PT1848813E - Activação de glicolípidos bacterianos de células nkt restritas ao cd1d - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"ACTIVAÇÃO DE GLICOLÍPIDOS BACTERIANOS DE CÉLULAS NKT RESTRITAS AO CDld"

DECLARAÇÃO RELATIVA A INVESTIGAÇÃO FINANCIADA PELO GOVERNO FEDERAL

Esta invenção foi feita com o apoio do governo dos Estados Unidos concedido por National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Disease (Bolsa N° AI053725). 0 governo dos Estados Unidos tem certos direitos nesta invenção.

INTRODUÇÃO A molécula CDld é um membro da família Cl de moléculas associadas a β2 microglobulina. Em contraste com as moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) da classe I e II apresentadoras de antigénios de proteínas a células T CD8+ e CD4+, respectivamente, as moléculas CDl evoluíram para capturar e processar tanto os antigénios estranhos como os auto-antigénios de lípidos para apresentação a células T. Demonstrou-se que as moléculas CDla, b e c apresentam antigénios microbianos estranhos a células T TCRaP humanas. Em contraste, as células T restritas ao CDld, ou células NKT, são uma ΡΕ1848813 população de células de memória/efectoras semelhantes a inatas que exprimem tanto os receptores de NK como uma TCR conservada, semi-invariante (Vai4-Jal8/νβ8 em murganhos e να24-ύα18/νβ11 em seres humanos). Tal como as células NK, as células NKT exprimem ARNm constitutivamente mas não proteína para IFN-γ, evidenciando a sua fase efectora estável. As células NKT foram implicadas na supressão da auto-imunidade e rejeição de enxertos, promoção de resistência aos agentes patogénicos e promoção da imunidade tumoral.

Enquanto as células NKT são conhecidas por responderem à α-GalactosilCeramida (aGal-Cer) , um ligando substituto derivado de uma esponja marinha, a falta de conhecimento sobre os seus antigénios naturais impediu anteriormente a compreensão dos mecanismos da sua activação periférica e recrutamento, bem como o seu desenvolvimento tímico.

Os inventores identificaram anteriormente um antigénio endógeno natural, isoglobotri-hexosilceramida (iGb3), que é apresentado às células NKT por células dendríticas activadas por LPS. Este trabalho sugere que iGb3 é um ligando primário para as células NKT. No entanto, a diversidade parcial da cadeia β do TCR sugere que a especificidade para antigénios naturais múltiplos pode ser possível. ΡΕ1848813 3

SUMÁRIO

Descreve-se aqui a surpreendente constatação dos inventores de que glicolípidos derivados de membros da classe Alphaproteobacteria também actuam como ligandos naturais de moléculas CDld para activar células NKT.

Num aspecto, a invenção proporciona um método de activação de uma célula NKT compreendendo fazer contactar a célula NKT com um glicolipido bacteriano complexado com uma molécula CDld. Em algumas formas de realização, o glicolipido bacteriano pode ser derivado de um membro da classe Alphaproteobacteria.

Noutro aspecto, a invenção proporciona um método de indução da expressão de citoquinas por uma célula NKT compreendendo fazer contactar um receptor de células T da célula NKT com um glicolipido bacteriano complexado com uma molécula CDld.

Ainda noutro aspecto, a invenção proporciona um método de estimulação de uma resposta imunitária num indivíduo compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de células NKT activadas por contacto de um receptor de células T das células NKT com um glicolipido bacteriano complexado com uma molécula CDld.

Noutros aspectos, a invenção proporciona métodos para melhorar a eficácia de vacinas, promover a rejeição de 4 ΡΕ1848813 tumores, modular a auto-imunidade, inibir a hipersensibi-lidade induzida por alergénios e tratar uma infecção num indivíduo por administração de uma quantidade eficaz de um gl icolípido bacteriano derivado de um membro da Classe Alphaproteobacteria.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A FIG. IA ilustra a secreção de IFN-γ dependente de CDld por células NKT de murganho e humanas estimuladas com bactérias mortas pelo calor ou aGal-Cer. Média e desvio padrão de 3 experiências. A FIG. 1B ilustra a proliferação de células NKT numa cultura de células de baço estimuladas com bactérias mortas pelo calor ou aGal-Cer. Os pontos de dados mostram médias e desvios padrão de três experiências separadas. A FIG. 1C ilustra a proliferação de células NKT em resposta a estímulos bacterianos ou aGal-Cer. Na fila superior, a coloração com CDld-aGal-Cer/B220 de células de baço com separação e percentagem de células NKT indicadas. Na fila inferior, o perfil de diluição de CFSE de 5xl03 células NKT separadas. A FIG. 2A ilustra IFN-γ libertado por células de baço inteiras cultivadas com Salmonella typhimurium, Sphingomonas capsulata e Ehrlichia Muris mortas pelo calor durante 48 horas. 0 painel à esquerda mostra os dados como 5 ΡΕ1848813 percentagem do controlo de tipo selvagem. 0 painel da direita mostra os dados como média e desvio padrão de dois a três experiências separadas. A FIG. 2B ilustra o bloqueio de respostas das células NKT humanas a DC mais antigénio por lectina IB4. Dados semelhantes foram obtidos em duas experiências. A FIG. 2C ilustra a estimulação de respostas de células NKT de murganho ao antigénio bacteriano apresentado por DC Hexb+/~ ou Hexb”7”. Dados semelhantes foram obtidos em duas experiências. A FIG. 3A ilustra estruturas de antigénios de paredes celulares de Sphingomonas sintéticos. PBS 50 é uma β-glucuronosilceramida de controlo. A FIG. 3B ilustra a resposta de IFN-γ de uma linha de NKT Va24-Jal8 humana e células NKT de murganho purificadas frescas estimuladas por antigénios lipídicos sintéticos e DC. Os dados apresentados são a média e o desvio padrão de duas experiências separadas. A FIG. 3C ilustra a coloração de tetrâmero CDld de células NKT humanas (fila superior) e células de baço de murganho (fila inferior) com glicolípidos sintéticos. O isolamento de células NKT e as percentagens são como indicados. 6 ΡΕ1848813 A FIG. 4A ilustra a activação in vivo de células NKT 24 horas após infecção intravenosa com Sphingomonas (lxlO7), Ehrlichia (lxlO8) e Salmonella (lxlO6). Obteve-se resultados semelhantes em 2 experiências. A FIG. 4B ilustra a produção de IFN-γ por células NKT em resposta a Salmonella. A diferença entre Hexb+/+ e Hexb_/_ foi significativa para Salmonella (p = 0,001) . Três murganhos por grupo, foram analisadas e obteve-se resultados semelhantes em 2 experiências independentes. A FIG. 4C ilustra a carga bacteriana nos pulmões de murganhos CDld+/_ e CDld~7~ após infecção com as UFC indicadas de Sphingomonas (cada barra representa 4 a 5 murganhos). Estão indicados o aumento em X e os valores de p. Estão ilustradas duas experiências representativas. A FIG. 4D ilustra a letalidade aguda em murganhos após a inoculação de uma dose elevada de 5xl08 Sphingomonas capsulata. São apresentadas experiências separadas comparando CDld+/ e CDld~7~ (n = 24 cada, p <0,0001) e Jal8+/“ e Jal8_/_ (n = 12 cada, P = 0,034) . A FIG. 4E ilustra a libertação soro aguda de IFN-γ e IL-12 p40 em CDld heterozigota e homozigota e murganhos mutantes Jal8 e controlos da ninhada após a infecção com lxlO7 Sphingomonas capsulata. Obteve-se resultados semelhantes em 2 experiências independentes. 7 ΡΕ1848813 A FIG. 4F ilustra contagens por PCR de Ehrlichia em pulmões, fígados e baços de murganhos CDld+/“ e CDld~x~ recuperados no dia 2 e no dia 7 pós-infecção (cada barra representa 3 murganhos). Estão indicados o aumento em X e os valores de p. Está ilustrada uma experiência representativa. A FIG. 5 ilustra vários glicolípidos sintéticos derivados de bactérias da classe Alphaproteobacteria. A FIG. 6 mostra um esquema sintético exemplificativo para o glicolípido PBS 61.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DE VÁRIAS FORMAS DE REALIZAÇÃO Várias células T restritas ao CD1 realizam ambas as funções efectora e auxiliar e interactuam com uma variedade de tipos de células, incluindo macrófagos, células dendríticas, células NK, células T e células B, contribuindo assim para as respostas imunes tanto inata como adaptativa. Um subconjunto destas células T, as células NKT, também conhecidas como células T restritas ao CDld ou células T do tetrâmero+ CDld, são caracterizadas por cadeias TCRa invariantes, auto-reactividade lipídica e respostas efectoras rápidas. Estas células desempenham um papel importante em várias funções imunitárias, incluindo respostas antimicrobianas, imunidade anti-tumoral e na regulação do equilíbrio entre tolerância e auto-imunidade. ΡΕ1848813

Na ausência de antigénios estranhos, as células NKT são estimuladas por exposição a células apresentadoras de antigénio CD1+, como monócitos, células dendriticas (DC) e macrófagos. As classes de auto-antigénios que podem ser apresentados e reconhecidos por células NKT incluem fosfo-lipidos, como fosfatidilinositol, fosfatidiletanolamina e fosfatidilglicerol, bem como esfingolipidos. No entanto, nem todas as classes eliciam uma resposta em células NKT em termos de libertação de citoquinas.

As células NKT são também conhecidas por reconhecerem α-galactosilceramida (aGal-Cer), um glicoesfingo-lípido encontrado em esponjas marinhas. Esta molécula não tem função imunológica conhecida ou outra função fisiológica em mamíferos, mas é amplamente utilizada pelos investigadores a estudar a activação de NKT. Antes da presente invenção, a activação de NKT por apresentação directa de glicolípidos microbianos não era conhecida.

As células NKT são activadas rapidamente com estimulação por antigénios lipídicos polares apresentados a CDld. "Activação", tal como o termo é utilizado aqui e na arte, refere-se à secreção por células NKT de IFN-γ, IL-4, IL-2, IL-10, IL-13, GM-CSF ou TNF-α, ou combinações destas citoquinas, por contacto com antigénios estimuladores apresentados a CDld. Alternativamente, "activação" pode referir-se a expressão sobrerregulada de marcadores da superfície celular para células T activadas, por exemplo, CD69 . 9 ΡΕ1848813 A activação de células NKT de acordo com a invenção compreende fazer contactar uma célula NKT, ou mais especificamente um receptor de células T (TCR) da célula NKT, com um lípido polar bacteriano complexado com CDld. Os glicolípidos são espécies adequadas de lipidos polares. Assim, em algumas formas de realização, a activação de células NKT compreende fazer contactar uma célula NKT com um glicolipido bacteriano derivada de um membro da Classe Alphaproteobacteria. "Um receptor de células T de uma célula NKT", tal como o termo é aqui utilizado, refere-se a células NKT de TCR conservado, semi-invariante, compreendendo, e.g., Vai 4-Jal8/νβδ em murganhos e Va24-Jal8/vpil em seres humanos. "Fazer contactar", tal como aqui utilizado, refere-se à adição in vitro de glicolipido bacteriano em solução a moléculas CDld imobilizadas, solúveis ou insolúveis, ou à administração in vivo de glicolipido bacteriano a um indivíduo que tem células apresentadoras de um antigénio que exprime moléculas CDld na superfície celular. A activação de células NKT pode ser medida in vitro ou ex vivo por qualquer método adequado. Um exemplo de um ensaio in vitro que permite a avaliação da activação de células NKT é a co-cultura de células NKT com células apresentadoras de antigénios (APC), como células dendríticas (DC), na presença de um activador ou activador 10 ΡΕ1848813 putativo de glicolípido bacteriano, e subsequentemente o doseamento de IFN-γ ou outras citoquinas segregadas no sobrenadante. Alternativamente, a activação de células NKT pode ser medida ex vivo por administração de um antigénio glicolípido bacteriano a um indivíduo ou por administração de células apresentadoras de antigénio CDld+ após contacto ex vivo com glicolípidos bacterianos a um indivíduo. As células NKT destes indivíduos podem ser isoladas por, e.g., coloração de tetrâmero de CDld de e separação por citometria de fluxo, e subsequentemente doseadas quanto a CD69 de superfície (antigénio de activação de células T inicial) e/ou IFN-γ intracelular por métodos adequados.

Alphaproteobacteria é uma classe do filo Proteo-bacteria composta principalmente por bactérias que têm dois fenotipos principais: bactérias púrpura não sulfurosas e bactérias aeróbias contendo bacterioclorofila. Os membros bacterianos da classe de Alphaproteobacteria são principalmente isolados do solo, lagos ou lagoas. Vários membros são agentes patogénicos humanos conhecidos. A classe Alphaproteobacteria inclui seis ordens: Rhodospiríllales, Ríckettsiales, Rhodobacterales, Sphingo-monadales, Caulobacterales e Rhizobiales (Garrity, G. M. et al., Taxonomic Outline of the Procaryotic Genera, BERGEY'S MANUAL of Systematic Bacteriology, 2nd Ed., April 2001). Os glicolípidos bacterianos que podem ser úteis na activação de células NKT podem ser derivados de membros de qualquer destas ordens. No entanto, os membros das ordens Rickettsi- 11 ΡΕ1848813 ales, Sphingomonadales e Rhizobiales estão contemplados como sendo particularmente adequados. A ordem Rickettsiales inclui três famílias: Rickettsiaceae, Ehrlichiaceae e Holosporaceae. Os lípidos polares derivados de membros de Ehrlichiaceae do género Ehrlichia estão contemplados como sendo adequados. Por exemplo, os glicolípidos derivados de E. muris podem ser adequados. A ordem Sphingomonadales inclui a família Sphin-gomonadaceae. Os glicolípidos derivados de membros desta família do género Sphingomonas, por exemplo de S. capsu-lata, estão contemplados como sendo adequados. A ordem Rhizobiales ordem inclui dez famílias: Rhizobiaceae, Bartonellaceae, Brucellaceae, Phyllobacteria-ceae, Methylocystaceae, Bei jerinckiaceae, Bradyrhizobia-ceae, Hyphomicrobiaceae, Methylobacteriaceae e Rhodobia-ceae. Os glicolípidos derivados de membros de Brucellaceae do género Brucella estão contemplados para serem utilizados com vantagem nos métodos da invenção. A Sphingomonas capsulata é um agente patogénico da classe Alphaproteobacteria que é uma bactéria gram-negativa, negativa a lipopolissacárido (LPS) cujos lípidos das paredes celulares foram extensamente caracterizados. Os glicolípidos derivados das paredes celulares destas bactérias podem ser utilizados para activar células NKT. 12 ΡΕ1848813

Analogamente, os membros do género Ehrlichia são bactérias gram-negativas, negativas a LPS cujos lípidos das paredes celulares podem ser utilizados para activar células NKT. Embora os lipidos da membrana celular de Ehrlichia não estejam tão bem caracterizados como os de Sphingomonas capsulata, está contemplado que os membros deste género vão funcionar para activar células NKT em ensaios de activação adequados, bem como in vivo.

Brucella é outro género desta classe conhecido por ser patogénica. As quatro espécies deste género que podem infectar seres humanos incluem B. abortus, B. suis, B. melitensis e B. canis. A doença brucelose em seres humanos é caracterizada como uma doença febril aguda ou uma doença persistente com uma ampla variedade de sintomas. É uma verdadeiro zoonose na medida em que praticamente todas as infecções humanas são adquiridas a partir de animais. A infecção subclinica é comum. Em contraste com Erlichia e Sphingomonas spp., a membrana celular externa compreende um componente de LPS dominante e três grupos principais de proteínas. Está contemplado que fracções ou componentes específicos destas membranas celulares bacterianas podem ser utilizados para activar directamente células NKT.

Como indicado, os glicolípidos bacterianos são adequadamente derivados de bactérias da classe Alphapro-teobacteria. "Derivado de " refere-se ao isolamento e/ou purificação a partir de fontes bacterianas, e também se refere à síntese de novo de compostos bacterianos ou 13 ΡΕ1848813 compostos racionalmente concebidos com base em compostos bacterianos, utilizando processos de síntese adequados conhecidos na arte. Como será entendido por um vulgar perito na arte, "glicolípidos bacterianos" também pode incluir bactérias mortas ou atenuadas pelo calor. Por exemplo, fazer contactar uma célula NKT com um glicolípido bacteriano com vantagem inclui fazer contactar uma célula NKT com uma bactéria mora ou atenuada pelo calor, bem como glicolípidos bacterianos isolados ou sintéticos. 0 termo "glicolípido" designa qualquer composto contendo um ou mais resíduos de monossacáridos ligados por uma ligação glicosídica a uma unidade hidrófoba como um acilglicerol, um esfingóide, uma ceramida (N-acil-esfingóide) ou um fosfato de prenilo. Em particular, um ou mais sacáridos ligados a uma unidade de ceramida podem ser particularmente úteis na activação de células NKT.

Os glicolípidos bacterianos adequados para utilização em métodos de activação de células NKT podem ser genericamente de fórmula estrutural (I):

14 ΡΕ1848813 em que - indica uma ligação simples em que X é H ou alquilo inferior, ou uma ligação iónica em que X é um contra-ião; Ri e R2 são seleccionados independentemente do grupo que consiste em -H, -OH, um monossacárido e um oligossacárido; R3 é -H ou -OH; R4 é -H ou -OH ou, conjuntamente com R7, forma uma ligação dupla; R5 e R6 são independentemente Ci-C30 alquilo, em que o C1-C30 alquilo é saturado ou insaturado ou compreende um ou mais grupos ciclopropilo; e R7 é -H ou, conjuntamente com R4, forma uma ligação dupla. Tal como aqui utilizado, o termo "alquilo inferior" pretende referir-se a um radical hidrocarboneto linear ou ramificado, saturado ou insaturado, com 1 a 4 átomos de carbono. Exemplos específicos desses radicais hidrocarboneto são metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobu-tilo, t-butilo, etenilo, propenilo, butenilo, isobutenilo, isopropenilo, formilo, acetilo, propionilo, butirilo ou ciclopropilo. Também tal como aqui utilizado, um "contra-ião" é qualquer espécie positivamente carregada que se pode associar através de uma ligação iónica a um carboxilato carregado negativamente do glicolípido.

Alguns exemplos representativos de glicolípidos bacterianos adequados para complexar com moléculas CDld e activar células NKT estão apresentados na FIG. 5.

Em particular, a presente invenção refere-se aos seguintes glicolípidos bacterianos: 15 ΡΕ1848813 • PBS-49 em que X é metilo; Ri é -H; R2 é -OH; R3 é -OH; R4 é -H; R5 é Cu alquilo; R6 é Ci3 alquilo; e R7 é -H; • PBS-45 em que X é H; Ri é -H; R2 é -OH; R3 é -OH; R4 é -H; R5 é Cu alquilo; R6 é Ci3 alquilo; e R7 é -H; • PBS-3 0 em que X é H; Ri é -H; R2 é -OH; R3 é -OH; R4 é -H; R5 é Ci6 alquilo; R6 é Ci5 alquilo; e R7 é -H; • PBS-29 em que X é H; R4 é -H; R2 é -OH; R3 é -H; R4 é -OH; R5 é C23 alquilo; R6 é C33 alquilo; e R7 é -H; • PBS-6 2 em que X é H; R4 é -H; R2 é -OH; R3 é -OH; R4 é -H; R5 é C23 alquilo; Re é C15 alquilo compreendendo uma ligação dupla; e R7 é -H; e • PBS-65 em que X é H; R4 é -H; R2 é -OH; R3 é -OH; R4 é -H; R5 é Cu alquilo; R6 é C43 alquilo compreendendo um grupo ciclopropilo; e R7 é -H. PBS 30, PBS 45 e PBS 59 foram sintetizados com base nas moléculas da membrana celular de Sphingomonas conhecidas e verificou-se que activam células NKT in vitro. Pelo contrário, PBS 50 e PBS 60 não activam células NKT.

Os compostos restantes descritos na FIG. 5 foram concebidos racionalmente com base nas seguintes caracteris-ticas determinadas como sendo comuns entre glicolípidos capazes de activar células NKT: 1) uma ligação glicosidica 16 ΡΕ1848813 de tipo alfa e 2) oxidação na posição 6 da unidade de hidrato de carbono do glicolípido.

Em algumas formas de realização, a activação de células NKT por administração de um glicolípido bacteriano de acordo com a invenção pode proporcionar um meio pelo qual pode ser estimulada uma resposta imunitária num indivíduo. Uma "resposta imunitária" tal como aqui utilizada refere-se a qualquer nível elevado de resposta humoral ou celular que é mensurável num indivíduo em comparação com a linha de base do indivíduo, ou estado não estimulado. Os métodos de medição das respostas imunes tanto humorais como celulares são bem conhecidos na arte. Como será entendido, a resposta in vivo de células NKT é influenciada, em parte, pelo ambiente celular durante a activação. As respostas imunes TH1 são caracterizadas predominantemente por libertação de, e.g., IL-2, IFN-γ, IL-12 e TNF-α. Em contraste, as citoquinas TH2 incluem predominantemente IL-4, IL-5, IL-β, IL-10 e IL-13. A resposta in vivo de células NKT também pode ser influenciada pela concentração de antigénio ou exposição prévia ou repetida ao antigénio. A activação pode ainda ser adicionalmente mediada por interacções com moléculas co-estimuladoras em células NKT e APCs, e.g. interacções CD40/CD40L.

Além da secreção de citoquinas, as células NKT activadas são potentemente citolíticas através da libertação de perforina e granzimas, bem como granulisina, 17 ΡΕ1848813 e podem contribuir directamente para a morte das células bacterianas e/ou células tumorais através da secreção destas moléculas.

Assim, a activação de células NKT num indivíduo por administração de uma quantidade eficaz de um glicolí-pido bacteriano a um indivíduo pode gerar uma resposta imunitária antimicrobiana e proporcionar assim um meio de tratamento de uma infecção no indivíduo. A presente invenção refere-se assim aos glicolípidos seleccionados de PBS-49, PBS-45, PBS-30, PBS-29, PBS-62 e PBS-65 para utilização no tratamento de doenças infecciosas. A infecção pode ser virai, bacteriana ou parasitária e a resposta imunitária antimicrobiana pode ser suficiente para inibir o crescimento de, ou matar um microrganismo, incluindo, e.g., vírus, bactérias ou parasitas. A administração pode ser efec-tuada por qualquer método utilizado na arte, incluindo absorção intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutânea, transcutânea, oral, nasofaríngea ou através da mucosa, entre outras.

Os glicolípidos bacterianos de acordo com a invenção também podem ser utilizados no tratamento de cancro, ou para a promoção de rejeição de tumores, por indução de uma resposta imunitária antiproliferativa num mamífero. "Tratar" ou "tratamento" de cancro num mamífero inclui um ou mais de: (1) inibição do crescimento do 18 ΡΕ1848813 cancro, i.e. paragem do seu desenvolvimento, (2) prevenção da disseminação do cancro, i.e. prevenção de metástases, (3) alivio do cancro, i.e. causar a regressão do cancro, (4) prevenção da recorrência do cancro, (5) paliação dos sintomas do cancro e (6) promoção da rejeição de um ou mais tumores sólidos.

Numa forma de realização especifica, os glicolí-pidos bacterianos de acordo com a invenção podem ser administrados como um adjuvante para melhorar a eficácia da vacina quando co-administrados com uma vacina. Tal como aqui utilizado, o termo "co-administração" ou "co-adminis-trar" refere-se à administração de pelo menos dois componentes concorrentemente, i.e., simultaneamente no tempo, ou sequencialmente, i.e., administração de um componente seguida pela administração do outro componente. Métodos de transferência adoptiva são baseados na administração de células que foram contactadas com glicolipidos bacterianos ex vivo para estimular uma resposta imunitária num indivíduo. Em algumas formas de realização, as células podem ser células NKT que são acti-vadas ex vivo e injectadas num indivíduo para proporcionar ou aumentar uma resposta imunitária a, e.g., células cancerígenas ou microrganismos. Em algumas formas de realização, a administração de células NKT activadas pode induzir uma resposta imunitária anti-hiperproliferativa para promover a rejeição do tumor sólido. Noutras formas de realização, as células podem ser células apresentadoras de 19 ΡΕ1848813 antigénios que foram contactadas com glicolípidos bacte-rianos ex vivo para permitir a complexação dos glicolípidos bacterianos com as moléculas CDld expressas pela célula apresentadora do antigénio, e.g., uma célula dendrítica. As células apresentadoras de antigénios podem então ser administradas, e.g., por injecção no indivíduo, para proporcionar uma resposta imunitária adequada. Este método de administração permite a estimulação da resposta imunitária com exposição mínima do indivíduo ou das células do indivíduo aos glicolípidos bacterianos. A activação de células NKT também pode ser utilizada em métodos de modulação de auto-imunidade ou de inibição da hipersensibilidade induzida pelo alergénio. Tanto a administração directa de glicolípidos bacterianos, como métodos de transferência adoptiva estão contemplados para estes tratamentos específicos.

Os seguintes exemplos são proporcionados para auxiliar uma melhor compreensão da invenção. Os materiais e condições específicas utilizados destinam-se a ser ainda mais ilustrativos da invenção e não são limitativos do seu âmbito razoável.

Exemplo 1. Estimulação in vitro de células NKT com bactérias mortas pelo calor.

As estirpes bacterianas Sphingomonas capsulata (ATCC 14666) e Salmonella typhimurium R71 foram cultivadas 20 ΡΕ1848813 em agar Mueller-Hinton. Ehrlichia muris foram preparadas como descrito por Ismail N. et ai., J. Immunol. 172, 1786-1800 (2004). As bactérias foram mortas pelo calor por exposição durante 2 horas a 74°C e utilizou-se 2,5-5 xlO6 equivalentes de ufc/poço para estimulação in vitro.

Os ensaios de estimulação foram realizados com células de baço inteiras (5xl05 por poço de 200 pL) ou com células T purificadas e células apresentadoras de antigénio. Populações de células T utilizadas nos ensaios compreenderam células de baço de murganho CDld-a-Gal-Cer+ separadas (5xl04 por poço de 200 pL) , linfócitos de sangue periférico humano (PBL) (5xl05 por poço de 200 pL) (obtido após a centrifugação de Ficoll de sangue heparinizado) ou linhas celulares de NKT humanas (2,5xl05 por poço de 200 pL). Células NKT Va24 humanas foram derivadas de PBL estimulados com α-Gal-Cer e foram mantidas por ciclos repetidos de estimulação com PHA e IL-2 na presença de PBMC irradiado e células B transformadas com EBV in vitro. As células apresentadoras de antigénios eram células dendrí-ticas que foram derivadas de medula óssea, estimuladas com GMCSF/IL-4 (2 ng/mL e 5 ng/mL, Biosource) e cultivadas a 2,5xl05 por poço de 200 pL para ensaios com murganhos e PBMC humano alogénico irradiado fresco ou cultivado durante 5 dias com GMCSF/IL-4 recombinante humano, (100 pg/mL de cada citoquina, R&D Systems) (2xl05 por poço de 200 pL) para ensaios humanos. As células foram lavadas duas vezes e privadas durante 6 horas em meio sozinho antes da adição às experiências de estimulação. 21 ΡΕ1848813

As células NKT foram estimuladas com bactérias mortas pelo calor, tal como indicado acima, durante 48 horas em placas de fundo redondo com 96 poços em meio RPMI 1640 (Biofluids) suplementado com glutamina, antibióticos, 5xl0“5 M 2-ME e 10% de FCS (estudos em murganhos) ou 5% de soro AB (estudos em seres humanos).

As concentrações de IFN-γ de murganho e humano no sobrenadante foram medidas às 48 horas, utilizando os respectivos kits de ELISA (BD Bioscience, o limite de detecção de 12,5 pg/mL). Células do baço inteiras foram estimulados durante 6 dias com 5xl06 bactérias mortas pelo calor ou 100 ng/mL de aGal-Cer e a frequência de células NKT CDld-aGal-Cer+ foi determinada na estimulação e 2, 4 e 6 dias após a estimulação.

Aos 6 dias após a estimulação, foram realizados procedimentos de marcação e coloração de CDld-α Gal-Cer, CFSE e aB220 (BD Pharmigen) e as células foram analisadas por FACS. Para gerar tetrâmeros CDld-aGal-Cer, uma mistura de 5 pL de aGal-Cer (da solução mãe a 1 mg/mL em DMSO), 10 pL de PBS 0,5% Tween 20, 10 pL de CDld biotinilado (1 mg/mL) e 75 pL de PBS foi incubada a 37°C durante 1 h, e CDld carregado de lipido foi purificado por diálise e centrifugação e complexado com estreptavidina-APC. (Benlagha K. et ai., J. Exp. Med. 191, 1895-1903 (2000).) As células 22 ΡΕ1848813 foram analisadas num FACSCalibur (BD Biosciences) com o software CellQuest.

Os resultados estão apresentados nas Figs. 1A-C. Células NKT separadas de tetrâmeros de CDld de murganho co-cultivadas com CD1+/^ ou CD1~7~ derivadas de medula óssea fresca segregaram lFN-γ de uma maneira dependente de CDld quando estimuladas com Sphingomonas e Erlichia mortas pelo calor, bem como Salmonella e α Gal-Cer de controlo (Fig. IA, à esquerda). Analogamente, as células NKT humanas co-cultivadas com DC derivadas de PBMC segregaram IFN-γ de uma maneira dependente de CDld por estimulação, em que a dependência de CDld foi ilustrada utilizando bloqueamento com 1 yg/mL de anticorpos anti-CDld ou IgGl de controlo (FIG. IA, à direita) . As suspensões de células do baço inteiras cultivadas na presença de bactérias mortas pelo calor durante 6 dias mostrou uma forte expansão e proliferação das células NKT, apenas ligeiramente menor do que a induzida por aGal-Cer pura (Fig. 1 B-C.)

Exemplo 2. Requisitos diferenciais para a resposta de IFN-γ a Sphingomonas e Ehrlichia em comparação com Salmonella. Células do baço inteiras co-cultivadas com DC do genotipo MyD88_/“, Trifips2/ips2 e MyD88_/“Triflps2/lps2 (sem um ou os dois adaptadores MyD88 e TRIF para sinalização de RTLR) ou CDl~/_ foram estimuladas durante 48 horas com 5xl06 de Salmonella, Sphingomonas ou Ehrlichia mortas pelo calor. As 23 ΡΕ1848813 concentrações de IFN-γ de murganho e humana no sobrenadante foram determinadas às 48 horas, utilizando os respectivos kits de ELISA (BD Bioscience, limite de detecção inferior de 12,5 pg/mL) .

As DC foram pulsadas com bactérias mortas pelo calor, preparadas como descrito no Exemplo 1 e adicionadas a preparações de células NKT humanas na presença de IB4 (isolectina B4 de Griffonia simplicifolia) (Vector Laboratories) que se liga ao terminal do dissacárido iGb3, mas não se liga a aGal-Cer. A produção de IFN-γ foi medida às 48 horas. DC Hexb~7~, que não conseguem gerar iGb3 no lisossoma porque não têm a b-hexosaminidase necessária para remover o terminal GalNAc de iGb4, o precursor de iGb3, foram pulsadas com bactérias mortas pelo calor como descrito acima e adicionadas a culturas de células NKT. A produção de IFN-γ foi medida às 48 horas.

Os resultados estão apresentados nas Figs. 2A-C. No ensaio de cultura de células de baço inteiras, IFN-γ induzido por Salmonella foi drasticamente reduzido para 2-15% do controlo, em média, na ausência de um ou dos dois adaptadores TLR (FIG. 2A). Em contraste acentuado, a resposta de IFN-γ do baço para Ehrlichia e Sphingomonas negativas a LPS foi em largamente independente de MyD88 e TRIF. As células do baço CDld_/_ sem células NKT não conseguiram responder a Sphingomonas e Ehrlichia, enquanto 24 ΡΕ1848813 que a resposta a Salmonella foi apenas ligeiramente reduzida (Fig. 2A, à esquerda). Analogamente, as células NKT de tipo selvagem co-cultivadas com DC deficientes em MyD8 8 responderam a Sphingomonas e Ehrlichia mas não a Salmonella (Figura 2A, à direita) . No seu conjunto, estes resultados sugerem que em baços totais expostos a Salmonella morta pelo calor, a produção de IFN-γ foi iniciada depois de sinalização TLR de células apresentadoras do antigénio e subsequente recrutamento das células NKT bem como de outros tipos de células, como células NK. Em contraste, a estimulação de IFN-γ por Ehrlichia e Sphingomonas foi principalmente dependente de células NKT e CDld com contribuição mínima de TLR.

Analogamente, a ligação a lectina IB4 não prejudica a estimulação das células NKT por DC pulsadas com Ehrlichia ou Sphingomonas mortas pelo calor, consistente com o reconhecimento direto de um antigénio microbiano distinto. No entanto, as lectinas prontamente bloquearam a estimulação por Salmonella (Figura 2B), sugerindo que para a resposta NKT de Salmonella, iGb3 endógeno é o ligando provável. DC Hexb_/~ pulsadas com Ehrlichia ou Sphingomonas mortas pelo calor estimularam as células NKT, bem como DC de tipo selvagem (Fig. 2C). Em contraste, DC Hex_/“ pulsadas com Salmonella não estimularam células NKT.

Conjuntamente, os resultados identificam o 25 ΡΕ1848813 ligando endógeno iGb3, em vez de um antigénio microbiano, como o alvo das células NKT na sua resposta à infecção por Salmonella.

Exemplo 3. Resposta estimuladora de células NKT a antigénios glicolípidos sintéticos. α-glucuronosilceramida (PBS 30) e a-galacturo-nosilceramida (PBS 59), derivadas de antigénios da membrana celular de Sphingomonadaceae conhecidos, foram sintetizadas como descrito no Exemplo 5. PBS 50, uma β-glucurono-silceramida, serviu como um composto de controlo. As estruturas destes compostos estão apresentadas na FIG. 3A.

Foram determinadas as propriedades imunológicas dos compostos acima referidos em células NKT. Células NKT Va24-Jal8 humanas e células NK de murganho purificadas frescas foram co-cultivadas com DC pulsadas com aGal-Cer ou glicolipido sintético em concentrações que variam de 0,001-1000 ng/mL. A produção de IFN-γ foi medida às 48 horas como descrito acima.

Tetrâmeros de CDld foram preparados como descrito no Exemplo 1, utilizando os glicolípidos sintéticos PBS 30, PBS 59 e PBS 50 e aGal-Cer, e foram utilizados para corar células NKT humanas e células de baço de murganhos.

Os resultados estão apresentados nas FIGS. 3 B-C. A α-glucuronosilceramida (PBS 30) e, em menor grau, a- 26 ΡΕ1848813 galacturonosilceramida (PBS 59) activaram fortemente a proliferação de células NKT de murganho e humanas, bem como a secreção de IFN-γ , enquanto que a β-glucuronosilceramida (PBS 50) de controlo não o fizeram (FIG. 3B). Os tetrâmeros de CDld-a-glucuronosilceramida (PBS 30) coraram todas as células NKT humanas e -25% de células NKT de murganho (Fig. 3C) . Assim, estes resultados revelaram que os lípidos que substituem LPS na parede celular de algumas espécies de bactérias gram-negativas podem ser directamente reconhecidos por TCR conservado de células NKT semelhantes às naturais.

Exemplo 4. Papel in vivo de células NKT durante a infecção microbiana.

Murganhos CDld-/~ foram gerados na Universidade de Chicago, murganhos Jal8_/_ foram obtidos do Dr. Taniguchi, Universidade de Chiba (Japão) e murganhos Hexb_/” foram obtidos de R. Proia, National Institutes of Health. Todos os ratos estavam na referência C57/BL6. Em todos os casos, as ninhadas obtidas por acasalamento heterozigótico foram genotipifiçados por PCR e utilizados para análise comparativa. Todos os murganhos foram criados num ambiente isento de agentes patogénicos na Universidade de Chicago, de acordo com as directrizes do Institutional Animal Care and Use Committee.

Murganhos C57/BL6 com seis a sete semanas de idade foram inoculados intravenosamente com 100 pL de 27 ΡΕ1848813

Sphingomonas (lxlO7), Ehrlichia (lxlO8) ou Salmonella (lxlO6) suspensas em PBS. Vinte e quatro horas após a infecção, as células NKT isoladas bloqueadas como tetrâmero+/B220” foram analisadas por FACS quanto a CD69 de superfície (antigénio de activação das células T inicial) e IFN-γ intracelular. Os resultados, apresentados na FIG. 4A, confirmam que as células NKT são activados e segregam IFN-γ dentro de 24 horas após a infecção in vivo.

Para determinar se hexb é necessário para o processamento de antigénios em resposta a infecção por Salmonella e Sphingomonas in vivo, ninhadas Hexb+/~ e Hexb+/~ foram desafiadas intraperitonealmente com 5xl06 de Sphingomonas ou Salmonella. Duas horas pós-desafio, 5xl06 de timocitos transgénicos Val4 marcados com CFSE foram injectados intraesplenicamente num volume de 50 pL (Bendelac A. et al., J. Exp. Med. 184, 1285-12293 (1996). Às 24 horas após o desafio, foi realizada a coloração intracelular de IFN-γ. Os resultados estão apresentados na FIG. 4B. A diferença entre Hexb+/~ e Hexb+/“ era estatisticamente significativa só para murganhos desafiados com Salmonella, demonstrando que a produção de IFN-γ por células NKT em resposta à infecção por Salmonella requer iGb3 lisossomal, enquanto a resposta de células NKT a Sphingomonas não requer iGb3 lisossomal.

Para caracterizar o papel de células NKT no controlo da infecção in vivo, murganhos Jal8_/_ e CDl_/_ e as suas ninhadas foram injectados intravenosamente com 28 ΡΕ1848813 5xl06 ou lxlO6 Sphingomonas. A carga bacteriana nos pulmões foi avaliada a intervalos indicados na FIG. 4C. As contagens bacterianas foram realizadas após homogeneização dos tecidos em 0,5% de Triton X-100 e cultivadas para a formação de colónias. Os resultados demonstram gue ambos os murganhos murganhos Jal8_/“ e CDl_/“ tinham eliminação bacteriana atrasada em comparação com controlos das ninhadas heterozigóticas, com até 12-14 vezes maior carga bacteriana no pulmão nos pontos de tempo iniciais.

Para experiências de sobrevivência, murganhos murganhos Jal8”/_ e CD1_/” e os seus controlos de ninhadas foram injectados intravenosamente com uma dose elevada de 5x108 Sphingomonas. Os murganhos mortos ou moribundos (eutanizados) foram registados a cada 2-4 horas pós-infec-ção. Os resultados, apresentados na FIG. 4D, demonstram que a infecção com uma dose elevada de Sphingomonas foi rapidamente letal em murganhos de tipo selvagem, ao passo que a maioria dos murganhos deficientes em NKT sobreviveu.

Para testar se a letalidade estava associada à libertação de citoquinas, Sphingomonas (lxlO7) foi injecta-da intravenosamente em murganhos murganhos Jal8-/~ e CD1_/ e os seus controles da ninhada. A intervalos especificados na FIG. 4E, determinou-se os níveis séricos de IFN-γ e IL-12 p40. Os resultados indicam que o resultado letal em murganhos de tipo selvagem estava associado à libertação explosiva de IFN-γ e IL-12 no soro, enquanto que murganhos deficientes em NKT produziram significativamente menos citoquinas. 29 ΡΕ1848813

Para experiências de infecção com Ehrlichia, murganhos foram infectados intraperitonealmente com 500 pL de uma diluição de 10-1 de cultura mãe de Ehrlichia muris. A carga de Ehrlichia nos pulmões, fígados e baços de CDld~/_ e das ninhadas de controlo foi determinada por PCR em tempo real do gene dsb de Ehrlichia (Ismail, N. et al., J. Immunol. 172, 1786-1800 (2004)) nos dias 2 e 7 pós-infecção. Os resultados, apresentados na FIG. 4F, mostram gue murganhos deficientes em NKT demonstraram incapacidade de eliminar Ehrlichia.

Lisboa, 9 de julho de 2013

Claims (13)

1. ΡΕ1848813 1 REIVINDICAÇÕES 1. Glicolípido de fórmula (I):

   em que o glicolípido é seleccionado dos segui compostos: PBS-49 em que X é metilo; Ri é -H; R2 é -OH; R3 é R4 é -H; R5 é Cu alquilo; R6 é C13 alquilo; e R7 é - PBS-45 em que X é H; R7 é -H; R2 é -OH; R3 é -OH; -H; R5 é Cu alquilo; R6 é C13 alquilo; e R7 é -H; PBS-30 em que X é H; R7 é -H; R2 é -OH; R3 é -OH; -H; R5 é Ci6 alquilo; R6 é C15 alquilo; e R7 é -H; PBS-2 9 em que X é H; R7 é -H; R2 é -OH; R3 é -H; OH; R5 é C23 alquilo; R6 é C13 alquilo; e R7 é -H; ntes -OH; H; R4 e R4 é R4 é 2 ΡΕ1848813 - PBS-62 em que X é H; Ri é -H; R2 é -OH; R3 é -OH; R4 é -H; R5 é C23 alquilo; R6 é C15 alquilo compreendendo uma ligação dupla; e R7 é -H; e - PBS-65 em que X é H; Ri é -H; R2 é -OH; R3 é -OH; R4 é -H; R5 é Cu alquilo; R6 é C13 alquilo compreendendo um grupo ciclopropilo; e R7 é -H, para utilização no tratamento de doenças infecciosas.
2. 2. Glicolipido para utilização de acordo com a reivindicação 1, por activação de uma célula NKT por contacto da célula NKT com o referido glicolipido comple-xado com uma molécula CDld.
3. 3. Glicolipido para utilização de acordo com a reivindicação 2, em que a molécula CDld é expressa por uma célula.
4. 4. Glicolipido para utilização de acordo com a reivindicação 3, em que a célula é uma célula apresentadora do antigénio.
5. 5. Glicolipido para utilização de acordo com a reivindicação 4, em que a célula apresentadora do antigénio é uma célula dendrítica.
6. 6. Glicolipido para utilização de acordo com a 3 ΡΕ1848813 reivindicação 2, em que a molécula CDld compreende um tetrâmero.
7. 7. Glicolipido para utilização de acordo com a reivindicação 1, por estimulação de uma resposta imunitária .
8. 8. Glicolipido para utilização de acordo com a reivindicação 1, por estimulação de uma resposta imunitária pelas células NKT activadas pelo referido glicolipido de acordo com a reivindicação 2.
9. 9. Glicolipido para utilização de acordo com a reivindicação 1, por estimulação de uma resposta imunitária por células apresentadoras do antigénio CDld+ postas em contacto com o referido glicolipido.
10. 10. Glicolipido para utilização de acordo com qualquer das reivindicações 7 a 9 em que a resposta imunitária é uma resposta imunitária antimicrobiana.
11. 11. Glicolipido para utilização de acordo com a reivindicação 10, em que a resposta imunitária antimicrobiana é eficaz para inibir o crescimento de um microrganismo .
12. 12. Glicolipido para utilização de acordo com a reivindicação 11, em que o microrganismo é seleccionado do grupo que consiste num virus, numa bactéria e num parasita. 4 ΡΕ1848813
13. 13. Composição de vacina compreendendo uma vacina e um adjuvante, em que o adjuvante compreende um glicolípido de fórmula (I) de acordo com a reivindicação 1 ou uma combinação de um glicolípido de fórmula (I) de acordo com a reivindicação 1 e de uma quantidade eficaz de células NKT activadas de acordo com a reivindicação 2. Lisboa, 9 de julho de 2013