠类mAb对于临床配置可能有某些局限性，包括其血清半衰期短、不能引发人类效应功能及产生人类抗鼠类抗体(HAMA)反应(LoBuglio等人,1989)。因此，mAb可通过将其CDR移植至人类Ig分子的VH及VL FR 上来发生人类化(Roguska等人,1994)。
为了开发人类化MC48，对来自融合瘤细胞的MC48的VH及VL可变区测序(表II)。将MC48的VH及VL可变区与NCBI IgBLAST数据库比对之后，本发明人修饰MC48的FR且产生第1、第2、第3人类化MC48序列(表II)。接着根据此等人类化MC48序列建构且产生噬菌体呈现scFv形式。为测定人类化MC48噬菌体纯系的结合活性，进行基于固体的ELISA涂布SSEA-4-BSA(图15)。发现第3人类化MC48scFv噬菌体可以剂量依赖性方式识别SSEA-4，而第1及第2人类化MC48scFv对于SSEA-4的结合活性消失。
例示性抗体的序列阐明于图16的表I及II中。
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Claims (39)

1.一种经分离的单株抗体，其特异性结合至Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1。
2.如权利要求1的分离抗体，其进一步结合至Fucα1→2Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1及Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1。
3.如权利要求1或2的分离抗体，其中所述抗体为IgG或IgM。
4.一种经分离的单株抗体，其特异性结合至Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1，其中所述抗体不为小鼠IgG3，且其中所述抗体不为小鼠IgM。
5.如权利要求4的分离抗体，其进一步结合至Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1。
6.如权利要求4的分离抗体，其进一步结合至Neu5Acα2-8→Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1。
7.如权利要求4或5的分离抗体，其中所述抗体为IgG1。
8.一种经分离的单株抗体，其特异性结合至Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1、Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1、Fucα1→2Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1、Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1、GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1及Neu5Acα2-8→Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1。
9.如权利要求8的分离抗体，其中所述抗体为IgG或IgM。
10.如权利要求1至9中任一项的分离抗体，其中所述抗体为全长抗体或其抗原结合片段。
11.如权利要求10的分离抗体，其中所述抗原结合片段为Fab片段、F(ab')2片段，或单链Fv片段。
12.如权利要求1至9中任一项的分离抗体，其中所述抗体为人类抗体、人类化抗体、嵌合抗体或单链抗体。
13.一种分离抗体或其抗原结合片段，包含分别选自(i)至(iii)、如表I(图16)中所列的H-CDR1、H-CDR2及H-CDR3：
(i)选自SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:56的H-CDR1；
(ii)选自SEQ ID NO:54或SEQ ID NO:58的H-CDR2；
(iii)选自SEQ ID NO:60或SEQ ID NO:63的H-CDR3；
且包含分别选自(iv)至(vi)的L-CDR1、L-CDR2及L-CDR3：
(iv)选自SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:70的L-CDR1；
(v)选自SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:72的L-CDR2；及
(vi)选自SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:77的L-CDR3。
14.如权利要求13的分离抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或所述抗原结合片段进一步包含分别选自(i)至(iv)、如表I(图16)中所列的H-FR1、H-FR2、H-FR3及HFR4：
(i)选自SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:55的H-FR1；
(ii)选自SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:57的H-FR2；
(iii)选自SEQ ID NO:59或SEQ ID NO:62的H-FR3；
(iv)选自SEQ ID NO:61或SEQ ID NO:64的H-FR4；
且包含分别选自(v)至(viii)的L-FR1、L-FR2、L-FR3及L-FR4：
(v)选自SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:69的L-FR1；
(vi)选自SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:71的L-FR2；
(vii)选自SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:76的L-FR3；
(viii)选自SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:78的L-FR4。
15.如权利要求13或14的分离抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或所述抗原结合片段视情况或替代地改包含与SEQ ID NO:51至78中的任一者的氨基酸序列的差别少于三个保守性氨基酸取代的氨基酸序列。
16.一种经分离的抗SSEA4人类化抗体或其抗原结合片段，包含分别选自(i)至(iii)、如表II(图16)中所列的H-CDR1、HCDR2及H-CDR3：
(i)具有SEQ ID NO:80的序列的H-CDR1；
(ii)具有SEQ ID NO:82的序列的H-CDR2；
(iii)具有SEQ ID NO:90的序列的H-CDR3；
且包含分别选自(iv)至(vi)的L-CDR1、L-CDR2及L-CDR3：
(iv)具有SEQ ID NO:99的序列的L-CDR1；
(v)具有SEQ ID NO:101的序列的L-CDR2；及
(vi)具有SEQ ID NO:109的序列的L-CDR3。
17.如权利要求16的分离抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或所述抗原结合片段进一步包含分别选自(i)至(iv)、如表I(图16)中所列的H-FR1、H-FR2、H-FR3及HFR4：
(i)选自SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85或SEQ ID NO:87的H-FR1；
(ii)选自SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86或SEQ ID NO:88的H-FR2；
(iii)选自SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94或SEQ ID NO:96的H-FR3；
(iv)选自SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95或SEQ ID NO:97的H-FR4；且
包含分别选自(v)至(viii)的L-FR1、L-FR2、L-FR3及L-FR4：
(v)选自SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104或SEQ ID NO:106的L-FR1；
(vi)选自SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:105或SEQ ID NO:107的L-FR2；
(vii)选自SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113或SEQ ID NO:114的L-FR3；
(viii)选自SEQ ID NO:110或SEQ ID NO:112的L-FR4。
18.如权利要求16或17的分离抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或所述抗原结合片段视情况或替代地改包含与SEQ ID NO:79至114中的任一者的氨基酸序列的差异少于十个保守性氨基酸取代的氨基酸序列。
19.一种治疗个体的癌症的方法，所述方法包括向有需要的个体投与有效量的如权利要求1至18中任一项的分离抗体或其组合。
20.如权利要求19的方法，其中所述癌症是选自由以下组成之群：脑癌、肺癌、乳癌、口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆管癌、胰脏癌、结肠癌、肾癌、子宫颈癌、卵巢癌及前列腺癌。
21.如权利要求19的方法，其中所述癌症为脑癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌或胰脏癌。
22.如权利要求19的方法，其中所述癌症为乳癌、胰脏癌、脑癌或多形性胶质母细胞瘤(GBM)癌症。
23.如权利要求19至22中任一项的方法，其中所述个体为患有或怀疑患有癌症的人类。
24.如权利要求19的方法，进一步包括在投与如权利要求1至19中任一项的分离抗体之前、期间或之后，向所述个体投与另一种疗法。
25.如权利要求24的方法，其中所述另一种疗法为使用化学治疗剂或辐射疗法治疗。
26.一种侦测个体的癌症的方法，包括：
(a)将一或多种单株抗体施加至获自所述个体的细胞或组织样品，这些单株抗体可侦测由以下组成之一组标记的表达：GM3、GM2、GM1、GD1、GD1a、GD3、GD2、GT1b、A2B5、LeX、sLeX、LeY、SSEA-3、SSEA-4、唾液酸基SSEA-4、Globo H、Gb4、TF、Tn、sTn、CD44、CD24、CD45、CD90、CD133/1及CD133/2；
(b)分析所述一或多种单株抗体与所述细胞或所述组织样品的结合；及
(c)将所述结合与正常对照进行比较，从而判定所述癌症于所述个体中的存在。
27.如权利要求26的方法，其中这些标记是由以下组成：GD2、GM2、GM1、GD1a、GT1b、A2B5、Tf、Tn、Globo H、Gb4、SSEA-3、SSEA-4、唾液酸基SSEA-4、CD24、CD44及CD90。
28.如权利要求26的方法，其中这些细胞是选自由以下组成之群：脑癌细胞、肺癌细胞、乳癌细胞、口腔癌细胞、食道癌细胞、胃癌细胞、肝癌细胞、胆管癌细胞、胰脏癌细胞、结肠癌细胞、肾癌细胞、子宫颈癌细胞、卵巢癌细胞及前列腺癌细胞。
29.如权利要求28的方法，其中所述癌症为脑癌多形性胶质母细胞瘤(GBM)癌症、肺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、胰脏癌或其他上皮癌症。
30.如权利要求29的方法，其中所述癌症为脑癌或多形性胶质母细胞瘤(GBM)癌症。
31.一种对人类患者中的肿瘤进行分期及/或确定预后的方法，所述方法包括：
(a)将一或多种单株抗体施加至获自所述患者的细胞或组织样品，所述一或多种单株抗体侦测由SSEA-3、SSEA-4及Globo H组成的一或多种标记；
(b)分析这些单株抗体与所述细胞或所述组织样品的结合；
(c)将所述测试样品中的这些标记的表达量与参考样品中的表达量进行比较，及
(d)基于步骤(c)中所鉴别的结果来决定所述患者中的肿瘤分期及/或预后。
32.如权利要求31的方法，其中所述肿瘤为脑肿瘤或多形性胶质母细胞瘤(GBM)。
33.如权利要求31的方法，其中所述标记为SSEA-4。
34.如权利要求33的方法，其中所述抗体进一步侦测SSEA-3或Globo H中之一或多者。
35.如权利要求34的方法，其中所述一或多种抗体进一步包含侦测以下中之一或多者的一或多种抗体：GM3、GM2、GM1、GD1、GD1a、GD3、GD2、GT1b、A2B5、LeX、sLeX、LeY、TF、Tn、sTn、CD44、CD24、CD45、CD90、CD133/1及CD133/2。
36.一种使用细胞表面标记GD2、SSEA-4及CD133使干细胞与GBM肿瘤细胞分离、富集及自行再生的方法。
37.一种分离细胞群的方法，所述细胞群实质上富含来源于GBM肿瘤的致瘤性干细胞。
38.一种医药组合物，其包含如权利要求1至19的抗体或其抗原结合片段。
39.一种向有需要的人类投与抗SSEA4抗体的方法，所述方法包括向所述人类投与约1mg/kg至约100mg/kg的对SSEA-4展示结合亲和力的抗SSEA-4抗体。
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