WO2020179104A1 - α－ガラクトシルセラミド及び／又はα－ガラクトシルセラミドでパルスされた樹状細胞を含有する医薬組成物 - Google Patents
α－ガラクトシルセラミド及び／又はα－ガラクトシルセラミドでパルスされた樹状細胞を含有する医薬組成物 Download PDFInfo
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Definitions
- Cancer is the disease with the highest mortality rate in Japan, and is said to affect one in two Japanese. Cancer treatment methods are roughly classified into surgical therapy, radiation therapy, and chemotherapy, and various advantages and disadvantages are pointed out for each.
- myocardial remodeling progresses, causing irreversible and progressive drug-induced cardiomyopathy.
- cardiac function gradually declines to develop heart failure in the distant phase, and it may be the first time to be diagnosed as drug-induced myocardial disorder.
- anthracycline anticancer drug Immediately after administration of a high dose of anthracycline anticancer drug, there may be sudden cardiac dysfunction, and even if the use of anticancer drug is stopped, the cardiac function does not recover and aggressive cancer There are also cases in which treatment must be abandoned.
- each of the ⁇ -GalCer and ⁇ -GalCer pulsed dendritic cells prevent the occurrence of myocardial damage by the anthracycline drug doxorubicin or reduce the degree of myocardial damage,
- the following inventions have been completed.
- the gene expression level of each group is shown as a relative value to the gene expression level in the DOX group (indicated as DOX+PBS in the figure).
- 1 is a graph showing the gene expression levels of IFN- ⁇ , TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ , TGF- ⁇ 1, IL-4 and IL-10 in the myocardium of doxorubicin myocardial injury model mice to which ⁇ -GalCer was administered.
- the gene expression level of each group is shown as a relative value to the gene expression level in the Control group.
- the first aspect of the present invention relates to a pharmaceutical composition containing ⁇ -GalCer and/or ⁇ -GalCer-pulsed dendritic cells for the prevention and/or treatment of drug-induced myocardial injury.
- the culturing step is a step of culturing the mononuclear cell isolated according to a usual method in an appropriate medium containing GM-CSF and IL-2, and by this step, the mononuclear cell becomes a dendritic cell. Differentiation is induced.
- Mononuclear cells can be separated from various animal tissues, typically, for example, from peripheral blood or apheresis cell fluid by density gradient centrifugation or the like.
- mononuclear cells are preferably collected from an animal of the same species or a closely related species to which the cells are administered.
- the subject is a human
- cells collected from a human of the same species are used, and more preferably cells collected from the human who receives the administration, that is, autologous mononuclear cells are used.
- the medium used in the culturing step and the pulse step described later is a medium usually used when inducing differentiation of dendritic cells from mononuclear cells, such as AIM-V medium or RPMI-1640 medium, if necessary. Other components such as serum, plasma or albumin may be added.
- GM-CSF is added to these media to a final concentration of 500 to 1000 U/mL, preferably about 800 U/mL, and IL-2 is added to a final concentration of 50 to 200 JRU/mL, preferably about 100 JRU.
- the culture step and the pulse step may be performed separately, or the culture step and the pulse step may be performed simultaneously by adding ⁇ -GalCer to the medium in the latter half of the culture step.
- the mononuclear cells and dendritic cells obtained by the culturing process may be cryopreserved according to a usual method, thawed when necessary, and used in the subsequent process.
- the ⁇ -GalCer-pulsed dendritic cells obtained by the pulse step may be cryopreserved after preparation and thawed when necessary for use.
- a subject at risk of developing a drug-induced myocardial disorder is a subject to whom a drug capable of causing a drug-induced myocardial disorder has been administered or a subject who is scheduled to receive the drug.
- a drug capable of causing drug-induced myocardial injury is typically an anticancer agent
- the subject at risk of developing drug-induced myocardial injury according to the present invention is typically drug-induced.
- a cancer patient to whom a drug capable of causing myocardial damage is administered or a cancer patient who is scheduled to administer the drug.
- the pharmaceutical composition of the present invention is, in particular, a subject to whom a drug capable of causing drug-induced myocardial injury has been administered or is scheduled to be administered, and which has a high risk factor for drug-induced myocardial disorder.
- a drug capable of causing drug-induced myocardial injury has been administered or is scheduled to be administered, and which has a high risk factor for drug-induced myocardial disorder.
- High risk factors for drug-induced myocardial injury caused by anthracyclines include age 65 and older, high blood pressure, a history of heart disease, and recurrent cancer cases. (See European Heart Journal (2016) 37, 2768-2801, item 2.1.1.1 and Table 2), those who have at least one of these high risk factors are those who do not have high risk factors. In comparison, the risk of developing drug-induced myocardial injury is increased.
- prevention and/or treatment includes all types of medically acceptable prophylactic and/or therapeutic interventions for the purpose of cure, temporary remission or prevention of diseases. That is, the prevention and/or treatment of drug-induced myocardial disorder includes medically acceptable interventions for various purposes including delaying or stopping the progression of drug-induced myocardial disorder, preventing the onset or preventing the recurrence.
- the subject in the present invention means any animal capable of developing drug-induced myocardial injury, preferably a mammalian individual, for example, humans, primates such as chimpanzees, mice, rats, guinea pigs, rodents such as hamsters. It is an individual, such as a genus, cattle, goats, sheep and the like Artiodactyla, equine and the like Perissodactyla, rabbits, dogs, cats and the like, and more preferably humans.
- a mammalian individual for example, humans, primates such as chimpanzees, mice, rats, guinea pigs, rodents such as hamsters. It is an individual, such as a genus, cattle, goats, sheep and the like Artiodactyla, equine and the like Perissodactyla, rabbits, dogs, cats and the like, and more preferably humans.
- Drug-induced myocardial disorder is a myocardial disorder caused by administration of a drug.
- drugs capable of causing drug-induced myocardial injury include anthracycline drugs such as doxorubicin, epirubicin, daunorubicin, idarubicin, pirarubicin, amrubicin, mitoxantrone, etc.; alkylating agents such as cyclophosphamide, ifosfamide, cisplatin, Mitomycin C and the like; antimetabolites such as fluorouracil, capecitabine, cytarabine, clofalamin and the like; microtubule inhibitors such as paclitaxel, vinca alkaloid and the like; molecular targeting agents such as trastuzumab, bevacizumab, sunitinib, sorafenib and the like.
- the pharmaceutical composition of the present invention is suitable for preventing and/or treating myocardial disorders caused by anthracyclines or microtubule inhibitors, preferably myocardial disorders caused by doxorubicin or paclitaxel, particularly myocardial disorders caused by doxorubicin. There is.
- the present invention also provides a subject having or at risk of developing drug-induced myocardial injury, for administration before and after administration of a drug capable of causing drug-induced myocardial injury, ⁇ -GalCer and Also provided is a pharmaceutical composition containing dendritic cells pulsed with ⁇ -GalCer.
- the pharmaceutical composition of the present invention can be used in the form of parenteral preparations such as injections and drops.
- carriers that can be used for parenteral preparations include aqueous carriers such as physiological saline and isotonic solutions containing glucose, D-sorbitol and the like.
- doxorubicin Doxorubicin hydrochloride, D1515 (SIGMA-ALDRICH); 20 mg / kg body weight
- DOX group and DOX + ⁇ -GC group DOX + ⁇ -GC group
- Vehicle PBS
- DOX or PBS DOX or PBS
- ⁇ -GalCer 0.1 ⁇ g/g body weight
- fibrosis of myocardial tissue frozen sample of myocardial tissue was fixed with 10% formalin and then stained with 3% Picro-sirius Red (One Giesson's solution P (Wako) 100 ml + 1% Sirius red solution (Muto Chemical Co., Ltd.) 3 ml). It was evaluated by detecting collagen. A stained image was acquired under a microscope, and the ratio of the stained area in the ROI to the area of the entire ROI was calculated. The fibrosis of myocardial tissue was significantly increased in the DOX group as compared with the Control group, but in the DOX+ ⁇ -GC group, the increase observed in the DOX group was significantly suppressed (FIG. 3).
- the primer sets and probes used are as follows. GAPDH was used as the intrinsic control.
- IFN- ⁇ TaqMan Gene Expression Assays
- Mm01168134_m1 TNF- ⁇ TaqMan Gene Expression Assays
- Mm00443258_m1 IL-1 ⁇ TaqMan Gene Expression Assays
- Mm00434228_m1 TGF- ⁇ 1 TaqMan Gene Expression Assays
- Mm01178820_m1 IL-4 TaqMan Gene Expression Assays
- Mm00445259_m1 IL-10 TaqMan Gene Expression Assays
- Mm01288386_m1 GAPDH Mouse GAPD (20X), Probe dye VIC-MGB
- Interleukin-4 (IL-4) expression (FIG. 4, FIG. 5) and IFN- ⁇ expression (FIG. 5) tended to be increased in the DOX+ ⁇ -GC group compared with other groups, Activation of iNKT cells in myocardial tissue was shown. On the other hand, the expression of other cytokines such as IL-10 was not significantly changed among the 3 groups.
- CD11c TaqMan Gene Expression Assays
- Mm00498701_m1 MHC II (H2-A1) TaqMan Gene Expression Assays
- Mm00439211_m1 MCP1 (CCL2) TaqMan Gene Expression Assays
- Mm00441242_m1 iNOS (NOS2) TaqMan Gene Expression Assays
- Mm00440502_m1 IL-1 ⁇ TaqMan Gene Expression Assays
- Mm00434228_m1 Retnla TaqMan Gene Expression Assays
- Mm00445109_m1 Arg1 TaqMan Gene Expression Assays
- Mm00475988_m1 GAPDH Mouse GAPD (20X)
- Example 2 Therapeutic effect of ⁇ -GalCer-pulsed dendritic cells on myocardial damage caused by doxorubicin (1)
- Preparation of ⁇ -GalCer-pulsed dendritic cells Apheresis cell fluid was collected from healthy adult donors using a continuous blood component separator. 26.6 mL of apheresis cell solution was layered on 20 mL of Ficoll-Paque PREMIUM (GE Healthcare Japan) in a 50 mL centrifuge tube, and centrifuged at 400 xg for 30 minutes at 20°C to collect the mononuclear cell layer. ..
- the mononuclear cell layer was washed with the same amount of physiological saline and centrifuged at 400 ⁇ g for 10 minutes at 20 ° C.
- AIM-V medium containing albuminate (AIM-V medium (GIBCO Invitrogen Corporation) plus 20% volume of 4.4% blood donated albuminate (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd., 1 volume) was added to the sediment to make the volume up to 45 mL.
- the suspension was centrifuged again. After repeating this operation once more, the obtained precipitate was treated with autologous plasma-containing albuminate-added AIM-V medium (1 volume of healthy adult donor plasma to 40 volume of AIM-V medium, 4.4% blood donated albuminate).
- the cryopreserved mononuclear cells were thawed at 37° C., washed with 2 volumes of 4.4% blood donated albuminate, and then centrifuged at 400 ⁇ g for 5 minutes at 20° C. 45 mL of albuminated saline was added to the sediment, and the cells were washed again and centrifuged to obtain a sediment of mononuclear cells.
- 1 ⁇ 10 8 mononuclear cells were seeded in a 225 cm 2 flask, and human IL-2 (Shionogi & Co.) was added at a final concentration of 100 JRU/mL to human GM-CSF (North China Pharmaceutical Group Corporation-GeneTech).
- ⁇ -GalCer-pulsed dendritic cells were collected from the flask by a cell scraper and pipetting, filtered through a cell strainer, and then supplemented with albumin-containing saline (physiological saline).
- the cells were washed with 45 mL of 25% blood albumin (1 volume of Chemistry and Serum Therapy Laboratory) added to 10 volumes of water), and then centrifuged at 400 xg for 5 minutes at 20°C.
- the precipitate was washed three times in the same manner, suspended in 1 mL of albumin-added physiological saline, and further diluted with PBS to 3.0 ⁇ 10 6 /50 ⁇ L to give a cell suspension.
- a suspension of control dendritic cells was prepared in the same manner as described above except that ⁇ -GalCer was not added.
- the survival rate of mice in each group was measured 14 days after administration of DOX or PBS.
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Abstract
本発明は、薬剤性心筋障害の予防及び／又は治療のための、α-ガラクトシルセラミド及び／又はα-ガラクトシルセラミドでパルスされた樹状細胞を含有する医薬組成物に関する。また本発明は、薬剤性心筋障害を発症した又は発症するおそれのある対象に対して、薬剤性心筋障害を引き起こし得る薬剤の投与前及び投与後に投与するための、α－ガラクトシルセラミド及び／又はα－ガラクトシルセラミドでパルスされた樹状細胞を含有する医薬組成物に関する。
Description
本発明は、α－ガラクトシルセラミド（α-GalCer）及び／又はα-GalCerでパルスされた樹状細胞を含有する、薬剤性心筋障害の予防及び／又は治療のための医薬組成物に関する。
がんは、我が国で最も死亡率の高い病気であり、日本人の2人に1人が罹患するといわれている。がんの治療方法は、外科的療法、放射線療法及び化学療法に大別されており、それぞれについて様々なメリット及びデメリットが指摘されている。
化学療法において特に問題とされるのが、いわゆる抗がん剤の副作用であり、その1つに、薬剤性心筋障害が挙げられる。薬剤性心筋障害は、薬剤によって心筋の障害が引き起こされて心筋症を呈することを基本病態とする疾患であり、これを発症した患者は、難治性心不全を呈して死に至ることがある。これまでに、多数の薬剤が薬剤性心筋障害を引き起こすことが報告されている。特に、抗がん剤として広く使用されている代表的な薬剤であるドキソルビシン等のアントラサイクリン系薬剤は、投与後早期から心筋障害を引き起こすが、軽微な障害であってもそれを契機として慢性期に心筋リモデリングが進行し、不可逆かつ進行性の薬剤性心筋症を引き起こす場合がある。例えば、アントラサイクリン系抗がん剤によるがん治療が奏功した後、心機能が徐々に低下し遠隔期になって心不全を発症して、初めて薬剤性心筋障害と診断されることがある一方、アントラサイクリン系抗がん剤を高用量投与した直後、急激に心機能障害をきたすこともあり、中には抗がん剤の使用を中止しても心機能が回復せず、積極的がん治療を断念せざるを得ないケースも存在している。
ドキソルビシンを含むアントラサイクリン系抗がん剤に起因する薬剤性心筋障害の発症には、心筋細胞に発現するTopoisomerase(Top)2β活性の阻害、並びにこれによって引き起こされるDNA障害、ミトコンドリア機能障害及びROS産生亢進等の誘導が重要であると考えられている。最近の総説には、ドキソルビシンに起因する薬剤性心筋障害は、多数のファクターが関与する複雑な機序を有することが記載されている（非特許文献１）。これまでTop2β及びその下流をターゲットにした介入研究がなされてきたが、薬剤性心筋障害の発症や進展の予防に有効な介入法は皆無である。
一般的に、心不全の進行は、虚血や圧負荷などによる心筋細胞障害を契機とし、心ポンプ機能不全によって引き起こされる「交感神経系、レニン・アンジオテンシン系、酸化ストレスの亢進」がさらに心筋細胞障害を増悪させる悪循環（いわゆる「心筋リモデリング」）によってもたらされる。心不全の病因は多岐にわたり、治療はACE阻害薬、アンジオテンシン受容体拮抗薬及びβ遮断薬といった対症療法が主体となっている。
これに対し、薬剤性心筋障害は、拡張型心筋症と臨床的に類似した心筋症と位置づけられている一方で、心筋細胞障害を惹起する多くの機序が絡む特殊な病態とみなされており、ACE阻害薬、アンジオテンシン受容体拮抗薬及びβ遮断薬等の既存の標準的心不全治療に抵抗性を呈することが知られている。例えば、非特許文献２は、アントラサイクリン系抗がん剤に起因する薬剤性心筋障害を有する小児がん患者において、ACE阻害薬エナラプリルの投与は左室収縮末期壁応力を低減させたものの運動能力等を反映する他の重要なパラメータを改善することはできなかったことを開示している。また、非特許文献３は、アントラサイクリン系抗がん剤で治療された早期乳がんの患者において、アンジオテンシン受容体拮抗薬カンデサルタンの投与は左室駆出率の低下を軽減したものの左室長軸方向グローバルストレイン又は心筋バイオマーカー（トロポニンI、BNP）を改善することができずアントラサイクリンの心毒性を妨げなかったこと、及びβ遮断薬メトプロロールは左室駆出率の低下を防ぐことはできなかったことを開示している。
このような知見から、薬剤性心筋障害は、虚血性心不全等の一般的な心不全において見られる心筋リモデリングとは異なる進展メカニズムを有するものと推測されている。
また、薬剤性心筋障害の発症リスクは、薬剤累積使用量に加えて年齢や基礎心疾患の存在が寄与することが報告されているが、現時点では発症リスクの正確な予測には至っていない。このような背景から、薬剤性心筋障害は積極的がん化学療法を進める上での妨げになっており、薬剤性心筋障害の発症予測や予防・治療法の開発は、社会的に強く求められているにもかかわらず、有効な手段が存在しないのが現状である。
一方、α-GalCerは特異的にNKT細胞を活性化させることが知られており、α-GalCer又はα-GalCerでパルスされた樹状細胞を用いたNKT細胞の研究は多数報告されている。本発明者らは、虚血性心不全である心筋梗塞後心不全に対するα-GalCer（非特許文献４）及びα-GalCerでパルスされた樹状細胞（特許文献１）の治療効果を確認している。
Renu et al., European Journal of Pharmacology 2018; 818: 241-253.
Silber et al., J. Clin. Oncol. 2004; 22: 820-828.
Gulati et al., European Heart Journal 2016; 37: 1671-1680.
Sobirin et al., Circ. Res. 2012; 111: 1037-1047.
本発明は、薬剤性心筋障害を予防及び／又は治療するための手段を提供することを目的とする。
本発明者らは、α-GalCer及びα-GalCerでパルスされた樹状細胞のそれぞれがアントラサイクリン系薬剤であるドキソルビシンによる心筋障害の発生を予防する又は心筋障害の程度を軽減することを見出し、以下の発明を完成させた。
（１）α-GalCer及び／又はα-GalCerでパルスされた樹状細胞を含有する、薬剤性心筋障害の予防及び／又は治療のための医薬組成物。
（２）薬剤性心筋障害が、アントラサイクリン系薬剤によって引き起こされる心筋障害である、（１）に記載の医薬組成物。
（３）薬剤性心筋障害が、ドキソルビシンによって引き起こされる心筋障害である、（１）に記載の医薬組成物。
（４）薬剤性心筋障害を発症した又は発症するおそれのある対象に対して、薬剤性心筋障害を引き起こし得る薬剤と組み合わせて用いるための、α-GalCer及び／又はα-GalCerでパルスされた樹状細胞を含有する医薬組成物。
（５）薬剤性心筋障害を発症した又は発症するおそれのある対象に対して、薬剤性心筋障害を引き起こし得る薬剤の投与前及び投与後に投与するための、α-GalCer及び／又はα-GalCerでパルスされた樹状細胞を含有する医薬組成物。
（６）薬剤性心筋障害を引き起こし得る薬剤が、アントラサイクリン系薬剤、アルキル化剤、代謝拮抗薬、微小管阻害薬及び分子標的薬よりなる群から選択される、（４）又は（５）に記載の医薬組成物。
（７）薬剤性心筋障害を引き起こし得る薬剤が、アントラサイクリン系薬剤である、（４）又は（５）に記載の医薬組成物。
（８）薬剤性心筋障害を引き起こし得る薬剤が、ドキソルビシンである、（４）又は（５）に記載の医薬組成物。
（２）薬剤性心筋障害が、アントラサイクリン系薬剤によって引き起こされる心筋障害である、（１）に記載の医薬組成物。
（３）薬剤性心筋障害が、ドキソルビシンによって引き起こされる心筋障害である、（１）に記載の医薬組成物。
（４）薬剤性心筋障害を発症した又は発症するおそれのある対象に対して、薬剤性心筋障害を引き起こし得る薬剤と組み合わせて用いるための、α-GalCer及び／又はα-GalCerでパルスされた樹状細胞を含有する医薬組成物。
（５）薬剤性心筋障害を発症した又は発症するおそれのある対象に対して、薬剤性心筋障害を引き起こし得る薬剤の投与前及び投与後に投与するための、α-GalCer及び／又はα-GalCerでパルスされた樹状細胞を含有する医薬組成物。
（６）薬剤性心筋障害を引き起こし得る薬剤が、アントラサイクリン系薬剤、アルキル化剤、代謝拮抗薬、微小管阻害薬及び分子標的薬よりなる群から選択される、（４）又は（５）に記載の医薬組成物。
（７）薬剤性心筋障害を引き起こし得る薬剤が、アントラサイクリン系薬剤である、（４）又は（５）に記載の医薬組成物。
（８）薬剤性心筋障害を引き起こし得る薬剤が、ドキソルビシンである、（４）又は（５）に記載の医薬組成物。
本発明によれば、従来の心筋障害に対する治療薬では処置が困難であった薬剤性心筋障害を効果的に予防及び／又は治療することができる。
本発明の第一の態様は、α-GalCer及び／又はα-GalCerでパルスされた樹状細胞を含有する、薬剤性心筋障害の予防及び／又は治療のための医薬組成物に関する。
本発明において用いられるα-GalCerは、樹状細胞等の抗原提示細胞の細胞膜上に存在するCD1d分子によって提示されたときに、NKT細胞上のNKT細胞固有のT細胞受容体であるNKT細胞受容体によって特異的に認識されてNKT細胞を特異的に活性化することができるものであればよい。その観点で、本発明においては、α-GalCerそのもの、又はα-GalCerのアナログ、例えばα-GalCerの塩、エステル若しくは誘導体（例えばTashiro T., Biosci.Biotechnol.Biochem., 2012, 76(6), pp.1055-67に記載されるもの）を用いることができる。また、市販のα-GalCer（例えばフナコシ株式会社、株式会社レグイミューン等から入手可能なもの）を用いることもできる。
α-GalCerでパルスされた樹状細胞は、単核球細胞をGM-CSF及びIL-2の存在下で培養する工程並びに培養された細胞をα-GalCerでパルスする工程を含む方法により得られる樹状細胞であり、その調製方法は、例えば国際公開番号WO2015/129791、米国特許第10,022,401号及びIshikawaら（Int.J.Cancer, 2005, 117, pp.265-273）に記載されている。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
培養工程は、通常の方法に従って分離された単核球細胞を、GM-CSF及びIL-2を含有する適当な培地で培養する工程であり、かかる工程によって単核球細胞は樹状細胞へと分化誘導される。単核球細胞は、様々な動物組織から分離することができ、典型的には例えば末梢血又はアフェレーシス細胞液から密度勾配遠心法等によって分離することができる。
単核球細胞は、その後の樹状細胞投与の際の安全性を考慮した場合、細胞を投与する対象と同種又は近縁種の動物から採取するのが好ましい。例えば、対象がヒトである場合、好ましくは同種であるヒトから採取された細胞が、より好ましくは投与を受けるヒト自身から採取された細胞、すなわち自己単核球細胞が用いられる。
培養工程及び後述のパルス工程において用いられる培地は、単核球細胞から樹状細胞を分化誘導するときに通常用いられる培地、例えばAIM-V培地やRPMI-1640培地等であり、必要に応じて血清、血漿又はアルブミン等の他の成分を添加してもよい。培養工程では、これらの培地にGM-CSFを最終濃度が500～1000U/mL、好ましくは約800U/mLになるように、及びIL-2を最終濃度が50～200JRU/mL、好ましくは約100JRU/mLになるように添加したものを用いて、単核球細胞を5～10日間、培養する。
パルス工程は、培養工程により調製された樹状細胞をα-GalCerでパルスする工程であって、具体的にはα-GalCerを最終濃度50～200 ng/mL、好ましくは約100 ng/mLで含有する培地中で、樹状細胞を8～48時間培養することにより行われる。
培養工程とパルス工程とは各々別々に行ってもよく、又は培養工程の後半でα-GalCerを培地に添加することにより培養工程とパルス工程を同時に行うこともできる。
単核球細胞及び培養工程により得られる樹状細胞は、通常の方法に従って凍結保存し、必要な時に融解してその後の工程に用いてもよい。同様に、パルス工程により得られるα-GalCerをパルスした樹状細胞は、調製後に凍結保存し、必要な時に融解して用いてもよい。
本発明の医薬組成物は、薬剤性心筋障害の予防及び／又は治療を必要とする対象に、具体的には薬剤性心筋障害を発症した対象又は薬剤性心筋障害を発症するおそれのある対象に投与することで、薬剤性心筋障害並びにこれに起因する心機能低下及び心不全等の症候を予防及び／又は治療することができる。
薬剤性心筋障害を発症するおそれのある対象とは、薬剤性心筋障害を引き起こし得る薬剤を投与された対象又は当該薬剤の投与が予定されている対象である。後述のように、薬剤性心筋障害を引き起こし得る薬剤は典型的には抗がん剤であることから、本発明における薬剤性心筋障害を発症するおそれのある対象は、典型的には、薬剤性心筋障害を引き起こし得る薬剤を投与されたがん患者又は当該薬剤の投与が予定されているがん患者である。
本発明の医薬組成物は、特に、薬剤性心筋障害を引き起こし得る薬剤を投与された対象又は当該薬剤の投与が予定されている対象であって、かつ薬剤性心筋障害のハイリスク因子を有する対象に用いられることが好ましい。アントラサイクリン系薬剤によって引き起こされる薬剤性心筋障害のハイリスク因子としては、年齢65歳以上であること、高血圧であること、心疾患の既往があること、がんの再発例であることが挙げられ（European Heart Journal (2016) 37, 2768-2801の項目2.1.1.1及びTable 2を参照されたい）、これらのハイリスク因子のうちの少なくとも１つを有する対象は、ハイリスク因子を有しない対象に比して、薬剤性心筋障害を発症するリスクが増加する。
このように、本発明はまた、薬剤性心筋障害を発症した又は発症するおそれのある対象に対して、薬剤性心筋障害を引き起こし得る薬剤と組み合わせて用いるための、α-GalCer及び／又はα-GalCerでパルスされた樹状細胞を含有する医薬組成物をも提供する。
本明細書において用いられる予防及び／又は治療は、疾患の治癒、一時的寛解又は予防等を目的とする医学的に許容される全てのタイプの予防的及び／又は治療的介入を包含する。すなわち薬剤性心筋障害の予防及び／又は治療は、薬剤性心筋障害の進行の遅延又は停止、発症の予防又は再発の防止等を含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。
本発明における対象とは、薬剤性心筋障害を発症し得る任意の動物を意味し、好ましくは哺乳動物の個体、例えば、ヒト、チンパンジー等の霊長類、マウス、ラット、モルモット、ハムスター等の齧歯類、ウシ、ヤギ、ヒツジ等の偶蹄目、ウマ等の奇蹄目、ウサギ、イヌ、ネコ等の個体であり、さらに好ましくはヒトの個体である。
薬剤性心筋障害は、薬剤の投与によって引き起こされる心筋障害である。薬剤性心筋障害を引き起こし得る公知の薬剤としては、アントラサイクリン系薬剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、ピラルビシン、アムルビシン、ミトキサントロン等；アルキル化剤、例えばシクロホスファミド、イホスファミド、シスプラチン、マイトマイシンC等；代謝拮抗薬、例えばフルオロウラシル、カペシタビン、シタラビン、クロファラミン等；微小管阻害薬、例えばパクリタキセル、ビンカアルカロイド等；分子標的薬、例えばトラスツズマブ、ベバシズマブ、スニチニブ、ソラフェニブ等を挙げることができる。本発明の医薬組成物は、アントラサイクリン系薬剤又は微小管阻害薬によって引き起こされる心筋障害、好ましくはドキソルビシン又はパクリタキセルによって引き起こされる心筋障害、特にドキソルビシンによって引き起こされる心筋障害の予防及び／又は治療に適している。
本発明の医薬組成物は、有効量のα-GalCer及び／又はα-GalCerでパルスされた樹状細胞を含む。本明細書中で用いられる「有効量」とは、薬剤性心筋障害を予防及び／又は治療するのに効果的な量を意味する。かかる有効量は、薬剤性心筋障害の重症度、患者その他の医学的要因によって適宜調節される。
本発明の医薬組成物の好ましい実施形態において、α-GalCerの有効量は、投与される個体の体重1 kgあたり1～1000μg、好ましくは5～500μg、より好ましくは10～100μgであり、α-GalCerでパルスされた樹状細胞の有効量は、投与される個体の体表面積1 m2あたり106個～109個、好ましくは107個～109個である。これらの有効量の医薬組成物は、1日に1回若しくは複数回に分けて、又は間歇的に投与することができる。
好ましい実施形態において、本発明の医薬組成物は、薬剤性心筋障害を引き起こし得る薬剤の投与前及び投与後に対象に投与される。例示的なレジメンは以下のとおりである：対象、典型的にはがん患者、例えば悪性リンパ腫患者に、本発明の医薬組成物を投与；投与の数日後、薬剤性心筋障害を引き起こし得る薬剤、例えばドキソルビシン、CHOP（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾロンの組み合わせ）等をがんの治療のために投与；さらにその数日後、再度、本発明の医薬組成物を投与。
このように、本発明はまた、薬剤性心筋障害を発症した又は発症するおそれのある対象に対して、薬剤性心筋障害を引き起こし得る薬剤の投与前及び投与後に投与するための、α-GalCer及び／又はα-GalCerでパルスされた樹状細胞を含有する医薬組成物をも提供する。
本発明の医薬組成物は、上述の有効成分以外の薬物又は緩衝剤、抗酸化剤、保存剤、タンパク質、親水性ポリマー、アミノ酸、キレート化剤、非イオン性界面活性剤、賦形剤、安定化剤、担体等の薬学的に許容される成分を含んでもよい。薬学的に許容される成分は当業者において周知であり、当業者が通常の実施能力の範囲内で、例えば第十七改正日本薬局方その他の規格書に記載された成分から製剤の形態に応じて適宜選択して使用することができる。
本発明の医薬組成物は、注射剤、点滴剤等の非経口製剤の形態で用いられることができる。非経口製剤に用いることができる担体としては、例えば、生理食塩水や、ブドウ糖、D-ソルビトール等を含む等張液といった水性担体が挙げられる。
本発明の医薬組成物の投与方法は、特に制限されないが、非経口製剤である場合は、例えば血管内投与（好ましくは静脈内投与）、腹腔内投与、腸管内投与、皮下投与等を挙げることができる。好ましい実施形態の一つにおいて、本発明の医薬組成物は、静脈内投与又は腹腔内投与により生体に投与される。
本発明は、薬剤性心筋障害の予防及び／又は治療を必要とする対象に有効量のα-GalCer及び／又はα-GalCerでパルスされた樹状細胞を投与することを含む、薬剤性心筋障害の予防及び／又は治療の方法をも提供する。予防及び／又は治療の方法における各用語の意味は、上で説明したとおりである。
以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、これらの実施例は本発明の理解を助けるためのものであって、本発明の技術的範囲はこれらにより限定されるものではない。
実施例１ ドキソルビシンによる心筋障害に対するα-GalCerの治療効果
8週齢雄性C57BL/6マウスを3群（Control群、DOX群、DOX＋α-GC群）に分け、DOX＋α-GC群にα- GalCer（KRN7000（フナコシ）；0.1μg/g体重）を、Control群及びDOX群にPBSを腹腔内投与した。投与の4日後、DOX群及びDOX＋α-GC群にドキソルビシン（Doxorubicin hydrochloride, D1515（SIGMA-ALDRICH)；20 mg/kg体重）を、Control群にVehicle（PBS）を腹腔内投与した。DOX又はPBS投与から3日後に、DOX＋α-GC群にα- GalCer（0.1μg/g体重）を、Control群及びDOX群にPBSを腹腔内投与した。DOX又はPBS投与から14日後に、各群のマウスに対して心エコー検査を行って心機能を評価し、その後に心臓を採取して、心筋組織線維化の病理学的評価及び定量的リアルタイムRT-PCR法での炎症性サイトカイン発現評価を行った。試験スケジュールを図１に示す。
8週齢雄性C57BL/6マウスを3群（Control群、DOX群、DOX＋α-GC群）に分け、DOX＋α-GC群にα- GalCer（KRN7000（フナコシ）；0.1μg/g体重）を、Control群及びDOX群にPBSを腹腔内投与した。投与の4日後、DOX群及びDOX＋α-GC群にドキソルビシン（Doxorubicin hydrochloride, D1515（SIGMA-ALDRICH)；20 mg/kg体重）を、Control群にVehicle（PBS）を腹腔内投与した。DOX又はPBS投与から3日後に、DOX＋α-GC群にα- GalCer（0.1μg/g体重）を、Control群及びDOX群にPBSを腹腔内投与した。DOX又はPBS投与から14日後に、各群のマウスに対して心エコー検査を行って心機能を評価し、その後に心臓を採取して、心筋組織線維化の病理学的評価及び定量的リアルタイムRT-PCR法での炎症性サイトカイン発現評価を行った。試験スケジュールを図１に示す。
心エコー検査は超音波記録装置EUB-8000（日立）を用いて、ペントバルビタール麻酔下で行った。エコー画像から左室拡張末期径及び左室収縮期末期径を測定し、左室収縮力の指標となる左室短縮率（%FS）を（左室拡張末期径－左室収縮期末期径）／左室拡張末期径×100として算出した。心機能（%FS）は、Control群と比較してDOX群で有意に低下していたが、DOX＋α-GC群では、DOX群で認められた心機能の低下は確認されなかった（図２）。
心筋組織の線維化は、心筋組織の凍結切片試料を10%ホルマリンで固定した後、3% Picro-sirius Red（ワンギーソン液P（Wako）100ml＋1% シリウスレッド液（武藤化学株式会社）3ml）で染色してコラーゲンを検出することによって評価した。顕微鏡下で染色画像を取得し、関心領域全体の面積に対する関心領域内の染色面積の割合を算出した。心筋組織の線維化は、Control群と比較してDOX群で有意に増加したが、DOX＋α-GC群では、DOX群で認められた増加が有意に抑制されていた（図３）。
また、心筋組織からQuickGene-810（富士フイルム）を用いてTotal RNAを抽出し、これをcDNA reverse transcription kit（Applied Biosystems）を用いた逆転写反応に供してcDNAを調製した。このcDNAを鋳型としてTaqMan法による定量的リアルタイムRT-PCRを行うことによって炎症性サイトカインの発現を評価した。使用したプライマーセット及びプローブ（いずれもApplied Biosystems）は、以下の通りである。内在性コントロールとしてはGAPDHを用いた。
IFN-γ：TaqMan Gene Expression Assays, Mm01168134_m1
TNF-α：TaqMan Gene Expression Assays, Mm00443258_m1
IL-1β：TaqMan Gene Expression Assays, Mm00434228_m1
TGF-β1：TaqMan Gene Expression Assays, Mm01178820_m1
IL-4：TaqMan Gene Expression Assays, Mm00445259_m1
IL-10：TaqMan Gene Expression Assays, Mm01288386_m1
GAPDH：Mouse GAPD (20X), Probe dye VIC-MGB
IFN-γ：TaqMan Gene Expression Assays, Mm01168134_m1
TNF-α：TaqMan Gene Expression Assays, Mm00443258_m1
IL-1β：TaqMan Gene Expression Assays, Mm00434228_m1
TGF-β1：TaqMan Gene Expression Assays, Mm01178820_m1
IL-4：TaqMan Gene Expression Assays, Mm00445259_m1
IL-10：TaqMan Gene Expression Assays, Mm01288386_m1
GAPDH：Mouse GAPD (20X), Probe dye VIC-MGB
インターロイキン-4（IL-4）の発現（図４、図５）及びIFN-γの発現（図５）は、他群と比較してDOX＋α-GC群において亢進している傾向が認められ、心筋組織におけるiNKT細胞の活性化が示された。一方、IL-10等他のサイトカインの発現は、３群間で大きな変化は認められなかった。
さらに、上記cDNAを鋳型として下記のプライマーセット及びプローブ（いずれもApplied Biosystems）を用いたTaqMan法による定量的リアルタイムRT-PCRを行うことによって、CD11c及びMHC II（活性化マクロファージマーカー）、MCP-1、iNOS、IL-1β（M1マクロファージマーカー）、並びにRetnla及びArginase 1（Arg1）（M2マクロファージマーカー）の発現を評価した。内在性コントロールとしてはGAPDHを用いた。
CD11c：TaqMan Gene Expression Assays, Mm00498701_m1
MHC II (H2-A1)：TaqMan Gene Expression Assays, Mm00439211_m1
MCP1 (CCL2)：TaqMan Gene Expression Assays, Mm00441242_m1
iNOS (NOS2)：TaqMan Gene Expression Assays, Mm00440502_m1
IL-1β：TaqMan Gene Expression Assays, Mm00434228_m1
Retnla：TaqMan Gene Expression Assays, Mm00445109_m1
Arg1：TaqMan Gene Expression Assays, Mm00475988_m1
GAPDH：Mouse GAPD (20X), Probe dye VIC-MGB
CD11c：TaqMan Gene Expression Assays, Mm00498701_m1
MHC II (H2-A1)：TaqMan Gene Expression Assays, Mm00439211_m1
MCP1 (CCL2)：TaqMan Gene Expression Assays, Mm00441242_m1
iNOS (NOS2)：TaqMan Gene Expression Assays, Mm00440502_m1
IL-1β：TaqMan Gene Expression Assays, Mm00434228_m1
Retnla：TaqMan Gene Expression Assays, Mm00445109_m1
Arg1：TaqMan Gene Expression Assays, Mm00475988_m1
GAPDH：Mouse GAPD (20X), Probe dye VIC-MGB
他群と比較して、DOX＋α-GC群において、CD11c及びMHC IIの発現亢進並びにRetnla及びArg1の発現亢進が観察された。一方、M1マクロファージマーカーであるMCP-1、iNOS、IL-1βの発現は3群間で大きな変化は認められなかった（図６）。以上から、心筋組織では、主に組織修復型M2マクロファージがα- GalCerの投与によって活性化されたと考えられる。
実施例２ ドキソルビシンによる心筋障害に対するα-GalCerをパルスした樹状細胞の治療効果
（１）α- GalCerをパルスした樹状細胞の調製
健常成人ドナーから連続式血液成分分離装置を用いてアフェレーシス細胞液を採取した。50 mL遠心チューブ中のFicoll-Paque PREMIUM（GEヘルスケア・ジャパン）20 mLにアフェレーシス細胞液26.6 mLを積層し、400×gで30分間、20℃で遠心し、単核球細胞層を回収した。単核球細胞層を同量の生理食塩水で洗浄し、400×gで10分間、20℃で遠心した。沈渣にアルブミネート加AIM-V培地（AIM-V培地（GIBCO Invitrogen Corporation）20容量に対して4.4％献血アルブミネート（日本製薬）1容量を添加したもの）を加えて液量を45 mLにした懸濁液を再度遠心した。この操作をさらに1回繰り返した後、得られた沈渣を自己血漿加アルブミネート加AIM-V培地（AIM-V培地40容量に対して健常成人ドナーの血漿を1容量、4.4％献血アルブミネートを2容量添加したもの）に懸濁し、細胞濃度が2.7×108個／mL以下となるように液量を調節して細胞浮遊液とした。細胞浮遊液13.8 mLを25 mL凍結バッグに分注し、抗凝固液ACD-A液（テルモ）2 mL及び凍害保護液CP-1（極東製薬工業）9.2 mLを各バッグに添加した後、-80℃で凍結保存した。
（１）α- GalCerをパルスした樹状細胞の調製
健常成人ドナーから連続式血液成分分離装置を用いてアフェレーシス細胞液を採取した。50 mL遠心チューブ中のFicoll-Paque PREMIUM（GEヘルスケア・ジャパン）20 mLにアフェレーシス細胞液26.6 mLを積層し、400×gで30分間、20℃で遠心し、単核球細胞層を回収した。単核球細胞層を同量の生理食塩水で洗浄し、400×gで10分間、20℃で遠心した。沈渣にアルブミネート加AIM-V培地（AIM-V培地（GIBCO Invitrogen Corporation）20容量に対して4.4％献血アルブミネート（日本製薬）1容量を添加したもの）を加えて液量を45 mLにした懸濁液を再度遠心した。この操作をさらに1回繰り返した後、得られた沈渣を自己血漿加アルブミネート加AIM-V培地（AIM-V培地40容量に対して健常成人ドナーの血漿を1容量、4.4％献血アルブミネートを2容量添加したもの）に懸濁し、細胞濃度が2.7×108個／mL以下となるように液量を調節して細胞浮遊液とした。細胞浮遊液13.8 mLを25 mL凍結バッグに分注し、抗凝固液ACD-A液（テルモ）2 mL及び凍害保護液CP-1（極東製薬工業）9.2 mLを各バッグに添加した後、-80℃で凍結保存した。
凍結保存した単核球細胞を37℃で解凍し、2倍容量の4.4％献血アルブミネートを加えて洗浄した後、400×gで5分間、20℃で遠心した。沈渣にアルブミネート加生理食塩水45 mLを加えて再度洗浄、遠心分離を行い、単核球細胞の沈渣を得た。単核球細胞1×108個を225 cm2フラスコに播種し、ヒトIL-2（塩野義製薬）を最終濃度100 JRU／mLで、ヒトGM-CSF（North China Pharmaceutical Group Corporation-GeneTech）を最終濃度800 U／mLで添加した自己血漿加アルブミネート加AIM-V培地50 mLを用いて、温度37℃、CO2濃度5.0％で7日間培養した。培養3日目及び6日目に自己血漿加アルブミネート加AIM-V培地50 mLをさらに添加し、ヒトIL-2を最終濃度100 JRU／mLになるように、ヒトGM-CSFを最終濃度800 U／mLになるように添加した。培養6日目にα-GalCer（フナコシ）を最終濃度100 ng／mLとなるよう添加した。
培養終了後、得られたα- GalCerがパルスされた樹状細胞（α-GC/DC）をセルスクレーパー及びピペッティングによりフラスコから回収し、セルストレーナーでろ過後、アルブミン加生理食塩水（生理食塩水10容量に対して25％献血アルブミン（化学及血清療法研究所）1容量を添加したもの）45 mLで洗浄した後、400×gで5分間、20℃で遠心した。沈渣をさらに3回、同様に洗浄した後、アルブミン加生理食塩水1mLに懸濁し、さらに3.0×106／50μLとなるようにPBSで希釈し、細胞懸濁液とした。また、α- GalCerを添加しないこと以外は上述と同様の方法で対照となる樹状細胞（DC）の懸濁液を調製した。
（２）ドキソルビシンによる心筋障害に対する治療効果の評価
8週齢雄性C57BL/6マウスを4群（Control群（n＝6）、DOX＋PBS群（n＝11）、DOX＋DC群（n＝10）、DOX＋α-GC/DC群（n＝10））に分け、DOX＋DC群に上記（１）で得たDC 3×106個／匹を、DOX＋α-GC/DC群に上記（１）で得たα-GC/DC 3×106個／匹を、Control群及びDOX＋PBS群にPBSを腹腔内投与した。投与の4日後、DOX＋PBS群、DOX＋DC群及びDOX＋α-GC/DC群にドキソルビシン（20mg/kg体重）を、Control群にVehicle（PBS）を腹腔内投与した。DOX又はPBS投与から3日後に、DOX＋DC群に上記（１）で得たDC 3×106個／匹を、DOX＋α-GC/DC群に上記（１）で得たα-GC/DC 3×106個／匹を、Control群及びDOX＋PBS群にPBSを腹腔内投与した。DOX又はPBS投与から14日後に、実施例１と同様にして、各群のマウス（Control群; n=6、DOX＋PBS群; n=9、DOX＋DC群; n=5、DOX＋α-GC/DC群; n=9）に対して心エコー検査を行って心機能を評価した。さらに、DOX又はPBS投与から14日間における各群のマウスの生存率を測定した。
8週齢雄性C57BL/6マウスを4群（Control群（n＝6）、DOX＋PBS群（n＝11）、DOX＋DC群（n＝10）、DOX＋α-GC/DC群（n＝10））に分け、DOX＋DC群に上記（１）で得たDC 3×106個／匹を、DOX＋α-GC/DC群に上記（１）で得たα-GC/DC 3×106個／匹を、Control群及びDOX＋PBS群にPBSを腹腔内投与した。投与の4日後、DOX＋PBS群、DOX＋DC群及びDOX＋α-GC/DC群にドキソルビシン（20mg/kg体重）を、Control群にVehicle（PBS）を腹腔内投与した。DOX又はPBS投与から3日後に、DOX＋DC群に上記（１）で得たDC 3×106個／匹を、DOX＋α-GC/DC群に上記（１）で得たα-GC/DC 3×106個／匹を、Control群及びDOX＋PBS群にPBSを腹腔内投与した。DOX又はPBS投与から14日後に、実施例１と同様にして、各群のマウス（Control群; n=6、DOX＋PBS群; n=9、DOX＋DC群; n=5、DOX＋α-GC/DC群; n=9）に対して心エコー検査を行って心機能を評価した。さらに、DOX又はPBS投与から14日間における各群のマウスの生存率を測定した。
DOX＋PBS群及びDOX＋DC群では左室短縮率（%FS）の低下が認められる一方、DOX＋α-GC/DC群では左室短縮率の低下はほとんど観察されなかったことから（図７）、α- GalCerをパルスした樹状細胞はドキソルビシン投与による心機能の低下を防ぎ、また低下した心機能を回復させることが示唆された。生存率は、Control, DOX+α-GC/DC, DOX+PBS, DOX+DCの順に低下した（図８）。
また、心機能評価後に心臓を採取して、心筋組織線維化の病理学的評価及び定量的リアルタイムRT-PCR法での炎症性サイトカイン発現評価を行うことによっても、ドキソルビシンによる心筋障害に対するα-GC/DCの治療効果を確認することができる。
Claims (8)
- 薬剤性心筋障害の予防及び／又は治療のための、α－ガラクトシルセラミド及び／又はα－ガラクトシルセラミドでパルスされた樹状細胞を含有する医薬組成物。
- 薬剤性心筋障害が、アントラサイクリン系薬剤によって引き起こされる心筋障害である、請求項１に記載の医薬組成物。
- 薬剤性心筋障害が、ドキソルビシンによって引き起こされる心筋障害である、請求項１に記載の医薬組成物。
- 薬剤性心筋障害を発症した又は発症するおそれのある対象に対して、薬剤性心筋障害を引き起こし得る薬剤と組み合わせて用いるための、α－ガラクトシルセラミド及び／又はα－ガラクトシルセラミドでパルスされた樹状細胞を含有する医薬組成物。
- 薬剤性心筋障害を発症した又は発症するおそれのある対象に対して、薬剤性心筋障害を引き起こし得る薬剤の投与前及び投与後に投与するための、α－ガラクトシルセラミド及び／又はα－ガラクトシルセラミドでパルスされた樹状細胞を含有する医薬組成物。
- 薬剤性心筋障害を引き起こし得る薬剤が、アントラサイクリン系薬剤、アルキル化剤、代謝拮抗薬、微小管阻害薬及び分子標的薬よりなる群から選択される、請求項４又は５に記載の医薬組成物。
- 薬剤性心筋障害を引き起こし得る薬剤が、アントラサイクリン系薬剤である、請求項４又は５に記載の医薬組成物。
- 薬剤性心筋障害を引き起こし得る薬剤が、ドキソルビシンである、請求項４又は５に記載の医薬組成物。
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|---|---|---|---|
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| US17/435,230 US20220160659A1 (en) | 2019-03-04 | 2019-08-28 | PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING a-GALACTOSYLCERAMIDE AND/OR DENDRITIC CELLS PULSED WITH a-GALACTOSYLCERAMIDE |
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2021010344A1 (ja) * | 2019-07-12 | 2021-01-21 |
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| WO2007043630A1 (ja) * | 2005-10-06 | 2007-04-19 | Riken | 上気道粘膜下に投与されるｎｋｔ細胞刺激剤 |
| US20100008954A1 (en) * | 2008-07-11 | 2010-01-14 | Chi-Huey Wong | Alpha-galactosyl ceramide analogs and their use as immunotherapies |
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-
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JPWO2021010344A1 (ja) * | 2019-07-12 | 2021-01-21 | ||
| EP3984597A4 (en) * | 2019-07-12 | 2023-07-12 | Kyushu University, National University Corporation | DEVELOPMENT OF A THERAPY TO IMPROVE MYOCARDIAL CONTRACTION AND A METHOD OF INHIBITION OF CARDIOMYOCYTE DEATH |
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