JP2010523724A - α−ガラクトシルセラミド類似体およびそれらの免疫療法剤としての使用 - Google Patents
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Abstract
本開示は、合成アルファ−ガラクトシルセラミド(α−GalCer)類似体、およびそれらを免疫療法剤として使用することに関する。一つの態様において、被検対象におけるサイトカイン応答を活性化させる方法は、少なくとも一つのリンパ球および少なくとも一つの抗原提示細胞を含む細胞集団を含む適応免疫系を有する被検対象に、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩を投与する工程;該化合物と該抗原提示細胞との間に複合体を形成させ、その結果、上記リンパ球上にある受容体を活性化させる工程;およびリンパ球を活性化させてサイトカイン応答を生じさせる工程を含む。
Description
本願は、2007年4月13日に出願された、「Glicolipid analogs of alpha−Galactosylceramide」と題する、米国仮特許出願第60/911,798号の利益および同号に対する優先権を主張する。
本開示は、α−ガラクトシルセラミド(α−GalCer)類似体、およびそれらを免疫療法剤として使用することに関する。
ナチュラルキラーT細胞(NKT)は、CD1dによって提示される天然または合成の糖脂質に対する反応性や、インバリアントT細胞抗原受容体(TCR)α鎖の発現などという特異的な性質をもつTリンパ球のサブセットに相当する。NKTは、ナチュラルキラー細胞とT細胞の両方の性質をもち、それらのリガンドによる刺激を受けると直ちにTH1型およびTH2型の応答を生じさせることができる(自然免疫)という点で、機能的に分化した通常のαβ−T細胞とは異なる。NKTの活性化は、逆説めいているが、免疫応答の抑制と促進のいずれをももたらすことができる。例えば、TH1サイトカインの産生は、抗腫瘍活性、抗ウイルス/抗細菌活性、およびアジュバント活性による細胞性免疫を促進すると考えられているが、一方、TH2サイトカイン産生は、自己免疫疾患を抑制し、抗体産生を促進すると考えられている。NKTは、免疫系において調節的役割を果たしているため、免疫療法にとっては魅力的な標的である。
一つの典型的な実施態様において、DCの発生を、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)を使用することによって促進することができる。または、別の典型的な実施態様では、インターロイキン(IL)−3を使用することによって促進することができるが、IL−3は、別の典型的な実施態様においては、DCの生存率を高めることができる。
一つの典型的な実施態様において、本開示の方法で使用されるDCは、骨髄マーカー、例えば、CD11cを発現することができるが、別の典型的な実施態様ではIL−3受容体−α(IL−3Rα)鎖(CD−123)を発現することができる。別の典型的な実施態様においては、DCはI型インターフェロン(IFN)を産生することができる。一つの典型的な実施態様において、本開示の方法で使用されるDCは、共刺激分子を発現する。別の典型的な実施態様において、本開示の方法で使用されるDCは、さらに別の接着分子を発現することができるが、それらは、一つの実施態様ではさらに別の共刺激分子として役立つか、または、別の実施態様では、後述するように、本開示の方法によって送達されると、インビボで特定の部位にDCを標的させるのに役立つかもしれない。
一つの典型的な実施態様において、本開示の方法で使用される樹状細胞は、一つの実施態様では、DEC−205/CD205などの自己抗原の取り込みを増加させるエンドサイトーシス受容体であるCD83、またはDC−LAMP(CD208)細胞表面マーカーを、または、別の実施態様では、MHCクラスIおよびIIの産物を提示するさまざまなレベルの抗原を、または別の実施態様では、CD40、CD54、CD58、もしくはCD86などのアクセサリー分子(接着分子および共刺激分子)を、またはこれらを任意に組み合わせたものを発現することができる。別の実施態様において、該樹状細胞は、さまざまなレベルのCD115、CD14、CD68、またはCD32を発現することができる。
一つの典型的な実施態様において、本開示の方法には、成熟樹状細胞が使用される。一つの実施態様において、「成熟樹状細胞」という用語は、CD115、CD14、CD68、またはCD32の発現が低下している樹状細胞の集団を意味し、または別の実施態様において、CD86の発現が増加している細胞集団を意味し、またはこれらが併存する集団を意味する。別の実施態様において、成熟樹状細胞は、p55、CD83、CD40、またはCD86のうちの一つ以上のもの、またはこれらを組み合わせたものの発現の増加を示すであろう。別の実施態様において、本開示の方法で使用される樹状細胞は、その表面上にDEC−205受容体を発現させるであろう。別の実施態様において、DCの成熟は、例えば、CD40ライゲーション、CpGオリゴデオキシリボヌクレオチドの付加、IL−1、TNFα、もしくはTOLL様受容体リガンドのライゲーション、細菌のリポグリカンもしくは多糖の付加、またはTRAF−6もしくはNF−κBなど細胞内経路の活性化によって行うことができる。
一つの典型的な実施態様において、DCの成熟誘導は、予め選択された抗原のエンドサイトーシス受容体による送達と連動していてもよい。一つの実施態様において、エンドサイトーシス受容体による抗原の送達は、DEC−205受容体の使用を介していてもよい。
一つの典型的な実施態様において、樹状細胞の成熟状態は、例えば、1)p55抗原、CD83抗原、CD40抗原、またはCD86抗原の一つ以上の発現増加;2)CD115抗原、CD14抗原、CD32抗原、またはCD68の抗原の消失;または3)PBMCが未成熟樹状細胞に成熟するのを促進するサイトカインを除去した後に接着性が増大し、ベールが消失するということで特徴づけられるマクロファージ表現型への復帰のうちの一つ以上を、当技術分野においてよく知られている方法、例えば、免疫組織化学法、FACS解析法などによって検出することで確認することができる。
NKT増殖は、一つの実施態様では、提示抗原に応じて変化する。一つの実施態様において、樹状細胞がNKTと接触するのと同時に、本開示のα−GalCer類似体が培養液中に供給される。別の実施態様では、すでに抗原処理を終えた樹状細胞を、NKTと接触させる。
一つの典型的な実施態様において、本明細書では、「標的細胞を接触させる」という用語は、細胞を、指示されたものに直接的および間接的に曝露することを意味する。一つの実施態様において、NKTを、本開示に係るα−GalCer類似体、サイトカイン、増殖因子、樹状細胞、またはこれらを組み合わせたものに接触させるのは、直接的であるか、または間接的である。一つの実施態様において、細胞を接触させることは、当技術分野においてよく知られている方法、例えば、微量注入法などによって細胞を直接注入することを含みうる。別の実施多様においては、例えば、細胞を囲む培地中への供給や、または当技術分野においてよく知られている、下記に記載されているような経路を介した被検対象への投与によるなどして、細胞への供給を間接的に行うことも想定している。
樹状細胞を抗原刺激する方法は当業者によく知られており、例えば、Hsuら、Nature Med.2:52−58(1996)、またはSteinmanら、国際出願PCT/US93/03141号に記載されているように行うことができる。
一つに実施態様において、α−GalCer類似体を被検対象に投与し、別の実施態様では、樹状細胞を標的とするが、以下に記載するような方法では、インビボにおいて取り込みが起こる。
α−GalCer類似体の取り込みおよびプロセシングは、一つの実施態様では、24時間以内に起こりうるが、別の実施態様では、より長い期間、例えば、4日以下の期間が必要となることがあり、別の実施態様では、より短い時間、例えば、約1〜2時間が必要となることがある。
別の実施態様において、本開示に係る方法における樹状細胞によって増殖されたNKTは、その樹状細胞について、自家性、同系、または異種同系のものである。
一つの実施態様において、NKTを使用して、疾患特異的に免疫応答を調節することができる。すなわち、サイトカイン産生を促進するか、インターフェロン−γ、インターロイキン−2、および/またはインターロイキン−4などの特定のサイトカインプロファイルを誘導することが望まれる任意の免疫応答において、本開示に係るNKT細胞を利用することができ、そのような免疫応答が、本開示の実施態様を代表するものであると理解されるべきである。
別の実施態様において、本開示に係る方法は、さらに、予め単離されたNKTを、別の樹状細胞、および本開示に係るα−GalCer類似体とともに一定の期間培養して、さらなるNKT増殖、サイトカイン産生、またはその両方を生じさせる工程を含むことができる。
別の実施態様において、本開示は、被検対象の発症年齢を遅らせ、発症率を低下させ、または病気を抑制する方法であって、培養液中でNKTを樹状細胞および本開示に係るα−GalCer類似体と一定時間接触させて、NKT増殖、サイトカイン産生、またはその両方を生じさせる工程、および、このようにして得られた、被検対象の発症年齢を遅らせ、発症率を低下させ、または病気を抑制するNKTを被検対象に投与し、その結果、被検対象において発症年齢を遅らせ、発症率を低下させ、または病気を抑制する
一つの典型的な実施態様において、本開示で被検対象に投与される細胞は、組成物にして提供することができる。これらの組成物は、一つの実施態様では、非経口的または静脈内に投与することができる。投与用組成物は、一つの実施態様では、無菌溶液であってもよく、別の実施態様では、水性または非水性の懸濁液または乳液であってもよい。一つの実施態様において、本組成物は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、例えば、オレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステル、またはシクロデキストリンを含むことができる。別の実施態様において、組成物は、湿潤剤、乳化剤、および/または分散剤を含むこともできる。別の実施態様において、本組成物は、滅菌水、またはその他任意の無菌で注射可能な溶媒を含んでいてもよい。別の実施態様において、本組成物は、本明細書に記載された方法のいくつかのものでは、下記でさらに説明するように、免疫応答を促進することが望ましい場合には、当業者によく知られているアジュバント(例えば、ビタミンC、抗酸化剤など)を含むことができる。
一つの典型的な実施態様において、本開示で被検対象に投与される細胞は、組成物にして提供することができる。これらの組成物は、一つの実施態様では、非経口的または静脈内に投与することができる。投与用組成物は、一つの実施態様では、無菌溶液であってもよく、別の実施態様では、水性または非水性の懸濁液または乳液であってもよい。一つの実施態様において、本組成物は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、例えば、オレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステル、またはシクロデキストリンを含むことができる。別の実施態様において、組成物は、湿潤剤、乳化剤、および/または分散剤を含むこともできる。別の実施態様において、本組成物は、滅菌水、またはその他任意の無菌で注射可能な溶媒を含んでいてもよい。別の実施態様において、本組成物は、本明細書に記載された方法のいくつかのものでは、下記でさらに説明するように、免疫応答を促進することが望ましい場合には、当業者によく知られているアジュバント(例えば、ビタミンC、抗酸化剤など)を含むことができる。
一つの実施態様において、α−GalCer類似体、細胞、ワクチン、または本開示に係る組成物を、注射により被検対象に投与することができる。一つの実施態様において、注射は、当技術分野で知られた手段によればよく、例えば、リンパ内注射、または皮下注射なども可能である。
一つの実施態様では、本開示に係るα−GalCer類似体は、インビボにおいて、定常状態で樹状細胞に送達されるが、これは、別の実施態様では、疾患改善作用のあるNKTの増殖をもたらす。定常状態での類似体の送達は、一つの実施態様では、Bonifazら、(2002)Journal of Experimental Medicine 196:1627−1638;Manavalanら、(2003)Transpl Immunol.11:245−58に記載されたところに従って行うことができよう。
別の典型的な実施態様において、限定された種類の樹状細胞が、インビボにおいて、NKTを抗原刺激するよう作用する。
別の典型的な実施態様において、本開示は、不適切または望ましくない免疫応答を調節する方法を提供する。一つの実施態様において、この免疫応答は、宿主に有害なサイトカインプロファイルを特徴とする。
一つの典型的な実施態様において、本開示に係るNKTは、特定の病気の治療と同時に、例えば、標準的な抗癌療法と同時に患者に投与されて、所定の癌に対する補助療法として役立つかもしれない。別の実施態様において、本開示に係るNKTは、もう一方の治療を行う前に投与することもできる。
別の典型的な実施態様において、本開示は、病原体による感染に対する免疫応答であって、被検対象を防御しない免疫応答を調節する方法を提供する。
別の典型的な実施態様において、この免疫応答は、宿主にとって有益ではないサイトカインプロファイルをもたらす。一つの実施態様において、このサイトカインプロファイルは病気を悪化させる。一つの実施態様において、TH1応答が宿主に有益な場合に、例えば、らい腫型ハンセン病などにおいて、TH2応答が開始される。別の実施態様において、例えば、虫卵病原に対する応答が住血吸虫病であるときには、対象者の体内でTH1応答が開始して持続する。
別の典型的な実施態様において、本開示は、有効量の化合物または塩もしくは混合物を投与することによって、被検対象におけるサイトカイン応答を活性化させる方法を提供するが、該被検対象は、少なくとも一つのリンパ球および少なくとも一つの抗原提示細胞を含む細胞集団を含む適応免疫系を有し、該化合物は、化学式1の構造によって表されるか、またはその薬学的に許容される塩である。
ただし、式中、nは0から25であり、Xは、OおよびSから選択され、R1は、H、CH3、およびフェニルから選択されるが、該フェニルが、任意で、H、OH、OCH3、F、CF3、フェニル、フェニル−F、C1〜C6アルキル、またはC2〜C6分枝状アルキルであり、R2は、OHおよびHから選択され、R3は、C1〜C15アルキルおよびフェニルから選択されるが、該フェニルが、任意で、H、OH、OCH3、F、CF3、フェニル、C1〜C6アルキル、またはC2〜C6分枝状アルキルであり、R4は、OH、OSO3H、OSO3Na、およびOSO3Kから選択され、かつ、R5は、CH2OHおよびCO2Hフェニルから選択される。本方法は、該化合物と該抗原提示細胞との間に複合体を形成させるが、この複合体の形成は、上記リンパ球上にある受容体の活性化をもたらす。また、本方法は、リンパ球を活性化させてサイトカイン応答を生じさせる。
本方法のいくつかの態様において、上記少なくとも一つのリンパ球はTリンパ球であり、場合によっては、このTリンパ球はナチュラルキラーT細胞である。場合によっては、該ナチュラルキラーT細胞は、インバリアントナチュラルキラーT細胞である。いくつかの態様において。
いくつかの態様において、上記少なくとも一つの抗原提示細胞は樹状細胞である。場合によっては、この樹状細胞は、未成熟樹状細胞または成熟樹状細胞である。
本方法のいくつかの態様において、化合物の投与は、皮下投与、静脈内投与、鼻腔内投与、または筋肉内投与によって行われる。
本発明のいくつかの態様において、化合物は、抗原提示細胞上でCD1分子と複合体を形成する。場合によっては、このCD1分子はCD1d分子である。場合によっては、Tリンパ球上の受容体はT細胞受容体である。場合によっては、別の少なくとも一つのリンパ球を刺激するのは、サイトカイン応答を引き起こすためであり、場合によっては、このその他の少なくとも一つのリンパ球は、Tヘルパー細胞である。
本方法のいくつかの態様において、サイトカイン応答は、IFN−γ、IL−1β、IL−2、IL−3、IL−8、IL−12、IL−15、TNF−α、GM−CSF、RANTES、MIP−1α、およびMCP−1からなる群から選択することもできるTH1サイトカインを産生するTH1型サイトカイン応答である。
請求項1記載の方法のいくつかの態様において、サイトカイン応答は、IL−4、IL−6、IL−8、IL−10、IL−13、RANTES、MIP−1α、およびMCP−1からなる群から選択することもできるTH2サイトカインを産生するTH2型サイトカイン応答である。
いくつかの典型的な実施態様において、本開示は、有効量の化合物、または薬学的に許容されるその塩、およびワクチン成分を含むワクチンを提供するが、該化合物は、以下のものからなる群から選択される:
場合によっては、上記ワクチン成分は、死滅微生物、弱毒化生ウイルス、類毒素、および不活化微生物もしくは弱毒化微生物の断片からなる群から選択される。場合によっては、微生物は細菌または真菌である。場合によっては、類毒素は破傷風またはジフテリアである。場合によっては、ワクチン成分は、ワクチンを投与された被検対象において、免疫応答を誘導することができる。場合によっては、上記化合物は免疫アジュバントとして働き、免疫系を刺激することによって、ワクチン成分によって誘導される免疫応答を修正または増強することができ、該化合物がない場合よりも活発にワクチンに応答する被検対象をもたらす。
いくつかの典型的な実施態様において、本開示は、以下の化学式で表される化合物からなる群から選択される化合物または薬学的に許容されるその塩の有効量を投与することを含む抗腫瘍免疫療法を提供する:
本方法のいくつかの態様において、投与は、少なくとも一つの癌、癌のリスク増加、または前癌性前駆体に基づいて行われる。本方法のいくつかの態様において、化合物の投与により、少なくとも一つの腫瘍細胞または癌細胞において応答が誘導される。本方法のいくつかの態様において、誘導される応答は腫瘍増殖の緩徐化である。本方法のいくつかの態様において、誘導される応答は腫瘍の大きさの縮小である。
いくつかの典型的な実施態様において、本方法は、少なくとも一つのリンパ球を含む細胞集団を含み、誘導される応答が細胞集団の増幅であるという適応免疫系をもたらすために上記化合物を投与することを含む。
本方法のいくつかの態様において、適応免疫系における細胞集団の増幅は、T細胞、CD8T細胞、NK細胞、またはNKT細胞の数が増加することを含む。いくつかの態様において、本方法は、上記化合物が添加されている癌ワクチンを提供することを含む。本方法のいくつかの態様において、癌は、肺癌、乳癌、肝臓癌、白血病、固形腫瘍、および癌腫からなる群から選択される。
いくつかの典型的な実施態様において、本方法は、被検対象に、化合物または薬学的に許容されるその塩の有効量を投与することを含む抗菌免疫療法を提供する。ただし、該化合物は、以下の化学式で表される化合物からなる群から選択される:
本方法のいくつかの態様において、投与は、微生物性病原体の存在によって引き起こされる感染症に基づいている。本方法のいくつかの態様において、微生物性病原体は、ウイルス、細菌、真菌、原生生物、多細胞寄生生物、および異常型タンパク質からなる群から選択される。本方法のいくつかの態様において、微生物性病原体はウイルスである。本方法のいくつかの態様において、ウイルスは、レトロウイルス科、ピコルナウイルス科、カリシウイルス科、トガウイルス科、フラビウイルス科、コロナウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブンガウイルス科(Bungaviridae)、アレナウイルス科、レオウイルス科、ビルナウイルス科、ヘパドナウイルス科、パルボウイルス科、パポバウイルス科、アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、およびイリドウイルス科からなる群から選択される。本方法のいくつかの態様において、微生物性病原体は細菌である。本方法のいくつかの態様において、細菌は、ピロリ菌(Helicobacter pylori)、ライム病ボレリア(Borellia burgdorferi)、レジオネラニューモフィリア菌(Legionella pneumophilia)、肺炎桿菌、マイコバクテリア種、黄色ブドウ球菌、淋菌、髄膜炎菌、リステリア菌、化膿連鎖球菌、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、連鎖球菌、大便連鎖球菌、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、肺炎連鎖球菌、病原性カンピロバクター種、エンテロコッカス種、クラミジア種、インフルエンザ菌、炭疽菌(Bacillus antracis)、ジフテリア菌、コルネバクテリウム種、ブタ丹毒菌、ウェルシュ菌(Clostridium perfringers)、破傷風菌、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)、肺炎桿菌、パスツレラ・ムルトシダ(Pasturella multocida)、バクテロイデス種、フソバクテリウム・ヌクレアタム(Fusobacterium nucleatum)、モニリホルム連鎖桿菌(Streptobacillus moniliformis)、梅毒トレポネーマ、トレポネーマ・ペルテニュ(Treponema pertenue)、レプトスピラ属、イスラエル放射菌(Actinomyces israelii)、スフィンゴモナス・カプスラータ(Sphingomonas capsulata)、および野兎病菌からなる群から選択される。本方法のいくつかの態様において、化合物を被検対象に投与すると、該化合物を投与されなかった被検対象と比較して細菌除去が促進される。本方法のいくつかの態様において、化合物を被検対象に投与すると、微生物因子の死滅がもたらされる。本方法のいくつかの態様において、該化合物の投与の結果、微生物因子が増殖できなくなる。
典型的な実施態様において、本開示は、以下の化学式2の構造によって表される化合物を提供する:
本特許または出願は、色つきで作成された少なくとも一つの図面を含む。カラー版の図面が載った本特許または本特許出願の公報は、請求を行い、必要な費用を支払えば、特許庁より提供されるはずである。
図A〜Bは、ナチュラルキラーT細胞(NKT)の機能を示す略図である。図1Aは、一般的な仕組みを示している。図1Bは、アルファ−ガラクトシルセラミド(α−GalCer)、および本開示に係るα−GalCer類似体が、どのようにしてCD1dに結合して、TH1およびTH2の迅速なサイトカイン応答を刺激することができるかを示している。
α−GalCer(C1)および、本開示に係るさまざまなα−GalCer糖脂質(類似体とも呼ばれる)の化学構造を示しており、細菌由来の糖脂質(C3、C3、およびC14)、スルホン化によって修飾された糖脂質(C4、C5、およびC9)、フェニル−アルキル鎖糖脂質(C6〜C8、C10〜C11、C15〜C16、C18〜C33、7DW8−5(aka、C8−5)および7DW8−6(aka、C8−6))およびフィトスフィンゴシン切断型糖脂質(C12、C13およびC17)が含まれている。
α−GalCer(C1)および、本開示に係るさまざまなα−GalCer糖脂質(類似体とも呼ばれる)の化学構造を示しており、細菌由来の糖脂質(C3、C3、およびC14)、スルホン化によって修飾された糖脂質(C4、C5、およびC9)、フェニル−アルキル鎖糖脂質(C6〜C8、C10〜C11、C15〜C16、C18〜C33、7DW8−5(aka、C8−5)および7DW8−6(aka、C8−6))およびフィトスフィンゴシン切断型糖脂質(C12、C13およびC17)が含まれている。
α−GalCer(C1)および、本開示に係るさまざまなα−GalCer糖脂質(類似体とも呼ばれる)の化学構造を示しており、細菌由来の糖脂質(C3、C3、およびC14)、スルホン化によって修飾された糖脂質(C4、C5、およびC9)、フェニル−アルキル鎖糖脂質(C6〜C8、C10〜C11、C15〜C16、C18〜C33、7DW8−5(aka、C8−5)および7DW8−6(aka、C8−6))およびフィトスフィンゴシン切断型糖脂質(C12、C13およびC17)が含まれている。
α−GalCer(C1)および、本開示に係るさまざまなα−GalCer糖脂質(類似体とも呼ばれる)の化学構造を示しており、細菌由来の糖脂質(C3、C3、およびC14)、スルホン化によって修飾された糖脂質(C4、C5、およびC9)、フェニル−アルキル鎖糖脂質(C6〜C8、C10〜C11、C15〜C16、C18〜C33、7DW8−5(aka、C8−5)および7DW8−6(aka、C8−6))およびフィトスフィンゴシン切断型糖脂質(C12、C13およびC17)が含まれている。
本開示に係るC12およびC13のα−GalCer類似体の合成スキームを示している。
α−GalCerまたは表示されている本開示のα−GalCer類似体によって処理されたマウス1.2ハイブリドーマによるIL−2サイトカインの分泌量(pg/ml)を示している。
図A〜Cは、α−GalCerまたは表示されている本開示のα−GalCer類似体によって処理され、自家性の未成熟CD14+DCと同時培養されたヒトCD161+/CD3+NKTによる、(図A)INF−γおよびIL−4のサイトカイン産生、(図B)IL−2およびIL−6のサイトカイン産生、ならびに(図C)IL−12およびIL−10のサイトカイン産生を、DMSO対照に対して標準化した「増加倍率」を示す。左側の図はTH1型の応答を示し、右側の図はTH2型の応答を示す。
図A〜Cは、α−GalCerまたは表示されている本開示のα−GalCer類似体によって処理され、自家性の未成熟CD14+DCと同時培養されたヒトCD161+/CD3+NKTによる、(図A)INF−γおよびIL−4のサイトカイン産生、(図B)IL−2およびIL−6のサイトカイン産生、ならびに(図C)IL−12およびIL−10のサイトカイン産生を、DMSO対照に対して標準化した「増加倍率」を示す。左側の図はTH1型の応答を示し、右側の図はTH2型の応答を示す。
図A〜Cは、α−GalCerまたは表示されている本開示のα−GalCer類似体によって処理され、自家性の未成熟CD14+DCと同時培養されたヒトCD161+/CD3+NKTによる、(図A)INF−γおよびIL−4のサイトカイン産生、(図B)IL−2およびIL−6のサイトカイン産生、ならびに(図C)IL−12およびIL−10のサイトカイン産生を、DMSO対照に対して標準化した「増加倍率」を示す。左側の図はTH1型の応答を示し、右側の図はTH2型の応答を示す。
図A〜Bは、(図A)ヒトCD161+CD3+NKTの純度、および、(図B)図5に示されたデータから得られたIFN−γ/IL−4サイトカイン産生を対照(DMSO)に対して標準化したものの比の「増加倍率」を示している。
α−GalCerまたは表示されている本開示のα−GalCer類似体によって処理された、図5および図6のヒトNKTの上清中の基礎サイトカイン濃度に対する増加倍率を示す表である。
図8A〜Fは、α−GalCerまたは表示されている本開示のα−GalCer類似体によって処理され、自家性の未成熟DCと同時培養されたナイーブヒトNKTによる、(図A)IFN−γサイトカイン産生、(図B)IL−4サイトカイン産生、(図C)IFN−γ/IL−4サイトカイン産生の比、(図D)IL−2サイトカイン産生、(図E)IL−12サイトカイン産生、および(図F)IL−6サイトカイン産生を、対照(DMSO)に対して標準化した「増加倍率」を示している。
図8A〜Fは、α−GalCerまたは表示されている本開示のα−GalCer類似体によって処理され、自家性の未成熟DCと同時培養されたナイーブヒトNKTによる、(図A)IFN−γサイトカイン産生、(図B)IL−4サイトカイン産生、(図C)IFN−γ/IL−4サイトカイン産生の比、(図D)IL−2サイトカイン産生、(図E)IL−12サイトカイン産生、および(図F)IL−6サイトカイン産生を、対照(DMSO)に対して標準化した「増加倍率」を示している。
図8A〜Fは、α−GalCerまたは表示されている本開示のα−GalCer類似体によって処理され、自家性の未成熟DCと同時培養されたナイーブヒトNKTによる、(図A)IFN−γサイトカイン産生、(図B)IL−4サイトカイン産生、(図C)IFN−γ/IL−4サイトカイン産生の比、(図D)IL−2サイトカイン産生、(図E)IL−12サイトカイン産生、および(図F)IL−6サイトカイン産生を、対照(DMSO)に対して標準化した「増加倍率」を示している。
図8A〜Fは、α−GalCerまたは表示されている本開示のα−GalCer類似体によって処理され、自家性の未成熟DCと同時培養されたナイーブヒトNKTによる、(図A)IFN−γサイトカイン産生、(図B)IL−4サイトカイン産生、(図C)IFN−γ/IL−4サイトカイン産生の比、(図D)IL−2サイトカイン産生、(図E)IL−12サイトカイン産生、および(図F)IL−6サイトカイン産生を、対照(DMSO)に対して標準化した「増加倍率」を示している。
図8A〜Fは、α−GalCerまたは表示されている本開示のα−GalCer類似体によって処理され、自家性の未成熟DCと同時培養されたナイーブヒトNKTによる、(図A)IFN−γサイトカイン産生、(図B)IL−4サイトカイン産生、(図C)IFN−γ/IL−4サイトカイン産生の比、(図D)IL−2サイトカイン産生、(図E)IL−12サイトカイン産生、および(図F)IL−6サイトカイン産生を、対照(DMSO)に対して標準化した「増加倍率」を示している。
図8A〜Fは、α−GalCerまたは表示されている本開示のα−GalCer類似体によって処理され、自家性の未成熟DCと同時培養されたナイーブヒトNKTによる、(図A)IFN−γサイトカイン産生、(図B)IL−4サイトカイン産生、(図C)IFN−γ/IL−4サイトカイン産生の比、(図D)IL−2サイトカイン産生、(図E)IL−12サイトカイン産生、および(図F)IL−6サイトカイン産生を、対照(DMSO)に対して標準化した「増加倍率」を示している。
表示されている本開示に係るα−GalCer類似体に応答したiNKTの総数の変化の倍率を示している。
図A〜Eは、α−GalCerまたは表示されている本開示に係るα−GalCer類似体によって処理された、(図A)自家樹状細胞と同時培養されているナイーブiNKT、(図B)HeLa−CD1d細胞と同時培養されているナイーブiNKT、(図C)HeLa−CD1d細胞と同時培養されている、α−GalCerでパルスされたiNKT細胞、および(図D)HeLa−CD1d細胞と同時培養されている、α−GalCer類似体C11でパルスされたiNKT細胞によるIFN−γサイトカイン産生を、賦形剤対照(DMSO)に対して標準化したものを示す。(図E)は、ヒトのナイーブiNKT、α−GalCerでパルスされたiNKTおよび、α−GalCer類似体C11でパルスされたiNKTにおける、IFN−γサイトカイン産生のさまざまな基礎レベルを示している。
図A〜Eは、α−GalCerまたは表示されている本開示に係るα−GalCer類似体によって処理された、(図A)自家樹状細胞と同時培養されているナイーブiNKT、(図B)HeLa−CD1d細胞と同時培養されているナイーブiNKT、(図C)HeLa−CD1d細胞と同時培養されている、α−GalCerでパルスされたiNKT細胞、および(図D)HeLa−CD1d細胞と同時培養されている、α−GalCer類似体C11でパルスされたiNKT細胞によるIFN−γサイトカイン産生を、賦形剤対照(DMSO)に対して標準化したものを示す。(図E)は、ヒトのナイーブiNKT、α−GalCerでパルスされたiNKTおよび、α−GalCer類似体C11でパルスされたiNKTにおける、IFN−γサイトカイン産生のさまざまな基礎レベルを示している。
図A〜Eは、α−GalCerまたは表示されている本開示に係るα−GalCer類似体によって処理された、(図A)自家樹状細胞と同時培養されているナイーブiNKT、(図B)HeLa−CD1d細胞と同時培養されているナイーブiNKT、(図C)HeLa−CD1d細胞と同時培養されている、α−GalCerでパルスされたiNKT細胞、および(図D)HeLa−CD1d細胞と同時培養されている、α−GalCer類似体C11でパルスされたiNKT細胞によるIFN−γサイトカイン産生を、賦形剤対照(DMSO)に対して標準化したものを示す。(図E)は、ヒトのナイーブiNKT、α−GalCerでパルスされたiNKTおよび、α−GalCer類似体C11でパルスされたiNKTにおける、IFN−γサイトカイン産生のさまざまな基礎レベルを示している。
図A〜Eは、α−GalCerまたは表示されている本開示に係るα−GalCer類似体によって処理された、(図A)自家樹状細胞と同時培養されているナイーブiNKT、(図B)HeLa−CD1d細胞と同時培養されているナイーブiNKT、(図C)HeLa−CD1d細胞と同時培養されている、α−GalCerでパルスされたiNKT細胞、および(図D)HeLa−CD1d細胞と同時培養されている、α−GalCer類似体C11でパルスされたiNKT細胞によるIFN−γサイトカイン産生を、賦形剤対照(DMSO)に対して標準化したものを示す。(図E)は、ヒトのナイーブiNKT、α−GalCerでパルスされたiNKTおよび、α−GalCer類似体C11でパルスされたiNKTにおける、IFN−γサイトカイン産生のさまざまな基礎レベルを示している。
図A〜Eは、α−GalCerまたは表示されている本開示に係るα−GalCer類似体によって処理された、(図A)自家樹状細胞と同時培養されているナイーブiNKT、(図B)HeLa−CD1d細胞と同時培養されているナイーブiNKT、(図C)HeLa−CD1d細胞と同時培養されている、α−GalCerでパルスされたiNKT細胞、および(図D)HeLa−CD1d細胞と同時培養されている、α−GalCer類似体C11でパルスされたiNKT細胞によるIFN−γサイトカイン産生を、賦形剤対照(DMSO)に対して標準化したものを示す。(図E)は、ヒトのナイーブiNKT、α−GalCerでパルスされたiNKTおよび、α−GalCer類似体C11でパルスされたiNKTにおける、IFN−γサイトカイン産生のさまざまな基礎レベルを示している。
図A〜Cは、α−GalCerまたは表示されている本開示に係るα−GalCer類似体によって処理されたヒトのナイーブiNKTによる(図A)IFN−γサイトカインの分泌レベル(pg/ml)、(図B)IL−4サイトカインの分泌レベル(pg/ml)、および(図C)IFN−γ/IL−4比を示している。
α−GalCerまたは表示されている本開示に係るα−GalCer類似体によって処理された、図10で得られたヒトNKTの上清中における血清の基礎濃度に対する増加倍率を示す表である。
自家性の未成熟CD14+樹状細胞とともに培養され、α−GalCerまたは表示されている本開示に係るα−GalCer類似体でパルスされたヒトCD56+細胞(NK/NKT混合細胞)の増殖に関する代表的なフローサイトメトリーのデータを示している。
図13のNK/NKT混合物細胞に存在するiNKT(103)の総数を示している。
図A〜Bは、α−GalCerまたは表示されている本開示に係るα−GalCer類似体でパルスされた自家性の未成熟CD14+樹状細胞とともに培養されたヒトCD56+細胞(NK/NKT混合細胞)の増殖に関する代表的なフローサイトメトリーのデータを示している。図Aは、NK/NKT混合細胞におけるCD161+/Vα24TCR+細胞の割合の代表的なフローサイトメトリーのデータを示し、図Bは、NK/NKT混合細胞中に見出されたiNKTの総数の増加倍率を示している。
図A〜Bは、α−GalCerまたは表示されている本開示に係るα−GalCer類似体でパルスされた自家性の未成熟CD14+樹状細胞とともに培養されたヒトCD56+細胞(NK/NKT混合細胞)の増殖に関する代表的なフローサイトメトリーのデータを示している。図Aは、NK/NKT混合細胞におけるCD161+/Vα24TCR+細胞の割合の代表的なフローサイトメトリーのデータを示し、図Bは、NK/NKT混合細胞中に見出されたiNKTの総数の増加倍率を示している。
未成熟のヒトDCを、α−GalCerまたは表示されている本開示に係るα−GalCer類似体とともにインキュベートした後の樹状細胞(DC)上における、表面タンパク質CD40、CD80、CD86、およびCD83、ならびにMHCクラスII細胞表面受容体HLA−DRの発現量を、平均蛍光強度(MFI)として示したものである。
図A〜Bは、本開示に係るα−GalCer類似体C13がヒト単球由来のDCの成熟を促進する仕組みを示している。図Aは、C13に応答した、DCにおけるCD40、CD80、CD83、CD86、およびHLA−DRの発現のヒストグラムを示している。図Bは、C13とともに48時間インキュベートされたDCの形態を示している。
図A〜Bは、本開示に係るα−GalCer類似体C13がヒト単球由来のDCの成熟を促進する仕組みを示している。図Aは、C13に応答した、DCにおけるCD40、CD80、CD83、CD86、およびHLA−DRの発現のヒストグラムを示している。図Bは、C13とともに48時間インキュベートされたDCの形態を示している。
iNKT細胞受容体のシグナル伝達経路の略図を示す。
図A〜Eは、本開示に係るα−GalCer類似体が、ヒトNKTのCD1d依存性T細胞受容体(TCR)活性化を促進する仕組みを明らかにしている。図Aは、CD1dで形質転換されたHeLa細胞(HeLa−CD1d)におけるCD1d発現を示している。図Bは、ホスホ−CD3εの細胞内レベルを示している。図Cは、ホスホ−ERK1/2の細胞内レベルを示している。図Dは、ホスホ−Sykの細胞内レベルを示している。図E、ホスホ−CREBの細胞内レベルを示している。
図A〜Eは、本開示に係るα−GalCer類似体が、ヒトNKTのCD1d依存性T細胞受容体(TCR)活性化を促進する仕組みを明らかにしている。図Aは、CD1dで形質転換されたHeLa細胞(HeLa−CD1d)におけるCD1d発現を示している。図Bは、ホスホ−CD3εの細胞内レベルを示している。図Cは、ホスホ−ERK1/2の細胞内レベルを示している。図Dは、ホスホ−Sykの細胞内レベルを示している。図E、ホスホ−CREBの細胞内レベルを示している。
図A〜Eは、本開示に係るα−GalCer類似体が、ヒトNKTのCD1d依存性T細胞受容体(TCR)活性化を促進する仕組みを明らかにしている。図Aは、CD1dで形質転換されたHeLa細胞(HeLa−CD1d)におけるCD1d発現を示している。図Bは、ホスホ−CD3εの細胞内レベルを示している。図Cは、ホスホ−ERK1/2の細胞内レベルを示している。図Dは、ホスホ−Sykの細胞内レベルを示している。図E、ホスホ−CREBの細胞内レベルを示している。
図A〜Eは、本開示に係るα−GalCer類似体が、ヒトNKTのCD1d依存性T細胞受容体(TCR)活性化を促進する仕組みを明らかにしている。図Aは、CD1dで形質転換されたHeLa細胞(HeLa−CD1d)におけるCD1d発現を示している。図Bは、ホスホ−CD3εの細胞内レベルを示している。図Cは、ホスホ−ERK1/2の細胞内レベルを示している。図Dは、ホスホ−Sykの細胞内レベルを示している。図E、ホスホ−CREBの細胞内レベルを示している。
図A〜Eは、本開示に係るα−GalCer類似体が、ヒトNKTのCD1d依存性T細胞受容体(TCR)活性化を促進する仕組みを明らかにしている。図Aは、CD1dで形質転換されたHeLa細胞(HeLa−CD1d)におけるCD1d発現を示している。図Bは、ホスホ−CD3εの細胞内レベルを示している。図Cは、ホスホ−ERK1/2の細胞内レベルを示している。図Dは、ホスホ−Sykの細胞内レベルを示している。図E、ホスホ−CREBの細胞内レベルを示している。
図A〜Lは、本開示に係るα−GalCer類似体が、ナイーブヒトiNKT(Vα24+)のCD1d依存性T細胞受容体(TCR)活性化を促進する仕組みを明らかにしている。図Aは、単離されたナイーブヒトVα24+T細胞のフローサイトメトリーによる測定結果を示す。図B〜Lは、iNKT上におけるTCRの活性化を示している。HeLa細胞またはHeLa−CD1d細胞に、α−GalCer、またはα−GalCer類似体であるC16、C23、7DW8−5、7DW8−6、またはC26を投入してから、細胞をナイーブVα24+T細胞に添加した。以下のリン酸化タンパク質の細胞内レベルを測定して蛍光強度の中央値として表し、全投入タンパク質量に対して標準化した:(図B)ホスホ−CD3ε(ホスホチロシン)、(図C)ホスホ−CREB(Ser−133)、(図D)ホスホ−ERK1/2(Thr−185/Tyr−187)、(図E)ホスホ−p38(Thr−180/Tyr−182)、(図F)ホスホ−IKBα(Ser32)、(図G)ホスホ−Lck、(図H)ホスホ−Lat、(図I)ホスホ−STAT3(Ser727)、(図J)ホスホ−STAT5 A/B(Tyr 694/699)、(図K)ホスホ−Syk(ホスホ−チロシン)、および(図L)ホスホ−Zap−70(ホスホ−チロシン)。*p<0.05、DMSO対照と比較した場合、および、#、p<0.05、α−GalCerと比較した場合。
図A〜Lは、本開示に係るα−GalCer類似体が、ナイーブヒトiNKT(Vα24+)のCD1d依存性T細胞受容体(TCR)活性化を促進する仕組みを明らかにしている。図Aは、単離されたナイーブヒトVα24+T細胞のフローサイトメトリーによる測定結果を示す。図B〜Lは、iNKT上におけるTCRの活性化を示している。HeLa細胞またはHeLa−CD1d細胞に、α−GalCer、またはα−GalCer類似体であるC16、C23、7DW8−5、7DW8−6、またはC26を投入してから、細胞をナイーブVα24+T細胞に添加した。以下のリン酸化タンパク質の細胞内レベルを測定して蛍光強度の中央値として表し、全投入タンパク質量に対して標準化した:(図B)ホスホ−CD3ε(ホスホチロシン)、(図C)ホスホ−CREB(Ser−133)、(図D)ホスホ−ERK1/2(Thr−185/Tyr−187)、(図E)ホスホ−p38(Thr−180/Tyr−182)、(図F)ホスホ−IKBα(Ser32)、(図G)ホスホ−Lck、(図H)ホスホ−Lat、(図I)ホスホ−STAT3(Ser727)、(図J)ホスホ−STAT5 A/B(Tyr 694/699)、(図K)ホスホ−Syk(ホスホ−チロシン)、および(図L)ホスホ−Zap−70(ホスホ−チロシン)。*p<0.05、DMSO対照と比較した場合、および、#、p<0.05、α−GalCerと比較した場合。
図A〜Lは、本開示に係るα−GalCer類似体が、ナイーブヒトiNKT(Vα24+)のCD1d依存性T細胞受容体(TCR)活性化を促進する仕組みを明らかにしている。図Aは、単離されたナイーブヒトVα24+T細胞のフローサイトメトリーによる測定結果を示す。図B〜Lは、iNKT上におけるTCRの活性化を示している。HeLa細胞またはHeLa−CD1d細胞に、α−GalCer、またはα−GalCer類似体であるC16、C23、7DW8−5、7DW8−6、またはC26を投入してから、細胞をナイーブVα24+T細胞に添加した。以下のリン酸化タンパク質の細胞内レベルを測定して蛍光強度の中央値として表し、全投入タンパク質量に対して標準化した:(図B)ホスホ−CD3ε(ホスホチロシン)、(図C)ホスホ−CREB(Ser−133)、(図D)ホスホ−ERK1/2(Thr−185/Tyr−187)、(図E)ホスホ−p38(Thr−180/Tyr−182)、(図F)ホスホ−IKBα(Ser32)、(図G)ホスホ−Lck、(図H)ホスホ−Lat、(図I)ホスホ−STAT3(Ser727)、(図J)ホスホ−STAT5 A/B(Tyr 694/699)、(図K)ホスホ−Syk(ホスホ−チロシン)、および(図L)ホスホ−Zap−70(ホスホ−チロシン)。*p<0.05、DMSO対照と比較した場合、および、#、p<0.05、α−GalCerと比較した場合。
図A〜Lは、本開示に係るα−GalCer類似体が、ナイーブヒトiNKT(Vα24+)のCD1d依存性T細胞受容体(TCR)活性化を促進する仕組みを明らかにしている。図Aは、単離されたナイーブヒトVα24+T細胞のフローサイトメトリーによる測定結果を示す。図B〜Lは、iNKT上におけるTCRの活性化を示している。HeLa細胞またはHeLa−CD1d細胞に、α−GalCer、またはα−GalCer類似体であるC16、C23、7DW8−5、7DW8−6、またはC26を投入してから、細胞をナイーブVα24+T細胞に添加した。以下のリン酸化タンパク質の細胞内レベルを測定して蛍光強度の中央値として表し、全投入タンパク質量に対して標準化した:(図B)ホスホ−CD3ε(ホスホチロシン)、(図C)ホスホ−CREB(Ser−133)、(図D)ホスホ−ERK1/2(Thr−185/Tyr−187)、(図E)ホスホ−p38(Thr−180/Tyr−182)、(図F)ホスホ−IKBα(Ser32)、(図G)ホスホ−Lck、(図H)ホスホ−Lat、(図I)ホスホ−STAT3(Ser727)、(図J)ホスホ−STAT5 A/B(Tyr 694/699)、(図K)ホスホ−Syk(ホスホ−チロシン)、および(図L)ホスホ−Zap−70(ホスホ−チロシン)。*p<0.05、DMSO対照と比較した場合、および、#、p<0.05、α−GalCerと比較した場合。
図A〜Lは、本開示に係るα−GalCer類似体が、ナイーブヒトiNKT(Vα24+)のCD1d依存性T細胞受容体(TCR)活性化を促進する仕組みを明らかにしている。図Aは、単離されたナイーブヒトVα24+T細胞のフローサイトメトリーによる測定結果を示す。図B〜Lは、iNKT上におけるTCRの活性化を示している。HeLa細胞またはHeLa−CD1d細胞に、α−GalCer、またはα−GalCer類似体であるC16、C23、7DW8−5、7DW8−6、またはC26を投入してから、細胞をナイーブVα24+T細胞に添加した。以下のリン酸化タンパク質の細胞内レベルを測定して蛍光強度の中央値として表し、全投入タンパク質量に対して標準化した:(図B)ホスホ−CD3ε(ホスホチロシン)、(図C)ホスホ−CREB(Ser−133)、(図D)ホスホ−ERK1/2(Thr−185/Tyr−187)、(図E)ホスホ−p38(Thr−180/Tyr−182)、(図F)ホスホ−IKBα(Ser32)、(図G)ホスホ−Lck、(図H)ホスホ−Lat、(図I)ホスホ−STAT3(Ser727)、(図J)ホスホ−STAT5 A/B(Tyr 694/699)、(図K)ホスホ−Syk(ホスホ−チロシン)、および(図L)ホスホ−Zap−70(ホスホ−チロシン)。*p<0.05、DMSO対照と比較した場合、および、#、p<0.05、α−GalCerと比較した場合。
図A〜Lは、本開示に係るα−GalCer類似体が、ナイーブヒトiNKT(Vα24+)のCD1d依存性T細胞受容体(TCR)活性化を促進する仕組みを明らかにしている。図Aは、単離されたナイーブヒトVα24+T細胞のフローサイトメトリーによる測定結果を示す。図B〜Lは、iNKT上におけるTCRの活性化を示している。HeLa細胞またはHeLa−CD1d細胞に、α−GalCer、またはα−GalCer類似体であるC16、C23、7DW8−5、7DW8−6、またはC26を投入してから、細胞をナイーブVα24+T細胞に添加した。以下のリン酸化タンパク質の細胞内レベルを測定して蛍光強度の中央値として表し、全投入タンパク質量に対して標準化した:(図B)ホスホ−CD3ε(ホスホチロシン)、(図C)ホスホ−CREB(Ser−133)、(図D)ホスホ−ERK1/2(Thr−185/Tyr−187)、(図E)ホスホ−p38(Thr−180/Tyr−182)、(図F)ホスホ−IKBα(Ser32)、(図G)ホスホ−Lck、(図H)ホスホ−Lat、(図I)ホスホ−STAT3(Ser727)、(図J)ホスホ−STAT5 A/B(Tyr 694/699)、(図K)ホスホ−Syk(ホスホ−チロシン)、および(図L)ホスホ−Zap−70(ホスホ−チロシン)。*p<0.05、DMSO対照と比較した場合、および、#、p<0.05、α−GalCerと比較した場合。
図A〜Lは、本開示に係るα−GalCer類似体が、ナイーブヒトiNKT(Vα24+)のCD1d依存性T細胞受容体(TCR)活性化を促進する仕組みを明らかにしている。図Aは、単離されたナイーブヒトVα24+T細胞のフローサイトメトリーによる測定結果を示す。図B〜Lは、iNKT上におけるTCRの活性化を示している。HeLa細胞またはHeLa−CD1d細胞に、α−GalCer、またはα−GalCer類似体であるC16、C23、7DW8−5、7DW8−6、またはC26を投入してから、細胞をナイーブVα24+T細胞に添加した。以下のリン酸化タンパク質の細胞内レベルを測定して蛍光強度の中央値として表し、全投入タンパク質量に対して標準化した:(図B)ホスホ−CD3ε(ホスホチロシン)、(図C)ホスホ−CREB(Ser−133)、(図D)ホスホ−ERK1/2(Thr−185/Tyr−187)、(図E)ホスホ−p38(Thr−180/Tyr−182)、(図F)ホスホ−IKBα(Ser32)、(図G)ホスホ−Lck、(図H)ホスホ−Lat、(図I)ホスホ−STAT3(Ser727)、(図J)ホスホ−STAT5 A/B(Tyr 694/699)、(図K)ホスホ−Syk(ホスホ−チロシン)、および(図L)ホスホ−Zap−70(ホスホ−チロシン)。*p<0.05、DMSO対照と比較した場合、および、#、p<0.05、α−GalCerと比較した場合。
図A〜Lは、本開示に係るα−GalCer類似体が、ナイーブヒトiNKT(Vα24+)のCD1d依存性T細胞受容体(TCR)活性化を促進する仕組みを明らかにしている。図Aは、単離されたナイーブヒトVα24+T細胞のフローサイトメトリーによる測定結果を示す。図B〜Lは、iNKT上におけるTCRの活性化を示している。HeLa細胞またはHeLa−CD1d細胞に、α−GalCer、またはα−GalCer類似体であるC16、C23、7DW8−5、7DW8−6、またはC26を投入してから、細胞をナイーブVα24+T細胞に添加した。以下のリン酸化タンパク質の細胞内レベルを測定して蛍光強度の中央値として表し、全投入タンパク質量に対して標準化した:(図B)ホスホ−CD3ε(ホスホチロシン)、(図C)ホスホ−CREB(Ser−133)、(図D)ホスホ−ERK1/2(Thr−185/Tyr−187)、(図E)ホスホ−p38(Thr−180/Tyr−182)、(図F)ホスホ−IKBα(Ser32)、(図G)ホスホ−Lck、(図H)ホスホ−Lat、(図I)ホスホ−STAT3(Ser727)、(図J)ホスホ−STAT5 A/B(Tyr 694/699)、(図K)ホスホ−Syk(ホスホ−チロシン)、および(図L)ホスホ−Zap−70(ホスホ−チロシン)。*p<0.05、DMSO対照と比較した場合、および、#、p<0.05、α−GalCerと比較した場合。
図A〜Lは、本開示に係るα−GalCer類似体が、ナイーブヒトiNKT(Vα24+)のCD1d依存性T細胞受容体(TCR)活性化を促進する仕組みを明らかにしている。図Aは、単離されたナイーブヒトVα24+T細胞のフローサイトメトリーによる測定結果を示す。図B〜Lは、iNKT上におけるTCRの活性化を示している。HeLa細胞またはHeLa−CD1d細胞に、α−GalCer、またはα−GalCer類似体であるC16、C23、7DW8−5、7DW8−6、またはC26を投入してから、細胞をナイーブVα24+T細胞に添加した。以下のリン酸化タンパク質の細胞内レベルを測定して蛍光強度の中央値として表し、全投入タンパク質量に対して標準化した:(図B)ホスホ−CD3ε(ホスホチロシン)、(図C)ホスホ−CREB(Ser−133)、(図D)ホスホ−ERK1/2(Thr−185/Tyr−187)、(図E)ホスホ−p38(Thr−180/Tyr−182)、(図F)ホスホ−IKBα(Ser32)、(図G)ホスホ−Lck、(図H)ホスホ−Lat、(図I)ホスホ−STAT3(Ser727)、(図J)ホスホ−STAT5 A/B(Tyr 694/699)、(図K)ホスホ−Syk(ホスホ−チロシン)、および(図L)ホスホ−Zap−70(ホスホ−チロシン)。*p<0.05、DMSO対照と比較した場合、および、#、p<0.05、α−GalCerと比較した場合。
図A〜Lは、本開示に係るα−GalCer類似体が、ナイーブヒトiNKT(Vα24+)のCD1d依存性T細胞受容体(TCR)活性化を促進する仕組みを明らかにしている。図Aは、単離されたナイーブヒトVα24+T細胞のフローサイトメトリーによる測定結果を示す。図B〜Lは、iNKT上におけるTCRの活性化を示している。HeLa細胞またはHeLa−CD1d細胞に、α−GalCer、またはα−GalCer類似体であるC16、C23、7DW8−5、7DW8−6、またはC26を投入してから、細胞をナイーブVα24+T細胞に添加した。以下のリン酸化タンパク質の細胞内レベルを測定して蛍光強度の中央値として表し、全投入タンパク質量に対して標準化した:(図B)ホスホ−CD3ε(ホスホチロシン)、(図C)ホスホ−CREB(Ser−133)、(図D)ホスホ−ERK1/2(Thr−185/Tyr−187)、(図E)ホスホ−p38(Thr−180/Tyr−182)、(図F)ホスホ−IKBα(Ser32)、(図G)ホスホ−Lck、(図H)ホスホ−Lat、(図I)ホスホ−STAT3(Ser727)、(図J)ホスホ−STAT5 A/B(Tyr 694/699)、(図K)ホスホ−Syk(ホスホ−チロシン)、および(図L)ホスホ−Zap−70(ホスホ−チロシン)。*p<0.05、DMSO対照と比較した場合、および、#、p<0.05、α−GalCerと比較した場合。
図A〜Lは、本開示に係るα−GalCer類似体が、ナイーブヒトiNKT(Vα24+)のCD1d依存性T細胞受容体(TCR)活性化を促進する仕組みを明らかにしている。図Aは、単離されたナイーブヒトVα24+T細胞のフローサイトメトリーによる測定結果を示す。図B〜Lは、iNKT上におけるTCRの活性化を示している。HeLa細胞またはHeLa−CD1d細胞に、α−GalCer、またはα−GalCer類似体であるC16、C23、7DW8−5、7DW8−6、またはC26を投入してから、細胞をナイーブVα24+T細胞に添加した。以下のリン酸化タンパク質の細胞内レベルを測定して蛍光強度の中央値として表し、全投入タンパク質量に対して標準化した:(図B)ホスホ−CD3ε(ホスホチロシン)、(図C)ホスホ−CREB(Ser−133)、(図D)ホスホ−ERK1/2(Thr−185/Tyr−187)、(図E)ホスホ−p38(Thr−180/Tyr−182)、(図F)ホスホ−IKBα(Ser32)、(図G)ホスホ−Lck、(図H)ホスホ−Lat、(図I)ホスホ−STAT3(Ser727)、(図J)ホスホ−STAT5 A/B(Tyr 694/699)、(図K)ホスホ−Syk(ホスホ−チロシン)、および(図L)ホスホ−Zap−70(ホスホ−チロシン)。*p<0.05、DMSO対照と比較した場合、および、#、p<0.05、α−GalCerと比較した場合。
図A〜Lは、本開示に係るα−GalCer類似体が、ナイーブヒトiNKT(Vα24+)のCD1d依存性T細胞受容体(TCR)活性化を促進する仕組みを明らかにしている。図Aは、単離されたナイーブヒトVα24+T細胞のフローサイトメトリーによる測定結果を示す。図B〜Lは、iNKT上におけるTCRの活性化を示している。HeLa細胞またはHeLa−CD1d細胞に、α−GalCer、またはα−GalCer類似体であるC16、C23、7DW8−5、7DW8−6、またはC26を投入してから、細胞をナイーブVα24+T細胞に添加した。以下のリン酸化タンパク質の細胞内レベルを測定して蛍光強度の中央値として表し、全投入タンパク質量に対して標準化した:(図B)ホスホ−CD3ε(ホスホチロシン)、(図C)ホスホ−CREB(Ser−133)、(図D)ホスホ−ERK1/2(Thr−185/Tyr−187)、(図E)ホスホ−p38(Thr−180/Tyr−182)、(図F)ホスホ−IKBα(Ser32)、(図G)ホスホ−Lck、(図H)ホスホ−Lat、(図I)ホスホ−STAT3(Ser727)、(図J)ホスホ−STAT5 A/B(Tyr 694/699)、(図K)ホスホ−Syk(ホスホ−チロシン)、および(図L)ホスホ−Zap−70(ホスホ−チロシン)。*p<0.05、DMSO対照と比較した場合、および、#、p<0.05、α−GalCerと比較した場合。
図A〜Cは、本開示に係るα−GalCer類似体がどのようにして、より大きな細胞増殖を誘導し、CD1d拘束性NKTおよびT細胞に結合する、より高い能力を示すのかを示している。0.1μg/マウスの賦形剤、α−GalCer、または表示のα−GalCer類似体を静脈内(IV)注射した72時間後にBALB/cマウスから脾臓を採取した。(図A)マウスNKTまたは(図B)T細胞の割合を測定した。(図C)は、CD1d拘束性のNKTおよびT細胞に対するα−GalCerまたは表示のα−GalCer類似体のさまざまな結合アフィニティーを示している。
図A〜Dは、本開示に係るα−GalCer類似体に応答した2つのNKTサブセットのCD1d依存性増殖およびNK活性化を示している。図A〜Cは、2つのNKTサブセットのCD1d依存性増殖を示している。α−GalCerまたは表示されている本開示に係るα−GalCer類似体を注射した72時間後、BALB/c野生型(WT)マウスまたはCD1−KOマウスから脾臓を採取した。応答した(図B)WTマウスまたは(図C)CD1−KOマウスにおける、NKT、およびその2つのサブタイプで、NKT1およびNKT2と名付けられたものの総数をFACSにより測定した。(図D)NKのCD1依存型活性化。応答したWTマウス(左図)またはCD1−KOマウス(右図)のNK総数の増加をFACSにより測定した。
図A〜Dは、本開示に係るα−GalCer類似体に応答した2つのNKTサブセットのCD1d依存性増殖およびNK活性化を示している。図A〜Cは、2つのNKTサブセットのCD1d依存性増殖を示している。α−GalCerまたは表示されている本開示に係るα−GalCer類似体を注射した72時間後、BALB/c野生型(WT)マウスまたはCD1−KOマウスから脾臓を採取した。応答した(図B)WTマウスまたは(図C)CD1−KOマウスにおける、NKT、およびその2つのサブタイプで、NKT1およびNKT2と名付けられたものの総数をFACSにより測定した。(図D)NKのCD1依存型活性化。応答したWTマウス(左図)またはCD1−KOマウス(右図)のNK総数の増加をFACSにより測定した。
図A〜Dは、本開示に係るα−GalCer類似体に応答した2つのNKTサブセットのCD1d依存性増殖およびNK活性化を示している。図A〜Cは、2つのNKTサブセットのCD1d依存性増殖を示している。α−GalCerまたは表示されている本開示に係るα−GalCer類似体を注射した72時間後、BALB/c野生型(WT)マウスまたはCD1−KOマウスから脾臓を採取した。応答した(図B)WTマウスまたは(図C)CD1−KOマウスにおける、NKT、およびその2つのサブタイプで、NKT1およびNKT2と名付けられたものの総数をFACSにより測定した。(図D)NKのCD1依存型活性化。応答したWTマウス(左図)またはCD1−KOマウス(右図)のNK総数の増加をFACSにより測定した。
図A〜Dは、本開示に係るα−GalCer類似体に応答した2つのNKTサブセットのCD1d依存性増殖およびNK活性化を示している。図A〜Cは、2つのNKTサブセットのCD1d依存性増殖を示している。α−GalCerまたは表示されている本開示に係るα−GalCer類似体を注射した72時間後、BALB/c野生型(WT)マウスまたはCD1−KOマウスから脾臓を採取した。応答した(図B)WTマウスまたは(図C)CD1−KOマウスにおける、NKT、およびその2つのサブタイプで、NKT1およびNKT2と名付けられたものの総数をFACSにより測定した。(図D)NKのCD1依存型活性化。応答したWTマウス(左図)またはCD1−KOマウス(右図)のNK総数の増加をFACSにより測定した。
図A〜Cは、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体を静脈内(IV)注射した0時間後、2時間後、18時間後、36時間後、48時間後、72時間後における、DMSO対照に対して標準化された、さまざまなサイトカイン(図A)IFN−γ、(図B)IL−4のマウス血清中濃度(pg/ml)、および(図C)IFN−γ/IL−4の比を示している。
図A〜Cは、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体を静脈内(IV)注射した0時間後、2時間後、18時間後、36時間後、48時間後、72時間後における、DMSO対照に対して標準化された、さまざまなサイトカイン(図A)IFN−γ、(図B)IL−4のマウス血清中濃度(pg/ml)、および(図C)IFN−γ/IL−4の比を示している。
図A〜Cは、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体を静脈内(IV)注射した0時間後、2時間後、18時間後、36時間後、48時間後、72時間後における、DMSO対照に対して標準化された、さまざまなサイトカイン(図A)IFN−γ、(図B)IL−4のマウス血清中濃度(pg/ml)、および(図C)IFN−γ/IL−4の比を示している。
図A〜Cは、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体をIV注射した2時間後および18時間後における、さまざまなサイトカイン/ケモカイン(図A)IFN−γ、(B)IL−4のマウス血清中濃度(pg/ml)、および(図C)IFN−γ/IL−4の比を示している。
図A〜Cは、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体をIV注射した2時間後および18時間後における、さまざまなサイトカイン/ケモカイン(図A)IFN−γ、(B)IL−4のマウス血清中濃度(pg/ml)、および(図C)IFN−γ/IL−4の比を示している。
図A〜Cは、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体をIV注射した2時間後および18時間後における、さまざまなサイトカイン/ケモカイン(図A)IFN−γ、(B)IL−4のマウス血清中濃度(pg/ml)、および(図C)IFN−γ/IL−4の比を示している。
α−GalCerまたは表示されている本開示に係るα−GalCer類似体のIV注射されたBALB/cマウスの上清における(サイトカイン基礎濃度の増加倍率で表された)結果の表である。サイトカイン/ケモカインは、18時間後にピークを示した*印を付けたもの以外はすべて、注射した2時間後にピークを示した。
図A〜Hは、図23の賦形剤、α−GalCer、またはα−GalCer類似体のIV注射に応答したときの(図A)有核細胞の総数および脾臓の大きさ、(B)成熟樹状細胞などの自然免疫細胞集団、(図C)活性化NK、(図D)活性化NKT、(図E)活性型B細胞、(図F)活性型CD8+T細胞、(図G)活性型CD4+T細胞、および(図H)CD8+T細胞/CD4+T細胞の比を示しているが、これらはすべて、DMSOにより標準化されている。
図A〜Hは、図23の賦形剤、α−GalCer、またはα−GalCer類似体のIV注射に応答したときの(図A)有核細胞の総数および脾臓の大きさ、(B)成熟樹状細胞などの自然免疫細胞集団、(図C)活性化NK、(図D)活性化NKT、(図E)活性型B細胞、(図F)活性型CD8+T細胞、(図G)活性型CD4+T細胞、および(図H)CD8+T細胞/CD4+T細胞の比を示しているが、これらはすべて、DMSOにより標準化されている。
図A〜Hは、図23の賦形剤、α−GalCer、またはα−GalCer類似体のIV注射に応答したときの(図A)有核細胞の総数および脾臓の大きさ、(B)成熟樹状細胞などの自然免疫細胞集団、(図C)活性化NK、(図D)活性化NKT、(図E)活性型B細胞、(図F)活性型CD8+T細胞、(図G)活性型CD4+T細胞、および(図H)CD8+T細胞/CD4+T細胞の比を示しているが、これらはすべて、DMSOにより標準化されている。
図A〜Hは、図23の賦形剤、α−GalCer、またはα−GalCer類似体のIV注射に応答したときの(図A)有核細胞の総数および脾臓の大きさ、(B)成熟樹状細胞などの自然免疫細胞集団、(図C)活性化NK、(図D)活性化NKT、(図E)活性型B細胞、(図F)活性型CD8+T細胞、(図G)活性型CD4+T細胞、および(図H)CD8+T細胞/CD4+T細胞の比を示しているが、これらはすべて、DMSOにより標準化されている。
図A〜Hは、図23の賦形剤、α−GalCer、またはα−GalCer類似体のIV注射に応答したときの(図A)有核細胞の総数および脾臓の大きさ、(B)成熟樹状細胞などの自然免疫細胞集団、(図C)活性化NK、(図D)活性化NKT、(図E)活性型B細胞、(図F)活性型CD8+T細胞、(図G)活性型CD4+T細胞、および(図H)CD8+T細胞/CD4+T細胞の比を示しているが、これらはすべて、DMSOにより標準化されている。
図A〜Hは、図23の賦形剤、α−GalCer、またはα−GalCer類似体のIV注射に応答したときの(図A)有核細胞の総数および脾臓の大きさ、(B)成熟樹状細胞などの自然免疫細胞集団、(図C)活性化NK、(図D)活性化NKT、(図E)活性型B細胞、(図F)活性型CD8+T細胞、(図G)活性型CD4+T細胞、および(図H)CD8+T細胞/CD4+T細胞の比を示しているが、これらはすべて、DMSOにより標準化されている。
図A〜Hは、図23の賦形剤、α−GalCer、またはα−GalCer類似体のIV注射に応答したときの(図A)有核細胞の総数および脾臓の大きさ、(B)成熟樹状細胞などの自然免疫細胞集団、(図C)活性化NK、(図D)活性化NKT、(図E)活性型B細胞、(図F)活性型CD8+T細胞、(図G)活性型CD4+T細胞、および(図H)CD8+T細胞/CD4+T細胞の比を示しているが、これらはすべて、DMSOにより標準化されている。
図A〜Hは、図23の賦形剤、α−GalCer、またはα−GalCer類似体のIV注射に応答したときの(図A)有核細胞の総数および脾臓の大きさ、(B)成熟樹状細胞などの自然免疫細胞集団、(図C)活性化NK、(図D)活性化NKT、(図E)活性型B細胞、(図F)活性型CD8+T細胞、(図G)活性型CD4+T細胞、および(図H)CD8+T細胞/CD4+T細胞の比を示しているが、これらはすべて、DMSOにより標準化されている。
図A〜Cは、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体を皮下(SubQ)注射した0時間後、2時間後、18時間後、36時間後、48時間後、72時間後における、DMSO対照に対して標準化された、さまざまなサイトカイン(図A)IFN−γ、(B)IL−4のマウス血清中濃度、および(図C)IFN−γ/IL−4の比を示している。
図A〜Cは、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体を皮下(SubQ)注射した0時間後、2時間後、18時間後、36時間後、48時間後、72時間後における、DMSO対照に対して標準化された、さまざまなサイトカイン(図A)IFN−γ、(B)IL−4のマウス血清中濃度、および(図C)IFN−γ/IL−4の比を示している。
図A〜Cは、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体を皮下(SubQ)注射した0時間後、2時間後、18時間後、36時間後、48時間後、72時間後における、DMSO対照に対して標準化された、さまざまなサイトカイン(図A)IFN−γ、(B)IL−4のマウス血清中濃度、および(図C)IFN−γ/IL−4の比を示している。
図A〜Hは、図27の賦形剤、α−GalCer、またはα−GalCer類似体のSubQ注射に応答したときの(図A)有核細胞の総数および脾臓の大きさ、(B)成熟樹状細胞などの自然免疫細胞集団、(図C)活性化NK、(図D)活性化NKT、(図E)活性型B細胞、(図F)活性型CD8+T細胞、(図G)活性型CD4+T細胞および(図H)CD8+T細胞/CD4+T細胞の比を示しているが、これらはすべて、DMSOによって標準化されている。
図A〜Hは、図27の賦形剤、α−GalCer、またはα−GalCer類似体のSubQ注射に応答したときの(図A)有核細胞の総数および脾臓の大きさ、(B)成熟樹状細胞などの自然免疫細胞集団、(図C)活性化NK、(図D)活性化NKT、(図E)活性型B細胞、(図F)活性型CD8+T細胞、(図G)活性型CD4+T細胞および(図H)CD8+T細胞/CD4+T細胞の比を示しているが、これらはすべて、DMSOによって標準化されている。
図A〜Hは、図27の賦形剤、α−GalCer、またはα−GalCer類似体のSubQ注射に応答したときの(図A)有核細胞の総数および脾臓の大きさ、(B)成熟樹状細胞などの自然免疫細胞集団、(図C)活性化NK、(図D)活性化NKT、(図E)活性型B細胞、(図F)活性型CD8+T細胞、(図G)活性型CD4+T細胞および(図H)CD8+T細胞/CD4+T細胞の比を示しているが、これらはすべて、DMSOによって標準化されている。
図A〜Hは、図27の賦形剤、α−GalCer、またはα−GalCer類似体のSubQ注射に応答したときの(図A)有核細胞の総数および脾臓の大きさ、(B)成熟樹状細胞などの自然免疫細胞集団、(図C)活性化NK、(図D)活性化NKT、(図E)活性型B細胞、(図F)活性型CD8+T細胞、(図G)活性型CD4+T細胞および(図H)CD8+T細胞/CD4+T細胞の比を示しているが、これらはすべて、DMSOによって標準化されている。
図A〜Hは、図27の賦形剤、α−GalCer、またはα−GalCer類似体のSubQ注射に応答したときの(図A)有核細胞の総数および脾臓の大きさ、(B)成熟樹状細胞などの自然免疫細胞集団、(図C)活性化NK、(図D)活性化NKT、(図E)活性型B細胞、(図F)活性型CD8+T細胞、(図G)活性型CD4+T細胞および(図H)CD8+T細胞/CD4+T細胞の比を示しているが、これらはすべて、DMSOによって標準化されている。
図A〜Hは、図27の賦形剤、α−GalCer、またはα−GalCer類似体のSubQ注射に応答したときの(図A)有核細胞の総数および脾臓の大きさ、(B)成熟樹状細胞などの自然免疫細胞集団、(図C)活性化NK、(図D)活性化NKT、(図E)活性型B細胞、(図F)活性型CD8+T細胞、(図G)活性型CD4+T細胞および(図H)CD8+T細胞/CD4+T細胞の比を示しているが、これらはすべて、DMSOによって標準化されている。
図A〜Hは、図27の賦形剤、α−GalCer、またはα−GalCer類似体のSubQ注射に応答したときの(図A)有核細胞の総数および脾臓の大きさ、(B)成熟樹状細胞などの自然免疫細胞集団、(図C)活性化NK、(図D)活性化NKT、(図E)活性型B細胞、(図F)活性型CD8+T細胞、(図G)活性型CD4+T細胞および(図H)CD8+T細胞/CD4+T細胞の比を示しているが、これらはすべて、DMSOによって標準化されている。
図A〜Hは、図27の賦形剤、α−GalCer、またはα−GalCer類似体のSubQ注射に応答したときの(図A)有核細胞の総数および脾臓の大きさ、(B)成熟樹状細胞などの自然免疫細胞集団、(図C)活性化NK、(図D)活性化NKT、(図E)活性型B細胞、(図F)活性型CD8+T細胞、(図G)活性型CD4+T細胞および(図H)CD8+T細胞/CD4+T細胞の比を示しているが、これらはすべて、DMSOによって標準化されている。
図A〜Cは、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体を筋肉内(IM)注射した0時間後、2時間後、18時間後、36時間後、48時間後、72時間後における、DMSO対照に対して標準化された、さまざまなサイトカイン(図A)IFN−γ、(B)IL−4のマウス血清中濃度、および(図C)IFN−γ/IL−4の比を示している。
図A〜Cは、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体を筋肉内(IM)注射した0時間後、2時間後、18時間後、36時間後、48時間後、72時間後における、DMSO対照に対して標準化された、さまざまなサイトカイン(図A)IFN−γ、(B)IL−4のマウス血清中濃度、および(図C)IFN−γ/IL−4の比を示している。
図A〜Cは、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体を筋肉内(IM)注射した0時間後、2時間後、18時間後、36時間後、48時間後、72時間後における、DMSO対照に対して標準化された、さまざまなサイトカイン(図A)IFN−γ、(B)IL−4のマウス血清中濃度、および(図C)IFN−γ/IL−4の比を示している。
図A〜Hは、図29の賦形剤、α−GalCerまたはα−GalCer類似体のIM注射に応答したときの(図A)有核細胞の総数および脾臓の大きさ、(B)成熟樹状細胞などの自然免疫細胞集団、(図C)活性化NK、(図D)活性化NKT、(図E)活性型B細胞、(図F)活性型CD8+T細胞、(図G)活性型CD4+T細胞および(図H)CD8+T細胞/CD4+T細胞の比を示しているが、これらはすべて、DMSOにより標準化されている。
図A〜Hは、図29の賦形剤、α−GalCerまたはα−GalCer類似体のIM注射に応答したときの(図A)有核細胞の総数および脾臓の大きさ、(B)成熟樹状細胞などの自然免疫細胞集団、(図C)活性化NK、(図D)活性化NKT、(図E)活性型B細胞、(図F)活性型CD8+T細胞、(図G)活性型CD4+T細胞および(図H)CD8+T細胞/CD4+T細胞の比を示しているが、これらはすべて、DMSOにより標準化されている。
図A〜Hは、図29の賦形剤、α−GalCerまたはα−GalCer類似体のIM注射に応答したときの(図A)有核細胞の総数および脾臓の大きさ、(B)成熟樹状細胞などの自然免疫細胞集団、(図C)活性化NK、(図D)活性化NKT、(図E)活性型B細胞、(図F)活性型CD8+T細胞、(図G)活性型CD4+T細胞および(図H)CD8+T細胞/CD4+T細胞の比を示しているが、これらはすべて、DMSOにより標準化されている。
図A〜Hは、図29の賦形剤、α−GalCerまたはα−GalCer類似体のIM注射に応答したときの(図A)有核細胞の総数および脾臓の大きさ、(B)成熟樹状細胞などの自然免疫細胞集団、(図C)活性化NK、(図D)活性化NKT、(図E)活性型B細胞、(図F)活性型CD8+T細胞、(図G)活性型CD4+T細胞および(図H)CD8+T細胞/CD4+T細胞の比を示しているが、これらはすべて、DMSOにより標準化されている。
図A〜Hは、図29の賦形剤、α−GalCerまたはα−GalCer類似体のIM注射に応答したときの(図A)有核細胞の総数および脾臓の大きさ、(B)成熟樹状細胞などの自然免疫細胞集団、(図C)活性化NK、(図D)活性化NKT、(図E)活性型B細胞、(図F)活性型CD8+T細胞、(図G)活性型CD4+T細胞および(図H)CD8+T細胞/CD4+T細胞の比を示しているが、これらはすべて、DMSOにより標準化されている。
図A〜Hは、図29の賦形剤、α−GalCerまたはα−GalCer類似体のIM注射に応答したときの(図A)有核細胞の総数および脾臓の大きさ、(B)成熟樹状細胞などの自然免疫細胞集団、(図C)活性化NK、(図D)活性化NKT、(図E)活性型B細胞、(図F)活性型CD8+T細胞、(図G)活性型CD4+T細胞および(図H)CD8+T細胞/CD4+T細胞の比を示しているが、これらはすべて、DMSOにより標準化されている。
図A〜Hは、図29の賦形剤、α−GalCerまたはα−GalCer類似体のIM注射に応答したときの(図A)有核細胞の総数および脾臓の大きさ、(B)成熟樹状細胞などの自然免疫細胞集団、(図C)活性化NK、(図D)活性化NKT、(図E)活性型B細胞、(図F)活性型CD8+T細胞、(図G)活性型CD4+T細胞および(図H)CD8+T細胞/CD4+T細胞の比を示しているが、これらはすべて、DMSOにより標準化されている。
図A〜Hは、図29の賦形剤、α−GalCerまたはα−GalCer類似体のIM注射に応答したときの(図A)有核細胞の総数および脾臓の大きさ、(B)成熟樹状細胞などの自然免疫細胞集団、(図C)活性化NK、(図D)活性化NKT、(図E)活性型B細胞、(図F)活性型CD8+T細胞、(図G)活性型CD4+T細胞および(図H)CD8+T細胞/CD4+T細胞の比を示しているが、これらはすべて、DMSOにより標準化されている。
図A〜Kは、サイトカインの動態および脾細胞の増殖/活性化に対する、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体の投与経路(IV、SubQ、またはIM)の効果を示している。図Aは、IFN−γのマウス血清中濃度(pg/ml)を示している。図Bは、IL−4のマウス血清中濃度(pg/ml)を示している。図Cは、IFN−γ/IL−4の比(log10)を示している。図Dは、マウス有核細胞(脾細胞)の総数を示している。図Eは、脾臓中の成熟樹状細胞などの自然免疫細胞集団を示している。図Fは、脾臓中の活性化NKの集団を示している。図Gは、脾臓中の活性化NKTの集団を示している。図Hは、脾臓中の活性型B細胞の集団を示している。図Iは、脾臓中の活性型CD8+T細胞の集団を示している。図Jは、脾臓中の活性型CD4+T細胞の集団を示している。図Kは、CD8+T細胞/CD4+T細胞の比を示している。すべての解析は、賦形剤に対して標準化して行われた。
図A〜Kは、サイトカインの動態および脾細胞の増殖/活性化に対する、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体の投与経路(IV、SubQ、またはIM)の効果を示している。図Aは、IFN−γのマウス血清中濃度(pg/ml)を示している。図Bは、IL−4のマウス血清中濃度(pg/ml)を示している。図Cは、IFN−γ/IL−4の比(log10)を示している。図Dは、マウス有核細胞(脾細胞)の総数を示している。図Eは、脾臓中の成熟樹状細胞などの自然免疫細胞集団を示している。図Fは、脾臓中の活性化NKの集団を示している。図Gは、脾臓中の活性化NKTの集団を示している。図Hは、脾臓中の活性型B細胞の集団を示している。図Iは、脾臓中の活性型CD8+T細胞の集団を示している。図Jは、脾臓中の活性型CD4+T細胞の集団を示している。図Kは、CD8+T細胞/CD4+T細胞の比を示している。すべての解析は、賦形剤に対して標準化して行われた。
図A〜Kは、サイトカインの動態および脾細胞の増殖/活性化に対する、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体の投与経路(IV、SubQ、またはIM)の効果を示している。図Aは、IFN−γのマウス血清中濃度(pg/ml)を示している。図Bは、IL−4のマウス血清中濃度(pg/ml)を示している。図Cは、IFN−γ/IL−4の比(log10)を示している。図Dは、マウス有核細胞(脾細胞)の総数を示している。図Eは、脾臓中の成熟樹状細胞などの自然免疫細胞集団を示している。図Fは、脾臓中の活性化NKの集団を示している。図Gは、脾臓中の活性化NKTの集団を示している。図Hは、脾臓中の活性型B細胞の集団を示している。図Iは、脾臓中の活性型CD8+T細胞の集団を示している。図Jは、脾臓中の活性型CD4+T細胞の集団を示している。図Kは、CD8+T細胞/CD4+T細胞の比を示している。すべての解析は、賦形剤に対して標準化して行われた。
図A〜Kは、サイトカインの動態および脾細胞の増殖/活性化に対する、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体の投与経路(IV、SubQ、またはIM)の効果を示している。図Aは、IFN−γのマウス血清中濃度(pg/ml)を示している。図Bは、IL−4のマウス血清中濃度(pg/ml)を示している。図Cは、IFN−γ/IL−4の比(log10)を示している。図Dは、マウス有核細胞(脾細胞)の総数を示している。図Eは、脾臓中の成熟樹状細胞などの自然免疫細胞集団を示している。図Fは、脾臓中の活性化NKの集団を示している。図Gは、脾臓中の活性化NKTの集団を示している。図Hは、脾臓中の活性型B細胞の集団を示している。図Iは、脾臓中の活性型CD8+T細胞の集団を示している。図Jは、脾臓中の活性型CD4+T細胞の集団を示している。図Kは、CD8+T細胞/CD4+T細胞の比を示している。すべての解析は、賦形剤に対して標準化して行われた。
図A〜Kは、サイトカインの動態および脾細胞の増殖/活性化に対する、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体の投与経路(IV、SubQ、またはIM)の効果を示している。図Aは、IFN−γのマウス血清中濃度(pg/ml)を示している。図Bは、IL−4のマウス血清中濃度(pg/ml)を示している。図Cは、IFN−γ/IL−4の比(log10)を示している。図Dは、マウス有核細胞(脾細胞)の総数を示している。図Eは、脾臓中の成熟樹状細胞などの自然免疫細胞集団を示している。図Fは、脾臓中の活性化NKの集団を示している。図Gは、脾臓中の活性化NKTの集団を示している。図Hは、脾臓中の活性型B細胞の集団を示している。図Iは、脾臓中の活性型CD8+T細胞の集団を示している。図Jは、脾臓中の活性型CD4+T細胞の集団を示している。図Kは、CD8+T細胞/CD4+T細胞の比を示している。すべての解析は、賦形剤に対して標準化して行われた。
図A〜Kは、サイトカインの動態および脾細胞の増殖/活性化に対する、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体の投与経路(IV、SubQ、またはIM)の効果を示している。図Aは、IFN−γのマウス血清中濃度(pg/ml)を示している。図Bは、IL−4のマウス血清中濃度(pg/ml)を示している。図Cは、IFN−γ/IL−4の比(log10)を示している。図Dは、マウス有核細胞(脾細胞)の総数を示している。図Eは、脾臓中の成熟樹状細胞などの自然免疫細胞集団を示している。図Fは、脾臓中の活性化NKの集団を示している。図Gは、脾臓中の活性化NKTの集団を示している。図Hは、脾臓中の活性型B細胞の集団を示している。図Iは、脾臓中の活性型CD8+T細胞の集団を示している。図Jは、脾臓中の活性型CD4+T細胞の集団を示している。図Kは、CD8+T細胞/CD4+T細胞の比を示している。すべての解析は、賦形剤に対して標準化して行われた。
図A〜Kは、サイトカインの動態および脾細胞の増殖/活性化に対する、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体の投与経路(IV、SubQ、またはIM)の効果を示している。図Aは、IFN−γのマウス血清中濃度(pg/ml)を示している。図Bは、IL−4のマウス血清中濃度(pg/ml)を示している。図Cは、IFN−γ/IL−4の比(log10)を示している。図Dは、マウス有核細胞(脾細胞)の総数を示している。図Eは、脾臓中の成熟樹状細胞などの自然免疫細胞集団を示している。図Fは、脾臓中の活性化NKの集団を示している。図Gは、脾臓中の活性化NKTの集団を示している。図Hは、脾臓中の活性型B細胞の集団を示している。図Iは、脾臓中の活性型CD8+T細胞の集団を示している。図Jは、脾臓中の活性型CD4+T細胞の集団を示している。図Kは、CD8+T細胞/CD4+T細胞の比を示している。すべての解析は、賦形剤に対して標準化して行われた。
図A〜Kは、サイトカインの動態および脾細胞の増殖/活性化に対する、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体の投与経路(IV、SubQ、またはIM)の効果を示している。図Aは、IFN−γのマウス血清中濃度(pg/ml)を示している。図Bは、IL−4のマウス血清中濃度(pg/ml)を示している。図Cは、IFN−γ/IL−4の比(log10)を示している。図Dは、マウス有核細胞(脾細胞)の総数を示している。図Eは、脾臓中の成熟樹状細胞などの自然免疫細胞集団を示している。図Fは、脾臓中の活性化NKの集団を示している。図Gは、脾臓中の活性化NKTの集団を示している。図Hは、脾臓中の活性型B細胞の集団を示している。図Iは、脾臓中の活性型CD8+T細胞の集団を示している。図Jは、脾臓中の活性型CD4+T細胞の集団を示している。図Kは、CD8+T細胞/CD4+T細胞の比を示している。すべての解析は、賦形剤に対して標準化して行われた。
図A〜Kは、サイトカインの動態および脾細胞の増殖/活性化に対する、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体の投与経路(IV、SubQ、またはIM)の効果を示している。図Aは、IFN−γのマウス血清中濃度(pg/ml)を示している。図Bは、IL−4のマウス血清中濃度(pg/ml)を示している。図Cは、IFN−γ/IL−4の比(log10)を示している。図Dは、マウス有核細胞(脾細胞)の総数を示している。図Eは、脾臓中の成熟樹状細胞などの自然免疫細胞集団を示している。図Fは、脾臓中の活性化NKの集団を示している。図Gは、脾臓中の活性化NKTの集団を示している。図Hは、脾臓中の活性型B細胞の集団を示している。図Iは、脾臓中の活性型CD8+T細胞の集団を示している。図Jは、脾臓中の活性型CD4+T細胞の集団を示している。図Kは、CD8+T細胞/CD4+T細胞の比を示している。すべての解析は、賦形剤に対して標準化して行われた。
図A〜Kは、サイトカインの動態および脾細胞の増殖/活性化に対する、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体の投与経路(IV、SubQ、またはIM)の効果を示している。図Aは、IFN−γのマウス血清中濃度(pg/ml)を示している。図Bは、IL−4のマウス血清中濃度(pg/ml)を示している。図Cは、IFN−γ/IL−4の比(log10)を示している。図Dは、マウス有核細胞(脾細胞)の総数を示している。図Eは、脾臓中の成熟樹状細胞などの自然免疫細胞集団を示している。図Fは、脾臓中の活性化NKの集団を示している。図Gは、脾臓中の活性化NKTの集団を示している。図Hは、脾臓中の活性型B細胞の集団を示している。図Iは、脾臓中の活性型CD8+T細胞の集団を示している。図Jは、脾臓中の活性型CD4+T細胞の集団を示している。図Kは、CD8+T細胞/CD4+T細胞の比を示している。すべての解析は、賦形剤に対して標準化して行われた。
図A〜Kは、サイトカインの動態および脾細胞の増殖/活性化に対する、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体の投与経路(IV、SubQ、またはIM)の効果を示している。図Aは、IFN−γのマウス血清中濃度(pg/ml)を示している。図Bは、IL−4のマウス血清中濃度(pg/ml)を示している。図Cは、IFN−γ/IL−4の比(log10)を示している。図Dは、マウス有核細胞(脾細胞)の総数を示している。図Eは、脾臓中の成熟樹状細胞などの自然免疫細胞集団を示している。図Fは、脾臓中の活性化NKの集団を示している。図Gは、脾臓中の活性化NKTの集団を示している。図Hは、脾臓中の活性型B細胞の集団を示している。図Iは、脾臓中の活性型CD8+T細胞の集団を示している。図Jは、脾臓中の活性型CD4+T細胞の集団を示している。図Kは、CD8+T細胞/CD4+T細胞の比を示している。すべての解析は、賦形剤に対して標準化して行われた。
図A〜Hは、α−GalCer類似体C11または賦形剤のIV投与に応答した脾細胞の増殖/活性化の用量応答を示している。図Aは、マウス有核細胞(脾細胞)の総数を示している。図Bは、脾臓中の成熟樹状細胞などの自然免疫細胞集団を示している。図Cは、脾臓中の活性化NKの集団を示している。図Dは、脾臓中の活性化NKTの集団を示している。図Eは、脾臓中の単球顆粒球細胞集団を示している。図Fは、脾臓中の活性型CD4+T細胞集団を示している。図Gは、脾臓中の活性型CD8+T細胞集団を示している。図Hは、脾臓中の活性型B細胞集団を示している。すべての解析は、賦形剤に対して標準化して行われた。
図A〜Hは、α−GalCer類似体C11または賦形剤のIV投与に応答した脾細胞の増殖/活性化の用量応答を示している。図Aは、マウス有核細胞(脾細胞)の総数を示している。図Bは、脾臓中の成熟樹状細胞などの自然免疫細胞集団を示している。図Cは、脾臓中の活性化NKの集団を示している。図Dは、脾臓中の活性化NKTの集団を示している。図Eは、脾臓中の単球顆粒球細胞集団を示している。図Fは、脾臓中の活性型CD4+T細胞集団を示している。図Gは、脾臓中の活性型CD8+T細胞集団を示している。図Hは、脾臓中の活性型B細胞集団を示している。すべての解析は、賦形剤に対して標準化して行われた。
図A〜Hは、α−GalCer類似体C11または賦形剤のIV投与に応答した脾細胞の増殖/活性化の用量応答を示している。図Aは、マウス有核細胞(脾細胞)の総数を示している。図Bは、脾臓中の成熟樹状細胞などの自然免疫細胞集団を示している。図Cは、脾臓中の活性化NKの集団を示している。図Dは、脾臓中の活性化NKTの集団を示している。図Eは、脾臓中の単球顆粒球細胞集団を示している。図Fは、脾臓中の活性型CD4+T細胞集団を示している。図Gは、脾臓中の活性型CD8+T細胞集団を示している。図Hは、脾臓中の活性型B細胞集団を示している。すべての解析は、賦形剤に対して標準化して行われた。
図A〜Hは、α−GalCer類似体C11または賦形剤のIV投与に応答した脾細胞の増殖/活性化の用量応答を示している。図Aは、マウス有核細胞(脾細胞)の総数を示している。図Bは、脾臓中の成熟樹状細胞などの自然免疫細胞集団を示している。図Cは、脾臓中の活性化NKの集団を示している。図Dは、脾臓中の活性化NKTの集団を示している。図Eは、脾臓中の単球顆粒球細胞集団を示している。図Fは、脾臓中の活性型CD4+T細胞集団を示している。図Gは、脾臓中の活性型CD8+T細胞集団を示している。図Hは、脾臓中の活性型B細胞集団を示している。すべての解析は、賦形剤に対して標準化して行われた。
図A〜Hは、α−GalCer類似体C11または賦形剤のIV投与に応答した脾細胞の増殖/活性化の用量応答を示している。図Aは、マウス有核細胞(脾細胞)の総数を示している。図Bは、脾臓中の成熟樹状細胞などの自然免疫細胞集団を示している。図Cは、脾臓中の活性化NKの集団を示している。図Dは、脾臓中の活性化NKTの集団を示している。図Eは、脾臓中の単球顆粒球細胞集団を示している。図Fは、脾臓中の活性型CD4+T細胞集団を示している。図Gは、脾臓中の活性型CD8+T細胞集団を示している。図Hは、脾臓中の活性型B細胞集団を示している。すべての解析は、賦形剤に対して標準化して行われた。
図A〜Hは、α−GalCer類似体C11または賦形剤のIV投与に応答した脾細胞の増殖/活性化の用量応答を示している。図Aは、マウス有核細胞(脾細胞)の総数を示している。図Bは、脾臓中の成熟樹状細胞などの自然免疫細胞集団を示している。図Cは、脾臓中の活性化NKの集団を示している。図Dは、脾臓中の活性化NKTの集団を示している。図Eは、脾臓中の単球顆粒球細胞集団を示している。図Fは、脾臓中の活性型CD4+T細胞集団を示している。図Gは、脾臓中の活性型CD8+T細胞集団を示している。図Hは、脾臓中の活性型B細胞集団を示している。すべての解析は、賦形剤に対して標準化して行われた。
図A〜Hは、α−GalCer類似体C11または賦形剤のIV投与に応答した脾細胞の増殖/活性化の用量応答を示している。図Aは、マウス有核細胞(脾細胞)の総数を示している。図Bは、脾臓中の成熟樹状細胞などの自然免疫細胞集団を示している。図Cは、脾臓中の活性化NKの集団を示している。図Dは、脾臓中の活性化NKTの集団を示している。図Eは、脾臓中の単球顆粒球細胞集団を示している。図Fは、脾臓中の活性型CD4+T細胞集団を示している。図Gは、脾臓中の活性型CD8+T細胞集団を示している。図Hは、脾臓中の活性型B細胞集団を示している。すべての解析は、賦形剤に対して標準化して行われた。
図A〜Hは、α−GalCer類似体C11または賦形剤のIV投与に応答した脾細胞の増殖/活性化の用量応答を示している。図Aは、マウス有核細胞(脾細胞)の総数を示している。図Bは、脾臓中の成熟樹状細胞などの自然免疫細胞集団を示している。図Cは、脾臓中の活性化NKの集団を示している。図Dは、脾臓中の活性化NKTの集団を示している。図Eは、脾臓中の単球顆粒球細胞集団を示している。図Fは、脾臓中の活性型CD4+T細胞集団を示している。図Gは、脾臓中の活性型CD8+T細胞集団を示している。図Hは、脾臓中の活性型B細胞集団を示している。すべての解析は、賦形剤に対して標準化して行われた。
賦形剤、α−GalCer、または本開示に係るさまざまなα−GalCer類似体をIV注射した0時間後、12時間後、24時間後、36時間後、48時間後、72時間後における、賦形剤対照に対して標準化された、さまざまなサイトカイン(a)IFN−γ、(b)IL−4のマウス血清中濃度、および(C)IFN−γ/IL−4の比を示している。
賦形剤、α−GalCer、または本開示に係るさまざまなα−GalCer類似体をIV注射した0時間後、12時間後、24時間後、36時間後、48時間後、72時間後における、賦形剤対照に対して標準化された、さまざまなサイトカイン(a)IFN−γ、(b)IL−4のマウス血清中濃度、および(C)IFN−γ/IL−4の比を示している。
賦形剤、α−GalCer、または本開示に係るさまざまなα−GalCer類似体をIV注射した0時間後、12時間後、24時間後、36時間後、48時間後、72時間後における、賦形剤対照に対して標準化された、さまざまなサイトカイン(a)IFN−γ、(b)IL−4のマウス血清中濃度、および(C)IFN−γ/IL−4の比を示している。
図33で得られた、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体をIV注射されたBALB/cマウスの上清における結果(サイトカイン基礎濃度に対する増加倍率)の表である。サイトカイン/ケモカインは、18時間後にピークを示した*印を付けたもの以外はすべて、注射した2時間後にピークを示した。
図A〜Gは、野生型BALB/c(wt)マウスおよびCD1d KO BALB/c(CD1KO)マウスに、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体をIV注射した2時間後および18時間後におけるさまざまなサイトカイン/ケモカインの血清中濃度(pg/ml)を示している。(図A)IFN−γ。(B)IL−4。(図C)IFN−γ/IL−4比(log10)。(図D)IL−10。(図E)IL−12p70。(図F)KC。(図G)MCP−1。
図A〜Gは、野生型BALB/c(wt)マウスおよびCD1d KO BALB/c(CD1KO)マウスに、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体をIV注射した2時間後および18時間後におけるさまざまなサイトカイン/ケモカインの血清中濃度(pg/ml)を示している。(図A)IFN−γ。(B)IL−4。(図C)IFN−γ/IL−4比(log10)。(図D)IL−10。(図E)IL−12p70。(図F)KC。(図G)MCP−1。
図A〜Gは、野生型BALB/c(wt)マウスおよびCD1d KO BALB/c(CD1KO)マウスに、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体をIV注射した2時間後および18時間後におけるさまざまなサイトカイン/ケモカインの血清中濃度(pg/ml)を示している。(図A)IFN−γ。(B)IL−4。(図C)IFN−γ/IL−4比(log10)。(図D)IL−10。(図E)IL−12p70。(図F)KC。(図G)MCP−1。
図A〜Gは、野生型BALB/c(wt)マウスおよびCD1d KO BALB/c(CD1KO)マウスに、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体をIV注射した2時間後および18時間後におけるさまざまなサイトカイン/ケモカインの血清中濃度(pg/ml)を示している。(図A)IFN−γ。(B)IL−4。(図C)IFN−γ/IL−4比(log10)。(図D)IL−10。(図E)IL−12p70。(図F)KC。(図G)MCP−1。
図A〜Gは、野生型BALB/c(wt)マウスおよびCD1d KO BALB/c(CD1KO)マウスに、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体をIV注射した2時間後および18時間後におけるさまざまなサイトカイン/ケモカインの血清中濃度(pg/ml)を示している。(図A)IFN−γ。(B)IL−4。(図C)IFN−γ/IL−4比(log10)。(図D)IL−10。(図E)IL−12p70。(図F)KC。(図G)MCP−1。
図A〜Gは、野生型BALB/c(wt)マウスおよびCD1d KO BALB/c(CD1KO)マウスに、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体をIV注射した2時間後および18時間後におけるさまざまなサイトカイン/ケモカインの血清中濃度(pg/ml)を示している。(図A)IFN−γ。(B)IL−4。(図C)IFN−γ/IL−4比(log10)。(図D)IL−10。(図E)IL−12p70。(図F)KC。(図G)MCP−1。
図A〜Gは、野生型BALB/c(wt)マウスおよびCD1d KO BALB/c(CD1KO)マウスに、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体をIV注射した2時間後および18時間後におけるさまざまなサイトカイン/ケモカインの血清中濃度(pg/ml)を示している。(図A)IFN−γ。(B)IL−4。(図C)IFN−γ/IL−4比(log10)。(図D)IL−10。(図E)IL−12p70。(図F)KC。(図G)MCP−1。
図A〜Iは、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体をIV注射された後のC57BL/6マウスにおける脾細胞の増殖/活性化を示し、図G〜Iは、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体をIV注射された後の2種類のNKTサブセット(C57BL/6野生型(Wt)マウスおよびCD1KOマウス)のCD1d依存性活性化を示している。図Aは、C57BL/6マウスの有核細胞(脾細胞)の総数を示す。図Bは、成熟樹状細胞集団を示す。図Cは、活性化NKの集団を示す。図Dは、活性型CD4+T細胞の集団を示す。図Eは活性型CD8+T細胞の集団を示す。図Fは、DMSOによって標準化された、CD8+/CD4+T細胞の比を示している。図Gは、フローサイトメトリーによるWtマウス中のNKTの測定結果(左下の図)、NKTの総数(左上の図)、ならびにその2つのサブタイプであるNKT1(右上の図)およびNKT2(右下の図)を示している。図Hは、CD1KOマウスにおけるNKTの総数を示す。図Iは、WtマウスにおけるTreg細胞の総数を示す。すべての解析は、賦形剤に対して標準化して行われた。
図A〜Iは、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体をIV注射された後のC57BL/6マウスにおける脾細胞の増殖/活性化を示し、図G〜Iは、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体をIV注射された後の2種類のNKTサブセット(C57BL/6野生型(Wt)マウスおよびCD1KOマウス)のCD1d依存性活性化を示している。図Aは、C57BL/6マウスの有核細胞(脾細胞)の総数を示す。図Bは、成熟樹状細胞集団を示す。図Cは、活性化NKの集団を示す。図Dは、活性型CD4+T細胞の集団を示す。図Eは活性型CD8+T細胞の集団を示す。図Fは、DMSOによって標準化された、CD8+/CD4+T細胞の比を示している。図Gは、フローサイトメトリーによるWtマウス中のNKTの測定結果(左下の図)、NKTの総数(左上の図)、ならびにその2つのサブタイプであるNKT1(右上の図)およびNKT2(右下の図)を示している。図Hは、CD1KOマウスにおけるNKTの総数を示す。図Iは、WtマウスにおけるTreg細胞の総数を示す。すべての解析は、賦形剤に対して標準化して行われた。
図A〜Iは、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体をIV注射された後のC57BL/6マウスにおける脾細胞の増殖/活性化を示し、図G〜Iは、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体をIV注射された後の2種類のNKTサブセット(C57BL/6野生型(Wt)マウスおよびCD1KOマウス)のCD1d依存性活性化を示している。図Aは、C57BL/6マウスの有核細胞(脾細胞)の総数を示す。図Bは、成熟樹状細胞集団を示す。図Cは、活性化NKの集団を示す。図Dは、活性型CD4+T細胞の集団を示す。図Eは活性型CD8+T細胞の集団を示す。図Fは、DMSOによって標準化された、CD8+/CD4+T細胞の比を示している。図Gは、フローサイトメトリーによるWtマウス中のNKTの測定結果(左下の図)、NKTの総数(左上の図)、ならびにその2つのサブタイプであるNKT1(右上の図)およびNKT2(右下の図)を示している。図Hは、CD1KOマウスにおけるNKTの総数を示す。図Iは、WtマウスにおけるTreg細胞の総数を示す。すべての解析は、賦形剤に対して標準化して行われた。
図A〜Iは、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体をIV注射された後のC57BL/6マウスにおける脾細胞の増殖/活性化を示し、図G〜Iは、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体をIV注射された後の2種類のNKTサブセット(C57BL/6野生型(Wt)マウスおよびCD1KOマウス)のCD1d依存性活性化を示している。図Aは、C57BL/6マウスの有核細胞(脾細胞)の総数を示す。図Bは、成熟樹状細胞集団を示す。図Cは、活性化NKの集団を示す。図Dは、活性型CD4+T細胞の集団を示す。図Eは活性型CD8+T細胞の集団を示す。図Fは、DMSOによって標準化された、CD8+/CD4+T細胞の比を示している。図Gは、フローサイトメトリーによるWtマウス中のNKTの測定結果(左下の図)、NKTの総数(左上の図)、ならびにその2つのサブタイプであるNKT1(右上の図)およびNKT2(右下の図)を示している。図Hは、CD1KOマウスにおけるNKTの総数を示す。図Iは、WtマウスにおけるTreg細胞の総数を示す。すべての解析は、賦形剤に対して標準化して行われた。
図A〜Iは、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体をIV注射された後のC57BL/6マウスにおける脾細胞の増殖/活性化を示し、図G〜Iは、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体をIV注射された後の2種類のNKTサブセット(C57BL/6野生型(Wt)マウスおよびCD1KOマウス)のCD1d依存性活性化を示している。図Aは、C57BL/6マウスの有核細胞(脾細胞)の総数を示す。図Bは、成熟樹状細胞集団を示す。図Cは、活性化NKの集団を示す。図Dは、活性型CD4+T細胞の集団を示す。図Eは活性型CD8+T細胞の集団を示す。図Fは、DMSOによって標準化された、CD8+/CD4+T細胞の比を示している。図Gは、フローサイトメトリーによるWtマウス中のNKTの測定結果(左下の図)、NKTの総数(左上の図)、ならびにその2つのサブタイプであるNKT1(右上の図)およびNKT2(右下の図)を示している。図Hは、CD1KOマウスにおけるNKTの総数を示す。図Iは、WtマウスにおけるTreg細胞の総数を示す。すべての解析は、賦形剤に対して標準化して行われた。
図A〜Iは、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体をIV注射された後のC57BL/6マウスにおける脾細胞の増殖/活性化を示し、図G〜Iは、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体をIV注射された後の2種類のNKTサブセット(C57BL/6野生型(Wt)マウスおよびCD1KOマウス)のCD1d依存性活性化を示している。図Aは、C57BL/6マウスの有核細胞(脾細胞)の総数を示す。図Bは、成熟樹状細胞集団を示す。図Cは、活性化NKの集団を示す。図Dは、活性型CD4+T細胞の集団を示す。図Eは活性型CD8+T細胞の集団を示す。図Fは、DMSOによって標準化された、CD8+/CD4+T細胞の比を示している。図Gは、フローサイトメトリーによるWtマウス中のNKTの測定結果(左下の図)、NKTの総数(左上の図)、ならびにその2つのサブタイプであるNKT1(右上の図)およびNKT2(右下の図)を示している。図Hは、CD1KOマウスにおけるNKTの総数を示す。図Iは、WtマウスにおけるTreg細胞の総数を示す。すべての解析は、賦形剤に対して標準化して行われた。
図A〜Iは、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体をIV注射された後のC57BL/6マウスにおける脾細胞の増殖/活性化を示し、図G〜Iは、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体をIV注射された後の2種類のNKTサブセット(C57BL/6野生型(Wt)マウスおよびCD1KOマウス)のCD1d依存性活性化を示している。図Aは、C57BL/6マウスの有核細胞(脾細胞)の総数を示す。図Bは、成熟樹状細胞集団を示す。図Cは、活性化NKの集団を示す。図Dは、活性型CD4+T細胞の集団を示す。図Eは活性型CD8+T細胞の集団を示す。図Fは、DMSOによって標準化された、CD8+/CD4+T細胞の比を示している。図Gは、フローサイトメトリーによるWtマウス中のNKTの測定結果(左下の図)、NKTの総数(左上の図)、ならびにその2つのサブタイプであるNKT1(右上の図)およびNKT2(右下の図)を示している。図Hは、CD1KOマウスにおけるNKTの総数を示す。図Iは、WtマウスにおけるTreg細胞の総数を示す。すべての解析は、賦形剤に対して標準化して行われた。
図A〜Iは、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体をIV注射された後のC57BL/6マウスにおける脾細胞の増殖/活性化を示し、図G〜Iは、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体をIV注射された後の2種類のNKTサブセット(C57BL/6野生型(Wt)マウスおよびCD1KOマウス)のCD1d依存性活性化を示している。図Aは、C57BL/6マウスの有核細胞(脾細胞)の総数を示す。図Bは、成熟樹状細胞集団を示す。図Cは、活性化NKの集団を示す。図Dは、活性型CD4+T細胞の集団を示す。図Eは活性型CD8+T細胞の集団を示す。図Fは、DMSOによって標準化された、CD8+/CD4+T細胞の比を示している。図Gは、フローサイトメトリーによるWtマウス中のNKTの測定結果(左下の図)、NKTの総数(左上の図)、ならびにその2つのサブタイプであるNKT1(右上の図)およびNKT2(右下の図)を示している。図Hは、CD1KOマウスにおけるNKTの総数を示す。図Iは、WtマウスにおけるTreg細胞の総数を示す。すべての解析は、賦形剤に対して標準化して行われた。
図A〜Iは、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体をIV注射された後のC57BL/6マウスにおける脾細胞の増殖/活性化を示し、図G〜Iは、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体をIV注射された後の2種類のNKTサブセット(C57BL/6野生型(Wt)マウスおよびCD1KOマウス)のCD1d依存性活性化を示している。図Aは、C57BL/6マウスの有核細胞(脾細胞)の総数を示す。図Bは、成熟樹状細胞集団を示す。図Cは、活性化NKの集団を示す。図Dは、活性型CD4+T細胞の集団を示す。図Eは活性型CD8+T細胞の集団を示す。図Fは、DMSOによって標準化された、CD8+/CD4+T細胞の比を示している。図Gは、フローサイトメトリーによるWtマウス中のNKTの測定結果(左下の図)、NKTの総数(左上の図)、ならびにその2つのサブタイプであるNKT1(右上の図)およびNKT2(右下の図)を示している。図Hは、CD1KOマウスにおけるNKTの総数を示す。図Iは、WtマウスにおけるTreg細胞の総数を示す。すべての解析は、賦形剤に対して標準化して行われた。
図A〜Bは、本開示に係るα−GalCer類似体が、肺癌担持マウスの生存期間を延長できる仕組みを示している。C57BL/6マウスにマウス肺癌細胞(TC−1)をIV接種し、その後、週2回4週間にわたって、対照、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体で処理した。図Aは、第I群のα−GalCer類似体の試験結果を示している。図Bは、第II群のα−GalCer類似体の試験結果を示している。図Cは、第III群のα−GalCer類似体の試験結果を示している。図Dは、第IV群のα−GalCer類似体の試験結果を示している。肺癌担持マウスのカプラン・マイヤー生存率曲線(左図)および体重変化(右図)が示されている。対照は、腫瘍を接種されていないマウスである。
図A〜Bは、本開示に係るα−GalCer類似体が、肺癌担持マウスの生存期間を延長できる仕組みを示している。C57BL/6マウスにマウス肺癌細胞(TC−1)をIV接種し、その後、週2回4週間にわたって、対照、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体で処理した。図Aは、第I群のα−GalCer類似体の試験結果を示している。図Bは、第II群のα−GalCer類似体の試験結果を示している。図Cは、第III群のα−GalCer類似体の試験結果を示している。図Dは、第IV群のα−GalCer類似体の試験結果を示している。肺癌担持マウスのカプラン・マイヤー生存率曲線(左図)および体重変化(右図)が示されている。対照は、腫瘍を接種されていないマウスである。
図A〜Bは、本開示に係るα−GalCer類似体が、肺癌担持マウスの生存期間を延長できる仕組みを示している。C57BL/6マウスにマウス肺癌細胞(TC−1)をIV接種し、その後、週2回4週間にわたって、対照、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体で処理した。図Aは、第I群のα−GalCer類似体の試験結果を示している。図Bは、第II群のα−GalCer類似体の試験結果を示している。図Cは、第III群のα−GalCer類似体の試験結果を示している。図Dは、第IV群のα−GalCer類似体の試験結果を示している。肺癌担持マウスのカプラン・マイヤー生存率曲線(左図)および体重変化(右図)が示されている。対照は、腫瘍を接種されていないマウスである。
図A〜Bは、本開示に係るα−GalCer類似体が、肺癌担持マウスの生存期間を延長できる仕組みを示している。C57BL/6マウスにマウス肺癌細胞(TC−1)をIV接種し、その後、週2回4週間にわたって、対照、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体で処理した。図Aは、第I群のα−GalCer類似体の試験結果を示している。図Bは、第II群のα−GalCer類似体の試験結果を示している。図Cは、第III群のα−GalCer類似体の試験結果を示している。図Dは、第IV群のα−GalCer類似体の試験結果を示している。肺癌担持マウスのカプラン・マイヤー生存率曲線(左図)および体重変化(右図)が示されている。対照は、腫瘍を接種されていないマウスである。
図A〜Bは、(図A)α−GalCer類似体C11または対照で処理され、TC−1細胞を腫瘍接種した16日後に解剖されたマウスの肺の表面上の腫瘍小結節および大きさ、および(B)α−GalCer類似体C11または対照で処理され、マウス乳癌細胞細胞(4T−1)をSubQ腫瘍接種した16日後に解剖されたマウスの皮下腫瘍の腫瘍小結節および大きさを示している。
図A〜Bは、マウス乳癌細胞4T−1を皮下接種し、接種の3日後に、(図A)IV注射、または(B)SubQ注射によって、週2回4週間にわたり、対照、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体で処理したマウスのカプラン・マイヤー生存率曲線(左図)および腫瘍増殖(右図)を示している。
図A〜Bは、マウス乳癌細胞4T−1を皮下接種し、接種の3日後に、(図A)IV注射、または(B)SubQ注射によって、週2回4週間にわたり、対照、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体で処理したマウスのカプラン・マイヤー生存率曲線(左図)および腫瘍増殖(右図)を示している。
乳癌を担持し、α−GalCer(C1)のIV注射またはSubQ注射によって処理されたマウスのカプラン・マイヤー生存率曲線を示している。C1のSubQ送達の方が、IV送達よりも、乳癌担持マウスの生存期間を延長するのに効果的である。
図A〜Cは、本開示に係るα−GalCer類似体の抗癌治療プロトコルの投与量による最適化を示している。マウス肺癌細胞(TC−1)のIV接種後、4週間にわたり、週2回または週1回、さまざまな投薬量のα−GalCer、またはα−GalCer類似体である7DW8−5またはC26で処理したC57BL/6マウスの体重変化(右図)およびカプラン・マイヤー生存率曲線(左図)。(図A)α−GalCer。(B)α−GalCer類似体7DW8−5。(図C)α−GalCer類似体C26。
図A〜Cは、本開示に係るα−GalCer類似体の抗癌治療プロトコルの投与量による最適化を示している。マウス肺癌細胞(TC−1)のIV接種後、4週間にわたり、週2回または週1回、さまざまな投薬量のα−GalCer、またはα−GalCer類似体である7DW8−5またはC26で処理したC57BL/6マウスの体重変化(右図)およびカプラン・マイヤー生存率曲線(左図)。(図A)α−GalCer。(B)α−GalCer類似体7DW8−5。(図C)α−GalCer類似体C26。
図A〜Cは、本開示に係るα−GalCer類似体の抗癌治療プロトコルの投与量による最適化を示している。マウス肺癌細胞(TC−1)のIV接種後、4週間にわたり、週2回または週1回、さまざまな投薬量のα−GalCer、またはα−GalCer類似体である7DW8−5またはC26で処理したC57BL/6マウスの体重変化(右図)およびカプラン・マイヤー生存率曲線(左図)。(図A)α−GalCer。(B)α−GalCer類似体7DW8−5。(図C)α−GalCer類似体C26。
図A〜Cは、経路および頻度を変えることによる、本開示に係るα−GalCer類似体の抗癌治療プロトコルの最適化を示している。図Aは、マウス乳癌細胞4T−1をSubQ接種し、接種の3日後に、IV経路またはSubQ経路によって、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体で週2回4週間にわたり処理したBALB/cマウスの腫瘍容積(mm3)(右図)およびカプラン・マイヤー生存率曲線(左図)を示す。図Bは、マウス肺癌細胞TC−1をIV接種し、接種の3日後に、IV経路またはSubQ経路によって、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体で週2回4週間にわたり処理したC57BL/6マウスの体重変化(右図)およびカプラン・マイヤー生存率曲線(左図)を示す。図Cは、マウス肺癌細胞TC−1をIV接種し、その後、IV経路によって、賦形剤またはα−GalCer類似体C16で、4週間にわたり週2回または週1回処理したC57BL/6マウスの体重(右図)およびカプラン・マイヤー生存率曲線(左図)に対する投与頻度の影響を示している。
図A〜Cは、経路および頻度を変えることによる、本開示に係るα−GalCer類似体の抗癌治療プロトコルの最適化を示している。図Aは、マウス乳癌細胞4T−1をSubQ接種し、接種の3日後に、IV経路またはSubQ経路によって、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体で週2回4週間にわたり処理したBALB/cマウスの腫瘍容積(mm3)(右図)およびカプラン・マイヤー生存率曲線(左図)を示す。図Bは、マウス肺癌細胞TC−1をIV接種し、接種の3日後に、IV経路またはSubQ経路によって、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体で週2回4週間にわたり処理したC57BL/6マウスの体重変化(右図)およびカプラン・マイヤー生存率曲線(左図)を示す。図Cは、マウス肺癌細胞TC−1をIV接種し、その後、IV経路によって、賦形剤またはα−GalCer類似体C16で、4週間にわたり週2回または週1回処理したC57BL/6マウスの体重(右図)およびカプラン・マイヤー生存率曲線(左図)に対する投与頻度の影響を示している。
図A〜Cは、経路および頻度を変えることによる、本開示に係るα−GalCer類似体の抗癌治療プロトコルの最適化を示している。図Aは、マウス乳癌細胞4T−1をSubQ接種し、接種の3日後に、IV経路またはSubQ経路によって、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体で週2回4週間にわたり処理したBALB/cマウスの腫瘍容積(mm3)(右図)およびカプラン・マイヤー生存率曲線(左図)を示す。図Bは、マウス肺癌細胞TC−1をIV接種し、接種の3日後に、IV経路またはSubQ経路によって、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体で週2回4週間にわたり処理したC57BL/6マウスの体重変化(右図)およびカプラン・マイヤー生存率曲線(左図)を示す。図Cは、マウス肺癌細胞TC−1をIV接種し、その後、IV経路によって、賦形剤またはα−GalCer類似体C16で、4週間にわたり週2回または週1回処理したC57BL/6マウスの体重(右図)およびカプラン・マイヤー生存率曲線(左図)に対する投与頻度の影響を示している。
図A〜Bは、本開示に係るさまざまなα−GalCer類似体の抗腫瘍効果の評価を示す。C57BL/6マウスに、マウス肺癌細胞TC−1をIV接種するか、またはマウス黒色腫B16細胞をSubQ接種した後、4週間にわたり週1回ずつ、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体で処理した。図Aは、カプラン・マイヤー生存率曲線を示す。図Bは、腫瘍容積(mm3)の増加曲線を示す。
図A〜Bは、(図A)肺癌細胞(TC−1−GRP−ルシフェラーゼ)または(B)乳癌細胞(4T−1−GFP−ルシフェラーゼ)をSQ接種した後、4週間にわたり週1回、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体で処理したC57BL/6マウスにおける腫瘍増殖のリアルタイム評価を示している。
図A〜Hは、TH−1バイアスがかかった、本開示に係るα−GalCer類似体が、肺癌または黒色腫瘍において、より多くの腫瘍浸潤性リンパ球を誘導することを示している。図A〜Dは、肺癌細胞(TC−1)における腫瘍浸潤性リンパ球を示している。C57BL/6マウスを、3週間にわたり週1回ずつ、0.1μg/マウスの賦形剤、α−GalCer、またはα−GalCer類似体であるC23、C8−5、もしくはC30で処理した。図Aは、CD3+細胞の集団を示している。図Bは、CD8 T細胞の集団を示している。図Cは、NKの集団を示している。図Dは、NKTの集団を示している。すべての解析は、賦形剤に対して標準化して行われた。図E〜Hは、黒色腫細胞における腫瘍浸潤性リンパ球を示している。C57BL/6マウスを、3週間にわたり週1回ずつ、0.1μg/マウスの賦形剤、α−GalCer、またはα−GalCer類似体であるC23、C8−5、もしくはC30で処理した。図Eは、CD3+細胞の集団を示す。図Fは、CD8 T細胞の集団を示している。図Gは、NKの集団を示している。図Hは、NKTの集団を示している。すべての解析は、賦形剤に対して標準化して行われた。
図A〜Hは、TH−1バイアスがかかった、本開示に係るα−GalCer類似体が、肺癌または黒色腫瘍において、より多くの腫瘍浸潤性リンパ球を誘導することを示している。図A〜Dは、肺癌細胞(TC−1)における腫瘍浸潤性リンパ球を示している。C57BL/6マウスを、3週間にわたり週1回ずつ、0.1μg/マウスの賦形剤、α−GalCer、またはα−GalCer類似体であるC23、C8−5、もしくはC30で処理した。図Aは、CD3+細胞の集団を示している。図Bは、CD8 T細胞の集団を示している。図Cは、NKの集団を示している。図Dは、NKTの集団を示している。すべての解析は、賦形剤に対して標準化して行われた。図E〜Hは、黒色腫細胞における腫瘍浸潤性リンパ球を示している。C57BL/6マウスを、3週間にわたり週1回ずつ、0.1μg/マウスの賦形剤、α−GalCer、またはα−GalCer類似体であるC23、C8−5、もしくはC30で処理した。図Eは、CD3+細胞の集団を示す。図Fは、CD8 T細胞の集団を示している。図Gは、NKの集団を示している。図Hは、NKTの集団を示している。すべての解析は、賦形剤に対して標準化して行われた。
図A〜Hは、TH−1バイアスがかかった、本開示に係るα−GalCer類似体が、肺癌または黒色腫瘍において、より多くの腫瘍浸潤性リンパ球を誘導することを示している。図A〜Dは、肺癌細胞(TC−1)における腫瘍浸潤性リンパ球を示している。C57BL/6マウスを、3週間にわたり週1回ずつ、0.1μg/マウスの賦形剤、α−GalCer、またはα−GalCer類似体であるC23、C8−5、もしくはC30で処理した。図Aは、CD3+細胞の集団を示している。図Bは、CD8 T細胞の集団を示している。図Cは、NKの集団を示している。図Dは、NKTの集団を示している。すべての解析は、賦形剤に対して標準化して行われた。図E〜Hは、黒色腫細胞における腫瘍浸潤性リンパ球を示している。C57BL/6マウスを、3週間にわたり週1回ずつ、0.1μg/マウスの賦形剤、α−GalCer、またはα−GalCer類似体であるC23、C8−5、もしくはC30で処理した。図Eは、CD3+細胞の集団を示す。図Fは、CD8 T細胞の集団を示している。図Gは、NKの集団を示している。図Hは、NKTの集団を示している。すべての解析は、賦形剤に対して標準化して行われた。
図A〜Hは、TH−1バイアスがかかった、本開示に係るα−GalCer類似体が、肺癌または黒色腫瘍において、より多くの腫瘍浸潤性リンパ球を誘導することを示している。図A〜Dは、肺癌細胞(TC−1)における腫瘍浸潤性リンパ球を示している。C57BL/6マウスを、3週間にわたり週1回ずつ、0.1μg/マウスの賦形剤、α−GalCer、またはα−GalCer類似体であるC23、C8−5、もしくはC30で処理した。図Aは、CD3+細胞の集団を示している。図Bは、CD8 T細胞の集団を示している。図Cは、NKの集団を示している。図Dは、NKTの集団を示している。すべての解析は、賦形剤に対して標準化して行われた。図E〜Hは、黒色腫細胞における腫瘍浸潤性リンパ球を示している。C57BL/6マウスを、3週間にわたり週1回ずつ、0.1μg/マウスの賦形剤、α−GalCer、またはα−GalCer類似体であるC23、C8−5、もしくはC30で処理した。図Eは、CD3+細胞の集団を示す。図Fは、CD8 T細胞の集団を示している。図Gは、NKの集団を示している。図Hは、NKTの集団を示している。すべての解析は、賦形剤に対して標準化して行われた。
図A〜Hは、TH−1バイアスがかかった、本開示に係るα−GalCer類似体が、肺癌または黒色腫瘍において、より多くの腫瘍浸潤性リンパ球を誘導することを示している。図A〜Dは、肺癌細胞(TC−1)における腫瘍浸潤性リンパ球を示している。C57BL/6マウスを、3週間にわたり週1回ずつ、0.1μg/マウスの賦形剤、α−GalCer、またはα−GalCer類似体であるC23、C8−5、もしくはC30で処理した。図Aは、CD3+細胞の集団を示している。図Bは、CD8 T細胞の集団を示している。図Cは、NKの集団を示している。図Dは、NKTの集団を示している。すべての解析は、賦形剤に対して標準化して行われた。図E〜Hは、黒色腫細胞における腫瘍浸潤性リンパ球を示している。C57BL/6マウスを、3週間にわたり週1回ずつ、0.1μg/マウスの賦形剤、α−GalCer、またはα−GalCer類似体であるC23、C8−5、もしくはC30で処理した。図Eは、CD3+細胞の集団を示す。図Fは、CD8 T細胞の集団を示している。図Gは、NKの集団を示している。図Hは、NKTの集団を示している。すべての解析は、賦形剤に対して標準化して行われた。
図A〜Hは、TH−1バイアスがかかった、本開示に係るα−GalCer類似体が、肺癌または黒色腫瘍において、より多くの腫瘍浸潤性リンパ球を誘導することを示している。図A〜Dは、肺癌細胞(TC−1)における腫瘍浸潤性リンパ球を示している。C57BL/6マウスを、3週間にわたり週1回ずつ、0.1μg/マウスの賦形剤、α−GalCer、またはα−GalCer類似体であるC23、C8−5、もしくはC30で処理した。図Aは、CD3+細胞の集団を示している。図Bは、CD8 T細胞の集団を示している。図Cは、NKの集団を示している。図Dは、NKTの集団を示している。すべての解析は、賦形剤に対して標準化して行われた。図E〜Hは、黒色腫細胞における腫瘍浸潤性リンパ球を示している。C57BL/6マウスを、3週間にわたり週1回ずつ、0.1μg/マウスの賦形剤、α−GalCer、またはα−GalCer類似体であるC23、C8−5、もしくはC30で処理した。図Eは、CD3+細胞の集団を示す。図Fは、CD8 T細胞の集団を示している。図Gは、NKの集団を示している。図Hは、NKTの集団を示している。すべての解析は、賦形剤に対して標準化して行われた。
図A〜Hは、TH−1バイアスがかかった、本開示に係るα−GalCer類似体が、肺癌または黒色腫瘍において、より多くの腫瘍浸潤性リンパ球を誘導することを示している。図A〜Dは、肺癌細胞(TC−1)における腫瘍浸潤性リンパ球を示している。C57BL/6マウスを、3週間にわたり週1回ずつ、0.1μg/マウスの賦形剤、α−GalCer、またはα−GalCer類似体であるC23、C8−5、もしくはC30で処理した。図Aは、CD3+細胞の集団を示している。図Bは、CD8 T細胞の集団を示している。図Cは、NKの集団を示している。図Dは、NKTの集団を示している。すべての解析は、賦形剤に対して標準化して行われた。図E〜Hは、黒色腫細胞における腫瘍浸潤性リンパ球を示している。C57BL/6マウスを、3週間にわたり週1回ずつ、0.1μg/マウスの賦形剤、α−GalCer、またはα−GalCer類似体であるC23、C8−5、もしくはC30で処理した。図Eは、CD3+細胞の集団を示す。図Fは、CD8 T細胞の集団を示している。図Gは、NKの集団を示している。図Hは、NKTの集団を示している。すべての解析は、賦形剤に対して標準化して行われた。
図A〜Hは、TH−1バイアスがかかった、本開示に係るα−GalCer類似体が、肺癌または黒色腫瘍において、より多くの腫瘍浸潤性リンパ球を誘導することを示している。図A〜Dは、肺癌細胞(TC−1)における腫瘍浸潤性リンパ球を示している。C57BL/6マウスを、3週間にわたり週1回ずつ、0.1μg/マウスの賦形剤、α−GalCer、またはα−GalCer類似体であるC23、C8−5、もしくはC30で処理した。図Aは、CD3+細胞の集団を示している。図Bは、CD8 T細胞の集団を示している。図Cは、NKの集団を示している。図Dは、NKTの集団を示している。すべての解析は、賦形剤に対して標準化して行われた。図E〜Hは、黒色腫細胞における腫瘍浸潤性リンパ球を示している。C57BL/6マウスを、3週間にわたり週1回ずつ、0.1μg/マウスの賦形剤、α−GalCer、またはα−GalCer類似体であるC23、C8−5、もしくはC30で処理した。図Eは、CD3+細胞の集団を示す。図Fは、CD8 T細胞の集団を示している。図Gは、NKの集団を示している。図Hは、NKTの集団を示している。すべての解析は、賦形剤に対して標準化して行われた。
図A〜Bは、破傷風トキソイド(TT)−タンパク質ワクチンに対する抗体応答に対するミョウバン、α−GalCer、およびα−GalCer類似体C11のアジュバント効果を示している。(図A)マウスに対し、0日目(初回ワクチン接種)および28日目(4週後2回目ワクチン接種)に、従来型アジュバントであるミョウバン、α−GalCer、もしくはα−GalCer類似体C11とともに、またはそれらなしでTTをワクチン、またはこれらを含んだTTワクチンを接種した。抗TT−特異性抗体を測定するため、一週間毎に血清を採取した。図Bは、2回目ワクチン接種後20週間の遅延型抗原ブーストに対する、従来型アジュバントであるミョウバン、α−GalCer、およびα−GalCer類似体C11の効果を示している。
H1N1ウイルス株のM2(M2e)タンパク質の細胞外ドメインを含むペプチドに対する従来型アジュバントであるミョウバン、α−GalCer、および本開示に係るさまざまなα−GalCer類似体の、3回目の免疫化の2週間後のアジュバント効果を示している。0週目、3週目、および6週目に、α−GalCerおよび本開示に係るさまざまなα−GalCer類似体とともに、またはそれらなしで、BALB/cマウスに5μgまたは45μgのM2eタンパク質をワクチン接種した。
図A〜Cは、鳥インフルエンザウイルスの完全長H5のコンセンサス配列を含むDNAプラスミドであるpHAで免疫されたマウスに対する、α−GalCer(C1)のアジュバント効果を示している。(図A)0週目および3週目に、C1なしか、またはC1とともに、5μgから45μgのpHAでマウスを免疫した。(図B)C1なしか、またはC1とともに、低用量のpHAワクチンでマウスを免疫化した。図Cは、20LD50のベトナム型合併結合変異インフルエンザウイルス株NIBRG−14によるウイルス曝露に対する、C1添加または無添加のH5DNAワクチンを接種した2週間後の防御作用を示す。
図A〜Cは、鳥インフルエンザウイルスの完全長H5のコンセンサス配列を含むDNAプラスミドであるpHAで免疫されたマウスに対する、α−GalCer(C1)のアジュバント効果を示している。(図A)0週目および3週目に、C1なしか、またはC1とともに、5μgから45μgのpHAでマウスを免疫した。(図B)C1なしか、またはC1とともに、低用量のpHAワクチンでマウスを免疫化した。図Cは、20LD50のベトナム型合併結合変異インフルエンザウイルス株NIBRG−14によるウイルス曝露に対する、C1添加または無添加のH5DNAワクチンを接種した2週間後の防御作用を示す。
図A〜Cは、鳥インフルエンザウイルスの完全長H5のコンセンサス配列を含むDNAプラスミドであるpHAで免疫されたマウスに対する、α−GalCer(C1)のアジュバント効果を示している。(図A)0週目および3週目に、C1なしか、またはC1とともに、5μgから45μgのpHAでマウスを免疫した。(図B)C1なしか、またはC1とともに、低用量のpHAワクチンでマウスを免疫化した。図Cは、20LD50のベトナム型合併結合変異インフルエンザウイルス株NIBRG−14によるウイルス曝露に対する、C1添加または無添加のH5DNAワクチンを接種した2週間後の防御作用を示す。
図A〜Cは、鳥インフルエンザウイルスの完全長H5のコンセンサス配列を含むDNAプラスミドであるpHAで免疫されたマウスに対する、α−GalCer(C1)のアジュバント効果を示している。(図A)0週目および3週目に、C1なしか、またはC1とともに、5μgから45μgのpHAでマウスを免疫した。(図B)C1なしか、またはC1とともに、低用量のpHAワクチンでマウスを免疫化した。図Cは、20LD50のベトナム型合併結合変異インフルエンザウイルス株NIBRG−14によるウイルス曝露に対する、C1添加または無添加のH5DNAワクチンを接種した2週間後の防御作用を示す。
図A〜Cは、C1または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体とともに、またはそれらなしで、pHAによってマウスを免疫した後の抗HA−特異的IgG抗体の誘導を示す。図Aは、0.2μgのpHAで免疫した後のマウスにおける抗−HA特異的IgG抗体(AY3)の力価を示している。図Bは、0.2μgのpHAで免疫した後のマウスにおける抗−HA特異的IgG抗体(AY4)の力価を示している。図Cは、ウイルス曝露のマウス生存率を示している。
図A〜Bは、C1または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体とともに、またはそれらなしで、pHAによってマウスを免疫した後の抗HA−特異的IgG抗体の誘導を示す。図Aは、0.5μgのpHAおよび表示されている本開示に係るα−GalCer類似体で免疫した後の抗−HA特異的IgG抗体(AY4)の力価を示している。図Bは、ウイルス曝露後の生存率を示している。
図A〜Bは、(図A)0.1μgのpHAまたは(図B)0.2μgのpHAと、表示されている本開示に係るα−GalCer類似体によって免疫した後の抗−HA特異的IgG抗体(AY5)のマウスの力価を示している。
図A〜Bは、(図A)0.1μgのpHAまたは(図B)0.2μgのpHAと、0.1μgまたは1μgの表示されている本開示に係るα−GalCer類似体によって免疫した後の抗−HA特異的IgG抗体(AY6)のマウスの力価を示している。
図A〜Dは、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体による、抗HA特異的IgG抗体の誘導を示している。BALB/cマウスに、pHAcとともに、α−GalCer、または表示されているα−GalCer類似体を、電気移動法により筋肉内にワクチン接種し、4週間後に同じ処方で1回追加免疫した。2回目のワクチン接種の2週間後に血液試料を採集し、ELISA法により抗HAc特異的IgG抗体価について試験した。図Aは、抗−HA特異的IgG抗体(AY3)の力価を示している。図(B)は、抗−HA特異的IgG抗体(AY4)の力価を示している。(C)は、は、抗−HA特異的IgG抗体(AY5)の力価を示している。(D)は、は、抗−HA特異的IgG抗体(AY16)の力価を示している。
図A〜Bは、(図A)HA特異的IFN−γ産生細胞、および(図B)HA特異的ペプチド応答細胞を示している。BALB/cマウスに、pHAとα−GalCerまたは表示されている本開示に係るα−GalCer類似体とを、筋肉に電気移動法によってワクチン接種し、3週間後に同じ処方で1回追加免疫した。脾細胞を、HA特異的ペプチド(9量体)とともに培養し、1日後にスポットを測定した。
ウイルス曝露に対する防御を示している。BALB/cマウスに、pHAとα−GalCerまたは表示されている本開示に係るα−GalCer類似体とを、筋肉に電気移動法によってワクチン接種し、3週間後に同じ処方で1回追加免疫した。2回目にワクチン接種した2週間後に、マウスを200LD50のNIBRG−14ウイルスに曝露し、マウスの生存率を観測した。
図A〜Bは、単回ワクチン接種の効果を示している。BALB/cマウスに、pHA(2μg)とα−GalCerまたは表示されている本開示に係るα−GalCer類似体(2μg)とを筋肉内に電気移動法によりワクチン接種した。(図A)3週間後に血液試料を採集して、抗HAc特異的IgG抗体の力価を試験した。(図B)初回投与の3週間後、マウスを200LD50のNIBRG−14ウイルスに曝露し、生存率を観測した。
図A〜Bは、糖鎖抗原に対する、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体の効果を示している。BALB/cマウスに、グロボH−DTと混合したα−GalCerまたは表示されている本開示に係るα−GalCer類似体をIM注射によりワクチン接種し、2週間以内の間隔で2回追加免疫した。3回目のワクチン接種の2週間後に血液試料を採集して、(図A)抗グロボH特異的IgG抗体、および(図B)抗グロボH特異的IgM抗体の産生について試験した。
図A〜Bは、BALB/cマウスを、腹腔内(IP)経路を介したα−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体によって処理するのを、(図A)FLU−Aウイルス血清型H1N1(WSN)ウイルスに曝露した30分後から開始した場合、および(図B)H1N1ウイルス曝露の2週間前から開始した場合のマウスの生存率を示している。
図A〜Bは、H1N1(WSN)に感染したBALB/cマウスを、(図A)高用量のH1N1(WSN)ウイルスによるウイルス曝露の2週間前から、および(図B)鼻腔内経路を介して、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体で処理したときのマウスの生存率の累積比率を示している。
図A〜Bは、インビトロにおけるメイディン・ダービー・イヌ腎臓(MDCK)細胞の細胞変性効果(CPE)を示している。MDCK細胞を、10μg/mlの賦形剤、α−GalCer、またはα−GalCer類似体であるC13、C14、またはC16のいずれか一つで4時間予備処理した後、10TCID50のFLU−Aウイルス血清型H1N1(WSN)に感染させた。図Aは、インビトロにおいて糖脂質で処理した後の生存ウイルスの力価(log10)を示し、図Bは、感染48時間後のMDCK細胞におけるウイルス力価を示している。
図A〜Bは、スフィンゴモナス・カプスラータ(Sphingomonas capsulata)に感染したマウスにおける、(図A)100μg/kgまたは(B)50μg/kgで処理されたα−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体の抗細菌作用を示す。
図A〜Bは、肺炎桿菌に感染したマウスにおける、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体の抗細菌作用を示している。C1およびC14は、注射後のマウスの(図A)肺および(B)肝臓において、細菌の負荷量を有意に低下させることができる。
50μg/kgのC23およびC30で処理された群の(肺における)CFU数が、未処理群と比較して有意であることを示している。
別の意味が下記に記載されていない限り、すべての科学用語は、当業者によって理解されている通りの通常の意味をもつものとして使用されている。矛盾する場合には、本明細書に記載された定義が優先するものとする。
本明細書において、「脂質」という用語は、細胞のシグナル伝達経路に関与する任意の脂溶性(親油性)分子を意味する。
本明細書において、「糖脂質」という用語は、細胞を認識するためのマーカーとして働く糖結合脂質を意味する。
本明細書において、「アルファ−ガラクトシルセラミド」および「α−GalCer」という用語は、ナチュラルキラーT細胞を刺激してTヘルパー(TH)1サイトカインおよびTH2サイトカインを産生させる糖脂質を意味する。
本明細書において、「グリカン」という用語は、多糖、またはオリゴ糖を意味する。また、グリカンは、本明細書において、糖タンパク質、糖脂質、糖ペプチド、糖プロテオーム、ペプチドグリカン、リポ多糖、またはプロテオグリカンなどの複合糖質の糖質部分を意味するためにも使用される。グリカンは、通常、単糖間のO−グリコシド結合のみからなる。例えば、セルロースは、β−1,4−結合型D−グルコースからなるグリカン(より具体的にはグルカン)であり、キチンは、β−1,4−結合型N―アセチル―D−グルコサミンからなるグリカンである。グリカンは、単糖残基のホモポリマーでもヘテロポリマーでもよく、また、直鎖状でも分枝状でもよい。グリカンは、糖タンパク質およびプロテオグリカンのように、タンパク質に結合して存在することができる。これらは、通常、細胞の外表面上に存在する。O−結合型グリカンおよびN−結合型グリカンは、真核生物では非常に一般的なものである。あまり一般的ではないが、原核生物でも存在する可能性がある。N−結合型グリカンは、シークオンのアスパラギンのR基窒素(N)に結合して存在する。シークオンとは、Xがプロリン以外の任意のアミノ酸である、Asn−X−Ser配列またはAsn−X−Thr配列のことである。
本明細書において、「糖タンパク質」という用語は、グリカンによって共有結合的に修飾されているタンパク質を意味する。糖タンパク質には四つの型がある:1)N−結合型糖タンパク質、2)O−結合型糖タンパク質(ムチン)、3)グリコサミノグリカン(GAG、これもプロテオグリカンとも呼ばれる)、4)GPI−アンカー型。大部分の糖タンパク質は、構造上のミクロ不均一性(同一のグリコシル化部位の内部に結合している複数の異なったグリカン構造体)、および構造上のマクロ不均一性(複数のグリカン結合部位と型)を有する。
本明細書において、「類似体」という用語は、構造が別の化合物の構造と類縁関係にあるが、化学的および生物学的な性質が全く異なっているかもしれない化合物、例えば、薬物を意味する。
本明細書において、「抗原」という用語は、免疫応答を誘導することができる物質であると定義される。
本明細書において、「病原体」という用語は、その宿主に対して疾患または病気の原因となる生物因子である。身体は、ヒト免疫系という形で、一般的な病原体のいくつか(ニューモシスティスなど)に対する自然の防御能を数多く含んでいる。
本明細書において、「免疫原」という用語は、抗原、または抗原産生を誘導することができる物質、例えば、DNAワクチンなどを意味する。
本明細書において、「免疫原性」という用語は、免疫原、抗原、またはワクチンが免疫応答を刺激する能力を意味する。
本明細書において、「免疫療法」という用語は、免疫系を調節して予防および/または治療という目的を達成するという概念に基づいた一連の治療戦略を意味する。
本明細書において、「CD1d」という用語は、さまざまなヒト抗原提示細胞の表面上に発現される糖タンパク質のCD1(分化クラスター1)ファミリーのメンバーを意味する。CD1dにより提示される脂質抗原は、ナチュラルキラーT細胞を活性化させる。CD1dは、糖脂質抗原が結合する深い抗原結合溝がある。樹状細胞上に発現されるCD1d分子は、糖脂質に結合して、それを提示することができる。
本明細書において、「適応免疫系」という用語は、病原体の攻撃を排除する、高度に特化した全身の細胞およびプロセスを意味する。適応免疫系の細胞は、一種の白血球で、リンパ球と呼ばれる。B細胞およびT細胞がリンパ球の主な型である。
本明細書において、「T細胞」および「T」という用語は、細胞性免疫において中心的な役割を果たしている、リンパ球として知られている一群の白血球を意味する。T細胞は、T細胞受容体(TCR)と呼ばれる特別な受容体が、その細胞表面上に存在することによって、B細胞およびNKなどの他のリンパ球型と区別することができる。T細胞のいくつかの異なるサブセットが記載されているが、それぞれ明確な機能を持っている。ヘルパーT(TH)細胞は、適応免疫系の「仲介役」である。これらは活性化されると、すぐに分裂して、免疫応答を調節または「補助」するサイトカインと呼ばれる低分子タンパク質を分泌する。これらの細胞は、受け取ったサイトカインシグナルに応じて、さまざまなサイトカインを分泌する、TH1、TH2、TH17、またはその他のサブセットの一つに分化する。
本明細書において、「抗原提示細胞」(APC)という用語は、その表面上で主要組織適合複合体(MHC)と複合体を形成する外来抗原を提示する細胞を意味する。T細胞は、そのTCRを用いて、この複合体を認識することができる。APCは、プロフェッショナルおよび非プロフェッショナルという2つのカテゴリーに分けられる。樹状細胞(DC)は、プロフェッショナルのカテゴリーに入り、CD1に関連して、T細胞に抗原を提示することができる。典型的な実施態様において、本開示に係る方法で利用されるDCは、いくつかのDCサブセットのうちの任意のものであればよく、一つの実施態様においては、リンパ球系前駆体から分化し、別の実施態様においては、骨髄球系骨髄前駆体から分化する。
本明細書において、「ナイーブ細胞」という用語は、まだ特定の病原体を認識できるように特化していない、例えば、CD4T細胞などの未分化の免疫系細胞を意味する。
本明細書において、「ナチュラルキラー細胞」または「NK」という用語は、インターフェロンによって活性化されて、ウイルスまたはその他の細胞内病原体に対する先天性の宿主防御能に寄与するリンパ球系細胞のクラスを意味する。
本明細書において、「ナチュラルキラーT細胞」(NKT)という用語は、通常のTおよびNKの両方と特徴/受容体を共有する、T細胞のサブセットを意味する。これらの細胞の多くは、自己性および外来性の脂質および糖脂質に結合する抗原提示分子である非多型性CD1d分子を認識する。NKTのTCRは、CD1d分子によって提示された(介添えされた)糖脂質抗原を認識することができる。NKTの主な応答は、刺激を受けると迅速に、IL4、INF−γ、およびIL−10などのサイトカインを分泌し、その結果、多様な免疫応答および発病過程に影響を及ぼす。NKTは同種集団であっても異種集団であってもよい。一つの典型的な実施態様において、この集団は、「非インバリアントNKT」であってもよいが、これは、例えば、多様なTCRを発現し、また、大量のIL−4およびINF−γを産生することもできるCD1d応答性非インバリアントT細胞である、ヒトおよびマウスの骨髄T細胞集団およびヒト肝臓T細胞集団を含むことができる。最もよく知られたCD1d依存性NKTのサブセットは、インバリアントTCR−アルファ(TCR−α)鎖を発現する。これらは、I型NKTまたはインバリアントNKT(iNKT)と呼ばれる。これらの細胞は、ヒト(Vα24iNKT)とマウス(Vα14iNKT)の間で保存されており、数多くの免疫学的過程に関与している。
本明細書において、「サイトカイン」という用語は、それによって前駆細胞が明確な特化細胞型となる遺伝子発現の変化を通常含む免疫細胞分化過程に影響することによって、免疫応答の強度および持続時間を調節する無数の低分子分泌タンパク質の任意のものを意味する。サイトカインは、それらの推定機能、分泌する細胞、または作用の標的に基づいて、リンホカイン、インターロイキン、およびケモカインとさまざまに名付けられてきた。例えば、いくつかの一般的なインターロイキンには、IL−12、IL−18、IL−2、IFN−γ、TNF、IL−4、IL−10、IL−13、IL−21、およびTGF−βが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書において、「ケモカイン」という用語は、リンパ球を可動化および活性化させる手段を提供する、感染部位で放出される多様な低分子走化性サイトカインの任意のものを意味する。ケモカインは、白血球を感染部位に引き寄せる。ケモカインは、それらを4群に分けることができる保存的システイン残基を有する。これらの群は、代表的なケモカインによって、C−Cケモカイン(RANTES、MCP−1、MIP−1α、およびMIP−1β)、C−X−Cケモカイン(IL−8)、Cケモカイン(リンホタクチン)、およびCXXXCケモカイン(フラクタルカイン)である。
本明細書において、「TH2型応答」という用語は、一定の型のサイトカイン、インターフェロン、ケモカインが産生されるようにするサイトカイン発現のパターンを意味する。典型的なTH2サイトカインは、IL−4、IL−5、IL−6、およびIL−10を含むが、これらに限定されない。
本明細書において、「TH1−型」という用語は、一定の型のサイトカイン、インターフェロン、ケモカインが産生されるようにするサイトカイン発現のパターンを意味する。典型的なTH1サイトカインは、IL−2、INF−γ、GM−CSF、およびTNF−βを含むが、これらに限定されない。
本明細書において、「TH1偏向」という用語は、TH1サイトカインおよび/またはケモカインの産生が、TH2サイトカインおよび/またはケモカインの産生よりも大きく増加する免疫原性応答を意味する。
本明細書において、「エピトープ」という用語は、抗体またはT細胞受容体の抗原結合部位に接触する、抗原分子の部分と定義される。
本明細書において、「ワクチン」という用語は、完全な病原生物(死滅または弱毒化させたもの)またはそのような生物の構成要素、例えば、タンパク質、ペプチド、または多糖からなる抗原を含む製剤であって、その生物が原因となる病気に対する免疫を与えるために用いられる製剤を意味する。ワクチン製剤は、天然のもの、合成のもの、または組み換えDNA技術によって得られたものであってもよい。
本明細書において、「抗菌剤」という用語は、細菌、真菌、またはウイルスなどの微生物を死滅させるか、または増殖を阻害する物質を意味する。
本明細書において、「類毒素」という用語は、化学薬品(ホルマリン)または加熱処理によって毒性が弱められるか、抑制されているが、その他の性質、一般的には免疫原性は維持されている細菌毒素を意味する。類毒素は、本来の毒素に対する免疫応答を誘導したり、別の抗原に対する応答を増加させたりするため、ワクチンに利用される。例えば、破傷風毒素は、破傷風菌(Clostridium tetani)によって産生され、破傷風の原因となるテタノスパスミンに由来するものである。破傷風類毒素は、血漿に富むワクチン(plasma rich vaccines)を開発するために、合衆国の数多くの血漿センターで利用されている。
本明細書において、「DNAワクチン」という用語は、細胞に導入され、次に、特異的抗原タンパク質に翻訳されるDNAコンストラクトを意味する。
本明細書において、「プラスミド」という用語は、複製能をもつ、染色体外の環状DNAであって、クローニングベクターとして使用することができるものを意味する。
本明細書において、「微生物」という用語は、顕微鏡でしか見えない(小さすぎて人間の裸眼では見ることができない)生物を意味する。微生物は信じられないほど多様であり、細菌および真菌を含むが、これらに限定されない。
本明細書において、「免疫学的アジュバント」という用語は、免疫原ともに使用される物質で、該免疫原に対する応答を促進または改変する物質を意味する。典型的な実施態様において、本開示に係るα−GalCer類似体を免疫学的アジュバントとして使用して、ワクチンに対してより強く反応するようワクチンを投与されている患者の免疫系を刺激することによって、ワクチンの作用を改変または増強する。
本明細書において、「ミョウバンアジュバント」という用語は、免疫アジュバント活性をもつアルミニウム塩を意味する。この薬剤は、溶液中でタンパク質抗原を吸収および沈殿させ、生じた沈殿物が、ワクチン接種部位に形成されるワクチンデポーからの抗原の徐放を促進させることによって、ワクチンの免疫原性を改善する。
本明細書において、「抗腫瘍免疫療法活性剤」という用語は、腫瘍を抑制、縮小、および/または除去する、本開示に係るα−GalCer類似体を意味する。
本明細書において、「顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子」(GM−CSF)という用語は、白血球、特に顆粒球(好中球、好塩基球、および好酸球)、マクロファージ、および血小板の前駆体である、骨髄中の細胞の産生を促進するコロニー刺激因子として働くサイトカインを意味する。
本明細書において、「抗原特異的」という用語は、特定の抗原、または該抗原の断片を供給すると、特異的な細胞増殖が生じるような細胞集団の性質を意味する。
本明細書において、「フローサイトメトリー」または「FACS」という用語は、光学的または電子的な検出装置によって、液流中に懸濁された粒子または細胞の物理的および化学的な性質を試験する技術を意味する。
本明細書において、α−GalCer類似体または合成α−GalCer類似体は、別段の記載がない限り、α−ガラクトシルセラミドを主材料とする、構造に基づいた合成糖脂質類似体を意味する。
ペプチドの中のアミノ酸残基は、本明細書では以後、次のように略されるものとする:フェニルアラニンはPheまたはF;ロイシンはLeuまたはL;イソロイシンはIleまたはI;メチオニンはMetまたはM;バリンはValまたはV;セリンはSerまたはS;プロリンはProまたはP;トレオニンはThrまたはT;アラニンはAlaまたはA;チロシンはTyrまたはY;ヒスチジンはHisまたはH;グルタミンはGlnまたはQ;アスパラギンはAsnまたはN;リジンはLysまたはK;アスパラギン酸はAspまたはD;グルタミン酸はGluまたはE;システインはCysまたはC;トリプトファンはTrpまたはW;アルギニンはArgまたはR;そしてグリシンはGlyまたはGである。アミノ酸のより詳細な説明については、Proteins:Structure and Molecular Properties by Creighton,T.E.,W.H.Freeman & Co.,New York 1983を参照されたい。
哺乳類またはマイコバクテリアの脂質は、ヒトのCD1a、CD1b、CD1c、およびCD1dによって提示されることが知られている。海綿アゲラス・マウリチアヌス(Agelas mauritianus)に見られる脂質であるα−ガラクトシルセラミドは、最も広範に研究されている、CD1dに対するリガンドである。α−GalCerによりマウス脾臓細胞をインビボで刺激したところ、NKTの増殖、および、それぞれTH1型およびTH2型の応答であるIFN−γおよびIL−4の産生がもたらされたことが示されている。マウスの研究によって、細胞は、α−GalCerを担持する未成熟樹状細胞(iDC)によって迅速に活性化させることができること、および活性化iNKTは、次にDCの完全な成熟を誘発することができることが示されている。
一つの態様において、本開示は、CD1分子上の結合溝によって結合してCD1類似体複合体を形成することができるα−GalCer類似体の一連の新規の脂質部位を提供する。これらのCD1−類似体複合体は、T細胞受容体認識という手段によって、CD1拘束性T細胞(NKT)に対して提示され、TCRを活性化させること、TH1サイトカインおよびTH2サイトカインを放出させること、およびNKTを増殖させることができる。一つの典型的な実施態様において、本開示に係るα−GalCer類似体は、CD1分子上の結合溝によって強い結合アフィニティーをもつように設計されており、TH1偏向免疫原応答と相関する。別の典型的な実施態様において、本開示に係るα−GalCer類似体は、CD1分子上の結合溝によって強い結合アフィニティーをもつよう設計されており、TH2偏向免疫原応答と相関する。
本開示の別の態様において、α−GalCer類似体を免疫療法薬として使用することができる。一つの典型的な実施態様において、α−GalCer類似体を癌免疫療法に使用することができる。一つの典型的な実施態様において、α−GalCer類似体をアジュバント免疫療法に使用することができる。別の典型的な実施態様において、α−GalCer類似体を、ワクチン接種などの抗微生物免疫療法に使用することができる。さらに別の典型的な実施態様において、α−GalCer類似体を、自己免疫疾患を治療するための免疫抑制に使用することができる。
本開示に係るα−GalCer類似体によるT細胞受容体の認識および活性化、ならびにその結果得られる免疫応答
図1Aは、CD1dによって提示された糖脂質抗原をインバリアントNTKが認識して、一連の事象をもたらす仕組みを示す概略図である。糖脂質抗原の脂質部分は、CD1分子の疎水性の結合溝に挿入されて、CD1−抗原複合体を形成するが、これが、NKT上でT細胞受容体(TCR)と接触することができ、その結果、サイトカイン、ケモカイン、および共刺激分子が関与する一連の事象が生じる。サイトカイン産生の多様性および範囲は、細胞性免疫の促進(TH1型応答)から細胞性免疫の抑制(TH2型応答)まで、広範な影響を与える可能性がある。図1Bは、CD1dによって提示されたα−GalCerまたは本開示に係るα−GalCer類似体を、NKT細胞が認識して、迅速なTH1サイトカイン応答とTH2サイトカイン応答を促進させる仕組みを示す概略図である。一つの典型的な実施態様において、TH1サイトカイン応答が開始される。別の典型的な実施態様において、TH2サイトカイン応答が開始される。さらに別の典型的な実施態様において、TH1およびTH2の両方のサイトカイン応答が開始される。
図1Aは、CD1dによって提示された糖脂質抗原をインバリアントNTKが認識して、一連の事象をもたらす仕組みを示す概略図である。糖脂質抗原の脂質部分は、CD1分子の疎水性の結合溝に挿入されて、CD1−抗原複合体を形成するが、これが、NKT上でT細胞受容体(TCR)と接触することができ、その結果、サイトカイン、ケモカイン、および共刺激分子が関与する一連の事象が生じる。サイトカイン産生の多様性および範囲は、細胞性免疫の促進(TH1型応答)から細胞性免疫の抑制(TH2型応答)まで、広範な影響を与える可能性がある。図1Bは、CD1dによって提示されたα−GalCerまたは本開示に係るα−GalCer類似体を、NKT細胞が認識して、迅速なTH1サイトカイン応答とTH2サイトカイン応答を促進させる仕組みを示す概略図である。一つの典型的な実施態様において、TH1サイトカイン応答が開始される。別の典型的な実施態様において、TH2サイトカイン応答が開始される。さらに別の典型的な実施態様において、TH1およびTH2の両方のサイトカイン応答が開始される。
α−GalCer、および本開示に係る合成α−GalCer類似体の化学構造を図2に示す。本開示に係るα−GalCer類似体には、細菌由来のα−GalCer類似体(第I群:C2、C3、およびC14)、スルホン化によって修飾されたα−GalCer類似体(第II群:C4、C5、およびC9)、フェニル−アルキル鎖α−GalCer類似体(第III群:C6〜C8、C10〜C11、C15〜C16、C18〜C33、C8−5、およびC8−6)、フィトスフィンゴシン切断型α−GalCer類似体(第IV群:C12、C13、およびC17)などがある。図3は、スフィンゴ糖脂質α−GalCer類似体であるC12およびC13の合成例を示している。
一つの態様において、本開示に係る合成α−GalCer類似体は、CD1d分子と複合体を形成することができる。別の態様において、本開示に係る合成α−GalCer類似体には、NKTのT細胞受容体によって認識される能力をもつ。さらに別の態様において、本開示に係る合成α−GalCer類似体は、TH1型応答、TH2型応答、またはTH1型とTH2型の両応答を誘導することができる。一つの典型的な実施態様において、本開示に係るα−GalCer類似体は、インビトロにおいてNKTを活性化させることができる。別の典型的な実施態様において、本開示に係るα−GalCer類似体は、インビボにおいてNKTを活性化させることができる。
本開示に係る合成α−GalCer類似体のいずれか一つを被検対象に投与することを含む、組織、細胞、および/または被検対象においてサイトカイン産生を刺激または促進する方法であって、被検対象中のNKTが、該α−GalCer類似体に接触すると活性化され、サイトカイン応答が開始される方法が提供される。このサイトカインは、例えば、インターフェロン−γ(INF−γ)またはインターロイキン−4(IL−4)などであろう。
一つの典型的な実施態様において、本開示は、有効量の化合物または塩または混合物を投与して、組織、細胞、および/または被検対象におけるサイトカイン応答を活性化させる方法であって、該化合物が、C2〜C8、C8−5、C8−6、およびC9〜C33からなる群から選択され、該被検対象が、少なくとも一つのリンパ球および少なくとも一つの抗原提示細胞を含む細胞集団を含む適応免疫系を有し、該化合物と該抗原提示細胞の間に複合体を形成させて、この複合体形成の結果、リンパ球上の受容体が活性化し、そして、リンパ球を活性化させることによって、上記サイトカイン応答を生じさせる方法を提供する。
一つの典型的な実施態様において、マウス1.2ハイブリドーマ(CD1d反応性Vα14/T細胞ハイブリドーマ)をmCD1dで被覆した96穴プレート中で培養し、対照であるDMSO、α−GalCer(C1)、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体、100ng/mlでパルスした。図4に示した通り、培養後18時間目に、組織培養培地中へのIL−2放出を測定した。本開示に係るα−GalCer類似体のほとんどが、α−GalCerよりも高いIL−2産生を誘導した。ヒトナイーブNKT(CD161+CD3+)におけるインビトロでのサイトカイン/ケモカイン産生を誘導する能力について、本開示に係るα−GalCer類似体を試験したときにも、同様の結果になった。ヒトナイーブCD161+CD3+NKTを、自己未成熟樹状細胞(CD14+DC)とともに培養し、対照であるDMSO、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体、100ng/mlでパルスした。図5に示した通り、培養後18時間目に、組織培養培地中に放出されたサイトカインを測定した。これらのα−GalCer類似体は、TH1サイトカインおよびTH2サイトカインの分泌の強力なインデューサである。図5Aは、IFN−γおよびIL−4の誘導を示し、図5Bは、IL−2およびIL−6の誘導を示し、図5Cは、IL−12およびIL−10の誘導を示している。第III群および第IV群の芳香族化合物、特にC11、C16、およびC13は、α−GalCerよりも有意に多いIFN−γ分泌を誘導したが、すべてのα−GalCer類似体が、α−GalCerよりも有意に少ないIL−4を分泌した。図6は、ヒトCD161+CD3+NKTの純度(上図)、および、DMSO対照に対して標準化されたIFN−γ/IL−4比(下図)を示している。IFN/IL−4比で表されている場合、C9、C12、C13、C14、および第III群化合物のすべてが、よりTH1に偏向していたが、一方、C1、C3、C4、C5、C8、およびC17は、よりTH2に偏向していた。ヒトCD161+CD3+NKTからのサイトカインおよびケモカインの誘導結果が図7に一覧されている。各サイトカインにつき、上位5つの値を太字で示した。試験したα−GalCer類似体には、ケモカインにおいて、α−GalCerよりも強い誘導を示すものがあった。例えば、C13は、MIP−1α、MCP−1、およびIL−8などのケモカインで顕著な増加を誘導した。芳香族化合物であるC10、C11、およびC16は、顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、およびIL−15のより高い誘導を示した。
図8は、本開示に係るα−GalCer類似体が、初代ナイーブヒトiNKTにおいてサイトカイン/ケモカイン産生を誘導する能力についての、インビトロにおける、さらなる結果を示している。初代ナイーブヒトiNKTを自家性未成熟DCとともに培養し、対照であるDMSO、α−GalCer、または表示したα−GalCer類似体(C11およびC18〜C29)でパルスした。図8Aに示したように、試験した本開示に係るα−GalCer類似体はすべて、C1よりも高量のINF−γ分泌を誘導した。α−GalCer類似体は、ほぼ同等の量のIL−4を誘導した(図8B参照)。α−GalCer類似体は、C1より高いIFN−γ/IL−4比、すなわちTH1/TH2偏向を誘導した(図8C参照)。α−GalCer類似体であるC20、C24、およびC26は、α−GalCer類似体であるC11よりも、有意に強力なIFN−γ産生、より高いIFN−γ/IL−4比、およびより高量のIL−2分泌を誘導した(図8D)。α−GalCer類似体C20およびC24は、IL−12産生を誘導し、また、試験されたその他のα−GalCer類似体よりも多量のIL−6放出を誘導した(図8Eおよび8F参照)。図9は、α−GalCer類似体C11およびC18〜C29によるヒトiNKTの増殖を示している。α−GalCer類似体C20、C22〜C24、およびC26〜C27は、C1およびC11よりも有意に高いCD1d拘束性ヒトiNKT増殖を誘導した。
図10は、ナイーブヒトNKTと、さまざまなα−GalCer類似体でパルスされたヒトNKTとの間におけるIFN−γ分泌量の違いを示している。図10Aは、未成熟CD14+DCとともに培養され、対照であるDMSO、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体でパルスされたヒトナイーブiNKT(Vα24+)からのIFN−γ分泌を示している。図10B〜Dは、以下の3つの相異なるiNKT源における、α−GalCer類似体に応答したIFN−γ分泌を示している:(B)ヒトナイーブiNKT、(C)α−GalCer類似体でパルスされたiNKT、および(D)C11でパルスされたiNKT。これらのiNKTをHeLa−CD1d細胞とともに培養し、対照DMSO、α−GalCer、または表示されているα−GalCer類似体で18時間パルスした。図10Eは、ヒトのナイーブiNKT、α−GalCerでパルスされたiNKT、またはC11でパルスされたiNKTにおけるIFN−γの基礎濃度の違いを示している。
図11は、本開示に係るα−GalCer類似体に応答したインバリアント・ヒト・ナイーブNKTによるTH1/TH2サイトカイン産生を示している。ヒトVα24+iNKTを、対照DMSO、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体でパルスされた自家性未成熟CD14+DCとともに18時間培養した。図11Aは、IFN−γの誘導を示し、図Bは、IL−4の誘導を示し、また図Cは、DMSO対照に対して標準化された、IL−4に対するIFN−γの比を示している。ナイーブヒトVα24+iNKTからのサイトカインおよびケモカインの誘導結果が、図12に一覧されている。
α−GalCer類似体を用いたNKTの増殖および活性化
一つの態様において、本開示に係る合成α−GalCer類似体は、NKおよびiNKTを増殖および活性化させることができる。ヒト末梢血単核球中のiNKT数の減少が、悪性腫を患っている患者で記録されているため、本開示に係るα−GalCer類似体によって、このような患者のiNKTを増殖および活性化させることは治療的に有益であるかもしれない。典型的な実施態様において、本開示に係るα−GalCer類似体は、インビトロにおいて、ヒトiNKTを増殖させる能力がある。
一つの態様において、本開示に係る合成α−GalCer類似体は、NKおよびiNKTを増殖および活性化させることができる。ヒト末梢血単核球中のiNKT数の減少が、悪性腫を患っている患者で記録されているため、本開示に係るα−GalCer類似体によって、このような患者のiNKTを増殖および活性化させることは治療的に有益であるかもしれない。典型的な実施態様において、本開示に係るα−GalCer類似体は、インビトロにおいて、ヒトiNKTを増殖させる能力がある。
単離された培養増殖型NKT集団を作成する方法であって、Vα14iT細胞またはVα24iT細胞を、類似体特異的なT細胞の増殖が起きるまでの期間、樹状細胞または本開示に係るα−GalCer類似体と接触させること、および、このように得られた増殖T細胞を単離して、単離された培養増殖型NKT集団を作成することを含む方法が提供される。一つの典型的な実施態様において、単離された培養増殖型NKT集団を作成する方法は、さらに、樹状細胞、NKT細胞培養物にサイトカインもしくは増殖因子を添加する工程を含む。
ヒトCD56+細胞(NK/NKT細胞混合物)を自家性未成熟CD14+DCとともに培養し、DMSO、α−GalCer、またはさまざまな本開示に係るα−GalCer類似体でパルスした。曝露後9日目に、NKおよびNKTの増殖/生存、およびNKTの亜集団であるiNKT(CD161+/Vα24+/CD56+/CD3+)の増殖/生存をフローサイトメトリー法によって測定した。図13および14に示したように、C2、C8〜C12、およびC15〜C16で刺激すると、対照に対し有意なiNKT増加が注目された。試験されたα−GalCer類似体の中で、第III群の芳香族化合物のいくつか、特にC11、C15、およびC16は、C1よりも有効であった。
図15に示したように、ヒトCD56+細胞(NK/NKT混合物)を自家性未成熟CD14+DCとともに培養し、2日目に18時間、10ng/mlまたは100ng/mlのDMSO、α−GalCer、または本開示に係るさまざまなα−GalCer類似体でパルスした。9日目にNK/NKT混合物中のCD161+/Vα24 TCR+細胞の比率をフローサイトメトリーによってゲートした。図15Aは、100ng/mlに応答したVα24iNKTの比率を示している。図15Bは、さまざまな用量に応答したVα24iNKTの総数の変化倍率を示している。*、p<0.05、DMSOと比較して;#、p<0.05、C1と比較して。
α−GalCer類似体を用いた樹状細胞の成熟および伸長
最も効率的な抗原提示細胞(APC)は、成熟した免疫適格な樹状細胞(DC)である。DCは、未成熟な抗原捕捉細胞を成熟した抗原提示型のT細胞感作細胞に進化させ、抗原を免疫原に変え、サイトカイン、ケモカイン、共刺激分子、およびプロテアーゼなどの分子を発現させて免疫応答を開始させることができる。しかし、誘導されるT細胞媒介性免疫応答の種類(寛容対免疫、TH1対TH2)は、周囲の微環境から受け取る活性化シグナルのほかに、具体的なDC系譜および成熟段階に応じて変わる可能性がある。
最も効率的な抗原提示細胞(APC)は、成熟した免疫適格な樹状細胞(DC)である。DCは、未成熟な抗原捕捉細胞を成熟した抗原提示型のT細胞感作細胞に進化させ、抗原を免疫原に変え、サイトカイン、ケモカイン、共刺激分子、およびプロテアーゼなどの分子を発現させて免疫応答を開始させることができる。しかし、誘導されるT細胞媒介性免疫応答の種類(寛容対免疫、TH1対TH2)は、周囲の微環境から受け取る活性化シグナルのほかに、具体的なDC系譜および成熟段階に応じて変わる可能性がある。
DCが免疫を調節する能力は、DCの成熟化に依存している。その結果、DCの成熟化が、免疫応答の開始に重大な意味を持つ。DC内部への抗原の取り込みおよびプロセッシングの後、さまざまな因子が成熟化を誘導することができる。DCは、未成熟細胞から成熟細胞に変わる過程で、いくつかの表現型および機能の変化を経験する。DCの成熟過程には、一般的に、主要組織適合複合体(MHC)分子の細胞内区画からDC表面への再分布、抗原内在化の下方制御、共刺激分子の細胞表面発現の増加、形態変化(例えば、樹状突起の形成)、細胞骨格再構成、ケモカイン、サイトカインおよびプロテアーゼの分泌、ならびに接着分子およびケモカイン受容体の細胞表面発現が含まれる。
一つの態様において、本開示に係る合成α−GalCer類似体は、ヒトDCの成熟を促進することができる。樹状細胞の成熟によって、適応免疫応答の促進がもたらされうる。樹状細胞を成熟させる方法であって、未成熟樹状細胞を供給する工程、および該未成熟樹状細胞を、一定濃度の本開示に係るα−GalCer類似体とともに、該未成熟樹状細胞が成熟するまでの期間インキュベートする工程を含む方法が開示される。一つの典型的な実施態様において、これらの成熟樹状細胞は、次に、免疫療法薬、例えば、癌免疫療法薬およびアジュバント免疫療法薬などとして使用することができる。別の典型的な実施態様において、本開示に係るα−GalCer類似体は、未成熟樹状細胞または成熟樹状細胞と組み合わせて、免疫療法薬、例えば、癌免疫療法薬およびアジュバント免疫療法薬などとして使用することができる。
本開示に係るα−GalCer類似体は、マウス脾臓DCの成熟を促進することができる。インビトロでは、本開示に係るα−GalCer類似体は、樹状突起の伸長とともに、ヒトDC上のCD40、CD54、CD80、CD83、CD86、CD209、およびHLA−DR(MHCII分子)など、さまざまな細胞表面成熟化マーカーの発現量を直接的に増大させることができた。図16に示したように、C13は、CD40、CD80、CD83、CD86、およびHLA−DRの発現量の有意な増加を示し、ヒト単球由来DCの成熟を促進する。図17Aは、C13に応答したDCにおけるCD40、CD80、CD83、CD86、およびHLA−DRのヒストグラムを示している。図17Bは、C13とともに48時間インキュベートされたDCの形態を示している。
α−GalCer類似体を用いた、NKTのCD1d依存性TCR活性化
さらに別の態様において、本開示に係る合成α−GalCer類似体は、CD1d依存性のTCR活性化を誘導することができる。図18は、NKTにおけるTCRシグナル伝達経路をまとめた概略図を示している。iNKTは、T細胞受容体複合体を介して、抗原提示細胞(APC)表面上に、CD1dに関連して提示された糖脂質抗原を認識する。糖脂質抗原の結合によって、ERK1/2、p38、IκBα、CREB、STAT3、およびSTAT5のリン酸化など、iNKTにおける細胞質キナーゼが活性化される。これらのシグナル伝達カスケードによって、iNKTの増殖およびサイトカイン/ケモカインの産生がもたらされる。
さらに別の態様において、本開示に係る合成α−GalCer類似体は、CD1d依存性のTCR活性化を誘導することができる。図18は、NKTにおけるTCRシグナル伝達経路をまとめた概略図を示している。iNKTは、T細胞受容体複合体を介して、抗原提示細胞(APC)表面上に、CD1dに関連して提示された糖脂質抗原を認識する。糖脂質抗原の結合によって、ERK1/2、p38、IκBα、CREB、STAT3、およびSTAT5のリン酸化など、iNKTにおける細胞質キナーゼが活性化される。これらのシグナル伝達カスケードによって、iNKTの増殖およびサイトカイン/ケモカインの産生がもたらされる。
一つの典型的な実施態様において、本開示に係るα−GalCer類似体は、ナイーブなヒトNKTのCD1d依存性TCR活性化を誘導することができる。TCR活性化がCD1d依存性であるか否かを識別するために、ヒトCD1dを過剰発現しているHeLa−CD1dによって提示される、本開示に係るさまざまなα−GalCer類似体の効果、および対照であるHeLa細胞を測定した。また、さまざまなα−GalCer類似体をNKTに提示することについて、HeLa−CD1d(非プロフェッショナルAPC)の能力を、未成熟DC(プロフェッショナルAPC)と比較した。図19に示すように、C1、ならびにα−GalCer類似体であるC11、C13、およびC17は、リン酸化CD3εの細胞内値を、HeLa−CD1d細胞によって提示された場合には、それぞれ7.3倍、10倍、7.3倍、および5.9倍増加させ、DCによって提示された場合には、それぞれ10.8倍、21.3倍、17.3倍、および12倍増加させた。リン酸化ERK1/2については、C1、ならびにα−GalCer類似体であるC11、C13、およびC17が、HeLa−CD1d細胞では、それぞれ6.6倍、14.6倍、6.6倍、および3.3倍の増加を誘導し、DCでは、それぞれ30倍、48.3倍、35倍、および18.6倍の増加を誘導した。リン酸化CREBの誘導はさらに驚くべきもので、C1、ならびにα−GalCer類似体であるC11、C13、およびC17は、HeLa−CD1d細胞によって提示された場合には、それぞれ2倍、117倍、41倍、および20倍の発現を誘導し、DCによって提示された場合には、それぞれ68倍、204倍、158倍、および49倍の発現を誘導した。試験されたα−GalCer類似体はいずれも、B細胞受容体のシグナル伝達には関与するが、TCR経路には関与しないことが知られているタンパク質キナーゼであるSykのリン酸化には全く作用を及ぼさなかった。これらの知見は、本開示に係る芳香族のα−GalCer類似体が、強力なTCR活性化を、CD1dに依存する形で誘導したこと、および活性化の程度は、非プロフェッショナルAPCと比較して、プロフェッショナルAPCによって提示された場合に非常に増強されることを示唆している。本開示に係るα−GalCer類似体はいずれも、対照であるHeLa細胞と同時培養されたNKT細胞におけるCD3ε、ERK1/2、またはCREBのリン酸化に対して全く効果を示さなかった。全体的に見て、化合物C11およびC13の方が、化合物C1およびC17よりも、TCR活性化においては強力であると考えられるが、これらは、C11によって開始されるTH1に偏向したサイトカインプロファイルの誘導の方が、C1と比較するとより強いことと整合する。なぜなら、ERK1/2およびCREB活性化が、IL−12およびIFN−γなど、数多くのTH1サイトカインの誘導に関与することが報告されているからである。C13も、おそらく、DC上における共刺激分子の発現を促進させるユニークな能力の結果として、TCRの有意な活性化を開始させた。試験した4種類のα−GalCer類似体で、特にC13で、HeLa−CD1d細胞によって提示された場合よりも、DCによって提示された場合に、TCRがより強力に活性化された。C1によるよりも、α−GalCer類似体のC11による方が、より高度にリン酸化されたCD3ε、ERK1/2、およびCREBが誘導されたことは、糖脂質がCD1dに強く結合するほど、NKT上におけるTCRの促進をより強く誘導するという考えに合致している。
図20は、本開示に係るα−GalCer類似体が、どのようにして、CD1dに依存したTCR活性化を誘導することができるかの別の実施態様を示している。さまざまな本開示に係るα−GalCer類似体(具体的には、C16、C23、C26、C8−5、およびC8−6)は、ERK1/2、p38、IκBα、CREB、STAT3、およびSTAT5のリン酸化によって、ヒトiNKT(Vα24+T細胞)におけるTCRシグナル伝達経路を活性化させることができる。TCR活性化がCD1d依存性であるか否かを識別するために、ヒトCD1dを過剰発現しているHeLa−CD1dによって提示される、本開示に係るさまざまなα−GalCer類似体の効果、および対照であるHeLa細胞を測定した。図20Aは、92%のナイーブVα24+/CD3+T細胞を含んだフローサイトメトリーによって、単離されたVα24+T細胞の測定結果を示している。C1、ならびにα−GalCer類似体、具体的には、C16、C23、C26、C8−5、およびC8−6は、(B)リン酸化CD3ε(ホスホチロシン)、(C)リン酸化CREB(Ser133)、(D)リン酸化ERK1/2(Thr185/Thr187)、(E)リン酸化p38(Thr180/Thr182)、(F)リン酸化IκBα(Ser32)、(G)リン酸化Lck、(H)リン酸化Lat、(I)リン酸化STAT3(Ser727)、(J)リン酸化STAT5A/B(Tyr694/699)、(K)リン酸化Syk(ホスホチロシン)、および(L)リン酸化Zap−70(ホスホチロシン)の細胞内の値を増大させた。*、p<0.05、DMSOと比較した場合;#、p<0.05、C1と比較した場合。
また、本開示に係るα−GalCer類似体は、インビトロにおいて、CD1d拘束性マウスNKT/Tに対してより高い結合アフィニティーを示し(図21)、インビボにおいて、2つのサブセットNKTおよびNKのCD1d依存的な活性化も示す(図22)。図21に示されているように、表示されているα−GalCer類似体(C1、7DW8−5、C26、C8、C17)または賦形剤を、0.1μg/マウスにて静脈内(IV)注射した72時間後に、BALB/cマウスから脾臓を採取した。一定の割合のマウスNKT細胞(図21A)またはマウスT細胞(図21B)を、α−GalCerを負荷されたmCD1dテトラマー(μgあたり10モル)で染色した。図21Cは、CD1d拘束性NKTおよびT細胞に対する、α−GalCerおよびフェノールα−GalCer類似体7DW8−5の異なる結合アフィニティを示している。図22は、2つのNKTサブセットのCD1依存的な増殖を示している。DMSO対照、α−GalCer、または表示されているα−GalCer類似体であるC8、C16、C22、C23、C26、7DW8−5、および7DW8−6をIV注射した72時間後に、BALB/c野生型(WT)マウスまたはCD1ノックアウト(KO)マウスから脾臓を採取した。表示されているα−GalCer類似体に応答した(B)野生型マウスまたは(C)CD1ノックアウトマウスにおけるNKTの総数、ならびにNKT1(CD3+/NK+/CD49+/CD69)およびNKT2(CD3−/NK+/CD49/CD69+)と名付けられたNKTの2つのサブタイプをFACSによって測定した。図Dは、NKのCD1d−依存型活性化を示している。表示してあるα−GalCer類似体に応答したWTマウスまたはCD1KOマウスにおける活性型NK(CD3+/NK+/CD69+)の総数の増大を、FACSによって測定した。*、p<0.05、DMSOと比較した場合、;#、p<0.05、C1と比較した場合。
α−GalCer類似体を用いた、インビボにおけるT H 細胞の活性化、脾細胞の増殖/活性化、およびNKTのCD1d依存性TCR活性化
さらに別の態様において、本開示に係るα−GalCer類似体は、インビボにおいてTH細胞を活性化することができる。サイトカイン分泌への投与経路の影響を評価するために、α−GalCerおよび7つの本開示に係るα−GalCer類似体を、静脈内(IV)経路、皮下(SubQ)経路、および筋肉内(IM)経路にいずれかによってBALB/cマウスに注射し、サイトカイン産生への影響を測定した。図23A、図27A、および図29Aは、さまざまなα−GalCer類似体を異なった経路で注射した72時間後のIFN−γの血清中濃度を示している。一般的に、サイトカイン産生の増加は早ければ2時間で検出可能となり、18時間でピークに達し、48時間かけて徐々にベースライン値まで低下した。IV経路によって導入された場合(図23A)、α−GalCer類似体C9およびα−GalCer類似体C16が、C1の活性レベルに近い活性レベルを示し、α−GalCer類似体C13、C11、C2、C14、およびC3が、それらに続いた。特筆すべきは、同じα−GalCer類似体のSubQ投与によって誘導されたIFN−γのレベル(図27A)は、IV経路でのレベルよりもずっと低く、一方、IM経路でのレベル(図29A)は中程度であったことである。C1は、IV投与された場合には、最も高量のIFN−γを誘導したが、SubQ経路およびIM経路によって投与された場合には、α−GalCer類似体C9の方がC1を上回った。図23B、図27B、および図29Bは、さまざまな経路によってα−GalCer類似体を注射した後のIL−4のレベルを示している。試験されたα−GalCer類似体のすべて、およびα−GalCerは、SubQ経路で導入された場合には、IL−4をほとんど誘導しなかったが、IM投与された場合には、中程度の量のIL−4が全てのα−GalCer類似体によって誘導された。これらのデータを、TH1/TH2偏向を反映させるためにIFN−γ/IL−4比として表すと(図23C、図27C、および図29C)、芳香族α−GalCer類似体であるC11、C13、C16、および細菌由来のC14が、図23C、図27Cおよび図29Cに示すように、IV経路では、2時間でC1よりも低いTH2応答を誘導し、18〜72時間の間は、すべてのα−GalCer類似体が、TH1に偏向した応答を誘導した。さらに、SubQ経路で投与されると、α−GalCer類似体C2およびC3以外のすべての試験された本開示に係るα−GalCer類似体は、2〜72時間の全期間で、C1よりも高いTH1/TH2比を示した。一方、IM注射によって投与されると、本開示に係るα−GalCer類似体は、C14以外はすべて、2時間でTH2に偏向した応答を示し、18〜72時間の間は、再びTH1に偏向した応答に変わった。後者は、2時間目には、より強いTH1に偏向した応答を示し、2〜72時間の間ずっとTH1偏向を維持した。別の図では、図24が、表示されているα−GalCer類似体をIV投与した2時間後および18時間後の分泌された(A)IFN−γ、(B)IL−4のマウス血清中濃度、および(C)IFN−γ/IL−4の比を示している。
さらに別の態様において、本開示に係るα−GalCer類似体は、インビボにおいてTH細胞を活性化することができる。サイトカイン分泌への投与経路の影響を評価するために、α−GalCerおよび7つの本開示に係るα−GalCer類似体を、静脈内(IV)経路、皮下(SubQ)経路、および筋肉内(IM)経路にいずれかによってBALB/cマウスに注射し、サイトカイン産生への影響を測定した。図23A、図27A、および図29Aは、さまざまなα−GalCer類似体を異なった経路で注射した72時間後のIFN−γの血清中濃度を示している。一般的に、サイトカイン産生の増加は早ければ2時間で検出可能となり、18時間でピークに達し、48時間かけて徐々にベースライン値まで低下した。IV経路によって導入された場合(図23A)、α−GalCer類似体C9およびα−GalCer類似体C16が、C1の活性レベルに近い活性レベルを示し、α−GalCer類似体C13、C11、C2、C14、およびC3が、それらに続いた。特筆すべきは、同じα−GalCer類似体のSubQ投与によって誘導されたIFN−γのレベル(図27A)は、IV経路でのレベルよりもずっと低く、一方、IM経路でのレベル(図29A)は中程度であったことである。C1は、IV投与された場合には、最も高量のIFN−γを誘導したが、SubQ経路およびIM経路によって投与された場合には、α−GalCer類似体C9の方がC1を上回った。図23B、図27B、および図29Bは、さまざまな経路によってα−GalCer類似体を注射した後のIL−4のレベルを示している。試験されたα−GalCer類似体のすべて、およびα−GalCerは、SubQ経路で導入された場合には、IL−4をほとんど誘導しなかったが、IM投与された場合には、中程度の量のIL−4が全てのα−GalCer類似体によって誘導された。これらのデータを、TH1/TH2偏向を反映させるためにIFN−γ/IL−4比として表すと(図23C、図27C、および図29C)、芳香族α−GalCer類似体であるC11、C13、C16、および細菌由来のC14が、図23C、図27Cおよび図29Cに示すように、IV経路では、2時間でC1よりも低いTH2応答を誘導し、18〜72時間の間は、すべてのα−GalCer類似体が、TH1に偏向した応答を誘導した。さらに、SubQ経路で投与されると、α−GalCer類似体C2およびC3以外のすべての試験された本開示に係るα−GalCer類似体は、2〜72時間の全期間で、C1よりも高いTH1/TH2比を示した。一方、IM注射によって投与されると、本開示に係るα−GalCer類似体は、C14以外はすべて、2時間でTH2に偏向した応答を示し、18〜72時間の間は、再びTH1に偏向した応答に変わった。後者は、2時間目には、より強いTH1に偏向した応答を示し、2〜72時間の間ずっとTH1偏向を維持した。別の図では、図24が、表示されているα−GalCer類似体をIV投与した2時間後および18時間後の分泌された(A)IFN−γ、(B)IL−4のマウス血清中濃度、および(C)IFN−γ/IL−4の比を示している。
IFN−γおよびIL−4と同様に、その他のサイトカインおよびケモカインも、これら新規のα−GalCer類似体に応答して、血清中で顕著に増加した。これらは、IL−2、IL−6、KC、IL−10、IL−12、IL−13、GM−CSF、TNFα、RANTES、MCP−1、およびMIP−1などであり、図25の表に列挙されている。IV投与では、これら新規のα−GalCer類似体は、C1よりも強いTH1に偏向したサイトカイン応答およびケモカイン応答を誘導する。例えば、芳香族α−GalCer類似体であるC11、C13、およびC16は、IL−2、IL−12、MIP−1β、およびMCP−1の顕著な増加を誘導し、C14は、さらに強いIL−3、GM−CSFおよびIL−12の誘導を示した。
α−GalCerまたは表示されている本開示に係るα−GalCer類似体を注射されたBALB/cマウスの脾臓における免疫細胞集団を測定するために、BALB/cマウスに注射し、注射の72時間後に検査した。図26に示されているように、IV投与後、試験されたα−GalCer類似体はすべて、(A)C1よりも高い効力を示すC9、C13、およびC16によって、脾細胞、(B)DC、(C)NK、(D)NKT、(E)B細胞、(F)CD8+T細胞、(G)CD4+T細胞、および(H)活性CD8+/CD4+比の顕著な増大を誘導した。図28に示されているように、SubQ投与後、試験されたα−GalCer類似体はいずれも、C1の効果と比較して、(A)脾細胞の増殖に対して顕著な効果を示さなかった。図30に示されているように、IM投与後、試験されたα−GalCer類似体はすべて、C1より大きい効果を示すC9、C13、およびC14によって、(A)脾細胞の増殖を誘導した。芳香族α−GalCer類似体C12、C13、およびC16は、C1よりも、総DCおよび成熟DCの顕著な増加を誘導した(図26B、図28B、および図30B)。α−GalCer類似体C9、C12、C13、およびC16は、NKおよびNKTを増殖/活性化させる最高の能力を示した(図26C〜D、図28C〜D、および図30C〜D)。α−GalCer類似体C16が、B細胞増殖に最も効果が高く、α−GalCer類似体C2、C9、C10、およびC11も、C1よりは活性が高かった(図26E、図28E、および図30E)。CD8+T細胞では、α−GalCer類似体C14が、細胞の増殖/活性化に最も有効であったが、ただし、α−GalCer類似体C9、C11、C16、C12、およびC13も、C1よりは活性が高かった(図26F、図28F、および図30F)。α−GalCer類似体C9は、CD4+T細胞の増殖/活性化において、C1よりも効果が高かった(図26G、図28Gおよび図30G)。T細胞亜集団の中では、試験されたα−GalCer類似体のすべてが、CD8+/CD4+比の増大を誘導したが、α−GalCer類似体C11、C13、C14、およびC16は、C1よりも強力であった(図26H、図28H、および図30H)。SubQ経路によってα−GalCer類似体で処理されたマウスにおいては、α−GalCer類似体C9が、C1よりも有意に高い総DCおよび成熟DCの増殖を誘導したが、これ以外のα−GalCer類似体は、C1と同等であった(図28B)。NKおよびNKTの増殖/活性化では、α−GalCer類似体C9、C11、C13、C14、およびC16が、C1と同等の活性を示したが、これら以外のα−GalCer類似体は、活性がより低いように思われた(図28C〜D)。B細胞の増殖/活性化では、α−GalCer類似体C1、C9、C11、およびC13が顕著な活性を示した(図28E)。CD8+T細胞については、α−GalCer類似体C9、C11、C13、C14、およびC16が、C1よりも高い活性を示し、残りのα−GalCer類似体は、C1と同等の活性であると見られた(図28F)。CD4+T細胞では、C1が最も有効であったが、ただし、α−GalCer類似体C9、C11、C13、C14、およびC16も、対照よりも活性が高かった(図28G)。T細胞では、試験されたα−GalCer類似体の大部分が、C1よりも高いCD8+/CD4+比の増大を誘導した(図28H)。α−GalCer類似体は、IM経路を介して導入されると、すべてが、DC、NK、NKT、B細胞、およびCD8+/CD4+比の有意な増加を誘導した。新規のα−GalCer類似体の大多数は、C1よりも大きなDC増殖を誘導した(図30B)。α−GalCer類似体C9およびC14は、C1よりも強力なNK細胞誘導を示した(図30C)が、NKT細胞には同等もしくはより低い効果を示した(図30D)。α−GalCer類似体C2、C11、C12、およびC16は、C1よりも強力なB細胞の活性化を示した(図30E)。CD8+T細胞では、α−GalCer類似体C9およびC16が、細胞の増殖/活性化について、C1と同等の活性を示したが、これら以外のα−GalCer類似体も、対照と比べて有意な増加を誘導した(図30F)。CD4+T細胞では、α−GalCer類似体C2およびC9が、細胞の増殖/活性化について、C1と同等の活性を示したが、これら以外のα−GalCer類似体も、対照と比べて有意な増加を誘導した(図30G)。α−GalCer類似体C9、C11、およびC16は、CD8+/CD4+比を増大させるのに、C1と同様の活性を示した(図30H)。
図31は、サイトカインの動態および脾細胞の増殖/活性化に対する、α−GalCer類似体の投与経路の効果の別の典型的な実施態様を示している。図31A〜Cは、異なった経路で投与されたDMSO賦形剤、α−GalCer、またはα−GalCer類似体C16に応答したサイトカインの動態を示している。BALB/cマウスに、IV、SubQ、またはIMで、賦形剤、C1、またはC16(マウス1匹あたり2μg)を注射した。血清試料を0、2、18、36、48、72時間目に採集し、サイトカイン:(A)IFN−γ、(B)IL−4、および(C)IL−4に対するIFN−γの比率について、DMSO賦形剤に対して標準化して解析した。図31D〜Kは、異なった経路で投与された賦形剤、C1、およびC16に応答した脾細胞の増殖/活性化を示している。C1、C16(マウス1匹あたり2μg)、または賦形剤をIV注射、SubQ注射、またはIM注射した72時間後に、BALB/cマウスから脾臓を採取した。図Dは、有核細胞の総数を示し、図E〜Gは、成熟樹状細胞(CD11C+/CD80+/CD86+)、活性化NK(U5A2−13Ag+/CD3−/CD69+)、活性NKT(U5A2−13Ag+/CD3+/CD69+)など自然免疫細胞集団を示し、図H〜Jは、活性化B細胞(CD45R+/CD23+/CD69+)、活性化CD8 T細胞(CD3+/CD4−/CD8+/CD69+)、および活性化CD4 T細胞(CD3+/CD4+/CD8−/CD69+)などの適応免疫細胞を示し、図Kは、DMSOに対して標準化されたCD8/CD4の比を示している。**、p<0.05、C1と比較した場合。
別の典型的な実施態様において、本開示に係るα−GalCer類似体をさまざまな用量でマウスに投与して、脾細胞の増殖/活性化について、用量反応が顕著であるか否かを判定した。図32A〜Hに示されているように、賦形剤またはα−GalCer類似体C11(マウス1匹あたり2μgまたは0.1μg)をIV注射した72時間後に、BALB/cマウスから脾臓を採取した。図Aは、有核細胞の総数を示し、図B〜Hは、成熟DC(CD11C+/CD80+/CD86+)、活性化NK(U5A2−13Ag+/CD3−/CD69+)、活性化NKT(U5A2−13Ag+/CD3+/CD69+)、単球(CD11b+Gr1−)、顆粒球(CD11b−Gr1+)を含む自然免疫細胞集団を示し;図F〜Hは、活性化CD4 T細胞(CD3+/CD4+/CD8―/CD69+)、活性化CD8 T細胞(CD3+/CD4―/CD8+/CD69+)、および活性化B細胞(CD45R+/CD23+/CD69+)を含む適応免疫細胞を示している。*、p<0.05、DMSOと比較した場合;#、p<0.05、C11と比較した場合(マウス1匹あたり2μg)。
さらに別の典型的な実施態様において、本開示に係るα−GalCer類似体によって誘導されたTH1サイトカイン/TH2サイトカインの動態を評価した(図33)。BALB/cマウスに、賦形剤、C1、または表示されているα−GalCer類似体を、IV注射した(マウス1匹あたり0.1μg)。血清試料を0、2、12、24、48、および72時間後に採集して、(A)IFN−γ、(B)IL−4の分泌、および(C)IL−4に対するIFN−γの比について、DMSO対照(D)に対して標準化して評価した。2時間および18時間後に採集された血清試料を示す図34の表からわかるように、これら強力な本開示に係るα−GalCer類似体はサイトカイン/ケモカインを誘導した。本開示に係るα−GalCer類似体を(マウス1匹あたり0.1μg)、野生型(WT)およびCD1dノックアウト(CD1KO)のBALB/cマウスにIV投与した。図35参照。血清試料を2時間および18時間後に採集して、(A)IFN−γ、(B)IL−4、(C)IFN−γ/IL−4比、(D)IL−10、(E)IL−12p70、(F)KC、および(G)MCP−1などのサイトカイン/ケモカインについて解析した。*、p<0.05、DMSOと比較した場合。これらの結果は、本開示に係るα−GalCer類似体が、マウスにおいてCD1依存性のサイトカイン/ケモカイン分泌を誘導することを示している。
図36は、本開示に係るさまざまなα−GalCer類似体を注射した後の脾細胞の増殖/活性化および2つのNKTサブセットのCD1d依存的活性化の別の典型的な実施態様を示している。図A〜Fは、試験されたα−GalCer類似体に応答した脾細胞の増殖/活性化を示している。賦形剤、α−GalCer、または表示されているα−GalCer類似体(マウス1匹あたり0.1μg)をIV注射した72時間後、C57BL/6マウスから脾臓を採取した。図Aは有核細胞の総数を示し、図B〜Fは、成熟樹状細胞(CD11C+/CD80+/CD86+)、活性化NK(NK11+/CD3−/CD69+)、活性化CD4 T細胞(CD3+/CD4+/CD8−/CD69+)、活性化CD8 T細胞(CD3+/CD4−/CD8+/CD69+)、およびCD8/CD4の比を、DMSOに対して標準化して示している。*、p<0.05、DMSOと比較した場合。図G−Hは、2つのNKTサブセットのCD1依存的増殖を示している。マウス1匹あたり0.1μgの賦形剤、C1、7DW8−5、C22、C23、C26、C30、およびC17をIV注射した72時間後、C57BL/6野生型(Wt)マウスまたはCD1ノックアウト(CD1KO)マウスから脾臓を採取した。図Gは、フローサイトメトリーによるマウスNKTの測定を示している(左下図)。WtにおけるNKT(右上図)、およびその2つの亜型であるNKT1(CD3+/NK1.1+/CD49+/CD69−)(右上図)、およびNKT2(CD3+/NK1.1+/CD49−/CD69+)(右下図)の総数の増加が、FACSにより観察された。図Hは、CD1KOマウスにおけるNKTの総数を示し、図Iは、α−GalCer類似体に応答したWtC57BL/6マウスにおけるTreg細胞(CD4+/CD25+/FoxP3+)の総数を示している。*、p<0.05、DMSOと比較した場合;#、p<0.05、C1と比較した場合。
免疫療法
免疫系は、病原菌を排除することによってわれわれの身体が乗っ取られるのを効果的に妨げている。有効な免疫系がなければ、人々は、細菌、ウイルス、原生生物、寄生虫、および真菌に由来するあらゆる種類の感染症を容易に発症する。また、人々は癌を発症する可能性も高くなる。NKTは、免疫系において調節機能を果たしているため、免疫療法にとって格好の標的である。NKTの活性化は、逆説的に、免疫応答の抑制または促進をもたらすことができる。例えば、TH1サイトカインの産生は、抗腫瘍活性、抗ウイルス/抗細菌活性、およびアジュバント活性と相関すると考えられているが、TH2サイトカイン産生は、自己免疫疾患を抑えると考えられている。
免疫系は、病原菌を排除することによってわれわれの身体が乗っ取られるのを効果的に妨げている。有効な免疫系がなければ、人々は、細菌、ウイルス、原生生物、寄生虫、および真菌に由来するあらゆる種類の感染症を容易に発症する。また、人々は癌を発症する可能性も高くなる。NKTは、免疫系において調節機能を果たしているため、免疫療法にとって格好の標的である。NKTの活性化は、逆説的に、免疫応答の抑制または促進をもたらすことができる。例えば、TH1サイトカインの産生は、抗腫瘍活性、抗ウイルス/抗細菌活性、およびアジュバント活性と相関すると考えられているが、TH2サイトカイン産生は、自己免疫疾患を抑えると考えられている。
坑腫瘍免疫療法
現在では、免疫系と癌の間には強い関連性が見られ、免疫系を適切に刺激することによって、数多くの癌に影響を及ぼす可能性があると理解されている。α−GalCerでマウスを処理すると、肝臓、肺およびリンパ節への腫瘍転移を抑えることが明らかになっている。α−GalCerまたはα−GalCer負荷iDCを注射された進行癌患者での2つの第I相臨床試験において、検出可能な数のVα24+Vβ11+NKTを治療前から持っていた患者において免疫系の明らかな活性化が観察された。持続的な腫瘍退縮は見られなかったが、毒性のない安定した病状が何人かの患者で観察され、血清腫瘍マーカーまたは腫瘍サイズの一時的な減少を示す患者さえもいた。数回の臨床試験におけるα−GalCerの顕著な抗癌活性の欠如は、IFN−γの効果がIL−4(TH2サイトカイン)によって相殺され、その結果、最終的な有益性が生じないせいかもしれない。
現在では、免疫系と癌の間には強い関連性が見られ、免疫系を適切に刺激することによって、数多くの癌に影響を及ぼす可能性があると理解されている。α−GalCerでマウスを処理すると、肝臓、肺およびリンパ節への腫瘍転移を抑えることが明らかになっている。α−GalCerまたはα−GalCer負荷iDCを注射された進行癌患者での2つの第I相臨床試験において、検出可能な数のVα24+Vβ11+NKTを治療前から持っていた患者において免疫系の明らかな活性化が観察された。持続的な腫瘍退縮は見られなかったが、毒性のない安定した病状が何人かの患者で観察され、血清腫瘍マーカーまたは腫瘍サイズの一時的な減少を示す患者さえもいた。数回の臨床試験におけるα−GalCerの顕著な抗癌活性の欠如は、IFN−γの効果がIL−4(TH2サイトカイン)によって相殺され、その結果、最終的な有益性が生じないせいかもしれない。
一つの態様において、本開示に係る合成α−GalCer類似体には、抗腫瘍免疫療法の活性薬剤としての用途がある。TH1に偏向するよう、本開示に係るα−GalCer類似体を設計することができる。これらのTH1偏向α−GalCer類似体は、TH1サイトカイン応答を誘導して、癌に苦しむ動物の生存期間を増加させたり、癌に苦しむ動物の腫瘍増殖を遅らせたり、T細胞、CD8T細胞、NK細胞、およびNKT細胞など腫瘍浸潤性リンパ球を増加させたりすることができる。
一つの典型的な実施態様において、本開示に係るα−GalCer類似体は、抗腫瘍療法において治療薬として作用する。これらのα−GalCer類似体を癌ワクチンとして投与することができる。別の典型的な実施態様において、本開示に係るα−GalCer類似体を併用免疫療法で使用することができるが、その場合、α−GalCer類似体を既存の癌ワクチンと併用する。本開示に係るα−GalCer類似体のいずれかで治療される被検対象は、癌に苦しんでいたり、癌リスクが増大していたり、または前癌性前駆体を有していたりする。
いくつかの典型的な実施態様において、本開示は、C3、C10〜C17、C19〜C28、C30、およびC8−5からなる群から選択される化合物、またはその塩もしくは混合物の有効量を被検対象に投与することを含む抗腫瘍免疫療法を提供する。
本開示に係るα−GalCer類似体の抗癌効果を判定するために、一つの典型的な実施態様では、同系免疫応答性マウス(それぞれC57BL/6およびBALB/c)において、TC1細胞株による転移性肺癌のマウスモデル、および4T1細胞株による乳癌の皮下腫瘍モデルを研究した。図38Aは、α−GalCer類似体C11で処理されたマウスの肺表面上の腫瘍小結節数の減少による代表的な実験結果を示している。TC1腫瘍担持マウスの生存率に対する、第I〜IV群からのさまざまな本開示に係るα−GalCer類似体のIV投与の効果が図37に示されている。C4、C6、C7、C8、およびC17以外の多くの試験されたα−GalCer類似体で、生存期間の顕著な延長および体重減少の低下が観察された。さらに、8種類の試験されたα−GalCer類似体、C3、C10、C11、C12、C13、C14、C15、およびC16には、C1よりも有意に高い抗癌効果がある。次に、4T1乳癌を担持するマウスに対する、IV投与された8種類のα−GalCer類似体およびC1の抗腫瘍効果を評価した。α−GalCer類似体C11によって処理した16日後にマウスの腫瘍サイズが減少したことが、図38Bに一例として示されている。試験されたα−GalCer類似体はすべて、対照と比較すると、腫瘍増殖を抑え、かつ生存期間を延長させることができ、すべてが、C1よりも効果的であった。図39A。これらの知見に基づき、最も活性が高い、本開示に係るα−GalCer類似体のいくつか(C9、C11、C13、C14、C16)およびC1のSubQ送達の効果を試験した。試験されたα−GalCer類似体のSubQ送達によって、対照と比較すると、腫瘍増殖を抑え、かつ生存期間を延長することができた。α−GalCer類似体であるC13、C14、およびC16Cは、C1よりも有意に腫瘍サイズを抑えた。ただし、生存期間に対するそれらの効果には、C1の効果と有意な違いがなかった(図39B)。C1は、IV経路よりもSubQ送達で統計的に優れた効能を示したが(図40)、投与経路は、試験された残余のα−GalCer類似体の抗腫瘍効果に顕著な影響を及ぼさなかった(図39A〜B)。α−GalCer類似体のSubQ注射を受けたマウスは、IV処理されたマウスよりも病的状態の程度が低いように見えたが、SubQ投与後のサイトカイン/ケモカインの血清中濃度の低下と矛盾しない。
これら新規のα−GalCer類似体の治療プロトコルを最適化するために、本発明者らは、経路、頻度、および投与量に特に重点を置いて、担腫瘍マウスにおける抗腫瘍効果を評価した(図41〜44参照)。その結果、最適な投与スケジュールは、週1回、マウス1匹あたり0.1μgのα−GalCerをIV投与することであることが示された。これは、黒色腫のみならず、乳癌および肺癌を担持するマウスの治療にも適用可能である(図43および図44参照)。新規のα−GalCer類似体で処理すると、T、CD8T、NK、およびNKTなど腫瘍浸潤性リンパ球が増加した(図45参照)。図41A〜Bは、異なった投与経路の影響を示している。(図A)BALB/cマウスにマウス乳癌細胞4T−1をSubQ接種した。腫瘍接種した3日後、マウスを、4週間にわたって週2回、賦形剤、α−GalCer、または表示されているα−GalCer類似体(マウス1匹あたり2μg)で処理した。3日おきに33日間、腫瘍容積を記録し、70日間まで生存しているかを観察した。左図:乳癌担持マウスのカプラン・マイヤー生存率曲線;右図:腫瘍増殖曲線。(図B)C57BL/6マウスにマウス肺癌細胞TC−1をIV接種して、4週間にわたり週2回、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体(マウス1匹あたり2μg)で(IVまたはSubQ)処理した。左図:肺癌担持マウスのカプラン・マイヤー生存率曲線;右図:体重の変化。
図Cは、投与頻度の影響を示している。C57BL/6マウスにマウス肺癌細胞TC−1をIV接種して、4週間にわたり週2回または週1回、賦形剤、α−GalCer、または表示されているα−GalCer類似体(マウス1匹あたり2μg)で(IVまたはSubQ)処理した。左図:肺癌担持マウスのカプラン・マイヤー生存率曲線;右図:体重の変化。
図43および図44は、最適化されたプロトコルによる、本開示に係るα−GalCer類似体の抗癌効果の評価を示している。図43は、肺癌細胞(TC1)をIV接種、または黒色腫細胞(B16)をSubQ接種され、その後、4週間にわたり週1回、賦形剤、α−GalCer、または表示されている本開示に係るα−GalCer類似体(C23、C26、C30、7DW8−5)(マウス1匹あたり0.1μg)でIV処理されたC57BL/6マウスを示す。図Aは、TC1担持マウスのカプラン・マイヤー生存率曲線を示し、図Bは、B16腫瘍の増殖曲線を示す。試験されたα−GalCer類似体はすべて、TC−1担持マウスの生存期間を有意に延長させた。また、B16担持マウスを本開示に係るα−GalCer類似体で処理したときには、腫瘍の顕著な縮小が見られた。図44A〜Bは、マウスにおける腫瘍増殖のリアルタイム評価を示している。C57BL/6マウスに、(A)肺癌細胞(TC1−GFP−ルシフェラーゼ)または(B)乳癌細胞(4T1−GFP−ルシフェラーゼ)をSubQ接種して、4週間にわたり週1回、賦形剤、α−GalCer、または表示されているα−GalCer類似体(C23、C30、7DW8−5およびC17)でIV処理した(マウス1匹あたり0.1μg)。インビボにおける腫瘍の生体発光画素を測定し、IVIS装置により計算した。左図:生体発光の定量データ;右図:腫瘍担持マウスの代表的な画像。*、p<0.05、DMSOと比較したとき;#、p<0.05、C1と比較したとき。肺癌細胞を接種されたマウスにおいて、α−GalCer類似体のC30、C23、およびC8−5は、対照およびα−GalCerのどちらと比較しても、腫瘍増殖を顕著に減少させた。興味深いことに、これらのα−GalCer類似体C30、C23、およびC8−5はすべて、上記の結果に示されているように、TH1に偏向した応答を引き起こすことが分かっている。乳癌を接種されたマウスにおいて、α−GalCer類似体C8−5は、対照およびα−GalCerのどちらと比較しても、腫瘍増殖を顕著に減少させた。α−GalCer類似体C17は、対照と比較して、腫瘍増殖を顕著に減少させたが、α−GalCerでも同様の結果であった。興味深いことに、α−GalCer類似体C17は、上記の結果に示されているように、TH2に偏向した応答を生じさせることが分かっている。これらの結果から、TH1サイトカインの産生が抗腫瘍活性と相関しているという考えが確認される。
図45は、典型的な実施態様において、本開示に係るα−GalCer類似体が、肺癌および黒色腫の腫瘍において、どのようにTH1に偏向した腫瘍浸潤性リンパ球を誘導するかを示している。図A〜Dは、肺癌中の腫瘍浸潤性リンパ球を示している。賦形剤、α−GalCer、または表示されているα−GalCer類似体(C23、C30、C8−5;0.1μg/マウス、週1回)で処理された、TC1腫瘍を担持しているC57BL/6マウスから21日目に採取した腫瘍の単一細胞懸濁液を、(図A)CD3+T細胞、(図B)CD8 T細胞(CD3+/CD4−/CD8+)、(図C)NK(NK1.1+/CD3−)、および(図D)NKT(NK1.1+/CD3+)について染色し、DMSOに対して標準化した。α−GalCer類似体C30は、対照およびα−GalCerのどちらと比較しても、肺癌において顕著かつ有意にTH1に偏向した腫瘍浸潤性リンパ球の数を増加させた。α−GalCer類似体C23およびC8−5も、(CD3+T細胞に対する)対照と比較しても、また、(CD8T細胞、NKおよびNTに対する)対照およびα−GalCerのどちらと比較しても、肺癌において顕著かつ有意に腫瘍浸潤性リンパ球の数を増加させた。図E〜Hは、黒色腫における腫瘍浸潤性リンパ球を示している。賦形剤、α−GalCer、または表示されているα−GalCer類似体(C23、C30、C8−5;0.1μg/マウス、週1回)で処理された、B16黒色腫を担持しているC57BL/6マウスから21日目に採取した腫瘍の単一細胞懸濁液を、(図E)CD3+T細胞、(図F)CD8 T細胞(CD3+/CD4−/CD8+)、(図G)NK(NK1.1+/CD3−)、および(図H)NKT(NK1.1+/CD3+)について染色し、DMSOに対して標準化した。α−GalCer類似体C23、C8−5、およびC30はすべて、対照およびα−GalCerのどちらと比較しても、黒色腫において顕著かつ有意にTH1に偏向した腫瘍浸潤性リンパ球の数を増加させた。*、p<0.05、DMSOと比較したとき;#、p<0.05、C1と比較したとき。
アジュバント免疫療法
ペプチド免疫原、タンパク質免疫原、多糖免疫原およびDNA免疫原に対するアジュバント効果
アジュバントは、免疫された生物種において抗原と併用されると、免疫応答を強化する化合物である。80年以上の間、アジュバントは、ワクチンの効果を高めるために利用されてきた。弱毒型の感染性生物を含む生ワクチンは、一般的に、それ自体で問題なく作用する。しかし死生物を含むワクチン(不活性化ワクチン)または感染性生物の断片またはそれらの毒素を含むワクチン(無細胞ワクチンまたは組換えワクチン)は、一般に、それらの効果を強化するためにアジュバントを必要とする。ほとんどの場合、誘導される応答のタイプ(1型または2型)が、ワクチンの予防効果に大きな影響を与える。代替アジュバントには、特定の型の応答を助長する傾向がある。しかし、アジュバントの選択は、機能的に予測が不可能であることによって、また、商業的な制約および利用可能性によっても複雑なものになっている。
ペプチド免疫原、タンパク質免疫原、多糖免疫原およびDNA免疫原に対するアジュバント効果
アジュバントは、免疫された生物種において抗原と併用されると、免疫応答を強化する化合物である。80年以上の間、アジュバントは、ワクチンの効果を高めるために利用されてきた。弱毒型の感染性生物を含む生ワクチンは、一般的に、それ自体で問題なく作用する。しかし死生物を含むワクチン(不活性化ワクチン)または感染性生物の断片またはそれらの毒素を含むワクチン(無細胞ワクチンまたは組換えワクチン)は、一般に、それらの効果を強化するためにアジュバントを必要とする。ほとんどの場合、誘導される応答のタイプ(1型または2型)が、ワクチンの予防効果に大きな影響を与える。代替アジュバントには、特定の型の応答を助長する傾向がある。しかし、アジュバントの選択は、機能的に予測が不可能であることによって、また、商業的な制約および利用可能性によっても複雑なものになっている。
ミョウバンとして知られているアルミニウム塩は、通常の予防ワクチン用に合衆国内で使用を認可された唯一のアジュバントである。しかし、アルミニウム塩は、ヒトにおいて、また動物においても、専らTH2型応答(例えば、IL−4産生)への変化を増大させることが分かっている。アルミニウム塩がTH1細胞媒介型免疫応答(例えば、IFN−γ産生)を誘導することができないことが、それをアジュバントとして使用することへの主な制約である。特に、細胞内でのウイルス感染および細菌感染に対するワクチンにとって、細胞傷害性T細胞応答がないことは致命的である。
本開示に係るα−GalCer類似体を、TH1偏向免疫原応答を開始させるように合成することができる。したがって、TH1型指向性免疫応答を示す改良型ワクチン、または、TH2型に加えて、免疫応答のTH1型への変化も可能にするワクチンを、本開示に係るα−GalCer類似体をアジュバントに用いて実現することができる。そのため、ワクチン投与と同時に、一つ以上のα−GalCer類似体をアジュバントとして投与する。さらに、すでに利用可能なワクチンに本開示に係るα−GalCer類似体を加えれば、TH1型応答の誘導が可能になるため、該ワクチンを改良型にして提供することも可能であろう。
いくつかの典型的な実施態様において、本開示は、C3、C11、C13〜C14、C16〜C18、C20、C22〜C24、C26、C8−5、およびC8−6からなる群から選択される化合物、またはその塩もしくは混合物の有効量、およびワクチン成分を含むワクチンを提供する。場合によっては、ワクチン成分は、死滅微生物、生きた弱毒化ウイルス微生物、類毒素、および不活性化もしくは弱毒化された微生物の断片からなる群から選択される。場合によっては、微生物は細菌または真菌である。場合によっては、類毒素は破傷風またはジフテリアである。場合によっては、ワクチン成分は、該ワクチンを投与される被検対象において免疫応答を誘導することができる。場合によっては、本化合物は免疫学的アジュバントとして作用し、ワクチン成分によって免疫系を刺激して誘導される免疫応答を変更または増強することができる。その結果、被検対象は、本化合物を含まない場合よりも強くワクチンに応答するようになる。
一つの態様において、適当なワクチンは、ペプチド免疫原、タンパク質免疫原、多糖免疫原、またはDNA免疫原を含むことができる。別の態様において、ワクチンは、一つ以上の市販ワクチン、例えば、A型肝炎、B型肝炎、ロタウイルス、ジフテリア、破傷風、百日咳、b型インフルエンザ桿菌、肺炎球菌、ポリオウイルス、インフルエンザ、はしか、流行性耳下腺炎、風疹、水痘、髄膜炎菌、ヒトパピロマウイルス、帯状疱疹、ライム病ボレリア、腸チフス、日本脳炎、狂犬病、ダニ媒介脳炎、コレラ、黄熱病、H5N1、西ナイル、パルボウイルス、猫鼻気管炎、カリシウイルス、汎白血球減少症ウイルス、オウム病クラミジア、ネコ白血病、イヌジステンパー、イヌアデノウイルス、イヌパラインフルエンザ、気管支敗血症菌、イヌコロナウイルス、ランブル鞭毛虫、レプトスピラ病(Leptospira bacterin)、ウシ伝染性鼻気管炎ウイルス、パラインフルエンザ3型ウイルス、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス、気腫疽菌、セプチカム(Septicum)ヘモリチカム(Haemolyticum)、セプチカム(Septicum)ノビイ(Novyi)、テタニ(Tetani)、ソルデリ(Sordellii)ペルフリンゲンス(Perfringens)、モラクセラ・ボビス(Moraxella bovis)、マンヘミア・ヘモリチカ(Mannheimia haemolytica)、パスツエラ・マルトシダ(Pateurella multocida)、レプトスピラ・ポモナ(Leptospira pomona)、レプトスピラ・ハルジオ(Leptospira hardjo)、レプトスピラ・グリポティフォーサ(Leptospira grippotyphosa)、レプトスピラ・カニコーラ(Leptospira canicola)、および黄疸出血症レプトスピラ(Leptospira icterohaemorrhagiae)などから選択することができる。
被検対象において化合物、組成物、またはワクチンの免疫原性を促進する方法であって、本開示に記載されたアジュバントをさらに含む化合物、組成物、またはワクチンを該被検対象に投与することを含み、該アジュバントが、該化合物、組成物、またはワクチンの免疫原性を促進する方法が提供される。
タンパク質ワクチンに対するアジュバント効果
α−GalCer、および本開示に係るα−GalCer類似体を、破傷風類毒素(TT)不活化毒素など、既存のタンパク質ワクチンに対する免疫応答を促進する能力について試験した。0日目と28日目に、本開示に係るα−GalCer類似体なしで、またはこれとともに、TTをマウスにワクチン接種した。抗TT特異的抗体を測定するために、血清を毎週採取した。図46Aは、TTに対する抗体応答に対する、本開示に係るα−GalCer類似体のアジュバント効果を示している。図46Aに示されているように、抗TT特異的IgG抗体の産生は、α−GalCer(C1)およびα−GalCer類似体(C11)によって促進された。抗TT産生の動態は、従来からのアジュバントであるミョウバン(以下「Alum」)によって誘導されものと同じであったが、C1は、Alumよりも顕著に高い抗体産生を誘導した。従来のTT+AlumにC1またはC11を組み合わせると、抗体応答は、従来のワクチンのほぼ2倍までさらに増強された。これらの知見は、C1およびC11が、Alumと相乗作用して免疫応答をさらに促進するアジュバント効果を持っていたことを示している。α−GalCer類似体C11のアジュバント効果は、著しく持続的であった。2回目に免疫した20週間後、マウスに(Alumもα−GalCer類似体C11も用いずに)TTを単独で追加免疫投与したところ、1週間後、抗TT抗体が急速に増加した。図46Bは、2回目にワクチン接種した20週間後の遅延抗原追加投与に対するα−GalCer類似体C11の効果を示している。C1またはC11で処理したマウスにおける抗体量は、TT+Alumを与えられたマウスの2倍あり、図46Bに示されているように、TTのみを注射されたものの25倍以上あった。これらの知見は、C1またはα−GalCer類似体C11が、増強された追加免疫応答をもたらすメモリーT細胞およびB細胞に対して効果をもつことを示唆した。
α−GalCer、および本開示に係るα−GalCer類似体を、破傷風類毒素(TT)不活化毒素など、既存のタンパク質ワクチンに対する免疫応答を促進する能力について試験した。0日目と28日目に、本開示に係るα−GalCer類似体なしで、またはこれとともに、TTをマウスにワクチン接種した。抗TT特異的抗体を測定するために、血清を毎週採取した。図46Aは、TTに対する抗体応答に対する、本開示に係るα−GalCer類似体のアジュバント効果を示している。図46Aに示されているように、抗TT特異的IgG抗体の産生は、α−GalCer(C1)およびα−GalCer類似体(C11)によって促進された。抗TT産生の動態は、従来からのアジュバントであるミョウバン(以下「Alum」)によって誘導されものと同じであったが、C1は、Alumよりも顕著に高い抗体産生を誘導した。従来のTT+AlumにC1またはC11を組み合わせると、抗体応答は、従来のワクチンのほぼ2倍までさらに増強された。これらの知見は、C1およびC11が、Alumと相乗作用して免疫応答をさらに促進するアジュバント効果を持っていたことを示している。α−GalCer類似体C11のアジュバント効果は、著しく持続的であった。2回目に免疫した20週間後、マウスに(Alumもα−GalCer類似体C11も用いずに)TTを単独で追加免疫投与したところ、1週間後、抗TT抗体が急速に増加した。図46Bは、2回目にワクチン接種した20週間後の遅延抗原追加投与に対するα−GalCer類似体C11の効果を示している。C1またはC11で処理したマウスにおける抗体量は、TT+Alumを与えられたマウスの2倍あり、図46Bに示されているように、TTのみを注射されたものの25倍以上あった。これらの知見は、C1またはα−GalCer類似体C11が、増強された追加免疫応答をもたらすメモリーT細胞およびB細胞に対して効果をもつことを示唆した。
ペプチドワクチンに対するアジュバント効果
A型インフルエンザウイルスのH1N1亜型のM2タンパク質の細胞外ドメインを含むペプチドワクチンによるアジュバント効果を評価した。このペプチドワクチンのアミノ酸配列はMSLLTEVETPIRNEWGCRCNであった。0週目、3週目、および6週目に、本開示に係るさまざまなα−GalCer類似体(C9、C11、C14、C17)とともに、またはこれらなしで、5μgまたは45μgのM2eペプチドをメスBALB/cマウスにワクチン接種した。図47は、M2eペプチドワクチンに対する、さまざまなα−GalCer類似体のアジュバント効果を示している。図47に示されているように、3回目に免疫した2週間後、M2eペプチドは単独で、5μgおよび45μgの抗原投与量に対して、それぞれ1.8×105および5.4×105の抗M2e特異的IgG力価を誘導した。本開示に係るα−GalCer類似体を併用すると、10〜30倍高い抗M2抗体価が得られた。試験されたα−GalCer類似体のうち、C11が、完全フロイントアジュバント(CFA)と等しく、C1よりも力価が3倍高い、最も優れたアジュバント効果を示した。これ以外のα−GalCer類似体(C9、C14、およびC17)はC1と同等であった。これらの知見は、α−GalCerおよびその類似体が、ペプチド抗原に対して強力なアジュバント活性をもち、C11のように、アシルテールに芳香環を含むものが最も強力であることを示唆している。
A型インフルエンザウイルスのH1N1亜型のM2タンパク質の細胞外ドメインを含むペプチドワクチンによるアジュバント効果を評価した。このペプチドワクチンのアミノ酸配列はMSLLTEVETPIRNEWGCRCNであった。0週目、3週目、および6週目に、本開示に係るさまざまなα−GalCer類似体(C9、C11、C14、C17)とともに、またはこれらなしで、5μgまたは45μgのM2eペプチドをメスBALB/cマウスにワクチン接種した。図47は、M2eペプチドワクチンに対する、さまざまなα−GalCer類似体のアジュバント効果を示している。図47に示されているように、3回目に免疫した2週間後、M2eペプチドは単独で、5μgおよび45μgの抗原投与量に対して、それぞれ1.8×105および5.4×105の抗M2e特異的IgG力価を誘導した。本開示に係るα−GalCer類似体を併用すると、10〜30倍高い抗M2抗体価が得られた。試験されたα−GalCer類似体のうち、C11が、完全フロイントアジュバント(CFA)と等しく、C1よりも力価が3倍高い、最も優れたアジュバント効果を示した。これ以外のα−GalCer類似体(C9、C14、およびC17)はC1と同等であった。これらの知見は、α−GalCerおよびその類似体が、ペプチド抗原に対して強力なアジュバント活性をもち、C11のように、アシルテールに芳香環を含むものが最も強力であることを示唆している。
DNAワクチンに対するアジュバント効果
H5DNAコンストラクト(pHA)を、鳥インフルエンザウイルスの完全長H5コンセンサス配列を含むプラスミドとして調製した。要するに、遺伝的変異性をカバーし、それによって異なるH5N1株全般にわたる交差防御を誘導するために、500種類のH5N1ウイルス株のHA遺伝子から、コンセンサスHA配列を導き出して、これをワクチン開発に用いた。Hoら(Jinら、(2002)J.Virol.76(5):2306−2216)によって開発されたHIV用のDNAワクチンであるADVAXと同様の戦略に基づいて、HAのコンセンサス配列をpVAXベクターの中に構築してDNAワクチンの候補とした。初回免疫した3週間後のマウスにおける、α−GalCer(C1)とともに、またはそれなしでH5DNAワクチン(pHA)を投与した効果を図48Aに示す。α−GalCerとともに、またはそれなしで、5〜45μgのH5DNAワクチンによりマウスを免疫すると、5〜30μgのH5DNAでは、α−GalCerによって抗H5応答が促進されるが、45μgで横這いになることが示された。図48Bは、2回目に免疫して2週間後の抗H5力価に対する、低用量のH5DNAワクチンおよびα−GalCer(C1)の効果を示している。H5DNA投与量を0.2〜5μgに減らすと、試験された全ての低投与量について、v−GalCerのアジュバント効果がはっきりした。図48Cは、C1とともに、またはそれなしで、低用量のH5DNAワクチンを投与した2週間後の、ベトナム交雑インフルエンザ株NIBRG−14によるウイルス抗原投与に対する防御を示している。α−GalCerなしでは、20LD50のNIBRG−14ウイルスを抗原投与されると、<2μgで処理された動物はすべて生き残ることができなかったが、α−GalCerとともに0.2〜1μgのpHAで処理された動物では、80%の防御が見られた(図48C)。これらの知見によって、NIBRG−14に対する防御免疫の誘導に対して、低用量のpHAワクチンと併用されたときにα−GalCerがアジュバント効果をもつことが確認される。
H5DNAコンストラクト(pHA)を、鳥インフルエンザウイルスの完全長H5コンセンサス配列を含むプラスミドとして調製した。要するに、遺伝的変異性をカバーし、それによって異なるH5N1株全般にわたる交差防御を誘導するために、500種類のH5N1ウイルス株のHA遺伝子から、コンセンサスHA配列を導き出して、これをワクチン開発に用いた。Hoら(Jinら、(2002)J.Virol.76(5):2306−2216)によって開発されたHIV用のDNAワクチンであるADVAXと同様の戦略に基づいて、HAのコンセンサス配列をpVAXベクターの中に構築してDNAワクチンの候補とした。初回免疫した3週間後のマウスにおける、α−GalCer(C1)とともに、またはそれなしでH5DNAワクチン(pHA)を投与した効果を図48Aに示す。α−GalCerとともに、またはそれなしで、5〜45μgのH5DNAワクチンによりマウスを免疫すると、5〜30μgのH5DNAでは、α−GalCerによって抗H5応答が促進されるが、45μgで横這いになることが示された。図48Bは、2回目に免疫して2週間後の抗H5力価に対する、低用量のH5DNAワクチンおよびα−GalCer(C1)の効果を示している。H5DNA投与量を0.2〜5μgに減らすと、試験された全ての低投与量について、v−GalCerのアジュバント効果がはっきりした。図48Cは、C1とともに、またはそれなしで、低用量のH5DNAワクチンを投与した2週間後の、ベトナム交雑インフルエンザ株NIBRG−14によるウイルス抗原投与に対する防御を示している。α−GalCerなしでは、20LD50のNIBRG−14ウイルスを抗原投与されると、<2μgで処理された動物はすべて生き残ることができなかったが、α−GalCerとともに0.2〜1μgのpHAで処理された動物では、80%の防御が見られた(図48C)。これらの知見によって、NIBRG−14に対する防御免疫の誘導に対して、低用量のpHAワクチンと併用されたときにα−GalCerがアジュバント効果をもつことが確認される。
他の本開示に係るα−GalCer類似体も、上記で使用されたものと同様のプロトコルおよびスケジュールを用いて(違いがあるときは特記する)、マウスにおけるpHAワクチンと併用されるアジュバントとして試験した。6〜7週齢のメスBALB/cマウスに、pHAとともに、α−GalCer、または表示されているα−GalCer類似体を、電気移動法により筋肉内にワクチン接種し、4週間後に同じ処方で1回追加免疫した。2回目のワクチン接種の2週間後に血液試料を採集し、ELISA法により抗HA特異的IgG抗体価について試験した。図49Aは、α−GalCer、またはα−GalCer類似体C3、C11、C13、C14、およびC16とともに、またはそれらなしで、0.2μgのpHAで免疫した後のマウスにおける抗HA特異的IgG抗体(AY3)の力価を示している。図49Bは、α−GalCer、またはα−GalCer類似体C10、C13、C18、C19、およびC20とともに、またはそれらなしで、0.2μgのpHAで免疫した後のマウスにおける抗HA特異的IgG抗体(AY4)の力価を示している。図49Cは、試験されたα−GalCer類似体のいくつかについて、上記したようにウイルス投与した後のマウス生存率を示している。図50Aは、0.5μgのpHAおよび表示されているα−GalCer類似体で免疫した後の抗HA特異的IgG抗体(AY4)を示している。図50Bは、上記したようにウイルス投与した後のマウス生存率を示している。図51は、(図A)0.1μgのpHA(pHA0.1対pHA0.1+C26:一方向ANOVAクルスカル−ワリス検定でp<0.01)、または(図B)0.2μgのpHA(pHA0.2対pHA0.2+C17:p<0.01、pHA0.2対pHA0.2+C26:一方向ANOVAクルスカル−ワリス検定でp<0.05)、および表示されているα−GalCer類似体で免疫した後の抗HA特異的IgG抗体(AY5)のマウス力価を示している。図52は、(図A)0.1μgのpHA、または(図B)0.2μgのpHA、および0.1μgまたは1μgの表示されているα−GalCer類似体で免疫した後の抗HA特異的IgG抗体(AY6)のマウス力価を示している。0.2μgのpHA投与量で、アジュバントとして特に有効な本開示に係るα−GalCer類似体は、C13、C17、C20、およびC26であった。
図53は、0.2μgのpHAcと、α−GalCer、または表示されているα−GalCer類似体C3、C10、C11、C13、C14、C16、C17、C18、C19、C20、C23、C24、C26、7DW8−5、ならびにミョウバンで免疫した後のマウス抗HA特異的IgG抗体である(図A)AY3、(図B)AY4、(図C)AY5、および(図D)AY15の力価を示している。その結果、C1、C13、C14、C17、C26、および7DW8−5が、抗体価を高めるという点で、その他のものより優れたアジュバント活性をもっていたことを示している。HA特異的CD8 T細胞応答が、本開示に係るα−GalCer類似体をアジュバントとして使用することによって促進されるか否かを調べるために、C1、C26、および7DW8−5をさらに評価した。図54に示されているように、α−GalCer類似体アジュバント群では、IFN−γ分泌細胞が増加した。さらに、NIBRG−14ウイルスを抗原投与した後、C1アジュバント群、C26アジュバント群、および7DW8−5アジュバント群の生存率は、ミョウバンアジュバント群またはpHAのみの群のものより高かった(図55)。
本開示に係るα−GalCer類似体のアジュバント効果は、単回投与によるpHAワクチン接種でも明らかになった。単回投与免疫した3週間後に、アジュバントとしてC26およびC1で処理されたマウスでは、抗HA特異的IgG抗体が増加した(図56)。C1、C26、または7DW8−5で処理されたマウスは、NIBRG−14ウイルス抗原投与による致死量の抗原投与から効果的に保護され、生存率は、87.5%〜100%であった。これらの知見は、単回ワクチン接種という状況で、C1、C26、および7DW8−5が良好なアジュバント活性をもつことを示している。
多糖免疫原に対するアジュバント効果
グロボHは、六糖であるが(Fucα1→2Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1)、結腸癌、卵巣癌、胃癌、膵臓癌、子宮内膜癌、肺癌、前立腺癌、および乳癌など多様な上皮細胞腫瘍上で過剰発現することが、モノクロ−ナル抗体MBr1(IgM)およびVK−9(IgG3)を用いて明らかになっている。正常な組織では、グロボHは、免疫系に到達不能と考えられている部位である細胞内腔境界にある上皮細胞の先端面に限局されている。そのため、グロボHは、乳癌およびその他の上皮癌の免疫療法にとって理想的な標的抗原である。
グロボHは、六糖であるが(Fucα1→2Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1)、結腸癌、卵巣癌、胃癌、膵臓癌、子宮内膜癌、肺癌、前立腺癌、および乳癌など多様な上皮細胞腫瘍上で過剰発現することが、モノクロ−ナル抗体MBr1(IgM)およびVK−9(IgG3)を用いて明らかになっている。正常な組織では、グロボHは、免疫系に到達不能と考えられている部位である細胞内腔境界にある上皮細胞の先端面に限局されている。そのため、グロボHは、乳癌およびその他の上皮癌の免疫療法にとって理想的な標的抗原である。
α−GalCer、ならびに本開示に係るα−GalCer類似体C23および7DW8−5のアジュバント効果を、ジフテリア類毒素ワクチンに結合したグロボH(GH−DT)について評価した。BALB/cマウスに、2週間隔で3回、グロボH−DT/α−GalCerまたはグロボH−DT/α−GalCer類似体をIM注射した。3回目にワクチン接種した2週間後、血清を採集し、グリカンマイクロアレイを用いて、IgG抗グロボH特異的抗体およびIgM抗グロボH特異的抗体について、それぞれ1:480および1:240の希釈率で試験した。図57Aに示されているように、GH−DTは単独では、抗グロボH抗体を全く誘導しなかったが、C1または7DW8−5が添加されると、顕著にIgG抗体産生を誘導した。一方、IgMの産生は、7DW8−5アジュバント群でのみ観察され、C1処理群では観察されなかった(図57B)。結論として、C1または7DW8−5をGH−DTワクチンに添加すると、糖鎖抗原に対する特異抗体の産生を促進することができた。
抗微生物免疫療法
さらに別の態様において、本開示に係るα−GalCer類似体は、例えば、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、多細胞寄生虫、および異常タンパク質(プリオン)など微生物性病原体の存在が原因で起こる感染症の治療において使用される。
さらに別の態様において、本開示に係るα−GalCer類似体は、例えば、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、多細胞寄生虫、および異常タンパク質(プリオン)など微生物性病原体の存在が原因で起こる感染症の治療において使用される。
いくつかの典型的な実施態様において、本方法は、C9、C11、C13〜C16、C23、およびC30からなる群から選択される化合物、またはその塩もしくは混合物の有効量を被検対象に投与することを含む抗微生物免疫療法を被検対象に提供する。
抗ウイルス効果
抗ウイルス薬は、特にウイルス感染症を治療するのに使用される一群の薬物である。抗生物質と同様、特定のウイルスには特定の抗ウイルス薬が使用される。これらは宿主にとって比較的無害であるので、感染症を治療するために使用することができる。抗ウイルス薬は、わずかなウイルス性疾患を治療するためにしか利用できない。2種類の有用な抗ウイルス薬が、ヌクレオシド類似体およびインターフェロンである。インターフェロンには、α−インターフェロン、β−インターフェロン、およびγ−インターフェロンという3つのクラスがある。α−インターフェロンおよびβ−インターフェロンは、ウイルスに感染した細胞から分泌されるサイトカインである。これらは、隣接する細胞上にある特異的受容体に結合し、それらの細胞をウイルスによる感染から守る。これらは、ウイルスによる侵入に対する即応型宿主防御応答の一部をなしている。このような直接的な抗ウイルス効果に加え、α−インターフェロンおよびβ−インターフェロンは、感染細胞の表面上にクラスIおよびクラスIIのMHC分子が発現されるのも促進し、このようにして、特異的免疫細胞に対するウイルス抗原提示を促進する。これらの存在は、ウイルス感染の急性期の体液において証明することができる。現在、組換え型のα−インターフェロンおよびβ−インターフェロンが利用可能であり、慢性のB型およびC型の肝炎ウイルス感染症を治療するために使用されている。しかし、発熱、倦怠感、および体重減少などの副作用のせいで、その使用は制限されてきた。γ−インターフェロン(免疫インターフェロン)は、TH1型CD4細胞によって分泌されるサイトカインである。その機能は、特異的T細胞が媒介する免疫応答を促進することである。
抗ウイルス薬は、特にウイルス感染症を治療するのに使用される一群の薬物である。抗生物質と同様、特定のウイルスには特定の抗ウイルス薬が使用される。これらは宿主にとって比較的無害であるので、感染症を治療するために使用することができる。抗ウイルス薬は、わずかなウイルス性疾患を治療するためにしか利用できない。2種類の有用な抗ウイルス薬が、ヌクレオシド類似体およびインターフェロンである。インターフェロンには、α−インターフェロン、β−インターフェロン、およびγ−インターフェロンという3つのクラスがある。α−インターフェロンおよびβ−インターフェロンは、ウイルスに感染した細胞から分泌されるサイトカインである。これらは、隣接する細胞上にある特異的受容体に結合し、それらの細胞をウイルスによる感染から守る。これらは、ウイルスによる侵入に対する即応型宿主防御応答の一部をなしている。このような直接的な抗ウイルス効果に加え、α−インターフェロンおよびβ−インターフェロンは、感染細胞の表面上にクラスIおよびクラスIIのMHC分子が発現されるのも促進し、このようにして、特異的免疫細胞に対するウイルス抗原提示を促進する。これらの存在は、ウイルス感染の急性期の体液において証明することができる。現在、組換え型のα−インターフェロンおよびβ−インターフェロンが利用可能であり、慢性のB型およびC型の肝炎ウイルス感染症を治療するために使用されている。しかし、発熱、倦怠感、および体重減少などの副作用のせいで、その使用は制限されてきた。γ−インターフェロン(免疫インターフェロン)は、TH1型CD4細胞によって分泌されるサイトカインである。その機能は、特異的T細胞が媒介する免疫応答を促進することである。
インターフェロンの作用メカニズムには以下が含まれる:1)特異的免疫応答の促進。インターフェロンは、感染細胞の表面上におけるMHCクラスI分子の発現を増加させることにより、特異的細胞傷害性T細胞が感染細胞を認識して死滅させる機会を増やすこと;および2)直接的抗ウイルス効果:a)ウイルスmRNAの分解、およびb)タンパク質合成の阻害、これは、新たな細胞への感染を予防する。
一つの態様において、本開示に係る合成α−GalCer類似体は、さまざまな感染性ウイルスの抗ウイルス薬治療および予防に使用される。本開示に係る方法によってか、または本開示に係るNKT、ワクチン、または組成物を用いて行うことができる防御免疫応答刺激が望ましい感染性ウイルスの例は、以下のものを含むが、これらに限定されない:レトロウイルス科(例えば、ヒト免疫不全ウイルス、例えば、HIV−1(HTLV−III、LAV、またはHTLV−III/LAVとも呼ばれる)、またはHIV−III;およびその外の分離株、例えば、HIV−LP);ピコルナウイルス科(例えば、ポリオウイルス、A型肝炎ウイルス;エンテロウイルス、ヒトコクサッキ−ウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス);カルシウイルス科(例えば、胃腸炎を引き起こす系統);トガウイルス科(例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス);フラビウイルス科(例えば、デング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス);コロナウイルス科(例えば、コロナウイルス);ラブドウイルス科(例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス);フィロウイルス科(例えば、エボラウイルス);パラミクソウイルス科(例えば、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス);オルトミクソウイルス科(例えば、インフルエンザウイルス);ブンガウイルス科(例えば、ハンタウイルス、ブンガウイルス、フレボウイルス、およびナイロウイルス);アレナウイルス科(出血熱ウイルス);レオウイルス科(例えば、レオウイルス、オルビウイルス、およびロタウイルス);ビルナウイルス科;ヘパドナウイルス科(B型肝炎ウイルス);パルボウイルス科(パルボウイルス);パポバウイルス科(パピローマウイルス、ポリオーマウイルス);アデノウイルス科(ほとんどのアデノウイルス);ヘルペスウイルス科(単純ヘルペスウイルス(HSV)1型および2型、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス(CMV)、ヘルペスウイルス);ポックスウイルス科(痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス);およびイリドウイルス科(例えば、アフリカブタコレラウイルス);ならびに未分類のウイルス(例えば、海綿状脳症の病原因子、デルタ型肝炎の病原因子(B型肝炎ウイルスの欠損サテライトと考えられている)、非A非B型肝炎因子(クラス1=内部感染するもの、クラス2=非経口感染するもの(すなわち、C型肝炎);ノーウォークウイルスおよびその関連ウイルス、ならびにアストロウイルス)。
ウイルス抗原投与−インフルエンザウイルスH1N1感染
α−GalCer類似体のIP注射による治療
図58は、インフルエンザウイルスH1N1感染後0〜12日目におけるマウスの生存率を示している。マウスを、2μgのα−GalCer(C1)またはα−GalCer類似体C2、C3、C9、C11、C13、C14、およびC16で処理し(IP注射)、対照DMSOと比較した。3つの異なった処理計画を試験した。図58Aは、BALB/cマウスを、H1N1ウイルスを抗原投与した30分後から処理したときの生存率を示している。対照と比較したときのP値は、C1:0.4554、C2:0.5149、C3:0.5764、C9:0.5466、C11:0.2031、C16:0.0359であった。図58Bは、BALB/cマウスを、H1N1ウイルス(WSN)投与の2週間前から処理したときの生存率を示している。マウスは、2μgの対照、α−GalCer(C1)、またはα−GalCer類似体で、−14日間、−10日間、−3日間、0.5時間、2日間、4日間、6日間、8日間、10日間、および12日間(IP注射)処理された。ウイルス投与の2週間前に処理を始め、週2回投与した場合には、試験したすべての類似体(C9、C11、C13、およびC14)によるα−GalCer処理で、マウスは、有意に高くなった生存率を示した。対照と比較したときのP値は、C1:0.000116、C9:0.000126、C11:0.02627、C13:0.000027、およびC14:0.000147であった。図59は、より高用量のH1N1ウイルスを感染させたマウスの生存の累積比率を示している。図59Aでは、H1N1(WSN)で抗原投与する2週間前から、マウスの処理を開始した。マウスは、2μgの対照、α−GalCer(C1)、またはα−GalCer類似体で、−14日間、−10日間、−3日間、0.5時間、2日間、4日間、および6日間(IP注射)処理された。第1群は対照群である。第6群は、α−GalCer(C1)で処理された。第7群は、α−GalCer類似体C13で処理された。第8群は、α−GalCer類似体C14で処理された。第9群は、α−GalCer類似体C16で処理された。α−GalCer類似体C16は生存期間を延ばし、C16に直接的な抗ウイルス効果があることを示した。
α−GalCer類似体のIP注射による治療
図58は、インフルエンザウイルスH1N1感染後0〜12日目におけるマウスの生存率を示している。マウスを、2μgのα−GalCer(C1)またはα−GalCer類似体C2、C3、C9、C11、C13、C14、およびC16で処理し(IP注射)、対照DMSOと比較した。3つの異なった処理計画を試験した。図58Aは、BALB/cマウスを、H1N1ウイルスを抗原投与した30分後から処理したときの生存率を示している。対照と比較したときのP値は、C1:0.4554、C2:0.5149、C3:0.5764、C9:0.5466、C11:0.2031、C16:0.0359であった。図58Bは、BALB/cマウスを、H1N1ウイルス(WSN)投与の2週間前から処理したときの生存率を示している。マウスは、2μgの対照、α−GalCer(C1)、またはα−GalCer類似体で、−14日間、−10日間、−3日間、0.5時間、2日間、4日間、6日間、8日間、10日間、および12日間(IP注射)処理された。ウイルス投与の2週間前に処理を始め、週2回投与した場合には、試験したすべての類似体(C9、C11、C13、およびC14)によるα−GalCer処理で、マウスは、有意に高くなった生存率を示した。対照と比較したときのP値は、C1:0.000116、C9:0.000126、C11:0.02627、C13:0.000027、およびC14:0.000147であった。図59は、より高用量のH1N1ウイルスを感染させたマウスの生存の累積比率を示している。図59Aでは、H1N1(WSN)で抗原投与する2週間前から、マウスの処理を開始した。マウスは、2μgの対照、α−GalCer(C1)、またはα−GalCer類似体で、−14日間、−10日間、−3日間、0.5時間、2日間、4日間、および6日間(IP注射)処理された。第1群は対照群である。第6群は、α−GalCer(C1)で処理された。第7群は、α−GalCer類似体C13で処理された。第8群は、α−GalCer類似体C14で処理された。第9群は、α−GalCer類似体C16で処理された。α−GalCer類似体C16は生存期間を延ばし、C16に直接的な抗ウイルス効果があることを示した。
α−GalCer類似体の鼻腔内投与による治療
図59Bは、H1N1を感染させたマウスの生存の累積比率を示している。H1N1(WSN)によるウイルス抗原を投与する1時間前に、BALB/cマウスを、対照、α−GalCer(C1)、またはα−GalCer類似体C13、C14、またはC16で鼻腔内経路によって処理した。C13は生存期間を延長させ、直接的な抗ウイルス効果があることを示唆した。一般的に、一定のα−GalCer類似体は、直接的な抗ウイルス効果を及ぼすか、または免疫刺激を介して間接的に作用することができる。図60は、インビトロにおけるメイディン・ダ−ビ−・イヌ腎臓(MDCK)細胞の細胞変性効果(CPE)を示している。MDCK細胞を、10μg/mlの賦形剤、α−GalCer、またはα−GalCer類似体C13、C14、またはC16のうちの一つで4時間、前処理した後、10TCID50にてFLU−Aウイルス血清型H1N1(WSN)を感染させた。感染させた48時間後にMDCK細胞のウイルス力価を測定した(右図)。α−GalCer、および試験された3つのα−GalCer類似体は、インビトロにおいて、H1N1ウイルスの侵入/複製をわずかに阻害した。
図59Bは、H1N1を感染させたマウスの生存の累積比率を示している。H1N1(WSN)によるウイルス抗原を投与する1時間前に、BALB/cマウスを、対照、α−GalCer(C1)、またはα−GalCer類似体C13、C14、またはC16で鼻腔内経路によって処理した。C13は生存期間を延長させ、直接的な抗ウイルス効果があることを示唆した。一般的に、一定のα−GalCer類似体は、直接的な抗ウイルス効果を及ぼすか、または免疫刺激を介して間接的に作用することができる。図60は、インビトロにおけるメイディン・ダ−ビ−・イヌ腎臓(MDCK)細胞の細胞変性効果(CPE)を示している。MDCK細胞を、10μg/mlの賦形剤、α−GalCer、またはα−GalCer類似体C13、C14、またはC16のうちの一つで4時間、前処理した後、10TCID50にてFLU−Aウイルス血清型H1N1(WSN)を感染させた。感染させた48時間後にMDCK細胞のウイルス力価を測定した(右図)。α−GalCer、および試験された3つのα−GalCer類似体は、インビトロにおいて、H1N1ウイルスの侵入/複製をわずかに阻害した。
抗菌効果
ペニシリンが1940年代に臨床使用されるようになって以来、抗菌薬は何百万もの生命を救ってきた。しかし、抗菌耐性という長い影が、抗生物質以前の時代への回帰をもたらす脅威となっている。α−GalCerなどの合成糖脂質および天然の細菌性糖脂質が、NKT細胞を活性化させて宿主の抗菌機能に貢献したCD1dリガンドであることが実証された。α−GalCerの抗菌活性は、結核菌感染症の寛解、緑膿菌による肺感染の排除で実証された。マウスにおけるスフィンゴモナス・カプスラ−タ(Spingomonas capsulate)およびエールリキア・ムリス(Ehrlichia muris)による感染も、糖脂質によるNKT細胞の活性化によって軽減した。
ペニシリンが1940年代に臨床使用されるようになって以来、抗菌薬は何百万もの生命を救ってきた。しかし、抗菌耐性という長い影が、抗生物質以前の時代への回帰をもたらす脅威となっている。α−GalCerなどの合成糖脂質および天然の細菌性糖脂質が、NKT細胞を活性化させて宿主の抗菌機能に貢献したCD1dリガンドであることが実証された。α−GalCerの抗菌活性は、結核菌感染症の寛解、緑膿菌による肺感染の排除で実証された。マウスにおけるスフィンゴモナス・カプスラ−タ(Spingomonas capsulate)およびエールリキア・ムリス(Ehrlichia muris)による感染も、糖脂質によるNKT細胞の活性化によって軽減した。
本開示に係る方法によってか、または本開示に係るNKT、ワクチン、または組成物を用いて行うことができる防御免疫応答刺激が望ましい感染性細菌の例は、以下のものを含むが、これらに限定されない:ピロリ菌(Helicobacter pylori)、ライム病ボレリア菌(Borellia burgdorferi)、レジオネラニューモフィリア菌(Legionella pneumophilia)、肺炎桿菌(Klebsiella Pneumoniae)、マイコバクテリア種(例えば、ヒト型結核菌(M.tuberculosis)、トリ型結核菌(M.avium)、M.イントラセルラーレ(M.intracellulare)、M.カンサイ(M.kansaii)、M.ゴルドナエ(M.gordonae))、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、淋菌(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、リステリア菌(Listeria monocytogenes)、化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)(A群連鎖球菌)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)(B群連鎖球菌)、連鎖球菌(緑色)(viridans group))、大便連鎖球菌(Streptococcus faecalis)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、連鎖球菌(嫌気性種)、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)、病原性カンピロバクタ−種(Campylobactersp.)、腸球菌種(Enterococcus sp.)、クラミジア種、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、炭疽菌(Bacillus antracis)、ジフテリア菌(corynebacterium diphtheriae)、コリネバクテリア種(corynebacterium sp.)、ブタ丹毒菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、ウェルシュ菌(clostridium perfringens)、破傷風菌(Clostridium tetani)、エンテロバクタ−・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、パスツエラ・マルトシダ(Pasturella multocida)、バクテロイデス種(Bacteroides sp.)、フソバクテリウム・ヌクレアタム(Fusobacterium nucleatum)、モリニホルム連鎖桿菌(Streptobacillus moniliformis)、梅毒トレポネ−マ(Treponema pallidium)、ラセン菌トレポネ−マ(Treponema pertenue)、レプトスピラ(Leptospira)、イスラエル放線菌(Actinomyces israelii)、スフィンゴモナス・カプスラ−タ(Sphingomonas capsulata)、および野兎病菌(Francisella tularensis)。
細菌排除の促進−スフィンゴモナス・カプスラ−タ感染マウス
スフィンゴモナス・カプスラ−タは、空気中や水中など多くの場所に存在する一般的な環境由来細菌である。これは、そのコロニーが黄色をしているため、栄養寒天平板上で容易に同定することができる。大部分のグラム陰性細菌とは異なり、スフィンゴモナス・カプスラ−タは、宿主の抗菌活性を活性化させるために動物によって利用されるリポ多糖類(LPS)を含んでいない。糖脂質抗原の抗菌活性は、糖脂質が結合したCD1d分子によるNKT細胞の活性化を介しているため、スフィンゴモナス・カプスラ−タ感染症の病気モデルを用いて抗菌効力を評価することは、糖脂質結合によって活性化されるNKT介在経路の影響だけを見ることになる。6〜8週齢のメスC57BL/6マウスに、スフィンゴモナス・カプスラ−タ細胞をIP注射した。注射した4時間後に、対照、α−GalCer(C1)、またはα−GalCer類似体(C3、C9、C11、C14、C16、またはC17)を50μg/kgまたは100μg/kgにてマウスにIP注射した。細菌に感染させた24時間後、マウスから肝臓を切り出してホモジナイズした。希釈した試料を栄養プレート上で平板培養して、肝ホモジネート中のスフィンゴモナス・カプスラ−タのコロニー形成単位(CFU)を測定した。37℃にて48時間インキュベ−トした後、コロニーを計測した。図61Aは、100μg/kgのα−GalCer、ならびにC11、C14、およびC16で処理された群のCFU数が、細菌感染後24時間で、対照群よりも有意に低くなっていることを示している。これらのα−GalCer類似体の抗菌効力を確認するために、別の試験を行い、同一の病気モデルにおいて50μg/kgで感染マウスを処理して実験を反覆した。図61Bは、C11、C14、C16、およびC15で処理されたマウスの抗菌効力が、未処理群と比較すると有意であることを示している。効力のあった3つの群、C1、C11、およびC15の間で、肝臓1グラムあたりのCFU値における差異は、統計学的に有意ではない。図63は、50μg/kgのC23およびC30で処理された群の(肺中の)CFU数が、未処理群と比較して有意であることを示している。同様の結果が、マウスをC23およびC30で処理した後の肝臓のCFU数で見られた。
スフィンゴモナス・カプスラ−タは、空気中や水中など多くの場所に存在する一般的な環境由来細菌である。これは、そのコロニーが黄色をしているため、栄養寒天平板上で容易に同定することができる。大部分のグラム陰性細菌とは異なり、スフィンゴモナス・カプスラ−タは、宿主の抗菌活性を活性化させるために動物によって利用されるリポ多糖類(LPS)を含んでいない。糖脂質抗原の抗菌活性は、糖脂質が結合したCD1d分子によるNKT細胞の活性化を介しているため、スフィンゴモナス・カプスラ−タ感染症の病気モデルを用いて抗菌効力を評価することは、糖脂質結合によって活性化されるNKT介在経路の影響だけを見ることになる。6〜8週齢のメスC57BL/6マウスに、スフィンゴモナス・カプスラ−タ細胞をIP注射した。注射した4時間後に、対照、α−GalCer(C1)、またはα−GalCer類似体(C3、C9、C11、C14、C16、またはC17)を50μg/kgまたは100μg/kgにてマウスにIP注射した。細菌に感染させた24時間後、マウスから肝臓を切り出してホモジナイズした。希釈した試料を栄養プレート上で平板培養して、肝ホモジネート中のスフィンゴモナス・カプスラ−タのコロニー形成単位(CFU)を測定した。37℃にて48時間インキュベ−トした後、コロニーを計測した。図61Aは、100μg/kgのα−GalCer、ならびにC11、C14、およびC16で処理された群のCFU数が、細菌感染後24時間で、対照群よりも有意に低くなっていることを示している。これらのα−GalCer類似体の抗菌効力を確認するために、別の試験を行い、同一の病気モデルにおいて50μg/kgで感染マウスを処理して実験を反覆した。図61Bは、C11、C14、C16、およびC15で処理されたマウスの抗菌効力が、未処理群と比較すると有意であることを示している。効力のあった3つの群、C1、C11、およびC15の間で、肝臓1グラムあたりのCFU値における差異は、統計学的に有意ではない。図63は、50μg/kgのC23およびC30で処理された群の(肺中の)CFU数が、未処理群と比較して有意であることを示している。同様の結果が、マウスをC23およびC30で処理した後の肝臓のCFU数で見られた。
細菌排除の促進−肺炎桿菌感染マウス
肺炎桿菌は、肝膿瘍を引き起こすグラム陰性菌で、台湾における糖尿病患者では重篤な病気となりつつある。図62は、C1およびC14がともに、注射後、マウスの肺および肝臓において細菌負荷を有意に低下させうることを示している。BALB/cBylメスマウスに、単回投薬量の生きた肺炎桿菌を強制経口投与した。細菌感染させてから4時間後と8時間の2回、100μg/kgの対照、α−GalCer、またはα−GalCer類似体C14をマウスに注射した。注射した24時間後、各マウスから肝臓と肺を採集して、ホモジナイズした。細菌数は、上記のようにして測定した。
肺炎桿菌は、肝膿瘍を引き起こすグラム陰性菌で、台湾における糖尿病患者では重篤な病気となりつつある。図62は、C1およびC14がともに、注射後、マウスの肺および肝臓において細菌負荷を有意に低下させうることを示している。BALB/cBylメスマウスに、単回投薬量の生きた肺炎桿菌を強制経口投与した。細菌感染させてから4時間後と8時間の2回、100μg/kgの対照、α−GalCer、またはα−GalCer類似体C14をマウスに注射した。注射した24時間後、各マウスから肝臓と肺を採集して、ホモジナイズした。細菌数は、上記のようにして測定した。
C14による細菌排除の程度は、図62に示されているように、C1による排除よりも高いことが分かった。
抗真菌効果
1型ヘルパーT細胞(TH1)媒介性免疫は、さまざまな感染性真菌に対する防御において決定的な役割を果たしている。さらに別の態様において、本開示に係るα−GalCer類似体を抗真菌療法に用いることができる。抗真菌薬を用いて、真菌によって引き起こされる感染症を治療し、免疫系が弱い患者において真菌性感染症が進行するのを防ぐことができる。真菌性感染症は、免疫抑制患者における罹患率および死亡率をもたらす主な要因の一つとなっている。
1型ヘルパーT細胞(TH1)媒介性免疫は、さまざまな感染性真菌に対する防御において決定的な役割を果たしている。さらに別の態様において、本開示に係るα−GalCer類似体を抗真菌療法に用いることができる。抗真菌薬を用いて、真菌によって引き起こされる感染症を治療し、免疫系が弱い患者において真菌性感染症が進行するのを防ぐことができる。真菌性感染症は、免疫抑制患者における罹患率および死亡率をもたらす主な要因の一つとなっている。
真菌性疾患に対する宿主の先天的防御は、貪食細胞(PMNLおよびマクロファージ)の作用に基づいており、これらの細胞の数と機能はともに、コロニー刺激因子(CSF)によって調節することができる。一方、獲得防御は、抗原提示細胞、Tリンパ球、Bリンパ球、およびNKの間の相互作用を必要とする、IL−2およびIFN−γのようなサイトカインによって操作および調節される細胞性免疫および液性免疫を含む。日和見真菌に対する宿主防御においてサイトカインを介した免疫活性化が重要であるかもしれないことが、いくつかの研究対象となっており、カンジダおよびアスペルギルスによる感染症に対する新規の抗真菌戦略について、いくつか興味深い問題を提起してきた。サイトカインのさまざまな潜在的な役割については既述されている。まず、真菌およびそれらの抗原への曝露は、IL−2、IFN−γ、腫瘍壊死因子−α(TNF−α)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)の放出を誘導することができる。これらのサイトカインは、次に、カンジダ種およびアスペルギルス種に対する貪食細胞の抗真菌機能を活性化または促進することができる。
本開示に係るα−GalCer類似体を単独または抗真菌薬と併用して投与することによって行うことができる防御免疫応答刺激が望ましい感染性真菌の例は、以下のものを含むが、これらに限定されない:クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、ヒストプラズマ・カプスラーツム(Histoplasma capsulatum)、コクシジオイデス・イミティス(Coccidioides immitis)、ブラストマイセス・デルマティティディス(Blastomyces dermatitidis)、クラミジア・トラコマティス(Chlamydia trachomatis)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)。その他の感染性生物(すなわち、原生生物)は、プラスモジウム種(Plasmodium)、ライシュマニア種(Leishmania)、シストソ−マ種(Schistosoma)およびトキソプラズマ種(Toxoplasma)などである。
自己免疫疾患の免疫療法
自己免疫は、自己抗原および組織に向けられた炎症反応をもたらす、免疫系における調節の破綻が原因となっている。自己免疫疾患は、合衆国において、癌および心臓病に次いで第三位の最も一般的な病気のカテゴリ−であり、人口の約5%〜8%、すなわち1400万〜2200万人が罹っている。Tリンパ球による自己抗原の破壊を伴う自己免疫疾患には、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、および関節リウマチがあるが、これらに限定されない。
自己免疫は、自己抗原および組織に向けられた炎症反応をもたらす、免疫系における調節の破綻が原因となっている。自己免疫疾患は、合衆国において、癌および心臓病に次いで第三位の最も一般的な病気のカテゴリ−であり、人口の約5%〜8%、すなわち1400万〜2200万人が罹っている。Tリンパ球による自己抗原の破壊を伴う自己免疫疾患には、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、および関節リウマチがあるが、これらに限定されない。
現在の定説によれば、心筋炎などの炎症性自己免疫疾患は、主に、IFN−γを原型サイトカインとするTH1応答に一次的に起因するものであり;一方、IL−4が中心となるTH2応答は、自己免疫を軽減させると考えられている。本開示に係るα−GalCer類似体は、TH2に偏向した免疫原応答を開始するように設計することができるため、これらのα−GalCer類似体を自己免疫疾患用の免疫治療薬として用いることができる。
α−GalCerの糖脂質類似体、試薬、およびマウス
α−GalCer(C1)、および本開示に係る合成α−GalCer類似体を、Fujioら、(2006)J.Am.Chem.Soc.128:9022−9023;Xingら、(2005)Bioorg.Med.Chem.13:2907−2916;Kinjoら、(2005)Nature 434:520−525;Wuら、(2006)Natl.Acad.Sci.U.S.A 103:3972−3977;およびWuら、(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 102:1351−1356で既述された手法により、カラムクロマトグラフィ法によって合成および精製した。これらの文献は、参照して本明細書に組み込まれる。
α−GalCer(C1)、および本開示に係る合成α−GalCer類似体を、Fujioら、(2006)J.Am.Chem.Soc.128:9022−9023;Xingら、(2005)Bioorg.Med.Chem.13:2907−2916;Kinjoら、(2005)Nature 434:520−525;Wuら、(2006)Natl.Acad.Sci.U.S.A 103:3972−3977;およびWuら、(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 102:1351−1356で既述された手法により、カラムクロマトグラフィ法によって合成および精製した。これらの文献は、参照して本明細書に組み込まれる。
図2に示されているように、本開示にかかる合成α−GalCer類似体は、その化学構造に基づいて4つの群に分けられた。第I群:C2、C3、およびC14は、細菌起源のものである。第II群:C4、C5、およびC9は、セラミドへのO−結合の硫黄修飾(C4)、またはガラクトース部分の3”−OHにおける硫酸基(C5、C9)を含む。第III群:C6〜C8、C8−5、C8−6、C10〜C11、C15〜C16、およびC18〜C33は、それらのアシルテールにある芳香環で修飾されている。第IV群:C12、C13、およびC17は切断型フィトスフィンゴシンを含む。これら新たな類似体のうち、C10、C11、C16、C27、C28、C29は、脂肪アミド鎖がさまざまな長さのフェニル基で修飾されている(Ph);C18、C22は、フェニル環においてメトキシ基(−OMe)で修飾されている;C19、C23、7DW8−5は、フェニル環においてフルオリド基(−F)で修飾されている;C20、C24、7DW8−6は、フェニル環においてトリフルオロメチル基(−CF3)で修飾されている;C21、C25、C26は、フェニル環においてフェニル基(−Ph)で修飾されている;C30は、フェニル環において4’−フルオロフェニル基(−Ph−F)で修飾されている;そして、C17は、切断型フィトスフィンゴシンを含む。
スフィンゴ糖脂質化合物C12およびC13の合成が、略図1(図3)に要約されている。これらの化合物に関する特性データについては後述する。
化合物C13(lot.MFJ3−017−1):
ヒトNK細胞株、未成熟単球由来樹状細胞、およびNK/NKTの単離と生成
ナイーブVα24iNKT細胞を、間接的に抱合された抗Vα24iTCRマイクロビーズ(Miltenyi Biotec,USA)を用いて分離した。単離された細胞を50U/mlのIL−2(R&D system)存在下でインキュベートし、3日毎に新鮮な培地を補充した。α−GalCerまたはフェニル糖脂質でパルスされたVα24iNKTの生成を次のようにして行った。それぞれが磁気ビーズ(Miltenyi Biotec,Auburn,CA)に結合している抗Vα24iTCRmAbsおよび抗CD14mAbsを連続的に使用して、ロイコパック(leukopak)からVα24iNKT細胞およびCD14細胞を単離した。未成熟樹状細胞は、このCD14細胞から、300U/mlのGM−CSF(R&D Systems)および100U/mlのIL−4(R&D Systems)の存在下で2日間インキュベートした後生成した。2000ラドで照射した後、この未成熟樹状細胞を、10〜14日間、100ng/mlのα−GalCerまたはC11と50U/mlのIL−2(Invitrogen)の存在下で同系CD161と同時培養した。α−GalCerでパルスされたiNKT細胞、またはフェニル糖脂質でパルスされたiNKT細胞を生成させるために、それぞれ、100ng/mlのα−GalCerパルスされた照射未成熟樹状細胞またはC11パルスされた照射未成熟樹状細胞でVα24iNKT細胞を2度目に刺激した後。すべてのiNKT細胞株(ナイーブ株、α−GalCerでパルスされた株、またはフェニル糖脂質でパルスされた株)が、フローサイトメトリーによって、Vα24i T細胞抗原受容体(95%純度)を発現することが明らかにされた。NK細胞およびNKT細胞は、抗CD56マイクロビーズ(Miltenyi Biotec,USA)を用いて、ヒトロイコパックから単離した。
ナイーブVα24iNKT細胞を、間接的に抱合された抗Vα24iTCRマイクロビーズ(Miltenyi Biotec,USA)を用いて分離した。単離された細胞を50U/mlのIL−2(R&D system)存在下でインキュベートし、3日毎に新鮮な培地を補充した。α−GalCerまたはフェニル糖脂質でパルスされたVα24iNKTの生成を次のようにして行った。それぞれが磁気ビーズ(Miltenyi Biotec,Auburn,CA)に結合している抗Vα24iTCRmAbsおよび抗CD14mAbsを連続的に使用して、ロイコパック(leukopak)からVα24iNKT細胞およびCD14細胞を単離した。未成熟樹状細胞は、このCD14細胞から、300U/mlのGM−CSF(R&D Systems)および100U/mlのIL−4(R&D Systems)の存在下で2日間インキュベートした後生成した。2000ラドで照射した後、この未成熟樹状細胞を、10〜14日間、100ng/mlのα−GalCerまたはC11と50U/mlのIL−2(Invitrogen)の存在下で同系CD161と同時培養した。α−GalCerでパルスされたiNKT細胞、またはフェニル糖脂質でパルスされたiNKT細胞を生成させるために、それぞれ、100ng/mlのα−GalCerパルスされた照射未成熟樹状細胞またはC11パルスされた照射未成熟樹状細胞でVα24iNKT細胞を2度目に刺激した後。すべてのiNKT細胞株(ナイーブ株、α−GalCerでパルスされた株、またはフェニル糖脂質でパルスされた株)が、フローサイトメトリーによって、Vα24i T細胞抗原受容体(95%純度)を発現することが明らかにされた。NK細胞およびNKT細胞は、抗CD56マイクロビーズ(Miltenyi Biotec,USA)を用いて、ヒトロイコパックから単離した。
α−GalCer類似体でパルスされたヒトNKT細胞株の生成を、Fujiらの方法に従って行い、これらの細胞を用いて、試験されたα−GalCer類似体に対するサイトカイン応答を評価した(図5および図6参照)。未成熟DCは、300U/mlのGM−CSFおよび100U/mlのIL−4と2日間インキュベートした後のロイコパック中のCD14+細胞に由来していた。照射(3,000ラド)後、このiDCを、100ng/mlのα−GalCerおよび10U/mlのIL−2の存在下で自家性CD161+細胞と一緒に10日間培養した。この刺激を反復した後、NT細胞株が生成し、CD161+/CD3+/Vα24iTCR+(純度99%)を発現することが示された。ヒト単球に由来する未成熟DCを生成させるために、300U/mlのGM−CSFおよび100U/mlのIL−4の存在下でロイコパックの中のCD14+細胞を6日間培養した。これらのDCは、未成熟表現型(CD14−CD80+CD86+CD83weakHLA−DR+)を有し、成熟DCよりも高いCD1d発現を示した。このiDCに、3μg/mlのさまざまなα−GalCer類似体をパルスし、48時間後、それらの表現型および形態を調べた。
間接的に抱合した抗CD161マルチソート型マイクロビーズを用いて、TCR活性化実験(図19参照)に使用するナイーブNKT(CD161+/CD3+)を単離し、抗CD3マイクロビーズによってさらに分離した。この単離細胞を、100U/mlのIL−2の存在下でインキュベートし、3日毎に新鮮な培地を補充した。
インビトロ・ヒトNKT細胞サイトカイン分泌アッセイ
96ウェル平底プレートの中で、10μg/mlの本開示に係るα−GalCer類似体の存在下、Vα24iヒトNKT細胞(1×105)を5×104個の被照射未成熟CD14+DCと同時培養した。18時間後に採集された上清中のサイトカイン/ケモカインを、Beadlyte(登録商標)Human 22−plex Multi−Cytokine Detection Systemを用いて定量し、Luminex(登録商標)100TM装置によって測定した。
96ウェル平底プレートの中で、10μg/mlの本開示に係るα−GalCer類似体の存在下、Vα24iヒトNKT細胞(1×105)を5×104個の被照射未成熟CD14+DCと同時培養した。18時間後に採集された上清中のサイトカイン/ケモカインを、Beadlyte(登録商標)Human 22−plex Multi−Cytokine Detection Systemを用いて定量し、Luminex(登録商標)100TM装置によって測定した。
iNKTのインビトロにおける増殖
iNKT細胞増殖実験に使用されるヒトCD56+細胞(NK/NKT混合物)(図13および図14参照)を、抗CD56マイクロビーズを用いてヒトロイコパックから単離した。ヒトCD56+細胞(NK/NKT混合物)を、3μg/mlの表示されているα−GalCer類似体、または0.3%DMSOで、2日目に18時間パルスされたか(図13および14参照)、または10ng/mlもしくは100ng/mlで2日目に18時間パルスされた(図15参照)4×105個の自家性未成熟CD14+DCと培養した。3日目に、この懸濁細胞を新しい培養皿に移し、100U/mlのIL−2存在下で培養し、3日毎に新鮮な培地を補充した。NK/NKT混合物中のCD161+/Vα24TCR+細胞の集団を、フローサイトメトリーによって9日目にゲートし、Vα24iNKTの総数を計測した。
iNKT細胞増殖実験に使用されるヒトCD56+細胞(NK/NKT混合物)(図13および図14参照)を、抗CD56マイクロビーズを用いてヒトロイコパックから単離した。ヒトCD56+細胞(NK/NKT混合物)を、3μg/mlの表示されているα−GalCer類似体、または0.3%DMSOで、2日目に18時間パルスされたか(図13および14参照)、または10ng/mlもしくは100ng/mlで2日目に18時間パルスされた(図15参照)4×105個の自家性未成熟CD14+DCと培養した。3日目に、この懸濁細胞を新しい培養皿に移し、100U/mlのIL−2存在下で培養し、3日毎に新鮮な培地を補充した。NK/NKT混合物中のCD161+/Vα24TCR+細胞の集団を、フローサイトメトリーによって9日目にゲートし、Vα24iNKTの総数を計測した。
ヒトNKTのTCR活性化
一つの典型的な実施態様において、HeLa、HeLa−CD1d、または自家性iDCを、24穴プレート上で、10μg/mlのC1、C11、C13、もしくはC17、またはDMSOとともに2時間インキュベートしてから、3×105個のナイーブCD161+/CD3+NKTを加えた(図19参照)。別の典型的な実施態様において、HeLaまたはHeLa−CD1dに、100ng/mlのC1、C16、C23、C8−5、C8−6、もしくはC26、またはDMSOを2時間負荷してから、3×105個のナイーブCD161+/CD3+NKTを加えた(図20参照)。5〜10分間刺激した後、懸濁液中の細胞を試験管に移し、PBSで洗浄して、Beadlyte(登録商標)Cell Signaling Universal Lysis Bufferを用いて4℃にて溶解させた。ライセート中のリン酸化−CD3ε(ホスホ−チロシン)、リン酸化−ERK1/2(Thr185/Tyr187)、リン酸化−CREB(Ser133)、リン酸化−Syk(ホスホ−チロシン)、リン酸化−p38(THr180/Tyr182)、リン酸化−IκBα(Ser32)、リン酸化−Lck、リン酸化−Lat、リン酸化−STAT3(Ser727)、リン酸化−STAT5A/B(Tyr694/699)、およびリン酸化−Dap−70(ホスホ−チロシン)の濃度を、アッセイプロトコルに従って、Beadlyte(登録商標)Phosphoprotein Detection Systemによって評価し、Luminex100装置によって測定した。数値を総投入タンパク質の量で標準化した。
一つの典型的な実施態様において、HeLa、HeLa−CD1d、または自家性iDCを、24穴プレート上で、10μg/mlのC1、C11、C13、もしくはC17、またはDMSOとともに2時間インキュベートしてから、3×105個のナイーブCD161+/CD3+NKTを加えた(図19参照)。別の典型的な実施態様において、HeLaまたはHeLa−CD1dに、100ng/mlのC1、C16、C23、C8−5、C8−6、もしくはC26、またはDMSOを2時間負荷してから、3×105個のナイーブCD161+/CD3+NKTを加えた(図20参照)。5〜10分間刺激した後、懸濁液中の細胞を試験管に移し、PBSで洗浄して、Beadlyte(登録商標)Cell Signaling Universal Lysis Bufferを用いて4℃にて溶解させた。ライセート中のリン酸化−CD3ε(ホスホ−チロシン)、リン酸化−ERK1/2(Thr185/Tyr187)、リン酸化−CREB(Ser133)、リン酸化−Syk(ホスホ−チロシン)、リン酸化−p38(THr180/Tyr182)、リン酸化−IκBα(Ser32)、リン酸化−Lck、リン酸化−Lat、リン酸化−STAT3(Ser727)、リン酸化−STAT5A/B(Tyr694/699)、およびリン酸化−Dap−70(ホスホ−チロシン)の濃度を、アッセイプロトコルに従って、Beadlyte(登録商標)Phosphoprotein Detection Systemによって評価し、Luminex100装置によって測定した。数値を総投入タンパク質の量で標準化した。
インビトロCD1d−テトラマーアッセイ
製造業者のプロトコルに従い、1μgの可溶性二価マウスCD1d−IgG1融合タンパク質(マウスCD1d−IgG1テトラマー、BD Pharmingen)を、10モルの各α−GalCer類似体と、37℃および中性pHにて一晩インキュベートした。この糖脂質負荷CD1d−IgG1テトラマーを、マウスNKTと4℃にて60分間インキュベートした後、FITC−抱合抗マウスIgG1
mAbs(A85−1)とともにインキュベートした。この細胞も、PE抱合抗NKmAbsおよびAPC抱合抗CD3mAbs(BD Pharmingen)で表面染色した。
製造業者のプロトコルに従い、1μgの可溶性二価マウスCD1d−IgG1融合タンパク質(マウスCD1d−IgG1テトラマー、BD Pharmingen)を、10モルの各α−GalCer類似体と、37℃および中性pHにて一晩インキュベートした。この糖脂質負荷CD1d−IgG1テトラマーを、マウスNKTと4℃にて60分間インキュベートした後、FITC−抱合抗マウスIgG1
mAbs(A85−1)とともにインキュベートした。この細胞も、PE抱合抗NKmAbsおよびAPC抱合抗CD3mAbs(BD Pharmingen)で表面染色した。
マウス脾細胞の調製
表示されている本開示に係るα−GalCer類似体または賦形剤で処理されたBALB/cマウスを、注射した72時間後に殺処理した。脾臓を回収した。要するに、脾臓を70μmのストレーナーに押しつけて通し、赤血球を溶解させた後、有核細胞をハンクス液中に再懸濁し、4℃にて5分間、300gで遠心分離してから、FACS解析を行った。
表示されている本開示に係るα−GalCer類似体または賦形剤で処理されたBALB/cマウスを、注射した72時間後に殺処理した。脾臓を回収した。要するに、脾臓を70μmのストレーナーに押しつけて通し、赤血球を溶解させた後、有核細胞をハンクス液中に再懸濁し、4℃にて5分間、300gで遠心分離してから、FACS解析を行った。
マウス脾細胞亜集団の測定
表示されている本開示に係るα−GalCer類似体(2μg/マウス)または賦形剤(PBS中の1%DMSO)で処理されたBALB/cマウスを72時間後に殺処理し、脾臓を回収した。要するに、脾臓を70μmのストレーナーに押しつけて通し、赤血球を溶解させた後、有核細胞をハンクス液中に再懸濁し、4℃にて5分間、300gで遠心分離してから、FACS解析を行った。抗CD3e−アロフィコシアニン、抗CD4−PE、抗CD8α−アロフィコシアニン−シアニド−dye7、抗CD11c−アロフィコシアニン、抗CD23−PE、抗45R−アロフィコシアニン、抗CD69−FITC、抗CD80−FITC、抗CD86−PE、抗Ly6G−PE、およびU5A2−13Ag+−PEは、BD Bioscience−Pharmingenから入手した。
表示されている本開示に係るα−GalCer類似体(2μg/マウス)または賦形剤(PBS中の1%DMSO)で処理されたBALB/cマウスを72時間後に殺処理し、脾臓を回収した。要するに、脾臓を70μmのストレーナーに押しつけて通し、赤血球を溶解させた後、有核細胞をハンクス液中に再懸濁し、4℃にて5分間、300gで遠心分離してから、FACS解析を行った。抗CD3e−アロフィコシアニン、抗CD4−PE、抗CD8α−アロフィコシアニン−シアニド−dye7、抗CD11c−アロフィコシアニン、抗CD23−PE、抗45R−アロフィコシアニン、抗CD69−FITC、抗CD80−FITC、抗CD86−PE、抗Ly6G−PE、およびU5A2−13Ag+−PEは、BD Bioscience−Pharmingenから入手した。
マウス脾細胞のNKT亜集団およびNK亜集団の測定
表示されている本開示に係るα−GalCer類似体(0.1μg/マウス)または賦形剤(PBS中の0.1%DMSO)で処理されたBALB/cマウスを72時間後に殺処理し、脾臓を回収した。要するに、脾臓を70μmのストレーナーに押しつけて通し、赤血球を溶解させた後、有核細胞をハンクス液中に再懸濁し、4℃にて5分間、300gで遠心分離してから、FACS解析を行った。抗CD3e−アロフィコシアニンおよびNKマーカーであるU5A2−13Ag+−PEは、BD Bioscience−Pharmingenから入手した。
表示されている本開示に係るα−GalCer類似体(0.1μg/マウス)または賦形剤(PBS中の0.1%DMSO)で処理されたBALB/cマウスを72時間後に殺処理し、脾臓を回収した。要するに、脾臓を70μmのストレーナーに押しつけて通し、赤血球を溶解させた後、有核細胞をハンクス液中に再懸濁し、4℃にて5分間、300gで遠心分離してから、FACS解析を行った。抗CD3e−アロフィコシアニンおよびNKマーカーであるU5A2−13Ag+−PEは、BD Bioscience−Pharmingenから入手した。
血清サイトカイン/ケモカイン
賦形剤または本開示にかかる合成α−GalCer類似体を投与した0、2、18、36、48、および72時間後にマウス血清試料を採集した。さまざまなサイトカイン/ケモカインの血清中濃度を、Beadlyte(登録商標)Mouse 21−plex Cytokine Detection Systemによって測定し、Luminex(登録商標)100TM装置で読み取った。。
賦形剤または本開示にかかる合成α−GalCer類似体を投与した0、2、18、36、48、および72時間後にマウス血清試料を採集した。さまざまなサイトカイン/ケモカインの血清中濃度を、Beadlyte(登録商標)Mouse 21−plex Cytokine Detection Systemによって測定し、Luminex(登録商標)100TM装置で読み取った。。
マウスの肺癌モデル
C57BL/6マウス(6〜8週齢、メス)に、0.1mlのPBS中に懸濁された2×105個の同系肺癌(TC1)細胞をIV注射した。1時間したところで、C57BL/6マウス群(n=5)を、4週間にわたり週2回、表示されている本開示に係るα−GalCer類似体(マウスあたり2μg)または賦形剤をIV投与で処理した。体重を1月間記録し、生存しているかを50日間観察した。
C57BL/6マウス(6〜8週齢、メス)に、0.1mlのPBS中に懸濁された2×105個の同系肺癌(TC1)細胞をIV注射した。1時間したところで、C57BL/6マウス群(n=5)を、4週間にわたり週2回、表示されている本開示に係るα−GalCer類似体(マウスあたり2μg)または賦形剤をIV投与で処理した。体重を1月間記録し、生存しているかを50日間観察した。
マウスの乳癌モデル
BALB/Cマウス(6〜8週齢、メス)の背中の右下部に、2×105個の同系乳癌(4T1)細胞をSubQ接種した。BALB/cマウス群(n=6)を、腫瘍接種した3日後から4週間にわたり週2回、表示されている本開示に係るα−GalCer類似体または賦形剤をIVもしくはSubQで処理した。このα−GalCer類似体を、腫瘍接種部位の遠位にある部位に注射した。腫瘍容積を、長軸(a)、短軸(b)、および高さ(c)に沿ってノギスで測定して、1ヶ月間3日おきに記録した。腫瘍容積(mm3)をa×b×cの式により算出し、生存しているかを70日間観察した。
BALB/Cマウス(6〜8週齢、メス)の背中の右下部に、2×105個の同系乳癌(4T1)細胞をSubQ接種した。BALB/cマウス群(n=6)を、腫瘍接種した3日後から4週間にわたり週2回、表示されている本開示に係るα−GalCer類似体または賦形剤をIVもしくはSubQで処理した。このα−GalCer類似体を、腫瘍接種部位の遠位にある部位に注射した。腫瘍容積を、長軸(a)、短軸(b)、および高さ(c)に沿ってノギスで測定して、1ヶ月間3日おきに記録した。腫瘍容積(mm3)をa×b×cの式により算出し、生存しているかを70日間観察した。
マウスにおける腫瘍増殖のリアルタイム評価
Xenogen社のIVIS(登録商標)200シリーズ、およびLiving Image(登録商標)ソフトウェア(Xenogen,U.S.)によってマウスの画像を得て解析した。黒色腫モデルでは、C57BL/6マウス(6〜8週齢、メス)に、0.1mlのPBS中で懸濁した2×105個の同系黒色腫細胞(B16)を静脈内注射した。3日後、C57BL/6マウスの群(n=5)を、表示してある治療プロトコルに従って、表示されている糖脂質で静脈内から処理した。24日間3日おきに腫瘍容積を記録した。
Xenogen社のIVIS(登録商標)200シリーズ、およびLiving Image(登録商標)ソフトウェア(Xenogen,U.S.)によってマウスの画像を得て解析した。黒色腫モデルでは、C57BL/6マウス(6〜8週齢、メス)に、0.1mlのPBS中で懸濁した2×105個の同系黒色腫細胞(B16)を静脈内注射した。3日後、C57BL/6マウスの群(n=5)を、表示してある治療プロトコルに従って、表示されている糖脂質で静脈内から処理した。24日間3日おきに腫瘍容積を記録した。
フローサイトメトリー解析によるリンパ球の浸潤
対照マウスおよび糖脂質処理マウスから、腫瘍移植後21日目に無菌的に腫瘍を取り出し、培養ペトリ皿の中で手作業により2〜3mmの切片に切り分けた。そして、小さな組織片を、RPMI1640中0.01%のDNA分解酵素、0.01%のヒアルラニダーゼ(hyaluranidase)、および0.1%のコラーゲナーゼ(すべてSigma Chemical Co.製)によって、持続的に攪拌しながら、37℃で2〜3時間分解した。次に、得られた単一細胞懸濁液を、PBS中0.1%のFCSで2回洗浄し、標準的なフローサイトメトリー法により染色した。これらの組織を浸潤するリンパ球の亜集団を検出するために、以下の抱合抗体をFACSに使用した:FITC−抗CD3、PE−抗NK、APCCy7−抗CD8、(BD Biosciences PharMingen,San Diego,CA)。
対照マウスおよび糖脂質処理マウスから、腫瘍移植後21日目に無菌的に腫瘍を取り出し、培養ペトリ皿の中で手作業により2〜3mmの切片に切り分けた。そして、小さな組織片を、RPMI1640中0.01%のDNA分解酵素、0.01%のヒアルラニダーゼ(hyaluranidase)、および0.1%のコラーゲナーゼ(すべてSigma Chemical Co.製)によって、持続的に攪拌しながら、37℃で2〜3時間分解した。次に、得られた単一細胞懸濁液を、PBS中0.1%のFCSで2回洗浄し、標準的なフローサイトメトリー法により染色した。これらの組織を浸潤するリンパ球の亜集団を検出するために、以下の抱合抗体をFACSに使用した:FITC−抗CD3、PE−抗NK、APCCy7−抗CD8、(BD Biosciences PharMingen,San Diego,CA)。
免疫組織化学染色
2×105個のTC1腫瘍細胞をi.v注射され、3週間後殺処分されたB6マウスから肺小結節を取り出して、パラフィン包埋切片にした。厚さ3μmの切片を56℃のオーブンで一晩処理し、その後、脱パラフィンおよび熱による抗原回復(pH9のTris−EDTA緩衝液中、121℃で7.5分間)を行い、一般的なリンパ球抗原の指標としての抗CD45RA抗体(クローンRA3−6B2;BD Biosciences PharMingen,San Diego,CA)とともに、1:100の力価で4℃にて一晩インキュベートした。ホースラディッシュペルオキシダーゼを抱合した二次抗体およびDAB基質を加えることによって、結合した一次抗体を検出する。マウントする前に、すべての切片をヘマトキシリンで対比染色した。
2×105個のTC1腫瘍細胞をi.v注射され、3週間後殺処分されたB6マウスから肺小結節を取り出して、パラフィン包埋切片にした。厚さ3μmの切片を56℃のオーブンで一晩処理し、その後、脱パラフィンおよび熱による抗原回復(pH9のTris−EDTA緩衝液中、121℃で7.5分間)を行い、一般的なリンパ球抗原の指標としての抗CD45RA抗体(クローンRA3−6B2;BD Biosciences PharMingen,San Diego,CA)とともに、1:100の力価で4℃にて一晩インキュベートした。ホースラディッシュペルオキシダーゼを抱合した二次抗体およびDAB基質を加えることによって、結合した一次抗体を検出する。マウントする前に、すべての切片をヘマトキシリンで対比染色した。
統計学的解析
PRISMソフトウェアによるデータ解析のために、スチューデントの独立両面t検定を用いた。グラフは3回反復実験の平均値を示し、エラーバーはSDを表している。ログランク検定を用いて、各群の腫瘍防御の差異を解析した。p<0.05を、統計学的に有意であるとみなした。
PRISMソフトウェアによるデータ解析のために、スチューデントの独立両面t検定を用いた。グラフは3回反復実験の平均値を示し、エラーバーはSDを表している。ログランク検定を用いて、各群の腫瘍防御の差異を解析した。p<0.05を、統計学的に有意であるとみなした。
抗菌効果実験
α−GalCerの糖脂質類似体
抗細菌研究で使用されたα−GalCer類似体の構造が、図2のC3、C9、C11およびC14〜C17に示されている。α−GalCer類似体の保存液を、1mg/mlのDMSO溶液として調製した。使用前に、α−GalCer類似体をリン酸緩衝食塩水(PBS)で10μg/mlに希釈した。
α−GalCerの糖脂質類似体
抗細菌研究で使用されたα−GalCer類似体の構造が、図2のC3、C9、C11およびC14〜C17に示されている。α−GalCer類似体の保存液を、1mg/mlのDMSO溶液として調製した。使用前に、α−GalCer類似体をリン酸緩衝食塩水(PBS)で10μg/mlに希釈した。
動物および細菌
6〜8週齢のメスのC57L/6マウスおよびBALB/c−Bylマウスを研究に使用した。マウスを、自由に餌および水を摂ることができるプラスチック製ケージに収容し、実験開始の少なくとも1週間前に順応させた。スフィンゴモナス・カプスラータ細菌株(ATCC 14666)は、台湾のBCRCから得たものであった。肺炎桿菌株(NTUH−KP2044)は、台湾国立大学病院のJ.T.Wang博士から贈られたものである。
6〜8週齢のメスのC57L/6マウスおよびBALB/c−Bylマウスを研究に使用した。マウスを、自由に餌および水を摂ることができるプラスチック製ケージに収容し、実験開始の少なくとも1週間前に順応させた。スフィンゴモナス・カプスラータ細菌株(ATCC 14666)は、台湾のBCRCから得たものであった。肺炎桿菌株(NTUH−KP2044)は、台湾国立大学病院のJ.T.Wang博士から贈られたものである。
スフィンゴモナス・カプスラータ感染マウスを用いた抗細菌効力実験
6〜8週齢のメスC57BL/6マウスに、5×108個のスフィンゴモナス・カプスラータ細胞をIP注射した。マウスを、群あたり4〜6匹の処理群および対照群に分けた。感染の4時間後、処理群のマウスに、50μg/kgまたは100μg/kgの試験α−GalCer類似体をIP注射し、対照群のマウスには同じ体積のPBSを注射した。細菌感染の24時間後、すべての群のマウスを殺処理した。マウスから肝臓を取り出し、組織ホモジナイザーを用いて、0.9%NaCl、0.02%Tween80の中でホモジナイズした。肝臓ホモジネート中のスフィンゴモナス・カプスラータのコロニー形成単位(CFU)を、栄養培地プレート上で希釈試料を平板培養して測定した。37℃で48時間インキュベートした後、コロニー数を数えた。
6〜8週齢のメスC57BL/6マウスに、5×108個のスフィンゴモナス・カプスラータ細胞をIP注射した。マウスを、群あたり4〜6匹の処理群および対照群に分けた。感染の4時間後、処理群のマウスに、50μg/kgまたは100μg/kgの試験α−GalCer類似体をIP注射し、対照群のマウスには同じ体積のPBSを注射した。細菌感染の24時間後、すべての群のマウスを殺処理した。マウスから肝臓を取り出し、組織ホモジナイザーを用いて、0.9%NaCl、0.02%Tween80の中でホモジナイズした。肝臓ホモジネート中のスフィンゴモナス・カプスラータのコロニー形成単位(CFU)を、栄養培地プレート上で希釈試料を平板培養して測定した。37℃で48時間インキュベートした後、コロニー数を数えた。
肺炎桿菌感染マウスを用いた抗細菌効力実験
BALB/c−Bylメスマウス(一群あたり10匹)に、単回投与量(106CFU)の生きた肺炎桿菌を強制経口投与した。処理群のマウスには、細菌に感染させた4時間後および8時間後の2回、100μg/kgの試験α−GalCer類似体を注射した。対照群のマウスには、4時間目および8時間目にPBSを注射した。感染の24時間後に、すべてのマウスを殺処理した。各マウスから肝臓および肺を採集してホモジナイズした。上記と同様に細菌数を測定した。
BALB/c−Bylメスマウス(一群あたり10匹)に、単回投与量(106CFU)の生きた肺炎桿菌を強制経口投与した。処理群のマウスには、細菌に感染させた4時間後および8時間後の2回、100μg/kgの試験α−GalCer類似体を注射した。対照群のマウスには、4時間目および8時間目にPBSを注射した。感染の24時間後に、すべてのマウスを殺処理した。各マウスから肝臓および肺を採集してホモジナイズした。上記と同様に細菌数を測定した。
統計学的解析
試験α−GalCer類似体の相対的効力を、処理群の器官CFUの値を対照群の値と比較して示し、また効力の有意性を、それぞれ0.05または<0.01のp値で示した。
試験α−GalCer類似体の相対的効力を、処理群の器官CFUの値を対照群の値と比較して示し、また効力の有意性を、それぞれ0.05または<0.01のp値で示した。
Claims (46)
- 以下の工程を含む、被検対象におけるサイトカイン応答を活性化させる方法:
有効量の化合物を被検対象に投与する工程であって、該被検対象は、少なくとも一つのリンパ球および少なくとも一つの抗原提示細胞を含む細胞集団を含む適応免疫系を有し、該化合物は、下記の化学式1の構造で表される化合物、またはその薬学的に許容される塩である工程:
該化合物と該抗原提示細胞との間に複合体を形成させる工程であって、該複合体形成が、該リンパ球上の受容体を活性化させる工程;および
リンパ球を活性化させてサイトカイン応答を生じさせる工程。 - 前記サイトカイン応答が、TH1サイトカインを産生させるTH1型サイトカイン応答である、請求項1記載の方法。
- 前記TH1サイトカインが、IFN−γ、IL−1β、IL−2、IL−3、IL−8、IL−12、IL−15、TNF−α、GM−CSF、RANTES、MIP−1α、およびMCP−1からなる群から選択される、請求項2記載の方法。
- 前記サイトカイン応答が、TH2サイトカインを産生させるTH2型サイトカイン応答である、請求項1記載の方法。
- 前記TH2サイトカインが、IL−4、IL−6、IL−8、IL−10、IL−13、RANTES、MIP−1α、およびMCP−1からなる群から選択される、請求項4記載の方法。
- 化合物の投与が、皮下投与、静脈内投与、鼻腔内投与、または筋肉内投与によって行われる、請求項1記載の方法。
- 前記少なくとも一つのリンパ球がTリンパ球である、請求項1記載の方法。
- 前記Tリンパ球がナチュラルキラーT細胞である、請求項7記載の方法。
- 前記ナチュラルキラーT細胞がインバリアントナチュラルキラーT細胞である、請求項8記載の方法。
- 前記少なくとも一つの抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項1記載の方法。
- 前記樹状細胞が、未成熟樹状細胞または成熟樹状細胞である、請求項10記載の方法。
- 前記化合物が、抗原提示細胞上のCD1分子と複合体を形成する、請求項1記載の方法。
- 前記CD1分子がCD1d分子である、請求項12記載の方法。
- 前記Tリンパ球上の受容体がT細胞受容体である、請求項7記載の方法。
- 少なくとも一つの別のリンパ球を刺激して、サイトカイン応答を生じさせる工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 前記少なくとも一つの別のリンパ球がTヘルパー細胞である、請求項15記載の方法。
- 前記化合物の投与によって、被検対象の適応免疫系において細胞集団の増殖がもたらされる、請求項1記載の方法。
- 被検対象が、癌または感染症を患っている、請求項2記載の方法。
- 被検対象が、自己免疫疾患を患っている、請求項4記載の方法。
- 以下のものを含むワクチン:
有効量の化合物であって、該化合物が、以下のものからなる群から選択されるもの:
ワクチン成分。 - 前記ワクチン成分が、死滅微生物、弱毒化生ウイルス微生物、類毒素、および不活化微生物もしくは弱毒化微生物の断片からなる群から選択される、請求項20記載のワクチン。
- 前記微生物が細菌または真菌である、請求項21記載のワクチン。
- 前記類毒素が破傷風またはジフテリアである、請求項21記載のワクチン。
- ワクチン成分が、ワクチンを投与された被検対象において、免疫応答を誘導することができる、請求項20記載のワクチン。
- 化合物が、免疫アジュバントとして働き、免疫系を刺激することによって、ワクチン成分によって誘導される免疫応答を修正または増強することができ、該化合物がない場合よりも活発にワクチンに応答する被検対象をもたらす、請求項24記載のワクチン。
- 前記被検対象が、皮下投与、静脈内投与、鼻腔内投与、または筋肉内投与によってワクチンの投与を受ける、請求項24記載のワクチン。
- 有効量の化合物を投与する工程を含む抗腫瘍免疫療法であって、該化合物が、以下のものからなる群から選択される化合物または薬学的に許容されるそれらの塩である方法:
- 投与が、少なくとも一つの癌、癌のリスク増加、または前癌性前駆体に基づいて行われる、請求項27記載の方法。
- 化合物の投与によって、少なくとも一つの腫瘍細胞または癌細胞において応答が誘導される、請求項28記載の方法。
- 前記誘導される応答が、腫瘍増殖の緩徐化である、請求項29記載の方法。
- 前記誘導される応答が、腫瘍の大きさの縮小である、請求項29記載の方法。
- 化合物の投与が、少なくとも一つのリンパ球を含む細胞集団を含み、誘導される応答が該細胞集団の増殖であるという適応免疫系をもたらす、請求項27記載の方法。
- 前記適応免疫系における細胞集団の増殖が、T細胞、CD8 T細胞、NK細胞、またはNKT細胞の数の増大である、請求項32記載の方法。
- 前記化合物が添加されている癌ワクチンを提供する工程をさらに含む、請求項27記載の方法。
- 前記癌が、肺癌、乳癌、肝臓癌、白血病、固形腫瘍、および癌腫からなる群から選択される、請求項28記載の方法。
- 被検対象を抗菌免疫治療する方法であって、化合物が、以下のものからなる群から選択される化合物または薬学的に許容されるそれらの塩の有効量を投与することを含む、方法:
- 投与が、微生物性病原体の存在によって引き起こされる感染症に基づいている、請求項36記載の方法。
- 前記微生物性病原体が、ウイルス、細菌、真菌、原生生物、多細胞寄生生物、および異常型タンパク質からなる群から選択される、請求項37記載の方法。
- 前記微生物性病原体がウイルスである、請求項38記載の方法。
- 前記ウイルスが、レトロウイルス科、ピコルナウイルス科、カリシウイルス科、トガウイルス科、フラビウイルス科、コロナウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブンガウイルス科(Bungaviridae)、アレナウイルス科、レオウイルス科、ビルナウイルス科、ヘパドナウイルス科、パルボウイルス科、パポバウイルス科、アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、およびイリドウイルス科からなる群から選択される、請求項39記載の方法。
- 前記微生物性病原体が細菌である、請求項38記載の方法。
- 前記細菌が、ピロリ菌(Helicobacter pylori)、ライム病ボレリア(Borellia burgdorferi)、レジオネラニューモフィリア菌(Legionella pneumophilia)、肺炎桿菌、マイコバクテリア種、黄色ブドウ球菌、淋菌、髄膜炎菌、リステリア菌、化膿連鎖球菌、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、連鎖球菌、大便連鎖球菌、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、肺炎連鎖球菌、病原性カンピロバクター種、エンテロコッカス種、クラミジア種、インフルエンザ菌、炭疽菌(Bacillus antracis)、ジフテリア菌、コルネバクテリウム種、ブタ丹毒菌、ウェルシュ菌(Clostridium perfringers)、破傷風菌、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)、肺炎桿菌、パスツレラ・ムルトシダ(Pasturella multocida)、バクテロイデス種、フソバクテリウム・ヌクレアタム(Fusobacterium nucleatum)、モニリホルム連鎖桿菌(Streptobacillus moniliformis)、梅毒トレポネーマ、トレポネーマ・ペルテニュ(Treponema pertenue)、レプトスピラ属、イスラエル放線菌(Actinomyces israelii)、スフィンゴモナス・カプスラータ(Sphingomonas capsulata)、および野兎病菌からなる群から選択される、請求項41記載の方法。
- 化合物を被検対象に投与すると、該化合物を投与されなかった被検対象と比較して細菌除去が促進される、請求項41記載の方法。
- 化合物を投与すると、微生物因子の死滅がもたらされる、請求項37記載の方法。
- 化合物を投与すると、増殖することができなくなる微生物因子がもたらされる、請求項37記載の方法。
- 以下の化学式2によって表される化合物:
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