CN109563481B - 用于优化宿主抗原呈递和宿主抗肿瘤和抗病原体免疫的平台和方法 - Google Patents

Abstract

本文公开了用于增加细胞疫苗的实用性和有效性的方法和平台。具体地讲，本发明公开了优化离体B细胞扩增和促进宿主体内免疫的步骤。本发明还公开了用于增强抗原呈递和抗原特异性免疫应答的有效性的平台。本发明还公开了一种用于增强APC在受试者中的有效性的方法。本发明还公开了基于所述平台的疫苗和试剂盒。

Description

用于优化宿主抗原呈递和宿主抗肿瘤和抗病原体免疫的平台 和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年7月13日提交的美国临时专利申请62/361,591，2017年1月10日提交的美国专利临时申请62/444,460的权益，所述临时申请据此全文以引用方式并入本文。

背景技术

抗原呈递细胞(APC)或佐细胞是显示在其表面上与主要组织相容性复合物(MHC)复合的抗原的细胞；该过程被称为抗原呈递。T细胞可使用它们的T细胞受体(TCR)来识别这些复合物。APC处理抗原并将其呈递给T细胞。

几乎所有细胞类型均可用作APC的一些形式。它们存在于多种组织类型中。专职性APC，包括巨噬细胞、B细胞和树突状细胞，向CD4⁺辅助T细胞呈递外抗原，然而其他细胞类型可向CD8⁺细胞毒性T细胞呈递源自细胞内部的抗原。除了蛋白质的MHC家族之外，抗原呈递依赖于APC和T细胞两者的表面上的其他专门信号传递分子。

APC对有效的适应性免疫应答是至关重要的，因为CD8⁺细胞毒性和CD4⁺辅助T细胞两者的功能取决于APC功能。抗原呈递允许适应性免疫的特异性，并且可有助于针对细胞内和细胞外病原体的免疫应答。它还参与防御肿瘤。一些癌症疗法涉及建立人工APC以引入适应性免疫系统来靶向恶性细胞。

认为树突状细胞(DC)是蛋白质抗原呈递细胞(APC)，并且是针对感染性疾病和癌症的预防性免疫的有效诱导物。这些已经引起了将DC用作细胞疫苗方面的强烈关注；尤其是DC分化形成外周血单核细胞。DC通过识别病原体或肿瘤细胞并向免疫细胞提供可溶性细胞间信号来在控制先天和获得性免疫的界限方面起到关键作用。DC的这些功能主要取决于特异性表面受体、“图案识别受体”(PRR)的表达，最值得注意的是，通过toll样受体(TLR)和C型凝集素或凝集素样受体(LLR)表达。

B细胞代表大量有效的APC，并且可能是DC的唯一自体同源APC替代物，其可离体大量产生以用于免疫治疗目的。虽然已经描述了B细胞在体内诱导T细胞耐受或甚至阻断抗肿瘤免疫应答，但是这些报道限于缺乏重要辅助和共刺激分子表达的高表达的静息B细胞。另一方面，B细胞可通过表达CD40L的细胞与细胞因子和TLR配体的组合来活化以成为有效的APC。然而，这些方法不引起最佳B细胞活化(在TLR配体的情况下)或需要具有经转染细胞系的B细胞的共培养物(在CD40L的情况下)。这些限制使其较不适用于临床应用。因此，本领域需要诱导APC的活化和增殖以及增加其体内功效的实用方法和平台，以靶向多种类型的肿瘤和感染性疾病。

发明内容

本文公开了一种用于增强体内抗原呈递和抗原特异性免疫应答的有效性的平台，其中该平台包含：含有至少两种细胞因子的组合物，其中细胞因子中的两种是Fms相关的酪氨酸激酶3配体(Flt-3L)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，其中Flt-3L以8μg/kg或更少的待施用量存在；并且其中APC群已经加载有抗原和佐剂以在体内引发宿主抗原-特异性免疫应答。该平台还可包括用于促进该应答的其他因子，包括1-乙基1-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDAC)、环己酰亚胺(CHX)和α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)。EDAC(或其他化学交联剂)、CHX和α-GalCer(以及其他相似佐剂)可与包含Flt-3L和GM-CSF的平台一起使用或独立使用。

本文还公开了一种用于在对其有需要的受试者中增强抗原呈递和抗原特异性免疫应答的有效性的方法，该方法包括：向受试者施用包含至少两种细胞因子的组合物，其中该细胞因子中的两种为Flt-3L和GM-CSF，其中Flt-3L以8μg/kg或更小的剂量水平存在；以及向所述受试者施用抗原呈递细胞(APC)群，其已经与抗原和佐剂交联或负载有抗原和佐剂。

本文公开了用于增强抗原呈递和抗原特异性免疫应答的有效性的平台，其中该平台包含：含有FTY720的组合物；以及APC群，其已经与抗原和佐剂交联或负载有抗原和佐剂。此类佐剂是本领域的技术人员已知的。

本发明还公开了一种用于增强对其有需要的受试者中的抗原呈递细胞(APC)的有效性的方法，该方法包括：向受试者施用包含FTY720的组合物；以及向所述受试者施用APC群，其已经与抗原和佐剂交联或负载有抗原和佐剂。

本发明公开了一种用于在受试者中生产衣原体活化的抗原呈递细胞(APC)的方法，该方法包括：从受试者获得APC；使来自步骤a)的APC暴露于衣原体属物种(Chlamydiaspp.)、或活化蛋白、肽、或其片段；使来自步骤b)的APC暴露于抗-CD40单克隆抗体；以及使步骤c)的APC暴露于期望的抗原，其中所述抗原不来源于衣原体属物种(Chlamydia spp.)，从而获得活化的抗原呈递细胞(CAB)。

本发明还公开了一种用于增强对其有需要的受试者中的抗原呈递细胞(APC)的有效性的方法，该方法包括：向受试者施用包含抗-IL6和抗-PDL-1单克隆抗体的组合物；以及向受试者施用APC群，其已经与抗原和佐剂交联或负载有抗原和佐剂。

本文还公开了基于该平台的疫苗和试剂盒。

在附图和下面的描述中阐述了本发明的一个或多个实施方案的细节。根据下面的描述和附图以及权利要求，本发明的其他特征、目标和优点将显而易见。

附图说明

图1示出了用于改善体内抗原呈递和宿主抗原特异性免疫应答的方法的示意图。该方法可结合到疫苗接种策略中，该疫苗接种策略增加宿主T细胞应答和宿主抵抗肿瘤和病原体的能力。用Flt-3L和GM-CSF、以及FTY720处理携带肿瘤的宿主，通过增加宿主树突状细胞(DC)的成熟来增加抗肿瘤功效。

图2A-B示出用Flt-3L和GM-CSF对小鼠进行低剂量治疗，在不同剂量Flt3-L的情况下，以剂量响应方式增加CD8⁺和CD11b DC的数量(A)。此外，治疗增加了CD8⁺CD103⁺DC(具有交叉呈递能力的DC)的百分比(B)。

图3A-B示出用Flt-3L和GM-CSF对小鼠进行低剂量治疗，在不同剂量的GM-CSF的情况下，以剂量响应方式增加CD8⁺和CD11b DC的数量(A)。此外，治疗增加了CD8⁺CD103⁺DC(具有交叉呈递能力的DC)的百分比(B)。

图4A-B示出用Flt-3L和GM-CSF对小鼠进行低剂量治疗，增加了CD8⁺DC的数量并降低了髓源抑制细胞(MDSC)的比率(A)。此外，治疗增加了CD8⁺CD103⁺DC(具有交叉呈递能力的DC)的百分比并降低了未成熟DC(Ly6c^hi)的比率(B)。重要的是，Flt-3L和GM-CSF处理还可改善其他抗原加载的APC(例如基于DC的疫苗平台)的干预效果，因为其增加了肿瘤内DC的频率，增加了体内抗原特异性T细胞引发，降低了髓源性抑制细胞频率，并增加了肿瘤内巨噬细胞的分化。

图5示出在利用Flt-3L和GM-CSF处理携带肿瘤的宿主的情况下观察到的负载抗原的活化B细胞的抗肿瘤功效增加不是Flt-3L和GM-CSF的直接抗肿瘤效果。在附图图例框中，“GF”表示用Flt-3L和GM-CSF处理。如图所示，用GM-CSF和Flt-3L处理的小鼠中的肿瘤尺寸减小，然而在肿瘤施用之后仅用GM-CSF/Flt-3L处理的小鼠中的肿瘤生长不受控制。

图6示出低剂量Flt-3L/GM-CSF改善了活化B细胞引发CD8⁺细胞的能力。换句话说，通过Flt-3L和GM-CSF的前期处理增加体内CD8⁺T细胞引发。

图7示出低剂量Flt-3L/GM-CSF增加了CAB的抗肿瘤活性。

图8示出体内施用之前活化B细胞的CHX处理。通过在注射之前活化B细胞的CHX处理增加体内CD8⁺T细胞引发。CHX可通过增加活化B细胞的存活率来增强抗原呈递能力。

图9示出用EDAC将抗原与活化B细胞交联。零长度交联接头EDAC促进含氨基的分子附着到活化B细胞，诸如CAB(衣原体活化的B细胞)。在底片中，活化B细胞(或其他专职性APC)的抗原呈递能力可通过在体内施用之前将用EDAC交联期望的抗原(蛋白质或肽)来增强。与简单肽冲击/负载CAB相比，使用EDAC将肽与CAB化学缀合增加了抗肿瘤治疗活性。

图10示出在体内施用之前CAB的α-GC负载可显著增加内源性DC的活化。除了GM-CSF和Flt-3L之外，活化B细胞(或其他专职性APC)的抗原呈递能力还通过在体内施用之前用α-GC体外加载APC来增强。

图11示出α-GC负载的CAB增强了引发的抗原特异性CD8⁺T细胞的效应子功能。

图12示出α-GC负载的活化B细胞增强CAB功效并更有效地减小肿瘤尺寸，并且该效果取决于NKT细胞的存在。

图13示出整个优化递送系统提供优异的抗肿瘤活性。本文所述的策略增加活化B细胞的抗原呈递能力。例如，它们还可与其他细胞疫苗平台(例如，基于CD40B细胞的疫苗和基于DC的疫苗)一起使用，或在体内与检查点抑制剂(例如抗-PDL1mAb)组合使用。

图14示出优化的递送系统相对于对照。降低肿瘤尺寸和肿瘤负荷。前期注射低剂量Flt3l/GMCSF增加了经CHX处理的、抗原负载的、α-GC负载的抗原呈递细胞(例如活化B细胞或成熟DC)的功效。利用EDAC将抗原负载到抗原呈递细胞上(但可使用其他零长度交联剂)。

图15示出优化的递送系统增加生存率。

图16示出用优化的递送系统控制B16.F10黑素瘤。

图17示出即使使用极具挑战性的B16.F10小鼠黑素瘤模型，优化的递送系统也被证明是有效的，并且存活率显著增加。

图18显示了评估FTY720对宿主的脾脏中CAB频率的影响的方法。

图19示出FTY720促进宿主的脾脏中的CAB积聚。CAB-CTV表示用CellTraceViolet^TM标记的CAB。FTY720以1.25mg/kg使用。

图20示出评估FTY720对CAB介导的CD8⁺T细胞引发的影响的方法。

图21示出FTY720增加了负载有α-GC的CAB引发稳健的CD8⁺T细胞应答的能力。

图22示出FTY720与CAB疗法的组合治疗HPV相关肿瘤的能力。使用TC-1细胞(HPV18E6/E7)(2×10⁵个肿瘤细胞)。

图23示出FTY720和CAB疗法的组合显著增加携带HPV相关肿瘤的小鼠的存活。使用TC-1细胞(HPV18E6/E7)(2×10⁵个肿瘤细胞)。

图24示出冷冻保存的CAB不丧失其引发稳健的CD8⁺T细胞应答的能力。

图25示出FTY720和冷冻保存的CAB疗法的组合显著增加携带HPV相关肿瘤的小鼠的存活。使用TC-1细胞(HPV18E6/E7)(2×10⁵个肿瘤细胞)。

图26示出FTY720和异源CAB疗法的组合显著增加携带HPV相关肿瘤的小鼠的存活。使用TC-1细胞(HPV18E6/E7)(2×10⁵个肿瘤细胞)。

图27示出添加抗-IL6 mAb显著增加CAB和抗-PDL-1 mAb联合疗法的抗肿瘤治疗活性。第0天：SQ施用4×10⁵个B16-F10黑素瘤细胞(侵袭性肿瘤细胞系的非常高的肿瘤负荷)。在第8天开始施用与B16-特异性肽缀合并且负载有α-GC的CAB。

图28示出向CAB添加抗-IL6 mAb和抗-PDL-1 mAb联合疗法显著增加了受治疗动物的存活率。第0天：SQ施用4×10⁵个B16-F10黑素瘤细胞(使用侵袭性肿瘤细胞系的非常高的肿瘤负荷)。

图29示出抗-CD40mAb有利于(即，进一步促进)在体内形成人CAB的能力。

具体实施方式

定义

“FTY720”也被称为“芬戈莫徳”。FTY720是免疫调节药物，其最常用于临床治疗多发性硬化症(MS)。芬戈莫徳是鞘氨醇-1-磷酸酯受体调节剂，其在淋巴结中多价螯合淋巴细胞，从而防止它们有助于自身免疫反应。还设想了本领域技术人员已知的FTY720的类似物。

“抗-CD40单克隆抗体”是CD40(分化40的簇)的抗体，其是存在于抗原呈递细胞上促进其活化的共刺激蛋白质。T_H细胞上的CD154(CD40L)与CD40的结合活化抗原呈递细胞并且诱导各种下游效应。

“抗-IL6单克隆抗体”是指抗白介素-6抗体。白介素6是参与宿主对许多炎性疾病和癌症的应答的细胞因子。

“抗-PDL-1单克隆抗体”是指程序性死亡配体1(PD-L1)的抗体，也被称为分化274的簇(CD274)或B7同系物1(B7-H1)。其是人体内由CD274基因编码的蛋白质。程序性死亡配体1(PD-1)为40kDa 1型跨膜蛋白。

“Fms相关酪氨酸激酶3配体”(Flt-3L)是指可用于刺激造血祖细胞的增殖和分化的细胞因子。

“粒细胞巨噬细胞集落刺激因子”(GM-CSF)是指促进单核细胞迁移到组织中及其分化成树突状细胞(DC)的细胞因子。

“1-乙基1-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺”(EDAC)是零长度交联剂。

“环己酰亚胺”(CHX)是蛋白质生物合成抑制剂。

“α-半乳糖基神经酰胺”(α-GalCer)是用作1型NKT细胞活化因子的脑苷脂。

本文所用的冠词“一个”和“一种”是指冠词的语法对象中的一个或多于一个(即，至少一个)。以举例的方式，“元件”是指一个元件或多于一个元件。

如本文所用，“约”在涉及可测量的值(诸如，量、时距等)时，旨在涵盖从指定值的约20％或约10％，更优选地5％，甚至更优选地1％，并且还更优选0.1％的变化，因为此类变型对于行进本发明所公开的方法是合适的。

术语“抗原组合物”是指包含刺激免疫系统并引起宿主或受试者的免疫应答的物质的组合物。

术语“引发免疫应答”是指响应于刺激(诸如抗原)在体内刺激免疫细胞。免疫应答由细胞免疫应答(例如T细胞和巨噬细胞刺激)和体液免疫应答(例如，B细胞和补体刺激和抗体产生)组成。可使用本领域熟知的技术来测量免疫应答，其包括但不限于抗体免疫测定法、增殖测定法、细胞因子产生测定法等。

如本文所用，术语“疫苗”是指包含如本文所述的免疫原性表位的组合物，其可用于在受试者体内建立对病原体或肿瘤细胞的免疫性。设想疫苗包含药学上可接受的载体和/或佐剂。设想疫苗是预防性或治疗性的。

“预防性”治疗是向不表现出疾病病征或仅表现出疾病的早期病征的受试者施用以用于降低发展病变的风险的目的的治疗。本文所公开的疫苗可作为预防性治疗给予，以减少发展病变的可能性或如果发展则使病变的严重性最小化。

“治疗性”治疗是向表现出病变的病征或症状的受试者施用，以用于减少或消除那些病征或症状的目的的治疗。病征或症状可以是生物化学、细胞、组织学、功能性、主观或客观的。

术语“失活”用于本文以描述微生物，诸如衣原体属物种(Chlamydia spp.)(包括沙眼衣原体(C.trachomatis)、鹦鹉热衣原体(C.psittaci)、肺炎衣原体(C.pneumoniae)和沙眼衣原体鼠肺炎株(C.muridarum))，其在本领域中被称为“杀死”或“死亡”微生物。失活细菌是不具有感染特性的全细菌，并且由“活”细菌产生，不考虑该细菌先前是否以任何方式减弱。

多肽的“片段”是指比全长多肽或蛋白质表达产物小的多肽的任何部分。在一个方面，片段是全长多肽的缺失类似物，其中一个或多个氨基酸残基已从全长多肽的氨基末端和/或羧基末端移除。因此，“片段”是下文所述的缺失类似物的子集。

如本文所用，术语“抗体”是指能够结合到抗原的特异性表位的免疫球蛋白分子。抗体可以是来源于天然来源或来自重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫活性部分。抗体可由本文所述的疫苗产生，并且可以多种形式存在，其包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、细胞内抗体(“细胞内抗体(intrabodies)”)、Fv、Fab和F(ab)2、以及单链抗体(scFv)、重链抗体，诸如骆驼科抗体、合成抗体、嵌合抗体和人源化抗体(Harlow等人，1999，Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress，NY；Harlow等人，1989，Antibodies:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，N.Y.；Houston等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird等人，1988，Science 242:423-426)。

当在生物体、组织、细胞或其组分的上下文中使用时，术语“异常”是指与显示“正常”(预期)相应特性的那些生物体、组织、细胞或其组分在至少一个可观察或可检测特征方面(例如，年龄、治疗、当日时间等)不同的那些生物体、组织、细胞或其组分。对于一个细胞或组织类型是正常或预期的特性对于不同的细胞或组织类型可能是异常的。

如本文所用，“减轻”疾病是指降低疾病或病症的至少一种病征或症状的频率或严重性。

如本文所用，“有效量”意指提供治疗或预防有益效果的量。

如本文所用，“免疫测定”是指使用能够特异性结合靶分子的抗体以检测并定量靶分子的任何结合测定。

如本文所用，“说明材料”包括出版物、记录、图表、或任何其他表达媒介，其可用于传达试剂盒中的本发明的化合物、组合物、方法、平台或体系用于操作本文所述方法的实用性。本发明的试剂盒的说明材料可例如附接到包含本发明经鉴定化合物、组合物、平台或递送体系的容器，或连同包含本发明的经鉴定化合物、组合物、方法组件、平台或体系的容器一起装运。另选地，说明材料可与容器分开装运，使得说明材料和化合物由接收者配合使用。

如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指由通过肽键共价连接的氨基酸残基构成的化合物。蛋白质或肽必须包含至少两种氨基酸，并且不限于可包含蛋白质序列或肽序列的最大氨基酸数。多肽包括任何肽或蛋白质，其包含通过肽键彼此接合的两个或更多个氨基酸。如本文所用，术语是指短链，其也通常在本领域中被称为例如肽、低聚肽和低聚物，并且指长链，其一般在本领域中被称为蛋白质，所述蛋白质具有许多类型。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源多肽、低聚肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽、或它们的组合。

“疾病”是动物的健康状况，其中动物不能维持体内平衡，并且其中如果疾病没有改善则动物的健康持续恶化。相比之下，动物的“病症”是其中动物能够维持体内平衡，但其中动物的健康状况比其没有病症时可能的健康状态较不利的健康状况。如果不及时治疗，病症并不一定会导致动物的健康状况进一步下降。

术语“受试者”是指为施用或治疗的目标的任意个体。受试者可以是脊椎动物，例如哺乳动物。因此，受试者可以为人或兽医患者，诸如伴侣动物或服务动物。术语“患者”是指接受临床护理提供方(例如医生)的治疗的受试者。

如本文所用，术语“治疗”或“治疗方案”是指用于减轻或改变病症或疾病状态的那些活性物质，例如旨使用药理学、外科、饮食和/或其他技术减少或消除疾病或病症的至少一种病征或症状的治疗过程。治疗方案可包括一种或多种药物或手术的处方剂量。治疗通常是有益的并且减少或消除病症或疾病状态的至少一种病征或症状，但在一些情况下，治疗的效果将具有不可取的作用或副作用。治疗效果也将受到受试者的生理状态的影响，例如年龄、性别、遗传学、体重、其他疾病条件等。

术语“治疗有效量”是指将引起正在被研究人员、兽医、医师或其他临床医生寻找的组织、系统或受试者的生物或医学响应的主题化合物的量。术语“治疗有效量”包括当施用时，足以防止足以防止所治疗的病症或疾病的一种或多种病征或症状发展或在一定程度上缓解的化合物的量。治疗有效量将根据化合物、疾病及其严重性和待治疗的受试者的年龄、体重等而有所不同。

“治疗”疾病作为术语用于本文，意指减少受试者经历的疾病或病症的至少一种病征或症状的频率或严重性。

除非特别指明，否则如本文所用，术语“细胞”还指单个细胞、细胞系、原代培养物或来源于此类细胞的培养物。“培养物”是指包含相同或不同类型的分离细胞的组合物。细胞系是一种特定类型的细胞的培养物，其可无限期地复制，因此使得细胞系“永生”。细胞培养物可以为在体外或离体生长的细胞群。原代细胞培养物是来自细胞或直接取自活生物体的培养物，其不是永生的。

术语“生物样品”是指组织(例如，组织活检)、器官、细胞(包括保持在培养物中的细胞)、细胞裂解物(或裂解物级分)、来源于细胞或细胞物质的生物分子(例如，多肽或核酸)或来自受试者的体液。体液的非限制性示例包括血液、尿液、血浆、血清、泪液、淋巴液、胆汁、脑脊液、间质液、水性或玻璃体液、初乳、痰、羊水、唾液、肛门和阴道分泌物、汗液、精液、渗出液、流出物和滑液。

以单数或复数形式使用的术语“肿瘤细胞”或“癌细胞”是指经历恶性转化的细胞，所述恶性转化使得它们对宿主生物体是病理性的。通过成熟的技术，具体地讲组织学检查，可容易地将原发性癌细胞(即，从恶性转化位点附近获得的细胞)与非癌细胞区分开。如本文所用，癌细胞的定义不仅包括原发性癌细胞，而且包括来源于癌细胞祖先的任何细胞。这包括转移的癌细胞，以及来源于癌细胞的体外培养物和细胞系。

术语“肿瘤相关的抗原”或“TAA”用于本文是指由肿瘤细胞以比相同组织类型的非肿瘤细胞更高的频率或密度表达的分子或复合物。肿瘤相关的抗原可以是不由宿主正常表达的抗原；其可能是由宿主正常表达的分子的突变、截短、错误折叠或以其他方式异常表现；其可与正常表达但以异常高水平表达的分子相同；或者其可在异常的环境或背景中表达。肿瘤相关的抗原可为例如蛋白质或蛋白质片段、复合碳水化合物、神经节苷脂、半抗原、核酸、或这些或其他生物分子的任何组合。特定肿瘤相关的抗原的存在或特征的知识不是本发明的实践所必需的。

术语“B细胞”是指B淋巴细胞。B细胞前体位于其中产生未成熟的B细胞的骨髓中。B细胞发育通过若干阶段进行，每个阶段代表抗体基因座处的基因组含量的变化。在基因组重链可变区中，存在三个片段V、D和J，其在被称为VDJ重排的过程中随机重组，以在每个B细胞的免疫球蛋白中产生独特的可变区。轻链可变区进行类似的重排，不同的是仅涉及两个片段，V和J。在完全重排后，B细胞到达骨髓中的IgM⁺未成熟阶段。这些未成熟的B细胞在其表面上呈递膜结合的IgM，即B细胞受体(BCR)，并迁移到脾脏，其中它们被称为过渡性B细胞。这些细胞中的一些分化成成熟的B淋巴细胞。在它们的表面上表达BCR的成熟的B细胞使血液和淋巴系统循环，从而起到免疫监视的作用。它们不产生可溶性抗体，直至它们完全活化。每个B细胞具有将与一个特定抗原结合的独特受体蛋白质。一旦B细胞遇到其抗原并接收来自CD4⁺T辅助细胞的附加信号，其就可进一步分化成表达和分泌可溶性抗体的浆细胞或记忆B细胞。

术语“B细胞”也可指在其表面上呈递完全重排的(即成熟的)B细胞受体(BCR)的任何B淋巴细胞。例如，B细胞可以是未成熟或成熟的B细胞，并且优选是幼稚B细胞，即未暴露于被所述B细胞的表面上的BCR特异性识别的抗原的B细胞。B细胞可以是记忆B细胞，优选IgG⁺记忆B细胞。术语“B细胞”还可是指B细胞的混合物。B细胞的混合物可意指混合物中的B细胞具有不同的抗原特异性，即产生识别多种抗原的抗体或完全重排的BCR。同样关于抗原特异性，单个B细胞的抗体或BCR通常是相同的。

术语“B细胞分泌抗体”优选是指血浆细胞。术语“在其表面上携带BCR的B细胞”优选是指在其质膜上表达BCR(优选完全重排的BCR)的B细胞。在这种情况下，“BCR”优选不意指单个BCR，但优选地意指多个BCR。

术语“部分”是指分数。一部分优选意指至少20％、至少30％、优选至少40％、更优选至少50％、更优选至少60％、更优选至少70％、甚至更优选至少80％、并且最优选至少90％的整个实体。术语“大部分”优选是指整个实体的至少50％、更优选至少60％、更优选至少70％、甚至更优选至少80％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％、并且最优选至少99％。

术语“克隆扩增”是指其中特定实体繁殖的过程。在本发明的上下文中，术语优选在免疫应答的上下文中使用，其中淋巴细胞受抗原刺激、增殖，并且扩增识别所述抗原的特定淋巴细胞。优选地，克隆扩增导致淋巴细胞分化，优选地分化成例如产生和分泌抗体的淋巴细胞。B淋巴细胞分泌抗体为例如浆细胞。

术语“抗原”涉及包含免疫应答待针对其产生的表位的试剂。具体地讲，术语“抗原”包括蛋白质、肽、多糖、脂质和核酸(尤其是RNA和DNA)以及核苷酸。术语“抗原”还包括作为次要物质的衍生抗原，其仅通过转化(例如，在分子中间，由主体蛋白完成)变成抗原性和致敏性，以及缀合抗原，其通过人工结合原子基团(例如，异氰酸酯、重氮盐)表现出新的组成特异性。在一个优选的实施方案中，抗原是肿瘤抗原，即可来源于细胞质、细胞表面和细胞核的肿瘤细胞的组分，具体地讲优选在细胞内大量产生的那些抗原，或作为肿瘤细胞上的表面抗原。示例为癌胚抗原、α-甲胎蛋白、异铁蛋白和胚胎硫糖蛋白、α2-H-甲胎蛋白和γ-甲胎蛋白以及各种病毒性肿瘤抗原。在另一个实施方案中，抗原是微生物病原体(例如病毒抗原)的一部分，诸如病毒核糖核酸或包膜蛋白。具体地讲，抗原或其肽应当可通过B细胞受体或免疫球蛋白分子(诸如抗体)来识别。优选地，如果被B细胞受体识别，则抗原能够在适当共刺激信号的存在下，诱导携带BCR的B细胞的克隆扩增特异性识别抗原并将此类B细胞分化成分泌B细胞的抗体。抗原可以存在于重复组织中，即抗原包含多于一种、优选至少2种、至少3种、至少4种、最多至6种、10种、12种或更多种免疫应答待针对其产生，或者抗体待针对其产生的试剂或表位。此类重复抗原优选地能够结合到具有相同特异性的多于一种抗体。换句话讲，此类重复抗原包含多于一种表位，优选地相同的表位，并且因此能够“交联”针对所述表位的抗体。多于一种试剂或表位可共价或非共价连接，其中共价连接可通过任何化学基团，诸如通过肽键来连接。抗原可以是融合分子，所述融合分子包含抗原肽的重复或包含具有共同表位的不同抗原肽。在一个优选的实施方案中，所述抗原肽通过肽接头连接。

如本文所用，术语“T淋巴细胞”和“T细胞”包括从T细胞前体(包括不具有重排的T细胞受体[TCR]基因的Thy阳性细胞)到成熟T细胞(即，针对CD4⁺或CD8⁺单阳性，表面TCR阳性细胞)的T淋巴细胞谱系中的任何细胞。

如本文所用，“CD4⁺T细胞”和“CD4T细胞”是指辅助T细胞，然而“CD8⁺T细胞”和“CD8T细胞”是指细胞毒性T细胞。

如本文所用，“T细胞表位”是指在对包含该抗原的肽的免疫应答开始时被T细胞受体识别的肽或蛋白质的特征。一般据信，由T细胞识别T细胞表位是经由以下机制，其中T细胞识别结合到在抗原呈递细胞上表达的I型或II型主要组织相容性复合物(MHC)分子的抗原的肽片段(参见例如，Moeller(编辑)，Immunol.Rev.,98:187[1987])。

如本文所用，“T细胞增殖”是指在具有或不具有抗原的情况下，在T细胞与抗原呈递细胞温育期间产生的T细胞数。

如本文所用，“基线T细胞增殖”是指在不存在同源肽或蛋白质抗原的情况下响应于对抗原呈递细胞的暴露，在个体中正常观察到的T细胞增殖的程度。出于本文的目的，基线T细胞增殖水平对于每个个体基于每个样品确定为在不存在抗原的情况下，响应于抗原呈递细胞的T细胞增殖。

范围：在整个本公开中，本发明的各个方面可以以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应当理解为对本发明范围的不可改变的限制。因此，应当认为范围的描述具体公开了所有可能的子范围以及在该范围内的单个数值。例如，应当认为范围诸如1至6的描述已经具体地公开了子范围，诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单个数值，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围宽度如何，这都适用。

根据本文教导的方法，向受试者施用有效量的试剂。术语有效量和有效剂量可互换使用。术语有效量被定义为产生期望的生理应答所需的任何量。用于施用试剂的有效量和时间表可凭经验确定，并且进行此类测定在本领域技术的范围内。用于施用的剂量范围为足够大以产生影响(例如，减少或延迟)疾病或病症的一种或多种症状的期望效果的那些。剂量不应大到引起显著不良副作用，诸如不希望的交叉反应、过敏反应等。通常，剂量将随年龄、状况、性别、疾病类型、疾病或病症的程度、给药途径或该方案中是否包括其他药物而变化，并且可由本领域技术人员确定。在任何禁忌症的情况下，个体医师可以调整剂量。剂量可以变化，并且可在一天或几天内每天施用一次或多次剂量施用。对于给定类别的药物产品，可以在文献中找到关于适当剂量的指导。

如本文所用，术语“治疗”(treatment、treat或treating)是指降低疾病或病症的作用或者疾病或病症的症状的方法。因此，在本发明所公开的方法中，治疗可是指已造成的疾病或病症的严重性或者该疾病或病症的症状降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。例如，与对照相比，如果受试者的疾病的一种或多种症状降低10％，则治疗病症的方法被认为是治疗。因此，与天然或控制水平相比，降低程度可以是介于10％和100％之间的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或任何百分比的降低程度。应当理解，治疗不一定是指治愈或完全消除疾病、病症、或者该疾病或病症的症状。

如本文所用，术语“预防(prevent、preventing和prevention)疾病或病症”是指在受试者开始表现出疾病或病症的一种或多种症状之前或几乎在受试者开始表现出疾病或症状的一种或多种症状的同一时间发生的动作，例如，施用治疗剂，该动作抑制或延迟疾病或病症的一种或多种症状的发作或恶化。如本文所用，提及减少、降低或抑制包括与对照水平相比，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高的变化。此类术语可包括但不一定包括完全消除。

一般描述

本文公开了一种用于增强抗原呈递细胞(APC)的有效性的平台，其中该平台包含：含有至少两种细胞因子的组合物，其中细胞因子中的两种是Fms相关的酪氨酸激酶3配体(Flt-3L)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，其中Flt-3L以8μg/kg或更少的待施用量存在；以及已经负载有抗原的APC群，其旨在向内源性免疫细胞(包括APC)呈递所负载的抗原。

另外，本文公开了用于增强抗原呈递和抗原特异性免疫应答的有效性的平台，其中该平台包含：含有FTY720的组合物；以及已经负载有抗原的APC群。

平台还可包括其他因子，其在下文更详细地描述。这些因子包括但不限于1-乙基1-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDAC)、环己酰亚胺(CHX)、FTY720和α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)。EDAC(或其他化学交联剂)、CHX、FTY720和α-GalCer(以及下文所述的其他等同佐剂)可与包含Flt-3L和GM-CSF的平台一起使用或独立使用。

本文还公开了一种用于在对其有需要的受试者中增强体内抗原呈递的有效性的方法，该方法包括：向受试者施用包含至少两种细胞因子的组合物，其中细胞因子中的两种为Flt-3L和GM-CSF，其中Flt-3L以8μg/kg或更小的剂量水平存在；并且其中向所述受试者施用APC群，其已经与抗原和一种或多种佐剂交联或负载有抗原和一种或多种佐剂。施加的APC随后可向内源性宿主APC和其他内源性免疫细胞呈递所负载的抗原。

FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt-3L)是内源性小分子，其用作细胞因子和生长因子，所述细胞因子和生长因子通过活化造血祖细胞来增加免疫细胞(淋巴细胞(B细胞和T细胞))的数目。它通过结合到并活化FLT3(CD135)起作用，所述FLT3存在于所谓的多能祖细胞(MPP)和常见淋巴细胞祖细胞(CLP)上(小鼠中)。如本文所用，术语“Flt3-配体”是指描述于美国专利5,554,512、EP 0627487A2和WO 94/28391中的多肽属，所述专利文献均以引用方式并入本文。

粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是促进造血祖细胞的增殖和分化的造血生长因子。用于GM-CSF的克隆基因已在细菌、酵母和哺乳动物细胞中表达。内源性人类蛋白质是具有约22,000道尔顿分子量的单体糖蛋白。酵母表达体系中产生的GM-CSF是以商品名从Immunex Corporation，Seattle，Wash商购获得。其是127个氨基酸的糖蛋白，其特征在于具有19,500、16,800和15,500道尔顿的分子质量的三个主要分子物质。GM-CSF描述于美国专利5,108,910和5,229,496中，其各自以引用方式并入本文。

本文所公开的方法可用于增加针对肿瘤和病原体的抗原特异性T细胞的诱导，以用于主动或被动免疫治疗、免疫调节和研究目的。本文所公开的方法也可用于增加针对处于肿瘤发展的高风险下个体(即，患有恶性肿瘤前或癌前状态的个体)中肿瘤的抗原特异性T细胞的诱导。APC能够处理外源蛋白抗原、呈递免疫原性肽并刺激T细胞，诸如同种异体的幼稚CD4⁺和CD8⁺T细胞，以及幼稚和记忆抗原特异性CD4⁺和CD8⁺T细胞。这些特性允许有效地引发体内T细胞应答，包括治疗癌症所期望的那些。

根据本文所公开的条件制备的APC可通过本领域技术人员已知的多种技术与任何期望的抗原或抗原的组合、以及免疫原性肽进行组合。例如，用本文所公开的方法处理的APC可静脉内施用于受试者。T细胞增殖和活化的量级取决于待施用的APC数。由于可利用本文所公开的方法获得的高细胞数，例如本文所公开的经处理的APC可被同源肿瘤抗原或肿瘤特异性肽进行冲击，以诱导肿瘤特异性CD8⁺T细胞应答，从而能够排斥鼠模型中相应的肿瘤挑战。

由于增加APC数的本发明所公开的方法，这些细胞可用于多种方法中以向T细胞呈递期望的抗原，例如肿瘤相关的抗原。例如，人APC可以刺激人类同种异体的幼稚CD4⁺和CD8⁺T细胞。它们还可以在动物(包括伴侣动物和人类)中引发对病毒和肿瘤抗原具有特异性的自体同源幼稚和记忆T细胞。此外，在小鼠中，这些增强的T细胞应答能够促进对致死性病毒感染的拯救并使已建立的肿瘤消退。

与尚未与本文所述平台一起使用的APC相比，本文所述平台中所用的APC(在图1的示意图中所示)可具有多个优点。因此，本文公开了APC，其与不处于具有FTY720、α-GalCer(或下文所述的它们的等同佐剂)、Flt-3L和GM-CSF的平台中的APC相比，具有呈递抗原和活化T细胞的改善的能力。“改善的”是指与在不具有FTY720、α-GalCer(或下文所述的它们的等同佐剂)、Flt-3L和GM-CSF暴露的情况下施用APC相比，给予已暴露于FTY720、α-GalCer(或下文所述的它们的等同佐剂)、Flt-3L和GM-CSF的患者的APC具有更大的呈递抗原和活化T细胞的能力。这种增加的能力可为增加10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％。其也可以是增加2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍、或更多。

本发明还公开了在使用Flt-3L和GM-CSF的平台中的树突状细胞在次级淋巴器官和肿瘤中的增加的频率(与不具有Flt-3L和GM-CSF的平台相比)。所谓“增加的频率”是指与不具有Flt-3L和GM-CSF的平台中的宿主相比，已经暴露于Flt-3L和GM-CSF的宿主具有更大量的内源性树突状细胞。这种增加的频率可为增加10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％或更多。其也可以是增加2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍的树突状细胞、或更多。

本发明还公开了与不具有Flt-3L和GM-CSF的平台相比，增加的抗原特异性T细胞引发。所谓的“增加的引发”意指与不具有Flt-3L和GM-CSF的平台相比，抗原特异性T细胞引发更频繁地发生。这种增加的频率可为抗原特异性T细胞引发增加10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％或更多。其也可以是增加2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍、或更多。

本发明还公开了与不具有Flt-3L和GM-CSF的平台相比，降低的髓源抑制细胞(MDSC)频率。所谓“降低的MDSC”频率意指与不具有Flt-3L和GM-CSF的平台相比，MDSC出现较不频繁。这种降低的频率可以为MDSC频率降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％。

本发明还公开了与不具有Flt-3L和GM-CSF的平台相比，肿瘤内巨噬细胞的增加的分化。所谓“增加的分化”是指与不具有Flt-3L和GM-CSF的平台相比，肿瘤内巨噬细胞的分化更频繁地发生。这种增加的频率可以为肿瘤内巨噬细胞的分化增加10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％或更多。其也可以是肿瘤内巨噬细胞增加2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍、或更多。

本发明还公开了与不具有FTY720的平台相比，次级淋巴器官中灌注的APC的增加的频率。所谓“增加的频率”是指与不具有FTY720的平台中的宿主相比，已经暴露于FTY720的宿主具有次级淋巴器官中更大量的灌注的APC。这种增加的频率可为增加10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％或更多。其也可以是增加2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍的灌输APC、或更多。

本发明还公开了与不具有FTY720的平台相比，增加的抗原特异性T细胞引发。所谓的“增加的引发”意指与不具有FTY720的平台相比，抗原特异性T细胞引发更频繁地发生。这种增加的频率可为抗原特异性T细胞引发增加10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％或更多。其也可以是增加2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍、或更多。

重要的是，图7示出了使用GM-CSF和Flt-3L，低剂量相对于高剂量治疗的有效性。展示出低剂量的GM-CSF和Flt-3L(如本文所定义)比较高剂量的GM-CSF和Flt-3L更有效地减小肿瘤尺寸。值得注意的是，在图2、图3和图7中，Flt-3L小鼠剂量为0.5μg-2μg/小鼠(20g)或25μg-100μg/Kg(计算的相当的人剂量为2μg-8μg/Kg)。就GM-CSF而言，小鼠剂量为0.125μg-0.5μg/小鼠(20g)、6.25μg-25μg/kg(计算的相当的人剂量为0.5μg-2μg/kg)。因此，“低剂量”定义为对于Flt-3L，在人类中为2μg-8μg/kg，对于GM-CSF在人类中为0.5μg-2μg/kg。“高剂量”定义为高于8μg/kg的Flt-3L和高于2μg/kg的GM-CSF的任何量。

FTY720可给予具有抗原呈递细胞的受试者。例如，FTY720可与APC同时给予。另选地，FTY720可在APC之前，诸如在APC之前1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、24小时、36小时、48小时、60小时或72小时给予受试者。FTY720也可在APC之后给予受试者。例如，FTY720可在施用APC之后1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、24小时、36小时、48小时、60小时或72小时给予。给予受试者的FTY720的剂量可以为1μg/kg、2μg/kg、3μg/kg、4μg/kg、5μg/kg、6μg/kg、7μg/kg、8μg/kg、9μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、50μg/kg，或比这些量小、大或在这些量之间的任何量。

向受试者施用FTY720可结合下文更详细讨论的其他治疗、因子或APC增强方法来进行。这些包括使用细胞因子诸如GM-CSF和/或Flt-3L。例如，Flt-3L可以8μg/kg或更少的待施用量存在。其他因子包括但不限于1-乙基1-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDAC)、环己酰亚胺(CHX)、和α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)。EDAC(或其他化学交联剂)、CHX和α-GalCer(或下文详述的其他相当的佐剂)可一起或单独用于该平台中。

在本文所述的平台中，APC可与佐剂交联或负载有佐剂。佐剂在下文更详细地描述。已负载有抗原的APC群向内源性免疫细胞呈递所负载的抗原。抗原可以为蛋白质、肽或任何含胺分子。抗原可与APC交联，诸如与(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDAC)交联。可在与抗原交联之前，用环己酰亚胺(CHX)处理APC。抗原以及交联抗原的方法在下文中更详细地描述。APC可暴露于α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)或等同的佐剂。这也在下文更详细地描述。

与不具有FTY720、α-GalCer(或下文讨论的等效佐剂)、Flt-3L或GM-CSF的平台相比，受试者暴露于本文所公开的平台可导致宿主的抗原特异性T细胞应答的抗肿瘤或抗微生物病原体效应子功能增加。本文所公开的平台可用于增加针对肿瘤和病原体的抗原特异性T细胞的诱导，以用于主动或被动免疫治疗、免疫调节和研究目的。本文所公开的方法也可用于增加针对处于肿瘤发展的高风险下个体(即，患有恶性肿瘤前或癌前状态的个体)中肿瘤的抗原特异性T细胞的诱导。如上介绍的，APC能够处理外源蛋白抗原、呈递免疫原性肽并刺激T细胞，诸如同种异体的幼稚CD4⁺和CD8⁺T细胞，以及幼稚和记忆抗原特异性CD4⁺和CD8⁺T细胞。这些特性允许有效地引发体内T细胞应答，包括治疗癌症所期望的那些。

根据本文所公开的条件制备的APC可通过本领域技术人员已知的多种技术与任何期望的抗原或抗原的组合、以及免疫原性肽进行组合。例如，用本文所公开的方法处理的APC可静脉内施用于受试者。T细胞增殖和活化的量级取决于待施用的APC数。由于可利用本文所公开的方法获得的高细胞数，例如本文所公开的经处理的APC可被同源肿瘤抗原或肿瘤特异性肽进行冲击，并诱导肿瘤特异性CD8⁺T细胞应答(这些应答示出能够拒绝鼠模型中相应的肿瘤挑战)。

与尚未与本文所述平台一起使用的APC相比，本文所述平台中所用的APC(在图1的示意图中所示)可具有多个优点。这些优点中的一些可见于图22、23、24、25和26。因此，本文公开了APC，其与不处于具有Flt-3L、GM-CSF、α-GalCer(或下文所讨论的其他相当佐剂)和/或FTY720的平台中的APC相比，具有呈递抗原和活化T细胞的改善的能力。“改善的”是指与在不具有Flt-3L、α-GalCer(或下文所讨论的其他等同佐剂)、GM-CSF、和/或FTY720暴露的情况下施用APC相比，给予已暴露于Flt-3L、GM-CSF、α-GalCer(或下文所讨论的其他等同佐剂)和/或FTY720的患者的APC具有更大的呈递抗原和活化T细胞的能力。这种增加的能力可为增加10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％。其也可以是增加2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍、或更多。

本发明还公开了相比于不具有FTY720、α-GalCer(或下文所讨论的其他等同佐剂)、Flt-3L和/或GM-CSF的平台，在次级淋巴器官和肿瘤中树突状细胞的增加的频率。所谓“增加的频率”是指与不具有FTY720、α-GalCer(或下文所述的其他等同佐剂)、Flt-3L和/或GM-CSF的平台中的宿主相比，已经暴露于FTY720、α-GalCer(或下文所述的其他等同佐剂)、Flt-3L和/或GM-CSF的宿主具有更大量的内源性树突状细胞。这种增加的频率可为增加10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％或更多。其也可以是增加2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍的树突状细胞、或更多。这种内源性DC的频率增加与灌注APC的募集增加以及内源性APC的活化的组合，，增强了抗原特异性T细胞应答并增加了本文所述平台的功效。

本发明还公开了与不具有Flt-3L、GM-CSF、α-GalCer(或下文所讨论的其他等同佐剂)和/或FTY720的平台相比，增加的抗原特异性T细胞引发。所谓的“增加的引发”意指与不具有FTY720的平台相比，抗原特异性T细胞引发更频繁地发生。这种增加的频率可为抗原特异性T细胞引发增加10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％或更多。其也可以是增加2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍、或更多。本发明还公开了使用平台诱导的宿主的抗原特异性T细胞应答的增强的抗肿瘤或抗微生物病原体效应子功能。

本文公开了使用本文所述的平台产生的疫苗。此类疫苗在下文中更详细地描述。

本文公开了试剂盒，所述试剂盒包含Flt-3L、GM-CSF和/或FTY720，以及APC群，所述APC群已经负载有抗原和佐剂，以在体内引发宿主抗原-特异性免疫应答。试剂盒还可包含CHX、EDAC和α-GalCer或其他等同佐剂，包括FTY720的佐剂。在另一个实施方案中，试剂盒可包括用于制备抗原负载的APC连同免疫原性细胞诸如B细胞和树突状细胞的说明。例如，所述试剂盒还可包含抗-CD40单克隆抗体以及抗-IL6和/或抗-PDL-1。

抗-CD40单克隆抗体

本发明公开了一种用于在受试者中生产活化的、抗原呈递的衣原体活化的抗原呈递细胞(APC)的方法，该方法包括：a)从受试者获得APC；b)使来自步骤a)的APC暴露于衣原体属物种(Chlamydia spp.)、或活化蛋白、肽、或其片段；c)使APC暴露于抗-CD40单克隆抗体；以及d)使APC暴露于期望的抗原，其中所述抗原不来源于衣原体属物种(Chlamydiaspp.)，从而获得活化的抗原呈递细胞(诸如，衣原体活性B细胞，即CAB)。值得注意的是，步骤b)、c)和d)可以任何顺序发生。可将抗-IL6和抗-PDL-1单克隆抗体连同来源于该方法的CAB一起给予对其有需要的受试者。

APC还可暴露于白介素-2(IL-2)和IL-4，并且这些细胞因子还可与抗-CD40单克隆抗体组合以增加APC扩增。在该方法中公开的APC可与佐剂交联或负载有佐剂。已负载有抗原的APC群向宿主中的内源性免疫细胞呈递所负载的抗原。

当已暴露于抗-CD40单克隆抗体的APC被给予受试者时，它们可与本文所公开的其他平台和方法一起给予。例如，可将FTY720给予受试者。还可将抗-IL-6和抗-PDL-1单克隆抗体也给予受试者。还可给予GM-CSF和/或Flt-3L。例如，Flt-3L可以8μg/kg或更少的待施用量存在。其他因子包括但不限于1-乙基1-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDAC)、环己酰亚胺(CHX)、和α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)(或下文所讨论的其他等同佐剂)。EDAC(或其他化学交联剂)、CHX和α-GalCer(或下文详述的其他相当的佐剂)。这些可一起使用或单独使用。

在本文所述的平台中，APC可与佐剂交联或负载有佐剂。佐剂在下文更详细地描述。已负载有抗原的APC群向内源性免疫细胞呈递所负载的抗原。抗原可以为蛋白质、肽或任何含胺分子。抗原可与APC交联，诸如与(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDAC)交联。可在与抗原交联之前，用环己酰亚胺(CHX)处理APC。抗原以及交联抗原的方法在下文中更详细地描述。APC可暴露于α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)或等同的佐剂。这在下文更详细地描述。

当与未暴露于抗-CD40单克隆抗体的APC群相比时，本文所公开的使APC暴露于抗-CD40抗体的方法导致APC的离体扩增增加。如本文所用，APC的扩增包括刺激细胞增殖以及预防细胞凋亡或导致细胞死亡的其他过程。如本文所用，“培养”和“温育”用于指示细胞在细胞培养基中维持一段时间，所述细胞培养基具有适当的添加剂(饲养细胞、细胞因子、激动剂、其他刺激分子或培养基，其可包含缓冲液、盐、糖、血清或各种其他组分)。本领域的技术人员将理解，可改变培养或温育时间以允许适当的扩增，调节单个亚组的不同的细胞密度或频率，并允许研究者适时使用细胞。因此，精确的培养长度可由本领域技术人员根据经验确定。

抗-IL6和抗-PDL-1单克隆抗体

本文还公开了一种用于增强对其有需要的受试者中的抗原呈递细胞(APC)的有效性的方法，该方法包括：a)向受试者施用包含抗-IL6和抗-PDL-1单克隆抗体的组合物；以及b)向所述受试者施用APC群，其已经与抗原和佐剂交联或负载有抗原和佐剂。抗体可同时施用于对其有需要的受试者，或者可以在其他物质之前施用。例如，它们可彼此隔开1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、或更多个小时施用。

可将抗-IL6和抗-PDL-1单克隆抗体与APC联合给予受试者。例如，可同时给予抗-IL6和抗-PDL-1单克隆抗体与APC。另选地，可在APC之前，诸如在APC施用之前1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、24小时、36小时、48小时、60小时或72小时，将抗-IL6和抗-PDL-1单克隆抗体给予受试者。还可在APC之后将抗-IL-6和抗-PDL-1单克隆抗体给予受试者。例如，可在施加APC之后1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、24小时、36小时、48小时、60小时或72小时，给予抗-IL6和抗-PDL-1单克隆抗体。

向受试者施用抗-IL6和抗-PDL-1单克隆抗体可结合下文更详细讨论的其他治疗、因子或APC增强方法来进行。在本文所述的平台中，APC可与抗原和佐剂交联或负载有抗原和佐剂。佐剂在下文更详细地描述。已负载有抗原的APC群向内源性免疫细胞呈递所负载的抗原。抗原可以为蛋白质、肽或任何含胺分子。抗原可以与APC诸如EDAC)交联。可在与抗原交联之前，用CHX处理APC。抗原以及交联抗原的方法在下文中更详细地描述。APC可暴露于α-GalCer或等同佐剂。这也在下文更详细地描述。

与不具有抗-IL6和抗-PDL-1单克隆抗体的平台相比，使受试者暴露于使用抗-IL6和抗-PDL-1单克隆抗体的平台可导致抗原特异性T细胞引发增加。这些结果显示在图27和图28中。本文所公开的平台可用于增加针对肿瘤和病原体的抗原特异性T细胞的诱导，以用于主动或被动免疫治疗、免疫调节和研究目的。本文所公开的方法也可用于增加针对处于肿瘤发展的高风险下个体(即，患有恶性肿瘤前或癌前状态的个体)中肿瘤的抗原特异性T细胞的诱导。APC能够处理外源蛋白抗原、呈递免疫原性肽并刺激T细胞，诸如同种异体的幼稚CD4⁺和CD8⁺T细胞，以及幼稚和记忆抗原特异性CD4⁺和CD8⁺T细胞。这些特性允许有效地引发体内T细胞应答，包括治疗癌症所期望的那些。

本文公开了使用本文所述的平台产生的疫苗。此类疫苗在下文中更详细地描述。

本文公开了试剂盒，所述试剂盒包含抗-IL6和抗-PDL-1单克隆抗体，以及APC群，所述APC群已经负载有抗原和佐剂，以在体内引发宿主抗原-特异性免疫应答。试剂盒还可包括FTY720、Flt3-L、GM-CSF、CHX、EDAC、和α-GalCer或它们的等同物。在另一个实施方案中，试剂盒可包括用于制备抗原加载的APC连同免疫原性细胞诸如B细胞或树突状细胞的说明。试剂盒还可包含抗-40单克隆抗体。

抗原呈递细胞(APC)

本文所公开的抗原呈递细胞(APC)可来自多种来源。示例包括但不限于B细胞，诸如衣原体活化的B细胞(CAB)、CD40活化的B细胞、树突状细胞、以及人造APC(细胞衍生或合成的)，诸如纳米颗粒、抗-DEC-205抗体缀合物、以及抗-CLEC9抗体缀合物。

本文所用的B细胞可得自多种来源，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、来自感染部位的组织、脾组织和肿瘤。本领域中可得的任何数量的B细胞系可与本文所公开的平台和方法一起使用。在本文所述方法的某些实施方案中，B细胞可使用技术人员已知的任何数量的技术由从受试者收集的血液单元获得，诸如FICOLL^TM(可用于制备高密度溶液的蔗糖和表氯醇的共聚物)分离。B细胞还可得自尸体脾组织。可将B细胞预处理以增加其有效性，诸如CD40活化的B细胞和衣原体活化的B细胞(CAB)。

具体地，关于CAB，衣原体属物种(Chlamydia spp.)具有诱导静息B细胞的选择性多克隆活化的独特能力，所述静息B细胞易于从外周血或次级淋巴器官(例如淋巴结)，以及从各种哺乳动物(小鼠、猫、狗、恒河猴(rhesus macaques)和人)中获得。灭活的衣原体属物种(Chlamydia spp.)(EB)、原质小体(EB)、网状体(RB)或其裂解物能够活化得自外周血或次级淋巴器官的静息B细胞并诱导其增殖。这使其数量大量扩增，这通过本文所公开的其他因素进一步增强。这使得其后续免疫磁珠分选相当有效。其稳健扩增也有利于其用作免疫疗法而不具有先前的选择过程。CAB可表达高水平的共刺激分子，并且能够获得可溶性蛋白并且比静息B细胞更有效地处理它们。这些必要条件使得产生的CAB能够将抗原呈递给T细胞。产生的CAB可使用各种施用方案用于自体或同种异体输注，这是由于所述平台生成大量APC的能力以及冷冻保存CAB并且仍然保持其作为APC的全部功能的适应性，如图24和图25所示。

属于骨髓来源的细胞谱系的树突状细胞(DC)存在于身体中的多个组织中，并且用作哺乳动物免疫系统的中心部分。其主要功能是处理抗原物质并将在其表面上的抗原物质呈递给免疫系统的其他细胞。因此，DC用作抗原呈递细胞(APC)。

DC存在于与外部环境直接接触的组织中，诸如皮肤(其中存在被称为朗格汉斯细胞的专化DC类型)以及鼻、肺、胃和肠的内层。其也可以血液中的未成熟状态存在(iDC)。一旦活化，它们就迁移到淋巴结，其中它们与T细胞和B细胞相互作用以启动并塑造适应性免疫应答。用于治疗用途的DC也可使用细胞因子的组合(诸如，但不限于，GM-CSF和IL-4)由外周血单核细胞的分化产生。

抗原

本文所公开的与平台一起使用的抗原可以为任何蛋白质、肽、全灭活生物体、或任何含胺分子。可使用来自大量疾病、病症或症状的相关抗原。示例性抗原包括但不限于细菌、病毒、寄生虫、过敏原、自身抗原和肿瘤相关的抗原。如果使用基于DNA或RNA的疫苗，则抗原通常将由所施用的DNA或RNA构建体的序列编码。另选地，如果抗原以缀合物形式施用，则抗原通常将是包含在施用的缀合物中的蛋白质。本文所公开的APC可同时或依次暴露于多于一种抗原或与多于一种抗原交联。例如，本文所公开的APC可同时或依次暴露于2、3、4、5、6或更多种抗原，或负载有不同单一抗原的APC可组合在一起施用。

可以使用的抗原的具体示例包括但不限于来自甲型、乙型、丙型或丁型肝炎的抗原、爱泼斯坦巴尔病毒、流感病毒、李斯特氏菌属、肉毒杆菌(Clostridium botulinum)、肺结核、兔热病毒、重型天花病毒(天花)、病毒性出血热、鼠疫杆菌(Yersinia pestis)(鼠疫)、HIV、疱疹、乳头状瘤病毒以及其他与感染因子相关的抗原。其他抗原包括与自身免疫病症、炎性病症、过敏、哮喘和移植排斥相关的抗原。抗原负载的APC可单独施用或与其他治疗剂诸如CD40激动剂或TLR激动剂结合施用。作为具体示例，与抗-CD40抗体结合用于治疗病症或增强免疫力的治疗性或预防性疫苗中。又如，本文所公开的APC平台可与检查点抑制剂结合使用。检查点抑制剂技术的示例可见于WO1999015157A2、WO2015016718A1和WO2010149394A1，所述专利文献以其全文关于检查点抑制剂的公开内容并入本文。本文还讨论了其他联合疗法。

在一个实施方案中，抗原可包括肿瘤相关的抗原。可治疗的肿瘤的示例包括以下肿瘤：胰腺肿瘤，诸如胰腺导管腺癌；肺肿瘤，诸如小细胞和大细胞腺癌、鳞状上皮细胞癌和支气管肺泡癌；结肠肿瘤，诸如上皮腺癌及其癌细胞转移；和肝癌，诸如肝癌和胆管癌。还包括HPV诱导的肿瘤和其他病毒诱导的肿瘤；乳腺肿瘤，诸如导管和小叶腺癌；妇科肿瘤，诸如子宫颈的鳞状和腺癌、子宫和卵巢上皮腺癌；前列腺肿瘤，诸如前列腺腺癌；膀胱肿瘤，诸如移行性鳞状细胞癌；网状内皮(RES)系统的肿瘤，诸如结节性或弥漫性B或T细胞淋巴瘤、浆细胞瘤、和急性或慢性白血病；皮肤肿瘤，诸如恶性黑素瘤；以及软组织肿瘤，诸如软组织肉瘤和平滑肌肉瘤。特别值得注意的是脑肿瘤，诸如星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤和原始神经外胚层肿瘤。此类别中包括神经胶质瘤、胶质母细胞瘤和胶质肉瘤。

具体地，以下抗原相与以下类型的癌症相关，并且可用于表1中所公开的平台和方法：

表1：癌症和相关抗原

经治疗个体的免疫状态可以为下列中的任一种：关于组合物中存在的某些肿瘤相关的抗原，个体的免疫力较低，在这种情况下，可给予所述组合物以引发或促进抗肿瘤应答的成熟。个体目前可能不表达抗肿瘤免疫，但可具有免疫记忆，具体地讲与疫苗中包含的肿瘤相关的抗原有关的T细胞记忆，在这种情况下，可给予组合物以刺激记忆应答。个体还可对疫苗中包含的肿瘤相关的抗原具有主动免疫(体液或细胞免疫，或上述两者)，在这种情况下，可给予组合物以保持、促进或使应答成熟，或募集免疫系统的其他臂。受试者应当至少部分地具有免疫活性，使得疫苗可诱导内源性T细胞应答。

在另一个实施方案中，抗原可包含感染性试剂。可使用本文所公开的平台和方法治疗的感染因子的示例包括但不限于流感病毒、呼吸道合胞体病毒(RSV)、人乳头瘤病毒(HPV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人T-淋巴细胞病毒1型、人类免疫缺陷病毒1(HIV)、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)、细胞巨化病毒(CMV)和其他疱疹病毒科。其他示例包括单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、沙门氏菌(Salmonella)、肺结核分枝杆菌(Salmonella)、疟原虫属(Plasmodium sp.)(疟疾)、刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)和克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)。

佐剂

根据本文所述的方法和组合物可使用多种佐剂。佐剂的示例包括但不限于无机盐、皂苷、多糖、脂质、脂多糖(内毒素)、核酸或蛋白质。

佐剂可以是合成的咪唑并喹啉，诸如咪喹莫特(S-26308，R-837)(Harrison等人，Vaccine 19：1820-1826(2001))或瑞喹莫德(S-28463，R-848)(Vasilakos等人，CellularImmunology 204：64-74(2000))。

佐剂可以为核酸。核酸佐剂的示例包括但不限于CpG、聚腺苷酸/聚尿苷酸、聚肌胞：聚胞苷酸和洛索比(7-烯丙基-8-氧代鸟嘌呤)(参见，例如，美国专利6,406,705)。

佐剂可以为天然的或合成的MR1配体，诸如维生素B2生物合成中间体。这些化合物的示例包括但不限于5-氨基-6-d-核糖醇基氨基尿嘧啶(天然)或水稳定的合成MR1配体，诸如衍生自3c 5-OP-RU 3c的化合物9-11(Mak，Nature Communications2016)。

佐剂可以为蛋白质或蛋白质片段。蛋白质佐剂的示例包括血蓝蛋白、血红素、血清蛋白、细胞因子、巨噬细胞炎性蛋白、细菌抗原、酵母抗原、哺乳动物多肽和超级抗原。

佐剂可为血蓝蛋白和血红素。示例性血蓝蛋白来自钥孔虫戚(KLH)，但可采用其他软体动物和节肢动物的血蓝蛋白和血红蛋白。在另一个示例性实施方案中，蛋白质佐剂可以是卡介苗(BCG)。

蛋白质佐剂可以为血清蛋白，诸如例如互补因子C3d。C3d为16个氨基酸肽(参见，例如，Fearon等人，1998，Semin.Immunol.10:355-61；Nagar等人，1998，Science；280(5367):1277-81，Ross等人，2000，Nature Immunol.，第1(2)卷)，其可商购获得(例如，Sigma Chemical Company，目录号C 1547)。

蛋白质/肽佐剂可以为细菌或酵母抗原。合适的细菌或酵母抗原的示例包括，例如，胞壁酰肽(诸如，Immther^TM，theramide(MDP衍生物)、DTP-N-GDP、GMDP(GERBU佐剂)、MPC-026、MTP-PE、murametide和murapalmitine)；MPL衍生物(诸如MPL-A、MPL-SE，3D-MLA和SBAS-2)；Mannon、N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(去甲-MDP)和N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1'-2’二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)。这些试剂可商购获得，例如，MPL-A可购自ICN Chemical Company(目录号150012)，Immther^TM可购自DorPharma Inc.。

蛋白质佐剂可以为哺乳动物肽。可用作佐剂的哺乳动物肽的示例包括，例如，黑素瘤肽946、中性粒细胞趋化肽和弹性蛋白重复肽。

佐剂可以为超抗原。具体地讲，超抗原可用于产生或增强针对细胞内抗原(包括细胞内肿瘤抗原)的免疫应答。超抗原是比肽抗原刺激更大比例的T淋巴细胞但不需要抗原加工的细菌产物(Mooney等人，(1994),MoI.Immunol.31:675-681)。超抗原包括葡萄球菌外蛋白，诸如来自金黄色葡萄球菌(S.aureus)和表皮葡萄球菌(S.epidermidis)的α、β、γ和δ肠毒素，以及α、β、γ和δ大肠杆菌外毒素、以及来自细菌诸如产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)和酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的其他膜蛋白和毒素。在其他实施方案中，佐剂可以为多糖。也可使用各种多糖佐剂，诸如例如肺炎球菌多糖佐剂(参见例如，Yin等人，(1989)J.Biological Response Modifiers 8:190-205)。还可使用多糖的多胺变体，诸如甲壳质和脱乙酰壳多糖以及脱乙酰化甲壳质。

佐剂也可为脂多糖(内毒素)。此类佐剂的示例可为可用于动物中的脂质A、和可用于动物和人中的解毒内毒素。解毒和精制的内毒素以及它们的组合描述于美国专利4,866,034；4,435,386；4,505,899；4,436,727；4,436,728；4,505,900中。

佐剂也可以为来自辣子革兰氏阴性细胞的磷壁酸。这些包括脂磷壁酸(LTA)、核糖醇磷壁酸(RTA)和甘油磷壁酸(GTA)。还可采用其合成配对物的活性形式(Takada等人，(1995)Infection and Immunity 63:57-65)。BCG和BCG细胞壁骨架(CWS)也可在具有或不具有海藻糖二霉菌酸酯的情况下用作佐剂。可使用海藻糖二霉菌酸酯本身。海藻糖二霉菌酸酯可如美国专利4,579,945中所述制备。本文所述的佐剂可商购获得，或可使用本领域熟知的常规方法获得。

附加平台因子

如上所述，本文所述的平台还可包括其他因子。这些因子包括但不限于1-乙基1-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDAC)、环己酰亚胺(CHX)、和α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)或等同物。EDAC、CHX、和α-GalCer(以及下文所述的其他等同佐剂)可与包含FTY720、Flt-3L和/或GM-CSF的平台一起使用或独立使用。

蛋白或肽抗原可利用EDAC或能够交联的任何其他试剂交联到APC。交联剂诸如EDAC可极大地增强APC的抗原呈递能力。这可在APC的体内施用之前进行，如在以下示例中：与简单的肽冲击/CAB负载相比，利用EDAC，肽与衣原体活化的B细胞(CAB)的化学缀合增加了抗肿瘤治疗活性。可使用任何已知的交联剂，只要其对APC是非细胞毒性的即可。在一个具体示例，APC以10⁸-2.5×10⁸个细胞/ml的浓度重新悬浮于PBS(pH 6.0)中。添加含胺抗原(蛋白或肽)，并且然后添加新鲜EDAC以获得最终浓度为25.65mg/ml。将混合物充分混合，并在冰上温育1小时。温育后，用PBS(pH 7.4)洗涤APC。

还可在与抗原交联之前，用环己酰亚胺(CHX)处理APC。这可用于增强抗原呈递容量，诸如活化B细胞。环己酰亚胺是真核生物体中蛋白质生物合成的抑制剂，其由细菌灰色链霉菌(streptomyces griseus)产生。环己酰亚胺通过干扰蛋白质合成中的易位步骤(2个tRNA分子和mRNA相对于核糖体的运动)发挥其作用，从而阻断翻译延伸。通常，将CHX以2.5μg/ml的最终浓度加入APC中，并且然后温育45分钟-60分钟。在该步骤之后，APC用PBS(pH7.4)洗涤，然后使用APC或将其与抗原缀合。

APC还可暴露于佐剂，诸如α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)或等同物，诸如α-C-GC、C18、C22、C23、7DW8-5、7DW8-6、α-GC C24:0、或α-Carba-GC。该示例可参见图12、图22和图23。还可使用其他NKT细胞活化剂。示例包括但不限于α-C-半乳糖基神经酰胺(Fujii，PNAS 2006)。此外，α-GalCer可与其他类型的天然杀伤T(NKT)细胞的另一种活化剂组合，诸如溶血磷脂酰胆碱或β-甘露糖基神经酰胺。溶血磷脂酰胆碱或β-甘露糖基神经酰胺也可单独用作佐剂。也可以考虑使用天然或合成的MR1配体，诸如维生素B2生物合成中间体。例如，CAB可单独地或与α-GalCer一起负载有5-氨基-6-d-核糖醇基氨基尿嘧啶。还可添加其他佐剂，诸如TLR配体(例如聚肌胞：聚胞苷酸)和STING配体，所述添加可单独进行或与α-GalCer一起进行。

α-GalCer由Nattori等人进行描述(Tetrahedron，50:2271(1994)，其以引用的方式并入)，其本身已经示出抑制肿瘤生长。参见，Koejuka等人，Recent Res.Cancer，1:341(1999)。Sharif等人，Nature Med.，7:1057(2001)，和Hong等人，Nature Med.，7:1052(2002)。α-GalCer结构的研究示出其包含鞘氨醇链。Miyamoto等人，Nature，413：531(2001)已经示出该链的截短物以产生预防自身免疫性脑脊髓炎的化合物。在并行工作中，已示出NKT细胞识别由主要组织相容性复合物-I型样蛋白，例如CD1D呈递的脂质抗原。参见，Godfrey等人，J.Clin.Invest.，114:1379-1388(2004)。Singh等人，J.Immunol.，163:2373(1999)，和Burdin等人，Eur.J.Immunol.,29:2014(1999)，已经示出αGalCer和CD1d通过活化Vα14自然杀伤T(NKT)细胞加强Th2介导的适应性免疫应答。

已经开发α-GalCer作为潜在的治疗化合物并进行临床试验，参见，例如Giaccone等人，Clin Canc.Res.，8，3702-3709(2002)。然而，在用α-GalCer治疗后，经治疗的癌症患者的外周血中的NKT细胞在治疗的24小时内降至不可检测的水平，并且不能在研究期间恢复预处理水平。当α-GalCer以细胞相关的方式施用时(如这些方法中所述)，避免上述影响，例如Chang等人，J Exp Med，201:1503(2005)。Chung等人，Cancer Res，66：6843(2006)。

各种出版物描述了α-GalCer及其衍生物的合成，其全文以引用方式并入本文。此类文献的示例性但绝不是穷举的列表包括：Morita等人，J.Med.Chem.，38:2176(1995)；Sakai等人，J.Med.Chem.，38:1836(1995)；Morita等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.，5:699(1995)；Takakawa等人，Tetrahedron，54:3150(1998)；Sakai等人，Org.Lett.，1:359(1998)；Figueroa-Perez等人，Carbohydr.Res.，328:95(2000)；Plettenburg等人，J.Org.Chem.，67:4559(2002)；Yang等人，Angew.Chem.，116:3906(2004)；Yang等人，Angew.Chem.Int.编辑，43:3818(2004)；和Yu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，102(9)：3383-3388(2005)。

各自独立地或以全部可能的组合添加EDAC、CHX和α-GalCer或它们的等同物，可用于增加本文所述平台和方法的有效性，但这对其有效性不是必需的。

施用和疫苗

GM-CSF和Flt-3L可单独施用，或彼此组合施用。例如，GM-CSF可以2μg/kg或更少的待施用量存在。待施用的GM-CSF的量可基于多种患者特异性因素来确定。GM-CSF可以0.5μg/kg至2.0μg/kg或更小的范围施用。因此，待施用的量可以为2.0μg/kg、1.9μg/kg、1.8μg/kg、1.7μg/kg、1.6μg/kg、1.5μg/kg、1.4μg/kg、1.3μg/kg、1.2μg/kg、1.1μg/kg、1.0μg/kg、0.9μg/kg、0.8μg/kg、0.7μg/kg、0.6μg/kg、0.5μg/kg、0.4μg/kg、0.3μg/kg、0.2μg/kg或0.1μg/kg，或低于、高于、或在这些量之间的任何量。

例如，Flt-3L可以2.0μg/kg至8.0μg/kg或更小的范围施用。因此，待施用的量可以为8.0μg/kg、7.5μg/kg、7.0μg/kg、6.5μg/kg、6.0μg/kg、5.5μg/kg、5.0μg/kg、4.5μg/kg、4.0μg/kg、3.5μg/kg、3.0μg/kg、2.5μg/kg、2.0μg/kg、1.5μg/kg、1.0μg/kg或0.5μg/kg，或低于、高于、或在这些量之间的任何量。

GM-CSF、FTY720和Flt-3L可在施用APC之前、同时和/或之后施用。优选GM-CSF和Flt-3L在施用APC之前施用。其可在用APC治疗之前1、2、3、4、5、6或7或更多天进行施用。其可以本领域技术人员已知的多种方式施用。细胞因子也可与已发现有效用于提高APC有效性的其他细胞因子组合。在一个示例中，GM-CSF和Flt-3L可用于受控、延长释放的配方中。此类配方在本领域中已知。对于FTY720，优选在施用APC之后进行施用。其可在用APC治疗之后1、2、3、4、5、6或7或更多天进行施用。其可以本领域技术人员已知的多种方式施用。在一个示例中，FTY720可用于受控、延长释放的配方中。此类配方在本领域中已知。

在一个具体示例中，经历治疗的癌症患者可用以下方案进行治疗。以举例的方式，患者首先提供通常约500ml的外周血，其可用于在5-30天内产生APC(取决于APC的类型)。然后，患者将接受3天的细胞因子联合治疗(即低剂量Flt-3L和GM-CSF)，皮下施用，然后进行APC施用。前一天通过将APC与所选佐剂(例如α-GalCer)和所选抗原(如果抗原是蛋白质或多肽)一起温育来制备APC用于抗原负载。在施用当天，APC用CHX处理并且与EDAC缀合(如果使用肽)。然后患者接受静脉内APC(CAB、DC、CD40活化的B细胞)输注(如果使用CAB)。细胞因子联合治疗在APC施用之前进行，使得其可刺激宿主DC的体内生成并且还降低髓源抑制细胞(MDSC)的比例。APC施用之后2小时，给予FTY720。可根据需要将该治疗重复足够多的循环，以诱导抗原特异性T细胞应答。

本文所公开的组合物可单独施用，或彼此组合施用。其可与其他细胞因子、抗体或已知用于提高APC的效果或受试者的治疗的化合物进行组合。

本文公开了使用本文所公开的平台产生的疫苗。具体地讲，本文公开了用于离体免疫的基于细胞的疫苗，以及用于体内免疫以引发针对抗原的免疫应答的组合物和方法。在一个实施方案中，本发明公开了患有表达肿瘤特异性抗原的一类癌症的受试者。这可导致患者的改善的治疗结果，例如由减慢或减少表达肿瘤特异性抗原的癌细胞或实体肿瘤的生长或癌细胞总数或肿瘤负荷总数减少来证明。在相关实施方案中，患者已被诊断为患有与特异性抗原例如病毒抗原的表达相关的病毒、细菌、真菌或其他类型的感染(或病毒诱导的肿瘤)。这种疫苗可导致患者的改善的治疗结果，如由患者体内致病感染因子的生长减慢和/或通常与特异性感染性疾病相关的可检测症状的减少或消除来证明。

本文所公开的抗体、细胞因子和化合物可根据用于制备药学上有用的组合物的已知方法来配制。它可以作为唯一的活性物质或与其他已知的活性物质、与药学上合适的稀释剂(例如，Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、防腐剂(例如硫柳汞(Thimerosal)、苯甲醇、对羟基苯甲酸酯)、乳化剂、增溶剂、佐剂和/或载体一起组合到混合物中。合适的载体及其制剂描述于Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，1980年，Mack Publishing Co.中。此外，此类组合物可与聚乙二醇(PEG)、金属离子络合，或掺入聚合物化合物诸如聚乙酸、聚乙醇酸、水凝胶等中，或掺入脂质体、微乳液、胶束、单层或多层囊泡、红细胞血影或球芽中。此类组合物将影响细胞因子的物理状态、溶解度、稳定性、体内释放速度、和体内清除速率。

本文所公开的抗体和化合物可局部施用、胃肠外施用或吸入施用。术语“肠胃外”包括皮下注射、静脉内注射、肌内注射、脑池内注射或输注技术。这些组合物通常将单独包含有效量的化合物或与有效量的其他活性物质(例如，上述那些)组合包含有效量的化合物。它们可通过适用于与药物联合使用的任何常规方法施用，作为单独的治疗活性成分或与治疗活性成分的组合施用。其可单独施用，但通常与基于所选的施用途径和标准药物实践所选的药物载体一起施用。

一般来讲，水、合适的油、盐水、右旋糖水溶液(葡萄糖)和相关的糖溶液以及二醇诸如丙二醇或聚乙二醇是用于肠胃外溶液的合适载体。用于肠胃外施用的溶液包含活性成分、合适的稳定剂以及如果需要，缓冲物质。抗氧化剂诸如硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸(单独或组合的)是合适的稳定剂。还使用柠檬酸及其盐以及乙二胺四乙酸钠(EDTA)。此外，肠胃外溶液可包含防腐剂，诸如苯扎氯铵、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯和氯代丁醇。适宜的药物载体描述于Remington's Pharmaceutical Sciences、本领域的标准参考文献中。另外，可采用标准的配药方法来控制作用的持续时间。这些是本领域所熟知的，并且包括控释制剂，并且可包括适当的大分子，例如聚合物、聚酯、聚氨基酸、聚乙烯、吡咯烷酮、乙烯-乙酸乙烯酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素或硫酸鱼精蛋白。可调节大分子的浓度以及掺入的方法以便控制释放。另外，试剂可掺入聚合物材料的颗粒中，诸如聚酯、聚氨基酸、水凝胶、聚(乳酸)或乙烯-乙酸乙烯酯共聚物。除了掺入外，这些试剂还可用于在微胶囊中捕集化合物。

包含本文所公开的治疗剂的药物制剂可通过本领域已知的程序使用熟知且容易获得的成分来制备。还可将治疗剂配制为适用于肠胃外施用的溶液，例如通过肌内、皮下或静脉注射途径。治疗剂的药物制剂还可采用水溶液或无水溶液或分散体的形式，或者作为另外一种选择，乳液或悬浮液的形式。

细胞疫苗的各种组分以“有效组合”存在，这意指有足够量的每种组分以使疫苗有效。可使用任何数量的组成细胞或其他组分，只要疫苗作为整体有效即可。这也将取决于用于制备疫苗的方法。

药物组合物可以在与在受试者中产生免疫应答或治疗癌症有关的其他疗法之后、之前、之中、或与其组合给予。例如，受试者可预先或与外科手术去填充、化疗、放疗、检查点抑制剂和其他形式的免疫疗法和过继转移同时进行治疗。在使用此类模式时，其优选以不干扰本文所公开的组合物的免疫原性的方式或时间来使用。受试者还可施用另一种疫苗或其他组合物以便刺激免疫应答。此类另选的组合物可包括肿瘤抗原疫苗、编码肿瘤抗原的核酸疫苗、抗独特型疫苗和其他类型的细胞疫苗，包括表达细胞因子的肿瘤细胞系。

本文公开了联合疗法，其包括与被设计用于增强抗肿瘤免疫应答的另一种策略联合施用本文所述的细胞疫苗。在一种联合疗法中，在用包含本文所公开的APC的组合物在远离肿瘤的位点处治疗之前、期间或之后，对受试者给予肿瘤内植入。在另一种联合疗法中，在用本文所公开的负载抗原的APC治疗之前、期间或之后，用另选的细胞疫苗组合物在远离肿瘤的位点处治疗受试者。在另一种联合疗法中，给予受试者检查点抑制剂。在整个治疗过程中采用多种不同的组合物或施用方式时，选择每种治疗元素的顺序和时间以优化免疫刺激和抗肿瘤效果。

制备方法

如本领域技术人员所知的，本发明方法中可使用多种培养基中的任一种(参见例如，Current Protocols in Cell culture，2000-2009，John Wiley&Sons,Inc.)。在一个实施方案中，用于本文所述方法中的培养基包括但不限于改性的Dulbecco培养基(其具有或不具有胎牛血清或其他适当的血清)。示例性培养基还包括但不限于，IMDM、RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20。在另一实施方案中，培养基可包含表面活性剂、抗体、人血浆蛋白粉或还原剂(例如N-乙酰基-半胱氨酸、2-巯基乙醇)、或一种或多种抗生素。在一些实施方案中，还可使用IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、激动剂抗-CD40单克隆抗体、可溶性CD40L以及交联增强剂、或经辐照的tCD40L NIH/3T3细胞。B细胞可在条件下培养并持续足以实现期望的活化的时间段。在某些实施方案中，B细胞在条件下培养并持续足够的时间段，使得根据需要活化10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或甚至100％的B细胞。

APC的成熟和活化状态可通过使用流式细胞术测定其共刺激分子的表达来评估。在培养适当的时间段之后，诸如2、3、4、5、6、7、8、9或更多天，通常约3天，如果需要，可添加附加体积的包含新鲜细胞因子的培养基。

在一个实施方案中，具体地讲，CAB和CD40活化的B细胞可在饲养细胞上接触或培养。在其他实施方案中，本文所述的培养系统在不存在饲养细胞的情况下进行，从而提供优于本领域已知的需要饲养细胞的其他系统的优点。在可使用饲养细胞的情况下，饲养细胞是基质细胞系，诸如鼠基质细胞系S17或MS5。在另一个实施方案中，纯化的CD19⁺细胞可在存在表达CD40-配体的成纤维细胞存在下，在存在B细胞活化因子细胞因子诸如IL-10和IL-4的情况下进行培养。还可提供与表面(诸如组织培养板或小珠)结合的CD40L。在另一个实施方案中，纯化的B细胞可在存在或不存在饲养细胞的情况下，与CD40L或激动剂抗-CD40单克隆抗体一起培养，并且在存在一种或多种细胞因子或因子的情况下进行培养，所述细胞因子或因子选自IL-10、IL-4、IL-7、p-ODN、CpG DNA、IL-2、IL-15、IL6、IFN-α和IFN-δ。在另一个实施方案中，可使用TLR配体诸如CpG和聚I:C、和/或细胞因子，诸如IFN-γ、和/或CD40L或激动剂抗-CD40单克隆抗体使树突状细胞成熟。

上述APC中的任一种均可通过简单负载或通过交联来负载抗原(例如蛋白质或肽)，然后负载佐剂(例如α-GalCer，或者天然或合成的MR1配体、或TLR或STING配体)。温育过夜之后，可用CHX处理负载的APC，然后制备细胞以进行施用。

平台可全部或部分地离体或在体内进行。“离体”是指在自然条件改变最小的情况下，在生物体外的人工环境中，在细胞或组织内或上进行的方法。相比之下，术语“体内”是指在处于其正常的完整状态的活生物体内进行的方法，而“体外”方法使用已经从其常见生物环境中分离的生物体的组分进行。例如，可通过使静息B细胞暴露于灭活的或活的衣原体属物种(包括沙眼衣原体(C.trachomatis)、鹦鹉热衣原体(C.psittaci)、肺炎衣原体(C.pneumoniae)和沙眼衣原体鼠肺炎株(C.muridarum))或其在体内的肽或片段、或其离体肽来生成。然后将扩增的B细胞暴露于或交联到抗原，使得其可相应地摄取抗原。同样，这可在体内或离体进行。例如，抗原可直接注入受试者中，或者可在体外(离体)使受试者的B细胞暴露于或交联到经修饰的抗原，然后，使扩增的活化B细胞返回至受试者。CAB可用于例如直接体内施用、离体体细胞疗法、体内可植入装置和离体体外装置。

已经描述了本发明的多个实施方案。然而应当理解，在不脱离本发明的实质和范围的情况下可以作出各种修改。相应地，其他实施方案在以下权利要求书的范围内。

实施例

实施例1：添加抗-IL6 mAb显著增加CAB和抗-PDL-1 mAb联合疗法的抗肿瘤治疗活 性。

使用非常具有侵袭性的肿瘤模型(即B16-F10黑素瘤)，其中施用非常高剂量的肿瘤细胞(4×10⁵)，观察到CAB疗法与抗-PDL-1 mAb之间的明显的协同作用(值得注意的是，可另选地使用抗-PD-1)。有趣的是，当将抗-IL-6加入该联合疗法中时，检测到抗肿瘤活性的显著增加(如通过添加抗-IL-6治疗的组中减少的肿瘤负荷和增加的存活率所展示的)，如图27和图28所示。对于这些研究，在肿瘤注射后第8天开始每隔一天单独地或与抗-IL-6mAb组合给予抗-PDL-1 mAb，总共7个剂量(即，对于前5个剂量，与CAB疗法共同给予)。显然添加抗-IL-6 mAb可减少由CAB和抗-PDL-1联合疗法激发的有害炎性应答，但不影响由联合疗法诱导的肿瘤特异性CD8⁺T细胞应答的增强。如果在肿瘤治疗早期使用，即使不使用CAB疗法，抗-PDL1 mAb与抗-IL-6 mAb的组合也可具有协同效应。

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与所公开的发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中引述的出版物及其中引述的材料明确地以引用方式并入。

本领域的技术人员将认识到或能够使用不超过常规实验来探知本文所述发明的具体实施方案的许多等同物。此类等同物旨在由以下权利要求书涵盖。

实施例2：添加FTY720显著增加抗原特异性CD8⁺T细胞的引发和CAB疗法的抗肿瘤 治疗活性

该实施例使用图20中所示的实验系统，其中荧光标记的卵清蛋白特异性TCR转基因CD8⁺T细胞在输注负载有卵清蛋白和α-GC的CAB前一天转染到幼稚C57BL/6小鼠中。如图所示，这些小鼠也用FTY720或载体处理。图21中所示的数据展示施用FTY720显著增加了CAB疗法在体内活化和诱导抗原特异性CD8⁺T细胞增殖的能力。此外，如图22和图23所示，将FTY720加入单剂量CAB疗法中导致在HPV相关肿瘤的该鼠模型中对肿瘤的完全排斥。

显然，添加FTY720增加了次级淋巴器官(诸如脾)中的CAB的频率(图18和图19)，从而增加可用于引发抗原特异性CD8⁺T细胞的抗原的量。它还可增加在次级淋巴器官中的CD8⁺T细胞的保留，增加活化抗原特异性CD8⁺T细胞的可能。

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与所公开的发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中引述的出版物及其中引述的材料明确地以引用方式并入。

本领域的技术人员将认识到或使用不超过常规实验来探知本文所述发明的具体实施方案的许多等同物。此类等同物旨在由以下权利要求书涵盖。

实施例3：添加抗-CD40激动剂抗体增加体外扩增人的CAB的能力

通过免疫磁性阴性选择耗尽单核细胞的人外周血单核细胞在人重组IL-2和抗-CD40激动剂mAb的存在下暴露于灭活的沙眼衣原体血清变型L2RB并持续总共8天。使用该体系，发现相比于在不存在该抗体的情况下扩增的细胞，在衣原体和抗-CD40激动剂mAb之间存在对生成衣原体活化的B细胞的明显协同作用(图29)。

显然，添加抗-CD40激动剂mAb可通过抑制凋亡细胞死亡但不影响其引发T细胞应答的能力来促进衣原体活化的B细胞的存活。因此，将衣原体和抗-CD40激动剂mAb组合在产生用于免疫疗法的活化B细胞方面具有协同效应。

实施例4：Flt-3L和GM-CSF减小肿瘤尺寸

在EG.7-OVA肿瘤的小鼠模型中，小鼠皮下注射约120万EG.7-OVA细胞。该治疗后7天、8天和9天，小鼠接受低剂量GM-CSF和Flt-3L。在第三次GM-CSF/Flt-3L治疗后当天，向小鼠施用负载OVA的活化B细胞。发现未处理对照中的肿瘤大小稳步增加，但用GM-CSF和Flt-3L治疗的小鼠中的肿瘤大小减小(在40％的这些小鼠中，肿瘤变得不可检测)。相反，在肿瘤施用后，在仅用GM-CSF/Flt-3L治疗的小鼠中，肿瘤生长不受控制。

虽然在该模型中，GM-CSF/Flt-3L施用改善了负载OVA的B细胞治疗的功效，但重要的是需注意这种细胞因子治疗可改善利用其他负载抗原的抗原呈递细胞(例如基于树突状细胞的疫苗平台)干预的功效。为了支持这一点，发现GM-CSF/Flt-3L施用增加了肿瘤内CD103⁺树突状细胞的频率(图2-图5)，增加了体内抗原特异性T细胞引发(图6)，减少了髓源性抑制细胞频率(图2-图5)，并增加了肿瘤内巨噬细胞的分化(图4)。

除了GM-CSF/Flt-3L的新用途外，还发现活化B细胞(或其他专职化抗原呈递细胞)的抗原呈递能力可在体内施用活化B细胞之前通过体外负载α-GalCer和使用同源抗原的体外交联来增强(图10-图12)。

还发现，在体内施用之前，通过使用EDAC(图9、图24和图25)交联期望的抗原(蛋白质或肽)，可增强新鲜或冷冻保存的活化B细胞(或其他专职性APC)的抗原呈递能力。有意思的是，CAB(合成相对于同种异体的)的来源不影响治疗活性(图26)。

在体外还展示出用CHX进行的治疗可用于增强抗原呈递能力(图8)。

值得注意的是，示出增加活化B细胞的抗原呈递能力的上述策略也可适用于其他细胞疫苗平台(例如，CD40活化的B细胞、基于DC的疫苗和人工APC)和在体内与使用检查点抑制剂(例如，抗-PDL1 mAb)组合。

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与所公开的发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中引述的出版物及其中引述的材料明确地以引用方式并入。

本领域的技术人员将认识到或使用不超过常规实验来探知本文所述发明的具体实施方案的许多等同物。此类等同物旨在由以下权利要求书涵盖。

Claims (46)

1.一种用于增强宿主的体内抗原呈递和抗原特异性免疫应答的有效性的疫苗，其中所述疫苗包含：

a.用于施用至所述宿主的组合物，所述组合物包含至少两种细胞因子，其中所述细胞因子中的两种为Flt-3L和GM-CSF，其中Flt-3L以8μg/kg以下的待施用量存在；以及

b.用于施用至所述宿主的APC群，所述APC群已经负载有抗原，其中，所述APC为衣原体活化的B细胞(CAB)，并且其中所述抗原不来源于衣原体物种。

2.根据权利要求1所述的疫苗，其中在b中，所述APC还与佐剂交联或负载有佐剂。

3.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述已经负载有抗原的APC群向所述宿主的内源性免疫细胞呈递所负载的抗原。

4.根据权利要求3所述的疫苗，其中所述内源性免疫细胞包括内源性宿主APC。

5.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述抗原为蛋白质、肽或任何含胺分子。

6.根据权利要求5所述的疫苗，其中所述蛋白质或肽利用(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDAC)交联到抗原呈递细胞。

7.根据权利要求1所述的疫苗，其中在与抗原交联之前，用环己酰亚胺(CHX)处理APC。

8.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述APC暴露于α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)。

9.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述APC暴露于FTY720或相当的佐剂。

10.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述疫苗包含多于一种抗原。

11.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述疫苗包含多于两种抗原。

12.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述抗原包含肿瘤相关的抗原或病毒相关的肿瘤抗原。

13.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述抗原包含感染因子的一种或多种组分。

14.根据权利要求1所述的疫苗，其中GM-CSF以2μg/kg以下的待施用量存在。

15.根据权利要求1所述的疫苗，其中GM-CSF以在0.5μg/kg至2.0μg/kg范围内的待施用量存在。

16.根据权利要求1所述的疫苗，其中Flt-3L以在2.0μg/kg至8.0μg/kg范围内的待施用量存在。

17.根据权利要求9所述的疫苗，其中FTY720以50μg/kg以下的待施用量存在。

18.组合物和APC群在制备用于增强对其有需要的受试者中的APC的有效性的药物中的用途，其中：

a.所述组合物用于向所述受试者施用，所述组合物包含至少两种细胞因子，其中所述细胞因子中的两种为Flt-3L和GM-CSF，其中Flt-3L以8μg/kg以下的剂量水平存在；以及

b.所述APC群用于向所述受试者施用，所述APC群已经与抗原交联或负载有抗原，其中，所述APC为衣原体活化的B细胞(CAB)，并且其中所述抗原不来源于衣原体物种。

19.根据权利要求18所述的用途，其中，所述组合物还包含FTY720。

20.根据权利要求18所述的用途，其中，所述APC还与佐剂交联或负载有佐剂。

21.根据权利要求18所述的用途，其中所述已经负载有抗原的APC群向内源性免疫细胞呈递所负载的抗原。

22.根据权利要求21所述的用途，其中所述内源性免疫细胞包含所述受试者的内源性APC。

23.根据权利要求18所述的用途，其中所述抗原为蛋白质或肽或任何含胺分子。

24.根据权利要求23所述的用途，其中所述蛋白质或肽与(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDAC)交联。

25.根据权利要求18所述的用途，其中在加载有抗原之前，用环己酰亚胺(CHX)处理所述APC。

26.根据权利要求18所述的用途，其中APC暴露于α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)或相当佐剂。

27.根据权利要求18所述的用途，其中所述抗原包含多于一种抗原。

28.根据权利要求27所述的用途，其中所述抗原包含多于两种抗原。

29.根据权利要求18所述的用途，其中所述抗原包含肿瘤相关的抗原或病毒相关的肿瘤抗原。

30.根据权利要求18所述的用途，其中所述抗原包含感染因子的1种或多种组分。

31.根据权利要求18所述的用途，其中GM-CSF以2μg/kg以下的剂量水平存在。

32.根据权利要求31所述的用途，其中GM-CSF的剂量水平以0.5μg/kg至2.0μg/kg的范围存在。

33.根据权利要求18所述的用途，其中Flt-3L的剂量水平以2.0μg/kg至8.0μg/kg的范围存在。

34.根据权利要求19所述的用途，其中FTY720的剂量水平以50μg/kg以下存在。

35.根据权利要求18所述的用途，其中所述受试者患有癌症。

36.根据权利要求35所述的用途，其中所述抗原为肿瘤相关的抗原或病毒-肿瘤相关的抗原。

37.根据权利要求18所述的用途，其中所述受试者患有感染性疾病。

38.根据权利要求37所述的用途，其中所述抗原对于感染性疾病具有特异性。

39.根据权利要求18所述的用途，其中所述受试者为哺乳动物。

40.根据权利要求39所述的用途，其中所述哺乳动物为人。

41.一种用于增强宿主的体内抗原呈递和抗原特异性免疫应答的有效性的试剂盒，所述试剂盒包含：

用于向所述宿主施用的至少两种细胞因子，其中所述细胞因子中的两种为Flt-3L和GM-CSF，其中Flt-3L以8μg/kg以下的待施用量存在；和

用于向所述宿主施用的已经负载有抗原的APC群，其中，所述APC为衣原体活化的B细胞(CAB)，并且其中所述抗原不来源于衣原体物种。

42.根据权利要求41所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含FTY720。

43.根据权利要求41所述的试剂盒，其中所述抗原为蛋白质或肽或任何含胺分子。

44.根据权利要求41所述的试剂盒，其还包含(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDAC)。

45.根据权利要求41所述的试剂盒，其还包含环己酰亚胺(CHX)。

46.根据权利要求41所述的试剂盒，其还包含α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)。