TW200911274A - Alpha-galatosyl ceramide analogs and their use as immunotherapies - Google Patents

Description

200911274 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種α-半乳糖神經醯胺（a_GaiCer ) 類似物，及其於免疫治療之用途。 【先前技術】 自然殺手T細胞（NKT細胞）係一具有獨特性質 的T淋巴球亞群’包括它會對CDld所呈獻之合成性醋 脂質有反應’且會表現一 T細胞抗原受器不變鏈 (invariant TCR α chain )。ΝΚΤ細胞與已有功能性分化 ，習知〇Φ T細胞不同，它們有自體反應性 (autoreactwe)，且在其配位體（ligand)的 下合 生TH1型，Th2型反應。NKT細胞的異常活化可能^使 ίΞϋΐΐ，或受到刺激。舉例㈣，—般認為曰¥ 劑活性有所關連，而Τη2細胞激素的生產：丄g 疫疾病。因為ΝΚΤ細胞在免疫系統中扮二了調 色，所以在免疫治療中，它們會是报好的目標。D玉、 【發明内容】 在一實施態樣範例中，可能是俥用 來刺激 DC 細 或者在另貝施恶樣範例中，使用介白素 在另一實絲樣範财，這會提高存^而 在一實施態樣範例中，在本發明 DC細胞可能會表現出骨髓系―方的〜 CD11C;或者在另-實施態樣範例中，該以 5 200911274 器-a (IL-3Ra)鏈（CD123)。在另一實施態樣範例中， DC細胞可能會產生第I型干擾素（IFN )。在一實施態 樣範例中，在本發明之方法中所用的DC細胞會表現出 共刺激分子（costimulatory molecule )。在另一實施態樣 範例中，在本發明之方法中所用的DC細胞可能會表現 出其他黏附分子（adhesion molecule);這些黏附分子在 一實施態樣中可能是作為額外的共刺激分子；或者在另 一實施態樣中透過本發明之方法進行遞送時，這些黏附 分子可能是用來把DC細胞導引到活體内的特定位置， 如下文進一步所述。 在一實施態樣範例中’在本發明之方法中所用的 樹突細胞可能會表現出CD83 ( —種胞吞型受器），來增 加自體抗原（如DEC-205/CD205)的攝入；在一實施^ 樣中’前述自體抗原為DC-LAMP (CD208)細胞表^ 標記；或者在另一實施態樣中，前述自體抗原為會呈獻 第I類及第II類MHC產物之抗原，且其量不定；或者 在另一實施態樣中，前述自體抗原為輔助分子（a(xess〇ry molecule，為黏附分子及共刺激分子），包括CD4()、 CD54、CD58或CD86、或其任何組合。在另一實施態 樣中，前述樹突細胞可能會表現出 或CD32 ’且其量不定。 在一實施態樣範例中，係在本發明之方法中使用 樹突細胞。在一實施態樣中，「成熟的樹突細胞」 =糸指CD115、CD14、CD68或CD32之表現減弱的 檢^二胞群；或在另一實施態樣中，係指CD86之表現 細胞群；或其組合。在另一實施態樣中，成熟的 =亡=胞具有P55、CD83、cmo或CD80或其組合當 或多種標記同時表現增加的情形。在另一實施態樣 中，本發明之方法所用的樹突細胞表面會有DEC_205受 6 200911274 器的表現。在另一實施態樣中，DC細胞的成熟可以透 過下列各種方式來達成，如CD40的接合（ligation)、 CpG寡去氧核糖核苷酸的加入（addtion)、或IL-1、 TNFa、或類 TOLL 受器配位體（TOLL like receptor ligand )的接合、細菌性脂多醣或多聚醣的加入、或細 胞内路徑（如TRAF-6或NF-κΒ)之活化。 在一實施態樣範例中，誘發DC細胞成熟可能會與 一預先選擇之抗原的胞吞型受器遞送一併進行。在一實 施態樣中，抗原之胞吞型受器的遞送可以透過DEC-205 受器來進行。 在一實施態樣範例中’可以確認樹突的成熟狀 態，舉例來說，藉由偵測一或多種下列情形來加以確 認：1) p55、CD83、CD40或CD86抗原當中一或多種的 表現增加；2) CD115、CD14、CD32或CD68抗原的喪 失；或3)回復為巨嗟細胞表現型，其特徵為黏附增加、 紗狀構造（veils)喪失，之後使得會促進pBMC細胞成 热的細胞激素移到未成熟的樹突細胞中，以上係藉由在 所屬領域中眾所周知之方法來進行偵測，如免疫^織化 學分析、FACS分析及其他方法。 、、 在一實施態樣中，NKT細胞的擴增具有抗原專一 性。在一實施態樣中，在培養物中供給本發明之a_GalCer 類似物的同時，亦使NKT細胞與樹突細胞接觸。在另 一實施態樣中，係使已處理過抗原的樹突細胞與NKT 細胞接觸。 〃 在一實施態樣範例中，「與目標細胞接觸」一詞在 本文中係指細胞直接及間接暴露於目標物兩種情形。在 一實施態樣中，NKT細胞與本發明之似物、 細胞激素、生長因子、树突細胞、或其組合的接觸是直 200911274 接或間接接觸。在一實施態樣中，與細胞接觸可能包含 透過所屬領域眾所周知之任何裝置來直接注射細胞（如 微注射）。在另一實施態樣中，亦能想見將之間接提供 給細胞的情形，如透過環繞在細胞四周的培養基、戒遂 過對患者投藥、或透過所屬領域眾所周知之任二徑來 提供，其如下文所述。 、以抗原促發（priming)樹突細胞的方法係所屬領 域具有通常知識者眾所周知的知識，且可能會受到如下 列所述的景>響· Hsu et al.，Nature Med. 2:52-58 (1996)成 Steinman et al.之國際專利申請案 pCT/US93/〇3141。 在一實施態樣中’係對患者投予a_GaiCer類似 物；而在另一實施態樣中，係將a_GalCer類似物導向刻 樹突細胞，在活體内攝入，如下文所述之方法。 在一實施態樣中，a_GalCer類似物的攝入及[處理] t在21小時以内進行；或者在另—實施態樣中，所需 牯間可能較長，如大於等於4天；或者在另一實施態樣 中，所需時間可能較短，如約U小時。 、在f 一±實施態樣中，對樹突細胞而言，本發明之 $法中藉由樹突細胞來進行擴增的ΝΚτ細胞係自體 autogeneic )、同系（Syngeneic )或異體（an〇geneic ) 的細胞。 在一實施態樣中，ΝΚΐ細胞可用一種疾病專一性 的方式來調節免疫反應。應了解，任何—種免疫反應部 是2要增加細驗*生產或引發特定纟讀激素（包括千 擾” γ ;丨白素_2及/或介白素-4) ’所以可以使用本發 明之ΝΚΤ細胞，並顯示為本發明之一實施態樣。 在另一實施態樣中’本發明之方法可進一步含有 8 200911274 刀離之Νκτ細胞與額外的樹突細胞及本發明 Γ 類似物一起培養—段時間的步驟，而進—步引 起 T細胞擴增、細胞激素生產、或其組合。 在另一實施態樣中，本發明提供一種在患者 病的發生、減少疾病發生率或壓制疾病的方法， 有下列步驟：使培養之Νκτ細胞與樹突細胞及本 ^月之cx-GalCer類似物接觸一段時間，使Νκτ細胞 :沾=胞激素生產、或其組合；以及對患者投予由是^ ，的NKT細胞，其中前述Νκτ細胞會在患者身上 ^病的發生、減少疾病發生率錢制疾病，從而在患^ 身上延遲疾病的發生、減少疾病發生率或壓制疾病二 ㈣JV"實施態樣範例中’本發明中對患者投予的細 胞可此疋以組成物形式來提供。在一實施態樣中， t成物可能是非經口投予或靜脈内投予。在一實施 t ’所投予的組成物可能是滅菌溶液；或者在其他二】 怂，中，其係水溶液或非水溶液、懸浮液或乳化液= 貫施悲樣中，前述組成物可能含有丙二醇、聚乙— 醇、可注射之有機酯類如油酸乙酯（ethyl oleate) t ，精類（cyclo—)。在另一實施態樣中，該 = 亦可含有潤溼劑、乳化劑及/或分散劑。在另一實施離 =該組成物亦可含有滅g水或任何其他滅g的可= 二貝。在另一實施態樣令，該組成物可含有所屬領夏 有通常知識者眾所周知而可用於本文所述之一些 m(如維生素〇、抗氧化劑等），其中會需要免疫ί 應的刺激，如下文進一步所述者。 又夂

明夕施態樣中，可透過注射來對患者投予本菸 月之α-GalCer類似物、細胞、疫苗或組成物。在—* X 態樣中，可藉由所屬領域已知之任城置來進行注f 9 200911274 舉例來說’其可包括淋巴内注射、或SubQ注射。 在一實施態樣中，本發明之α-GalCer類似物係以 穩定狀態在活體内被送至樹突細胞中；在另一實施態樣 中，則會使疾病專一性之NKT細胞擴增。在一實施態 樣中’類似物係以穩定狀態進行遞送，如Bonifaz, et al. (2002) Journal of Experimental Medicine 196: 1627-1638 ； Manavalan et al. (2003) Transpl Immunol. 11: 245-58所述。 在另一實施態樣範例中，選擇能夠在活體内促發 (prime ) NKT細胞的樹突細胞類型。 在另一實施態樣範例中，本發明提供一種調節不 當或不良免疫反應的方法。在一實施態樣中，前述免疫 反應的標§己是對宿主不利之細胞激素。 在一實施態樣範例中，可在對接受者投予本發明 之ΝΚΤ細胞的同時進行特定疾病的治療，如同時進行 標準抗癌療法’作為特定癌症的附屬治療。在另一實施 態樣中，可在進行其他治療之前投予本發明之ΝΚΤ細 胞。 在另一實施態樣範例中，本發明提供一種調節針 對病原體感染之免疫反應的方法，前述免疫反應對患者 來說不具保護性。 在另一實施態樣範例中，前述免疫反應會引發不 利於宿主的細胞激素。在一實施態樣中，前述細胞激素 會使疾病惡化。在一實施態樣中，係在TH1反應對宿主 (如瘤型麻瘋(lepromatous leprosy)的宿主）有利時，啟 動了 TH2反應。在另一實施態樣中，則是在患者（如對 蛋抗原有反應之血吸蟲病（schistosomiasis)患者）身上啟 200911274 動並持續產生Th1反應。 在另一實施態樣範例中’本發明提供/種在患者 身上活化細胞激素反應的方法，係投予一有效量之化合 物或其鹽或其混合物’其中前述化合物係送自由 C2-C8、C8-5、C8-6及C9-C33所組成之組群，而前述 患者之後天免疫系統包括一細胞群，且前述細胞群包括 至少一種淋巴球及至少一種抗原呈獻細胞；由前述化合 物與前述抗原呈獻細胞形成一複合物，其中前述複合物 之形成會使前述淋巴球上的受器活化；以及活化前述淋 巴球，以產生前述細胞激素反應。 在本方法之一些觀點中，前述至少一種淋巴球為T 淋巴球；且在一些例子當中，前述Τ淋巴球為自然殺手 Τ細胞。在一些實施例中，前述自然殺手Τ細胞為不變 型自然殺手 Τ 細胞（invariant Natural Killer T cell) ° 在一些觀點中’前述至少一種抗原呈獻細胞為樹 突細胞。在一些實施例中，前述樹突細胞為未成熟或成 熟的樹突細胞。 在本方法的一些觀點中，其中前述化合物的投予 係藉由下列方式來完成：皮下投藥、靜脈内投藥、鼻内 投藥或肌肉内投藥。 在另一實施態樣範例中，前述化合物係與前述抗 原呈獻細胞上的CD1分子形成複合物。在一些實施例 中，前述CD1分子為CDld分子。在一些實施例中，前 述T淋巴球上的受器為丁細胞受器。在二些實施例中， 刺激至少另一種淋巴球，以產生前述細胞激素反應；在 一些實施例中，前述至少另一種淋巴球為辅助τ細胞 (T helper cell)。 11 200911274 在本方法之一些觀點中，前述細胞激素反應為會 產生TH1細胞激素的τΗ1型細胞激素反應，其中前述 TH1細胞激素亦可選自由11；^彳、江-；^、11^2、11^3、江-8、 IL-12、IL-15、TNF-α、GM-CSF、RANTES、ΜΙΡ-1α及 MCP-1所組成之組群。 在本方法之一些觀點中’前述細胞激素反應為會 產生ΤΗ2細胞激素的Τη2型細胞激素反應，其中前述 Τη2 細胞激素亦可選自由 IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、 RANTES、MIP-la及MCP 1所組成之組群。 C22-C24、C26、 在一些實施態樣範例中，本發明提供一種疫苗， 其含有：一有效量之化合物或其鹽或其混合物，其中前 述化合物係選自由 C3、Cii、ci3-CM、C16-C18、C20、 :背丨在些貝把例中，前述疫苗劑係選自由死體微生 物、活體減毒病毒微生物、類毒素、及去活㈣遍夕

C8-5及C8-6所組成之組群；以及一疫 在已投予前…夕二：::二：™宙訓&列

12 200911274 係基於癌症、高度癌症風險或癌前前驅細胞當中至少— 種情形為之。在本方法之—錢點巾，前述化合物的投 予會在，瘤及癌細胞當中至少—種引發反應。在本方法 之-些觀點巾’前述被；丨發之反應是前述腫瘤的生長減 緩。在本方法之一些觀點中，前述被引發之反應是 腫瘤的尺寸縮小。

在本方法之一些實施態樣範例中，前述化合物的 投予會影響後天免疫系統，其中前述後天免疫系統包括 一細胞群，且前述細胞群包括至少一種淋巴球，而前述 被引發之反應係指前述後天免疫系統中的細胞群擴增。 在本方法之一些觀點中，前述後天免疫系統中的 細胞群擴增包括T細胞、CD8 T細胞、NK細胞或NKT 細胞的大，擴增。在一些觀點中，本方法包括：提供— 種添加了前述化合物的癌症疫苗。在本方法之一些觀點 中’如述癌症係選自由肺癌、乳癌、肝細胞瘤 (hepatoma )、血癌、固態瘤（s〇Ud tum〇r )及癌瘤 (carcinoma)所組成之組群。 在本方法之一些實施態樣範例中，對患者提供了 一種抗微生物免疫治療之方法，其含有：對患者投予一 有效量之化合物或其鹽或其混合物，其中前述化合物選 自由C9、Cll、C13-C16、C23及C30所組成之組群。 在本方法之一些觀點中，前述化合物的投予係基於病原 ，微生物，存在所引起之感染病為之。在本方法之一些 巧點中，前述病原性微生物劑係選自由病毒、細菌、真 囷原烛夕細胞寄生蟲及異常蛋白（aberrant protein ) 所組成之組群。在本方法之一些觀點中，前述病原性微 生物劑為病毒。在本方法之一些觀點中，前述病毒係選 自由下列各項所組成之組群：反轉錄病毒科 13 200911274 (Retroviridae)、小 RNA 病毒科（Picornaviridae)、杯 狀病毒科（Calciviridae)、披衣病毒科（Togaviridae)、 黃病毒科（Flaviridae)、冠狀病毒科（Coronaviridae)、 彈狀病毒科（Rhabdoviridae )、線狀病毒科（Filoviridae )、 副黏液病毒科（Paramyxoviridae )、正黏液病毒科 (Orthomyxoviridae)、布尼亞病毒科（Bungaviridae)、 沙狀病毒科（Arenaviridae )、呼腸孤病毒科 (Reoviridae )、雙核糖核酸病毒科（Biraaviridae )、肝 炎DNA病毒科（Hepadnaviridae)、小DNA病毒科 (Parvoviridae)、乳多空病毒科（Papovaviridae)、腺病 毒科（Adenoviridae)、疮療病毒科（Herpesviridae)、痘 病毒科（Poxviridae )及虹彩病毒科（Iridoviridae )的病 毒。在本方法之一些觀點中，前述病原性微生物劑為細 菌。在一些觀點中，本方法之細菌係選自由下列各項所 組成之組群：幽門螺旋桿菌（Helicobacter pylori)、伯氏 疏螺旋菌（Borrelia burgdorferi )、嗜肺性退伍軍人菌 (Legionella pneumophilia )、克雷白氏肺炎桿菌 (Klebsiella pneumoniae)、分枝桿菌屬（Mycobacterium sp.)、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus )、奈瑟氏 淋病雙球菌（Neisseria gonorrhoeae )、奈瑟氏腦膜炎雙 球菌（Neisseria meningitidis )、單核球增多性李斯特菌 (Listeria monocytogenes )、化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes)、無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae)、糞 鏈球菌（Streptococcus faecalis )、牛鏈球菌（Streptococcus bovis )、肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae )、病原 性彎曲桿菌屬（pathogenic Campylobacter sp.)、腸球菌 屬（Enterococcus sp.)、彼衣菌屬（Chlamydia sp‘）、流 行性感冒嗜血桿菌（Haemophilus influenzae )、炭疽桿菌 (Bacillus anthracis )、白喉棒狀桿菌（Corynebacterium 14 200911274 diphtheriae)、棒狀桿菌屬（Corynebacterium sp.)、紅斑 丹毒絲狀菌（Erysipelothrix rhusiopathiae )、產氣莢膜芽 孢梭菌（Clostridium perfringens )、破傷風芽孢梭菌 (Clostridium tetani )、產氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes)、敗血性巴氏桿菌（pasteureiia multocida)、 類桿菌屬（Bacteroides sp·)、具核梭形桿菌 (Fusobacterium nucleatum )、念珠狀鏈桿菌 (Streptobacillus moniliformis )、梅毒螺旋體（Treponema pallidum)、細弱螺旋體（Treponema pertenue)、鉤端螺 旋體（Leptospira )、以色列放線菌（Actinomyces israelii )、荚膜鞍氨醇單胞菌（sphingomonas capsules ) 及弗蘭斯氏兔熱菌（Francisella tularensis )。在本方法之 一些觀點中’對患者投予前述化合物的細菌清除率較未 對患者投予前述化合物的情形為高。在本方法之一些觀 點中，前述化合物的投予會使前述微生物劑死亡。在本 方法之一些觀點中，前述化合物的投予會使前述微生物 劑無法生長。 在一些實施態樣範例中，本發明係提供一種以式1 之結構表示的化合物：

其中 R 係選自（CH2)10Ph(/7-Ph-F)、（CH2)6Ph、 (CH2)8Ph 或（CH2)10Ph(p-〇Me)。 15 200911274 【實施方式】 除了在下文中作其他意義解釋者以外，所有科學 術語係如發明所屬領域具有通常知識者的理解而作其 原始意義解釋。如有爭議，應以本說明書之定義為主。 在本文中，「脂質（lipid)」一詞係指參與細胞訊息 傳遞路徑之任何一種脂溶性（親脂性）分子。 在本文中，「醣脂質（glycolipid)」一詞係指一種 與碳水化合物連結之脂質，其係作為細胞辨識用的標 記。 在本文中，「α-半乳糖神經醯胺（a-galactosyl ceramide)」及「a_GalCer」之用詞係指一種會刺激自然 殺手T細胞產生τ細胞輔助型（T helper )之TH1及th2 細胞激素的醣脂質。 在本文中，「多醣（glycan)」一詞係指一種多聚醣 (Polysaccharide)或募醋。在本文中，多醣亦指糖共輛 體（glycoconjugate)之碳水化合物部分，其中前述糖共 軛體係如醣蛋白、醣脂質、醣胜肽、醣蛋白質組 (glycoproteome)、肽多醋（peptid〇glycan)、脂多或

蛋白多醣（proteoglycan)。多醣通常僅由單醣間的〇-糖 苷鍵構成。舉例來說，纖維素是一種由卜丨冷鍵結之D_ 葡萄糖所組成的多醣（或者更特定地說，是一種葡聚糖 (glucan))，而幾丁質（chitin)是一種由p_M_鍵結之N_ 乙醯基-D-葡萄糖胺所組成的多醣。多醣可以是單醣殘基 之同型或異型聚合物，也可以是線型或分枝型。多醣可 與蛋白連結，如_蛋白及蛋白多醣。它們一般位於細胞 1表面。在真核生物中，〇_及沁鍵結之多醣非常普遍， 這類鍵結在原核生物中雖然較不常見，但也可以找到。 N-鍵結之多醣會與序列子（sequ〇n)中天冬醯胺酸的R 200911274 基氮（N)連結。前述序列子為Asn-X-Ser或Asn-X-Thr 序列，其中X係為任一胺基酸，但不為脯胺酸。 在本文中，「醣蛋白（glycoprotein)」一詞係指一 種以多醣進行共價修飾的蛋白。醣蛋白共有四個類型： 1) N-鍵結之醣蛋白、2) 0-鍵結之醣蛋白（黏蛋白）、3) 葡萄糖胺多醣（glucosaminoglycan，GAG，亦稱為蛋白 多骑）、4) GPI錨定（GPI-anchored)之多醣分子。大多 數的醣蛋白具有結構上的微小異質性 (micro-heterogeneity，在相同的糖基化位置中連結了多 種不同的多醣結構），以及結構上的巨大異質性 (macro-heterogeneity，有多種多醣連結的位置及類型）。 在本文中，「類似物（analog )」一詞係指一種結構 與另一化合物有關、但其化學及生物性質可能相當不同 的化合物，如藥物。 在本文中，「抗原（antigen )」一詞係定義為任何 可引發免疫反應的物質。 在本文中，「病原體（pathogen)」一詞係指一種會 在宿主身上引起疾病或病症的生物用劑。宿主的身體包 含許多以人類免疫系統形式來對抗一些常見病原體（如 肺囊蟲)的天然防禦。 在本文中，「免疫原（immunogen)」一詞係指一種 可誘發抗體產生之抗原或物質，如DNA疫苗。 在本文中，「免疫原性（immunogenicity)」一詞係 指免疫原、抗原或疫苗刺激免疫反應的能力。 在本文中，「免疫治療（immunotherapy )」一詞係 指一組基於調節免疫系統而達到預防及/或治療目的之 概念的治療策略。 17 200911274 在本文中’「CDld」一詞係指會表現在多種人類抗 原壬獻細胞表面之CD1 (分化鎮1 (cluster of differentiation 1))家族醣蛋白中的一個成員。由c〇ld 所呈獻之脂質抗原會活化自然殺手T細胞。CDld有一 道很深的抗原結合溝（antigen-binding groove )，是與酷 脂質抗原結合的部位。表現在樹突細胞上的CDld分子 可與醣脂質結合並呈獻醣脂質。 在本文中’後天免疫系統（adaptive immune system)」一詞係指會消滅病原性攻毒（challenge)的高 度特彳^系統性細胞（systemic cell)及其方法。這種後天 免疫系統的細胞是一種被稱之為淋巴球的白血球。B細 胞及T細胞則是淋巴球的主要類型。 在本文中’「T細胞（T cell)」一詞係指一群被稱 為淋巴球的白血球，在細胞性免疫（cell_mediated 愤演重要肖色。τ細胞與其賴型的淋巴 ，（^ Β細胞和ΝΚ細胞）可用其細胞表面__ 器（TCR)的特殊受器來區分。目前已知Τ細 二數種不同的亞群，每一種都有獨特的功能。輔助型 = 天免疫系統的「中間人」，-旦活化， ΪΪ Γ被稱為細胞激素的小型蛋白，它們 上V】，4反應的進行。依照其所接收的細 二二胞會分化為W、¥、ΤηΠ 或其他亞群，而分泌不同的細胞數素。 ceU Α在文!V「抗原呈獻細胞（——ing (MHC)複；^料細胞。 1細胞可用其TCR來辨識這籍％人 種.直肫r ί· . 種啜合物。APC細胞分成二 種·專職（_娜刪D或非專職（麵_prGfessi〇nai)。 18 200911274 樹突細胞（DC細胞）係一專職細胞群，且可藉由cm 將抗原呈獻給T細胞。在一實施態樣範例中，本發明之 方法所用的DC細胞可能是數種Dc亞群中的任二種； 在一實施態樣中，其係從淋巴系（lymph〇id)骨髓前驅 細胞（progenitor)分化而來；或者在另一實施態樣中， 係從骨髓系（myeloid)骨髓前驅細胞分化而來。 在本文中，「原態細胞（nalfve cell)」一詞係指未 分化之免疫系統細胞，如尚未特化來辨識專一性病原體 的CD4 T細胞。 在本文中’「自然殺手細胞（naturai killer cell)」 及「NK細胞」之用詞係指一種淋巴系細胞，其可為干 擾素所活化，而參與對抗病毒及其他細胞内病原體的先 天伤主防索。 在本文中，「自然殺手T細胞（naturai killer Teel卜 NKT細胞）」一詞係指一具有習知τ細胞及NK細胞兩 者之特徵/受器的T細胞亞群。這些細胞大多會辨識祚多 型性（non-polymorphic) CDld分子，這是一種會與自 體及外來脂質和醣脂質結合的抗原呈獻分子。NKT細胞 之TCR可辨識由CDld分子所呈獻（伴護(chaperoned)) 的醣脂質抗原。NKT細胞的主要反應是在刺激後快速分 泌細胞激素，包括IL-4、IFN-γ及IL-10，進而影響多種 免疫反應及致病過程。NKT細胞可以是同質的細胞群或 異質的細胞群。在一實施態樣範例中，前述細胞群玎以 是「非不變性NKT細胞（non-invariant NKT ce丨Is )」，其 可含有人類及小鼠骨髓、以及人類肝臟之T細胞群，舉 例來說’這些細胞會是CDld反應性之非不變性T細胞， 它們會表現多種TCR，且可產生大量IL-4及IFN-γ。最 為人所知的CDld依存性NKT細胞亞群會表現一 TCR-a 19 200911274 不變鏈。這些細胞係指第I型或不變性NKT細胞（iNKT 細胞）。這些細胞在人類（Va24i NKT細胞）及小l (Val4i NKT細胞）當中被保留下來（conserved )，會 參與許多免疫反應過程。 在本文中，「細胞激素（cytokine )」一詞係指許多 被分泌出來的小蛋白當中的任一種，它們會藉由影響免 疫細胞的分化過程來調控免疫反應的強度和時間，通常 與基因表現改變有關，而使前驅細胞變成一種獨特的特 化細胞類型。細胞激素多被稱為淋巴激素 (lymphokine )、介白素（interleukin )和趨化因子 (chemokine)，依其預定功能、分泌細胞、或作用標的 而定。舉例來說’常見的介白素包括但不限於：IL-12、 IL-18、IL-2、IFN-γ、TNF、IL-4 ' IL-10、IL-13、IL-21 及 TGF-β。 在本文中，「趨化因子（chemokine )」一詞係指多 種會在感染位置釋出之小型趨化性細胞激素當中的任 一種，它們會提供一種移動並活化淋巴球的方式。趨化 因子會將白血球吸引到感染位置上。趨化因子具有保留 性（conserved)半胱胺酸殘基，而分為四個群組。這四 個具有代表性趨化因子的群组是：C-C趨化因子 (RANTES、MCP-1、ΜΠΜα及 ΜΠΜβ)、C-X-C 趨化 因子（IL-8 )、C趨化因子（淋巴細胞趨化因子 (lymphotactin))及CXXXC趨化因子（神經趨化因子 (fractalkine))。 在本文中’「TH2型反應（TH2-type response)」一 詞係指一種細胞激素表現的模式，會使某些類型的細胞 激素、干擾素及趨化因子產生。典型的TH2細胞激素包 括但不限於：IL-4、IL-5、IL-6 及 IL-10。 20 200911274 ^ 在本文 _，ThI 型反應（THl-type response)」— 詞指一種細胞激素表現的模式，會使某些類型的細胞 激素、干擾素及趨化因子產生。典型的細胞激素包 括但不限於 IL-2、IFN-γ、GM-CSF 及 TNF-β。 在本文中’「TH1偏移（THl-biased)」一詞係指— 種免疫原性反應，其中TH1細胞激素及/或趨化因子之生 產增加的程度大於TH2細胞激素及/或趨化因子之生產。 、>在本文中，「抗原決定基（epitope)」一詞係定義 為抗原分子會與抗體或τ細胞受器之抗原結合位置接觸 的部分。 在本文中’「疫苗（vaccine)」一詞係指一種内含 抗原的製備物，其係由完整的致病有機體（死體或減毒 或這些有機體的部分（如蛋白、胜肽或多聚醣）所組成， 而用於賦予對抗該有機體所引起之疾病的免疫性。疫苗 =備物可以是天然的、合成的、或由重組DNA技術得 在本文中’「抗微生物（antimicr〇biai )」一詞係指 一種會殺害微生物（如細菌、真菌或病毒）或抑制Α 長的物質。 王 主在本文中’「類毒素（toxoid)」一詞係指一種細菌 毒素，其毒性已藉由化學處理（福馬林）或加熱處理來 減弱或抑制，同時又保有其他性質，典型如免疫原性。 在疫苗中使用類毒素，是要它們誘發對原始毒素的免疫 反，、或增加對另一種抗原的反應。舉例來說，破傷風 類毋素係源自破傷風芽孢梭菌•出如⑽丨）所 產生、且會引起破傷風的破傷風痙攣毒素 C tetanospasmin )。美國有許多血漿中心都使用破傷風類 毒素來開發富含血漿的疫苗。 、 21 200911274 在本文中’「DNA疫苗（DNA vaccine)」一詞係指 一種被引入細胞、之後被轉譯成專一性抗原蛋白的dna 構築體。 在本文中’「質體（plasmid )」-詞係指一種在染 色體外的可複製環狀DNA，其可用作選殖用載體。 在本文中’「微生物（microorganism及microbe」 一詞係指一種顯微（太小，所以人類裸眼無法看見）有 機體。微生物種類繁多，其包括但不限於：細菌及真菌。 在本文中’「免疫佐劑（immunologic adjuvant)」 一詞係指一種用於與免疫原結合的物質，會增強或改變 針對免疫原的免疫反應。在一實施態樣範例中，本發明 之α-GalCer類似物係用作免疫佐劑’來調整或增強疫苗 的效應’其係刺激被投予疫苗之患者的免疫系統，而使 之對疫苗產生較為劇烈的反應。 在本文中，「明釁佐劑（alum adjuvant )」一詞係指 一種具有免疫佐劑活性的鋁鹽。這種佐劑會吸收溶液中 的蛋白抗原，並使之沉澱；所得沉澱物會改善疫苗之免 疫原性’其係使抗原從接種位置上形成之疫苗儲存處緩 緩釋出而達成。 在本文中’「抗腫瘤之免疫治療活性劑（anti-tumor immunotherapy active agent )」一詞係指本發明之 α-GalCer類似物會抑制、減少及/或去除腫瘤。. 在本文中，「顆粒球-巨噬細胞集落刺激因子 (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor » GM-CSF )」一詞係指—種作為集落刺激因子的細胞激 素，其會刺激白血球的產生，特別是顆粒球（嗜中性球、 嗜鹼性球及嗜酸性球）、巨噬細胞、以及骨髓中作為血 22 200911274 小板前驅細胞之細胞。 在本文中’「抗原專一性（antigen specific)」〆詞 係指一細胞群的性質，在給予一特定抗原或抗原片段 後，會引起專一性細胞的增生。 在本文中’「流式細胞（flow cytometry )」或「FACS」 之用詞係指一種用來檢驗懸浮於流體束之顆粒或細胞 的物理及化學性質的技術，其係透過光學或電子偵測裝 置來進行。 除非另有註明，否則本文中的α-GalCer類似物或 合成性α-GalCer類似物，係指以α-半乳糖神經醯胺為主 的結構系合成性醣脂質類似物。 本文之胜肽中的胺基酸殘基縮寫如下：苯丙胺酸 為Phe或F ;白胺酸為Leu或L ;異白胺酸為lie或I ; 曱硫胺酸為Met或M;纈胺酸為Val或V;絲胺酸為Ser 或S ;脯胺酸為Pro或P ;酥胺酸為Thr或T ;丙胺酸為 Ala或A ;酪胺酸為Tyr或Y ;組胺酸為His或Η ;麩醯 胺酸為Gin或Q;天冬醯胺酸為Asn或Ν;離胺酸為Lys 或K，天冬胺酸為Asp或D ;麵胺酸為Glu或E ;半脱 胺酸為Cys或C ;色胺酸為Trp或W ;精胺酸為Arg或 R，以及甘胺酸為Gly或G。關於胺基酸的進一步描述， 請參見：Proteins: Structure and Molecular Properties by Creighton, T. E., W. H. Freeman & Co., New York 1983. 已知哺乳類及分枝桿菌之脂質是由人類CDla、 CDlb、CDlc及CDld來呈獻的。α-半乳糖神經醯胺是 一種在海生海綿dge/似 ⑽發現的脂質，也是目 前研究最廣泛的CDld配位體。現已顯示，以a-GalCer 對小鼠脾臟細胞進行活體外刺激會引起NKT細胞增 生，並會引起IFN-γ及IL-4的生產，這分別是TH1型及 23 200911274 Τ±Η^型反應。鼠類研究顯示，帶有α-GalCer之未成熟的 樹突細胞（iDC細胞）會快速地活化細胞，而已活化之 iNKT細胞會回頭誘發Dc細胞，使之完全成熟。 匕在一觀點中，本發明提供一系列a_GalCer類似物 的新顆脂質部分，其可與CD1分子之結合溝結合，而形 成CD1-類似物複合物。這些€〇1_類似物複合物係以τ 細胞文器可辨識的方式呈獻給CD1限定之τ細胞（NKT 細胞）’且能夠使TCR活化、使τΗ1及TH2細胞激素釋 出、並使NKT細胞擴增。在一實施態樣範例中，本發 明之α-GalCer類似物的設計係使之與CD1分子上和τΗ1 偏移之免疫原性反應有關的結合溝有強大的結合親和 力。在另一實施態樣範例中’本發明ia_GalCer類似物 的设汁係使之與CD1分子上和τΗ2偏移之免疫原性反應 有關的結合溝有強大的結合親和力。 在本發明之另一觀點中，a_GalCer類似物可用於 免疫治療。在一實施態樣範例中，a_GalCer類似物可用 於癌症免疫治療。在一實施態樣範例中’ a_GalCer類似 物可用於佐劑免疫治療。在另一實施態樣範例中， α-GalCer類似物可用於包括免疫作用（vaccinati〇n)在 内的抗微生物免疫治療。在又—實施態樣範例中， α-GalCer類似物可在自體免疫疾病的治療中用於免疫 抑制。 逶遲本發明_Sa-GalCer類似後進赶τ細胞受器辨識及 活化，以及所得之免疫反應 第一圖A為一示意圖，顯示了由CDld所呈獻之 醣脂質抗原的不變性NKT細胞辨識如何引起—連串的 連鎖反應。醣脂質抗原的脂質部分會插入CD1分子之疏 24 200911274 水性結合清，形成CD 1-抗原複合物，而可與NKT細胞 之T細胞受器（TCR)接觸，引起一連串與細胞激素、 赵化因子及共刺激分子有關的連鎖反應。細胞激素生產 之多樣性和程度的效應範圍报廣，從增強細胞性免疫 (TH1型反應）到抑制細胞性免疫（Th2型反應）都有。 第一圖B為一示意圖，顯示了由CDldK呈獻之本發明 α-GalCer或α-GalCer類似物的Νκτ細胞辨識如何刺激 快速的TH1及TH2細胞激素反應。在一實施態樣範例 中，TH1細胞激素反應會被啟動。在另一實施態樣範例 中’ TH2細胞激素反應會被啟動。在又一實施態樣範例 中，TH1及TH2細胞激素反應都會被啟動。 本發明之α-GalCer及合成性a_GalCer類似物的化 學結構係顯示於第二圖。本發明之a_GalCer類似物包括 細菌源之α-GalCer類似物（第I組：C2、C3及C14)、 經磺化修飾之α-GalCer類似物（第π組：C4、C5及C9)、 苯基-烷基鏈α-GalCer類似物（第in組：C6-C8、 C10-C1 卜 C15-C16、C18-C30、C8-5 及 C8-6)以及經植 物鞘氨醇（phytosphingosine )截短（truncated )之 a-GalCer 類似物（第IV組：C12、C13及C17)。第三圖顯示了 鞘糖脂（glycosphingolipid) α-GalCer 類似物 C12 及 C13 之合成範例。 在一觀點中’本發明之合成性a_GalCe]r類似物可 與CDld分子形成複合物。在另一觀點中，本發明之合 成性α-GalCer類似物可為NKT細胞之τ細胞受器所^ 識。在又一觀點中，本發明之合成性二物可 ^發TH1型、τη2型、或Th1型及Τη2型之反應。在— 實施態樣範例中，本發明之oc-GalCer類似物可在活體外 活化NKT細胞。在另一實施態樣範例中，本發明之 〇t-GalCer類似物可在活體内活化nkt細胞。只 25 200911274 本金明提供-種在心者身上刺激或增強細胞激素 生產的方法，該方法包括：投予患者任一種本發明之合 成性α-GalCer類似物，其中患者身上的NKT細胞會被 活化，^後與cc-GalCer類似物接觸，並啟動一細胞激素 反應。韵述細胞激素可為如干擾素( IFN-γ )或介白素 -4 (IL-4) ° 一 ’、 在一實施態樣範例中，係將鼠類12融合瘤（cDld_ 反應性Val4i T細胞融合瘤）培養於經mCDld塗覆之 96孔盤，並以100 ng/ml之對照組DMS〇、本發明之 a-GalCer ( C1 )或指定a-GalCer類似物加以衝擊 (pulse)。在18小時的培養後’測量釋出到組織培養基 中的IL-2，如第四圖所示。大多數本發明之a_QalCer類 似物所誘發的IL-2生產量會比a_GalCer更高。在檢驗本 發明之a-palC=類似物在活體外之人類原態nkt細胞 (CD161+CD3+)中引發細胞激素/趨化因子生產的時 候’也有類似的結果。將人類原態CD161+CD3+NKT細 胞與自體之未成熟的樹突細胞（CD14+DC細胞）共同 培養’並用10 pg/ml之對照物DMSO、本發明之a-GalCer 或指定α-GalCer類似物加以衝擊。培養μ小時後，測 篁釋入組織培養基的細胞激素，如第五圖所示。a_GaiCer 類似物可能能夠誘發TH1及TH2細胞激素的分泌。第五 圖A顯示了 IFN-γ及il-4的誘發，第五圖B顯示了 IL-2 及IL-6的誘發’而第五圖c顯示了 IL-12及IL-10的誘 發。第III組及第IV組的芳族化合物（特別是C11、C16 及C13)所誘發的iFN-γ分泌情形明顯地比a_GalCer更 向’其中所有ot-GalCer類似物所引發的IL-4都會比 α-GalCer略少。第六圖顯示了人類CD161+CD3+NKT細 胞之純度（上方圖）及IFN-y/IL-4比率，其值已用DMSO 對照組加以正規化（下方圖）。若以IFN/IL-4比率來表 26 200911274 現，C9、C12、C13、C14及所有第III組化合物的Th1 偏移較多；而Cl、C3、C4、C5、C8及C17的th2偏 移較多。在人類CD161+CD3+NKT細胞誘發細胞激素及 趨化因子的情形列示於第七圖。各個細胞激素的前五個 數值係以粗體字標示。有些測試的α-GalCer類似物所顯 示之趨化因子誘發情形會比a_GalCer更高；舉例來說‘， C13會使趨化因子急遽增加，如MIP-la、MCP-1、及 IL-8。而芳族化合物CIO、C11及C16所誘發的IL-3、 顆粒球-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF)及IL-15會 比較高。 胃 第八圖顯示了更多本發明之a_GalCer類似物在初 代原態人類iNKT細胞中引發細胞激素/趨化因子生產之 能力的活體外結果。初代原態人類iNKT細胞係與自體 之未成熟的DC細胞共同培養，並以對照組dms〇、 ot-GalCer 或指定a_GalCer 類似物（C11 及 C18_C29)加 以衝擊。如第八圖A所示，所測試的所有本發明之 α-GalCer類似物所誘發的ΙΝρ_γ分泌量都會比c丨更高。 α-GalCer類似物會誘發相當量的IL 4 (見第八圖b)。 α-GalCer類似物所誘發的Ι]ρΝ_γ/Ιί4比率（即th1/ τ 偏移）會比C1更高（見第八圖C)。α-GalCer類似^ C20、C24及C26在引發IFN々生產、引發較高之 IFN-Y/IL4比率及較高之正_2量方面的潛力明顯優於 α-GalCer類似物cu (見第八圖〇)。a_GalCer類. ，及C24，们乙七生產，且其所引發的江_6釋^

置會'比戶!測s式的其他…㈤⑸類似*更高（見第8圖E 及F)。第九圖顯示了 α-GalCer類似物C11及C18-C29 所引發的人類細胞擴增情形。a_GalCer類似 C20、C22 C24 及 C26_C2 cd = 燃丁細胞擴增情形明顯地比〇1及⑶更高。人類 27 200911274 第十圖顯示了原態及多種經α-GalCer類似物加以 衝擊之人類NKT細胞之間不同的IFN-γ分泌量。第十圖 A顯示了與未成熟CD 14+ DC細胞共同培養、且以對照 組DMSO、本發明之α-GalCer或指定α-GalCer類似物加 以衝擊後的人類原態iNKT細胞（Va24+ ) IFN-γ分泌情 形。第十圖B-D顯示了 a-GalCer類似物在三種不同來源 之iNKT細胞中引發的IFN-γ分泌情形：（B)人類原態 iNKT細胞、（C)經α-GalCer衝擊之iNKT細胞、以及 經C11衝擊之iNKT細胞。iNKT細胞係與HeLa-CDld 細胞共同培養、且以對照組DMSO、α-GalCer或指定 α-GalCer類似物加以衝擊18小時。第十圖E顯示了在 人類原態iNKT細胞、經α-GalCer衝擊之iNKT細胞及 經C11衝擊之iNKT細胞中不同的IFN-γ基準量。 第—圖顯示了本發明之α-GalCer類似物在不變 性人類原態NKT細胞所引發的TH1/ TH2細胞激素生產 情形。人類Va24+iNKT細胞係與自體之未成熟的CD14+ DC細胞共同培養、且以對照組DMSO、a-GalCer或指 定α-GalCer類似物加以衝擊18小時。第十一圖（A)顯示 了 IFN-γ的誘發情形，（B)顯示了 IL-4的誘發情形，而（c) 顯示了 IFN-y/IL-4比率，其值已用DMSO對照組加以正 規化。在原態人類Vct24+ iNKT細胞誘發細胞激素和趨 化因子的情形列示於第十二圖。 使用α-GalCer類似物來擴增並活化NKT lajfe 在一觀點中，本發明之合成性α-GalCer類似物可 擴增並活化NK細胞及iNKT細胞。因為已有文獻指出， 在帶有惡性腫瘤的患者身上，人類周邊血液單核細胞中 的iNKT細胞數目會減少，因此，以本發明之a-GalCer 28 200911274 類似物使這類患者的iNKT細胞擴増及活化 實施態樣範例中’本發明之“二 類似物可在活體外擴增人類iNKT細胞。 本發明提供一種會產生一經分離、 NKT細胞群的方法，其含有：使Val4i、/=== 胞與樹突細胞及本發明之a_GalCer類似^接觸一段時 間，使類似物專-性之T細胞擴增；8J 之已擴增的τ細胞，從而產生-經分離 NKT細胞群。在-實施態樣範例中，冑述產生一、經分 離、培養-擴增之NKT細胞群的方法進一牛人 驟：在樹突細胞、N K T細胞培養物中添加=^激素或1 長因子。 人類CD56+細胞（NK/NKT細胞混合物）係與自體 之未成热的CD14 DC細胞共同培養、且以dms〇、本 發明之cc-GalCer或多種α-GalCer類似物加以衝擊。在暴 路後第9天，以流式細胞法來測定nk細胞及NKT細 胞、以及NKT細胞亞群iNKT細胞（CD161+/V(x24+/ CD56 /CD3 )之擴增/存活。如第十三圖及第十四圖所 示，在C2、C8-C12及C15-C16的刺激之下，iNKT細 胞的增加會比對照組更加明顯。在所測試的α-GalCer類 似物中，有數種第III組的芳族化合物（尤其是C11、 C15及C16)會比C1更加有效。 如第十五圖所示，人類CD56+細胞（NK/NKT混合 物）係與自體之未成熟的CD14+ DC細胞共同培養’且 以10或100 ng/ml DMSO、本發明之α-GalCer或多種 oc-GalCer類似物於第2天加以衝擊18小時。NK/NKT 混合物中的CD161+/Va24 TCR+細胞百分比係於第9天 藉由流式細胞法進行圈取（gated)。第十五圖A顯示對 29 200911274 100 ng/ml有所反應之Va24i NKT細胞的百分比。第十 五圖Β顯示對不同劑量有所反應之Vot24i ΝΚΤ細胞的 總數的倍數變化。* :與DMSO組相較之下，p<0.05 ; # : 與C1組相較之下，p<〇.〇5。 使apGalCer類似物來使榭突細胞成熟及伸長 最有效的抗原呈獻細胞（APC細胞）是成熟、且 具有免疫能力的樹突細胞（DC細胞）。DC細胞係可由 未成熟的抗原捕獲細胞（antigen-capturig cell)進化成 為可將T細胞活性化之成熟的抗原呈獻細胞；且其可將 抗原轉換成免疫原’並可使分子（如細胞激素、趨化因 子、共刺激分子及蛋白酶）表現，來起始免疫反應。被 誘發之T細胞免疫反應（财受性對免疫度，Th丨對Th2) 可能有很多種，而這取決於專一性的DC細胞品系及其 成熟階段、以及從周遭微環境中所接收的活化信號為 何。 DC細胞調控免疫度（immunity)的能力係取決於 DC細胞的成熟度。因此，DC細胞的成熟度是免疫反應 起始的關鍵。有多種因子可以誘發DC細胞的成熟，以 及之後抗原的攝入及處理。在它們從未成熟細胞到成熟 細胞的轉變中，DC細胞歷經了許多表型及功能上的變 化。一般來說，DC細胞成熟的過程涉及主要組織相容 抗原複合物（MHC )分子的重新分配（從細胞内胞吞型 細胞間隔（compartment)移到DC細胞表面）、抗原進入 (internalization)的向下調控、以及共刺激分子在表面 之表現增加、形態改變（如樹突的形成）、細胞骨架 (cytoskeleton)重新組織、趨化因子、細胞激素及蛋白 酶的分泌、以及黏附分子及趨化因子受器在表面之表 30 200911274 現。 在一觀點中，本發明之合成性a_GalCer類似物可 促進人類DC細胞的成熟。樹突細胞成熟可能會增強後 天免疫反應。現已揭露了 一種用於樹突細胞成熟的方 法，其包括：提供未成熟的樹突細胞；以及使前述未成 熟的樹突細胞與一定濃度的本發明2a_GaK：er類似物 共同培養一段，間，使未成熟的樹突細胞變為成熟的細 胞。在一實施態樣範例中，這些成熟的樹突細胞之後可 , 能用=免j治療，如癌症免疫治療及佐劑免疫治療。在 另一實施態樣範例中，本發明之類似物可與未 成熟的樹突細胞或或成熟的樹突細胞合併使用，而用於 免疫治療，如癌症免疫治療及佐劑免疫治療。 本發明之α-GalCer類似物可誘發小鼠脾臟DC細 胞成熟。本發明之α-GalCer類似物可在活體外直接增強 人類DC細胞上多種表面成熟標記（包括cd40、CD54、 CD80、CD83、CD86、CD209 及 HLA-DR(MHCII 分子）） 的表現程度及樹突的伸長。如第十六圖所示，C13會顯 著增加 CD40、CD80、CD83、CD86 及 HLA-DR 的表現 ( 程度’並促進人類單核球源之DC細胞的成熟。第十七 圖A為一圖形’顯示在DC細胞對C13的反應當中的 CD40、CD80、CD83、CD86 及 HLA-DR 表現情形。第 十七圖B顯示DC細胞與C13共同培養48小時的形態。 使用α-GalCer類似物引發NKT細胞之CDld依存性 TCR活化 在又一觀點中，本發明之合成性α-GalCer類似物 可誘發CDld依存性TCR活化。第十八圖為一示意圖， 概略顯示了 NKT細胞之TCR訊息傳遞路徑。iNKT細胞 31 200911274 會透過T細胞受器複合物來辨識抗原呈獻細胞（apc) 表面由CDld所呈獻的醣脂質抗原。醣脂質抗原的結合 會活化iNKT細胞中的胞質激酶（Cyt〇s〇iic kinase )，包 括 ERK1/2、ρ38、ΙκΒα、CREB、STAT3 及 STAT5 的磷 酸化。這些訊息傳遞反應會使iNKT增生，並使細胞激 素/趨化因子生產。 在一實施態樣範例中，本發明之a_GalCer類似物 可誘發原態人類NKT細胞之CDld依存性TCR活化。 為了解TCR活化是否為CDld依存性，測定了 HeLa-CDld(人類CDld過度表現）及對照組HeLa細胞 呈獻本發明之多種α-GalCer類似物的效果。此外，比較 了 HeLa-CDld(非專職APC細胞）與未成熟DC細胞（專 職APC細胞）對NKT細胞呈獻多種α-GalCer類似物的 能力。如第十九圖所示，當以HeLa-CDld細胞進行呈獻 時，C1及α-GalCer類似物CU、C13及C17分別會使細 胞内磷-CD3s的值較對照組增加7.3倍、1〇倍、7.3倍及 5.9倍；而當以DC細胞進行呈獻時，則分別增加log 倍、21.3倍、17.3倍及12倍。而在磷-ERK1/2，當使用 HeLa-CDld 細胞時，C1 及α-GalCer 類似物 cil、C13 及C17分別會誘發6.6倍、14.6倍、6.6倍及3.3倍的增 加；而使用DC細胞時，則分別有30倍、48.3倍、35 倍及18.6倍的增加。碌-CREB的誘發則更加驚人，當以 HeLa-CDld細胞進行呈獻時’ C1及α-GalCer類似物 Cll、C13及C17分別會誘發2倍、117倍、41倍及20 倍的表現，而當以DC細胞進行呈獻時，則分別有68 倍、204倍、158倍及49倍的增加。所測試的a_GalCer 類似物都不會對Syk之鱗酸化產生任何效應；Syk是一 種蛋白激酶，目前已知它在B細胞受器訊息傳遞中扮演 一定的角色，但不涉及TCR路徑。這些發現說明，本發 200911274 明之芳族α-GaICer類似物會以CD 1 d依存性的模式誘發 強烈的TCR活化，且當由專職APC細胞進行呈^時，" 其活化增加的程度會比非專職APC細胞高彳艮多。當與對 照HeLa細胞共同培養時’本發明之a_GaK：er類似物在 NKT細胞中都不會影響CD3s、ERK1/2或CREB構酸 化。整體來說，化合物C11及C13在TCR活化的效果 會比化合物C1及C17更強，這與C11所誘發之Th1偏 移的細胞激素效果較C1為大的結果是一致的，因為已 有報告顯示ERK1/2及CREB活化在許多τΗ1細胞激素 (如IL-12及IFN-γ)的誘發上扮演了 一定的角色。ci3 也會誘發顯著的TCR活化，這可能是C13會增強共刺 激分子在DC細胞上之表現這項獨特能力所產生的結 果。而在所檢驗之四種α-GalCei•類似物中，以DC細胞 進行呈獻時，TCR的活化會比以HeLa-CDld細胞進行 呈獻時更強’尤其是C13。α-GalCer類似物C11所誘發 之CD3s、ERK1/2及CREB填酸化的程度會比ci所誘 發的更高’這與醣脂質與CDld之間更強的結合會在 NKT細胞上誘發更大的TCR刺激這個現象是一致的。 苐一十圖顯示了另·-.貫施態樣範例，關於本發明 之α-GalCer類似物如何誘發CDld依存性之TCR活化。 本發明之多種α-GalCer類似物特別是C16、C23、C26、 C8-5及C8-6)可在人類iNKT細胞（Va24+ T細胞）活 化 TCR 訊息傳遞路徑，使 ERK1/2、ρ38、ΙκΒα、CREB、 STAT3及STAT5磷酸化。為了解TCR活化是否為CDld 依存性’測定了 HeLa-CDld (人類CDld過度表現）及 對照組HeLa細胞呈獻本發明之多種a_GalCer類似物的 效果。苐·一十圖A顯示了以流式細胞法對分離的Va24+ T細胞所進行的測定，其包含92%原態Va24+/CD3+ T 細胞。Cl及a-GalCer類似物（特別是C16、C23、C26、 33 200911274 C8-5及C8-6)會增加下列各項在細胞内的值：（B)石舞 _CD3s (墙-路胺酸）、（c)麟 _CREB (Serl33)、（D)石粦 -ERKl/2(Thrl85/Tyrl87)、（E)_-p38(Thrl80/Tyrl82)、 (F)石舞-lKBoc(Ser32)、（G)磷-Lck、（Η)石粦-Lat、（I)石粦-STAT3 (Ser727)、（J)碟-STAT5 A/B ( Tyr 694/699)、（K)構-Syk (填-酪胺酸）及(L)礙-Zap-70(亦絡胺酸）。* :與DMSO 組相較之下’ ρ<〇·〇5 ; # :與ci 相較之下，p<〇.〇5。 本發明之α-GalCer類似物也在活體外對cDld限 定之小鼠的NKT/T細胞展現出較高的結合親和力（第二 十一圖），且在活體内對兩個亞群NKT細胞及NK細胞 展現出CDld依存性活化（第二十二圖）。如第二十一圖 所示，在靜脈内（IV)注射0.1 μδ/小鼠之指定a_GalCer 類似物（Cl、7DW8-5、C26、C8、C17)或媒劑後 72 小時’從BALB/c小鼠身上收取脾臟。在mCDld四聚物 中加入α-GalCer (每pg 10莫耳）進行染色’測定小鼠之 NKT細胞（第二十一圖A)或T細胞（第二十一圖b) 百分比。弟一十一圖C顯示了 oc-GalCer及紛a-GalCer 類似物（phenol ot-GalCer analog) 7DW8-5 對 CDld 限定 之NKT及T細胞不同的結合親和力。第二十二圖顯示 了兩個ΝΚΤ細胞亞群的CD 1-依存性擴增情形。在以ιν 方式注射對照物DMSO、tx-GalCer或指定α-GalCer類似 物 C8、C16、C22、C23、C26、7DW8-5 及 7DW8-6 後 72小時，從BALB/c野生型（WT )或CD1剔除（KO ) 小鼠身上收取脾臟。藉由FACS來估算(B)野生型或(〇 CD1剔除小鼠對指定α-GalCer類似物有所反應而得出 之NKT細胞及其兩個亞型（標識為NKT 1 (CD3+/NK+/ CD49+/CD69-)及 NKT2 (CD3+/NK+/CD497CD69+))的總 數。（D)顯示了 NK細胞的CDld依存性活化。藉由FACS 來估算WT或CD 1 KO小鼠對指定α-GalCer類似物有所 34 200911274 反應而得出之活性NK細胞（CD37NK+/CD69+ )總數的 擴增。* :與DMSO組相較之下，p<〇.〇5 ; # :與ci組 相較之下，p<〇.〇5。 使用α-GalCer類似物引起的活體內Txx鈿妝.法化、牌鏟 細胞的擴增/活化、以及nkt細胞的r；md依存性tcr 活化 在又一觀點中’本發明之α-GalCer類似物可在活 體内活化Τη細胞。為了估算投藥途徑對細胞激素分泌 的影響’將本發明之α-GalCer及七種a_GalCer類似物以 靜脈内（IV)、皮下（SubQ)或肌肉内（IM)途徑注射 到BALB/c小鼠身上，並測定它們對細胞激素生產的影 響。第二十三圖A、第二十七圖A及第二十九圖A顯示 了透過不同途徑注射多種α-GalCer類似物後72小時當 中的IFN-γ血清值。一般來說，細胞激素生產的增加在 早先2小時是可偵測的，並在18小時達到高峰，並在 48小時前慢慢降低到基準量。當透過iv途徑引入時（第 二十三圖A) ’ α-GalCer類似物C9及α-GalCer類似物 C16的活性程度與C1相近，其次則是a_GalCer類似物 C13、Cll、C2、C14 及 C3。尤其是，相同的α-GalCer 類似物藉由SubQ投藥所誘發IFN-γ量（第二十七圖A) 會比IV途徑低很多，而IM途徑的量（第二十九圖A) 則介於中間。雖然以IV投藥時，ci所誘發的IFN_Y量 最高’但以SubQ及IM途徑給Ta_GalCer類似物C9時’ 其量會勝過C1。第二十三圖B、第二十七圖B及第二十 九圖B顯不了透過不同途控注射a_GalCer類似物後的 IL-4量。所測試的所有α-GalCer類似物（包括α-GalCer ) 都顯示，透過SubQ途徑引入時只能誘發一點點IL-4， 35 200911274 而透過IM給予oc-GalCer類似物時，則都能誘 的IL-4。IFN-y/IL-4比率的數據（第二十三圖^二里 十七圖c及第二十九圖c)是用來反映Th^ 偏 透過W途徑投予細菌來源的芳族a_GalCer ^、（^、⑽及⑴’在：小時時所弓降的以^ 會比C1少，而所有0C-Gaicer類似物在18_72 = 都會誘發TH1偏移反應’如第二十三圖c、 間 c及第二十九圖c所示。進一步言之，從Sub^~途^ 予時，除了 oc-GalCer類似物C2及C3以外，所測試^ 有本發明之α-GalCer類似物在2-72小時内的Th1/ 了 ^ 比率都比Cl高。另一方面，當以ΙΜ方式注射^予Η， 除了 C14以外’所有本發明之a_GalCer類似物都會 小時時顯示出TH2偏移反應，並在18-72小時當中再a 呈現TH1偏移反應較高的情形。而C14在2小^時顯^ 出TH1偏移反應較高，並在2-72小時期間維持= 移較高的狀態。在另一個觀點中’第二十四圖顯示 投予指定〇c-GalCer類似物後2及18小時時，小鼠八必 (A) IFN-γ、（B) IL-4 及(C) IFN-Y/IL-4 比率的血清=刀/必

血清中其他細胞激素及趨化因子和IFN-γ及il 4 一樣，也會對這些新穎α-GalCer類似物有所反應，而 顯著的增加，包括 ΙΙ^'ΙΙ^'ΚΟΙΙ^ΗΜ^πΓΐι^π、 GM-CSF、TNFcc、RANTES、MCP-1 及 ΜΙΡ-1，如 $ _ 十五圖之表中所列示。在IV投藥時，這些新穎a_GalCer 類似物所引發的TH1偏移細胞激素及趨化因子反應會比 C1更大。舉例來說，芳族α-GalCer類似物cil、C13及 C16 會誘發 IL-2、IL-12、MIP-Ιβ及 MCP-1 急遽上升， 而C14誘發IL-3、GM-CSF及IL-12的程度較高。 為了測定注射α-GalCer或指定本發明之a_GaiCer 類似物之B ALB/c小鼠脾臟中的免疫細胞群，對b ALB/c 36 200911274 小鼠進行注射，並在注射後72小時進行檢驗。如第二 十六圖所示，IV投予所測試的所有α-GalCer類似物會明 顯地誘發下列各項的擴增：（A)脾臟細胞（C9、C13及 C16所顯示出來的能力高於Cl)、（B)DC細胞、（C)NK 細胞、（D)NKT 細胞、（e)B 細胞、（F)CD8+ T 細胞、（G)CD4+ I細胞及(Η)已活化之CD8+/CD4+比率。如第二十八圖所 示’在SubQ投藥後，所測試的α-GalCer類似物在(Α) 脾臟細胞的擴增上顯示出來的效應與Ci相較之下都不 明顯。如第三十圖所示，在IM投藥後，所測試的所有 α-GalCer類似物都會誘發(A)脾臟細胞擴增，且C9、ci3 及C14的效應高於Cl。芳族α-GalCer類似物C12、C13 及Clf在誘發全部及成熟細胞上升方面都顯著高於 C1 (第二十六圖b、第二十八圖b及第三十圖B)。 α-GalCer類似物、C12、C13及C16對NK細胞及 NKT細胞之擴增/活化的能力最佳（第二十六圖C_D、 第二十八圖C-D及第三十圖C-D)〇a-GalCer類似物C16 在B細胞擴增方面是最有效的，而α-GalCer類似物C2、 C9、C10、及C11的活性也比C1更強，（第二十六圖 E、第二十八圖e及第三十圖e)。對CD8+ T細胞來說， 雖然a_GalCer 類似物 C9、cil、C16、C12 及 C13 的活 性也比C1更強’但α-GalCer類似物C14在細胞擴增/ 活化方面是最有效的（第二十六圖F、第二十八圖F及 第三十圖F)。a_GalCer類似物在CD4+T細胞擴增/ 活化方比C1來得有效（第二十六圖〇、第二十八 圖G及第二十圖G)。在τ細胞亞群當中，所測試的所 有α-GalCer類似物都會誘發cd8+/CD4+比率的上升，而 α-Galfer類似物Cll、⑴、C14及ci6的潛力會優於 C1、（第二十六圖H、第二十八圖η及第三十圖η)。在 透過SubQ途|以a_Gaicer類似物處理的小鼠中， 37 200911274 α-GalCer類似物C9所誘發之所有及成熟的DC細胞擴 增情形顯著地比C1來得高，其他α-GalCer類似物則與 C1差不多（第二十八圖B)。對NK及NKT擴增/活化 來說，α-GalCer 類似物 C9、Cll、C13、C14 及 C16 顯 示出來的活性與C1差不多，而其他α-GalCer類似物的 活性似乎較低（第二十八圖C-D)。對B細胞擴增/活化 來說，oc-GalCer類似物Cl、C9、C11及C13顯示出明 顯的活性（第二十八圖E)。對CD8+T細胞來說，a_Gal(：ei· 類似物C9、Cll、C13、C14及C16顯示出來的活性會 比C1更尚’而其他oc-GalCer類似物顯示出來的活性則 與C1差不多（第二十八圖F)。對CD4+ T細胞來說， 雖然α-GalCer 類似物 C9、Cll、C13、C14 及 C16 的活 性也比對照物更高’但C1是最有效的（第二十八圖G)。 對T細胞來說’多數所測試的α-GalCer類似物引發的 CD8+/CD4+比率增加會比C1更大（第二十八圖η):當 透過IM途徑引入α-GalCer類似物時，所誘發的Dc細 胞、NK細胞、NKT細胞、B細胞及CD8+/CD4+比率都 有顯著的增加。大部分新穎的α-GalCer類似物所引發的 DC細胞擴增會比C1更而（第三十圖b )。α-GalCer類 似物C9及C14在NK細胞誘發方面展示出比ci更強的 作用（第三十圖C)’但在NKT細胞方面的效應是差不 多或較低的（第三十圖D)。α-GalCer類似物C2、C11、 C12及C16的B細胞活化要比C1更強（第三十圖E)。 對CD8+ T細胞來說’ α-GalCer類似物C9及C16在細於 擴增/活化方面顯示出來的活性與C1差不多，而其= oc-GalCer類似物所誘發的增加則比對照物更為明^ ^ 三十圖F)。對CD4+ T細胞來說，a_GalCer類似物 及C9在細胞擴增/活化方面顯示出來的活性與差 多，而其他〇^〇31〇61·類似物所誘發的增加則比對照物更 38 200911274 為明顯（第三十圖G)。α-GalCer類似物C9、C11及c 16 在提高CD8+/CD4+比率方面顯示出來的活性與Cl類似 (第三十圖H)。 第三十一圖顯示了另一實施態樣範例，係關於 α-GalCer類似物之投藥途徑對細胞激素動力學及脾臟 細胞擴增/活化的效應。第三十一圖（A-C)顯示了對不同 途控投予DMSO媒劑、α-GalCer或α-GalCer類似物C16 有所反應而引起的細胞激素動力學情形。BALB/c小鼠 係以IV、SubQ或IM方式注射媒劑、C1或C16 (每隻 小鼠2 pg )。在〇、2、18、36、48、72小時時收集血清 樣本’並進行細胞激素分析：（A) IFN-γ、（B) IL-4及(C) IFN-Y/IL-4比率，其值已用DMSO劑加以正規化。第三 十一圖（D-K)顯示了對不同途徑投予媒劑、C1及C16有 所反應而引起的脾臟細胞擴增/活化情形。在以IV、S u b Q 或IM方式注射C1、C16 (每隻小鼠2 pg )或媒劑後72 小時，從BALB/c小鼠身上收取脾臟。（D)顯示了有核細 胞總數，（E-G)顯示了包括下列細胞在内之先天免疫細胞 群：成熟的樹突細胞（CD11C+/CD80+/CD86+)、已活化 之 NK 細胞（U5A2—13Ag+/CD37CD69+)及已活化之 NKT 細胞（U5Ari3Ag+/CD3+/CD69+); (H-J)顯示了包括下列 細胞在内之後天免疫細胞：已活化之B細胞 (CD45R+/CD23+/CD69+ )、已活化之 CD8 T 細胞 (CD3+/CD47CD8+/CD69+)及已活化之 CD4 T 細胞 (€03+/004+/0087€069+);(〖)顯示了008/€04比率， 其值已用DMSO加以正規化。:與C1組相較之下， p<0.05 ° 在另一實施態樣範例中，係對小鼠投予多種劑量 的本發明之α-GalCer類似物，以測定是否有對脾臟細胞 之擴增/活化來說很顯明的劑量反應（dose-response )。 39 200911274 如弟二十二圖A-Η所不’在以IV方式注射媒劑或 α-GalCer類似物C11(每隻小鼠2或0.1 pg)後72小時， 從BALB/c小鼠身上收取脾臟。（A)顯示了有核細胞總 數，（B-H)顯示了包括下列細胞在内之先天免疫細胞群： 成熟的DC細胞（CD11C+/CD80+/CD86+)、已活化之NK 細胞（U5A2_13Ag+/CD37CD69+)、已活化之 NKT 細胞 (U5A2_13Ag+/CD3+/CD69+)、單核球（CDllb+Grr)、 顆粒球（CDllb_Grl+) ; (F-H)顯示了包括下列細胞在内 之後天免疫細胞：已活化之CD4 T細胞 (CD3+/CD4+/CD87CD69+ )、已活化之 CD8 T 細胞 (CD3+/CD47CD8+/CD69+ )及已活化之 b 細胞 (CD45R+/CD23+/CD69+)。* :與 DMSO 組相較之下， ρ<0·05 ; #:與C1組（每隻小鼠2 pg)相較之下，p<〇 〇5。 在又一活體内實施態樣範例中，估算了本發明之 α-GalCer類似物誘發TH1/TH2細胞激素的動力學（第三 十三圖）。BALB/c小鼠係以IV方式注射媒劑、ci成指 定α-GalCer類似物（每隻小鼠〇.1 pg)。在〇、2、12、曰 24、48及72小日守時收集血清樣本’之後估算(a) 、 (B) IL-4及(C) IFN-y/IL-4比率的分泌情形，其值已用 DMSO對照組(D)力σ以正規化。這些有潛力的 類似物會引發細胞激素/趨化因子，如第三十四圖的表中 所示’這個表顯示了在2及18小時收集的血清樣^。 本發明之α-GalCer類似物係以iv方式投予野生型（WT) 及CDld剔除（CD1 KO) BALB/c小鼠（每隻小鼠〇 1 pg)，參見第三十五圖。在2及第18小時時彳^集清樣 本’之後分析細胞激素/趨化因子，包括(A) IF^ 、^B IL-4、（C) IFN-Y/IL-4 比率、（D) IL_10、（E) IL l KC)及（G) MCP-1。* :與 DMSO 組相較之下，p<〇 這表示，本發明之α-GalCer類似物會在小鼠身上引發 200911274 CD1依存性的細胞激素/趨化因子分泌情形。 第三十六圖顯示了另一實施態樣範例：在注射本 發明之多種α-GalCer類似物後，兩個NKT亞群之脾臟 細胞的擴增/活化及CD 1 d依存性活化。（a_f)顯示了對所 測试的α-GalCer類似物有所反應而引起的脾臟細胞擴 增/活化情形。在以IV方式注射媒劑、a_GalCer或指定 α-GalCer類似物（每隻小鼠〇_ι μδ)後72小時，從 C57BL/6小鼠身上收取脾臟。（A)顯示了有核細胞總數， (B-F)顯示 了成熟的樹突細胞群 (CD11C+/CD80+/CD86+ )、已活化之 NK 細胞群 (NK1.1+/CD37CD69+ )、已活化之 CD4 T 細胞群 (CD3+/CD4+/CD87CD69+)、已活化之 CD8 T 細胞群 (CD3+/CD47CD8+/CD69+)及 CD8/CD4 比率，其值已 用DMSO加以正規化。*:與DMSO組相較之下，p<〇.〇5。 (G-Η)顯示了兩個NKT亞群的CD1依存性擴增情形。在 以 IV 方式注射媒劑、Cl、7DW8-5、C22、C23、C26、 C30及C17 (每隻小鼠0.1 pg)後72小時，從C57BL/6 野生型（Wt)或CD1剔除（CD1 KO)小鼠身上收取脾 臟。（G)顯示了以流.式細胞法測定小鼠NKT細胞（左下 方圖面）。FACS發現Wt身上NKT細胞（左上方圖面） 及其兩 個亞型 （包括 NKT1 (CD3+/NKl.l+/CD49+/CD69〇(右上方圖面）及 NKT2 (CD3+/NK1.1+/CD497CD69+X右下方圖面））之總數的增 加。（H)顯示了 CD1 KO小鼠對α-GalCer類似物有所反 應而得到的NKT細胞總數，而（I)顯示了 WtC57BL/6小 鼠對α-GalCer類似物有所反應而得到的Treg細胞 (CD4+/CD25+/FoxP3+)總數。*:與 DMSO 組相較之下， p<0.05 ; # :與C1組才目較之下，p<0.05。 41 200911274 免疫治瘵 免疫系統藉由清除微生物而有效地預防我 體受到侵襲。如果缺乏有效的免疫系統，人們就合產 各種細菌、病毒、原蟲、寄生蟲及真菌的感染，ς 情形也有可能會發展成癌症。因為νκτ細胞在免声^ 統中扮演調控的角色，所以它們會是免疫治療中报=的 目標。ΝΚΤ細胞的反常活化可能會抑制或刺激免产反 應。舉例來說，一般認為Th1細胞激素的生產與抗腫瘤 活性、抗病毒/抗菌活性、及佐劑活性有關，❿Μ 激素的生產則會壓制自體免疫疾病。 、 抗腫瘤之免疫治瘙 卢刺疋5疫系統和癌症密切相關，藉由適 度=免昃糸統，可能會對許多癌症造成影響。以 、二，會抑制腫瘤轉移到肝臟、肺臟及淋 Φ °射广弟一』床試驗（phaseIclinicaltrial)當 症末期的患者注射a_Galcer或加入aGalcer之 1 ΪΙτΊ (即未成熟樹突細胞），在治療前να24+νβ 11+ Ν ΚΤ細胞數目達到可偵測等級的患者身上，可觀察 ίί統活化的情形。雖然沒有持久性的腫瘤逆行性 雙化，一些患者的病情很穩定，也沒有產生任何毒性， 出血清腫瘤標記暫時降低或腫瘤 ’月开》。在—些臨床言式,驗中缺乏…如⑸的顯 能是因為1fn_y (―種π細胞激素） =(一種Th2細胞激素)抵銷，而沒有產生 用你Λ—Λ點中，本發明之合成性a_GalCer類似物可 乍抗腫瘤之減轉活性劑。可將本發明之… 42 200911274 類似物設計成τΗι偏移型。這些 類似物可引發Th1細胞激素反應;'，a-GalCer 時間’減緩罹癌動物的腫瘤生^=動物的存活 巴球（包括τ細胞、CD8 τ細胞、浸潤性淋 的數目。 ^ NK細胞及NKT細胞） 在一實施態樣範例中，本發明 ， 在抗腫瘤之免疫治療中係作為治療性a :類似2 a，GalCer類似物可用作癌症疫 ^。在、與二^ 樣範例中，本發明之a_GalCei^~ ^于在另一貫施態 投予，i中前：殳二6 Γ類似物可與免疫治療合併 丄:::r之====”合 可能有高 在一 本發明之a_GaiCei*類似物的抗癌效度， ^貝施恶樣範例中，在具有免疫能力的同系 小鼠t上研究帶有Tci細胞株之轉移性肺 ^杈型、以及帶有4T1細胞株之乳癌SubQ腫瘤模 ^ U別為C57BL/6及BALB/C)。第三十八圖\2 代表，實驗結果’顯* aa_GalCer類似物⑶加以處理 之小鼠的肺臟表面腫瘤結節數目會減少。以IV方式投 自帛m组的本發明之a_GalCer類似物及ci Tf有TC1腫瘤之小鼠的存活效應顯示於第三十七 ^除了 C4、C6、C7、C8及C17以外，在許多所測試 的α-GalCer類似物的情況下都會觀察到存活時間明顯 延長、以及體重降低程度減少。此外，在所測試的 °^&1(^類似物中，有八種（〇3、（：10、〇11、（：12、（：13、 C1i、C15及Cl6)的抗癌效度明顯要比C1更高。其次， 在帶有4T1乳癌之小鼠身上估算以IV方式投予、八種 α-GalCer類似物及C1的抗腫瘤效度。在以a_GalCer類 43 200911274 似物cy處理後16天，小鼠的腫瘤大小會變小，此係 顯示於第三十八圖B作為實施例。與對照物相較之下， 所測試的所有a-Gaicer類似物都可以抑制腫瘤生長並 延長存活^夺間，而且都比C1更加有效，見第三十九圖 A。基於這些發現’測試了 SubQ遞送本發明活性最高之 α-GalCer 類似物當中幾個（C9、cu、ci3、C14、C16) 及Cl的效應。與對照物相較之下，SubQ遞送所測試的 oc-GalCer類似物都可以抑制腫瘤生長並延長存活時 間。α-GalCer類似物C13、C14及C16在抑制腫瘤大小 方面的效力明顯鬲於C1，不過它們在存活方面的效力與 C1並沒有明顯的不同（第三十九圖B)。在統計上來說 C1以s'bQ遞送的效力會比IV途徑更好（第四十圖）， 其中投藥途徑不會明顯地影響所測試的其他a_GalCer 類似物的抗腫瘤效力（第三十九圖A_B)。以SubQ方式 注射α-GalCer類似物之小鼠發病的情形要比IV處理的 小鼠來得少，這與SubQ投藥後細胞激素/趨化因子血清 值較低的結果是一致的。 為了使這些新穎a_GalCer類似物的治療程序最適 化，我們鎖疋了投藥的途徑、頻率及劑量，在帶有腫瘤 之小身上估异抗癌效度（見第四·]--至四十四圖）。 結果顯示’ iv投藥的合適劑量療程是每隻小鼠〇1吨 的α-GalCer，每週一次。這可以應用到帶有乳癌、肺癌、 以及黑色素細胞瘤之小鼠的治療（參見第四十三圖及第 四十四圖）。以新穎類似物進行處理，會使 腫瘤浸潤性淋巴球增加，包括T細胞、CD8 τ細胞、ΘΝΚ 細胞及ΝΚΤ細胞（參見第四十五圖）。第四十一圖α_β 顯示出不同投藥途徑的影響。（A) BALB/c小鼠以SubQ 方式接種小鼠乳癌細胞4T-1。腫瘤接種後三天，以媒 劑、oc-GalCer或指定a_GalCer類似物（每隻小鼠2呢)、 44 200911274 處理小鼠（IV或SubQ )，每週兩次，共處理四週。腫瘤 體積每3天記錄一次，共記錄33天，並監測存活情形 高達70天。左方圖面為帶有乳癌之小鼠的Kaplan Meier 存活曲線；右方圖面為腫瘤生長曲線。（B) C57BL/6小 鼠以IV方式接種小鼠肺癌細胞TC-1 ’之後以媒劑、 α-GalCer或指定α-GalCer類似物（每隻小鼠2 pg )加以 處理（IV或SubQ)，每週兩次，共處理四週。左方圖面 為帶有肺癌之小鼠的Kaplan Meier存活曲線；右方圖面 為體重的變化。 (C)顯示了投藥頻率的影響。C57BL/6小鼠以IV方 式接種小鼠肺癌細胞TC-1，之後以媒劑、α-GalCer或 指定α-GalCer類似物（每隻小鼠2 pg)加以處理（iv 或SubQ)，每週兩次或每週一次，共處理四週。左方圖 面為帶有肺癌之小鼠的Kaplan Meier存活曲線；右方圖 面為體重的變化。 第四十三圖及第四十四圖顯示了以最適當的程序 進行本發明之α-GalCer類似物的抗癌效度評估。第四十 三圖顯示C57BL/6小鼠以IV方式接種肺癌（TC1)或 以SubQ方式接種黑色素細胞瘤（B16)細胞，之後用 IV方式以媒劑、cc-GalCer或指定oc-GalCer類似物（C23、 C26、C30、7DW8-5)加以處理（每隻小鼠〇_1 μέ)，每 週一次，共處理四週。（Α)顯示了帶有TC1之小鼠的 Kaplan Meier存活曲線，（Β)顯示了 βι6腫瘤的生長曲 線。所測試的所有α-GalCer類似物在帶有tc 1之小鼠的 存活時間上都顯著地顯示出明顯的增加。此外，當帶有 B16之小鼠以本發明之α-GalCer類似物加以處理時，腫 瘤大小也顯著地有明顯的縮小。第四十四圖（A_b)顯示了 在小鼠身上進行腫瘤生長真實時間的估算。C57BL/6小 鼠以SubQ方式接種（A)肺癌（TC1-GFP-螢光素酶 45 200911274 (Luciferase))細胞或(B)乳癌（4τ 1-GFP-螢光素酶）細胞， 之後用IV方式以媒劑、a_Gaicer或指定a_GaiCer類似 物（C23、f3〇、7DW8_5及C17)加以處理（每隻小鼠 0.1 pg) ’每週一次，共處理四週。以IVIS系統對活體 内腫瘤的生物冷光（bi〇iuminescence)晝素進行評估及 計算。左方圖面為生物冷光之定量數據；右方圖面為帶 有腫瘤之小鼠的代表性影像。* :與DMS〇組相較之下， p<0.05 ; # :與C1組相較之下，p<〇 〇5。與對照物及 α-GalCer 相較之下’ a-GalCer 類似物 C3〇、C23 及 C8_5 在接種肺癌之小鼠的腫瘤生長方面顯著地顯示出明顯 的減少。有趣的是’這些a_GalCer類似物（C3〇、C23 及C8-5)都會產生Th1偏移反應，如前述結果所示。與 對照物及α-GalCer相較之下，a_Gaicer類似物C8-5在 接種乳癌的小鼠的腫瘤生長方面顯著地顯示出明顯的 減少。與對照物相較之下，a_GalCer類似物c17在腫瘤 生長方面顯著地顯示出明顯的減少，但其結果與 α-GalCer類似。有趣的是，a GalCer類似物C17會產生 Th2偏移反應’如前述結果所示。這些結果確認了 Th1 細胞激素的生產與抗腫瘤活性有關的想法。 第四十五圖顯示在一實施態樣範例中，本發明之 α-GalCer類似物如何在肺臟腫瘤及黑色素細胞瘤中引 發τΗι偏移之腫瘤浸潤性淋巴球。（A_D)顯示了肺癌中 的腫瘤浸潤性淋巴球。在第21天從帶有TC1腫瘤、且 以媒劑、α-GalCer或指定a_GalCer類似物（⑶、C3〇、 C8-5，0.1 pg/小鼠，—週—次）處理之C57BL/6小鼠身 上移+除之腫瘤的單一細胞懸浮液係接受下列染色：（A) CD3 T 細胞、⑻ CD8 T 細胞（CD3+/CD47CD8+ )、（C) NK 細胞（NK1.1 /CD3·)及(D)NKT 細胞（NK1.1+/CD3+)， 其值已用DMSO加以正規化。與對照物及a_GalCer相較 46 200911274 之下，α-GalCer類似物C30在肺癌的TH1偏移之腫瘤浸 潤性淋巴球數目上顯著地顯示出明顯的增加。與對照組 (針對CD3+ T細胞）、以及與對照物及α-GalCer (針對 CD8 T細胞、NK細胞及NKT細胞）相較之下，a_GalCer 類似物C23及C8-5亦在肺癌的TH1偏移之腫瘤浸潤性 淋巴球數目上顯著地顯示出明顯的增加。（E-Η)顯示了黑 色素細胞瘤中的腫瘤浸潤性淋巴球。在第21天從帶有 B16黑色素細胞瘤、且以媒劑、α-GalCer或指定a-GalCer 類似物（C23、C30、C8-5 ; 0.1 pg/小鼠，一週一次）處 理之C57BL/6小鼠身上移除之腫瘤的單一細胞懸浮液係 接受下列染色：（E) CD3+ T細胞、（F) CD8 T細胞 (CD3+/CD47CD8+ )、(G) NK 細胞（NK1.1 +/CD3-)及(H) NKT細胞（NK1.1+/CD3+)，其值已用DMSO加以正規 化。與對照物及α-GalCer相較之下，α-GalCer類似物 C23、C8-5及C30在黑色素細胞瘤的TH1偏移之腫瘤浸 潤性淋巴球數目上顯著地顯示出明顯的增加。* :與 DMSO組相較之下，ρ<〇·〇5 ; # :與ci組相較之下Y ρ<0.05 ° 佐剤免痖治療 及DNA旁，癌原的佐劑效應 佐劑是一種與抗原合併使用時會在已進行免疫的 物種身上引起免疫反應的化合物。八十多年來，佐劑係 用於補強（boost)疫苗的效度。一般來說，活體疫苗（包 t感朵性有機體的減毒形式）自己就會運作得很好。但 是’包含死亡有機體（去活性疫苗）或感染性有機體碎 片或其毒素（細胞疫苗或重組疫苗）的疫苗通常 劑來補強它們的效度。在大多數的狀：下， 47 200911274 應類型（弟1型或第2型）對疫苗的保護效度有明顯的 影響。可互相替代的佐劑偏好特定的反應類型。然而， 佐劑的選擇是很複雜的，一方面是因為它在功能上無可 預測’一方面則是因為它在商業上的限制及利用性。 俗稱明礬（alum)的鋁鹽是美國惟一許可用於_ 般預防用疫苗的佐劑。然而，目前顯示鋁鹽會在人類及 動物身上專一地增加TH2型反應偏移（如IL_4的生產）。 銘鹽無法引發TH1細胞性免疫反應（如ΙΡΝ_γ的生產）， 而這是限制它用作佐劑的主要原因。特別是用於對抗細 胞内病毒及細菌感染之疫苗的時候，缺乏細胞毒性τ細 胞反應是會致命的。 可以合成本發明之α-GalCer類似物來啟動τΗΐ偏 移之免疫原性反應。因此，或可使用本發明之a_GalCer 類似物作為佐劑，而得到會顯示出Th1型免疫反應之改 良疫苗、或在TH2型反應之外亦允許免疫反應有Th1型 偏移的疫苗。就這樣，將一或多種a_GalCer類似物作為 佐劑，而與疫苗一起投藥。此外，將會誘發Th1型反應 的本發明之α-GalCer類似物加入已經可用的疫苗時，可 提供該疫苗的改良形式。 在一觀點中，合適的疫苗可能含有胜肽、蛋白、 多醣或DNA免疫原。在另一觀點中，前述疫苗可能選 自一或多種市售疫苗’其如下所示但不限於：A型肝炎、 B型肝炎、輪狀病毒（rotavirus)、白喉（Diphtheria)、 破傷風、百日咳、b型流行性感冒嗜血桿菌（Haemophilus influenza type b)、肺炎鏈球菌（Pneumococcal)、小兒麻 痺病毒（Poliovirus)、流行性感冒病毒、麻疹、腮腺炎、 德國麻療、水疫、腦膜炎球菌（Meningococcal )、人類 乳突病毒、帶狀癌療、伯氏疏螺旋菌、傷寒、日本腦炎、 48 200911274 狂犬病、蜱媒腦炎、霍亂、黃熱病、H5N1、西尼羅（West Nile )、小DNA病毒（Parvovirus )、描鼻氣管炎、杯狀 病毒（Calicivims )、泛白血球減少症病毒（Panleukopenia virus)、鸚鶴彼衣菌（Chlamydia psittaci)、|苗白血病、 犬痕熱、犬腺病毒（Canine Adenovirs )、犬副流行感冒 病毒（Canine Parainfluenza )、支氣管敗A性博德氏桿菌 (Bordetella Bronchiseptica )、犬冠狀病毒（Canine Coronavirus )、梨形鞭毛蟲（Giardia lamblia )、鉤端螺旋 體（Leptospira)的菌苗（bacterin)、感染性牛傳染性鼻 氣管炎病毒（Bovine Rhinotracheitis virus )、副流行性感 冒病毒第三型（Parainfluenza 3 virus )、牛呼吸道融合病 毒（Bovine Respiratory Syncytial virus)、牛病毒性下痢 病毒（Bovine viral Diarrhea virus )、氣疽芽孢梭菌 (Clostridium Chauvoei )、敗血芽孢梭菌（Clostridium septicum )、溶血芽胞梭菌（Clostridium haemolyticum )、 諾維氏芽孢梭菌（Clostridium novyi)、破傷風芽孢梭菌 (Clostridium tetani )、蘇德氏芽胞梭菌（Clostridium sordellii )、產氣莢膜芽孢梭菌（Clostridium perfringens)、牛莫拉氏桿菌（Moraxellabovis)、溶血性 曼哈米亞桿菌（Mannheimia haemolytica)、敗血性巴氏 桿菌、波莫那鉤端螺旋體（Leptospira pomona )、哈特焦 鉤端螺旋體（Leptospira hardj〇 )、流行性感冒傷寒型鉤 端螺旋體（Leptospira grippotyphosa )、犬型鉤端螺旋體 (Leptospira canicola )及黃疸出血性鉤端螺旋體 (Leptospira icterohaemorrhagiae )的疫苗。 本發明提供一種在患者身上增強化合物、組成物 或疫苗之免疫原性的方法，前述方法包括：投予患者一 種進一步含有本發明之佐劑的化合物、組成物或疫苗， 其中前述佐劑會增強前述化合物、組成物或疫苗的免疫 49 200911274 原性。 Μ白疫苗的佐劑#應 測試本發明之α-GalCer及α-GalCer類似物增強對 以f白為主成分之既有疫苗（如破傷風類毒素(ττ)去活 性毒素）之免疫反應的能力。小鼠係以ττ在有或沒有 本發明之α-GalCer類似物的情況下於第〇天和第28天 進行免疫。每週收取血清來測定抗ττ之專一性抗體。 弟四十六圖Α顯示了本發明之a_GaiCer類似物在對ΤΤ 之抗體反應上的佐劑效應。如第四十六圖A所示， α-GalCer ( C1 )及α-GalCer類似物C11會增加抗TT之 專=性IgG抗體的生產。雖然對抗ττ之生產的動力學 與習知佐劑明礬（「Alum」）所誘發的情形相似，但C1 所引發的抗體生產量明顯大於明釁。當習知的ττ+明釁 與C1或C11合併使用時，抗體反應會進一步增強至習 知疫苗之〜2倍。這些發現指出，C1及C11具有佐劑效 應，會與明礬進一步協同地增強免疫反應。〇1_(3&1(：以類 似物C11之佐劑效應顯然相當持久。第二次免疫後二十 週時，補強劑量只給小鼠TT (沒有明礬或a_GalCer類 似物C11)-會使1週後的抗ττ抗體快速上升。第四十 六圖Β顯示了α-GalCer類似物cil在第二次免疫後延遲 抗原補強二十週的效應。以C1或cu處理之小鼠體内 的抗體量為投與ττ+明礬者的兩倍，且為僅注射ττ者 的25倍以上，如第四十六圖Β所示。這些發現說明了 C1或α-GalCer類似物Cn在記憶性τ細胞及Β細胞上 的作用會使補強後的免疫反應增強。 50 200911274 對胜肽疫苗的佐劑效應 以包含流行性感冒病毒A病毒H1N1亞型之]V[2 蛋白胞外功能域（domain)的胜肽疫苗來估算佐劑效 應。前述胜肽疫苗的胺基酸序列為MSLLTEVETTIRNE WGCRCN。雌性BALB/c小鼠係以5或45 pg之M2e胜 肽在有或沒有本發明之多種α-GalCer類似物（C9、C11、 C14、C17)的情況下於第0、3及6週進行免疫。第四 十七圖顯示了多種α-GalCer類似物在M2e胜肽疫苗上 的佐劑效應。如第四十七圖所示，在第三次免疫後二週 時，單用M2e胜肽且抗原劑量為5及45 pg時，誘發抗 M2e之專一性IgG效價分別為1.8xl〇5及5·4χ105。當與 本發明之α-GalCer類似物合併使用時，所得之抗m2抗 體效價會有10〜30倍以上。在所測試的a_GalCer類似物 中’cii的佐劑效應最佳，相當於完全弗氏佐劑（c〇mplete

Freund’s adjuvant，CFA)，且為Cl效價的3倍以上。其 他的α-GalCer類似物（C9、C14及C17)則與C1相當。 這些發現顯示，α-GalCer及其類似物對胜肽抗原具有強 烈的佐劑活性，而那些在醯基尾部包含芳族環的化合物 (如C11)是最有效的。 對DNA疫苗的佐刳 主製備一 H5DNA構築體（pHA)，其係包含禽流感 病毋H5共有序列全長的質體。簡言之，為了要涵蓋基 因上的變化而在不同的H5N1株當中誘發交互保^ 果，從500株H5m病毒株之HA基因推算出一段HA ，有序列，並將之用於疫苗的開發。將HA共有序列 =pVAX載體中，來作為DNA疫苗候選物，此係根 ，、ADVAX( - 種由 H〇 et al (Jin et al，（2〇〇2) 了 ％址 51 200911274 76 (5):2306-2216)開發的HIVDNA疫苗）類似的策略來 進行。第一次免疫後三週時，H5 DNA疫苗（pHA)在 有及沒有α-GalCer ( C1 )的情況下在小鼠之抗H5效價 上的劑量效應顯示於第四十八圖A。以5-45 pg之H5 DNA疫苗在有或沒有α-GalCer的情況下對小鼠進行免 疫’ H5 DNA為5-30 pg時，顯示α-GalCer會增強抗H5 反應，但在45 gg時會則達到高原期。在第二次免疫後 二週時，低劑量之H5DNA疫苗及a-GalCer (C1)在抗 H5效價上的效應顯示於第四十八圖b。當H5 DNA劑量 減少到0.2-5 pg時，〇c-GalCer的佐劑效應在所測試的所 有低劑罝當中相當明顯。以低劑量H5 DNA疫苗在有或 ^有C1、的情況下進行免疫後二週時，對抗以越南重配 流行性感冒病毒株（Vietnam reassortant influenza strain) NIBRG-14病毒進行攻毒的保護作用顯示於第四十八圖 C。以<2 pg加以處理的動物，於2〇 LD5〇之nibrg i4 在沒有oc-GalCer的情況下進行病毒攻毒時都益法存 活，而以0.2至i盹之1)11八與〜^1(：沉加以處理的， 則'80%的保護作$ (第四十八圖c)。這些發現確認了

…如⑺與低劑量PHA疫苗共同使用時會誘發對抗 NIBRG-14之免疫保護的佐劑效應。 十之其他a_GalCer類似物作為佐劑，而以 Ϊ ^ t -程類似的方式，與PHA疫苗一起在小鼠 BALB/cV^’-'l§己下相異之處。Η週大的雌性 =電極刺激轉殖（細―鈿）在 I ί ^a'〇alCer 11 ^ PHAc ^ ^ 進灯免疫並在四週後以相同的配方補強一-欠。為镇- 液樣本，並藉由贿 3 5的效價。第四十九圖a顯示了以 .Mg之PHA在有或沒有…⑽打或純此打類似物 52 200911274 C3、Cll、C13、C14及C16的情況下進行免疫後，小 鼠身上抗HA之專一性IgG抗體（Αγ3)的效價。第四 十九圖B顯示了以0.2 pg之PHA在有或沒有a_GalCer 或α-GalCer 類似物 CIO、C13、C18、C19 及 C2〇 的情況

下進行免疫後，小鼠身上抗HA之專一性丨π俨麯「Δν4、 的效價。第四十九圖c顯示，所測試的—^a_GalCer 類似物以如上方法進行病毒攻毒後，小鼠的存活百分 比。第五十圖A顯示了以0.5 pg之pha與指定a_GalCer 類似物進行免疫後的抗HA之專一性IgG抗體ζ AY4 )。 第五十圖Β顯示了在如上病毒攻毒後的存活分比。第 五十一圖顯示了以㈧〇·1μ§之 PHA0J+C26 ’在單因子變異數分析（〇ne_way an〇VA) Kruskal-Walis 測試中，p<0.01)或以⑻ 〇 2 呢之 pHA (pHA0·2對pHA0.2+C17，在單因子變異數分析 Kmskal-Walis 測試中 ’ p<0.01 ; pHA〇 2 對 pHA〇 2+C26， 則p<0.05)及指定α-GalCer類似物進行免疫後，小鼠身 上抗HA之專一性IgG抗體（AY5)的效價。第五十二 圖顯示了以（A) 0.1 pg 之 pHA 或（Β) 〇·2 pg 之 pHA 及 0.1 pg或1 pg之指定α-GalCer類似物進行免疫後，小鼠身 上抗HA之專一性IgG抗體（AY6 )的效價。在劑量0.2 gg之pHA時，作為佐劑特別有效的本發明之a_GalCer 類似物為C13、C17、C20及C26。 第五十三圖顯示了在以0.2 pg之pHAc及a-GalCer 或指定α-GalCer 類似物 C3、CIO、Cll、C13、C14、C16、 C17、C18、C19、C20、C23、C24、C26、7DW8-5 及明 礬進行免疫後，小鼠身上抗HAc之專一性IgG抗體(A) AY3、（B)AY4、（C)AY5 及(D)AY15 的效價。結果顯示， 在增強抗體效價方面，Cl、C13、C14、C17、C26&7DW8-5 的佐劑活性比其他藥物更好。為了研究HA專一性CD8 53 200911274 T細胞反應是否會因為將本發明之(χ-GalCer類似物作為 佐劑來使用而有所增強，進一步評估Cl、C26及 7DW8-5。如第五十四圖戶斤示，在α-GalCer類似物佐劑 組中，IFN-γ分泌細胞會增加。此外，在NIBRG-14病毒 攻毒後’ C1、C26及7DW8-5佐劑組的存活百分比會比 明礬佐劑組或單用pHA組更高（第五十五圖）。 在單一劑量之pHA免疫後，本發明ta_GalCer類 似物的佐劑效應也很明顯。在單一劑量免疫後三週時， 以C26及C1作為佐劑加以處理的小鼠身上的抗ha之 專一性IgG抗體會增加（第五十六圖）。以ci、C26或 7DW8-5加以處理之小鼠會受到有效的保護，不會因為 NIBRG-14病毒攻毒而致死’而其存活率範圍為從87.5% 至100%。這些發現指出，在單一免疫程序的設定中， Cl、C26及7DW8-5具有良好的佐劑活性。 對多餹免疫原的佐劑效應

Globo Η 是一種六酷（hexasaccharide) (Fucal-^ 2G_1—3GalNAcpl—3Galal—4Galpl->4Glcpi)，目前 已使用單株抗體MBrl (IgM)及VK-9 (IgG3)發現它 會在多種上皮細胞腫瘤中有過度表現的情形，如結腸 癌、印巢癌、胃癌、騰臟癌、子宮内膜癌、肺癌、前列 腺癌及乳癌。在正常組織中，globo Η會被限制在體腔 (lumen)邊緣之上皮細胞頂部的表面，這個位置不容 易受到免疫系統的影響。因此，globo Η是一種可用於 乳癌及其他上皮癌症之免疫治療的理想目標抗原。 本發明之α-GalCer及ot-GalCer類似物C23和 7DW8-5的佐劑效應係以與白喉類毒素（GH-DT)疫苗 共軛結合之globo Η來估計。在二週内，對BALB/c小 54 200911274 鼠以 IM 方式注射 globo Η-DT/a-GalCer 或 globo H-DT/a-GalCer類似物三次。第三次免疫後二週收集企 清’並使用多醣微陣列（glyCan microarray )，以1 : 480 及1 : 240稀釋物分別測試igG及IgM的抗globo Η之 專一性抗體。如第五十七圖Α所示，單用GH-DT不會 誘發任何抗globo Η抗體，但加入C1或7DW8-5後，會 引發顯著的IgG抗體生產。另一方面，只有在7DW8-5 佐劑組中觀察到IgM的生產，C1處理組則無（第五十 七圖B)。綜上所述，在GiI-DT疫苗中加入C1或7DW8-5 可增強對抗碳水化合物抗原之專一性抗體的生產。 抗微生物免疫治療 在又一觀點中，本發明之α-GalCer類似物具有如 治療感染病之用途，其中前述感染病係如病原性&生物 劑的存在而引起，而病原性微生物劑包括病毒、細菌、 真菌、原蟲、多細胞寄生蟲及異常蛋白（普利子蛋白 (prion)) ° 抗病毒效應： 抗病毒藥物是一種可專一地用於治療病毒感染的 藥物。和抗生素一樣，特定的抗病毒劑係用於特病 毒。它們對宿主的相對危害較小，因此可用以治療感 染。抗病毒藥物只能用於治療少數病毒性疾病。^兩^ 有用的抗病毒劑：核苷類似物及干擾素。干擾素共有二 種：α-、（3-及γ-干擾素。α^β-干擾素是經病毒^染: 細胞所分泌的細胞激素。它們會與鄰近細胞上的^ =性 受器結合’並保護這些細胞不受病毒感染。它們形成了 55 200911274 反應入侵之立即保護性宿主反應的一部分。 些^接k病毒效應以外’ ^及^干擾素也會增強= 和第II類MHC分子在感染細胞表面的表現，用 = 式來增強病毒抗原對專一性免疫細胞的呈獻。^主 感染急性期之體液來證明它們的存在。目前已 = 用、^已^使用重組之〇^β干擾素來治療慢性B型及匸 里肝火病母感染 '然而，副作用（如發燒、抑鬱及 減輕）會對這項用途形成限制。γ干擾素（免疫干夸 是-種由TH1 CD4細胞（原文作TH1 CD4 )所分泌&的細 胞激素。它的功能是增強專一性τ細胞免疫反應。、 干擾素的作用機制包括：1}專一性免疫反應 強’其中干擾素係藉由增加第ί型MHC分子在^染^ 胞表面的表現，來增加專一性細胞毒性Τ細胞辨識^殺 死感染細胞的機會，以及2)直接抗病毒效應：a)病毒'的 mRNA的分解及b)蛋白合成的抑制，可預防新細胞感染。 在一觀點中，本發明之合成性a_GalCer類似物可 用於抗病毒治療，且可預防多種感染性病毒。感染性病 毒係以會刺激保護性免疫反應者較佳，其可藉由本發明 之方法、或利用NKT細胞、疫苗或本發明之組成物來 達成，其實例包括但不限於：反轉錄病毒科（如人類免 疫不全病毒，例如HIV-1 (亦指如HTLV-III、LAV或 HTLV-III/LAV、或HIV-III);以及其他分離株，如 HIV-LP);小RNA病毒科（如、小兒麻痺病毒、a型肝 炎病毒；腸病毒、人類克沙奇病毒（human coxsackie virus)、鼻病毒(rhinovirus)、伊科病毒(ech〇virus));杯狀 病毒科（如會引起腸胃炎之病毒株）；彼衣病毒科（如 馬腦炎病毒(equine encephalitis virus)、德國麻疹病毒）； 黃病毒科（如登革熱病毒、腦炎病毒(encephalitis virus)、 黃熱病病毒(yellow fever virus));冠狀病毒科（如冠狀 56 200911274 病毒）；彈狀病毒科（如水疮性口炎病毒（vesicular stomatitis virus)、狂犬病病毒）；線狀病毒科（如伊波拉 病毒(ebola virus));副黏液病毒科（如、副流行性感冒 病毒、I思腺炎病毒、麻療病毒、呼·吸融合病毒病毒 (respiratory syncytial virus));正黏液病毒科（如流行性 感冒病毒）；布尼亞病毒科（如漢他病毒(Hantaan vims)、 布尼亞病毒、沙繩病毒(phlebovirus)及奈洛病毒(Nairo virus));沙狀病毒科（出血熱病毒（hemorrhagic fever vims));呼腸孤病毒科（如、呼腸孤病毒、環狀病毒 (orbivirus)及輪狀病毒）；雙核糖核酸病毒科；肝炎DNA 病毒科（B型肝炎病毒）；小DNA病毒科（小DNA病 毒）；乳多空病毒科（乳突病毒、多瘤病毒(polyoma virus));腺病毒科（大多數的腺病毒）；疱疹病毒科（單 純疮療病毒(herpes simplex virus，HSV) -1 及-2、水痘帶 狀范療病毒（varicella zoster vims)、巨細胞病毒 (cytomegalovirus，CMV)、疱療病毒）；痘病毒科（天花 病毒(variola virus)、牛痘病毒(vaccinia virus)、痘病毒）； 以及虹彩病毒科（如非洲豬瘦病毒(African swine fever virus));以及未分類之病毒（如海綿狀腦病（Spongiform encephalopathies)之致病原、D 型肝炎（delta hepatitis)之 致病原（被認為是B型肝炎病毒之缺陷衛星病毒、非A 非B型肝炎之致病原（第1類為内部感染[internally transmitted];第2類為非經口傳染，即C型肝炎；諾沃 克病毒(Norwalk virus)及其相關病毒；以及星狀病毒 (astrovirus))。 57 200911274 病毒攻毒：流行性感置瘂竟-H1N1感染 读過IP注射α-GalCerJli以來進行治療 第五十八圖顯示了在流行性感冒病毒H1N1感染 後0至12天時的小鼠存活率。小鼠係以2吨2a_GalCer (Cl )或oc-GalCer 類似物 C2、C3、C9、Cll、C13、C14 及C16加以處理（IP注射）’並與對照組DMS0進行比 較。測試三種不同的治療療程。第五十八圖A顯示了在 H1N1病毒攻毒後30分鐘開始進行處理之BALB/c小鼠 的存活率。與對照組相較之下’ P值為Cl : 0.4554、C2 : 0.5149、C3 : 0.5764、C9 : 0.5466、Cll : 0.2031、C16 : 0.0359。第五十八圖B顯示了在( WSN)病毒攻 毒前二週開始進行處理之BALB/c小鼠的存活率。在-14 天、-10天、-3天、0.5小時、2天、4天、6天、8天、 10天及12天時，以（IP注射）2 pg之對照物、a-GalCer (Cl)或α-GalCer類似物來處理小鼠。病毒攻毒前二週 開始進行處理時，每週給予二次，以a-GalCer類似物進 行處理之小鼠會展現出比所測試之所有類似物（C9、 Cn、C13及C14)明顯增強的存活率。與對照組相較之 下，P 值為 C1: 0.000116、C9 : 0.000126、C11 : 0.02627、 C13 : 0.000027、及 C14 : 0.000147。第五十九圖顯示了 感染較高劑量流行性感冒病毒H1N1之小鼠的累計存活 比例。第五十九圖A顯示了在H1N1 ( WSN)病毒攻毒 前二週開始進行處理之BALB/c小鼠。在-14天、-10天、 -3天、0.5小時、2天、4天及6天時，以（IP注射）2 pg 之對照物、cc-GalCer ( C1 )或α-GalCer類似物來處理小 鼠。第1組是對照組。第6組係以α-GalCer (C1)加以 處理。第7組係以α-GalCer類似物C13加以處理。第8 組係以α-GalCer類似物C14加以處理。第9組係以 58 200911274 oc-GalCer類似物C16加以處理。a_GaiCer類似物ci6 顯示存活時間會延長，指出Cl6具有直接抗病毒效應。 逮過鼻内故予α-GalCer類似物谁行虛採 第五十九圖B顯示了感染H1N1之小鼠的累計存 活比例。在H1N1 (WSN)病毒攻毒前一小時，透過鼻 内途徑以對照物、α-GalCer (C1)或α-GalCer類似物 C13、C14或C16來處理BALB/c小鼠。C13顯示存活時 間會延長’ 5兒明匕具有直接抗病毒效應。一般來說，有 些α-GalCer類似物可能會發揮直接抗病毒效應’或者透 過免疫刺激來間接作用。第六十圖顯示了 MDCK細胞 (Madin-Darby canine kidney cell)的活體外細胞病變效 應（cytopathetic effect，CPE )。MDCK 細胞係以 10 pg/ml 之媒劑、α-GalCer 或α-GalCer 類似物 C13、C14 或 C16 當中一種進行預處理四小時，接著感染10TCID50的 FLU-A病毒血清型H1N1 ( WSN)。感染後48小時測定 MDCK細胞中的病毒效價（右方圖面）。α-GalCer及三 種所測試的α-GalCer類似物顯示，它們會輕微地抑制活 體外H1N1病毒之進入/複製。 抗囷效應. 自從1940年代以來將青黴素引入臨床使用後，抗 菌物質已經拯救了數百萬條生命。然而，抗微生物耐受 性那條長長的陰影顯示，我們仍有回到抗生素前時期的 危機。合成性醣脂質（如α-GalCer)及天然的細菌醣脂 質係以CDl-d配位體來表現，它會活化NKT細胞且對 宿主的抗菌功能有所貢獻。已有文獻顯示，oc-GalCer之 59 200911274 才几囷活性能夠改善結核分枝桿菌的感染、及清除綠腹桿 菌（Pseudomonas aeruginosa)之肺臟感染。透過醣脂質 來活化NKT細胞也可以在小鼠身上降低莢膜鞘氨醇| 胞菌（Spingomonas capsules )及大鼠埃立克體（Ehdichia muris )的感染。 可能可以運用透過本發明之方法、或利用本發明 之NKT細胞、疫苗或組成物來刺激保護性免疫反應的 治療或預防感染性細菌’其實施例包括但不限於：幽門 螺旋桿菌（Helicobacter pylori )、伯氏疏螺旋菌（B〇rrelia burgdorferi )、嗜肺性退伍軍人菌（Legi〇ndla pneumophilia ),克雷白氏肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae)、分枝桿菌屬（Mycobacterium sp.，如結核 分枝桿菌（M. tuberculosis)、鳥型分枝桿菌（μ. avium)、 胞内分枝桿菌（M. intracellulare)、堪薩斯分枝桿菌（μ. kansaii)、戈登氏分枝桿菌（M. gordonae))、金黃色葡萄 球菌（Staphylococcus aureus )、奈瑟氏淋病雙球菌 (Neisseria gonorrhoeae )、奈瑟氏腦膜炎雙球菌 (Neisseria meningitidis )、單核球增多性李斯特菌 (Listeria monocytogenes )、化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes ’為A型鍵球菌）、無乳鍵球菌（streptococcus agalactiae ’為B型鏈球菌）、鏈球菌（綠色鏈球菌 (viridans group))、糞鏈球菌（streptococcus faecalis)、 牛鏈球菌（Streptococcus bovis)、鏈球菌（嫌氣屬）、肺 炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae )、病原性彎曲桿菌 屬（Campylobacter sp·)、腸球菌屬（Enterococcus sp.)、 彼衣菌屬（Chlamydia sp.)、流行性感冒嗜血桿菌 (Haemophilus influenzae )、炭疽桿菌（Bacillus anthracis )、白喉棒狀桿菌（Corynebacterium diphtheriae)、棒狀桿菌屬（Corynebacterium sp·)、紅斑 60 200911274 丹毒絲狀菌（Erysipelothrix rhusiopathiae )、產氣莢膜芽 孢梭菌（Clostridium perfringens )、破傷風芽抱梭菌 (Clostridium tetani )、產氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes)、敗血性巴氏桿菌（Pasteurella multocida)、 類桿菌屬（Bacteroides sp·)、具核梭形桿菌 (Fusobacterium nucleatum )、念珠狀鏈桿菌 (Streptobacillus moniliformis)、梅毒螺旋體（Treponema pallidum)、細弱螺旋體（Treponema pertenue)、鉤端螺 方疋體（Leptospira )、以色列放線菌（Actinomyces israelii)、莢膜鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas capsules) 及弗蘭斯氏兔熱菌（Francisella tularensis )。 經爽膜鞋風醉早胞菌〔Sphingomonas capsules)感染之 止的細菌靡清率增袢 ^ 莢膜勒氨醇單胞菌是一種常見的環境菌株，在很 多地方如空氣和水中都可以找到。因為它的菌落是黃色 的以可以在瓊脂培養盤上輕易地鑑定出來。和大多 f g氏，性（Gramnegative)細菌不同的是，莢膜鞠 ，醇，t滴不3月曰多醋（Lps )，這是一種動物用來活化 几菌活性的物質。由於醣脂質抗原的抗菌活性是透 Ϊ二醋脂質結合之CD1_d分子_ NKT細胞的活化來達 此使用莢膜鞘氨醇單胞菌感染之疾病模型來評 效度會著重在經醣脂質結合所活化、且由ΝΚΤ 二二之路徑上。對六至八週大的雌性C5 7BL/6小鼠以 式注射莢膜鞘氨醇單胞菌細胞。感染後四小時，對 r Γι ί ί方式注射50或100㈣峰之對照物、a_GalCer ' )f a-GalCer 類似物（C3、C9、Cll、C14、C16 ， 。細菌感染後二十四小時，從小鼠身上取出肝 61 200911274 臟，並將之均質化。將稀釋後的樣本舖入捭 測定英媒勒氨醇單胞菌在肝臟均質物中的\|二出， =咖）。於W培養4M、時後，行成; :十二圖A顯示了在細菌感染24小時後，經⑽ =Cer及C11、C14及C16處理之組別的cfu數 =，其係顯著少於對照組。為了確認這些〜(^1(：以類似 物的抗菌效度，在另一研究中重複此項研究，在相同的 疾病模型中以50 pg/kg來處理經感染之小鼠。第六十一 ，B顯示，以C11、ci4、C16及C15處理之小鼠的抗 菌效度要比未處理組來得顯著。在三個有效組C1、C11 及C15中’每克肝臟中之CFU值的差異並沒有統計上 的顯著意義。第六十三圖顯示，以50 |ug/kg之C23及 C30處理之組別的CFU數目（肺臟内）要比未處理組來 得顯著。以C23及C30處理小鼠後，其肝臟CFU數目 也有類似的結果。 雷白氏肺炎桿jj ( Klebsiella pneumoniae) 息的細菌廓清率增強 克雷白氏肺炎桿菌是一.種革蘭氏陰性細_ ’匕_ 引發肝膿瘍，在台灣，它還會在糖尿病人身上變成/穆 嚴重的疾病。第六十二圖顯示了 C1及C14均讦在注射 後顯著減少小鼠肺臟及肝臟的細菌量。以強迫餵食的方 式對BALB/cByl雌性小鼠投予單一劑量之活體克雷白 民肺炎桿菌。在細菌感染後4小時及8小時，雨次對 鼠注射100 pg/kg之對照物、a-GalCer或α-GalCer類似 物C14。感染後二十四小時，收集各小鼠之肝臟及肺臟j 教將之均質化。細菌計數係以前文所述的方式來力σ以$ 定。 62 200911274 率，清除率會高於Cl的清除 第1 夕、種感染性真菌的保護中’輔助型τ細胞 真菌藥ti用ία:療Τ，似物可用於抗真菌治療。抗 S iif虛的患者身上的發展。真菌感染已緩 成為一項會引起免疫抑制患者發病及死亡的首要因子。 抗真菌疾病之先天性宿主防禦係基於吞喔細胞 ”巧伽胞）的仙來進行；這独胞的數目 和功此可藉由多種集落刺激因子（CSF)來加以調控。 \ 另方面，後天性防禦牽涉到細胞性及體液性免疫，需 要^原呈獻細胞、T淋巴球、:B淋巴球及NK細胞之間 的交互作用，而前述細胞係由細胞激素如IL_2及IFN_丫 所驅動及調控。細胞激素所引起的免疫活化在對抗機會 性真菌（opportunistic fungi)之宿主防禦中的重要性已 經成為幾項研究的課題’且已在念珠菌（Candida)及麴 菌（Aspergillus)感染有關之新穎抗真菌策略方面引發 了一些有趣的問題。目前已描述了細胞激素的不同潛在 角色。首先，對真菌及其抗原的暴露可能會誘發IL-2、 IFN-γ、腫瘤壞死因子-a (TNF-α)、顆粒球集落刺激因 子（G-CSF )及顆粒球-巨嗟細胞集落刺激因子（GM-CSF ) 的釋出。這些細胞激素可能會回頭活化或增強吞噬細胞 對抗念珠菌及麴菌種的抗真菌功能。 希望藉由單獨投予本發明之a-GalCer類似物或將 之與抗真菌藥物一起投予而達到刺激保護性免疫反應 63 200911274 之目標的感染性真菌包括但不限於：新型隱球菌 (Cryptococcus neoformans )、笑臈組織胞漿菌 (Histoplasma capsulatum)、粗球孢子菌（c〇ccidi〇ides immitis )、皮义牙生囷（Blastomyces dermatitidis )、砂眼 披衣菌（Chlamydia trachomatis)、白色念珠菌（Candida albicans)。其他感染性有機體（即原生生物）包括：瘧 原虫虫屬（Plasmodium sp.)、利什曼原蟲屬（Leishmania sp.)、血吸蟲屬（Schistosoma sp.)及弓蟲屬（Toxoplasma sp.)。 自體免疫疾病之免疫治瘵 自體免疫疾病是免疫系統調控失常的結果，會引 起針對自體抗原和組織的發炎性反應。自體免疫疾病是 美國第二常見見的疾病種類，僅次於癌症和心臟病；大 約有族群的5%-8%或14-22百萬人受到影響。自體免疫 疾病涉及T淋巴球對自體抗原的破壞，其包括但不限 於：多發性硬化症、胰島素依存性糖尿病、及類風濕性 關節炎。 根據最新的論點，發炎性自體免疫疾病如心肌炎 主要係參與TH1反應，並以lFN-γ作為原型細胞激素 (prototypic cytokine);而由 IL-4 所主導的 TH2 反應， 一般則認為它會降低自體免疫◊因為本發明2a_GalCer 類似物可以被設計成會啟動TH2偏移之免疫原性反應的 類型’因此這些α-GalCer類似物可以用於自體免疫疾病 的免疫治療。 64 200911274 實施例 α-GalCer之醣脂質類似物、試劑及小畠f 合成本發明之α-GalCer (Cl)及合成性a-GalCer 類似物’並以管柱層析加以純化’其技術係已描述於下 列文獻：？_〇61&1.(2006)了.人111.0^111.8〇〇· 128:9022-9023 ； Xing et al. (2005) Bioorg. Med. Chem. 13:2907-2916 ； Kinjo et al. (2005) Nature 434:520-525 ； Wu et al. (2006) Natl. Acad. Sci. U. S. A 103:3972-3977 ； 以及 Wu et al. (2005) Proc. Natl· Acad. Sci. U. S· A 102:1351-1356 ;以上各項係合併於本文作為參考文獻之 用。 基於化學結構，將本發明之合成性α-GalCer類似 物分成四組，如第二圖所示。第I組：細菌源的C2、C3 及C14 ;第II組：C4、C5及C9，其包含在神經醯胺（C4) 上、或在半乳糖部分（C5、C9)之3”-OH之硫酸基上 之0-鍵結的硫修飾；第III組：C6-C8、C8-5、C8-6、 C10-C1卜C15-C16及C18-C33係在其醯基尾部以芳族 環加以修飾；第IV組：C12、C13及C17包含截短之植 物鞘氨醇。 鞘糖脂化合物C12及C13之合成係簡示於流程圖 1 (第五十三圖）。這些化合物之定性數據如下所示。 化合物 C13 (序號 MFJ3-017-1) : 4 NMR (500MHz， CDCl3-MeOH 4:1) δ: 7.26 (m, 2H)? 7.23-7.19 (m, 2H), 7.18-7.14 (m, 1H), 4.90 ((1,/= 3.9 Hz, 1H), 4.24-4.19 (m, 1H), 3.86 (dd, 10.8, 5.2 Hz, 1H), 3.82-3.62 (m, 7H), 3.58-3.53 (m, 2H), 2.92-2.84 (m, 1H), 2.67 (ddd, J- 13.7, 9.3, 7.5 Hz, 1H), 2.16 (m, 2H), 2.06-1.98 (m, 1H), 65 200911274 1.74-1.65 (m, 1H), 1.62-1.53 (m, 2H), 1.33-1.19 (m, 44H), 0.88 (t, J 二 7.0 Hz, 3H). 13C NMR (125MHz, CDCl3-MeOH 4:1) δ: 174.06, 141.93, 128.25, 128.01, 125.43, 99.48, 74.60, 70.75, 70.44, 69.99, 69.52, 68.66, 67.03, 61.69, 50.15, 50.06, 36.27, 34.13, 31.67, 31.59, 29.43, 29.31, 29.15, 29.09, 25.55, 22.41, 17.60, 13.76. HRMS (ESI-TOF) for C44H80NO9+ [M + H]+ calcd 766.5827, found 766.5813. 化合物 C12 (序號 MFJ3-018-1) : 4 NMR (400MHz， CDCl3-MeOH 4:1) δ: 7.26 (m, 2H), 7.19-7.13 (m, 3H), 4.91 (d, J = 3.8 Hz, 1H), 4.20 (q, J = 4.4 Hz, 1H), 3.95-3.85 (m, 2H), 3.83-3.61 (m, 6H), 3.59-3.50 (m, 2H), 2.63 (t, J= 7.5 Hz, 2H), 2.20 (t, J= 7.5 Hz, 2H), 1.78-1.54 (m, 6H), 1.47-1.17 (m, 46H), 0.89 (t, J= 6.9 Hz, 3H). 13C NMR (100MHz, CDCl3-MeOH 4:1) δ: 174.16, 142.27, 127.91, 127.77, 125.14, 99.33, 74.28, 71.38, 70.42, 69.86, 69.33, 68.51, 66.84, 61.40, 50.02, 36.04, 35.52, 31.93, 31.51, 31.21, 29.26, 29.14, 28.99, 28.94, 25.47, 25.08, 22.25, 13.51. HRMS (ESI-TOF) for C46H84N09+ [M + H]+ calcd 794.6140, found 794.6129. 所有合成性α-GalCer類似物一開始都溶解於l 〇〇〇/〇 DMSO，〉辰度為1 -2 mg/ml。在活體内實驗中，合成性 α-GalCer類似物係在注射到小鼠身上之前，先於鹽溶液 (saline)中稀釋成20 pg/m卜無病原體感染之6-10週 大BALB/c (野生型或CDld剔除）及C57BL/6雌性小 鼠係得自國家實驗動物中心（台灣，台北），並在國防 醫學院之無菌動物設施中飼養。 66 200911274 人類NK細胞抶、来成熟單核球源之樹穿細 NK/NKT細胞的分齙及味成 經α-GalCer類似物衝擊之人類NKT細胞株的生成 係依照Fujio et al.的方法來進行，這些細胞係用來估算 所研究之α-GalCer類似物的細胞激素反應（見第五圖及 第六圖）。與 300 U/ml 之 GM-CSF 及 100 U/ml 之 IL~4 培養二天後，從富含白血球之濃厚液（leukopaks)之 CD14+細胞中取得未成熟的DC細胞。在放射作用（3,〇〇〇 rad)後，將iDC細胞與自體的CD161+細胞在1〇〇 ng/mi α-GalCer及10 U/ml IL-2存在的情況下共同培養1 〇天。 重複此一刺激後，會生成NK細胞株，其會表現 CD161+/CD3+/Voc24iTCR+ (純度 99%)。為生成未成熟 的人類單核球源之DC細胞，將富含白血球之濃厚液中 的 CD14+細胞在 300 U/ml GM-CSF 及 100 U/ml IL-4 存 在的情況下培養6天。這些DC細胞具備未成熟的表現 型（CD14_CD80+CD86+CD83 弱111^1)11+)，且展現出較 成熟DC細胞更高的CDld表現。使iDC細胞接受3 pg/ml 之多種a-GalCer類似物的衝擊，並在48小時後檢驗其 表現型及形態。 使用間接共軛結合抗CD161之多分類微粒 (multi-sort microbeads)來分離用於TCR活化實驗之原 態NKT細胞（CD161+/CD3+)(見第十九圖），並使用抗 CD3微粒來做進一步的分離。分離後的細胞係在1〇〇 U/ml IL-2存在的情況下進行培養，每3天補充一次新鮮 的培養基。 活體外之人類NKT細胞細胞激素分泌測定法 將Va24i人類NKT細胞（ΙχΙΟ5個）與5xl04個 67 200911274 經放射處理之未成熟的CD14 DC細胞在l〇 pg/ml本發 明之α-GalCer類似物存在的情況下於96孔平底盤中共 同培養。在18小時時收集上清液中的細胞激素/趨化因 子，以 Beadlyte® Human 22-plex Multi-Cytokine Detection System 力口 以定量，並以 Luminex® 100TM 系 統進行測定。 iNKT細胞之活體外擴增 藉由抗CD56微粒的使用，從人類富含白血球之濃 厚液中分離出在iNKT細胞擴增實驗中使用的人類 CD56+細胞（NK/NKT混合物）（見第十三圖及第十四 圖）。人類CD56+細胞（包括NK/NKT細胞）係在第2 天與4xl05個自體之未成熟的CD14+ DC細胞以施予3 pg/ml之指定α-GalCer類似物或0.3% DMSO濃度之下共 同培養18小時（見第十三圖及第十四圖）、或在第2天 時與將在1 〇或100 ng/ml之指定α-GalCer類似物處理之 自體之未成熟的CD14+DC細胞共同培養18小時（見第 十五圖）。在第3天時，將懸浮細胞移入新培養盤中， 在100U/mlIL-2存在的情況下進行培養，每3天補充一 次新鮮的培養基。第9天時，以流式細胞法在NK/NKT 混合物中圈取（gate)出CD161+/Va24TCR+細胞群，並 計算Va24i NKT細胞總數。 人類NKT細胞之ΤΓΑ活化 在一實施態樣範例中，將HeLa、HeLa-CDld或自 體的iDC細胞在24孔盤中與10 pg/ml之Cl、Cll、C13 或C17、或與DMSO共同培養2小時，之後加入3xl05 68 200911274 個原態CD161+/CD3+NKT細胞（見第十九圖）。在另一 實施態樣範例中，將HeLa或HeLa-CDld細胞與100 ng/ml 之 Cl、C16、C23、C8-5、C8-6 或 C26、或與 DMSO 共同置入2小時，之後加入3xl05個原態CD161+/CD3+ NKT細胞（見第二十圖）。在5-10分鐘的刺激後，將懸 浮液中的細胞移入管中，以PBS清洗，以Beadlyte® Cell Signaling Universal Lysis Buffer 於 4°C 進行溶胞。再以 Beadlyte⑧ Phosphoprotein Detection System 依照測定程 序來估算溶胞產物中的磷-CD3s (磷-酪胺酸）、磷 -ERK1/2 (Thrl85/Tyrl87)、磷-CREB (Serl33)、磷-Syk (磷-酪胺酸）、磷-p38 ( Thrl80/Tyrl82 )、磷-ΙκΒα (Ser32 )、磷-Lck、磷-Lat、磷-STAT3( Ser727 )、磷-STAT5 A/B (Tyr694/699)及磷-Dap-70 (磷-絡胺酸）的濃度， 並以LuminexlOO系統加以測定。其值使用投入蛋白總 量加以正規化。 企清細胞激素/趨化因子 在投予媒劑或本發明之合成性a_GalCer類似物後 0、2、18、36、48及72小時後，收集小鼠血清樣本。 以 Beadlyte® Mouse 21-Plex Cytokine Detecetion System 來測量多種細胞激素/趨化因子之血清濃度，並以 Luminex® 100TM系統讀出數值。 小鼠脾臟細胞之製備 經本發明之指定a_GalCe]r類似物或媒劑處理的 BALB/c小鼠在注射後72小時犧牲，收取脾臟。簡言之， 將脾臟壓過70 μπι之過濾器並使紅血球溶胞後，使有核 69 200911274

細胞再懸浮於 Hank’s Balanced Salt Solution 中，並於 4〇C 在3〇o g離心5分鐘，之後進行FACS分析。 小鼠之肺癌模型 /對C57BL/6小鼠（6_8週、雌性）以w方式注射 懸浮於0.1 mlPBS中的2xi05個同基因型之肺癌（TC1) 細胞。在1小時時’以本發明之指定a_GalCer類似物（每 隻小鼠2 pg)或媒劑來處理分組的OWL/6小鼠（η#)， 每Ϊ兩次’共處理四週。記錄體重-個月，並監測其存 活情形50天。 小鼠之乳癌模φ)

Sub〇i ^ (6、8週、雕性）的右後背上以 腫f個同基因型之乳癌（4τι)細胞。 腫瘤接種後3天，以ιν々。 α-GalCer類似物或姐^ SubQ的方式用本發明之指定 (n=6)，每週兩次處理分組的BALB/c小鼠 射位置在腫瘤接種位置=四週。類似：= 積，共記錄一個月，f彳。母3天記錄一次腫瘤胆 轴（b)及高度（c)進係使用測徑器沿著長軸⑷、短 公式axbxc來計瞀，剛量。腫瘤體積（mm3)係以 ^且戒娜其存活情形54天。 統計分析 使用非成對雙尾舉4 數據分析。圖形領亍-/ t檢定與PRISM軟體來進打 示SD值。使用對势=重複實驗之平均值，誤差線係表 '、列檢定（log-rank test)來分析各 70 200911274 組之腫瘤保護的差異。P<0.05視為統計顯著。 抗菌效 α二QalCer之醣脂晳類似物 在本抗菌研究中使用之α-GalCer類似物C3、C9、 C11及C14-C17的結構係顯示於第二圖。α-GalCer類似 物儲存溶液係製備為1 mg/ml之DMSO溶液。使用前， 以磷酸鹽緩衝溶液（PBS)將α-GalCer類似物稀釋至10 gg/ml。 動物及細菌 使用6-8週大的C57L/6及BALB/c-Byl雌性小鼠 進行研究。小鼠關在塑膠籠中，可自由取用食水，實驗 開始前有至少一週適應期。莢膜鞘氨醇單胞菌菌株 (ATCC 14666)係得自台灣BCRC。克雷白氏肺炎桿菌 菌株（NTUH-KP2044)係台灣台大醫院王錦堂博士的贈 禮。 星_里經莢膜鞘氨醇單胞菌威染之小鼠推杆抗菌效度硬 對六至八週大的雌性C57BL/6小鼠以IP方式注射 5xl〇8個莢膜鞘氨醇單胞菌的細胞。將小鼠分為處理組 及對照組，每組4-6隻小鼠。感染四小時後，對處理組 I氣以IP方式注射5〇或1〇〇 gg/kg之測試用〇c-GalCer =似物，且對對照組小鼠注射相同體積的pBS。細菌感 染二十四小時後，犧牲所有組別的小鼠。從小鼠身上取 200911274 出肝臟，並使用組織均質機，以0.9% NaCl、0.02% Tween 80將之均質化。將稀釋後的樣本鋪入培養盤中來測定在 肝臟均質物中莢膜鞘氨醇單胞菌的菌落形成單位 (CFU)。於37〇C培養48小時後，進行菌落計數。 使用克雷白氏肺炎桿菌感染之小鼠進行抗菌效度研究 對BALB/c-Byl雌性小鼠（每組十隻小鼠）以強制 餵食的方式投予單一劑量（1〇6 CFU)之活體克雷白氏 肺炎桿菌。對處理組小鼠注射1〇〇 pg/kg之測試用 α-GalCer類似物兩次，分別在細菌感染後4小時及8小 時時進行。對照組小鼠則是在4及8小時時注射PBS。 感染二十四小時後，犧牲所有的小鼠。從各小鼠身上收 集肝臟及肺臟，並將之均質化。以與前述類似的方式來 進行細菌計數。 統計分析 測試用α-GalCer類似物之比較效度係以處理組與 對照組之器官的CFU值比較來加以描述，而效度的顯著 性係以p值表示，分別為<0.05或<0.01。 【圖式簡單說明】 本專利或本申請案係包含至少一個彩色圖式。提 出申請並繳納規費後，可由官方提供本專利或本專利申 請案之公開文件附有彩色圖式的複本。 第一圖（A-B)係顯示自然殺手T細胞（NKT細胞） 功能之示意圖。第一圖A顯示的是一般示意圖。第一圖 72 200911274 B ^員二的Γ本發明之°°半乳糖神經醯胺（a-GalCer)及 = 物如何與CDld結合並刺激快速的Τη1及 ΤΗ2細胞激素反應。 第二圖顯示本發明之oc-GalCer ( C1 )和多種 α-GalCer醣脂質（亦翻員似物）的化學結構，其包括： 細菌源之脂質（C2、C3及C14)、、㈣化修飾之酷脂 質（C4、C5及C9)、苯基_炫基鏈醣脂質（C6_C8、 C10-C11、C15-C16、C18-C33、7DW8-5 (即 C8-5)及

7DW8-6 (即C8-6))及經植物鞘氨醇截短之醣脂質 (C12、C13 及 C17)。 第三圖顯示本發明之C12及C13 α-GalCer類似物 的合成流程圖。 第四圖顯示經本發明之α-GalCer或指定oc-GalCer 類似物處理的鼠類1.2融合瘤的〗l_2細胞激素分泌量 (pg/ml) ° 第五圖（A-C)顯示（A) IFN-γ及 IL-4、（B) IL-2 及 IL-6、以及（C) IL-12及IL_l〇細胞激素生產的「增加倍 數」，其值已用DMS〇對照組加以正規化，係藉由本發 明之α-GalCer或指定a_GaiCer類似物處理人類CD161 + CD3+NKT細胞、並將之與自體之未成熟的CD14+DC 細胞共同培養而得出。左側圖面係指TH1型反應，而右 侧圖面係指Th2型反應、。 第六圖（A-B)顯示（A)人類CD161+CD3+NKT細胞 之純度與（B) IFN-y/IL-4細胞激素生產比率的「增加倍 數」，其值已用得自第五圖所示數據之對照組（DMSO) 加以正規化。 第七圖為一表格，顯示了第五圖及第六圖之人類 73 200911274 NKT細胞經本發明之α-GalCer或指定α-GalCer類似物 處理後，上清液中較基準細胞激素濃度增加的倍數。 第八圖（A-F)顯示（Α) IFN-γ、（B) IL-4、（C) IFN-y/IL-4 比率、（D) IL-2、（E) IL-12 及(F) IL-6 細胞激 素生產的「增加倍數」，其值已用對照組（DMSO)加以 正規化’係藉由本發明之α-GalCer或指定oc-GalCer類似 物處理原態人類NKT細胞、並將之與自體之未成熟的 DC細胞共同培養而得出。 第九圖顯示會對本發明之指Sa_GalCer類似物產 生反應之iNKT細胞總數的倍數變化。 第十圖（A-E)顯示下列各項的IFN-γ細胞激素生產 情形：（A)原態iNKT細胞與自體的樹突細胞共同培養、 (B)原態iNKT細胞與HeLa-CDld細胞共同培養、（C)經 α-GalCer衝擊之iNKT細胞與HeLa-CDld細胞共同培 養、以及(D)經α-GalCer類似物C11衝擊之iNKT細胞與 HeLa-CDld細胞共同培養；其值已用媒劑對照組 (DMSO)加以正規化；係以本發明之α-GalCer或指定 α-GalCer類似物加以處理。（E)顯示了在人類原態iNKT 細胞、經α-GalCer衝擊之iNKT細胞、以及經α-GalCer 類似物Cl 1衝擊之iNKT細胞中，IFN-γ細胞激素生產的 不同基準量。 第十一圖（A-C)顯示了以本發明之α-GalCer或指定 α-GalCer類似物處理人類原態iNKT細胞的（A) IFN-γ細 胞激素分泌量（pg/ml)、（B) IL-4細胞激素分泌量（Pg/ml) 及（C) IFN-y/IL-4 比率。 第十二圖為一表格，指出第十圖以本發明之 α-GalCer或指定ot-GalCer類似物處理人類NKT細胞的 上清液中，較基準血清濃度增加的倍數。 74 200911274 第十三圖顯示了人類CD56+細胞（NK/NKT混合 物）與自體之未成熟的CD14+樹突細胞共同培養、且用 本發明之α-GalCer或指定α-GalCer類似物加以衝擊後 的擴增情形以流式細胞表示的數據。已顯示NK/NKT混 合物中的CD161+/Va24TCR+細胞百分比。 第十四圖顯示第十三圖之NK/NKT混合物中的 iNKT細胞總數（103)。 第十五圖（A-B)顯示了人類CD56+細胞（NK/NKT 混合物）與經本發明之a-GalCer或指定a-GalCer類似物 衝擊後的自體之未成熟的CD14+樹突細胞共同培養而有 所擴增的表示性流式細胞數據。（A)顯示了 NK/NKT混 合物中CD161+/Vot24TCR+細胞百分比的表示性流式細 胞數據，而（B)顯示了 NK/NKT混合物中iNKT細胞總數 的增加倍數。 弟十六圖顯不了在未成热的人類DC細胞與本發 明之a-GalCer或指定ot-GalCer類似物共同培養後，表面 蛋白 CD40、CD80、CD86、CD83、以及第二類 MHC 細 胞表面受器HLA-DR在樹突細胞（DC細胞）上的表現 量，以平均螢光強度（MFI)表示。 第十七圖（A-B)顯示了本發明之α-GalCer類似物 C13促進人類單核球源之DC細胞的成熟。（A)顯示了 DC細胞對C13有所反應後之CD40、CD80、CD83、CD86 及HLA-DR表現的圖形。（B)顯示了 DC細胞與C13共 同培養48小時後的形態。 第十八圖顯示了 iNKT細胞受器訊息傳遞路彳呈的 示意圖。 第十九圖（A-E)說明了本發明之α-GalCer類似物如 75 200911274 何促進人類NKT細胞的CD 1 d依存性τ細胞受器（tcr ) 活化。（A)顯示了 Hela細胞及其cDld轉染株 Hela-CDld，後者表面的CDld過度表現。（B)顯示了細 胞内磷-CD3s的量。（C)顯示細胞内磷—ERK1/2的量。（D) 顯示細胞内填-Syk的量。（E)顯示細胞内填-CREB的量。 第二十圖（A-L)說明了本發明之α-GalCer類似物如 何促進原態人類iNKT細胞（Va24+)的CDld依存性τ 細胞党器（TCR)活化。（Α)顯示分離之原態人類Va24+ T細胞之流式細胞測定。（B_l)顯示了 iNKT細胞之TCR 活化情形。HeLa或HeLa-CDld細胞先與a_GalCer或 α-GalCer 類似物 C16、C23、7DW8-5、7DW8-6 或 C26 加在一起，之後加入原態Va24+T細胞。測量下列經碟 酸化之蛋白在細胞内的量，並以平均螢光強度表示，其 值用投入蛋白總量加以正規化：（B)—_CD3s (磷_酪& 酸）、（C)鱗-CREB (Ser-133)、（D)碟-ERK1/2 (Thr-185/ Tyr-187)、（E)麟-P38 (Thr-180/Tyr-182)、（F)填-ΙκΒα (Ser32 )、(G)磷-Lck、(Η)石粦-Lat、(I)磷-STAT3( Ser727 )、 (J)碟-STAT5A/B ( Tyr 694/699)、（K)磷-Syk (磷-赂胺酸） 及(L)填-Zap-70 (磷-赂胺酸）。* :與dmSO對照組相較 之下，p<0.05。# :與a_GalCer 組相較之下，p<〇.〇5。 第二十一圖（A-C)顯示本發明之a_GalCer類似物如 何誘發較南的細胞擴增情形，並展示出其與CDld限定 之NKT及T細胞的結合能力較高。在靜脈内（IV )注 射〇·1 μδ/小鼠的媒劑、α-GalCer或指定a_GalCer類似物 後72小時，收取BALB/c小鼠的脾臟。測定(A)小鼠ΝΚτ 細胞或(Β)Τ細胞的百分比。（c)顯示了 a_GalCer及指定 〇t-GalCer類似物對CDld限定之NKT及τ細胞具有不 同的結合性親和力。 76 200911274 第二十二圖（A-D)顯示了兩種NKT細胞亞群的 CDld依存性擴增情形，以及對本發明之α-GalCer類似 物有所反應的NK活化。（A-C)顯示了兩種NKT細胞亞 群的CDld依存性擴增。注射本發明ia_GalCer或指定 α-GalCer類似物72小時後，收取BALB/c野生型（WT) 或CD1 KO小鼠的脾臟。用FACS來估算有所反應的（B) WT或(C) CD1 KO小鼠之NKT細胞及其標識為NKT1 及NKT2之兩個亞型細胞的總數。（D) NK細胞的CDld 依存性活化作用。用FACS來估算有所反應的WT (左 方圖面）或CD1 KO (右方圖面）小鼠中NK細胞總數 的擴增情形。 第二十三圖（A-C)顯示了在靜脈内（IV)注射媒 劑、本發明之α-GaICer或指定α-GalCer類似物後〇、2、 18、36、48、72 小時，多種細胞激素(A) IFN-Y、（B) IL-4 及(C) IFN-y/IL-4比率的小鼠血清值（pg/ml)。其值已用 DMSO對照組加以正規化。 第二十四圖（A-C)顯示了在以IV方式注射媒劑、 本务明之α-GalCer或指定α-GalCer類似物後2小時及 18小時’多種細胞激素/趨化因子(A) IFN_y、（b)il-4及 (C) IFN-y/IL-4比率的小鼠血清值（pg/ml)。 第二十五圖為一表格，顯示了以IV方式注射本發 明之α-GalCer或指定a_GalCer類似物的bALB/c小鼠的 上清液結果（高於基準細胞激素濃度的增加倍數）。所 有細胞激素/趨化因子在注射後2小時達到高峰，但標有 *者係在18小時達到高峰。 、第二十六圖（A-Η)顯示了在第二十三圖中以IV方 式注射媒劑、α-GalCer或α-GalCer類似物後所反應的（A) 有核細胞總數及脾臟大小、（B)包括成熟的樹突細胞在内 77 200911274 之先天免疫細胞群、（C)已活化之NK細胞、（D)已活化 之NKT細胞、（E)活性B細胞、⑺活性CD8+ T細胞、 (G)活性CD4+T細胞及（H)CD8+/CD4+T細胞比率。所有 值已用DMSO對照組加以正規化。 第二十七圖（A-C)顯示了在皮下（SubQ)注射媒 劑、本發明之α-GalCer或指定oc-GalCer類似物後0、2、 18、36、48、72 小時，多種細胞激素(A) IFN_y、（b) IL-4 及(C) IFN-y/IL-4比率的小鼠血清值。其值已用DMSO 對照組加以正規化。 第二十八圖（A-Η)顯示了在第二十七圖中以SubQ 方式注射媒劑、α-GalCer或α-GalCer類似物後所反應的 (A)有核細胞總數及脾臟大小、（B)包括成熟的樹突細胞 在内之先天免疫細胞群(C)已活化之NK細胞、（D)已活 化之NKT細胞、（E)活性B細胞、（F)活性CD8+T細胞、 (G)活性CD4+T細胞及(h)CD8+/CD4+T細胞比率。所有 值已用DMSO對照組加以正規化。 第二十九圖（A-C)顯示了在肌肉内（IM)注射媒 劑、本發明之α-GalCer或指定α-GalCer類似物後〇、2、 18、36、48、72 小時，多種細胞激素(A) IFN-γ、（B) IL-4 及(C) IFN-y/IL-4比率的小鼠血清值。其值已用DMSO 對照組加以正規化。 第三十圖（A-Η)顯示了在第二十九圖中以IM方式 注射媒劑、α-GalCer或α-GalCer類似物後所反應的（A) 有核細胞總數及脾臟大小、（B)包括成熟的樹突細胞在内 之先天免疫細胞群（C)已活化之NK細胞、（D)已活化之 NKT細胞、（E)活性B細胞、（F)活性CD8+ T細胞、（G) 活性CD4+ T細胞及(H)CD8+/CD4+ T細胞比率。所有值 已用DMSO對照組加以正規化。 78 200911274 或J C劑圖顯示”投藥途徑（IV、SubQ 似物於細胞激素動x明之a-GaCer或指定a-GalCer類 應。㈧顯示了： 胞擴增/活化方面的欵 IL-4的小鼠血清值”小二值（Pg/ml)。⑻顯示了 率（μ 。dpg/ml)。（)顯示了 IFN_Y/IL_4 的比 總數。（E)顯示了 了*鼠有/亥細胞（脾臟細胞）的 免疫細胞群。(F)IsM中包括成U樹突細胞在内之先天 顯示了脾臟中()=了脾臟中，化之皿細胞-ΛΑ W : T已化之NKT細胞群。⑻顯示了脾脇、J 的活性B細胞群。（1)顯示了脾臟中的活性CD8+ τ * t 群。y)顯示了脾臟中的活性CD4+T細胞群Q(K)=i CD8 /CD4+ T細胞比率。所有分析的進行係用媒劍= 以正規化。 、、’力Π 第二十二圖（A-Η)顯示了 IV投予a_GalCer類似物 C11或媒劑後所反應的脾臟細胞擴增/活化之劑量 應。（A)顯示了小鼠有核細胞（脾臟細胞）的總數。 顯示了脾臟中包括成熟的樹突細胞在内之先天免疫細 胞群。（^)顯示了脾臟中的已活化之NK細胞群。 示了脾臟中的已活化之NKT細胞群。（E)顯示了脾臟‘中 的單核球顆粒球細胞群。（F)顯示了脾臟中的活性CD4+ T 細胞群。（G)顯示了脾臟中的活性CD8+Τ細胞群 顯示了脾臟中的活性Β細胞群。所有分析的進行係用 劑組加以正規化。 、 第三十三圖顯示了在以IV方式注射媒劑、本發明 之α-GalCer 或多種a_GalCer 類似物後 0、12、24、36、 48、72小時，多種細胞激素⑻iFN-γ、（b) IL-4及（c) IFN-y/IL-4比率的小鼠血清值。其值已用媒劑對照、級加 以正規化。 79 200911274 第三十四圖為一表格，顯示了第三十三圖中以ιν 方式注射本發明之α-GalCer或指定α-GalCer類似物之 BALB/c小鼠的上清液結果（高於基準細胞激素濃度的 增加倍數）。所有細胞激素/趨化因子在注射後2小時達 到高峰，但標有*者係在18小時達到高峰。 第三十五圖（A-G)顯示了對野生型BALB/c (wt) 及CDldKOBALB/c (CD1 KO)小鼠以IV方式注射媒 劑、本發明之α-GalCer或指定a_GalCer類似物後2小時 及18小時之多種細胞激素/趨化因子的血清值（pg/ml)。 (A) IFN-γ、⑼ IL-4、（C) IFN-Y/IL_4 比率（log 10)、（D) IL-10、（E) IL-12p70、（F) KC、（G) MCP-1。 第三十六圖（A-I)顯示了對C57BL/6小鼠以IV方式 注射媒劑、本發明之α-GalCer或指定a-GalCer類似物後 之脾臟細胞擴增/活化情形；而（G-I)顯示了對C57BL/6 1生型（Wt)及CD1 KO小鼠以iv方式注射媒劑、本 發明之oc-GalCer或指定a-GalCer類似物後，兩個NKT 細胞亞群針對CDld依存性活化情形。（A)顯示了 =5=BL/6小鼠有核細胞（脾臟細胞）的總數。（B)顯示了 =t的樹突細胞群。（C)顯示了已活化之NK細胞群。（D) 2不了活,I±CD4+T細胞群。（E)顯示了活性CD8+T細胞 ί示了 CD8+/CD4+ T細胞的比率，其值已用 Wt d公士照組加以正規化。顯示藉由流式細胞來測定 、乳身上的Νκτ細胞（左下方圖面）時，Νκτ細胞 NKT#方圖面）及其兩個亞型ΝΚΤ1 (右上方圖面）和 身卜右下方圖面）的總數。（H)顯示了 CD1 KO小鼠 胞的她細胞的總數。（1)顯示了 Wt小氣身上Treg細 ⑽數。所有分析的進行係用媒劑組加以正規化。 第—十七圖（A-B)顯示了本發明之α-GalCer類似物 200911274 如何延長帶有肺癌之小鼠的存活期。C57BL/6小鼠以ιγ 接種小鼠肺癌細胞（TC-1)，之後以對照物、本發明之 a GalCer或指疋〇t-GalCer類似物加以處理，每週兩次， ς處理四。（A}严員示了第I組a_GalCer類似物的測試結 一（B)顯示了第II組α-GalCer類似物的測試結果。（c) j示了第IH組0^&1〇61·類似物的測試結果。⑼顯示了 第IV組α-GalCer類似物的測試結果。所顯示者，為帶 有肺癌之小鼠的KaplanMeier存活曲線（左方圖面）及 其在體重上的變化（右方圖面）。對照組為未進行腫瘤 接種的小鼠。 第三十八圖（A-B)顯示下列部位的腫瘤結節及其大 小：（A)以α-GalCer類似物C11或對照組處理、且於腫 瘤接種TC-1細胞後第16天犧牲之小鼠的肺臟表面，以 及(B)以α-GalCer類似物C11或對照組處理、且SubQ腫 瘤接種小鼠乳癌細胞（4T-1)後第16天犧牲之小鼠的皮 下腫瘤。 第三十九圖（A-B)顯示了皮下接種小鼠乳癌細胞 4T_1、且在接種後三天以對照物、本發明之a_GalCer或 指定α-GalCer類似物處理之小鼠的Kaplan Meier存活曲 線（左方圖面）及其腫瘤生長（右方圖面），其中前述 處理係每週兩次，共處理四週，處理方式為（A)以IV方 式注射或(B)以SubQ方式注射。 第四十圖顯示了以IV或SubQ方式注射a-GalCer C C1 )處理▼有乳癌之小鼠的Kapian Meier存活曲線。 在延長帶有乳癌之小鼠的存活時間方面，C1的SubQ遞 送會比IV遞送有效。 第四十一圖（A-C)_示本發明之a_GalCer類似物治 療性抗癌程序在投藥劑量上的最適化結果 81 200911274 (optimization)。IV接種小鼠肺癌細胞（TC-l )、之後 以多種劑量之α-GalCer或ot-GalCer類似物7DW8-5或 C26處理之C57BL/6小鼠的體重變化（右方圖面）及 Kaplan Meier存活曲線（左方圖面），其中前述處理係每 週兩次或每週一次，共處理四週。（A) α-GalCer。（B) α-GalCer 類似物 7DW8-5。（C) α-GalCer 類似物 C26。 第四十二圖（A-C)係藉由多種途徑和頻率來顯示本 發明之α-GalCer類似物的治療性抗癌程序最適化結 果。（A)顯示了 SubQ接種小鼠乳癌細胞4T-1、且在接種 後三天以媒劑、本發明之α-GalCer或指定α-GalCer類似 物處理之BALB/c小鼠的腫瘤體積（mm3)(右方圖面） 及Kaplan Meier存活曲線（左方圖面），其中前述處理 係以IV或SubQ途徑為之，每週兩次，共處理四週。（B) 顯示了 IV接種小鼠肺癌細胞TC-1、且在接種三天後以 媒劑、本發明之α-GalCer或指定α-GalCer類似物處理之 C57BL/6小鼠的體重變化（右方圖面）及Kaplan Meier 存活曲線（左方圖面），其中前述處理係每週兩次，共 處理四週，以IV或SubQ途徑為之。（C)顯示了投藥頻 率對於IV接種小鼠肺癌細胞TC-1、之後以媒劑或 α-GalCer類似物C16處理之C57BL/6小鼠在體重（右 方圖面）及Kaplan Meier存活曲線（左方圖面）方面的 影響，其中前述處理係每週兩次或每週一次，共處理四 週，以IV途徑為之。 第四十三圖（A-B)顯示了本發明之多種α-GalCer類 似物的抗癌效度評估。C57BL/6小鼠係以IV接種小鼠 肺癌細胞TC-1、或以SubQ接種小鼠黑色素細胞瘤B16 細胞，之後以媒劑、本發明之α-GalCer或指定a-GalCer 類似物加以處理，每週一次，共處理四週。（A)顯示了 Kaplan Meier存活曲線。（B)顯示了腫瘤體積（mm3 )生 82 200911274 長曲線。 第四十四圖（A-B)顯示了以SQ接種（A)肺癌細胞 (TC-1-GRP-螢光素酶）或(B)乳癌細胞（4T-1-GFP-螢光 素酶）、之後以媒劑、本發明之α-GalCer或指定α-GalCer 類似物處理之C57BL/6小鼠的腫瘤生長的真實時間估 算，其中前述處理係每週一次，共處理四週。 第四十五圖（A-Η)顯示本發明之τΗ1偏移a-GalCer 類似物會在肺臟腫瘤和黑色素細胞瘤中引發更多腫瘤 浸潤性淋巴球。（A-D)顯示了肺癌細胞（tc，1 )中的腫 瘤浸潤性淋巴球。C57BL/6小鼠係以〇.〗μ§/小鼠之媒 劑、α-GalCer 或oc-GalCer 類似物 C23、C8-5 或 C30 加 以處理，每週一次，共處理三週。（A)顯示了 CD3+細胞 群。（B)顯示了 CD8 T細胞群。（〇顯示了 NK細胞群。 (D)顯示了 NKT細胞群。所有分析的進行係用媒劑組加 以正規化。（E-Η)顯示了黑色素細胞瘤細胞中的腫瘤浸潤 性淋巴球。C57BL/6小鼠係以〇.1 μ§/小鼠之媒劑、 α-GalCer 或α-GalCer 類似物 C23、C8-5 或 C30 加以處 理，每週一次，共處理三週。（E)顯示了 CD3+細胞群。 (F)顯示了 CD8 T細胞群。（G)顯示了 NK細胞群。（H) 顯不了 NKT細胞群。所有分析的進行係用媒劑组加以 正規化。 第四十六圖（A-B)顯示了明礬、a_GalCer及 二Galfer類似物C11在針對破傷風類毒素（ττ)蛋白疫 苗之抗體反應上的佐劑效應。（八)以ττ與習知佐劑明 礬、α-GalCer或a_GalCer類似物cu共同/進行免疫或 不與習知佐劑明礬、a-GalCer或a_GalCer類似物C11 共同進行，疫的小鼠在第0天（第一次免疫）及第28 天（4週-第二次免疫）的情形。每週收取血清，以測定 83 200911274 抗TT之專一性抗體。（b)顯示了第四十六圖B顯示了習 知佐劑明礬、α-GalCer及α-GalCer類似物C11在第二次 免疫後延遲抗原補強二十週時的效應。 第四十七圖顯示了在第三次免疫後二週時，習知 佐劑明礬、本發明之α-GalCer及多種α-GalCer類似物在 包含H1N1病毒株M2蛋白之細胞外功能域（M2e)的 胜肽上的佐劑效應。係以5或45 pg之M2e胜肽與 α-GalCer及多種a_GalCer類似物共同進行免疫、或不與 之共同進行免疫之BALB/c小鼠在第0、3及6週時的情 形。 第四十八圖（A-C)顯示了 α-GalCer ( C1)在以pHA 進行免疫之小鼠身上的佐劑效應，其中PHA為一包含禽 流感病毒H5共有序列全長的DNA質體。（A)在第0週 及第3週時’以5及epg之pHA與C1共同進行免疫、 或不與之共同進行免疫的小鼠。（B)以低劑量PHA疫苗 與C1共同進行免疫、或不與之共同進行免疫的小鼠。 (C)顯示了在以H5 DNA疫苗與C1共同進行免疫、或不 與之共同進行免疫後二週時，對抗20 LD5〇之越南重配 流行性感冒病毒NIBRG-14之病毒攻毒的保護效果。 第四十九圖（A-C)顯示小鼠在以pHA與C1或指定 本發明之α-GalCer類似物共同進行免疫、或不與之共同 進行免疫後，誘發抗HA專一性IgG抗體的情形。（A) 顯示了小鼠以0.2 pg之pHA進行免疫後的抗HA專一性 IgG抗體（AY3 )效價。⑻顯示了小鼠以0.2 pg之PHA 進行免疫後的抗HA專一性IgG抗體（AY4)效價。（C) 顯示了病毒攻毒後的小鼠存活百分比。 第五十圖（A-B)顯示了小鼠在以pHA與C1或指定 本發明之α-GalCer類似物共同進行免疫、或不與之共同 84 200911274 進行免疫後，誘發抗HA專一性IgG抗體的情形。（A) 顯示了在以0.5 pg之pHA與本發明之指定a_GalCer類 似物進行免疫後的抗HA專一性IgG抗體（AY4)效價。 (B)顯示了病毒攻毒後的存活百分比。 第五十一圖(A-B)顯示了小鼠在以(△)〇」MgpHA 或(B) 0.2 pgpHA與指定本發明2a_GaiCer類似物共同 進行免疫後的抗HA專一性IgG抗體（AY5)效價。 第五十二圖（A-B)顯示了小鼠在以〇」吨pHA 或(B) 0.2 pg pHA與0.1从名或1 gg本發明之指定 α-GalCer類似物共同進行免疫後的抗HA專一性IgG抗 體（AY6)效價。 第五十三圖（A-D)顯示了藉由本發明之a_GalCer或 指定α-GalCer類似物來誘發抗HA專一性Ig(}抗體的情 形。BALB/c小鼠係以a-GalCer或指定a_GalCer類似物 與pHAc —同在肌肉中藉由電極刺激轉殖來進行免疫， 並在4週後以相同的製備物補強一次。在第二次免疫後 2週時收集血液樣本，並藉由ELISA來測試抗HAc |一 性IgG抗體效價。（A)顯示了抗HA專一性 (H顯示了抗HA專一十生1gG抗體（AY4 ) 效仞。（C)抗HA專一性IgG抗體（Αγ5)效價 示了抗HA專一性IgG抗體（Αγ16)效價。、‘'、、、 第五十四圖（Α-Β)顯示了似專_性之跡 用細胞小鼠係以PHAc及本發明之a_Galct 或指定夕Gal,C:i:類似物在肌肉中藉由電極刺激轉殖 進行免疫，亚在二週後以相同的製備物補強—次。 天後測定的點（spots)，〇5)與11八專—性之胜 共同培養的脾臟細胞。 （mer) 第五十五圖顯示了對抗病毒攻#的保護作用。 85 200911274 BALB/c小鼠係以pHAc及本發明之a_Gaicer或指定 α-GalCer類似物在肌肉中藉由電極刺激轉殖來進行免 疫，並在三週後以相同的製備物補強一次。小鼠在第二 次免疫後二週時以200 LD% NIBRG-14病毒進行攻毒， 並監測小鼠的存活情形。 第五十六圖（A-B)顯示單一劑量的免疫效應。 BALB/c小鼠係以pHAc (2 pg)及本發明之α-GalCer或 指定α-GalCer類似物（2pg)在肌肉中藉由電極刺激轉 殖來進行免疫。（A)三週後收集血液樣本，並測試抗HAc : 專一性IgG抗體效價。（B)小鼠在促發（prime)後三週 時以200 LD5GNIBRG-14病毒進行攻毒，並監測其存活 情形。 第五十七圖（A-B)顯示了本發明之α-GalCer或指定 α-GalCer類似物在碳水化合物抗原上的佐劑效應。 BALB/c小鼠係以IM方式注射與glob〇 Η-DT混合之 α-GalCer或指定α-GalCer類似物進行免疫’並在二週間 内補強兩次。在第三次免疫後二週時收集血液樣本，並 測試其(A)抗globo Η專一性IgG抗體及(B)抗globo Η專 (一性IgM抗體的生產情形。 第五十八圖（A-B)顯示了透過腹腔内（IP)途徑以 本發明之α-GalCer或指定α-GalCer類似物處理之 BALB/c小鼠的存活率，（A)起始點為以FLU-A病毒血清 型H1N1 ( WSN)病毒攻毒後30分鐘’（B)起始點為在 H1N1病毒攻毒前2週。 第五十九圖（A-B)顯示了感染H1N1 ( WSN )、並以 本發明之α-GalCer或指定α-GalCer類似物處理之 B ALB/c小鼠的累計存活比例，（A)起始點為以高劑量 H1N1 ( WSN)病毒進行病毒攻毒前2週’（B)透過鼻内 86 200911274 途徑來進行。 第六十圖（A-B)顯不了 MDCK細胞（Madin-Darby canine kidney細胞）的活體外細胞病變效應（CPE )。（A) 顯示了 MDCK細胞用10 pg/ml之媒劑、a-GalCer或 oc-GalCer類似物C13、C14或C16之中一個預處理四小 時、接著用10TCID50之FLU-A病毒血清型H1N1( WSN) 感染後的結果。（B)顯示了 MDCK細胞在感染後48小時 的病毒效價。 第六十一圖（A-B)顯示了在感染莢膜鞘氨醇單胞菌 之小鼠身上以（A) 100 pg/kg或(B) 50 pg/kg本發明之 α-GalCer或指定α-GalCer類似物進行處理的抗菌效度。 第六十二圖(A-B)顯示了在感染克雷白氏肺炎桿菌 之小鼠身上以本發明之α-GalCer或指定α-GalCer類似 物進行處理的抗菌效度。注射後，C1及C14可顯著減 少（A)小鼠肺臟及(B)肝臟中的細菌量。 ’、' 弟六十三圖顯示了以50 jag/kg之C23及C30處理 之組別的CFU數目（肺臟中）會比未經處理之組別更加 顯著。 σ 【主要元件符號說明】 益 87

Claims (1)

1. 200911274 十、申請專利範圍： 1. 一種在患者身上活化細胞激素反應的方法，其含 有： 對患者投予一有效量之化合物或其鹽或其混 合物，其中前述化合物係選自由C2-C8、C8-5、C8-6 及C9-C33所組成之組群，而前述患者之後天免疫 系統包括一細胞群，且前述細胞群包括至少一種淋 巴球及至少一種抗原呈獻細胞； 由前述化合物與前述抗原呈獻細胞形成一複 合物，其中前述複合物之形成會使前述淋巴球上的 受器活化；以及 活化前述淋巴球，以產生前述細胞激素反應。 2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中前述細胞 激素反應為會產生TH1細胞激素的TH1型細胞激素 反應。 3. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中前述TH1 細胞激素係選自由 IFN-Y、IL-ip、IL-2、IL-3、IL-8、 IL-12、IL-15、TNF-α、GM-CSF、RANTES、ΜΙΡ-1α 及MCP-1所組成之組群。 4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中前述細胞 激素反應為會產生TH2細胞激素的TH2型細胞激素 反應。 5. 如申請專利範圍第4項所述之方法，其中前述Th2 細胞激素係選自由 IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、 RANTES、MIP-la及MCP 1所組成之組群。 6. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中前述化合 物的投予係藉由下列方式來完成：皮下投藥、靜脈 88 200911274 内投藥、鼻内投藥或肌肉内投藥。 7. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中前述至少 一種淋巴球為T淋巴球。 8. 如申請專利範圍第7項所述之方法，其中前述T淋 巴球為自然殺手T細胞。 9. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中前述自然 殺手T細胞為不變型自然殺手T細胞（invariant Natural Killer T cell)。 10. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中前述至少 一種抗原呈獻細胞為樹突細胞。 11. 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中前述樹突 細胞為未成熟或成熟的樹突細胞。 12. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中前述化合 物係與前述抗原呈獻細胞上的CD1分子形成複合 物。 13. 如申請專利範圍第12項所述之方法，其中前述CD1 分子為CDld分子。 14. 如申請專利範圍第7項所述之方法，其中前述T淋 巴球上的受器為T細胞受器。 15. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其進一步含有： 刺激至少另一種淋巴球，以產生前述細胞激素 反應。 16. 如申請專利範圍第15項所述之方法，其中前述至少 另一種淋巴球為辅助型T細胞（T helper cell)。 17. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中前述化合 物的投予會使前述患者之後天免疫系統中的細胞群 擴增。 89 200911274 18. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中前述患者 患有癌症或感染病。 19. 如申請專利範圍第4項所述之方法，其中前述患者 患有自體免疫疾病。 20. 一種疫苗，其含有： 一有效量之化合物或其鹽或其混合物，其中前 述化合物係選自由C3、Cll、C13-C14、C16-C18、 C20、C22-C24、C26、C8-5 及 C8-6 所組成之組群； 以及 一疫苗劑。 21. 如申請專利範圍第20項所述之疫苗，其中前述疫苗 劑係選自由死體微生物、活體減毒病毒微生物、類 毒素、及去活性或減毒之微生物的片段所組成之組 群。 22. 如申請專利範圍第21項所述之疫苗，其中前述微生 物為細菌或真菌。 23. 如申請專利範圍第21項所述之疫苗，其中前述類毒 素為破傷風或白喉類毒素疫苗。 24. 如申請專利範圍第20項所述之疫苗，其中前述疫苗 劑能夠在已投予前述疫苗之患者身上引發免疫反 應。 25. 如申請專利範圍第24項所述之疫苗，其中前述化合 物係作為免疫佐劑，且能夠調整或增強藉由前述疫 苗劑刺激免疫系統而引發之免疫反應，且會使該患 者對該疫苗產生比沒有該化合物時更猛烈的反應。 26. 如申請專利範圍第24項所述之疫苗，其中前述疫苗 係藉由下列方式投予該患者：皮下投藥、靜脈内投 90 200911274 藥、鼻内投藥或肌肉内投藥。 27. 一種抗腫瘤免疫治療之方法，其含有： 對患者投予一有效量之化合物或其鹽或其混 合物，其中前述化合物係選自由C3、C10-C17、 C19-C28、C30及C8-5所組成之組群。 28. 如申請專利範圍第27項所述之方法，其中前述化合 物的投予係基於癌症、高度癌症風險或癌前前驅細 胞當中至少一種情形為之。 29. 如申請專利範圍第28項所述之方法，其中前述化合 物的投予會在腫瘤及癌細胞當中至少一種引發反 應。 30. 如申請專利範圍第29項所述之方法，其中前述被引 發之反應是前述腫瘤的生長減缓。 31. 如申請專利範圍第29項所述之方法，其中前述被引 發之反應是前述腫瘤的尺寸縮小。 32. 如申請專利範圍第29項所述之方法，其中前述化合 物的投予會影響後天免疫系統，其中前述後天免疫 系統包括一細胞群，且前述細胞群包括至少一種淋 巴球，而前述被引發之反應係指前述後天免疫系統 中的細胞群擴增。 33. 如申請專利範圍第32項所述之方法，其中前述後天 免疫系統中的細胞群擴增包括T細胞、CD8 T細 胞、NK細胞或NKT細胞的大量擴增。 34. 如申請專利範圍第27項所述之方法，其進一步含 有：提供一種添加了前述化合物的癌症疫苗。 35. 如申請專利範圍第28項所述之方法，其中前述癌症 係選自由肺癌、乳癌、肝細胞瘤、血癌、固態瘤（solid 91 200911274 tumor)及癌瘤（carcin〇ma)所組成之組群。 36· 種抗微生物免疫治療之方法，其含有： 對心者投予一有效量之化合物或其鹽或其混 5物，其中前述化合物係選自由C9、C11、C11C16、 C23及C30所組成之組群。 37.如申睛專利範圍第36項所述之方法，其中前述化合 物的技予係基於病原性微生物劑存在所引起之感染 病為之。 38.如申請專利範圍第37項所述之方法，其中前述病原 性微生物劑係選自由病毒、細菌、真菌、原蟲、多 細胞寄生蟲及異常蛋白（aberrant protein)所組成之 組群。 39. 如申請專利範圍第38項所述之方法，其中前述病原 性微生物劑為病毒。 40. 如申請專利範圍第39項所述之方法，其中前述病毒 係選自由下列各項所組成之組群：反轉錄病毒科 (Retroviridae )、小 RNA 病毒科（)、

   杯狀病毒科（Cfl/c/WrzWize )、披衣病毒科 ()、黃病毒科（F/aWrzWae )、冠狀病毒 科（CoronavzWi/ae)、彈狀病毒科、 線狀病毒科（)、副黏液病毒科 (Paramyxoviridae ) 正黏液病毒科 (Orthomyxoviridae ) 布尼亞病毒科 (Bungaviridae)、沙狀病毒科（Arenaviridae)、呼 腸孤病毒科（及⑼)、雙核糖核酸病毒科 (Birnaviridae )、肝炎 DNA 病毒科 (Hepadnaviridae ) 小 DNA 病毒科 92 200911274 C Parvoviridae)、乳多空病秦科（Papovaviridae)、 腺病毒科（)、疱療病毒科 (//erpesv/rzWae )、痘病毒科（尸〇χνζ>/ί/ββ )及虹彩 病毒科（/nWoWrzWae )的病毒。 41. 如申請專利範圍第38項所述之方法，其中前述病原 性微生物劑為細菌。 42. 如申請專利範圍第41項所述之方法，其中前述細菌 係選自由下列各項所組成之組群：幽門螺旋桿菌 (Helicobacter pylori )、伯氏疏螺旋菌（Borrelia burgdorferi )、嗜肺性退伍軍人菌（Legionella pneumophilia )、克雷白氏肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae)、分枝桿菌屬（Mycobacterium sp.)、 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus )、奈瑟氏 淋病雙球菌（Neisseria gonorrhoeae)、奈瑟氏腦膜 炎雙球菌（Neisseria meningitidis)、單核球增多性 李斯特菌（Listeria monocytogenes )、化膿性鏈球菌 (Streptococcus pyogenes )、無乳鏈球菌 (Streptococcus agalactiae )、鏈球菌、糞鏈球菌 (Streptococcus faecalisi)、牛鏈球菌（Streptococcus bovis)、肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae)、 病原性彎曲桿菌屬（Campylobacter sp.)、腸球菌屬 (Enterococcus sp.)、披衣菌屬（Chlamydia sp.)、 流行性感冒嗜血桿菌（Haemophilus influenzae )、炭 疽桿菌（Bacillus anthracis )、白喉棒狀桿菌 (Corynebacterium diphtheriae )、棒狀桿菌屬 C Corynebacterium sp.)、紅斑丹毒絲狀菌 (Erysipelothrix rhusiopathiae )、產氣莢膜芽孢梭菌 93 200911274 (Clostridium perfringens )、破傷風芽抱梭菌 (Clostridium tetani )、產氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes )、克雷白氏肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae )、敗血性巴氏桿菌（Pasteurella multocida)、類桿菌屬（Bacteroides sp.)、具核梭形 桿菌（Fusobacterium nucleatum )、念珠狀鏈桿菌 (Streptobacillus moniliformis )、梅毒螺旋體 (Treponema palladium)、細弱螺旋體（Trep0nema pertenue)、鉤端螺旋體（Leptospira)、以色列放線 菌（Actinomyces israelii )、莢膜鞘氨醇單胞菌 (Sphingomonas capsules )及弗蘭斯氏兔熱菌 (Francisella tularensis ) 〇 43. 如申清專利範圍弟41項所述之方法，其中對串者投 予前述化合物的細菌清除率較未對患者投予前述化 合物的情形為高。 44. 如申請專利範圍第37項所述之方法，其中前述化合 物的投予會使前述微生物劑死亡。 45. 如申請專利範圍第37項所述之方法，其中前述化合 物的投予會使前述微生物劑無法生長。 46. —種以式1之結構表示的化合物：

   其中 R 係選自（CH2)i〇Ph(/?-Ph-F)、（CH2)6Ph、 (CH2)8P1i 或(CH2)10Ph〇-OMe)。 6 94