JP2016516668A - iNKT細胞の活性化 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、特にワクチンにおけるアジュバントとして又は免疫療法において使用するための、粒子状実体、例えばナノ粒子又はコンジュゲートに関する。より具体的には、本発明は、
i.iNKT細胞アゴニスト、例えば原型iNKT細胞リガンドα−ガラクトシルセラミド(α−GalCer)、
ii.場合により、1つ以上の抗原決定基(群)、例えば腫瘍抗原(群)又は病原体由来の抗原(群)、及び
iii.インビボにおいて該iNKT細胞アゴニスト(群)及び場合により該1つ以上の抗原決定基(群)を、樹状細胞、例えばヒトBDCA3+樹状細胞にターゲティングする標的化剤
を含む、粒子状実体に関する。
癌に対する免疫療法は依然として、腫瘍増殖を制御する有望なアプローチであり、抗腫瘍免疫の誘導に大いに有望である。
本発明は、
i.iNKT細胞アゴニスト、
ii.場合により、1つ以上の抗原決定基(群)、及び
iii.インビボにおいて該iNKT細胞アゴニスト及び場合により該1つ以上の抗原決定基(群)を、ヒト樹状細胞にターゲティングする標的化剤
を含む、粒子状実体に関する。
i.α−ガラクトシルセラミド又はインバリアントナチュラルキラーT(iNKT)細胞を活性化することのできるその機能的誘導体からなるα−GalCer化合物、及び
ii.場合により、1つ以上の抗原決定基、例えば腫瘍抗原(群)又は病原体に由来する抗原(群)、
iii.インビボにおいて該α−GalCer及び場合により該1つ以上の抗原決定基(群)を、ヒトBDCA3+樹状細胞にターゲティングする標的化剤
を含む、粒子状実体に関する。
i.ワクチン組成物におけるアジュバントとして;
ii.癌若しくは感染症の予防若しくは治療において;又は
iii.自己免疫疾患及び炎症疾患、例えば喘息などの予防又は治療において
のいずれかに特に有用である。
本発明者らは実際に、抗体(Ab)を備えたナノ粒子(NP)を用いて、能動的にインビボにおいてα−GalCer及び抗原を樹状細胞にターゲティングすることが、iNKT細胞依存性免疫応答を改善し得るという可能性を調べた。その表面上にCD8α+マウスDCへの標的化剤を担持したPLGAをベースとしたナノ粒子を使用して、本発明者らは初めて、CD8α+DCへのα−GalCer化合物及び抗原のインビボにおける送達は、iNKT細胞の初期活性化を増強し、後の時点でiNKT細胞性適応免疫応答(B及びT細胞応答)を増強するだけでなく、iNKT細胞が、さらなる再刺激に応答することを可能とし、癌療法及びワクチン接種のための新規戦略への道を開拓することを示す。
i.インバリアントナチュラルキラーT(iNKT)細胞アゴニスト、及び
ii.場合により、1つ以上の抗原決定基、及び
iii.インビボにおいて該iNKT細胞アゴニスト及び場合により該1つ以上の抗原決定基(群)を樹状細胞にターゲティングする標的化剤
を含む、粒子状実体を提供する。
本明細書において使用される「iNKT細胞アゴニスト」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、典型的には抗原提示細胞(APC)によってCD1dのコンテクストにおいて提示され、かつiNKT細胞を活性化、すなわち、特異的に、iNKT細胞によるサイトカイン産生を促進することのできる、脂質から導かれた任意の誘導体又は類似体を指す。典型的には、iNKT細胞アゴニストはα−ガラクトシルセラミド化合物である。
(2S,3R)−1−(α−D−ガラクトピラノシルオキシ)−2−テトラコサノイルアミノ−3−オクタデカノール、
(2S,3R)−2−ドコサノイルアミノ(docosanoylamina)−1−(α−D−ガラクトピラノシルオキシ)−3−オクタデカノール、
(2S,3R)−1−(α−D−ガラクトピラノシルオキシ)−2−イコサノイルアミノ−3−オクタデカノール、
(2S,3R)−1−(α−D−ガラクトピラノシルオキシ)−2−オクタデカノイルアミノ−3−オクタデカノール、
(2S,3R)−1−(α−D−ガラクトピラノシルオキシ)−2−テトラデカノイルアミノ−3−オクタデカノール、
(2S,3R)−2−デカノイルアミノ−1−(α−D−40ガラクトピラノシルオキシ)−3−オクタデカノール、
(2S,3R)−1−(α−D−ガラクトピラノシルオキシ)−2−テトラコサノイルアミノ−3−テトラデカノール、
(2S,3R)−1−(α−D−ガラクトピラノシルオキシ)−2−テトラデカノイルアミノ−3−ヘキサデカノール、
(2R,3S)−1−(α−D−ガラクトピラノシルオキシ)−2−テトラデカノイルアミノ−3−ヘキサデカノール、
(2S,3S)−1−(α−D−ガラクトピラノシルオキシ)−2−テトラデカノイルアミノ−3−ヘキサデカノール、
(2S,3R)−1−(α−D−ガラクトピラノシルオキシ)−2[(R)−2−ヒドロキシテトラコサノイルアミノ]−3−オクタデカノール、
(2S,3R,4E)−1−(α−D−ガラクトピラノシルオキシ)−2−オクタデカノイルアミノ−4−オクタデセン−3−オール、
(2S,3R,4E)−1−(α−D−ガラクトピラノシルオキシ)−2−テトラデカノイルアミノ−4−オクタデセン−3−オール、
(2S,3S,4R)−1−(α−D−ガラクトピラノシルオキシ)−2−テトラコサノイルアミノ−3,4−オクタデカンジオール、
(2S,3S,4R)−1−(α−D−ガラクトピラノシルオキシ)−2−テトラコサノイルアミノ−3,4−ヘプタデカンジオール、
(2S,3S,4R)−1−(α−D−ガラクトピラノシルオキシ)−2−テトラコサノイルアミノ−3,4−ペンタデカンジオール、
(2S,3S,4R)−1−(α−D−ガラクトピラノシルオキシ)−2−テトラコサノイルアミノ−3,4−ウンデカンジオール、
(2S,3S,4R)−1−(α−D−ガラクトピラノシルオキシ)−2−ヘキサコサノイルアミノ−3,4−ヘプタデカンジオール、
(2S,3S,4R)−1−(α−D−ガラクトピラノシルオキシ)−2−[(R)−2−ヒドロキシテトラコサノイルアミノ]−3,4−オクタデカンジオール、
(2S,3S,4R)−1−(α−D−ガラクトピラノシルオキシ)−2−[(R)−2−ヒドロキシテトラコサノイルアミノ]−3,4−ヘプタデカンジオール、
(2S,3S,4R)−1−(α−D−ガラクトピラノシルオキシ)−2−[(R)−2−ヒドロキシテトラコサノイルアミノ]−3,4−ペンタデカンジオール、
(2S,3S,4R)−1−(α−D−ガラクトピラノシルオキシ)−2−[(R)−2−ヒドロキシテトラコサノイルアミノ]−3,4−ウンデカンジオール、
(2S,3S,4R)−1−(α−D−ガラクトピラノシルオキシ)−2−[(R)−2−ヒドロキシヘキサコサノイルアミノ]−3,4−オクタデカンジオール、
(2S,3S,4R)−1−(α−D−ガラクトピラノシルオキシ)−2−[(R)−2−ヒドロキシヘキサコサノイルアミノ]−3,4−ノナデカンジオール、
(2S,3S,4R)−1−(α−D−ガラクトピラノシルオキシ)−2−[(R)−2−ヒドロキシヘキサコサノイルアミノ(hydroxyhexacosanoylamina)]−3,4−イコサンジオール、
(2S,3S,4R)−1−(α−D−ガラクトピラノシルオキシ)−2−[(S)−2−ヒドロキシテトラコサノイルアミノ]−3,4−ヘプタデカンジオール、
(2S,3S,4R)−1−(α−D−ガラクトピラノシルオキシ)−2−[(R)−2−ヒドロキシテトラコサノイルアミノ]−3,4−ヘキサデカンジオール、
(2S,3S,4R)−1−(α−D−ガラクトピラノシルオキシ)−2−[(S)−2−ヒドロキシテトラコサノイルアミノ]−16−メチル−3,4−ヘプタデカンジオール、
(2S,3S,4R)−1−(α−D−ガラクトピラノシルオキシ)−16−メチル−2−テトラコサノイルアミノ−3,4−ヘプタデカンジオール、
(2S,3S,4R)−1−(α−D−ガラクトピラノシルオキシ)−2−[(R)−2−ヒドロキシトリコサノイルアミノ]−16−メチル−3,4−ヘプタデカンジオール、
(2S,3S,4R)−1−(α−D−ガラクトピラノシルオキシ)−2−[(R)−2−ヒドロキシペンタコサノイルアミノ]−16−メチル−3,4−オクタデカンジオール、
(2S,3R)−1−(α−D−ガラクトピラノシルオキシ)−2−オレオイルアミノ−3−オクタデカノール、
(2S,3S,4R)−1−(α−D−ガラクトピラノシルオキシ)−2−ヘキサコサノイルアミノ−3,4−オクタデカンジオール、
(2S,3S,4R)−1−(α−D−ガラクトピラノシルオキシ)−2−オクタコサノイルアミノ−3,4−ヘプタデカンジオール、
(2R,3R)−1−(α−D−ガラクトピラノシルオキシ)−2−テトラデカノイルアミノ−3−ヘキサデカノール、
(2S,3R,4S,5R)−2−((2S,3S,4R)−2−(4−ヘキシル−1H−1,2,3−トリアゾール−1−イル)−3,4−ジヒドロキシオクタデシルオキシ)−6−(ヒドロキシメチル)−テトラヒドロ−28−ピラン−3,4,5−トリオール、
(2S,3R,4S,5R)−2−((2S,3S,4R)−2−(4−ヘプチル−1H−1,2,3−トリアゾール−1−イル)−3,4−ジヒドロキシオクタデシルオキシ)−6−(ヒドロキシメチル)−テトラヒドロ−28−ピラン−3,4,5−トリオール、
(2S,3R,4S,5R)−2−((2S,3S,4R)−2−(4−ヘキサデシル−1H−1,2,3−トリアゾール−1−イル)−3,4−ジヒドロキシオクタデシルオキシ)−6−(ヒドロキシメチル)−テトラヒドロ−28−ピラン−3,4,5−トリオール、
(2S,3R,4S,5R)−2−((2S,3S,4R)−3,4−ジヒドロキシ−2−(4−トリコシル−1H−1,2,3−トリアゾール−1−イル)オクタデシルオキシ)−6−(ヒドロキシメチル)−テトラヒドロ−28−ピラン−3,4,5−トリオール、
(2S,3R,4S,5R)−2−((2S,3S,4R)−3,4−ジヒドロキシ−2−(4−テトラコシル−1H−1,2,3−トリアゾール−1−イル)オクタデシルオキシ)−6−(ヒドロキシメチル)−テトラヒドロ−2H−ピラン−3,4,5−トリオール、
(2S,3R,4S,5R)−2−((2S,3S,4R)−3,4−ジヒドロキシ−2−(4−ペンタコシル−1H−1,2,3−トリアゾール−1−イル)オクタデシルオキシ)−6−(ヒドロキシメチル)−テトラヒドロ−28−ピラン−3,4,5−トリオール、
(2S,3R,4S,5R)−2−((2S,3S,4R)−3,4−ジヒドロキシ−2−(4−(6−フェニルヘキシル)−1H−1,2,3−トリアゾール−1−イル)オクタデシルオキシ)−6−(ヒドロキシメチル)−テトラヒドロ−28−ピラン−3,4,5−トリオール、
(2S,3R,4S,5R)−2−((2S,3S,4R)−3,4−ジヒドロキシ−2−(4−(7−フェニルヘプチル)−1H−1,2,3−トリアゾール−1−イル)オクタデシルオキシ)−6−(ヒドロキシメチル)−テトラヒドロ−28−ピラン−3,4,5−トリオール、
(2S,3R,4S,5R)−2−((2S,3S,4R)−3,4−ジヒドロキシ−2−(4−(8−フェニルオクチル)−1H−1,2,3−トリアゾール−1−イル)オクタデシルオキシ)−6−(ヒドロキシメチル)−テトラヒドロ−28−ピラン−3,4,5−トリオール、
11−アミノ−N−((2S,3S,4R)−3,4−ジヒドロキシ−1−((2S,3R,4S,5R)−3,4,5−トリヒドロキシ−6−(ヒドロキシメチル)−テトラヒドロ−28−ピラン−2−イルオキシ)オクタデカン−2−イル)ウンデカンアミド、
12−アミノ−N−((2S,3S,4R)−3,4−ジヒドロキシ−1−((2S,3R,4S,5R)−3,4,5−トリヒドロキシ−6−(ヒドロキシメチル)−テトラヒドロ−2H−ピラン−2−オキシ)オクタデカン−2−イル)ドデカンアミド、
N−((2S,3S,4R)−3,4−ジヒドロキシ−1−((2S,3R,4S,5R)−3,4,5−トリヒドロキシ−6−(ヒドロキシメチル)−テトラヒドロ−2Hピラン−2−イルオキシ)オクタデカン−2−イル)−11−ヒドロキシウンデカンアミド、
N−((2S,3S,4R)−3,4−ジヒドロキシ−1−((2S,3R,4S,5R)−3,4,5−トリヒドロキシ−6−(ヒドロキシメチル)−テトラヒドロ−2Hピラン−2−イルオキシ)オクタデカン−2−イル)−12−ヒドロキシドデカンアミド、
8−(ジヘプチルアミノ)−N−((2S,3S,4R)−3,4−ジヒドロキシ−1−((2S,3R,4S,5R)−3,4,5−トリヒドロキシ−6−(ヒドロキシメチル)−テトラヒドロ−2H−ピラン−2−イルオキシ)オクタデカン−2−イル)オクタンアミド、
N−((2S,3S,4R)−3,4−ジヒドロキシ−1−((2S,3R,4S,5R)−3,4,5−トリヒドロキシ−6−(ヒドロキシメチル)−テトラヒドロ−2Hピラン−2−イルオキシ)オクタデカン−2−イル)−11−(ジペンチルアミノ)ウンデカンアミド、
11−(ジヘプチルアミノ)−N−((2S,3S,4R)−3,4−ジヒドロキシ−1−((2S,3R,4S,5R)−3,4,5−トリヒドロキシ−6−(ヒドロキシメチル)−テトラヒドロ−2H−ピラン−2−イルオキシ)オクタデカン−2−イル)ウンデカンアミド、
N−((2S,3S,4R)−3,4−ジヒドロキシ−1−((2S,3R,4S,5R)−3,4,5−トリヒドロキシ−6−(ヒドロキシメチル)−テトラヒドロ−2Hピラン−2−イルオキシ)オクタデカン−2−イル)−11−メルカプトウンデカンアミド、
N−((2S,3S,4R)−3,4−ジヒドロキシ−1−((2S,3R,4S,5R)−3,4,5−ジヒドロキシ−6−(ヒドロキシメチル)−テトラヒドロ−2Hピラン−2−イルオキシ)オクタデカン−2−イル)−12−メルカプトドデカンアミドが挙げられる。
特定の樹状細胞、特にマウスCD8α+又はヒトにおいて相当するBDCA3+樹状細胞に、場合により1つ以上の抗原決定基(群)と共に、α−GalCer化合物などのiNKT細胞アゴニストを効率的に送達することは、iNKT細胞の早期活性化を増強することを可能とさせ、かつiNKT細胞がさらなる再刺激に対して応答することを可能とすることは、本発明の重要な発見である。
標的化剤による、iNKT細胞アゴニスト(例えばα−GalCer化合物)及び場合により抗原決定基(群)の効率的なターゲティングのために、該iNKT細胞アゴニスト及び場合により該抗原決定基(群)を、間接的又は直接的なカップリングのいずれかによって標的化剤にカップリングさせて、粒子状実体を形成しなければならない。間接的なカップリングの一例は、iNKT細胞アゴニスト(例えばα−GalCer化合物)、場合により抗原決定基(群)の、該iNKT細胞アゴニスト及び場合により該抗原決定基(群)を適切な樹状細胞に適切にインビボにおいて送達するための、標的化剤をさらに担持するナノ粒子への封入である。このような実施態様において、iNKT細胞アゴニスト(例えばα−GalCer化合物)、場合により1つ以上の抗原決定基(群)、及び標的化剤は、同じ粒子状実体、すなわちナノ粒子に物理的に関連付けられている。
− それは生体適合性である、
− それは、iNKT細胞アゴニスト、場合により抗原決定基(群)、及び標的化剤を、共有結合又は非共有結合的な連結を介して物理的にカップリングさせ得る。
(i)その表面上にコーティングを有する、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、又はそれらのコポリマーから作られたコア、
(ii)有効量のiNKT細胞アゴニスト、例えばα−GalCer化合物、
(iii)場合により、有効量の1つ以上の抗原決定基(群)、例えば腫瘍抗原又は病原体に由来する抗原、
(iv)ナノ粒子のコーティングに共有結合的に付着した抗体
を含み、該抗体は、BDCA3+樹状細胞に特異的に結合する。
あるいは、本発明の粒子状実体は、iNKT細胞アゴニスト(例えばα−GalCer化合物)の、標的化剤への、直接的か又は場合によりリンカーを介してかのいずれかでの化学的カップリングによりコンジュゲートを形成することからもたらされる。
本発明の粒子状実体は、アジュバントとして、すなわち、抗原決定基に対する免疫応答を増強させるために使用され得る。従って、本発明の粒子状実体は、抗原と共に、2つの別々の医薬組成物として、又は同組成物の一部として、又は同じ粒子状実体の一部としてのいずれかとして投与され得る。別々に投与されるならば、両方の組成物は、順次又は同時に投与され得る。具体的な実施態様において、抗原及び粒子状実体は同時に投与され、例えば、同組成物に製剤化される。他の実施態様において、該抗原は、ナノ粒子又はコンジュゲートなどの粒子状実体に含まれる。
本発明は、前の節に記載のように、iNKT細胞アゴニスト、場合により抗原決定基、及び樹状細胞への標的化剤を含有する本発明の粒子状実体並びに、1つ以上の生理学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。
− iNKT細胞アゴニスト、例えばα−GalCer化合物、
− 場合により、1つ以上の抗原決定基(群)、
− 樹状細胞、好ましくは特にBDCA3+樹状細胞への標的化剤
と共に含む医薬組成物に関し、該組成物は、該抗原に対する免疫応答を誘導することができる。
− iNKT細胞アゴニスト、例えばα−GalCer化合物、
− 樹状細胞、好ましくはBDCA3+樹状細胞への標的化剤、
− 場合により、1つ以上の抗原決定基(群)、
− 1つ以上の生理学的に許容される担体又は賦形剤、
− 場合により、1つ以上の補助物質。
本発明の粒子状実体及び医薬組成物は、例えば、様々な感染症を防ぎ、及び/又は処置するのに、或いは、腫瘍又は癌を治療又は予防するのに有用である。
材料及び方法
マウス
6〜8週令の雄の野生型C57BL/6マウスは、Janvier (Le Genest-St-Isle, France)から、RAG2−/− x OTIは、Jackson laboratory (St. Germain sur l'Arbresle, France)から購入した。CD1d−/−及びCD11c−DTRマウスの作製はすでに記載されている27,28。マウスを、本発明者ら自身の施設で病原体を含まない条件で飼育した。動物は、パスツール研究所の動物管理使用委員会の指針に沿って取扱い及び飼った。
α−GalCerは、以前に記載のように合成された(51)。Vybrant CFDA SE Cell Tracer KitはLife technologies(St Aubin, France)から購入した。PKH−26標識キット及びオボアルブミン(OVA)はSigma-Aldrich(St Quentin-Fallavier, France)から購入した。シアニン(Cy)5にコンジュゲートしたα−GalCerは記載のように合成された29。マウスCD5、CD11c、CD86に対するAPCにコンジュゲートしたモノクローナル抗体、PEにコンジュゲートした抗NK1.1抗体、抗TCRγδ抗体、FITCにコンジュゲートした抗CD8α抗体、抗TCRβ抗体、抗CD3ε抗体、PerCpCy5.5にコンジュゲートした抗CD11b抗体、eFluor450にコンジュゲートした抗Vα2 TCR抗体、PE−Cy7にコンジュゲートした抗CD11c抗体、抗CD8α抗体、抗PD−1抗体、ビオチンにコンジュゲートした抗CD1d抗体、AlexaFluor700にコンジュゲートしたストレプトアビジン、及びアイソタイプ対照は、BD Pharmingen (Le Pont de Claix, France)又はOzyme/Biolegend (Saint-Quentin-en-Yvelines, France)から購入した。PerCP−eFluor710抗CD205抗体はeBioscience (Paris, France)から購入した。IFN−γ(AlexaFluor647のコンジュゲートした)及びアイソタイプ対照は全てOzyme/Biolegendから購入した。PEにコンジュゲートしたPBS−57糖脂質のローディングされたCD1dテトラマーはNIAID Tetramer Facility (Emory University, Atlanta, GA)製であった。NPに備えるために使用された抗DEC205抗体(CD205)及びアイソタイプ対照(IgG2b)抗体は、BIO-X-CELL (West Lebanon, NH)製であった。
脂質−PEGでコーティングされかつ抗体を担持するナノ粒子は、前記されているように乳酸・グリコール酸コポリマー(PLGA)を使用して作製された30、31。簡潔に言えば、エンドトキシンを含まないOVA(5mg、Sigma-Aldrich)及び/又はα−GalCer(50μg)を、PLGA100mgに封入した。抗DEC205抗体及びそのアイソタイプ対照を、以前に記載のように脂質−PEG層に付着させた30。粒子表面上の抗体の存在は、クーマシー色素タンパク質アッセイによって決定された(表1)。PLGA NPは、動的光散乱及びゼータ電位によってキャラクタライズされた(表1)。
DCがPLGAをベースとしたNPに結合/取り込む能力を評価するために、骨髄由来DC(BM−DC)(5×105個の細胞/ウェル)32又は脾臓単核細胞(MNC)(1×106個の細胞/ウェル)を、37℃で2時間、AlexaFluor647で標識された粒子(それぞれ10μg/ml及び100μg/ml)に曝した。十分に洗浄した後、BM−DC(CD11c+DEC205+/−)及び脾臓CD8α+及びCD8α−DCをフローサイトメトリーによって分析した。BM−DC(1×105個の細胞/ウェル)を、iNKT細胞ハイブリドーマDN32.D3(1×105個の細胞/ウェル)と共に、段階付をした用量の遊離又は封入されたα−GalCerの存在下で24時間共培養した。CD8α+及びCD8α−DCのエクスビボにおける刺激能を試験するために、マウスに、α−GalCer 2μgを静脈内注射し、2時間後、DCサブセットをFACSAria(Becton Dickinson, MD, USA)を使用して選別し、選別された肝NKT細胞(CD5+NK1.1+細胞、純度は98%超)又はDN32.D3(1×105個の細胞/ウェル)と共にそれぞれ48時間及び24時間共培養した。培養上清中のIFN−γ、IL−4及びIL−2の産生を、ELISA(R&D systems)によって測定した。
細胞を、抗体の適切な組合せ中に再懸濁することにより、DCサブセット(抗CD11c抗体、抗CD8α抗体、抗CD11b抗体)、iNKT細胞(抗TCRβ抗体、PBS−57のローディングされたCD1dテトラマー)、NK細胞(抗CD3ε抗体、抗NK1.1抗体)、又はγδTリンパ球(抗TCRγδ抗体、抗CD3ε抗体)の同定を可能とした。その後、抗PD−1抗体、抗CD86抗体、抗CD1d抗体、又はアイソタイプ対照を必要である場合には加えた。細胞内IFN−γの発現を以前に記載されているように分析した32。脾臓DCサブセットによるCy5−α−GalCer取り込みを測定するために、マウスに、Cy5にコンジュゲートしたα−GalCer(20μg)を静脈内注射し、2時間後、脾臓DCサブセットによるCy5の取り込みをフローサイトメトリーによって分析した。
マウスに、5ngの遊離(又は対照として100ng)又は封入されたα−GalCerを含有するPBS200μlを静脈内投与した。CD11c−DTRマウスには、記載のように27、α−GalCer投与の24時間前に、ジフテリア毒素(DT)を注射した。脾臓DCを選別し(CD11c+細胞)、25ng/mlのα-GalCerを用いて感作し、マウスに静脈内注射した。リコール応答を分析するために、マウスは1週間後に遊離α−GalCer(100ng/マウス)の2回目の静脈内注射を受けた。動物から採血し、処置から3時間後に屠殺した。脾臓iNKT細胞を、細胞内IFN−γ発現について分析し、血清中のIFN−γ及びIL−4の濃度をELISAによって決定した。
マウスは、RAG2−/−xOT−Iマウスから精製された5×106個のCFSEで標識されOVA特異的であるCD8+T細胞を受けた。1日後、マウスの足蹠に、α−GalCer(5ng/マウス)及びOVA(250ng/マウス)の両方を含有するNPを、又は、同量の遊離α−GalCer及びOVAを注射した。3日後、膝窩リンパ節(LN)におけるCFSE標識細胞の増殖をフローサイトメトリーによって測定した。Vα2 TCR+CD8α+細胞によるIFN−γの発現を、膝窩LN細胞をMHCクラスI拘束OVAペプチドSIINFEKL(10μg/ml)でインビトロで18時間かけて再刺激した後に決定した。インビボにおけるCTLアッセイのために、マウス動物に、NPを用いての免疫化から6日後に、CFSE標識SIINFEKLで刺激された脾臓細胞及びPKH−26で標識された刺激されていない脾臓細胞(2×107個の細胞/マウス)の混合物を静脈内注射した。脾臓を2日後に収集し、CFSE及びPKH−26で標識された細胞の数を、フローサイトメトリーによって決定した。特異的溶解率を、以下のように決定した:[1−(刺激されていない割合/刺激された割合)]×100(式中、割合は、PHK−26で標識された細胞/CFSEで標識された細胞の数に等しい)。体液性応答及び記憶T細胞応答を分析するために、マウスに、遊離又はNPに共封入されたα−GalCer(100ng/マウス)及びOVA(5μg/マウス)を2回(0日目及び21日目)静脈内注射した。血液を28日目に採取し、抗OVA全IgG力価をELISAによって決定した。脾臓MNCを、2回目の免疫化から2か月後に調製し、SIINFEKLを用いて48時間インビトロで再刺激した。
マウスに、遊離又はベクター化OVA及びα−GalCerの接種から7日後にOVAを発現している2.5×105個のB16F10メラノーマ細胞を注射した。マウスを18日目に殺滅し、肺転移を顕微鏡を用いて計数した。
結果は、平均値±SD又はSEMとして表現される。実験群間の差の統計学的有意性は、対応のないスチューデント両側t検定によって計算された(GraphPad Prism 4 software, San Diego, CA)。0.05未満のp値を有する結果を有意と判断した。
樹状細胞は、インビボにおいてアネルギーを誘導することなく、iNKT細胞を効率的に活性化する
本発明者らはまず、トランスジェニックCD11c.DTRマウスを使用して、初回及び二次iNKT応答に対するDC枯渇の結果を調べた。DTによる処置は脾臓DCを枯渇させ(データは示されていない)、IFN−γ陽性iNKT細胞の出現頻度の減少によって(図1A)及び血清中のサイトカインの早期放出の減少によって(示されていない)例証されるように、初回iNKT細胞活性化の程度を強く低下させた。DCコンピテント動物においては、iNKT細胞は、α−GalCerによる再刺激時にIFN−γを産生する能力の低下を示したが、リコール応答は、初回iNKT細胞刺激時にDCが欠失していた場合には、完全に鈍っていた(図1A)。この効果は、脾臓においてDCの再増殖異常に起因するものではなかった(データは示されていない)。さらに、α−GalCerを経験していない動物においては、この新規に再増殖したDC集団は、α−GalCer接種後早期にiNKT細胞応答を促進することができた(データは示されていない)。総合すると、初期iNKT細胞活性化時におけるDCの欠失により、顕著なiNKT細胞の無応答性がもたらされ、これによりDCは、α−GalCerによる反復チャレンジ時のiNKT細胞応答の正の制御因子ということになる。この所見を確認するために、本発明者らは、DCによるiNKT細胞の初期活性化がiNKT細胞アネルギーを防ぐことができるかどうかを調べた。本発明者らの実験条件においては、遊離α−GalCer及びインビトロでα−GalCerのローディングされたDCは、同じようなiNKT細胞の初期活性化をトリガーした(図1B)。注目すべきことに、遊離α−GalCerは、予想されたiNKT細胞アネルギーを誘導したが、α−GalCerのローディングされたDCが以前に接種されたマウスからのiNKT細胞は、再活性化する能力を維持していた。特に、遊離α−GalCerは、iNKT細胞アネルギーを引き起こす阻害分子である、iNKT細胞上のPD−1の増強された発現を誘導したが33〜35、α−GalCerのローディングされたDCは誘導しなかった(データは示されていない)。従って、DCによるα−GalCerの提示により、その後のチャレンジ時にアネルギーを誘導することなくiNKT細胞活性化がもたらされる。
その後、本発明者らは、iNKT細胞の活性化におけるCD8α−及びCD8α+DCサブセットのそれぞれの役割を調べた。この問題に取り組むために、マウスにα−GalCerを接種し、2時間後、脾臓CD8α−及びCD8α+DCを精製し(図2A)、NKT細胞と共に培養した。CD8α−DCと比べて、CD8α+DCは、IFN−γ及びIL−4のはるかにより強力な分泌を促進した(図2B)。同様に、CD8α+DCは、iNKT細胞ハイブリドーマDN32.D3によるより高いIL−2の産生をトリガーしたが、その活性化は、CD1d/抗原により媒介されるTCRトリガーのみに依存する(図2C)。フローサイトメトリー分析は、CD8α−DCと比べて脾臓CD8α+DC上でのより高度なCD1dの発現を明らかにした(図2D)。この差異はα−GalCerのインビボにおける取り込みの相違にも起因し得るという可能性を調べるために、Cy5のコンジュゲートしたα−GalCerを投与した。CD8α−DCと比べて、Cy5のコンジュゲートしたα−GalCerの取り込み率は、CD8α+DCにおいてより重要であった(図2E)。逆に、脾臓細胞を、Cy5のコンジュゲートしたα−GalCerにインビトロで曝すと、CD8α−及びCD8α+DCの両方による同等の取り込みが行なわれた(データは示されていない)。まとめると、遊離α−GalCerの全身接種時に、CD8α+DCはiNKT細胞の強力な活性化因子である。
エンドサイトーシスC型レクチン受容体DEC205は、脾臓及びLNのCD8α+DCの細胞表面上に発現されている36。本発明者らはこの特性を利用して、α−GalCerをCD8α+DCにターゲティングした。そのために、本発明者らは、DEC205を認識する抗体でコーティングされたPLGAをベースとしたNP(NP/DEC205)中にα−GalCerを製剤化した(NPの物理的及び生化学的な特徴については、表1を参照されたい)。図3Aが示すように、DEC205+BM−DCは、DEC205−BM−DCとは対照的に、ここで陰性対照として使用されたNP/IgGと比べて、NP/DEC205を取り込んだ(図3A)。より重要なことには、脾臓細胞と共にインキュベートした場合、CD8α+DCは、CD8α−DCと比べてNP/DEC205をより効率的に取り込んだ(図3B)。その後、本発明者らは製剤の生物学的活性を比較した。段階付をした用量のNP/DEC205/α−GalCerと共にインキュベートされたBM−DCは、遊離のベクター化されていないα−GalCerと比較して、特にNP/IgG/α−GalCerと比較して、より高度にiNKT細胞活性化をトリガーした(図3C)。図3Dに示されているように、効果はCD1dに依存的であった。これらのデータは、まとめると、NP/DEC205へのα−GalCerの封入は、CD8α+DCを選択的にターゲティングし、インビトロにおいてiNKT細胞を効率的に活性化することを示す。
CD8α+DCへのα−GalCerのインビボにおける送達は、iNKT細胞の初期活性化を増強することが確立されたので、本発明者らは次に、リコール応答時のその応答性に影響を及ぼし得るかどうかを調べた。この問題に取り組むために、マウスに、NP/DEC205に封入された低用量のα−GalCer(5ng/マウス)又は高用量の遊離α−GalCer(100ng/マウス)のいずれかを注射し、両方共に、同等な初期iNKT細胞活性化をもたらした(図5A)。注目すべきことに、遊離α−GalCerはiNKT細胞アネルギーを誘導したが、NP/DEC205/α−GalCerは誘導しなかった(図5B)。この条件において、IFN−γ陽性iNKT細胞の出現頻度は、高用量のα−GalCerを1回注射された動物と同等であったことが注目に値する。最後に、遊離α−GalCerはiNKT細胞上でPD−1の発現を誘導したが、これは、NP/DEC205/α−GalCer投与後には当てはまらなかった(図5C)。まとめると、CD8α+DCへのα−GalCerのインビボにおける送達はiNKT細胞アネルギーを防ぐ。
マウスにおける数多くの研究が、DEC205を介して抗原をCD8α+DCにターゲティングする利点、特に、抗原交差提示を促進し、CD8T細胞を刺激する利点を示した38,39。α−GalCerと抗原とを互いに近接させた状態でCD8α+DCにターゲティングする効果は、依然として調査されていない。それをするために、CFSEで標識されたOT−I細胞で再構成されたマウスに、α−GalCer及びモデル抗原オボアルブミン(OVA)の両方を含有するNP/DEC205を接種した。NP/DEC205/OVA/α−GalCerは、NP/IgG/OVA/α−GalCerを用いて又は可溶性α−GalCerとOVA、又はOVA単独を用いて接種されたマウスと比較して、OVA特異的OT−I細胞のより高度な増殖を誘導した(図6A及び図7)。さらに、インビトロにおけるペプチドによる再刺激時に、IFN−γを発現しているOVA特異的CD8+Tリンパ球の出現頻度は、他の動物群と比較して、NP/DEC205/OVA/α−GalCerを受けたマウスにおいてより高かった(図S1B)。NP/DEC205/OVA/α−GalCerはまた、標的細胞溶解の測定によって評価したところ、より高い細胞障害性T細胞活性を惹起した(図6B)。最後に、最後の免疫化から2か月後のリコール応答は他の群においてはほぼ検出不可能であったが、NP/DEC205/OVA/α−GalCerを投与されたマウスは、長期間持続するCD8+T細胞記憶応答を示した(図6C)。DEC205のターゲティングはまた、体液性応答も促進し得る40,41。
腫瘍発症の制御に対するα−GalCer及び抗原のベクター化の結果を調べるために、マウスにNP/DEC205/OVA/α−GalCerを用いてワクチン接種し、その後、OVAを発現しているB16F10メラノーマ細胞を接種した。陽性対照として、マウスは、高用量の遊離α−GalCerとOVA(10倍以上)を受けた。図8が示しているように、NP/IgG/OVA/α−GalCerを受けているマウスと比較して、ワクチン接種を受けたマウスは、肺転移の発症から完全に防御された。
α−GalCerは、治療目的及びワクチン開発に対して非常に有望である強力な免疫刺激分子である1,2,7,42。しかしながら、いくつかの懸念がその臨床使用を制限する。その中で、α−GalCerがターゲティングする細胞の性質が依然として不明であること、及び従ってそれが促進する制御不能の応答は、依然として大きな問題である。最も重要なことは、α−GalCerが誘導する顕著かつ長期なiNKT細胞の不応答性であり、効果的な(例えば抗腫瘍)応答を発達させるため複数回の免疫学的な刺激を必要とする患者にとっては大きなハードルである22,24,26,43。iNKT細胞機能をよりうまく制御する可能性は、適切なAPC、例えばDCへのα−GalCerの受動的又は能動的な送達に見出し得る。この戦略はまた、iNKT細胞性免疫応答の強度及び品質を増強させ得る。本発明者ら及び他の者は、PLGAをベースとしたNP32若しくはリポソーム(データは示されていない)中にベクター化された又はウイルス様粒子44に含まれたα−GalCerは、iNKT細胞を活性化したが、再刺激時にそのアネルギーを防ぐことができなかったことを示した。それ故、α−GalCerの制御された送達は、iNKT細胞応答を最適化するための必要条件である。本発明において、本発明者らは初めて、CD8α+DCへのα−GalCerの特異的送達が、iNKT細胞の初期活性化を増強し、iNKT細胞アネルギーを回避するために役立つことを実証する。平行して、CD8α+DC(同じDCであるようである)へのα−GalCer及び抗原の共送達は、細胞性及び体液性免疫応答を非常に増幅(exacerbate)させる。
Claims (15)
- i.インバリアントナチュラルキラーT(iNKT)細胞アゴニスト、
ii.場合により、1つ以上の抗原決定基、及び
iii.該iNKT細胞アゴニスト及び場合により該1つ以上の抗原決定基を樹状細胞にインビボでターゲティングする標的化剤
を含む、粒子状実体。 - 該標的化剤が、該iNKT細胞アゴニストをヒトBDCA3+細胞へとターゲティングする、請求項1の粒子状実体。
- 該粒子状実体が、10〜2000nmの直径のサイズを有するナノ粒子である、請求項1又は2の粒子状実体。
- ポリマーを含有するコアとコーティングを含むナノ粒子であり、該標的化剤が、該コーティングの表面に共有結合的に連結されている、請求項3の粒子状実体。
- 該コアが、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、又はそれらのコポリマーを含む、請求項4の粒子状実体。
- 該粒子状実体が、場合によりリンカーを介して、標的化剤に共有結合的に連結された該iNKTアゴニストからなるコンジュゲートである、請求項1又は2の粒子状実体。
- 該iNKTアゴニストが、α−ガラクトシルセラミド又はその機能的誘導体である、請求項1〜6のいずれか一項の粒子状実体。
- 該標的化剤が、ヒトBDCA−3+樹状細胞に特異的な細胞表面マーカーに特異的に結合する結合分子を含む、請求項1〜7のいずれか一項の粒子状実体。
- BDCA−3+樹状細胞の該細胞表面マーカーが、XCR−1及びCLEC9Aからなる群より選択される、請求項8の粒子状実体。
- 該結合分子が、ヒトBDCA−3+樹状細胞の細胞表面マーカーの少なくとも1つに特異的に結合する抗体である、請求項8又は請求項9の粒子状実体。
- 1つ以上の抗原決定基をさらに含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の粒子状実体。
- 該抗原決定基が、感染剤、病原体、真菌細胞、細菌細胞、ウイルス粒子、又は腫瘍細胞に特異的である、請求項11の粒子状実体。
- 該粒子状実体が、CD1d分子を含まない、請求項1〜12のいずれか一項の粒子状実体。
- 請求項1〜13のいずれか一項記載の粒子状実体及び1つ以上の生理学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
- i.ワクチン組成物におけるアジュバントとして;
ii.腫瘍、癌又は感染症の処置において;
iii.自己免疫疾患及び炎症性疾患の処置において
のいずれかに使用するための、請求項1〜13のいずれか一項記載の粒子状実体又は請求項14の医薬組成物。
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