ES2902032T3 - Composiciones y procedimientos para el tratamiento y detección de cánceres - Google Patents

Abstract

Anticuerpo monoclonal humanizado aislado que se une específicamente a Neu5Acα2 → 3Galβ1 → 3GalNAcβ1 → 3Galα1 → 4Galβ1 → 4Glcβ1, en el que el anticuerpo comprende un VH que tiene la SEQ ID NO: 147 y un VL que tiene la SEQ ID NO: 148.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y procedimientos para el tratamiento y detección de cánceres

CAMPO

[0001] Los anticuerpos que se unen a SSEA-4 se describen en el presente documento, así como composiciones relacionadas y su uso terapéutico, que incluye, sin limitación, terapias y diagnóstico contra el cáncer.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] El glioblastoma multiforme (GBM), que representa del 60 al 70% de los gliomas malignos, es la forma más agresiva de gliomas y el tumor cerebral primario más común en adultos (Louis DN, et al. (2007) The 2007 WHO classification of tumours of the central nervous system. Acta Neuropathol 114 (2): 97-109). A pesar de muchos tratamientos, incluida la cirugía y la quimioterapia o radioterapia disponibles para GBM, el pronóstico y la tasa de supervivencia de los pacientes con GBM siguen siendo pobres, con una tasa de supervivencia media de 14 a 15 meses (Van Meir EG, et al. (2010) Exciting new advances in neuro-oncology: the avenue to a cure for malignant glioma. CA Cancer J Clin 60(Meyer MA (2008) Malignant gliomas in adults. N Engl J Med 359(17):1850; author reply 1850):166-193). El GBM es notoriamente resistente a la mayoría de los medicamentos contra el cáncer y extremadamente infiltrante, lo que dificulta la resección quirúrgica completa y, por lo tanto, la mayoría de los pacientes desarrollan recurrencia o progresión del tumor incluso después de múltiples terapias. Debido a la alta mortalidad, se han propuesto nuevos enfoques terapéuticos, tales como la inmunoterapia y la terapia génica, para el tratamiento de GBM (Meyer MA (2008) Malignant gliomas in adults. N Engl J Med 359 (17): 1850; respuesta del autor 1850).

[0003] La glicosilación alterada es una característica de las células cancerosas, y varias estructuras de glicanos son marcadores tumorales bien conocidos (Meezan E, Wu HC, Black PH y Robbins PW (1969) Comparative studies on the carbohydrate-containing membrane components of normal and virus-transformed mouse fibroblasts. II. Separation of glycoproteins and glycopeptides by sephadex chromatography. Biochemistry 8(6):2518-2524; Hakomori S (2002) Glycosylation defining cancer malignancy: new wine in an old bottle. Proc Natl Acad Sci U S A 99(16):10231-10233). Estos cambios aberrantes incluyen el aumento general en la ramificación de los glicanos ligados a N (Lau KS & Dennis JW (2008) N-Glycans in Cancer Progress. Glycobiology 18 (10): 750-760) y el contenido de ácido siálico (van Beek WP, Smets LA, y Emmelot P (1973) Increased sialic acid density in surface glycoprotein of transformed and malignant cells--a general phenomenon? Cancer Res 33(11):2913-2922), y la sobreexpresión de ciertos epítopos de glicanos, tales como sialil Lewis x (sLex), sialil Tn (sTn), Lewis y (Ley), Globo H y ácido polisálico (Sell S (1990) Cancerassociated carbohydrates identified by monoclonal antibodies. Hum Pathol 21(10):1003-1019; Hakomori S & Zhang Y (1997) Glycosphingolipid antigens and cancer therapy. Chem Biol 4(2):97-104; Taylor-Papadimitriou J & Epenetos AA (1994) Exploiting altered glycosylation patterns in cancer: progress and challenges in diagnosis and therapy. Trends Biotechnol 12(6):227-233). Muchos tumores también exhiben una mayor expresión de ciertos glicolípidos, especialmente los gangliósidos, glucoesfingolípidos (GSL) con ácido siálico(s) unido(s) a la cadena de glicano. Los gangliósidos se observan normalmente en los sistemas neurales y se encuentran elevados en los tumores, en particular los gangliósidos complejos asociados con la malignidad (Birkle S, Zeng G, Gao L, Yu RK y Aubry J (2003) Role of tumor-associated gangliosides in cancer progression. Biochimie 85(3-4):455-463).

[0004] Se ha descrito que el glioma humano muestra la expresión de gangliósidos (Fredman P, et al. (1986) Potential ganglioside antigens associated with human gliomas. Neurol Res 8(2):123-126; Yates AJ, Becker LE, & Sachs LA (1979) Brain tumors in childhood. Childs Brain 5(1):31-39; Traylor Td & Hogan EL (1980) Gangliosides of human cerebral astrocytomas. J Neurochem 34(1):126-131; Berra B, Gaini SM, & Riboni L (1985) Correlation between ganglioside distribution and histological grading of human astrocytomas. Int J Cancer 36(3):363-366; Fredman P, von Holst H, Collins VP, Granholm L, & Svennerholm L (1988) Sialyllactotetraosylceramide, a ganglioside marker for human malignant gliomas. J Neurochem 50(3):912-919; Mansson JE, et al. (1986) Characterization of new gangliosides of the lactotetraose series in murine xenografts of a human glioma cell line. FEBS Lett 201(1):109-113; Fredman P, von Holst H, Collins VP, Dellheden B, & Svennerholm L (1993) Expression of gangliosides GD3 and 3'-isoLM1 in autopsy brains from patients with malignant tumors. J Neurochem 60(1):99-105). Dado que algunos de los gangliósidos asociados al glioma rara vez se expresan o incluso están ausentes en los tejidos normales (Svennerholm L, et al. (1989) Human brain gangliosides: developmental changes from early fetal stage to advanced age. Biochim Biophys Acta 1005(2): 109-117), son adecuados para la terapia dirigida (Kato Y, et al. (2010) GMab-1, a high-affinity anti-3'-isoLM1/3',6'-isoLD1 IgG monoclonal antibody, raised in lacto-series ganglioside-defective knockout mice. Biochem Biophys Res Commun 391(1):750-755). Por lo tanto, el descubrimiento de nuevos GSL asociados a gliomas proporcionaría nuevas dianas para el desarrollo de nuevas terapias contra los gliomas.

[0005] Los GSL de la serie globo presentan un enlace Gala1-4Gal a lactosilceramidas, y este enlace está catalizado por lactosilceramida 4-alfa-galactosiltransferasa (A4GALT). Aunque la globotriosilceramida (Gb3Cer) y el globósido (Gb4Cer) constituyen la base del sistema de grupos sanguíneos P (Schenkel-Brunner H (1995) P System. Human Blood Groups, (Springer Vienna), págs. 211-234), el galactosil globósido (Gb5Cer) y sialil galactosil globósido (sialil Gb5Cer, s Gg , MSGG), también conocido como antígeno embrionario específico de etapa-3 (SSEA-3) y SSEA-4 (Kannagi R, et al. (1983) Stagespecific embryonic antigens (SSEA-3 and -4) are epitopes of a unique globo-series ganglioside isolated from human teratocarcinoma cells. EMBO J 2(12):2355-2361), respectivamente, se utilizan ampliamente como marcadores de superficie celular para definir células madre embrionarias humanas. También se han observado GSL de la serie Globo en tumores: Globo H (fucosil Gb5Cer) se sobreexpresa en muchos cánceres epiteliales, tales como los cánceres de ovario, gástrico, de próstata, de pulmón, de mama y de páncreas (Zhang S, et al. (1997) Selection of tumor antigens as targets for immune attack using immunohistochemistry: I. Focus on gangliosides. Int J Cancer 73(1):42-49); SSEA-3, SSEA-4 y Globo H se expresan no solo en células de cáncer de mama, sino también en células madre de cáncer de mama (Chang WW, et al. (2008) Expression of Globo H and SSEA3 in breast cancer stem cells and the involvement of fucosyl transferases 1 and 2 in Globo H synthesis. Proc Natl Acad Sci U S A 105(33):11667-11672; Huang YL, et al. (2013) Carbohydrate-based vaccines with a glycolipid adjuvant for breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A 110(7):2517-2522). Además, en el carcinoma de células renales, se observan expresiones de alto nivel de SSEA-4 y disialosil galactosil globósido (disialosil Gb5Cer, DSGG) (Saito S, et al. (1997) Expression of globo-series gangliosides in human renal cell carcinoma. Jpn J Cancer Res 88(7):652-659), pero aún no se sabe si los GSL de la serie globo se expresan en GBM. Lou VW et al., PNAS, 2014, 111 (7), 2482­ 2487, se refiere a SSEA4 como una diana terapéutica potencial en el glioblastoma multiforme y otros cánceres.

[0006] Es de gran interés identificar marcadores de glicanos asociadas con y/o predictivos de cánceres, y desarrollan anticuerpos contra los marcadores para uso en el diagnóstico y el tratamiento de un amplio espectro de cánceres.

CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN

[0007] La presente invención se define en las reivindicaciones 1 a 14 y se refiere a un anticuerpo monoclonal humanizado aislado específico de SSEA4 que se une específicamente a Neu5Aca2 ^ 3Galp1 ^ 3GalNAcp1 ^ 3Gala1 ^ 4Galp1 ^ 4Glcp1, en el que el anticuerpo comprende un VH que tiene la SEQ ID NO: 147 y un VL que tiene la SEQ ID NO: 148 y además su uso para tratar el cáncer en un sujeto que lo necesite. La presente divulgación también se basa en el descubrimiento de que Globo H, SSEA-3 y SSEA-4 se expresan de forma aberrante en un amplio espectro de cánceres, pero no en células normales. Las células cancerosas que expresan Globo H, SSEA-3 y SSEA-4 incluyen, pero sin limitación, cáncer de cerebro, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer oral, cáncer de esófago, cáncer de estómago, cáncer de hígado, cáncer de conductos biliares, cáncer de hueso (osteosarcoma), cáncer de piel, cáncer de páncreas, cáncer de colon, cáncer de riñón, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario y cáncer de próstata.

[0008] Los anticuerpos de ejemplo descritos en este documento pueden tener una o más características de:

[0009] a) es un anticuerpo recombinante, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo monoespecífico, un anticuerpo monovalente, un anticuerpo IgG1, un anticuerpo IgG2 o un derivado de un anticuerpo; b) es un anticuerpo humano, murino, humanizado o quimérico, fragmento de unión a antígeno o derivado de un anticuerpo; c) es un fragmento de anticuerpo de una sola cadena, un multicuerpo, un fragmento Fab y/o una inmunoglobulina de los isotipos IgG, IgM, IgA, IgE, IgD y/o subclases de los mismos; d) tiene una o más de las siguientes características: (i) media la ADCC y/o la CDC de las células cancerosas; (ii) induce y/o promueve la apoptosis de las células cancerosas; (iii) inhibe la proliferación de células diana de células cancerosas; (iv) induce y/o promueve la fagocitosis de células cancerosas; y/o (v) induce y/o promueve la liberación de agentes citotóxicos; e) no se une a un antígeno expresado en células no cancerosas, células no tumorales y/o células tumorales benignas.

[0010] En algunos ejemplos, cualquiera de los anticuerpos descritos en este documento se pueden generar como Fab o de una sola cadena por biblioteca de anticuerpos de presentación en fagos o células B individuales usando las células B de pacientes o pacientes recuperados o de personas sanas.

[0011] El sujeto (por ejemplo, un paciente humano) con necesidad del tratamiento está diagnosticado con, sospechoso de tener, o en riesgo de cáncer. Los ejemplos del cáncer incluyen, pero no se limitan a, cáncer de cerebro, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer oral, cáncer de esófago, cáncer de estómago, cáncer de hígado, cáncer de conductos biliares, cáncer de páncreas, cáncer de colon, cáncer de riñón, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario cáncer y cáncer de próstata. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de cerebro, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de colon o cáncer de páncreas. En algunas realizaciones preferidas, el cáncer es cáncer de cerebro o cáncer de glioblastoma multiforme (GBM).

[0012] El anticuerpo es capaz de atacar a las células de cáncer que expresan SSEA-4.

[0013] Los resultados del tratamiento en la reducción del tamaño del tumor, la eliminación de las células malignas, la prevención de metástasis, prevención de la recaída, la reducción o la muerte de cáncer diseminado, la prolongación de la supervivencia y/o prolongación del tiempo hasta la progresión del cáncer tumor.

[0014] En algunas realizaciones, el tratamiento comprende además administrar una terapia adicional a dicho sujeto antes de, durante o después de dicha administración de los anticuerpos. En algunas realizaciones, la terapia adicional es el tratamiento con un agente quimioterapéutico. En algunas realizaciones, la terapia adicional es radioterapia.

[0015] En aún otro aspecto, la presente divulgación presenta composiciones farmacéuticas para uso en el tratamiento del cáncer, tal como el cáncer de cerebro, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer oral, cáncer de esófago, cáncer de estómago, cáncer de hígado, cáncer de conductos biliares, cáncer pancreático, cáncer de colon, cáncer de riñón, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario y cáncer de próstata, etc. La composición farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos o ácido nucleico que los codifica y un portador farmacéuticamente aceptable, y usos de dichas composiciones farmacéuticas en la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer.

[0016] Los detalles de una o más realizaciones de la invención se exponen en los dibujos y descripción detallada de más abajo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0017] Tal como se usa en este documento, la nomenclatura simbólica, gráfica y de texto para describir glicanos y estructuras relacionadas están bien establecidos y entendidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, "Symbols Nomenclatures for Glycan Representation”. Proteomics. Diciembre de 2009; 9 (24): 5398-5399 de Ajit Varki et al.

Figuras 1A-1B. Las características de unión del mAb anti-SSEA-4 a las líneas celulares de GBM. (Fig. 1A) Diagrama esquemático de la biosíntesis de GSL de la serie globo. SSEA-3, el precursor de SSEA-4 y Globo H, se sintetiza a partir de globósido. Los enlaces glucosídicos y las notaciones gráficas están marcadas (Glc, glucosa; Gal, galactosa; GalNAc, N-acetilgalactosamina; Fuc, fucosa; NeuAc, ácido N-acetilneuramínico). (Fig. 1B). Se tiñeron células GBM con MC813-70 conjugado con Alexa Fluor 488 y se analizó la intensidad de la tinción con citometría de flujo. Todas las células examinadas eran líneas celulares GBM excepto SVG p12, que es una línea celular glial fetal humana normal transformada con antígeno T grande de SV40. Los histogramas de las células teñidas con MC813-70 y el control de isotipo se muestran en gris y blanco, respectivamente.

Figuras 2A-2H. Perfiles de unión a glicanos de anticuerpos. Las micromatrices de glicanos en portaobjetos de vidrio se interactuaron con el anticuerpo conjugado con Alexa Flour 647 (10 pg/mL) y se leyeron en un escáner para matriz a 635 nm. Los datos se presentan como media ± DE. (Fig. 2A) perfil de unión del mAb 273 (Fig. 2B) perfil de unión del mAb 651 (Fig. 2C) perfil de unión del mAb VK9 (Fig. 2D) perfil de unión del mAb Mbr1 (Fig. 2e ) perfil de unión del mAb 45 (Fig. 2F) perfil de unión del mAb 46 (Fig. 2G) perfil de unión del mAb 48 (Fig. 2H) perfil de unión de MC813-70.

Figuras 3A-3B. Inmunotinción con HPTLC y perfiles MALDI-MS de gangliósidos de líneas celulares de GBM. (Fig. 3A) Los gangliósidos se separaron en una placa de HPTLC y se detectaron con mAb MC813-70. Se aplicaron gangliósidos de 2012Ep (línea celular de carcinoma embrionario humano) y YAC-1 (línea celular de linfoma de ratón) para que sirvieran como controles positivos para SSEA-4 y GM1b, respectivamente. SSEA-4 con diferentes longitudes de cadena de ácidos grasos migró como dos bandas cercanas. (Fig. 3B) Los gangliósidos extraídos de células DBTRG de GBM se permetilaron y analizaron por MALDI-MS. Los principales gangliósidos en las células DBTRG fueron GM3 (mlz = 1371.9), GM2 (m/z = 1617.0), Neu5Ac-(n)Lc4/Gg4Cer (m/z = 1821,1) y Neu5Ac2-(n)Lc4/Gg4Cer (m/z = 2182,3). Aunque en una señal relativamente débil, también se observó SSEA-4 (Neu5Ac-Hex4-HexNAc-Cer, m/z = 2025,2). Entre paréntesis los gangliósidos con el mismo resto de glicano, pero con diferente contenido de acilo graso.

Figuras 4A-4C. Perfil de expresión de SSEA-4 en GBM. Imágenes representativas de tejidos cerebrales normales (Fig. 4A) y GBM (Fig. 4B) después de la tinción inmunohistoquímica con MC-813-70. El recuadro en el panel B muestra una imagen ampliada de la pequeña área rectangular. Barra de escala, 100 pm. (Fig. 4C) Resultados estadísticos de SSEA-4 IHC. La intensidad de tinción de las muestras de GBM se calificó como 0 (negativo, i), 1+ (débil, ii), 2+ (moderado, iii) y 3+ (fuerte, iv). Barra de escala, 100 pm. Las muestras de grado I (n = 15), grado II (n = 31), grado III (n = 24), grado IV (GBM, n = 55) y tejidos cerebrales normales (n = 19) se contratiñeron con hematoxilina después de IHC. La intensidad de la tinción de los tejidos se calificó como 0 (negativo), 1+ (débil), 2+ (moderado) y 3+ (fuerte).

Figuras 5A-5B. Efectos de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) de anti-SSEA-4.

(Fig. 5A) MC813-70 en GBM. Las líneas celulares de GBM se trataron con 20 pg/ml y complemento de conejo para observar la lisis celular inducida por MC813-70. La actividad CDC de MC813-70 se midió mediante un ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) tal como se describe en "Materiales y procedimientos". Los datos se muestran como media ± DE. (Fig. 5B) mAb 273 sobre MCF-7 in vitro. (Fig. 5C) mAb 46 y 48 en células de cáncer de páncreas humano BxPC3 in vitro. Las alícuotas de las células tumorales (104 células) se incubaron con 80 pl de anticuerpo a diversas concentraciones en presencia de 20 pl de suero humano o suero de conejo como fuente de complemento durante 2 horas a 37° C. La citotoxicidad se determinó dentro de la población de células tumorales después de la adición de 7-aminoactinomicina D (7-AAD).

Fig. 6. Inhibición del crecimiento tumoral de DBTRG por anti-SSEA-4. Se inocularon ratones desnudos macho con células DBTRG en el flanco derecho el día 0, se administraron intraperitonealmente con MC813-70 o control de isotipo IgG3 de ratón (200 pg por dosis) los días 11, 15 y 19, y se sacrificaron el día 31. El tumor el volumen en cada grupo (n = 3) se midió en diferentes puntos de tiempo y se mostró como media ± DE. Se obtuvo P = 0,001 mediante ANOVA de dos vías.

Figuras 7A-7D. Unión de anticuerpos a células cancerosas. (Fig. 7A) Las células de cáncer de mama MCF-7 se tiñeron con mAb 273. (Fig. 7B) Las células de cáncer de páncreas (HPAC y BxPC3) y las células de cáncer de mama MCF-7 se tiñeron con mAb 45. (Fig. 7C) Las células de cáncer de páncreas (HPAC y BxPC3) y las células de cáncer de mama MCF-7 se tiñeron con mAb 46. (Fig. 7D) Las células de cáncer de páncreas (HPAC y BxPC3) y las células de cáncer de mama MCF-7 se tiñeron con mAb 48. Estas células se tiñeron con anticuerpos conjugados con Alexa Fluor 488 y se analizó la intensidad de la tinción con citometría de flujo. Las células teñidas con mAb y los controles de isotipo se muestran en azul y rojo, respectivamente.

Fig. 8. Comparación de las secuencias de aminoácidos de mAb 45 (SEQ ID NOS 23 y 24, respectivamente, en orden de aparición), mAb 46 (SEQ ID NOS 33 y 34, respectivamente, en orden de aparición) y mAb 48 (SEQ ID NOS 43 y 44, respectivamente, en orden de aparición). Para alineaciones de múltiples secuencias, ClustalW utiliza procedimientos de alineación progresiva.

Fig. 9. Vector de expresión del anticuerpo IgG humano.

Figuras 10A-10B. Biopanning para SSEA-4 mediante biblioteca scFv humana sin tratar presentada en fagos. Selección de scFv presentada en fagos que se unió a SSEA-4. Se usó una biblioteca de scFv humana sin tratar presentada en fagos para seleccionar fagos que se unían a Dynabeads conjugados con SSEA-4-PEG. La tasa de recuperación de los fagos aumentó después de la quinta ronda de biopanning en comparación con la primera ronda. Se utilizó PBS (Fig. 10A) y PBS que contenía Tween20 al 0,01% (Fig. 10B) como sistema de tampón de lavado durante el proceso de biopanning.

Figuras 11A-11D. Cribado de scFv presentado en fagos que se unió a SSEA-4 mediante ELISA.

Los clones de fagos seleccionados al azar se cribaron mediante ELISA para revelar uniones diferentes. (Fig. 11A) Las colonias se seleccionaron del grupo de lavado con PBS. (Figs. 11B-11D) Las colonias se seleccionaron del grupo de lavado PBST⁰.⁰¹. Se encontró que ocho clones de fagos tenían una actividad de unión superior a SSEA-4-BSA (A490 ^ 0,2). Se usó fago de control como control negativo (Neg.) Se usó mAb anti-SSEA-4 comercial (MC813-70) como control positivo (Pos.). A490: absorbancia a 490 nm.

Fig. 12. Comparación de la actividad de unión de los clones del fago anti-SSEA-4 con los glicanos de la serie Globo. Se realizó un ELISA para examinar la unión de los clones del fago anti-SSEA-4 a SSEA-4-BSA, Globo H-BSA y SSEA-3-BSA. El anticuerpo monoclonal de ratón anti-SSEA-4 comercial (MC813-70) y el fago de control (Con-phage) se utilizaron como control positivo y negativo, respectivamente. El pMC48 es el formato scFv presentado en fagos de mAb de ratón anti-SSEA-4 creado por el Dr. Wong's Lab. A490: absorbancia a 490 nm

Figuras 13A-13B. Análisis de la actividad de unión de hAb p2-78 mediante ELISA. (Fig. 13A) La pureza de IgG se analizó mediante SDS-PAGE con tinción con azul de Coomassie. (Fig. 13B) Se realizó ELISA para examinar la unión de 1 |jg/ml de hAb anti-SSEA-4 a los glicanos, tal como se indica en la figura. Se utilizaron anticuerpos monoclonales de ratón anti-SSEA-4 comerciales (MC813-70; 0,5 jg/m l) e IgG humana normal (NHIgG) como control positivo y negativo, respectivamente. HC: cadena pesada. LC: cadena ligera. A490: absorbancia a 490 nm

Figuras 14A-14B. Análisis de la actividad de unión de hAb p2-78 por matriz de glicanos.

(Fig. 14A) El anticuerpo IgM disponible comercialmente, MC631 (5 jg/ml), se usó como control positivo. (Fig. 14B) El hAb p2-78 (7,5 jg/m l) reconoció SSEA4, Sialil-SSEA4, SSEA4Gc y Gb5 (SSEA3) y GloboH.

Figuras 15A-15B. Ensayo de unión de clones de fago de scFv de hMC48.

La actividad de unión de los clones de MC48 humanizados se examinó mediante ELISA. El 3er clon de fago de scFv de la variante MC48 humanizada podría unirse a SSEA-4 (Fig. 15A) de una manera dependiente de la dosis, pero no a la proteína de control de BSA (Fig. 15B).

Figuras 16A-16B. (Fig. 16A) Se muestran las regiones determinantes de complementariedad 1-3 (CDR1-3) y las regiones estructurales 1-4 (FW1-4) para los dominios Vh y Vl de clones de anticuerpos de ejemplo. Los dominios de las variables se alinearon con la base de datos IMGT. (Fig. 16B) Se muestran las regiones determinantes de complementariedad 1-3 (CDR1-3) y las regiones estructurales 1-4 (FW1-4) para los dominios VH y VL. Los dominios de las variables se alinearon con la base de datos IMGT.

La Figura 17 ilustra secuencias de aminoácidos y nucleótidos de ejemplo de variantes de glicoanticuerpos de ejemplo basadas en el anticuerpo monoclonal de ratón MC48 (MC48 es un anticuerpo monoclonal anti-SSEA-4 de ratón de ejemplo usado para humanización). Los ejemplos de variantes de glicoanticuerpos humanizados se generan como se establece en las secciones de ejemplo. Las Tablas 17-1 a 17-4 describen secuencias de glicoanticuerpos humanizados de ejemplo obtenidas de cada ronda de humanización correspondiente.

Figura 18 Ensayo de unión de clones de fago de scFv de hMC48. La actividad de unión de los clones de MC48 humanizados se examinó mediante ELISA. El 4° clon de fago de scFv de la variante de MC48 humanizado podría unirse a SSEA-4 (A) de una manera dependiente de la dosis, pero no a la proteína de control de BSA (B).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0018] La invención es como se define en las reivindicaciones.

En consecuencia, se proporciona un anticuerpo monoclonal humanizado aislado específico de SSEA4 que se une específicamente a Neu5Aca2 ^ 3Galp1 ^ 3GalNAcp1 ^ 3Gala1 ^ 4Galp1 ^ 4Glcp1, en el que el anticuerpo comprende un VH que tiene SEQ ID NO: 147 y un VL que tiene SEQ ID NO: 148 y su uso en el tratamiento del cáncer. Los anticuerpos descritos en el presente documento se pueden unir a un amplio espectro de células cancerosas que expresan Globo H, SSEA3 y SSEA-4, lo que facilita el diagnóstico y el tratamiento del cáncer. Las células que pueden ser reconocidas por los anticuerpos incluyen carcinomas, tales como las de cerebro, pulmón, mama, ratón, esófago, estómago, hígado, conductos biliares, páncreas, colon, riñón, cuello uterino, ovario, cáncer de próstata, etc.

Definiciones

[0020] ] La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro del conocimiento de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la literatura. Véase, por ejemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Antibodies: A Laboratory Manual, by Harlow and Lanes (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988); y Handbook Of Experimental Immunology, Volúmenes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986).

[0021] Tal como se usa en este documento, el término "glicano" se refiere a un polisacárido u oligosacárido. El glicano también se usa aquí para referirse a la porción de carbohidrato de un glicoconjugado, tal como una glicoproteína, glicolípido, glicopéptido, glicoproteoma, peptidoglicano, lipopolisacárido o un proteoglicano. Los glicanos generalmente consisten únicamente en enlaces O-glicosídicos entre monosacáridos. Por ejemplo, la celulosa es un glicano (o más específicamente un glucano) compuesto de D-glucosa unida en p-1,4, y la quitina es un glicano compuesto de N-acetil-D-glucosamina unida en p-1,4. Los glicanos pueden ser homopolímeros o heteropolímeros de residuos de monosacáridos y pueden ser lineales o ramificados. Los glicanos se pueden encontrar unidos a proteínas como en las glicoproteínas y proteoglicanos. Generalmente se encuentran en la superficie exterior de las células. Los glicanos ligados a O y N son muy comunes en eucariotas, pero también se pueden encontrar, aunque con menos frecuencia, en procariotas. Los glicanos unidos a N se encuentran unidos al nitrógeno del grupo R (N) de la asparagina en el sequon. El sequon es una secuencia Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, donde X es cualquier aminoácido excepto praliné.

[0022] Tal como se utiliza en el present documento, el término "antígeno" se define como cualquier sustancia capaz de provocar una respuesta inmunitaria.

[0023] Tal como se usa en este documento, el término "inmunogenicidad" se refiere a la capacidad de un inmunógeno, antígeno o vacuna para estimular una respuesta inmunitaria.

[0024] Tal como se usa en este documento, el término "CD1d" se refiere a un miembro de la familia de CD1 (grupo de diferenciación 1) de glicoproteínas expresadas en la superficie de diversas células presentadoras de antígenos humanos. Los antígenos lipídicos presentados en Cd1 activan las células T asesinas naturales. CD1d tiene un surco profundo de unión al antígeno en el que se unen los antígenos glicolípidos. Las moléculas de CD1d expresadas en células dendríticas pueden unirse y presentar glicolípidos, incluidos los análogos de alfa-GalCer, tal como C34.

[0025] Tal como se usa en este documento, el término "epítopo" se define como las partes de una molécula de antígeno que contacta con el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo o un receptor de células T.

[0026] Tal como se usa en este documento, el término "vacuna" se refiere a una preparación que contiene un antígeno, que consiste en organismos completos causantes de enfermedades (muertos o debilitados) o componentes de tales organismos, tales como proteínas, péptidos, o polisacáridos, que se utilizan para conferir inmunidad contra la enfermedad que causan los organismos. Las preparaciones de vacunas pueden ser naturales, sintéticas o derivadas mediante tecnología de ADN recombinante.

[0027] Tal como se usa en este documento, el término "específico de antígeno" se refiere a una propiedad de una población de células de tal manera que el suministro de un antígeno particular, o un fragmento del antígeno, da lugar a la proliferación celular específica.

[0028] Tal como se usa en este documento, el término "unión específica", se refiere a la interacción entre pares de unión (por ejemplo, un anticuerpo y un antígeno). En varios casos, la unión específica puede realizarse mediante una constante de afinidad de aproximadamente 10-6 moles/litro, aproximadamente 10-7 moles/litro o aproximadamente 10-8 moles/litro o menos.

[0029] Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con los usos de investigación, diagnóstico o terapéuticos del anticuerpo y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En una realización, el anticuerpo se purificará (1) hasta más del 95% en peso de anticuerpo según se determine mediante, por ejemplo, el procedimiento de Lowry, y en algunas realizaciones más del 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de, por ejemplo, un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando, por ejemplo, azul de Coomassie o tinción con plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes ya que no estará presente al menos un componente del entorno natural del anticuerpo. Sin embargo, normalmente, el anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.

[0030] La frase "sustancialmente similar", "sustancialmente la misma", "equivalente", o "sustancialmente equivalente", como se usa en el presente documento, indica un grado suficientemente alto de similitud entre dos valores numéricos (por ejemplo, una asociado con una molécula y el otro asociado con una molécula de referencia/comparadora) de modo que un experto en la técnica consideraría que la diferencia entre los dos valores tiene poca o ninguna importancia biológica y/o estadística dentro del contexto de la característica biológica medida por dichos valores (por ejemplo, valores de Kd, efectos antivirales, etc.). La diferencia entre dichos dos valores es, por ejemplo, menos de aproximadamente 50%, menos de aproximadamente 40%, menos de aproximadamente 30%, menos de aproximadamente 20%, y/o menos de aproximadamente el 10% en función del valor para la molécula de referencia/comparadora.

[0031] La frase "sustancialmente reducida" o "sustancialmente diferente", como se usa en el presente documento, indica un grado suficientemente alto de diferencia entre dos valores numéricos (generalmente uno asociado con una molécula y el otro asociado con una molécula de referencia/comparadora), de manera que un experto en la técnica consideraría que la diferencia entre los dos valores tiene significación estadística dentro del contexto de la característica biológica medida por dichos valores (por ejemplo, valores de Kd). La diferencia entre dichos dos valores es, por ejemplo, mayor que aproximadamente el 10%, mayor que aproximadamente el 20%, mayor que aproximadamente el 30%, mayor que aproximadamente el 40% y/o mayor que aproximadamente el 50% en función del valor para la molécula de referencia/comparadora.

[0032] "Afinidad de unión" generalmente se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su pareja de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique lo contrario, tal como se usa en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre los miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su pareja Y generalmente se puede representar mediante la constante de disociación (Kd). La afinidad se puede medir mediante procedimientos comunes conocidos en la técnica, incluidos los descritos en el presente documento. Los anticuerpos de baja afinidad generalmente se unen al antígeno lentamente y tienden a disociarse fácilmente, mientras que los anticuerpos de alta afinidad generalmente se unen al antígeno más rápido y tienden a permanecer unidos por más tiempo. Se conocen en la técnica una variedad de procedimientos para medir la afinidad de unión, cualquiera de los cuales puede usarse para los propósitos de la presente invención. A continuación se describen ejemplos ilustrativos específicos.

[0033] En un ejemplo, el "Kd" o el "valor de Kd" según esta invención se mide mediante un ensayo de unión a antígeno radiomarcado (RIA) realizado con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno, tal como se describe en el siguiente ensayo. La afinidad de unión en solución de los Fab por el antígeno se mide equilibrando el Fab con una concentración mínima de antígeno marcado con (125I) en presencia de una serie de titulación de antígeno no marcado, y a continuación capturando el antígeno unido con una placa recubierta con anticuerpo anti-Fab (Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293: 865-881). Para establecer las condiciones para el ensayo, las placas de microtitulación (Dynex) se recubren durante la noche con 5 pg/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en carbonato de sodio 50 mM (pH 9,6), y posteriormente se bloquea con albúmina de suero bovino al 2% (p/v) en PBS durante dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23°C). En una placa no adsorbente (Nunc # 269620), se mezclan 100 pM o 26 pM de antígeno [125I] con diluciones en serie de un Fab de interés (por ejemplo, de acuerdo con la evaluación de un anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et al., (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599). A continuación, se incuba el Fab de interés durante la noche; sin embargo, la incubación puede continuar durante un período más largo (por ejemplo, 65 horas) para asegurar que se alcance el equilibrio. A continuación, las mezclas se transfieren a la placa de captura para su incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora). A continuación, se retira la solución y se lava la placa ocho veces con Tween-20 al 0,1% en PBS. Cuando las placas se hayan secado, se añaden 150 pl/pocillo de centelleante (MicroScint-20; Packard), y las placas se cuentan en un contador gamma Topcount (Packard) durante diez minutos. Las concentraciones de cada Fab que dan menos de o igual al 20% de unión máxima se eligen para su uso en ensayos de unión competitiva. El valor de Kd o Kd se mide usando ensayos de resonancia de plasmón superficial usando un BIAcore ™ -2000 o un BIAcore ™ -3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 ° C con chips CM5 de antígeno inmovilizado en ~ 10 unidades de respuesta (RU). Brevemente, los chips biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) se activan con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, a 5 |jg/ml (~0,2 |jM) antes de la inyección a un caudal de 5 jl/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de proteína acoplada. Después de la inyección de antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos que no han reaccionado. En cada experimento, se activó un punto y se bloqueó con etanolamina sin inmovilizar la proteína, para ser utilizada para la resta de referencia. Para las mediciones cinéticas, se inyectan diluciones en serie dobles de Fab (0,78 nM a 500 nM) en PBS con Tween 20 al 0,05% (PBST) a 25°C a un caudal de aproximadamente 25 jl/min. Las velocidades de asociación (kon) y las velocidades de disociación (koff) se calculan utilizando un modelo de unión de Langmuir uno a uno simple (software de evaluación BIAcore versión 3.2) ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación en equilibrio (Kd) se calcula como la relación koff/kon. Véase, por ejemplo, Chen, Y. et al., (1999) J. Mol Biol 293: 865-881. Si la velocidades de asociación excede 106 M-1s-1 mediante el ensayo de resonancia de plasmón de superficie anterior, entonces la velocidad de asociación se puede determinar utilizando una técnica de extinción fluorescente que mide el aumento o la disminución de la intensidad de la emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, paso de banda de 16 nm) a 25 ° C de un anticuerpo anti-antígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno medidas en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con parada de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-Aminco de la serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.

[0034] Una "velocidad de asociación" o "kon" de acuerdo con esta invención también se puede determinar con la misma técnica de resonancia de plasmón superficial descrita anteriormente utilizando un BIAcore ™ -2000 o un BIAcore ™ -3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25°C con chips CM5 de antígeno inmovilizado a ~10 unidades de respuesta (RU). Brevemente, los chips biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) se activan con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, a 5 jg/m l (~0,2 jM ) antes de la inyección a un caudal de 5 jl/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de proteína acoplada. Después de la inyección de antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos que no han reaccionado. Para las mediciones cinéticas, se inyectan diluciones en serie dobles de Fab (0,78 nM a 500 nM) en PBS con Tween 20 al 0,05% (PBST) a 25°C a un caudal de aproximadamente 25 jl/min. Las vlocidades de asociación (kon) y las velocidades de disociación (koff) se calculan utilizando un modelo de unión de Langmuir uno a uno simple (software de evaluación BIAcore versión 3.2) ajustando simultáneamente el sensograma de asociación y disociación. La constante de disociación de equilibrio (Kd) se calculó como la relación koff/kon. Véase, por ejemplo, Chen, Y. et al., (1999) J. Mol Biol 293: 865-881. Sin embargo, si la velocidad de activación supera los 106 M-1s-1 según el ensayo de resonancia de plasmón de superficie anterior, entonces la velocidad de asociación se puede determinar utilizando una técnica de extinción fluorescente que mide el aumento o la disminución de la intensidad de la emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, paso de banda de 16 nm) a 25 ° C de un anticuerpo anti-antígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno medidas en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con parada de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-Aminco de la serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.

[0035] El término "vector", tal como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle circular de ADN de doble cadena en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector fago. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores de mamíferos episomales). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamíferos no episomales) se pueden integrar en el genoma de una célula huésped tras su introducción en la célula huésped, y por lo tanto se replican junto con el genoma del huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están ligados operativamente. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente, "vectores recombinantes"). En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante se encuentran a menudo en forma de plásmidos. En la presente memoria, "plásmido" y "vector" pueden usarse indistintamente ya que el plásmido es la forma de vector más comúnmente usada.

[0036] "Polinucleótido" o "ácido nucleico", tal como se usa indistintamente en el presente documento, se refiere a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud e incluye ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos o bases modificadas y/o sus análogos, o cualquier sustrato que pueda incorporarse a un polímero mediante ADN o ARN polimerasa, o mediante una reacción sintética. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. Si está presente, la modificación de la estructura de nucleótidos puede impartirse antes o después del ensamblaje del polímero. La secuencia de nucleótidos puede estar interrumpida por componentes no nucleotídicos. Un polinucleótido puede modificarse adicionalmente después de la síntesis, tal como mediante conjugación con un marcador. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, "bloqueos", sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural por un análogo, modificaciones internucleotídicas, tales como, por ejemplo, aquellos con enlaces no cargados (por ejemplo, metilfosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquellos que contienen restos colgantes, tales como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, ply-L-lisina, etc.), aquellos con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), los que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, boro, metales oxidativos, etc.), los que contienen alquilantes, los que tienen enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), así como formas no modificadas de los polinucleótidos. Además, cualquiera de los grupos hidroxilo normalmente presentes en los azúcares puede ser reemplazado, por ejemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegido por grupos protectores estándar o activado para preparar enlaces adicionales a nucleótidos adicionales, o puede conjugarse a soportes sólidos o semisólidos. El OH terminal en 5' y 3' puede fosforilarse o sustituirse con aminas o restos de grupos de bloqueo orgánicos de 1 a 20 átomos de carbono. También se pueden derivar otros hidroxilos a grupos protectores estándar. Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de azúcares de ribosa o desoxirribosa que se conocen generalmente en la técnica, incluyendo, por ejemplo, 2'-O-metil-, 2'-O-alil-, 2'-fluoro- o 2'-azido-ribosa, análogos de azúcares carbocíclicos, azúcares a-anoméricos, azúcares epiméricos, tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares de piranosa, azúcares de furanosa, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos de nucleósidos básicos, tales como metil ribósido. Uno o más enlaces fosfodiéster pueden reemplazarse por grupos de enlace alternativos. Estos grupos de enlace alternativos incluyen, pero no se limitan a, realizaciones en las que el fosfato se reemplaza por P(O)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), "(O)NR2 ("amidato") , P(O)R, P(O)OR', CO o CH2 ("formacetal"), en el que cada R o R' es independientemente H o alquilo (1-20 C) sustituido o no sustituido que contiene opcionalmente un enlace éter (-O-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No es necesario que todos los enlaces en un polinucleótido sean idénticos. La descripción anterior se aplica a todos los polinucleótidos a los que se hace referencia en este documento, incluidos el ARN y el ADN.

[0037] "Oligonucleótido", tal como se usa en el presente documento, se refiere generalmente a polinucleótidos cortos, generalmente de una sola cadena, generalmente sintéticos, que son generalmente, pero no necesariamente, de menos de aproximadamente 200 nucleótidos de longitud. Los términos "oligonucleótido" y "polinucleótido" no se excluyen mutuamente. La descripción anterior para polinucleótidos es igualmente y completamente aplicable a oligonucleótidos.

[0038] Los "anticuerpos" (Abs) e "inmunoglobulinas" (Igs) son glicoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos exhiben especificidad de unión a un antígeno específico, las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas similares a anticuerpos que generalmente carecen de especificidad de antígeno. Los polipéptidos de este último tipo se producen, por ejemplo, a niveles bajos por el sistema linfático y en niveles elevados por los mielomas.

[0039] Los términos "anticuerpo" y "inmunoglobulina" se usan indistintamente en el sentido más amplio e incluyen anticuerpos monoclonales (por ejemplo, anticuerpos monoclonales de longitud completa o intactos), anticuerpos policlonales, anticuerpos monovalentes, multivalentes, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos siempre que exhiban la actividad biológica deseada) y también pueden incluir ciertos fragmentos de anticuerpos (tal como se describe con mayor detalle en el presente documento). Un anticuerpo puede ser quimérico, humano, humanizado y/o madurado por afinidad.

[0040] La "región variable" o "dominio variable" de un anticuerpo se refiere a los dominios amino-terminales de la cadena pesada o ligera del anticuerpo. Estos dominios son generalmente las partes más variables de un anticuerpo y contienen los sitios de unión al antígeno.

[0041] El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren ampliamente en la secuencia entre los anticuerpos y se usan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a lo largo de los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos llamados regiones determinantes de complementariedad (CDR) o regiones hipervariables en los dominios variables tanto de cadena ligera como de cadena pesada. Las porciones más conservadas de los dominios variables se denominan marco (FR). Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR, que adoptan en gran medida una configuración de lámina beta, conectadas por tres CDR, que forman bucles que conectan y, en algunos casos, forman parte de la estructura de lámina beta. Las CDR en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por las regiones FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos (ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, Instituto Nacional de Salud, Bethesda, Md (1991)). Los dominios constantes no participan directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero exhiben varias funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente del anticuerpo.

[0042] La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, denominados fragmentos "Fab", cada uno con un único sitio de unión al antígeno, y un fragmento "Fc" residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación de antígeno y todavía es capaz de reticular el antígeno.

[0043] "Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de unión y reconocimiento de antígeno completo. En una especie de Fv de dos cadenas, esta región consta de un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en asociación estrecha, no covalente. En una especie de Fv de una sola cadena, un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera pueden unirse covalentemente mediante un enlazador peptídico flexible de modo que las cadenas ligeras y pesadas puedan asociarse en una estructura "dimérica" análoga a la de en una especie de Fv de dos cadenas. Es en esta configuración que las tres CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión al antígeno en la superficie del dímero VH-VL. En conjunto, las seis CDR confieren especificidad de unión al antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un dominio variable único (o medio de un Fv que comprende solo tres CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque a una afinidad menor que el sitio de unión completo.

[0044] El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' se diferencian de los fragmentos Fab por la adición de algunos residuos en el extremo carboxi del dominio CH1 de la cadena pesada que incluyen una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación aquí para Fab' en la que el residuo o residuos de cisteína de los dominios constantes llevan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.

[0045] Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa (k) y lambda (A), en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

[0046] Dependiendo de las secuencias de aminoácidos de los dominios constantes de sus cadenas pesadas, los anticuerpos (inmunoglobulinas) pueden asignarse a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de ellas pueden dividirse en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, 8, £, y y M, respectivamente. Las estructuras de subunidades y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas y se describen generalmente en, por ejemplo, Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4a ed. (2000). Un anticuerpo puede ser parte de una molécula de fusión más grande, formada por asociación covalente o no covalente del anticuerpo con una o más de otras proteínas o péptidos.

[0047] Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se usan aquí de forma intercambiable para referirse a un anticuerpo en su forma sustancialmente intacta, no a fragmentos de anticuerpo como se define a continuación. Los términos se refieren particularmente a un anticuerpo con cadenas pesadas que contienen la región de Fc.

[0048] Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden solo una parte de un anticuerpo intacto, en el que la parte retiene al menos una, y tantas como la mayoría o todas, de las funciones normalmente asociadas con esa parte cuando está presente en un anticuerpo intacto. En una realización, un fragmento de anticuerpo comprende un sitio de unión al antígeno del anticuerpo intacto y, por tanto, conserva la capacidad de unirse al antígeno. En otra realización, un fragmento de anticuerpo, por ejemplo uno que comprende la región de Fc, retiene al menos una de las funciones biológicas normalmente asociadas con la región de Fc cuando está presente en un anticuerpo intacto, tal como unión de FcRn, modulación de la semivida del anticuerpo, función ADCC y unión del complemento. En una realización, un fragmento de anticuerpo es un anticuerpo monovalente que tiene una semivida in vivo sustancialmente similar a un anticuerpo intacto. Por ejemplo, dicho fragmento de anticuerpos puede comprender un brazo de unión a antígeno unido a una secuencia de Fc capaz de conferir estabilidad in vivo al fragmento.

[0049] El término "anticuerpo monoclonal", tal como se usa en este documento, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, por ejemplo, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores o que comprenden solo un perfil de glicoformas homogéneas (que tienen un solo glicano o perfil de un solo glicano en un glicoanticuerpo en una población). En el documento US 12/959,351 se describen ejemplos de composición de anticuerpos homogénea para mejorar las funciones efectoras mediante el uso de glicanos biantenales complejos 2,3 y 2,6-sialilo y desfucosilados en la posición Fc-297. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que no es una mezcla de anticuerpos discretos. Dicho anticuerpo monoclonal incluye típicamente un anticuerpo que comprende una secuencia polipeptídica que se une a una diana, en el que la secuencia polipeptídica que se une a la diana se obtuvo mediante un proceso que incluye la selección de una única secuencia polipeptídica que se une a la diana de una pluralidad de secuencias polipeptídicas. Por ejemplo, el proceso de selección puede ser la selección de un clon único de una pluralidad de clones, tal como un grupo de clones de hibridoma, clones de fagos o clones de ADN recombinante. Debe entenderse que la secuencia de unión a la diana seleccionada se puede alterar adicionalmente, por ejemplo, para mejorar la afinidad por la diana, humanizar la secuencia de unión a la diana, mejorar su producción en cultivo celular, reducir su inmunogenicidad in vivo, crear una anticuerpo multiespecífico, etc., y que un anticuerpo que comprende la secuencia de unión a la diana alterada también es un anticuerpo monoclonal de esta invención. A diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales está dirigido contra un único determinante de un antígeno. Además de su especificidad, las preparaciones de anticuerpos monoclonales son ventajosas porque típicamente están no contaminadas por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse que requiera la producción del anticuerpo por ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a utilizar según la presente invención se pueden fabricar mediante una variedad de técnicas, que incluyen, por ejemplo, el procedimiento de hibridoma (por ejemplo, Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), procedimientos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, patente de Estados Unidos No. 4,816,567), tecnologías de presentación en fagos (véase, por ejemplo, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol.

338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); y Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004), y tecnologías para producir anticuerpos humanos o similar a humano en animales que tienen partes o todos los loci o genes de inmunoglobulinas humanas que codifican secuencias de inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, WO98/24893; WO96/34096; WO96/33735; WO91/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); patentes de Estados Unidos Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016; Marks et al., Bio. Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996) y Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995).

[0050] Los anticuerpos monoclonales del presente documento incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o perteneciente a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la cadena o cadenas es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada ( Patente de Estados Unidos N° 4.816.567 y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984)).

[0051] Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En una realización, un anticuerpo humanizado es una inmunoglobulina humana (anticuerpo receptor) en la que los residuos de una región hipervariable del receptor se reemplazan por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata, conejo o primate no humano, que tiene la especificidad, afinidad y/o capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región estructural (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente el rendimiento de los anticuerpos. En general el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todos o sustancialmente todos las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593 - 596 (1992). Véanse también los siguientes artículos de revisión y las referencias allí citadas: Vaswani y Hamilton, Ann. Allergy, Asthma and Immunol. 1: 105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23: 1035-1038 (1995); Hurle y Gross, Curr. Op. Biotech. 5: 428 - 433 (1994).

[0052] El término "región hipervariable", "HVR" o "HV", cuando se usa en este documento, se refiere a las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o forman bucles definidos estructuralmente. Generalmente, los anticuerpos comprenden seis regiones hipervariables; tres en el VH (H1, H2, H3) y tres en el VL (L1, L2, L3). Se utilizan varias delineaciones de regiones hipervariables y se incluyen en este documento. Las regiones determinantes de complementariedad de Kabat (CDR) se basan en la variabilidad de secuencia y son las más utilizadas habitualmente (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Chothia se refiere en cambio a la ubicación de los bucles estructurales (Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). Las regiones hipervariables de AbM representan un compromiso entre las CDR de Kabat y los bucles estructurales de Chothia, y son utilizadas por el software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. Las regiones hipervariables de "contacto" se basan en un análisis de las estructuras cristalinas complejas disponibles. Los residuos de cada una de estas regiones hipervariables se indican a continuación.

Bucle Kabat AbM Chothia Contacto L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96 H1 H31-H35B H26- H35B H26-H32 H30H35B

(Numeración de Kabat)

H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35

(Numeración de Chothia)

H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58

H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101

[0053] Las regiones hipervariables pueden comprender las "regiones hipervariables extendidas" siguientes: 24-36 o 24-34 (L1), 46-56 o 50-56 o 49-56 (L2) y 89-97 o 89-96 (L3) en el VL y 26-35 (H1), 50-65 o 49-65 (H2) y 93-102, 94­ 102 o 95-102 (H3) en el VH. Los residuos del dominio variable se numeran de acuerdo con Kabat et al., supra, para cada una de estas definiciones.

[0054] Los residuos "estructurales" o "FR" son aquellos residuos de dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable como se define en el presente documento.

[0055] El término "numeración de residuos de dominio variable como en Kabat" o "numeración de posición de aminoácidos como en Kabat", y variaciones de los mismos, se refiere al sistema de numeración utilizado para dominios variables de cadena pesada o dominios variables de cadena ligera de la compilación de anticuerpos en Kabat et al. al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Servicio de Salud Pública, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Maryland (1991). Usando este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos aminoácidos o más, correspondientes a un acortamiento o inserción en una FR o HVR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir un inserto de un solo aminoácido (residuo 52a según Kabat) después del residuo 52 de H2 y los residuos insertados (por ejemplo, residuos 82a, 82b y 82c, etc. según Kabat) después del residuo 82 de FR de cadena pesada. La numeración Kabat de residuos se puede determinar para un anticuerpo determinado mediante alineación en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia enumerada Kabat “estándar”.

[0056] Los fragmentos de anticuerpo "Fv de una sola cadena" o "scFv" comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, en los que estos dominios están presentes en una única cadena polipeptídica. Generalmente, el polipéptido scFv comprende además un enlazador polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite que scFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno. Para una revisión de scFv, véase Pluckthun, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, págs. 269­ 315 (1994).

[0057] El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión a antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Al usar un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, los dominios se ven obligados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión al antígeno. Los diacuerpos se describen con más detalle, por ejemplo, en los documentos EP 404.097; WO93/1161; y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444 - 6448 (1993).

[0058] Un "anticuerpo humano" es aquel que posee una secuencia de aminoácido que corresponde a la de un anticuerpo producido por un humano y/o se ha fabricado usando cualquiera de las técnicas para preparar anticuerpos humanos como se describe en el presente documento. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígenos no humanos.

[0059] Un anticuerpo "madurado por afinidad" es uno con una o más alteraciones en una o más HVR del mismo que dan como resultado una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno, en comparación con un anticuerpo parental que no posee esas alteraciones. En una realización, un anticuerpo madurado por afinidad tiene afinidades nanomolares o incluso picomolares por el antígeno diana. Los anticuerpos madurados por afinidad se producen mediante procedimientos conocidos en la técnica. Marks et al. Bio/Technology 10: 779-783 (1992) describe la maduración por afinidad mediante la reorganización de los dominios VH y VL. La mutagénesis aleatoria de CDR y/o residuos estructurales está descrita por: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91: 3809 - 3813 (1994); Schier et al. Gene 169: 147 - 155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154 (7): 3310 - 9 (1995); y Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226: 889-896 (1992).

[0060] Un anticuerpo de "bloqueo" o un anticuerpo "antagonista" es aquel que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno que se une. Ciertos anticuerpos de bloqueo o anticuerpos antagonistas inhiben sustancial o completamente la actividad biológica del antígeno.

[0061] Un "anticuerpo agonista", tal como se usa en el presente documento, es un anticuerpo que imita al menos una de las actividades funcionales de un polipéptido de interés.

[0062] Un "trastorno" es cualquier afección que se beneficiaría del tratamiento con un anticuerpo de la invención. Esto incluye trastornos o enfermedades crónicas y agudas, incluidas aquellas afecciones patológicas que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión. Los ejemplos no limitantes de trastornos a tratar en el presente documento incluyen el cáncer.

[0063] Los términos "trastorno proliferativo celular" y "trastorno proliferativo" se refieren a trastornos que están asociados con cierto grado de proliferación celular anormal. En una realización, el trastorno de proliferación celular es cáncer.

[0064] "Tumor", tal como se usa en el presente documento, se refiere a todo crecimiento y proliferación de células neoplásicas, ya sean malignas o benignas, y todas las células y tejidos precancerosos y cancerosos. Los términos "cáncer", "canceroso", "trastorno de proliferación celular", "trastorno de proliferación" y "tumor" no son mutuamente excluyentes, tal como se hace referencia en el presente documento.

[0065] Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren o describen la afección fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por un crecimiento/proliferación celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma (por ejemplo, linfoma de Hodgkin y no Hodgkin), blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma de células escamosas de pulmón, cáncer de peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gastrointestinal, cáncer de páncreas, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, leucemia y otros trastornos linfoproliferativos, y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello.

[0066] Tal como se usa en el presente documento, "tratamiento" se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar el curso natural del individuo o célula que se está tratando, y se puede realizar ya sea para la profilaxis o durante el transcurso de la patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen la prevención de la aparición o recurrencia de la enfermedad, el alivio de los síntomas, la disminución de las consecuencias patológicas directas o indirectas de la enfermedad, la prevención o disminución de la inflamación y/o el daño tisular/orgánico, la disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, la mejora o la paliación del estado de la enfermedad y remisión o mejora del pronóstico. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención se utilizan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o trastorno.

[0067] Un "individuo" o un "sujeto" es un vertebrado. En determinadas realizaciones, el vertebrado es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero sin limitación, animales de granja (tales como vacas), animales deportivos, mascotas (tales como gatos, perros y caballos), primates, ratones y ratas. En determinadas realizaciones, el vertebrado es un ser humano.

[0068] "Mamífero" para los propósitos de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, deportivos o de animales de compañía, tales como perros, caballos, gatos, vacas, etc. En ciertas realizaciones, el mamífero es un ser humano.

[0069] Una "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapéutico o profiláctico deseado.

[0070] Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de una sustancia/molécula de la invención puede variar según factores, tales como el estado de enfermedad, edad, sexo y peso del individuo, y la capacidad de la sustancia/molécula, para producir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz es también aquella en la que los efectos terapéuticamente beneficiosos superan cualquier efecto tóxico o perjudicial de la sustancia/molécula. Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, en las dosis y durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Normalmente, pero no necesariamente, dado que se usa una dosis profiláctica en sujetos antes o en una etapa más temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz sería menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.

[0071] El término "agente citotóxico" tal como se usa en este documento se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de las células y/o causa la destrucción de las células. El término pretende incluir isótopos radiactivos (por ejemplo, At211, 1131, 1125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radiactivos de Lu), agentes quimioterapéuticos (por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorrubicina, melfalán, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina u otros agentes intercalantes, enzimas y fragmentos de los mismos, tales como enzimas nucleolíticas, antibióticos y toxinas, tales como toxinas de moléculas pequeñas o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de las mismas, y los diversos agentes antitumorales o anticancerosos descritos a continuación. Otros agentes citotóxicos se describen a continuación. Un agente tumoricida provoca la destrucción de las células tumorales.

[0072] Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclosfosfamida CYTOXAN®; sulfonatos de alquilo tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bullatacina y bullatacinona); delta-9-tetrahidrocannabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapacona; lapacol; colquicinas; ácido betulínico; una camptotecina (que incluye el análogo sintético topotecan (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecán, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina, escopolectina y 9-aminocamptotecina); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluidos sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); podofilotoxina; ácido podofilínico; tenipósido; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluidos los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictiina; espongistatina; mostazas nitrogenadas, tales como clorambucilo, clomafazina, clolofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibióticos, tales como los antibióticos de enediina (por ejemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gamma1I y caliqueamicina omegaI1 (ver, por ejemplo, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); dinemicina, incluida dinemicina A; una esperamicina; así como cromóforo de neocarzinostatina y cromóforos antiobióticos enediina de cromoproteína relacionada), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina ADRIAMYCIN® (incluyendo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolinodoxorrubicina y desoxdoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, tal como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos del ácido fólico, tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina, tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos, tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenales, tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; rellenador de ácido fólico, tal como ácido frolínico; aceglatona; glicósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elformitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidainina; maitansinoides, tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo de polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); razoxano; rizoxina; sizofurano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromana; gacitoina; arabinósido ("Ara-C"); tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ), Formulación de paclitaxel en nanopartículas con ingeniería de albúmina sin cremóforo ABRAXANe ™ (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, I11.) y doxetaxel TAXOTERE® (Rhóne-Poulenc Rorer, Antony, Francia); cloranbucilo; gemcitabina (GEMZAR®); 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino, tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina (VELBAN®); platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®); oxaliplatino; leucovovina; vinorelbina (NAVELBINE®); novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides, tales como ácido retinoico; capecitabina (XELODA®); sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores, tales como CHOP, una abreviatura de una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisolona, y FOLFOX, una abreviatura de un régimen de tratamiento con oxaliplatino (ELOXATIN™) combinado con 5- FU y leucovovina.

Anticuerpos de trip le reconocimiento Globo H, SSEA3 y SSEA-4 (que no forman parte de la presente invención)

[0073] Un aspecto de la presente divulgación presenta el nuevo anticuerpo de triple reconocimiento Globo H, SSEA3 y SSEA-4. El anticuerpo de triple reconocimiento se une específicamente a Fuca ^ 2Galp1 ^ 3GalNAcp1 ^ 3Gala1 ^ 4Galp1 ^ 4Glcp1 (hexasacárido Globo H) y Galp1 ^ 3GalNAcp1 ^ 3Gala1 ^ 4Galp1 ^ 4Glcp1 (pentasacárido SSEA-3) y Neu5Aca2 -> 3Galp1 ^ 3GalNAcp1 ^ 3Gala1 ^ 4Galp1 ^ 4Glcp1 (hexasacárido SSEA-4). En un ejemplo, el anticuerpo de triple reconocimiento es mAb 651, que no forma parte de la presente invención.

[0074] El mAb 651 es un anticuerpo monoclonal de ratón, producido por la línea celular de hibridoma. El anticuerpo de triple reconocimiento descrito en el presente documento puede contener las mismas cadenas Vh y Vl que el anticuerpo MC651.

Tabla 1. Secuencias de aminoácidos y nucleótidos de Anticuerpo MC651 (no forma parte de la presente invención) I SEQ ID NO: I DESCRIPCIÓN I Se CUEn C iA H

Anticuerpos de doble reconocimiento Globo H y SSEA3 (que no forman parte de la presente invención) [0075] Un aspecto de la presente divulgación presenta los nuevos anticuerpos de doble reconocimiento Globo H y SSEA3. El anticuerpo de doble reconocimiento se une específicamente a Fuca1 ^ 2Galp1 ^ 3GalNAcp1 ^ 3Gala1 ^ 4Galp1 ^ 4Glcp1 (hexasacárido Globo H) y Galp1 ^ 3GalNAcp1 ^ 3Gala1 ^ 4Galp1 ^ 4Glcp1 (pentasacárido SSEA-3). En un ejemplo, el anticuerpo de doble reconocimiento es mAb 273, que no forma parte de la presente invención.

[0076] El mAb 273 es un anticuerpo monoclonal de ratón, producido por la línea celular de hibridoma. Los anticuerpos de doble reconocimiento descritos en el presente documento pueden contener las mismas cadenas de Vh y Vl que el anticuerpo MC273.

T l 2 n i min i n l i Ani r M 2 n f rm r l r n in n i n

Anticuerpos específicos para SSEA4

[0077] Un aspecto de la presente divulgación presenta los nuevos anticuerpos específicos para SSEA-4. El anticuerpo anti-SSEA-4 se une a Neu5Aca2 ^ 3Galp1 ^ 3GalNAcp1 ^ 3Gala1 ^ 4Galp1 ^ 4Glcp1 ^ (hexasacárido SSEA-4). En algunos ejemplos, el anticuerpo es capaz de unirse a Neu5Gca2 ^ 3Galp1 ^ 3GalNAcp1 ^ 3Gala1 ^ 4Galp1 ^ 4Glcp1 ^ (un análogo de hexasacárido SSEA-4). Preferiblemente, el anticuerpo no es una IgG3 de ratón (por ejemplo, mAb MC-831-70) y el anticuerpo no es una IgM de ratón (por ejemplo, anti-RM1). Los ejemplos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, mAb 45, que no forma parte de la presente invención, y 48.

[0078] El anticuerpo monoclonal MC45, que no forma parte de la presente invención, es un anticuerpo monoclonal de ratón anti-SSEA-4, producido por la línea celular de hibridoma. El anticuerpo anti-SSEA-4 descrito en este documento puede contener las mismas cadenas de Vh y Vl que el anticuerpo MC45.

[0079] El anticuerpo monoclonal MC48 es producido por la línea celular de hibridoma. El anticuerpo anti-SSEA-4 descrito en el presente documento puede contener las mismas cadenas Vh y Vl que el anticuerpo MC48 o variantes del mismo. Los anticuerpos que se unen al mismo epítopo que MC48 también están dentro del alcance de esta divulgación.

T l 4 n i min i n l i An i r M 4 n f rm r l r n in n i n

________

[0080] Un aspecto de la presente divulgación proporciona glicoanticuerpos humanizados basados en la modificación del MC48. Los ejemplos y sus estructuras/secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos se proporcionan a continuación:

Tabla 17-0. Secuencias de aminoácidos y secuencias de nucleótidos de anticuerpo monoclonal de ratón

MC48

Tab la 17-1. Secuencias de aminoácidos y secuencias de nucleótidos de anticuerpo monoclonal humanizado

MC48 (1°)

a a - . ecuenc as e am no c os y secuenc as e nuc e os e an cuerpo monoc ona uman za o _____________ ______________________ _________ MC48 (2°)_____________________________________________ SEQ ID NO DESCRIPCIÓN SECUENCIA

125 Secuencia de CAGGTGCAGCTGAAGCAGAGCGGACCTGGCCTGGTGCA nucleótidos de VH de

hM 4 GCCCTCACAGAGCCTGAGCATCACTTGTACCGTCAGTG GATTCTCCCTGACATCTTACGGCGTGTCTTGGGTCAGGC AGAGCCCTGGCAAGGGGCTGGAGTGGCTGGGCGTGATC TGGGGAGAAGGCTCAACTAACTATCACAGCGTCCTGAT CAG TCGCCTGTCAA'ITAACAAGG ACAAITCTAAAAGTC AGGTGTTCTTTAAAATGAACAGCCTGCAGTCCAATGAT ACCGCCATCT ACT ATTGCGCT ATG ACCGGCAC AGCATAC

TGGGGGCAGGGAACACTGGTGACTGTCTCCGCT

126 Secuencia de GAGATTGTGCTGACCCAGAGCCCTGCCACACTGTCACT nucleótidos de VL de

GAGCCCAGGCGAGCGAGCCACACTGTCCTGTTCTGCTA GCTCCTCTGTCTCCT AC ATGC ATTGGT ATC AGC AG A AGC CAGG ACTGGC ACCACG ACTGCTG ATCT ATG AC ACTTCT A AACTGAGTTCAGGCATTCCCGCCAGATTCAGTGGCTCA GGGAGCGGAACCGACTTTACTCTGACCATTAGCTCCCTG GAGCCTGAAGATTTCGCCGTGTACTATTGCCATCAGTGG TCATCAAGCCCTCATACCTTCGGGGGGGGGACTAAGCT

GGAAATCAAACGC

127 Secuencia de QVQLKQSGPGLVQPSQSLS1TCTVSGFSLTSYGVSWVRQSPGKGLEWL aminoácidos de VH de GV1WGEGSTNYIISVLISRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCA hMC48

MTGTAYWGQGTLVTVSA

128 Secuencia de KIVLTQSPATLSLSPGERATI.SCSASSSVSYMHWYQQKPGI.APRI.I.IY aminoácidos de VL de DTSKLSSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCHQWSSSPHTFG hMC48

GGTKVLEIKR

129 CDR1 de VL de hMC48 SSVSY

130 CDR2 de VL de hMC48 DTS

131 CDR3 de VL de hMC48 HQWSSSPHT

132 CDR1 de VH de hMC48 GFSLTSYG

133 CDR2 de VH de hMC48 IWGEGST

134

CDR3 de VH de hMC48 AMTGTAY

Tabla 17-3. Secuencias de aminoácidos y secuencias de nucleótidos de anticuerpo monoclonal humanizado

MC48 3°

Tabla 17-4. Secuencias de aminoácidos y secuencias de nucleótidos de anticuerpo monoclonal humanizado

MC48 4°

Anticuerpos específicos para SSEA4 y fragmentos del mismo (no forman parte de la presente invención)

[0081] Un aspecto de la presente divulgación presenta los nuevos anticuerpos que se unen a SSEA-4 y fragmentos de los mismos. El anticuerpo anti-SSEA-4 se une a Neu5Aca2 ^ 3Galp1 ^ 3GalNAcp1 ^ 3Gala1 ^ 4Galp1 ^ 4Glcp1 ^ (hexasacárido Ss EA-4) y Neu5Aca2 ^ 3Galp1 ^ 3GalNAcp1 ^ 3Gala1 (fragmento del hexasacárido SSEA-4). En algunos ejemplos, el anticuerpo es capaz de Neu5Aca2 ^ 3Galp1 ^ 3GalNAcp1 ^ 3Galp1. En algunos ejemplos, el anticuerpo es capaz de Neu5Gca2 ^ 3Galp1 ^ 3GalNAcp1 ^ 3Gala1 ^ 4Galp1 ^ 4Glcp1 (un análogo del hexasacárido SSEA-4). En un ejemplo, el anticuerpo es mAb 46, que no forma parte de la presente invención).

[0082] El anticuerpo monoclonal MC46 es producido por la línea celular de hibridoma. El anticuerpo anti-SSEA-4 descrito en el presente documento puede contener las mismas cadenas de Vh y Vl que el anticuerpo MC46.

T l n i min i n l i An i r M 4 n f rm r l r n in n i n

[0083] "Anticuerpo MC45" A o "mAb 45" o "anticuerpo del clon MC45" se refiere a un anticuerpo expresado por el clon 45 o a un anticuerpo sintetizado de otras maneras, pero que tienen las mismas CDRs y, opcionalmente, las mismas regiones estructurales que el anticuerpo expresado por el clon MC45. De manera similar, los anticuerpos MC46 (mAb 46 o clon 46), MC48 (mAb 48 o clon 48), MC273 (mAb 273 o clon 273), MC651 (mAb 651 o clon 651) y similares se refieren a anticuerpos expresados por el clon o clones correspondientes y/o a anticuerpos sintetizados de otras formas, pero que tienen las mismas CDR y, opcionalmente, las mismas regiones estructurales que los anticuerpos referenciados.

Tabla 6.Com aración de e íto o de unión e soti o de anticuer os

[0084] Cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento puede ser un anticuerpo de longitud completa o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunos ejemplos, el fragmento de unión al antígeno es un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2 o un fragmento Fv de una sola cadena. En algunos ejemplos, el fragmento de unión al antígeno es un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2 o un fragmento Fv de una sola cadena. En algunos ejemplos, el anticuerpo aislado es un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo de una sola cadena.

[0085] Cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento tiene una o más características de: a) es un anticuerpo recombinante, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo monoespecífico, un anticuerpo monovalente, un anticuerpo IgG1, un anticuerpo IgG2 o un derivado de un anticuerpo; b) es un anticuerpo humano, murino, humanizado o quimérico, fragmento de unión a antígeno o derivado de un anticuerpo; c) es un fragmento de anticuerpo de una sola cadena, un multicuerpo, un fragmento Fab y/o una inmunoglobulina de los isotipos IgG, IgM, IgA, IgE, IgD y/o subclases de los mismos; d) tiene una o más de las siguientes características: (i) media en ADCC y/o CDC de células cancerosas; (ii) induce y/o promueve la apoptosis de las células cancerosas; (iii) inhibe la proliferación de células diana de células cancerosas; (iv) induce y/o promueve la fagocitosis de células cancerosas; y/o (v) induce y/o promueve la liberación de agentes citotóxicos; e) se une específicamente al antígeno de carbohidrato asociado al tumor, que es un antígeno de carbohidrato específico del tumor; f) no se une a un antígeno expresado en células no cancerosas, células no tumorales, células cancerosas benignas y/o células tumorales benignas; y/o g) se une específicamente a un antígeno de carbohidrato asociado a tumor expresado en células madre cancerosas y en células cancerosas normales.

[0086] Preferiblemente, la unión de los anticuerpos a sus respectivos antígenos es específica. El término "específica" se usa generalmente para referirse a la situación en la que un miembro de un par de unión no mostrará ninguna unión significativa a moléculas distintas de su(s) pareja(s) de unión específica y, por ejemplo, tiene menos de aproximadamente 30%, preferiblemente 20%, 10% o 1% de reactividad cruzada con cualquier otra molécula distinta de las especificadas en el presente documento.

[0087] Los anticuerpos se unen de forma adecuada a sus epítopos diana con una alta afinidad (valor de KD bajo), y preferiblemente KD está en el rango nanomolar o inferior. La afinidad se puede medir mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo; resonancia de plasmones superficiales.

Preparación de anticuerpos de ejemplo

[0088] Los ejemplos de anticuerpos capaces de unirse a los epítopos de SSEA-4 descritos en este documento se pueden fabricar mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York.

Inmunización de animales huésped y tecnología de hibridoma

[0089] Pueden prepararse anticuerpos policlonales de ejemplo contra los anticuerpos anti-SSEA-4 recolectando sangre del mamífero inmunizado examinado para determinar el aumento de anticuerpos deseados en el suero y separando el suero de la sangre mediante cualquier procedimiento convencional. Los anticuerpos policlonales incluyen suero que contiene los anticuerpos policlonales, así como la fracción que contiene los anticuerpos policlonales puede aislarse del suero.

[0090] Los anticuerpos policlonales se generan generalmente en animales huésped (por ejemplo, conejo, ratón, caballo o cabra) mediante múltiples inyecciones subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante con una proteína que sea inmunogénica en la especie que se va a inmunizar, por ejemplo, hemocianina de lapa californiana, albúmina sérica, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soja usando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCh, etc.

[0091] Cualquier animal mamífero puede ser inmunizado con el antígeno para la producción de los anticuerpos deseados. En general, se pueden utilizar animales de Rodentia, Lagomorpha o Primates. Los animales de Rodentia incluyen, por ejemplo, ratón, rata y hámster. Los animales de Lagomorpha incluyen, por ejemplo, conejo. Los animales de primates incluyen, por ejemplo, un mono de Catarrhini (mono del viejo mundo), tal como Macaca fascicularis, mono rhesus, babuino y chimpancés.

[0092] Los procedimientos para la inmunización de animales con antígenos son conocidos en la técnica. La inyección intraperitoneal o la inyección subcutánea de antígenos es un procedimiento estándar para la inmunización de mamíferos. Más específicamente, los antígenos se pueden diluir y suspender en una cantidad apropiada de solución salina tamponada con fosfato (PBS), solución salina fisiológica, etc. Si se desea, la suspensión de antígenos se puede mezclar con una cantidad apropiada de un adyuvante estándar, tal como el adyuvante completo de Freund, convertirse en emulsión, y a continuación administrarse a animales mamíferos. Los animales se inmunizan contra el antígeno, conjugados inmunogénicos o derivados combinando 1 mg o 1 |jg del péptido o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante incompleto de Freund.

[0093] Se pueden reforzar a los animales hasta que el título se estabilice mediante varias administraciones de antígeno mezclado con una cantidad adecuada de adyuvante incompleto de Freund cada 4 a 21 días. Los animales se refuerzan con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. De siete a 14 días después, se extrae sangre a los animales y se analiza el título de anticuerpos en el suero. También se puede usar un portador apropiado para la inmunización. Después de la inmunización como anteriormente, el suero se examina mediante un procedimiento estándar para determinar un aumento en la cantidad de anticuerpos deseados. Preferiblemente, el animal se refuerza con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado con una proteína diferente y/o mediante un reactivo de reticulación diferente. Los conjugados también se pueden preparar en cultivos de células recombinantes como fusiones de proteínas. También, se pueden utilizar de forma adecuada agentes agregantes, tales como alumbre, para aumentar la respuesta inmunitaria.

[0094] Durante las últimas dos o tres décadas, se han desarrollado una serie de metodologías para preparar anticuerpos quiméricos, humanizados o humanos para aplicaciones terapéuticas humanas in vivo. La metodología más utilizada y probada es preparar mAb de ratón utilizando la metodología de hibridomas y a continuación humanizar los mAb convirtiendo las regiones estructurales de los dominios Vh y Vl y los dominios constantes de los mAb en las regiones estructurales humanas más homólogas de dominios Vh y Vl humanos y regiones constantes de un isotipo de inmunoglobulina y humana deseable y subclase. Muchos mAb, tales como Xolair, usados clínicamente son mAb humanizados de isotipo y1, k humano y subclase y se preparan usando esta metodología.

[0095] En algunas realizaciones, los anticuerpos pueden fabricarse mediante la tecnología de hibridoma convencional. Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975). En el procedimiento del hibridoma, se inmuniza un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster o un conejo, tal como se describió anteriormente para provocar que los linfocitos produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína utilizada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro.

[0096] Para preparar anticuerpos monoclonales, las células inmunes se recogen del mamífero inmunizado con el antígeno y se comprueba el aumento del nivel de anticuerpos deseados en el suero, tal como se describió anteriormente, y se someten a fusión celular. Las células inmunes utilizadas para la fusión celular se obtienen preferiblemente del bazo. Otras células parentales preferidas para fusionar con el inmunocito anterior incluyen, por ejemplo, células de mieloma de mamíferos y más preferiblemente células de mieloma que tienen una propiedad adquirida para la selección de células fusionadas por fármacos.

[0097] Las células de mieloma preferidas son aquellas que se fusionan eficientemente, apoyan una producción estable de alto nivel de anticuerpo por las células productoras de anticuerpos seleccionadas y son sensibles a un medio, tal como el medio HAT. Entre estas, las líneas celulares de mieloma preferidas son las líneas de mieloma murino, tales como las derivadas de los tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles en el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, EE. UU., y las células SP-2 disponibles en la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, EE. UU. También se han descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratónhumano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pág. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)).

[0098] Las células de mieloma y inmunocitos anteriores se pueden fusionar de acuerdo con procedimientos conocidos, por ejemplo, el procedimiento de Milstein et al. (Galfre et al., Methods Enzymol. 73: 3-46, 1981). Los linfocitos se fusionan con células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, págs. 59-103 (Academic Press, 1986)). Los hibridomas resultantes obtenidos mediante la fusión celular pueden seleccionarse cultivándolos en un medio de selección estándar, tal como medio HAT (medio que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina). El cultivo celular se continúa típicamente en el medio HAT durante varios días a varias semanas, siendo el tiempo suficiente para permitir que todas las demás células, con la excepción del hibridoma deseado (células no fusionadas), mueran. A continuación, se realiza la dilución limitante estándar para cribar y clonar una célula de hibridoma que produce el anticuerpo deseado.

[0099] Las células de hibridoma así preparadas se siembran y crecen en un medio de cultivo adecuado que contiene preferentemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma parentales no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), sustancias que impiden el crecimiento de células deficientes de HGPRT.

[0100] El medio de cultivo en el que crecen las células de hibridoma se analiza para determinar la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferiblemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro. La medición de la absorbancia en el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), inmunoensayo enzimático (EIA), radioinmunoensayo (RIA) y/o inmunofluorescencia puede usarse para medir la actividad de unión al antígeno del anticuerpo de la invención. En ELISA, el anticuerpo de la presente invención se inmoviliza en una placa, la proteína de la invención se aplica a la placa y a continuación se aplica una muestra que contiene un anticuerpo deseado, tal como sobrenadante de cultivo de células productoras de anticuerpos o anticuerpos purificados. A continuación, se aplica un anticuerpo secundario que reconoce el anticuerpo primario y se marca con una enzima, tal como la fosfatasa alcalina, y se incuba la placa. A continuación, después del lavado, se añade a la placa un sustrato enzimático, tal como p-nitrofenilfosfato, y se mide la absorbancia para evaluar la actividad de unión al antígeno de la muestra. En este procedimiento puede usarse un fragmento de la proteína, tal como un fragmento C-terminal o N-terminal. Puede usarse BIAcore (Pharmacia) para evaluar la actividad del anticuerpo según la presente invención. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal se puede determinar, por ejemplo, mediante el análisis de Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem. 107: 220 (1980).

[0101] La aplicación de cualquiera de los procedimientos convencionales, incluyendo los descritos anteriormente, las células de hibridoma que producen anticuerpos que se unen a epítopos descritos aquí pueden ser identificados y seleccionados para caracterización adicional.

[0102] Después de identificar las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones pueden subclonarse mediante procedimientos de dilución limitante y crecer mediante procedimientos estándares (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, líquido ascítico o suero mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas, tales como, por ejemplo, proteína A-Sefarosa, cromatografía en hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

[0103] Además, las células de hibridoma pueden crecer in vivo como tumores ascíticos en un animal. Por ejemplo, los hibridomas obtenidos se pueden trasplantar posteriormente a la cavidad abdominal de un ratón y se recolectan los ascitos.

[0104] Los anticuerpos monoclonales obtenidos se pueden purificar mediante, por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio, una columna de proteína A o proteína G, cromatografía de intercambio iónico DEAE, o una columna de afinidad a la que se acopla la proteína de la presente invención. El anticuerpo de la presente invención puede usarse no solo para la purificación y detección de la proteína de la presente invención, sino también como candidato para agonistas y antagonistas de la proteína de la presente invención. Además, este anticuerpo se puede aplicar al tratamiento con anticuerpos para enfermedades relacionadas con la proteína de la presente invención.

Tecnología recombinante

[0105] Los anticuerpos monoclonales obtenidos de este modo también puede prepararse de forma recombinante usando técnicas de ingeniería genética (véase, por ejemplo, Borrebaeck CAK y Larrick JW Therapeutic Monoclonal Antibodies, publicado en el Reino Unido por MacMillan Publishers LTD, 1990). Puede clonarse un ADN que codifica un anticuerpo a partir de una célula inmunitaria, tal como un hibridoma o un linfocito inmunizado que produce el anticuerpo, insertarse en un vector apropiado e introducirse en las células huésped para preparar un anticuerpo recombinante. La presente invención también proporciona anticuerpos recombinantes preparados como se describió anteriormente.

[0106] Cuando el anticuerpo obtenido se va a administrar al cuerpo humano (tratamiento con anticuerpos), es preferible un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado para reducir la inmunogenicidad. Por ejemplo, los animales transgénicos que tienen un repertorio de genes de anticuerpos humanos pueden inmunizarse con un antígeno seleccionado entre una proteína, células que expresan proteínas o sus lisados. A continuación, se recogen células productoras de anticuerpos de los animales y se fusionan con células de mieloma para obtener un hibridoma, a partir del cual se pueden preparar anticuerpos humanos contra la proteína. Alternativamente, una célula inmunitaria, tal como un linfocito inmunizado, que produce anticuerpos puede inmortalizarse mediante un oncogén y usarse para preparar anticuerpos monoclonales.

[0107] El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se puede aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos). Las células de hibridoma sirven como fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que a continuación se transfectan en células huésped, tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otra manera no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. Los artículos de revisión sobre la expresión recombinante en bacterias de ADN que codifica el anticuerpo incluyen Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993) y Pluckthun, Immunol. Rev. 130: 151 - 188 (1992).

[0108] Los ADN que codifican los anticuerpos producidos por las células de hibridoma descritas anteriormente pueden modificarse genéticamente, mediante tecnología de rutina, para producir anticuerpos modificados genéticamente. Los anticuerpos modificados genéticamente, tales como los anticuerpos humanizados, los anticuerpos quiméricos, los anticuerpos monocatenarios y los anticuerpos biespecíficos, pueden producirse mediante, por ejemplo, tecnología recombinante convencional. A continuación, el ADN puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante de los dominios constantes de la cadena ligera y pesada humana en lugar de las secuencias murinas homólogas, Morrison et al., (1984) Proc. Nat. Acad. Sci. 81: 6851, o uniéndose covalentemente a la secuencia de codificación de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia de codificación de un polipéptido que no es de inmunoglobulina. De esa manera, los anticuerpos modificados genéticamente, tales como anticuerpos "quiméricos" o "híbridos", se pueden preparar con especificidad de unión de un antígeno diana.

[0109] Las técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" son bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. Us a 81, 6851; Neuberger et al. (1984) Nature 312, 604; y Takeda et al. (1984) Nature 314: 452.

[0110] Típicamente, tales polipéptidos que no son inmunoglobulinas se sustituyen por los dominios constantes de un anticuerpo, o se sustituyen por los dominios variables de un sitio de combinación a antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación a antígeno que tiene especificidad para un antígeno y otro sitio de combinación a antígeno que tiene especificidad por un antígeno diferente.

[0111] Los anticuerpos quiméricos o híbridos se pueden preparar también in vitro usando procedimientos conocidos en la química de proteínas sintéticas, incluyendo aquellos que implican agentes de reticulación. Por ejemplo, las inmunotoxinas se pueden construir usando una reacción de intercambio de disulfuro o formando un enlace tioéter. Los ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato.

[0112] Los procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en él de una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos se denominan a menudo residuos "importados", que normalmente se toman de un dominio variable "importado". La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al. ., Science, 239: 1534-1536 (1988)), sustituyendo las secuencias de CDR o CDR de roedor por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente de Estados Unidos n° 4.816.567), en el que sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores.

[0113] La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, que se utilizarán en la fabricación de anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el procedimiento denominado de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se criba frente a la biblioteca completa de secuencias conocidas de dominio variable humano. La secuencia humana más cercana a la del roedor se acepta entonces como estructura humana (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)). Otro procedimiento usa una región estructural particular derivada de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. La mismo estructura puede usarse para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 89: 4285 (1992); Prestaetal. J. Immnol. 151: 2623 (1993)).

[0114] Es además importante que los anticuerpos se humanicen manteniendo una alta afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, de acuerdo con un procedimiento preferido, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y varios productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales están comúnmente disponibles y son familiares para los expertos en la técnica. Hay disponibles programas informáticos que ilustran y muestran probables estructuras conformacionales tridimensionales de secuencias de inmunoglobulinas candidatas seleccionadas. La inspección de estas presentaciones permite analizar el papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De esta forma, los residuos de FR pueden seleccionarse y combinarse a partir de las secuencias receptoras y de importación de modo que se logre la característica deseada del anticuerpo, tal como una mayor afinidad por el (los) antígeno(s) diana. En general, los residuos de CDR están directa y más sustancialmente implicados en influir en la unión del antígeno.

[0115] Alternativamente, ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, tras inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigótica del gen de la región de unión de la cadena pesada del anticuerpo (J^h) en ratones mutantes quiméricos y de la línea germinal da como resultado la inhibición completa de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia de la matriz de genes de inmunoglobulina de la línea germinal humana en tales ratones mutantes de la línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos tras la exposición al antígeno. Véase, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993). Los anticuerpos humanos también pueden derivarse de bibliotecas de presentación en fagos (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)).

[0116] En algunos ejemplos, un vector comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que codifica la región variable de la cadena pesada o la región variable de la cadena ligera de un anticuerpo anti-SSEA-4 como se describe aquí. En otros ejemplos, el vector comprende secuencias de nucleótidos que codifican tanto la región variable de la cadena pesada como la región variable de la cadena ligera, cuya expresión puede controlarse mediante un solo promotor o dos promotores separados. También se describen aquí procedimientos para producir anticuerpos anti-SSEA-4 como se describen en este documento, por ejemplo, mediante la tecnología recombinante descrita en esta sección.

Otra tecnología para preparar anticuerpos

[0117] Los anticuerpos totalmente humanos se pueden obtener mediante el uso de ratones disponibles comercialmente que han sido manipulados para expresar proteínas de inmunoglobulina específicas humanas. Los animales transgénicos que están diseñados para producir una respuesta inmune más deseable (por ejemplo, anticuerpos completamente humanos) o más robusta también pueden usarse para la generación de anticuerpos humanizados o humanos. Ejemplos de dicha tecnología son Xenomouse RTM de Amgen, Inc. (Fremont, California) y HuMAb-MouseRTM y TC Mouse™ de Medarex, Inc. (Princeton, Nueva Jersey). En otra alternativa, los anticuerpos pueden fabricarse de forma recombinante mediante tecnología de presentación en fagos. Véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N° 5.565.332; 5,580,717; 5,733,743; y 6.265.150; y Winter et al., (1994) Annu. Rev. Immunol. 12: 433-455. Alternativamente, la tecnología de presentación en fagos (McCafferty et al., (1990) Nature 348: 552-553) puede usarse para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos in vitro, a partir de repertorios de genes de dominio variable (V) de inmunoglobulina de donantes no inmunizados.

[0118] Los fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo intacto (anticuerpo de longitud completa) se pueden preparar mediante procedimientos de rutina. Por ejemplo, se pueden producir fragmentos F(ab')2 mediante digestión con pepsina de una molécula de anticuerpo, y fragmentos Fab que se pueden generar reduciendo los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')2.

[0119] Alternativamente, los anticuerpos anti-SSEA-4 descritos en este documento se pueden aislar de bibliotecas de fagos de anticuerpos (por ejemplo, bibliotecas de fagos de anticuerpos de una sola cadena) generados utilizando las técnicas descritas en McCafferty et al, Nature, 348:. 552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol Biol., 222: 581-597 (1991). Publicaciones posteriores describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (rango nM) por mezcla de cadenas (Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)), así como la infección combinatoria y la recombinación in vivo como una estrategia para construir bibliotecas de fagos muy grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993)). Por tanto, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas tradicionales de hibridoma de anticuerpos monoclonales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.

[0120] Los anticuerpos obtenidos como se describen en el presente documento se pueden purificar hasta homogeneidad. Por ejemplo, la separación y purificación del anticuerpo se puede realizar de acuerdo con los procedimientos de separación y purificación usados para proteínas generales. Por ejemplo, el anticuerpo puede separarse y aislarse mediante el uso combinado y seleccionado de forma apropiada de cromatografías en columna, tales como cromatografía de afinidad, filtro, ultrafiltración, salado, diálisis, electroforesis en gel de poliacrilamida SDS, enfoque isoeléctrico y otros (Antibodies: A Laboratory Manua, Ed Harlow y David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), pero no se limitan a los mismos. La concentración de los anticuerpos obtenidos como anteriormente se puede determinar mediante la medición de la absorbancia, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), o etc. La cromatografía de ejemplo, con la excepción de la afinidad incluye, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, filtración en gel, cromatografía de fase inversa, cromatografía de adsorción y similares (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). Los procedimientos cromatográficos se pueden llevar a cabo mediante cromatografía en fase líquida, tal como HPLC, FPLC.

[0121] Los anticuerpos se pueden caracterizar usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un procedimiento consiste en identificar el epítopo al que se une el antígeno, o "mapeo de epítopos". Existen muchos procedimientos conocidos en la técnica para mapear y caracterizar la ubicación de epítopos en proteínas, incluida la resolución de la estructura cristalina de un complejo anticuerpo-antígeno, ensayos de competencia, ensayos de expresión de fragmentos génicos y ensayos basados en péptidos sintéticos, tal como se describe, para ejemplo, en el Capítulo 11 de Harlow y Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1999. En un ejemplo adicional, se puede usar el mapeo de epítopos para determinar la secuencia a la que se une un anticuerpo. El epítopo puede ser un epítopo lineal, es decir, contenido en un solo tramo de aminoácidos, o un epítopo conformacional formado por una interacción tridimensional de aminoácidos que puede no estar necesariamente contenido en un solo tramo (secuencia lineal de estructura primaria). Los péptidos de diferentes longitudes (por ejemplo, de al menos 4-6 aminoácidos de longitud) pueden aislarse o sintetizarse (por ejemplo, de forma recombinante) y usarse para ensayos de unión con un anticuerpo. En otro ejemplo, el epítopo al que se une el anticuerpo se puede determinar en un cribado sistemático utilizando péptidos solapantes derivados de la secuencia del antígeno diana y determinando la unión por el anticuerpo. Según los ensayos de expresión de fragmentos génicos, el marco de lectura abierto que codifica el antígeno diana se fragmenta al azar o mediante construcciones genéticas específicas y se determina la reactividad de los fragmentos expresados del antígeno con el anticuerpo que se va a analizar. Los fragmentos de genes pueden, por ejemplo, producirse mediante PCR y a continuación transcribirse y traducirse en proteína in vitro, en presencia de aminoácidos radiactivos. A continuación, se determina la unión del anticuerpo a los fragmentos de antígeno marcados radiactivamente mediante inmunoprecipitación y electroforesis en gel. Ciertos epítopos también pueden identificarse usando grandes bibliotecas de secuencias de péptidos aleatorias presentadas en la superficie de las partículas de fagos (bibliotecas de fagos). Alternativamente, se puede probar una biblioteca definida de fragmentos de péptidos solapantes para determinar la unión al anticuerpo de prueba en ensayos de unión simples.

[0122] En un ejemplo adicional, la mutagénesis de un dominio de unión a antígeno, experimentos de intercambio de dominios y mutagénesis de barrido de alanina se pueden realizar para identificar los residuos requeridos, suficientes, y/o necesarios para la unión a epítopo. Por ejemplo, los experimentos de intercambio de dominios se pueden realizar utilizando un mutante de un antígeno diana en el que varios residuos en el epítopo de unión para el anticuerpo candidato se han reemplazado (intercambiado) por secuencias de una proteína estrechamente relacionada, pero antigénicamente distinta (tal como otro miembro de la familia de proteínas neurotrofinas). Al evaluar la unión del anticuerpo a la proteína diana mutante, se puede evaluar la importancia del fragmento de antígeno particular para la unión al anticuerpo.

[0123] Alternativamente, los ensayos de competición se pueden realizar usando otros anticuerpos conocidos por unirse al mismo antígeno para determinar si un anticuerpo se une al mismo epítopo (por ejemplo, el anticuerpo MC45 descrito en este documento) como los otros anticuerpos. Los expertos en la técnica conocen bien los ensayos de competición.

Aspectos adicionales de procedimientos de producción de anticuerpos generales adecuados de ejemplo

[0124] Los procedimientos para preparar anticuerpos monoclonales y policlonales y fragmentos de los mismos en animales (por ejemplo, ratón, conejo, cabra, oveja o caballo) son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York. El término "anticuerpo" incluye moléculas de inmunoglobulina intactas así como fragmentos de las mismas, tales como Fab, F(ab')², Fv, scFv (anticuerpo de una sola cadena) y dAb (anticuerpo de dominio; Ward, et. Al. (1989) Nature, 341, 544).

[0125] Las composiciones descritas en este documento pueden ser incluidas en una composición farmacéutica junto con agentes activos adicionales, portadores, vehículos, excipientes o agentes auxiliares identificables por un experto en la técnica tras la lectura de la presente descripción.

[0126] Las composiciones farmacéuticas comprenden preferiblemente al menos un portador farmacéuticamente aceptable. En tales composiciones farmacéuticas, las composiciones descritas en el presente documento forman el "compuesto activo", también denominado "agente activo". Tal como se usa en el presente documento, el lenguaje "portador farmacéuticamente aceptable" incluye disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. También se pueden incorporar compuestos activos suplementarios en las composiciones. Una composición farmacéutica se formula para que sea compatible con su vía de administración prevista. Los ejemplos de vías de administración incluyen administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (tópica), transmucosa y rectal. Las soluciones o suspensiones utilizadas para aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril, tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos, tales como alcohol bencílico o metil parabenos; antioxidantes, tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes, tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones, tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad, tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede incluirse en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiples fabricados de vidrio o plástico.

[0127] Se proporcionan composiciones que comprenden un anticuerpo anti-SSEA-4 o al menos un polinucleótido que comprende secuencias que codifican un anticuerpo anti-SSEA-4. En determinadas realizaciones, una composición puede ser una composición farmacéutica. Estas composiciones pueden comprender además portadores adecuados, tales como excipientes farmacéuticamente aceptables que incluyen tampones, que son bien conocidos en la técnica.

[0128] También se proporcionan anticuerpos y polinucleótidos aislados. En determinadas realizaciones, los anticuerpos y polinucleótidos aislados son sustancialmente puros.

[0129] Los anticuerpos anti-SSEA-4 son monoclonales. En otra realización, se proporcionan fragmentos de los anticuerpos anti-SSEA-4 (por ejemplo, fragmentos Fab, Fab'-SH y F(ab')2). Estos fragmentos de anticuerpos pueden crearse mediante medios tradicionales, tales como digestión enzimática, o pueden generarse mediante técnicas recombinantes. Dichos fragmentos de anticuerpos pueden ser quiméricos, humanizados o humanos. Estos fragmentos son útiles para los fines de diagnóstico y terapéuticos que se exponen a continuación.

[0130] Una variedad de procedimientos se conocen en la técnica para generar bibliotecas de presentación en fagos, a partir de las cuales se puede obtener un anticuerpo de interés. Un procedimiento para generar anticuerpos de interés es mediante el uso de una biblioteca de anticuerpos de fagos, tal como se describe en Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340 (5): 1073-93.

[0131] Los anticuerpos anti-SSEA-4 de la invención se pueden preparar usando bibliotecas combinatorias para cribar clones de anticuerpos sintéticos con la actividad o actividades deseadas. En principio, los clones de anticuerpos sintéticos se seleccionan cribando bibliotecas de fagos que contienen fagos que presentan varios fragmentos de la región variable del anticuerpo (Fv) fusionados con la proteína de la cubierta del fago. Dichas bibliotecas de fagos se criban mediante cromatografía de afinidad contra el antígeno deseado. Los clones que expresan fragmentos Fv capaces de unirse al antígeno deseado se adsorben en el antígeno y, por tanto, se separan de los clones que no se unen en la biblioteca. A continuación, los clones de unión se eluyen del antígeno y pueden enriquecerse más mediante ciclos adicionales de adsorción/elución de antígenos. Cualquiera de los anticuerpos anti-SSEA-4 de la invención puede obtenerse diseñando un procedimiento de cribado de antígenos adecuado para seleccionar el clon de fago de interés seguido de la construcción de un clon de anticuerpo anti-SSEA-4 de longitud completa utilizando las secuencias Fv del clon de fago de interés y secuencias de región constante (Fc) adecuadas descritas en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Publicación NIH 91-3242, Bethesda Md. (1991), vols. 1-3.

[0132] El dominio de unión a antígeno de un anticuerpo está formado por dos regiones variables (V) de aproximadamente 110 aminoácidos, una de cada una de la cadena ligera (VL) y la cadena pesada (VH), que ambas presentan tres bucles hipervariables o regiones determinantes de complementariedad (CDR). Los dominios variables se pueden presentar funcionalmente en fagos, ya sea como fragmentos Fv de una sola cadena (scFv), en los que VH y VL están unidos covalentemente a través de un péptido corto y flexible, o como fragmentos Fab, en los que cada uno de ellos se fusiona con un dominio constante e interactúan de forma no covalente, tal como se describe en Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433 -455 (1994). Tal como se usa en este documento, los clones de fagos que codifican scFv y los clones de fagos que codifican Fab se denominan colectivamente "clones de fagos de Fv" o "clones de Fv".

[0133] Los repertorios de genes de VH y VL pueden clonarse por separado mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y recombinarse aleatoriamente en bibliotecas de fagos, que a continuación pueden buscarse clones de unión a antígeno, tal como se describe en Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433 - 455 (1994). Las bibliotecas de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad por el inmunógeno sin el requisito de construir hibridomas. Alternativamente, el repertorio sin tratar se puede clonar para proporcionar una única fuente de anticuerpos humanos contra una amplia gama de antígenos no propios y también propios sin ninguna inmunización, tal como describen Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Finalmente, las bibliotecas sin tratar también se pueden preparar sintéticamente clonando los segmentos del gen V no reordenados de las células madre, y usando de cebadores de PCR que contienen una secuencia aleatoria para codificar las regiones CDR3 altamente variables y para lograr el reordenamiento in vitro como describen por Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 - 388 (1992).

[0134] Se utiliza fago filamentoso para presentar los fragmentos de anticuerpos por fusión a la proteína de cubierta menor pIII. Los fragmentos de anticuerpo se pueden presentar como fragmentos Fv de una sola cadena, en los que los dominios VH y VL están conectados en la misma cadena polipeptídica mediante un espaciador polipeptídico flexible, por ejemplo, tal como describe por Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), o como fragmentos Fab, en los que una cadena se fusiona con pIII y la otra se secreta en el periplasma de la célula huésped bacteriana donde se ensambla una estructura de proteína de recubrimiento Fab que se presenta en la superficie del fago desplazando algunas de las proteínas de la cubierta de tipo salvaje, por ejemplo, tal como se describe en Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19: 4133 -4137 (1991).

[0135] En general, los ácidos nucleicos que codifican fragmentos de genes de anticuerpos se obtienen de células inmunes recolectadas de humanos o animales. Si se desea una biblioteca sesgada a favor de los clones anti-SSEA-4, el sujeto se inmuniza con SSEA-4 para generar una respuesta de anticuerpos, y se recuperan las células del bazo y/o las células B circulantes u otros linfocitos de sangre periférica (PBL) para construcción de biblioteca. En un ejemplo, una biblioteca de fragmentos de genes de anticuerpos humanos sesgada a favor de clones anti-SSEA-4 humanos se obtiene generando una respuesta de anticuerpos anti-SSEA-4 humanos en ratones transgénicos que llevan una matriz de genes de inmunoglobulina humana funcional (y que carecen de un sistema de producción de anticuerpos endógenos funcionales) de manera que la inmunización con SSEA-4 da lugar a células B que producen anticuerpos humanos contra SSEA-4. A continuación, se describe la generación de ratones transgénicos productores de anticuerpos.

[0136] El enriquecimiento adicional para poblaciones de células reactivas anti-SSEA-4 se pueden obtener mediante el uso de un procedimiento de cribado adecuado para aislar células B que expresan el anticuerpo específico de SSEA-4, por ejemplo, por separación de células con cromatografía de afinidad de SSEA-4 o adsorción de células a SSEA-4 marcado con fluorocromo, seguido de clasificación de células activadas por flujo (FACS).

[0137] Alternativamente, el uso de células del bazo y/o células B u otras PBLs de un donante no inmunizado proporciona una mejor representación del posible repertorio de anticuerpos, y también permite la construcción de una biblioteca de anticuerpos utilizando cualquier especie animal (humana o no humana), en la que SSEA-4 no es antigénico. Para las bibliotecas que incorporan la construcción de genes de anticuerpos in vitro, las células madre se recolectan del sujeto para proporcionar ácidos nucleicos que codifican segmentos de genes de anticuerpos no reordenados. Las células inmunes de interés se pueden obtener de una variedad de especies animales, tales como especies de humanos, ratones, ratas, lagomorfa, luprinos, caninos, felinos, porcinos, bovinos, equinos y aviares, etc.

[0138] Los segmentos de genes variables de anticuerpos que codifican el ácido nucleico (incluidos los segmentos VH y VL) se recuperan de las células de interés y se amplifican. En el caso de bibliotecas de genes de VH y VL reorganizadas, el ADN deseado se puede obtener aislando ADN genómico o ARNm de linfocitos seguido de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores que coinciden con los extremos 5' y 3' de los genes VH y VL reorganizados como se describe en Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989), creando así diversos repertorios de genes V para la expresión. Los genes V pueden amplificarse a partir de ADNc y ADN genómico, con cebadores inversos en el extremo 5' del exón que codifican el dominio V maduro y cebadores directos basados en el segmento J como se describe en Orlandi et al. (1989) y en Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989). Sin embargo, para amplificar a partir de ADNc, los cebadores inversos también pueden basarse en el exón líder como se describe en Jones et al., Biotechnol., 9: 88-89 (1991), y los cebadores directos dentro de la región constante como se describe en Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (Estados Unidos), 86: 5728 - 5732 (1989). Para maximizar la complementariedad, la degeneración se puede incorporar en los cebadores tal como se describe en Orlandi et al. (1989) o Sastry et al. (1989). En ciertos ejemplos, la diversidad de la biblioteca se maximiza utilizando cebadores de PCR dirigidos a cada familia de genes V para amplificar todas las disposiciones de VH y VL disponibles presentes en la muestra de ácido nucleico de células inmunes, por ejemplo, tal como se describe en el procedimiento de Marks et al. , J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) o como se describe en el procedimiento de Orum et al., Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993). Para la clonación del ADN amplificado en vectores de expresión, se pueden introducir sitios de restricción raros dentro del cebador de PCR como una etiqueta en un extremo como se describe en Orlandi et al. (1989), o mediante amplificación por PCR adicional con un cebador marcado como se describe en Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991).

[0139] Los repertorios de genes V reordenados sintéticamente pueden derivarse in vitro de segmentos de genes V. La mayoría de los segmentos de genes VH humano se han clonado y secuenciado (descrito en Tomlinson et al., J. Mol. Biol., 227: 776-798 (1992)) y mapeado (descrito en Matsuda et al., Nature Genet., 3: 88-94 (1993); estos segmentos clonados (incluidas todas las conformaciones principales del bucle H1 y H2) pueden usarse para generar diversos repertorios de genes VH con cebadores de PCR que codifican bucles H3 de diversa secuencia y longitud, tal como se describe en Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Los repertorios de VH también se pueden producir con toda la diversidad de secuencia enfocada en un bucle H3 largo de una sola longitud, tal como se describe en Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457 - 4461 (1992). Se han clonado y secuenciado segmentos VK y Vx humanos (descrito en Williams y Winter, EUR. J. Immunol., 23: 1456-1461 (1993)) y puede usarse para fabricar repertorios de cadenas ligeras sintéticas. Los repertorios de genes V sintéticos, basados en un rango de pliegues de VH y VL, y longitudes L3 y H3, codificarán anticuerpos de considerable diversidad estructural. Después de la amplificación de los ADN que codifican el gen V, los segmentos del gen V de la línea germinal se pueden reorganizar in vitro de acuerdo con los procedimientos de Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 - 388 (1992).

[0140] Pueden construirse repertorios de fragmentos de anticuerpos combinando repertorios de genes VH y VL de varias formas. Cada repertorio se puede crear en diferentes vectores, y los vectores se pueden recombinar in vitro, por ejemplo, tal como se describe en Hogrefe et al., Gene, 128: 119-126 (1993), o in vivo mediante infección combinatoria, por ejemplo, el sistema loxP descrito en Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266 (1993). El enfoque de recombinación in vivo aprovecha la naturaleza de dos cadenas de los fragmentos Fab para superar el límite del tamaño de la biblioteca impuesto por la eficiencia de transformación de E. coli. Los repertorios sin tratar de VH y VL se clonan por separado, uno en un fagémido y el otro en un vector de fago. A continuación, las dos bibliotecas se combinan mediante infección por fagos de bacterias que contienen fagémidos, de modo que cada célula contiene una combinación diferente y el tamaño de la biblioteca está limitado únicamente por el número de células presentes (aproximadamente 1012 clones). Ambos vectores contienen señales de recombinación in vivo de modo que los genes VH y VL se recombinan en un solo replicón y se empaquetan conjuntamente en viriones de fagos. Estas enormes bibliotecas proporcionan un gran número de diversos anticuerpos de buena afinidad (Kd-1 de aproximadamente 10-8 M).

[0141] Alternativamente, los repertorios pueden clonarse secuencialmente en el mismo vector, por ejemplo como se describe en Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991), o ensamblarse por Pc R y a continuación clonarse, por ejemplo, como se describe en Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991). El ensamblaje por PCR también se puede usar para unir ADN de VH y VL con ADN que codifica un espaciador de péptido flexible para formar repertorios de Fv de una sola cadena (scFv). En otra técnica más, el "ensamblaje por PCR en la célula" se usa para combinar genes de VH y VL dentro de linfocitos mediante PCR y a continuación clonar repertorios de genes unidos, como se describe en Embleton et al., Nucl. Acids Res., 20: 3831 - 3837 (1992).

[0142] El cribado de las bibliotecas se puede realizar mediante cualquier técnica conocida en el sector. Por ejemplo, las dianas de SSEA-4 se pueden usar para recubrir los pocillos de las placas de adsorción, se pueden expresar en las células huésped fijadas a las placas de adsorción o se pueden usar en la clasificación de células, o se pueden conjugar con biotina para su captura con partículas recubiertas con estreptavidina, o se pueden usar en cualquier otro procedimiento conocido en el sector para realizar un barrido de bibliotecas de presentación de fagos.

[0143] Las muestras de la biblioteca de fagos se ponen en contacto con SSEA-4 H inmovilizado en condiciones adecuadas para la unión de al menos una parte de las partículas de fago con el adsorbente. Normalmente, las condiciones, incluido el pH, la fuerza iónica, la temperatura y similares, se seleccionan para imitar las condiciones fisiológicas. Los fagos unidos a la fase sólida se lavan y a continuación se eluyen con ácido, por ejemplo, tal como se describe en Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991), o con álcali, por ejemplo, tal como se describe en Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), o por competición de antígenos de SSEA-4, por ejemplo, en un procedimiento similar al procedimiento de competición de antígenos de Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991). Los fagos se pueden enriquecer desde aproximadamente 20 veces hasta aproximadamente 1000 veces en una sola ronda de selección. Además, los fagos enriquecidos se pueden desarrollar en cultivo bacteriano y someterse a más rondas de selección.

[0144] La eficacia de la selección depende de muchos factores, incluida la cinética de disociación durante el lavado, y si múltiples fragmentos de anticuerpos en un solo fago pueden unirse simultáneamente con el antígeno. Los anticuerpos con cinética de disociación rápida (y afinidades de unión débiles) se pueden retener mediante el uso de lavados cortos, presentación de fagos multivalentes y alta densidad de recubrimiento de antígeno en fase sólida. La alta densidad no solo estabiliza el fago a través de interacciones multivalentes, sino que favorece la re-unión del fago que se ha disociado. La selección de anticuerpos con una cinética de disociación lenta (y buenas afinidades de unión) se puede promover mediante el uso de lavados prolongados y la presentación en fagos monovalentes, tal como se describe en Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990) y en el documento WO 92/09690, y una baja densidad de recubrimiento de antígeno, tal como se describe en Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992).

[0145] Es posible seleccionar entre anticuerpos de fagos de diferentes afinidades, incluso con afinidades que difieren ligeramente, para SSEA-4. Sin embargo, es probable que la mutación aleatoria de un anticuerpo seleccionado (por ejemplo, como se realiza en algunas de las técnicas de maduración por afinidad descritas anteriormente) dé lugar a muchos mutantes, la mayoría de los cuales se unen al antígeno y algunos con mayor afinidad. Con la limitación de SSEA-4, los fagos raros de alta afinidad podrían dejar de ser competencia. Para retener todos los mutantes de mayor afinidad, los fagos se pueden incubar con SSEA-4 biotinilado en exceso, pero con SSEA-4 biotinilado a una concentración de menor molaridad que la constante de afinidad molar diana para SSEA-4. Los fagos de unión de alta afinidad se pueden capturar mediante partículas paramagnéticas recubiertas de estreptavidina. Tal "captura en equilibrio" permite que los anticuerpos se seleccionen de acuerdo con sus afinidades de unión, con una sensibilidad que permite el aislamiento de clones mutantes con una afinidad tan pequeña como dos veces mayor de un gran exceso de fagos con menor afinidad. Las condiciones utilizadas en el lavado de fagos unidos a una fase sólida también pueden manipularse para discriminar sobre la base de la cinética de disociación.

[0146] El ADN que codifica los clones Fv de la invención se aísla y secuencia fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando cebadores oligonucleotídicos diseñados para amplificar específicamente las regiones codificantes de cadena pesada y ligera de interés a partir del molde de ADN de hibridoma o fago). Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión, que a continuación se transfectan en células huésped, tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otro modo no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de los anticuerpos monoclonales deseados en las células huésped recombinantes. Los artículos de revisión sobre la expresión recombinante en bacterias de ADN que codifica anticuerpos incluyen a Skerra et al., Curr. Opinión en Immunol., 5: 256 (1993) y Pluckthun, Immunol. Revs, 130: 151 (1992).

[0147] El ADN que codifica los clones Fv de la invención se puede combinar con secuencias de ADN conocidas que codifican regiones constantes de cadena pesada y/o cadena ligera (por ejemplo, las secuencias de ADN apropiadas pueden obtenerse de Kabat et al., supra) para formar clones que codifican cadenas pesadas y/o ligeras de longitud total o parcial. Se entenderá que se pueden usar regiones constantes de cualquier isotipo para este propósito, incluyendo regiones constantes de IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, y que tales regiones constantes se pueden obtener de cualquier especie humana o animal. Un clon de Fv derivado del ADN de dominio variable de una especie animal (tal como un ser humano) y a continuación fusionado con el ADN de región constante de otra especie animal para formar secuencia(s) codificante(s) para cadena pesada y/o cadena ligera de longitud completa “híbrida” está incluido en la definición de anticuerpo "quimérico" e "híbrido", tal como se usa en este documento. En una realización, un clon de Fv derivado de ADN variable humano se fusiona con ADN de región constante humana para formar secuencia(s) codificante(s) para todas las cadenas pesadas y/o ligeras humanas, de longitud completa o parcial.

[0148] Los anticuerpos producidos por bibliotecas sin tratar (naturales o sintéticas) pueden ser de afinidad moderada (Kd -1 de aproximadamente 106 a 107 M-1), pero la maduración por afinidad también se puede imitar in vitro mediante la construcción y reselección de bibliotecas secundarias, tal como se describe en Winter et al. (1994), supra. Por ejemplo, la mutación se puede introducir al azar in vitro usando polimerasa propensa a errores (reportada en Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989)) en el procedimiento de Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992) o en el procedimiento de Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3576 - 3580 (1992). Además, la maduración por afinidad se puede realizar mutando aleatoriamente una o más CDR, por ejemplo, usando PCR con cebadores que llevan una secuencia aleatoria que abarca la CDR de interés, en clones de Fv individuales seleccionados y cribando clones de mayor afinidad. El documento WO 9607754 (publicado el 14 de marzo de 1996) describió un procedimiento para inducir mutagénesis en una región determinante de complementariedad de una cadena ligera de inmunoglobulina para crear una biblioteca de genes de cadena ligera. Otro enfoque eficaz es recombinar los dominios VH o VL seleccionados por presentación de fagos con repertorios de variantes de dominio V de origen natural obtenidas de donantes no inmunizados y cribar para una mayor afinidad en varias rondas de reorganización de cadenas, tal como se describe en Marks et al., Biotechnol., 10 : 779 - 783 (1992). Esta técnica permite la producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos con afinidades en el rango de 10-9 M.

Otros procedimientos de generación de anticuerpos anti-SSEA-4

[0149] Otros procedimientos de producción y evaluación de la afinidad de anticuerpos son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Kohler et al, Nature 256:. 495 (1975); Patente de Estados Unidos N° 4.816.567; Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, págs. 59-103 (Academic Press, 1986; Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987; Munson et al., Anal. Biochem., 107: 220 (1980); Engels et al., Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., 28: 716-734 (1989); Abrahmsen et al., EMBO J., 4: 3901 (1985); Methods in Enzymology, vol. 44 (1976); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984).

Procedimientos generales

[0150] La generación de anticuerpos puede lograrse usando capacidades de rutina en la técnica, incluidas las descritas en el presente documento, tales como la técnica de hibridoma y el cribado de bibliotecas de moléculas de unión presentadas en fagos. Estos procedimientos están bien establecidos en la técnica.

[0151] Brevemente, los anticuerpos anti-SSEA-4 de la invención se pueden preparar usando bibliotecas combinatorias para cribar clones de anticuerpos sintéticos con la actividad o actividades deseadas. En principio, los clones de anticuerpos sintéticos se seleccionan cribando bibliotecas de fagos que contienen fagos que presentan varios fragmentos de la región variable del anticuerpo (Fv) fusionados con la proteína de la cubierta del fago. Dichas bibliotecas de fagos se criban mediante cromatografía de afinidad contra el antígeno deseado. Los clones que expresan fragmentos Fv capaces de unirse al antígeno deseado se adsorben en el antígeno y, por tanto, se separan de los clones que no se unen en la biblioteca. A continuación, los clones de unión se eluyen del antígeno y pueden enriquecerse más mediante ciclos adicionales de adsorción/elución de antígenos. Cualquiera de los anticuerpos anti-SSEA-4 de la invención puede obtenerse diseñando un procedimiento de cribado de antígenos adecuado para seleccionar el clon de fago de interés seguido de la construcción de un clon de anticuerpo anti-SSEA-4 de longitud completa utilizando las secuencias Fv del clon de fago de interés y secuencias de región constante (Fc) adecuadas descritas en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Publicación NIH 91-3242, Bethesda Md. (1991), vols. 1-3.

[0152] Los anticuerpos anti-SSEA-4 de la invención son monoclonales. También se incluyen dentro del alcance de la invención los fragmentos de anticuerpos tales como los fragmentos Fab, Fab ', Fab'-SH y F(ab')2, y variaciones de los mismos, de los anticuerpos anti-SSEA-4 proporcionados en este documento. Estos fragmentos de anticuerpos pueden crearse por medios tradicionales, tales como la digestión enzimática, o pueden generarse mediante técnicas recombinantes. Dichos fragmentos de anticuerpos pueden ser quiméricos, humanos o humanizados. Estos fragmentos son útiles para los fines experimentales, de diagnóstico y terapéuticos establecidos en el presente documento.

[0153] Los anticuerpos monoclonales se pueden obtener a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que no es una mezcla de anticuerpos discretos.

[0154] Los anticuerpos monoclonales anti-SSEA-4 de la invención se pueden fabricar usando una variedad de procedimientos conocidos en la técnica, incluyendo el procedimiento del hibridoma descrito primero por Kohler et al, Nature, 256:. 495 (1975), o alternativamente pueden prepararse mediante procedimientos de ADN recombinante (por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 4.816.567).

Vectores, células huésped y procedimientos recombinantes

[0155] Para la producción recombinante de un anticuerpo de la invención, el ácido nucleico que lo codifica se aísla y se inserta en un vector replicable para clonación adicional (amplificación del ADN) o para expresión. El ADN que codifica el anticuerpo se aísla y secuencia fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo). Hay muchos vectores disponibles. La elección del vector depende en parte de la célula huésped que se utilice. Las células huésped incluyen, pero no se limitan a, células de origen procariótico o eucariótico (generalmente de mamífero). Se entenderá que las regiones constantes de cualquier isotipo se pueden usar para este propósito, incluidas las regiones constantes de IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, y que dichas regiones constantes se pueden obtener de cualquier especie humana o animal.

Generación de anticuerpos utilizando células huésped procariotas

Construcción de vector

[0156] Las secuencias de polinucleótidos que codifican componentes polipeptídicos del anticuerpo de la invención pueden obtenerse usando técnicas recombinantes estándar. Las secuencias de polinucleótidos deseadas pueden aislarse y secuenciarse a partir de células productoras de anticuerpos, tales como células de hibridoma. Alternativamente, los polinucleótidos se pueden sintetizar usando un sintetizador de nucleótidos o técnicas de PCR. Una vez obtenidas, las secuencias que codifican los polipéptidos se insertan en un vector recombinante capaz de replicar y expresar polinucleótidos heterólogos en huéspedes procarióticos. Se pueden usar muchos vectores disponibles y conocidos en la técnica para el propósito de la presente invención. La selección de un vector apropiado dependerá principalmente del tamaño de los ácidos nucleicos que se insertarán en el vector y de la célula huésped particular que se transformará con el vector. Cada vector contiene varios componentes, dependiendo de su función (amplificación o expresión de polinucleótidos heterólogos, o ambos) y su compatibilidad con la célula huésped particular en la que reside. Los componentes del vector generalmente incluyen, pero no se limitan a: un origen de replicación, un gen marcador de selección, un promotor, un sitio de unión al ribosoma (RBS), una secuencia señal, el inserto de ácido nucleico heterólogo y una secuencia de terminación de la transcripción.

[0157] En general, los vectores plasmídicos que contienen replicones y secuencias de control que se derivan de especies compatibles con la célula huésped se utilizan en relación con estos huéspedes. El vector normalmente contiene un sitio de replicación, así como secuencias marcadoras que son capaces de proporcionar una selección fenotípica en células transformadas. Por ejemplo, E. coli se transforma típicamente usando pBR322, un plásmido derivado de una especie de E. coli. pBR322 contiene genes que codifican la resistencia a ampicilina (Amp) y tetraciclina (Tet) y, por tanto, proporciona un medio sencillo para identificar células transformadas. El pBR322, sus derivados u otros plásmidos microbianos o bacteriófagos también pueden contener, o modificarse para contener, promotores que pueden ser utilizados por el organismo microbiano para la expresión de proteínas endógenas. Los ejemplos de derivados de pBR322 usados para la expresión de anticuerpos particulares se describen en detalle en Carter et al., Patente de Estados Unidos N° 5.648.237.

[0158] Además, los vectores de fago que contienen secuencias de replicón y de control que son compatibles con el microorganismo huésped se pueden utilizar como vectores transformantes en relación con estos huéspedes. Por ejemplo, se puede utilizar un bacteriófago tal como AGEM™ -11 para preparar un vector recombinante que se puede utilizar para transformar células huéspedes susceptibles tales como E. coli LE392.

[0159] El vector de expresión puede comprender dos o más pares de promotor-cistrón, que codifican cada uno de los componentes polipeptídicos. Un promotor es una secuencia reguladora no traducida ubicada en dirección 5' (5') a un cistrón que modula su expresión. Los promotores procarióticos se clasifican típicamente en dos clases, inducibles y constitutivos. El promotor inducible es un promotor que inicia niveles aumentados de transcripción del cistrón bajo su control en respuesta a cambios en las condiciones del cultivo, por ejemplo, la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio de temperatura.

[0160] Un gran número de promotores reconocidos por una variedad de células huésped potenciales son bien conocidos. El promotor seleccionado puede unirse operativamente al ADN del cistrón que codifica la cadena ligera o pesada eliminando el promotor del ADN fuente mediante digestión con enzimas de restricción e insertando la secuencia del promotor aislada en el vector. Tanto la secuencia promotora nativa como muchos promotores heterólogos pueden usarse para dirigir la amplificación y/o expresión de los genes diana. Pueden utilizarse promotores heterólogos, ya que generalmente permiten una mayor transcripción y mayores rendimientos del gen diana expresado en comparación con el promotor del polipéptido diana nativo.

[0161] Los promotores adecuados para su uso con huéspedes procariotas incluyen el promotor PhoA, los sistemas promotores de p-galactamasa y lactosa, un sistema promotor de triptófano (trp) y promotores híbridos tales como el promotor tac o trc. Sin embargo, también son adecuados otros promotores que son funcionales en bacterias (tales como otros promotores bacterianos o de fagos conocidos). Sus secuencias de nucleótidos se han publicado, lo que permite a un experto ligarlos operativamente a cistrones que codifican las cadenas ligeras y pesadas diana (Siebenlist et al. (1980) Cell 20: 269) usando enlazadores o adaptadores para suministrar cualquier sitio de restricción requerido.

[0162] Cada cistrón dentro del vector recombinante comprende un componente de secuencia señal de secreción que dirige la translocación de los polipéptidos expresados a través de una membrana. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector o puede ser parte del ADN del polipéptido diana que se inserta en el vector. La secuencia señal seleccionada debe ser una que sea reconocida y procesada (es decir, escindida por una peptidasa señal) por la célula huésped. Para las células huésped procariotas que no reconocen y procesan las secuencias señal nativas a los polipéptidos heterólogos, la secuencia señal se sustituye por una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo que consiste en fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp o líderes de enterotoxina II estables al calor (STII), LamB, PhoE, PelB, OmpA y MBP. Las secuencias señal utilizadas en ambos cistrones del sistema de expresión pueden ser secuencias señal STII o variantes de las mismas.

[0163] La producción de las inmunoglobulinas puede tener lugar en el citoplasma de la célula huésped, y por lo tanto no requiere la presencia de secuencias señal de secreción dentro de cada cistrón. En ese sentido, las cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulinas se expresan, pliegan y ensamblan para formar inmunoglobulinas funcionales dentro del citoplasma. Ciertas cepas del huésped (por ejemplo, las cepas de E. coli trxB-) proporcionan condiciones de citoplasma que son favorables para la formación de enlaces disulfuro, lo que permite el plegamiento y ensamblaje adecuados de las subunidades de proteínas expresadas. Proba y Pluckthun Gene, 159: 203 (1995).

[0164] Los anticuerpos de la invención también se pueden producir mediante el uso de un sistema de expresión en el que la relación cuantitativa de los componentes del polipéptido expresado se puede modular con el fin de maximizar el rendimiento de los anticuerpos secretados y correctamente ensamblados de la invención. Tal modulación se logra al menos en parte modulando simultáneamente las fuerzas de traducción de los componentes polipeptídicos.

[0165] Una técnica para modular la fuerza de traducción se describe en Simmons et al., Patente de Estados Unidos N° 5.840.523. Utiliza variantes de la región de iniciación de la traducción (TIR) dentro de un cistrón. Para una TIR dada, se pueden crear una serie de variantes de secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos con un rango de fuerzas de traducción, proporcionando así un medio conveniente mediante el cual ajustar este factor para el nivel de expresión deseado de la cadena específica. Las variantes de TIR se pueden generar mediante técnicas de mutagénesis convencionales que dan como resultado cambios de codones que pueden alterar la secuencia de aminoácidos. Los cambios en la secuencia de nucleótidos pueden ser silenciosos. Las alteraciones en la TIR pueden incluir, por ejemplo, alteraciones en el número o espaciado de las secuencias de Shine-Dalgarno, junto con alteraciones en la secuencia señal. Un procedimiento para generar secuencias señal mutantes es la generación de un "banco de codones" al comienzo de una secuencia codificante que no cambia la secuencia de aminoácidos de la secuencia señal (es decir, los cambios son silenciosos). Esto se puede lograr cambiando la posición del tercer nucleótido de cada codón; además, algunos aminoácidos, tal como la leucina, la serina y la arginina, tienen múltiples primera y segunda posiciones que pueden agregar complejidad al fabricar el banco. Este procedimiento de mutagénesis se describe en detalle en Yansura et al. (1992) METHODS: A companion to Methods in Enzymol. 4: 151-158.

[0166] Un conjunto de vectores puede generarse con un rango de fuerzas de TIR para cada cistrón en el mismo. Este conjunto limitado proporciona una comparación de los niveles de expresión de cada cadena, así como el rendimiento de los productos de anticuerpos deseados en diversas combinaciones de fuerza de TIR. Las fuerzas de TIR se pueden determinar cuantificando el nivel de expresión de un gen indicador, tal como se describe en detalle en Simmons et al. Patente de Estados Unidos N° 5.840.523. Basándose en la comparación de la fuerza de traducción, se seleccionan las TIR individuales deseadas para combinarlos en las construcciones del vector de expresión.

[0167] Las células huésped procariotas adecuadas para expresar anticuerpos de la invención incluyen Archaebacteria y Eubacteria, tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos. Ejemplos de bacterias útiles incluyen Escherichia (por ejemplo, E. coli), Bacilli (por ejemplo, B. subtilis), Enterobacteria, especies de Pseudomonas (por ejemplo, P. aeruginosa), Salmonella typhimurium, Serratia marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla o Paracoccus. Pueden usarse células gram-negativas. Las células de E. coli pueden usarse como huéspedes. Ejemplos de cepas de E. coli incluyen la cepa W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, DC: American Society for Microbiology, 1987), págs. 1190-1219; ATCC Depósito No. 27,325) y sus derivados, incluidos cepa 33D3 que tiene el genotipo W3110 AfhuA (A tonA) ptr3 lac Iq lacL8 AompTA (nmpc-fepE) degP41 kanR (patente de Estados Unidos n° 5.639.635). También son adecuadas otras cepas y derivados de las mismas, tales como E. coli 294 (ATCC 31.446), E. coli B, E. coli A1776 (ATCC 31.537) y E. coli RV308 (ATCC 31.608). Estos ejemplos son ilustrativos más que limitantes. Los procedimientos para construir derivados de cualquiera de las bacterias mencionadas anteriormente que tienen genotipos definidos se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990). Generalmente es necesario seleccionar las bacterias apropiadas teniendo en cuenta la replicabilidad del replicón en las células de una bacteria. Por ejemplo, las especies de E. coli, Serratia o Salmonella pueden usarse adecuadamente como huésped cuando se usan plásmidos bien conocidos tales como pBR322, pBR325, pACYC177 o pKN410 para suministrar el replicón. Normalmente, la célula huésped debe secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticas, y los inhibidores de proteasa adicionales se pueden incorporar de manera deseable en el cultivo celular.

Producción de anticuerpos

[0168] Las células huésped se transforman con los vectores de expresión descritos anteriormente y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

[0169] Transformación significa introducir ADN en el huésped procariota de modo que el ADN sea replicable, ya sea como elemento extracromosómico o como integrante cromosómico. Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se realiza utilizando técnicas estándar apropiadas para tales células. El tratamiento con calcio que emplea cloruro de calcio se usa generalmente para células bacterianas que contienen barreras sustanciales de la pared celular. Otro procedimiento de transformación emplea polietilenglicol/DMSO. Otra técnica más utilizada es la electroporación.

[0170] Las células procariotas utilizadas para producir los polipéptidos de la invención se cultivan en medios conocidos en la técnica y adecuados para el cultivo de las células huésped seleccionadas. Los ejemplos de medios adecuados incluyen caldo de luria (LB) más los suplementos nutricionales necesarios. Los medios también pueden contener un agente de selección, elegido en base a la construcción del vector de expresión, para permitir selectivamente el crecimiento de células procariotas que contienen el vector de expresión. Por ejemplo, se añade ampicilina al medio para el crecimiento de células que expresan el gen resistente a ampicilina.

[0171] También se puede incluir cualquier suplemento necesario además de carbono, nitrógeno y fuentes de fosfato inorgánico en las concentraciones apropiadas introducidos solos o como una mezcla con otro suplemento o medio tal como una fuente de nitrógeno compleja. Opcionalmente, el medio de cultivo puede contener uno o más agentes reductores seleccionados del grupo que consiste en glutatión, cisteína, cistamina, tioglicolato, ditioeritritol y ditiotreitol.

[0172] Las células huésped procariotas se cultivan a temperaturas adecuadas. Para el crecimiento de E. coli, por ejemplo, el crecimiento se produce en un intervalo de temperatura que incluye, pero no se limita a, de aproximadamente 20° C a aproximadamente 39° C, de aproximadamente 25° C a aproximadamente 37° C y aproximadamente a 30° C. El pH del medio puede ser cualquier pH en el intervalo de aproximadamente 5 a aproximadamente 9, dependiendo principalmente del organismo huésped. Para E. coli, el pH puede ser de aproximadamente 6,8 a aproximadamente 7,4, o aproximadamente 7,0.

[0173] Si se utiliza un promotor inducible en el vector de expresión, la expresión de la proteína se induce en condiciones adecuadas para la activación del promotor. Los promotores PhoA se utilizan para controlar la transcripción de los polipéptidos. Por consiguiente, las células huésped transformadas se cultivan en un medio limitante de fosfato para la inducción. El medio limitante de fosfato puede ser el medio C.R.A.P. (véase, por ejemplo, Simmons et al., J. Immunol.

Methods (2002), 263: 133-147). Se puede usar una variedad de otros inductores, de acuerdo con la construcción de vector empleada, tal como se conoce en la técnica.

[0174] Los polipéptidos expresados de la presente invención se secretan y recuperan del periplasma de las células huésped. La recuperación de proteínas implica típicamente alterar el microorganismo, generalmente por medios tales como choque osmótico, sonicación o lisis. Una vez que las células se rompen, los restos celulares o las células completas pueden extraerse mediante centrifugación o filtración. Las proteínas pueden purificarse adicionalmente, por ejemplo, mediante cromatografía de resina de afinidad. Alternativamente, las proteínas pueden transportarse al medio de cultivo y aislarse en el mismo. Las células se pueden extraer del cultivo y el sobrenadante del cultivo se puede filtrar y concentrar para una mayor purificación de las proteínas producidas. Los polipéptidos expresados pueden aislarse e identificarse adicionalmente usando procedimientos comúnmente conocidos, tales como electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) y ensayo de transferencia Western.

[0175] La producción de anticuerpos se lleva a cabo en grandes cantidades mediante un proceso de fermentación. Se encuentran disponibles varios procedimientos de fermentación por lotes alimentados a gran escala para la producción de proteínas recombinantes. Las fermentaciones a gran escala tienen al menos 1000 litros de capacidad, por ejemplo aproximdamente de 1000 a 100.000 litros de capacidad. Estos fermentadores utilizan impulsores agitadores para distribuir oxígeno y nutrientes, especialmente glucosa (una fuente común de carbono/energía). La fermentación a pequeña escala se refiere generalmente a la fermentación en un fermentador que no tiene más de aproximadamente 100 litros de capacidad volumétrica y puede variar entre aproximadamente 1 litro y aproximadamente 100 litros.

[0176] En un proceso de fermentación, la inducción de la expresión de proteínas se inicia típicamente después de que las células se han cultivado en condiciones adecuadas hasta una densidad deseada, por ejemplo, una DO550 de aproximadamente 180-220, en cuya fase las células están en la fase estacionaria temprana. Puede usarse una variedad de inductores, de acuerdo con la construcción de vector empleada, tal como se conoce en la técnica y se describe anteriormente. Las células pueden cultivarse durante períodos más cortos antes de la inducción. Las células se inducen habitualmente durante aproximadamente 12 a 50 horas, aunque se puede usar un tiempo de inducción más largo o más corto.

[0177] Para mejorar el rendimiento de producción y la calidad de los polipéptidos de la invención, se pueden modificar varias condiciones de fermentación. Por ejemplo, para mejorar el ensamblaje y plegamiento adecuados de los polipéptidos de anticuerpo secretados, se pueden utilizar vectores adicionales que sobreexpresan proteínas chaperonas, tales como proteínas Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD o DsbG) o FkpA (una peptidilprolil cis, transisomerasa con actividad chaperona) para co-transformar las células procariotas del huésped. Se ha demostrado que las proteínas chaperonas facilitan el plegamiento y la solubilidad adecuados de las proteínas heterólogas producidas en las células huésped bacterianas. Chen et al. (1999) J Bio Chem 274: 19601-19605; Georgiou et al., Patente de Estados Unidos N° 6.083.715; Georgiou et al., Patente de Estados Unidos N° 6.027.888; Bothmann y Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275: 17100-17105; Ramm y Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275: 17106-17113; Arie et al. (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210.

[0178] Para minimizar la proteólisis de proteínas heterólogas expresadas (especialmente aquellas que son proteolíticamente sensibles), se pueden usar ciertas cepas del huésped deficientes de enzimas proteolíticas. Por ejemplo, las cepas de células huésped pueden modificarse para efectuar una mutación o mutaciones genéticas en los genes que codifican proteasas bacterianas conocidas, tales como Proteasa III, OmpT, DegP, Tsp, Proteasa I, Proteasa Mi, Proteasa V, Proteasa VI y combinaciones de las mismas. Algunas cepas de E. coli deficientes en proteasa están disponibles y se describen en, por ejemplo, Joly et al. (1998), supra; Georgiou et al., Patente de Estados Unidos N° 5.264.365; Georgiou et al., Patente de Estados Unidos N° 5.508.192; Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2: 63-72 (1996).

[0179] Las cepas de E. coli deficientes en enzimas proteolíticas y transformadas con plásmidos que sobreexpresan una o más proteínas chaperonas pueden usarse como células huésped en el sistema de expresión.

Purificación de anticuerpos

[0180 La proteína de anticuerpo producido en el presente documento puede purificarse adicionalmente para obtener preparaciones que son sustancialmente homogéneas para ensayos y usos. Pueden emplearse procedimientos estándar de purificación de proteínas conocidos en la técnica. Los siguientes procedimientos son ejemplos de procedimientos de purificación adecuados: fraccionamiento en columnas de inmunoafinidad o de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice o en una resina de intercambio catiónico, tal como DEAE, cromatoenfoque, SDS-PAGE, precipitación con sulfato de amonio, y filtración en gel usando, por ejemplo, Sephadex G-75.

[0181] La proteína A inmovilizada en una fase sólida se usa para la purificación por inmunoafinidad de los productos de anticuerpos de la invención. La proteína A es una proteína de pared celular de 41 kD de Staphylococcus aureas que se une con una alta afinidad a la región de Fc de los anticuerpos. Lindmark et al. (1983) J. Immunol. Meth. 62: 1­ 13. La fase sólida en la que se inmoviliza la proteína A puede ser una columna que comprende una superficie de vidrio o sílice, o una columna de vidrio de poro controlado o una columna de ácido silícico. En algunas aplicaciones, la columna se recubre con un reactivo, tal como glicerol, para posiblemente prevenir la adherencia inespecífica de contaminantes.

[0182] Como la primera etapa de purificación, la preparación derivada del cultivo celular, tal como se describe anteriormente, se puede aplicar sobre una proteína A inmovilizada en fase sólida para permitir la unión específica del anticuerpo de interés a la proteína A. La fase sólida a continuación se lavaría para eliminar contaminantes no unidos específicamente a la fase sólida. Finalmente, el anticuerpo de interés se recupera de la fase sólida mediante elución. Generación de anticuerpos utilizando células huésped eucariotas

[0183] Los componentes del vector generalmente incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de terminación de la transcripción.

(i) Componente de secuencia de señales

[0184] Un vector para el uso en una célula huésped eucariota también puede contener una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio de escisión específico en el extremo N-terminal de la proteína madura o polipéptido de interés. La secuencia señal heteróloga seleccionada generalmente es una que es reconocida y procesada (es decir, escindida por una peptidasa señal) por la célula huésped. En la expresión de células de mamíferos, están disponibles secuencias señal de mamíferos así como líderes secretores virales, por ejemplo, la señal gD de herpes simplex.

[0185] El ADN para dicha región precursora se liga en el marco de lectura al ADN que codifica el anticuerpo.

(ii) Origen de la replicación

[0186] Generalmente, no es necesario un componente de origen de replicación para vectores de expresión de mamíferos. Por ejemplo, el origen de SV40 puede usarse típicamente solo porque contiene el promotor temprano. (iii) Componente del gen de selección

[0187] Los vectores de expresión y clonación pueden contener un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan las deficiencias auxotróficas, cuando sea relevante, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles en medios complejos.

[0188] Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Aquellas células que se transforman con éxito con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia al fármaco y, por tanto, sobreviven al régimen de selección. Ejemplos de tal selección dominante usan los fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

[0189] Otro ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero son aquellos que permiten la identificación de células competentes para captar el ácido nucleico del anticuerpo, tal como DHFR, timidina quinasa, metalotioneína I y II (por ejemplo, genes de metalotioneína de primates), adenosina desaminasa, ornitina descarboxilasa, etc.

[0190] Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección de DHFR pueden ser identificadas primero mediante el cultivo de todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de DHFR. Las células huésped apropiadas cuando se emplea DHFR de tipo salvaje incluyen, por ejemplo, la línea celular de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad DHFR (por ejemplo, ATCC CRL-9096).

[0191] Alternativamente, las células huésped (particularmente huéspedes de tipo salvaje que contienen DHFR endógeno) transformadas o cotransformadas con secuencias de ADN que codifican un anticuerpo, proteína DHFR de tipo salvaje, y otro marcador seleccionable, tal como la aminoglicósido 3' fosfotransferasa (APH), se pueden seleccionar por crecimiento celular en medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable, tal como un antibiótico aminoglucosídico, por ejemplo, kanamicina, neomicina o G418. Ver la Patente de Estados Unidos N° 4.965.199.

(iv) Componente promotor

[0192] Los vectores de expresión y clonación normalmente contienen un promotor que es reconocido por el organismo huésped y está operativamente unido al ácido nucleico que codifica un polipéptido de interés (por ejemplo, un anticuerpo). Las secuencias promotoras son conocidas para eucariotas. Prácticamente todos los genes eucariotas tienen una región rica en AT ubicada aproximadamente de 25 a 30 bases en dirección 5' del sitio donde se inicia la transcripción. Otra secuencia que se encuentra de 70 a 80 bases en dirección 5' desde el inicio de la transcripción de muchos genes es una región CNCAAT donde N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucariotas hay una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola poli A al extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias se insertan adecuadamente en vectores de expresión eucariotas.

[0193] La transcripción del polipéptido de anticuerpo a partir de vectores en células huésped de mamífero se puede controlar, por ejemplo, mediante promotores obtenidos de los genomas de virus, tales como el virus del polioma, virus de la viruela aviar, adenovirus (tal como Adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y virus de los simios 40 (SV40), de promotores de mamíferos heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, o de promotores de choque térmico, siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de células huésped.

[0194] Los promotores temprano y tardío del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción de SV40 que también contiene el origen de replicación viral de SV40. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción HindIII E. En la patente de Estados Unidos N° 4.419.446 se describe un sistema para expresar ADN en huéspedes de mamífero utilizadno el virus de papiloma bovino como vector. Una modificación de este sistema se describe en la patente de Estados Unidos N° 4.601.978. Véase también Reyes et al., Nature 297: 598-601 (1982) sobre la expresión de ADNc de interferón p humano en células de ratón bajo el control de un promotor de timidina quinasa del virus del herpes simple. Alternativamente, la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous se puede utilizar como promotor.

(v) Componente de elemento potenciador

[0195] La transcripción de ADN que codifica un polipéptido de anticuerpo de la invención por eucariotas superiores a menudo puede aumentarse insertando una secuencia de potenciador en el vector. Actualmente se conocen muchas secuencias de potenciadores de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína e insulina). Sin embargo, normalmente se utilizará un potenciador de un virus de células eucariotas. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pb 100-270), el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación y potenciadores de adenovirus. Véase también Yaniv, Nature 297: 17-18 (1982) sobre elementos potenciadores para la activación de promotores eucariotas. El potenciador puede empalmarse en el vector en una posición 5' o 3' de la secuencia que codifica el polipéptido del anticuerpo, pero generalmente está ubicado en un sitio 5' desde el promotor.

(vi) Componente de terminación de la transcripción

[0196] Los vectores de expresión usados en células huésped eucariotas normalmente también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Dichas secuencias están comúnmente disponibles a partir de las regiones no traducidas 5' y, ocasionalmente 3', de ADN o ADNc eucariotas o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte no traducida del ARNm que codifica un anticuerpo. Un componente de terminación de la transcripción útil es la región de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovino. Véase el documento WO94/11026 y el vector de expresión descrito en el mismo.

(vii) Selección y transformación de células huésped

[0197] Las células huésped adecuadas para clonar o expresar el ADN en los vectores del presente documento incluyen las células eucariotas superiores descritas en el presente documento, incluidas las células huéspedes de vertebrados. La propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejidos) se ha convertido en un procedimiento de rutina. Ejemplos de líneas celulares huésped de mamíferos útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 ATCC Cc L 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, At Cc c Rl-1587); células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA, ATCC CCL 2); células renales caninas (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, a Tc C CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); Células TRI (Mather et al., Annals NY Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); Células MRC 5; Células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2).

[0198] Las células huésped se transforman con los vectores de clonación o expresión descritos anteriormente para la producción de anticuerpos y se cultivan en un medio nutritivo convencional modificado según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

(viii) Cultivo de las células huésped

[0199] Las células huésped utilizadas para producir un anticuerpo de esta invención pueden cultivarse en una variedad de medios. Los medios disponibles comercialmente, tales como F10 de Ham (Sigma), Medio Mínimo Esencial ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y medio de Eagle modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) son adecuados para cultivar las células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), Patentes de Estados Unidos Nos. 4.767.704, 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; o 5.122.469; WO 90/03430; WO 87/00195; o la Patente de Estados Unidos Re.30,985, se pueden utilizar como medio de cultivo para las células huésped. Culquiera de estos medios se pueden complementar, según sea necesario, con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como el fármaco GENTAMYCIN™), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos normalmente presentes en concentraciones finales en el rango micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. También se puede incluir cualquier otro complemento necesario en concentraciones apropiadas que serían conocidas por los expertos en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son las utilizadas previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión, y resultarán evidentes para el experto en la materia.

(ix) Purificación de anticuerpos

[0200] Cuando se utilizan técnicas recombinantes, el anticuerpo se puede producir intracelularmente, o se secreta directamente en el medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como primera etapa, los restos de partículas, ya sean células huésped o fragmentos lisados, generalmente se eliminan, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. Cuando el anticuerpo se secreta al medio, los sobrenadantes de tales sistemas de expresión generalmente se concentran primero usando un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Se puede incluir un inhibidor de proteasa, tal como PMSF, en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteólisis y se pueden incluir antibióticos para prevenir el crecimiento de contaminantes inesperados.

[0201] La composición de anticuerpo preparada a partir de las células se puede purificar usando, por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad una técnica de purificación generalmente aceptable. La idoneidad de los reactivos de afinidad, tales como la proteína A como ligando de afinidad depende de la especie y el isotipo de cualquier dominio de Fc de inmunoglobulina que esté presente en el anticuerpo. La proteína A se puede usar para purificar anticuerpos que se basan en cadenas pesadas y1, y2 o y4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para y3 humana (Guss et al., EMBO J. 5: 15671575 (1986)). La matriz a la que se une el ligando de afinidad suele ser agarosa, pero hay otras matrices disponibles. Las matrices mecánicamente estables, tales como el vidrio de poro controlado o el poli(estirendivinil)benceno, permiten velocidades de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos que los que se pueden lograr con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABX ™ (JT Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para la purificación. Otras técnicas para la purificación de proteínas, tales como el fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina, cromatografía SEPHAROSE ™ en una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna de ácido poliaspártico), cromatoenfoque, SDS-PAGE y precipitación con sulfato de amonio también están disponibles dependiendo del anticuerpo a recuperar.

[0202] Después de cualquier etapa o etapas de purificación preliminar, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y los contaminantes se puede someter a etapas de purificación adicionales, según sea necesario, por ejemplo mediante cromatografía de interacción hidrofóbica a pH bajo utilizando un tampón de elución a un pH entre aproximadamente 2,5-4,5, generalmente realizado a bajas concentraciones de sal (por ejemplo, de aproximadamente 0-0,25 M de sal).

[0203] Cabe señalar que, en general, las técnicas y metodologías para la preparación de anticuerpos para su uso en investigación, pruebas y uso clínico están bien establecidas en la técnica, de acuerdo con lo anterior y/o como se considere apropiado por un experto en la técnica para el anticuerpo particular de interés.

Ensayos de actividad

[0204] Los anticuerpos de la invención se pueden caracterizar por sus propiedades físicas/químicas y funciones biológicas mediante varios ensayos conocidos en la técnica.

[0205] Los anticuerpos purificados se pueden caracterizar además por una serie de ensayos que incluyen, pero no se limitan a, la secuenciación N-terminal, análisis de aminoácidos, exclusión por tamaño no desnaturalizante, cromatografía líquida de alta presión (HPLC), espectrometría de masas, cromatografía de intercambio iónico y digestión con papaína.

[0206] Cuando sea necesario, los anticuerpos se analizan por su actividad biológica. Los anticuerpos de la invención pueden analizarse para determinar su actividad de unión a antígenos. Los ensayos de unión a antígenos que se conocen en la técnica y que se pueden usar en el presente documento incluyen, sin limitación, cualquier ensayo de unión directa o competitiva que utilice técnicas tales como transferencias de Western, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), inmunoensayos en "sándwich", ensayos de inmunoprecipitación, ensayos de inmunoprecipitación, inmunoensayos fluorescentes e inmunoensayos de proteína A.

Fragmentos de anticuerpos

[0207] La presente invención abarca fragmentos de anticuerpos. En determinadas circunstancias, existen ventajas de utilizar fragmentos de anticuerpos, en lugar de anticuerpos completos. El tamaño más pequeño de los fragmentos permite una eliminación rápida y puede conducir a un mejor acceso a los tumores sólidos.

[0208] Se han desarrollado varias técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos se obtuvieron mediante digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992); y Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos ahora pueden ser producidos directamente por células huésped recombinantes. Los fragmentos de anticuerpos Fab, Fv y ScFv pueden expresarse y secretarse a partir de E. coli, lo que permite la fácil producción de grandes cantidades de estos fragmentos. Los fragmentos de anticuerpos pueden aislarse de las bibliotecas de fagos de anticuerpos discutidas anteriormente. Alternativamente, los fragmentos Fab'-SH pueden recuperarse directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). Según otro enfoque, se pueden aislar fragmentos F(ab')2 directamente del cultivo de células huésped recombinantes. En la patente de Estados Unidos N° 5.869.046 se describen fragmentos Fab y F(ab')2 con mayor semivida in vivo que comprende los residuos de epítopo de unión a receptor salvaje. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos resultarán evidentes para el médico experto. En otras realizaciones, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv de una sola cadena (scFv). Ver WO 93/16185; Patente de Estados Unidos N° 5.571.894; y 5.587.458. Fv y sFv son las únicas especies con sitios de combinación intactos que carecen de regiones constantes; por tanto, son adecuados para una unión inespecífica reducida durante el uso in vivo. Las proteínas de fusión de sFv pueden construirse para producir la fusión de una proteína efectora en el extremo amino o carboxi terminal de un sFv. Véase Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra. El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo, tal como se describe en la patente de Estados Unidos N° 5.641.870, por ejemplo. Dichos fragmentos de anticuerpos lineales pueden ser monoespecíficos o biespecíficos.

Anticuerpos humanizados

[0209] La invención abarca anticuerpos humanizados. Se conocen en la técnica varios procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado puede tener uno o más residuos de aminoácidos introducidos en él de una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos se denominan a menudo residuos "importados", que normalmente se toman de un dominio variable "importado". La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores (Jones et al. (1986) Nature 321: 522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332: 323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239: 1534-1536), sustituyendo las secuencias de la región hipervariable por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente de Estados Unidos 567) en los que sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de la región hipervariable y posiblemente algunos residuos de FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores.

[0210] La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, que se utilizarán en la fabricación de anticuerpos humanizados puede ser importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el procedimiento denominado de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se criba frente a la biblioteca completa de secuencias conocidas de dominio variable humano. La secuencia humana más cercana a la del roedor se acepta entonces como estructura humana para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)). Otro procedimiento usa una región estructural particular derivada de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. La mismo estructura puede usarse para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 89: 4285 (1992); Prestaetal. J. Immnol. 151: 2623 (1993)).

[0211] Es además generalmente deseable que los anticuerpos se humanicen manteniendo una alta afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, de acuerdo con un procedimiento preferido, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y varios productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales están comúnmente disponibles y son familiares para los expertos en la técnica. Hay disponibles programas informáticos que ilustran y muestran probables estructuras conformacionales tridimensionales de secuencias de inmunoglobulinas candidatas seleccionadas. La inspección de estas presentaciones permite analizar el papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De esta forma, los residuos de FR pueden seleccionarse y combinarse a partir de las secuencias receptoras y de importación de modo que se logre la característica deseada del anticuerpo, tal como una mayor afinidad por el (los) antígeno(s) diana. En general, los residuos de la región hipervariable están directa y más sustancialmente implicados en influir en la unión del antígeno.

Anticuerpos humanos (que no forman parte de la presente invención)

[0212] Los anticuerpos humanos anti-SSEA-4 pueden construirse mediante la combinación de secuencias de dominios variables de clon de Fv a partir de bibliotecas de presentación en fagos derivadas de humanos con secuencias de dominio constante humanos conocidos, tal como se describió anteriormente. Alternativamente, pueden prepararse anticuerpos monoclonales humanos anti-SSEA-4 mediante el procedimiento del hibridoma. Las líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos han sido descritas, por ejemplo, por Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987); y Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).

[0213] Ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo ratones) que son capaces, tras inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigótica del gen de la región de unión de la cadena pesada (JH) del anticuerpo en ratones mutantes quiméricos y de la línea germinal da como resultado una inhibición completa de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia de la matriz de genes de inmunoglobulina de la línea germinal humana en tales ratones mutantes de la línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos tras la exposición al antígeno. Véase, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol., 7:33 (1993).

[0214] La mezcla de genes también puede usarse para derivar anticuerpos humanos a partir de anticuerpos no humanos, por ejemplo, de roedores, donde el anticuerpo humano tiene afinidades y especificidades similares al anticuerpo no humano de partida. De acuerdo con este procedimiento, que también se denomina "impresión de epítopo", la región variable de cadena pesada o ligera de un fragmento de anticuerpo no humano obtenido mediante técnicas de presentación en fagos como se describe anteriormente se reemplaza por un repertorio de genes de dominio V humanos, creando una población de quimeras scFv o Fab de cadena no humana/cadena humana. La selección con antígeno da como resultado el aislamiento de un scFv o Fab quimérico de cadena no humana/cadena humana en el que la cadena humana restaura el sitio de unión al antígeno destruido tras la eliminación de la cadena no humana correspondiente en el clon de presentación del fago primario, es decir el epítopo gobierna (imprime) la elección del socio de la cadena humana. Cuando se repite el proceso para reemplazar la cadena no humana restante, se obtiene un anticuerpo humano (ver PCT WO 93/06213 publicado el 1 de abril de 1993). A diferencia de la humanización tradicional de anticuerpos no humanos mediante injerto de CDR, esta técnica proporciona anticuerpos completamente humanos, que no tienen residuos de FR o CDR de origen no humano.

Anticuerpos biespecíficos (que no forman parte de la presente invención)

[0215] Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes. Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos humanos o humanizados. Una de las especificidades de unión es para SSEA-4 que incluye un enlace de lisina específico y la otra es para cualquier otro antígeno. Los anticuerpos biespecíficos pueden unirse a dos SSEA-4 diferentes que tienen dos enlaces lisina diferentes. Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')2).

[0216] Los procedimientos para fabricar anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesadacadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades (Milstein y Cuello, Nature, 305: 537 (1983)). Debido al surtido aleatorio de cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpos diferentes, de las cuales solo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que generalmente se realiza mediante etapas de cromatografía de afinidad, es bastante engorrosa y los rendimientos del producto son bajos. Se describen procedimientos similares en el documento WO 93/08829 publicado el 13 de mayo de 1993 y en Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655 (1991).

[0217] Los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) pueden fusionarse con secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión, por ejemplo, es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. La primera región constante de cadena pesada (CH1), que contiene el sitio necesario para la unión a la cadena ligera, puede estar presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de la cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se cotransfectan en un organismo huésped adecuado. Esto proporciona una gran flexibilidad para ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos polipeptídicos cuando las proporciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas utilizadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias de codificación para dos o las tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas en proporciones iguales da lugar a rendimientos altos o cuando las proporciones no son de particular importancia.

[0218] Los anticuerpos biespecíficos pueden estar compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se encontró que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones de cadenas de inmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en sólo la mitad de la molécula biespecífica proporciona una forma fácil de separación. Este enfoque se describe en el documento WO 94/04690. Para obtener más detalles sobre la generación de anticuerpos biespecíficos, véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).

[0219] Según otro enfoque, la interfase entre un par de moléculas de anticuerpo puede manipularse para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo de células recombinantes. La interfase comprende al menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este procedimiento, una o más cadenas laterales pequeñas de aminoácidos de la interfase de la primera molécula de anticuerpo se reemplazan por cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la(s) cadena(s) laterale(s) grande(s) en la interfase de la segunda molécula de anticuerpo reemplazando las cadenas laterales grandes de aminoácidos por otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos finales no deseados, como los homodímeros.

[0220] Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos "heteroconjugados" o reticulados. Por ejemplo, uno de los anticuerpos del heteroconjugado se puede acoplar a avidina y el otro a biotina. Se ha propuesto, por ejemplo, que tales anticuerpos dirijan células del sistema inmunológico a células no deseadas (patente de Estados Unidos n° 4.676.980) y para el tratamiento de la infección por VIH (WO 91/00360, WO 92/00373 y EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados se pueden preparar usando cualquier procedimiento de reticulación conveniente. Los agentes de reticulación adecuados son bien conocidos en la técnica y se describen en la patente de Estados Unidos N° 4.676.980, junto con varias técnicas de reticulación.

[0221] También se han descrito en la bibliografía técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos biespecíficos usando enlaces químicos. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) describen un procedimiento en el que los anticuerpos intactos se escinden proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente complejante de ditiol arsenito de sodio para estabilizar los ditioles vecinales y prevenir la formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados se convierten a continuación en derivados de tionitrobenzoato (TNB). A continuación, uno de los derivados de Fab'-TNB se reconvierte en Fab'-tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado de Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden usar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.

[0222] El reciente progreso ha facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab'-SH a partir de E. coli, que pueden acoplarse químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) describen la producción de una molécula F(ab')2 de anticuerpo biespecífico completamente humanizado. Cada fragmento Fab se secretó por separado de E. coli y se sometió a acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico así formado fue capaz de unirse a células que sobreexpresan el receptor HER2 y células T humanas normales, así como desencadenar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos contra dianas de tumores de mama humanos.

[0223] También se han descrito diversas técnicas para fabricar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente a partir de cultivos de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos utilizando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol., 148 (5): 1547-1553 (1992). Los péptidos de cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión de genes. Los homodímeros del anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y a continuación se volvieron a oxidar para formar los heterodímeros del anticuerpo. Este procedimiento también se puede utilizar para la producción de homodímeros de anticuerpos. La tecnología del "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) por un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios de la misma cadena. Por consiguiente, los dominios VH y VL de un fragmento se obligan a emparejarse con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, formando así dos sitios de unión al antígeno. También se ha informado de otra estrategia para preparar fragmentos de anticuerpos biespecíficos mediante el uso de dímeros de Fv de una sola cadena (sFv). Véase Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994).

[0224] Se contemplan los anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos específicos. Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).

Anticuerpos multivalentes (que no forman parte de la presente invención)

[0225] Un anticuerpo multivalente puede internalizarse (y/o catabolizarse) más rápido que un anticuerpo bivalente por una célula que expresa un antígeno al que se unen los anticuerpos. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos multivalentes (que no son de la clase IgM) con tres o más sitios de unión al antígeno (por ejemplo, anticuerpos tetravalentes), que pueden producirse fácilmente mediante la expresión recombinante de ácido nucleico que codifica las cadenas polipeptídicas del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerización y tres o más sitios de unión al antígeno. El dominio de dimerización comprende (o consiste en), por ejemplo, una región Fc o una región bisagra. En este escenario, el anticuerpo comprenderá una región Fc y tres o más sitios de unión de antígeno amino terminales a la región Fc. Un anticuerpo multivalente puede comprender (o consistir en), por ejemplo, de tres a aproximadamente ocho, o cuatro sitios de unión al antígeno. El anticuerpo multivalente comprende al menos una cadena polipeptídica (por ejemplo, dos cadenas polipeptídicas), en la que la cadena o cadenas polipeptídicas comprenden dos o más dominios variables. Por ejemplo, la cadena o cadenas polipeptídicas pueden comprender VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, donde VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, Fc es una cadena polipeptídica de una región Fc, X1 y X2 representan un aminoácido o polipéptido, y n es 0 o 1. Por ejemplo, la cadena o cadenas polipeptídicas pueden comprender: VH-CH1-enlazador flexible-VH-CH1-cadena de la región Fc; o VH-CH1-VH-CH1-cadena de la región Fc. El anticuerpo multivalente del presente documento puede comprender además al menos dos (por ejemplo, cuatro) polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. El anticuerpo multivalente del presente documento puede, por ejemplo, comprender de aproximadamente dos a aproximadamente ocho polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. Los polipéptidos de dominio variable de cadena ligera contemplados aquí comprenden un dominio variable de cadena ligera y, opcionalmente, comprenden además un dominio CL. Variantes de anticuerpos

[0226] Una modificación o modificaciones de la secuencia de aminoácido de los anticuerpos se describen en este documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo se preparan introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ácido nucleico del anticuerpo o mediante síntesis de péptidos. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones y/o inserciones y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Puede realizarse cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas. Las alteraciones de aminoácidos pueden introducirse en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo sujeto en el momento en que se fabrica la secuencia.

[0227] Un procedimiento útil para la identificación de ciertos residuos o regiones del anticuerpo que son ubicaciones preferidas para la mutagénesis se denomina "mutagénesis de barrido de alanina", tal como describe por Cunningham y Wells (1989) Science, 244: 1081-1085. Aquí, se identifica un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados, tales como Arg, Asp, His, Lys y Glu) y se reemplaza por un aminoácido neutro o cargado negativamente (por ejemplo, alanina o polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con antígeno. Aquellas ubicaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan a continuación introduciendo variantes adicionales u otras en, o para, los sitios de sustitución. Por tanto, aunque el sitio para introducir una variación de secuencia de aminoácidos está predeterminado, no es necesario que la naturaleza de la mutación per se esté predeterminada. Por ejemplo, para analizar el rendimiento de una mutación en un sitio determinado, se realiza el rastreo de alanina o mutagénesis aleatoria en el codón o región diana y las inmunoglobulinas expresadas se criban por la actividad deseada.

[0228] Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o carboxi terminales que varían en longitud desde un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuencia de residuos de aminoácidos individuales o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo N-terminal o el anticuerpo fusionado a un polipéptido citotóxico. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión al extremo N o C del anticuerpo con una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que aumenta la semivida en suero del anticuerpo.

[0229] Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácido. Estas variantes tienen al menos un residuo de aminoácido en la molécula de anticuerpo reemplazado por un residuo diferente. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis por sustitución incluyen las regiones hipervariables, pero también se contemplan alteraciones de FR. Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla A bajo el título de "sustituciones preferidas". Si tales sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, entonces se pueden introducir cambios más sustanciales, denominados "sustituciones de ejemplo" en la Tabla A, o como se describe adicionalmente a continuación en referencia a clases de aminoácidos, y se pueden seleccionar los productos.

TABLA A Sustituciones de residuos preferidas de ejemplo originales

Ala (A) Val; Leu; Ile Val

Arg(R) Lys; Gln; Asn Lys

Asn (N) Gln; Su; Asp, Lys; Arg Gln

Asp (d ) Glu; Asn Glu

Cys (c ) Ser; Ala Ser

Gln (Q) Asn; Glu Asn

Glu (e ) Asp; Gln Asp

Gly (G) Ala Ala

His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg

Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Leu

Phe; Norleucina

Leu (L) Norleucina; Ile; Val; Ile

Met; Ala; Phe

Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg

Met (M) Leu; Phe; Ile Leu

Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr

Pro (P) Ala Ala

Ser (S) Thr Thr

Thr (T) Val; Ser Ser

Trp (w ) Tyr; Phe Tyr

Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe

Val (V) Ile; Leu; Reunió; Phe; Leu

Ala; Norleucina

[0230] Las modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo se realizan mediante sustituciones de selección que difieren significativamente en su efecto de mantener (a) la estructura del esqueleto del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación en lámina o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) la mayor parte de la cadena lateral. Los aminoácidos pueden agruparse de acuerdo con las similitudes en las propiedades de sus cadenas laterales (en AL Lehninger, en Biochemistry, segunda ed., Págs. 73-75, Worth Publishers, Nueva York (1975)):

• (1) no polar: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)

• (2) polar no cargado: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (O)

• (3) ácido: Asp (D), Glu (E)

• (⁴ ) básico: Lys (K), Arg (R), His (H)

[0231] Alternativamente, los residuos de origen natural pueden dividirse en grupos basados en propiedades comunes de la cadena lateral:

(1) hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) ácidos: Asp, Glu;

(4) básicos: His, Lys, Arg;

(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;

(6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

[0232] Las sustituciones no conservativas implicarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase. Dichos residuos sustituidos también pueden introducirse en los sitios de sustitución conservativa o en los sitios restantes (no conservados).

[0233] Un tipo de variante de sustitución implica la sustitución de uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo parental (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). Generalmente, la(s) variante(s) resultante(s) seleccionada(s) para el desarrollo adicional tendrán propiedades biológicas modificadas (por ejemplo, mejoradas) en relación con el anticuerpo parental a partir del cual se generan. Una forma conveniente de generar tales variantes de sustitución implica la maduración por afinidad usando presentación de fagos. Brevemente, se mutan varios sitios de la región hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) para generar todas las posibles sustituciones de aminoácidos en cada sitio. Los anticuerpos así generados se presentan a partir de partículas de fagos filamentosos como fusiones a al menos parte de una proteína de la cubierta del fago (por ejemplo, el producto del gen III de M13) empaquetada dentro de cada partícula. Las variantes presentadas en fagos se criban a continuación para determinar su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) tal como se describe en el presente documento. Con el fin de identificar los sitios candidatos de la región hipervariable para la modificación, se puede realizar una mutagénesis de rastreo (por ejemplo, rastreo de alanina) para identificar los residuos de la región hipervariable que contribuyen significativamente a la unión del antígeno. Alternativamente, o adicionalmente, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Dichos residuos de contacto y residuos vecinos son candidatos para la sustitución de acuerdo con técnicas conocidas en el sector, incluidas las elaboradas en el presente documento. Una vez que se generan tales variantes, el panel de variantes se somete a cribado utilizando técnicas conocidas en el sector, incluidas las descritas en el presente documento, y se pueden seleccionar anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes para desarrollo posterior.

[0234] Las moléculas de ácido nucleico que codifican las variantes de secuencia de aminoácidos del anticuerpo se preparan mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia de aminoácidos de origen natural) o preparación mediante mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida al sitio), mutagénesis por PCR y mutagénesis en casete de una variante preparada anteriormente o una versión no variante del anticuerpo.

[0235] Puede ser deseable introducir una o más modificaciones de aminoácidos en una región de Fc de anticuerpos de la invención, generando de este modo una variante de la región de Fc. La variante de la región de Fc puede comprender una secuencia de la región de Fc humana (por ejemplo, una región de Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprende una modificación de aminoácidos (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones de aminoácidos que incluyen la de una cisteína bisagra.

Inmunoconjugados

[0236] En otro aspecto, la invención proporciona inmunoconjugados o conjugados anticuerpo-fármaco (ADC), que comprenden un anticuerpo conjugado a un agente citotóxico, tal como un agente quimioterapéutico, un fármaco, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado).

[0237] El uso de conjugados anticuerpo-fármaco para la administración local de agentes citotóxicos o citostáticos, es decir, fármacos que destruyen o inhiben células tumorales en el tratamiento del cáncer (Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172; Patente de Estados Unidos No. 4,975,278) permite la administración dirigida de los grupos farmacológicos a los tumores, y la acumulación intracelular en los mismos, donde la administración sistémica de estos agentes farmacológicos no conjugados pueden dar lugar a niveles inaceptables de toxicidad en células normales, así como en las células tumorales que se busca eliminar (Baldwin et al., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (ed.s), pág. 475-506). De este modo se busca la máxima eficacia con una mínima toxicidad. Se ha informado que tanto los anticuerpos policlonales como los anticuerpos monoclonales son útiles en estas estrategias (Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21: 183-87). Los fármacos usados en estos procedimientos incluyen daunomicina, doxorrubicina, metotrexato y vindesina (Rowland et al., (1986) supra). Las toxinas utilizadas en los conjugados anticuerpo-toxina incluyen toxinas bacterianas, tales como la toxina de la difteria, toxinas vegetales, tales como la ricina, toxinas de moléculas pequeñas, tales como la geldanamicina (Mandler et al (2000) Jour. Of the Nat. Cancer Inst. 92 (19): 1573- 1581; Mandler et al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13: 786-791), maitansinoides (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8618-8623) y caliqueamicina (Lode et al. (1998) Cancer Res. 58: 2928; Hinman et al. (1993) Cancer Res. 53: 3336-3342). Las toxinas pueden realizar sus efectos citotóxicos y citostáticos mediante mecanismos que incluyen la unión a tubutina, unión al ADN o inhibición de la topoisomerasa. Algunos fármacos citotóxicos tienden a ser inactivos o menos activos cuando se conjugan con anticuerpos o ligandos de receptores de proteínas grandes.

Derivados de anticuerpos

[0238] Los anticuerpos de la invención pueden modificarse adicionalmente para contener restos no proteicos adicionales que se conocen en la técnica y están fácilmente disponibles. En una realización, los restos adecuados para la derivatización del anticuerpo son polímeros solubles en agua. Los ejemplos no limitantes de polímeros solubles en agua incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o copolímeros aleatorios) y dextrano o poli (n-vinil pirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de óxido de prolipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), alcohol polivinílico y mezclas de los mismos. El propionaldehído de polietilenglicol puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede tener cualquier peso molecular y puede estar ramificado o no ramificado. El número de polímeros unidos al anticuerpo puede variar, y si se une más de un polímero, los polímeros pueden ser moléculas iguales o diferentes. En general, el número y/o tipo de polímeros usados para la derivatización se puede determinar basándose en consideraciones que incluyen, pero no se limitan a, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo que se va a mejorar, si el derivado del anticuerpo se usará en una terapia bajo condiciones definidas, etc.

[0239] En otra realización, se proporcionan conjugados de un anticuerpo y un resto no proteico que se puede calentar de forma selectiva por la exposición a la radiación. En una realización, el resto no proteico es un nanotubo de carbono (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 102: 11600-11605 (2005)). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda e incluye, pero no se limita a, longitudes de onda que no dañan las células ordinarias, pero que calientan el resto no proteico a una temperatura a la que mueren las células próximas al resto no proteico del anticuerpo.

Formulaciones farmacéuticas

[0240] Las formulaciones terapéuticas que comprenden un anticuerpo de la invención se preparan para el almacenamiento mezclando el anticuerpo que tiene el grado de pureza deseado con portadores, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A.

Ed. (1980)), en en forma de soluciones acuosas, formulaciones liofilizadas u otras formulaciones secas. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato, histidina y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Znproteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG).

[0241] La formulación en este documento también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que está siendo tratada, incluyendo, pero no limitado a, aquellos con actividades complementarias que no afectan adversamente entre sí. Tales moléculas están presentes de forma adecuada en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido.

[0242] Los ingredientes activos también pueden atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsula de gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de liberación de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980).

[0243] Las formulaciones a utilizar para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.

[0244] Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen la inmunoglobulina de la invención, cuyas matrices están en forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (metacrilato de 2-hidroxietilo) o poli (alcohol vinílico)), polilactidas (patente de Estados Unidos No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y y-etil-L-glutamato, copolímeros de etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables, tales como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Aunque los polímeros como el etileno-acetato de vinilo y el ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos de tiempo más cortos. Cuando las inmunoglobulinas encapsuladas permanecen en el cuerpo durante un tiempo prolongado, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a la humedad a 37° C, dando como resultado una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Se pueden diseñar estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo involucrado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces S-S intermoleculares a través del intercambio de tio-disulfuro, la estabilización se puede lograr modificando los residuos de sulfhidrilo, liofilizando a partir de soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos apropiados y desarrollando composiciones de matriz polimérica específicas.

Usos

[0245] Los anticuerpos de la invención se usan para el tratamiento del cáncer.

[0246] El anticuerpo de la invención es específico para SSEA-4.

[0247] En ciertas realizaciones, un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo de la invención conjugado con un agente citotóxico se administra al paciente. En algunas realizaciones, el inmunoconjugado y/o antígeno al que está unido es internalizado por células que expresan una o más proteínas en su superficie celular que están asociadas con SSEA-4, lo que da como resultado una mayor eficacia terapéutica del inmunoconjugado para matar la célula diana con la se asocia. En una realización, el agente citotóxico se dirige a o interfiere con el ácido nucleico en la célula diana. Los ejemplos de dichos agentes citotóxicos incluyen cualquiera de los agentes quimioterapéuticos indicados en este documento (como un maitansinoide o una caliqueamicina), un isótopo radiactivo o una ribonucleasa o una ADN endonucleasa.

[0248] Los anticuerpos de la invención se pueden usar solos o en combinación con otras composiciones en una terapia. Por ejemplo, un anticuerpo de la invención puede coadministrarse con otro anticuerpo y/o agentes adyuvantes/terapéuticos (por ejemplo, esteroides). Por ejemplo, un anticuerpo de la invención puede combinarse con un antiinflamatorio y/o antiséptico en un esquema de tratamiento, por ejemplo, en el tratamiento de cualquiera de las enfermedades descritas en este documento, incluyendo cáncer, trastornos musculares, trastornos genéticos relacionados con la vía de la ubiquitina, trastornos inmunes/inflamatorios, trastornos neurológicos y otros trastornos relacionados con la vía de la ubiquitina. Dichas terapias combinadas indicadas anteriormente incluyen la administración combinada (donde los dos o más agentes se incluyen en la misma formulación o en formulaciones separadas) y la administración separada, en cuyo caso, la administración del anticuerpo de la invención puede tener lugar antes, y/o después de, la administración de la terapia o terapias adyuvantes.

[0249] Un anticuerpo de la invención (y el agente terapéutico adyuvante) se puede administrar mediante cualquier medio adecuado, incluyendo parenteral, subcutánea, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal, y, si se desea, para el tratamiento local, la administración intralesional. Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. Además, el anticuerpo se administra adecuadamente mediante infusión por pulsos, particularmente con dosis decrecientes del anticuerpo. La dosificación puede ser por cualquier vía adecuada, por ejemplo, mediante inyecciones, como inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica.

[0250] La ubicación de la diana de unión de un anticuerpo de la invención puede tenerse en cuenta en la preparación y administración del anticuerpo. Cuando la diana de unión es una molécula intracelular, ciertas realizaciones de la invención prevén que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se introduzca en la célula donde se encuentra la diana de unión. En una realización, un anticuerpo de la invención puede expresarse intracelularmente como un intracuerpo. El término "intracuerpo", como se usa en este documento, se refiere a un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo que se expresa intracelularmente y que es capaz de unirse selectivamente a una molécula diana, tal como se describe en Marasco, Gene Therapy 4: 11-15 (1997); Kontermann, Methods 34: 163­ 170 (2004); Patentes de Estados Unidos Nos. 6.004.940 y 6.329.173; Publicación de solicitud de patente de Estados Unidos No. 2003/0104402, y Publicación PCT No. WO2003/077945. La expresión intracelular de un intracuerpo se efectúa mediante la introducción de un ácido nucleico que codifica el anticuerpo deseado o la porción de unión al antígeno del mismo (que carece de la secuencia líder de tipo salvaje y las señales secretoras normalmente asociadas con el gen que codifica ese anticuerpo o fragmento de unión al antígeno) en una célula diana. Se puede usar cualquier procedimiento estándar de introducción de ácidos nucleicos en una célula, incluidos, pero sin limitación, microinyección, inyección balística, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, liposomas y transfección con vectores retrovirales, adenovirales, virales adenoasociados y vaccinia que llevan el ácido nucleico de interés. Uno o más ácidos nucleicos que codifican todo o una parte de un anticuerpo anti-SSEA-4 de la invención pueden administrarse a una célula diana, de manera que se expresan uno o más intracuerpos que son capaces de unirse intracelularmente a un SSEA-4 y la modulación de uno o más mecanismos celulares mediados por SSEA-4.

[0251] Los anticuerpos pueden poseer ciertas características que mejoran el suministro de anticuerpos a las células, o pueden modificarse para poseer tales características. Las técnicas para lograr esto se conocen en la técnica. Por ejemplo, se sabe que la cationización de un anticuerpo facilita su captación en las células (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos No. 6.703.019). También se pueden usar lipofecciones o liposomas para suministrar el anticuerpo a las células. Cuando se utilizan fragmentos de anticuerpos, el fragmento inhibidor más pequeño que se une específicamente al dominio de unión de la proteína diana generalmente es ventajoso. Por ejemplo, basándose en las secuencias de la región variable de un anticuerpo, se pueden diseñar moléculas de péptidos que retengan la capacidad de unirse a la secuencia de la proteína diana. Dichos péptidos pueden sintetizarse químicamente y/o producirse mediante tecnología de ADN recombinante. Véase, por ejemplo, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. u Sa , 90: 7889 -7893 (1993).

[0252] La entrada de polipéptidos moduladores en las células diana se puede potenciar mediante procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, ciertas secuencias, como las derivadas de Tat del VIH o la proteína del homeodominio de Antennapedia, son capaces de dirigir la captación eficaz de proteínas heterólogas a través de las membranas celulares. Véase, por ejemplo, Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. u Sa (1999), 96: 4325-4329.

[0253] Cuando la diana de unión se encuentra en el cerebro, ciertas realizaciones de la invención prevén que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo atraviese la barrera hematoencefálica de unión al antígeno. Ciertas enfermedades neurodegenerativas están asociadas con un aumento de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica, de modo que el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno se puede introducir fácilmente en el cerebro. Cuando la barrera hematoencefálica permanece intacta, existen varios enfoques conocidos en la técnica para transportar moléculas a través de ella, incluidos, pero sin limitación, procedimientos físicos, procedimientos basados en lípidos y procedimientos basados en receptores y canales.

[0254] Los procedimientos físicos para transportar el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno a través de la barrera hematoencefálica incluyen, pero no se limitan a, sortear completamente la barrera hematoencefálica o crear aberturas en la barrera hematoencefálica. Los procedimientos de elusión incluyen, pero no se limitan a, inyección directa en el cerebro (ver, por ejemplo, Papanastassiou et al., Gene Therapy 9: 398-406 (2002)), administración mejorada por infusión intersticial/convección (ver, por ejemplo, Bobo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2076-2080 (1994)), e implantar un dispositivo de administración en el cerebro (véase, por ejemplo, Gill et al., Nature Med. 9: 589­ 595 (2003); y Gliadel Wafers ™ , Guildford Pharmaceutical). Los procedimientos para crear aberturas en la barrera incluyen, pero no se limitan a, ultrasonido (ver, por ejemplo, la publicación de Patente de los Estados Unidos No.

2002/0038086), presión osmótica (por ejemplo, mediante administración de manitol hipertónico (Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 & 2, Plenum Press, N.Y. (1989))), permeabilización mediante, por ejemplo, bradiquinina o permabilizador A-7 (véase, por ejemplo, patentes de Estados Unidos Nos.

5,112,596, 5,268,164, 5,506,206, y 5,686,416), y la transfección de neuronas que evita la barrera hematoencefálica con vectores que contienen genes que codifican el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno (véase, por ejemplo, la publicación de patente de Estados Unidos No. 2003/0083299).

[0255] Los procedimientos basados en lípidos para transportar el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno a través de la barrera hematoencefálica incluyen, pero no se limitan a, encapsular el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno en liposomas que están acoplados a fragmentos de unión de anticuerpos que se unen a receptores en el endotelio vascular de la barrera hematoencefálica (ver, por ejemplo, publicación de solicitud de patente de Estados Unidos No. 20020025313), y y recubrir el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno en partículas de lipoproteína de baja densidad (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos No. 20040204354) o apolipoproteína E (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos No. 20040131692).

[0256] Los procedimientos basados en receptor y canal de transporte del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno a través de la barrera hematoencefálica incluyen, pero no se limitan a, el uso de bloqueadores de glucocorticoides para aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica (véase, por ejemplo, publicaciones de solicitudes de Patente de Estados Unidos Nos. 2002/0065259, 2003/0162695 y 2005/0124533); activar los canales de potasio (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos No. 2005/0089473), inhibir los transportadores de fármacos ABC (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos No.

2003/0073713); recubrir los anticuerpos con una transferrina y modular la actividad de uno o más receptores de transferrina (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos No. 2003/0129186), y cationizar los anticuerpos (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos No. 5.004.697).

[0257] La composición de anticuerpos de la invención se formularía, dosificaría y administraría de una manera coherente con las buenas prácticas médicas. Los factores a considerar en este contexto incluyen el trastorno particular que se está tratando, el mamífero particular que se está tratando, la condición clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el punto de administración del agente, el procedimiento de administración, el programa de administración. y otros factores conocidos por los médicos. No es necesario, pero opcionalmente el anticuerpo está formulado con uno o más agentes utilizados actualmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad eficaz de tales otros agentes depende de la cantidad de anticuerpos de la invención presentes en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento y otros factores discutidos anteriormente. Estos se utilizan generalmente en las mismas dosis y con las rutas de administración descritas en este documento, o de aproximadamente el 1 al 99% de las dosis descritas en el presente documento, o en cualquier dosis y cualquier ruta que se determine empíricamente/clínicamente como apropiada.

[0258] Para la prevención o el tratamiento de una enfermedad, la dosis apropiada de un anticuerpo de la invención (cuando se usa solo o en combinación con otros agentes, tales como agentes quimioterapéuticos) dependerá del tipo de enfermedad a tratar, el tipo de anticuerpo, la gravedad y curso de la enfermedad, ya sea que el anticuerpo se administre con fines preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia clínica del paciente y la respuesta al anticuerpo, y la discreción del médico tratante. El anticuerpo se administra de forma adecuada al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y la gravedad de la enfermedad, de aproximadamente 1 |jg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,1 mg/kg-10 mg/kg) de anticuerpo puede ser una dosis candidata inicial para la administración al paciente, ya sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones independientes, o por infusión continua. Una dosis diaria típica puede oscilar entre aproximadamente 1 jg/kg y 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento generalmente se mantendría hasta que se produzca la supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Una dosis de ejemplo del anticuerpo estaría en el intervalo de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. Por tanto, se pueden administrar al paciente una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de los mismos). Dichas dosis se pueden administrar de forma intermitente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de modo que el paciente reciba de aproximadamente dos a aproximadamente veinte, o por ejemplo, aproximadamente seis dosis del anticuerpo). Se puede administrar una dosis de carga inicial más alta, seguida de una o más dosis más bajas. Un régimen de dosificación de ejemplo comprende administrar una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg, seguida de una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 2 mg/kg del anticuerpo. Sin embargo, pueden resultar útiles otros regímenes de dosificación. El progreso de esta terapia se controla fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales.

Artículos de fabricación (que no forman parte de la presente invención)

[0259] Se describe un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto sobre el recipiente o asociado con el mismo. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, etc. Los recipientes se pueden formar a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es por sí misma o cuando se combina con otra composición eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable con una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo de la invención. La etiqueta o el prospecto indica que la composición se usa para tratar la afección elegida. Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un anticuerpo de la invención; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un agente citotóxico o, en cualquiera caso, terapéutico adicional. El artículo de fabricación puede comprender además un prospecto que indique que las composiciones se pueden usar para tratar una afección particular. Alternativa o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

[0260] En determinadas realizaciones, el sujeto que se está tratando es un mamífero. En determinadas realizaciones, el sujeto es un ser humano. En determinadas realizaciones, el sujeto es un animal domesticado, tal como un perro, gato, vaca, cerdo, caballo, oveja o cabra. En determinadas realizaciones, el sujeto es un animal de compañía, tal como un perro o un gato. En determinadas realizaciones, el sujeto es un animal de ganado, tal como una vaca, un cerdo, un caballo, una oveja o una cabra. En determinadas realizaciones, el sujeto es un animal de zoológico. En otra realización, el sujeto es un animal de investigación, tal como un roedor, un perro o un primate no humano. En determinadas realizaciones, el sujeto es un animal transgénico no humano, tal como un ratón transgénico o un cerdo transgénico.

Composiciones y formulaciones farmacéuticas

[0261] Después de la preparación de los anticuerpos, tal como se describe en el presente documento, se puede producir una "formulación preliofilizada". El anticuerpo para preparar la formulación es preferiblemente esencialmente puro y deseablemente esencialmente homogéneo (es decir, libre de proteínas contaminantes, etc.). Proteína "esencialmente pura" significa una composición que comprende al menos aproximadamente el 90 % en peso de la proteína, basado en el peso total de la composición, preferiblemente al menos aproximadamente el 95 % en peso. Proteína "esencialmente homogénea" significa una composición que comprende al menos aproximadamente 99 % en peso de proteína, basado en el peso total de la composición. La proteína es un anticuerpo.

[0262] La cantidad de anticuerpo en la formulación preliofilizada se determina teniendo en cuenta los volúmenes de dosis deseados, modo(s) de administración, etc. Cuando la proteína de elección es un anticuerpo intacto (un anticuerpo de longitud completa), de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, preferiblemente de aproximadamente 5 mg/ml a aproximadamente 40 mg/ml y lo más preferiblemente de aproximadamente 20-30 mg/ml es una concentración de proteína de partida de ejemplo. La proteína generalmente está presente en solución. Por ejemplo, la proteína puede estar presente en una solución tamponada de pH a un pH de aproximadamente 4-8, y preferiblemente de aproximadamente 5-7. Los tampones de ejemplo incluyen histidina, fosfato, Tris, citrato, succinato y otros ácidos orgánicos. La concentración de tampón puede ser de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 20 mM, o de aproximadamente 3 mM a aproximadamente 15 mM, dependiendo, por ejemplo, del tampón y la isotonicidad deseada de la formulación (por ejemplo, de la formulación reconstituida). El tampón preferido es la histidina porque, tal como se demuestra a continuación, puede tener propiedades lioprotectoras. Se demostró que el succinato es otro tampón útil.

[0263] El lioprotector se agrega a la formulación preliofilizada. En realizaciones preferidas, el lioprotector es un azúcar no reductor, tal como sacarosa o trehalosa. La cantidad de lioprotector en la formulación preliofilizada es generalmente tal que, tras la reconstitución, la formulación resultante será isotónica. Sin embargo, también pueden ser adecuadas las formulaciones reconstituidas hipertónicas. Además, la cantidad de lioprotector no debe ser demasiado baja de modo que se produzca una cantidad inaceptable de degradación/agregación de la proteína tras la liofilización. Cuando el lioprotector es un azúcar (tal como sacarosa o trehalosa) y la proteína es un anticuerpo, las concentraciones de lioprotector de ejemplo en la formulación preliofilizada son de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 400 mM, y preferiblemente de aproximadamente 30 mM a aproximadamente 300 mM, y lo más preferiblemente de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 100 mM.

[0264] La relación de proteína con respecto a lioprotector se selecciona para cada combnación de proteína y lioprotector. En el caso de un anticuerpo como proteína de elección y un azúcar (por ejemplo, sacarosa o trehalosa) como lioprotector para generar una formulación reconstituida isotónica con una alta concentración de proteína, la relación molar de lioprotector con respecto a anticuerpo puede ser de aproximadamente 100 a aproximadamente 1500 moles de lioprotector por 1 mol de anticuerpo, y preferiblemente de aproximadamente 200 a aproximadamente 1000 moles de lioprotector por 1 mol de anticuerpo, por ejemplo, de aproximadamente 200 a aproximadamente 600 moles de lioprotector por 1 mol de anticuerpo.

[0265] En realizaciones preferidas de la invención, se ha descubierto que es deseable añadir un tensioactivo a la formulación preliofilizada. Alternativamente, o además, el tensioactivo se puede añadir a la formulación liofilizada y/o la formulación reconstituida. Los tensioactivos de ejemplo incluyen tensioactivos no iónicos, tales como polisorbatos (por ejemplo, polisorbatos 20 u 80); poloxámeros (por ejemplo, poloxámero 188); Tritón; dodecil sulfato de sodio (SDS); laurel sulfato de sodio; octilglicósido de sodio; lauril-, miristil-, linoleil- o estearil-sulfobetaína; lauril-, miristil-, linoleil- o estearil-sarcosina; linoleil-, miristil- o cetil-betaína; lauroamidopropil-, cocamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palnidopropil- o isoestearamidopropil-betaína (por ejemplo, lauroamidopropil); miristamidopropil-, palmidopropil- o isoestearamidopropil-dimetilamina; metil cocoil taurato de sodio o metil oleil taurato disódico; y la serie MONAQUATTM (Mona Industries, Inc., Paterson, NJ), polietilglicol, polipropilglicol y copolímeros de etileno y propilenglicol (por ejemplo, Pluronics, PF68, etc.). La cantidad de tensioactivo añadido es tal que reduce la agregación de la proteína reconstituida y minimiza la formación de partículas después de la reconstitución. Por ejemplo, el tensioactivo puede estar presente en la formulación preliofilizada en una cantidad de aproximadamente 0,001-0,5%, y preferiblemente de aproximadamente 0,005-0,05%.

[0266] En ciertas realizaciones de la invención, una mezcla del lioprotector (tal como sacarosa o trehalosa) y un agente de carga (por ejemplo manitol o glicina) se utiliza en la preparación de la formulación de prelifolización. El agente de carga puede permitir la producción de una torta liofilizada uniforme sin bolsas excesivas en la misma, etc.

[0267] Otros portadores, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables, tales como los descritos en Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980), pueden incluirse en la formulación pre­ liofilizada (y/o la formulación liofilizada y/o la formulación reconstituida) siempre que no afecten adversamente a las características deseadas de la formulación. Los portadores, excipientes o estabilizantes aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas e incluyen; agentes tamponadores adicionales; conservantes; codisolventes; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; agentes quelantes como EDTA; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína); polímeros biodegradables, tales como poliésteres; y/o contraiones formadores de sal, tales como sodio.

[0268] Las composiciones farmacéuticas y formulaciones descritas en el presente documento son preferiblemente estables. Una formulación/composición "estable" es aquella en la que el anticuerpo en la misma esencialmente retiene su estabilidad e integridad física y química tras el almacenamiento. Varias técnicas analíticas para medir la estabilidad de las proteínas están disponibles en la técnica y se revisan en Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, NY, Pubs. (1991) y Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29 - 90 (1993). La estabilidad se puede medir a una temperatura seleccionada durante un período de tiempo seleccionado.

[0269] Las formulaciones a utilizar para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles, antes o después de la liofilización y reconstitución. Alternativamente, la esterilidad de toda la mezcla se puede lograr esterilizando en autoclave los ingredientes, excepto la proteína, a aproximadamente 120°C durante aproximadamente 30 minutos, por ejemplo.

[0270] Después de mezclar la proteína, el lioprotector y otros componentes opcionales, la formulación se liofiliza. Hay muchos liofilizadores diferentes disponibles para este propósito, tales como los liofilizadores Hull50® (Hull, EE. UU.) O GT20® (Leybold-Heraeus, Alemania). La liofilización se logra congelando la formulación y sublimando posteriormente el hielo del contenido congelado a una temperatura adecuada para el secado primario. En esta condición, la temperatura del producto está por debajo del punto eutéctico o la temperatura de colapso de la formulación. Típicamente, la temperatura de almacenamiento para el secado primario variará de aproximadamente -30 a 25°C (siempre que el producto permanezca congelado durante el secado primario) a una presión adecuada, que varía típicamente de aproximadamente 50 a 250 mTorr. La formulación, el tamaño y el tipo de recipiente que contiene la muestra (por ejemplo, vial de vidrio) y el volumen de líquido determinará principalmente el tiempo necesario para el secado, que puede oscilar entre unas pocas horas y varios días (por ejemplo, 40-60 horas). Se puede llevar a cabo una etapa de secado secundario a aproximadamente 0-40°C, dependiendo principalmente del tipo y tamaño del recipiente y del tipo de proteína empleada. Sin embargo, se encontró en el presente documento que puede no ser necesario una etapa de secado secundario. Por ejemplo, la temperatura de almacenamiento durante toda la fase de eliminación de agua de la liofilización puede ser de aproximadamente 15-30°C (por ejemplo, aproximadamente 20°C). El tiempo y la presión necesarios para el secado secundario serán los que produzcan una torta liofilizada adecuada, dependiendo, por ejemplo, de la temperatura y otros parámetros. El tiempo de secado secundario viene dictado por el nivel de humedad residual deseado en el producto y normalmente tarda al menos aproximadamente 5 horas (por ejemplo, 10-15 horas). La presión puede ser la misma que la empleada durante la etapa de secado primario. Las condiciones de liofilización se pueden variar según la formulación y el tamaño del vial.

[0271] En algunos casos, puede ser deseable liofilizar la formulación de proteína en el recipiente en el que la reconstitución de la proteína se va a llevar a cabo con el fin de evitar una etapa de transferencia. El recipiente en este caso puede ser, por ejemplo, un vial de 3, 5, 10, 20, 50 o 100 cc. Como propuesta general, la liofilización dará como resultado una formulación liofilizada en la que el contenido de humedad de la misma es de menos de aproximadamente 5%, y preferiblemente menos de aproximadamente 3%.

[0272] En la etapa deseada, típicamente cuando es el momento de administrar la proteína al paciente, la formulación liofilizada se puede reconstituir con un diluyente de manera que la concentración de proteína en la formulación reconstituida sea de al menos 50 mg/ml, por ejemplo de aproximadamente 50 mg/ml a aproximadamente 400 mg/ml, más preferiblemente de aproximadamente 80 mg/ml a aproximadamente 300 mg/ml y lo más preferiblemente de aproximadamente 90 mg/ml a aproximadamente 150 mg/ml. Se considera que tales concentraciones elevadas de proteína en la formulación reconstituida son particularmente útiles cuando se pretende la administración subcutánea de la formulación reconstituida. Sin embargo, para otras vías de administración, como la administración intravenosa, se pueden desear concentraciones más bajas de la proteína en la formulación reconstituida (por ejemplo, de aproximadamente 5-50 mg/ml, o de aproximadamente 10-40 mg/ml de proteína en la formulación reconstituida). En ciertas realizaciones, la concentración de proteína en la formulación reconstituida es significativamente mayor que en la formulación preliofilizada. Por ejemplo, la concentración de proteína en la formulación reconstituida puede ser aproximadamente de 2 a 40 veces, preferiblemente de 3 a 10 veces y más preferiblemente de 3 a 6 veces (por ejemplo, al menos tres veces o al menos cuatro veces) que la de la formulación preliofilizada.

[0273] La reconstitución tiene lugar generalmente a una temperatura de aproximadamente 25°C para asegurar una hidratación completa, aunque se pueden emplear otras temperaturas según se desee. El tiempo necesario para la reconstitución dependerá, por ejemplo, del tipo de diluyente, la cantidad de excipiente(s) y proteína. Los diluyentes de ejemplo incluyen agua estéril, agua bacteriostática para inyección (BWFI), una solución tamponada de pH (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato), solución salina estéril, solución de Ringer o solución de dextrosa. El diluyente contiene opcionalmente un conservante. Se han descrito anteriormente conservantes de ejemplo, siendo los conservantes preferidos alcoholes aromáticos, tales como alcohol bencílico o fenólico. La cantidad de conservante empleada se determina evaluando diferentes concentraciones de conservante para determinar la compatibilidad con la proteína y las pruebas de eficacia del conservante. Por ejemplo, si el conservante es un alcohol aromático (tal como alcohol bencílico), puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 0,1 a 2,0% y preferiblemente de aproximadamente 0,5 a 1,5%, pero lo más preferiblemente de aproximadamente 1,0 a 1,2%. Preferiblemente, la formulación reconstituida tiene menos de 6000 partículas por vial que tienen un tamaño > 10 |jm.

Aplicaciones Terapéuticas

[0274] En el presente documento se describe un anticuerpo monoclonal humanizado aislado para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesite.

[0275] El sujeto (por ejemplo, un paciente humano) con necesidad del tratamiento está diagnosticado con, sospechoso de tener, o en riesgo de cáncer. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero sin limitación, cáncer de cerebro, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer oral, cáncer de esófago, cáncer de estómago, cáncer de hígado, cáncer de conductos biliares, cáncer de páncreas, cáncer de colon, cáncer de riñón, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario y cáncer de próstata. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de cerebro, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de colon o cáncer de páncreas. En algunas realizaciones preferidas, el cáncer es cáncer de cerebro o cáncer de glioblastoma multiforme (GBM).

[0276] El anticuerpo es un anticuerpo anti-SSEA-4.

[0277] El tratamiento da lugar a la reducción del tamaño del tumor, la eliminación de las células malignas, la prevención de metástasis, prevención de la recaída, la reducción o la muerte de cáncer diseminado, la prolongación de la supervivencia y/o prolongación del tiempo hasta la progresión del cáncer con tumor.

[0278] En algunas realizaciones, el tratamiento comprende además administrar una terapia adicional a dicho sujeto antes de, durante o después de dicha administración de los anticuerpos. En algunas realizaciones, la terapia adicional es el tratamiento con un agente quimioterapéutico. En algunas realizaciones, la terapia adicional es radioterapia.

[0279] La invención es particularmente ventajosa en el tratamiento y prevención de tumores en fase inicial, evitando de ese modo la progresión a las etapas más avanzadas que resultan en una reducción en la morbilidad y mortalidad asociada con cáncer avanzado. La invención también es ventajosa para prevenir la recurrencia de un tumor o el recrecimiento de un tumor, por ejemplo, un tumor latente que persiste después de la extirpación del tumor primario, o para reducir o prevenir la aparición de un tumor.

[0280] La invención, tal como se describe en el presente documento, es útil para el tratamiento o la prevención de un cáncer, por ejemplo, cuando un cáncer se caracteriza por el aumento de la expresión de SSEA-4. En algunas realizaciones, el cáncer comprende una célula madre cancerosa. En algunas realizaciones, el cáncer es un precáncer y/o un cáncer maligno y/o un cáncer resistente a la terapia. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer de cerebro.

[0281] Según la invención, el cáncer puede ser un tumor sólido, por ejemplo, tal como cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de recto, cáncer de pulmón, cáncer de células renales, un glioma (por ejemplo, astrocitoma anaplásico, oligoastrocitoma anaplásico, oligodendroglioma anaplásico, glioblastoma multiforme (GBM)), cáncer de riñón, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, sarcoma de tejidos blandos, carcinoma carcinoide, cáncer de cabeza y cuello, melanoma y cáncer de ovario. En una realización, el cáncer es un cáncer de cerebro o GBM. Se puede administrar una cantidad eficaz de la composición/formulación farmacéutica descrita anteriormente, que contiene al menos un anticuerpo descrito en este documento, a un sujeto (por ejemplo, un ser humano) que necesite el tratamiento a través de una ruta adecuada, tal como administración intravenosa, por ejemplo, en forma de bolo o por infusión continua durante un período de tiempo, por vía intramuscular, intraperitoneal, intracerebrospinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, inhalatoria o tópica. Los nebulizadores disponibles comercialmente para formulaciones líquidas, incluidos los nebulizadores de chorro y los nebulizadores ultrasónicos, son útiles para la administración. Las formulaciones líquidas se pueden nebulizar directamente y el polvo liofilizado se puede nebulizar después de la reconstitución. Alternativamente, los anticuerpos pueden aerosolizarse usando una formulación de fluorocarburo y un inhalador de dosis medida, o inhalarse como un polvo liofilizado y molido.

[0282] El sujeto a ser tratado tal como se describe en el presente documento puede ser un mamífero, más preferiblemente un ser humano. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales de granja, animales deportivos, mascotas, primates, caballos, perros, gatos, ratones y ratas. Un sujeto humano que necesita el tratamiento puede ser un paciente humano que tiene, está en riesgo de padecer o se sospecha que tiene cáncer, que incluye, pero sin limitación, cáncer de cerebro, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer oral, cáncer de esófago, cáncer de estómago, cáncer de hígado, cáncer de conductos biliares, cáncer de páncreas, cáncer de colon, cáncer de riñón, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario y cáncer de próstata. Un sujeto que tiene cáncer puede identificarse mediante un examen médico de rutina.

[0283] "Una cantidad eficaz", tal como se usa en este documento, se refiere a la cantidad de cada agente activo requerida para conferir un efecto terapéutico al sujeto, ya sea solo o en combinación con uno o más de otros agentes activos. Las cantidades efectivas varían, como reconocen los expertos en la técnica, dependiendo de la afección particular que se esté tratando, la gravedad de la afección, los parámetros individuales del paciente, incluida la edad, la condición física, el tamaño, el sexo y el peso, la duración del tratamiento, la naturaleza de la terapia concurrente (si la hubiera), la vía específica de administración y factores similares dentro del conocimiento y la experiencia del médico. Estos factores son bien conocidos por los expertos en la técnica y se pueden abordar con sólo una experimentación de rutina. En general, se prefiere que se use una dosis máxima de los componentes individuales o combinaciones de los mismos, es decir, la dosis segura más alta de acuerdo con el juicio médico. Sin embargo, los expertos en la técnica entenderán que un paciente puede insistir en una dosis más baja o una dosis tolerable por razones médicas, psicológicas o prácticamente por cualquier otra razón.

[0284] Consideraciones empíricas, tales como la semivida, generalmente contribuirán a la determinación de la dosificación. Por ejemplo, los anticuerpos que son compatibles con el sistema inmunológico humano, tales como anticuerpos humanizados o anticuerpos completamente humanos, pueden usarse para prolongar la semivida del anticuerpo y para prevenir que el anticuerpo sea atacado por el sistema inmunológico del huésped. La frecuencia de administración puede determinarse y ajustarse durante el curso de la terapia, y generalmente, pero no necesariamente, se basa en el tratamiento y/o supresión y/o mejora y/o retraso del cáncer. Alternativamente, pueden ser apropiadas las formulaciones de liberación continua sostenida de los anticuerpos descritos en este documento. Se conocen en la técnica diversas formulaciones y dispositivos para lograr una liberación sostenida.

[0285] En un ejemplo, las dosificaciones para un anticuerpo como se describe en el presente documento se pueden determinar empíricamente en individuos que han recibido una o más administraciones del anticuerpo. Los individuos reciben dosis incrementales del anticuerpo. Para evaluar la eficacia del anticuerpo, se puede seguir un indicador de la enfermedad (por ejemplo, cáncer) de acuerdo con la práctica habitual.

[0286] Generalmente, para la administración de cualquiera de los anticuerpos descritos en este documento, una dosis candidata inicial puede ser de aproximadamente 2 mg/kg. Para el propósito de la presente divulgación, una dosis diaria típica podría variar de aproximadamente 0,1 pg/kg a 3 pg/kg a 30 pg/kg a 300 pg/kg a 3 mg/kg, a 30 mg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento se mantiene hasta que se produce la supresión deseada de los síntomas o hasta que se alcanzan niveles terapéuticos suficientes para aliviar el cáncer o uno de sus síntomas. Un régimen de dosificación de ejemplo comprende administrar una dosis inicial de aproximadamente 2 mg/kg, seguida de una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 1 mg/kg del anticuerpo, o seguida de una dosis de mantenimiento de aproximadamente 1 mg/kg cada dos semanas. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación, dependiendo del patrón de degradación farmacocinética que el médico desee lograr. Por ejemplo, se contempla la dosificación de una a cuatro veces por semana. En algunas realizaciones, la dosificación varía de aproximadamente 3 pg/mg a aproximadamente 2 mg/kg (tal como aproximadamente 3 pg/mg, aproximadamente 10 pg/mg, aproximadamente 30 pg/mg, aproximadamente 100 pg/mg, aproximadamente 300 pg/mg, aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 2 mg/kg). En algunas realizaciones, la frecuencia de dosificación es una vez a la semana, cada 2 semanas, cada 4 semanas, cada 5 semanas, cada 6 semanas, cada 7 semanas, cada 8 semanas, cada 9 semanas o cada 10 semanas; o una vez al mes, cada 2 meses o cada 3 meses o más. El progreso de esta terapia se controla fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales. El régimen de dosificación (incluido el anticuerpo utilizado) puede variar con el tiempo.

[0287] Para los fines de la presente descripción, la dosificación apropiada de un anticuerpo descrito en el presente documento dependerá del anticuerpo específico (o composiciones del mismo) empleado, el tipo y la gravedad del cáncer, si el anticuerpo se administra para fines preventivos o terapéuticos, la terapia previa, la historia clínica del paciente y la respuesta al anticuerpo, y la discreción del médico tratante. La administración de los anticuerpos descritos en el presente documento puede ser esencialmente continua durante un período de tiempo preseleccionado o puede ser en una serie de dosis espaciadas, por ejemplo, antes, durante o después del desarrollo del cáncer.

[0288] Tal como se usa en el presente documento, el término "tratar" se refiere a la aplicación o administración de una composición que incluye uno o más agentes activos a un sujeto, que tiene cáncer, un síntoma de cáncer, o una predisposición hacia el cáncer, con el propósito de curar, curar, aliviar, alterar, remediar, mejorar o afectar el cáncer, el síntoma del cáncer o la predisposición al cáncer.

[0289] Aliviar el cáncer incluye retrasar el desarrollo o la progresión del cáncer o reducir la gravedad del cáncer. Aliviar el cáncer no requiere necesariamente resultados curativos. Tal como se utiliza en el presente documento, "retrasar" el desarrollo del cáncer significa diferir, obstaculizar, ralentizar, retrasar, estabilizar y/o posponer la progresión del cáncer. Este retraso puede ser de diferentes períodos de tiempo, según el historial de cáncer y/o las personas que están siendo tratadas. Un procedimiento que "retrasa" o alivia el desarrollo del cáncer, o retrasa la aparición del cáncer, es un procedimiento que reduce la probabilidad (el riesgo) de desarrollar uno o más síntomas de cáncer en un período de tiempo determinado y/o reduce la extensión de los síntomas en un período de tiempo determinado, en comparación con no utilizar el procedimiento. Estas comparaciones se basan típicamente en estudios clínicos, utilizando un grupo de sujetos suficientes para proporcionar un resultado significativamente estadístico.

[0290] El "desarrollo" o "progresión" de cáncer significa manifestaciones iniciales y/o subsiguiente progresión del cáncer. El desarrollo del cáncer puede detectarse y evaluarse usando técnicas clínicas estándar bien conocidas en la técnica. Sin embargo, el desarrollo también se refiere a una progresión que puede ser indetectable. A los efectos de esta divulgación, desarrollo o progresión se refiere al curso biológico de los síntomas. El "desarrollo" incluye la aparición, la recurrencia y el inicio. Tal como se usa en el presente documento, "aparición" o "inicio" de cáncer incluye aparición inicial y/o recurrencia.

[0291] Se pueden usar procedimientos convencionales, conocidos por los expertos en la técnica de la medicina, para administrar la composición farmacéutica al sujeto, dependiendo del tipo de enfermedad a tratar o el sitio de la enfermedad. Esta composición también puede administrarse por otras vías convencionales, por ejemplo, administrada por vía oral, parenteral, por pulverización con inhalación, por vía tópica, rectal, nasal, bucal, vaginal o mediante un depósito implantado. El término "parenteral", tal como se usa en este documento, incluye técnicas de inyección o infusión subcutánea, intracutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intraarterial, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intralesional e intracraneal. Además, se puede administrar al sujeto a través de vías de administración de depósito inyectable tales como usando materiales y procedimientos de inyectables en depósiyo o biodegradables de 1, 3 o 6 meses.

[0292] Las composiciones inyectables pueden contener varios portadores, tales como aceites vegetales, dimetilactamida, dimetilformamida, lactato de etilo, carbonato de etilo, miristato de isopropilo, etanol y polioles (glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido y similares). Para la inyección intravenosa, los anticuerpos solubles en agua se pueden administrar mediante el procedimiento de goteo, mediante el cual se infunde una formulación farmacéutica que contiene el anticuerpo y excipientes fisiológicamente aceptables. Los excipientes fisiológicamente aceptables pueden incluir, por ejemplo, dextrosa al 5%, solución salina al 0,9%, solución de Ringer u otros excipientes adecuados. Las preparaciones intramusculares, por ejemplo, una formulación estéril de una forma de sal soluble adecuada del anticuerpo, se pueden disolver y administrar en un excipiente farmacéutico, tal como agua para inyección, solución salina al 0,9% o solución de glucosa al 5%.

[0293] Sin más elaboración, se cree que un experto en la técnica puede, basándose en la descripción anterior, utilizar la presente invención en su extensión más completa. Los ejemplos 1-14 a continuación son ejemplos de antecedentes. La presente invención, tal como se define en las reivindicaciones, se ejemplifica en los Ejemplos 15 y 16.

EJEMPLO 1: Análisis citom étrico de flu jo de epítopos de glicanos en líneas celulares GBM

[0294] Se analizaron los niveles de expresión de diversos epítopos de glicano por citometría de flujo en cuatro líneas celulares de GBM humanos: G5T, LN-18, U-138 y U-251. Los epítopos de glicano examinados incluyen glicanos ligados a O (Tn, sTn, TF), antígenos de Lewis (Lex, Ley y sLex), gangliósidos complejos [GM2, GM1, GD1a, GD3, GD2, GTlb y A2B5 (gangliósidos de la serie c)] y Gs L de la serie globo (SSEA-3, s SeA-4 y Globo H; Fig. 1A). Nuestros resultados mostraron que la mayoría de estas cuatro líneas celulares de GBM expresaron niveles altos de Tn, TF, Lex y Ley, un nivel bajo de sLexy nada de sTn (Tabla 7). Además, estas cuatro líneas celulares de GBM fueron positivas para todos los gangliósidos que examinamos. Con respecto a los niveles de expresión de GSL de la serie globo, U-251 mostró una tinción débil para un anticuerpo anti-SSEA-4, MC813-70, y G5T, U-138 y LN-18 mostraron una alta intensidad de tinción para MC813-70 (Figura 1B). La tinción positiva para un anticuerpo anti-SSEA-3, MC631, solo se observó en G5T entre estas cuatro líneas celulares, y ninguna mostró tinción positiva para un anticuerpo anti-Globo H, VK9 (Tabla 7). Además, examinamos los patrones de expresión de GSL de la serie globo en más líneas celulares de GBM y descubrimos que de las 17 líneas celulares de GBM, nueve mostraron una fuerte señal de tinción de MC813-70 (SSEA-4hi); tres se tiñeron débilmente (SSEA-4lD) y cinco no se tiñeron con MC813-70 (Fig. 1A). Nueve de las 17 líneas celulares fueron positivas para la tinción de MC631 y seis fueron positivas para la tinción de VK9. SVG p12, una célula glial fetal humana inmortalizada, mostró una señal de tinción de MC813-70 muy débil, pero ninguna señal de tinción de MC631 o VK-9 (Fig. 1). Estos resultados indicaron que la mayoría de las líneas celulares de GBM examinadas se tiñeron positivamente con el anticuerpo anti-SSEA-4 usando MC813-70 como ejemplo.

EJEMPLO 2 : Verificación de la expresión de SSEA-4 en células cancerosas de GBM

[0295] Para excluir la posibilidad de que el anticuerpo anti-SSEA-4 pueda unirse al 1 O-glicano de núcleo extendido en glicoproteínas en células de GBM, se trataron células DBTRG con metanol para eliminar los lípidos antes de la tinción con un anticuerpo anti-SSEA-4, MC813-70. Tras el tratamiento con metanol, la inmunorreactividad de MC813-70 desapareció, según se analizó por citometría de flujo y microscopía de inmunofluorescencia, lo que sugiere que la inmunorreactividad de MC813-70 fue hacia glicolípidos, no hacia glicoproteínas. Para confirmar la existencia del epítopo SSEA-4 en la superficie de la célula GBM, realizamos además la tinción de MC631 en células DBTRG tratadas con a2,3-sialidasa, y el resultado mostró que al tratar con a2,3-sialidasa, las células se convirtieron en negativas de MC813- 70 y positivas de MC631, lo que apoya que las células GBM expresaban SSEA-4.

[0296] Para verificar adicionalmente la expresión de SSEA-4, a continuación purificamos los gangliósidos (los glicolípidos con ácido siálico) usando cromatografía de intercambio aniónico, revelamos los gangliósidos purificados en placas de HPTLC y los visualizamos mediante tinción con orcinol-H²SO⁴ o inmunotransferencia. Los gangliósidos purificados de tres líneas celulares de GBM diferentes exhibieron patrones similares, con abundantes GM3, GM2, Neu5Ac-(n)Lc4/Gg4Cer y Neu5Ac2-(n)Lc4/Gg4Cer. De acuerdo con los resultados del análisis de citometría de flujo, MC813-70 reconoció dos gangliósidos (debido a una longitud de cadena diferente de ácidos grasos) en TLC de DBTRG y D54MG, pero no en células de GBM 8901 (Fig. 3A). Las posiciones de las bandas dobles inmunorreactivas en los gangliósidos de GBM eran las mismas que en los gangliósidos purificados a partir de células 2102Ep (Fig.3A, carril 4), células de carcinoma embrionario que se sabe que expresan un alto nivel de glicolípido SSEA-4 (Kannagi R, et al. (1983) Los antígenos embrionarios específicos de la etapa (SSEA-3 y -4) son epítopos de un gangliósido de la serie globo único aislado de células de teratocarcinoma humano. Em BO J 2 (12): 2355-2361). Mediante MC813-70 se detectó una doble banda revelada a una distancia más corta que el glicolípido positivo de MC813-70 en células YAC-1 (Fig.3A, carril 5), en las que GMlb es un gangliósido principal (Zarei M, Muthing J, Peter-Katalinic J, & Bindila L (2010) Separation and identification of GMlb pathway Neu5Ac- and Neu5Gc gangliosides by on-line nanoHPLC-QToF MS and tandem MS: toward glycolipidomics screening of animal cell lines. Glycobiology 20 (1): 118-126), lo que respalda que MC813-70 alberga una reactividad cruzada débil hacia GMlb. La inmunotransferencia con MC631 reveló que también podía reconocer el glicolípido positivo a MC813-70 con una afinidad menor que la de MC813-70. Para examinar el número de ácidos siálicos en glicolípidos positivos para MC813-70, eluimos gangliósidos en diferentes condiciones de sal y realizamos inmunotransferencia con MC813-70. El resultado apoyó que los gangliósidos reactivos a MC813-70 se monosialilaron, ya que aparecieron las dos bandas en la fracción eluida en condiciones bajas en sal. A continuación, utilizamos sialidasas para dilucidar el enlace del ácido siálico en este monosialogangliósido reactivo con MC813-70. Los gangliósidos revelados en la placa de TLC se trataron con a2,3-sialidasa o la sialidasa que escinde todos los enlaces de los ácidos siálicos y se transfirieron con MC813-70 y MC631. Los resultados mostraron que la inmunorreactividad de MC813-70 desapareció después del tratamiento con sialidasa, mientras que MC631 pudo detectar señales fuertes en las posiciones similares a los dobletes reactivos de MC813-70, lo que indica la presencia de un ácido siálico unido a a2,3.

[0297] También analizamos los gangliósidos de las células DBTRG mediante el perfil de MALDI-MS (Fig. 3B). Los espectros estuvieron dominados por varios picos importantes que aparecieron en grupos de señales debido a la heterogeneidad esperada de las porciones de ceramida (Cer). En base a los valores m/z de los iones moleculares principales, ajustados a la permetilación de residuos de hexosa (Hex), N-acetilhexosamina (HexNAc) o NeuAc, en combinación con esfingosina y cadenas de acilo graso, se asignaron los perfiles de gangliósidos respectivos. De acuerdo con los resultados de HPTLC, el perfil de MS reveló que las principales especies de gangliósidos en las células DBTRG eran GM3, GM2, Neu5Ac-(n)Lc4/Gg4Cer y Neu5Ac2-(n)Lc4/Gg4Cer. También se detectó la señal con Neu5Ac-Hex4-HexNAc-Cer (m/z = 2025,2) que representaba SSEA-4, aunque con baja intensidad, reflejando la existencia de SSEA-4 en células DBTRG. Estos datos apoyan que el gangliósido reactivo a MC813-70 era SSEA-4 y que a pesar de ser un constituyente menor de los gangliósidos totales, SSEA-4 se expresó en células GBM.

EJEMPLO 3 : Expresión de SSEA-4 en tejidos de GBM

[0298] SSEA-4 es un marcador ampliamente utilizado para las células madre, pero se desconoce la información sobre la expresión de SSEA-4 en tejidos de GBM y en tejidos cerebrales normales. Para comprender si SSEA-4 se sobreexpresa en muestras clínicas de GBM, además de las líneas celulares de GBM, analizamos la expresión de SSEA-4 entre astrocitomas de grado I a IV y tejidos cerebrales normales mediante inmunohistoquímica en micromatrices de tejido humano (Fig.4). Encontramos que 38 de las 55 muestras de tejido GBM (69%) fueron positivas para la tinción de MC813-70, y alrededor de la mitad de las muestras de GBM se tiñeron intensamente (>2 ). Como se muestra en las muestras positivas, SSEA-4 se situó en la membrana plasmática de las células GBM. Además, alrededor del 55% de las muestras de astrocitoma de bajo grado se tiñeron débilmente (calificadas como 1+) por MC813-70, y las puntuaciones de intensidad de SSEA-4 se correlacionaron positivamente con los grados de astrocitomas. Por el contrario, la mayoría de los tejidos cerebrales normales fueron negativos de SSEA-4. El resultado mostró que SSEA-4 se expresa altamente en tumores, en particular, en tumores GBM.

EJEMPLO 4 : Anti-SSEA-4 media CDC contra líneas celulares de GBM

[0299] Para analizar si el reconocimiento de SSEA-4 desencadenaría la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) en células de GBM, las líneas celulares de GBM se trataron con MC813-70 y complemento de conejo, y el grado de CDC se evaluó mediante la detección del nivel de lactato deshidrogenasa liberada causada por la muerte celular. La Fig. 5 mostró que en presencia de complemento, mAb MC813-70 redujo notablemente el número de células de GBM viables. Observamos una CDC significativa en las líneas celulares de g Bm SSEA-4hi: 71,7% de citotoxicidad de células DBTRG, 46,6% de células LN-229, 67% de células G5T y 65,4% de células LN-18. La CDC mediada por MC813-70 no mataron dos líneas celulares de GBM, Hs683 y U87, que expresaron de forma baja SSEA-4 o nada. Por lo tanto, el nivel de CDC mediado por MC813-70 se correlacionó positivamente con el nivel de expresión de SSEA-4 en cada línea celular GBM.

EJEMPLO 5 : Anti-SSEA-4 suprime el crecim iento del tum or cerebral in vivo

[0300] Para comprobar si MC813-70 era capaz de suprimir el crecimiento tumoral de GBM in vivo, se administró MC813-70 a los ratones desnudos inyectados con células DBTRG por vía subcutánea, cuando los tumores crecieron hasta formar protuberancias palpables (15-30 mm3 el día 11 después de la inyección). Se administró MC813-70 (200 |jg) por vía intraperitoneal a cada ratón cada cuatro días durante un total de tres veces, con una IgG3 de ratón irrelevante (control de isotipo) inyectada en paralelo para comparación. El experimento reveló que la administración de MC813-70 podría inhibir el crecimiento del tumor DBTRG (Fig. 6). El crecimiento de tumores DBTRG se suprimió por completo en dos de los tres ratones tratados con MC813-70, y el tercer ratón desarrolló un tumor después de la interrupción del tratamiento con anticuerpos. En comparación con los ratones que recibieron el tratamiento con MC813-70, el tumor DBTRG creció agresivamente (con un volumen tumoral de 184 mm3 en promedio el día 31) en el grupo de control inyectado con IgG3 de ratón. Estos datos demostraron que MC813-70 era capaz de inhibir el crecimiento de tumores GBM que expresan SSEA-4, posiblemente a través de CDC y citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) in vivo.

EJEMPLO 6 : Expresión de Globo H, SSEA3 y SSEA-4 en varias líneas celulares cancerosas

[0301] Se ha informado que SSEA-4 se expresa en carcinoma renal (Saito S, et al. (1997) Expression of globoseries gangliosides in human renal cell carcinoma. Jpn J Cancer Res 88(7):652-659), cáncer de pulmón basaloide (Gottschling S, et al. (2013) Stage-specific embryonic antigen-4 is expressed in basaloid lung cancer and associated with poor prognosis. Eur Respir J 41(3):656-663), carcinoma de ovario epitelial (Ye F, Li Y, Hu Y, Zhou C, & Chen H (2010) Stage-specific embryonic antigen 4 expression in epithelial ovarian carcinoma. Int J Gynecol Cancer 20(6):958-964), cancer de mama (Huang YL, et al. (2013) Carbohydrate-based vaccines with a glycolipid adjuvant for breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A 110(7):2517-2522) y cáncer oral (Noto Z, et al. (2013) CD44 and SSEA-4 positive cells in an oral cancer cell line HSC-4 possess cancer stem-like cell characteristics. Oral Oncol). Aquí, analizamos los niveles de expresión de SSEA-3, Globo H y SSEA-4 en varias líneas de células cancerosas mediante citometría de flujo. Tal como se muestra en la Tabla 7, hemos examinado un total de 134 líneas celulares de cáncer (17 líneas de células de cáncer de cerebro, 20 líneas de células de cáncer de pulmón, 23 líneas de células de cáncer de mama, 13 líneas de células de cáncer oral, 2 líneas de células de cáncer de esófago, 6 líneas de células de cáncer gástrico, 10 líneas celulares de cáncer de hígado, 5 líneas celulares de cáncer de conductos biliares, 8 líneas celulares de cáncer de páncreas, 7 líneas celulares de cáncer de colon, 6 líneas celulares de cáncer renal, 4 líneas celulares de cáncer de cuello uterino, 9 líneas celulares de cáncer de ovario y 4 líneas celulares de cáncer de próstata).

Tabla 7. Expresión de Globo H, SSEA-3 y SSEA-4 en varias líneas de células cancerosas. Línea de célula de cáncer Globo H

de cerebro

A172

D54MG - -

G5T -

G9T

GBM 8401 - - -

GBM 8901 - - -

Hs683 - -

LN-18

LN.229

SF126 -

SNB75 -

T95G - - -

U-138 MG -

U-251 MG -

U-373 MG

U-87 MG - - -

Línea de célula de cáncer SSEA-3 SSEA-4 Globo H

de pulmón

A549

Calu-3

CL1

CL1-0

CL1-5

CL2

CL3

H1299

H1355

H157

H441

H460

H480

H520

H661

H928

NuLi-1

PC-13

PC-14

PC-9

Línea de célula de cáncer Globo H de mama

Au565 - - -

BT-20 - - -

BT-474 - - -

BT-483 - -

BT-549 -

DU4475 - -

HBL-100 -

HBL-435 - -

HCC1395

HCC1599 - -

HCC1806

HCC1937 -

HCC38 -

Hs578T

MCF-7

MDA-MB-157

MDA-MB-231

MDA-MB-361 -

MDA-MB-453 -

MDA-MB-468 - -

SK-BR-3 -

T47D

ZR75 -

Línea de célula de cáncer Globo H

oral

Ca922 -

Cal27 -

HSC3 -

OC3 - -

OECM1 - -

SAS - -

SCC25 - -

SCC4

Tu-183 - -

Tw1.5 -

Tw2.6 -

UMSCC-1

YD-15

Línea de célula de cáncer Globo H de esófago

CE81T - -

KYSE70 - Línea de célula de cáncer Globo H gástrico

AGS - -

AZ521

KATO III

NCI-N87 - -

SCM-1

SNU-1 -

Línea de célula de cáncer Globo H de hígado

59T

Changliver - -

HA22T - -

Hep3b

HepG2 -

Huh-7 -

J5 - -

Mahlavu - -

NTU-BL

SK-HEP-1

Línea de célula de cáncer Globo H de conductos biliares

HuccT1

SNU-1079 - - -

SNU-1196 - -

SNU-245 -

SNU-308 - - -

Línea de célula de cáncer Globo H pancreática

AsPC1 - -BxPC3 -

HPAC -

KP-4

MIA PaCa-2

Panc0203 -

PANC1 - -

PL45

Línea de célula de cáncer Globo H de colon

CX-1 -

DLD-1 - -

H3347 -

HCT1116 - -

HT-29 - -

SW480 -

SW620 -

Línea de célula de cáncer Globo H

renal

769-P

A498 - -

A704 - -

ACHN

Caki-1

Caki-2

Línea de célula de cáncer Globo H de cuello de útero

Hela -Hela 229 -Hela S3 - - -

ME-180 -

Línea de célula de cáncer Globo H de ovario

C33A - -

CAOV3 - -

ES-2 -

NUGCC

OVCAR-3 -

SiHa - - -

SKOV3 - -

TOV-112D -

TOV-21G

Línea de célula de cáncer Globo H

de próstata

22Rr1 -

Du145 - -hTERT-HPNE -

PC-3 - -

Tabla 8 Resumen de expresión de las GSL de la serie globo en líneas celulares cancerosas Origen del SSEA-4+ SSEA-3+ Globo H+ SSEA4+o SSEA4+ SSEA4+ SSEA4+ tumor SSEA3+o SSEA3+ Globo H+ SSEA3+ Globo H+ Globo H+ Cerebro 12/17 9/17 6/17 12/17 9/17 6/17 5/17 Pulmón 13/20 5/20 13/20 16/20 5/20 10/20 5/20 Mama 17/23 6/23 14/23 18/23 6/23 13/23 6/23 Boca 8/13 2/13 11/13 12/13 2/13 7/13 2/13 Esófago 1/2 0/2 2/2 2/2 0/2 1/2 0/2 Estómago 4/6 3/6 6/6 6/6 3/6 4/6 3/6 Hígado 6/10 4/10 9/10 9/10 4/10 6/10 4/10 Conductos 2/5 1/5 3/5 3/5 1/5 2/5 1/5 biliares

Páncreas 8/8 3/8 6/8 8/8 3/8 6/8 3/8 Colon 5/7 0/7 6/7 7/7 0/7 4/7 0/7 Riñón 5/6 0/6 5/6 6/6 0/6 4/6 0/6 Cuello de 3/4 2/4 1/4 3/4 2/4 1/4 0/4 útero

Ovario 8/9 2/9 5/9 8/9 2/9 5/9 2/9 Próstata 4/4 1/4 1/4 4/4 1/4 1/4 0/4

La expresión de los GSL de la serie globo se determinó mediante citometría de flujo. Aquellas líneas celulares en las que más del 15% de las células totales son positivas en la citometría de flujo se etiquetan como positivas.

[0302] Se encontró que SSEA-4 se expresó en cada tipo de línea celular de cáncer (96 de 134 líneas celulares de cáncer). Globo H también se expresó en muchas líneas de células cancerosas (88 de 134), preferentemente en líneas celulares de cáncer de pulmón, mama, páncreas, colon, estómago, boca, hígado y riñón. También observamos que muchas de las líneas de células cancerosas (70 de 134) expresaban SSEA-4 y Globo H simultáneamente. Por otro lado, la expresión de SSEA-3 siempre siguió a una alta expresión de SSEA-4, lo que indica que SSEA-4 y Globo H eran los principales GSL de la serie globo en las células cancerosas.

[0303] Para validar la identidad de SSEA-4, purificamos los gangliósidos a partir de nueve líneas celulares positivas MC813-70, así como TF1a, una línea celular de leucemia negativa MC813-70-negativo, y se realizó la inmunotinción en placas de HPTLC. Tal como se esperaba, se detectó SSEA-4 en estas nueve líneas de células cancerosas, pero no en TF1a, y la intensidad se correlacionó bien con la intensidad de fluorescencia media geométrica examinada por citometría de flujo. Estos resultados revelaron que SSEA-4 podría expresarse en una variedad de líneas de células cancerosas y podría servir como una diana potencial para múltiples tipos de cánceres.

EJEMPLO 7: Expresión de moléculas relacionadas con glicanos en células cancerosas y células del tipo de madre cancerosas

[0304] Para las células del tipo de madre cancerosas, se recogieron 8 líneas celulares de glioblastoma de ATCC y se mantuvieron en la placa de filjación ultra-baja (Corning) con NSM que consiste en medio neurobasal (Invitrogen), suplemento B27 (Invitrogen), y bFGF y EGF recombinantes humanos (20 ng/ml cada uno; Upstate). Los medios se renovaron cada 3 días y todas las células se cultivaron en CO2 al 5% y atmósfera humidificada a 37° C.

[0305] Se examinaron los perfiles de expresión de diversos marcadores en líneas celulares LN18, U138, U251, DBTRG y G5T y sus esferas. Se examinaron un total de 22 marcadores, incluidos 17 glicanos (GM3, GM2, GM1, GD1a, GD3, GD2, GT1b, A2B5, LeX, sLeX, LeY, SSEA-3, SSEA-4, Globo H, TF, Tn y sTn) y 5 glicoproteínas (CD44, CD24, CD45, CD90, CD133). El anticuerpo monoclonal anti-Globo H se generó internamente. Otros anticuerpos específicos para los marcadores se compraron en los proveedores que se enumeran a continuación. CD 133/1 y CD 133/2 eran anticuerpos contra diferentes epítopos de la glicoproteína CD133.

Anticuerpo Vendor

GM3 seikagaku

GM2 Merck Calbiochem

GM1 Merck Calbiochem

GDla Millipore

GDla Millipore

GD3 BD

GD2 BD

GT1b Millipore

A2B5 Millipore

LeX BD

sLeX BD

LeY Abcam

SSEA-3 eBioscience

SSEA-4 eBioscience

Globo H Purificado en Laboratorio Wong

TF Thermo Scientific

Tn DakoCytomation

sTn Abnova

CD44 eBioscience

CD24 eBioscience

CD90 BD

CD133/1 Miltenyi Biotec

CD133/2 Miltenyi Biotec

[0306] Las células (1 * 105) se resuspendieron en 50 |il de tampón FACS (1% de solución de BSA/PBS) que contiene varios anticuerpos de concentración y se incubaron en hielo durante 30 min. Después de lavarse dos veces con tampón FACS, si era necesario, las células se incubaron con anticuerpo anti-ratón o FITC-anti-conejo de cabra marcado con Alexa488 (1:100; Jackson ImmunoResearch) durante 30 minutos en hielo antes del análisis en un sistema FACSCalibur (BD Biosciencies).

[0307] Entre los patrones de expresión de gangliósidos, se encontró que GD2 predominaba altamente y se expresaba consistentemente en células de neuroesferas 5 GBM. Sin embargo, en el mecanismo de la neolactoserie, LeX, un marcador bien conocido de células madre pluripotentes, no mostró ninguna diferencia significativa entre estos grupos. Además, GM2, GM1, GD1a, GT1b, A2B5, Tf, Tn, SSEA3, SSEA4, CD24, CD44 y CD90 se expresaron altamente en células 5 GBM. Curiosamente, en el mecanismo de las globoseries, SSEA4 se expresa abundantemente en las células parentales en lugar de en las células de la neuroesfera, lo que indica que SSEA4 puede servir como dianas terapéuticas de las células GBM.

T l Ex r i n li n li r ín n l l n r l l l i m r n r

EJEMPLO 8: Enriquecimiento de células madre de GBM por GD2 más SSEA-4 y CD133

[0308] Con el fin de comprender si la combinación de GD2 más SSEA4 y CD133 podría determinar más concretamente la población de células madre de GBM, se compara la capacidad de auto-renovación y la tumorigenicidad de la población GD2+SSEA4+CD133+ a las otras poblaciones.

[0309] Las células de tumor GBM se disociaron en suspensiones de células individuales y se marcaron con anticuerpo anti-GD2 (BD), anti-SSEA4 (Biolegend), anti-CD133 (Miltenyi Biotec). A continuación, estas células marcadas se clasificaron físicamente usando el citómetro de flujo (BD) FACS Aria II. Para la detección de la capacidad de autorrenovación, las células tumorales GBM se disociaron, se tiñeron y se sembraron en placas de 96 pocillos. Se calculó el número de neuroesferas cuyo diámetro superaba los 100 um. Para la tumorigenicidad, se inyectaron por vía subcutánea o intracraneal varios cantidades de células, incluidas 10.000-10 células, en los ratones inmunodeficientes. Se observa que la aparición de tumores será significativamente más rápida en la población GD2+SSEA4+CD133+ en comparación con las otras poblaciones.

EJEMPLO 9: Generación de anticuerpos monoclonales anti-Globo H

[0310] Se empleó la metodología de hibridoma para el desarrollo de mAbs específicos a Globo H. Se inmunizaron ratones BALB/c hembra con edades entre 6-8 semanas de edad, tres veces por vía subcutánea con la vacuna de Globo H. Se administraron tres inmunizaciones a intervalos de 2 semanas. Cada vacuna contenía 2 |jg de Globo H. Todos los sueros se obtuvieron mediante centrifugación a 4.000 xg durante 10 min. Las respuestas serológicas se analizaron mediante micromatrizs de glicanos. Se administró un refuerzo final por vía intraperitoneal con 2 jg de Globo H y, 3 días después, se usaron las células del bazo de los ratones inmunizados para generar hibridomas.

[0311] Las células de hibridoma que secretan anticuerpos con las actividades de unión al antígeno deseadas se seleccionaron de la siguiente manera. Las placas de microtitulación se recubrieron incubando con 4 jg/m l de neutravidina en tampón de carbonato, 0,1 M, pH 9,6, durante la noche a 4 C. Los pocillos se bloquearon con BSA al 1% en PBS, pH = 7,3 durante 1 hora y se incubaron con 4 jg/m l de GloboH-biotina durante 1 hora. Los antisueros estuvieron en diversas diluciones durante 1 hora a 37° C. Después del lavado, los anticuerpos unidos al ligando se detectaron mediante IgG anti-ratón de cabra conjugado con HRP, fragmento Fcy específico (Jackson ImmunoResearch) a 1:10.000 y se incubaron durante 1 hora a 37° C, seguido de incubación con sustrato TMB. La DO se determinó a 450 nm. Se seleccionaron clones positivos para una caracterización adicional. En este estudio se identificaron dos clones de ejemplo, mAb 273 y 651, que se unían específicamente a Globo H. Para el isotipado monoclonal de ratón, se utilizaron las tiras y kits IsoQuick (sigma, 19535). Se añadió medio de hibridoma al vial de reacción. Se insertó la tira en la muestra asegurándose de que las tiras estén en posición vertical. La muestra viajará por la tira. Se dejó que la tira se revelara durante 5 minutos antes de realizar las interpretaciones finales.

[0312] Los segmentos de genes de Vh y Vl de los mAb 273 y 651 se amplificaron por PCR a partir del clon de hibridoma que secreta el anticuerpo. Los segmentos génicos así obtenidos se secuenciaron para determinar las secuencias de Vh y Vl de mAb 273 y 651, que se muestran en las Tablas 1 y 2.

EJEMPLO 10: Generación de anticuerpos monoclonales anti-SSEA-4

[0484] Se empleó la metodología de hibridoma para el desarrollo de mAbs específicos de SSEA-4. Se inmunizaron tres veces por vía subcutánea a ratones hembra BALB/c, de 6 a 8 semanas de edad, con la vacuna de SSEA-4. Se administraron tres inmunizaciones a intervalos de 2 semanas. Cada vacuna contenía 2 jg de SSEA-4. Todos los sueros se obtuvieron por centrifugación a 4.000 xg durante 10 min. Las respuestas serológicas se analizaron mediante micromatrizs de glicanos. Se administró un refuerzo final por vía intraperitoneal con 2 jg de SSEA-4 y, 3 días después, se usaron las células del bazo de los ratones inmunizados para generar hibridomas.

[0314] Las células de hibridoma que secretan anticuerpos con las actividades de unión al antígeno deseadas se seleccionaron de la siguiente manera. Se recubrieron placas de microtitulación incubando con 4 jg/m l de neutravidina en tampón carbonato, 0,1 M, pH 9,6, durante la noche a 4° C. Los pocillos se bloquearon con BSA al 1% en PBS, pH = 7,3 durante 1 hora y se incubaron con 4 jg/m l de SSEA-4-biotina durante 1 hora. Los antisueros estuvieron en diversas diluciones durante 1 hora a 37° C. Después del lavado, los anticuerpos unidos al ligando se detectaron mediante anticuerpo IgG o IgM anti-ratón de cabra conjugado con HRP (Jackson ImmunoResearch) a 1:10.000 y se incubaron durante 1 hora a 37° C, seguido de incubación con sustrato TMB. La DO se determinó a 450 nm. Se seleccionaron clones positivos para una caracterización adicional. En este estudio se identificaron tres clones de ejemplo 45, 46 y 48 que se unían específicamente a SSEA-4. Para el isotipado monoclonal de ratón, se utilizaron las tiras y kits IsoQuick (sigma, 19535). Se añadió medio de hibridoma al vial de reacción. Se insertó la tira en la muestra asegurándose de que las tiras estén en posición vertical. La muestra viajará por la tira. Se dejó que la tira se revelara durante 5 minutos antes de realizar las interpretaciones finales.

[0315] Los segmentos de genes de Vh y Vl de los mAbs 45, 46 y 48 se amplificaron por PCR a partir del clon de hibridoma que secreta el anticuerpo. Los segmentos génicos así obtenidos se secuenciaron para determinar las secuencias de Vh y Vl de mAb 45, 46 y 48, que se muestran en las Tablas 3-5.

EJEMPLO 11: Generaciones de anticuerpos quiméricos

[0316] Los segmentos de genes de Vh y Vl de los mAb 273 y 651 se amplificaron por PCR a partir del clon de hibridoma que secreta el anticuerpo. Los segmentos génicos así obtenidos se secuenciaron para determinar las secuencias de Vh y Vl de mAb 273 y 651, que se muestran en las Tablas 1 y 2. La región variable de cadena pesada y de cadena ligera se clonó en el vector de expresión del anticuerpo IgG1 humano que se muestra en la Fig. 9. VH estaba usando el sitio de enzima B s iW I y A p a l, y VL estaba usando el sitio de enzima B sP E I y N he l. Los vectores se transfectaron transitoriamente en células 293F o CHO-S. Se purificó el Ab quimérico recombinante y se realizó un estudio adicional para el ensayo de unión y el ensayo de lisis de células tumorales dependiente del complemento.

[0317] Los segmentos de genes de Vh y Vl de los mAb 46 y 48 se amplificaron por PCR a partir del clon de hibridoma que secreta el anticuerpo. Los segmentos génicos así obtenidos se secuenciaron para determinar las secuencias Vh y Vl de mAb 46 y 48, que se muestran en las Tablas 5 y 4. La región variable de cadena pesada y de la cadena ligera se clonaron en el vector de expresión del anticuerpo IgG1 humano que se muestra en la Fig. 9. VH estaba usando el sitio de enzima B s iW I y A pa l, y VL estaba usando el sitio de enzima B sP E I y N he l. Los vectores se transfectaron transitoriamente en células 293F o CHO-S. Se purificó el Ab quimérico recombinante y se realizó un estudio adicional para el ensayo de unión y el ensayo de lisis de células tumorales dependiente del complemento.

EJEMPLO 12: Análisis de unión de anticuerpos mediante matriz de glicanos

[0318] Los mAbs 273 y 651, y anti-SSEA-4 (mAbs 45, 46 y 48) se sometieron a estudios de unión a glicano, tal como se describe a continuación. Se sintetizaron 152 glicanos sintetizados químicamente y se colocaron en el micromatriz de glicanos. La matriz de glicanos se incubó con anticuerpos a diversas diluciones durante 1 hora a 37° C. A continuación, los portaobjetos se lavaron tres veces cada uno con Tween 20 al 0,05%/tampón PBS (PBST). A continuación, se añadió al portaobjetos anticuerpo IgM o IgG anti-ratón de cabra conjugado con Cy5. Finalmente, los portaobjetos se lavaron tres veces con PBST. Los portaobjetos de micromatrizs se secaron antes de rastrearlos a 635 nm con un lector de chips de fluorescencia en micromatrizs (4000B; Genepix). Los datos fueron analizados por el software GenePix Pro-6.0 (Axon Instruments). Los resultados obtenidos de este estudio se muestran en la Figura 2.

[0319] El mAb 273 es capaz de unir el hexasacárido epítopo Globo H de Fuca1 ^ 2Galp1 ^ 3GalNAcp1 ^ 3Gala1 ^ 4Galp1 ^ 4Glcp1 (# 53 en la matriz de glicano), y un segmento de Galp1 ^ 3GalNAcp1 ^ 3Gala1 ^ 4Galp1 ^ 4Glcp1 (# 57 en matriz de glucanos). El mAb 651 reconoce los epítopos de glicanos de Fuca1 ^ 2Galp1 ^ 3GalNAcp1 ^ 3Gala1 ^ 4Galp1 ^ 4Glcp1 (# 53 en la matriz de glicanos), Galp1 ^ 3GalNAcp1 ^ 3Gala1 ^ 4Galp1 ^ 4Glcp1 (# 57 ^ en matriz de glicanos) y Neu5Aca2 -> 3Galp1 -> 3GalNAcp1 -> 3Gala1 -> 4Galp1 ^ 4Glcp1 (# 12 en la matriz de glicanos).

[0320] El mAb 45 es capaz de unirse al hexasacárido epítopo SSEA-4 de Neu5Aca2 ^ 3Galp1 ^ 3GalNAcp1 ^ 3Gala1 ^ 4Galp1 ^ 4Glcp1 (# 12 en la matriz de glicanos), y un análogo Neu5Gca2 ^ 3Galp1 ^ 3GalNAcp1 ^ 3Gala1 ^ 4Galp1 ^ 4Glcp1 (# 49 en matriz de glicanos). El mAb 46 se une a Neu5Aca2 ^ 3Galp1 ^ 3GalNAcp1 ^ 3Gala1 ^ 4Galp1 ^ 4Glcp1 (#12 en la matriz de glicanos), Neu5Gca2 ^ 3Galp1 ^ 3GalNAcp1 ^ 3Gala1 ^ 4Galp1 ^ 4Glcp1 (# 49 en en la matriz de glicanos), Neu5Aca2 ^ 3Galp1 ^ 3GalNAcp1 ^ 3Gala1 (#11 en la matriz de glicanos) y Neu5Aca2 ^ 3Galp1 ^ 3GalNAcp1 ^ 3Galp1 (# 10 en la matriz de glucanos). El mAb 48 es capaz de unirse a Neu5Aca2 ^ 3Galp1 ^ 3GalNAcp1 ^ 3Gala1 ^ 4Galp1 ^ 4Glcp1 (# 12 en la matriz de glicanos), y Neu5Gca2 ^ 3Galp1 ^ 3GalNAcp1 ^ 3Gala1 ^ 4Galp1 ^ 4Glcp1 (# 49 en la matriz de glucanos).

[0321] La micromatriz de glicanos también se utilizó para investigar la especificidad de unión de MC813-70. Tal como se muestra en la Fig.2 (H), encontramos que entre los 152 glicanos sintetizados químicamente en la micromatriz de glicanos, MC813-70 reconoce Neu5Aca2 ^ 3Galp1 ^ 3GalNAcp1 ^ 3Gala1 ^ 4Galp1 ^ 4Glcp1 (# 12 en la matriz de glicanos) y Neu5Gca2 ^ 3Galp1 ^ 3GalNAcp1 ^ 3Gala1 ^ 4Galp1 ^ 4Glcp1 (# 49 en la matriz de glicanos). MC813-70 no se une a GMlb (# 104 en la matriz de glicanos) o GDla (# 106 en la matriz de glicanos).

[0322] También se utilizó la matriz de glicano para determinar las constantes de disociación de MC45, MC48 y MC813-70 con hexasacárido SSEA-4 en la superficie, y los valores de Kd para MC45, 48 y 813 se muestran a continuación. Estos resultados mostraron que estos mAb son altamente específicos para SSEA4.

MC45 0,37 ± 0,08

MC48 0,46 ± 0,1

MC813-70 4,21 ± 0,26

EJEMPLO 13: Análisis de unión de anticuerpos a células cancerosas mediante citometría de flujo

[0323] Se examinó la unión de mAb 273 y anti-SSEA-4 (mAbs 45, 46 y 48) a líneas de células cancerosas. Se resuspendieron células (1 * 105) en 100 ul de tampón FACS (solución al 1% de BSA/PBS) que contenía anticuerpos de diversas concentraciones y se incubaron en hielo durante 30 min. Después de lavarse dos veces con tampón FACS, las células se incubaron con anticuerpo anti-ratón de cabra marcado con 649 (1:100; Jackson ImmunoResearch) durante 30 min en hielo antes del análisis en un sistema FACSCalibur (BD Biosciences). Los resultados se muestran en las Figuras 7A-D. Las células de cáncer de mama MCF-7 se tiñeron con mAb 273 (Fig. 7A). Las células de cáncer de páncreas (HPAC y BxPC3) y las células de cáncer de mama MCF-7 se tiñeron con mAb 45 (Fig. 7B). Las células de cáncer de páncreas (HPAC y BxPC3) y las células de cáncer de mama MCF-7 se tiñeron con mAb 46 (Fig. 7C). Las células de cáncer de páncreas (HPAC y BxPC3) y las células de cáncer de mama MCF-7 se tiñeron con mAb 48 (Fig. 7D).'

EJEMPLO 14-1: Los anticuerpos median la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC)

[0324] Se examinó la capacidad del mAb 273 para mediar CDC de células que expresan Globo H. Células MCF-7 en presencia de suero humano como fuente de complemento. La muerte celular se evaluó mediante la adición de la sonda de viabilidad 7-AAD. Basándose en los resultados de la medición de 7-AAD, se calculó la lisis específica porcentual usando un citómetro de flujo FACScan. Los anticuerpos mostraron aproximadamente un 30% de actividad destructora a 40 pg/ml. Tal como se muestra en la Figura 5 (B), mAb273 puede mediar con éxito en la citotoxicidad dependiente del complemento de la célula que expresa Globo H.

[0325] Ejemplo 14-2: se examinó la capacidad de mAbs 46 y 48 de ejemplo para mediar CDC de células que expresan SSEA-4. Célula de adenocarcinoma de páncreas de Homo sapiens (BxPC3) en presencia de suero de conejo como fuente de complemento. La muerte celular se evaluó mediante la adición de la sonda de viabilidad 7-AAD. Basándose en los resultados de la medición de 7-AAD, se calculó la lisis específica porcentual usando un citómetro de flujo FACScan. Los anticuerpos mostraron aproximadamente un 20% de actividad destructora a 40 pg/ml. Tal como se muestra en la Figura 5 (C), mAb 46 y 48 mediaron con éxito CDC de células que expresan SSEA-4.

Materiales y procedimientos

[0326] Los reactivos. Los anticuerpos anti-Lex, anti-sLex y anti-GD2 se adquirieron de BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ). Los anticuerpos anti-GDla, anti-GTlb y anti-A2B5 Alexa Fluor® 488 se adquirieron de Millipore (Billerica, MA). Los anticuerpos anti-GM1 y anti-GM2 se adquirieron de Calbiochem (Merck, Darmstadt, Alemania). Los anticuerpos anti­ Ley y anti-sTn se adquirieron de Abcam (Cambridge, Reino Unido). El anticuerpo anti-TF se adquirió de Thermo Scientific (Waltham, MA). El anticuerpo anti-Tn se adquirió de DakoCytomation (Glostrup, Dinamarca). MC813-70 y MC631 marcados con fluorescencia o purificados se adquirieron de Biolegend (San Diego, CA). Los ascitos de MC813-70 se adquirieron en el Developmental Studies Hybridoma Bank de la Universidad de lowa. Los usos de estos anticuerpos en experimentos individuales se describen en los siguientes párrafos.

[0327] Cultivo celular. Las células U-251, U-138, LN-18, T98, LN-229, U87, U-373, Hs683, D54MG, GBM 8401, GBM 8901, G5T, G9T, SNB75, A172 y SF126 se mantuvieron de forma rutinaria en niveles altos de glucosa DMEM (Life Technologies, Carlsbad, CA) suplementado con 10% de FBS (Biological Industries, Israel). Las células DBTRG se mantuvieron en RPMI 1640 (Life Technologies) con FBS al 10%.

[0328] Citometría de Flujo. Las células (1 * 105) se tiñeron con 0,5 |jg de mAb anti-SSEA-3 conjugado con Alexa Flour 488 (MC-631), mAb anti-SSEA-4 (MC813-70) o mAb anti-Globo H conjugado con aloficocianina (APC) (VK9, un obsequio de Philip O. Livingston, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, Nueva York, NY) en 50 pl de tampón FACS (solución de PBS con 1% de FBS) en hielo durante 30 min. Para la tinción con lectina, las células se incubaron en tampón de unión a lectina [BSA al 1%, 0,5 x tampón de bloqueo libre de carbohidratos (Vector Laboratories, Burlingame, CA), MgCh 2 mM, CaCh2 mM] que contiene lectina biotinilada durante 30 min en hielo. Después de lavarse dos veces con tampón de unión a lectina, las células se incubaron con estreptavidina-APC (1:500 diluido en tampón FACS; Biolegend) en hielo durante 30 min. Después de lavar dos veces con 200 pl de tampón FACS, las células se resuspendieron en 200 pl de tampón FACS que contenía 1 pg/ml de yoduro de propidio (PI) y se sometieron a análisis. La adquisición de datos se realizó en un FACSCanto (BD Biosciences) con el software FACSDiva (BD Biosciences), y los análisis de datos se realizaron utilizando el software FlowJo (TreeStar, Ashland, OR). Las células vivas (PI negativo) se seleccionaron para el análisis. Para el lavado con metanol, las células se lavaron y fijaron con paraformaldehído al 4% en PBS durante 15 min a temperatura ambiente, seguido de incubación en metanol durante 10 min antes de teñir con anticuerpos específicos.

[0329] Tinción mediante inmunofluorescencia. Las células se sembraron en portaobjetos de cámara de plástico de cultivo de tejidos (Nunc, Roskilde, Dinamarca) durante la noche para permitir una unión suficiente, se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente, se lavaron tres veces con PBS y a continuación se bloquearon con BSA al 3% en PBS. A continuación, las células se incubaron durante la noche con 10 pg/ml de mAb MC813-70 (Biolegend), se lavaron tres veces con PBS y se incubaron durante 2 ha temperatura ambiente con 5 pg/ml de IgG anti-ratón conjugado con FITC (eBioscience, San Diego, CA). Los núcleos se contratiñeron con Hoechst 33342 (2 pg/ml, Life Technologies). Todas las imágenes fueron adquiridas con un microscopio Olympus IX71.

[0330] Inmunohistoquímica. Para la tinción de MC813-70 en muestras de cerebro normal y GBM, se probaron tres portaobjetos de micromatrices de tejido diferentes (Biomax, Rockville, MD), que comprenden un total de 19 secciones de cerebro normal y 55 secciones de GBM. Los portaobjetos se secaron a 56 ° C durante 1 h, se desparafinaron en xileno y se rehidrataron en alcoholes graduados, seguido de tratamiento con tampón de bloqueo [² % de reactivo de bloqueo (Roche, Basel, Suiza) en PBS con 0,1% Triton X-100] durante 30 min a temperatura ambiente. A continuación, los portaobjetos se incubaron a 4°C durante la noche con mAb MC813-70 (10 |jg/ml en tampón de bloqueo). Después de lavar suavemente con PBST, se detectó la inmunorreactividad en sepecimens con Supersensitive ™ Polymer-HRP IHC Detection System (BioGenex, Fremont, CA), y los portaobjetos se tiñeron con hematoxilina y se prepararon para el montaje.

[0331] Fabricación de matrices de glicano. Se imprimieron micromatrices (BioDot; Cartesian Technologies, Irvine, CA) mediante una clavija robótica (SMP3; TeleChem International Inc., Sunnyvale, CA) con la deposición de -0,6 nl por mancha. Los glicanos que contienen amina en tampón de impresión (fosfato de sodio 300 mM, pH 8,5, Triton X-100 al 0,01%) se colocaron sobre portaobjetos de vidrio activados con N-hidroxisuccinimida (NHS). Cada glicano se imprimió a 100 jM en una réplica de cuatro o 50 jM en una réplica de seis para la determinación de Kd. Se dejaron incubar los portaobjetos impresos al 80% de humedad durante 30 min, seguido de desecación durante la noche. Los grupos NHS restantes se bloquearon sumergiendo los portaobjetos durante 1 h en tampón de bloqueo SuperBlock (PBS) (Pierce, Appleton, WI).

[0332] Ensayo de unión a Ab. Se preparó MAb MC813-70 Alexa Fluor 647 (Biolegend) en 100 j l de PBS-BT (pH 7,4, con BSA al 3% y Tween-20 al 0,05%) y se aplicó para cubrir la rejilla. Después de la incubación en una cámara húmeda durante 30 minutos, los portaobjetos se aclararon con PBST y agua desionizada y se secaron con secador. Los portaobjetos se escanearon a 635 nm en genepix 4300A (dispositivo molecular, Sunnyvale, CA). Los datos fueron analizados por GenePix Pro-6.0 (Molecular Devices).

[0333] Tratamiento con sialidasa. Las células se lavaron y se resuspendieron en tampón PBS a 1 x 10⁷ células/ml. Las células se incubaron con o sin 500 mU de a2,3 sialidasa (NEB, Ipswich, MA)/10⁶ células/100 |il durante 1 h a 37 ° C, y lavaron dos veces con tampón FACS seguidos por tinción de la superficie y citometría de flujo. La eficacia del tratamiento con sialidasa se midió mediante lectina II de M a a ck ia a m u re n s is biotinilada (MAL II; Vector Laboratories), que reconoce los ácidos siálicos unidos a a2,3.

[0334] Extracción de glicoesfingolípidos. Se recogieron células (4 * 107), se lavaron con PBS y se homogeneizaron en agua. Por 3 vol. de homogeneizado se añadieron ⁸ vol. de metanol y 4 vol. de cloroformo y la muestra se incubó en un baño de ultrasonidos durante 30 min. Después de centrifugar a 3000 xg durante 15 min, el sedimento se extrajo repetidamente con cloroformo/metanol/agua 4:8:3 y el sobrenadante combinado se secó bajo una corriente de nitrógeno. A continuación, el extracto de lípidos totales se disolvió en cloroformo/metanol/agua (30/60/8, v/v/v) y los gangliósidos se purificaron mediante cromatografía de intercambio aniónico basado en DEAE-Sephadex A-25 (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido). Se recogió y se secó el fluido que contenía glicolípidos neutros no unidos. Después de lavar con cloroformo/metanol/agua (30/60/8, v/v/v), los gangliósidos se eluyeron con cloroformo/metanol/NaCl acuoso (0,02, 0,2 y 0,8 M gradualmente) (30/60/8, v/v/v), seguido de desalación con cartuchos Sep-Pak C18 (Waters, Milford, MA). Los extractos se secaron bajo nitrógeno y los residuos de gangliósido, así como los residuos de glicolípidos neutros, se redisolvieron en ^{1 0 0} j l de cloroformo/metanol (² / ¹ , v/v).

[0335] Cromatografía en capa fina de alto rendimiento. Los GSL se separaron en placas de cromatografía en capa fina de alto rendimiento (HPTLC) prerrevestidas con gel de sílice 60 rellenas de vidrio (Merck). Los gangliósidos se cromatografiaron en cloroformo/metanol/agua (120/85/20, v/v/v) y los GSL neutros en cloroformo/metanol/agua (120/70/17, v/v/v), respectivamente, cada uno suplementado con CaCh 2 mM. Para fines analíticos, los GSL se tiñeron con orcinol al 0,3% en H²SO⁴3 M y a continuación se transfirió a una placa calefactora precalentada (110° C) hasta que aparecieron manchas azul púrpura. Para fines de preparación, los gangliósidos se tiñeron con primulina al 0,02% (Sigma, St. Louis, MO) en acetona/agua (4/1, v/v). Las manchas de gangliósidos se marcaron con un lápiz bajo luz ultravioleta y se rasparon de la placa con un raspador adsorbente (Sigma) y los gangliósidos se extrajeron con cloroformo/metanol/agua (30/60/8, v/v/v) bajo sonicación para 10 minutos. La sílice se extrajo por centrifugación, se volvió a extraer de nuevo y el sobrenadante combinado se secó y se redisolvió en metanol.

[0336] Inmunotinción con TLC. Los GSL se separaron en placas de HPTLC como se describió anteriormente. Después de la cromatografía, la placa de TLC se secó al aire, se sumergió en poli(metacrilato de isobutilo) (Sigma) al 2,1% en hexano/cloroformo (42: ⁸ , v/v) tres veces y se remojó en PBS a 37°C durante la noche. La placa se secó, se bloqueó con PBS durante 30 min a temperatura ambiente y se hizo reaccionar con MC813-70 o MC-631 (5 jg/m l) durante 2 h a temperatura ambiente. Se lavó suavemente con PBST (Tween-20 al 0,05%) tres veces, la placa se incubó con anticuerpo secundario biotinilado ⁽¹ jg/m l) durante ¹ h, seguido de incubación con estreptavidina-fosfatasa alcalina (1:1000; Millipore). Después de lavar con PBST, la placa de TLC se reveló con NBT/b C iP (Thermo Scientific). La reacción se detuvo lavando con agua destilada y las placas se secaron al aire.

[0337] Perfil de MALDI-MS y análisis MS/MS. El análisis MALDI-MS de glicanos permetilados se realizó en un analizador proteómico ABI 4700 (Applied Biosystems, Foster City, CA) usando ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB) como matriz (10 mg/ml). La secuenciación MALDI-MS/MS con disociación inducida por colisión de baja y alta energía se realizó en un Q/TOF Ultima MALDI (Waters Micromass) y un 4700 Proteomics Analyzer usando la matriz DHB como se describe anteriormente.

[0338] Ensayo de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). La actividad CDC de mAb anti-SSEA4 de ejemplo, tal como mAb (MC813-70), se midió mediante un ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) usando el kit de ensayo de citotoxicidad no radiactiva CytoTox 96® (Promega, Fitchburg, WI). Las células (1 * 104) se sembraron en cada pocillo de placas de 96 pocillos y se lavaron con PBS dos veces después del crecimiento durante la noche. A continuación, las células se incubaron con 1 |jg de MC813-70 o control de isotipo IgG3 de ratón en 50 |jl de DMEM o RPMI sin rojo fenol con complemento de conejo (dilución 1:5; Life Technologies). Después de la incubación en una incubadora de CO2 al 5% a 37° C durante 1 h, se determinó el grado de lisis celular midiendo la cantidad de LDH liberada en el sobrenadante del cultivo. La liberación máxima de LDH se determinó mediante la lisis de las células con la solución de lisis proporcionada por el kit. El porcentaje de lisis específica se calculó de acuerdo con la ecuación: % de lisis = [liberación experimental - liberación espontánea]/[liberación máxima - liberación espontánea] * 100.

[0339] Crecimiento tumoral in vivo. Se adquirieron ratones BALB/cAnN.Cg-Foxn1nu/CrlNarl del Centro Nacional de Animales de Laboratorio (Taiwán) y se mantuvieron en condiciones específicas libres de patógenos. El estado de salud del animal se controló diariamente. Los procedimientos que involucran a los animales y su cuidado se llevaron a cabo de acuerdo con el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales de la Academia Sínica de conformidad con las leyes y políticas nacionales e internacionales. Se inyectaron subcutáneamente células DBTRG (1 * 107/250 j l de PBS) se en las regiones de los flancos de ratones (de 8 a 10 semanas de edad) para generar el modelo de xenoinjerto. Los días 11, 15 y 19, a cada ratón se le inyectaron por vía peritoneal 200 jg de MC813-70 (purificado de la ascitis) o Ab de control de isotipo IgG3 de ratón. El tamaño del tumor se determinó mediante un calibrador vernier midiendo la longitud (L) y el ancho (W), y el volumen del tumor se calculó (en mm3) como 1/2 x LW2.

EJEMPLO 15 Procedimientos de biopanning de presentación en fagos de ejemplo

[0340] De la biblioteca scFv humana sin tratar presentada en fagos que contenía 2,5 x 1010 clones (Lu et al., 2011) se sustrajo la unión no específica en Dynabeads de carboxilo (Invitrogen) conjugado con PEG a temperatura ambiente (TA) durante 1 hora, y posteriormente se incubó con Dynabeads inmovilizados con SSEA-4-PEG a 4° C durante 1 hora. Después de lavar con PBS o PBS que contenía Tween 20 al 0,01% (PBST0.01), los fagos que se unían a SSEA-4-PEG-Dynabeads se recuperaron por infección con células E-coli TG1 a 37° C durante 0,5 horas. Algunas de las células infectadas se diluyeron en serie para determinar el título y las otras se rescataron mediante el fago M13KO7 y se amplificaron. Después de la determinación del título de fagos rescatados, se realizó la siguiente ronda de biopanning. En la cuarta y quinta ronda de biopanning, los clones de fagos se seleccionaron aleatoriamente para cultivo para cribado por ELISA.

Cribado por ELISA de clones de fagos seleccionados

[0341] Para la detección de reconocimiento del antígeno, se recubrieron placas de micropocillos (Nunc) con 0,2 |j g/ml de s SeA-4-BSA, Globo H-BSA, SSEA-3-BSA y BSA, respectivamente. Los clones de fagos seleccionados se diluyeron 1:2 en PBS que contenía BSA al 3% y se añadieron a cada pocillo. Las placas se incubaron a TA durante 1 hora, se lavaron con PBST0.1 y se incubaron con anticuerpo de ratón anti-fago M13 conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (GE Healthcare). Las placas se lavaron nuevamente y se agregaron OPD y H2O2. Después de la terminación de la reacción con HCl 3 N, se midió la absorbancia usando un lector de microplacas de 490 nm (Modelo 680, BioRad). Extrajimos fagémidos de clones de fagos positivos en ELISA para identificar regiones codificantes de scFv mediante secuenciación automática.

Construcción y expresión de IgG humana anti-SSEA-4

[0342] La región de VH de scFv seleccionado se clonó con el sitio Agel y NheI en el vector de expresión modificado pcDNA5-FRT-gamma1 que contenía un péptido señal y la región constante de caena pesada de inmunoglobulina gamma 1 humana. La región VL del scFv seleccionado se clonó con el sitio Agel y EcoRV en el vector de expresión modificado p-Kappa-HuGs que contenía un péptido señal y una región constante de la cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana. Ambos plásmidos se transfectaron en células FreeStyle293 (Invitrogen) y se incubaron continuamente en medio sin suero a 37 ° C durante 1 semana para producir anticuerpos humanos.

Purificación de IgG humana anti-SSEA-4

[0343] Se recogió el medio de cultivo, se centrifugó y filtró con membrana de tamaño de poro de 0,45 |im. A continuación, el sobrenadante se sometió a cromatografía en columna de proteína G (GE healthcare) para la purificación de IgG humana anti-SSEA-4. Después de la diálisis de eluyentes con PBS, el anticuerpo se examinó mediante análisis SDS-PAGE con tinción con azul de Coomassie como de costumbre. La concentración de anticuerpo se evaluó mediante reactivo de Bradford (Thermo Scientific) y espectrofotómetro.

Humanización de MC48

[0344] Dos genes humanos, acceso a GenBank Q9UL73 y AY577298, fueron los más similares a VH y VL de MC48, respectivamente. Se humanizaron tres secuencias de MC48, incluida la primera VH de MC48 humanizada (hMC48) que consistía en el marco modificado (FR) 1 a FR4 del gen Q9UL73 y la primera VL de hMC48 que consistía en cuatro Fr del acceso AY577298, la segunda f R de hMC48 de VH seguida de 1YY8 de PDB, mientras que la segunda VL de hMC48 igual que la primera secuencia, y la tercera secuencia de VH de hMC48 modificaron FR1, 2 y 4 del gen Q9UL73 y la tercera Vl de hMC48 cambió FR2 y FR4 al gen AY577298 humano. Todas estas secuencias humanizadas conservaron CDR1 a CDR3 de VH y VL de MC48.

Construcción de la variable de fragmentos deuna sola cadena (scFv) de variantes de MC48 humanizadas

[0345] La forma del scFv de secuencias de MC48 humanizado (VH-GGGGSGGGGSGGGGS-VL (SEQ ID NO: 115)) se sintetizó en genes (Genomics) y se cortó por Sfi I y Not I (Fermentas). Después de la extracción en gel, los productos digeridos se clonaron en el fagémido pCANTAB-5E (GE Healthcare).

Generación de clones de fagos de scFv de MC48 (hMC48) humanizados.

[0346] Los fagémidos variantes de hMC48 se transformaron en E-coli TG1 y se recuperaron en medio 2 * YT (BD Pharmingen) que contenía 100 pg/ml de ampicilina y glucosa al 2% y se rescataron con el fago auxiliar M13KO7 (NEB) durante 1 hora a 37° C. Después de centrifugación a 1.500 xg durante 10 min, estos sedimentos se resuspendieron en medio 2 x YT que contenía 100 pg/ml de ampicilina y 50 pg/ml de kanamicina durante la noche para generar fagos de scFv.

Ensayo de unión de clones de fago de scFv de hMC48 por ELISA

[0347] Se recubrió con SSEA-4-BSA una placa ELISA a la concentración de 0,2 pg/ml. Después de lavar y bloquear, los fagos diluidos en serie se incubaron a TA durante 1,5 horas. Después del lavado, se añadió anticuerpo anti-M13 conjugado con HRP diluido 1:1000 (GE Healthcare) a TA durante 1 hora. A continuación, se reveló con el sustrato líquido 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) y se terminó con HCl 3N. La densidad óptica se midió a 450 nm.

Resultados

Identificación de scFv presentado en fagos que se une a SSEA-4

[0348] Para identificar los anticuerpos que se unen a SSEA-4, utilizamos una biblioteca scFv humana sin tratar presentada en fagos que contenía 2,5 x 1010miembros que se estableció como se describe en nuestro informe anterior (Lu et al., 2011). De estea biblioteca se eliminaron primero los fagos de unión a Dynabeads y a continuación se seleccionaron los fagos de unión a SSEA-4 mediante Dynabeads conjugados con SSEA-4-PEG. Usamos dos sistemas de tampón, PBS y PBS que contenía Tween20 al 0,01% (PBST0.01), durante el biopanning. Después de cinco rondas de selección por afinidad, la recuperación de fagos de la quinta ronda había aumentado aproximadamente 55 veces y 80 veces la de la primera ronda en el sistema PBS y PBST0.01, respectivamente (Fig. 10). Los clones de fagos se seleccionaron aleatoriamente y se ensayaron para determinar la unión de SSEA-4 mediante ELISA (Fig. 11). Encontramos siete clones que se unían específicamente a SSEA-4-BSA, pero no a la proteína de control BSA. Al secuenciar los 8 clones individuales, se identificaron dos clones de fagos anti-SSEA-4 únicos (p1-52 y p2-78) que contenían regiones de codificación de VH y VL humanas distintas (fig 16A).

[0349] Para examinar la especificidad y la afinidad de unión de los dos clones de fago, se realizó un ELISA comparativo utilizando el mismo título de fago a glicanos de la serie globo, incluyendo SSEA-4-BSA, Globo H-BSA y SSEA-3-BSA (Fig 12). El clon del fago p2-78 mostró una unión fuerte a SSEA-4-BSA y SSEA-3-BSA, y una unión ligeramente más débil a Globo H-BSA. Sin embargo, encontramos que la actividad de unión del clon del fago p1-52 a SSEA-4-BSA es muy débil. Por lo tanto, nos centramos en el clon p2-78 para un estudio adicional.

[0350] Para establecer el anticuerpo completamente humano (hAB) contra SSEA-4, se diseñó molecularmente las secuencias de codificación de VH y VL de scFv p2-78 en el esqueleto de IgG1 humana, respectivamente. El hAb anti-SSEA-4 p2-78 se produjo usando el sistema de expresión FreeStyle 293 y a continuación se purificó a través de la columna de proteína G sefarosa. Examinamos la pureza del anticuerpo mediante análisis SDS-PAGE con tinción con azul de Coomassie (Fig. 13A). El resultado muestra que el nivel de pureza del anticuerpo supera el 95%. Posteriormente, realizamos un ELISA para investigar la actividad de unión de hAb p2-78 para glicanos de la serie Globo (Fig. 13B). Encontramos que hAb p2-78 se unía a SSEA-4 y SSEA-3, pero no a Globo H, lo que demuestra que la versión IgG humana de p2-78 retiene la actividad de su versión de scFv parental para reconocer el epítopo de unión de SSEA-4.

[0351] Se utilizó una matriz de glicanos que contiene 203 glicanos diferentes para confirmar adicionalmente la especificidad de hAb p2-78. Los resultados mostraron que hAb p2-78 reconocía SSEA4, Sialil-SSEA4, SSEA4Gc y Gb5 (SSEA3) (Fig. 14B). Curiosamente, hAb p2-78 también reconoció GloboH, similar a los resultados del ensayo ELISA (Fig. 12). El anticuerpo IgM disponible comercialmente, MC631, se utilizó como control positivo (Fig. 14A).

Desarrollo de mAbs MC48 humanizados

[0352] Los mAbs murinos no humanizados pueden tener ciertas limitaciones en entornos clínicos, incluyendo su semivida corta en suero, la incapacidad de desecadenar funciones efectoras humanas y la producción de respuesta de anticuerpos anti-murinos humanos (HAMA) (LoBuglio et al., 1989). Por tanto, los mAb se pueden humanizar injertando sus CDR en las FR de VH y VL de moléculas de Ig humana (Roguska et al., 1994).

[0353] Para desarrollar un MC48 humanizado, se secuencióa la región variable de Vh y Vl de MC48 a partir de una célula de hibridoma (Tabla 4). Después de la alineación de la región variable de Vh y Vl de MC48 con la base de datos NCBI IgBLAST, modificamos las Fr de MC48 y generamos 1 ', 2 ', 3' y 4' secuencias de MC48 humanizadas (Tabla 17, Figura 17). A continuación, construimos y generamos los formatos de scFv presentados en fagos de acuerdo con estas secuencias de MC48 humanizadas. Para determinar la actividad de unión de los clones de fago de MC48 humanizados, llevamos a cabo un recubrimiento ELISA de base sólida con SSEA-4-BSA (Figuras 15 y 18). Encontramos que el fago de scFv de MC48 humanizado podría reconocer SSEA-4 de una manera dependiente de la dosis. Los datos indicaron que el 4° fago de scFv de MC48 humanizado MC48 mantuvo su afinidad de unión en comparación con el mAb MC48 murino.

Ejemplo 16

Ensayo de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).

[0354] Se examina la capacidad de MC 48 humanizado de ejemplo para mediar la CDC de células que expresan SSEA-4. Se colocaron en placa células de carcinoma pancreático o de mama de Homo sapiens en cada pocillo de placas de 96 pocillos para el crecimiento durante la noche antes del ensayo. A continuación, las células se incubaron con concentraciones diluidas en serie de MC 48 humanizado o control de isotipo IgG1 humano en RPMI en presencia de suero de conejo como fuente de complemento (dilución 1:5; Life Technologies). La muerte celular se evalúa mediante la adición de la sonda de viabilidad 7-AAD. Según los resultados de la medición de 7-AAD, la lisis específica porcentual se calcula utilizando un citómetro de flujo FACScan. Los anticuerpos muestran una actividad destructora significativa a 10 pg/ml en comparación con el control de isotipo. Como se muestra, MC48-4 humanizado media con éxito la CDC de células que expresan SSEA-4.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Anticuerpo monoclonal humanizado aislado que se une específicamente a Neu5Aca2 ^ 3Galp1 ^ 3GalNAcp1 ^ 3Gala1 ^ 4Galp1 ^ 4Glcp1, en el que el anticuerpo comprende un VH que tiene la SEQ ID NO: 147 y un VL que tiene la SEQ ID NO: 148.

2. Anticuerpo monoclonal humanizado aislado, según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es una IgG.

3. Anticuerpo monoclonal humanizado aislado, según la reivindicación 2, en el que el anticuerpo es una IgG1.

4. Anticuerpo monoclonal humanizado aislado, según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesite.

5. Anticuerpo monoclonal humanizado aislado para su uso, según la reivindicación 4, en el que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de cerebro, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer oral, cáncer de esófago, cáncer de estómago, cáncer de hígado, cáncer de conductos biliares, cáncer de páncreas, cáncer de colon, cáncer de riñón, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario y cáncer de próstata.

6. Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo monoclonal humanizado aislado, según las reivindicaciones 1-3.

7. Composición farmacéutica, según la reivindicación 6, para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesite.

8. Composición farmacéutica para su uso, según la reivindicación 7, en la que una célula del cáncer expresa el antígeno SSEA4 en la superficie de la célula.

9. Composición farmacéutica para su uso, según la reivindicación 7, en la que una célula del cáncer expresa además al menos uno de GloboH y/o SSEA3 en la superficie de la célula.

10. Composición farmacéutica para su uso, según la reivindicación 7, en la que una célula del cáncer expresa el antígeno Globo H, SSEA3 y SSEA4 simultáneamente en la superficie de la célula.

11. Composición farmacéutica para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones 8-10, en la que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de cerebro, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer oral, cáncer de esófago, cáncer de estómago, cáncer de hígado, cáncer de conductos biliares, cáncer de páncreas, cáncer de colon, cáncer de riñón, cáncer de huesos (osteosarcoma), cáncer de piel, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario y cáncer de próstata.

12. Anticuerpo monoclonal humanizado aislado, según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es un glicoanticuerpo y en el que el glicoanticuerpo comprende un N-glicano unido a Asn-297 de la región Fc de dicho anticuerpo en el que el N-glicano consiste en la estructura de Sia2(a2-6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 y en el que el glicoanticuerpo se une específicamente a un antígeno SSEA-4.

13. Fragmento de unión a antígeno del anticuerpo, según la reivindicación 1, cuyo fragmento se une específicamente a Neu5Aca2 ^ 3Galp1 ^ 3GalNAcp1 ^ 3Gala1 ^ 4Galp1 ^ 4Glcp1 y comprende un VH que tiene la SEQ ID NO: 147 y un VL que tiene la SEQ ID NO: 148.

14. Fragmento de unión a antígeno, según la reivindicación 13, en el que el fragmento de unión a antígeno es un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2 o un fragmento Fv de una sola cadena.