KR101755526B1 - 알파-갈락토실 세라미드 유사체, 및 면역요법제, 아주반트, 및 항바이러스제, 항박테리아제, 및 항암제로서의 그의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 합성 알파-갈락토실 세라미드 (α-GalCer) 유사체, 및 면역요법제, 아주반트, 및 항바이러스제, 항박테리아제, 및 항암제로서의 그의 용도에 관한 것이다. 일 측면에서, 대상체에서의 사이토킨 반응을 활성화시키는 방법은 적어도 하나의 림프구 및 적어도 하나의 항원-제시 세포를 포함한 세포 집단을 포함하는 후천성 면역계를 가진 대상체에게 화학식 1의 구조로 나타낸 유효량의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 단계; 상기 화합물과 항원-제시 세포 사이에 복합체를 형성하고, 여기서 복합체의 형성이 림프구 상의 수용체를 활성화시키는 단계; 및 림프구를 활성화시켜 사이토킨 반응을 생성하는 단계를 포함한다.
Description
관련 출원
본 출원은 2008년 7월 11자로 출원된 미국 출원 제12/218,082호에 대한 완전한 파리 조약 우선권을 주장하며, 그의 내용은 그 전체가 본원에 포함된다.
기술 분야
본 발명은 알파-갈락토실 세라미드 (α-GalCer) 유사체, 및 면역요법제, 아주반트, 항바이러스제, 항박테리아제 및 항암제로서의 그의 용도에 관한 것이다.
천연 킬러 T 세포 (NKT)는, CD1d에 의해 제공되는 천연 또는 합성 당지질에 대한 반응성 및 불변 T 세포 항원 수용체 (TCR) 알파 쇄의 발현을 비롯한 독특한 특성을 갖는 T 림프구 아류에 해당한다. NKT는, 리간드로 자극시에 TH1형 및 TH2형 반응을 신속하게 나타낼 수 있는 T 세포 및 천연 킬러 세포 둘 다의 특성 (선천적 면역성)을 공유한다는 점에서, 기능적으로 분화된 통상의 αβ T 세포와 다르다. NKT의 활성화는 역설적으로, 면역성 반응의 저해 또는 자극을 일으킬 수 있다. 예를 들면, TH1 사이토킨의 생성은 항종양, 항바이러스/항박테리아 및 아주반트 활성에 의해 세포 면역성을 촉진하는 것으로 여겨지고, TH2 사이토킨 생성은 자가면역성 질환을 진압하며 항체 생성을 촉진하는 것으로 여겨진다. NKT는 면역계에서 조절 역할을 수행하기 때문에 면역요법을 위한 매력적인 표적이다.
발명의 요약
한 예시적인 실시양태에서, DC 발생은 과립구-대식세포 콜로니-자극-인자 (GM-CSF) 또는 또다른 예시적인 실시양태에서 인터류킨 (IL)-3 (또다른 예시적인 실시양태에서 DC 생존을 증진시킬 수 있음)의 사용을 통해 자극될 수 있다.
한 예시적인 실시양태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 DC는 골수 마커, 예를 들어 CD11c 또는 또다른 예시적인 실시양태에서 IL-3 수용체-α (IL-3Rα) 쇄 (CD123)를 발현할 수 있다. 또다른 예시적인 실시양태에서, DC는 I형 인터페론 (IFN)을 생성할 수 있다. 한 예시적인 실시양태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 DC는 보조자극성 분자를 발현한다. 또다른 예시적인 실시양태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 DC는 추가의 부착 분자를 발현할 수 있고, 이 분자는 한 실시양태에서 추가의 보조자극성 분자로 기능하거나 또는 또다른 실시양태에서 아래 추가로 기재된 바와 같은 본 발명의 방법을 통해 전달시 DC를 생체내 특정 부위로 표적화시키는 기능을 할 수 있다.
한 예시적인 실시양태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 수상 세포는 CD83, 한 실시양태에서 자가항원의 흡수를 증가시키는 엔도시토시스성 수용체, 예컨대 DEC-205/CD205, 또는 DC-LAMP (CD208) 세포 표면 마커, 또는 또다른 실시양태에서 다양한 수준의 항원 제공 MHC 클래스 I 및 II 생성물, 또는 또다른 실시양태에서 액세서리 (부착 및 보조자극성) 분자 (CD40, CD54, CD58 또는 CD86 포함), 또는 이들의 임의 조합을 발현할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 수상 세포는 다양한 수준의 CD115, CD14, CD68 또는 CD32를 발현할 수 있다.
한 예시적인 실시양태에서, 성숙 수상 세포가 본 발명의 방법에 사용된다. 한 실시양태에서, 용어 "성숙 수상 세포"는 감소된 CD115, CD14, CD68 또는 CD32 발현을 나타내는 수상 세포의 집단, 또는 또다른 실시양태에서 증진된 CD86 발현을 나타내는 세포 집단, 또는 이들의 조합을 나타낸다. 또다른 실시양태에서, 성숙 수상 세포는 하나 이상의 p55, CD83, CD40 또는 CD86 또는 이들의 조합의 증가된 발현을 나타낼 것이다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 수상 세포는 그 표면 상에 DEC-205 수용체를 발현할 것이다. 또다른 실시양태에서, DC의 성숙은, 예를 들어 CD40 라이게이션, CpG 올리고데옥시리보뉴클레오티드 첨가, IL-1, TNFα 또는 TOLL 유사 수용체 리간드의 라이게이션, 박테리아 리포글리칸 또는 폴리사카라이드 첨가, 또는 TRAF-6 또는 NF-κB와 같은 세포내 경로의 활성화를 통해 달성될 수 있다.
한 예시적인 실시양태에서, DC 성숙의 유도는 사전선택된 항원의 엔도시토시스성 수용체 전달과 함께할 수 있다. 한 실시양태에서, 항원의 엔도시토시스성 수용체 전달은 DEC-205 수용체의 사용을 통해 이루어질 수 있다.
한 예시적인 실시양태에서, 수상 세포의 성숙 상태는 당업계에 잘 알려져 있는 방법 (예를 들어, 면역조직화학, FACS 분석 등)에 의해, 예를 들어 1) 하나 이상의 p55, CD83, CD40 또는 CD86 항원의 발현 증가; 2) CD115, CD14, CD32 또는 CD68 항원의 손실; 또는 3) PBMC가 미성숙 수상 세포로 성숙되는 것을 촉진하는 사이토킨의 제거에 따른 주름 세포의 증가된 부착 및 손실을 특징으로 하는 대식세포 표현형으로의 역전 중 하나 이상을 검출함으로써 확인될 수 있다.
한 실시양태에서, NKT 팽창은 제공 항원에 따라 달라진다. 한 실시양태에서, 본 발명의 α-GalCer 유사체는 NKT와 접촉하는 수상 세포와 동시에 배양액에 공급된다. 또다른 실시양태에서, 사전 처리된 항원을 갖는 수상 세포는 NKT와 접촉한다.
한 예시적인 실시양태에서, 용어 "표적 세포와의 접촉"은 본원에서, 세포가 표시된 것에 직접적으로 및 간접적으로 노출됨을 나타낸다. 한 실시양태에서, NKT와 본 발명의 α-GalCer 유사체, 사이토킨, 성장 인자, 수상 세포 또는 이들의 조합과의 접촉은 직접적인 접촉 또는 간접적인 접촉이다. 한 실시양태에서, 세포 접촉은 당업계에 잘 알려진 임의의 수단, 예컨대 미세주입을 통한 세포의 직접 주입을 포함할 수 있다. 또한, 또다른 실시양태에서, 세포로의 공급은, 예컨대 세포를 둘러싼 배양 배지에서의 공급을 통한 간접적인 공급, 또는 당업계에 잘 알려져 있으며 아래 기재된 바와 같은 임의의 경로를 통한 대상체 투여인 것으로 구상된다.
수상 세포를 항원으로 프라이밍하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌 [Hsu et al., Nature Med. 2:52-58 (1996)] 또는 스타인만 (Steinman) 등의 국제 출원 PCT/US93/03141에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
한 실시양태에서, α-GalCer 유사체는 아래 기재된 바와 같은 방법에 의해 대상체에 투여되고, 또다른 실시양태에서 수상 세포로 표적화된다 (여기서, 생체내 흡수가 일어남).
한 실시양태에서, α-GalCer 유사체 흡수 및 처리는 24시간내에 일어날 수 있거나, 또는 또다른 실시양태에서 보다 긴 기간, 예컨대 4일 이하가 필요할 수 있거나, 또는 또다른 실시양태에서, 보다 짧은 기간, 예컨대 약 1 내지 2시간이 필요할 수 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 방법에서의 수상 세포에 의해 팽창된 NKT는 수상 세포와 관련하여 자가조직성, 공통유전자성 또는 동종이형성이다.
한 실시양태에서, NKT는 질환-특이적 방식으로 면역성 반응을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 사이토킨 생성을 증진시키거나 특정 사이토킨 프로파일 (인터페론-γ, 인터류킨-2 및/또는 인터류킨-4 포함)을 유도하는 것이 필요한 임의의 면역성 반응을 위해 본 발명의 NKT 세포가 사용될 수 있고, 이는 본 발명의 실시양태를 제공하는 것으로 이해한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 소정 기간 동안 예비 단리된 NKT를 추가의 수상 세포 및 본 발명의 α-GalCer 유사체와 함께 배양하여 추가의 NKT 팽창, 사이토킨 생성 또는 이들의 조합을 유도하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 배양물에서 NKT를 수상 세포 및 본 발명의 α-GalCer 유사체와 소정 기간 동안 접촉시켜 NKT 팽창, 사이토킨 생성 또는 이들의 조합을 유도하는 단계, 및 얻어진 NKT를 대상체에게 투여함으로써 (여기서, NKT는 질환의 발생을 지연시키거나, 발생을 감소시키거나, 억제함) 대상체에서 질환의 발생 지연, 발생 감소 또는 억제를 달성하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환의 발생 지연, 발생 감소 또는 억제를 위한 방법을 제공한다.
한 예시적인 실시양태에서, 본 발명에서의 대상체에 투여되는 세포는 조성물로 제공될 수 있다. 한 실시양태에서, 이러한 조성물은 비경구적으로 또는 정맥내로 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 투여되는 조성물은 멸균 용액 또는 다른 실시양태에서 수성 또는 비-수성의 현탁액 또는 에멀젼일 수 있다. 한 실시양태에서, 조성물은 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 주사가능한 유기 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트, 또는 시클로덱스트린을 포함할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 조성물은 또한, 습윤제, 에멀젼화제 및/또는 분산화제를 포함할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 조성물은 또한, 멸균수 또는 임의의 다른 멸균 주사가능한 매질을 포함할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 조성물은 본원에 기재된 방법 중 일부의 경우에 당업자에게 잘 알려져 있는 아주반트를 포함할 수 있고, 이때 면역성 반응의 자극이 아래 추가로 기재된 바와 같이 요구된다.
하나의 예시적인 구현예에서, 본 발명은 하기 화학식 1의 구조로 표시되는 화합물을 제공한다.
<화학식 1>
하나의 예시적인 구현예에서, 본 발명은 하기 화학식 2의 구조로 표시되는 화합물을 제공한다.
<화학식 2>
하나의 예시적인 구현예에서, 본 발명은 하기 화학식 3의 구조로 표시되는 화합물을 제공한다.
<화학식 3>
한 구현예에서, 본 발명의 α-GalCer 유사체, 세포, 백신 또는 조성물은 주사를 통해 대상체에 투여할 수 있다. 하나의 구현예에서, 주사로서는 당업계에 공지되어 있는 임의의 수단을 통한 것일 수 있고, 예를 들면 내부-림프성 (intra-lymphoidal) 또는 SubQ 주사 등을 들 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명의 α-GalCer 유사체는 안정한 상태에서의 생체내 수상 세포 전달되며, 또다른 구현예에서, 질환 개선 NKT의 확대를 유도한다. 문헌[Bonifaz, et al. (2002) Journal of Experimental Medicine 196: 1627-1638]; 및 [Manavalan et al. (2003) Transpl Immunol. 11:245-58]에 기재되어 있는 바와 같이, 한 구현예에서, 안정한 상태에서의 유사 전달이 완료될 수 있다.
또다른 예시적인 구현예에서, 엄선된 유형의 생체내 수상 세포는 NKT를 준비시키도록 기능한다.
또다른 예시적인 구현예에서, 본 발명은 부적합하거나 바람직하지 않은 반응인 면역성 반응을 조절하기 위한 방법을 제공한다.
한 구현예에서, 면역성 반응은 숙주에 유해한 사이토킨 프로파일로 표시된다.
하나의 예시적인 구현예에서, 본 발명의 NKT는 특정 질환의 치료법, 예를 들면 표준 항암 요법을 동시에 이용하면서 환자에게 투여하여, 소정의 암을 위한 부가적인 치료법으로서 제공가능하다. 또다른 구현예에서, 본 발명의 NKT는 다른 치료법의 이용 전에 투여할 수 있다.
또다른 예시적인 구현예에서, 본 발명은 병원균에 의한 감염에 의해 유발되는 면역성 반응을 조절하는 방법을 제공하며, 이 면역성 반응은 대상체에 대해 방어적이지 않다.
또다른 예시적인 구현예에서, 면역성 반응은 사이토킨 프로파일을 야기하고, 이는 숙주에게 유리하지 않다. 한 구현예에서, 사이토킨 프로파일은 질환을 악화시킨다. 한 구현예에서, 예를 들면 나종나병에서와 같이, TH1 반응이 숙주에게 유리한 경우, TH2 반응이 개시된다. 또다른 구현예에서, 예를 들면 충난 항원에 대한 반응이 주혈흡충병인 바와 같이, TH1 반응은 개시되고, 대상체에서 지속된다.
또다른 예시적인 구현예에서, 본 발명은 유효량의 화합물 또는 염 또는 혼합물을 투여하여 대상체에서의 사이토킨 반응을 활성화시키는 단계 (여기서, 대상체는 세포의 집단을 포함하는 후천성 면역계를 가지며, 상기 집단은 1종 이상의 림프구 및 1종 이상의 항원-제시 세포를 포함하고, 화합물은 하기 화학식 1의 구조에 의해 표시되는 것이거나, 또는 그의 제약상 허용되는 염임),
<화학식 1>
화합물과 항원-제시 세포 사이의 복합체를 형성하는 단계 (여기서, 복합체의 형성은 림프구 상의 수용체를 활성화시킴), 및
림프구를 활성화시켜 사이토킨 반응을 생성하는 단계를 포함한다.
상기 방법의 일부 측면에서, 1종 이상의 림프구는 T 림프구이고, 일부의 경우 T 림프구는 천연 킬러 T 세포이다. 일부 예시에서, 천연 킬러 T 세포는 불변 천연 T 세포이다.
일부 측면에서, 적어도 하나의 항원-제시 세포는 수상 세포이다. 일부 예시에서, 수상 세포는 미성숙 또는 성숙 수상 세포이다.
투여 방법의 일부 측면에서, 화합물은 피하 투여, 정맥내 투여, 비강내 투여 또는 근육내 투여에 의해 완성된다.
방법의 일부 측면에서, 화합물은 항원-제시 세포 상의 CD1 분자와의 복합체를 형성한다. 일부 예시에서, CD1 분자는 CD1d 분자이다. 일부 예시에서, T 림프구 상의 수용체는 T 세포 수용체이다. 1종 이상의 다른 림프구를 자극하여 사이토킨 반응을 생성하는 일부 예시 중, 일부 예시에서는 1종 이상의 다른 림프구는 T 헬퍼 세포이다.
상기 방법의 일부 측면에서, 사이토킨 반응은 TH1 사이토킨을 생성하는 TH1-형 사이토킨 반응이며, IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-8, IL-12, IL-15, TNF-α, GM-CSF, RANTES, MIP-1α 및 MCP-1로 이루어진 군으로부터 선택될 수도 있다.
청구항 1의 방법 중 한 측면에서, 사이토킨 반응은 TH2 사이토킨을 생성하는 TH2-형 사이토킨 반응이며, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, RANTES, MIP-1α 및 MCP-1로 이루어진 군으로부터 선택될 수도 있다.
일부 예시적인 구현예에서, 본 발명은 하기 화학식 1의 구조로 표시되는 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 유효량 포함하는 백신 및 백신제를 제공한다.
<화학식 1>
일부 경우에, 백신제는 사멸된 미생물, 약독화된 생바이러스 미생물, 톡소이드 및 불활성화되거나 약독화된 미생물의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, 미생물은 박테리아 또는 진균이다. 일부 경우에, 톡소이드는 파상풍 또는 디프테리아이다. 일부 경우에, 백신제는 백신이 투여된 대상체에서 면역 반응을 유발할 수 있다. 일부 경우에, 화합물은 면역학적 아주반트로 작용하고, 면역계를 자극하여 백신제에 의해 유발되는 면역 반응을 변형 또는 증진시킴으로써 화합물이 없는 경우보다 대상체에서 백신에 보다 활발하게 반응하게 할 수 있다.
일부 예시적 실시양태에서, 본 개시문은 유효량의 하기 화학식 1의 구조로 표시되는 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는 항-종양 면역요법을 제공한다.
<화학식 1>
방법의 일부 측면에서, 투여는 암, 암에 대해 상승된 위험 또는 전암 전구체 중 적어도 하나를 기반으로 한다. 방법의 일부 측면에서, 화합물의 투여는 종양 및 암 세포 중 적어도 하나에서 반응을 유발한다. 방법의 일부 측면에서, 유발되는 반응은 종양의 성장 지연이다. 방법의 일부 측면에서, 유발되는 반응은 종양 크기의 감소이다.
일부 예시적 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 림프구를 비롯한 세포 집단을 포함하는 후천성 면역계에 작용하는 화합물의 투여를 포함하고, 여기서 유발되는 반응은 후천성 면역계에서의 세포 집단의 확대이다.
방법의 일부 측면에서, 후천성 면역계에서의 세포 집단의 확대는 T 세포, CD8 T 세포, NK 세포 또는 NKT 세포의 수의 확대를 포함한다. 일부 측면에서, 방법은 화합물을 첨가한 암 백신을 제공하는 것을 포함한다. 방법의 일부 측면에서, 암은 폐암, 유방암, 간암, 백혈병, 충실성 종양 및 암종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
방법의 일부 측면에서, 투여는 병원성 미생물 물질의 존재로부터 발생하는 감염성 질환을 기반으로 한다. 방법의 일부 측면에서, 병원성 미생물 물질은 바이러스, 박테리아, 진균, 원생동물, 다세포 기생충 및 비정상적인 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다. 방법의 일부 측면에서, 병원성 미생물 물질은 바이러스이다. 방법의 일부 측면에서, 바이러스는 레트로바이러스과(Retroviridae), 피코르나바이러스과(Picornaviridae), 칼시바이러스과(Calciviridae), 토가바이러스과(Togaviridae), 플라비바이러스과(Flaviridae), 코로나바이러스과(Coronaviridae), 랍도바이러스과(Rhabdoviridae), 필로바이러스과(Filoviridae), 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae), 오르토믹소바이러스과(Orthomyxoviridae), 분가바이러스과(Bungaviridae), 아레나바이러스과(Arenaviridae), 레오바이러스과(Reoviridae), 비르나바이러스과(Birnaviridae), 헤파드나바이러스과(Hepadnaviridae), 파르보바이러스과(Parvoviridae), 파포바바이러스과(Papovaviridae), 아데노바이러스과(Adenoviridae), 헤르페스바이러스과(Herpesviridae), 폭스바이러스과(Poxviridae) 및 이리도바이러스과(Iridoviridae)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 방법의 일부 측면에서, 병원성 미생물 물질은 박테리아이다. 방법의 일부 측면에서, 박테리아는 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori), 보렐리아 부르그도르페리(Borellia burgdorferi), 레기오넬라 뉴모필리아(Legionella pneumophilia), 클레브시엘라 뉴모니애(Klebsiella Pneumoniae), 미코박테리아 sps(Mycobacteria sps), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 네이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhoeae), 네이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코쿠스 아갈락티애(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 스트렙토코쿠스 파에칼리스(Streptococcus faecalis), 스트렙토코쿠스 보비스(Streptococcus bovis), 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae), 병원성 캄필로박터 종(pathogenic Campylobacter sp.), 엔테로코쿠스 종(Enterococcus sp.), 클라미디아 종(Chlamidia sp.), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 바실러스 안트라시스(Bacillus antracis), 코리네박테리움 디프테리아(corynebacterium diphtheriae), 코리네박테리움 종(corynebacterium sp.), 에리시펠로트릭스 루시오파티애(Erysipelothrix rhusiopathiae), 클로스트리디움 페르프린게르스(Clostridium perfringers), 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani), 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes), 클레브시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae), 파스투렐라 뮬토시다(Pasturella multocida), 박테로이데스 종(Bacteroides sp.), 푸소박테리움 누클레아텀(Fusobacterium nucleatum), 스트렙토바실러스 모닐리포르미스(Streptobacillus moniliformis), 트레포네마 팔리디움(Treponema pallidium), 트레포네마 페르테누에(Treponema pertenue), 렙토스피라(Leptospira), 악티노마이세스 이스라엘리(Actinomyces israelli), 스핑고모나스 캡슐라타(Sphingomonas capsulata) 및 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
방법의 일부 측면에서, 대상체에게 화합물을 투여하는 것은 화합물을 투여하지 않은 대상체에 비해 박테리아 박멸을 향상시킨다. 방법의 일부 측면에서, 화합물을 투여하는 것은 미생물 물질을 사멸시킨다. 방법의 일부 측면에서, 화합물을 투여하는 것은 미생물 물질이 성장할 수 없도록 한다.
특허 또는 간행물은 적어도 하나의 컬러 실행 도면을 함유한다. 컬러 도면이 포함된 본 특허 또는 특허 출원 공보의 복사본은 신청 및 필요한 요금 지불시 청에서 제공될 것이다.
도 1(a-b)은 천연 킬러 T 세포 (NKT) 기능을 보여주는 개략도이다. 도 1a는 일반적인 도식을 보여준다. 도 1b는 어떻게 본 개시문의 알파-갈락토실 세라미드 (α-GalCer) 및 α-GalCer 유사체가 CD1d에 결합하고 신속한 TH1 및 TH2 시토카인 반응을 자극할 수 있는지 보여준다.
도 2는 박테리아 기원의 당지질 (C3, C3 및 C14), 술폰화에 의해 변형된 당지질 (C4, C5 및 C9), 페닐-알킬 쇄 당지질 (C6-C8, C10-C11, C15-C16, C18-C34, 7DW8-5 (일명, C8-5) 및 7DW8-6 (일명, C8-6)) 및 피토스핑고신 말단절단된 당지질 (C12, C13 및 C17)을 비롯하여, 본 개시문의 α-GalCer (C1) 및 다양한 α-GalCer 당지질 (또한 유사체로 언급됨)의 화학적 구조를 보여준다.
도 3은 본 개시문의 C12 및 C13 α-GalCer 유사체에 대한 합성 반응식을 보여준다.
도 4는 본 개시문의 α-GalCer 또는 지시된 α-GalCer 유사체로 처리된 뮤린 1.2 하이브리도마에 의한 IL-2 시토카인 분비 수준 (pg/ml)을 보여준다.
도 5(a-c)는 본 개시문의 α-GalCer 또는 지시된 α-GalCer 유사체로 처리되고, 자가조직 미성숙 CD14+ DC와 공동 배양된 인간 CD161+/CD3+ NKT에 의한, (a) IFN-γ 및 IL-4, (b) IL-2 및 IL-6, 및 (c) IL-12 및 IL-10 시토카인 생산의 "증가 배수" (DMSO 대조군에 대해 표준화됨)를 보여준다. 좌측 패널은 TH1-유형 반응을 나타내고, 우측 패널은 TH2-유형 반응을 나타낸다.
도 6(a-b)는 (a) 인간 CD161+CD3+ NKT의 순도 및 (b) IFN-γ/IL-4 시토카인 생산 비율의 "증가 배수" (대조군 (DMSO)에 대해 표준화, 도 5에 제시된 데이타로부터 유래됨)를 보여준다.
도 7은 본 개시문의 α-GalCer 또는 지시된 α-GalCer 유사체로 처리된, 도 5 및 6으로부터의 인간 NKT의 상청액에서의 기저 시토카인 농도에 대한 증가 배수를 보여주는 표이다.
도 8(a-f)은 본 개시문의 α-GalCer 또는 지시된 α-GalCer 유사체로 처리되고, 자가조직 미성숙 DC와 공동 배양된 나이브(naive) 인간 NKT에 의한, (a) IFN-γ, (b) IL-4, (c) IFN-γ/IL-4의 비율, (d) IL-2, (e) IL-12 및 (f) IL-6 시토카인 생산의 "증가 배수" (대조군 (DMSO)에 대해 표준화됨)를 보여준다.
도 9는 본 개시문의 지시된 α-GalCer 유사체에 반응한 iNKT의 전체 수의 변화 배수를 보여준다.
도 10(a-e)은 본 개시문의 α-GalCer 또는 지시된 α-GalCer 유사체로 처리된, (a) 자가조직 수상 세포와 공동 배양된 나이브 iNKT; (b) HeLa-CD1d 세포와 공동 배양된 나이브 iNKT; (c) HeLa-CD1d 세포와 공동 배양된 α-GalCer-펄싱된 iNKT; 및 (d) HeLa-CD1d 세포와 공동 배양된 α-GalCer 유사체 C11-펄싱된 iNKT에 의한 IFN-γ 시토카인 생산 (비히클 대조군 (DMSO)에 대해 표준화됨)을 보여준다. (e)는 인간 나이브 iNKT, α-GalCer-펄싱된 iNKT 및 α-GalCer 유사체 C11-펄싱된 iNKT에서의 IFN-γ 시토카인 생산의 여러 기저 수준을 보여준다.
도 11(a-c)은 본 개시문의 α-GalCer 또는 지시된 α-GalCer 유사체로 처리된 인간 나이브 iNKT에 의한, (a) IFN-γ 시토카인 분비 수준 (pg/ml), (b) IL-4 시토카인 분비 수준 (pg/ml) 및 (c) IFN-γ/IL-4의 비율을 보여준다.
도 12는 α-GalCer 또는 본 개시내용의 지정된 α-GalCer 유사체로 처리된, 도 10으로부터의 인간 NKT의 상청액 중 기준 혈청 농도에 대한 증가 배수를 나타내는 표이다.
도 13은 자가조직 미성숙 CD14+ 수상 세포와 함께 배양되고 α-GalCer 또는 본 개시내용의 지정된 α-GalCer 유사체로 펄싱시킨, 인간 CD56+ 세포 (NK/NKT 혼합물)의 확대에 대한 대표적인 유세포 분석 데이타를 나타낸다. NK/NKT 혼합물 중 CD161+/Vα24TCR+ 세포의 백분율을 나타낸다.
도 14는 도 13으로부터의 NK/NKT 혼합물 중에서 발견된 전체 iNKT 갯수 (103)를 나타낸다.
도 15(a-b)는 α-GalCer 또는 본 개시내용의 지정된 α-GalCer 유사체로 펄싱시킨 자가조직 미성숙 CD14+ 수상 세포와 함께 배양된 인간 CD56+ 세포 (NK/NKT 혼합물)의 확대에 대한 대표적인 유세포 분석 데이타를 나타낸다. (a)는 NK/NKT 혼합물 중 CD161+/Vα24TCR+ 세포의 백분율의 대표적인 유세포 분석 데이타를 나타내고, (b)는 NK/NKT 혼합물 중 발견된 전체 iNKT 갯수의 증가의 배수를 나타낸다.
도 16은 미성숙 인간 수상 세포 (DC)를 α-GalCer 또는 본 개시내용의 지정된 α-GalCer 유사체와 함께 배양한 후에 수상 세포 (DC) 상의 표면 단백질 CD40, CD80, CD86 및 CD83, 및 MHC 클래스 II 세포 표면 수용체 HLA-DR의 발현 수준을 평균 형광 강도 (MFI)로서 나타낸다.
도 17(a-b)는 본 개시내용의 α-GalCer 유사체 C13이 인간 단핵구-유래 DC의 성숙을 촉진하는 방법을 나타낸다. (a)는 C13에 대한 반응에서 DC에서의 CD40, CD80, CD83, CD86 및 HLA-DR 확대에 대한 히스토그램을 나타낸다. (b)는 48 시간 동안 C13과 함께 배양된 DC의 형태를 나타낸다.
도 18은 iNKT 세포 수용체 신호전달 경로의 개략도를 나타낸다.
도 19(a-e)는 본 개시내용의 α-GalCer 유사체가 인간 NKT의 CD1d-의존성 T 세포 수용체 (TCR) 활성화를 촉진하는 방법을 증명한다. (a)는 CD1d로 형질감염된 HeLa 세포 (HeLa-CD1d)에서의 CD1d의 발현을 나타낸다. (b)는 포스포-CD3ε의 세포내 수준을 나타낸다. (c)는 포스포-ERK1/2의 세포내 수준을 나타낸다. (d)는 포스포-Syk의 세포내 수준을 나타낸다. (e)는 포스포-CREB의 세포내 수준을 나타낸다.
도 20(a-l)은 본 개시내용의 α-GalCer 유사체가 나이브 인간 iNKT (Vα24+)의 CD1d-의존성 T 세포 수용체 (TCR) 활성화를 촉진하는 방법을 증명한다. (a)는 유세포 분석에 의한 단리된 나이브 인간 Vα24+ T 세포의 측정을 나타낸다. (b-l)은 iNKT 상에서의 TCR의 활성화를 나타낸다. HeLa 또는 HeLa-CD1d 세포를 α-GalCer 또는 α-GalCer 유사체 C16, C23, 7DW8-5, 7DW8-6 또는 C26과 함께 로딩한 다음, 나이브 Vα24+ T 세포에 첨가하였다. 하기 인산화 단백질의 세포내 수준을 측정하여 중앙 형광 강도로 표현하고, 총 유입 단백질의 양에 대하여 표준화하였다: (b) 포스포-CD3ε (포스포티로신), (c) 포스포-CREB (Ser-133), (d) 포스포-ERK1/2 (Thr-185/Tyr-187), (e) 포스포-p38 (Thr-180/Tyr-182), (f) 포스포-IκBα (Ser32), (g) 포스포-Lck, (h) 포스포-Lat, (i) 포스포-STAT3 (Ser727), (j) 포스포- STAT5 A/B (Tyr 694/699), (k) 포스포-Syk (포스포-티로신) 및 (l) 포스포- Zap-70 (포스포-티로신). *는 DMSO 대조군과 비교하여 p < 0.05인 것이고, #는 α-GalCer와 비교하여 p < 0.05인 것이다.
도 21(a-c)는 본 개시내용의 α-GalCer 유사체가 더 큰 세포 확대를 유도하고 CD1d-제한된 NKT 및 T 세포에 결합하는 더 큰 능력을 표시하는 방법을 나타낸다. BALB/c 마우스로부터의 비장은 비히클, α-GalCer 또는 지정된 α-GalCer 유사체 0.1 ㎍/마우스의 정맥내 (IV) 주사 후 72 시간에 수확하였다. (a) 마우스 NKT 또는 (b) T 세포의 백분율을 측정하였다. (c)는 CD1d-제한된 NKT 및 T 세포에 대한 α-GalCer 및 지정된 α-GalCer 유사체의 상이한 결합 친화성을 나타낸다.
도 22(a-d)는 본 개시내용의 α-GalCer 유사체에 대한 반응에서 2종의 NKT 하위세트의 CD1d-의존성 확대 및 NK 활성화를 나타낸다. (a-c)는 2종의 NKT 하위세트의 CD1d-의존성 확대를 나타낸다. BALB/c 야생형 (WT) 또는 CD1 KO 마우스로부터의 비장은 α-GalCer 또는 본 개시내용의 지정된 α-GalCer 유사체의 주사 후 72 시간에 수확하였다. 반응에 있어서 (b) WT 또는 (c) CD1 KO 마우스에서의 NKT 및 그의 2종의 하위유형 (I형 NKT 및 II형 NKT로 표시됨)의 총 갯수는 FACS에 의해 평가하였다. (d) NK의 CD1d 의존성-활성화. 반응에 있어서 WT (좌측 패널) 또는 CD1 KO (우측 패널) 마우스에서의 NK의 총 갯수의 확대는 FACS에 의해 평가하였다.
도 23(a-c)는 비히클, α-GalCer 또는 본 개시내용의 지정된 α-GalCer 유사체의 정맥내 (IV) 주사 후, 주사 후 0, 2, 18, 36, 48, 72 시간에서의 다양한 사이토킨 (a) IFN-γ, (b) IL-4의 마우스 혈청 수준 (pg/ml), 및 (c) IFN-γ/IL-4의 비율을 나타낸다 (이는 DMSO 대조군에 대해 표준화한 것임).
도 24(a-c)는 비히클, α-GalCer 또는 본 개시내용의 지정된 α-GalCer 유사체의 IV 주사 후 2 및 18 시간에서의 다양한 사이토킨/케모카인 (A) IFN-γ, (b) IL-4의 마우스 혈청 수준 (pg/ml), 및 (c) IFN-γ/IL-4의 비율을 나타낸다.
도 25는 α-GalCer 또는 본 개시내용의 지정된 α-GalCer 유사체로 IV 주사된 BALB/c 마우스의 상청액에서의 결과 (기준 사이토킨 농도에 대한 증가 배수)를 나타낸 표이다. 모든 사이토킨/케모카인은 18 시간에 피크에 도달하는 *로 표시된 것들을 제외하고는 주사 후 2 시간에 피크에 도달한다.
도 26(a-h)는, 도 23으로부터의 비히클, α-GalCer 또는 α-GalCer 유사체의 IV 주사에 대한 반응에서, (a) 유핵 세포의 총 갯수 및 비장 크기, (b) 성숙한 수상 세포를 비롯한 선천적 면역 세포의 집단, (c) 활성화된 NK, (d) 활성화된 NKT, (e) 활성 B 세포, (f) 활성 CD8+ T 세포, (g) 활성 CD4+ T 세포 및 (h) CD8+/CD4+ T 세포의 비율 (모두 DMSO로 표준화함)을 나타낸다.
도 27(a-c)는 비히클, α-GalCer 또는 본 개시내용의 지정된 α-GalCer 유사체의 피하 (SubQ) 주사 후, 주사 후 0, 2, 18, 36, 48, 72 시간에서의 다양한 사이토킨 (a) IFN-γ, (b) IL-4의 마우스 혈청 수준, 및 (c) IFN-γ/IL-4의 비율을 나타낸다 (이는 DMSO 대조군에 대해 표준화한 것임).
도 28(a-h)는, 도 27로부터의 비히클, α-GalCer 또는 α-GalCer 유사체의 SubQ 주사에 대한 반응에서, (a) 유핵 세포의 총 갯수 및 비장 크기, (b) 성숙한 수상 세포를 비롯한 선천적 면역 세포의 집단, (c) 활성화된 NK, (d) 활성화된 NKT, (e) 활성 B 세포, (f) 활성 CD8+ T 세포, (g) 활성 CD4+ T 세포 및 (h) CD8+/CD4+ T 세포의 비율 (모두 DMSO로 표준화함)을 나타낸다.
도 29(a-c)는 비히클, α-GalCer 또는 본 개시내용의 지정된 α-GalCer 유사체의 정맥내 (IM) 주사 후, 주사 후 0, 2, 18, 36, 48, 72 시간에서의 다양한 사이토킨 (a) IFN-γ, (b) IL-4의 마우스 혈청 수준, 및 (c) IFN-γ/IL-4의 비율을 나타낸다 (이는 DMSO 대조군에 대해 표준화한 것임).
도 30(a-h)는, 도 29로부터의 비히클, α-GalCer 또는 α-GalCer 유사체의 IM 주사에 대한 반응에서, (a) 유핵 세포의 총 갯수 및 비장 크기, (b) 성숙한 수상 세포를 비롯한 선천적 면역 세포의 집단, (c) 활성화된 NK, (d) 활성화된 NKT, (e) 활성 B 세포, (f) 활성 CD8+ T 세포, (g) 활성 CD4+ T 세포 및 (h) CD87CD4+ T 세포의 비율 (모두 DMSO로 표준화함)을 나타낸다.
도 31(a-k)는 사이토킨 동역학 및 비장세포 확대/활성화에 대한 비히클, α-GalCer 또는 본 개시내용의 지정된 α-GalCer 유사체의 투여 경로 (IV, SubQ 또는 IM)에 따른 효과를 나타낸다. (a)는 IFN-γ의 마우스 혈청 수준 (pg/ml)을 나타낸다. (b)는 IL-4의 마우스 혈청 수준 (pg/ml)을 나타낸다. (c)는 IFN-γ/IL-4의 비율 (log 10)을 나타낸다. (d)는 마우스 유핵 세포 (비장세포)의 총 갯수를 나타낸다. (e)는 비장에서의 성숙한 수상 세포를 비롯한 선천적 면역 세포의 집단을 나타낸다. (f)는 비장에서의 활성화된 NK의 집단을 나타낸다. (g)는 비장에서의 활성화된 NKT의 집단을 나타낸다. (h)는 비장에서의 활성 B 세포의 집단을 나타낸다. (i)는 비장에서의 활성 CD8+ T 세포의 집단을 나타낸다. (j)는 비장에서의 활성 CD4+ T 세포의 집단을 나타낸다. (k)는 CD8+/CD4+ T 세포의 비율을 나타낸다. 모든 분석은 비히클에 대해 표준화하여 수행되었다.
도 32(a-h)는 α-GalCer 유사체 C11 또는 비히클의 IV 투여에 대한 반응에서 비장세포 확대/활성화의 용량-반응을 나타낸다. (a)는 마우스 유핵 세포 (비장세포)의 총 갯수를 나타낸다. (b)는 비장에서의 성숙한 수상 세포를 비롯한 선천적 면역 세포의 집단을 나타낸다. (c)는 비장에서의 활성화된 NK의 집단을 나타낸다. (d)는 비장에서의 활성화된 NKT의 집단을 나타낸다. (e)는 비장에서의 단핵구 과립구 세포의 집단을 나타낸다. (f)는 비장에서의 활성 CD4+ T 세포의 집단을 나타낸다. (g)는 비장에서의 활성 CD8+ T 세포의 집단을 나타낸다. (h)는 비장에서의 활성 B 세포의 집단을 나타낸다. 모든 분석은 비히클에 대해 표준화하여 수행되었다.
도 33(a-d)는 (a) 비히클, α-GalCer 또는 본 개시내용의 다양한 α-GalCer 유사체의 IV 주사 후, 주사 후 0, 12, 24, 36, 48, 72 시간에서의 다양한 사이토킨 (b) IFN-γ, (c) IL-4의 마우스 혈청 수준, 및 (d) IFN-γ/IL-4의 비율을 나타낸다 (이는 비히클 대조군에 대하여 표준화한 것임).
도 34는 도 33으로부터의 α-GalCer 또는 본 개시내용의 표시된 α-GalCer 유사체로 IV 주사된 BALB/c 마우스의 상청액에서의 결과 (기저 사이토킨 농도에 대한 증가 배수)를 나타낸 표이다. 모든 사이토킨/케모카인은 주사 후 2 시간에서 정점을 나타냈고, 예외로, * 표시된 것은 18 시간에서 정점을 나타냈다.
도 35 (a-g)는 야생형 BALB/c (wt) 및 CD1d KO BALB/c (CD1KO) 마우스에 대한 비히클, α-GalCer 또는 본 개시내용의 표시된 α-GalCer 유사체의 IV 주사 후 2 및 18 시간에 다양한 사이토킨/케모카인의 혈청 수준 (pg/ml)을 나타낸다. (a) IFN-γ. (b) IL-4. (c) IFN-γ/IL-4 비율 (로그 10). (d) IL-10. (e) IL-12p70. (f) KC. (g) MCP-1.
도 36(a-i)는 비히클, α-GalCer 또는 본 개시내용의 표시된 α-GalCer 유사체의 IV 주사 후 C57BL/6 마우스 내 지라세포의 확대/활성화를 나타내고, (g-i)는 비히클, α-GalCer 또는 본 개시내용의 표시된 α-GalCer 유사체의 IV 주사 후 두 NKT 서브세트 (C57BL/6 야생형 (Wt) 및 CD1 KO 마우스)의 CD1d-의존성 활성화를 나타낸다. (a)는 C57BL/6 마우스 유핵 세포 (지라세포)의 총 수를 나타낸다. (b)는 성숙한 수상 세포의 집단을 나타낸다. (c)는 활성화 NK의 집단을 나타낸다. (d)는 활성 CD4+ T 세포의 집단을 나타낸다. (e)는 활성 CD8+ T 세포의 집단을 나타낸다. (f)는 DMSO로 표준화된 CD8+/CD4+ T 세포의 비율을 나타낸다. (g)는 유세포분석기에 의한 Wt 마우스에서의 NKT 세포의 측정 (좌측 하단 패널), NKT의 총 수 (좌측 상단 패널), 및 유형 II NKT (우측 상단 패널) 및 유형 I NKT (우측 하단 패널)를 포함하는 그의 두 하위유형의 총 수를 나타낸다. (h)는 CD1 KO 마우스에서의 NKT의 총 수를 나타낸다. (i)는 Wt 마우스에서 Treg 세포의 총 수를 나타낸다. 모든 분석은 비히클에 대하여 표준화에 의해 수행하였다.
도 37(a-b)는 본 개시내용의 α-GalCer 유사체가 폐암을 갖는 마우스의 생존을 어떻게 연장시킬 수 있는지 보여준다. C57BL/6 마우스는 마우스 폐암 세포 (TC-1)를 IV 접종한 후, 대조군, α-GalCer 또는 본 개시내용의 표시된 α-GalCer 유사체로 4 주 동안 주 2 회 치료하였다. (a)는 I 군 α-GalCer 유사체의 시험으로부터의 결과를 나타낸다. (b)는 II 군 α-GalCer 유사체의 시험으로부터의 결과를 나타낸다. (c)는 III 군 α-GalCer 유사체의 시험으로부터의 결과를 나타낸다. (d)는 IV 군 α-GalCer 유사체의 시험으로부터의 결과를 나타낸다. 폐암을 갖는 마우스의 카플란 마이어 생존 곡선 (좌측 패널) 및 체중 변화 (우측 패널)를 나타내었다. 대조군은 종양 접종하지 않은 마우스이다.
도 38(a-b)는 α-GalCer 유사체 C11 또는 대조군으로 치료하고 TC-1 세포로의 종양 접종 후 16 일 째에 희생시킨 마우스의 폐의 표면 상 (a), α-GalCer 유사체 C11 또는 대조군으로 치료하고, 마우스 유방암 세포 (4T-1)로의 SubQ 종양 접종 후 16 일 째에 희생시킨 마우스의 피하 종양 (b)에서의 종양 결절 및 크기를 보여준다.
도 39(a-b)는 마우스 유방암 세포 4T-1을 피하 접종하고, 접종 후 3 일에 대조군, α-GalCer 또는 본 개시내용의 표시된 α-GalCer 유사체로 (a) IV 주사 또는 (b) SubQ 주사에 의해 4 주 동안 주 2 회 치료한 마우스의 카플란 마이어 생존 곡선 (좌측 패널) 및 종양 성장 (우측 패널)을 나타낸다.
도 40은 α-GalCer (C1)의 IV 또는 SubQ 주사에 의해 치료한, 유방암을 갖는 마우스의 카플란 마이어 생존 곡선을 나타낸다. C1의 SubQ 전달은 유방암을 갖는 마우스의 생존 연장 면에서 IV 전달보다 더욱 효과적이다.
도 41 (a-c)은 투여 용량에 의한 본 개시내용의 α-GalCer 유사체의 치료학적 항암 프로토콜의 최적화를 나타낸다. 마우스 폐암 세포 (TC-1)를 IV 접종하고, 이어서 α-GalCer 또는 α-GalCer 유사체 7DW8-5 또는 C26을 다양한 투여량으로 4 주 동안 주 2 회 또는 주 1 회 치료한 후의, C57BL/6 마우스의 체중 변화 (우측 패널) 및 카플란 마이어 생존 곡선 (좌측 패널)을 나타낸다. (a) α-GalCer. (b) α-GalCer 유사체 7DW8-5. (c) α-GalCer 유사체 C26.
도 42(a-c)는 경로 및 빈도를 다양화하는 것에 의한 본 개시내용의 α-GalCer 유사체의 치료학적 항암 프로토콜의 최적화를 나타낸다. (a)는 마우스 유방암 세포, 4T-1을 SubQ 접종하고 이어서 접종 후 3 일에 비히클, α-GalCer 또는 본 개시내용의 표시된 α-GalCer 유사체로 IV 또는 SubQ 경로에 의해 4 주 동안 주 2 회 치료한 후 BALB/c 마우스의 종양 부피 (mm3) (우측 패널) 및 카플란 마이어 생존 곡선 (좌측 패널)을 나타낸다. (b)는 마우스 폐암 세포, TC-1을 IV 접종하고 이어서 접종 후 3 일에 비히클, α-GalCer 또는 본 개시내용의 표시된 α-GalCer 유사체로 IV 또는 SubQ 경로에 의해 4 주 동안 주 2 회 치료한 후, C57BL/6 마우스의 체중 변화 (우측 패널) 및 카플란 마이어 생존 곡선 (좌측 패널)을 나타낸다. (c)는 마우스 폐암 세포, TC-1을 IV 접종하고 이어서 비히클 또는 α-GalCer 유사체 C16으로 IV 경로에 의해 4 주 동안 주 2 회 또는 주 1 회 치료한 후, C57BL/6 마우스의 체중 (우측 패널) 및 카플란 마이어 생존 곡선 (좌측 패널)에 대한 투여 빈도의 영향을 나타낸다.
도 43(a-b)은 본 개시내용의 다양한 α-GalCer 유사체의 항암 효능의 평가를 나타낸다. C57BL/6 마우스를 마우스 폐암 세포, TC-1로 IV 접종시키거나 또는 마우스 흑색종, B16 세포로 SubQ 접종하고, 이어서 비히클, α-GalCer 또는 본 개시내용의 표시된 α-GalCer 유사체로 4 주 동안 주 1 회 치료하였다. (a)는 카플란 마이어 생존 곡선을 나타낸다. (b)는 종양 부피 (mm3) 성장 곡선을 나타낸다.
도 44(a-b)는 (a) 폐암 세포 (TC-1-GRP-루시페라제) 또는 (b) 유방암 세포(4T-1-GFP-루시페라제)로 SQ 접종하고, 이어서 비히클, α-GalCer 또는 본 개시내용의 표시된 α-GalCer 유사체로 4 주 동안 주 1 회 치료한 C57BL/6 마우스에서의 종양 성장의 실시간 평가를 나타낸다.
도 45(a-h)는 본 개시내용의 TH1-편재된 α-GalCer 유사체가 폐 및 흑색종 종양에서 더 종양 침윤성 림프구를 유발함을 나타낸다. (a-d)는 폐암 세포 (TC-1)에서의 종양 침윤성 림프구를 나타낸다. C57BL/6 마우스를 비히클, α-GalCer 또는 α-GalCer 유사체 C23, C8-5 또는 C34로 3 주 동안 주 1 회 0.1 μg/마우스로 치료하였다. (a)는 CD3+ 세포의 집단을 나타낸다. (b)는 CD8 T 세포의 집단을 나타낸다. (c)는 NK 세포의 집단을 나타낸다. (d)는 NKT의 집단을 나타낸다. 모든 분석은 비히클에 대한 표준화에 의해 수행하였다. (e-h)는 흑색종 세포에서의 종양 침윤성 림프구를 나타낸다. C57BL/6 마우스를 비히클, α-GalCer 또는 α-GalCer 유사체 C23, C8-5 또는 C34로 3 주 동안 주 1 회 0.1 μg/마우스로 치료하였다. (e)는 CD3+ 세포의 집단을 나타낸다. (f)는 CD8 T 세포의 집단을 나타낸다. (g)는 NK의 집단을 나타낸다. (h)는 NKT의 집단을 나타낸다. 모든 분석은 비히클에 대한 표준화에 의해 수행하였다.
도 46(a-b)는 파상풍톡소이드 (TT) - 단백질 백신에 반응하는 항체에 대한 알럼, α-GalCer 및 α-GalCer 유사체 C11의 아주반트 효과를 나타낸다. (a) 마우스를 통상의 아주반트 알럼, α-GalCer 또는 α-GalCer 유사체 C11의 존재 또는 부재 하에 0 일 째 (첫번째 백신접종)에 및 28 일 째 (4 주-두번째 백신접종)에 TT 백신접종하였다. 항-TT-특이적 항체의 측정을 위하여 혈정을 매주 수확하였다. (b)는 두번째 백신접종 20 주 후, 지연된 항원 부스트(boost)에 대한 통상의 아주반트 알럼, α-GalCer 및 α-GalCer 유사체 C11의 효과를 나타낸다.
도 47은 세번째 면역화 후 2 주에 H1N1 바이러스 균주의 M2 (M2e) 단백질의 세포외 도메인을 함유하는 펩티드에 대한 통상의 아주반트 알럼, α-GalCer 및 본 개시내용의 다양한 α-GalCer 유사체의 아주반트 효과를 나타낸다. BALB/c 마우스를 0, 3 및 6 주째에 α-GalCer 및 다양한 α-GalCer 유사체의 존재 또는 부재 하에 5 또는 45 μg의 M2e 펩티드로 백신접종하였다.
도 48(a-c)는 조류 인플루엔자 바이러스의 전장 H5의 컨센서스 서열을 포함하는 DNA 플라스미드인 pHA로 면역화된 마우스 상에서의 α-GalCer (C1)의 아주반트 효과를 나타낸다. (a) 마우스를 0 및 3 주째에 C1의 부재 또는 존재 하에 5 내지 45 μg의 pHA로 면역화시켰다. (b) 마우스를 C1의 부재 또는 존재 하에 저용량의 pHA 백신으로 면역화시켰다. (c)는 C1의 부재 또는 존재 하 H5 DNA 백신 후 2 주에 베트남 외피 인플루엔자 균주 NIBRG-14의 20 LD5O으로의 바이러스성 챌린지에 대한 보호를 나타낸다.
도 49(a-c)는 마우스를 C1 또는 본 개시내용의 표시된 α-GalCer 유사체의 존재 또는 부재 하에 pHA로 면역화시킨 후의 항-HA-특이적 IgG 항체의 유도를 나타낸다. (a)는 0.2 μg pHA로의 면역화 후 마우스에서의 항-HA 특이적 IgG 항체 (AY3)의 역가를 나타낸다. (b)는 0.2 μg pHA로의 면역화 후 마우스에서의 항-HA 특이적 IgG 항체 (AY4)의 역가를 나타낸다. (c)는 바이러스성 챌린지 후 마우스 생존 백분율을 나타낸다.
도 50 (a-b)은, 마우스를 pHA (C1 함유 또는 무함유) 또는 본 개시내용의 지정 α-GalCer 유사체로 면역화시킨 후의 항-HA-특이적 IgG 항체의 유도를 나타낸다. (a)는 pHA 0.5 ㎍ 및 본 개시내용의 지정 α-GalCer 유사체를 사용한 면역화 후의 항-HA 특이적 IgG 항체 (AY4)의 역가를 나타낸다. (b)는 바이러스 투여 후 생존율(％)을 나타낸다.
도 51 (a-b)은 (a) pHA 0.1 ㎍ 또는 (b) pHA 0.2 ㎍, 및 본 개시내용의 지정 α-GalCer 유사체를 사용한 면역화 후의 항-HA 특이적 IgG 항체 (AY5)의 마우스 역가를 나타낸다.
도 52 (a-b)는 (a) pHA 0.1 ㎍ 또는 (b) pHA 0.2 ㎍, 및 본 개시내용의 지정 α-GalCer 유사체 (0.1 ㎍ 또는 1 ㎍)를 사용한 면역화 후의 항-HA 특이적 IgG 항체 (AY6)의 마우스 역가를 나타낸다.
도 53 (a-d)은 α-GalCer 또는 본 개시내용의 지정 α-GalCer 유사체에 의한 항-HA-특이적 IgG 항체의 유도를 나타낸다. α-GalCer 또는 지정 α-GalCer 유사체 (pHAc 함유)를 사용하여 근육내 전기전달에 의해 BALB/c 마우스를 백신접종하고, 4주 후 동일 제제를 사용하여 1회 부스팅하였다. 제2 백신접종 2주 후, 혈액 샘플을 수집하고, ELISA에 의해 항-HAc-특이적 IgG 항체 역가에 대해 시험하였다. (a)는 항-HA 특이적 IgG 항체 (AY3)의 역가를 나타낸다. (b)는 항-HA 특이적 IgG 항체 (AY4)의 역가를 나나탠다. (c)는 항-HA 특이적 IgG 항체 (AY5)의 역가를 나타낸다. (d)는 항-HA 특이적 IgG 항체 (AY16)의 역가를 나타낸다.
도 54 (a-b)는 (a) HA-특이적 IFN-γ 생성 세포 및 (b) HA-특이적 펩티드 반응 세포를 나타낸다. pHAc, 및 α-GalCer 또는 본 개시내용의 지정 α-GalCer 유사체를 사용하여 근육내 전기전달에 의해 BALB/c 마우스를 백신접종하고, 3주 후 동일 제제를 사용하여 1회 부스팅하였다. 비장세포를 HA-특이적 펩티드 (9-mer)와 함께 배양하고, 1일 후 스폿을 측정하였다.
도 55는 바이러스 투여에 대한 보호를 나타낸다. pHAc, 및 α-GalCer 또는 본 개시내용의 지정 α-GalCer 유사체를 사용하여 근육내 전기전달에 의해 BALB/c 마우스를 백신접종하고, 3주 후 동일 제제를 사용하여 1회 부스팅하였다. 제2 백신접종 2주 후, 마우스에게 200 LD50의 NIBRG-14 바이러스를 투여하고, 마우스 생존을 모니터링하였다.
도 56 (a-b)은 단일 용량 백신접종의 효과를 나타낸다. pHAc (2 ㎍), 및 α-GalCer 또는 본 개시내용의 지정 α-GalCer 유사체 (2 ㎍)를 사용하여 근육내 전기전달에 의해 BALB/c 마우스를 백신접종하였다. (a) 3주 후에 혈액 샘플을 수집하고, 항-HAc-특이적 IgG 항체 역가에 대해 시험하였다. (b) 초회 항원자극 3주 후, 마우스에게 200 LD50의 NIBRG-14 바이러스를 투여하고, 생존을 모니터링하였다.
도 57 (a-b)은 탄수화물 항원에 대한 α-GalCer 또는 본 개시내용의 지정 α-GalCer 유사체의 아주반트 효과를 나타낸다. α-GalCer 또는 지정 α-GalCer 유사체를 사용하여 IM 주사에 의해 BALB/c 마우스를 백신접종하고, globo H-DT와 혼합하고, 2주 간격으로 2회 부스팅하였다. 제3 백신접종 2주 후, 혈액 샘플을 수집하고, (a) 항-globo H-특이적 IgG 항체 및 (b) 항-globo H-특이적 IgM 항체 생성에 대해 시험하였다.
도 58 (a-b)은, BALB/c 마우스를 α-GalCer 또는 본 개시내용의 지정 α-GalCer 유사체로 복강내 (IP) 경로를 통해 (a) FLU-A 바이러스 혈청형 H1N1 (WSN) 바이러스 투여 30분 후에 처리하기 시작한 경우, 및 H1N1 바이러스 투여 2주 전에 처리하기 시작한 경우의 생존율을 나타낸다.
도 59 (a-b)는, H1N1 (WSN)로 감염되고, α-GalCer 또는 본 개시내용의 지정 α-GalCer 유사체로 (a) 고용량의 H1N1 (WSN) 바이러스를 사용한 바이러스 투여 2주 전에 출발하여, 그리고 (b) 비강내 경로를 통해 처리한 BALB/c 마우스의 누적 생존율을 나타낸다.
도 60 (a-b)은 시험관내 개의 원위세뇨관 (MDCK; Madin-Darby canine kidney) 세포의 세포병변 효과 (CPE)를 나타낸다. MDCK 세포를 비히클, α-GalCer, 또는 α-GalCer 유사체 C13, C14 또는 C16 중 하나 (10 ㎍/ml)로 4시간 동안 전처리한 후, FLU-A 바이러스 혈청형 H1N1 (WSN)을 사용하여 10TCID50으로 감염시켰다. (a)는 시험관내 당지질 처리 후의 생존 바이러스 역가 (log10)를 나타내고, (b)는 감염 48시간 후의 MDCK 세포의 바이러스 역가를 나타낸다.
도 61 (a-b)은 스핑고모나스 캅슐라타(Sphingomonas capsulata)로 감염된 마우스에서 (a) 100 ㎍/kg 또는 (b) 50 ㎍/kg으로 처리된 α-GalCer 또는 본 개시내용의 지정 α-GalCer 유사체의 항박테리아 효능을 나타낸다.
도 62 (a-b)는 클렙시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae)로 감염된 마우스에서의 α-GalCer 또는 본 개시내용의 지정 α-GalCer 유사체의 항박테리아 효능을 나타낸다. C1 및 C14는 주사 후 (a) 마우스 폐 및 (b) 간에서 박테리아 부하를 현저하게 감소시킬 수 있다.
도 63은, C23 및 C34를 사용하여 50 ㎍/kg으로 처리한 군의 (폐에서의) CFU 수가 비처리 군과의 비교시 유의함을 나타낸다.
도 64 (a-b)는 α-GalCer (C1), 및 C3, C9, C11, C14, C16, C17, C23, 7DW8-5 (aka, C8-5) 및 C34를 비롯한 본 개시내용의 다양한 α-GalCer 당지질 (또한 유사체로서 지칭됨)의 화학 구조를 나타낸다.
도 65는 스핑고모나스 캅슐라타로 감염된 마우스에서 100 ㎍/kg으로 처리된 당지질의 항박테리아 효능을 나타낸다. 각각의 처리 군에서 감염 24시간 후에 측정된 마우스 간의 CFU 값을 점으로 표시하였다. 각각의 처리 군의 평균 CFU 값을 짧은 횡선으로 나타냈다. 분산분석을 이용한 통계 분석에서, C1, C11, C14 및 C16으로 처리한 군에서의 간의 박테리아 부하가 현저하게 감소된 것으로 밝혀졌다. PBS 대조군으로부터 유의한 차이를 갖는 군을 별표로 표시하였다 ("*": P<0.05, "**": P<0.01).
도 66 (a-b)은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 대퇴 감염 모델에서의 선택된 당지질의 항박테리아 효능을 나타낸다. 감염 3시간 후 IP 주사에 의해 150 ㎍/kg으로 투여된 당지질의 항박테리아 효능을 발광 에스. 아우레우스 (S. aureus) Xen29로의 감염 48시간 후에 영상 분석으로 평가하였다. (a) 감염 48시간 후에 다양하게 처리된 마우스의 영상을 취하였다. (b) 감염 48시간 후에 측정한 각가의 마우스의 상대 발광 (RLU) 값을 개별 기호로 플로팅하고, 각각의 처리 군의 평균 값을 횡선으로 나타냈다 (*: p<0.05).
도 67은 JEV 감염에 대한 숙주 보호의 당지질 증강을 나타낸다. 7주령의 야생형 C57BL/6 마우스에게 각각의 군에 대해 바이러스 투여 1일 전에 화합물 C1, 7DW8-5, C23, C34 또는 용매 1 ㎍을 복강내 (IP) 주사하였다. 5x105 PFU의 JEV (RP-9 균주)를 사용하여 마우스를 IP 감염시키고, 동시에 PBS 30 ㎕를 뇌내 주사하였다. 바이러스 감염 1일 후, 마우스를 C1, 7DW8-5, C23, C34 또는 용매 1 ㎍으로 IP 부스팅하였다. 마우스를 25일 동안 매일 모니터링하고, 생존율(％)을 나타냈다. 각각의 실험 군에는 14마리의 마우스가 포함되었다. 프리즘 (Prism) 소프트웨어 통계 분석과 로그 순위 검정을 이용하여 생존 곡선 비교를 수행하고, 용매 대조군과 비교시 P < 0.05를 "*"로 나타냈다.
도 68 (a-c)은 숙주의 선천적 및 후천적 면역 성분에 있어서의 JEV 감염에 대한 보호를 유발하기 위한 당지질 의존도를 나타낸다. Stat-1 (a), 이뮤노글로불린 μ-사슬 (b) 또는 CD8α-사슬 (c)이 결핍된 7주령의 면역결핍 마우스에게 2-용량 프로토콜을 이용하여 도 67에 기재된 바와 같이 C34, 7DW8-5 또는 용매를 투여하였다. Stat-1 녹아웃 마우스에게 0.1 PFU의 JEV (RP-9 균주)를 복강내 투여하였다. Igμ-사슬 녹아웃 마우스 및 CD8α-사슬 녹아웃 마우스에게 도 67에 기재된 바와 같이 투여하였다. 마우스를 25일 동안 매일 모니터링하였다. 생존율(％)을 나타내고, 각각의 실험 군에서의 마우스의 수를 각각의 패널에 대한 범례에 나타냈다.
도 69 (a-b)는 최고의 보호 효과를 나타낸 2-용량 프로토콜 (JEV 감염 1일 전 및 1일 후)의 결과를 나타낸다. 당지질 C34 (a) 또는 7DW8-5 (b)를 도 67에 기재한 바와 같이 2-용량 프로토콜로 [-1일 및 +1일], 또는 바이러스 감염 1일 전 [-1일], 당일 [O일] 또는 1일 후 [+1일]에 1일 단 1회로 7주령의 야생형 C57BL/6 마우스에게 투여하였다. 도 67에 기재된 바와 같이 마우스에게 투여하고, 모니터링하였다. 생존율(％)을 나타내고, 각각의 실험 군에서의 마우스의 수를 각각의 패널에 대한 범례에 나타냈다.
도 70 (a-b)은 다양한 시간 및 용량으로 C34를 투여받은 인플루엔자 감염 마우스의 생존 프로파일을 나타낸다. Blab/C 마우스를 비강내 경로에 의해 10 LD50의 인플루엔자 바이러스로 감염시켰다. 마우스를 인플루엔자 감염에 대한 -1일 및 +1일의 양일에 2회의 IP 주사를 받은 4개의 군으로 분류하였다. 다양한 처리 군의 IP 주사량 (1 ㎍/마우스 C34 또는 PBS 비히클) 및 주사 시간에 대한 연구 프로토콜을 (a)에 기재하였다. 다양한 처리 군의 생존 곡선을 나타냈다 (b).
도 71은 뮤린 대퇴-상처 감염 모델의 감염 청소율에 대한 C34 투여 시간의 효과를 나타낸다. 좌측 대퇴를 발광 에스. 아우레우스로 감염시킨 마우스를 비히클 대조군, 및 감염 후 0 및 6시간에 C34를 투여받은 2개의 군으로 분류하였다. 감염 48시간 후의 마우스 영상을 얻었다. 발광 박테리아 감염의 영상 및 상대 발광 단위를 도 66과 유사하게 나타냈다 ("**": p<0.01로 유의함).
도 72는 에스. 캡슐라타 감염을 억제하는데 있어서 선택된 당지질의 효능을 도시하는 표이다.
도 73(A-B)는 pCHA5 +/- 당지질 백신의 2회 투여량의 근육내 주사에 의한 조류 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 면역 보호를 도시한다. 혈청을 수집하여, ELISA에 의해 HA-특이적 항체 적정 (A)을 시험하였고, 마우스를 200 LD50의 NIBRG-14 바이러스로 챌린징하여, 생존 (B)에 대해 모니터링하였다.
도 74(A-C)는 아주반트로서 당지질과 함께 또는 없이 pCHA5의 단일 IM 투여 이후 면역 반응 및 마우스 생존을 도시한다. IM 경로를 통해 pCHA5 (50 ㎍) +/- 당지질 (2 ㎍) 또는 명반으로 백신화한지 3 주 후에, 혈청을 수집하여, ELISA에 의해 HA-특이적 항체 적정 (A)을 시험하였다. 그와 동시에, 마우스를 희생시키고, 비장세포를 ELISPOT 검정 (B)을 위해 수확하였다. 또 다른 군의 마우스를 200 LD50의 NIBRG-14 바이러스로 챌린징하여, 생존 (C)에 대해 모니터링하였다.
도 75(A-C)는 pCHA5 및 pCHA5-ll 백신에 대한 당지질의 아주반트 효과의 비교를 도시한다. IM/EP 경로를 통해 제0주째 및 제3주째에 pCHA5 또는 pCHA5-ll (30 ㎍) +/- 당지질 (2 ㎍)로의 백신화를 위해 추가 주사한지 2 주 후에, 혈청을 수집하여, ELISA에 의해 HA-특이적 항체 적정 (A)을 시험하였고, pCHA5 (B) 및 pCHA5-ll (C)로 백신화한 마우스를 E319 바이러스로 챌린징하여, 생존에 대해 모니터링하였다.
도 76(A-D)는 마우스에서 HA-특이적 항체 생산 및 면역 보호에 대한 pCHA5-ll 및 C34의 투여량 효과를 도시한다. IM 경로를 통해 아주반트로서 C34 (0.5, 1, 2, 4 ㎍)와 함께 또는 없이 단일 투여량의 pCHA5-ll (100, 75, 50 ㎍)로 백신화한지 3 주 후에, 혈청을 수집하여, ELISA에 의해 HA-특이적 항체 적정 (A)을 시험하였다. 그와 동시에, 마우스를 희생시키고, 비장세포를 ELISPOT 검정 (B)을 위해 수확하였다. 도 76C는 상이한 투여량의 pCHA5-ll 및 2 ㎍의 C34 아주반트로 처리한 마우스의 생존을 도시한다. 도 76D는 100 ㎍의 pCHA5-ll 및 다양한 투여량의 C34로 처리한 마우스의 생존을 도시한다.
도 77(A-D)는 다양한 HA-가성형(pseudotyped) 바이러스에 대항하는 중화 항체 생산에 대한 C34의 아주반트 효과를 도시한다. 제0주째 및 제3주째에 2 ㎍의 C34를 함유하는 PBS에 용해된 0.2 ㎍의 pCHA5로 IM/EP 백신화한 후, TK (A), VN1 194 (B), ID05 (C) 및 안후이05 (D)에 대한 HA-가성형 바이러스 중화의 50％ (ID50)를 제공하는 혈청 희석액에 대한 비선형 회귀 분석을 도시한다. p의 값은 대입의 비교였다. * p < 0.05이며, C34-아주반트 군과 pCHA5 단독 군의 비교시 통계적 유의성을 제공하였다.
도 78(A-L)은 아주반트로서 C34와 함께 또는 없이 pCHA5를 수용한 마우스에서 혈청 사이토킨 발현 프로파일을 도시한다. IM/EP 경로를 통해 제0주째 및 제3주째에 C34와 함께 또는 없이 0.2 ㎍의 pCHA5로 백신화한 후 혈청 농도를 IL-2 (A), IL-5 (B), IL-13 (C), RANTES (D), MIP-1α (E), MIP-1β (F), KC (G), IL-1β (H), IL-17 (I), IL-12p40 (J), G-CSF (K) 및 IFN-γ (L)에 대해 도시된다.
도 79(A-D)는 항혈청의 중화 능력이 단일 투여량 근육내 주사를 통해 C34에 의해 유도됨을 도시한다. 2 ㎍의 C34를 함유하는 PBS에 용해된 50 ㎍의 pCHA5-ll로 백신화한지 3 주 후에 수행된 HA-가성형 바이러스 중화 검정의 결과는 안후이05 (A), TK05 (B), ID05 (C) 및 VN1194 (D)에 대해 도시된다. p의 값은 대입의 비교였다. * p < 0.05이며, C34-아주반트 군과 pCHA5-ll 단독 군의 비교시 통계적 유의성을 제공하였다.
도 80은 본 개시내용의 C34 α-GalCer 유사체에 대한 합성 반응식을 도시한다. 도시된 시약 및 조건은 다음과 같다: (a) 2-메톡시프로펜, CSA, DMF, 83％; (b) Ph3CCl, 피리딘. 77％; (c) C13H27 +PPh3 -Br, LHMDS, THF 75％; (d) H2, Pd(OH)2, EA, 90％; (e) Tf2O, 2,6-루티딘, TAIGA, CH2Cl2; (f) TFA/TFAA, CH2Cl2, 두 단계 63％; (g) Tf2O, Me2S, 2-Cl-피리딘, MS4A, CH2Cl2, 60％; (h) PPh3, 피리딘/H2O; (i) EDC, HBTU, TEA, CH2Cl2, 두 단계 88％; (j) NaOMe, MeOH/CH2Cl2; (k) AcOH(수성); (I) H2, Pd(OH)2, MeOH/CHCl3, 세 단계 40％.
도 1(a-b)은 천연 킬러 T 세포 (NKT) 기능을 보여주는 개략도이다. 도 1a는 일반적인 도식을 보여준다. 도 1b는 어떻게 본 개시문의 알파-갈락토실 세라미드 (α-GalCer) 및 α-GalCer 유사체가 CD1d에 결합하고 신속한 TH1 및 TH2 시토카인 반응을 자극할 수 있는지 보여준다.
도 2는 박테리아 기원의 당지질 (C3, C3 및 C14), 술폰화에 의해 변형된 당지질 (C4, C5 및 C9), 페닐-알킬 쇄 당지질 (C6-C8, C10-C11, C15-C16, C18-C34, 7DW8-5 (일명, C8-5) 및 7DW8-6 (일명, C8-6)) 및 피토스핑고신 말단절단된 당지질 (C12, C13 및 C17)을 비롯하여, 본 개시문의 α-GalCer (C1) 및 다양한 α-GalCer 당지질 (또한 유사체로 언급됨)의 화학적 구조를 보여준다.
도 3은 본 개시문의 C12 및 C13 α-GalCer 유사체에 대한 합성 반응식을 보여준다.
도 4는 본 개시문의 α-GalCer 또는 지시된 α-GalCer 유사체로 처리된 뮤린 1.2 하이브리도마에 의한 IL-2 시토카인 분비 수준 (pg/ml)을 보여준다.
도 5(a-c)는 본 개시문의 α-GalCer 또는 지시된 α-GalCer 유사체로 처리되고, 자가조직 미성숙 CD14+ DC와 공동 배양된 인간 CD161+/CD3+ NKT에 의한, (a) IFN-γ 및 IL-4, (b) IL-2 및 IL-6, 및 (c) IL-12 및 IL-10 시토카인 생산의 "증가 배수" (DMSO 대조군에 대해 표준화됨)를 보여준다. 좌측 패널은 TH1-유형 반응을 나타내고, 우측 패널은 TH2-유형 반응을 나타낸다.
도 6(a-b)는 (a) 인간 CD161+CD3+ NKT의 순도 및 (b) IFN-γ/IL-4 시토카인 생산 비율의 "증가 배수" (대조군 (DMSO)에 대해 표준화, 도 5에 제시된 데이타로부터 유래됨)를 보여준다.
도 7은 본 개시문의 α-GalCer 또는 지시된 α-GalCer 유사체로 처리된, 도 5 및 6으로부터의 인간 NKT의 상청액에서의 기저 시토카인 농도에 대한 증가 배수를 보여주는 표이다.
도 8(a-f)은 본 개시문의 α-GalCer 또는 지시된 α-GalCer 유사체로 처리되고, 자가조직 미성숙 DC와 공동 배양된 나이브(naive) 인간 NKT에 의한, (a) IFN-γ, (b) IL-4, (c) IFN-γ/IL-4의 비율, (d) IL-2, (e) IL-12 및 (f) IL-6 시토카인 생산의 "증가 배수" (대조군 (DMSO)에 대해 표준화됨)를 보여준다.
도 9는 본 개시문의 지시된 α-GalCer 유사체에 반응한 iNKT의 전체 수의 변화 배수를 보여준다.
도 10(a-e)은 본 개시문의 α-GalCer 또는 지시된 α-GalCer 유사체로 처리된, (a) 자가조직 수상 세포와 공동 배양된 나이브 iNKT; (b) HeLa-CD1d 세포와 공동 배양된 나이브 iNKT; (c) HeLa-CD1d 세포와 공동 배양된 α-GalCer-펄싱된 iNKT; 및 (d) HeLa-CD1d 세포와 공동 배양된 α-GalCer 유사체 C11-펄싱된 iNKT에 의한 IFN-γ 시토카인 생산 (비히클 대조군 (DMSO)에 대해 표준화됨)을 보여준다. (e)는 인간 나이브 iNKT, α-GalCer-펄싱된 iNKT 및 α-GalCer 유사체 C11-펄싱된 iNKT에서의 IFN-γ 시토카인 생산의 여러 기저 수준을 보여준다.
도 11(a-c)은 본 개시문의 α-GalCer 또는 지시된 α-GalCer 유사체로 처리된 인간 나이브 iNKT에 의한, (a) IFN-γ 시토카인 분비 수준 (pg/ml), (b) IL-4 시토카인 분비 수준 (pg/ml) 및 (c) IFN-γ/IL-4의 비율을 보여준다.
도 12는 α-GalCer 또는 본 개시내용의 지정된 α-GalCer 유사체로 처리된, 도 10으로부터의 인간 NKT의 상청액 중 기준 혈청 농도에 대한 증가 배수를 나타내는 표이다.
도 13은 자가조직 미성숙 CD14+ 수상 세포와 함께 배양되고 α-GalCer 또는 본 개시내용의 지정된 α-GalCer 유사체로 펄싱시킨, 인간 CD56+ 세포 (NK/NKT 혼합물)의 확대에 대한 대표적인 유세포 분석 데이타를 나타낸다. NK/NKT 혼합물 중 CD161+/Vα24TCR+ 세포의 백분율을 나타낸다.
도 14는 도 13으로부터의 NK/NKT 혼합물 중에서 발견된 전체 iNKT 갯수 (103)를 나타낸다.
도 15(a-b)는 α-GalCer 또는 본 개시내용의 지정된 α-GalCer 유사체로 펄싱시킨 자가조직 미성숙 CD14+ 수상 세포와 함께 배양된 인간 CD56+ 세포 (NK/NKT 혼합물)의 확대에 대한 대표적인 유세포 분석 데이타를 나타낸다. (a)는 NK/NKT 혼합물 중 CD161+/Vα24TCR+ 세포의 백분율의 대표적인 유세포 분석 데이타를 나타내고, (b)는 NK/NKT 혼합물 중 발견된 전체 iNKT 갯수의 증가의 배수를 나타낸다.
도 16은 미성숙 인간 수상 세포 (DC)를 α-GalCer 또는 본 개시내용의 지정된 α-GalCer 유사체와 함께 배양한 후에 수상 세포 (DC) 상의 표면 단백질 CD40, CD80, CD86 및 CD83, 및 MHC 클래스 II 세포 표면 수용체 HLA-DR의 발현 수준을 평균 형광 강도 (MFI)로서 나타낸다.
도 17(a-b)는 본 개시내용의 α-GalCer 유사체 C13이 인간 단핵구-유래 DC의 성숙을 촉진하는 방법을 나타낸다. (a)는 C13에 대한 반응에서 DC에서의 CD40, CD80, CD83, CD86 및 HLA-DR 확대에 대한 히스토그램을 나타낸다. (b)는 48 시간 동안 C13과 함께 배양된 DC의 형태를 나타낸다.
도 18은 iNKT 세포 수용체 신호전달 경로의 개략도를 나타낸다.
도 19(a-e)는 본 개시내용의 α-GalCer 유사체가 인간 NKT의 CD1d-의존성 T 세포 수용체 (TCR) 활성화를 촉진하는 방법을 증명한다. (a)는 CD1d로 형질감염된 HeLa 세포 (HeLa-CD1d)에서의 CD1d의 발현을 나타낸다. (b)는 포스포-CD3ε의 세포내 수준을 나타낸다. (c)는 포스포-ERK1/2의 세포내 수준을 나타낸다. (d)는 포스포-Syk의 세포내 수준을 나타낸다. (e)는 포스포-CREB의 세포내 수준을 나타낸다.
도 20(a-l)은 본 개시내용의 α-GalCer 유사체가 나이브 인간 iNKT (Vα24+)의 CD1d-의존성 T 세포 수용체 (TCR) 활성화를 촉진하는 방법을 증명한다. (a)는 유세포 분석에 의한 단리된 나이브 인간 Vα24+ T 세포의 측정을 나타낸다. (b-l)은 iNKT 상에서의 TCR의 활성화를 나타낸다. HeLa 또는 HeLa-CD1d 세포를 α-GalCer 또는 α-GalCer 유사체 C16, C23, 7DW8-5, 7DW8-6 또는 C26과 함께 로딩한 다음, 나이브 Vα24+ T 세포에 첨가하였다. 하기 인산화 단백질의 세포내 수준을 측정하여 중앙 형광 강도로 표현하고, 총 유입 단백질의 양에 대하여 표준화하였다: (b) 포스포-CD3ε (포스포티로신), (c) 포스포-CREB (Ser-133), (d) 포스포-ERK1/2 (Thr-185/Tyr-187), (e) 포스포-p38 (Thr-180/Tyr-182), (f) 포스포-IκBα (Ser32), (g) 포스포-Lck, (h) 포스포-Lat, (i) 포스포-STAT3 (Ser727), (j) 포스포- STAT5 A/B (Tyr 694/699), (k) 포스포-Syk (포스포-티로신) 및 (l) 포스포- Zap-70 (포스포-티로신). *는 DMSO 대조군과 비교하여 p < 0.05인 것이고, #는 α-GalCer와 비교하여 p < 0.05인 것이다.
도 21(a-c)는 본 개시내용의 α-GalCer 유사체가 더 큰 세포 확대를 유도하고 CD1d-제한된 NKT 및 T 세포에 결합하는 더 큰 능력을 표시하는 방법을 나타낸다. BALB/c 마우스로부터의 비장은 비히클, α-GalCer 또는 지정된 α-GalCer 유사체 0.1 ㎍/마우스의 정맥내 (IV) 주사 후 72 시간에 수확하였다. (a) 마우스 NKT 또는 (b) T 세포의 백분율을 측정하였다. (c)는 CD1d-제한된 NKT 및 T 세포에 대한 α-GalCer 및 지정된 α-GalCer 유사체의 상이한 결합 친화성을 나타낸다.
도 22(a-d)는 본 개시내용의 α-GalCer 유사체에 대한 반응에서 2종의 NKT 하위세트의 CD1d-의존성 확대 및 NK 활성화를 나타낸다. (a-c)는 2종의 NKT 하위세트의 CD1d-의존성 확대를 나타낸다. BALB/c 야생형 (WT) 또는 CD1 KO 마우스로부터의 비장은 α-GalCer 또는 본 개시내용의 지정된 α-GalCer 유사체의 주사 후 72 시간에 수확하였다. 반응에 있어서 (b) WT 또는 (c) CD1 KO 마우스에서의 NKT 및 그의 2종의 하위유형 (I형 NKT 및 II형 NKT로 표시됨)의 총 갯수는 FACS에 의해 평가하였다. (d) NK의 CD1d 의존성-활성화. 반응에 있어서 WT (좌측 패널) 또는 CD1 KO (우측 패널) 마우스에서의 NK의 총 갯수의 확대는 FACS에 의해 평가하였다.
도 23(a-c)는 비히클, α-GalCer 또는 본 개시내용의 지정된 α-GalCer 유사체의 정맥내 (IV) 주사 후, 주사 후 0, 2, 18, 36, 48, 72 시간에서의 다양한 사이토킨 (a) IFN-γ, (b) IL-4의 마우스 혈청 수준 (pg/ml), 및 (c) IFN-γ/IL-4의 비율을 나타낸다 (이는 DMSO 대조군에 대해 표준화한 것임).
도 24(a-c)는 비히클, α-GalCer 또는 본 개시내용의 지정된 α-GalCer 유사체의 IV 주사 후 2 및 18 시간에서의 다양한 사이토킨/케모카인 (A) IFN-γ, (b) IL-4의 마우스 혈청 수준 (pg/ml), 및 (c) IFN-γ/IL-4의 비율을 나타낸다.
도 25는 α-GalCer 또는 본 개시내용의 지정된 α-GalCer 유사체로 IV 주사된 BALB/c 마우스의 상청액에서의 결과 (기준 사이토킨 농도에 대한 증가 배수)를 나타낸 표이다. 모든 사이토킨/케모카인은 18 시간에 피크에 도달하는 *로 표시된 것들을 제외하고는 주사 후 2 시간에 피크에 도달한다.
도 26(a-h)는, 도 23으로부터의 비히클, α-GalCer 또는 α-GalCer 유사체의 IV 주사에 대한 반응에서, (a) 유핵 세포의 총 갯수 및 비장 크기, (b) 성숙한 수상 세포를 비롯한 선천적 면역 세포의 집단, (c) 활성화된 NK, (d) 활성화된 NKT, (e) 활성 B 세포, (f) 활성 CD8+ T 세포, (g) 활성 CD4+ T 세포 및 (h) CD8+/CD4+ T 세포의 비율 (모두 DMSO로 표준화함)을 나타낸다.
도 27(a-c)는 비히클, α-GalCer 또는 본 개시내용의 지정된 α-GalCer 유사체의 피하 (SubQ) 주사 후, 주사 후 0, 2, 18, 36, 48, 72 시간에서의 다양한 사이토킨 (a) IFN-γ, (b) IL-4의 마우스 혈청 수준, 및 (c) IFN-γ/IL-4의 비율을 나타낸다 (이는 DMSO 대조군에 대해 표준화한 것임).
도 28(a-h)는, 도 27로부터의 비히클, α-GalCer 또는 α-GalCer 유사체의 SubQ 주사에 대한 반응에서, (a) 유핵 세포의 총 갯수 및 비장 크기, (b) 성숙한 수상 세포를 비롯한 선천적 면역 세포의 집단, (c) 활성화된 NK, (d) 활성화된 NKT, (e) 활성 B 세포, (f) 활성 CD8+ T 세포, (g) 활성 CD4+ T 세포 및 (h) CD8+/CD4+ T 세포의 비율 (모두 DMSO로 표준화함)을 나타낸다.
도 29(a-c)는 비히클, α-GalCer 또는 본 개시내용의 지정된 α-GalCer 유사체의 정맥내 (IM) 주사 후, 주사 후 0, 2, 18, 36, 48, 72 시간에서의 다양한 사이토킨 (a) IFN-γ, (b) IL-4의 마우스 혈청 수준, 및 (c) IFN-γ/IL-4의 비율을 나타낸다 (이는 DMSO 대조군에 대해 표준화한 것임).
도 30(a-h)는, 도 29로부터의 비히클, α-GalCer 또는 α-GalCer 유사체의 IM 주사에 대한 반응에서, (a) 유핵 세포의 총 갯수 및 비장 크기, (b) 성숙한 수상 세포를 비롯한 선천적 면역 세포의 집단, (c) 활성화된 NK, (d) 활성화된 NKT, (e) 활성 B 세포, (f) 활성 CD8+ T 세포, (g) 활성 CD4+ T 세포 및 (h) CD87CD4+ T 세포의 비율 (모두 DMSO로 표준화함)을 나타낸다.
도 31(a-k)는 사이토킨 동역학 및 비장세포 확대/활성화에 대한 비히클, α-GalCer 또는 본 개시내용의 지정된 α-GalCer 유사체의 투여 경로 (IV, SubQ 또는 IM)에 따른 효과를 나타낸다. (a)는 IFN-γ의 마우스 혈청 수준 (pg/ml)을 나타낸다. (b)는 IL-4의 마우스 혈청 수준 (pg/ml)을 나타낸다. (c)는 IFN-γ/IL-4의 비율 (log 10)을 나타낸다. (d)는 마우스 유핵 세포 (비장세포)의 총 갯수를 나타낸다. (e)는 비장에서의 성숙한 수상 세포를 비롯한 선천적 면역 세포의 집단을 나타낸다. (f)는 비장에서의 활성화된 NK의 집단을 나타낸다. (g)는 비장에서의 활성화된 NKT의 집단을 나타낸다. (h)는 비장에서의 활성 B 세포의 집단을 나타낸다. (i)는 비장에서의 활성 CD8+ T 세포의 집단을 나타낸다. (j)는 비장에서의 활성 CD4+ T 세포의 집단을 나타낸다. (k)는 CD8+/CD4+ T 세포의 비율을 나타낸다. 모든 분석은 비히클에 대해 표준화하여 수행되었다.
도 32(a-h)는 α-GalCer 유사체 C11 또는 비히클의 IV 투여에 대한 반응에서 비장세포 확대/활성화의 용량-반응을 나타낸다. (a)는 마우스 유핵 세포 (비장세포)의 총 갯수를 나타낸다. (b)는 비장에서의 성숙한 수상 세포를 비롯한 선천적 면역 세포의 집단을 나타낸다. (c)는 비장에서의 활성화된 NK의 집단을 나타낸다. (d)는 비장에서의 활성화된 NKT의 집단을 나타낸다. (e)는 비장에서의 단핵구 과립구 세포의 집단을 나타낸다. (f)는 비장에서의 활성 CD4+ T 세포의 집단을 나타낸다. (g)는 비장에서의 활성 CD8+ T 세포의 집단을 나타낸다. (h)는 비장에서의 활성 B 세포의 집단을 나타낸다. 모든 분석은 비히클에 대해 표준화하여 수행되었다.
도 33(a-d)는 (a) 비히클, α-GalCer 또는 본 개시내용의 다양한 α-GalCer 유사체의 IV 주사 후, 주사 후 0, 12, 24, 36, 48, 72 시간에서의 다양한 사이토킨 (b) IFN-γ, (c) IL-4의 마우스 혈청 수준, 및 (d) IFN-γ/IL-4의 비율을 나타낸다 (이는 비히클 대조군에 대하여 표준화한 것임).
도 34는 도 33으로부터의 α-GalCer 또는 본 개시내용의 표시된 α-GalCer 유사체로 IV 주사된 BALB/c 마우스의 상청액에서의 결과 (기저 사이토킨 농도에 대한 증가 배수)를 나타낸 표이다. 모든 사이토킨/케모카인은 주사 후 2 시간에서 정점을 나타냈고, 예외로, * 표시된 것은 18 시간에서 정점을 나타냈다.
도 35 (a-g)는 야생형 BALB/c (wt) 및 CD1d KO BALB/c (CD1KO) 마우스에 대한 비히클, α-GalCer 또는 본 개시내용의 표시된 α-GalCer 유사체의 IV 주사 후 2 및 18 시간에 다양한 사이토킨/케모카인의 혈청 수준 (pg/ml)을 나타낸다. (a) IFN-γ. (b) IL-4. (c) IFN-γ/IL-4 비율 (로그 10). (d) IL-10. (e) IL-12p70. (f) KC. (g) MCP-1.
도 36(a-i)는 비히클, α-GalCer 또는 본 개시내용의 표시된 α-GalCer 유사체의 IV 주사 후 C57BL/6 마우스 내 지라세포의 확대/활성화를 나타내고, (g-i)는 비히클, α-GalCer 또는 본 개시내용의 표시된 α-GalCer 유사체의 IV 주사 후 두 NKT 서브세트 (C57BL/6 야생형 (Wt) 및 CD1 KO 마우스)의 CD1d-의존성 활성화를 나타낸다. (a)는 C57BL/6 마우스 유핵 세포 (지라세포)의 총 수를 나타낸다. (b)는 성숙한 수상 세포의 집단을 나타낸다. (c)는 활성화 NK의 집단을 나타낸다. (d)는 활성 CD4+ T 세포의 집단을 나타낸다. (e)는 활성 CD8+ T 세포의 집단을 나타낸다. (f)는 DMSO로 표준화된 CD8+/CD4+ T 세포의 비율을 나타낸다. (g)는 유세포분석기에 의한 Wt 마우스에서의 NKT 세포의 측정 (좌측 하단 패널), NKT의 총 수 (좌측 상단 패널), 및 유형 II NKT (우측 상단 패널) 및 유형 I NKT (우측 하단 패널)를 포함하는 그의 두 하위유형의 총 수를 나타낸다. (h)는 CD1 KO 마우스에서의 NKT의 총 수를 나타낸다. (i)는 Wt 마우스에서 Treg 세포의 총 수를 나타낸다. 모든 분석은 비히클에 대하여 표준화에 의해 수행하였다.
도 37(a-b)는 본 개시내용의 α-GalCer 유사체가 폐암을 갖는 마우스의 생존을 어떻게 연장시킬 수 있는지 보여준다. C57BL/6 마우스는 마우스 폐암 세포 (TC-1)를 IV 접종한 후, 대조군, α-GalCer 또는 본 개시내용의 표시된 α-GalCer 유사체로 4 주 동안 주 2 회 치료하였다. (a)는 I 군 α-GalCer 유사체의 시험으로부터의 결과를 나타낸다. (b)는 II 군 α-GalCer 유사체의 시험으로부터의 결과를 나타낸다. (c)는 III 군 α-GalCer 유사체의 시험으로부터의 결과를 나타낸다. (d)는 IV 군 α-GalCer 유사체의 시험으로부터의 결과를 나타낸다. 폐암을 갖는 마우스의 카플란 마이어 생존 곡선 (좌측 패널) 및 체중 변화 (우측 패널)를 나타내었다. 대조군은 종양 접종하지 않은 마우스이다.
도 38(a-b)는 α-GalCer 유사체 C11 또는 대조군으로 치료하고 TC-1 세포로의 종양 접종 후 16 일 째에 희생시킨 마우스의 폐의 표면 상 (a), α-GalCer 유사체 C11 또는 대조군으로 치료하고, 마우스 유방암 세포 (4T-1)로의 SubQ 종양 접종 후 16 일 째에 희생시킨 마우스의 피하 종양 (b)에서의 종양 결절 및 크기를 보여준다.
도 39(a-b)는 마우스 유방암 세포 4T-1을 피하 접종하고, 접종 후 3 일에 대조군, α-GalCer 또는 본 개시내용의 표시된 α-GalCer 유사체로 (a) IV 주사 또는 (b) SubQ 주사에 의해 4 주 동안 주 2 회 치료한 마우스의 카플란 마이어 생존 곡선 (좌측 패널) 및 종양 성장 (우측 패널)을 나타낸다.
도 40은 α-GalCer (C1)의 IV 또는 SubQ 주사에 의해 치료한, 유방암을 갖는 마우스의 카플란 마이어 생존 곡선을 나타낸다. C1의 SubQ 전달은 유방암을 갖는 마우스의 생존 연장 면에서 IV 전달보다 더욱 효과적이다.
도 41 (a-c)은 투여 용량에 의한 본 개시내용의 α-GalCer 유사체의 치료학적 항암 프로토콜의 최적화를 나타낸다. 마우스 폐암 세포 (TC-1)를 IV 접종하고, 이어서 α-GalCer 또는 α-GalCer 유사체 7DW8-5 또는 C26을 다양한 투여량으로 4 주 동안 주 2 회 또는 주 1 회 치료한 후의, C57BL/6 마우스의 체중 변화 (우측 패널) 및 카플란 마이어 생존 곡선 (좌측 패널)을 나타낸다. (a) α-GalCer. (b) α-GalCer 유사체 7DW8-5. (c) α-GalCer 유사체 C26.
도 42(a-c)는 경로 및 빈도를 다양화하는 것에 의한 본 개시내용의 α-GalCer 유사체의 치료학적 항암 프로토콜의 최적화를 나타낸다. (a)는 마우스 유방암 세포, 4T-1을 SubQ 접종하고 이어서 접종 후 3 일에 비히클, α-GalCer 또는 본 개시내용의 표시된 α-GalCer 유사체로 IV 또는 SubQ 경로에 의해 4 주 동안 주 2 회 치료한 후 BALB/c 마우스의 종양 부피 (mm3) (우측 패널) 및 카플란 마이어 생존 곡선 (좌측 패널)을 나타낸다. (b)는 마우스 폐암 세포, TC-1을 IV 접종하고 이어서 접종 후 3 일에 비히클, α-GalCer 또는 본 개시내용의 표시된 α-GalCer 유사체로 IV 또는 SubQ 경로에 의해 4 주 동안 주 2 회 치료한 후, C57BL/6 마우스의 체중 변화 (우측 패널) 및 카플란 마이어 생존 곡선 (좌측 패널)을 나타낸다. (c)는 마우스 폐암 세포, TC-1을 IV 접종하고 이어서 비히클 또는 α-GalCer 유사체 C16으로 IV 경로에 의해 4 주 동안 주 2 회 또는 주 1 회 치료한 후, C57BL/6 마우스의 체중 (우측 패널) 및 카플란 마이어 생존 곡선 (좌측 패널)에 대한 투여 빈도의 영향을 나타낸다.
도 43(a-b)은 본 개시내용의 다양한 α-GalCer 유사체의 항암 효능의 평가를 나타낸다. C57BL/6 마우스를 마우스 폐암 세포, TC-1로 IV 접종시키거나 또는 마우스 흑색종, B16 세포로 SubQ 접종하고, 이어서 비히클, α-GalCer 또는 본 개시내용의 표시된 α-GalCer 유사체로 4 주 동안 주 1 회 치료하였다. (a)는 카플란 마이어 생존 곡선을 나타낸다. (b)는 종양 부피 (mm3) 성장 곡선을 나타낸다.
도 44(a-b)는 (a) 폐암 세포 (TC-1-GRP-루시페라제) 또는 (b) 유방암 세포(4T-1-GFP-루시페라제)로 SQ 접종하고, 이어서 비히클, α-GalCer 또는 본 개시내용의 표시된 α-GalCer 유사체로 4 주 동안 주 1 회 치료한 C57BL/6 마우스에서의 종양 성장의 실시간 평가를 나타낸다.
도 45(a-h)는 본 개시내용의 TH1-편재된 α-GalCer 유사체가 폐 및 흑색종 종양에서 더 종양 침윤성 림프구를 유발함을 나타낸다. (a-d)는 폐암 세포 (TC-1)에서의 종양 침윤성 림프구를 나타낸다. C57BL/6 마우스를 비히클, α-GalCer 또는 α-GalCer 유사체 C23, C8-5 또는 C34로 3 주 동안 주 1 회 0.1 μg/마우스로 치료하였다. (a)는 CD3+ 세포의 집단을 나타낸다. (b)는 CD8 T 세포의 집단을 나타낸다. (c)는 NK 세포의 집단을 나타낸다. (d)는 NKT의 집단을 나타낸다. 모든 분석은 비히클에 대한 표준화에 의해 수행하였다. (e-h)는 흑색종 세포에서의 종양 침윤성 림프구를 나타낸다. C57BL/6 마우스를 비히클, α-GalCer 또는 α-GalCer 유사체 C23, C8-5 또는 C34로 3 주 동안 주 1 회 0.1 μg/마우스로 치료하였다. (e)는 CD3+ 세포의 집단을 나타낸다. (f)는 CD8 T 세포의 집단을 나타낸다. (g)는 NK의 집단을 나타낸다. (h)는 NKT의 집단을 나타낸다. 모든 분석은 비히클에 대한 표준화에 의해 수행하였다.
도 46(a-b)는 파상풍톡소이드 (TT) - 단백질 백신에 반응하는 항체에 대한 알럼, α-GalCer 및 α-GalCer 유사체 C11의 아주반트 효과를 나타낸다. (a) 마우스를 통상의 아주반트 알럼, α-GalCer 또는 α-GalCer 유사체 C11의 존재 또는 부재 하에 0 일 째 (첫번째 백신접종)에 및 28 일 째 (4 주-두번째 백신접종)에 TT 백신접종하였다. 항-TT-특이적 항체의 측정을 위하여 혈정을 매주 수확하였다. (b)는 두번째 백신접종 20 주 후, 지연된 항원 부스트(boost)에 대한 통상의 아주반트 알럼, α-GalCer 및 α-GalCer 유사체 C11의 효과를 나타낸다.
도 47은 세번째 면역화 후 2 주에 H1N1 바이러스 균주의 M2 (M2e) 단백질의 세포외 도메인을 함유하는 펩티드에 대한 통상의 아주반트 알럼, α-GalCer 및 본 개시내용의 다양한 α-GalCer 유사체의 아주반트 효과를 나타낸다. BALB/c 마우스를 0, 3 및 6 주째에 α-GalCer 및 다양한 α-GalCer 유사체의 존재 또는 부재 하에 5 또는 45 μg의 M2e 펩티드로 백신접종하였다.
도 48(a-c)는 조류 인플루엔자 바이러스의 전장 H5의 컨센서스 서열을 포함하는 DNA 플라스미드인 pHA로 면역화된 마우스 상에서의 α-GalCer (C1)의 아주반트 효과를 나타낸다. (a) 마우스를 0 및 3 주째에 C1의 부재 또는 존재 하에 5 내지 45 μg의 pHA로 면역화시켰다. (b) 마우스를 C1의 부재 또는 존재 하에 저용량의 pHA 백신으로 면역화시켰다. (c)는 C1의 부재 또는 존재 하 H5 DNA 백신 후 2 주에 베트남 외피 인플루엔자 균주 NIBRG-14의 20 LD5O으로의 바이러스성 챌린지에 대한 보호를 나타낸다.
도 49(a-c)는 마우스를 C1 또는 본 개시내용의 표시된 α-GalCer 유사체의 존재 또는 부재 하에 pHA로 면역화시킨 후의 항-HA-특이적 IgG 항체의 유도를 나타낸다. (a)는 0.2 μg pHA로의 면역화 후 마우스에서의 항-HA 특이적 IgG 항체 (AY3)의 역가를 나타낸다. (b)는 0.2 μg pHA로의 면역화 후 마우스에서의 항-HA 특이적 IgG 항체 (AY4)의 역가를 나타낸다. (c)는 바이러스성 챌린지 후 마우스 생존 백분율을 나타낸다.
도 50 (a-b)은, 마우스를 pHA (C1 함유 또는 무함유) 또는 본 개시내용의 지정 α-GalCer 유사체로 면역화시킨 후의 항-HA-특이적 IgG 항체의 유도를 나타낸다. (a)는 pHA 0.5 ㎍ 및 본 개시내용의 지정 α-GalCer 유사체를 사용한 면역화 후의 항-HA 특이적 IgG 항체 (AY4)의 역가를 나타낸다. (b)는 바이러스 투여 후 생존율(％)을 나타낸다.
도 51 (a-b)은 (a) pHA 0.1 ㎍ 또는 (b) pHA 0.2 ㎍, 및 본 개시내용의 지정 α-GalCer 유사체를 사용한 면역화 후의 항-HA 특이적 IgG 항체 (AY5)의 마우스 역가를 나타낸다.
도 52 (a-b)는 (a) pHA 0.1 ㎍ 또는 (b) pHA 0.2 ㎍, 및 본 개시내용의 지정 α-GalCer 유사체 (0.1 ㎍ 또는 1 ㎍)를 사용한 면역화 후의 항-HA 특이적 IgG 항체 (AY6)의 마우스 역가를 나타낸다.
도 53 (a-d)은 α-GalCer 또는 본 개시내용의 지정 α-GalCer 유사체에 의한 항-HA-특이적 IgG 항체의 유도를 나타낸다. α-GalCer 또는 지정 α-GalCer 유사체 (pHAc 함유)를 사용하여 근육내 전기전달에 의해 BALB/c 마우스를 백신접종하고, 4주 후 동일 제제를 사용하여 1회 부스팅하였다. 제2 백신접종 2주 후, 혈액 샘플을 수집하고, ELISA에 의해 항-HAc-특이적 IgG 항체 역가에 대해 시험하였다. (a)는 항-HA 특이적 IgG 항체 (AY3)의 역가를 나타낸다. (b)는 항-HA 특이적 IgG 항체 (AY4)의 역가를 나나탠다. (c)는 항-HA 특이적 IgG 항체 (AY5)의 역가를 나타낸다. (d)는 항-HA 특이적 IgG 항체 (AY16)의 역가를 나타낸다.
도 54 (a-b)는 (a) HA-특이적 IFN-γ 생성 세포 및 (b) HA-특이적 펩티드 반응 세포를 나타낸다. pHAc, 및 α-GalCer 또는 본 개시내용의 지정 α-GalCer 유사체를 사용하여 근육내 전기전달에 의해 BALB/c 마우스를 백신접종하고, 3주 후 동일 제제를 사용하여 1회 부스팅하였다. 비장세포를 HA-특이적 펩티드 (9-mer)와 함께 배양하고, 1일 후 스폿을 측정하였다.
도 55는 바이러스 투여에 대한 보호를 나타낸다. pHAc, 및 α-GalCer 또는 본 개시내용의 지정 α-GalCer 유사체를 사용하여 근육내 전기전달에 의해 BALB/c 마우스를 백신접종하고, 3주 후 동일 제제를 사용하여 1회 부스팅하였다. 제2 백신접종 2주 후, 마우스에게 200 LD50의 NIBRG-14 바이러스를 투여하고, 마우스 생존을 모니터링하였다.
도 56 (a-b)은 단일 용량 백신접종의 효과를 나타낸다. pHAc (2 ㎍), 및 α-GalCer 또는 본 개시내용의 지정 α-GalCer 유사체 (2 ㎍)를 사용하여 근육내 전기전달에 의해 BALB/c 마우스를 백신접종하였다. (a) 3주 후에 혈액 샘플을 수집하고, 항-HAc-특이적 IgG 항체 역가에 대해 시험하였다. (b) 초회 항원자극 3주 후, 마우스에게 200 LD50의 NIBRG-14 바이러스를 투여하고, 생존을 모니터링하였다.
도 57 (a-b)은 탄수화물 항원에 대한 α-GalCer 또는 본 개시내용의 지정 α-GalCer 유사체의 아주반트 효과를 나타낸다. α-GalCer 또는 지정 α-GalCer 유사체를 사용하여 IM 주사에 의해 BALB/c 마우스를 백신접종하고, globo H-DT와 혼합하고, 2주 간격으로 2회 부스팅하였다. 제3 백신접종 2주 후, 혈액 샘플을 수집하고, (a) 항-globo H-특이적 IgG 항체 및 (b) 항-globo H-특이적 IgM 항체 생성에 대해 시험하였다.
도 58 (a-b)은, BALB/c 마우스를 α-GalCer 또는 본 개시내용의 지정 α-GalCer 유사체로 복강내 (IP) 경로를 통해 (a) FLU-A 바이러스 혈청형 H1N1 (WSN) 바이러스 투여 30분 후에 처리하기 시작한 경우, 및 H1N1 바이러스 투여 2주 전에 처리하기 시작한 경우의 생존율을 나타낸다.
도 59 (a-b)는, H1N1 (WSN)로 감염되고, α-GalCer 또는 본 개시내용의 지정 α-GalCer 유사체로 (a) 고용량의 H1N1 (WSN) 바이러스를 사용한 바이러스 투여 2주 전에 출발하여, 그리고 (b) 비강내 경로를 통해 처리한 BALB/c 마우스의 누적 생존율을 나타낸다.
도 60 (a-b)은 시험관내 개의 원위세뇨관 (MDCK; Madin-Darby canine kidney) 세포의 세포병변 효과 (CPE)를 나타낸다. MDCK 세포를 비히클, α-GalCer, 또는 α-GalCer 유사체 C13, C14 또는 C16 중 하나 (10 ㎍/ml)로 4시간 동안 전처리한 후, FLU-A 바이러스 혈청형 H1N1 (WSN)을 사용하여 10TCID50으로 감염시켰다. (a)는 시험관내 당지질 처리 후의 생존 바이러스 역가 (log10)를 나타내고, (b)는 감염 48시간 후의 MDCK 세포의 바이러스 역가를 나타낸다.
도 61 (a-b)은 스핑고모나스 캅슐라타(Sphingomonas capsulata)로 감염된 마우스에서 (a) 100 ㎍/kg 또는 (b) 50 ㎍/kg으로 처리된 α-GalCer 또는 본 개시내용의 지정 α-GalCer 유사체의 항박테리아 효능을 나타낸다.
도 62 (a-b)는 클렙시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae)로 감염된 마우스에서의 α-GalCer 또는 본 개시내용의 지정 α-GalCer 유사체의 항박테리아 효능을 나타낸다. C1 및 C14는 주사 후 (a) 마우스 폐 및 (b) 간에서 박테리아 부하를 현저하게 감소시킬 수 있다.
도 63은, C23 및 C34를 사용하여 50 ㎍/kg으로 처리한 군의 (폐에서의) CFU 수가 비처리 군과의 비교시 유의함을 나타낸다.
도 64 (a-b)는 α-GalCer (C1), 및 C3, C9, C11, C14, C16, C17, C23, 7DW8-5 (aka, C8-5) 및 C34를 비롯한 본 개시내용의 다양한 α-GalCer 당지질 (또한 유사체로서 지칭됨)의 화학 구조를 나타낸다.
도 65는 스핑고모나스 캅슐라타로 감염된 마우스에서 100 ㎍/kg으로 처리된 당지질의 항박테리아 효능을 나타낸다. 각각의 처리 군에서 감염 24시간 후에 측정된 마우스 간의 CFU 값을 점으로 표시하였다. 각각의 처리 군의 평균 CFU 값을 짧은 횡선으로 나타냈다. 분산분석을 이용한 통계 분석에서, C1, C11, C14 및 C16으로 처리한 군에서의 간의 박테리아 부하가 현저하게 감소된 것으로 밝혀졌다. PBS 대조군으로부터 유의한 차이를 갖는 군을 별표로 표시하였다 ("*": P<0.05, "**": P<0.01).
도 66 (a-b)은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 대퇴 감염 모델에서의 선택된 당지질의 항박테리아 효능을 나타낸다. 감염 3시간 후 IP 주사에 의해 150 ㎍/kg으로 투여된 당지질의 항박테리아 효능을 발광 에스. 아우레우스 (S. aureus) Xen29로의 감염 48시간 후에 영상 분석으로 평가하였다. (a) 감염 48시간 후에 다양하게 처리된 마우스의 영상을 취하였다. (b) 감염 48시간 후에 측정한 각가의 마우스의 상대 발광 (RLU) 값을 개별 기호로 플로팅하고, 각각의 처리 군의 평균 값을 횡선으로 나타냈다 (*: p<0.05).
도 67은 JEV 감염에 대한 숙주 보호의 당지질 증강을 나타낸다. 7주령의 야생형 C57BL/6 마우스에게 각각의 군에 대해 바이러스 투여 1일 전에 화합물 C1, 7DW8-5, C23, C34 또는 용매 1 ㎍을 복강내 (IP) 주사하였다. 5x105 PFU의 JEV (RP-9 균주)를 사용하여 마우스를 IP 감염시키고, 동시에 PBS 30 ㎕를 뇌내 주사하였다. 바이러스 감염 1일 후, 마우스를 C1, 7DW8-5, C23, C34 또는 용매 1 ㎍으로 IP 부스팅하였다. 마우스를 25일 동안 매일 모니터링하고, 생존율(％)을 나타냈다. 각각의 실험 군에는 14마리의 마우스가 포함되었다. 프리즘 (Prism) 소프트웨어 통계 분석과 로그 순위 검정을 이용하여 생존 곡선 비교를 수행하고, 용매 대조군과 비교시 P < 0.05를 "*"로 나타냈다.
도 68 (a-c)은 숙주의 선천적 및 후천적 면역 성분에 있어서의 JEV 감염에 대한 보호를 유발하기 위한 당지질 의존도를 나타낸다. Stat-1 (a), 이뮤노글로불린 μ-사슬 (b) 또는 CD8α-사슬 (c)이 결핍된 7주령의 면역결핍 마우스에게 2-용량 프로토콜을 이용하여 도 67에 기재된 바와 같이 C34, 7DW8-5 또는 용매를 투여하였다. Stat-1 녹아웃 마우스에게 0.1 PFU의 JEV (RP-9 균주)를 복강내 투여하였다. Igμ-사슬 녹아웃 마우스 및 CD8α-사슬 녹아웃 마우스에게 도 67에 기재된 바와 같이 투여하였다. 마우스를 25일 동안 매일 모니터링하였다. 생존율(％)을 나타내고, 각각의 실험 군에서의 마우스의 수를 각각의 패널에 대한 범례에 나타냈다.
도 69 (a-b)는 최고의 보호 효과를 나타낸 2-용량 프로토콜 (JEV 감염 1일 전 및 1일 후)의 결과를 나타낸다. 당지질 C34 (a) 또는 7DW8-5 (b)를 도 67에 기재한 바와 같이 2-용량 프로토콜로 [-1일 및 +1일], 또는 바이러스 감염 1일 전 [-1일], 당일 [O일] 또는 1일 후 [+1일]에 1일 단 1회로 7주령의 야생형 C57BL/6 마우스에게 투여하였다. 도 67에 기재된 바와 같이 마우스에게 투여하고, 모니터링하였다. 생존율(％)을 나타내고, 각각의 실험 군에서의 마우스의 수를 각각의 패널에 대한 범례에 나타냈다.
도 70 (a-b)은 다양한 시간 및 용량으로 C34를 투여받은 인플루엔자 감염 마우스의 생존 프로파일을 나타낸다. Blab/C 마우스를 비강내 경로에 의해 10 LD50의 인플루엔자 바이러스로 감염시켰다. 마우스를 인플루엔자 감염에 대한 -1일 및 +1일의 양일에 2회의 IP 주사를 받은 4개의 군으로 분류하였다. 다양한 처리 군의 IP 주사량 (1 ㎍/마우스 C34 또는 PBS 비히클) 및 주사 시간에 대한 연구 프로토콜을 (a)에 기재하였다. 다양한 처리 군의 생존 곡선을 나타냈다 (b).
도 71은 뮤린 대퇴-상처 감염 모델의 감염 청소율에 대한 C34 투여 시간의 효과를 나타낸다. 좌측 대퇴를 발광 에스. 아우레우스로 감염시킨 마우스를 비히클 대조군, 및 감염 후 0 및 6시간에 C34를 투여받은 2개의 군으로 분류하였다. 감염 48시간 후의 마우스 영상을 얻었다. 발광 박테리아 감염의 영상 및 상대 발광 단위를 도 66과 유사하게 나타냈다 ("**": p<0.01로 유의함).
도 72는 에스. 캡슐라타 감염을 억제하는데 있어서 선택된 당지질의 효능을 도시하는 표이다.
도 73(A-B)는 pCHA5 +/- 당지질 백신의 2회 투여량의 근육내 주사에 의한 조류 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 면역 보호를 도시한다. 혈청을 수집하여, ELISA에 의해 HA-특이적 항체 적정 (A)을 시험하였고, 마우스를 200 LD50의 NIBRG-14 바이러스로 챌린징하여, 생존 (B)에 대해 모니터링하였다.
도 74(A-C)는 아주반트로서 당지질과 함께 또는 없이 pCHA5의 단일 IM 투여 이후 면역 반응 및 마우스 생존을 도시한다. IM 경로를 통해 pCHA5 (50 ㎍) +/- 당지질 (2 ㎍) 또는 명반으로 백신화한지 3 주 후에, 혈청을 수집하여, ELISA에 의해 HA-특이적 항체 적정 (A)을 시험하였다. 그와 동시에, 마우스를 희생시키고, 비장세포를 ELISPOT 검정 (B)을 위해 수확하였다. 또 다른 군의 마우스를 200 LD50의 NIBRG-14 바이러스로 챌린징하여, 생존 (C)에 대해 모니터링하였다.
도 75(A-C)는 pCHA5 및 pCHA5-ll 백신에 대한 당지질의 아주반트 효과의 비교를 도시한다. IM/EP 경로를 통해 제0주째 및 제3주째에 pCHA5 또는 pCHA5-ll (30 ㎍) +/- 당지질 (2 ㎍)로의 백신화를 위해 추가 주사한지 2 주 후에, 혈청을 수집하여, ELISA에 의해 HA-특이적 항체 적정 (A)을 시험하였고, pCHA5 (B) 및 pCHA5-ll (C)로 백신화한 마우스를 E319 바이러스로 챌린징하여, 생존에 대해 모니터링하였다.
도 76(A-D)는 마우스에서 HA-특이적 항체 생산 및 면역 보호에 대한 pCHA5-ll 및 C34의 투여량 효과를 도시한다. IM 경로를 통해 아주반트로서 C34 (0.5, 1, 2, 4 ㎍)와 함께 또는 없이 단일 투여량의 pCHA5-ll (100, 75, 50 ㎍)로 백신화한지 3 주 후에, 혈청을 수집하여, ELISA에 의해 HA-특이적 항체 적정 (A)을 시험하였다. 그와 동시에, 마우스를 희생시키고, 비장세포를 ELISPOT 검정 (B)을 위해 수확하였다. 도 76C는 상이한 투여량의 pCHA5-ll 및 2 ㎍의 C34 아주반트로 처리한 마우스의 생존을 도시한다. 도 76D는 100 ㎍의 pCHA5-ll 및 다양한 투여량의 C34로 처리한 마우스의 생존을 도시한다.
도 77(A-D)는 다양한 HA-가성형(pseudotyped) 바이러스에 대항하는 중화 항체 생산에 대한 C34의 아주반트 효과를 도시한다. 제0주째 및 제3주째에 2 ㎍의 C34를 함유하는 PBS에 용해된 0.2 ㎍의 pCHA5로 IM/EP 백신화한 후, TK (A), VN1 194 (B), ID05 (C) 및 안후이05 (D)에 대한 HA-가성형 바이러스 중화의 50％ (ID50)를 제공하는 혈청 희석액에 대한 비선형 회귀 분석을 도시한다. p의 값은 대입의 비교였다. * p < 0.05이며, C34-아주반트 군과 pCHA5 단독 군의 비교시 통계적 유의성을 제공하였다.
도 78(A-L)은 아주반트로서 C34와 함께 또는 없이 pCHA5를 수용한 마우스에서 혈청 사이토킨 발현 프로파일을 도시한다. IM/EP 경로를 통해 제0주째 및 제3주째에 C34와 함께 또는 없이 0.2 ㎍의 pCHA5로 백신화한 후 혈청 농도를 IL-2 (A), IL-5 (B), IL-13 (C), RANTES (D), MIP-1α (E), MIP-1β (F), KC (G), IL-1β (H), IL-17 (I), IL-12p40 (J), G-CSF (K) 및 IFN-γ (L)에 대해 도시된다.
도 79(A-D)는 항혈청의 중화 능력이 단일 투여량 근육내 주사를 통해 C34에 의해 유도됨을 도시한다. 2 ㎍의 C34를 함유하는 PBS에 용해된 50 ㎍의 pCHA5-ll로 백신화한지 3 주 후에 수행된 HA-가성형 바이러스 중화 검정의 결과는 안후이05 (A), TK05 (B), ID05 (C) 및 VN1194 (D)에 대해 도시된다. p의 값은 대입의 비교였다. * p < 0.05이며, C34-아주반트 군과 pCHA5-ll 단독 군의 비교시 통계적 유의성을 제공하였다.
도 80은 본 개시내용의 C34 α-GalCer 유사체에 대한 합성 반응식을 도시한다. 도시된 시약 및 조건은 다음과 같다: (a) 2-메톡시프로펜, CSA, DMF, 83％; (b) Ph3CCl, 피리딘. 77％; (c) C13H27 +PPh3 -Br, LHMDS, THF 75％; (d) H2, Pd(OH)2, EA, 90％; (e) Tf2O, 2,6-루티딘, TAIGA, CH2Cl2; (f) TFA/TFAA, CH2Cl2, 두 단계 63％; (g) Tf2O, Me2S, 2-Cl-피리딘, MS4A, CH2Cl2, 60％; (h) PPh3, 피리딘/H2O; (i) EDC, HBTU, TEA, CH2Cl2, 두 단계 88％; (j) NaOMe, MeOH/CH2Cl2; (k) AcOH(수성); (I) H2, Pd(OH)2, MeOH/CHCl3, 세 단계 40％.
본 개시내용의 상세한 설명
다른 의미가 아래에 설명되지 않는다면, 모든 과학 용어는 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 그의 통상적인 의미로 주어진다. 상충되는 경우, 본 명세서에서 설명된 정의가 적용되어야 한다.
본원에 사용된 용어 "지질"은 세포 신호전달 경로에 참여하는 임의의 지용성 (친유성) 분자를 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "당지질"은 세포 인식을 위한 마커의 역할을 하는 탄수화물-부착된 지질을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "알파-갈락토실 세라미드" 및 "α-GalCer"은 T 헬퍼 (TH)1 및 TH2 사이토킨 둘 다를 생산하기 위해 천연 킬러 T 세포를 자극하는 당지질을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "글리칸"은 다당류 또는 올리고당류를 나타낸다. 글리칸은 또한 당접합체의 탄수화물 부분, 예컨대 당단백질, 당지질, 글리코펩티드, 글리코프로테옴, 펩티도글리칸, 지다당류 또는 프로테오글리칸을 나타내기 위해 본원에서 사용된다. 글리칸은 통상적으로 단당류 사이의 O-글리코시드 연결만으로 이루어진다. 예를 들어, 셀룰로스는 베타-1,4-연결된 D-글루코스로 이루어진 글리칸 (또는 더욱 구체적으로는 글루칸)이고, 키틴은 베타-1,4-연결된 N-아세틸-D-글루코사민으로 이루어진 글리칸이다. 글리칸은 모노사카라이드 잔기의 단독중합체 또는 이종중합체일 수 있고, 선형 또는 분지형일 수 있다. 글리칸은 당단백질 및 프로테오글리칸에서와 같이 단백질에 부착된 것으로 발견될 수 있다. 이들은 일반적으로 세포의 외부 표면에서 발견된다. O-연결된 및 N-연결된 글리칸은 진핵생물에서 매우 흔하지만, 원핵생물에서도 덜 흔하지만 발견될 수 있다. N-연결된 글리칸은 세쿠온(sequon)에서 아스파라긴의 R-기 질소 (N)에 부착된 것으로 발견된다. 세쿠온은 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr 서열이며, 여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다
본원에 사용된 용어 "당단백질"은 글리칸(들)에 의해 공유적으로 개질된 단백질을 나타낸다. 네가지 유형의 당단백질이 있다: 1) N-연결된 당단백질, 2) O-연결된 당단백질 (뮤신), 3) 글루코사미노글리칸 (GAG, 프로테오글리칸으로도 불림), 4) GPI-앵커. 대부분의 당단백질은 구조적 미세-불균일성 (여러 상이한 글리칸 구조체가 동일한 글리코실화 부위 내에서 부착됨) 및 구조적 거대-불균일성 (여러 부위 및 유형의 글리칸이 부착됨)을 갖는다.
본원에 사용된 용어 "유사체"는 그의 구조가 또다른 화합물과 관련있지만, 그의 화학적 및 생물학적 특성은 매우 상이할 수 있는 화합물, 예를 들어 약물을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "항원"은 면역 반응을 유발할 수 있는 임의의 물질로서 정의되다.
본원에 사용된 용어 "병원체"는 그의 숙주에서 질환 또는 질병을 초래하는 생물 작용제이다. 신체는 인간 면역계의 형태로 일부 공통된 병원체 (예컨대 뉴모시스티스(Pneumocystis))에 대한 여러 천연 방어를 함유한다.
본원에 사용된 용어 "면역원"은 항원, 예컨대 DNA 백신의 생산을 유도할 수 있는 항원 또는 물질을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "면역원성"은 면역원, 항원 또는 백신이 면역 반응을 자극하는 능력을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "면역요법"은 예방적 및/또는 치료적 목적을 달성하기 위해 면역계를 조절하는 개념을 기초로 하는 여러 치료 방법을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "CD1d"는 다양한 인간 항원-제시 세포의 표면에서 발현되는 당단백질의 CD1 (분화 1의 클러스터) 패밀리의 구성원을 나타낸다. 지질 항원을 제시하는 CD1d는 천연 킬러 T 세포를 활성화시킨다. CD1d는 당지질 항원이 결합하는 깊은 항원-결합 홈을 갖는다. 수지상 세포에서 발현되는 CD1d 분자는 당지질에 결합할 수 있고 그를 제시할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "후천성 면역계"는 병원성 챌린지를 제거하는 고도로 전문화된 전신 세포 및 프로세스를 나타낸다. 후천성 면역계의 세포는 림프구로 불리는 일종의 백혈구이다. B 세포 및 T 세포는 주요 유형의 림프구이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "T 세포" 및 "T"는, 세포-매개 면역에서 중추적 역할을 하는, 림프구로서 공지된 백혈구의 하나의 군을 지칭한다. T 세포는 T 세포 수용체 (TCR)라고 불리는 이들의 세포 표면 상의 특정 수용체의 존재로 인해 다른 림프구 유형, 예컨대 B 세포 및 NK와 구별될 수 있다. 각각 특징적인 기능을 갖는 T 세포의 여러 다양한 하위세트가 기재된 바 있다. 헬퍼 T (TH) 세포는 적응성 면역계의 "중간자"이다. 이들은 일단 활성화되면, 빠르게 분할되어, 면역 반응을 조절하거나 "돕는" 사이토킨이라 불리는 작은 단백질을 분비한다. 수신된 사이토킨 신호에 따라, 이들 세포는 TH1, TH2, TH17 또는 다양한 사이토킨을 분비하는 다른 하위세트 중 하나로 분화한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항원-제시 세포" (APC)는 그의 표면 상에서 주요 조직적합성 복합체 (MHC)와 복합체화된 외래 항원을 나타내는 세포를 지칭한다. T-세포는 그의 TCR을 이용하여 상기 복합체를 인식할 수 있다. APC는 전문적 카테고리 또는 비-전문적 카테고리의 두가지 카테고리로 나뉜다. 수상 세포 (DC)는 전문적 카테고리에 속하고, CD1과 관련하여, T 세포에게 항원을 제시할 수 있다. 예시적 실행에서, 본 개시내용의 방법에서 이용되는 DC는 여러 DC 하위세트 중 임의의 것일 수 있고, 이는 하나의 실행에서는 림프성, 또는 또 다른 실행에서는 골수성 골수 전구체로부터 분화된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "비감작(
) 세포"는, 아직 특정 병원체를 인식하도록 특수화되지 않은 비분화 면역계 세포, 예를 들어 CD4 T-세포를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "천연 킬러 세포" 및 "NK"는 바이러스 및 다른 세포내 병원체에 대한 본유의 숙주 방어에 기여하도록 인터페론에 의해 활성화된 일종의 림프계 세포를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "천연 킬러 T 세포" (NKT)는 종래의 T 및 NK 둘다와 특징 / 수용체를 공유하는 T 세포의 하위세트를 지칭한다. 많은 이들 세포는, 자가- 및 외래 지질 및 당지질에 결합되는 항원-제시 분자, 비-다형성(non-polymorphic) CD1d 분자를 인식한다. NKT의 TCR은 CD1d 분자에 의해 제시된 (샤페론화된(chaperoned)) 당지질 항원을 인식할 수 있다. NKT의 주요 반응은 자극 후 IL-4, IFN-γ 및 IL-10을 비롯한 사이토킨의 빠른 분비이고, 따라서 이는 다양한 면역 반응 및 병리학적 과정에 영향을 미친다. NKT는 균일 집단 또는 불균일 집단일 수 있다. 하나의 예시적 실행에서, 집단은, 또한 다량의 IL-4 및 IFN-γ를 생산할 수 있고, 예를 들어 다양한 TCR을 발현하는 CD1d-반응성 비-불변 T 세포인 인간 및 마우스 골수 및 인간 간 T 세포 집단을 포함할 수 있는 "비-불변 NKT"일 수 있다. 가장 잘 알려진 CD1d-의존성 NKT의 하위세트는 불변 TCR-알파 (TCR-α) 쇄를 발현한다. 이들은 유형 I 또는 불변 NKT (iNKT)로서 언급된다. 이들 세포는 인간 (Vα24i NKT) 및 마우스 (Vα14i NKT) 사이에서 보존되고, 많은 면역학적 과정에 관련된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "사이토킨"은, 통상적으로 전구체 세포가 특징적인 특수화된 세포 유형으로 되는 유전자 발현의 변화를 포함하는 면역 세포 분화 과정에 영향을 미침으로써 면역 반응의 강도 및 지속시간을 조절하는 임의의 다수의 작은 분비 단백질을 지칭한다. 사이토킨은 그의 추정 기능, 분비 세포 또는 작용 표적을 기준으로 하여 림포킨, 인터류킨 및 케모카인으로 다양하게 지칭된다. 예를 들어, 일부 통상의 인터류킨은 IL-12, IL-18, IL-2, IFN-γ, TNF, IL-4, IL-10, IL-13, IL-21 및 TGF-β를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "케모카인"은 림프구의 가동화 및 활성화를 위한 수단을 제공하는 감염 부위에서 방출된 임의의 다양한 작은 화학주성 사이토킨을 지칭한다. 케모카인은 백혈구를 감염 부위로 끌어당긴다. 케모카인은 그들이 4개 그룹으로 할당될 수 있게 하는 보존된 시스테인 잔기를 갖는다. 대표적 케모카인을 갖는 그룹은 C-C 케모카인 (RANTES, MCP-1, MIP-1α 및 MIP-1β), C-X-C 케모카인 (IL-8), C 케모카인 (림포탁틴(Lymphotactin)) 및 CXXXC 케모카인 (프랙탈카인(Fractalkine))이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "TH2-유형 반응"은 특정 유형의 사이토킨, 인터페론, 케모카인이 생산되도록 하는 사이토킨 발현 패턴을 지칭한다. 전형적 TH2 사이토킨은 IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-10을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "TH1-유형 반응"은 특정 유형의 사이토킨, 인터페론, 케모카인이 생산되도록 하는 사이토킨 발현 패턴을 지칭한다. 전형적 TH1 사이토킨은 IL-2, IFN-γ, GM-CSF 및 TNF-β를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "TH1 바이어스된(biased)"은 TH1 사이토킨 및/또는 케모카인의 생산이 TH2 사이토킨 및/또는 케모카인의 생산보다 더 큰 정도로 증가된 면역원성 반응을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "에피토프"는 항체 또는 T 세포 수용체의 항원 결합 부위에 접촉되는 항원 분자의 부분으로서 정의된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "백신"은, 전체 질환-유발 유기체 (사멸 또는 약화됨) 또는 이러한 유기체의 성분, 예컨대 단백질, 펩티드 또는 폴리사카라이드로 구성된, 항원을 함유하는 제제를 지칭하며, 이는 유기체가 일으킨 질병에 대한 면역성을 제공하기 위해 사용된다. 백신 제제는 천연, 합성 제제일 수 있거나, 또는 재조합 DNA 기술에 의해 유도된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항균"은, 미생물, 예컨대 박테리아, 진균 또는 바이러스를 사멸시키거나 이들의 성장을 억제하는 물질을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "톡소이드"는, 그의 독성은 화학물질 (포르말린) 또는 열처리에 의해 약화되거나 억제되면서, 다른 특성, 전형적으로 면역원성은 유지된 박테리아 독소를 지칭한다. 톡소이드는, 그들이 원래의 독소에 대한 면역 반응을 유도하거나, 또 다른 항원에 대한 반응을 증가시킴에 따라 백신에 사용된다. 예를 들어, 파상풍 톡소이드는 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani)에 의해 생산되고 파상풍의 원인이 되는 테타노스파스민으로부터 유도된다. 파상풍 톡소이드는 혈장 풍부 백신의 개발을 위해 미국에서 많은 혈장 센터에서 사용되고 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "DNA 백신"은, 세포에 도입된 후 특정 항원 단백질로 변형되는 DNA 구축물을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "플라스미드"는 클로닝 벡터로서 이용될 수 있는 복제가능한 염색체외 원형 DNA를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "미생물 (microorganism 및 microbe)" 은 미시적인 (너무 작아서 인간 육안으로 볼 수 없는) 유기체를 지칭한다. 미생물은 대단히 다양하며, 박테리아 및 진균을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "면역 아주반트"는, 면역원에 대한 면역 반응을 향상시키거나 변형시키는, 면역원과 함께 사용되는 물질을 지칭한다. 하나의 예시적 실행에서, 본 개시내용의 α-GalCer 유사체는 백신에 대해 보다 강력하게 반응하도록 백신이 투여된 환자의 면역계를 자극함으로써 백신의 효과를 변형시키거나 증대시키는 면역 아주반트로서 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "알룸(alum) 아주반트"는 면역 아주반트 활성을 갖는 알루미늄 염을 지칭한다. 이 작용제는 용액 중에서 단백질 항원을 흡착하고 침전시키며; 생성된 침전물은 접종 부위에 형성된 백신 데포(depot)로부터의 항원의 서방성을 용이하게 함으로써 백신 면역원성을 향상시킨다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항-종양 면역요법 활성제"는, 종양을 억제하고/거나, 감소시키고/거나, 제거하는 본 개시내용의 α-GalCer 유사체를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "과립구-대식세포 콜로니-자극 인자" (GM-CSF)는 백혈구, 특히 과립구 (호중구, 호염기구 및 호산구), 대식세포, 및 혈소판의 전구체인 골수 내 세포의 생산을 자극하는 콜로니-자극 인자로서 작용하는 사이토킨을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항원 특이적"은, 특정 항원 또는 항원의 단편의 공급에 의해 특정 세포 증식이 일어나도록 하는 세포 집단의 특성을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "유세포 분석법" 또는 "FACS"는 광학적 및 전자적 검출 장치를 통하여, 유체의 스트림 중에 현탁되어 있는 입자 또는 세포의 물리적 및 화학적 특성을 검사하기 위한 기술을 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이, α-GalCer 유사체 또는 합성 α-GalCer 유사체는, 달리 나타내지 않는 한, 알파-갈락토실 세라미드를 기재로 하는 구조-기반 합성 당지질 유사체를 지칭한다.
이하에서, 펩티드의 아미노산 잔기는 하기와 같이 약칭될 것이다: 페닐알라닌은 Phe 또는 F이고; 류신은 Leu 또는 L이고; 이소류신은 Ile 또는 I이고; 메티오닌은 MET 또는 M이고; 발린은 Val 또는 V이고; 세린은 Ser 또는 S이고; 프롤린은 Pro 또는 P이고; 트레오닌은 Thr 또는 T이고; 알라닌은 Ala 또는 A이고; 티로신은 Tyr 또는 Y이고; 히스티딘은 His 또는 H이고; 글루타민은 Gln 또는 Q이고; 아스파라긴은 Asn 또는 N이고; 리신은 Lys 또는 K이고; 아스파르트산은 Asp 또는 D이고; 글루탐산은 Glu 또는 E이고; 시스테인은 Cys 또는 C이고; 트립토판은 Trp 또는 W이고; 아르기닌은 Arg 또는 R이고; 글리신은 Gly 또는 G이다. 아미노산에 대한 추가의 설명에 대해서는, 문헌 [Proteins: Structure and Molecular Properties by Creighton, T. E., W. H. Freeman & Co., New York 1983]을 참조하시오.
포유류 및 미코박테리아 지질은 인간 CD1a, CD1b, CD1c, 및 CD1d에 의해 제시되는 것으로 알려져 있다. 바다 해면동물 아겔라스 마우리티아누스(Agelas mauritianus)에서 발견된 지질인 α-갈락토실 세라미드는 CD1d에 대한 리간드로서 가장 심도있게 연구되어 왔다. α-GalCer에 의한 마우스 비장 세포의 시험관내 자극은 각각 NKT를 증식시키고, IFN-γ 및 IL-4 둘 다의 생산을 야기하고, TH1-유형 및 TH2-유형 반응을 야기하는 것으로 밝혀졌다. 뮤린 연구는 세포가 α-GalCer을 보유하는 미성숙 수상 세포 (iDC)에 의해 신속히 활성화될 수 있고, 이어서 활성화된 iNKT가 DC의 충분한 성숙을 유도할 수 있음을 보여준다.
한 측면에서, 본 개시내용은 CD1 분자 상의 결합-홈과 결합하여 CD1-유사체 복합체를 형성할 수 있는 일련의 신규한 α-GalCer 유사체의 지질 부분을 제공한다. 이들 CD1-유사체 복합체는 T 세포 수용체 인식에 의해 CD1-제한된 T 세포 (NKT)에 제시되고, 이는 TCR을 활성화시킬 수 있고, TH1 및 TH2 사이토킨을 방출시킬 수 있고, NKT를 확대시킬 수 있다. 예시적인 실시에서, 본 개시내용의 α-GalCer 유사체는 이것이 CD1 분자 상의 결합-홈과 강한 결합 친화성을 가지도록 설계되며, 이는 TH1-편향된 면역원성 반응과 관련이 있다. 또다른 예시적인 실시에서, 본 개시내용의 α-GalCer 유사체는 이것이 CD1 분자 상의 결합-홈과 강한 결합 친화성을 가지도록 설계되며, 이는 TH2-편향된 면역원성 반응과 관련이 있다.
본 개시내용의 또다른 측면에서, α-GalCer 유사체는 면역요법으로서 이용될 수 있다. 예시적인 실시에서, α-GalCer 유사체는 암 면역요법에 사용될 수 있다. 예시적인 실시에서, α-GalCer 유사체는 아주반트 면역요법에 사용될 수 있다. 또다른 예시적인 실시에서, α-GalCer 유사체는 항-미생물 면역요법에 사용될 수 있고, 그러한 면역요법에는 예방접종이 포함된다. 또다른 예시적인 실시에서, α-GalCer 유사체는 자가면역성 질환 치료용 면역억제제로 사용될 수 있다.
또다른 측면에 따르면, 본원에 개시된 조성물은 추가 활성제, 담체, 비히클, 부형제, 또는 본 개시내용을 읽고 당업자가 동일시할 수 있는 보조제와 함께 제약 또는 영양 조성물에 포함될 수 있다.
제약 또는 영양 조성물은 바람직하게는 적어도 하나의 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 그와 같은 제약 조성물에서, 본원에 개시된 조성물은 또한 "활성제"로도 언급되는 "활성 화합물"을 형성한다. 본원에서 사용된 어구 "제약상 허용되는 담체"에는 제약 투여와 상용가능한 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등이 포함된다. 보충적 활성 화합물도 또한 조성물에 혼입될 수 있다. 제약 조성물은 그의 의도되는 투여 경로와 상용가능하게 제제화된다. 투여 경로의 예로는 비경구, 예를 들면 정맥내, 피내, 피하, 경구 (예를 들면, 흡입), 경피 (국소), 경점막 및 직장 투여가 포함된다. 비경구, 피내 또는 피하 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액은 하기 성분을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예컨대 주사용수, 식염수 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항박테리아제, 예컨대 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 킬레이트화제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충액, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 긴장성 조정을 위한 작용제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스. pH는 염산 또는 수산화나트륨과 같은 산 또는 염기로 조정할 수 있다. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 앰풀, 일회용 주사기 또는 다중 투여량 바이알에 동봉될 수 있다.
본원에서 이용되는 대상체는 인간 및 비-인간 영장류 (예를 들면, 고릴라, 마카쿠, 마모셋), 가축 (예를 들면, 양, 소, 말, 당나귀 및 돼지), 애완 동물 (예를 들면, 개, 고양이), 실험실 시험 동물 (예를 들면, 마우스, 토끼, 래트, 기니아 피그, 햄스터), 포획된 야생 동물 (예를 들면, 여우, 사슴), 및 본 개시내용의 작용제에 의해 이익을 얻을 수 있는 기타 임의의 유기체로 언급된다. 본원에 기재된 작용제에 의해 이익을 얻을 수 있는 동물의 유형에는 제한이 없다. 인간이든 비-인간 유기체이든 관계없이, 대상체는 환자, 개체, 동물, 숙주 또는 수혜자로 언급될 수 있다.
주사가능한 용도로 적합한 제약 조성물은 멸균 수용액 (수용성) 또는 분산액 및 주사가능한 멸균 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 담체로는 생리학상 식염수, 정균수, 크레모폴 EL.TM.(Cremophor EL.TM.) (바스프(BASF), 뉴저지주 파르시파니 소재) 또는 포스페이트 완충 식염수 (PBS)가 포함된다. 모든 경우에, 조성물은 멸균되어야 하고, 용이한 주사가능성이 존재하는 정도로 유체여야 한다. 이는 제조 및 저장 조건하에서 안정적이어야 하고, 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보호되어야 한다. 담체는, 예를 들면 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적당한 유동성은, 예를 들면 코팅제 (예컨대, 레시틴)를 사용하고, 분산액의 경우에는 요구되는 입자 크기를 유지하며, 계면활성제를 사용하는 것에 의해 유지시킬 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들면 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에 있어, 상기 조성물에 등장화제, 예를 들면 당, 폴리알코올, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들면 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함시켜 야기할 수 있다.
주사가능한 멸균 용액은 필요한 양의 활성 화합물을 필요한 경우 상기 열거한 성분 중 하나 또는 그의 조합물과 함께 적절한 용매 중에 혼입시킨 후, 여과 멸균하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터의 필요한 기타 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 활성 화합물을 혼입시켜 분산액을 제조한다. 주사가능한 멸균 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 제조 방법은 진공 건조 및 동결-건조를 포함하며, 이는 활성 성분에 더하여 앞서 그의 멸균-여과된 용액으로부터의 임의의 부가적인 목적하는 성분을 함유하는 분말을 제공한다.
경구 조성물은 일반적으로 비활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 치료적 경구 투여를 위해, 활성 화합물을 부형제와 혼입하고, 정제, 트로키제 또는 캡슐제, 예를 들면 젤라틴 캡슐제의 형태로 사용할 수 있다. 경구 조성물은 또한, 구강세척제로서 사용하기 위해 유체 담체를 사용하여 제조할 수 있다. 제약상 상용가능한 결합제 또는 아주반트 물질은 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 정제, 환제, 캡슐제 및 트로키제 등은 하기의 성분 또는 유사한 성질의 화합물 중 임의의 것을 함유할 수 있다: 결합제, 예컨대 미세결정성 셀룰로스, 트래거캔스 검 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대 전분 또는 락토스, 붕해제, 예컨대 알긴산, 프리모겔 (Primogel), 또는 옥수수 전분; 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로트(Sterote); 활택제, 예컨대 콜로이드성 이산화규소; 감미제, 예컨대 수크로스 또는 사카린; 또는 향미제, 예컨대 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향미.
흡입에 의한 투여를 위해, 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면 이산화탄소와 같은 기체를 함유하는 가압 용기 또는 분배기, 또는 분무기로부터 에어로졸 스프레이의 형태로 전달된다.
전신 투여는 또한 경점막 또는 경피 투여일 수 있다. 경점막 또는 경피 투여를 위해, 투과될 장벽에 적절한 침투제가 제제에 사용된다. 그러한 침투제는 당업계에 일반적으로 공지되어 있고, 예를 들면 경점막의 투여의 경우, 세제, 담즙 염, 및 푸시딘산 유도체가 포함된다. 경점막 투여는 비강 스프레이 또는 좌제의 사용을 통해 달성될 수 있다. 경피 투여의 경우, 활성 화합물은 당업계에 일반적으로 공지되어 있는 바와 같은 연고, 고약, 젤, 또는 크림으로 제제화 된다. 화합물은 또한 좌제 (예를 들면, 통상적인 좌제 기재, 예컨대 코코아 버터 및 기타 글리세리드를 함유하는 것) 또는 직장 전달을 위한 정체 관장제의 형태로 제조될 수 있다.
구현예에 따라, 활성 화합물은 예를 들어 이식물 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 비롯한 제어 방출 제제와 같이, 신체로부터의 신속한 제거에 대해 화합물을 보호할 담체와 함께 제조된다. 생분해성의 생체적합성 중합체, 예를 들어 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산을 사용할 수 있다. 이러한 제제의 제조 방법은 당업자에게 명백할 것이다. 또한, 상기 물질은 알자 코포레이션(Alza Corporation) 및 노바 파마슈티칼즈 인크.(Nova Pharmaceuticals, Inc.)로부터 구입할 수도 있다. 리포좀 현탁액 (세포-특이적 항원에 대한 모노클로날 항체를 사용하여 감염된 세포로 표적화된 리포좀을 포함함)이 제약상 허용되는 담체로서 사용될 수도 있다. 이것들은 예를 들어 미국 특허 제4,522,811호 (본원에 참고로 포함됨)에 기재된 바와 같이 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.
투여 용이성 및 투여 균일성을 위해 경구 또는 비경구 조성물을 투여 단위 형태로 제제화하는 것이 유리하다. 본원에서 사용된 바와 같이, 투여 단위 형태는 치료받을 대상체에 대한 단일 투여로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며, 각각의 단위는 필요한 제약 담체와 함께 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 소정량의 활성 화합물을 함유한다.
이러한 화합물의 독성 및 치료 효능은 예를 들어 LD50 (집단의 50％에 치명적인 용량) 및 ED50 (집단의 50％에서 치료 효과적인 용량)을 결정하기 위한, 세포 배양 또는 실험 동물에서의 표준 제약 절차에 의해 결정할 수 있다. 독성 및 치료 효과 사이의 용량 비율이 치료 지수이고, 이것은 LD50/ED50의 비율로 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 화합물이 사용될 수 있지만, 이러한 화합물을 감염부 부위로 표적화하여 미감염 세포에 대한 잠재적인 손상을 최소화함으로써 부작용을 감소시키는 전달 시스템이 디자인되도록 주의해야 한다.
세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 수득된 데이터는 인간에 사용하기 위한 투여량 범위로 제제화하는데 이용될 수 있다. 이러한 화합물의 투여량은 독성이 거의 없거나 또는 전혀 없이 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내에 있는 것이 바람직하다. 투여량은 사용되는 투여 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 이러한 범위 내에서 달라질 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용되는 임의의 화합물의 치료 유효 용량은, 처음에는 세포 배양 검정으로부터 추정될 수 있다. 용량은 세포 배양물에서 측정된 바와 같은 IC50 (즉, 증상의 최대 억제의 절반을 달성하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하는 동물 모델에서 제제화될 수 있다. 이러한 정보는 인간에서 유용한 용량을 더욱 정확하게 결정하는데 이용될 수 있다. 혈장 중 수준은, 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.
본원에 정의된 바와 같이, 활성 화합물의 치료 유효량 (즉, 유효 투여량)은 약 0.001 내지 100 g/kg 체중의 범위일 수도 있고, 또는 과도한 실험 없이 당업자에게 명백하고 이해될 다른 범위일 수도 있다. 당업자는 질환 또는 장애의 중증도, 기존의 치료, 대상체의 일반적인 건강 또는 연령, 및 존재하는 다른 질환을 포함하지만 이에 제한되지 않는 특정 인자들이 대상체를 효과적으로 치료하는데 필요한 투여량 및 시기에 영향을 미칠 수 있음을 알 것이다.
또 다른 측면에 따라, 본원에 개시된 방법 중 적어도 하나를 수행하고 상기 언급된 방법 중 적어도 하나에 따라 유효량의 본원에 개시된 조성물을 단독으로 또는 조합하여 포함하는 2종 이상의 조성물을 포함하는 1종 이상의 부분들의 키트가 고려될 수 있다.
키트는 또한 가능하게는 활성 작용제, 생물학적 사건의 식별자, 또는 본 개시내용에 따라 당업자에 의해 인식가능한 기타 화합물을 포함한다. 용어 "식별자"는 당업자에 의해 인식가능한 절차하에 생물학적 사건의 실존, 존재 또는 사실여부를 알아내거나 결정할 수 있거나 또는 다른 방식으로 검출할 수 있는, 분자, 대사물질 또는 기타 화합물, 예컨대 항체, DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드를 지칭하고, 예시적인 식별자는 항체이고, 예시적인 절차는 웨스턴 블럿팅, 니트라이트 검정 및 RT-PCR, 또는 실시예에 기재된 바와 같은 다른 절차이다.
키트는 또한 유효량의 본원에 개시된 조성물 또는 세포주를 포함하는 1종 이상의 조성물을 포함할 수도 있다. 부분들의 키트의 조성물 및 세포주는 당업자에게 인식가능한 절차에 따라 본원게 개시된 하나 이상의 방법을 수행하는데 사용된다.
본 개시의 α-
GalCer
유사체를 통한 T 세포 수용체 인식 및 활성화 및 생성된 면역성 반응
도 1A는 불변성 NKT 세포가 CD1d에 의해 제시된 당지질 항원을 인식함에 따라 일련의 연쇄적인 사건들이 초래되는 과정을 보여주는 도식적인 도해이다. 당지질 항원의 지질 부분은 CD1 분자의 소수성 결합 홈 내로 삽입되어 CD1-항원 복합체를 형성하며, 이는 NKT 상의 T-세포 수용체 (TCR)와 접촉할 수 있는데, 이에 의해 사이토킨, 케모카인 및 보조 자극 분자가 연루된 일련의 연쇄적인 사건들이 초래된다. 사이토킨 생성의 다양성 및 정도는 세포-매개 면역성 증진 (TH1-유형 반응)에서부터 세포-매개 면역성 억제 (TH2-유형 반응)에 이르는 광범위한 효과를 가질 수 있다. 도 1B는 CD1d에 의해 제시된 본 개시의 α-GalCer 또는 α-GalCer 유사체에 대한 NKT 세포의 인식이 신속한 TH1 및 TH2 사이토킨 반응을 자극하게 되는 과정을 보여주는 도식적인 도해이다. 일 구현예에서는, TH1 사이토킨 반응이 개시된다. 또다른 구현예에서는, TH2 사이토킨 반응이 개시된다. 또다른 구현예에서는, TH1 및 TH2 사이토킨 반응이 모두 개시된다.
α-GalCer, 및 본 개시의 합성 α-GalCer 유사체의 화학적 구조는 도 2에 나타나 있다. 본 개시의 α-GalCer 유사체에는, 박테리아 기원의 α-GalCer 유사체 (그룹 I: C2, C3 및 C14), 술폰화에 의해 변형된 α-GalCer 유사체 (그룹 II: C4, C5 및 C9), 페닐-알킬 쇄 α-GalCer 유사체 (그룹 III: C6-C8, C10-C11, C15-C16, C18-C34, C8-5 및 C8-6) 및 피토스핑고신 절단된 α-GalCer 유사체 (그룹 IV: C12, C13 및 C17)이 있다. 도 3은 글리코스핑고리피드 α-GalCer 유사체인 C12 및 C13의 합성에 대한 일례를 나타낸다.
일 측면으로, 본 개시의 합성 α-GalCer 유사체는 CD1d 분자와 복합체를 형성할 수 있다. 또다른 측면으로, 본 개시의 합성 α-GalCer 유사체는 NKT T-세포 수용체에 의해 인식될 수 있다. 또다른 측면으로, 본 개시의 합성 α-GalCer 유사체는 TH1-유형, TH2-유형 또는 TH1-유형 및 TH2-유형 반응을 유발할 수 있다. 일 구현예에서, 본 개시의 α-GalCer 유사체는 시험관내에서 NKT를 활성화할 수 있다. 또다른 구현예에서, 본 개시의 α-GalCer 유사체는 생체내에서 NKT를 활성화할 수 있다.
본 개시의 합성 α-GalCer 유사체 중 임의의 것을 대상체에 투여하는 것을 포함하며, 이 때 이 대상체 내의 NKT가 α-GalCer 유사체와의 접촉 후에 활성화되어 사이토킨 반응이 개시되는 것인, 조직, 세포 및/또는 대상체에서 사이토킨 생성을 자극 또는 강화하는 방법이 제공된다. 사이토킨은, 예를 들면, 인터페론-γ (IFN-g) 또는 인터류킨-4 (IL-4)일 수 있다.
일 구현예에서, 본 개시는, C2-C8, C8-5, C8-6 및 C9-C34로 이루어진 군으로부터 선택되는 유효량의 화합물 또는 염 또는 혼합물을 투여하여 조직, 세포, 및/또는 대상체에서 사이토킨 반응을 활성화하고(여기서, 대상체는 1종 이상의 림프구 및 1종 이상의 항원-제시 세포를 포함하는 세포 집단이 포함된 후천성 면역계를 가짐); 상기 화합물과 항원-제시 세포 간에 복합체를 형성시켜, 그에 의해 림프구 상의 수용체의 활성화를 일으키고; 림프구를 활성화하여 사이토킨 반응을 일으키는 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 쥣과 1.2 하이브리도마 (CD1d-반응성 Vα14i T 세포 하이브리도마)를 mCD1d-코팅 96 웰 플레이트에서 배양하고, 대조군인 DMSO, α-GalCer (C1) 또는 나타낸 본 개시의 α-GalCer 유사체를 100 ng/ml로 펄스 제공하였다. 18시간 배양 후에 조직 배양 매질 내로의 IL-2 방출을 측정하였는데, 이는 도 4에 나타난 바와 같다. 본 개시의 α-GalCer 유사체 대부분이 α-GalCer보다 더 많은 IL-2 생성을 유도하였다. 본 개시의 α-GalCer 유사체에 대해 시험관내에서 인간 나이브(naive) NKT (CD161+CD3+)에서 사이토킨/케모카인 생성을 유발하는 능력을 조사한 결과, 유사한 결과가 관찰되었다. 인간 나이브 CD161+CD3+ NKT를 자가 미성숙 수상 세포 (CD14+ DC)와 함께 배양하고, 대조군인 DMSO, α-GalCer 또는 나타낸 본 개시의 α-GalCer 유사체를 10 μg/ml로 펄스 제공하였다. 18시간 배양 후에 조직 배양 매질 내로 방출된 사이토킨을 측정하였는데, 이는 도 5에 나타난 바와 같다. α-GalCer 유사체는 TH1 및 TH2 사이토킨 분비에 대한 강력한 유도인자였다. 도 5A는 IFN-γ 및 IL-4의 유도를 나타내고, 도 5B는 IL-2 및 IL-6의 유도를 나타내며, 도 5C는 IL-12 및 IL-10의 유도를 나타낸다. 그룹 III 및 IV로부터의 방향족 화합물, 특히 C11, C16 및 C13은 α-GalCer에 비해 유의미하게 더 많은 IFN-γ의 분비를 유도한 반면, 모든 α-GalCer 유사체는 α-GalCer에 비해 약간 더 적은 IL-4를 유도하였다. 도 6은 인간 CD161+CD3+ NKT (상단)의 순도 및 DMSO 대조군 (하단)으로 정규화된 IFN-γ/IL-4의 비를 보여준다. IFN/IL-4 비로 표현할 때, C9, C12, C13, C14 및 그룹 III의 모든 화합물은 TH1에 더 편향되었고; C1, C3, C4, C5, C8 및 C17은 TH2에 더 편향되었다. 인간 CD161+CD3+ NKT로부터 사이토킨 및 케모카인을 유도한 결과가 도 7에 열거되어 있다. 각각의 사이토킨에 대한 가장 높은 5개의 값이 볼드체로 표시되어 있다. 시험된 α-GalCer 유사체 중 일부는 α-GalCer에 의한 것보다 케모카인을 더 많이 유도하였는데, 예를 들면, C13은 케모카인, 예컨대 MIP-1α, MCP-1, 및 IL-8의 현저한 증가를 유발하였다. 방향족 화합물인 C10, C11, 및 C16은 IL-3, 과립구/대식세포 집락-자극 인자 (GM-CSF), 및 IL-15를 더 많이 유도하였다.
도 8은 주요한 나이브 인간 iNKT에서 사이토킨/케모카인 생성을 유발하는 본 개시의 α-GalCer 유사체의 능력에 대한 더 많은 시험관내 결과를 보여준다. 주요한 나이브 인간 iNKT를 자가 미성숙 DC와 함께 배양하였고, 대조군 DMSO, α-GalCer 또는 나타낸 α-GalCer 유사체 (C11 및 C18-C29)를 펄스 제공하였다. 도 8A에 나타난 바와 같이, 시험된 본 개시의 α-GalCer 유사체 전부가 C1에 의한 것보다 더 높은 수준의 INF-γ 분비를 유도하였다. α-GalCer 유사체는 비슷한 수준의 IL-4를 유도하였다 (도 8B 참조). α-GalCer 유사체는 C1에 의한 것보다 더 높은 IFN-γ/IL4 비, 즉, TH1/TH2 편향을 유도하였다 (도 8C 참조). α-GalCer 유사체 C20, C24 및 C26은 IFN-γ 생성, 더 높은 IFN-γ/IL4 비, 및 더 높은 수준의 IL-2를 유발함에 있어 α-GalCer 유사체 C11보다 유의미하게 더 강력하였다 (도 8D 참조). α-GalCer 유사체 C20 및 C24는 IL-12 생성을 유도하였으며, 또한 시험된 다른 α-GalCer 유사체에 의한 것보다 더 많은 IL-6 방출을 유발하였다 (도 8E 및 8F 참조). 도 9는 α-GalCer 유사체 C11 및 C18-C29에 의한 인간 iNKT의 확대를 보여준다. α-GalCer 유사체 C20, C22-C24 및 C26-C27은 CD1d-제한 인간 iNKT 세포에 있어 C1 및 C11에 의한 것보다 유의미하게 더 큰 확대를 유도하였다.
도 10은 나이브 및 다양한 α-GalCer 유사체가 펄스 제공된 인간 NKT 간의 상이한 IFN-γ 분비 수준을 보여준다. 도 10A는 미성숙 CD14+ DC와 함께 배양되고, 대조군 DMSO, α-GalCer 또는 나타낸 본 개시의 α-GalCer 유사체가 펄스 제공된 인간 나이브 iNKT (Vα24+)로부터의 IFN-γ 분비를 보여준다. 도 10B 내지 10D는 (B) 인간 나이브 iNKT, (C) α-GalCer 펄스 제공된 iNKT 및 (D) C11 펄스 제공된 iNKT의 세 가지 상이한 원천의 iNKT에서 α-GalCer 유사체에 반응하여 일어난 IFN-γ 분비를 보여준다. 이들 iNKT를 HeLa-CDId 세포와 함께 배양하고, 18시간 동안 대조군 DMSO, α-GalCer 또는 표시된 α-GalCer 유사체를 펄스 제공하였다. 도 10E는 인간 나이브 iNKT, α-GalCer 펄스 제공된 iNKT 및 C11 펄스 제공된 iNKT에서의 IFN-γ의 상이한 기저 수준을 보여준다.
도 11은 본 개시의 α-GalCer 유사체에 반응하여 일어나는 불변성 인간 나이브 NKT에 의한 TH1/TH2 사이토킨 생성을 보여준다. 인간 Vα24+ iNKT를 자가 미성숙 CD14+ DC와 함께 배양하면서, 18시간 동안 대조군 DMSO, α-GalCer 또는 표시된 α-GalCer 유사체를 펄스 제공하였다. 도 11(A)는 IFN-γ의 유도를 보여주며, 11(B)는 IL-4의 유도를 보여주고, 11(C)는 DMSO 대조군으로 정규화된 IL-4에 대한 IFN-γ의 비를 보여준다. 나이브 인간 Vα24+ iNKT로부터의 사이토킨 및 케모카인의 유도는 도 12에 열거되어 있다.
α-
GalCer
유사체를 이용한
NKT
의 확대 및 활성화
일 측면으로, 본 개시의 합성 α-GalCer 유사체는 NK 및 iNKT를 확대 및 활성화할 수 있다. 악성 종양을 가진 환자에서 인간 말초 혈액 단핵 세포 내 iNKT의 수가 감소된 것이 문헌 상으로 기록되어 있기 때문에, 본 개시의 α-GalCer 유사체를 이용하여 그러한 환자의 iNKT를 확대 및 활성화하는 것은 치료적으로 유익할 수 있다. 일 구현예에서, 본 개시의 α-GalCer 유사체는 인간 iNKT를 시험관내에서 확대할 수 있다.
Vα14i, 또는 Vα24i T 세포를 수상 세포 및 본 개시의 α-GalCer 유사체와 일정한 시간 동안 접촉시켜, 유사체-특이적 T 세포 확대를 일으키는 단계 및 그렇게 하여 수득된 확대된 T 세포를 단리하여, 단리된, 배양-확대된 NKT 집단을 생성하는 것을 포함하는, 단리된, 배양-확대된 NKT 집단을 생성하는 방법이 제공된다. 일 구현예에서, 상기 단리된 배양-확대된 NKT 집단을 생성하는 방법은 수상 세포, NKT 세포 배양물에 사이토킨 또는 성장 인자를 첨가하는 단계를 추가로 포함한다.
인간 CD56+ 세포 (NK/NKT 세포 혼합물)을 자가 미성숙 CD14+ DC와 배양하고, DMSO, α-GalCer 또는 다양한 본 개시의 α-GalCer 유사체를 펄스 제공하였다. 노출 후 제9일에, NK 및 NKT 및 NKT의 하위집단인 iNKT (CD161+/Vα24+/CD56+/CD3+)의 확대/생존을 유동 세포계측법으로 측정하였다. 도 13 및 14에 나타난 바와 같이, C2, C8-C12 및 C15-C16을 이용한 자극시 대조군에 비해 iNKT의 유의미한 증가가 주목되었다. 시험된 α-GalCer 유사체 중에서, 그룹 III로부터의 방향족 화합물 중 몇몇, 특히 C11, C15 및 C16은 C1보다 더 효과적이었다.
도 15에서 나타난 바와 같이, 인간 CD56+ 세포 (NK/NKT 혼합물)을 자가 미성숙 CD14+ DC와 함께 배양하고, 제2일에 DMSO, α-GalCer 또는 다양한 본 개시의 α-GalCer 유사체를 10 또는 100 ng/ml으로 18시간 동안 펄스 제공하였다. 제9일에 NK/NKT 혼합물 중 CD161+/Vα24 TCR+ 세포의 백분율을 유동 세포계측법으로 측정하였다. 도 15A는 100 ng/ml에 반응하여 나타난 Vα24i NKT의 백분율을 나타낸다. 도 15B는 상이한 용량에 반응하여 나타난 Vα24i NKT의 총 수의 배수 변화를 보여준다. *, p < 0.05, DMSO와 비교함; #, p < 0.05, C1과 비교함.
α-
GalCer
유사체를 이용한 수상 세포의 성숙 및 신장
가장 효율적인 항원-제시 세포 (APC)는 면역학적으로 유능한 성숙한 수상 세포 (DC)이다. DC는 미성숙한 항원-포획 세포로부터 성숙한 항원-제시성 T 세포-프라이밍 세포로 발달할 수 있고; 항원을 면역원으로 변환시키고, 사이토킨, 케모카인, 보조 자극 분자와 같은 분자 및 프로테아제를 발현시켜 면역성 반응을 개시할 수 있다. 그러나, 유도된 T 세포-매개 면역성 반응의 유형 (관용성 대 면역성, TH1 대 TH2)은, 주변 미세환경으로부터 수신된 활성화 신호 이외에도, 특정 DC 계통 및 성숙 단계에 따라 다를 수 있다.
면역성을 조정하는 DC의 능력은 DC의 성숙도에 좌우된다. 결과적으로, DC의 성숙도는 면역성 반응의 개시에 결정적이다. 다양한 인자가 성숙 후 항원 흡수 및 DC 내의 처리를 유발할 수 있다. 미성숙 세포로부터 성숙 세포로의 변환 중, DC는 다수의 표현형 및 기능적 변화를 겪는다. 일반적으로, DC 성숙 과정은 세포내 세포질 구획으로부터 DC 표면으로의 주요 조직적합성 착체 (MHC) 분자의 재분포, 항원 내면화의 하향 조절, 공동자극 분자의 표면 발현의 증가, 형태학적 변화 (예를 들면, 수지상 돌기의 형성), 세포골격 재조직, 케모카인, 사이토킨 및 프로테아제의 분비, 및 접착 분자 및 케모카인 수용체의 표면 발현을 포함한다.
일 측면에서, 본 개시내용의 합성 α-GalCer 유사체는 인간 DC의 성숙을 촉진할 수 있다. 수지상 세포 성숙은 개선된 적응성 면역성 반응을 가져올 수 있다. 미성숙 수지상 세포를 제공하는 단계; 및 미성숙 수지상 세포가 성숙해지는 시간 동안 본 개시내용의 α-GalCer 유사체의 농도로 미성숙 수지상 세포를 인큐베이션하는 단계를 포함하는, 수지상 세포의 성숙 방법이 개시되어 있다. 예시적인 일 실시양태에 있어서, 이러한 성숙 수지상 세포를 면역요법, 예를 들면 암 면역요법 및 보조 면역요법으로서 사용할 수 있다. 또다른 예시적인 실시양태에 있어서, 본 개시내용의 α-GalCer 유사체를 미성숙 수지상 세포 또는 성숙 수지상 세포와 합한 후, 면역요법, 예를 들면 암 면역요법 및 보조 면역요법으로서 사용할 수 있다.
본 개시내용의 α-GalCer 유사체는 마우스 비장 DC 성숙을 유발할 수 있다. 시험관내, 본 개시내용의 α-GalCer 유사체는 수지상 돌기 신장과 함께 인간 DC에 대한 CD40, CD54, CD80, CD83, CD86, CD209 및 HLA-DR (MHC II 분자)을 비롯한 다양한 표면 성숙 마커의 발현 수준을 직접적으로 증가시킬 수 있다. 도 16에 제시된 것과 같이, C13은 CD40, CD80, CD83, CD86 및 HLA-DR의 발현 수준에서의 유의한 증가를 나타내고, 인간 단핵세포-유래 DC의 성숙을 촉진시킨다. 도 17A는 DC에서 C13에 대한 CD40, CD80, CD83, CD86 및 HLA-DR 발현의 히스토그램을 나타낸다. 도 17B는 C13과 48 시간 동안 인큐베이션한 DC의 형태를 나타낸다.
α-
GalCer
유사체를 이용한
NKT
의
CD1d
-의존성
TCR
활성화
또다른 측면에서, 본 개시내용의 합성 α-GalCer 유사체는 CD1d-의존성 TCR 활성화를 유발할 수 있다. 도 18은 NKT에서 TCR 신호전달 경로를 요약하는 개시도를 나타낸다. iNKT는 T 세포 수용체 착체를 통해 항원 제시 세포 (APC)의 표면상에 CD1d의 맥락에서 제시되는 당지질 항원을 인식한다. 당지질 항원의 결합은 ERK1/2, p38, IκBα, CREB, STAT3 및 STAT5의 인산화를 포함하여 iNKT에서 세포질 키나제를 활성화시킨다. 이러한 신호전달 캐스케이드는 iNKT 증식 및 사이토킨/케모카인 생성을 가져온다.
예시적인 실시양태에서, 본 개시내용의 α-GalCer 유사체는 시험하지 않은 (naive) 인간 NKT의 CD1d-의존성 TCR 활성화를 유발할 수 있다. TCR 활성화가 CD1d-의존성인지를 구별하기 위해서, HeLa-CD1d에 의해 제시되는 본 개시내용의 다양한 α-GalCer 유사체, 과발현 인간 CD1d 및 대조군 HeLa 세포의 영향을 측정하였다. 또한, HeLa-CD1d (비전문적 APC)의 용량을 다양한 α-GalCer 유사체를 NKT에 제시하는데 있어서 미성숙 DC (전문적 APC)와 비교하였다. 도 19에 제시된 것과 같이, C1 및 α-GalCer 유사체 C11, C13 및 C17이 포스포-CD3ε의 세포내 값을 HeLa-CD1d 세포에 의해 제시되었을 때 각각 대조군의 7.3, 10, 7.3 및 5.9배, DC에 의해 제시되었을 때 각각 대조군의 10.8, 21.3, 17.3 및 12배 증가시켰다. 포스포-ERK1/2의 경우, C1 및 α-GalCer 유사체 C11, C13 및 C17은 HeLa-CD1d 세포로 각각 6.6, 14.6, 6.6 및 3.3배, DC로 각각 30, 48.3, 35 및 18.6배의 증가를 유발하였다. 포스포-CREB의 유발은 더욱 놀랍다; C1 및 α-GalCer 유사체 C11, C13 및 C17은 HeLa-CD1d 세포에 의해 제시되었을 때 각각 2, 117, 41 및 20배의 발현을 유발하였고, DC에 의해 제시되었을 때 각각 68, 204, 158 및 49배 증가를 유발하였다. 시험한 α-GalCer 유사체 중 어느 것도 TCR 경로가 아니라 B 세포 수용체 신호전달에서 역할을 담당하는 것으로 공지된 Syk, 단백질 키나제의 인산화에 어떠한 영향도 미치지 않았다. 이러한 발견은 본 개시내용의 방향족 α-GalCer 유사체가 CD1d-의존성 방식으로 강한 TCR 활성화를 유발하고, 활성화의 정도는 비-전문적 APC와 비교할 때 전문적 APC에 의해 제시되었을 때 크게 개선된다는 점을 시사한다. 본 개시내용의 α-GalCer 유사체 중 어느 것도, 대조군 HeLa 세포와 공동-배양했을 때, NKT 세포에서 CD3ε, ERK1/2 또는 CREB의 인산화에 어떠한 영향도 나타내지 않았다. 전체적으로, 화합물 C11 및 C13은 화합물 C1 및 C17 보다 TCR 활성화에 있어서 보다 강력한 것으로 보이며, 이것은 C1과 비교하여 C11에 의해 촉발되는 TH1-편향된 사이토킨 프로필의 유발이 더 큰 것과 일치하고, 이는 ERK1/2 및 CREB 활성화가 많은 TH1 사이토킨, 예컨대 IL-12 및 IFN-γ의 유발에서 역할을 담당하는 것으로 보고되어왔기 때문이다. 또한, C13은 아마도 DC 상에서의 공동자극 분자의 발현을 개선시키는 C13의 고유 능력의 결과로 TCR의 유의한 활성화를 촉발하였다. 검사한 4종의 α-GalCer 유사체의 경우, TCR은 HeLa-CD1d 세포보다 DC에 의해 제시되었을 때 특히 C13에 의해 더욱 강력하게 활성화되었다. C1 보다 α-GalCer 유사체 C11에 의해 유발되는 더 높은 수준의 인산화 CD3ε, ERK1/2 및 CREB는 당지질의 CD1d에의 더 강력한 결합이 NKT상에서 TCR의 더 큰 자극을 유발한다는 점과 일치한다
도 20은 어떻게 본 개시내용의 α-GalCer 유사체가 CD1d-의존성 TCR 활성화를 유발할 수 있는지에 대한 또다른 예시적인 실시양태를 제시한다. 본 개시내용의 다양한 α-GalCer 유사체 (구체적으로, C16, C23, C26, C8-5 및 C8-6)는 ERK1/2, p38, IκBα, CREB, STAT3 및 STAT5를 인산화시켜 인간 iNKT (Vα24+ T 세포)에서 TCR 신호전달 경로를 활성화시킬 수 있다. TCR 활성화가 CD1d-의존성인지를 구별하기 위해서, HeLa-CD1d에 의해 제시되는 본 개시내용의 다양한 α-GalCer 유사체, 과발현 인간 CD1d 및 대조군 HeLa 세포의 영향을 측정하였다. 도 2OA는 92%의 시험하지 않은 Vα24+/CD3+ T 세포를 함유하는 격리된 Vα24+ T 세포를 유동세포계측법에 의해 측정한 것을 나타낸다. C1 및 α-GalCer 유사체, 구체적으로 C16, C23, C26, C8-5 및 C8-6은 (B) 포스포-CD3ε (포스포-티로신), (C) 포스포-CREB (Ser133), (D) 포스포-ERK1/2 (Thr185/Tyr187), (E) 포스포-p38 (Thr180/Tyr182), (F) 포스포-IκBα (Ser32), (G) 포스포-Lck, (H) 포스포-Lat, (I) 포스포-STAT3 (Ser727), (J) 포스포-STAT5 A/B (Tyr 694/699), (K) 포스포-Syk (포스포-티로신) 및 (L) 포스포-Zap-70 (포스포-티로신)의 세포내 값을 증가시켰다. *, p < 0.05 (DMSO와 비교); #, p < 0.05 (C1과 비교).
또한, 본 개시내용의 α-GalCer 유사체는 시험관내 CD1d-제한된 마우스 NKT/T의 더 높은 결합 친화도 (도 21) 및 생체내 2개의 서브셋 (subset) NKT 및 NK의 CD1d-의존성 활성화 (도 22)를 나타낸다. 도 21에 제시된 것과 같이, BALB/c 마우스의 비장을 표지된 α-GalCer 유사체 (C1, 7DW8-5, C26, C8, C17) 또는 비히클의 정맥내 (IV) 주사 (0.1 μg/마우스) 후 72 시간에 수확하였다. 마우스 NKT 세포 (도 21A) 또는 T 세포 (도 21B)의 비율을 α-GalCer (10 몰/μg)을 로딩한 mCD1d 4량체로 훼손하였다. 도 21C는 α-GalCer 및 페놀 α-GalCer 유사체 7DW8-5의 CD1d-제한된 NKT 및 T 세포로의 상이한 결합 친화도를 나타낸다. 도 22는 2개의 NKT 서브셋의 CD1-의존성 확대를 나타낸다. BALB/c 야생형 (WT) 또는 CD1 녹아웃 (Knockout: KO) 마우스의 비장을 DMSO 대조군, α-GalCer 또는 표지된 α-GalCer 유사체 C8, C16, C22, C23, C26, 7DW8-5 및 7DW8-6의 IV 후-주사 후 72 시간에 수확하였다. NKT의 총 개수, 및 표지된 α-GalCer 유사체에 대한 (B) 야생형 또는 (C) CD1 녹아웃 마우스에서 유형 II NKT (CD3+/NK+/CD49+/CD69-) 및 유형 I NKT (CD3+/NK+/CD49-/CD69+)로 명시된 그의 2개의 아형 (subtype)을 FACS로 평가하였다. (D)는 NK의 CD1d-의존성 활성화를 나타낸다. 표지된 α-GalCer 유사체에 대한 WT 또는 CD1KO 마우스에서 활성 NK (CD3-/NK+/CD69+)의 총 수의 확대를 FACS로 평가하였다. *, p < 0.05 (DMSO와 비교); #, p < 0.05 (C1과 비교).
생체내
T
H
세포 활성화,
비장세포의
확대/활성화 및 α-
GalCer
유사체를 이용한
NKT
의
CD1d
-의존성
TCR
활성화
또다른 측면에서, 본 개시내용의 α-GalCer 유사체는 생체내 TH 세포를 활성화시킬 수 있다. 사이토킨 분비에 대한 투여 경로의 영향을 평가하기 위해서, 본 개시내용의 α-GalCer 및 7종의 α-GalCer 유사체를 정맥내 (IV), 피하 (SubQ) 또는 근육내 (IM) 경로로 BALB/c 마우스에 주사하고, 사이토킨 생성에 대한 영향을 측정하였다. 도 23A, 27A 및 29A는 다양한 α-GalCer 유사체를 상이한 경로를 통해 주사한 후 72 시간에 걸친 IFN-γ의 혈청 수준을 나타낸다. 일반적으로, 사이토킨 생성의 증가는 2 시간에 감지되었고, 18 시간에 최고에 도달하였으며, 48 시간까지 기저 수준으로 점차적으로 감소하였다. IV 경로로 도입되었을 때 (도 23A), α-GalCer 유사체 C9 및 α-GalCer 유사체 C16은 C1에 근접하는 활성 수준을 나타냈고, α-GalCer 유사체 C13, C11, C2, C14 및 C3이 그 뒤를 이었다. 특히, 동일한 α-GalCer 유사체의 SubQ 투여에 의해 유발된 IFN-γ의 수준 (도 27A)은 IV 경로의 수준보다 훨씬 낮은 반면, IM 경로의 수준 (도 29A)은 중간이었다. 비록 C1을 IV로 공급하면 IFN-γ의 최고 수준을 유발하였으나, SubQ 및 IM 경로로 공급하면 α-GalCer 유사체 C9가 C1을 능가하였다. 도 23B, 27B 및 29B는 상이한 경로로 α-GalCer 유사체를 주사한 후 IL-4의 수준을 나타냈다. α-GalCer뿐만 아니라 시험한 모든 α-GalCer 유사체를 SubQ 경로로 도입하면 IL-4를 거의 유발하지 않았으나, IL-4의 중간 수준은 IM 투여로 공급하면 모든 α-GalCer 유사체에 의해 유발되었다. TH1/TH2 편향을 반영하기 위해서 데이타를 IFN-γ/IL-4 비율로 표현하면 (도 23C, 27C 및 29C), 도 23C, 27C 및 29C에 제시된 것과 같이, 박테리아 기원의 방향족 α-GalCer 유사체 C11, C13, C16 및 C14는 2 시간에 IV 경로를 통해 C1 보다 TH2 반응을 덜 유도하였고, 모든 α-GalCer 유사체는 18 내지 72 시간 동안 TH1 편향 반응을 유발하였다. 게다가, SubQ 경로로 투여하면, 본 개시내용의 시험한 모든 α-GalCer 유사체는, α-GalCer 유사체 C2 및 C3을 제외하고는, 2 내지 72 시간의 총 기간 동안 C1 보다 더 큰 TH1/TH2 비율을 나타냈다. 반면, IM 주사로 제공하면, 본 개시내용의 모든 α-GalCer 유사체는 2 시간에 TH2 편향된 반응을 나타냈고, C14를 제외하고는 18 내지 72 시간의 기간 동안 다시 더욱 편향된 TH1 반응으로 이동하였다. 후자가 2 시간에 더욱 편향된 TH1 반응을 나타냈고, 2 내지 72 시간의 총 기간 동안 TH1 편향이 잔류하였다. 또다른 관점에서, 도 24는 분비된 (A) IFN-γ, (B) IL-4의 마우스 혈청 수준 및 (C) 표지된 α-GalCer 유사체의 IV 투여 후 2 시간 및 18 시간에서의 IFN-γ/IL-4 비율을 나타냈다.
IFN-γ 및 IL-4와 함께, 다른 사이토킨 및 케모카인도 또한 상기 신규한 α-GalCer 유사체에 대해 혈청 내에서 현저히 증가된다. 이들은 IL-2, IL-6, KC, IL-10, IL-12, IL-13, GM-CSF, TNFα, RANTES, MCP-1, 및 MIP-1을 포함하며, 도 25의 표에 나열되어 있다. IV 투여에서, 상기 신규한 α-GalCer 유사체는 C1보다 큰 TH1 편향된 사이토킨 및 케모카인 반응을 유발한다. 예를 들면, 방향족 α-GalCer 유사체 C11, C13 및 C16은 IL-2, IL-12, MIP-1β 및 MCP-1에서 두드러지는 상승을 유도하고, C14는 IL-3, GM-CSF 및 IL-12의 보다 큰 유도를 나타내었다.
α-GalCer 및 본원에 지시된 α-GalCer 유사체가 주입된 BALB/c 마우스의 비장 내의 면역성 세포의 집단을 결정하기 위해, BALB/c 마우스에 주사하고, 이어서 주사 72 시간 후 시험하였다. 도 26에 도시된 바와 같이, IV 투여 후, 시험된 모든 α-GalCer 유사체는 (A) 비장세포 (C9, C13 및 C16은 C1보다 큰 효능을 나타냄), (B) DC, (C) NK, (D) NKT, (E) B 세포, (F) CD8+ T 세포, (G) CD4+ T 세포 및 (H) 활성화된 CD8+/CD4+ 비에서 현저한 확대를 유도하였다. 도 28에 도시된 바와 같이, SubQ 투여 후, 시험된 α-GalCer 유사체 중 어느 것도 C1의 것과 비교하여 (A) 비장세포의 확대에 대한 현저한 영향을 나타내지 않았다. 도 30에 도시된 바와 같이, IM 투여 후, 시험된 모든 α-GalCer 유사체는 (A) 비장세포 확대를 유도하였으며, C9, C13 및 C14는 C1보다 큰 영향을 가졌다. 방향족 α-GalCer 유사체 C12, C13 및 C16은 C1보다 현저히 큰 총체적인 및 성숙한 DC의 상승을 유도하였다 (도 26B, 28B 및 30B). α-GalCer 유사체 C9, C12, C13 및 C16은 NK 및 NKT의 확대/활성화를 위한 최상의 수용력을 나타내었다 (도 26C-D, 28C-D 및 30C-D). α-GalCer 유사체 C16은 B 세포 확대에서 가장 효과적이었고, α-GalCer 유사체 C2, C9, C10, 및 C11도 또한 C1보다 활성이었다 (도 26E, 28E 및 30E). CD8+ T 세포의 경우, α-GalCer 유사체 C9, C11, C16, C12 및 C13이 또한 C1보다는 활성이었으나, α-GalCer 유사체 C14가 세포 확대/활성화에서 가장 효과적이었다 (도 26F, 28F 및 30F). α-GalCer 유사체 C9는 C1에 비해 CD4+ T 세포 확대/활성화에서 가장 효과적이었다 (도 26G, 28G 및 30G). T 세포 하위집단 중, 시험된 모든 α-GalCer 유사체가 CD8+/CD4+ 비의 상승을 유도하였으며, α-GalCer 유사체 C11, C13, C14 및 C16은 C1보다 더 효력이 있었다 (도 26H, 28H 및 30H). SubQ 경로에 의해 α-GalCer 유사체로 처리한 마우스에서, α-GalCer 유사체 C9는 C1보다 현저히 큰 총체적인 및 성숙한 DC의 확대를 유도하였으며, 나머지 α-GalCer 유사체는 C1에 필적하였다 (도 28B). NK 및 NKT 확대/활성화의 경우, α-GalCer 유사체 C9, C11, C13, C14 및 C16은 C1과 유사한 활성을 나타내었고, 나머지 α-GalCer 유사체는 보다 덜 활성인 듯 하였다 (도 28C-D). B 세포 확대/활성화의 경우, α-GalCer 유사체 C1, C9, C11 및 C13은 현저한 활성을 나타내었다 (도 28E). CD8+ T 세포의 경우, α-GalCer 유사체 C9, C11, C13, C14 및 C16은 C1보다 큰 활성을 나타내었고, 나머지 α-GalCer 유사체는 C1과 유사한 활성을 나타내는 것처럼 보였다 (도 28F). CD4+ T 세포의 경우, α-GalCer 유사체 C9, C11, C13, C14 및 C16이 또한 대조군에 비해 보다 활성이었지만, C1이 가장 효과적이었다 (도 28G). T 세포의 경우, 시험된 대부분의 α-GalCer 유사체가 C1보다 큰 CD8+/CD4+ 비의 증가를 유발하였다 (도 28H). α-GalCer 유사체가 IM 경로를 통해 도입되는 경우, 모두는 DC, NK, NKT, B 세포 및 CD8+/CD4+ 비의 현저한 증가를 유도하였다. 대다수의 신규한 α-GalCer 유사체는 C1보다 큰 DC의 확대를 유발하였다 (도 30B). α-GalCer 유사체 C9 및 C14는 C1보다 강한 NK 세포의 유도를 나타내었지만 (도 30C), NKT 세포에 대해서는 유사하거나 보다 적은 영향을 나타내었다 (도 30D). α-GalCer 유사체 C2, C11, C12 및 C16은 C1보다 강한 B 세포의 활성화를 나타내었다 (도 30E). CD8+ T 세포의 경우, α-GalCer 유사체 C9 및 C16은 세포 확대/활성화에서 C1과 유사한 활성을 나타내었고, 나머지 α-GalCer 유사체는 대조군에 비해 현저한 증가를 유도하였다 (도 30F). CD4+ T 세포의 경우, α-GalCer 유사체 C2 및 C9는 세포 확대/활성화에서 C1과 유사한 활성을 나타내고, 나머지 α-GalCer 유사체는 대조군에 비해 현저한 증가를 유도하였다 (도 30G). α-GalCer 유사체 C9, C11 및 C16은 CD8+/CD4+ 비의 상승에서 C1과 유사한 활성을 나타내었다 (도 30H).
도 31은 사이토킨 반응속도 및 비장세포 확대/활성화에 대한 α-GalCer 유사체의 투여 경로의 영향의 또다른 예시적인 실시를 나타낸다. 도 31(A-C)는 상이한 경로에 의해 주어진 DMSO 비히클, α-GalCer 또는 α-GalCer 유사체 C16에 대한 사이토킨의 반응속도를 나타낸다. BALB/c 마우스에 비히클, C1 또는 C16 (마우스 당 2 μg)을 IV, SubQ 또는 IM 주사하였다. 0, 2, 18, 36, 48, 72 시간에 수집한 혈청 샘플을 사이토킨: (A) IFN-γ, (B) IL-4 및 (C) DMSO 비히클로 표준화한 IL-4에 대한 IFN-γ의 비에 대해 분석하였다. 도 31(D-K)는 상이한 경로로 주어진 비히클, C1 및 C16에 대한 비장세포의 확대/활성화를 나타낸다. BALB/c 마우스로부터의 비장을 C1, C16 (마우스 당 2 μg) 또는 비히클의 IV, SubQ 또는 IM 주사 72 시간 후 수확하였다. (D)는 유핵 세포의 총 수를 나타내고, (E-G)는 성숙한 수상 세포 (CD11C+/CD80+/CD86+), 활성화된 NK (U5A2-13Ag+/CD3-/CD69+), 활성화된 NKT (U5A2-13Ag+/CD3+/CD69+)를 비롯한 선천성 면역성 세포의 집단을 나타내고, (H-J)는 활성화된 B 세포 (CD45R+/CD23+/CD69+), 활성화된 CD8 T 세포 (CD3+/CD4-/CD8+/CD69+), 및 활성화된 CD4 T 세포 (CD3+/CD4+/CD8-/CD69+)를 비롯한 후천성 면역성 세포를 나타내고, (K)는 DMSO로 표준화한 CD8/CD4의 비를 나타낸다. C1과 비교하여 **, p < 0.05이다.
또다른 예시적인 실시에서, 본원의 α-GalCer 유사체를 다양한 투약량으로 마우스에 투여하여 투여-반응이 비장세포의 확대/활성화에 있어 눈에 띄는지를 측정하였다. 도 32A-H에 도시된 바와 같이, BALB/c 마우스로부터의 비장을 비히클 또는 α-GalCer 유사체 C11 (마우스 당 2 또는 0.1 μg)의 IV 주사 72 시간 후 수확하였다. (A)는 유핵 세포의 총 수를 나타내고, (B-H)는 성숙한 DCS (CD11C+/CD80+/CD86+), 활성화된 NK (U5A2-13Ag+/CD3-/CD69+), 활성화된 NKT (U5A2-13Ag+/CD3+/CD69+), 단핵세포 (CD11b+Gr1-), 과립구 (CD11b-Gr1+)를 비롯한 선천성 면역성 세포의 집단을 나타내고; (F-H)는 활성화된 CD4 T 세포 (CD3+/CD4+/CD8-/CD69+), 활성화된 CD8 T 세포 (CD3+/CD4-/CD8+/CD69+), 및 활성화된 B 세포 (CD45R+/CD23+/CD69+)를 비롯한 후천성 면역성 세포를 나타낸다. DMSO와 비교하여 *, p < 0.05이고, C11 (마우스당 2 μg)과 비교하여 DMSO, #, p < 0.05이다.
또다른 생체내 예시적인 실시에서, 본원의 다양한 α-GalCer 유사체에 의해 유도되는 TH1/TH2 사이토킨의 반응속도를 평가하였다 (도 33). BALB/c 마우스에 비히클, C1 또는 지시된 α-GalCer 유사체 (A 참조, 마우스당 0.1 μg)를 IV 주사하였다. 혈청 샘플을 0, 2, 12, 24, 48, 및 72 시간에 수집한 후, (B) IFN-Y, (C) IL-4의 분비액 및 (D) DMSO 대조군으로 표준화한 IL-4에 대한 IFN-γ의 비를 평가하였다. 상기 효력 있는 α-GalCer 유사체는 2 및 18 시간에 수집한 혈청 샘플을 나타내는 도 34의 표로부터 알 수 있는 바와 같이 사이토킨/케모카인을 유발하였다. 본원의 α- GalCer 유사체는 야생형 (WT) 및 CD1d 녹아웃 (CD1KO) BALB/c 마우스 (마우스당 0.1 μg)에 IV 투여하였다 (도 35 참조). 혈청 샘플을 2 및 18 시간에 수집한 후, (A) IFN-γ, (B) IL-4, (C) IFN-γ/IL-4 비, (D) IL-10, (E) IL-12p70, (F) KC) 및 (G) MCP-1을 비롯하여 사이토킨/케모카인에 대해 분석하였다. DMSO와 비교하여 *, p < 0.05이다. 상기 결과는 본원의 α-GalCer 유사체가 마우스 내의 CD1-의존성 사이토킨/케모카인 분비액을 유발함을 나타낸다.
도 36은 본원의 다양한 α-GalCer 유사체의 주사 후 비장세포의 확대/활성화 및 2개의 NKT 아집단의 CD1d-의존성 활성화의 또다른 예시적인 실시를 나타낸다. (A-F)는 시험된 α-GalCer 유사체에 대한 비장세포의 확대/활성화를 나타낸다. C57BL/6 마우스로부터의 비장을 비히클, α-GalCer 또는 지시된 α-GalCer 유사체 (마우스당 0.1 μg)의 IV 주사 72 시간 후 수확하였다. (A)는 유핵 세포의 총 수를 나타내고, (B-F)는 성숙한 수상 세포 (CD11C+/CD80+/CD86+), 활성화된 NK (NK1.1+/CD3-/CD69+), 활성화된 CD4 T 세포 (CD3+/CD4+/CD8-/CD69+), 활성화된 CD8 T 세포 (CD3+/CD4-/CD8+/CD69+)의 집단, 및 DMSO로 표준화한 CD8/CD4 비를 나타낸다. DMSO와 비교하여 *, p < 0.05이다. (G-H)는 2개의 NKT 아집단의 CD1-의존성 확대를 나타낸다. C57BL/6 야생형 (Wt) 또는 CD1 녹아웃 (CD1KO) 마우스로부터의 비장을 비히클, C1, 7DW8-5, C22, C23, C26, C34 및 C17을 마우스당 0.1 μg IV 주사 72 시간 후 수확하였다. (G)는 유세포측정 (저급-좌측 패널)에 의한 마우스 NKT의 측정을 나타낸다. NKT (상급-좌측 패널) 및 유형 II NKT (CD3+/NK1.1+/CD49+/CD69-) (상급-우측 패널) 및 유형 I NKT (CD3+/NK1.1+/CD49-/CD69+) (저급-우측 패널)를 비롯한 그의 2개의 아류형의 Wt의 총 수의 증가는 FACS에 의해 주목되었다. (H)는 CD1 KO 마우스 내 NKT의 총 수를 나타내고 (I)는 α-GalCer 유사체에 대한 Wt C57BL/6 마우스 내 Treg 세포 (CD4+/CD25+/FoxP3+)의 총 수를 나타낸다. DMSO와 비교하여 *, p < 0.05이고, C1과 비교하여 #, p < 0.05이다.
면역요법
면역계는 세균을 제거하여 우리의 몸이 압도되는 것을 효과적으로 방지한다. 효과적인 면역계 없이는, 사람은 박테리아, 바이러스, 원생동물, 기생충 및 진균으로부터의 모든 종류의 감염에 걸리게 된다. 이들은 또한 암을 발달시킬 것이다. NKT가 면역계에서 조절 역할을 하기 때문에, 이들은 면역요법에 있어 매력적인 표적이다. NKT의 활성화는 역설적으로 면역성 반응의 억제 또는 자극을 유발할 수 있다. 예를 들면, TH1 사이토킨의 생성은 항종양, 항바이러스성/항박테리아, 및 아주반트 활성과 서로 관련이 있는 것으로 생각되고, 반면에 TH2 사이토킨 생성은 자가면역성 질환을 완화시키는 것으로 생각된다.
항종양 면역요법
현재, 면역계와 암 사이의 단단한 연결이 있고, 면역계를 적절히 자극하여 많은 암에 영향을 미칠 가능성이 있다고 생각되고 있다. α-GalCer을 이용한 마우스의 처리는 간, 폐 및 림프절로의 종양 전이를 억제함을 나타낸다. α-GalCer 또는 α-GalCer-로딩된 iDC를 주사한 암 발달된 환자의 2기 I 임상 시험에서, 처치 전 검출가능한 Vα24+Vβ11+ NKT 수를 가졌던 환자에게서 면역계의 독특한 활성화가 관측되었다. 지속적인 종양 퇴행은 없었지만, 안정적인 질환이 몇몇 환자에게서 임의의 독성 없이 주목되었고, 일부 환자는 심지어 혈청 종양 마커 또는 종양 크기의 일시적인 감소를 나타내었다. 몇몇의 임상 시험에서 α-GalCer의 현저한 항암 활성의 결여는 IL-4 (TH2 사이토킨)에 의해 중화된 IFN-γ (TH1 사이토킨)의 효과로 인한 것일 수 있으며, 이는 순익을 야기하지 않는다.
한 양태에서, 본원의 합성 α-GalCer 유사체는 항종양 면역효법 활성제로서 사용된다. 본원의 α-GalCer 유사체는 TH1-편향되도록 설계될 수 있다. 상기 TH1-편향된 α-GalCer 유사체는 TH1 사이토킨 반응을 유발할 수 있고, 암에 시달리는 동물의 생존 시간을 증가시킬 수 있고, 암에 시달리는 동물 내의 종양 성장을 늦출 수 있고, T, CD8T, NK 및 NKT 세포를 비롯한 종양-침윤 림프구를 증가시킬 수 있다.
예시적인 실시에서, 본 발명의 α-GalCer 유사체는 항종양 면역요법에서 치료학적 약물로서 작용한다. α-GalCer 유사체는 암 백신으로서 투여될 수 있다. 또다른 예시적인 실시에서, 본 발명의 α-GalCer 유사체는 α-GalCer 유사체를 이미 존재하는 암 백신과 조합하는 조합된 면역요법에 사용할 수 있다. 본 발명의 임의의 a-GalCer 유사체로 처리되는 대상체는 암을 앓고 있을 수 있거나, 암에 대한 높은 위험에 처해 있을 수 있거나, 전암 전구체를 가지고 있을 수 있다.
몇몇 예시적인 실시에서, 본 발명은 C3, C10-C17, C19-C28, C34 및 C8-5로 이루어진 군으로부터 선택되는 유효량의 화합물 또는 염 또는 이들의 혼합물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 항종양 면역요법을 제공한다.
본 발명의 α-GalCer 유사체의 항암 효능을 결정하기 위해, 예시적인 실시에서, TC1 세포주를 갖는 전이성 폐암의 마우스 모델 및 선천성 면역 적격 (syngeneic immunocompetent) 마우스인 4T1 세포주를 갖는 유방암의 SubQ 종양 모델 (각각 C57BL/6 및 BALB/c)을 조사하였다. 도 38A는 α-GalCer 유사체 C11로 처리된 마우스의 폐 표면 상의 종양 혹 (nodule)의 감소된 수를 나타내는 대표적인 실험 결과를 보여준다. TC1 종양을 갖는 마우스의 생존에 있어서 군 I 내지 IV 및 C1으로부터의 본 발명의 다양한 α-GalCer 유사체의 IV 투여의 효과를 도 37에 나타낸다. 생존의 상당한 연장 및 감소된 체중 감소가 C4, C6, C7, C8 및 C17를 제외한, 시험된 다수의 α-GalCer 유사체로 관찰되었다. 게다가, 8개의 시험된 α-GalCer 유사체, C3, C10, C11, C12, C13, C14, C15 및 C16은 C1보다 상당히 큰 항암 효능을 나타낸다. 다음으로, 4T1 유방암을 갖는 마우스에 IV로 투여된 8개의 α-GalCer 유사체 및 C1의 항종양 효능을 평가한다. α-GalCer 유사체 C11로 처리한 16일 후 마우스의 감소된 종양 크기를 예로서 도 38B에 나타낸다. 모든 시험된 α-GalCer 유사체가 대조군과 비교하여 생존이 연장되고 종양 성장이 억제될 수 있었으며, 모두가 C1보다 효과적이다 (도 39A). 이들 발견을 기초로, 몇몇의 가장 활성인 본 발명의 α-GalCer 유사체 (C9, C11 , C13, C14, C16) 및 C1의 SubQ 전달 효과를 시험한다. 시험된 α-GalCer 유사체의 SubQ 전달은 대조군과 비교하여 생존을 연장하고 종양 성장을 억제할 수 있다. α-GalCer 유사체 C13, C14 및 C16은 C1보다 상당히 큰 정도로 종양 크기 감소를 달성하나, 생존에 있어서 이들의 효과는 C1의 효과와 그다지 다르지 않다 (도 39B). C1은 통계적으로 IV 경로보다 SubQ 전달에서 더 나은 효능을 나타내나 (도 40), 투여 경로는 시험된 나머지 α-GalCer 유사체의 항종양 효과에는 그다지 영향을 미치지 않는다 (도 39A-B). α-GalCer 유사체를 SubQ 주사한 마우스는 IV 처리한 마우스보다 덜 병적인 것으로 보이며, 이는 SubQ 투여 후의 사이토킨/케모카인의 저급 혈청 수준과 일치한다.
이들 신규한 α-GalCer 유사체의 치료학적 프로토콜을 최적화하기 위해, 본 발명자들은 투여의 경로, 빈도 및 투여량에 특히 초점을 맞추어 종양을 갖는 마우스에서의 항암 효능을 평가하였다 (도 41-44 참조). 결과는 최적의 투여 스케줄이 마우스 당 0.1 μg의 α-GalCer를 일주일에 1회 IV 투여하는 것임을 보여준다. 이는 유방암 및 폐암 뿐만 아니라, 흑색종을 갖는 마우스의 치료에 적용할 수 있다 (도 43 및 44 참조). 신규한 α-GalCer 유사체로의 처리는 T, CD8T, NK, 및 NKT를 비롯한 종양-침윤 림프구의 증가를 초래한다 (도 45 참조). 도 41A-B는 상이한 경로로의 투여의 영향을 나타낸다. (A) BALB/c 마우스를 마우스 유방암 세포, 4T-1로 SubQ 접종한다. 종양 접종 3일 후, 마우스를 비히클, α-GalCer 또는 소정의 α-GalCer 유사체로 (2 μg/마우스) 4주 동안 일 주일에 2회 (IV 또는 SubQ) 처리한다. 종양 부피를 33일 동안 매 3일마다 기록하고 및 생존을 적어도 70일 동안 관찰한다. 좌측 패널은 유방암을 갖는 마우스의 카플란 마이어 (Kaplan Meier) 생존 곡선이고, 우측 패널은 종양 성장 곡선이다. (B) C57BL/6 마우스를 마우스 폐암 세포, TC-1로 IV 접종하고, 이어서 비히클, α-GalCer 또는 소정의 α-GalCer 유사체로 (2 μg/마우스) 4주 동안 일주일에 2회 (IV 또는 SubQ) 처리한다. 좌측 패널은 폐암을 갖는 마우스의 카플란 마이어 생존 곡선이고 우측 패널은 체중 변화이다.
(C)는 투여 빈도의 영향을 보여준다. C57BL/6 마우스를 마우스 폐암 세포, TC-1으로 IV 접종하고, 이어서 비히클, α-GalCer 또는 소정의 α-GalCer 유사체 (2 μg/마우스)으로 4주 동안 일주일에 2회 또는 일주일에 1회 (IV 또는 SubQ) 처리한다. 좌측 패널은 폐암을 갖는 마우스의 카플란 마이어 생존 곡선이고 우측 패널은 체중 변화이다.
도 43 및 44는 최적화된 프로토콜로의 본 발명의 α-GalCer 유사체의 항암 효능 평가를 보여준다. 도 43은 C57BL/6 마우스에 폐암 (TC1)를 IV로 또는 흑색종 (B16) 세포를 SubQ로 접종하고, 이어서 이를 비히클, α-GalCer 또는 소정의 α-GalCer 유사체 (C23, C26, C34, 7DW8-5)로 4주 동안 일주일에 1회 IV (0.1 μg/마우스)로 처리한다. (A)는 TC1을 갖는 마우스의 카플란 마이어 생존 곡선을 나타내고, (B)는 B16 종양의 성장 곡선을 나타낸다. 모든 시험된 α-GalCer 유사체는 TC1를 갖는 마우스의 생존 시간에 있어서 상당한 증가를 나타낸다. 또한, B16를 갖는 마우스를 본 발명의 α-GalCer 유사체로 처리하는 경우, 종양 크기에서의 상당한 감소가 있었다. 도 44(A-B)는 마우스에서의 종양 성장의 실시간 평가를 나타낸다. C57BL/6 마우스를 (A) 폐암 (TC1-GFP-루시페라제) 또는 (B) 유방암 (4T1-GFP-루시페라제) 세포로 SubQ 접종하고, 이어서 비히클, α-GalCer 또는 소정의 α-GalCer 유사체 (C23, C34, 7DW8-5 및 C17)로 4주 동안 일주일에 1회 IV (0.1 μg/마우스)로 처리한다. 생체내 종양의 생발광 (bioluminescence)의 화소를 평가하고 IVIS 시스템을 사용하여 계산한다. 좌측 패널은 생발광의 정량적 데이터이고, 우측 패널은 종양을 갖는 마우스의 대표적인 이미지이다. * (p ＜ 0.05)를 DMSO와 비교하고, # (p ＜ 0.05)를 C1와 비교한다. 폐암으로 접종된 마우스에서, α-GalCer 유사체 C34, C23 및 C8-5는 대조군 및 α-GalCer 모두와 비교하여 종양 성장에 있어서 상당한 감소를 나타낸다. 흥미롭게도, 이들 α-GalCer 유사체, C34, C23 및 C8-5는 모두 상기 결과에 나타낸 바와 같이 TH1에 편향된 반응을 나타낸다. 유방암을 접종한 마우스에서, α-GalCer 유사체 C8-5는 대조군 및 α-GalCer 모두와 비교하여 종양 성장에 있어서 상당한 감소를 나타낸다. α-GalCer 유사체 C17은 대조군과 비교하여 종양 성장에 있어서 상당한 감소를 나타내나, α-GalCer과 유사한 결과를 나타낸다. 흥미롭게도, α-GalCer 유사체 C17은 상기 결과에 나타낸 바와 같이 TH2에 편향된 반응을 나타낸다. 이들 결과는 TH1 사이토킨의 생성이 항종양 활성과 연관되어 있다고 생각되는 견해를 확실하게 한다.
도 45는 예시적인 실시에서, 본 발명의 α-GalCer 유사체가 어떻게 폐 및 흑색종 종양에서 TH1에 편향된 종양 침윤 림프구를 유발하는지를 보여준다. (A-D)는 폐암에서의 종양 침윤 림프구를 나타낸다. 비히클, α-GalCer 또는 소정의 α-GalCer 유사체 (C23, C34, C8-5; 0.1 μg/마우스, 1회/주)로 처리한, TC1 종양을 갖는 C57BL/6 마우스로부터 21일에 제거한 종양의 단일 세포 현탁액을 (A) CD3+ T 세포, (B) CD8 T 세포 (CD3+/CD4-/CD8+), (C) NK (NK1.1+/CD3-) 및 (D) NKT (NK1.1 +/CD3+)에 대해 착색시키고, DMSO에 대해 표준화한다. α-GalCer 유사체 C34는 대조군 및 α-GalCer 모두와 비교하여, 폐암에서 TH1에 편향된 종양 침윤 림프구 수의 상당한 증가를 나타낸다. α- GalCer 유사체 C23 및 C8-5는 또한 (CD3+ T 세포에 대해) 대조군과 비교하여 그리고 (CD8 T 세포, NK 및 NKT에 대해) 대조군 및 α-GalCer 모두와 비교하여, 폐암에서 종양 침윤 림프구 수의 상당한 증가를 나타낸다. (E-H)는 흑색종에서의 종양 침윤 림프구를 나타낸다. 비히클, α-GalCer 또는 소정의 α-GalCer 유사체 (C23, C34, C8-5; 0.1 μg/마우스, 1회/주)로 처리한, B16 흑색종을 갖는 C57BL/6 마우스로부터 21일에 제거한 종양의 단일 세포 현탁액을 (E) CD3+ T 세포, (F) CD8 T 세포 (CD3+/CD4-/CD8+), (G) NK (NK1.1+/CD3-) 및 (H) NKT (NK1.1+/CD3+)에 대해 착색시키고 DMSO에 대해 표준화한다. α-GalCer 유사체 C23, C8-5 및 C34 모두는 대조군 및 α-GalCer 모두와 비교하여, 흑색종에서 TH1에 편향된 종양 침윤 림프구 수의 상당한 증가를 나타낸다. * (p ＜ 0.05)를 DMSO와 비교하고, # (p ＜ 0.05)를 C1과 비교한다.
아주반트
면역요법
펩티드, 단백질, 다당류 및
DNA
면역원 (
lmmunogen
)에서의
아주반트
효과
아주반트는 항원과 조합되는 경우, 면역화시킨 종에서 면역성 반응을 하게 하는 화합물이다. 80년이 넘는 동안, 아주반트는 백신의 효과를 증진시키는데 사용되어 왔다. 감염성 유기체의 약화된 형태를 함유하는 생 백신 (live vaccine)은 일반적으로 이들에 의해 잘 작용한다. 그러나 죽은 유기체를 함유하는 백신 (비활성화 백신) 또는 감염성 유기체의 일부 또는 이들의 독소를 함유하는 백신 (비세포성 (acellular) 또는 재조합 백신)은 일반적으로 이들의 효과를 증진시키기 위한 아주반트가 필요하다. 대부분의 경우, 유도된 반응의 유형 (유형 1 또는 유형 2)은 백신의 보호 효능에 상당한 영향을 미친다. 별법의 아주반트는 반응의 특정 유형을 선호하는 경향이 있다. 그러나, 아주반트 선택은 기능적 예측불가능성 및 또한 상업적 제약 및 입수가능성에 의해 복잡해진다.
알룸 (alum)으로서 공지된 알루미늄 염은 통상적인 예방 백신을 위해 미국에서 사용이 승인된 유일한 아주반트이다. 그러나, 알루미늄 염은 인간 뿐만 아니라, 동물에서, TH2-유형 반응 (예를 들면, IL-4 생성)으로의 이동을 독점적으로 증가시키는 것으로 보여진다. TH1 세포-매개 면역성 반응 (예를 들면, IFN-y 생성)을 유발하는데 있어서의 알루미늄 염의 불능성은 그의 아주반트로서의 사용의 주된 제약이다. 특히 세포내 바이러스성 및 박테리아성 감염에 대한 백신에 있어서, 세포독성 T 세포 반응의 결핍은 치명적이다.
본 발명의 α-GalCer 유사체는 TH1에 편향된 면역 반응을 개시하도록 합성될 수 있다. 따라서, 면역성 반응과 관련된 TH1-유형을 나타내는 개선된 백신 또는 면역성 반응의 TH2-유형 반응, 또한 TH1-유형 이동을 가능하게 하는 백신을 본 발명의 α-GalCer 유사체를 아주반트로서 사용하여 달성할 수 있다. 이와 같이, 하나 이상의 α-GalCer 유사체가 백신의 투여와 함께 아주반트로서 투여된다. 게다가, 이미 입수가능한 백신은 본 발명의 α-GalCer 유사체가 이들에 첨가되는 경우, TH1-유형 반응을 유도하는 개선된 형태로 제공될 수 있다.
몇몇 예시적인 실시에서, 본 개시내용은 C3, C11, C13-C14, C16-C18, C20, C22-C24, C26, C8-5 및 C8-6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유효량의 화합물, 또는 그의 염 또는 혼합물; 및 백신제를 포함하는 백신을 제공한다. 일부 경우, 백신제는 사멸된 미생물, 약독화된 생 바이러스 미생물, 톡소이드 및 불활성화되거나 약독화된 미생물의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우, 미생물은 세균 또는 진균이다. 일부 경우, 톡소이드는 테타누스 또는 디프테리아이다. 일부 경우, 백신제는 백신이 투여된 대상체에서 면역성 반응을 일으킬 수 있다. 일부 경우, 본 발명의 화합물은 면역 아주반트로서 작용하고, 면역계를 자극함으로써 백신제에 의해 유발되는 면역성 반응을 완화 또는 촉진시킬 수 있으며, 이로써 대상체는 본 발명의 화합물이 없는 경우보다 격렬하게 백신에 반응하게 된다.
한 측면에서, 적절한 백신은 펩티드, 단백질, 다당류 또는 DNA 면역원을 포함할 수 있다. 또다른 측면에서, 백신은 하나 이상의 시판용 백신, 예컨대, 간염 A, 간염 B, 로타바이러스, 디프테리아, 파상풍, 백일해, 하에모필루스 인플루엔자 타입 b, 폐렴구균, 폴리오바이러스, 인플루엔자, 홍역, 볼거리, 풍진, 수두, 메닝기오코칼, 수막구균, 인간 파필로마바이러스, 대상포진, 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 장티푸스, 일본 뇌염, 광견병, 진드기-매개 뇌염, 콜레라, 황열, H5N1, 웨스트 나일(West Nile), 파르보바이러스, 고양이 비기관지염, 칼리시바이러스, 범백혈구감소증 바이러스, 클라미디아 시타시, 고양이 백혈병, 개 홍역, 개 아데노바이러스, 개 파라인플루엔자, 보르데텔라(Bordetella) 기관지패혈증, 개 코로나바이러스, 람블편모충, 렙토스피라(Leptospira) 박테린, 감염성 소 비기관지염 바이러스, 파라인플루엔자 3 바이러스, 소 호흡기 세포융합 바이러스, 소 바이러스성 설사 바이러스, 클로스트리디움 카우보에이(Clostridium Chauvoei), 셉티쿰 하에몰리티쿰(Septicum Haemolyticum), 셉티쿰 노브이(Septicum Novyi), 테타니(Tetani), 소르델리이 페르프링겐스(Sordellii Perfringens), 모락셀라 보비스(Moraxella bovis), 만헤이미아 하에몰리티카(Mannheimia haemolytica), 파테우렐라 물토시다(Pateurella multocida), 렙토스피라 포모나(Leptospira pomona), 렙토스피라 하르조(Leptospira hardjo), 렙토스피라 그립포티포사(Leptospira grippotyphosa), 렙토스피라 카니콜라(Leptospira canicola) 및 렙토스피라 이크테로하에모라기애(Leptospira icterohaemorrhagiae)에 대한 백신으로부터 선택될 수 있으나 이들로 한정되지는 않는다.
화합물, 조성물 또는 백신의 면역원성을 증진시키는 아주반트를 추가로 포함하는 화합물, 조성물 또는 백신을 본 개시내용에 따라 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 화합물, 조성물 또는 백신의 면역원성을 증진시키는 방법이 제공된다.
단백질 백신에 대한
아주반트
효과
본 개시내용의 α-GalCer 및 α-GalCer 유사체를 현존하는 단백질 기재 백신, 예컨대 파상풍 톡소이드 (TT) 불활성화된 독소에 대한 면역성 반응의 증진 능력에 대해 시험하였다. 0일째 및 28일째에, 본 개시내용의 α-GalCer 유사체 없이 또는 이와 함께 TT를 마우스에 백신접종하였다. 항-TT-특이적 항체의 측정을 위해 혈청을 매주 수확하였다. 도 46A는 TT에의 항체 반응에 대한 본 개시내용의 α-GalCer 유사체의 아주반트 효과를 보여준다. 도 46A에 제시된 바와 같이, 항-TT-특이적 IgG 항체의 생성은 α-GalCer (C1) 및 α-GalCer 유사체 C11에 의해 증진된다. 항-TT 생성의 속도론은 통상의 아주반트 백반 ("Alum")에 의해 유도되는 것과 유사하지만, C1은 Alum보다 현저하게 큰 항체 생성을 유발한다. 통상의 TT + Alum이 C1 또는 C11과 조합되는 경우, 항체 반응은 통상의 백신의 약 2배까지 추가로 증가된다. 이러한 발견은 C1 및 C11이 Alum과 함께 상승작용적인 아주반트 효과를 가져 면역성 반응을 더욱 증가시킴을 나타낸다. α-GalCer 유사체 C11의 아주반트 효과는 놀랍도록 지속적이다. 2차 면역접종한지 20주 후에, 마우스에서 TT 단독 (Alum 또는 α-GalCer 유사체 C11 무함유)의 추가 용량은 1주 후 항-TT 항체의 급속한 증가를 야기하였다. 도 46B는 2차 백신접종한지 20주 후 항원 증가의 지연에 대한 α-GalCer 유사체 C11의 효과를 보여준다. C1 또는 C11로 처치된 마우스에서 항체의 수준은 도 46B에 제시된 바와 같이, 제시된 TT + Alum의 것보다 2배 높았고, TT 단독으로 주사된 것보다는 25배 초과 높았다. 이러한 발견은 C1 또는 α-GalCer 유사체 C11이 기억 T 및 B 세포에 대해 효과를 가져 가속된 면역성 반응의 증가를 야기할 수 있음을 시사한다.
펩티드 백신에 대한
아주반트
효과
인플루엔자 A 바이러스의 H1N1 아형의 M2 단백질의 세포외 도메인을 함유하는 펩티드 백신을 사용하여 아주반트 효과를 평가하였다. 펩티드 백신의 아미노산 서열은 MSLLTEVETPIRNEWGCRCN이다. 0주, 3주 및 6주째에, 본 개시내용의 다양한 α-GalCer 유사체 (C9, C11, C14, C17) 없이 또는 이와 함께, M2e 펩티드 5 또는 45 μg을 암컷 BALB/c 마우스에 백신접종하였다. 도 47은 M2e 펩티드 백신에 대한 다양한 α-GalCer 유사체의 아주반트 효과를 보여준다. 도 47에 제시된 바와 같이, 3차 면역접종한지 2주 후, 단독의 M2e 펩티드는 5 및 45 μg의 항원 투여량에 대해 각각 1.8 x 105 및 5.4 x 105의 항-M2e-특이적 IgG 역가를 유도하였다. 본 개시내용의 α-GalCer 유사체와 조합되는 경우, 10 내지 30배 높은 항-M2 항체 역가를 얻었다. 시험된 α-GalCer 유사체 중, C11이 완전 프로인트 아주반트(complete Freund's adjuvant; CFA)와 동등하지만 C1보다 3배 높은 역가를 갖는 최상의 아주반트 효과를 가졌다. 나머지 α-GalCer 유사체 (C9, C14 및 C17)는 C1과 동등하였다. 이러한 발견은 α-GalCer 및 그의 유사체가 펩티드 항원에 대해 강력한 아주반트 활성을 가짐을 시사하며, 아실 말단에 방향족 고리를 함유하는 것, 예컨대 C11이 가장 효능적이다.
DNA
백신에 대한
아주반트
효과
새 인플루엔자 바이러스의 전장 H5 공통 서열을 함유하는 플라스미드로서 H5 DNA 구조물 (pHA)을 제조하였다. 요약하면, 유전적 변이성을 포함하고, 이에 따른 상이한 H5N1 균주에 대한 교차-방어를 도입하기 위해, HA 공통 서열을 500 H5N1 바이러스 균주의 HA 유전자로부터 추정하고, 백신 개발 시도를 위해 사용하였다. HA의 공통 서열을 호(Ho) 등에 의해 개발된 HIV에 대한 DNA 백신인 ADVAX에 대한 유사한 전략을 기초로 하여 DNA 백신 후보자로서 pVAX 벡터 내에 구축하였다 (문헌 [Jin et al., (2002) J. Virol. 76 (5):2306-2216]). 1차 면역접종한지 3주 후에, 마우스에서 항-H5 역가에 대한 α-GalCer (C1) 없이 또는 이와 함께 H5 DNA 백신 (pHA) 투여량의 결과를 도 48A에 나타냈다. α-GalCer 없이 또는 이와 함께 5-45 μg의 H5 DNA 백신으로의 마우스에의 면역접종은, 항-H5 반응이 α-GalCer에 의해 5-30 μg의 H5 DNA에서는 증진되지만, 45 μg에서는 플래토에 이른다는 것을 나타낸다. 도 48B는 2차 면역접종한지 2주 후 항-H5 역가에 대한 저용량의 H5 DNA 백신 및 α-GalCer (C1)의 효과를 보여준다. H5 DNA 투여량을 0.2-5 μg으로 낮춘 경우, v-GalCer의 아주반트 효과는 시험된 모든 저용량에 대해 명백하였다. 도 48C는 C1 없이 또는 이와 함께 저용량의 H5 DNA 백신을 접종한지 2주 후 비에트남 레아소르탄트(Vietnam reassortant) 인플루엔자 균주 NIBRG-14에 의한 바이러스성 항원투여에 대한 방어를 보여준다. 2 μg 미만으로 처치된 동물들 중 α-GalCer 없이 NIBRG-14의 20 LD5O으로의 바이러스성 항원투여에 대해 생존한 것은 하나도 없는 반면, α-GalCer와 함께 0.2 내지 1 μg의 pHA로 처치된 동물들 중에서는 80%의 방어율이 나타났다 (도 48C). 이러한 발견은 저용량의 pHA 백신을 사용한 경우, NIBRG-14에 대한 방어 면역성의 유도에 대한 α-GalCer의 아주반트 효과를 확인시켜 주었다.
본 개시내용의 다른 α-GalCer 유사체는 또한, 상기 사용된 바와 같은 유사한 프로토콜 및 스케쥴로 마우스에서 pHA 백신으로의 아주반트로서 시험하였고, 차이점을 주목하였다. 6-7 주령 암컷 BALB/C 마우스의 근육에 α-GalCer 또는 제시된 α-GalCer 유사체를 pHAc와 함께 전기이동에 의해 백신접종하고 4주 후 상기 제제를 한 번 더 백신접종하였다. 2차 백신접종한지 2주 후에 혈액 샘플을 수집하고, ELISA에 의해 항-HAc-특이적 IgG 항체 역가에 대해 시험하였다. 도 49A는 α-GalCer 또는 α-GalCer 유사체 C3, C11, C13, C14 및 C16 없이 또는 이와 함께 pHA 0.2 μg을 면역접종한 후 마우스에서의 항-HA 특이적 IgG 항체 (AY3)의 역가를 보여준다. 도 49B는 α-GalCer 또는 α-GalCer 유사체 C10, C13, C18, C19 및 C20 없이 또는 이와 함께 pHA 0.2 μg을 면역접종한 후 마우스에서의 항-HA 특이적 IgG 항체 (AY4)의 역가를 보여준다. 도 49C는 시험된 일부 α-GalCer 유사체에 대해 상기와 같이 바이러스성 항원투여 후 마우스 생존률 (%)을 보여준다. 도 50A는 0.5 μg의 pHA 및 제시된 α-GalCer 유사체를 면역접종한 후의 항-HA 특이적 IgG 항체 (AY4)를 보여준다. 도 50B는 상기 기재된 바와 같이 바이러스성 항원투여 후의 생존률 (%)을 보여준다. 도 51은 (A) 0.1 μg의 pHA (pHA0 .1 vs pHA0 .1 + C26: p < 0.01, 1-방식 아노바 크루스칼-발리스(one-way ANOVA Kruskal-Walis) 시험) 또는 (B) 0.2 μg의 pHA (pHA0 .2 vs pHA0 .2 + C17: p < 0.01, pHA0 .2 vs pHA0 .2 + C26: p < 0.05, 1-방식 아노바 크루스칼-발리스 시험), 및 제시된 α-GalCer 유사체를 면역접종한 후의 항-HA 특이적 IgG 항체 (AY5)의 마우스 역가를 보여준다. 도 52는 (A) 0.1 μg의 pHA 또는 (B) 0.2 μg의 pHA, 및 0.1 μg 또는 1 μg의 제시된 α-GalCer 유사체를 면역접종한 후의 항-HA 특이적 IgG 항체 (AY6)의 마우스 역가를 보여준다. 0.2 μg의 pHA 투여량에서 아주반트로서 특히 효과적인 본 개시내용의 α-GalCer 유사체는 C13, C17, C20 및 C26이었다.
도 53은 0.2 μg의 pHAc 및 α-GalCer 또는 제시된 α-GalCer 유사체 C3, C10, C11, C13, C14, C16, C17, C18, C19, C20, C23, C24, C26, 7DW8-5, 및 alum을 면역접종한 후의 항-HAc 특이적 IgG 항체 (A) AY3, (B) AY4, (C) AY5 및 (D) AY15의 마우스 역가를 보여준다. 결과는 항체 역가의 증진에 있어 C1, C13, C14, C17, C26 및 7DW8-5가 다른 것들보다 우수한 아주반트 활성을 가짐을 제시한다. HA 특이적 CD8 T 세포 반응이 아주반트로서 본 개시내용의 α-GalCer 유사체를 사용함으로써 증진되는지를 조사하기 위해, C1, C26 및 7DW8-5를 추가로 평가하였다. 도 54에 제시된 바와 같이, IFN-γ 분비 세포는 α-GalCer 유사체 - 아주반트 군에서 증가하였다. 게다가, NIBRG-14 바이러스 항원투여 후, C1, C26 및 7DW8-5 - 아주반트 군의 생존률 (%)은 alum - 아주반트 군 또는 pHA 단독 군에서보다 높았다 (도 55).
본 개시내용의 α-GalCer 유사체의 아주반트 효과는 또한 단일 투여량의 pHA 백신접종 후에 명백하였다. 1회 투여량의 면역접종 3주 후에, 항-HA-특이적 IgG 항체는 아주반트로서 C26 및 C1로 처치된 마우스에서 증가하였다 (도 56). C1, C26 또는 7DW8-5로 처치된 마우스는 NIBRG-14 바이러스 항원투여에 의한 치사량의 항원투여로부터, 87.5% 내지 100% 범위의 생존률로 효과적으로 방어되었다. 이러한 발견은 C1, C26 및 7DW8-5가 단일 백신접종 절차의 설정에서 우수한 아주반트 활성을 가짐을 제시한다.
다당류 면역원에 대한
아주반트
효과
Globo H, 6당류 (Fucα1 → 2Galβ1 → 3GalNAcβ1 → 3Galα1 → 4Galβ1 → 4Glcβ1)는 모노클로날 항체 MBr1 (IgM) 및 VK-9 (lgG3)의 사용으로, 각종 상피 세포 종양, 예컨대 결장암, 난소암, 위암, 췌장암, 자궁내막암, 폐암, 전립선암 및 유방암에서 과발현되는 것으로 입증되었다. 정상 조직에서, globo H는 루멘(lumen) 경계부의 상피 세포의 첨단 표면으로 국한되며, 이 영역은 면역계에 근접하지 않는 것으로 보인다. 따라서, globo H는 유방암 및 다른 상피성 암의 면역요법에 대해 이상적인 표적 항원이다.
본 개시내용의 α-GalCer 및 α-GalCer 유사체 C23 및 7DW8-5의 아주반트 효과를 디프테리아 톡소이드 (GH-DT) 백신에 컨쥬게이팅된 globo H에 대해 평가하였다. BALB/c 마우스에 globo H-DT/α-GalCer 또는 globo H-DT/α-GalCer 유사체를 2주 간격으로 3회 IM 주사하였다. 3차 백신접종한지 2주 후에 혈청을 수집하고, 글리칸(glycan) 미세배열법을 사용하여 IgG 및 IgM 항-globo H-특이적 항체에 대해 각각 1:480 및 1:240의 희석에서 시험하였다. 도 57A에 제시된 바와 같이, GH-DT 단독은 항-globo H 항체를 전혀 유도하지 않았고, C1 또는 7DW8-5의 첨가는 유의한 IgG 항체 생성을 유발하였다. 반면, IgM의 생성은 단지 7DW8-5 - 아주반트 군에서만 관찰되었고, C1 처치된 군에서는 관찰되지 않았다 (도 57B). 결론적으로, C1 또는 7DW8-5를 GH-DT 백신에 첨가함으로써, 탄수화물 항원에 대한 특이적 항체 생성을 증진시킬 수 있다.
항균성 면역요법
또다른 관점에서, 예를 들어 본 발명의 α-GalCer 유사체는, 예를 들어 바이러스, 박테리아, 균류, 원생동물, 다세포 기생충, 및 비정상 단백질 (프리온)을 비롯한 병원성 미생물 제제의 존재로부터 생성된 감염성 질환의 치료 방법에서의 용도를 가진다.
일부의 예시적인 실시에서, 이 방법은 유효량의 화합물(C9, C11, C13-C16, C23 및 C34로 이루어지는 군으로부터 선택됨) 또는 염 또는 이의 혼합물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 대상체를 위한 항균성 면역요법을 제공한다.
항바이러스성 효과:
항바이러스성 약물은 바이러스성 감염의 치료를 위해 특이적으로 사용되는 의약의 부류이다. 항생제와 같이, 특이적 항바이러스제는 특이적 바이러스에 사용된다. 이들은 숙주에 비교적 무해하므로, 감염을 치료하는 데에 사용될 수 있다. 항바이러스성 약물은 단지 몇몇의 바이러스성 질환을 치료하는 데에만 이용가능하다. 2개의 유용한 항바이러스제는 뉴클레오시드 유사체 및 인터페론이다. 인터페론의 3가지 부류에는 알파- 베타- 및 감마-인터페론이 있다. 알파 및 베타 인터페론은 바이러스 감염된 세포에 의해 분비된 사이토킨이다. 이들은 인접한 세포 상의 특이적 수용체에 결합하고 이들을 바이러스에 의한 감염으로부터 보호한다. 이들은 바이러스에 의한 침윤에 대한 즉각적인 보호 숙주 반응의 일부를 형성한다. 이들의 직접적인 항바이러스성 효과 이외에, 알파 및 베타 인터페론은 또한 감염된 세포의 표면 상에서 부류 I 및 부류 II MHC 분자의 발현을 향상시키고, 이러한 방식으로 바이러스성 항원의 특이적 면역성 세포의 제시(presentation)를 향상시킨다. 이들의 존재는 바이러스성 감염의 급성 상 동안 체액에서 입증될 수 있다. 지금까지 재조합 알파 및 베타 인터페론은 이용가능하였고 만성 간염 B 및 C 바이러스 감염의 치료를 위해 사용하여 왔다. 그러나, 부작용, 예컨대 발열, 불쾌감(malaise) 및 체중 감소로 인해 사용이 제한된다. 감마 인터페론 (면역성 인터페론)은 TH1 CD4 세포에 의해 분비된 사이토킨이다. 이의 기능은 특이적 T 세포 매개 면역성 반응을 향상시키는 것이다.
인터페론의 작용 기전은 1) 특이적 면역성 반응의 향상을 포함한다. 감염된 세포의 표면 상에서 MHC 부류 I 분자의 발현을 증가시킴으로써, 인터페론은 특이적 세포독성 T 세포가 감염된 세포를 인식하고 사멸시킬 기회; 및 2) 직접적인 항바이러스성 효과: a) 바이러스성 mRNA의 분해 및 b) 단백질 합성의 억제 (이는 새로운 세포의 감염을 막음)를 증가시킨다.
한 관점에서, 본 발명의 합성 α-GalCer 유사체는 다양한 감염성 바이러스의 항바이러스성 치료 및 이의 예방을 위해 사용된다. 본 발명의 방법을 통해, 또는 NKT, 백신 또는 본 발명의 조성물을 이용하여 수행할 수 있는 보호 면역성 반응의 자극이 바람직하고, 감염성 바이러스의 예에는, 이들로 한정되지는 않지만, 레트로비리다에(Retroviridae) (예를 들면, 인간 면역결핍 바이러스, 예컨대 HIV-1 (또한 HTLV-III, LAV 또는 HTLV-III/LAV, 또는 HIV-III로도 지칭됨); 및 다른 단리물, 예컨대 HIV-LP; 피코르나비리다에(Picornaviridae) (예를 들면, 폴리오 바이러스, 간염 A 바이러스; 엔테로바이러스, 인간 콕사키 바이러스, 리노바이러스, 에코바이러스); 칼시비리다에(Calciviridae) (예를 들면, 위장염을 유발하는 계통); 토가비리다에(Togaviridae) (예를 들면, 말 뇌염 바이러스, 풍진 바이러스); 플라비리다에(Flaviridae) (예를 들면, 뎅기열 바이러스, 뇌염 바이러스, 황열 바이러스); 코로나비리다에(Coronaviridae) (예를 들면, 코로나바이러스); 라브도비리다에(Rhabdoviridae) (예를 들면, 수포성 구내염 바이러스, 광견병 바이러스); 필로비리다에(Filoviridae) (예를 들면, 에볼라 바이러스); 파라믹소비리다에(Paramyxoviridae) (예를 들면, 파라인플루엔자 바이러스, 이하선염 바이러스, 홍역 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스); 오르토믹소비리다에(Orthomyxoviridae) (예를 들면 인플루엔자 바이러스); 분가비리다에(Bungaviridae) (예를 들면, 한탄(Hantaan) 바이러스, 분가 바이러스, 플레보바이러스 및 나이로(Nairo) 바이러스); 아레나 비리다에(Arena viridae) (출혈성 열병 바이러스); 레오비리다에(Reoviridae) (예를 들면, 레오바이러스, 오비바이러스 및 로타바이러스); 비르나비리다에(Birnaviridae); 헤파드나비리다에(Hepadnaviridae) (간염 B 바이러스); 파보비리다에(Parvoviridae) (파보바이러스); 파포바비리다에(Papovaviridae) (유두종 바이러스, 폴리오마 바이러스); 아데노비리다에(Adenoviridae) (대부분의 아데노바이러스); 헤르페스비리다에(Herpesviridae) (단순 포진 바이러스 (HSV; herpes simplex virus) 1 및 2, 수두 대상 포진 바이러스, 세포거대바이러스 (CMV), 헤르페스 바이러스'); 폭스비리다에(Poxviridae) (바리올라 바이러스, 벡시니아 바이러스, 폭스 바이러스); 및 이리도비리다에(Iridoviridae) (예를 들면 아프리카 돼지 열병 바이러스); 및 미분류 바이러스 (예를 들면, 해면양뇌증(Spongiform encephalopathies)의 유병기생충(etiological agents), 델타 간염의 제제 (간염 B 바이러스의 결함이 있는 부수체(satellite)로 간주됨), 비-A, 비-B 간염의 제제 (부류 1 = 내부적으로 전달됨; 부류 2 = 비경구적으로 전달됨 (즉, 간염 C); 노로(Norwalk) 바이러스 및 관련 바이러스, 및 아스트로바이러스)가 포함된다.
바이러스성
챌린지
- 인플루엔자 바이러스
H1N1
감염
α-
GalCer
유사체의
IP
주사를 통한 치료
도 58은 사후 인플루엔자 바이러스 H1N1 감염 0 내지 12일에서의 마우스 생존율을 나타낸다. 마우스를 2 μg의 α-GalCer (C1) 또는 α- GalCer 유사체 C2, C3, C9, C11, C13, C14 및 C16으로 처치하고 (IP 주사), 대조군 DMSO와 비교하였다. 3개의 상이한 처치 스케쥴을 테스트하였다. 도 58A는 사후-H1N1 바이러스 챌린지 30분에서 출발하여 BALB/c 마우스를 처치하는 경우의 생존율을 나타낸다. 대조군과 비교한 P 값은 C1: 0.4554, C2: 0.5149, C3: 0.5764, C9: 0.5466, C11: 0.2031, C16: 0.0359이다. 도 58B는 H1N1 (WSN)으로의 바이러스 챌린지 2주 전에 출발하여 BALB/c 마우스를 처치하는 경우의 생존율을 나타낸다. 마우스를 -14일, -10일, -3일, 0.5시간, 2일, 4일, 6일, 8일, 10일 및 12일에 2 μg의 대조군, α- GalCer (C1) 또는 α- GalCer 유사체로 처치한다(IP 주사). 바이러스 챌린지 2주 전에 처치를 시작하고 1주일에 2번 수행하는 경우, 마우스는 테스트한 모든 유사체 (C9, C11, C13 및 C14)를 포함하는 α- GalCer 유사체 처치에 의해 상당히 향상된 생존율을 나타낸다. 대조군과 비교한 P 값은 C1: 0.000116, C9: 0.000126, C11: 0.02627, C13: 0.000027, 및 C14: 0.000147이다. 도 59는 보다 많은 투여량의 인플루엔자 바이러스 H1N1로 감염된 마우스의 누적 생존 비율을 나타낸다. 도 59A에서, BALB/c 마우스를 H1N1 (WSN)으로의 바이러스 챌린지 2주 전에 출발하여 처치하였다. 마우스를 -14일, -10일, -3일, 0.5시간, 2일, 4일, 및 6일에 2 μg의 대조군, α-GalCer (C1) 또는 α-GalCer 유사체로 처치한다. 기 1는 대조군이다. 기 6를 α-GalCer (C1)로 처치한다 (IP 주사). 기 7를 α-GalCer 유사체 C13으로 처치한다. 기 8을 α-GalCer 유사체 C14로 처치한다. 기 9를 α-GalCer 유사체 C16으로 처치한다. α-GalCer 유사체 C16은 연장된 생존율을 나타내고, C16의 표시는 직접적인 항바이러스성 효과를 나타낸다.
α-
GalCer
유사체의
비강내
투여를 통한 치료
도 59B는 H1N1로 감염된 마우스의 누적 생존 비율을 나타낸다. BALB/c 마우스를 비강내 경로를 통해 대조군, α-GalCer (C1) 또는 α-GalCer 유사체 C13, C14 또는 C16으로 H1N1 (WSN)에 의한 바이러스 챌린지 1시간 전에 처치한다. C13은 연장된 생존율을 나타내고, 이는 직접적인 항바이러스성 효과를 암시한다. 일반적으로, 특정 α-GalCer 유사체는 직접적인 항바이러스성 효과를 발휘할 수 있거나, 간접적으로 면역성 자극을 통해 작용할 수 있다. 도 60은 시험관내 마딘-다비 캐닌 신장 (MDCK; Madin-Darby canine kidney) 세포의 세포 변성 효과(CPE; cytopathetic effect)를 나타낸다. MDCK 세포를 비히클(vehicle), α-GalCer 또는 α-GalCer 유사체 C13, C14 또는 C16 중 하나로 4시간 동안 10 μg/ml로 예비처치한 후 FLU-A 바이러스 항원형 H1N1 (WSN)으로 10TCID50에서 감염시킨다. MDCK 세포 내 바이러스 역가를 사후-감염 48시간에서 측정하였다 (오른쪽 패널). α-GalCer 뿐만 아니라 테스트한 3개의 α-GalCer 유사체는 시험관내 H1N1 바이러스의 진입/복제의 약간의 억제를 나타낸다.
항박테리아
효과:
1940년대에 페니실린을 임상 용도로 도입한 이래로, 항박테리아제는 수많은 생명을 구하였다. 그러나, 항균 내성의 연장의 영향으로 예비-항생제 상태(pre-antibiotic era)로의 돌아가게 한다. 합성 당지질, 예컨대 α-GalCer 및 천연 박테리아 당지질은 NKT 세포를 활성화하고 숙주의 항박테리아 작용에 기여하는 CD1-d 리간드로 나타난다. α-GalCer의 항박테리아 활성은 마이코박테리움 투베르쿨로시스 감염의 개선, 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa)에 의한 폐 감염의 제거로 나타난다. 당지질을 통한 NKT 셀의 활성화에 의해 마우스에서의 스핑고모나스 캡슐라타(Spingomonas capsulate) 및 에를리키아 무리스(Ehrlichia muris)에 의한 감염이 또한 약독화된다.
본 발명의 방법을 통해, 또는 NKT, 백신 또는 본 발명의 조성물을 이용하여 수행할 수 있는 보호 면역성 반응의 자극이 바람직한, 감염성 박테리아의 예에는, 이들로 한정되지는 않지만, 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori), 보렐리아 부르그도르페리(Borellia burgdorferi), 레기오넬라 네우모필리아(Legionella pneumophilia), 클레브시엘라 네우모니아에(Klebsiella Pneumoniae), 마이코박테리아종 (예를 들면 결핵균(M. tuberculosis), 조형결핵균(M. avium), M. 인트라셀룰러(Intracellulare), M. 칸사이(kansaii), M. 고르도나에(gordonae)), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 니세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae), 니세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis), 리스테리아 모노사이토젠(Listeria monocytogenes), 스트렙토코쿠스 파이오젠(Streptococcus pyogenes) (기 A 스트렙토코쿠스), 스트렙토코쿠스 아갈락티아에(agalactiae) (기 B 스트렙토코쿠스), 스트렙토코쿠스 (비리단(viridans) 기), 스트렙토코쿠스 파에칼리스(faecalis), 스트렙토코쿠스 보비스(bovis), 스트렙토코쿠스 (아나에로빅 종(anaerobic sps.)), 스트렙토코쿠스 뉴모니아(pneumoniae), 병원성 캄필로박터 종(Campylobactersp.), 엔터로코쿠스 종(Enterococcus sp.), 클라미디아 종(Chlamidia sp.), 해모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 바실루스 안트라시스(Bacillus antracis), 코리네박테리움 디프테리아(corynebacterium diphtheriae), 코리네박테리움 종(corynebacterium sp.), 에리시펠로트릭스 루시오파티아(Erysipelothrix rhusiopathiae), 클로스티리디움 퍼프링거(Clostridium perfringers), 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani), 엔테로박터 애로겐(Enterobacter aerogenes), 클레브시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 파스투렐라 물토시다(Pasturella multocida), 박테로이드 종(Bacteroides sp.), 푸조박테리움 누클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 스트렙토바실루스 모닐리포르미스(Streptobacillus moniliformis), 트레포네마 팔리디움(Treponema pallidium), 트레포네마 페테누(Treponema pertenue), 렙토스피라(Leptospira), 악티노마이세스 이스라엘리(Actinomyces israelli), 스핑고모나스 캡슐라타(Sphingomonas capsulata) 및 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis)가 포함된다.
향상된 박테리아 제거 -
스핑고모나스
캡슐라타
감염 마우스
스핑고모나스 캡슐라타는 많은 곳, 예컨대 공기 및 물에서 발견되는 통상적인 환경적 박테리아 계통이다. 그의 황색 결장 색으로 인해 한천 영양 배지 플레이트 상에서 쉽게 확인될 수 있다. 대부분의 그램 음성 박테리아와 달리, 스핑고모나스 캡슐라타는 숙주 항박테리아 활성의 활성화를 위해 동물에 의해 사용되는 지질다당류(LPS)를 함유하지 않는다. 당지질 항원의 항박테리아성 활성이 당지질 결합된-CD1-d 분자에 의한 NKT 세포의 활성화를 통해 매개되고, 스핑고모나스 캡슐라타 감염의 질환 모델을 사용하는 항박테리아성 효능의 평가는 당지질 결합에 의해 활성화되는 NKT 매개 경로의 영향에 집중될 것이다. 6 내지 8주된 암컷 C57BL/6 마우스에 스핑고모나스 캡슐라타 셀을 IP 주사한다. 감염 4시간 후에, 마우스에 대조군, α-GalCer (C1) 또는 α-GalCer 유사체 (C3, C9, C11, C14, C16 또는 C17)를 50 또는 100 μg/kg로 IP 주사한다. 박테리아성 감염 24시간 후에, 마우스에서 간을 제거하고 균질화한다. 간 호모제네이트로 스핑고모나스 캡슐라타의 결장 형성 단위 (CFU) 수를 영양 배지 플레이트에 묽힌 샘플을 플레이팅하여 측정한다. 결장을 48시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 후에 카운팅한다. 도 61A는 100μg/kg에서 α-GalCer 및 C11, C14, 및 C16로 처치한 기의 CFU 수가, 박테리아성 감염 24시간 후에 대조군 기보다 상당히 감소한다는 것을 나타낸다. 이들 α-GalCer 유사체의 항박테리아성 효능을 확인하기 위해, 동일한 질환 모델에서 감염 마우스를 50 μg/kg로 처치함으로써 조사를 반복하여 다른 조사를 수행한다. 도 61B는 C11, C14, C16, 및 또한 C15로 처치된 마우스의 항박테리아성 효능이 미처치 군과 비교하여 유의하다는 것을 나타낸다. 효과적인 3개의 기, C1, C11, 및 C15 중, 간의 그램 당 CFU의 값의 차이는 통계학적으로 유의하지 않다. 도 63은 50 μg/kg로 C23 및 C34로 처치된 기의 CFU 수 (폐에서)가 미처치 군과 비교하여 유의하다는 것을 나타낸다. 마우스를 C23 및 C34로 처치한 후의 간에서의 CFU 수에서 유사한 결과가 발견된다.
향상된 박테리아
클리어런스
-
클레브시엘라
뉴모니애
(
Klebsiella
Pneumoniae
) 감염된 마우스
케이. 뉴모니애는 간 농양을 발생시키고 대만의 당뇨병성 환자에서 중질환이 되게 하는 그람 음성 박테리아이다. 도 62는 C1 및 C14 둘다가 주입 후 마우스 폐 및 간에서의 박테리아 양을 유의적으로 감소시킬 수 있다는 것을 나타낸다. BALB/cByl 암컷 마우스에 살아있는 케이. 뉴모니애에 대한 단일 투여량을 경구 섭식으로 투여하였다. 박테리아 감염 후에 대조물, α-GalCer 또는 α-GalCer 유사체 C14를 4-시간 및 8-시간에서 2회 100 μg/kg을 마우스에 주입하였다. 감염 후 24시간째에 각 마우스로부터 간 및 폐 둘다를 수집하여 균질화시켰다. 박테리아 수를 상기한 바와 유사하게 측정하였다.
C14에 의한 박테리아 클리어런스 정도는 도 62에 나타난 바와 같이 C1에 의한 클리어런스보다 더 크다는 것을 알 수 있었다.
항진균성 효과:
T 보조 세포 타입 1 (TH1) 세포-매개 면역은 다양한 감염성 진균에 대한 보호에 있어서 중대한 역할을 한다. 추가의 또다른 측면에서, 본 개시의 α-GalCer 유사체를 항진균 요법에서 사용할 수 있다. 진균에 의해 발생된 감염을 치료하고, 약화된 면역계를 가진 환자에서 진균성 감염의 전개를 예방하기 위하여, 항진균성 약물을 사용하였다. 진균성 감염은 면역억제된 환자에서 이환율 및 사망률에 기여하는 선도 인자 중 하나가 된다.
진균성 질환에 대한 선천성 숙주 방어는 식세포 (PMNL 및 대식세포) 작용을 기반으로 한다; 상기 세포의 수 및 기능 둘다가 집락-자극 인자 (CSF)에 의해 조절될 수 있다. 반면에, 후천성 방어는 사이토킨, 예컨대 IL-2 및 IFN-γ에 의해 유도되고 조절되는 항원-제시 세포, T 림프구, B 림프구 및 NK 간의 상호작용을 요구하는 세포성 및 체액성 면역이다. 기회감염진균에 대한 숙주 방어에서 사이토킨을 통한 면역성 활성화의 잠재적인 중요성은 수가지 연구의 주제이며, 칸디다(Candida) 및 아스퍼질러스(aspergillus) 감염에 대한 새로운 항진균성 책략에 대한 몇가지 흥미로운 질문을 제기하였다. 사이토킨에 대한 상이한 잠재적 역할이 기재되어 있다. 먼저, 진균 및 그의 항원에의 노출은 IL-2, IFN-γ, 종양 괴사 인자-α (TNF-α), 과립구 집락-자극 인자 (G-CSF) 및 과립구 대식세포 집락-자극 인자 (GM-CSF)의 방출을 일으킬 수 있다. 상기 사이토킨은 다음으로 활성화되어 칸디다 및 아스퍼질러스 종에 대한 식세포의 항진균성 기능을 향상시킬 수 있다.
방어 면역 반응의 자극이 바람직하고, 본 개시의 α-GalCer 유사체 단독 또는 항진균성 약물과의 조합물을 투여함으로써 달성할 수 있는 감염성 진균의 예로는, 이들로 한정되지 않지만, 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 히스토플라스마 캡슐라툼(Histoplasma capsulatum), 코시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis), 블라스토마이세스 데르마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans)를 포함한다. 다른 감염성 생물체 (즉, 원생생물)은 열원충 종(Plasmodium sp.), 리슈만편모충 종(Leishmania sp.), 주혈흡충 종(Schistosoma sp.) 및 톡소포자충 종(Toxoplasma sp.)을 포함한다.
뮤린
질환 모델에서 박테리아 및 바이러스 감염을 억제하는 합성 α-
갈락토실
세라마이드
유사체
천연 살해 T 세포는 CD1-d 분자에 대해 제시된 지질 및 당지질 항원의 인식을 통해 다양한 면역 과정에 기여한다. CD1-d은 단백질 유사 주조직적합복합체 클래스 I이며, 대부분의 단핵세포, 대식세포, 수상 세포, B 세포, 뿐만 아니라 비림프성 세포에서 발현한다. CD1-d는 사이토킨, 예컨대 IFN-γ 및 IL-4의 Th1 및 Th2 생성을 통해 숙주 선천성 방어 시스템에 연관되는 CD1 d-제한 T 세포 (또는 NKT 세포)에 대한 당지질 항원을 제시한다. CD1-d과 결합하는 다양한 리간드 중에서, 가장 잘 연구된 리간드는 알파-갈락토실 세라마이드 (α-GalCer)이며, 이는 해양 해면동물인 아겔라스 마우리티아누스(Agelas mauritianus) 유래의 합성된 구조 최적화 α-연결 글리코스핑고리피드이다. 합성 당지질, 예컨대 알파-갈락토실 세라마이드 (α-GalCer) 및 천연 박테리아 당지질은 NKT 세포를 활성화시키는 CD1-d 리간드로서 보고되어 있다. α-GalCer 처리 마우스가 다양한 감염의 방어에 착수하였다. 다수의 α-GalCer 유사체를 합성하였다. 이의 면역 조정 활성이 CD1-d와의 결합에 관련이 있는 것으로 나타났다. CD1-d 어레이 결합을 이용한 최근 연구는 NKT 세포에 의한 IFN-γ 및 IL-4의 분비가 α-GalCer 유사체의 CD1-d 결합 포켓과의 결합 상수에 의해 결정되고, 분비된 Th1 및 Th2 사이토킨의 비율이 상기 분자의 면역 조성 특성에 대한 우세한 인자 중 하나인 것으로 확립하였다.
박테리아 및 바이러스 감염 둘다의 방어용 특정 합성 당지질의 효능은 수가지 뮤린 감염성 질환 모델을 이용하여 결정되었다. 모든 시험된 합성 α-GalCer 유사체 중에서, 4-(4-플루오로페녹시)페닐 옥타노일 수식된 α-GalCer (C34)는 뮤린 모델에서 박테리아 및 바이러스 감염에 대한 방어에 있어서 매우 효과적이었다. C34의 방어 효과는 예방 방식으로 주어질 때 또는 감염 직후에 매우 효과적이었다.
스핑고모나스
캡슐라타
(
Sphingomonas
capsulata
) 감염된 마우스를 이용한 α-GalCer 유사체의
항박테리아
효능
스핑고모나스 캡슐라타 감염된 마우스를 감염 모델로서 사용하여 특정 합성 당지질의 항박테리아 효능을 평가하였다. 에스. 캡슐라타는 통상적인 환경 박테리아 균주이며, 공기 및 물과 같은 대부분의 장소에서 발견된다. 이는 그의 황색 콜로니 색깔로 인하여 영양 한천 플레이트 상에서 용이하게 식별될 수 있다. 대부분의 그람 음성 박테리아와는 다르게, 스핑고모나스 캡슐라타는, 숙주 항박테리아 활성의 활성화를 위해 동물이 사용하는 리포다당질 (LPS)을 함유하지 않는다. 당지질의 항박테리아 활성은 당지질 결합된-CD1-d 분자에 의한 NKT 세포의 활성화를 통해 매개되며, 스핑고모나스 캡슐라타 감염의 질환 모델을 사용한 항박테리아 효능의 평가는 당지질 결합에 의해 활성화된 NKT 매개 경로에 효과가 집중될 것이다. 도 65는 박테리아 감염 후 24시간째에 100 μg/kg의 C1 , C11 , C14 또는 C16으로 처리한 군의 CFU 수는 대조군보다 유의하게 낮다는 것을 나타낸다. 반대로, C3, C9 및 C17로 처리된 군의 CFU 차이는 대조군 마우스 중에서 나타난 CFU와 비교하여 유의하지 않았다. 이들 당지질의 추가의 항박테리아 효능 연구는 동일한 질환 모델에서 감염된 마우스를 50 μg/kg 당지질로 처리하여 행하였다. 유의하게 감소된 CFU 값은 비처리군과 비교하여 C1, C11, C14, 및 C16로 처리된 마우스의 간에서 관찰되었다 (데이타 도시 생략). α-GalCer은, 그 차이가 유의하지 않지만, C11, C14 및 C16보다 생체내에서 에스. 캡슐라타를 억제하는데 있어서 보다 효과적인 것으로 보였다.
Th1 사이토킨의 생성은 당지질의 항종양, 항박테리아 및 항바이러스성 효과와 상호관련이 있는 것으로 생각되는 반면, Th2 사이토킨을 유도하는 능력은 특정 자가면역성 질환, 예컨대 타입 1 당뇨병의 악화와 상호관련이 있는 것으로 생각된다. 다수의 α-GalCer 유사체가 최근에 합성되었고, 이의 사이토킨 유도 프로파일은 시험관내 또는 생체내에서 특징규명되었다. NKT 세포에서 IFN-γ 분비를 고도 수준으로 유도시키는 것으로 알려진 α-GalCer 및 3개의 유사체, 7DW8-5, C23 및 C34의 항박테리아 및 항바이러스성 특성을 연구하였다. 상기 4개의 당지질은 최초로 C57/b 마우스에서 에스. 캡슐라타 감염 모델을 사용하여 평가하였다. 도 72의 표는 50 μg/kg의 4가지 모든 당지질이 0.001 미만의 p값을 가지면서 비히클 처리한 마우스보다 더 큰 정도로 에스. 캡슐라타 감염을 억제할 수 있다는 것을 나타낸다. 그러나, 4개의 당지질 간에, 이들의 효능은 에스. 캡슐라타 감염 모델에서 유의하게 다르지 않았다.
발광
스타필로코쿠스
아우레우스
(
Staphylococcus
aureus
) (
Xen29
)를 사용한 대퇴-창상 마우스 모델에서의 α-
GalCer
유사체의
항박테리아
활성
C57/B 마우스에 에스. 캡슐라타를 복막내 주입하여 일과성 감염을 일으키고, 당지질로의 처리는 감염 후 24시간 내에 클리어런스를 촉진시켰다. 그러나, 임의의 처리 부재에서는, 감염이 2 내지 3일 내에 클리어런스되었다. α-GalCer 유사체의 항박테리아 효능을 평가하기 위해, 마우스 후방 대퇴 근육에 발광 에스. 아우레우스 Xen29를 주입한 마우스 중증 대퇴 창상을 갖는 보다 적합한 질환 모델을 사용하였다. 에스. 아우레우스 Xen29 감염은, 실험 마우스의 수를 감소시키고 항박테리아 연구를 통한 감염 정도를 반복 조사하기 위해, 생존 마우스의 화상 분석에 의해 모니터링될 수 있다. 도 66 (A-B)는 대퇴-근육 감염된 마우스를 α-GalCer 및 그의 유사체로 처리하면 대부분의 처리 마우스의 클리어런스는 완전하였다; 그러나, 비히클 처리군와 비교한 통계적 유의차 (p<0.01)는 C34를 투여한 군에서만 오로지 유의하였다. 따라서, 이 결과는 C34 처리가 상기 질환 모델에서 박테리아 클리어런스에 유용할 수 있다는 큰 가능성을 제시한다.
일본 뇌염 바이러스 (
JEV
) 감염 동물 모델을 사용한 α-
GalCer
유사체의
항바이러스성
평가
당지질이 일본 뇌염 바이러스 (JEV) 감염에 대한 방어 면역을 유발시키는지 여부를 결정하기 위해, 마우스에서 바이러스 접종 1일 전 및 1일 후에 당지질을 제공하는 2회 투여 프로토콜을 사용하였다. 원형 당지질 α-GalCer (C1) 및 당지질 유도체 C23은 용매 대조군과 비교하여 마우스 생존율을 21% 내지 57%로 증가시켰다 (도 67). 게다가, 방어 효과는 당지질, 예컨대 C34 및 7DW8-5를 투여한 마우스에서 각각 64% 및 71%의 생존율을 갖는 것으로 매우 훨씬 완전하였다 (도 67). 이러한 결과는 당지질-자극된 NKT 세포가 JEV 감염에 대한 숙주 방어에 기여할 것이라는 것을 강하게 나타낸다. 유사하게, JEV 감염 방어에 효과적인 상기 유사체는 인플루엔자 감염된 Balb/C 마우스의 생존율을 연장시킨다는 것으로 밝혀졌다 (데이타 도시 생략). 당지질-매개 면역 방어용 요건을 추가로 분석하기 위하여, 시험을 행하여 C34 및 7DW8-5의 유용한 효과가 특정한 면역 결핍 마우스에서도 여전히 나타나는지 여부를 결정하였다. Stat-1, 이뮤노글로불린 μ-쇄 또는 CD8α-쇄 결핍 마우스에서 유용한 효과가 나타나지 않았기 때문에, 명백히 선천성 및 적응성 면역 성분 둘다는 JEV에 대한 방어 면역을 유발시키는데 상기 당지질을 필요로 하였다 (도 68 (A 내지 C)).
α-
GalCer
유사체의
항감염성
활성은
예방적
방식으로 투여하는 경우에 매우 효과적이다.
당지질을 바이러스 감염 후에 투여하는 경우에 이들이 방어 면역을 생성시킬 수 있는지 여부를 측정하기 위해 평가를 수행하였다. 상기의 2회 투여 프로토콜에 더하여, 몇가지 1회 투여 프로토콜을 또한 시험하였다.
당지질 C34 및 7DW8-5를 바이러스 감염 1일 전 또는 당일에 단지 1회만 투여하면, 2회 용량 프로토콜과 비교해서 보다 약한 보호 효과가 유발되었다 (도 69 (A-B)). 그러나, 당지질을 바이러스 감염 1일 후에 투여한 경우에는 JEV 접종에 대한 보호를 관찰할 수 없었는데 (도 69 (A-B)), 이는 당지질-매개 면역 조절이 감염 시간 의존적 사건임을 제안하는 것이다. C34 투여 시간 대 바이러스 감염 시간의 효과를 또한 인플루엔자 감염 Balb/C 마우스에서 평가하였다. 인플루엔자 감염 1일 전에 C34를 투여하는 것이 마우스 생존에 가장 유리하였다 (P 값 < 0.0001). 인플루엔자 감염 1일 전 및 1일 후 둘 다에 투여되는 2회 용량 C34으로의 치료 또한 비히클 치료군보다 생존을 유의하게 연장시킬 수 있었다 (P 값 = 0.0002). JEV 감염과 유사하게, 인플루엔자 감염 1일 후에 단일 용량의 C34를 투여하는 것은 생존에 유리하지 않았다 (도 7). 에스 . 아우레우스 대퇴부 감염 모델에서의 박테리아 청소율에 대한 C34 투여 시간의 효과를 또한 연구하였다. 마우스 감염을 감염 48시간 후에 검사하였을 때, 박테리아 청소율은 대퇴부 감염 도입 직후에 C34를 투여한 마우스의 군에서 가장 완전하였다. 대퇴부 감염 6시간 후에 C34를 투여받은 군에 대해서는, 박테리아 청소율에서의 개선이 관찰되지 않았지만, 비히클 치료군에 대한 차이는 유의하지 않았다 (도 71). 유사한 박테리아 청소율 프로파일이 감염 72시간 후 검사 시에 관찰되었다 (데이터 나타내지 않음).
박테리아 및 바이러스 감염 뮤린 모델 둘 다를 몇몇 α-GalCer 유사체의 감염 억제 효율을 평가하는 데 사용하여, 4-(4-플루오로페녹시)페닐 옥타노일 개질된 α-GalCer (C34)가 해당 모델에서 가장 효율적임이 밝혀졌다. 이전의 연구에서는 α-GalCer 치료가 해로운 부작용의 결합과 복잡하게 얽혀있어서, 치료 효능이 다양한 매개변수에 의해 영향을 받는 것으로 나타나 있었다. 천연 킬러 (NKT) 세포는 미생물에 의해 활성화된 수상 세포에 의해 생성된 사이토킨에 의해서 뿐만 아니라 감염 관련 당지질 자극에 대해서도 반응한다. 따라서, 당지질 및 감염 접종 둘 다를 받은 실험 마우스에서는, 뮤린 면역계에 대한 복잡한 자극이 예상되었다. 사이토킨 반응은 인플루엔자 감염된 마우스, α-GalCer-치료된 마우스, 또는 인플루엔자 감염되고 α-GalCer-치료된 마우스에서 기록되었다. 다수의 이중으로 자극된 마우스에서 보다 많은 혈청 사이토킨이 발견되었다. 그러나, 프로파일은 상이한 관찰 시간에서 복잡하고 다양하였다.
지질다당류-유도성 쇼크에 대한 보호에서의 α-GalCer의 효능은 투여 시간이 결정적인 것으로 밝혀진 반면, 당지질은 LPS 접종 전 또는 접종 후 2시간 내에 투여되는 것이 필요하였다. 박테리아 및 바이러스 감염 모델을 사용한 본 발명에서의 생체내 연구에서도 또한 C34는 감염 전 또는 직후에 투여될 때 감염 억제에 가장 효과적인 것으로 나타났다. 감염은 질환 진행과 밀접하게 관계된 상이한 동력학을 갖는 다양한 면역 자극을 유발한다. 감염에 대한 보호를 위해서는, 당지질의 투여량 및 투여 시간 둘 다를 유리하도록 미세하게 조율하는 것이 필요할 것으로 생각된다.
자가면역 질환에 대한 면역요법
자가면역성은 자가-항원 및 조직에 대한 염증성 반응을 유발하는 면역계 내 조절 장애로부터 발생한다. 자가면역 질환은 미국에서 암 및 심장 질환 다음의 3번째로 가장 일반적인 질환 범주에 속하며; 인구의 대략 5％-8％ 또는 1천 4백만 내지 2천 2백만 명을 감염시켰다. T 림프구에 의한 자가-항원 파괴를 동반하는 자가면역 질환에는, 이들로 한정되지는 않지만, 다발성 경화증, 인슐린-의존성 진성 당뇨병 및 류마티스성 관절염이 포함된다.
현재의 학설에 따르면, 심근염과 같은 염증성 자가면역 질환은 주로 TH1 반응에 기인하고, IFN-γ를 기본형 사이토킨으로 하며; IL-4가 우세한 TH2 반응은 자가면역성을 감소시키는 것으로 생각된다. 본 개시내용의 α-GalCer 유사체는 TH2-성향의 면역원성 반응이 개시되도록 설계될 수 있기 때문에, 이들 α-GalCer 유사체는 자가면역 질환에 대한 면역요법으로 사용될 수 있다.
α-
GalCer
유사체의
아주반트
활성
근육내
투여된
pCHA5
백신에 대한 α-
GalCer
유사체의
아주반트
활성
종래에, 전기천공법/근육내 (EPIM) 경로에 의한 30 ㎍ pCHA5로의 마우스 면역화는 고 역가의 항-HA 항체를 유도하고, NIBRG-14 바이러스의 치사 접종에 대한 100％ 보호를 제공하는 것으로 나타난 바 있었다. EP/IM에 의해 전달된 이러한 고 용량 pCHA5에 의해서, 당지질의 첨가는 면역 반응을 추가로 향상시킬 수 없었다. 그러므로, EP/IM 대신 근육내 경로에 의해 전달된 pCHA5 백신에 대한 당지질의 아주반트 효과를 시험하였다. 마우스에 2 ㎍ 당지질 (C1, C23, C26, C34 및 7DW8-5)과 함께 또는 이것 없이 30 ㎍ pCHA5를 근육내 주사하고, 2주 후에 pCHA5를 단독으로 추가주사하였다. 혈청을 수집하고, 제2 백신화 2주 후에 NIBRG-14 바이러스를 마우스에 접종하였다. pCHA5만 주사한 마우스에서는 유의한 항-HA-특이성 IgG 항체가 관찰된 반면, pVAX를 투여받은 마우스에서는 검출된 것이 없었다. pCHA5만 주사한 군 (16180 ± 5261)과 비교해서, 마우스 혈청은 아주반트로서 C1 (24250 ± 3206) 또는 C34 (23622 ± 5516)를 투여받은 군에서는 약간 더 높은 항체 역가를 나타내었고, C23 (14538 ± 3223) 및 C26 (16350 ± 2193) 군에서는 유사한 수준을 나타내었다 (도 73A). 바이러스 접종 시, pVAX 비히클을 투여받은 마우스는 어느 것도 생존하지 못한 반면, 아주반트로서 C1, C23, C26, C34를 투여받은 마우스는 모두 생존하였다. pCHA5만 주사한 군의 생존율 (80％)은 당지질-아주반트 투여군 만큼 양호하지는 않았지만, 생존율에서의 차이가 통계적으로 유의하지는 않았다 (도 73B). 그러므로, 이들 당지질의 아주반트 효과는 본 투여계획에서 명확하게 설명되지는 않았다. 그러나, 근육내 주사 경로는 백신 전달에 대해서 평가되지 않았었다.
다음으로, IM 주사에 의해 전달된 단일 용량의 pCHA5에 대한 당지질의 아주반트 효과를 평가하였다. 마우스를 당지질 또는 명반과 함께 또는 이것 없이 단일 용량의 50 마이크로그램 pCHA5로 근육내 백신화하였다. 3주 후, 혈청을 수집하고, 마우스에 NIBRG-14 바이러스를 접종하였다. HA 특이성 항체 반응의 유도가 pCHA5 (3692 ± 897.5) 백신화 마우스에서 관찰되었고, 일시적 명반 (2192 ± 547.5) 아주반트는 보다 양호한 효과를 나타내지 않았다. 그러나, 당지질 아주반트 C34 (7208 ± 1482) 존재 하의 치료군에서는 증가된 역가가 관찰된었다 (도 74A). 유사하게, 기능적 IFN-γ ELISPOT 분석에 의해서 측정된 바와 같은 향상된 세포 면역성이 아주반트로서의 당지질 존재 하에 검출되었다 (도 74B). pCHA5에서의 IFN-γ 분비 세포는 2 x 105개 세포당 29.5 ± 0.5개였고, 당지질 아주반트 투여군에서는, C1에서 66.33 ± 5.3개, C34에서 176.7 ± 2.3개, 7DW8-5에서 69.17 ± 1.5개, 및 명반에서 68.56 ± 8.72개와 같이 유의하게 증가하였다 (p < 0.05). 치사 용량의 NIBRG-14 바이러스 접종 시, 대조군 (pVAX)에서의 동물은 어느 것도 생존하지 못하였고, pCHA5만 주사한 군에 대해서는 20％가 생존하였다. 아주반트를 투여받은 마우스의 생존율은 C1 및 7DW8-5 군에 대해 40％, C34에 대해 60％, 및 명반에 대해 0％였다. 명반과 당지질 아주반트 군 사이의 생존율 차이는 통계적으로 유의하였다 (P < 0.05) (도 74C). 종합적으로, 당지질은 HA-특이성 항체 역가를 향상시키고, IFN-γ 생성 세포의 수를 상승시키며, H5N1 바이러스 치사 접종 후의 생존율을 개선시킬 수 있었다.
pCHA5
-
II
백신에 대한 α-
GalCer
유사체의
아주반트
활성
pCHA5 DNA 컨센서스 서열은 467 H5N1 바이러스 종으로부터 2년 전에 전달되었기 때문에, 사용할 수 없게 되었을 수 있다. 1192 전장 HA 서열을 수집하고, pCHA5-II로 명명된 새로운 컨센서스 HA 서열을 수득하였다. pCHA5와 비교했을 때, pCHA5-II에는 돌연변이화된 5개의 잔기가 존재한다. 이들 2가지 컨센서스 HA DNA 백신에서의 당지질의 아주반트 효과를 비교하였다. 마우스들의 군에 아주반트로서의 당지질의 존재/부재 하에 30 마이크로그램 pCHA5 또는 pCHA5-II의 EP/IM 주사를 투여하였다. 마우스를 3주의 간격을 두고 제2 백신화시키고, 최종 면역화 2주 후에 혈청을 수집하였다. 항-HA 항체 역가를 ELISA에 의해 시험하였고, 아주반트로서의 당지질이 존재하거나 부재하는 pCHA5와 pCHA5-II 사이에서 유의한 차이는 관찰되지 않았다 (도 75A). 그러나, 고도로 병원성인 야생형 H5N1 인플루엔자 바이러스 (E319)를 접종한 경우에는, pCHA5와 pCHA5-II 사이에 유의한 차이가 존재하였다. 당지질이 아주반트로서 첨가되었는지의 여부와 상관없이, pCHA5에 의해 제공된 보호는 현저하지 않았다 (도 75B). pCHA5만 주사한 군에서는 생존한 마우스가 없었던 반면, 7DW8-5 및 C34 아주반트 투여군에서는 각각 약 10％ 및 약 20％의 마우스가 생존하였다. pCHA5-II 백신화 군에서는, C34 및 7DW8-5 당지질이 생존율을 약 20％에서 각각 약 50％ 및 약 40％로 개선시킬 수 있었다 (도 75C). 결론적으로, 항체 역가는 당지질이 존재하거나 부재하는 pCHA5와 pCHA5-II 사이에서 유사하였지만, pCHA5-II는 pCHA5보다 양호한 보호를 제공하였고, pCHA5II의 보호 능력은 당지질 아주반트에 의해 향상되었다.
추가로, 일부 수행에서, 특정 조건 하의 최적 투여량을 평가하여, 일부 상황에서 원샷 백신화로서 IM에 의해 전달된 pCHA5-II 및 C34의 특정 투여량이 최적임을 제안하였다. pCHA5-II (50, 75 및 100 ㎍) 및 C34 (0.5, 1, 2 및 4 ㎍)의 다양한 투여량을 사용하여 pCHA5-II/C34 백신을 위한 제제를 결정하였다. 백신화 3주 후, 혈청을 수집하고, 항-HA 항체 역가를 ELISA에 의해 시험하였다. pCHA5-II 치료군에서는, 단지 약한 항-HA 항체만이 검출되었고, 명백한 용량 효과는 관찰되지 않았다. 항-HA 반응은 아주반트로서 2 ㎍의 C34를 첨가함으로써 약 8-9배 향상되었다. 100 ㎍의 pCHA5-II, 0.5 및 2 ㎍의 C34는 1 및 4 ㎍보다 높은 항체 역가를 유발하였다 (도 76A) (p < 0.01). 또한, 기능성 IFN-γ 분비 ELISPOT 시험에서, 100 ㎍의 pCHA5-II는 50 (31.33 ± 11.95) 또는 75 ㎍ (40 ± 3.67)의 pCHA5-II보다 많은 수의 IFN-γ 생성 세포 (136.5 ± 11.26)를 유도하였다 (p < 0.01). 이러한 세포-매개 면역 반응은 C34를 아주반트로서 첨가함으로써 증가하였다. 1 ㎍ (151.2 ± 22.58) 및 4 ㎍ (146.5 ± 19.41)의 C34 아주반트 첨가군에서의 IFN-γ 분비 세포는 0.5 ㎍ (106.7 ± 19.31) 및 2 ㎍ (95.56 ± 10.06)의 C34 군보다 양호하였지만, 차이는 통계적으로 유의하지 않았다 (도 76B). 치사 용량의 NIBRG-14로 비강내 접종 시, 바이러스 접종에 대한 마우스의 보호에서 pCHA5-II의 용량 효과가 나타났다. pCHA5-II 군에서 마우스의 생존율은 10％ (50 ㎍)에서 40％ (75 ㎍) 및 70％ (100 ㎍)로 증가하였다. 또한, 50 ㎍ 및 75 ㎍의 pCHA5-II 군에 대한 2 ㎍ C34의 첨가는 마우스의 생존율을 각각 10％에서 100％ 및 40％에서 100％로 증가시킬 수 있었다 (도 76C). 0.5 ㎍ (80％) 및 2 ㎍ (75％)의 C34에서의 마우스의 생존율은 그만큼 양호하지는 않았지만, 이들 시험에 기초한 차이는 당시의 실험 조건 하에서 통계적으로 유의한 것으로 여겨지지 않았다 (도 76D). 100 ㎍ pCHA5-II에 대한 아주반트로서의 1 ㎍ C34의 첨가는 마우스의 생존율을 70％에서 100％로 증가시켰다. 이들 데이터는 원샷 백신화 일정에서 2 ㎍의 C34와 50 ㎍의 pCHA5-II가 바이러스 접종에 대한 양호한 보호를 제공할 수 있음을 제안하였다. 보호의 효과를 보장하기 위해서, 일부 수행에서는 약 1-2 ㎍의 C34와 약 100 ㎍의 pCHA5-II가 안전한 제제를 제공하는 것으로 여겨진다.
C34를 갖거나/갖지 않는 pCHA5로 면역화된 마우스에서의 항혈청의 교차-중성화 능력을 조사하기 위해, pCHA5의 차선 용량(suboptimal dose)을 사용하였고, 동일한 백신 접종 스케줄을 적용하였다. 마지막 백신 접종 2주 후, 마우스 혈청을 취하고, HA-유사형 바이러스 중성화 분석법에 의해 분석하였다. 클레이드 1 (VN1194), 2.1 (ID05), 2.2 (TK05) 및 2.3.4 (Anhui05) 중에서 4개의 H5N1 인플루엔자 바이러스를 선택하였다. 대조군, pCHA5 단독, C34 아주반트 처리된 pCHA5의 마우스로부터의 항혈청으로 각종 HA-유사형 바이러스를 인큐베이션하였다. 중성화 역가를 루시페라아제 활성에 의해 측정하고, 그 데이터를 50%의 HA-유사형 바이러스 중성화 (ID50)를 일으키는 혈청 희석물로 보고하였다. ID50으로 나타내 바와 같이 (도 77), pCHA5 단독의 항혈청 군은 VN1194 (ID50 = 0.005862) 및 TK05 (ID50 = 0.005953) HA-유사형 바이러스에 대해, pVAX 군 (각각 ID50 = 0.0277 및 0.02668)에 비해, 더 큰 중성화 항체를 나타냈다. 게다가, C34 아주반트 처리된 군의 VN1194 (ID50 = 0.00408) 및 TK (ID50 = 0.003054)에 대한 중성화 효능은 유의미하게 향상될 수 있었다. ID05 및 Anhui05 HA-유사형 바이러스 중성화에 있어서, pVAX와, C34를 갖거나/갖지 않는 pCHA5 군 사이의 차이는 없는 것으로 관찰되었다. 이들 결과는 아주반트로서의 C34가, 몇몇 구현양태에서, 차선 pCHA5 백신에서 바이러스의 각종 균주에 대한 중성화 능력을 증가시키는 작용을 할 수 있음을 제시한다.
IM/EP 경로를 통한 C34의 아주반트 효과를 초래하는 메커니즘은 명확하지 않다. C34의 아주반트 효과의 메커니즘을 조사하기 위해, 부스팅(boosting) 후 0시간 및 20시간 후의 혈청을 수집하고, 사이토킨을 루미넥스(luminex)로 분석하였다. 분석 결과, C34 아주반트를 갖거나 갖지 않는 pCHA5의 군에서는 매우 낮은 수준 내지 측정불능 수준의 IL-1α, IL-3, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-15 및 TNF-α가 발견되는 것으로 드러났다 (도 78). IFN-γ, G-CSF, IL-5, IL-17, KC, MIP-1β 및 RANTES의 혈청 수준은 C34 아주반트 처리된 군에서 부스팅 후 유의미하게 증가하였다. 게다가, IL-2, IL-5, IL-12p40, IL-13, IL-17, IFN-γ, MIP-1α, MIP-1β, KC, RNATES 및 G-CSF는 pCHA5 단독 군에 비해 C34 아주반트 처리된 군에서 실질적으로 더 높은 것으로 발견되었다. 또한, IL-1β의 수준은 pCHA5 단독 군과 비교하여 C34 함유 pCHA5 군에서 낮은 것으로 발견되었다. 데이터는, 몇몇 예시적인 구현양태에서, C34의 아주반트 효과가 세포 증식 및 주화성에 수반된 전-염증성 사이토킨, T 헬퍼 I형 및 II형 사이토킨 및 케모카인의 더 많은 생성과 상관 관계에 있음을 나타낸다.
또한, C34 백신를 갖거나/갖지 않는 pCHA5-II로 면역화된 마우스에서의 항혈청의 교차-중성화 능력을 시험하였으며, 여기서는 pCHA5 50㎍을 사용하였고, 단일 백신 접종만 적용하였다. 백신 접종 3주 후, 마우스 혈청을 취하고, HA-유사형 바이러스 중성화 분석법으로 분석하였다. 4개의 H5N1 인플루엔자 바이러스를 사용하였고, 대조군, pCHA5-II 단독, C34 아주반트 처리된 pCHA5-II의 마우스로부터의 항혈청을 측정하였다. 도 79에 나타낸 데이터에 따르면, pCHA5-II 단독의 항혈청 군은 pVAX 군 (ID50 = 0.144)에 비해, TK05 (ID50 = 0.05376) HA-유사형 바이러스에 대한 중성화 항체가 더 큼을 나타냈다. pCHA5-II 단독 군과 달리, C34 아주반트 처리된 군의 VN1194 (0.003), TK05 (0.004), Anhui05 (0.0027) 및 ID05 (0.002)에 대한 중성화 효능 (ID50)은 유의미하게 향상되었다. 이와 함께, 이들 결과는, C34 아주반트가 중성화 효능을 증가시킬 뿐만 아니라 각종 바이러스에 대한 범위를 넓히는 작용을 할 수 있음을 지적한다.
[실시예]
α-GalCer의 당지질 유사체, 시약 및 마우스
본 개시내용의 α-GalCer (C1) 및 합성 α-GalCer 유사체를 합성하고, 문헌 ([Fujio et al. (2006) J. Am. Chem. Soc. 128:9022-9023]; [Xing et al. (2005) Bioorg. Med. Chem. 13:2907-2916]; [Kinjo et al. (2005) Nature 434:520-525]; [Wu et al. (2006) Natl. Acad. Sci. U. S. A 103:3972-3977]; 및 [Wu et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 102:1351-1356] (각각의 문헌은 본원에 참조로 포함됨))에 전술된 기술에 의해 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 본 개시내용의 합성 α-GalCer 유사체는 그들의 화학적 구조에 따라 하기 4개의 군으로 분리되었다. 군 I: C2, C3 및 C14는 박테리아 유래의 것임, 군 II: C4, C5 및 C9는 세라미드 (C4)에 대한 O-연결기의 황 변형 또는 갈락토스 잔기 (C5, C9)의 3"-OH에서의 술페이트 기를 함유함, 군 III: C6-C8, C8-5, C8-6, C10-C11, C15-C16 및 C18-C34는 그들의 아실 말단에서 방향족 고리로 변형됨, 군 IV: C12, C13 및 C17은 절두형(truncated) 피토스핑고신을 함유함. 이들 신규한 유사체 중, C10, C11, C16, C27, C28, C29는 여러 길이의 지방 아미드 쇄에서 페닐 기 (Ph)로 변형됨; C18, C22는 페닐 고리에서 메톡시 기 (-OMe)로 변형됨; C19, C23, 7DW8-5는 페닐 고리에서 플루오라이드 기 (-F)로 변형됨; C20, C24, 7DW8-6은 페닐 고리에서 트리플루오로메틸 기 (-CF3)로 변형됨; C21, C25, C26은 페닐 고리에서 페닐 기 (-Ph)로 변형됨; C34는 페닐 고리에서 1'-옥시-4'-플루오로페닐 (0-Ph-F) 
로 변형됨. 그러나, 페닐 고리에서 파라-옥시-플루오로페닐 (1'-옥시-4'-플루오로페닐)을, 비-파라 위치에 F 기를 갖는 옥시-플루오로페닐, 또는 디플루오로, 트리플루오로, 테트라플루오로 및 펜타플루오로 페닐 중 하나로 치환하는 것 또한 유용한 특성을 얻을 수 있고; C17은 절두형 피토스핑고신을 함유한다.
글리코스핑고지질 화합물 C12 및 C13의 합성을 반응식 1에 개략한다 (도 3). 이들 화합물의 특성화 데이터를 하기한다.
모든 합성 α-GalCer 유사체는 처음에는 농도 1-2mg/ml로 100% DMSO에 용해되어 있었다. 생체내 실험을 위해, 합성 α-GalCer 유사체를 마우스에 주사하기 직전에 식염수 중 20 또는 1㎍/ml로 희석하였다. 무-병원체 BALB/c (야생형 또는 CD1d 녹아웃) 및 C57BL/6 암컷 마우스 (연령 6-10주)를 대만 국립 연구소 동물 센터(National Laboratory Animal Center (대만 타이페이 소재))로부터 얻었다. CD1d-결핍된 BALB/c 및 C57BL/6을 각각 잭슨 래버러토리(Jackson laboratory (C.129S2-CD1tm1Gru/J, U.S))의 스티브 아르. 로플러(Steve R. Roffler (대만 소재 아카데미아 시니카 소속)) 박사로부터 얻었다. 모든 마우스를 무-병원체 동물 시설에서 유지하였다.
글리코스핑고지질 화합물 C34의 합성을 반응식 2에 개략하였다 (도 80). 피토스핑고신 유도체를 D-릭소오스로부터 합성하였다. D-릭소오스의 2,3-디히드록시 기는 산의 존재하에 2-메톡시프로펜에 의해 선택적으로 보호되어 아세토니드 중간체를 생성하고, 이어서 상기 중간체의 1급 히드록실 기를 트리틸 클로라이드 및 염기 조건을 거쳐 트리틸 에테르를 얻었다. 비티히(Wittig) 올레핀화를 행한 후, 후속 중간체를 리튬 헥사메틸디실라지드 (LHMDS)의 존재하에 C13H27 +PPh3 -Br과 반응시킴으로써, 1H NMR 분광분석 특성에 의해 2:1의 EIZ 비율을 갖는 알켄을 수득하였다. 불포화 알켄 중간체의 알칸으로의 촉매 수소화 후, 히드록시 기를 트리플레이트 무수물 및 2,6-루티딘에 의해 활성화시켜 트리플레이트 중간체를 얻었다. 트리플레이트 중간체의 테트라메틸구아니디늄 아지드 (TMGA)에 의한 SN2 반응은 역전 구성의 아지도 화합물을 생성하였다. C1의 트리틸 기는 트리플루오로아세트산 (TFA)을 사용하여 선택적으로 제거되었다.
공여체-갈락토스 유도체 및 수용체 피토스핑고신의 글리코실화를 트리플루오로메탄술폰산 무수물 (Tf2O) 및 황화디메틸 (Me2S)을 촉진제로서 사용하는 조건으로 행하여 주요(key) 중간체를 얻었다. 그 후, 상기 주요 중간체의 아지도 기를 슈타우딩거(Staudinger) 반응을 사용하여 환원시킴으로써 아민 중간체를 얻었다. EDC 및 HBTU를 사용하여 새롭게 제조된 지방산과 상기 아민을 커플링시킨 후, 전체적으로 탈보호시켜 화합물 C34를 얻었다.
이 화합물의 특성화 데이터를 하기한다.
인간 NK 세포주, 미성숙 단핵세포-유래의 수지상 세포 및 NK/NKT의 단리 및 생성
실험받은 적이 없는(naive) Vα24i NKT 세포를 간적적으로 접합된 항-Vα24iTCR 마이크로비드 (밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec; 미국 소재))를 사용하여 분리하였다. 단리된 세포를 50 U/ml IL-2 (R & D 시스템)의 존재하에 인큐베이션하고, 3일마다 신선한 배지를 보충하였다. α-Galcer-펄스(pulsed) 또는 페닐 당지질-펄스 Vα24i NKT의 생성을 하기한 바와 같이 행하였다. 항-Vα24i TCR mAbs, 및 항-CD14 mAbs (각각 자석 비드 (밀테니 바이오텍, 미국 캘리포니아주 오번 소재)에 커플링되었음)를 사용하여 순차적으로 류코팩(leukopak)으로부터 Vα24i NKT 세포 및 CD14 세포를 단리하였다. 300 U/ml GM-CSF (R & D 시스템즈) 및 100 U/ml IL-4 (R & D 시스템즈)의 존재하에 2일간 인큐베이션한 후 CD14 세포로부터 미성숙 수지상 세포를 생성하였다. 2,000 rad 조사한 후, 미성숙 수지상 세포를 100ng/ml α-GalCer 또는 C11 및 50 U/ml IL-2 (인비트로겐(Invitrogen))의 존재하에 10일 내지 14일간 합성 CD161 세포와 함께 공-배양하였다. Vα24i NKT 세포를 100ng/ml α-GalCer 또는 C11-펄스 조사된 미성숙 수지상 세포로 2회 자극한 후 α-GalCer 펄스 또는 페닐-당지질 펄스 iNKT 세포가 각각 생성되었다. 모든 iNKT 세포주 (실험받은 적이 없는, α-GalCer 펄스 또는 페닐-당지질 펄스)는 유동 세포계측법이 Vα24i T 세포 항원 수용체 (95% 순도)를 발현함을 나타냈다. NK 및 NKT 세포를 항-CD56 마이크로비드 (밀테니 바이오텍, 미국 소재)를 사용하여 인간 류코팩으로부터 단리하였다.
α-GalCer 유사체-감작된 인간 NKT 세포주의 생성을 후지오 등의 방법에 따라 수행하였으며, 및 이들 세포는 연구된 α-GalCer 유사체의 사이토킨 반응을 평가하는데 사용하였다 (도 5 및 6 참조). 미성숙 DC를 300 U/ml GM-CSF 및 100 U/ml IL-4와 함께 2일 인큐베이션한 후의 백혈구팩의 CD14+ 세포로부터 유도하였다. 조사 (3,000 rad) 후, iDC를 100 ng/ml α-GalCer 및 10 U/ml IL-2의 존재하에 자가 CD161+ 세포와 함께 10일 동안 배양하였다. 상기 자극을 반복한 후, NK 세포주가 생성되었으며, CD161+/CD3+/Vα24iTCR+ (99% 순도)를 발현하는 것으로 나타났다. 미성숙 인간 단핵세포-유도된 DC를 생성하기 위해, 백혈구팩의 CD14+ 세포를 300 U/ml GM-CSF 및 100 U/ml IL-4의 존재하에 6일 동안 배양하였다. 이들 DC는 미성숙 표현형 (CD14-CD80+CD86+CD83weakHLA-DR+)을 가지고, 성숙 DC보다 높은 CD1d 발현을 나타내었다. iDC를 3 μg/ml의 다양한 α-GalCer 유사체로 감작시켰으며, 이들의 표현형 및 모르폴로지를 48시간 후에 시험하였다.
TCR 활성화 실험을 위해 사용된 나이브 NKT (CD161+/CD3+)는 간접 접합된 항CD161 멀티-소트 마이크로비드를 사용하고 항CD3 마이크로비드로 추가로 분리하여 단리하였다 (도 19 참조). 단리된 세포를 100 U/ml IL-2의 존재하에 인큐베이션하고, 3일 마다 새로운 매질로 재충전하였다.
시험관내
인간
NKT
세포
사이토킨
분비 검정
96웰 넓적 바닥 플레이트에서, Vα24i 인간 NKT 세포 (1x105)를 10 μg/ml의 본 발명의 α-GalCer 유사체의 존재하에 5x104 조사된 미성숙 CD14+ DC와 함께 공배양하였다. 상등액의 사이토킨/케모카인을 18시간에 수집하고, 비드라이트(Beadlyte®) 인간 22-플렉스 멀티-사이토킨 검출 시스템으로 정량하고, 루미넥스(Luminex®) 100TM 시스템으로 측정하였다.
시험관내
iNKT
의 확대
iNKT 세포 확대 실험을 위해 사용된 인간 CD56+ 세포 (NK/NKT 혼합물)는 인간 백혈구팩으로부터 항CD56 마이크로비드를 사용하여 단리하였다 (도 13 및 14 참조). 인간 CD56+ 세포 (NK/NKT 혼합물)을 표지된 α-GalCer 유사체 또는 0.3% DMSO 3 μg/ml으로 제2일에 18시간 동안 감작시키거나(도 13 및 14 참조) 10 또는 100 ng/ml으로 제2일에 18시간 동안 감작시킨(도 15 참조) 4x105 자가 미성숙 CD14+ DC와 함께 배양하였다. 제3일에, 현탁 세포를 새로운 접시로 옮기고, 100 U/ml IL-2의 존재하에 배양하고, 3일 마다 새로운 매질로 재충전하였다. NK/NKT 혼합물 중 CD161+/Vα24TCR+ 세포 집단을 제9일에 유동 세포계측법으로 게이트하고, Vα24i NKT의 총수를 카운트하였다.
인간
NKT
TCR
활성화
예시적인 구현예에서는, 24웰 플레이트 상에서 HeLa, HeLa-CD1d 또는 자가 iDC를 10 μg/ml의 C1, C11, C13 또는 C17 또는 DMSO와 함께 2시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 3x105 나이브 CD161+/CD3+ NKT를 첨가하였다 (도 19 참조). 또다른 예시적인 구현예에서는, HeLa 또는 HeLa-CD1d 세포를 100 ng/ml의 C1, C16, C23, C8-5, C8-6 또는 C26 또는 DMSO와 함께 2시간 동안 로딩하고, 이어서 3x105 나이브 CD161+/CD3+ NKT을 첨가하였다 (도 20 참조). 5 내지 10분 자극 후, 현탁액 중 세포를 튜브로 옮기고, PBS로 세척하고, 4℃에서 비드라이트® 세포 신호 범용 용해 완충제로 용해시켰다. 용해물 중 포스포-CD3ε (포스포-티로신), 포스포-ERK1/2 (Thr185/Tyr187), 포스포-CREB (Ser133), 포스포-Syk (포스포-티로신), 포스포-p38 (Thr180/Tyr182), 포스포-IκBα (Ser32), 포스포-Lck, 포스포-Lat, 포스포-STAT3 (Ser727), 포스포-STAT5 A/B (Tyr694/699) 및 포스포-Dap-70 (포스포-티로신)의 농도를 검정 프로토콜에 따른 비드라이트® 인단백질 검출 시스템으로 평가하고, 루미넥스 100 시스템으로 측정하였다. 값을 총 투입 단백질의 양을 사용하여 정규화하였다.
시험관내
CD1d
-
테트라머
검정
가용성 2가 마우스 CD1d-IgG1 융합 단백질(마우스 CD1d-IgG1 테트라머, 비디 파밍겐(BD Pharmingen) 제조) 1 μg을 제조자의 프로토콜에 따라 각각의 α- GalCer 유사체 10 몰과 함께 37℃ 및 중성 pH에서 밤새 인큐베이션하였다. 당지질-로딩된 CD1d-IgG1 테트라머를 마우스 NKT와 함께 4℃에서 60분 동안 인큐베이션한 다음, FITC-커플링된 항마우스 IgG1 mAb (A85-1)와 함께 인큐베이션하였다. 또한, 세포를 PE 커플링된 항NK 및 APC 커플링된 항CD3 mAb (비디 파밍겐 제조)로 표면-염색시켰다.
마우스
비장세포의
제조
본 발명의 표지된 α-GalCer 유사체 또는 비히클로 처리된 BALB/c 마우스를 주사 후 72시간에 도살하였다. 비장을 수확하였다. 요약하면, 비장을 70 μm 스트레이너를 통해 가압하고 적혈구를 용해시킨 후, 유핵 세포를 행크 평형 염 용액(Hank's Balanced Salt Solution)에 재현탁하고, 4℃에서 5분 동안 300 g로 원심분리하고, 이어서 FACS 분석하였다.
마우스
비장세포
소집단의 측정
BALB/c 마우스를 본 발명의 표지된 α-GalCer 유사체 (2 μg/ 마우스) 또는 비히클 (PBS 중 1 % DMSO)로 처리하고, 72시간에 도살하고, 비장을 수확하였다. 요약하면, 비장을 70 μm 스트레이너를 통해 가압하고 적혈구를 용해시킨 후, 유핵 세포를 행크 평형 염 용액에 재현탁하고, 4℃에서 5분 동안 300 g로 원심분리하고, 이어서 FACS 분석하였다. 항CD3e-알로피코시아닌, 항CD4-PE, 항CD8α- 알로피코시아닌-시안화물-다이7, 항CD11c-알로피코시아닌, 항CD23-PE, 항45R-알로피코시아닌, 항CD69-FITC, 항CD80-FITC, 항CD86-PE, 항Ly6G-PE 및 U5A2-13Ag+ -PE는 비디 바이오사이언스-파밍겐(BD Bioscience-Pharmingen)에서 입수하였다.
마우스
비장세포
NKT
및
NK
소집단의 측정
BALB/c 마우스를 본 발명의 표지된 α-GalCer 유사체 (0.1 μg/ 마우스) 또는 비히클 (PBS 중 0.1 % DMSO)로 처리하고, 72시간에 도살하고, 비장을 수확하였다. 요약하면, 비장을 70 μm 스트레이너를 통해 가압하고 적혈구를 용해시킨 후, 유핵 세포를 행크 평형 염 용액에 재현탁하고, 4℃에서 5분 동안 300 g로 원심분리하고, 이어서 FACS 분석하였다. 항CD3e-알로피코시아닌 및 NK 마커 U5A2-13Ag+ -PE는 비디 바이오사이언스-파밍겐에서 입수하였다.
혈청
사이토킨
/
케모카인
마우스 혈청 샘플을, 비히클 또는 본 발명의 합성 α-GalCer 유사체를 투여한 후 0, 2, 18, 36, 48 및 72시간에 수집하였다. 다양한 사이토킨/케모카인의 혈청 농도를 비드라이트® 마우스 21-플렉스 사이토킨 검출 시스템으로 측정하고, 루미넥스® 100TM 시스템으로 판독하였다.
마우스의 폐암 모델
C57BL/6 마우스 (6 내지 8 주령, 암컷)에, 0.1 mL의 PBS에 현탁된 2x105 동계 폐암 (TC1) 세포를 IV 주사하였다. 1시간에, C57BL/6 마우스 군(n=5)을 본 발명의 표지된 α-GalCer 유사체 (마우스당 2 μg) 또는 비히클로 4주 동안 주당 2회 IV 처리하였다. 체중을 1개월 동안 기록하고, 생존을 50일 동안 모니터링하였다.
마우스의 유방암 모델
BALB/C 마우스 (6 내지 8 주령, 암컷)의 우측 등 하부에 2x105 동계 유방암 (4T1) 세포를 SubQ 접종하였다. BALB/c 마우스 군(n=6)을 본 발명의 표지된 α-GalCer 유사체 또는 비히클로 종양 접종 후 4주 3일 동안 주당 2회 IV 또는 SubQ 처리하였다. α-GalCer 유사체는 종양 접종 부위에서 먼 부위에 주사하였다. 종양 체적은 장축 (a), 단축 (b) 및 높이 (c)를 따라 캘리퍼로 측정하여 1개월 동안 3일 마다 기록하였다. 종양 체적 (mm3)을 식 a×b×c에 의해 계산하고, 생존을 70일 동안 모니터링하였다.
마우스의 종양 성장의 실시간 평가
마우스 화상은 제노젠(Xenogen) 제조의 IVIS® 200 시리즈 및 리빙 이미지(Living Image®) 소프트웨어 (미국 소재의 제노젠 제조)에 의해 수득 및 분석하였다. 흑색종 모델에서, C57BL/6 마우스 (6 내지 8 주령, 암컷)에 0.1 mL의 PBS에 현탁된 2x105 동계 흑색종 (B16) 세포를 정맥내 주사하였다. 3일 후, 나타낸 치료학적 프로토콜 하에서 C57BL/6 마우스 군(n=5)을 표지된 당지질로 정맥내 처리하였다. 종양 체적을 24일 동안 3일 마다 기록하였다.
유동 세포계측 분석에 의한 림프구의 침윤
종양 이식 후 제21일에 대조군 및 당지질 처리된 마우스로부터 종양을 무균하에 제거하고, 배양 페트리 접시에서 2 내지 3 mm 절편으로 손으로 절단하였다. 이어서, 작은 조직 단편을 RPMI 1640 중에서 0.01 % DNase, 0.01 % 히알루라니다제 및 0.1 % 콜라게나제 (모두 시그마 케미칼 컴파니(Sigma Chemical Co.) 제조)로 연속 교반하면서 37℃에서 2 내지 3시간 동안 소화시켰다. 이어서, 생성된 단일 세포 현탁액을 PBS 중 0.1 % FCS로 2회 세척하고, 표준 유동 세포계측 방법으로 염색시켰다. 이들 조직을 침윤하는 림프구 소집단을 검출하기 위해, FACS를 위해 다음 접합 항체를 사용하였다. FITC-항CD3, PE-항NK, APCCy7-항CD8 (미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 비디 바이오사이언스 파밍겐 제조).
면역조직화학 염색
3주 동안 2x105 TC1 종양 세포를 i.v 주사하고 이어서 도살한 B6 마우스로부터 폐 소절을 취하여, 파라핀-매립된 절편을 만들었다. 3 μm 두께의 절편을 56℃ 오븐으로 밤새 처리한 다음, 파라핀 제거 및 열 매개 항원 재생 (pH 9 트리스-EDTA 완충제 중에서 121℃에서 7.5분 동안)시키고, 공통 림프구 항원의 지표로서의 항CD45RA 항체 (클론 RA3-6B2; 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 비디 바이오사이언스 파밍겐 제조)와 함께 1:100의 역가로 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 결합된 1급 항체를 서양고추냉이 퍼옥시다제 및 DAB 기질과 접합된 2급 항체로 중독시켜 검출하였다. 마운팅 전에 모든 절편을 헤마톡실린으로 대비염색시켰다.
통계 분석
독립 양측 스튜던트의 t 검정(Unpaired two-tailed Student's t test)을 이용하여 프리즘(PRISM) 소프트웨어로 데이타를 분석하였다. 그래프는 3회 반복 시험의 평균값을 나타내었고, 에러바는 SD를 나타낸다. 각 군의 종양 보호에서의 차는 로그 순위 검정(log-rank test)을 이용하여 분석하였다. P<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 여겨졌다.
항박테리아
효능 연구
α-
GalCer
의
글리코리피드
유사체
항박테리아 연구에 이용되는 α-GalCer 유사체의 구조를 도 2, C3, C9, C11 및 C14 내지 C17에 나타내었다. α-GalCer 유사체 스탁 용액을 1 mg/ml DMSO 용액으로 준비하였다. α-GalCer 유사체를 사용하기 전에 포스페이트 완충 식염수 (PBS)로 10 μg/ml로 희석하였다.
동물 및 박테리아
6 내지 8 주령의 암컷 C57L/6 및 BALB/c-Byl 마우스를 연구에 이용하였다. 마우스는 자유롭게 음식 및 물에 접근하는 플라스틱 케이지에서 생육하여 적어도 실험 시작 일주일 전에 환경에 익숙해지게 하였다. 박테리아 균주 스핑고모나스 캡슐라타 (ATCC 14666)를 BCRC(타이완 소재)로부터 얻었다. 박테리아 균주 클레브시엘라 뉴모니애 (NTUH-KP2044)는 박사 왕(Dr. J. T. Wang, National Taiwan University Hospital, 타이완 소재)으로부터 증여받은 것이었다.
스핑고모나스
캡슐라타
감염 마우스를 이용한
항박테리아
효능 연구
6 내지 8주령의 암컷 C57BL/6 마우스는 5x108 스핑고모나스 캡슐라타 세포 를 IP 주사하였다. 마우스는 군 당 4 내지 6마리의 마우스를 처리군 및 대조군으로 분류하였다. 감염 4 시간 후, 처리군의 마우스는 50 또는 100 μg/kg의 시험 α-GalCer 유사체를 IP 주사하고, 대조군의 마우스는 동일한 부피의 PBS를 주사하였다. 박테리아성 감염 24 시간 후, 모든 군으로부터의 마우스를 희생시켰다. 마우스로부터 간을 적출하고, 조직 균질기를 이용하여 0.9％ NaCl, 0.02％ 트윈 (Tween) 80 중에서 균질화하였다. 간 균질물 중의 스핑고모나스 캡슐라타의 콜로니 형성 단위 (CFU)는 영양 플레이트 상의 플레이팅 희석 샘플로 결정하였다. 37℃에서 48 시간 동안 인큐베이션한 후 콜로니를 카운트하였다.
K.
뉴모니애
감염 마우스를 이용한
항박테리아
효능 연구
BALB/c-Byl 암컷 마우스 (군당 10마리의 마우스)는 1회량 (106 CFU)의 생 K. 뉴모니애를 경구 위관 영양법으로 투여하였다. 처리군의 마우스는 박테리아성 감염 후 4-시간 및 8-시간에 2회 100 μg/kg의 시험 α-GalCer 유사체를 주사하였다. 대조군의 마우스는 4-및 8-시간에 PBS를 주사하였다. 감염 24 시간 후, 모든 마우스를 희생시켰다. 간 및 폐 모두를 각각의 마우스로부터 수집하고 균질화하였다. 상기와 유사하게 박테리아 카운트를 결정하였다.
통계 분석
α-GalCer 유사체의 비교 효능은 처리군의 기관 CFU 값과 대조군의 CFU 값을 비교하여 설명하고, 유의한 효능은 각각 <0.05 또는 O.01의 p-값으로 나타내었다.
글리코리피드
시험제
사용된 글리코리피드의 구조 및 그들의 코드명을 도 64 (A 내지 B)에 나타내었다. 글리코리피드 스탁 용액을 1 mg/mL DMSO 용액으로 준비하였다. 화합물은 포스페이트 완충 식염수 (PBS)로 10 내지 30 μg/mL로 희석하여 동물 연구에 사용하였다.
사용된 마우스, 바이러스, 및 박테리아
6 내지 8주령의 C57L/6 및 BALB/c 마우스를 연구에 사용하였다. 마우스는 자유롭게 음식 및 물에 접근하는 플라스틱 케이지에서 생육하여 적어도 실험 시작 일주일 전에 환경에 익숙해지게 하였다. 본 연구에 사용된 바이러스는 상기 기재된 인플루엔자 균주 WSN (A/WSN/1933/H1N1) 및 일본 뇌염 바이러스 (JEV, RP-9 균주)였다. 박테리아 균주 스핑고모나스 캡슐라타 (ATCC 14666)는 BCRC(타이와 소재)로부터 얻었다. 발광 스타필로코쿠스 아우레우스 Xen29는 제노겐 코포레이션 (Xenogen Corporation; 미국 캘리포니아주 소재)으로부터 구입하였다. 모든 동물 연구는 아카데미아 시니카 애니멀 스터디 커미티 (Academia Sinica Animal Study Committee)에 의해 승인받았으며 가이드라인에 따라 수행하였다. 본 연구에 사용된 면역 결핍 마우스는 상기 기술한 바와 같다.
스핑고모나스
캡슐라타
감염 마우스를 이용한
항박테리아
효능 연구
6 내지 8 주령 암컷 C57BL/6 마우스는 5x108 스핑고모나스 캡슐라타 세포를 복막내 주사하였다. 마우스는 군 당 5 내지 10마리의 마우스를 처리군 및 대조군으로 분류하였다. 감염 3 내지 4 시간 후, 처리군의 마우스는 50 또는 100 μg/kg의 시험 글리코리피드를 복막내 주사하고, 대조군의 마우스는 동일한 부피의 PBS를 주사하였다. 박테리아성 감염 24 시간 후, 모든 군으로부터의 마우스를 희생시켰다. 마우스로부터 간을 적출하고, 조직 균질기를 이용하여 0.9％ NaCl, 0.02％ 트윈 80 중에서 균질화하였다. 간 균질물 중의 스핑고모나스 캡슐라타의 콜로니 형성 단위 (CFU)는 영양 플레이트 상의 플레이팅 희석 샘플로 결정하였다. 37℃에서 48 시간 동안 인큐베이션한 후 콜로니를 카운트하였다. 항박테리아 결과는 원-웨이 아노바 (one-way ANOVA)를 이용하여 분석하여 칠면조 후검정후의 처리군에서 유의차를 평가하였다.
화상 분석에 의한 발광
스타필로코쿠스
아우레우스
(
X29
)을 이용한
항박테리아
효능 연구
Balb/C 암컷 마우스를 칭량, 분류하고, 왼쪽 넓적 다리의 후측 사두근 근육에 3 X 108 CFU의 S. 아우레우스 Xen29를 함유하는 200 μL PBS를 주사하였다. Xen29 감염 후 상이한 시간에, 마우스는 기술한 바와 같이 비히클 또는 글리코리피드를 IP 주사하였다. 마우스는 기술한 바와 같이 이비스 이미징 시스템 (IVIS Imaging System; 제노겐 코포레이션; 미국 캘리포니아주 소재)을 이용하여 주기적으로 이미지화하였다. 이미지화 결과, 원-웨이 아노바를 사용하여 상대적인 발광을 분석하였으며 칠면조 후검정 후의 처리군에서 유의차가 평가되었다.
일본 뇌염 바이러스 (
JEV
) 감염 동물 모델
7 주령 C57/B56 마우스를 분류하고, JEV 감염 마우스에 다양한 시간에서 글리코리피드를 주사하였다. 감염은 500 μL PBS 중의 5 X 105 PFU의 RP-9 균주 JEV를 IP 주사하고, 동시에 이전에 개시된 바와 같이 50 mL PBS를 대뇌적으로 (IP + IC 경로) 주사하였다. 마우스의 생존을 매일 모니터하였다. 글리코리피드 처리된 군의 생존 곡선은 프리즘 소프트웨어 (그래프패드 소프트웨어 (GraphPad Software), 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)를 이용하여 대조군과 비교하였다.
항인플루엔자
동물 모델 연구
α-GalCer 유사체의 생체내 효능을 평가하기 위해, Balb/c 마우스는 10 LD5O WSN 바이러스를 이용한 비강 감염에 대하여 상이한 시간에서 C34를 처리하였다. 모든 군에서의 마우스 생존은 감염 후 14일 동안 매일 시험하였다. 글리코리피드 처리된 군의 생존 곡선은 프리즘 소프트웨어 (그래프패드 소프트웨어, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)를 사용하여 대조군과 비교하였다.
2 투여량의
pCHA5
+/-
글리코리피드
백신의
근육내
주사에 의한 새 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 면역보호.
마우스는 pCHA5 (30 μg) +/- 글리코리피드 (1 μg)를 IM 경로를 통해 백신화하고 단지 2주 후에 pCHA5로 보강시켰다. 보강 주사 2주 후, 혈청을 수집하고 ELISA에 의해 HA-특이적 항체 적정량에 대해 시험하고 (도 73A), 마우스는 200 LD5O의 NIBRG-14 바이러스로 조사하고 생존을 모니터하였다 (도 73B).
글리코리피드
함유 및
무함유
pCHA5
의 단일
근육내
백신 접종.
pCHA5의 단일 IM 투여 후의 면역성 반응 및 마우스 생존은 글리코리피드를 보조제로 사용함으로써 향상되었다. 마우스는 pCHA5 (50 μg) +/- 글리코리피드 (2 μg) 또는 명반 (alum)을 IM 경로를 통해 백신 접종하였다. 백신 접종 3주 후, 혈청을 수집하고 ELISA에 의해 HA-특이적 항체 적정량에 대해 시험하였다 (도 74A). 동시에, 마우스를 희생시키고 지라세포를 ELISPOT 어세이로 수확하였다 (도 74B). 마우스의 또다른 군은 200 LD5O의 NIBRG-14 바이러스로 조사하고 생존에 대해 모니터하였다 (도 74C).
pCHA5
및
pCHA5
-
II
백신에 대한
글리코리피드의
보조제 효과의 비교.
마우스는 0 및 3주에 IM/EP 경로를 통해 pCHA5 또는 pCHA5-II (30 μg) +/- 글리코리피드 (2 μg)를 백신 접종하였다. 보강 주사 2주 후, 혈청을 수집하고, ELISA에 의해 항HA 항체 적정량에 대해 시험하고 (도 75A), pCHA5 (도 75B) 및 pCHA5-II (도 75C)로 백신 접종한 마우스는 E319 바이러스로 조사하고 생존을 모니터하였다.
마우스의
HA
-특이적 항체 생성 및 면역성 보호에 대한
pCHA5
-
II
및
C34
의 투여량 효과.
마우스는 보조제로서 C34 (0.5, 1, 2, 4 μg) 함유 및 무함유의 1회량의 pCHA5-II (100, 75, 50 μg)를 IM 경로를 통해 백신 접종하였다. 백신 접종 3주 후, 혈청을 수집하고 HA-특이적 항체 적적량을 ELISA에 의해 어세이하였다 (도 76A). 동시에, 마우스를 희생시키고 지라세포를 ELISPOT 어세이로 수확하였다 (도 76B). 한편, 마우스의 다른 군은 NIBRG-14 바이러스로 조사하고 마우스 생존을 모니터하였다. 도 76C는 상이한 투여량의 pCHA5-II 및 2 μg C34 보조제로 처리한 마우스의 생존을 나타낸다. 도 76D는 다양한 투여량에서 100 μg pCHA5-II 및 C34로 처리한 마우스의 생존을 나타낸다.
다양한
HA
-
유사형
바이러스에 대한 중성화 항체 생성에 관한
C34
의 보조제 효과.
암컷 BALB/c 마우스는 0 및 3주에 2 μg의 C34를 함유하는 PBS 중에 용해된 0.2 μg의 pCHA5로 IM/EP 백신 접종하였다. 마지막 백신 접종 2주 후, 혈청을 수집하고 HA-유사형 바이러스 중성화 어세이에 의해 시험하였다. 데이타는 50％의 HA-유사형 바이러스 중성화 (ID50)가 되는 혈청 희석액으로 보고하였다. TK (도 77A), VN1 194 (도 77B), ID05 (도 77C), 및 AnhuiO5 (도 77D) HA-유사형 바이러스는 상기 어세이에 사용하였다. 비선형 회귀 분석을 사용하여 데이타 적합도를 시험하였다. p값은 적합도의 비교이다. *는 p < 0.05이고 C34-보조제 처리된 군을 pCHA5 만의 군과 비교한 경우 통계학적으로 유의한 것을 나타낸다.
보조제로서
C34
함유 또는
무함유
pCHA5
수령 마우스에서의 혈청
사이토킨
발현 프로파일.
암컷 BALB/c 마우스는 0 및 3주에 2 μg의 C34 함유 또는 미함유 0.2 μg pCHA5로 IM/EP 경로를 통해 백신 접종하였다. 제2 백신 접종 전(0 시간) 및 제2 백신 접종 2O 시간 후에 혈청을 수집하였다. 사이토킨의 혈청 농도는 루미넥스 (Luminex) 200 시스템에 의해 어세이하였다. *는 p < 0.05이고 C34 보조제 처리된 군을 pCHA5 만의 군과 비교한의 경우 독립 양측 t 검정에 의한 것이다. #는 p < 0.05이고 O 시간과 20 시간을 비교한 경우의 독립 양측 t 검정에 의한 것이다. 결과는 IL-2 (도 78A), IL-5 (도 78B), IL-13 (도 78C), RANTES (도 78D), MIP-1 α (도 78E), MIP-1 β (도 78F), KC (도 78G), IL-1 β (도 78H), IL-17 (도 78I), IL-12p40 (도 78J), G- CSF (도 78K) 및 IFN-γ (도 78L)에 대하여 나타내었다.
1회량
근육내
주사를 통한
C34
에 의해 유도된 항혈청의
중성화능
.
암컷 BALB/c 마우스는 2 μg의 C34를 함유하는 PBS 중에 용해된 50 μg의 pCHA5-II로 IM 백신 접종하였다. 3주 후, 혈청을 수집하고 HA-유사형 바이러스 중성화 어세이에 의해 시험하였다. TK, VN1 194, ID5 및 RG5의 HA-유사형 바이러스는 상기 어세이에 사용되었다. 데이타는 ID5O로 보고되었다. 비선형 회귀 분석을 사용하여 데이타 적합도를 시험하였다. p값은 적합도의 비교이다. *는 p < 0.05이고 C34-보조제 처리된 군을 pCHA5-II 만의 군과 비교한 경우 통계학적으로 유의한 것을 나타낸다. 결과는 AnhiO5 (도 79A), TK05 (도 79B), ID05 (도 79C) 및 VN1 194 (도 79D)에 대해 나타내었다.
Claims (109)
- 하기 화학식 1의 구조로 나타낸 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는, 감염성 질환, 암, 또는 자가면역 질환을 치료하는데 사용하기 위한 피하 투여, 정맥내 투여, 비강내 투여 또는 근육내 투여용 제제.
<화학식 1>
- 제1항에 있어서, 화합물이 대상체에서 TH1 사이토킨을 생성하는 TH1-유형 사이토킨 반응을 활성화시키는 것인 제제.
- 제2항에 있어서, TH1 사이토킨이 IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-8, IL-12, IL-15, TNF-α, GM-CSF, RANTES, MIP-1α 및 MCP-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제제.
- 제1항에 있어서, 화합물이 대상체에서 TH2 사이토킨을 생성하는 TH2-유형 사이토킨 반응을 활성화시키는 것인 제제.
- 제4항에 있어서, TH2 사이토킨이 IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, RANTES, MIP-1α 및 MCP-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제제.
- 제1항에 있어서, 화합물이 대상체에서 적어도 하나의 T 림프구를 활성화시키는 것인 제제.
- 제6항에 있어서, T 림프구가 천연 킬러 T 세포인 제제.
- 제7항에 있어서, 천연 킬러 T 세포가 불변 천연 킬러 T 세포인 제제.
- 제1항에 있어서, 화합물이 대상체에서 적어도 하나의 수상 세포와 복합체를 형성하는 것인 제제.
- 제9항에 있어서, 수상 세포가 미성숙 또는 성숙 수상 세포인 제제.
- 제1항에 있어서, 화합물이 대상체에서 항원-제시 세포 상의 CD1 분자와 복합체를 형성하는 것인 제제.
- 제11항에 있어서, CD1 분자가 CD1d 분자인 제제.
- 제6항에 있어서, 화합물이 T 림프구 상의 T 세포 수용체를 활성화시키는 것인 제제.
- 제1항에 있어서, 화합물이 대상체에서의 후천성 면역계에서 세포 집단의 확대를 유발하는 것인 제제.
- 하기 화학식 1의 구조로 나타낸 유효량의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및 백신제를 포함하는 백신.
<화학식 1>
- 제15항에 있어서, 백신제가 사멸된 미생물, 약독화된 생바이러스 미생물, 톡소이드 및 불활성화되거나 약독화된 미생물의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 백신.
- 제16항에 있어서, 미생물이 박테리아 또는 진균인 백신.
- 제16항에 있어서, 톡소이드가 파상풍 또는 디프테리아인 백신.
- 제15항에 있어서, 백신제가 백신이 투여된 대상체에서 면역 반응을 유발할 수 있는 것인 백신.
- 제19항에 있어서, 화합물이 면역학적 아주반트로 작용하고; 면역계를 자극하여 백신제에 의해 유발되는 면역 반응을 변형 또는 증진시킴으로써, 대상체가 화합물이 없는 경우보다 백신에 더 반응하게 할 수 있는 것인 백신.
- 제19항에 있어서, 피하 투여, 정맥내 투여, 비강내 투여 또는 근육내 투여를 위한 백신.
- 하기 화학식 1의 구조로 나타낸 유효량의 화합물, 그의 제약상 허용되는 염, 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 대상체의 항종양 면역요법에서 사용하기 위한 제약 조성물.
<화학식 1>
- 제22항에 있어서, 대상체가 암을 앓거나, 또는 암 또는 전암 전구체에 대한 위험이 있는 것인 제약 조성물.
- 제23항에 있어서, 대상체에서 종양 및 암 세포 중 적어도 하나에 대한 반응을 유발하는 제약 조성물.
- 제24항에 있어서, 유발된 반응이 종양 성장의 지연인 제약 조성물.
- 제24항에 있어서, 유발된 반응이 종양 크기의 감소인 제약 조성물.
- 제22항에 있어서, 적어도 하나의 림프구를 포함한 세포 집단을 포함하는 후천성 면역계에 작용하며, 여기서 유발된 반응이 후천성 면역계에서의 세포 집단의 확대인 제약 조성물.
- 제27항에 있어서, 후천성 면역계에서의 세포 집단의 확대가 T 세포, CD8 T 세포, NK 세포 또는 NKT 세포 수의 확대를 포함하는 것인 제약 조성물.
- 제22항에 있어서, 암 백신인 제약 조성물.
- 제23항에 있어서, 암이 폐암, 유방암, 간암, 백혈병, 고형 종양 및 암종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
- 하기 화학식 1의 구조로 표시되는 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
<화학식 1>
- 하기 화학식 1의 구조로 나타낸 유효량의 화합물, 그의 제약상 허용되는 염, 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 대상체를 위한 항-미생물 면역요법에서 사용하기 위한 제약 조성물.
<화학식 1>
- 제32항에 있어서, 병원성 미생물 물질의 존재로부터 발생하는 감염성 질환을 치료하는데 사용하기 위한 제약 조성물.
- 제33항에 있어서, 병원성 미생물 물질이 바이러스, 박테리아, 진균, 원생동물, 다세포 기생충 및 비정상적인 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
- 제33항에 있어서, 병원성 미생물 물질이 바이러스인 제약 조성물.
- 제35항에 있어서, 바이러스가 레트로바이러스과(Retroviridae), 피코르나바이러스과(Picornaviridae), 칼시바이러스과(Calciviridae), 토가바이러스과(Togaviridae), 플라비바이러스과(Flaviridae), 코로나바이러스과(Coronaviridae), 랍도바이러스과(Rhabdoviridae), 필로바이러스과(Filoviridae), 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae), 오르토믹소바이러스과(Orthomyxoviridae), 분가바이러스과(Bungaviridae), 아레나바이러스과(Arenaviridae), 레오바이러스과(Reoviridae), 비르나바이러스과(Birnaviridae), 헤파드나바이러스과(Hepadnaviridae), 파르보바이러스과(Parvoviridae), 파포바바이러스과(Papovaviridae), 아데노바이러스과(Adenoviridae), 헤르페스바이러스과(Herpesviridae), 폭스바이러스과(Poxviridae) 및 이리도바이러스과(Iridoviridae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
- 제33항에 있어서, 병원성 미생물 물질이 박테리아인 제약 조성물.
- 제37항에 있어서, 박테리아가 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori), 보렐리아 부르그도르페리(Borellia burgdorferi), 레기오넬라 뉴모필리아(Legionella pneumophilia), 클레브시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae), 미코박테리아 종(Mycobacteria spp.), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 네이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhoeae), 네이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코쿠스 아갈락티애(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 스트렙토코쿠스 파에칼리스(Streptococcus faecalis), 스트렙토코쿠스 보비스(Streptococcus bovis), 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae), 병원성 캄필로박터 종(pathogenic Campylobacter sp.), 엔테로코쿠스 종(Enterococcus sp.), 클라미디아 종(Chlamidia sp.), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 바실러스 안트라시스(Bacillus antracis), 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae), 코리네박테리움 종(Corynebacterium sp.), 에리시펠로트릭스 루시오파티애(Erysipelothrix rhusiopathiae), 클로스트리디움 페르프린게르스(Clostridium perfringers), 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani), 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes), 클레브시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae), 파스투렐라 뮬토시다(Pasturella multocida), 박테로이데스 종(Bacteroides sp.), 푸소박테리움 누클레아텀(Fusobacterium nucleatum), 스트렙토바실러스 모닐리포르미스(Streptobacillus moniliformis), 트레포네마 팔리디움(Treponema pallidium), 트레포네마 페르테누에(Treponema pertenue), 렙토스피라(Leptospira), 악티노마이세스 이스라엘리(Actinomyces israeli), 스핑고모나스 캡슐라타(Sphingomonas capsulata) 및 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
- 제37항에 있어서, 화합물을 투여하지 않은 대상체에 비해 박테리아 박멸을 향상시키는 제약 조성물.
- 제32항에 있어서, 미생물 물질을 사멸시키는 제약 조성물.
- 제32항에 있어서, 미생물 물질이 성장할 수 없도록 하는 제약 조성물.
- 제31항에 있어서, 하기 화학식의 구조로 나타낸 화합물.
- 하기 화학식 1의 구조로 나타낸 유효량의 화합물, 그의 제약상 허용되는 염, 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 대상체를 위한 항-자가면역 면역요법에서 사용하기 위한 제약 조성물.
<화학식 1>
- 제43항에 있어서, 자가면역 질환을 치료하는데 사용하기 위한 제약 조성물.
- 제44항에 있어서, 자가면역 질환이 타입 1 당뇨병, 다발성 경화증, 인슐린-의존성 진성 당뇨병, 류마티스성 관절염 및 심근염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
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| A201 | Request for examination | ||
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| E90F | Notification of reason for final refusal | ||
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| GRNT | Written decision to grant |