JP2010516239A - 細胞の産生に対する新規方法および試薬 - Google Patents

細胞の産生に対する新規方法および試薬 Download PDF

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Abstract

本発明は、幹細胞を、幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤と接触させることにより、幹細胞を調節し、および増殖させるための方法および材料を提供する。調節は形態学的変化、分化状態の変化、生物学的状態または接着であってよい。本発明において提供される材料はこのような結合物質および結合剤をスクリーニングするためにも有用である。
【選択図】なし

Description

本発明は幹細胞のグリカン構造に対する特異的結合剤のための試薬および方法ならびに細胞の培養と関連したこれらの使用を記載するものである。さらに本発明は、幹細胞の表面の特定のグリカンエピトープに対するさらなる結合剤のスクリーニングに関する。グリカン構造の好ましい結合剤としては、酵素、レクチンおよび抗体等のタンパク質などが挙げられる。
幹細胞
幹細胞は一連の成熟した機能細胞を生じうる未分化の細胞である。例えば、造血幹細胞は任意の各種の最終分化した血液細胞を生じ得る。胚性幹（ＥＳ）細胞は胚に由来し、多能性であり、そのため任意の器官または組織に、または、少なくとも潜在的に、完全な胚へと発生する能力を有する。
幹細胞の存在を示す最初の証拠は、生殖細胞由来の腫瘍である奇形腫の未分化幹細胞、胚性癌腫（ＥＣ）細胞の研究によってもたらされた。これらの細胞は多能性であって不死化しているが、限定的な発生能しか有しておらず、異常な核型を示していることが明らかになった（Ｒｏｓｓａｎｔ ａｎｄ Ｐａｐａｉｏａｎｎｏｕ，Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ １５，１５５−１６１，１９８４）。一方、ＥＳ細胞は奇形腫環境による選択圧を受けずに正常な胚細胞に由来したものであるため、より高い発生能を保持していると考えられる。
多能性胚幹細胞は従来、主に２種類の供給源より得られてきた。１つは着床前胚の内部細胞塊の細胞の培養で単離することができ、胚性幹（ＥＳ）細胞と呼ばれる（Ｅｖａｎｓ ａｎｄ Ｋａｕｆｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２９２，１５４−１５６，１９８１；米国特許第６，２００，８０６号）。多能性幹細胞の第２の種類は、胚の腸間膜または生殖隆起中の始原生殖細胞（ＰＧＣＳ）から単離することができ、胚性生殖細胞（ＥＧ）と名付けられた（米国特許第５，４５３，３５７号、米国特許第６，２４５，５６６号）。ヒトＥＳおよびＥＧ細胞は多能性である。これはｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を分化させることにより、また免疫不全（ＳＣＵＭ）マウスにヒト細胞を注射し、それによって生じた奇形腫を分析することにより（米国特許第６，２００，８０６号）、示された。本明細書で用いられる「幹細胞」という語は、胚幹細胞または胚性幹細胞、およびより組織特異的な幹細胞に分化したその幹細胞；間葉系幹細胞等の成体幹細胞；ならびに骨髄または臍帯血より得られる幹細胞等の血液幹細胞；等を含む幹細胞を意味する。
本発明は特に、胚性および成体幹細胞であってこれらの細胞が造血幹細胞ではない場合の細胞のための、新規マーカーおよび標的構造、ならびにこれらに対する結合剤を提供する。造血ＣＤ３４＋細胞からは、ＮｅｕＮＡｃα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ（Ｍａｇｎａｎｉ Ｊ．ＵＳ６３６２０１０）等の末端シアル化２型Ｎ−アセチルラクトサミンなどの特定の末端構造が示唆されており、Ｓｌｅｘ型構造ＮｅｕＮＡｃα３Ｇａｌβ４（Ｆｕｃα３）ＧｌｃＮＡｃ （Ｘｉａ Ｌ ｅｔ ａｌ Ｂｌｏｏｄ（２００４）１０４（１０）３０９１−６）の低発現の徴候が存在する。本発明は、特定の特徴的Ｏ−グリカンおよびＮ−グリカンとは別にＮｅｕＮＡｃα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ非ポリラクトサミンバリアントにも関する。本発明はさらに、本発明によるＣＤ１３３＋細胞のための新規マーカーおよび新規造血幹細胞マーカーを提供し、特に該構造はＮｅｕＮＡｃα３Ｇａｌβ４（Ｆｕｃα３）０−１ＧｌｃＮＡｃを含まない。好ましくは、前記造血幹細胞構造は本発明による非シアル化、フコシル化構造Ｇａｌβ１−３−構造、より好ましくは１型Ｎ−アセチルラクトサミン構造Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃまたは別に好ましいＧａｌβ３ＧａｌＮＡｃ基盤の構造である。
ヒトＥＳ、ＥＧおよびＥＣ細胞、ならびに霊長類ＥＳ細胞は、アルカリホスファターゼ、時期特異的胚抗原ＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４、ならびにＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１抗体により認識される表面プロテオグリカンを発現する。典型的にはこれらのマーカーは全てこれらの細胞を染色するが、幹細胞に完全に特異的ではなく、そのため器官または末梢血から幹細胞を単離するのに用いることはできない。
ＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４構造はガラクトシルグロボシドおよびシアリルガラクトシルグロボシドとして知られており、胚幹細胞の数少ない示唆されている構造のうちの一部であるが、これらの構造の性質は不明確ではない。Ｋ２１と呼ばれる抗体が胚性癌腫細胞上の硫酸化多糖を結合することが示唆された（Ｂａｄｃｏｃｋ Ｇ ｅｔ ａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（１９９９）４７１５−１９）。グリコシル化の細胞型、種、組織および他の特異性の様相によると（Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｋ．，ａｎｄ Ｋｏｂａｔａ，Ａ．（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３，５５４−５５９，Ｇａｇｎｅｕｘ，ａｎｄ Ｖａｒｋｉ，Ａ．（１９９９）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ９，７４７−７５５；Ｇａｗｌｉｔｚｅｋ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９５），Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４２，１１７−１３１；Ｇｏｅｌｚ，Ｓ．，Ｋｕｍａｒ，Ｒ．，Ｐｏｔｖｉｎ，Ｂ．，Ｓｕｎｄａｒａｍ，Ｓ．，Ｂｒｉｃｋｅｌｍａｉｅｒ，Ｍ．，ａｎｄ Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｐ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１０３３−１０４０；Ｋｏｂａｔａ，Ａ（１９９２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０９（２）４８３−５０１）。この結果は天然の胚幹細胞上の構造の存在を示すものではない。本発明はヒト幹細胞を対象とする。
一部の低特異性植物レクチン試薬が、胚幹細胞様材料の結合において報告されている。Ｖｅｎａｂｌｅ ｅｔ ａｌ ２００５，（Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．５：１５）は、胚幹細胞のＳＳＥＡ−４抗体陽性亜集団のレクチン結合を測定した。このアプローチには明白な問題がある。抗体非選択胚幹細胞における構造の発現が示されないのである。ＳＳＥＡ−４は特に多能性幹細胞を選択するために選ばれた。同じＢｒｅｓａｇｅｎ社の科学者はさらに、特定の幹細胞株のＳＳＥＡ−４の実際の役割は多能性と関連しないことを明らかにした。
この研究は：１）レクチンに結合する分子の実際の量または２）細胞選別または実験上の問題、例えば細胞のトリプシン処理、により引き起こされた欠陥による任意の分子の存在。細胞がトリプシン処理され、これがタンパク質を除去し、次いで有り得る糖脂質結合ＳＳＥＡ４抗体および二次抗マウス抗体により濃縮され、パラホルムアルデヒドにより抗体が除去されることなく固定され、レクチンおよび同一の抗体によって同時に標識され、そして観察されるグリカンプロファイルが同一の科学者による抗体グリコシル化に対するレクチン分析で明らかになるものと同様である（Ｍ．Ｐｉｅｒｃｅ ＵＳ２００５）ことは極めて注意が必要である；または３）レクチンにより結合される実際の構造；を明らかにしていない。細胞への有り得る残留する結合を明らかにするためには用いられた抗体のグリコシル化の分析が必要である（供給源およびロットが示されていない）。ＳＳＥＡ−４陽性細胞の純度は９８〜９９％と報告されており、これは異常に高い。結合の定量は明らかでなく、図３は、ｈＥＳＣ−細胞に結合しないレクチンＬＴＬおよびＤＢＡによる約１０％の結合を示している ３頁目、２列目、第２段落および免疫細胞化学４頁最終行による。
当業者はＶｅｎａｂｌｅ ｅｔ ａｌの結果を、レクチンの抗ＳＳＥＡ−４抗体への結合によるＳＳＥＡ−４およびレクチン結合のこのような好都合な共存と考えるであろう。より希な結合は、抗体分子あたりの末端エピトープの低い割合によって生じた、標識可能な抗体の低い密度を反映すると思われる。また、動物由来材料を用いた管理されない細胞培養過程は、精製および純度の分析に用いられる、二次抗体として用いられる抗マウス抗体（どの種類の抗マウスかは明示されていない）により認識され得るＮ−グリコリル−ノイラミン酸による細胞の混入をもたらすことがあり、これは好都合に高い細胞純度をもたらし得ると考えられる。この研究はＳＳＥＡ−４標識と関連する「多能性」胚幹細胞のみに関するものであり、本発明のようにその分化したバリアントに関するものではない。結果は、特定の潜在的な単糖エピトープ（６頁目、表１、、および列２）、例えばＲＣＡ（リシン、Ｇａｌまたはラクトースにより阻害され得る）に関してはＧａｌおよびガラクトサミン、ＴＬ（トマトレクチン）に関してはＧｌｃＮＡｃ、ＣｏｎＡに関してはＭａｎまたはＧｌｃ、ＳＮＡに関してはシアル酸／シアル酸α６ＧａｌＮＡｃ、ＨＨＬに関してはＭａｎα；ＳＳＥＡ−４と関連しない部分的結合を有するレクチン：ＧａｌＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃβ４Ｇａｌ（本文中）ＷＦＡ、ＰＮＡに関してはＧａｌ、ＳＮＡに関してはシアル酸／シアル酸α６ＧａｌＮＡｃ、への有り得る（恐らく抗体上の）結合を示唆し；および、ＳＳＥＡ−４細胞に部分的に関連するレクチンはＰＨＡ−ＬおよびＰＨＡ−ＥによりＧａｌを、ＶＶＡによりＧａｌＮＡｃを、およびＵＥＡによりＦｕｃを、およびＭＡＡ（ラクトースにより阻害される）によりＧａｌを結合することが示された。ＵＥＡ結合は内皮マーカーおよびタンパク質上のＳｅｒ（Ｔｈｒ）に直接結合するＯ−結合フコースと関連して議論された。背景は、内皮ＵＥＡ受容体に対するＨ２型特異性を示唆した。レクチンの特異性はやや異常であるが、レクチンの製品コードまたはイソレクチン番号／名は示されず（ＰＨＡ−ＥおよびＰＨＡ−Ｌ以外）、および、植物は各種特異性を有する多数のイソレクチンを有していることが知られる。
Ｗｅａｒｎｅ ＫＡ ｅｔ ａｌ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００６）１６（１０）９８１−９９０は植物レクチンによる胚幹細胞の染色も研究した。低特異性試薬を用いたデータは正確なグリカン構造、および特に本発明によりヒト胚幹細胞に対して記載される特異的グリカンコア構造上の伸長構造も末端エピトープの特異的認識のための有用な抗体試薬特異性も示さない。その著者らは、本発明により明らかになったものとは少なくとも部分的に異なるように思われる、レクチン結合に基づくいくつかの結合／非結合構造を推定しており、有り得る技術的問題が示唆される。この研究は他の細胞／細胞材料を対象とした方法におけるレクチンの他の形式の有用性は何も意味してはおらず、本発明の間葉系または他の細胞型に関して何も示唆していない。
本発明は、質量分析プロファイリング、ＮＭＲ分光法、およびグリカン修飾酵素等の結合試薬により特異的構造を明らかにした。レクチンは一般に低特異性の分子である。本発明は、これまでに記載された単糖エピトープよりも大きな結合エピトープを明らかにした。このより大きなエピトープにより、少なくとも二糖類に対して典型的な結合特異性を有するより特異的な結合物質を設計することができた。本発明は、天然胚幹細胞の分析のための有用な特異性により特定されたレクチン試薬も、管理されないマーカーに対する選択および／または異なる種からの１または２種類の抗体を用いたコーティングを用いることなく明らかにした。ＭＭＡによる結合は細胞のほとんどに明らかであったことから、明らかに天然胚幹細胞に対する結合は異なっており、細胞株間の相違が存在し、ＲＣＡ、ＬＴＡおよびＵＥＡは明らかにＨＥＳＣ細胞株を結合していたが他は結合しなかった。
幹細胞の分離および使用のための方法は当該分野において公知である。
造血幹細胞の分析および単離は米国特許第５，０６１，６２０号に報告されている。造血ＣＤ３４マーカーは、血液幹細胞を特異的に同定することが知られる最も一般的なマーカーであり、ＣＤ３４抗体は幹細胞を血液から移植目的で単離するために用いられる。しかし、ＣＤ３４＋細胞は血液細胞だけに、または主に血液細胞に、分化することができ、各種体細胞へと発生する能力を有する胚幹細胞とは異なる。さらに、ＣＤ３４＋細胞の増殖は不死である胚幹細胞と比べ限定的である。米国特許第５，６７７，１３６号はヒト造血幹細胞を、ＣＤ５９幹細胞マーカーに特異的な抗体を用いて幹細胞から濃縮することによって得るための方法を開示している。ＣＤ５９エピトープは幹細胞上で高度に利用しやすく、成熟した細胞上ではより利用しにくいか、または存在しない。米国特許第６，１２７，１３５号は幹細胞上に発現する固有の細胞マーカー（ＥＭ１０）に対する特異的な抗体、および造血細胞の試料内の造血幹細胞含有量を測定する方法を提供している。これらの開示は造血細胞に特異的であり、選択に用いられるマーカーはより成熟した細胞上に絶対的に存在しない訳ではない。
造血幹細胞よりも初期の分化段階の多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）または多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞を実質的に純粋なまたは純粋な形で診断、置換療法、および遺伝子治療の目的において単離するため、多くの試みが為されてきた。幹細胞は遺伝子治療の重要な標的であり、挿入遺伝子は幹細胞が移植された個体の健康を促進するように意図されている。さらに、幹細胞を単離できればそれがリンパ腫および白血病、ならびに他の癌疾患の治療に役立つ場合があり、この際、幹細胞は骨髄または末梢血中の腫瘍細胞から精製され、骨髄抑制化学療法または骨髄破壊的化学療法後の患者に再注入される。
様々な成体幹細胞集団が各種の成体組織から発見されている。造血幹細胞に加え、神経幹細胞が成体の哺乳類の中枢神経系において同定された（Ｏｕｒｅｄｎｉｋ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．５６，２６７，１９９９）。成体幹細胞は上皮組織および脂肪組織からも同定されている（Ｚｕｋ ｅｔ ａｌ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７，２１１，２００１）。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は肝臓や膵臓等の多くの供給源から培養されている（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｌａｂ Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ．１４１，３４２−３４９，２００３）。近年の研究では、一部の体性幹細胞が完全に異なる系統の細胞へと分化する能力を有するようであることが示された（Ｐｆｅｎｄｌｅｒ ＫＣ ａｎｄ Ｋａｗａｓｅ Ｅ，Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｓｕｒｖ ５８，１９７−２０８，２００３）。ある程度の多分化能を有する単球由来（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１００，２４２６−２４３１，２００３）および中胚葉由来（Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ１０９，１２９１−１３０１，２００２）細胞が同定された。血液中の多分化能「胚様」前駆細胞（“ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ−ｌｉｋｅ”ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）の存在も骨髄移植後のｉｎ ｖｉｖｏ実験によって示唆された（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｐｒｏｔｏｃ １１，３８−４５，２００３）。しかし、このような多分化能「胚様」幹細胞は公知のマーカーを用いて同定および単離することができない。
胎児細胞を母体循環系から回収できる可能性は、胎児異常の診断における、胎児に対し非侵襲的なあり得る手段としての興味をもたらした（Ｓｉｍｐｓｏｎ ａｎｄ Ｅｌｉａｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．２７０，２３５７−２３６１，１９９３）。出生前診断は世界中の病院において広く行われている。ダウン症等の染色体異常、および嚢胞性線維症等の単一遺伝子欠陥の診断のための、胎児、肝臓または絨毛生検といった従来の方法は非常に侵襲的であり、胎児に対してかなりのリスクがある。例えば羊水穿刺は、子宮に針を挿入して胎児組織または羊水から細胞を回収することを伴う。ダウン症および他の染色体異常を検出し得るこの検査には、１％と見積もられる流産のリスクがある。胎児治療は極めて初期段階であり、広範な障害のための早期検査の可能性は、この領域における研究のペースを間違いなく大幅に速めることになるであろう。そのため、出生前診断の比較的非侵襲的な方法は、非常に侵襲的な従来の方法に対する魅力的な代替手段である。母体血液を基盤とした方法は、より早期かつより容易な診断を妊娠第１期（ｆｉｒｓｔ ｔｒｉｍｅｓｔｅｒ）においてより広く利用可能にし、親および産科医の選択肢を増やし、結果として特定の胎児治療の進歩を可能にするであろう。
本発明は、診断、治療および組織工学のための、胚性幹（ＥＳ）細胞の特徴を有する幹細胞を、同定、分析および分離する方法を提供する。特に、本発明は、胚幹細胞または胎児細胞を母体血液から同定、選択および分離する方法、ならびに出生前診断および組織工学に用いるための試薬を提供する。本発明は組織および器官からの貴重な幹細胞の同定、分離および分析のために用いられ得る特異的マーカー／結合剤（ｂｉｎｄｅｒ）／結合物質（ｂｉｎｄｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を初めて提供し、胚幹細胞を得るための現在利用可能な方法における倫理上およびロジスティック（ｌｏｇｉｓｔｉｃａｌ）な困難を克服する。
本発明は、分化した体性母親細胞型と反応しない、非常に特異的な種類のマーカー／結合剤構造を開示することにより、胚性または胎児幹細胞の同定および分離のための公知の結合剤／マーカーの限界を克服する。本発明の他の局面においては、フィーダー細胞上では反応しない（すなわち発現しない）、特異的な結合剤／マーカー／結合物質が提供され、それによりフィーダー細胞のポジティブセレクションおよび幹細胞のネガティブセレクションが可能となる。
以下、例示により、式（Ｉ）に対する結合剤が、各種細胞系統へと分化する能力を有する胚幹細胞等の多能性または多分化能幹細胞の同定、選択および単離に対して有用なものとして開示される。
本発明の一局面により、末梢血および他の器官における多能性または多分化能幹細胞を同定するための新規方法が開示される。この局面により、胚幹細胞結合剤／マーカーが、幹細胞および／または生殖幹細胞におけるその選択的発現、ならびに分化した体細胞および／またはフィーダー細胞におけるその非存在に基づいて選択される。従って、幹細胞に発現するグリカン構造は、本発明により、血液、組織および器官からの多能性または多分化能幹細胞の単離のための選択的結合剤／マーカーとして用いられる。好ましくは、前記血液細胞および組織試料は哺乳類起源、より好ましくはヒト起源のものである。
特定の一態様によると、本発明は：
ｉ．幹細胞内／上で特異的発現を示し、フィーダー細胞および／または分化した体細胞内／上に発現が存在しないグリカン構造を選択すること；
ｉｉ．ならびに、幹細胞内／上の該グリカン構造に対する結合剤の結合を確認すること；
を含む、式（Ｉ）のグリカン構造に対する選択的幹細胞結合剤を同定するための方法：
の工程を含む、選択的胚幹細胞結合剤／マーカーを同定するための方法を提供する。
限定されない実施例により、前記結合剤を用いて選択された成体、間葉系、胚性、または造血幹細胞は、任意の種類の幹細胞が欠損した宿主の造血または他の組織系を再生するのに用いることができる。疾患を有する宿主は、幹細胞の再移植を行う前に、骨髄の除去、幹細胞の単離、および薬剤または放射線照射を用いた治療を行うことにより治療され得る。本発明の新規マーカーは各種幹細胞の同定および単離；幹細胞自己再生に関わる増殖因子の検出および評価；幹細胞系統の発生；および幹細胞の発生と関連した因子のアッセイ；に用いることができる。
ＵＥＡは赤芽球前駆細胞と関連する内容のＷＯ９４２５５７１との関連で示されており、本発明は非赤血球細胞および幹細胞ならびに新規の有効な試薬および複合体の産生にも関する。特定のレクチン（ＰＳＡ、ＰＮＡ）が神経幹細胞調製物に対するネガティブ細胞選択に対して示唆されておりＪＰ２００３１８９８４７（Ｋａｉｎｏｓｕ Ｍｕｒａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．）：ならびに、（ＰＨＡ−Ｅ、ＷＧＡ、ＬＡＣＡおよびＡＡｌが肝臓幹細胞調製物に対して示唆されている ＪＰ２００４３４４０３１（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ，Ｈｉｄｅｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ）。グリコシル化の細胞型および種特異性のため、これらは本発明とは関連しない。
Ｃｏｎ Ａ／Ｐｈａ Ｅが動物間葉系幹細胞培養物に対して、特に骨化または軟骨化に対して、関連があるとされており、グリコシル化の種特異性および細胞型特異性のため、データは本発明とは関連しない。さらに、前記レクチンは本発明の最も好ましい末端構造と異なる構造を認識し、本複合体は開示されなかった。ＪＰ２００４０３７７９５３；ＪＰ２００６２０４２００；Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ（２００４）２９５（１）１１９−２７。レクチンＣｏｎ ＡおよびＰｈａ−Ｅの使用を含む前記方法がウサギおよびマウスの間葉系細胞を含む特定の動物細胞に対して報告されている。グリコシル化は種特異的であり、そのためそのデータはヒトとは関連しないと考えられる。これは、ヒト細胞株のみが前記動物細胞よりもずっと弱く活性化された、同じ発明の図によっても示されている。
発明はさらに、２つの他のレクチンＷＧＡおよび が活性を有しなかったことを示した。従って、
ａ．ヒト幹細胞との関連においていずれかが用いられるべきである場合、どのレクチンであるかに関する教示が無い
ｂ．示されない場合、本発明の好ましい末端グリカンエピトープ、しかし、活性レクチンＣｏｎＡは極めて非特異的にＮ−グリカンコア構造、特に複合型および他の型の構造を含むマンノース含有Ｎ−グリカンを認識し、Ｐｈａ−ＥはＮ−グリカンコア構造の中央における二つに分かれるＧｌｃＮＡｃ分岐を特異的に認識した。不活性レクチンＷＧＡの特異性は、各種グリカンの中央におけるＧｌｃＮＡｃ含有構造、およびシアル酸の非特異的認識を含む
ｃ．レクチンの効果は細胞の増殖の減少であった。
ｄ．レクチンの固定化、および特異的な、好ましくは共有結合性の固定化は示されなかった。
グリコシル化およびグリカン認識の種および細胞／組織型特異性を考慮すると、動物間葉系幹細胞からの推測は任意のヒト細胞に対しては、ましてや血液由来幹細胞等の異なる細胞型に対しては、一般化することができない。
本発明は、細胞の末端エピトープグリカンを認識する結合剤の存在下で造血幹細胞を培養することが有用であろうことを明らかにした。好ましい末端エピトープとしては、グリカンの末端還元末端エピトープおよび非還元末端エピトープ等が挙げられる。末端エピトープは、認識のための構造の入手の容易さの点で特に好ましい。
特定のガラクトース結合レクチンが、骨髄移植片からのリンパ球の除去と関連づけられており、ＷＯ８００００５８，ＥＰ００１５’６７９０（Ｓｈａｒｏｎ Ｎ Ｒｅｉｓｎｅｒ Ｙ）、これはネガティブセレクションであり、使用は特に骨髄細胞に対してであり、発明の好ましい臍帯血細胞とは異なる。
ＦＲＩＬと名付けられたレクチンおよび関連する材料が、ある種のマンノース結合活性および幹細胞の維持と関連した活性または他の関連性を有すると報告されている：ＷＯ２００７０６６３５２（Ｄｏｌｉｃｈｏｓ ｌａｂ ｌａｂ；ニンニクレクチン（ＧＬ）、Ｍｕｓａ ｐａｒａｄｉｓｅ（ＢＬ）、Ａｒｔｈｒｏｃａｒｐｕｓ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ（ＡＬ）；Ｗｏ９８２５４５７、ＵＳ２００３０４９３３９、ＷＯ０１４９８５１：Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｐｈａ−Ｅ、Ｄ．ｌａｂ ｌａｂ、Ｓｐｈｅｌｌｏｓｔｙｌｉｓ ｓｔｅｎｏｃａｒｐａ。本発明は、多くのレクチンがスクリーニングされたと思われる場合の新規レクチン、およびマンノース結合レクチンのための新規の好ましい最適な特異性を明らかにし、本発明はさらに新規材料が結合し得ることに関する。
７つの臍帯血単核球試料（並行する列）の、ＦＩＴＣ標識レクチンによるＦＡＣＳ分析。百分率はレクチンに結合する細胞の割合を表す。ＦＩＴＣ標識レクチンの略号は本文を参照のこと。 マウスフィーダー細胞層上で増殖させたｈＥＳＣコロニーのレクチン染色。（Ａ）α２，３−シアル化グリカンを認識するＭａａｃｋｉａ ａｍｕｒｉｅｎｓｉｓ凝集素（ＭＡＡ）および（Ｂ）α−マンノシル化グリカンを認識するＰｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ凝集素（ＰＳＡ）を用いた。ｈＥＳＣへのレクチン結合はＭＡＡおよびＰＳＡに対するそれぞれα３’−シアリルラクトースおよびＤ−マンノースにより阻害され、ＰＳＡはｈＥＳＣのみを細胞透過化処理後に認識した（データ不掲載）。マウス線維芽細胞は両レクチンに対して補完的な染色パターンを有しており、その表面グリカンがｈＥＳＣとは異なっていたことが示唆された。Ｃ．結果は、マンノシル化Ｎ−グリカンはｈＥＳＣの細胞内区画に局在し、一方、α２，３−シアル化グリカンは細胞表面に生ずることを示す。 ｈＥＳＣフコース転移酵素遺伝子発現プロファイルの意味。Ａ．ｈＥＳＣは３つのフコース転移酵素遺伝子：ＦＵＴ１、ＦＵＴ４、およびＦＵＴ８を発現する。Ｂ．ＦＵＴ１およびＦＵＴ４の発現量はｈＥＳＣにおいてＥＢに比べ増加し、これは潜在的により複雑なフコシル化をｈＥＳＣにもたらす。公知のフコース転移酵素グリカン産物を示す。矢印はグリカン鎖の伸長の位置を表す。Ａｓｎは糖タンパク質への結合を表す。 ｈＥＳＣ Ｎ−グライコームのポートレート。４つのｈＥＳＣ株ＦＥＳ２１、２２、２９、および３０（黒いカラム）、４つのＥＢ試料（灰色のカラム）、および、前記４つのｈＥＳＣ株から得られた４つのｓｔ．３分化細胞試料（白いカラム）それぞれの、最も豊富な５０種の中性Ｎ−グリカン（Ａ．）および５０種のシアル化Ｎ−グリカン（Ｂ．）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析プロファイリング。カラムは各グリカンシグナルの平均存在量を表す（全グリカンシグナルの％）。中性およびシアル化Ｎ−グリカン画分に対する［Ｍ＋Ｎａ］＋または［Ｍ−Ｈ］−イオンに対して観察されたｍ／ｚ値を、それぞれ、ｘ軸上に示す。 構造特異的試薬によるｈＥＳＣグリカンの検出。検出されたグリカン成分のｈＥＳＣにおける局在を分析するため、マウスフィーダー細胞層上で増殖させた幹細胞コロニーを、分析結果に基づいて選択された蛍光化グリカン特異的試薬により標識した。Ａ．ｈＥＳＣ表面がＭａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ凝集素（ＭＡＡ）により染色され、α２，３−シアル化グリカンがｈＥＳＣ上で豊富であるがフィーダー細胞（ＭＥＦ、マウスフィーダー細胞）上では豊富でないことが示唆された。Ｂ．一方、ｈＥＳＣ細胞表面は、マウスフィーダー細胞を認識したＰｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ凝集素（ＰＳＡ）によっては染色されず、α−マンノシル化グリカンがｈＥＳＣ表面上に豊富ではないがマウスフィーダー細胞上には存在することが示唆された。Ｃ．３’−シアリルラクトースの添加はＭＡＡ結合をブロックし、Ｄ．Ｄ−マンノースの添加はＰＳＡ結合をブロックする。 分析されたｈＥＳＣ、ＥＢ、およびｓｔ．３試料の５０個の最も豊富なシアル化Ｎ−グリカンシグナルから選択されたｈＥＳＣ−関連グリカンシグナル（図４．Ｂから選ばれたデータ）。 分析されたｈＥＳＣ、ＥＢ、およびｓｔ．３試料の５０個の最も豊富なシアル化Ｎ−グリカンシグナルから選択された、分化した細胞と関連するグリカンシグナル（図４．Ｂから選ばれたデータ）。 分化中のＮ−グリカンの変化の模式図（詳細は必ずしも実際の構造を表さない）。フィンランド人ｈＥＳＣ株ＦＥＳ２１、２２、２９、および３０の分析によると、ｈＥＳＣの分化はｈＥＳＣ表面分子の大きな変化をもたらす。Ｓｔ．３はＥＢステージの後の分化ステージを意味する。 本発明を記載するのに用いられる幹細胞の名称。 単離されたヒト幹細胞中性スフィンゴ糖脂質グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析プロファイル。ｘ軸：表中に記載された［Ｍ＋Ｎａ］＋イオンのｍ／ｚ概算値。ｙ軸：プロファイル中の各グリカン成分の相対モル存在量。ｈＥＳＣ、ＢＭ ＭＳＣ、ＣＢ ＭＳＣ、ＣＢ ＭＮＣ：本文中に記載された幹細胞試料。 単離されたヒト幹細胞酸性スフィンゴ糖脂質グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析プロファイル。ｘ軸：表中に記載された［Ｍ−Ｈ］−イオンのｍ／ｚ概算値。ｙ軸：プロファイル中の各グリカン成分の相対モル存在量。ｈＥＳＣ、ＢＭ ＭＳＣ、ＣＢ ＭＳＣ、ＣＢ ＭＮＣ：本文中に記載された幹細胞試料。 ヒト胚幹細胞および分化した細胞のＮ−グリカンの質量分析プロファイリング。前記４つのｈＥＳＣ株（白いカラム）、ＦＥＳ２９およびＦＥＳ３０ ｈＥＳＣ株由来の胚様体（ＥＢ、淡色のカラム）、ならびにＦＥＳ２９由来のステージ３分化細胞（ｓｔ．３、黒いカラム）の、ａ 中性Ｎ−グリカン、およびｂ ５０種の最も豊富な酸性Ｎ−グリカン。カラムは各グリカンシグナルの平均存在量を表す（検出された全グリカンシグナルの％）。エラーバーは検出されたシグナル強度の範囲を表す。提案された単糖組成をｘ軸上に示す。Ｈ：ヘキソース、Ｎ：アセチルヘキソサミン、Ｆ：デオキシヘキソース、Ｓ：Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｇ：Ｎ−グリコリルノイラミン酸、Ｐ：硫酸／リン酸エステル。 Ａ）マウス線維芽細胞フィーダー細胞のヒヒポリクローナル抗Ｇａｌα３Ｇａｌ抗体染色（左）。ｈＥＳＣコロニーにおける染色の非存在（右）を示す。Ｂ）ステージ３ヒト胚幹細胞のＵＥＡ（Ｕｌｅｘ Ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）レクチン染色。ＦＥＳ ３０株。 Ａ）ＦＥＳ２２ヒト胚幹細胞（多能性、未分化）のＵＥＡレクチン染色。Ｂ）ＦＥＳ３０ヒト胚幹細胞（多能性、未分化）のＵＥＡ染色。 Ａ）ＦＥＳ２２ヒト胚幹細胞（多能性、未分化）のＲＣＡレクチン染色。Ｂ）ＦＥＳ３０ヒト胚幹細胞（多能性、未分化）のＷＦＡレクチン染色。 Ａ）ＦＥＳ３０ヒト胚幹細胞（多能性、未分化）のＰＷＡレクチン染色。Ｂ）ＦＥＳ３０ヒト胚幹細胞（多能性、未分化）のＰＮＡレクチン染色。 Ａ）ＦＥＳ３０ヒト胚幹細胞株のＧＦ２８４免疫染色。免疫染色が初期分化の細胞においてコロニーの端部に認められる（１０ｘ倍率）。マウスフィーダー細胞は染色されない。Ｂ）ＧＦ２８４の細部を４０ｘ倍率で見たもの。この抗体はｈＥＳＣ系統の一部を検出するのに適している。 Ａ）ＦＥＳ３０ヒト胚幹細胞株のＧＦ２８７免疫染色。免疫染色がコロニー全体に認められる（１０ｘ倍率）。マウスフィーダー細胞は染色されない。Ｂ）ＧＦ２８７の細部を４０ｘ倍率で見たもの。この抗体は未分化の多能性幹細胞を検出するのに適している。 Ａ）ＦＥＳ３０ヒト胚幹細胞のＧＦ２８８免疫染色。免疫染色の大部分が初期分化の細胞においてコロニーの端部に認められる（１０ｘ倍率）。マウスフィーダー細胞は染色されない。Ｂ）ＧＦ２８８の細部を４０ｘ倍率で見たもの。この抗体はｈＥＳＣ系統の一部を検出するのに適している。 ＭＳＣおよび骨原性に分化した（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃａｌｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ）細胞におけるＣＡ１５−３の免疫染色（ＭＵＣ−１におけるシアル化炭水化物エピトープ、＝ＧＦ２７５）。ＭＳＣにおいては点状染色が認められ、骨原性に分化した細胞（分化６週目、集密（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）培養）においてはより細胞膜に局在化した染色パターンが認められる。ＦＡＣＳ分析においてはＧＦ２７５免疫染色されるＭＳＣの割合を示す。骨原性に分化した細胞の大部分（８０−９０％超）がＧＦ２７５を発現している。 ＭＳＣおよび骨原性に分化した細胞の免疫染色。血液型Ｈ１（０）抗原、Ｌｅｗｉｓ ｄ（ＢＧ４＝ＧＦ３０３）。ＭＳＣにおいては明瞭な染色は認められないが、骨原性に分化した細胞においては明瞭な免疫染色が７０−９０％超の細胞において認められる。 ＭＳＣおよび骨原性に分化したＭＳＣのＨタイプ２血液型抗原（＝ ＧＦ３０２）免疫染色。ＭＳＣの免疫染色が両細胞型の約２０〜７５％に認められる。 ＭＳＣおよび骨原性に分化したＭＳＣのＬｅｗｉｓ ｘ（ＳＳＥＡ−１ ＝ ＧＦ３０５）免疫染色。ＭＳＣにおいては１０％未満という極めて少数の細胞しかＧＦ３０５で染色されない。骨原性に分化したＭＳＣは免疫染色を示さないか、または極めてわずかの免疫染色しか示さない。ＭＳＣおよび骨原性に分化したＭＳＣのシアリルＬｅｗｉｓ ｘ（＝ ＧＦ３０７）免疫染色。シアリルＬｅｗｉｓ ｘ免疫染色は、ＭＳＣが骨原性方向に分化すると減少する。 ＭＳＣおよび骨原性に分化したＭＳＣのＣＤ７７（グロボトリオース（ＧＢ３）、ｐｋ−血液型 ＝ ＧＦ２９８）免疫染色。ＭＳＣおよび骨原性方向に分化したＭＳＣ（のサブポピュレーション）はＣＤ７７を発現している。ＭＳＣおよび骨原性に分化したＭＳＣのグロボシドＧＢ４（＝ＧＦ２９７）免疫染色。骨原性に分化した細胞と比べ、より断続的なＧＢ４の染色がＭＳＣにおいて認められる。 ＭＳＣおよび骨原性に分化したＭＳＣのＳＳＥＡ−３（＝ ＧＦ３５３）およびＳＳＥＡ−４（＝ ＧＦ３５４）免疫染色。ＳＳＥＡ−３免疫染色はＭＳＣが骨原性方向に分化すると減少する。ＳＳＥＡ−４（＝ ＧＦ３５４）免疫染色はＭＳＣが骨原性方向に分化すると減少する。 ＭＳＣおよび骨原性に分化したＭＳＣのＴｎ（ＣＤ１７５ ＝ ＧＦ２７８）免疫染色。骨原性方向に分化した細胞と比べて少数（５−４５％）のＭＳＣがＣＤ１７５を発現している。 ＭＳＣおよび骨原性に分化したＭＳＣのシアリルＴｎ（ｓＣＤ１７５ ＝ ＧＦ２７７）免疫染色。５−４５％という少数のＭＳＣがシアリルＴｎを発現している。骨原性に分化した細胞はより多くの、または主にこのエピトープを発現している。 ＭＳＣおよび骨原性に分化したＭＳＣの腫瘍胎児抗原（ＴＡＧ−７２ ＝ ＧＦ２７６）免疫染色。ＴＡＧ７２免疫染色はＭＳＣが骨原性方向に分化すると増加するか、またはアップレギュレートされる。 ＰＳＡコーティング上で増殖する細胞は、それが網状単層を形成する様式において形態学的に他と異なる。ＭＡＡおよびＰＳＡ上の細胞はまた、より強固に表面に接着しており、トリプシンによるそれらの剥離は不可能であり、それらの細胞は機械的に掻き取る必要があった。 ＥＣＡおよびマトリゲルコーティングにおいて増殖させたｈＥＳＣ。胚幹細胞はＥＣＡ被覆上において、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）被覆プレート上におけるよりも均一に増殖し、増殖密度の明瞭なバッチ間変異を示さなかった。それらは小さなコロニーを形成し、これはＭａｔｒｉｇｅｌとは異なっていた。コロニーはフィーダー細胞上で増殖させたｈＥＳＣにより形成されるものよりも小さかった。 ＥＣＡおよびＭａｔｒｉｇｅｌ上で増殖させたｈＥＳＣに対する幹細胞および分化マーカー。図は、幹細胞マーカーＯｃｔ−４が、２および４回の継代後に、マウスフィーダー細胞上ではアップレギュレートされているがＥＣＡ被覆プレート上ではアップレギュレートされていないことを示す。分化マーカーの中でもグースコイドは継代２の後に短いアップレギュレーションを示すが、継代４までに、ｍａｔｒｉｇｅｌで増殖させたｈＥＳＣと同じまたはそれよりも低い水準に減少する。他の分化マーカーＳｏｘ７は、ｈＥＳＣをＥＣＡ被覆プレート上で増殖させた際には変化しない。 Ａ．継代Ｐ４およびＰ６。Ｂ、４回の継代後のＦＡＣＳ分析 Ｔｒａ−１−６０ ３２％ およびＳＳＥＡ３ ８３％。Ｍａｔｒｉｇｅｌ ４９％および７９％。Ｃ、継代ｐ５。 Ｄ、ＥＣＡ上での培養のためのマーカーおよびｈＥＳＣ（ＦＥＳ２９ ｐ３６）のＦＡＣＳ分析。Ｅ、Ｍａｔｒｉｇｅｌ ｐ４ ｖｓ．Ｍａｔｒｉｇｅｌ ｐ２＋ＥＣＡのＦＡＣＳ分析。 Ａ、ＦＥＳ２９ ｐ３８、Ｍａｔｒｉｇｅｌ ｐ３、およびレクチンｐ１。ＦＡＣＳ：Ｔｒａ−１−６０ ７０％ およびＳＳＥＡ３ ８９％。Ｂ、レクチン上で増殖させた細胞の継代４の像。ＵＥＡ、ＤＳＡおよびガレクチン。 各種レクチン上で増殖させたＭＳＣ細胞。ＰＳＡレクチン、細胞はＣＤ１０５陽性、ＣＤ７３陽性、ＣＤ４５陰性であり、ＨＬＡ−ＤＲは２１．６％である。 ＨＨＡ上のＭＳＣはＣＤ１０５陽性、ＣＤ７３陽性、ＣＤ４５陰性を示し、ＨＬＡ−ＤＲは２７．４％である。 各種レクチン上で増殖させたＭＳＣ細胞。ＬｃＨＡレクチン、細胞はＣＤ１０５陽性、ＣＤ７３陽性、ＣＤ４５陰性であり、ＨＬＡ−ＤＲは２７．３％である。 ＥＣＡレクチン、細胞はＣＤ１０５陽性、ＣＤ７３陽性、ＣＤ４５陰性であり、ＨＬＡ−ＤＲは２６％である。 各種レクチン上で増殖させたＭＳＣ細胞。ＣｏｎＡレクチン、細胞はＣＤ１０５陽性、ＣＤ７３陽性、ＣＤ４５陰性であり、ＨＬＡ−ＤＲは１９．６％である。 ＭＡＡレクチン、細胞はＣＤ１０５陽性、ＣＤ７３陽性、ＣＤ４５陰性であり、ＨＬＡ−ＤＲはＲ ２８．２％である。 各種レクチン上で増殖させたＭＳＣ細胞。ＳＮＡレクチン、細胞はＣＤ１０５陽性、ＣＤ７３陽性、ＣＤ４５陰性であり、ＨＬＡ−ＤＲは１８．３％である。 ガレクチン−１レクチン、細胞はＣＤ１０５陽性、ＣＤ７３陽性、ＣＤ４５陰性であり、ＨＬＡ−ＤＲは２３．８％である。プラスチック上ＨＬＡ−ＤＲは５６．５％である。 Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ ｃｒｉｓｔａｇａｌｌｉレクチンの部分アミノ酸配列をコードする合成遺伝子（遺伝子配列番号８９９）。実施例２４参照。 Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ ｃｒｉｓｔａｇａｌｌｉレクチンの部分アミノ酸配列をコードする合成遺伝子（遺伝子配列番号８９９）。実施例２４参照。 Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ ｃｒｉｓｔａｇａｌｌｉレクチンの非グリコシル化部分アミノ酸配列をコードする合成遺伝子（遺伝子配列番号９００）であって、配列番号８９９と比較した際にヌクレオチド部位３６８（Ａ＞Ｃ）および３７０（Ｃ＞Ａ）に点突然変異を有する。実施例２４参照。 Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ ｃｒｉｓｔａｇａｌｌｉレクチンの非グリコシル化部分アミノ酸配列をコードする合成遺伝子（遺伝子配列番号９００）であって、配列番号８９９と比較した際にヌクレオチド部位３６８（Ａ＞Ｃ）および３７０（Ｃ＞Ａ）に点突然変異を有する。実施例２４参照。 非グリコシル化ｎｇＥＣＡ精製工程のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。レーン１：Ｌａｃ−アガロース工程の未結合物質（フロースルー）。レーン２：洗浄中の溶出物質。レーン３：親和性精製され、透析されたｎｇＥＣＡ（左から１番目のレーン上の分子量標準に基づくとｃ．３０ｋＤａ）であって、有意な不純物を示さない。実施例２４参照。
本発明の一局面において、少なくとも１個の幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤と接触させることにより、幹細胞の状態の調節のための方法が提供される。
他の態様において、少なくとも１個の幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤と接触させることにより、幹細胞の未分化状態の支持のための方法が提供される。
他の態様において、少なくとも１個の幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤と接触させることにより、細胞の形態学的状態および分化と関連した状態を含むがそれらに限定されない生物学的状態の変化のための方法が提供される。
他の態様において、少なくとも１個の幹細胞または幹細胞群を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤と接触させることにより、接着状態の変化のための方法が提供される。
他の態様において、少なくとも１個の幹細胞または幹細胞群を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤と接触させることにより、幹細胞の増殖速度を変化させるための方法が提供される。
方法の一態様において、表面はそこに付着した結合剤を有し、前記結合剤分子は幹細胞の生物学的状態を調節する。関連する態様において、表面は生体適合性、天然もしくは合成であってよく、またはポリマーを含む。特定の態様において、該ポリマーはポリスチレン、ポリエステル、ポリエーテル、ポリアンヒドリド（ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅｓ）、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリオルトエステル、ポリホスファゼン、ポリ酢酸ビニル、ブロック共重合体、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、またはポリウレタンから選択される。さらに他の態様において、ポリマーは乳酸または共重合体を含んでいてよい。さらになお他の態様において、ポリマーは共重合体であってよい。このような共重合体は各種の公知の共重合体であってよく、乳酸および／またはグリコール酸（ＰＬＧＡ）を含んでいてよい。
生体適合性表面に関しては、このような表面は生分解性または非生分解性であってよい。関連する態様において、非生分解性表面はポリ（ジメチルシロキサン）および／またはポリ（エチレン−酢酸ビニル）を含んでいてよいがそれらに限定されない。さらに、生体適合性表面としてはコラーゲン、金属、ヒドロキシアパタイト、ガラス、アルミン酸塩、バイオセラミック材料、ヒアルロン酸ポリマー、アルギン酸塩、アクリル酸エステルポリマー、乳酸ポリマー、グリコール酸ポリマー、乳酸／グリコール酸ポリマー、精製タンパク質、精製ペプチド、および／または細胞外マトリクス組成物等が挙げられるが限定されない。
さらなる態様において、生体適合性表面は埋め込み型装置と関連してもよい。埋め込み型装置は使用が望まれる任意のものであってよく、ステント、カテーテル、ファイバー、中空糸、パッチ、または縫合糸等であってよい。関連する態様において、表面はガラス、シリカ、シリコン、コラーゲン、ヒドロキシアパタイト、ヒドロゲル、ＰＴＦＥ、ポリプロピレン、ポリスチレン、ナイロン、またはポリアクリルアミドであってよい。さらなる態様として、表面が脂質、プレート、バッグ、ロッド、ペレット、ファイバー、またはメッシュを含む場合等が挙げられる。他の態様としては、表面が粒子である場合、およびさらに該粒子がビーズ、ミクロスフィア、ナノ粒子、またはコロイド粒子を含む場合等が挙げられる。粒子およびビーズのサイズも選択することができ、ビーズが直径約５ナノメートル〜約５００ミクロンである場合等、各種のサイズを有していてよい。
好ましい態様において、前記結合剤はレクチンである。他の好ましい態様において、該結合剤は抗体である。他の好ましい態様において、該結合剤はグリコシダーゼであって、これは活性部位を突然変異させたものであってよい。
幹細胞は、例えば、間葉系幹細胞、または胎性幹細胞であり得る。幹細胞は臍帯、例えば、臍帯血等に由来するものであり得る。幹細胞はＣＤ３４＋細胞マーカーを発現する臍帯に由来するものであり得る。臍帯幹細胞は、例えば、ヒト等の哺乳動物に由来するものであり得る。増殖培地は所望により、増殖因子、増殖因子の組み合わせ、または幹細胞の生存能力を増加させ得る実質的な栄養分も含んでいてよい。
本発明の一部の態様において、少なくとも１個の幹細胞を結合剤と接触させることにより、幹細胞の拡張または増殖のための方法が提供される。幹細胞は、ａ）胚幹細胞、胚体外幹細胞、クローニングされた幹細胞、単為生殖由来細胞等の全能性細胞；ｂ）造血幹細胞、脂肪由来幹細胞、間葉系幹細胞、臍帯血幹細胞、胎盤由来幹細胞、脱離歯（ｅｘｆｏｌｉａｔｅｄ ｔｏｏｔｈ）由来幹細胞、毛包幹細胞もしくは神経幹細胞等の多能性細胞；またはｃ）神経、肝臓、脂質生成、骨芽、破骨、心臓、腸、または内皮系統の前駆細胞等の組織特異的前駆細胞であってよい。
本発明の他の一態様は、幹細胞を結合剤と接触させることであり、ここで前記結合剤は、ＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１、ＰＥＣＡＭ−１、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、ＣＤ４９ｂ／ＣＤ２９、ＣＤ４９ｃ／ＣＤ２９、ＣＤ４９ｄ／ＣＤ２９、ＣＤ６１、ＣＤ１８、ＣＤ２９、６−１９、トロンボモジュリン、テロメラーゼ、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＳＴＲＯ−１、ＳＴＲＯ−２、ＶＣＡＭ−１、ＣＤ１４６、ＴＨＹ−１等のマーカーで特徴付けられる間葉系幹細胞等の多能性幹細胞の増殖を刺激する。結合剤は単独で、例えば表面に固定化された増殖の刺激剤として、または前記細胞の培養に有用であることが知られる培地への添加剤として用いることができる。
本発明の一部の態様において、少なくとも１個の幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤と接触させることにより、実質的に分化を誘導しない幹細胞の拡張または増殖のための方法が提供される。前記の少なくとも１個の幹細胞は、例えば、身体の全組織型の細胞へ分化することができる、全能性であり得る。全能性幹細胞は、例えば、胚幹細胞、胚体外幹細胞、クローニングされた幹細胞、単為生殖由来細胞から選択され得る。胚幹細胞は、例えば、１または複数種の次のマーカー：ステージ特異的胚抗原（ＳＳＥＡ）３、ＳＳＥＡ ４、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１、Ｏｃｔ−３／４、Ｃｒｉｐｔｏ、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）受容体、ポドカリキシン様タンパク質（ＰＯＤＸＬ）、またはヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）を発現することができる。造血幹細胞は、例えば、１または複数種の次のマーカー：ＣＤ３４、ｃ−ｋｉｔ、および多剤耐性輸送タンパク質（ＡＢＣＧ２）を発現することができる。脂肪由来幹細胞は、例えば、１または複数種の次のマーカー：ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ６３、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１６６、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）、およびＡＢＣＧ２を発現することができる。間葉系幹細胞は、例えば、１または複数種の次のマーカー：ＳＴＲＯ−１、ＣＤ１０５、ＣＤ５４、ＣＤ１０６、ＨＬＡ−Ｉマーカー、ビメンチン、ＡＳＭＡ、コラーゲン−１、およびフィブロネクチンを発現することができるが、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１１７、および造血性細胞マーカーは発現できない。臍帯血幹細胞は、例えば、１または複数種の次のマーカー：ＣＤ３４、ｃ−ｋｉｔ、およびＣＸＣＲ−４を発現することができる。胎盤幹細胞は、例えば、１または複数種の次のマーカー：Ｏｃｔ−４、Ｒｅｘ−１、ＣＤ９、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＳＨ−３、ＳＨ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＳＳＥＡ−４およびＳｏｘ−２を発現することができる。神経幹細胞は、例えば、ＲＣ−２、３ＣＢ２、ＢＬＢ、Ｓｏｘ−２ｈｈ、ＧＬＡＳＴ、Ｐａｘ ６、ｎｅｓｔｉｎｇ、Ｍｕａｓｈｉ−１、およびプロミニンの発現により特徴付けることができる。前記の少なくとも１個の幹細胞は、身体の多数の細胞に分化し得るが全てには分化し得ない多能性であってよい。多能性幹細胞は、造血幹細胞、脂肪幹細胞、間葉系幹細胞、臍帯血幹細胞、胎盤幹細胞または神経幹細胞から選択され得る。前記の少なくとも１個の幹細胞は、限られた組織型に分化し得る前駆細胞であり得る。前駆幹細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）は、例えば、神経、肝臓、脂質生成、骨芽、破骨、肺胞、心臓、腸、内皮前駆細胞から選択され得る。
本発明の一部の態様において、少なくとも１個の幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤と接触させることにより、実質的に分化を誘導しない幹細胞の拡張または増殖のための方法が提供される。細胞培養液は、例えば、単一または複数の増殖因子を添加され得る。増殖因子は、例えば、ＷＮＴシグナル伝達アゴニスト、ＴＧＦ−ｂ、ｂＦＧＦ、ＩＬ−６、ＳＣＦ、ＢＭＰ−２、トロンボポエチン、ＥＰＯ、ＩＧＦ−１、ＩＬ−１１、ＩＬ−５、Ｆｌｔ−３／Ｆｌｋ−２リガンド、フィブロネクチン、ＬＩＦ、ＨＧＦ、ＮＦＧ、アンギオポイエチン様２および３、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｔｐｏ、Ｓｈｈ、Ｗｎｔ−３ａ、Ｋｉｒｒｅ、またはそれらの混合物から選択することができる。培地は、例えば、Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ−１６４０）、ダルベッコ修飾必須培地（ＤＭＥＭ）、イーグル修飾必須培地（ＥＭＥＭ）、Ｏｐｔｉｍｅｍ、およびＩｓｃｏｖｅ培地から選択することができる。血清のソース（ｓｏｕｒｃｅ）を培地に添加してよい。培地中の血清の濃度は約０．１〜２５％の間であってよい。培地中の血清の濃度は約１０％であってよい。血清はヒト成人血清、ヒト胎児血清、ウシ胎児血清および臍帯血血清から選択され得る。
本発明のさらなる態様において、増殖能力が維持されているが分化状態における阻害（ｂｌｏｃｋ）を有する幹細胞が提供され、これは幹細胞を結合剤と接触させて培養することにより誘導され得る。
幹細胞は、例えば、全能性幹細胞、多能性幹細胞、および前駆幹細胞から選択され得る。幹細胞は結合剤との接触の下、例えば１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００回の継代の期間維持してよい。幹細胞は最初に結合剤との接触の下である期間培養し、これに続き、異なる結合剤ならびに同一のまたは各種のサイトカインまたは増殖因子の混合物を含んだ第２の培地中で培養してよい。幹細胞は最初に結合剤および増殖因子との接触の下で例えば２０回の継代の間培養してよい。幹細胞は、ＷＮＴシグナル伝達アゴニスト、ＴＧＦ−ｂ、ｂＦＧＦ、ＩＬ−６、ＳＣＦ、ＢＭＰ−２、トロンボポエチン、ＥＰＯ、ＩＧＦ−１、ＩＬ−１１、ＩＬ−５、Ｆｌｔ−３／Ｆｌｋ−２リガンド、フィブロネクチン、ＬＩＦ、ＨＧＦ、ＮＦＧ、アンギオポイエチン様２および３、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｔｐｏ、Ｓｈｈ、Ｗｎｔ−３ａ、Ｋｉｒｒｅ、およびそれらの混合物からなる群より選択される少なくとも１種の増殖因子を添加し得る細胞培地中で維持してよい。幹細胞は、次の増殖因子を含んだ増殖培地中、ＤＭＥＭ培地中でも維持してもよい：ＩＬ−３（約２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（約２５０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（約１０ｎｇ／ｍｌ）、ＴＰＯ（約２５０ｎｇ／ｍｌ）、ｆｌｔ−３Ｌ（約１００ ｎｇ／ｍｌ）。幹細胞は次のうち１または複数より選択される薬剤の存在下で維持されてよい：ＧＳＫ−３の阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素活性の阻害剤、およびＤＮＡメチル基転移酵素活性の阻害剤。
本開示の一態様は多能性ヒトＥＳ細胞の精製された調製物に関するものであり、該細胞は：（ｉ）内胚葉、中胚葉、および外胚葉組織の派生物に分化する能力、（ｉｉ）正常な核型、（ｉｉｉ）少なくとも約１０回の継代の間、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養において増殖する能力を有し、ならびに（ｉｖ）前記細胞の本発明の結合剤との接触で得られる。
好ましい一態様において、結合剤はレクチン、抗体またはグリコシダーゼである。
本明細書において用いられる「多能性ヒトＥＳ細胞の精製された調製物」という語は、精製された調製物内の実質的に全てのヒトＥＳ細胞が記載される特徴を有することを意味する。従って、多能性ヒトＥＳ細胞の精製された調製物は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％が調製物中においてヒトＥＳ細胞の一般的な集団の特徴、例えば内胚葉、中胚葉、および外胚葉組織の派生物に分化する能力、正常な核型、ならびに少なくとも約１０回または２０回の継代の間、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養において増殖する能力、を有する細胞を含み得る。
本明細書において用いられる「薬剤」または「結合剤」または「結合物質」の語は、幹細胞上の末端グリカン構造に結合するおよび／またはそれを認識する分子のことを指す。結合剤は、任意の細胞表面部分、または、例えば受容体、抗原決定基、もしくは標的細胞集団上に存在する他の結合部位等の末端グリカン構造を有する細胞表面部分に結合し得る。結合剤はタンパク質、ペプチド、抗体およびその抗体断片、レクチン、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェリン酵素等であってよい。本明細書内において、および幹細胞調節との関連において、レクチンおよび抗体がこのような結合剤の典型例として用いられる。
本明細書において用いられる「表面」とは、そこに付着する薬剤を有し得る任意の表面のことを指し、金属、ガラス、プラスチック、共重合体、コロイド、脂質、細胞表面等が挙げられるが限定されない。本質的に、そこに結合または付着した薬剤を保持しうる任意の表面。
例えば、本開示のヒトＥＳ細胞は（１）１０、２０、４０または６０回超の継代の間、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養において増殖し得る；（２）結合剤、例えばレクチン、抗体またはグリコシダーゼの存在下で培養された際に分化が阻害される；（３）ＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４マーカーに対して陽性である；（４）ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１マーカーに対して陽性である；（５）Ｏｃｔ−４マーカーに対して陽性である；または（６）浮遊培養にかけた際、または免疫無防備状態の動物、好ましくはマウスに移植した際、胚様体を形成し得る。好ましくは、本開示の多能性ヒトＥＳ細胞の調製物は動物生成抗体および血清に対して曝露されなかった。
好ましい態様において、前記調製物は培養における約１０回の継代後、より好ましくは培養における約２０回の継代後、さらに好ましくは培養における約４０回の継代後、さらになお好ましくは培養における約６０回の継代後、最も好ましくは培養における１００回の継代後に実質的に未分化のままである。調製物中の未分化ＥＳ細胞のコロニーは周囲の分化した細胞に近接していてもよいが、該調製物はそれにもかかわらず、結合剤の存在下、適当な条件の下で培養または継代された際に実質的に未分化のままであり、個々の未分化ＥＳ細胞は細胞集団の実質的な割合を構成する。実質的に未分化の調製物は少なくとも約２０％の未分化ＥＳ細胞を含み、少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％のＥＳ細胞を含んでいてよい。
本発明は、特異的結合剤（結合）分子による、幹細胞試料からの広範なグリカン混合物の分析に関する。
本発明は特に、式Ｉ：
Ｒ１Ｈｅｘβｚ｛Ｒ３｝ｎ１ＨｅｘＮＡｃＸｙＲ２ （Ｉ）
［式中、Ｘは無であるかグリコシド結合した二糖エピトープβ４（Ｆｕｃα６）ｎＧＮであり、ここでｎは０または１であり；
ＨｅｘはＧａｌまたはＭａｎまたはＧｌｃＡであり；
ＨｅｘＮＡｃはＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃであり；
ｙはアノマー結合構造αおよび／もしくはβ、または誘導体化アノマー炭素からの結合であり、
ｚは結合位置３または４であり、ただしｚが４である場合にはＨｅｘＮＡｃはＧｌｃＮＡｃであり、ＨｅｘはＭａｎであるか、またはＨｅｘはＧａｌであるか、またはＨｅｘはＧｌｃＡであり、ｚが３である場合には、ＨｅｘはＧｌｃＡまたはＧａｌであり、ＨｅｘＮＡｃはＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃであり；
Ｒ１はコア構造に結合した１〜４個の天然型炭化水素置換基を表し；
Ｒ２は還元末端水酸基、化学的還元末端誘導体、あるいは、タンパク質由来のアスパラギン、Ｎ−グリコシドアミノ酸および／もしくはペプチドを含む天然アスパラギン結合Ｎ−グリコシド誘導体、または、タンパク質由来のアスパラギン、Ｎ−グリコシドアミノ酸および／またはペプチドを含む天然セリンまたはスレオニン結合Ｏ−グリコシド誘導体であり；
ＨｅｘＮＡｃがＧａｌＮＡｃである場合、Ｒ３は無であるか、もしくはＧｌｃＮＡｃβ６を示す分岐構造であるか、もしくはそのＧａｌＮＡｃに結合する還元末端にＧｌｃＮＡｃβ６を有するオリゴ糖であり、または、ＨｅｘがＧａｌ、ＨｅｘＮＡｃがＧｌｃＮＡｃ、およびｚが３である場合、Ｒ３は無もしくはＦｕｃα４であり、または、ｚが４である場合、Ｒ３は無もしくはＦｕｃα３である］
のグリカンマス成分（ｇｌｙｃａｎ ｍａｓｓ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）のそれぞれに対する単糖組成を有するグリカン材料を含む、本発明の幹細胞のグライコームに関する。
典型的なグライコームはＮ−グリカン、Ｏ−グリカン、糖脂質グリカン、ならびに中性および酸性サブグライコーム（ｓｕｂｇｌｙｃｏｍｅ）等のグリカンの亜群を含む。
本発明は試料中に存在するグリカンの分析に基づく幹細胞試料の臨床状態の診断に関する。本発明は特に、癌および癌の臨床状態の診断、優先的には幹細胞と癌性細胞との区別、ならびに幹細胞株および調製物における癌化の検出に関する。
本発明はさらに幹細胞試料中に存在するグリカン混合物の構造的分析にも関する。
発明の記載
本発明は幹細胞の状態の調節のための方法に関するものであり、ここで少なくとも１個の幹細胞が、本明細書において結合剤とも呼ばれるグリカン結合タンパク質と接触させられる。好ましい一態様において、結合剤は幹細胞の表面上の少なくとも１個のグリカン構造に結合し得る。より好ましくは結合剤は幹細胞の末端グリカン構造を認識する。
本発明は非造血幹細胞の調節または培養に関するものであり：（ｉ）少なくとも１個の幹細胞または幹細胞集団を提供すること；および（ｉｉ）前記の少なくとも１個の幹細胞または幹細胞集団を、グリカン構造を結合する１または複数種の結合剤と接触させることを含む。本発明はさらに、工程（ｉｉｉ）前記細胞を、所望の刺激、状態変化または増殖に十分な期間インキュベートすること、またはｉｉｉ）幹細胞の増殖が実質的に分化を伴わずに起こる場合に幹細胞を培養すること、を含む。
本発明の一局面において、幹細胞の状態の調節のための方法が、少なくとも１個の幹細胞を結合剤と接触させることにより提供される。該結合剤は好ましくは幹細胞の末端グリカン構造を認識する。
本発明の一局面において、前記結合剤はグリカン結合タンパク質の複合体、好ましくは多価の複合体である。好ましい一態様において、本発明は幹細胞を結合剤の存在下で調節する方法に関するものであり、該結合剤は固定化される。好ましい固定化は非共有結合性相互作用による固定化および共有結合性の固定化である。
他の態様において、幹細胞の未分化状態の支持のための方法が、少なくとも１個の幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤と接触させることにより提供される。本発明は幹細胞の培養に関するものであり、幹細胞の増殖は実質的に分化を誘導することなく生ずる。
本発明は好ましい一態様において本発明の非造血幹細胞、最も好ましくは胚性または間葉系幹細胞に関する。
本発明はさらに、造血幹細胞の調節または培養のための結合剤を選択するための方法に関するものであり：（ｉ）少なくとも１個の幹細胞または幹細胞集団を提供すること；および（ｉｉ）前記の少なくとも１個の幹細胞または幹細胞集団を、グリカン構造を結合する１または複数種の結合剤と接触させること、を含み、該結合剤はＭａｎα結合レクチンＦＲＩＬ群レクチンもしくは同様な特異性を有するレクチンまたは造血幹細胞の培養のために用いられる他のレクチンではなく、または前記結合剤は共有結合的に表面に付着する。
造血幹細胞の培養のための好ましい結合剤は本発明により明らかになった造血幹細胞のグリカンに結合するための特異性を有する。
本発明はさらに、造血幹細胞等の幹細胞の調節に関するものであり、該調節は細胞の分化を伴う。
他の態様において、細胞の形態学的状態および分化関連状態等であるが限定されない生物学的状態の変化のための方法が、少なくとも１個の幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤と接触させることにより提供される。
他の態様において、接着状態の変化のための方法が、少なくとも１個の幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤と接触させることにより提供される。
他の態様において、幹細胞の増殖速度を変えるための方法が、少なくとも１個の幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤と接触させることにより提供される。
好ましい一態様において、前記結合剤はレクチンである。ヒト胚幹細胞のための最も好ましいレクチンは、ＥＣＡ（Ｅ． ｃｒｉｓｔａｃａｌｌｉ）である。好ましい一態様において、ｈＥＳＣはＥＣＡ被覆表面上で増殖させられ、本質的にフィーダー細胞を含まない。好ましくは、ＥＣＡ被覆表面はｈＥＳＣを実質的に未分化の状態で維持する。他の好ましい態様において、ｈＥＳＣ培地は馴化培地、好ましくはｍＥＦまたはｈＥＦ馴化のものを含む。好ましくはｈＥＳＣはマウスフィーダー細胞上で増殖させられ、ＥＣＡ被覆プレート上に移されて増殖させられる。より好ましい一態様において、ｈＥＳＣは胚盤胞から得られ、ＥＣＡ被覆表面上に直接被覆される。ｈＥＳＣはコラゲナーゼ処理を用いて増殖させることができる。好ましくは、ｈＥＳＣはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて増殖／継代することができ、これは、反復的なプロテアーゼへの曝露により引き起こされる、あり得る細胞の損傷を減少させると考えられる。
他の好ましい態様において、前記結合剤はグリコシダーゼであり、これは活性部位が突然変異していてもよい。
本発明は、幹細胞の未分化状態を支持するための方法を、少なくとも１個の幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤と接触させることにより提供する。好ましくは、該方法は、幹細胞を表面上に固定化された結合剤と接触させることを伴う。好ましくは該表面は培養皿またはシャーレの底部である。
さらに、幹細胞増殖の速度を増加させ、それに加えて幹細胞を未分化状態で維持する薬剤に対する需要が存在する。さらに、幹細胞増殖の速度を減少させ、および／または幹細胞を未分化の状態で維持する薬剤に対する需要が存在する。さらに、幹細胞の接着状態、形態、増殖速度および／または分化状態を変化させる薬剤に対する需要が存在する。
これは、一般に、幹細胞は固有の生理学的ニッチ内に存在しており、このようなニッチの模倣物中で細胞の増殖を行っても、この幹細胞ニッチの模倣物は臨床の場において利用不可能であることが多いということを考えた場合に特に明らかである。その一例は、胚幹細胞の最適な増殖が未だ主としてマウスフィーダーを用いて達成されるという事実である。本発明は本質的にフィーダー細胞および潜在的な混入源無しに条件を再現するための方法および組成物を教示する。
従って、幹細胞集団が成体または胚性供給源のいずれに由来しても、幹細胞を培地中で増殖させて異種の細胞の混合物の集団または精製された細胞集団を増加させることができる。細胞増殖は、しかし、遅い場合があり、培養期間中に細胞が望ましくない細胞型に分化する場合がある。従って、幹細胞一般、および特に定義された幹細胞集団の増殖速度を向上させる方法は幹細胞の臨床用途を促進させるために有用であろう。従って、求められているのは培養液中で増殖させた際に幹細胞の拡張または増殖の速度を増加させる新規方法である。さらに、求められているのは、培養液中で増殖させた際に幹細胞の接着状態、形態、増殖速度および／または分化状態または増殖といった生物学的特徴を調節する新規方法である。
細胞集団を細胞表面部分に結合する結合剤（レクチン等）と接触させることにより、該細胞集団を刺激／調節することができる。結合剤は溶液中であってよく、しかし表面に付着していてもよい。結合剤の細胞表面部分／グリカン構造上への結合は、一般にシグナル伝達経路の活性化を誘導する。
本発明は、幹細胞の末端グリカン構造を認識する、特異的結合構造、結合剤を明らかにした。本発明は特に、幹細胞の調節のための結合剤の使用に関する。さらに本発明は特に、幹細胞結合分子の新規複合体に関する。結合した幹細胞結合分子は多価の形態、特に固定化された形態の幹細胞の調節に対して特に好ましい。結合分子は好ましくは表面上に固定化される。
グライコーム−幹細胞からの新規グリカン混合物
本発明は幹細胞から各種サイズの新規グリカンを明らかにした。幹細胞は小さなオリゴ糖から大きな複合構造にまでわたる範囲のグリカンを含んでいる。本分析は多数の成分と構造タイプとを相当量有する組成を明らかにする。これまで、これらの希少材料からの全グライコームは入手できず、幹細胞の遊離可能なグリカンの混合物、すなわちグライコームの性質は未知であった。
本発明は細胞表面のグリカン構造が初期のヒト細胞の各種集団、すなわち本発明の好ましい標的細胞集団、の間で異なることを明らかにした。該細胞集団は特異的に増加した「レポーター構造」を有していることが明らかになった。
細胞表面のグリカン構造は一般に多数の生物学的役割を有することが知られている。そのため、細胞表面からの正確なグリカン混合物についての知識は、細胞の状態に関する知識のために重要である。本発明は、複数の条件が細胞に影響し、そのグライコームに変化をもたらすことを明らかにした。本発明は、ヒト幹細胞から新規グライコーム成分および構造を明らかにした。本発明は特に、特異的結合剤分子によって分析することができる、特異的な末端グリカンエピトープを明らかにした。
好ましい末端エピトープは、実施例の広範な構造データから得られた構造表内の本発明の式に示されている。本発明は、好ましくは結合剤により、好ましくは他の担体構造上の同一の末端構造を効果的に認識しない高特異性結合剤により、認識される新規の伸長結合剤標的エピトープを明らかにした。本発明は特に、間葉系または胚幹細胞の濃縮および／または培養のための特異的結合剤の使用に関する、本発明はさらに、末端エピトープの識別に関するものであり、ここで末端Ｎ−グリカンエピトープはマンノースにβ２結合し、Ｏ−グリカンＮ−アセチルラクトサミン基盤エピトープはＧａｌＮＡｃにβ６結合し、糖脂質Ｎ−アセチルラクトサミン基盤エピトープはＧａｌにβ３結合する。
フコシル化構造
ｉ）α３−フコシル化構造、
好ましいα３−フコシル化構造は特にＬｅｗｉｓ ｘ、より好ましくはシアリルＬｅｗｉｓ ｘを含む。本発明は好ましい一態様において、特異的結合試薬による細胞表面上のα３−フコシル化構造への結合によって濃縮された幹細胞集団に関する。
本発明はさらに、特に細胞培養の使用のための、α３−フコース特異的結合試薬と幹細胞との複合体に関する。
特異的シアリルＬｅｗｉｓ ｘ構造は効果的に間葉系または胚幹細胞特異的であり、細胞の結合および操作のために有用であることが明らかになった。
ｓＬｅｘのための好ましい結合試薬としてＧＦ５２６、およびＧＦ３０７等が挙げられる。
好ましい一態様において、シアリルＬｅｗｉｓ ｘ特異的試薬は特にコアＩＩ ｓＬｅｘ［ＳＡα３Ｇａｌβ４（Ｆｕｃα３）ＧｌｃＮＡｃβ６（Ｒ１Ｇａｌβ３）ＧａｌＮＡｃαＳｅｒ／Ｔｈｒ［式中、Ｒ１すなわちシアル酸（ＳＡα３）または無］を抗体ＧＦ５２６と同様に結合する。本発明は、特に幹細胞の培養のための、特にｓＬｅｘおよびコアＩＩｓＬＥｘ陽性細胞の、特異的結合試薬による、幹細胞を含んだ材料からの選択に関する。好ましい一態様において、細胞選別システムはＦＡＣＳまたは結合剤を含んだ固相である。
幹細胞を増殖させるための好ましいレクチン試薬
本発明は幹細胞を増殖させることとの関連において有用な新規レクチン試薬を明らかにした。
組み替えレクチン
レクチンの好ましい型は、非哺乳類、好ましくは非動物細胞培養において産生された組み替えタンパク質である。このようなタンパク質は特に低い混入のリスクを有すると考えられる。好ましい産生宿主としては細菌、昆虫、イースト、菌類または植物細胞等が挙げられ、イーストまたは菌類が、アレルゲン性植物材料または潜在的エンドトキシン含有細菌産生と比べ、潜在的に有害な成分の量が最も少ないことから好ましい。実施例２４にｈＥＳＣ細胞の培養に特に有用な新規組み替えレクチンを示す。
グリカン改造レクチン
好ましい一態様において、本発明は生物活性グリコシル化を減少させるために改造された天然グリコシル化レクチンの使用に関する。動物グリコシル化、および非動物グリコシル化さえも、生物活性、抗原性または免疫原性構造を含んでおり、これは治療用幹細胞調製物とともに患者に移された場合に有害であり得るか、または動物モデルにおける誤った研究をもたらすか、または培養された細胞に天然グリカン結合受容体を介して変化を引き起こす。
グリカンは好ましくは
ａ）グリカン／グリコシル化部位の除去または
ｂ）グリカンの不活性化
により改造される。
非グリコシル化レクチン
植物レクチン等の天然グリコシル化レクチンの非グリコシル化型は、複数の糖型を有するグリコシル化タンパク質と比べ、タンパク質が均質であることから、生物工学的方法に対して有用であり得ると考えられる。非グリコシル化レクチンは大腸菌によるもの等の原核細胞系において産生されてよく、例えばＥＣＡレクチンは細菌中で産生されている。糖アフィニティーカラムと反応性の細菌内毒素および潜在的細菌レクチンまたはグリコシダーゼのため、菌類のイーストの発現が好ましい。
グリカン不活性化レクチン
本発明はさらに、レクチンのグリカンを不活性型に修飾することに関する。好ましい一態様において、グリカンは酸化により、好ましくはｐｅｒｊｏｄａｔｅ酸化により、修飾され、さらに不活性型に派生し、またはグリカンが細胞による認識に対して立体的に有効でないように固相へのグリカンから（に対して）結合させられる。
グリカン結合レクチン
グリカン不活性化レクチンのグリカン結合型は、受動的にまたは非特異的に化学的に固相に接着したレクチンと比べ、他の利点を有する。何故ならこれらの方法は少なくとも部分的にレクチンの結合部位の妨げとなる場合があるためである。さらに、グリカン結合レクチンは表面に均一に接着され得る。本発明は、タンパク質に対するビオチン化等の標準的な結合手段がタンパク質の生物活性を減少させ得ることを明らかにした。実施例において
グリコシル化部位変異組み替えＥＣＡレクチン
本発明は、好ましい一態様において、組み替え非グリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）ＥＣＡタンパク質であって該タンパク質のＮグリコシル化部位が変異したものに関する。
ＥＣＡレクチンの好ましい変異型の一つは部位１１３のアミノ酸残基ＮがＱとなった変異を含み、グリコシル化部位ＮＮＳが変化してＱＮＳを形成する。Ｑ残基は天然アミノ酸残基の最も近い模倣物として好ましい。アスパラギン残基はいくつかの他の残基に変化させ得ると考えられ、レクチンの活性を維持することが可能である。さらに、ＮＮＳグリコシル化部位はセリン残基等の他の残基を、例えばアラニンに変化させることにより、または長いもしくはプラリン（ｐｒａｌｉｎｅ）残基をＮとＳとの間に導入することにより、不活性型に変異させることができ、このようなアプローチによりタンパク質の性質を部分的に変化させることができる。
本発明はさらに、表面に結合した組み替え非グリコシル化ＥＣＡタンパク質に関する。該タンパク質は受動的に表面に吸着させられるか、またはクローニングされ、結合可能なアミノ酸残基を有し、または天然に入手可能な残基から結合され、特異的にまたは非特異的にレクチンの炭水化物結合活性を維持し得ると考えられる。本発明は、ＥＣＡの組み替え型がＥＣＡ調製物と比べ、細胞培養において、平均すると等しくまたはより効果的であったことを明らかにした。
本発明は、組み替え非グリコシル化Ｎ−グリコシル化部位変異ＥＣＡタンパク質またはその機能断片をコードするアミノ酸配列に関する。
さらに、いくつかのアミノ酸残基の相違のみを有する、機能的に同等な、変異ＥＣＡレクチンの相同バリアントが存在すると考えられる。本発明は、１〜６、より好ましくは１〜４アミノ酸残基の相違、または９７％超の相同性、またはより好ましくは９８％、および最も好ましくは９９％の相同性を有する、ＥＣＡレクチンと事実上同一なレクチンに関する。本発明は、タンパク質配列が少なくとも５０％、より好ましくは６５％、さらに好ましくは７５％、さらになお好ましくは８５％、および最も好ましくは９５％相同な相同レクチンに関するものであり、該レクチンは効果的にＮ−アセチルラクトサミンに結合し、ＥＣＡと類似のオリゴ糖特異性を有する。
本発明はさらに、非グリコシル化ＥＣＡタンパク質またはその機能的ホモログもしくは機能断片をコードする核酸配列に関する。本発明はさらに、前記核を含む宿主細胞に関する。
レクチン上で増殖させた胚幹細胞
本発明は、各種レクチン上でＨＥＳＣ細胞を増殖させることが可能であることを明らかにした。本発明は管理された条件において効果的に胚幹細胞を産生するための方法を提供する。現在の不均質な、および動物由来の材料、例えば線維芽細胞フィーダー細胞またはマトリゲルは、再現性、動物由来の有害な分子、例えばＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮｅｕＧｃ）等の抗原性構造によるあり得る混入、ウイルス、プリオンおよび他の感染性病原体のリスクに関して深刻な問題を含むと考えられる。レクチンタンパク質は 等の許容される動物供給源から入手可能である。本発明は細胞培養槽を被覆する単一の純粋なタンパク質を含んだ、細胞を支持するマトリクスを提供する。
レクチンの細胞の培養中に幹細胞マーカーの発現の量および形態の変化があった。しかし、これらは培養中に可逆的であるか、または細胞がレクチンからマトリゲルに移された場合に従来に変化するようである。
レクチンは細胞の接着および増殖を補助する。増殖中の細胞は、ｍａｔｒｉｇｅｌ上でまたは従来の支持体とともに形成された幹細胞コロニーと比べ、通常と異なる小細胞塊の形態および細胞の形状を有する。細胞はマトリクス上で一時的に特性の変化を伴って増殖する。
継代
レクチン上における幹細胞の増殖の新規方法は、さらなる利点を示した。細胞に有害であり得る酵素または掻き取りを用いることなく、穏やかに振とうする形式の動作により細胞を剥離することが可能であろう。
レクチン活性の阻害による細胞遊離の制御
本願発明者らは、細胞を細胞培養槽または容器から剥離するために阻害剤レクチンの使用が可能であろうとさらに考えた。
好ましいレクチン型
本発明は、ヒト胚幹細胞が、好ましくはＥＣＡ、ガレクチン、ＤＳＡおよびＵＥＡ−１の群から選択される（Ｆｕｃα２）ｎＧａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ［式中、ｎは０または１］認識レクチンとの接触において、特に効果的に培養されることを明らかにした。Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ特異的なレクチンＥＣＡ、ガレクチン、ＤＳＡは初期の接着および増殖のために好ましく、Ｆｕｃα２Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃは実質的に後の段階での細胞収率のために好ましい。ＥＣＡ型レクチンは幹細胞マーカーのより良好な保存のため、ガレクチンまたはＤＳＡ型レクチンよりも好ましい。実施例２７参照。
炭水化物阻害による細胞からの結合剤の遊離
本発明は好ましい一態様において、結合剤からのグリカンの遊離に関する。これは：
ａ）結合剤を伴う方法による細胞の濃縮または単離後の、可溶性結合剤からの細胞の遊離
ｂ）細胞の濃縮もしくは単離後の、または細胞培養中の、例えば細胞の継代のための、固相に結合した結合剤からの遊離
等のいくつかの方法のために好ましい
阻害炭水化物はレクチンの結合エピトープまたはその一部に対応するように選択される。好ましい炭水化物としてはオリゴ糖、単糖およびその複合体等が挙げられる。炭水化物の好ましい濃度としては、１ｍＭ〜５００ｍＭ、より好ましくは１０ｍＭ〜２５０ｍＭ、およびさらに好ましくは１０〜１００ｍＭの細胞が耐性を有する濃度が挙げられ、より高い濃度が単糖、および固相に結合した結合剤を用いる方法にとって好ましい。オリゴ糖および還元末端複合体を含む好ましいオリゴ糖配列としては、Ｇａｌβ４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃ、ならびに表１５および本発明の式に記載されるこれらのシアル化およびフコシル化バリアント等が挙げられる。
複合体中の好ましい還元末端構造は、
ＡＲ［式中、Ａはアノマー構造であって好ましくはＧａｌβ４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃに対するベータ、およびＧａｌβ３ＧａｌＮＡｃに対するアルファであり、Ｒは糖にグリコシド結合する有機残基であり、好ましくは方法、エチルもしくはプロピル等のアルキル、またはシクロヘキシルもしくは芳香環構造等の環構造であって、任意にさらなる官能基により修飾される］
である。
好ましい単糖としては、Ｆｕｃ、Ｇａｌ、ＧａｌＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ、Ｍａｎ等の結合エピトープの末端のまたは２個もしくは３個の末端の単糖などが挙げられ、好ましくはアノマー複合体：例えばＦｕｃαＲ、ＧａｌβＲ、ＧａｌＮＡｃβＲ、ＧａｌＮＡｃαＲ ＧｌｃＮＡｃβＲ、ＭａｎαＲとしてのものである。例えばＰＮＡレクチンは好ましくはＧａｌβ３ＧａｌＮＡｃまたはラクトースまたはＧａｌにより阻害され、ＳＴＡはＧａｌβ４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡまたはその由来するオリゴマーもしくはポリ−ＬａｃＮＡｃエピトープにより阻害され、およびＬＴＡはフコシララクトースＧａｌβ４（Ｆｕｃα３）Ｇｌｃ、Ｇａｌβ４（Ｆｕｃα３）ＧｌｃＮＡｃまたはＦｕｃもしくはＦｕｃαＲにより阻害される。一価の阻害条件の例はＶｅｎａｂｌｅ Ａ． ｅｔ ａｌ． （２００５） ＢＭＣ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｂｉｏｌｏｇｙに示されており、細胞が多価で固相に結合する場合の阻害については、より大きなエピトープおよび／または濃度またはマルチ／ポリバレント複合体が好ましい。
本発明はさらに、ＣＤ３４＋磁性ビーズからの細胞の遊離に対して知られるものと同様な、プロテアーゼ消化による結合剤の遊離の方法に関する。
固定化結合剤、好ましくは結合剤タンパク質タンパク質
本発明は、幹細胞の培養のための、またはそれに関連する、特異的結合剤の使用に関するものであり、ここで該結合剤は固定化される。
前記固定化には、非共有結合的固定化、および共有結合を伴う固定化法、ならびにさらに部位特異的固定化および非特異的固定化が含まれる。
好ましい非共有結合的固定化法は受動的吸着法を含む。好ましい一つの方法においては、細胞培養皿またはウェルのプラスチック表面等の表面に結合剤を受動的に吸収させる。好ましい方法としては溶媒中または湿潤状態の結合剤タンパク質の前記表面への吸収、好ましくは該表面への均一な吸収、などが挙げられる。好ましい均一な分布は、好ましくは形成１０分間〜３日間、より好ましくは１時間〜１日間、および最も好ましくは８〜２０時間の一晩の吸収時間の間、弱い振とうを用いて生成される。固定化の洗浄工程は、レクチンの脱落を回避するために、好ましくは低速の液体の流れを用いて穏やかに行われる。
特異的固定化
特異的固定化は、結合剤の結合部位がそのリガンドグリカンド、例えば本発明の幹細胞の特異的細胞表面グリカンに結合するのを妨げないタンパク質領域からの固定化を目的とする。
好ましい特異的固定化法としては、結合剤タンパク質／ペプチドの表面からの特異的アミノ酸残基からの化学的結合などが挙げられる。好ましい一つの方法においては、システイン等の特定のアミノ酸残基が固定化の部位にクローン化され、システインから結合が行われる。他の好ましい方法においては、Ｎ−末端システインが過ヨウ素酸により酸化され、アミノ−オキシ−メチルヒドロキシルアミンまたはヒドラジン構造等のアルデヒド反応性試薬に結合される。さらに好ましい化学としてはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより販売される「ｃｌｉｃｋ」化学ならびにＰｉｅｒｃｅおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓにより販売されるアミノ酸特異的カップリング試薬などが挙げられる。
好ましくはグリカンが結合部位に近接していない、またはより長いｓｐｅｃａｒが用いられる場合に、好ましい特異的固定化は結合剤のＯ−またはＮ−グリカン等のタンパク質結合炭水化物から起こる。
グリカン固定化結合剤タンパク質
好ましいグリカン固定化はグリカンの反応性化学選択的連結基（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ）Ｒ１を介して起こり、ここで該化学基は第二の化学選択的連結基Ｒ２に特異的に、結合剤のタンパク質部分に大きなまたは結合破壊性の変化をもたらすことなく、結合され得る。アルデヒドおよびケトンと反応する化学選択的基としてはアミノ−オキシ−メチルヒドロキシルアミンまたはヒドラジン構造等が挙げられる。好ましいＲ１基の一つはタンパク質の表面上に化学的に合成されたアルデヒドまたはケトン等のカルボニルである。他の好ましい化学選択的基としては、マレイミドおよびチオール；ならびにアジドおよびそれに対する反応性基を含んだ「Ｃｌｉｃｋ」試薬等が挙げられる。。
好ましい合成工程は
ａ）炭水化物選択的酸化化学による、好ましくは過ヨウ素酸による、化学酸化、または
ｂ）ガラクトース酸化酵素等の、非還元末端の末端単糖酸化酵素による、または、修飾単糖残基のグリカンの末端単糖への転移による、酵素的酸化
を含む。
酸化酵素または過ヨウ素酸の使用は当該分野に公知であり、Ｋａｂｉ−Ｆｒｅｎｓｅｎｉｕｓ（ＷＯ２００５ＥＰ０２６３７、ＷＯ２００４ＥＰ０８８２１、ＷＯ２００４ＥＰ０８８２０、ＷＯ２００３ＥＰ０８８２９、ＷＯ２００３ＥＰ０８８５８、ＷＯ２００５０９２３９１、ＷＯ２００５０１４０２４；参照により全体が組み込まれたものとする）およびドイツの研究機関によるＨＥＳ−多糖の組み替えタンパク質への結合に関する特許出願に記載されている。
末端単糖残基の転移のための好ましい方法としては、本願発明者らの一部による特許出願ＵＳ２００５０１４７１８（参照により全体が組み込まれたものとする）もしくはＱａｓｂａおよびＲａｍａｋｒｉｓｈｍａｎほかによるＵＳ２００７２５８９８６（参照により全体が組み込まれたものとする）に記載されるような、またはＮｅｏｓｅの糖ペグ化（ｇｌｙｃｏｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）特許（ＵＳ２００４１３２６４０；参照により全体が組み込まれたものとする）に記される方法を用いることによる、変異ガラクトシルトランスフェラーゼの使用などが挙げられる。
高特異性化学タグを含む複合体
好ましい一態様において、結合剤はリガンドＬによって特異的に認識され得るタグ（Ｔと呼ぶ）に特異的にまたは非特異的に結合する。タグの例としてはビオチン結合リガンド（ストレプト）アビジン、または他のフルオロカルボニルに結合するフルオロカルボニル、またはペプチド／抗原および該ペプチド／抗原に対する特異的抗体等が挙げられる。
好ましい複合体構造
タグ複合体構造
好ましい複合体構造は
式ＣＯＮＪ
Ｂ−（Ｇ−）ｍＲ１−Ｒ２−（Ｓ１−）ｎＴ−、
［式中、Ｂは結合剤であり、Ｇはグリカン（前記結合剤がグリカンを結合する場合）であり、
Ｒ１およびＲ２は化学選択的連結基であり、Ｔはタグ、好ましくはビオチンであり、Ｌはタグに特異的に結合するリガンドであり；Ｓ１は任意のスペーサー基、好ましくは炭素数１〜１０のアルキルであり、ｍおよびｎは独立に０または１のいずれかの整数である］
によるものである。
スペーサー構造連結基または（ストレプト）アビジン等のリガンドを固相に化学的に付着させる方法は当該分野において公知である。
複合構造
好ましい複合構造は
式ＣＯＭＰ
Ｂ−（Ｇ−）ｍＲ１−Ｒ２−（Ｓ１−）ｎ（Ｔ−）ｐ（Ｌ−）ｒ−（Ｓ２）ｓ−ＳＯＬ
［式中、Ｂは結合剤であり、ＳＯＬは固相またはマトリクスまたは表面であり、Ｇはグリカン（前記結合剤がグリカンを結合する場合）であり、
Ｒ１およびＲ２は化学選択的連結基であり、Ｔはタグ、好ましくはビオチンであり、Ｌはタグに特異的に結合するリガンドであり；Ｓ１およびＳ２は任意のスペーサー基、好ましくは炭素数１〜１０のアルキルであり、ｍ、ｎ、ｐ、ｒおよびはｓ独立に０または１のいずれかの整数である］
によるものである。
スペーサー構造を固相に化学的に付着させる方法は当該分野において公知である。
本発明は好ましい一態様において、
１．幹細胞の培養のための、幹細胞および／または関連する細胞を認識する特異的結合構造の試験および選択
２．幹細胞、特に間葉系または胚幹細胞の培養中または培養前の細胞の選択のための、好ましくは２種類の方法：
ａ）可溶性結合剤分子による、好ましくはＦＡＣＳ等の標識細胞を識別する物理的方法による、細胞の選択、および／または
ｂ）固相に結合した結合剤分子、例えば
ｂ１）プレートまたは容器等の細胞培養槽に結合した結合剤、および／または
ｂ２）細胞培養に有用な高分子またはゲル形成材料等のポリマー材料に結合した結合剤
ｂ３）ビーズ、特に磁性ビーズ等の微小粒子に結合した結合剤
による細胞の選択
における、特異的結合剤の使用
３．細胞培養中の可溶性のもしくは表面に結合した形態の幹細胞または混入／関連細胞集団を認識する特異的結合剤構造の使用
に関する。
グライコーム材料由来の構造の、および細胞表面上の構造の、結合法による識別
本発明は、ＮＭＲおよび／または質量分析による物理化学的分析に加え、いくつかの方法が前記構造の分析に有用であることを明らかにした。本発明は特に、方法：
ｉ）結合剤と呼ばれる、グリカンを結合する分子による識別
これらの分子はグリカンを結合し、結合剤に連結した標識等の、結合の観察を可能にする特性を有する。好ましい結合剤としては、
ａ）抗体、レクチンおよび酵素等のタンパク質
ｂ）タンパク質の結合ドメインおよび部位等のペプチド、ならびにファージディスプレイペプチド等の合成ライブラリー由来類似体
ｃ）ペプチド材料を模倣する他のポリマーまたは有機骨格分子（ｏｒｇａｎｉｃ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）等が挙げられる
に関する。
ペプチドおよびタンパク質は、好ましくは組み替えタンパク質またはそれに由来する対応する炭水化物認識ドメインであり、該タンパク質はモノクローナル抗体、グリコシダーゼ、グリコシル転移酵素、植物レクチン、動物レクチンまたはそれらのペプチド模倣物から選択され、結合剤は検出可能な標識構造を有していてよい。
炭水化物識別における酵素の属（ｇｅｎｕｓ）はレクチン（酵素活性を有しない炭水化物結合タンパク質）の属に対して連続的である．
ａ）天然グリコシルトランスフェラーゼ（Ｒａｕｖａｌａ ｅｔ ａｌ．（１９８３）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）３９９１−３９９５）およびグリコシダーゼ（Ｒａｕｖａｌａ ａｎｄ Ｈａｋｏｍｏｒｉ（１９８１）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８８，１４９−１５９）はレクチン活性を有する。
ｂ）炭水化物結合酵素は触媒アミノ酸残基を変異させることによりレクチンに改変することができる（ＷＯ９８４２８６４；Ａａｌｔｏ Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．（２００１），１８（１０）；７５１−８；Ｍｅｇａ ａｎｄ Ｈａｓｅ（１９９４）ＢＢＡ１２００（３）３３１−３を参照）。
ｃ）グリコシダーゼに構造的に相同な天然レクチンも知られており、酵素属およびレクチン属の連続性を示唆している（Ｓｕｎ，Ｙ−Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００１）２７６（２０）１７５０７−１４）。
酵素活性を有しない炭水化物結合タンパク質としての抗体の属もレクチンの概念に非常に近いが、抗体は通常レクチンとしては分類されない。
ペプチド概念の明白性および炭水化物結合タンパク質概念との連続性
タンパク質はペプチド鎖を有しており、そのためペプチドによる炭水化物の認識は明白であるとさらに考えられる。例えば、炭水化物結合タンパク質の活性部位由来のペプチドは炭水化物を認識し得ることが当業者に公知である（例えばＧｅｎｇ Ｊ−Ｇ．ｅｔ ａｌ（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８４６−５３）。
上記の通り、抗体断片は記載に含まれ、結合タンパク質の遺伝子組み替えバリアントである。明白な遺伝子組み替えバリアントは酵素、抗体およびレクチンの、短くなった、または断片のペプチドを含みうる。
細胞または分化および構造の個々の特異的末端バリアントの解明
本発明は、特定の分化段階のマーカーとしてのオン・オフ変化またはグライコームの定量的比較に基づく量的相違によって、構造的特徴を明らかにするための、グライコミクスプロファイリング法の使用に関する。個々の特異的バリアントは、グリコシルトランスフェラーゼの遺伝的変異、および／または、個々の特異的構造の合成を妨げる、または引き起こすグリコシル化機構の他の要素に基づくものである。
構造的末端エピトープ
本願発明者らはこれまでにヒトグライコームのグライコーム組成を明らかにしており、本明細書において本願発明者らは、幹細胞グライコームの、特に特異的結合剤による、分析に有用な構造的末端エピトープを提供する。
変化する特徴的な末端構造の例としては、主要な相同コアＧａｌβエピトープの修飾として生成された競合的（ｃｏｍｐｅｔｉｎｇ）末端エピトープの発現等が挙げられ、該修飾は結合位置Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃが異なる同一の単糖のいずれかによるもの；および結合位置Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃが異なる同一の単糖のいずれかを有する類似体；または同一の結合であるが４位のエピマー主鎖（ｅｐｉｍｅｒｉｃ ｂａｃｋｂｏｎｅ）Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃによるものである。これらは構造の生物学的認識および機能を修飾する特異的コア構造により提示され得る。他の共通の特徴は、同様なＧａｌβ構造が、タンパク質結合物（Ｏ−およびＮ−グリカン）および脂質結合物（糖脂質構造）の両者として発現されることである。α２フコシル化の代わりに、末端ＧａｌはＮＡｃ基をフコースと同じ２位上に有していてよい。これは相同エピトープＧａｌＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃ、およびさらに関連するＧａｌＮＡｃβ３Ｇａｌ構造を本発明の特徴的な特別な糖脂質上に生ずる。
本発明はヒト幹細胞、好ましくはヒト胚幹細胞または成体幹細胞からの新規の末端二糖および誘導体エピトープに関するものであり、これらが好ましくは間葉系幹細胞である造血幹細胞ではない場合のものである。グリコシル化は種、細胞および組織特異的であり、通常、癌細胞からの結果は正常な細胞のものとは顕著に異なっており、そのため、ヒト胚性癌腫から得られた膨大かつ様々なグリコシル化のデータは、ヒト胚幹細胞に実際に関連性のある、または明らかなものではない（ただし偶然の類似を除く）と考えられるべきである。さらに、奇形腫の正確な分化程度は知ることができず、そのため特異的修飾機構下の末端エピトープの比較は知ることができない。グリコシダーゼおよび抗体等の特異的結合分子による末端構造、および該構造の化学的分析。
本発明は、特異的フコシル化／ＮＡｃ修飾による類似の修飾、および末端二糖エピトープの対応する位置上のシアル化を有する、末端Ｇａｌ（ＮＡｃ）β１−３／４Ｈｅｘ（ＮＡｃ）構造の群を明らかにする。末端構造は遺伝的に調節されたフコース転移酵素およびシアリルトランスフェラーゼの相同なファミリーにより制御されると考えられる。この制御により、細胞間の伝達のための、および細胞の分析に用いられる他の特異的結合剤による認識のための、特徴的な構造パターンが生成する。主要エピトープを表２８に示す。データは各型の細胞の末端エピトープの特徴的パターン、例えばｈＥＳＣ細胞上での１型ラクトサミン（Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ）上のＦｕｃα２−構造等の一般に多量のＦｕｃα−構造の発現、同様にβ３−結合したコアＩ Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃα、および特定の型の糖脂質上に存在する４型構造、およびα３−フコシル化構造の発現を明らかにするが、ＩＩ型Ｎ−アセチララクトサミン上のα６−シアルは胚様体およびｓｔ３胚幹細胞のＮ−グリカン上に現れる。例えば末端型ラクトサミンおよびポリラクトサミンは間葉系幹細胞を他の型から区別する。末端Ｇａｌｂ−情報は好ましくは に関する情報と組み合わせられる。
本発明は特に、構造の識別のための、モノクローナル抗体等の高特異性結合分子に関する。
該構造は式Ｔ１により表すことができる。この式では第１の単糖残基が左側に記され、これはβ−Ｄ−ガラクトピラノシル構造であって、Ｒ５がＯＨの場合はα−またはβ−Ｄ−（２−デオキシ−２−アセトアミド）ガラクトピラノシル構造の、Ｒ４がＯ−を有する場合はβ−Ｄ−（２−デオキシ−２−アセトアミド）グルコピラノシルの、３または４位いずれかに結合する。式Ｔ１およびＴ２において、還元末端の特定されない立体化学はさらに（請求の範囲において）曲線で示される。シアル酸残基はＧａｌの３もしくは６位、またはＧｌｃＮＡｃの６位に結合してよく、フコース残基はＧａｌの２位、またはＧｌｃＮＡｃの３もしくは４位、またはＧｌｃの３位に結合してよい。
本発明は、新規末端エピトープＦｕｃα２Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃβとして明らかになった末端Ｆｕｃα２を含むガラクトシル−グロボシド型構造、または胚性細胞から明らかになったＧａｌβ３ＧａｌＮＡｃβＧａｌα３含有イソグロボ構造に関する。
式Ｔ１
Figure 2010516239

式中、Ｘは結合位置であり、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ６はＯＨまたはグリコシド結合した単糖残基シアル酸、好ましくはＮｅｕ５Ａｃα２またはＮｅｕ５Ｇｃα２、最も好ましくはＮｅｕ５Ａｃα２であり、または
Ｒ３はＯＨまたはグリコシド結合した単糖残基Ｆｕｃα１（Ｌ−フコース）またはＮ−アセチル（Ｎ−アセトアミド、ＮＣＯＣＨ３）であり；
Ｒ４はＨ、ＯＨまたはグリコシド結合した単糖残基Ｆｕｃα１（Ｌ−フコース）であり、
Ｒ４がＨである場合、Ｒ５はＯＨであり、Ｒ４がＨでない場合、Ｒ５はＨであり、
Ｒ７はＮ−アセチルまたはＯＨであり、
Ｘは細胞由来の天然オリゴ糖主鎖構造、好ましくはＮ−グリカン、Ｏ−グリカンもしくは糖脂質構造であり、またはｎが０である場合、Ｘは無であり、
Ｙはリンカー基（ｌｉｎｋｅｒ ｇｒｏｕｐ）、好ましくはＯ−グリカンおよびＯ−結合末端オリゴ糖および糖脂質のための酸素、ならびにＮ−グリカンのためのＮ、またはｎが０である場合、無であり、
Ｚは担体構造、好ましくは細胞により産生された天然担体であり、例えばタンパク質または脂質であって、好ましくは担体上のセラミドもしくは分岐グリカンコア構造、またはＨであり、
アーチはガラクトピラノシルからの結合が左側の残基の３位または４位いずれかに対するものであること、およびＲ４構造が他の４または３位にあることを表し、
ｎは０または１の整数であり、ｍは１〜１０００、好ましくは１〜１００、および最も好ましくは１〜１０の整数（担体上のグリカンの数）であり、
ただしＲ２およびＲ３のうち１つはＯＨまたはＲ３はＮ−アセチルであり、
左側の第１の残基が右側の残基の４位に結合する場合、Ｒ６はＯＨであり、
ＸはＧａｌα４Ｇａｌβ４Ｇｌｃではなく、（ＳＳＥＡ−３または４のコア構造）またはＲ３はフコシルであり、
Ｒ７は左側の第１の残基が右側の残基の３位に結合している場合、好ましくはＮ−アセチルである。
好ましい末端β３結合亜群は、左側の第１の残基が主鎖構造Ｇａｌ（ＮＡｃ）β３Ｇａｌ／ＧｌｃＮＡｃと３位で結合する場合の状態を示す、式Ｔ２により表される。
式Ｔ２
Figure 2010516239

式中、Ｒ１〜Ｒ７等の変数は、Ｔ１に対して記載される通りである。
好ましい末端β４−結合亜群は式Ｔ３により表される。
式Ｔ３
Figure 2010516239

式中、Ｒ１〜Ｒ４およびＲ７を含む変数はＴ１に対して記載される通りであり、ただしＲ４はＯＨまたはグリコシド結合した単糖残基Ｆｕｃα１（Ｌ−フコース）である。
あるいは、末端構造のエピトープは式Ｔ４およびＴ５で表される。
コアＧａｌβエピトープ式Ｔ４：
Ｇａｌβ１−ｘＨｅｘ（ＮＡｃ）ｐ
ｘは結合位置３または４であり、
および、ＨｅｘはＧａｌまたはＧｌｃであり、
ただし、ｐは０または１であり、
ｘが結合位置３である場合、ｐは１であり、ＨｅｘＮＡｃはＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃであり、
ｘが結合位置４である場合、ＨｅｘはＧｌｃである。
コアＧａｌβ１−３／４エピトープは、好ましくはＧａｌ結合ＳＡα３またはＳＡα６またはＦｕｃα２、およびＧｌｃ結合Ｆｕｃα３またはＧｌｃＮＡｃ結合Ｆｕｃα３／４の群より選択される、１または２個の構造ＳＡαまたはＦｕｃαにより、任意に水酸基に置換される。
式Ｔ５
［Ｍα］ｍＧａｌβ１−ｘ［Ｎα］ｎＨｅｘ（ＮＡｃ）ｐ
式中、ｍ、ｎおよびｐは独立に０または１の整数であり、
ＨｅｘはＧａｌまたはＧｌｃであり、
Ｘは結合位置であり、
ＭおよびＮは単糖残基であって、
独立に無（前記位置の遊離水酸基）ならびに／または、
Ｇａｌの３位もしくは／およびＨｅｘＮＡｃの６位に結合したシアル酸であるＳＡ、ならびに／または
Ｇａｌの２位；および／もしくは、Ｇａｌが他の位置（４または３）に結合し、ＨｅｘＮＡｃがＧｌｃＮＡｃである場合、ＨｅｘＮＡｃの３もしくは４位；または、Ｇａｌが他の位置（３）に結合する場合、Ｇｌｃの３位；に結合したＦｕｃ（Ｌ−フコース）残基であり、
ただし、ｍおよびｎの合計は２であり
好ましくはｍおよびｎは独立に０または１である。
正確な構造の詳細は、細胞の分析および／または操作のために設計された特異的結合分子による最適な認識にとって重要である。末端主要Ｇａｌβエピトープは同一の修飾単糖ＮｅｕＸ（Ｘはシアル酸の５位修飾ＡｃもしくはＧｃ）またはＦｕｃにより、同一の結合型アルファで修飾される（両構造の同一の水酸基位置の修飾）。
全てのエピトープの末端Ｇａｌβ上のＮｅｕＸα３、Ｆｕｃα２、および
Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃの末端Ｇａｌβを修飾するＮｅｕＸα６、または結合が６競合である場合はＨｅｘＮＡｃ
またはＧｌｃＮＡｃに残存する遊離アキシャル位（ａｘｉａｌ）第１級水酸基を修飾するＦｕｃα（ＧａｌＮＡｃ残基に遊離アキシャル位水酸基が存在しない）。
好ましい構造は、Ｔ２と同様に、好ましいＧａｌβ１−３構造に分類することができ、
式Ｔ６：
［Ｍα］ｍＧａｌβ１−３［Ｎα］ｎＨｅｘＮＡｃ
式中、変数はＴ５に対して記載される通りである。
好ましい構造は、Ｔ４と同様に、好ましいＧａｌβ１−４構造に分類することができ、
式Ｔ７：
［Ｍα］ｍＧａｌβ１−４［Ｎα］ｎＧｌｃ（ＮＡｃ）ｐ
式中、変数はＴ５に対して記載される通りである。
これらは好ましいＩＩ型Ｎ−アセチルラクトサミン構造および関連するラクトシル誘導体であり、好ましい一態様において、ｐは１であり、構造は２型Ｎ−アセチルラクトサミンのみを含む。本発明はこれらが幹細胞、好ましくは間葉系幹細胞もしくは胚性幹細胞またはその分化したバリアント（組織型特異的に分化した間葉系幹細胞または各種ステージの胚幹細胞）の特定の亜型の識別に非常に有用であることを明らかにした。各種フコシルおよび／またはシアル酸修飾が幹細胞型に特徴的なパターンを生成したことは注目に値する。
好ましいＩ型およびＩＩ型Ｎ−アセチルラクトサミン構造
好ましい構造は、Ｔ４と同様に、オリゴ糖コア配列Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃ構造を有する好ましい１（Ｉ）型および２（ＩＩ）型Ｎ−アセチルラクトサミン構造に分類することができ、
式Ｔ８：
［Ｍα］ｍＧａｌβ１−３／４［Ｎα］ｎＧＩｃＮＡｃ
式中、変数はＴ５に対して記載される通りである。
好ましい構造は、Ｔ８と同様に、好ましいＧａｌβ１−３構造に分類することができ、
式Ｔ９：
［Ｍα］ｍＧａｌβ１−３［Ｎα］ｎＧｌｃＮＡｃ
式中、変数はＴ５に対して記載される通りである。
これらは好ましいＩ型Ｎ−アセチルラクトサミン構造である。本発明は、これらが幹細胞、好ましくは間葉系幹細胞もしくは胚性幹細胞またはその分化したバリアント（組織型特異的に分化した間葉系幹細胞または各種ステージの胚幹細胞）の特定の亜型の識別に非常に有用であることを明らかにした。各種フコシルまたはシアル酸修飾が細胞または幹細胞型に特徴的なパターンを生成したことは注目に値する。
好ましい構造は、Ｔ８と同様に、好ましいＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃコア配列含有構造に分類することができ、
式Ｔ１０：
［Ｍα］ｍＧａｌβ１−４［Ｎα］ｎＧｌｃＮＡｃ
式中、変数はＴ５に対して記載される通りである。
これらは好ましいＩＩ型Ｎ−アセチルラクトサミン構造である。本発明は、これらが幹細胞、好ましくは間葉系幹細胞もしくは胚性幹細胞またはその分化したバリアント（組織型特異的に分化した間葉系幹細胞または各種ステージの胚幹細胞）の特定の亜型の識別に非常に有用であることを明らかにした。
各種フコシルおよび／またはシアル酸修飾Ｎ−アセチルラクトサミン構造が幹細胞型に特に特徴的なパターンを生成することは注目に値する。本発明はさらに、少なくとも１個のフコシル化またはシアル化バリアント、およびより好ましくは少なくとも２個のフコシル化バリアントまたは２個のシアル化バリアントを含む、少なくとも２個の異なるＩ型およびＩＩ型アセチルラクトサミンを認識する結合試薬の組み合わせの使用に関する。
末端Ｆｕｃα２／３／４構造を有する好ましい構造
本発明はさらに、各種幹細胞、特に胚および間葉系幹細胞ならびにその分化したバリアントの：
ａ）Ｉ型およびＩＩ型アセチルラクトサミンおよびそれらのフコシル化バリアント、ならびに好ましい一態様において
ｂ）非シアル化フコシル化、ならびにより好ましくは
ｃ）好ましくはＦｕｃα２末端および／またはＦｕｃα３／４分岐構造を有する、フコシル化Ｉ型およびＩＩ型Ｎ−アセチルラクトサミン構造、ならびにさらに好ましくは
ｄ）好ましくはＦｕｃα２末端を有する、フコシル化Ｉ型およびＩＩ型Ｎ−アセチルラクトサミン構造
を認識する、本発明の方法のための結合試薬の組み合わせの使用に関する。
好ましいＦｕｃα２構造の亜群としては、モノフコシル化Ｈ型およびＨＩＩ型構造、ならびにジフコシル化Ｌｅｗｉｓ ｂおよびＬｅｗｉｓ ｙ構造等が挙げられる。
好ましいＦｕｃα３／４構造の亜群としては、モノフコシル化Ｌｅｗｉｓ ａおよびＬｅｗｉｓ ｘ構造、シアル化シアリル−Ｌｅｗｉｓ ａおよびシアリル−Ｌｅｗｉｓ ｘ構造、ならびにジフコシル化Ｌｅｗｉｓ ｂおよびＬｅｗｉｓ ｙ構造等が挙げられる。
Ｆｕｃα３構造の好ましいＩＩ型Ｎ−アセチルラクトサミン亜群としては、モノフコシル化Ｌｅｗｉｓ ｘ構造、ならびにシアリル−Ｌｅｗｉｓ ｘ構造およびＬｅｗｉｓ ｙ構造等が挙げられる。
Ｆｕｃα４構造の好ましいＩ型Ｎ−アセチルラクトサミン亜群としては、モノフコシル化Ｌｅｗｉｓ ａ シアリル−Ｌｅｗｉｓ ａおよびジフコシル化Ｌｅｗｉｓ ｂ構造等が挙げられる。
本発明はさらに、好ましくは、モノフコシル化または少なくとも２個のジフコシル化、または少なくとも１個のモノフコシル化および１個のジフコシル化構造の群から選択される、少なくとも２個の異なってフコシル化された１型および／または２型Ｎ−アセチルラクトサミン構造の使用に関する。
本発明はさらに、フコシル化Ｉ型およびＩＩ型Ｎ−アセチルラクトサミン構造を認識する結合試薬と、Ｆｕｃα２／３／４含有構造を有する他の末端構造、好ましくはＦｕｃα２末端構造であって、好ましくはＦｕｃα２Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃ末端、より好ましくはＦｕｃα２Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃα／βを有する構造、を認識する結合剤、および特に好ましい態様において、好ましくはグロボまたはイソグロボ型構造の末端構造中のＦｕｃα２Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃβを認識する抗体との組み合わせの使用に関する。
好ましいグロボおよびガングリオコア型構造
本発明はさらに、式：
式Ｔ１１
［Ｍ］ｍＧａｌβ１−ｘ［Ｎα］ｎＨｅｘ（ＮＡｃ）ｐ
［式中、ｍ、ｎおよびｐは独立に０または１の整数であり
ＨｅｘはＧａｌまたはＧｌｃであり、Ｘは結合位置であり；
ＭおよびＮは単糖残基であって
独立に無（前記位置の遊離水酸基）
ならびに／または
Ｇａｌの３位もしくは／およびＨｅｘＮＡｃの６位に結合したシアル酸であるＳＡα
Ｇａｌの３もしくは４位に結合したＧａｌα、または
Ｇａｌの４位に結合するＧａｌＮＡｃβ、ならびに／または
Ｇａｌの２位；および／もしくは、Ｇａｌが他の位置（４または３）に結合し、ＨｅｘＮＡｃがＧｌｃＮＡｃである場合、ＨｅｘＮＡｃの３もしくは４位；または、Ｇａｌが他の位置（３）に結合する場合、Ｇｌｃの３位；に結合したＦｕｃ（Ｌ−フコース）残基
であり、
ただし、ｍおよびｎの合計は２であり
好ましくはｍおよびｎは独立に０または１であり、ならびに
ＭがＧａｌαである場合、Ｇａｌβ１に結合するシアル酸は存在せず、
ならびに
ｎは０であり、ｘは好ましくは４であり、
ＭがＧａｌＮＡｃβである場合、Ｇａｌβ１にα６結合するシアル酸は存在せず、ｎは０であり、ｘは４である］
の、グロボおよびガングリオ型グリカンコア構造を有する一般式に関する。
本発明はさらに、式
式Ｔ１２
［Ｍ］［ＳＡα３］ｎＧａｌβ１−４Ｇｌｃ（ＮＡｃ）ｐ、
［式中、ｎおよびｐは独立に０または１の整数であり、
ＭはＧａｌの３もしくは４位に結合したＧａｌα、またはＧａｌの４位に結合したＧａｌＮＡｃβであり、および／またはＳＡαはＧａｌの３位に結合したシアル酸分岐であり、
ＭがＧａｌαである場合、Ｇａｌβ１に結合するシアル酸は存在しない（ｎは０である）］
の、グロボおよびガングリオ型グリカンコア構造を有する一般式に関する。
本発明はさらに、式
式Ｔ１３
［Ｍ］［ＳＡα］ｎＧａｌβ１−４Ｇｌｃ
［式中、ｎおよびｐは独立に０または１の整数であり、
ＭはＧａｌの３もしくは４位に結合したＧａｌα、または
Ｇａｌの４位に結合したＧａｌＮＡｃβ
および／または
Ｇａｌの３位に結合したシアル酸であるＳＡαであり
ＭがＧａｌαである場合、Ｇａｌβ１に結合するシアル酸は存在しない（ｎは０である）］
の、グロボおよびガングリオ型グリカンコア構造を有する一般式に関する。
本発明はさらに、式
式Ｔ１４
Ｇａｌα３／４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ
の、グロボ型グリカンコア構造を有する一般式に関する。
好ましいグロボ型構造としては、Ｇａｌα３／４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、ＧａｌＮＡｃβ３Ｇａｌα３／４Ｇａｌβ４Ｇｌｃ、Ｇａｌα４Ｇａｌβ４Ｇｌｃ（グロボトリオース、Ｇｂ３）、Ｇａｌα３Ｇａｌβ４Ｇｌｃ（イソグロボトリオース）、ＧａｌＮＡｃβ３Ｇａｌα４Ｇａｌβ４Ｇｌｃ（グロボテトラオース、Ｇｂ４（またはＧｌ４））、およびＦｕｃα２Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃβ３Ｇａｌα３／４Ｇａｌβ４Ｇｌｃ等が挙げられる。または、前記結合剤が 未分化胚性もしくは間葉系幹細胞に関して使用されない、もしくは前記結合剤が本発明の他の好ましい結合剤と一緒に使用される場合、好ましい結合剤標的に対する他のグロボ型結合剤として、好ましくはさらにＧａｌβ３ＧａｌＮＡｃβ３Ｇａｌα４Ｇａｌβ４Ｇｌｃ（ＳＳＥＡ−３抗原）および／またはＮｅｕＡｃα３Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃβ３Ｇａｌα４Ｇａｌβ４Ｇｌｃ（ＳＳＥＡ−４抗原）またはその末端の非還元末端二もしくは三糖エピトープ等が挙げられる。
好ましいグロボテトラオシルセラミド（ｇｌｏｂｏｔｅｔｒａｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ）抗体はＧａｌＮＡｃβ３Ｇａｌα４Ｇａｌβ４Ｇｌｃの非還元末端伸長バリアントを認識しない。実施例中の抗体は のような特異性を有する。
本発明はさらに、好ましくは、糖脂質に結合しない場合のＮｅｕＡｃα３Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃ、ＮｅｕＡｃα３Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃβ、ＮｅｕＡｃα３Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃβ３Ｇａｌα４Ｇａｌ；ならびに新規フコシル化標的構造：Ｆｕｃα２Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃβ３Ｇａｌα３／４Ｇａｌ、Ｆｕｃα２Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃβ３Ｇａｌα、Ｆｕｃα２Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃβ３Ｇａｌ、Ｆｕｃα２Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃβ３、およびＦｕｃα２Ｇａｌβ３ＧａＩＮＡｃ；等の、より長いオリゴ糖配列の特異的エピトープのための結合剤に関する。
本発明はさらに、式
式Ｔ１５
［ＧａｌＮＡｃβ４］［ＳＡα］ｎＧａｌβ１−４Ｇｌｃ
［式中、ｎおよびｐは独立に０または１の整数であり
Ｇａｌの４位に結合したＧａｌＮＡｃβ、および／またはＧａｌの３位に結合したシアル酸分岐であるＳＡα］
の、グロボおよびガングリオ型グリカンコア構造を有する一般式に関する。
好ましいガングリオ型構造としては、ＧａｌＮＡｃβ４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、ＧａｌＮＡｃβ４［ＳＡα３］Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、およびＧａｌβ３ＧａｌＮＡｃβ４［ＳＡα３］Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ等が挙げられる。好ましい結合剤標的構造としては、さらに、好ましいオリゴ糖配列の糖脂質および可能な糖タンパク質複合体等が挙げられる。好ましい結合剤は好ましくは少なくとも二および三糖エピトープを特異的に認識する
ＧａｌＮＡｃα構造
本発明はさらに、式Ｔ１６：［ＳＡα６］ｍＧａｌＮＡｃα［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］ｎ−［Ｐｅｐｔｉｄｅ］ｐ
［式中、ｍ、ｎおよびｐは独立に０または１の整数であり、
式中、ＳＡは好ましくはＮｅｕＡｃであるシアル酸であり、Ｓｅｒ／Ｔｈｒはセリンまたはスレオニン残基を表す］
のペプチド／タンパク質結合ＧａｌＮＡｃα構造の識別に関する。Ｐｅｐｔｉｄｅは結合残基に近いペプチド配列の部分を表し、ただしｍまたはｎのいずれかは１である。
Ｓｅｒ／Ｔｈｒおよび／またはＰｅｐｔｉｄｅは、任意に、少なくとも部分的に、結合剤による結合のための認識に必要である。Ｐｅｐｔｉｄｅが特異性に含まれる場合、抗体はタンパク質構造の一部を伴う高い特異性を有すると考えられる。シアリル−Ｔｎの好ましい抗原配列：ＳＡα６ＧａｌＮＡｃα、ＳＡα６ＧａｌＮＡｃαＳｅｒ／Ｔｈｒ、およびＳＡα６ＧａｌＮＡｃαＳｅｒ／Ｔｈｒ−Ｐｅｐｔｉｄｅ、ならびにＴｎ−抗原：ＧａｌＮＡｃαＳｅｒ／Ｔｈｒ、およびＧａｌＮＡｃαＳｅｒ／Ｔｈｒ−Ｐｅｐｔｉｄｅ。本発明はさらに、ＧａｌＮＡｃα構造の組み合わせ、ならびに少なくとも１個のＧａｌＮＡｃα構造と他の好ましい構造との組み合わせの使用に関する。
好ましい結合基の組み合わせ
本発明は特に、少なくとも、ａ）フコシル化、好ましくはα２／３／４フコシル化構造、および／またはｂ）グロボ型構造、および／またはｃ）ＧａｌＮＡｃα型構造の組み合わせにおける使用に関する。異なる生合成を伴い、そのため幹細胞集団に対して特徴的な結合プロファイルを有する構造を認識する結合剤の組み合わせの使用が考えられる。より好ましくは、フコシル化構造およびグロボ構造、またはフコシル化構造およびＧａｌＮＡｃα型構造のための少なくとも１種の結合剤が用いられ、最も好ましくはフコシル化構造およびグロボ構造のためのものが用いられる。
フコシル化および非修飾構造
本発明はさらに、コア二糖エピトープ構造であって該構造がシアル酸により修飾されていないものに関する（式Ｔ１〜Ｔ３のＲ基または式Ｔ４〜Ｔ７のＭもしくはＮがいずれもシアル酸ではない）。
本発明は好ましい一態様において、少なくとも１個の本発明のフコース残基を有する構造に関する。これらの構造は新規特異的フコシル化末端エピトープであり、本発明の幹細胞の分析に有用である。好ましくは天然幹細胞が分析される。
好ましいフコシル化構造としては、（ＳＡα３）０または１Ｇａｌβ３／４（Ｆｕｃα４／３）ＧｌｃＮＡｃ、例えばＬｅｗｉｓ ｘおよびそのシアル化バリアント等の、ヒト幹細胞の新規α３／４フコシル化マーカーなどが挙げられる。
末端Ｆｕｃα１−２を有する構造の中で、本発明はＦｕｃα２Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃα／βおよびＦｕｃα２Ｇａｌβ３（Ｆｕｃα４）０または１ＧｌｃＮＡｃβを有する特に有用な新規マーカー構造を明らかにし、これらは胚幹細胞の研究に有用であることが見出された。この群の中で特に好ましい抗体／結合剤群はＦｕｃα２Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβに特異的な抗体であり、高い幹細胞特異性のために好ましい。他の好ましい構造群としては、特異的構造群を形成することが明らかな糖脂質を有するＦｕｃα２Ｇａｌ等が挙げられ、特に興味深い構造はグロボ−Ｈ型構造および末端Ｆｕｃα２Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃβを有する糖脂質であり、初期の推測される幹細胞マーカーと興味深い生合成上の関連を有するため好ましい。
Ｆｕｃα２Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβを認識する抗体の中で、結合における実質的な相違は担体構造に基づくものであるらしいことが明らかになった。本発明は特に、この種類の構造を認識する抗体に関するものであって、該抗体の特異性が実施例１４にフコース認識抗体とともに示す胚幹細胞に結合するものと類似している場合のものに関する。本発明は好ましくは、末端エピトープ表２８中に共通構造型として示されるＮ−グリカン上のＦｕｃα２Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβを認識する抗体に関する。別の一態様において、非結合クローンの抗体はフィーダー細胞の認識を対象とする。
好ましい非修飾構造としては、Ｇａｌβ４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβ、Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃβ／α、およびＧａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ等が挙げられる。これらは各種幹細胞に特徴的な好ましい新規コアマーカーである。構造Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃは特にｈＥＳＣ細胞において観察できる新規マーカーとして好ましい。好ましくは該構造を本発明の糖脂質コア構造が有しており、またはそれはＯ−グリカン上に存在する。非修飾マーカーは、細胞状態の分析のための少なくとも１種のフコシル化または／およびシアル化構造との組み合わせにおける使用において好ましい。
さらなる好ましい非修飾構造としては、ＧａｌＮＡｃβ構造等が挙げられ、末端ＬａｃｄｉＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃ、好ましくはＮ−グリカン上、およびグロボ系列糖脂質内にグロボテトラオース構造の末端として存在するＧａｌＮＡｃβ３ＧａｌＧａｌＮＡｃβ３Ｇａｌ等が挙げられる。
これらのうち、Ｇａｌ（ＮＡｃ）β３含有Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβ、Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃβ／α、およびＧａｌＮＡｃβ３ＧａｌＧａｌＮＡｃβ３Ｇａｌの特徴的亜群、ならびにＧａｌ（ＮＡｃ）β４含有Ｇａｌβ４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、およびＧａｌβ４ＧｌｃＮＡｃの特徴的亜群が別々に好ましい。
好ましいシアル化構造
好ましいシアル化構造としては、特徴的ＳＡα３Ｇａｌβ構造であるＳＡα３Ｇａｌβ４Ｇｌｃ、ＳＡα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ、ＳＡα３Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃ、ＳＡα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、ＳＡα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβ、ＳＡα３Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃβ／α、およびＳＡα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ；ならびに生合成的に部分的に競合するＳＡα６Ｇａｌβ構造であるＳＡα６Ｇａｌβ４Ｇｌｃ、ＳＡα６Ｇａｌβ４Ｇｌｃβ；ＳＡα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、およびＳＡα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ；ならびにジシアロ構造であるＳＡα３Ｇａｌβ３（ＳＡα６）ＧａｌＮＡｃβ／α等が挙げられる。
本発明は好ましくは、Ｇａｌ（ＮＡｃ）β３含有ＳＡα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ、ＳＡα３Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃ、ＳＡα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、ＳＡα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβ、ＳＡα３Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃβ／α、およびＳＡα３Ｇａｌβ３（ＳＡα６）ＧａｌＮＡｃβ／αの特異的亜群、ならびにＧａｌ（ＮＡｃ）β４含有シアル化構造に関する。ＳＡα３Ｇａｌβ４Ｇｌｃ、およびＳＡα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ；およびＳＡα６Ｇａｌβ４Ｇｌｃ、ＳＡα６Ｇａｌβ４Ｇｌｃβ；ＳＡα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃおよびＳＡα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ
これらは各種幹細胞に対して特徴的な好ましい新規調節マーカー（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｍａｒｋｅｒ）である。
末端ＭａｎαＭａｎα構造との併用
末端非修飾または修飾エピトープは好ましい態様において少なくとも１種のＭａｎαＭａｎ構造と併用される。これは、該構造が他のエピトープとは異なるＮ−グリカンまたはグリカン亜群中に存在するため好ましい。
造血幹細胞のための好ましい構造群
本発明は、特に胚性および成体幹細胞のための、新規マーカーおよび標的構造ならびにこれらに対する結合剤を提供するものであり、これらの細胞は造血幹細胞ではない。造血ＣＤ３４＋細胞から、ＮｅｕＮＡｃα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ（Ｍａｇｎａｎｉ Ｊ．ＵＳ６３６２０１０）等の末端シアル化２型Ｎ−アセチルラクトサミンなどの特定の末端構造が示唆されており、Ｓｌｅｘ型構造ＮｅｕＮＡｃα３Ｇａｌβ４（Ｆｕｃα３）ＧｌｃＮＡｃ（Ｘｉａ Ｌ ｅｔ ａｌ Ｂｌｏｏｄ（２００４）１０４（１０）３０９１−６）の低発現に対する徴候が存在する。本発明は、特異的な特徴的Ｏ−グリカンおよびＮ−グリカンとは別に、ＮｅｕＮＡｃα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ非ポリラクトサミンバリアントにも関する。本発明はさらに、本発明によるＣＤ１３３＋細胞に対する新規マーカーおよび新規造血幹細胞マーカーを提供し、特に前記構造はＮｅｕＮＡｃα３Ｇａｌβ４（Ｆｕｃα３）０−１ＧｌｃＮＡｃを含まない。好ましくは前記造血幹細胞構造は本発明による非シアル化、フコシル化構造Ｇａｌβ１−３構造、およびより好ましくは１型Ｎ−アセチルラクトサミン構造Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ、または別に好ましいＧａｌβ３ＧａｌＮＡｃを基盤とした構造である。
末端エピトープのコア構造
前記標的エピトープ構造は、特異的Ｎ−グリカン、Ｏ−グリカン上で、または糖脂質コア構造上で、最も効果的に認識されると考えられる。
伸長エピトープ−エピトープの還元末端上の隣接する単糖／構造
本発明は特に、最適化された結合剤およびその生産に関するものであり、該結合剤の結合エピトープは隣接する結合構造、および、より好ましくは標的エピトープの還元側上に隣接する構造（Ｏ−グリカンについては単糖もしくはアミノ酸、または糖脂質についてはセラミド）の少なくとも一部を含む。本発明は実施例に示すような、および表２８にまとめたもののような末端エピトープのためのコア構造を明らかにした。
より長い結合エピトープを有する抗体はより高い特異性を有しており、そのため所望の細胞または細胞由来成分をより効果的に認識すると考えられる。好ましい一態様において、伸長したエピトープに対する前記抗体が胚性幹細胞の効果的な分析のために選択される。
本発明は特に、抗体の選択の方法、および任意に、さらに、本発明の伸長エピトープを用いた、新規抗体または他の結合剤の精製の方法に関する。好ましい選択はグリカン構造（特異的配列を有する、合成、または分離された天然のグリカン）を血清または抗体またはファージディスプレイライブラリー等の抗体ライブラリーに接触させることにより行われる。これらの方法に関するデータは当業者に周知であり、例えばｐｕｂｍｅｄ−医学文献データベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ）、または特許、例えばｅｓｐａｃｅｎｅｔ（ｆｉ．ｅｓｐａｃｅｎｅｔ．ｃｏｍ）を検索することによりインターネットから入手できる。特異的抗体は、実施例に示すような、および表２８にまとめたもののようなグリカン型特異的末端構造の最適化された認識の使用に対して特に好ましい。
本発明の実施例に示す抗体の一部は、伸長エピトープに対する特異性を有するとさらに考えられる。本願発明者らは、例えばＬｅｗｉｓ ｘエピトープはＮ−グリカン上において、特定の末端Ｌｅｗｉｓ ｘ特異的抗体により認識され得るが、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミンまたはネオラクト系列糖脂質上に存在するＬｅｗｉｓ ｘβ１−３Ｇａｌを認識する抗体によってはそれほど効果的には、あるいは全く、認識されないことを発見した。
Ｎ−グリカン
本発明は特に、二分岐Ｎ−グリカン上の末端Ｎ−グリカンエピトープの識別に関する。Ｎ−グリカンのための好ましい非還元末端単糖エピトープとしてはβ２Ｍａｎおよびその還元末端がさらに伸長したバリアント
β２Ｍａｎ、β２Ｍａｎα、β２Ｍａｎα３、およびβ２Ｍａｎα６
等が挙げられる。
本発明は特に、Ａｊｉｔ Ｖａｒｋｉほか Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ （２００６） Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ｓｏｃｉｅｔｙ ｍｅｅｔｉｎｇ ２００６ Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓの要旨に本発明によるこの種類の抗体と関連しない（放棄される）神経細胞に関与する可能性とともに記載されたＮ−グリカンＬｅｗｉｓ ｘ特異的抗体による、Ｎ−グリカン上のｌｅｗｉｓ ｘの識別に関する。
発明はさらに、Ｏｚａｗａ Ｈ ｅｔ ａｌ（１９９７）Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３４２，４８−５７に記載される、２型Ｎ−アセチルラクトサミンβ２Ｍａｎを認識する、二分岐Ｎ−グリカンを対象とする抗体の特異性を有する抗体に関する。
Ｏ−グリカン、還元末端伸長エピトープ
本発明は特に、末端コアＩエピトープとしての、ならびにコアＩおよびコアＩＩ Ｏ−グリカンの伸長バリアントとしての、末端Ｏ−グリカンエピトープの識別に関する。Ｏ−グリカンのための好ましい非還元末端単糖エピトープとしては：
ａ）αＳｅｒ／Ｔｈｒ−［Ｐｅｐｔｉｄｅ］０−１に結合したコアＩエピトープ［式中、Ｐｅｐｔｉｄｅは存在するまたは存在しないペプチドを表す］
本発明は好ましくは
ｂ）好ましいコアＩＩ型エピトープ
Ｒ１β６［Ｒ２β３Ｇａｌβ３］ｎＧａｌＮＡｃαＳｅｒ／Ｔｈｒ
［式中、ｎは＝または１であって、該構造の有りうる分岐を表し、Ｒ１およびＲ２は末端エピトープの好ましい位置であり、Ｒ１がより好ましい］
ｃ）伸長コアＩエピトープ
［β３Ｇａｌおよびその還元末端がさらに伸長したバリアントβ３Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃα、β３Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃαＳｅｒ／Ｔｈｒ］
等が挙げられる。
Ｏ−グリカンコアＩ特異的およびガングリオ／グロボ型コア還元末端エピトープが、Ｓａｉｔｏ Ｓ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９９４）２６９、５６４４−５２において記載されており、本発明は好ましくは本発明のエピトープの同様な特異的認識に関する。
Ｏ−グリカンコアＩＩシアリル−Ｌｅｗｉｓ ｘ特異的抗体がＷａｌｃｈｅｃｋ Ｂ ｅｔ ａｌ． Ｂｌｏｏｄ （２００２） ９９， ４０６３−６９に記載されている。
Ｏ−グリカンの識別のためのペプチド特異性を有する抗体としては、さらにＧａｌＮＡｃアルファ（Ｔｎ）またはＧａｌｂ３ＧａｌＮＡｃアルファ（Ｔ／ＴＦ）構造を認識するムチン特異的抗体（Ｈａｎｉｓｃｈ Ｆ−Ｇ ｅｔ ａｌ （１９９５） ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５５、４０３６−４０； Ｋａｒｓｔｅｎ Ｕ ｅｔ ａｌ． Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ （２００４） １４， ６８１−９２）等が挙げられる。
糖脂質コア構造
本発明はさらに、脂質構造上の構造の識別に関する。好ましい脂質コア構造としては、
ａ）Ｇａｌβ４Ｇｌｃに対するβＣｅｒ（セラミド）およびそのフコシルまたはシアリル誘導体
ｂ）ラクトシルＣｅｒ−糖脂質上のＩ型およびＩＩ型Ｎ−アセチルラクトサミンに対するβ３／６Ｇａｌであって、好ましい伸長バリアントとしてβ３／６［Ｒβ６／３］ｎＧａｌβ、β３／６［Ｒβ６／３］ｎＧａｌβ４およびβ３／６［Ｒβ６／３］ｎＧａｌβ４Ｇｌｃが挙げられ、これはさらに、部分的により大きなエピトープとして認識され得る他のラクトサミン残基により分岐していてよく、ｎは０または１であって分岐を表し、Ｒ１およびＲ２は末端エピトープの好ましい位置である。好ましい直鎖（非分岐）共通構造としてはβ３Ｇａｌ、β３Ｇａｌβ、β３Ｇａｌβ４およびβ３Ｇａｌβ４Ｇｌｃ等が挙げられる
ｃ）グロボ系列エピトープに対するα３／４Ｇａｌ、および伸長バリアントα３／４Ｇａｌβ、α３／４Ｇａｌβ４Ｇｌｃであって、好ましいグロボエピトープは伸長エピトープα４Ｇａｌ、α４Ｇａｌβ、α４Ｇａｌβ４Ｇｌｃを有し、好ましいイソグロボエピトープは伸長エピトープα３Ｇａｌ、α３Ｇａｌβ、α３Ｇａｌβ４Ｇｌｃを有する
ｄ）ガングリオ系列エピトープ含有に対するβ４Ｇａｌであって、好ましい伸長バリアントとしてβ４Ｇａｌβ、およびβ４Ｇａｌβ４Ｇｌｃが挙げられる
等が挙げられる。
Ｏ−グリカンコア特異的およびガングリオ／グロボ型コア還元末端エピトープが、Ｓａｉｔｏ Ｓ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９９４）２６９、５６４４−５２に記載されており、本発明は好ましくは本発明のエピトープの同様な特異的認識に関する。
ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン
Ｏ−グリカン、Ｎ−グリカン、または糖脂質上のポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン主鎖構造はＩ型（ラクト系列）およびＩＩ型（ネオラクト）糖脂質上のラクトシル（ｃｅｒ）コア構造に類似した特徴的構造を有するが、末端エピトープは他のＩ型またはＩＩ型Ｎ−アセチルラクトサミンに結合しており、これは分岐構造からのものでありうる。好ましい伸長エピトープとしては：
Ｉ型およびＩＩ型Ｎ−アセチルラクトサミンエピトープに対するβ３／６Ｇａｌ等が挙げられ、好ましい伸長バリアントとしてＲ１β３／６［Ｒ２β６／３］ｎＧａｌβ、Ｒ１β３／６［Ｒ２β６／３］ｎＧａｌβ３／４およびＲ１β３／６［Ｒ２β６／３］ｎＧａｌβ３／４ＧｌｃＮＡｃ等が挙げられ、これはさらに、部分的により大きなエピトープとして認識され得る他のラクトサミン残基により分岐していてよく、ｎは０または１であって分岐を表し、Ｒ１およびＲ２は末端エピトープの好ましい位置である。好ましい直鎖（非分岐）共通構造としてはβ３Ｇａｌ、β３Ｇａｌβ、β３Ｇａｌβ４およびβ３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ等が挙げられる。
数多くの抗体が直鎖（ｉ−抗原）および分岐ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｉ−抗原）に対して知られており、本発明はさらに、Ｉ−抗原の識別のためのレクチンＰＷＡの使用に関する。本願発明者らは、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミンが特定の型のヒト幹細胞に対して特徴的な構造であることを明らかにした。他の好ましい結合試薬、酵素エンド−ベータ−ガラクトシダーゼを用いて幹細胞の糖脂質上および糖タンパク質上のポリ−Ｎ−アセチルラクトサミンの分析を行った。この酵素はさらに、特定の型の幹細胞上の、本発明のフコシル化および／またはシアル化等の特異的末端修飾を有する直鎖および分岐鎖両者のポリ−Ｎ−アセチルラクトサミンの特徴的発現を明らかにした。
伸長コアエピトープの組み合わせ
同一の末端エピトープが主要な担体型であるＯ−グリカン、Ｎ−グリカンおよび糖脂質の２種または３種上に存在する標的構造に結合する抗体に認識される場合、より強い標識が得られうると考えられる。さらに、このような使用に関して、末端エピトープは、有りうる混入細胞または混入細胞材料上に存在するエピトープと比べて十分に特異的である必要があると考えられる。さらに、高度に末端特異的な（ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体が存在し、これはいくつかの伸長構造上への結合を可能にすると考えられる。
本発明は、幹細胞に関して有用なそれぞれの伸長結合剤型（ｅｌｏｎｇａｔｅｄ ｂｉｎｄｅｒ ｔｙｐｅ）を明らかにした。従って本発明は、１または複数種の本発明の伸長構造上の末端構造を認識する結合剤に関する。
単糖伸長構造の好ましい群
本発明は伸長特異性（ｅｌｏｎｇａｔｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を有する結合剤の使用に関するものであり、該結合剤は式
ＡｘＨｅｘ（ＮＡｃ）ｎ
［式中、Ａはアノマー構造アルファまたはベータであり、Ｘは結合位置２、３、４または６であり、
ならびに、Ｈｅｘはヘキソピラノシル残基Ｇａｌ、またはＭａｎであり、ｎは０または１の整数であり、ｎが１である場合、ＡｘＨｅｘＮＡｃはβ４ＧａｌＮＡｃまたはβ６ＧａｌＮＡｃであり、ＨｅｘがＭａｎである場合、ＡｘＨｅｘはβ２Ｍａｎであり、および、ＨｅｘがＧａｌである場合、ＡｘＨｅｘはβ３Ｇａｌまたはβ６Ｇａｌである］
の少なくとも１種の還元末端伸長単糖エピトープを認識するか、またはそこに結合することができる。
単糖伸長構造以外に、αＳｅｒ／Ｔｈｒが還元末端ＧａｌＮＡｃ含有Ｏ−グリカンのための好ましい還元末端伸長構造であり、βＣｅｒがラクトシル含有糖脂質エピトープのために好ましい。
伸長構造の好ましい亜群としては、ｉ）Ｏ−グリカン、ポリラクトサミンおよび糖脂質コア上に存在する類似する構造エピトープ：β３／６Ｇａｌまたはβ６ＧａｌＮＡｃ；好ましいさらなる亜群は、ｉａ）β６ＧａｌＮＡｃ／β６Ｇａｌ、およびｉｂ）β３Ｇａｌ；ｉｉ）Ｎ−グリカン型エピトープβ２Ｍａｎ；ならびにｉｉｉ）グロボ系列エピトープα３Ｇａｌまたはα４Ｇａｌ等が挙げられる。前記の群は、群内の有り得る交差反応における構造的類似性のために好ましく、背景となる材料が伸長構造型を欠くように制御されている場合に標識強度を高めるために用いることができる。
有用な結合剤特異性を有するレクチンおよび伸長抗体エピトープは、Ｄｅｂａｒａｙ ａｎｄ Ｍｏｎｔｒｅｕｉｌ（１９９１） Ａｄｖ．Ｌｅｃｔｉｎ Ｒｅｓ ４、５１−９６； “Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ” Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ（２００１） ４９１（ｅｄ Ａｌｂｅｒｔ Ｍ Ｗｕ） Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； “Ｌｅｃｔｉｎｓ” ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００３）（ｅｄｓ Ｓｈａｒｏｎ、Ｎａｔｈａｎ ａｎｄ Ｌｉｓ、Ｈａｌｉｎａ） Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ、Ｔｈｅ Ｎｅａｔｈｅｒｌａｎｄｓ等の総説およびモノグラフ、および、ｐｕｂｍｅｄ／ｅｓｐａｃｅｎｅｔ等のインターネットデータベース、またはｗｗｗ．ｇｌｖｃｏ．ｉｓ．ｒｉｔｓｕｍｅｉ．ａｃ．ｊｐ／ｅｐｉｔｏｐｅ／等のモノクローナル抗体グリカン特異性を列挙した抗体データベースから入手可能である。
好ましい結合剤分子
本発明は、本発明の細胞、より具体的には本発明の好ましい細胞群および細胞型の分析に有用な各種の型の結合剤分子を明らかにした。好ましい結合剤分子は、細胞表面の炭水化物上の特異的な構造または構造的特徴に関する結合特異性に基づいて分類される。好ましい結合剤は特異的に複数の単糖残基を認識する。
現在の結合剤分子のほとんど、例えば植物レクチンの全てまたはほとんどは、その特異性において最適ではなく、通常、各種結合を有する１種または数種の単糖を大まかに認識すると考えられる。さらに、該レクチンの特異性は、通常、ヒト型の数種のグリカンによって十分に分析されていない。
好ましい高特異性結合剤は、
Ａ）少なくとも１種の単糖残基、およびそれらと他の単糖隣接単糖残基（ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｎｅｘｔ ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｒｅｓｉｄｕｅ）との間の特異的結合構造を認識し、ＭＳ１Ｂ１結合剤と称される、
Ｂ）より好ましくは少なくとも第２の単糖残基の一部を認識し、ＭＳ２Ｂ１結合剤と称される、
Ｃ）さらに好ましくは第２の結合構造および／または第３の単糖残基の少なくとも一部を認識し、ＭＳ３Ｂ２結合剤と称され、好ましくはＭＳ３Ｂ２は特異的な完全な三糖構造を認識する、
Ｄ）最も好ましくは前記結合構造は３個の結合構造を有する四糖を少なくとも部分的に認識し、ＭＳ４Ｂ３と称され、好ましくは該結合剤は完全な四糖配列を認識する。
好ましい結合剤としては、天然のヒトおよび／または動物の、またはグリカンの特異的識別のために開発された他のタンパク質等が挙げられる。好ましい高特異性結合剤タンパク質は特異的抗体、好ましくはモノクローナル抗体；レクチン、好ましくは哺乳動物または動物レクチン；または、特異的糖転移酵素、より好ましくはグリコシダーゼ型酵素、グリコシルトランスフェラーゼもしくはトランスグリコシル化酵素である。
結合剤による細胞の調節
本発明は細胞型と関連する特異的結合剤を細胞の調節に用いることができることを明らかにした。好ましい一態様においては、（幹）細胞が炭水化物媒介相互作用に関して調節される。本発明は、グリカンの構造を変え、それにより受容体の構造および該グリカンの機能を変える特異的結合剤を明らかにした。これらは特にグリコシダーゼ、ならびにグリコシルトランスフェラーゼおよび／またはトランスグリコシル化酵素等の糖転移酵素である。非酵素結合剤の結合それ自体が細胞を選択および／または操作するとさらに考えられる。操作は典型的には、グリカン受容体のクラスタリング；またはグリカン受容体の、細胞と関連する生物学的系またはモデルに存在するレクチン等のカウンターレセプターとの相互作用の影響に依存する。本発明はさらに、細胞培養における結合剤による調節は細胞の増殖速度に関する効果を有することを明らかにした。
幹細胞の調節
幹細胞の好ましい調節は次を含む
１）次の調節型のうちの１つまたはいくつかを含む細胞の状態の調節
１．１．幹細胞の未分化状態の支持
１．２．幹細胞の生物学状態、例えば
１．２．１．形態学的状態
および／または
１．２．２．細胞の分化関連状態
の変化
１．３．細胞の接着状態の変化、例えば
１．３．１．均質な細胞集団の接着の変化
または
１．３．２．不均質な細胞集団の接着状態の変化
前記調節は、幹細胞の量を増加させることを目的とする場合に、幹細胞の未分化状態を維持するのに有用である。
前記の生物学的細胞状態の変化は、有用な幹細胞由来細胞調製物の産生、および幹細胞の研究のための新規細胞集団の検証、および幹細胞集団の最適化のために有用である。
本方法は特に、幹細胞の形態学的状態に影響をあたえるのに有用である。本発明は細胞表面に作用し、従って形態学的な細胞状態を変えるのに有用な、新規の特異的結合分子を提供する。細胞表面分子およびそれらの細胞外接触（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｎｔａｃｔｓ）は形態を制御することから、本発明は特に、形態の変化に有用な、ポリバレントに示された結合剤分子を提供する。幹細胞の各種形態学的状態は、分化状態の潜在的な変化を反映すると考えられる。従って、各種形態学的状態の幹細胞調製物を生成することは、各種の有用な分化した形態の幹細胞を探索するために有用である。
幹細胞の接着状態を変えることはさらに有用であると考えられる。均質な細胞集団の接着状態の変化は有用であり、本発明の好ましい態様において、特に固体表面上のポリバレントな複合体によって形態細胞に影響を与えるために用いられる。増加した接着性は、細胞を固定し、これらを層として増殖させるために有用である。
不均質な細胞集団の接着状態の変化は、接着性および非接着性細胞集団を分離するために有用である。細胞培養は、好ましい方法において、接着性および／または非接着性細胞集団を支持するように行われ、より好ましくは細胞培養条件は接着性細胞集団を支持するように選択される。
２）幹細胞の増殖速度の変化
２．１．幹細胞の増殖速度の増加
または
２．２．幹細胞の増殖速度の減少
細胞の増殖を増加させると、特定の期間内により多くの細胞が産生され得ると考えられる。これは方法の費用対効果を高め、試薬およびエネルギーの節約を可能にする。
増殖速度の減少のための方法は、生きた細胞を特定の生物学的および／または科学的利用のために準備のできた状態に維持するのに有用である。本発明の好ましい一態様において、この維持はさらに細胞の生物学的または接着状態を維持するか、または変化させるためのものである。
調節は、好ましい細胞集団を得るための、１）細胞の状態の調節、および２）細胞の増殖速度の変化、の両者を含み得る。
本発明は、レクチンおよび結合剤が特に幹細胞の培養に有用であることを明らかにした。
レクチンの標的構造特異性は共通のエピトープを共有しており、レクチンは異なる構造も結合し得るが、その特異性に相同な一般構造テーマが存在すると考えられる。
本発明は末端Ｇａｌ、ＧａｌＮＡｃ、Ｆｕｃ、ＧｌｃＮＡｃ Ｍａｎを認識する結合剤、好ましくは末端Ｇａｌβ、ＧａｌＮＡｃβ、ＧｌｃＮＡｃβを認識する結合剤を明らかにしたものであり、または
１）式Ｈｅｘ（ＮＡｃ）ｎのβ結合Ｄ−ヘキソピラノシドであって、式中、ｎは０または１であり、ＨｅｘはＧａｌまたはＧｌｃであり、ただしｎが１である場合、ＨｅｘはＧｌｃである場合：末端Ｇａｌβ、ＧａｌＮＡｃβ、ＧｌｃＮＡｃβを含むもの、ならびに
２）α結合ピラノシド残基Ｍａｎα Ｆｕｃα、ｏρ シアル酸α、好ましくはＮｅｕ５ＡｃまたはＮｅｕ５Ｇｃ、Ｍａｎα、およびＦｕｃα含有グリカン構造が幹細胞の増殖の調節のために有用である。
レクチンの標的構造特異性はＩＩ型、Ｎ−アセチルラクトサミン構造含有コアエピトープＧｌｃ／Ｇａｌ（ＮＡｃ）０または１β４ＧｌｃＮＡｃと関連する共通の構造的特徴を共有し、ここで還元末端ＧｌｃＮＡｃはＦｕｃ残基により誘導体化されることができ、非還元末端残基はさらに好ましくはシアル酸またはＮ−グリカンコアオリゴ糖により伸長され得る。
本発明は特に、式ＣＣ０
［ＳＡ］ｐＨｅｘ（ＮＡｃ）ｎβ４［ＦｕｃαＸ］ｍＧｌｃＮＡｃβＲ、
［式中、ｎ、ｍ、およびｐは独立に０または１であり
Ｘは３または６のいずれかの結合位置であり、
ＨｅｘはＧａｌまたはＧｌｃであり
ＳＡは伸長する単−またはオリゴ糖構造、
好ましくはシアル酸であり、これは好ましくはＳＡα３、もしくはＳＡα６であって、好ましいシアル酸型はＮｅｕ５ＡｃまたはＮｅｕ５Ｇｃであり、
または、Ｎ−グリカンコア構造Ｍａｎα３［Ｍａｎα６］Ｍａｎβ４であって、ここでＭａｎα残基はさらに１つまたはいくつかのＧｌｃＮＡｃβ２またはＬａｃＮＡｃβ２等の複合型末端構造により伸長されていてよく、
Ｒは任意の伸長単糖残基構造であって、好ましくはＮ−アセチルラクトサミンの／ラクトシル−セラミド等の糖脂質の／Ｏ−グリカンの／３／６Ｇａｌ（ＮＡｃ）、またはＮ−グリカンの２Ｍａｎ、または、Ｈｅｘ（ＮＡｃ）がＧｌｃＮＡｃである場合の潜在的な結合コアタンパク質／ペプチドを表すＡｓｎ−（ペプチド）０または１であり、
ただし、ｍが１であり、Ｘが６である場合、ｎは１であり、およびＨｅｘはＧｌｃであり、およびＳＡはＮ−グリカンコア構造Ｍａｎα３［Ｍａｎα６］Ｍａｎβまたはその伸長バリアントであり、
ｎが１であり、ＨｅｘがＧａｌである場合、ｐは０である］
の少なくとも１つの構造を認識する結合剤に関する。
好ましい標的構造は
Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、Ｆｕｃα２Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ ＧａｌＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃ、およびＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ＧｌｃＮＡｃ
である。
標的構造を認識する最も好ましい結合剤レクチンは、Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃを認識するＥＣＡ、ＰＷＡ、およびＷＦＡ（より弱い結合）、Ｎｅｕ５Ａｃα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃを特に認識するＭＡＡ、Ｎｅｕ５Ａｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃを認識するＳＮＡ、ＧａｌＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃを認識するＷＦＡ、Ｆｕｃα２Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃを認識するＵＥＡ、Ｇａｌβ４（Ｆｕｃα３）ＧｌｃＮＡｃを認識するＬＴＡ、およびＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ＧｌｃＮＡｃ構造を認識するＰＳＡである。
本発明はさらに、短縮された末端エピトープＧｌｃＮＡｃβまたはＭａｎαを認識する植物レクチン群、好ましくはＧＳＡＩＩもしくはＮＰＡ、または同様な特異性を有する他のレクチンに関する。
本発明は特に、式ＣＣ１
［ＳＡ］ｐＨｅｘ（ＮＡｃ）ｎβ４［Ｆｕｃα６］ｍＧｌｃＮＡｃβＲ
［式中、ｎ、ｍ、およびｐは独立に０または１であり
ＨｅｘはＧａｌまたはＧｌｃであり
ＳＡは伸長する単−またはオリゴ糖構造、
好ましくはシアル酸であり、これは好ましくはＳＡα３であって、好ましいシアル酸型はＮｅｕ５ＡｃまたはＮｅｕ５Ｇｃであり、
または、Ｎ−グリカンコア構造Ｍａｎα３［Ｍａｎα６］Ｍａｎβ４であって、ここでＭａｎα残基はさらに１つまたはいくつかのＧｌｃＮＡｃβ２またはＬａｃＮＡｃβ２等の複合型末端構造により伸長されていてよく、
Ｒは任意の伸長単糖残基構造であって、好ましくはＮ−アセチルラクトサミンの／ラクトシル−セラミド等の糖脂質の／Ｏ−グリカンの／３／６Ｇａｌ（ＮＡｃ）、またはＮ−グリカンの２Ｍａｎ、または、Ｈｅｘ（ＮＡｃ）がＧｌｃＮＡｃである場合の潜在的な結合コアタンパク質／ペプチドを表すＡｓｎ−（ペプチド）０または１であり、
ただし、ｍが１である場合、ｎは１であり、およびＨｅｘはＧｌｃであり、およびＳＡはＮ−グリカンコア構造Ｍａｎα３［Ｍａｎα６］Ｍａｎβまたはその伸長バリアントであり、
ｎが１であり、ＨｅｘがＧａｌである場合、ｐは０である］
の少なくとも１つの構造を認識する結合剤に関する。
好ましい標的構造は
Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃ、およびＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ＧｌｃＮＡｃ
である。
標的構造を認識する最も好ましい結合剤レクチンは、Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃを認識するＥＣＡ、ＰＷＡ、およびＷＦＡ（より弱い結合）、Ｎｅｕ５Ａｃα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃを特に認識するＭＡＡ、ＧａｌＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃを認識するＷＦＡ、およびＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ＧｌｃＮＡｃ構造を認識するＰＳＡである。
好ましい標的構造亜群は：
式ＣＣ２
［ＳＡ］ｐＧａｌ（ＮＡｃ）ｎβ４ＧｌｃＮＡｃβＲ
［式中、残っており
ｐおよびｎは独立に０または１であり
ＳＡはシアル酸ＳＡα３であり、好ましいシアル酸型はＮｅｕ５ＡｃまたはＮｅｕ５Ｇｃ、より好ましくはＮｅｕ５Ａｃであり、
ｎが１であり、ＨｅｘがＧａｌの場合、ｐは０である］
の構造を含む。
ＣＣ２の好ましい標的構造エピトープは：Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、およびＧａｌＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃを含む。
好ましい標的構造亜群は：
式ＣＣ３
Ｍａｎα３［Ｍａｎα６］Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ＧｌｃＮＡｃβＲ
［式中、Ｍａｎα残基はさらに１つまたはいくつかのＧｌｃＮＡｃβ２、またはＬａｃＮＡｃβ２、またはＬａｃＮＡｃの末端シアル化バリアント、好ましくはＧａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、等の複合型末端構造により伸長されてよく
Ｒは任意にＡｓｎ−（ペプチド）０または１であり、潜在的な結合コアタンパク質／ペプチドを示す］
の構造を含む。
ＣＣ３の好ましい標的構造エピトープは：
ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ＧｌｃＮＡｃβ ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ＧｌｃＮＡｃβＡｓｎ、Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ＧｌｃＮＡｃ、Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ＧｌｃＮＡｃβＲ
Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ＧｌｃＮＡｃβＡｓｎ
Ｍａｎα３［Ｍａｎα６］Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ＧｌｃＮＡｃβ
Ｍａｎα３［ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６］Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ＧｌｃＮＡｃβ
ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３［Ｍａｎα６］Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ＧｌｃＮＡｃβ
ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３［ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６］Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ＧｌｃＮＡｃβ
を含む
幹細胞、特に間葉系幹細胞の増殖率の好ましい効果
表２４に、炭水化物特異性が異なる各種結合剤上の間葉系幹細胞の増殖速度を示す。データは、各種レクチン上でいくつかの細胞を培養することが可能であり、該タンパク質が本実験のプラスチック表面と比較して細胞の増殖速度を調節することを明らかにした。受動的に固定化された形態のレクチンＲＣＡは細胞にある程度の毒性を示す場合があり、本発明は特に、リシン等の細胞毒性レクチンの非毒性のバリアントまたは共有結合的に結合した形態に関する。本発明は、各種条件下での、好ましい一態様においては、実施例におけるように２週間以内等のより短い培養期間の下での、増殖速度の調節に関する。
好ましく増殖を増加させるためのレクチン
最高の増殖速度は、末端Ｎ−アセチルグルコサミン残基に対して特に特異的なＧＳＡＩＩ−レクチンで得られた。好ましい一態様において、本発明はＧＳＡＩＩと類似の特異性を有するレクチンの存在下での幹細胞の培養に関する。この培養法は特に細胞の増殖速度を変化させるものである。好ましくはＧＳＡＩＩと共に増殖させる幹細胞調製物はＧＳＡＩＩに結合するグリカン、より好ましくは末端ＧｌｃＮＡｃ含有グリカン、さらに好ましくは末端ＧｌｃＮＡｃβ含有グリカンを含む。
比較的高い増殖速度が、末端Ｎ−アセチルラクトサミン残基に対して特に特異的なＥＣＡレクチンで得られた。好ましい一態様において、本発明はＥＣＡと類似の特異性を有するレクチンの存在下での幹細胞の培養に関する。この培養法は特に細胞の増殖速度を変化させるものである。好ましくはＥＣＡと共に増殖させる幹細胞調製物はＥＣＡに結合するグリカン、より好ましくは末端Ｎ−アセチルラクトサミン含有グリカン、さらに好ましくは末端Ｎ−アセチルラクトサミンβ含有グリカンを含む。
増加した増殖速度が、末端Ｎ−アセチルラクトサミン残基に対して特に特異的なＰＷＡレクチンで得られた。好ましい一態様において、本発明は、ＰＷＡと類似の特異性を有するレクチンの存在下での幹細胞の培養に関する。この培養法は特に細胞の増殖速度を変化させるものである。好ましくはＰＷＡと共に増殖させる幹細胞調製物はＰＷＡに結合するグリカン、より好ましくは末端Ｎ−アセチルラクトサミン含有グリカン、さらに好ましくは末端Ｎ−アセチルラクトサミンβ含有グリカンを含む。
増殖速度のある程度の増加が、好ましくは末端Ｌｅｗｉｓ ｘ構造内のフコースに対して特に特異的なＬＴＡレクチンで得られた。好ましい一態様において、本発明は、ＬＴＡと類似の特異性を有するレクチンの存在下での幹細胞の培養に関する。この培養法は特に細胞の増殖速度を変化させるものである。好ましくはＬＴＡと共に増殖させる幹細胞調製物はＬＴＡに結合するグリカン、より好ましくはフコース残基含有グリカン、さらに好ましくは末端Ｌｅｗｉｓ ｘのフコースを含有するグリカンを含む。
増殖速度のある程度の増加が、コアフコースおよび／またはマンノース残基、好ましくは複合型Ｎ−グリカンのコアフコースに特に特異的なＰＳＡレクチンでも得られた。好ましい一態様において、本発明はＰＳＡと類似の特異性を有するレクチンの存在下での幹細胞の培養に関する。この培養法は特に細胞の増殖速度を変化させるものである。好ましくはＰＳＡと共に増殖させる幹細胞調製物はＰＳＡに結合するグリカン、より好ましくはコアフコースおよび／またはマンノース残基を含有するグリカン、さらに好ましくは複合型Ｎ−グリカンのフコースを含有するグリカンを含む。
好ましく初期増殖を維持する、または減少させるためのレクチン
本発明は、特異的α６−結合シアル酸であるレクチンＳＮＡレクチンおよび特異的α３−結合シアル酸残基に対して特異的なレクチンＭＡＡと同様の、またはやや減少した増殖活性を有するレクチン表面も明らかにした。好ましい一態様において本発明はＳＮＡまたはＭＡＡと同様な特異性を有するレクチンの存在下での幹細胞の培養に関する。この培養法は特に、細胞の増殖速度および／または本発明による他の好ましい特性を変化させるものである。好ましくはＳＮＡまたはＭＡＡと共に増殖させる幹細胞調製物はそれぞれＳＮＡまたはＭＡＡに結合するグリカン、より好ましくはレクチンＭＡＡに対するα３−結合シアル酸、およびＳＮＡに対するα６−結合シアル酸を含む。好ましい態様においては、末端標的グリカンエピトープを有し、本発明により記載される特異的Ｎ−グリカン、Ｏ−グリカンまたは糖脂質構造を含む幹細胞が選択される。好ましい共通の特異性は式ＳＡα３／６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ［式中、ＳＡはシアル酸、好ましくはＮ−アセチルラクトサミンにα３またはα６−結合するＮｅｕ５Ａｃである］によるものである。
本発明はさらに、マンノース特異的レクチンＮＰＡが、いくらか減少した増殖速度で細胞の増殖を支持することを明らかにした。ＮＰＡレクチンは特にα−結合Ｍａｎ、好ましくはＭａｎα３／６構造に対して特異的である。好ましい一態様において、本発明は、ＮＰＡと類似の特異性を有するレクチンの存在下での幹細胞の培養に関する。この培養法は特に細胞の増殖速度を変化させるものである。好ましくはＮＰＡと共に増殖させる幹細胞調製物はＮＰＡに結合するグリカン、より好ましくはＭａｎα、さらに好ましくはＭａｎα３／６含有グリカンを含む。好ましい態様においては、末端標的グリカンエピトープを有し、本発明により記載される特異的Ｎ−グリカン構造を含む幹細胞が、ＮＰＡとの培養のために選択される。
調製物の幹細胞特性を保つために、培養中に幹細胞の増殖を遅延させることも有用であると考えられる。増殖速度を減少させるための好ましいレクチンとしては、ＧａｌＮＡｃ構造、特にｌａｃｄｉＮａｃＧａｌＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃ、およびＮ−アセチルラクトサミン構造を結合する、ＷＦＡ；Ｎ−アセチルラクトサミン、特に直鎖ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミンを結合する、ＳＴＡ；ならびにフコシル化構造、特にＦｕｃα２Ｇａｌ型構造、例えばＦｕｃα２Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃを結合する、ＵＥＡ等が挙げられる。好ましい一態様において、本発明はＷＦＡ、ＳＴＡまたはＵＥＡと類似の特異性を有するレクチンの存在下での幹細胞の培養に関する。この培養法は特に、細胞の増殖速度および／または本発明による他の好ましい特性を変化、好ましくは減少させるものである。好ましくは、前記レクチンと共に増殖させる幹細胞調製物は、該レクチンの標的グリカン、好ましくは上記のものの１つまたはいくつかを含む。好ましい態様においては、末端標的グリカンエピトープを有し、本発明により記載される特異的Ｎ−グリカン、Ｏ−グリカンまたは糖脂質構造を含む幹細胞が選択される。
本発明は、この特異性を有するレクチンの特異的標的構造群を明らかにしたものであり、還元末端伸長ポリ−Ｎアセチルラクトサミン（ＳＴＡのように）、またはＷＦＡおよびＵＥＡに対する、それぞれＬａｃｄｉＮＡｃおよびＦｕｃα２Ｇａｌ−の２−修飾Ｇａｌ含有構造を含む。本発明は、幹細胞の増殖の調節のためのこれらのＮ−アセチルラクトサミン型特異性を有するレクチンの群に関する。好ましい共通の特異性は式［Ｒ２］ｎＧａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ［β３Ｇａｌβ］ｍ ［式中、ｎおよびｍは０または１であり、Ｒ２はＮ−アセチル基（ＮＡｃ）であり、ガラクトピラノシルの２位の水酸基またはグリコシド結合した２位のＦｕｃα−残基を置換する］によるものである。
細胞に対する他の調節効果
実施例１０に、より長い培養実験における細胞培養の効果をさらに記載する。細胞は恐らく、プラスチックまたは他の種類の表面と比較して、ＭＡＡおよびＥＣＡ上で最も効果的に増殖した。全てのウェルが１週間以内にコンフルエントになった。ＷＦＡおよびＰＷＡ上で培養した細胞は５週間の期間中にその増殖能力を失うようであり、ＷＦＡコーティング上ではいくらかの形態学的に異なる細胞が存在していた。レクチンＭＡＡおよびＥＣＡは特に、長期増殖効果のために好ましい。レクチンＷＦＡは細胞の形態に影響を与えるために好ましい。
細胞形態および接着効果。本発明は特に、レクチン等の結合剤による細胞の形態および／または接着強度の変化に関する。形態学的に、ＰＳＡコーティング上で増殖させた細胞は、網状単層を形成する様式において他とは異なった。ＭＡＡおよびＰＳＡ上の細胞はまた、より強固に表面に接着しており、トリプシンによるそれらの剥離は不可能であり、それらの細胞は機械的に掻き取る必要があった。ＰＳＡレクチン、および特にフコースおよび／またはマンノース構造に関して同様な特異性を有するレクチンは、細胞の形態に影響を与える活性、および／または、増加した結合、好ましくはプロテアーゼ耐性結合をもたらすその活性のために好ましい。ＭＡＡレクチン、および特にα３−結合シアル酸構造に関して同様な特異性を有するレクチンは、増加した結合、好ましくはプロテアーゼ耐性結合をもたらすその活性のために好ましい。
好ましい結合剤の組み合わせ
本発明は、細胞の状態の分析のための、特異的末端構造の有用な組み合わせを明らかにした。好ましい一態様において、本発明は、本発明の２種の異なる末端構造の水準を、好ましくは特異的結合分子により、好ましくは少なくとも２種の異なる結合剤により、測定することに関する。好ましい一態様において、該結合分子は、末端受容体グリカン構造の修飾を示す構造を対象とし、好ましくは該構造は連続的な（基質構造およびその修飾、例えば末端Ｇａｌ構造および対応するシアル化構造）または競合的な生合成段階（例えば、末端Ｇａｌβ、または末端Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌβ４ＧｌｃＮＡｃの、フコシル化およびシアル化）を示す。他の態様において、前記結合剤は連続的または競合的な段階、例えば末端Ｇａｌ構造および対応するシアル化構造、および対応するシアル化構造を示す３種の異なる構造を対象とする。
本発明はさらに、本発明の非修飾（非シアル化または非フコシル化）Ｇａｌ（ＮＡｃ）β３／４−コア構造、本発明の好ましいフコシル化構造および好ましいシアル化構造の群から選択される本発明の少なくとも２種の異なる構造の識別に関する。さらに、好ましくは、好ましい一構造群内に含まれる、３種、より好ましくは４種、およびさらに好ましくは５種の、異なる構造を識別することが有用であると考えられる。
特異的結合剤の標的構造、および結合分子の例
末端構造の、特異的グリカンコア構造との組み合わせ
構造要素の一部は特異的に特定のグリカンコア構造と関連していると考えられる。特定のコア構造に結合する末端構造の識別は特に好ましく、このような高特異性試薬は本発明の物理化学的分析の水準にまでほとんど完全な個々のグリカンを識別する能力を有する。例えば本発明の多くの特異的マンノース構造は一般に本発明のＮ−グリカングライコームに極めて特徴的である。本発明は特に識別末端エピトープに関する。
いくつかのグリカンコア構造上の共通末端構造
本発明は、いくつかのグリカン型上に特定の共通構造の特徴が存在すること、および、前記試薬の特異性が末端に限定され、コア構造に対する特異性を有していない場合、異なるグリカン構造上の特定の共通エピトープを特異的試薬により識別することが可能であることを明らかにした。本発明は特に、本発明の特定の細胞型の特徴的末端特性を明らかにした。本発明において、共通エピトープが識別の効果を高めることが認められた。この共通末端構造は、該共通末端構造を実質的な量含んでいない、有り得る他の細胞型または材料との関連において、識別に特に有用である。
本発明はＮ−グリカン、Ｏ−グリカンおよび／または糖脂質等の特定のコア構造上の末端構造の存在を明らかにした。本発明は好ましくは特定のグリカンコア型の識別を含む、前記構造のための特異的結合剤の選択に関する。
本発明はさらに、Ｎ−グリカンおよびＯ−グリカン等のタンパク質結合グライコームならびに糖脂質のグライコーム組成に関するものであり、各組成は特異的な量のグリカン亜群を含む。本発明はさらに、特定の量の所定の末端構造を有する場合の前記組成に関する。
特異的な好ましい構造群
本発明は、任意にさらに特異的コア構造を含んだ、特異的末端単糖型を有するオリゴ糖配列の識別に関する。好ましいオリゴ糖配列は、好ましい一態様において、末端単糖構造に基づき分類される。本発明はさらに、末端（非還元末端の末端）二糖エピトープのファミリーを、β結合ガラクトピラノシル構造に基づき明らかにしたものであり、これはさらに、末端Ｇａｌ残基をＧａｌＮＡｃに変える、フコースおよび／もしくはシアル酸残基により、またはＮ−アセチル基により修飾されていてよい。このような構造はＮ−グリカン、Ｏ−グリカンおよび糖脂質サブグライコーム（ｓｕｂｇｌｙｃｏｍｅ）中に存在する。さらに、本発明は末端ＭａｎαＭａｎを有するＮ−グリカンの末端二糖エピトープに関する。
前記構造は質量分析および任意にＮＭＲ分析により、および本発明の高特異性結合剤により得られ、糖脂質構造の分析に対してはパーメチル化（ｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）およびフラグメンテーション質量分析を用いた。Ｎ−グリカン、Ｏ−グリカンおよび糖脂質への公知の生合成経路を含む生合成分析を、グリカン組成の分析およびさらなる裏付けのためにさらに用いたが、それはＳｋｏｔｔｍａｎ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． （２００５）幹細胞の遺伝子発現プロファイリングデータ、および、臍帯血細胞のｍＲＮＡプロファイリングから得られ、Ｊａａｔｉｎｅｎ Ｔ ｅｔ ａｌ．ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ（２００６）２４（３）６３１−４１のデータを用いた生合成分析を支持するために用いられた同様なデータから得られたために、ｍＲＮＡ後の各種調節レベルによる直接的な証拠ではない。
末端マンノース単糖を有する構造
好ましいマンノース型標的構造が本発明により特異的に分類された。これらは本発明の各種の高および低マンノース構造ならびにハイブリッド型構造を含む。
好ましい末端Ｍａｎα−標的構造エピトープ
本発明は低マンノースＮ−グリカンおよび高マンノースＮ−グリカン上のＭａｎαの存在を明らかにした。生合成の知識に基づき、ならびに生合成酵素のｍＲＮＡの分析による、およびＮＭＲ分析による、この見解の支持に基づき、
前記構造および末端エピトープは、
Ｍａｎα２Ｍａｎ、Ｍａｎα３Ｍａｎ、Ｍａｎα６ＭａｎおよびＭａｎα３（Ｍａｎα６）Ｍａｎ
［式中、還元末端Ｍａｎは好ましくはαまたはβ結合グリコシド、およびＭａｎα２Ｍａｎの場合はα結合グリコシドである］
であると明らかにすることができた。
末端Ｍａｎα構造の一般構造は、
Ｍａｎαｘ（Ｍａｎαｙ）ｚＭａｎα／β
［式中、ｘは結合位置２、３または６であり、ｙは結合位置３または６であり、
ｚは０または１の整数であり、分岐の存在または非存在を表し、
ただしｘおよびｙは同一の位置ではなく、および
ｘが２の場合、ｚは０であり、還元末端Ｍａｎは好ましくはα結合する］
である。
低マンノース構造は好ましくは他のマンノース残基に結合するα３および／またはα６マンノースを有する構造
Ｍａｎαｘ（Ｍａｎαｙ）ｚＭａｎα／β
［式中、ｘおよびｙは３または６の結合位置であり、
ｚは０または１の整数であって分岐の存在または非存在を表す］
を有する非還元末端の末端エピトープを含む。
高マンノース構造は末端α２結合マンノース：Ｍａｎα２Ｍａｎ（α）、ならびに任意に上記のα３および／またはα６マンノース構造のｏｎまたはいくつかを含む。
末端Ｍａｎα構造の存在は幹細胞において制御されており、末端Ｍａｎα２構造を有する高Ｍａｎ構造の、Ｍａｎα３／６を有する低Ｍａｎ構造に対する、
および／またはＧａｌ主鎖エピトープを有する複合型Ｎ−グリカンに対する割合は、細胞型特異的に相違する。
データは、特異的末端Ｍａｎα２Ｍａｎおよび／またはＭａｎα３／６Ｍａｎを明らかにする結合剤が幹細胞の分析において非常に有用であることを示した。これまでの科学ではエピトープは細胞型または状態の特異的シグナルとして分析されなかった。
本発明は特に、好ましくは２つの構造型、Ｍａｎα２Ｍａｎ構造およびＭａｎα３／６Ｍａｎ構造を同一試料から定量することにより、低Ｍａｎおよび高Ｍａｎ構造両者の量を測定することに関する。
本発明は特に、本発明の好ましい幹細胞からの、より好ましくは分化した胚性細胞、より好ましくはステージ３の分化した細胞等の、胚様体を超えて分化したものからの、末端Ｍａｎα構造の識別のための酵素またはモノクローナル抗体等の高特異性結合剤に関するものであり、最も好ましくは前記構造はステージ３の分化した細胞から識別される。本発明は特に、好ましくは、成体幹細胞、より好ましくは間葉系幹細胞からの、特に間葉系幹細胞の表面からの、および別の態様においては血液由来幹細胞、また別の好ましい群として臍帯血および骨髄幹細胞からの、構造の検出に関する。好ましい一態様において、前記臍帯血および／または末梢血幹細胞は造血幹細胞ではない。
低特異性または未分析の特異性の結合剤
末端マンノース構造の識別に好ましいものとしてマンノース単糖結合植物レクチン等が挙げられる。本発明は好ましい態様において、胚性幹細胞等の幹細胞の、レクチンＰＳＡ等のＭａｎα認識レクチンによる識別に関する。好ましい一態様において、前記識別は透過性細胞中の細胞内グリカンを対象とする。他の一態様において、Ｍａｎα結合レクチンは、対応する実施例３に示すように、線維芽細胞型細胞またはフィーダー細胞等の混入細胞集団から末端Ｍａｎαを識別するために、無傷の非透過性細胞に対して用いられる。
好ましい高特異性の高特異性結合剤
ｉ）特異的マンノース残基遊離酵素（ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）、例えば結合特異的マンノシダーゼ、より好ましくはα−マンノシダーゼまたはβ−マンノシダーゼ。
好ましいα−マンノシダーゼとしては、好ましくは非還元末端の末端を開裂するα−マンノシダーゼ等の結合特異的α−マンノシダーゼなどが挙げられ、好ましいマンノシダーゼの一例はタチナタマメα−マンノシダーゼ（Ｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ； Ｓｉｇｍａ， ＵＳＡ）および相同なαマンノシダーゼ
特異的にもしくは他の結合よりも効果的にα２結合マンノース残基を、より好ましくは特異的にＭａｎα２構造を開裂するもの；または
特異的にもしくは他の結合よりも効果的にα３結合マンノース残基を、より好ましくは特異的にＭａｎα３構造を開裂するもの；または
特異的にもしくは他の結合よりも効果的にα６結合マンノース残基を、より好ましくは特異的にＭａｎα６構造を開裂するもの；
である。
好ましいβ−マンノシダーゼとしては、β４結合マンノースをＮ−グリカンコアＭａｎβ４ＧｌｃＮＡｃ構造の非還元末端の末端から開裂することができ、グライコーム中の他のβ結合した単糖を開裂しないβ−マンノシダーゼ等が挙げられる。
ｉｉ）本発明の好ましいマンノース構造を認識する特異的結合タンパク質。好ましい試薬として抗体および抗体の結合ドメイン（Ｆａｂフラグメント等）、ならびに他の改変された炭水化物結合タンパク質等が挙げられる。本発明はＭＳ２Ｂ１およびより好ましくはＭＳ３Ｂ２構造を認識する抗体に関する。
中性Ｎ−グリカンのマンノシダーゼ分析
α−マンノシダーゼ結合剤によるマンノシル化の検出ならびに実施例１におけるグリカン臍帯血および末梢血間葉系細胞の；実施例１５における臍帯血細胞のための、実施例７におけるｈＥＳＣ ＥＢおよびステージ３細胞、実施例１７および２においては胚幹細胞および分化した細胞のための；質量分析プロファイリングの例、ならびに本発明によって記載されるＭａｎ１−４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）０−１ＧｌｃＮＡｃ含有低マンノースグリカンのＭａｎβ４、Ｍａｎα３／６末端構造の全ての種類の存在を示す。
レクチン結合
α結合マンノースは実施例４においてヒト間葉系細胞に対してレクチンＨｉｐｐｅａｓｔｒｕｍ ｈｙｂｒｉｄ（ＨＨＡ）により示され、Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ（ＰＳＡ）レクチンは、それらがＮ−グリカン等のその表面複合糖質上にマンノース、より具体的にはα結合マンノース残基を発現していることを示唆している。有り得るα−マンノース結合としてはα１→２、α１→３、およびα１→６等が挙げられる。Ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｖａｌｉｓ（ＧＮＡ）レクチンの低結合は、細胞表面上の一部のα−マンノース結合が他と比べて優勢であることを示唆している。末端Ｍａｎα認識低親和性試薬の組み合わせは有用であり、マンノシダーゼスクリーニングにより得られた結果；ＮＭＲおよび質量分析の結果に対応すると思われる。臍帯血細胞のレクチン結合を実施例５に示す。ＰＳＡはコアＦｕｃａ６−エピトープを有する複合型Ｎ−グリカンに対する特異性を有する。
マンノース結合レクチン標識
実施例２における間葉系細胞の標識は、蛍光標識に結合したヒト血清マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）でも検出された。これは、この先天性免疫系成分のためのリガンドがｉｎ ｖｉｔｒｏ培養されたＢＭ ＭＳＣ細胞表面上で発現され得ることを示唆している。
本発明は特に、細胞表面上の末端Ｍａｎαの分析に関するものであり、それは該構造がＭＢＬおよび先天性免疫の他のレクチンに対するリガンドであるためである。さらに、末端Ｍａｎα構造は、血液循環中で細胞を肝臓のＫｕｐｆｅｒ細胞等のマンノース受容体含有組織に導くと考えられる。本発明は特に、末端Ｍａｎα構造を認識する結合剤の結合による、前記構造の量の制御に関する。
好ましい一態様において、本発明は、幹細胞へのレクチン（精製または好ましくは組み替え型のレクチン、好ましくは標識された形態）の結合の試験により、ヒトに存在するレクチン、例えば先天性免疫のレクチンおよび／または組織もしくは白血球のレクチンの、幹細胞上のリガンドの存在を試験することに関する。このようなレクチンとして、特にＭａｎαおよびＧａｌβ／ＧａｌＮＡｃβ構造を結合するレクチン等が挙げられると考えられる（本発明の末端の非還元末端またはα６シアル化型も）。
マンノース結合抗体
高マンノース結合抗体は例えばＷａｎｇ ＬＸ ｅｔ ａｌ（２００４）１１（１）１２７−３４に記載されている。トリマンノシルコア構造等の短いマンノシル化構造に対する特異的抗体も公開されている。
末端Ｇａｌ単糖を有する構造
好ましいガラクトース型標的構造が特に本発明により分類された。これらは本発明の各種のＮ−アセチルラクトサミン構造を含む。
末端Ｇａｌのための、低特異性または未分析の特異性の結合剤
末端ガラクトース構造の識別に好ましいものとして、リシンレクチン（トウゴマ（ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）凝集素ＲＣＡ）、ピーナッツレクチン（／凝集素ＰＮＡ）等の植物レクチンなどが挙げられる。低分解能結合剤（ｌｏｗ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｂｉｎｄｅｒ）は様々な広範な特異性を有する。
好ましい高特異性の高特異性結合剤としては
ｉ）特異的ガラクトース残基遊離酵素、例えば結合特異的ガラクトシダーゼ、より好ましくはα−ガラクトシダーゼまたはβ−ガラクトシダーゼ。
好ましいα−ガラクトシダーゼとしては、特定の細胞調製物から明らかになったＧａｌα３Ｇａｌ構造を開裂し得る結合ガラクトシダーゼ（ｌｉｎｋａｇｅ ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）等が挙げられる。
好ましいβ−ガラクトシダーゼとしては、
β４結合ガラクトースを非還元末端の末端Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ構造から開裂することができ、グライコーム中の他のβ結合単糖は開裂しない、および
β３結合ガラクトースを非還元末端の末端Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ構造から開裂することができ、グライコーム中の他のβ結合単糖は開裂しない
β−ガラクトシダーゼなどが挙げられる。
ｉｉ）本発明の好ましいガラクトース構造を認識する特異的結合タンパク質。好ましい試薬としては抗体および抗体の結合ドメイン（Ｆａｂフラグメント等）、ならびに他の改変された炭水化物結合タンパク質およびガレクチン等の動物レクチンなどが挙げられる。
特異的結合剤実験およびＧａｌβ構造に対する実施例
前記構造の特異的エキソグリコシダーゼおよび糖転移酵素分析が、胚幹細胞および分化した細胞に対しては実施例１７および２に、実施例１間葉系細胞、臍帯血細胞については実施例１５に、ならびに細胞表面に対する実施例１６に、ならびに糖転移酵素を含んで、糖脂質に対しては実施例１１に含まれる。末端Ｇａｌβおよびシアル酸発現に関連するシアル化度分析を実施例６に示す。
本発明のＧａｌβエピトープの結合のために好ましい酵素結合剤としては、β１，４−ガラクトシダーゼ、例えばＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからのもの（大腸菌における組み替え体、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ＵＳＡ）、β１，３−ガラクトシダーゼ（大腸菌における組み替え体、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、等）；グリコシルトランスフェラーゼ：α２，３−（Ｎ）−シアリルトランスフェラーゼ（ラット、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａにおける組み替え体、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、特異的Ｎ−アセチルラクトサミンエピトープＦｕｃ−ＴＶＩ、特にＧａｌβ４ＧｌｃＮＡｃを認識することが知られるα１、３−フコシルトランスフェラーゼＶＩ（ヒト、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａにおける組み替え体、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）等が挙げられる。
植物低特異性レクチン、例えばＲＣＡ、ＰＮＡ、ＥＣＡ、ＳＴＡ、および
ＰＷＡ、データはｈＥＳＣに対しては実施例３に、ＭＳＣに対しては実施例４に、臍帯血に対しては実施例５に、細胞増殖のためのレクチン結合剤の効果は実施例１０に、臍帯血細胞の選択は実施例１２に示す。
各種ガレクチン発現によるヒトレクチン分析は臍帯血および胚細胞からの実施例１３である。
実施例１４に、特にフコシル化およびガラクトシル化された構造の抗体標識を示す。
ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン配列
アメリカヤマゴボウ（ｐｏｋｅｗｅｅｄ）（ＰＷＡ）による細胞の標識、およびＳｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（ＳＴＡ）レクチンによる、より弱い細胞の標識は、細胞が、Ｎ−および／またはＯ−グリカンおよび／または糖脂質等のそれらの表面複合糖質上に、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン配列を発現することを示唆する。結果はさらに、細胞表面ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン鎖が直鎖および分岐鎖配列の両者を有することを示唆する。
末端ＧａｌＮＡｃ−単糖を有する構造
好ましいＧａｌＮＡｃ型標的構造が特に本発明により明らかにされた。これらは特に、本発明のＬａｃｄｉＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃβＧｌｃＮＡｃ型構造を含む。
末端ＧａｌＮＡｃのための、低特異性または未分析の特異性の結合剤
いくつかの植物レクチンが末端ＧａｌＮＡｃの認識に関して報告されている。一部のＧａｌＮＡｃ認識レクチンは好ましいＬａｃｄｉＮＡｃ構造の低特異性認識のために選択されてよいと理解される。
β−結合Ｎ−アセチルガラクトサミン
Ｗｉｓｔｅｒｉａ ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａレクチン（ＷＦＡ）によるｈＥＳＣの豊富な標識は、ｈＥＳＣが、β−結合非還元末端Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を、Ｎ−および／またはＯ−グリカン等のそれらの表面複合糖質上に発現していることを示唆する。ＷＦＡのｍＥＦに対する特異的結合が存在しないことは、レクチンリガンドエピトープが、ｍＥＦにおいて、より少ないということを示唆する。
Ｗｉｓｔｅｒｉａ ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ凝集素およびＬｏｔｕｓ ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ凝集素等の低特異性結合剤植物レクチンは、オリゴ糖配列に結合する（Ｓｒｉｖａｔｓａｎ Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９２）２（５）４４５−５２：Ｄｏ、ＫＹ ｅｔ ａｌ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９７）７（２）１８３−９４；Ｙａｎ、Ｌ．，ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．１４（１）４５−５５）。論文は、前記レクチンが、細胞が該レクチンに認識される他の構造を有していないと確認される場合に、構造の識別に有用であることも示している。
好ましい一態様において、低特異性レアクチン（ｌｅａｃｔｉｎ）試薬が、結合を確認する他の試薬と組み合わせて用いられる。
好ましい高特異性の高特異性結合剤として
ｉ）本発明は、β結合ＧａｌＮＡｃが、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ酵素と組み合わせた特異的β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ酵素によって認識され得ることを明らかにした。
この組み合わせは、末端単糖および少なくとも結合構造の一部を示す。
好ましいβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼとしては、非還元末端の末端ＧａｌＮＡｃβ４／３構造からβ結合ＧａｌＮＡｃを開裂することができるがグライコーム中のα結合したＨｅｘＮＡｃは開裂しない酵素等が挙げられる。好ましいＮ−アセチルグルコサミニダーゼとしては、β結合したＧｌｃＮＡｃは開裂し得るがＧａｌＮＡｃは開裂しない酵素等が挙げられる。
本発明の構造である、好ましいＧａｌＮＡｃβ４、より好ましくはＧａｌＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃを認識する特異的結合タンパク質。好ましい試薬としては抗体および抗体の結合ドメイン（Ｆａｂフラグメント等）、ならびに他の改変された炭水化物結合タンパク質等が挙げられる。
ＬａｃｄｉＮＡｃ構造を認識する抗体の例として、Ｎｙａｍｅ Ａ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ９（１０）１０２９−３５；ｖａｎ Ｒｅｍｏｏｒｔｅｒｅ Ａ．ｅｔ ａｌ（２０００）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １０（６）６０１−６０９；および、ｖａｎ Ｒｅｍｏｏｒｔｅｒｅ Ａ．ｅｔ ａｌ（２００１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９（４）２３９６−２４０１の文献が挙げられる。前記抗体はマウスおよびヒトの寄生虫（Ｓｈｉｓｔｏｓｏｍａ）との関連で分析されたが、本発明によると、これらの抗体は幹細胞のスクリーニングにおいても用いることができる。本発明は特に、本発明のＮ−グライコーム中に存在するサブグライコームおよびグリカン構造に特異的なＬａｃｄｉＮａｃ認識抗体の特異的クローンの選択に関する。
前記論文は、本発明と類似した抗体結合特異性およびこのような抗体を生産する方法を開示しており、そのため、前記抗体結合剤は当業者にとって明白である。特定のＬａｃｄｉＮＡｃ構造の免疫原性はヒトおよびマウスにおいて示される。
グリコシダーゼを前記構造の識別に用いることは本発明におけると同様に従来技術において公知であり、例えばＳｒｉｖａｔｓａｎ Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）２（５）４４５−５２が挙げられる。
末端ＧｌｃＮＡｃ単糖を有する構造
好ましいＧｌｃＮＡｃ型標的構造が本発明により具体的に明らかになった。これらは特に本発明のＧｌｃＮＡｃβ−型構造を含む。
末端ＧｌｃＮＡｃに対する低特異性または未分析の特異性の結合剤
いくつかの植物レクチンでは末端ＧｌｃＮＡｃの認識が報告されている。一部のＧｌｃＮＡｃ認識レクチンは好ましいＧｌｃＮＡｃ構造の低特異性認識のために選択され得ると考えられる。
好ましい高度に特異的な高特異性結合剤として
ｉ）本発明は、β結合ＧｌｃＮＡｃが特異的β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ酵素により認識され得ることを明らかにした。
好ましいβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼとしては、非還元末端の末端ＧｌｃＮＡｃβ２／３／６構造からβ結合ＧｌｃＮＡｃを開裂することができるが、グライコーム中のβ結合ＧａｌＮＡｃまたはα結合ＨｅｘＮＡｃは開裂しない酵素等が挙げられる；
ｉｉ）本発明の構造である、好ましいＧｌｃＮＡｃβ２／３／６、より好ましくはＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎαを認識する特異的結合タンパク質。好ましい試薬としては抗体および抗体の結合ドメイン（Ｆａｂフラグメント等）、ならびに他の改変された炭水化物結合タンパク質等が挙げられる。
特異的結合剤実験および末端ＨｅｘＮＡｃ（ＧａｌＮＡｃ／ＧｌｃＮＡｃおよびＧｌｃＮＡｃ構造）に対する実施例
前記構造のための特異的エキソグリコシダーゼ分析が胚幹細胞および分化した細胞のための実施例１７および２に、間葉系細胞のための実施例１に、臍帯血細胞に対しては実施例１５に、ならびに糖脂質に対しては実施例１１に含まれる。
ＷＦＡおよびＧＮＡＩＩ等の植物性低特異性レクチン、およびデータは、ｈＥＳＣに対する実施例３に、ＭＳＣに対する実施例４に、臍帯血に対する実施例５に示し、該レクチン結合剤の細胞増殖に対する効果は実施例１０に示し、臍帯血細胞選択は実施例１２に示す。
前記構造の識別のために好ましい酵素としては、一般的なヘキソサミニダーゼであるタチナタマメからのβ−ヘキソサミニダーゼ（Ｃ． ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ、Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）、およびＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからのβ−グルコサミニダーゼ（大腸菌における組み替え体、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ＵＳＡ）等の特異的Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはＮ−アセチルガラクトサミニダーゼ等が挙げられる。これらの組み合わせによりＬａｃｄｉＮＡｃの決定が可能となる。
本発明はさらに、Ｈｏｌｍｅｓ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｅ（１９９１）２８８（１）８７−９６に記載されるような末端ＧｌｃＮＡｃβ構造を認識し、いくつかの末端ＧｌｃＮＡｃ構造に対する特異性を有する特異的モノクローナル抗体による、前記構造の分析に関する。本発明は特に、前記構造に対する抗体の選択および生産のための、本発明の末端構造の使用に関する。
標的構造の確認は、糖脂質構造のための質量分析およびパーメチル化／フラグメンテーション分析を含む。
末端フコース−単糖を有する構造
好ましいフコース型標的構造が本発明により特異的に分類された。これらは本発明の各種のＮ−アセチルラクトサミン構造を含む。本発明はさらに、Ｎ−グリカンコア、ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ＧｌｃＮＡｃのラクトサミン類似α６−フコシル化エピトープに対する識別および他の方法に関する。本発明は、レクチンＰＳＡ（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ（１９８１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５６、６６３３−６６４０；Ｃｕｍｍｉｎｇｓ ａｎｄ Ｋｏｒｎｆｅｌｄ（１９８２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５７、１１２３５−４０）によって認識され得るこのような構造が例えば胚幹細胞および間葉系幹細胞中に存在することを明らかにした。
末端Ｆｕｃのための、低特異性または未分析の特異性の結合剤
末端フコース構造の識別に好ましいものとして、フコース単糖結合植物レクチンが挙げられる。Ｕｌｅｘ ｅｕｒｏｐｅａｕｓおよびＬｏｔｕｓ ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓのレクチンは、例えば末端フコースを認識し、それぞれα２結合構造および分岐α３フコースに対するある程度の特異性結合（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｂｉｎｄｉｎｇ）を有することが報告されている。データをｈＥＳＣに対する実施例３に、ＭＳＣに対する実施例４に、臍帯血に対する実施例５に示し、および細胞増殖に対するレクチン結合剤の効果を実施例１０に示し、臍帯血細胞選択を実施例１２に示す。
好ましい高特異性の高特異性結合剤として
ｉ）特異的フコース残基遊離酵素、例えば結合フコシダーゼ（ｌｉｎｋａｇｅ ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅ）、より好ましくはα−フコシダーゼ。
好ましいα−フコシダーゼとしては、特定の細胞調製物から明らかになったＦｕｃα２ＧａｌおよびＧａｌβ４／３（Ｆｕｃα３／４）ＧｌｃＮＡｃ構造を開裂することができる結合フコシダーゼ等が挙げられる。
特異的エキソグリコシダーゼおよび前記構造に対しては、胚幹細胞および分化した細胞のための実施例１７および２に、間葉系細胞のための実施例１に、臍帯血細胞に対しては実施例１５に、ならびに細胞表面に対する実施例１６に、糖脂質に対しては実施例１１に含まれる。好ましいフコシダーゼとしてはα１，３／４−フコシダーゼ、例えばＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ．由来のα１，３／４−フコシダーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ＵＳＡ）、およびα１，２−フコシダーゼ、例えばＸ． ｍａｎｉｈｏｔｉｓ由来のα１，２−フコシダーゼ（Ｇｌｙｋｏ）等が挙げられる。
ｉｉ）本発明の好ましいフコース構造を認識する特異的結合タンパク質。好ましい試薬としては抗体および抗体の結合ドメイン（Ｆａｂフラグメント等）、ならびに他の改変された炭水化物結合タンパク質、ならびに、Ｌｅｗｉｓ ｘであるＧａｌβ４（Ｆｕｃα３）ＧｌｃＮＡｃ、およびシアリルＬｅｗｉｓ ｘであるＳＡα３Ｇａｌβ４（Ｆｕｃα３）ＧｌｃＮＡｃ等のＬｅｗｉｓ型構造を特に認識する、セレクチン等の動物レクチンなどが挙げられる。
好ましい抗体としては、特異的にＬｅｗｉｓ ｘ、およびシアリル−Ｌｅｗｉｓ ｘ等のＬｅｗｉｓ型構造を認識する抗体が挙げられる。より好ましくは前記Ｌｅｗｉｓ ｘ抗体は典型的なＳＳＥＡ−１抗体ではないが、該抗体は、Ｎ−グリカンコアに結合したＧａｌβ４（Ｆｕｃα３）ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα等の特異的タンパク質結合Ｌｅｗｉｓ ｘ構造を認識する。
ｉｉｉ）本発明はさらに、Ｎ−グリカンコア、ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ＧｌｃＮＡｃのα６フコシル化エピトープの識別に関する。本発明はレクチンＰＳＡまたはレンズ豆（ｌｅｎｔｉｌ）レクチン（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ （１９８１） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５６、６６３３−６６４０）による構造による、または特異的モノクローナル抗体（例えばＳｒｉｋｒｉｓｈｎａ Ｇ． ｅｔ ａｌ （１９９７） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２７２、２５７４３−５２）による、このような構造の識別に関する。本発明はさらに、グリカンエピトープを含む細胞グリカン成分の単離、および、さらなる分析のための対照画分としての、レクチンに結合していない幹細胞Ｎ−グリカンの単離の方法に関する。
末端シアル酸−単糖を有する構造
好ましいシアル酸型標的構造が本発明により特異的に分類された。
末端シアル酸のための、低特異性または未分析の特異性の結合剤
末端シアル酸構造の識別に好ましいものとして、シアル酸単糖結合植物レクチンが挙げられる。
好ましい高度に特異的な高特異性結合剤として
ｉ）特異的シアル酸残基遊離酵素、例えば結合シアリダーゼ、より好ましくはα−シアリダーゼ。
好ましいα−シアリダーゼとしては、本発明の特定の細胞調製物から明らかになった、ＳＡα３ＧａｌおよびＳＡα６Ｇａｌ構造を開裂し得る結合シアリダーゼ等が挙げられる。
結合特異性を有する好ましい低特異性レクチンとしては、ＳＡα３Ｇａｌ構造に特異的なレクチン、好ましくはＭａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓレクチン、および／またはＳＡα６Ｇａｌ構造に特異的なレクチン、好ましくはＳａｍｂｕｃｕｓ ｎｉｇｒａ凝集素等が挙げられる。
ｉｉ）本発明の好ましいシアル酸オリゴ糖配列構造を認識する特異的結合タンパク質。好ましい試薬として抗体および抗体の結合ドメイン（Ｆａｂフラグメント等）、ならびに他の改変された炭水化物結合タンパク質、ならびに、シアリルＬｅｗｉｓ ｘであるＳＡα３Ｇａｌβ４（Ｆｕｃα３）ＧｌｃＮＡｃ等のＬｅｗｉｓ型構造を特に認識するセレクチンまたはシアル酸を認識するシグレック（Ｓｉｇｌｅｃ）タンパク質などの動物レクチン等が挙げられる。好ましい抗体としては特異的にシアリル−Ｎ−アセチルラクトサミンおよびシアリル−Ｌｅｗｉｓ ｘを認識する抗体などが挙げられる。
ＮｅｕＧｃ構造のための好ましい抗体としては、構造ＮｅｕＧｃα３Ｇａｌβ４Ｇｌｃ（ＮＡｃ）０または１および／またはＧａｌＮＡｃβ４［ＮｅｕＧｃα３］Ｇａｌβ４Ｇｌｃ（ＮＡｃ）０または１を認識する抗体等が挙げられ、式中、［］は構造中の分岐を表し、（）０または１は存在するまたは存在しない構造を表す。好ましい一態様において、本発明は抗体による、好ましくはモノクローナル抗体またはヒト／ヒト化モノクローナル抗体による、Ｎ−グリコリル−ノイラミン酸構造の識別に関する。好ましい抗体はＰ３抗体の可変領域を含む。
特異的結合剤実験およびα３／６シアル化構造に対する実施例
前記構造に対する特異的エキソグリコシダーゼ分析が、胚幹細胞および分化した細胞のための実施例１７および２に、間葉系細胞のための実施例１に、臍帯血細胞に対しては実施例１５に、ならびに細胞表面に対する実施例１６に、ならびに糖転移酵素を含んで、糖脂質に対しては実施例１１に含まれる。末端Ｇａｌβおよびシアル酸発現と関連したシアル化水準の分析を実施例６に示す。
本発明のシアル酸エピトープの結合のために好ましい酵素結合剤としては、Ａ．ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ由来の一般的シアリダーゼα２，３／６／８／９シアリダーゼ（Ｇｌｙｋｏ）、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のα２，３−シアリダーゼ等のα２，３−シアリダーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ＵＳＡ）などの、シアリダーゼなどが挙げられる。他の有用なシアリダーゼは大腸菌およびコレラ菌から知られている。
特異的Ｎ−アセチルラクトサミンエピトープ、特にＳＡα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃを有するＦｕｃ−ＴＶＩを認識することが知られるα１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩ（ヒト、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａにおける組み替え体、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）。
ＭＡＡおよびＳＮＡ等の植物低特異性レクチン、およびデータは、ｈＥＳＣのための実施例３に、ＭＳＣのための実施例４に、臍帯血のための実施例５に示し、細胞増殖に対するレクチン結合剤の効果は実施例１０に示し、臍帯血細胞選択は実施例１２に示す。
実施例１４においては、シアリル構造の抗体標識を示す。
幹細胞型特異的ガレクチンおよび／またはガレクチンリガンドのための好ましい使用
実施例に記載されるように、本願発明者らは各種幹細胞が異なったガレクチン発現プロファイルおよび異なったガレクチン（グリカン）リガンド発現プロファイルを有することも見出した。本発明はさらに、ガラクトース結合試薬、優先的にはガラクトース結合レクチン、より優先的には特異的ガレクチンを幹細胞型特異的な様式で用い、記載の使用に対して本発明に記載されるように特定の幹細胞を調節する、またはそれに結合させることに関する。さらに好ましい一態様において、本発明は、ガレクチンリガンド構造、その誘導体、またはリガンド模倣試薬を、本発明に記載される使用に対して幹細胞型特異的様式で用いることに関する。好ましいガレクチンを実施例１３に列挙する。
本発明は好ましい一態様において、Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ構造の識別のための、上記のようなガレクチンによる、細胞からの末端Ｎ−アセチルラクトサミンの識別に関する。結果は、ＣＢ ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋幹細胞集団およびｈＥＳＣの両者が、興味深い異なったガレクチン発現プロファイルを有し、異なったガレクチンリガンド親和性プロファイルを生成する（Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００２）ことを示した。結果はさらに、これら幹細胞における豊富なガレクチンリガンドの発現、特に非還元末端β−ＧａｌおよびＩＩ型ＬａｃＮＡｃ、ポリＬａｃＮＡｃ、β１，６−分岐ポリＬａｃＮＡｃならびに複合型Ｎ−グリカンの発現を示すグリカン分析の結果と相関している。
幹細胞グライコーム分析の特定の技術的局面
グリカンおよびグリカン画分の単離
本発明のグリカンは当該分野で公知の方法により単離することができる。好ましいグリカン調製法は次の工程からなる：
１° グリカン含有画分を試料から単離し、
２° 任意に前記画分をグライコーム分析に有用な純度に精製する。
好ましい単離法は分析されるべき所望のグリカン画分に応じて選ばれる。単離法は次の方法：
１° 水または他の親水性溶媒による抽出であって、水溶性グリカンまたは遊離オリゴ糖もしくは糖ペプチド等の複合糖質を生成するもの、
２° 疎水性溶媒による抽出であって、糖脂質等の疎水性複合糖質を生ずるもの、
３° Ｎ−グリコシダーゼ処理、特にＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ Ｎ−グリコシダーゼＦ処理であって、Ｎ−グリカンを生ずるもの、
４° ホウ化水素等の還元剤を用いた、または用いない、アルカリ処理、例えば弱い（０．１Ｍ等）水酸化ナトリウムまたは濃アンモニア処理であって、前者の場合、炭酸塩等の保護剤の存在下で処理が行われ、Ｏ−グリカン等のβ脱離産物（β−ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ）および／もしくはＮ−グリカン等の他の脱離産物を生ずるもの、
５° エンドグリコシダーゼ処理、例えばエンド−β−ガラクトシダーゼ処理、特にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｆｒｅｕｎｄｉｉエンド−β−ガラクトシダーゼ処理であって、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミングリカン鎖もしくは酵素特異性に応じて類似の産物からの断片を生ずるもの、ならびに／または
６° プロテアーゼ処理、例えば広範囲のまたは特異的なプロテアーゼ処理、特にトリプシン処理であって、糖ペプチド等のタンパク質分解断片を生ずるもの、
の１つまたは組み合わせ、またはもとの試料の画分を生ずる他の分画法であってよい。
遊離したグリカンは任意にシアル化および非シアル化亜画分（ｓｕｂｆｒａｃｔｉｏｎ）に分けられ、別々に分析される。本発明によると、これは中性グリカン成分の改善された検出のために、特にそれらが分析対象の試料中で希な場合に、および／または試料の量が少ないもしくは質が低い場合に、好ましい。好ましくは、このグリカン分画はグラファイトクロマトグラフィー（ｇｒａｐｈｉｔｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）により達成される。
本発明によると、シアル化グリカンは任意に、上記の非シアル化グリカン特異的単離手順において非シアル化グリカン画分とともに単離されるような様式で修飾され、非シアル化およびシアル化グリカン成分の両者に対して同時に改善された検出がもたらされる。好ましくは、この修飾は非シアル化グリカン特異的単離手順の前に行われる。好ましい修飾方法としてはノイラミニダーゼ処理およびシアル酸カルボキシル基の誘導体化等が挙げられ、好ましい誘導体化法として該カルボキシル基のアミド化およびエステル化等が挙げられる。
グリカン遊離法
好ましいグリカン遊離法としては次の方法：
遊離グリカン − 遊離グリカンの、例えば水または適した水−溶媒混合物による抽出。
Ｏ−およびＮ−結合グリカン等のタンパク質結合グリカン − タンパク質結合グリカンのアルカリ脱離（ａｌｋａｌｉｎｅ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ）、次いで任意に遊離したグリカンの還元を行う。
ムチン型および他のＳｅｒ／Ｔｈｒ Ｏ−結合グリカン − グリカンのアルカリβ脱離（ａｌｋａｌｉｎｅ β−ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ）、次いで任意に遊離したグリカンの還元を行う。
Ｎ−グリカン − 酵素的遊離（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｌｉｂｅｒａｔｉｏｎ）、任意に、例えばＣ． ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ由来のＮ−グリコシダーゼＦ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ由来のエンドグリコシダーゼＨ、またはアーモンド由来のＮ−グリコシダーゼＡ等のＮ−グリコシダーゼ酵素を用いる。
スフィンゴ糖脂質等の脂質結合グリカン − エンドグリコセラミダーゼ酵素を用いた酵素的遊離；化学的遊離；オゾン分解遊離。
グリコサミノグリカン − グリコサミノグリカンを開裂するエンドグリコシダーゼ、例えばコンドロイナーゼ（ｃｈｏｎｄｒｏｉｎａｓｅ）、コンドロイチンリアーゼ、ヒアルロンダーゼ（ｈｙａｌｕｒｏｎｄａｓｅ）、ヘパラナーゼ、ヘパラチナーゼ、もしくはケラタナーゼ／エンド−ベータ−ガラクトシダーゼを用いた処理；またはＯ−グリコシドグリコサミノグリカンに対するＯ−グリカン遊離法の使用；またはＮ−グリコシドグリコサミノグリカンに対するＮ−グリカン遊離法もしくは特異的グリコサミノグリカンコア構造を開裂する酵素の使用；または特異的化学的亜硝酸開裂法、特にアミン／Ｎ−硫酸エステル含有グリコサミノグリカンに対するもの
グリカン断片 − 特異的エキソまたはエンドグリコシダーゼ酵素、例えばケラタナーゼ、エンド−β−ガラクトシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、シアリダーゼ、または他のエキソおよびエンドグリコシダーゼ酵素；化学的開裂法；物理的方法
等が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の分析のための好ましい標的細胞集団および型
初期ヒト細胞集団
ヒト幹細胞および多分化能細胞
最も広い態様において、本発明は全ての型のヒト幹細胞に関するものであり、これは新鮮な、かつ培養されたヒト幹細胞を意味する。本発明の幹細胞は、天然の細胞に似た分化を示し得るが典型的には染色体の変化またはウイルス感染による非天然の発生を示す、従来の癌細胞株は含まない。幹細胞には、他の細胞型に分化することができる全ての型の良性多分化能細胞が含まれる。幹細胞は細胞分裂後に幹細胞のまま存在できる特別な能力、自己複製能を有する。
ヒト幹細胞に対する最も広い態様において、本発明は、新規の特別なグリカンプロファイル、および該グリカンプロファイルを対象とした新規の分析論、試薬および他の方法を記載する。本発明は、ヒト幹細胞の新規グリカンプロファイルに関して、細胞集団における特有の相違を示す。
本発明はさらに、本発明の好ましい細胞集団に関する新規構造および関連した発明に関する。本発明はさらに、特定の好ましい細胞集団に関連する特異的グリカン構造、特に末端エピトープに関するものであり、該細胞集団に対して該構造は新しいものである。
初期ヒト細胞の好ましい型
本発明は細胞の組織起源（ｔｉｓｓｕｅ ｏｒｉｇｉｎ）および／またはその分化状態に基づく、初期ヒト細胞の特異的な型に関する。
本発明は特に、ドナー個体の年齢、ならびに細胞が由来する組織の種類、例えば年上の個体または成人からの好ましい臍帯血および骨髄、などの細胞の由来に基づく、初期ヒト細胞集団、すなわち多分化能細胞およびそれに由来する細胞集団に関する。
分化状態を基盤とした好ましい分類は、好ましくは「固形組織前駆」細胞、より好ましくは「間葉系幹細胞」、または固形組織に分化する細胞、もしくは外胚葉、中胚葉、もしくは内胚葉、より優先的には間葉系幹細胞に分化し得る細胞を含む。
本発明はさらに、細胞培養に関連する状態に基づく初期ヒト細胞の分類および２つの主要な種類の細胞材料に関する。本発明は好ましくは、新鮮な、冷凍の、および培養の細胞を含む初期ヒト細胞の２つの主要な細胞材料型に関する。
臍帯血細胞、胚性細胞および骨髄細胞
本発明は特に、ドナー個体の年齢および細胞が由来する組織の種類などの細胞の由来に基づく、初期ヒト細胞集団、すなわち多分化能細胞およびそれに由来する細胞集団に関する。
ａ）１）ヒト新生児、好ましくは臍帯血および関連する材料に関するもの、および２）胚細胞型材料、などの若齢（ｅａｒｌｙ ａｇｅ ｃｅｌｌ）細胞から
ｂ）年上の個体（非新生児、好ましくは成人）由来の幹および前駆細胞から、好ましくはヒト「血液関連組織」由来の、好ましくは骨髄細胞を含むものから。
固形組織、好ましくは間葉系幹細胞に分化する細胞
本発明は特に、好ましい一態様の下で、「固形組織前駆細胞」と称する非造血組織に分化することができる細胞、すなわち血液細胞以外の細胞に分化する細胞に関する。より好ましくは、固形組織に分化するために産生される前記細胞集団は「間葉系細胞」であり、これは中胚葉起源の細胞、より好ましくは間葉系幹細胞に効果的に分化し得る多分化能細胞である。
従来技術のほとんどは本発明の間葉系細胞および間葉系幹細胞と極めて異なる特徴を有する造血細胞に関するものである。
本発明の好ましい固形組織前駆細胞としては、臍帯血の選択された多分化能細胞集団、臍帯血から培養された間葉系幹細胞、骨髄から培養された／得られた間葉系幹細胞、および胚性細胞等が挙げられる。より具体的な一態様において、好ましい固形組織前駆細胞は間葉系幹細胞、より好ましくは「血液関連間葉系細胞」、さらに好ましくは骨髄または臍帯血に由来する間葉系幹細胞である。
具体的一態様の下で、臍帯血のさらなる造血幹細胞型としてのＣＤ３４＋細胞またはＣＤ３４＋細胞一般は、前記固形組織前駆細胞から除外される。
初期血液細胞（ｅａｒｌｙ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）集団および対応する間葉系幹細胞
臍帯血
前記初期血液細胞集団は多分化能細胞に富んだ血液細胞材料を含む。好ましい初期血液細胞集団としては、多分化能細胞に富む末梢血細胞、骨髄血細胞および臍帯血細胞等が挙げられる。好ましい一態様において、本発明は初期血液または初期血液由来細胞集団に由来する間葉系幹細胞、好ましくは該細胞集団の分析に関する。
骨髄
初期血液細胞の他の別に好ましい群は骨髄血細胞である。これらの細胞も多分化能細胞を含む。好ましい一態様において、本発明は骨髄細胞集団に由来する間葉系幹細胞、好ましくは該細胞集団の分析に関する。
初期ヒト血液細胞の好ましい亜集団
本発明は特に、初期ヒト細胞の亜集団に関する。好ましい一態様において、該亜集団は抗体による選択によって産生され、他の態様においては特定の細胞型に有利な細胞培養により産生される。好ましい一態様において、前記細胞は抗体選択法により、好ましくは初期血液細胞から産生される。好ましくは、前記初期ヒト血液細胞は臍帯血細胞である。
ＣＤ３４陽性細胞集団は比較的大きく不均質である。これは特異的細胞産物を産生する目的のいくつかの用途に対して最適ではない。本発明は好ましくは特異的に選択された非ＣＤ３４集団、すなわちＣＤ３４マーカーに対する結合に対して選択されない細胞であって均質細胞集団と呼ばれるものに関する。均質な細胞集団はより小さいサイズの、例えばＣＤ１３３＋細胞集団に相当する、および特異的に選択されたＣＤ３４＋細胞集団よりも小さいサイズを有する、単核球集団のものであり得る。さらに、初期ヒト細胞の好ましい均質亜集団はＣＤ３４＋細胞集団よりも大きくてよいと考えられる。
均質細胞集団はＣＤ３４＋細胞集団の亜集団であってよく、好ましい態様においてこれは具体的にＣＤ１３３＋細胞集団またはＣＤ１３３型細胞集団である。本発明の「ＣＤ１３３型細胞集団」は、ＣＤ１３３＋細胞集団と類似しているが、好ましくはＣＤ１３３以外の他のマーカーに関して選択される。該マーカーは好ましくはＣＤ１３３共発現マーカーである。好ましい一態様において、本発明はＣＤ１３３＋細胞集団、またはＣＤ１３３型細胞集団としてのＣＤ１３３＋亜集団に関する。好ましい均質細胞集団はさらに、特別なＣＤ１３３型細胞として定義され得るもの以外の他の細胞集団を含むと考えられる。
好ましくは、均質な細胞集団は該細胞集団の細胞表面マーカーに対する特異的結合剤の結合により選択される。好ましい一態様において、均質な細胞は、ＣＤ３４マーカーとより低い相関を有し、細胞表面上のＣＤ１３３とより高い相関を有する細胞表面マーカーにより選択される。好ましい細胞表面マーカーとしては、ＣＤ１３３型細胞に豊富な本発明のα３−シアル化構造等が挙げられる。純粋な、好ましくは完全な、ＣＤ１３３＋細胞集団が、本発明の分析のために好ましい。
本発明は、純粋な臍帯血由来材料からの細胞集団の分析または識別を可能にするであろう本質的なｍＲＮＡ発現マーカーに関する。本発明は特に、初期ヒト臍帯血細胞上に特異的に発現するマーカーに関する。
本発明は、好ましい一態様において、天然細胞、すなわち遺伝的に改変されていない細胞に関する。遺伝的改変は細胞および改変された細胞からの背景を変えることが知られている。本発明はさらに、好ましい一態様において、新鮮な非培養細胞に関する。
本発明は、特別な分化能の細胞、好ましくはヒト血液細胞、またはより好ましくはヒト臍帯血細胞の分析のためのマーカーの使用に関する。
ヒト臍帯血由来の再現可能に高度に精製された単核完全細胞（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｅｌｌ）集団の好ましい純度
本発明は特に、ヒト臍帯血由来の精製された細胞集団の産生に関する。上記の通り、ヒト臍帯血由来の高度に精製された完全細胞（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｅｌｌ）調製物の産生は当該分野において問題であった。最も広い態様において、本発明は本発明のヒト臍帯血の生物学的等価物に関するものであり、これらは同様なマーカーを有し、本発明のＣＤ１３３＋細胞集団および等価物と同様に分離された際に同様な細胞集団を生ずるか、または臍帯血と等価な細胞が、さらに他の細胞型も含む試料に含まれる。臍帯血と同様の特性は少なくとも部分的にヒトの出生前に存在し得ると考えられる。本願発明者らは、高度に精製された細胞集団を、シアル化グリカンおよび関連するマーカーの正確な分析に有用な純度で初期ヒト細胞から生成することが可能であることを見出した。
好ましい骨髄細胞
本発明はヒト骨髄由来の多分化能細胞集団または初期ヒト血液細胞に関する。もっとも好ましいのは骨髄由来間葉系幹細胞である。好ましい一態様において、本発明は、骨および／または軟骨等の、構造的な支持機能を有する細胞に分化する間葉系幹細胞に関する。
これまでに言及されている各種因子が幹細胞の生き残り、複製、および分化の能力に影響する。例えば、栄養に関しては、アミノ酸タウリンは特定の条件下で齧歯類骨髄細胞が破骨細胞を形成するのを優先的に阻害し（Ｋｏｉｄｅ、ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｒｃｈ Ｏｒａｌ Ｂｉｏｌ ４４：７１１−７１９）、アミノ酸Ｌ−アルギニンは赤血球の分化および赤血球前駆細胞の増殖を刺激し（Ｓｈｉｍａ，ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｂｌｏｏｄ １０７：１３５２−１３５６）、Ｐ２Ｙ受容体を介して作用する細胞外ＡＴＰは造血および非造血幹細胞の両者に対して多種多様な変化を媒介し（Ｌｅｅ，ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １７：１５９２−１６０４）、多孔質高分子足場（ｐｏｒｏｕｓ ｐｏｌｙｍｅｒ ｓｃａｆｆｏｌｄ）に付着したアルギニン−グリシン−アスパラギン酸は骨芽細胞前駆体の分化および生き残りを促進する（Ｈｕ、ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ Ａ ６４：５８３−５９０）：これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられたものとする。従って、各種栄養を特定の型の幹細胞および／またはその子孫の分化の誘導または生存能力の維持のために用いることは当業者にとって公知であろう。
胚性細胞集団
本発明は特に、胚性細胞集団を対象とした方法に関するものであり、好ましくは前記使用はヒト胚の商業的または産業的使用も、ヒト胚の破壊も伴わない場合のものである。本発明は特定の一態様の下で、法律上許容される任意の時と場合における、胚細胞、および胚幹細胞等の胚由来材料の使用に関する。法律は国や地域によって異なることが理解される。
本発明はさらに、胚関連の、廃棄された、または自然に損傷を受けた材料であって、ヒト胚として生存能力が無く、ヒト胚とは見なされ得ない材料の使用に関する。さらに他の態様において、本発明は、偶然損傷を受けた胚材料であってヒト胚として生存能力が無く、ヒト胚とは見なされ得ない材料の使用に関する。
さらに、出生および正常分娩過程の臍帯の除去後のヒト臍帯または胎盤に由来する初期ヒト血液は倫理的に議論の対象とならない廃棄物であり、ヒトの部分を形成しないと理解される。
本発明はさらに、本発明の細胞材料と等価な細胞材料に関する。さらに、機能的におよび生物学的にも類似した細胞がクローニング技術等の人為的な方法により得ることができると理解される。
間葉系多分化能細胞
本発明はさらに、本発明の好ましい細胞集団としての間葉系幹細胞または多分化能細胞に関する。好ましい間葉系幹細胞としては初期ヒト細胞、好ましくはヒト臍帯血またはヒト骨髄から得られた細胞等が挙げられる。好ましい一態様において、本発明は、骨および／もしくは軟骨等の構造的な支持機能を有する細胞または脂肪組織等の軟組織を形成する細胞に分化する間葉系幹細胞に関する。
細胞状態の制御およびグリコシル化分析による潜在的混入
細胞状態の制御
原料細胞集団の制御
本発明は治療において用いるための細胞集団のグリコシル化の制御に関する。
本発明は特に、細胞材料のグリコシル化の制御に関するものであり、好ましくはここで、
１）細胞材料の由来と移植材料の潜在的レシピエントとの間に相違がある。好ましい一態様においては、潜在的な個体間の特異性の相違が細胞材料のドナーと該細胞材料のレシピエントとの間に存在する。好ましい一態様においては、本発明は動物またはヒト、より好ましくはヒトに特異的、個体特異的なグリコシル化の相違に関する。個体特異的な相違は好ましくは初期ヒト細胞、初期ヒト血液細胞および胚性細胞の単核細胞集団中に存在する。本発明は好ましくは公知の個体特異的相違、例えば赤血球上の血液型抗原の変化の観察に関するものではない。
２）材料中の疾患特異的変異による変異の可能性がある。本発明は特に、感染性疾患、炎症性疾患または悪性疾患と関連する本発明の初期細胞集団中のグリコシル化の相違の探索に関する。本願発明者らの一部は多数の癌および腫瘍を分析し、初期細胞中の特定のグリコシル化型と類似した型のグリコシル化を観察した。
３）細胞が得られた動物、好ましくはヒトにおける特異的な個体間の生物学的相違の可能性がある。例えば細胞材料における、種、系統、集団、隔離集団、または品種特異的相違。
４）特定の細胞集団が細胞治療用途に用いられ得ることが証明された場合、グリカン分析は、該細胞集団を臨床の場において有用であることが知られている細胞集団と同一の特徴を有するように制御するために用いることができる。
細胞培養中の時間依存的変化
さらに、細胞の長期培養において、自然突然変異が培養細胞材料中に生ずる場合がある。培養細胞株中の突然変異はグリコシル化度に対して有害な欠陥を生じさせることが多いことに留意されたい。
さらに留意すべきは、細胞の培養はグリコシル化の変化を引き起こす場合があるということである。各種の生物学的、有機および無機分子の質や濃度、温度、細胞密度または撹拌の度合い等の任意の物理的条件などの細胞培養の任意のパラメータにおけるわずかな変化が、細胞材料およびグリコシル化における相違を引き起こす場合がある。本発明は、細胞に影響を与える任意の細胞培養パラメータによって引き起こされる細胞状態の変化を観察するために、本発明のグリコシル化変化をモニタリングすることに関する。
本発明は好ましい一態様において、細胞の密度が変化した場合のグリコシル化変化の分析に関する。本願発明者らは、これが細胞培養においてグリコシル化の大きな影響を有することに気付いた。
細胞の遺伝的または分化安定性に制限がある場合、これらはグリカン構造の変化の可能性を高めることがさらに理解される。分化の初期段階の細胞集団は異なった細胞集団を産生する能力を有している。本願発明者らは、初期ヒト細胞集団におけるグリコシル化変化を発見することができた。
細胞株の分化
本発明は特に、細胞株の分化が観察される場合に本発明のグリコシル化変化を観察することに関する。好ましい一態様において、本発明は、本発明の初期ヒト細胞または他の好ましい細胞型から、中胚葉性の幹細胞への分化の観察のための方法に関する。
細胞材料に不均一性が存在する場合、グリコシル化において観察し得る変化または有害な効果が引き起こされる場合がある。
さらに、糖鎖構造における変化は、それが有害でなくとも、または機能的に未知であっても、細胞の正確な遺伝的状態に関する情報を得るのに用いることができる。
本発明は特に、細胞培養中の細胞状態の変化を観察するための、グリコシル化の変化、好ましくはグリカンプロファイル、個々のグリカンシグナル、および／または個々のグリカンもしくはグリカン群の相対存在量における変化の分析に関する。
支持／フィーダー細胞株の分析
本発明は特に、幹細胞および初期ヒト細胞または他の好ましい細胞型の培養において用いられる支持／フィーダー細胞上の本発明のグリコシル化の相違を観察することに関する。一部の細胞は他の細胞よりも支持／フィーダー細胞として作用する優れた活性を有することが当該分野において知られている。好ましい一態様において、本発明はこれらの支持／フィーダー細胞上のグリコシル化の相違の観察のための方法に関する。この情報は幹細胞および初期ヒト細胞または他の好ましい細胞型の増殖を補助するための新規試薬の設計において用いることができる。
作業条件による混入または細胞の変化
細胞操作中に細胞に対して有害なグリコシル化または有害なグリコシル化関連作用を誘発する条件および試薬
本願発明者らはさらに、混入グリカンと同一の関連する問題を伴う、有害なグリカンが細胞により発現されるように誘導する条件および試薬を明らかにした。本願発明者らは、通常の細胞精製過程において用いられるいくつかの試薬が初期ヒト細胞材料において変化を引き起こすことを見出した。
細胞の操作中の前記物質は細胞材料のグリコシル化に影響する場合があると考えられる。これは作業下の細胞における前記構造の付着、吸収、または代謝的蓄積に基づくものであり得る。
好ましい一態様において、前記細胞操作試薬は、抗原性の、または有害な構造であるグリカン成分、例えば細胞表面ＮｅｕＧｃ、Ｎｅｕ−Ｏ−Ａｃまたはマンノース構造の存在に関して試験される。この試験は特にヒト初期細胞集団およびその好ましい亜集団に対して好ましい。
本願発明者らは、糖鎖構造の吸収または代謝的移送（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｔｒａｎｓｆｅｒ）が行われなかった場合の、細胞により発現されているグリカンに対する細胞培養中の各種エフェクター分子の効果に注目する。エフェクターは典型的には、例えば細胞表面受容体の結合により、細胞へシグナルを媒介する。
前記エフェクター分子としては各種サイトカイン、増殖因子、ならびにそれらのシグナリング分子およびコレセプター等が挙げられる。エフェクター分子は炭水化物またはレクチン等の炭水化物結合タンパク質であってもよい。
有害なグリカンの混入またはグライコームレベルでの他の改変を回避するための制御された細胞単離／精製および培養条件
細胞の操作により引き起こされるストレス
単離／精製等の細胞の操作ならびに細胞貯蔵および細胞培養過程と関連する操作は細胞にとって自然な条件ではなく、物理的および化学的ストレスを細胞に対して引き起こすと考えられる。本発明は該ストレスによって引き起こされる潜在的な変化の制御を可能にする。この制御は常法と組み合わせられてよく、他の手法による、細胞の生存能力または細胞構造が無傷であることの通常の確認と組み合わせられてもよい。
細胞操作工程における物理的および／または化学的ストレスの例
細胞の洗浄および遠心分離は物理的ストレスを引き起こし、細胞膜構造を破壊または損傷する場合がある。非生理的流れ（ｎｏｎ−ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｌｏｗ）条件下での細胞の精製および分離または分析も、細胞を特定の非生理的なストレスに曝露する。低温での細胞貯蔵過程および細胞保存および操作は膜構造に影響を与える。培地または他の溶液、特に細胞周囲の洗浄溶液、の組成の変化を伴う全ての操作工程は、例えば変化した水と塩とのバランスにより、または細胞の生化学的および生理学的調節に影響する他の分子の濃度を変えることにより、細胞に影響を与える。
細胞操作工程におけるストレスによるグライコーム変化の観察および制御
本願発明者らは、本発明の方法が、本発明により観察されるグライコームの少なくとも一部を通常効果的に改変する、細胞膜における変化を観察するのに有用であることを明らかにした。これは正確な構成および無傷構造細胞膜ならびに該構成の一部の特異的グリカン構造に関連すると理解される。
本発明は特に、全グライコームおよび／または細胞表面グライコームの観察に関するものであり、これらの方法はさらに、特に細胞に対してストレスが大きい条件との関連において、特に細胞が物理的および／または化学的ストレスに曝露される場合に、細胞が無傷であるか分析するのに用いられることを目的とする。それぞれの新しい細胞操作工程および／または細胞操作工程のための新しい条件は、本発明の方法により制御されることに対して有用であると理解される。さらに、グライコームの分析は、特に炭水化物結合タンパク質（炭水化物結合活性を有する、レクチン、抗体、酵素および改変タンパク質）等の特異的炭水化物結合物質による結合などの他の方法による分析のための、もっとも効果的に変わるグリカン構造の探索のために有用であると考えられる。
試薬に関して制御された細胞調製（単離または精製）
本願発明者らは一般的な細胞調製法の処理工程を分析した。動物材料による潜在的混入の複数の発生源が発見された。
本発明は特に、細胞調製過程の制御のための炭水化物分析法に関する。本発明は特に、該過程の各種工程における、動物性グリカン、好ましくはＮ−グリコリルノイラミン酸による潜在的な混入を制御する方法に関する。
本発明はさらに、細胞の単離において用いる特異的グリカン管理試薬（ｇｌｙｃａｎ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅａｇｅｎｔ）に関する。
前記グリカン管理試薬は３つのレベル：
１．観察可能な量の有害なグリカン構造、好ましくはＮ−グリコリルノイラミン酸またはそれに関連した構造を含まないように管理された試薬
２．観察可能な量の、細胞調製に用いられるものと類似したグリカン構造を含まないように管理された試薬
３．観察可能な量の任意のグリカン構造を含まないように管理された試薬
において制御されてよい。
管理レベル２および３は特に細胞状態がグリカン分析および／またはプロファイリング法により制御される場合に有用である。細胞調製における試薬が示されたグリカン構造を含んでいる場合、この制御がより困難になるか、または妨げられるであろう。さらに、前記グリカン構造は細胞状態を変える生物学的活性を示す場合があることに留意されたい。
グリカン管理試薬を含む細胞調製法
本発明はさらに、グリカン管理試薬を含む特異的細胞精製法に関する。
好ましい制御された細胞精製過程
結合剤が細胞の精製または他の方法のために用いられ、その後該結合剤のグリカンが生物学的作用を有し得る方法において細胞が用いられる場合、該結合剤は好ましくはグリカン管理またはグリカン中和（ｇｌｙｃａｎ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅｄ）タンパク質である。
本発明は特に、１または複数の以下の工程を含む、ヒト初期細胞の制御された産生に関する。次の方法における通常の試薬を用いた各工程においては、外来グリカン材料による混入のリスクがあると考えられた。該方法は本発明の制御された試薬および材料の、該方法の工程内における使用に関する。
細胞の好ましい精製は、少なくとも１つの、管理された試薬の使用を含む工程を含み、より好ましくは少なくとも２つの工程が含まれ、より好ましくは少なくとも３つの工程、および最も好ましくは少なくとも工程１、２、３、４、および６が含まれる。
１．細胞材料を管理された試薬で洗浄する。
２．抗体を基盤とした方法が用いられる場合、細胞材料は、好ましい一態様において、管理されたＦｃ受容体ブロッキング試薬によりブロックされる。さらに、グリコシル化の一部が抗体の調製において必要とされる場合があり、より好ましい一態様においては末端除去（ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ ｄｅｐｌｅｔｅｄ）グリカンが用いられると理解される。
３．細胞を、管理されたブロッキング材料と管理された細胞結合剤材料とを有する固定化された細胞結合剤材料に接触させる。より好ましい一態様において、該細胞結合剤材料は本発明の磁性ビーズと管理されたゼラチン材料とを有する。好ましい一態様において、細胞結合剤材料は管理されており、好ましくは細胞結合剤抗体材料は管理されている。さもなくば、特に該抗体がＮ−グリコリルノイラミン酸を産生して産物を汚染する細胞株により産生される場合に、該細胞結合剤抗体はＮ−グリコリルノイラミン酸を含む場合もある。
４．固定化された細胞を管理されたタンパク質製剤または非タンパク質製剤で洗浄する。好ましい方法において磁性ビーズは管理されたタンパク質製剤、より好ましくは管理されたアルブミン製剤で洗浄される。
５．固定化からの細胞の任意の解放。
６．精製された細胞の、管理されたタンパク質製剤または非タンパク質製剤による洗浄。
好ましい一態様において、好ましい方法は、初期ヒト細胞の精製、好ましくは臍帯血細胞の精製のための、免疫磁性ビーズを用いる方法である。
本発明はさらに、細胞精製キット、好ましくは少なくとも１つの管理された試薬、より好ましくは少なくとも２個の管理された試薬、さらに好ましくは３つの管理された試薬、さらになお好ましくは４つの試薬を含む免疫磁性細胞精製キットに関するものであり、最も好ましくは好ましい管理された試薬は、アルブミン、ゼラチン、細胞精製のための抗体、および抗体であってもよいＦｃ受容体ブロッキング試薬の群から選択される。
抗原性動物性グリカン等の有害なグリカンの混入
いくつかのグリカン構造混入細胞産物は産物の生物学的活性を弱める場合がある。
有害なグリカンは細胞の操作中の生存能力、または細胞の治療的使用における生存能力および／または所望の生物活性および／または安全性に影響する場合がある。
有害なグリカン構造はｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおける細胞の生存能力を、有害なレクチンまたは抗体の細胞への結合を引き起こしたり増加させたりすることによって低下させる場合がある。このようなタンパク質材料は、例えば細胞操作材料において用いられるタンパク質製剤中に含まれる場合がある。炭水化物標的レクチンはヒト組織および細胞上、特に血液中および内皮表面にも存在する。ヒト血中の炭水化物結合抗体は補体を活性化し、他の免疫反応をｉｎ ｖｉｖｏで引き起こす場合がある。さらに、血中の免疫防御レクチンまたは白血球は通常と異なるグリカン構造に対する免疫防御を引き起こす場合がある。
さらに有害なグリカンはｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞の有害な凝集を引き起こす場合がある。該グリカンは凝集および／または細胞表面レクチンに媒介される生物学的制御の変化によって細胞の発生状態における望ましくない変化を引き起こす場合がある。
さらなる問題としては、有害なグリカンのアレルゲン性、および内皮／細胞の炭水化物受容体によるｉｎ ｖｉｖｏでの細胞の誤ったターゲッティング等が挙げられる。
全グライコームの共通構造の特徴および好ましい共通の準特徴（ｓｕｂｆｅａｔｕｒｅ）
本発明は幹細胞のための有用なグリカンマーカーおよびその組み合わせ、ならびに特異的な量の主要グリカン構造を有するグライコーム組成を明らかにする。本発明はさらに、特異的末端およびコア構造ならびにその組み合わせに関する。
本発明の細胞由来の好ましいグライコームグリカン構造および／またはグライコームは、
式Ｃ０：
Ｒ１Ｈｅｘβｚ｛Ｒ３｝ｎ１Ｈｅｘ（ＮＡｃ）ｎ２ＸｙＲ２
［式中、Ｘはグリコシド結合した二糖エピトープβ４（Ｆｕｃα６）ｎＧＮであり、ここでｎは０または１であり、またはＸは無であり、そして
ＨｅｘはＧａｌまたはＭａｎまたはＧｌｃＡであり、
ＨｅｘＮＡｃはＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃであり、
ｙはアノマー結合構造αおよび／またはβまたは誘導体化アノマー炭素からの結合であり、
ｚは結合位置３または４であり、ただしｚが４の場合、ＨｅｘＮＡｃはＧｌｃＮＡｃであり、およびその場合ＨｅｘはＭａｎであるか、または
ＨｅｘはＧａｌであるか、またはＨｅｘはＧｌｃＡであり、ならびに
ｚが３である場合、ＨｅｘはＧｌｃＡまたはＧａｌであり、ＨｅｘＮＡｃはＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃであり、
ｎ１は０または１であってＲ３の存在または非存在を表し、
ｎ２は０または１であってＮＡｃの存在または非存在を表し、ただしｎ２はＨｅｘβｚがＧａｌβ４である場合にのみ０であってよく、およびｎ２は好ましくは０であり、ｎ２構造は好ましくは糖脂質に由来するものであり、
Ｒ１はコア結合に結合する１−４、好ましくは１−３、天然型炭水化物置換基、または無であり、
Ｒ２は還元末端水酸基、化学的還元末端誘導体、またはタンパク質由来のアスパラギンＮ−グリコシドアミノ酸および／もしくはペプチドを含むアスパラギンＮ−グリコシド等の天然アスパラギンＮ−グリコシド誘導体、またはタンパク質由来のアスパラギンＮ−グリコシドアミノ酸および／もしくはペプチドを含むセリンもしくはスレオニン結合Ｏ−グリコシド等の天然セリンもしくはスレオニン結合Ｏ−グリコシド誘導体であり、または、ｎ２が１である場合、Ｒ２は無もしくはセラミド構造もしくはセラミド構造の誘導体、例えばリゾ脂質およびそのアミド誘導体であり、
Ｒ３は無であるか、または、ＧｌｃＮＡｃβ６、もしくはＧａｌＮＡｃ（ＨｅｘＮＡｃがＧａｌＮＡｃである場合）に結合するその還元末端にＧｌｃＮＡｃβ６を有するオリゴ糖、を示す分岐構造であり、またはＨｅｘがＧａｌであり、ＨｅｘＮＡｃがＧｌｃＮＡｃである場合、およびｚが３である場合、Ｒ３はＦｕｃα４もしくは無であり、およびｚが４である場合、Ｒ３はＦｕｃα３または無である］
の構造を有する。
本発明のグリカン構造およびグライコームにおいて好ましい二糖エピトープとしては構造Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＡβ４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃ、ＧｌｃＡβ３ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＡβ３ＧａｌＮＡｃ、およびＧａｌβ４Ｇｌｃ等が挙げられ、これはさらに還元末端炭素原子および非還元単糖残基から誘導体化されてよく、別の一態様においては還元末端残基から分岐してもよい。好ましい分岐エピトープとしてはＧａｌβ４（Ｆｕｃα３）ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ３（Ｆｕｃα４）ＧｌｃＮＡｃ、およびＧａｌβ３（ＧｌｃＮＡｃβ６）ＧａｌＮＡｃ等が挙げられ、これはさらに還元末端炭素原子および非還元単糖残基から誘導体化されてよい。
本発明の方法のための好ましいエピトープ
Ｎ−アセチルラクトサミンＧａｌβ３／４ＧｌｃＮＡｃ末端エピトープ
２つのＮ−アセチルラクトサミンエピトープＧａｌβ４ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＧａｌβ３ＧｌｃＮＡｃは、好ましい末端エピトープであって、幹細胞上またはこの好ましい末端エピトープの主鎖構造上に存在するものを表し、例えばさらに本発明のシアル酸またはフコース誘導体化を有する。好ましい一態様において、本発明はフコシル化および／または非置換グリカン非還元末端型の末端エピトープ、より好ましくはフコシル化および非置換型に関する。本発明は特に、ヒト幹細胞グライコームからの非還元末端の末端（非置換）天然Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＧａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ構造に関する。本発明は特定の態様においてヒト幹細胞グライコームからの非還元末端の末端フコシル化天然Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＧａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ構造に関する。
好ましいフコシル化Ｎ−アセチルラクトサミン
好ましいフコシル化エピトープは式ＴＦ：
（Ｆｕｃα２）ｎ１Ｇａｌβ３／４（Ｆｕｃα４／３）ｎ２ＧｌｃＮＡｃβ−Ｒ
［式中、ｎ１は０または１であってＦｕｃα２の存在または非存在を表し、
ｎ２は０または１であってＦｕｃα４／３（分岐）の存在または非存在を表し、
ＲはＮ−グリカン、Ｏ−グリカンおよび／または糖脂質の還元末端コア構造である］
によるものである。
好ましい構造としては、従って、１型ラクトサミン（Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ基盤）：
Ｇａｌβ３（Ｆｕｃα４）ＧｌｃＮＡｃ（Ｌｅｗｉｓ ａ）、Ｆｕｃα２Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ Ｈ−１型、構造、および、
Ｆｕｃα２Ｇａｌβ３（Ｆｕｃα４）ＧｌｃＮＡｃ （Ｌｅｗｉｓ ｂ）および、
２型ラクトサミン（Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ基盤）：
Ｇａｌβ４（Ｆｕｃα３）ＧｌｃＮＡｃ（Ｌｅｗｉｓ ｘ）、Ｆｕｃα２Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ Ｈ−２型、構造、および、
Ｆｕｃα２Ｇａｌβ４（Ｆｕｃα３）ＧｌｃＮＡｃ （Ｌｅｗｉｓ ｙ）
等が挙げられる。
２型ラクトサミン（フコシル化および／または末端非置換）は、成体幹細胞およびこれらに直接由来する分化した細胞に関して特に好ましい群を形成する。１型ラクトサミン（Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ構造）は、胚性幹細胞に関して特に好ましい。
ラクトサミンＧａｌβ３／４ＧｌｃＮＡｃ、およびラクトース構造（Ｇａｌβ４Ｇｌｃ）を有する糖脂質構造
ラクトサミンはラクトース基盤の糖脂質とともに好ましい構造群を形成する。これらの構造はβ３／４Ｇａｌ転移酵素の産物としての類似した特徴を共有する。β３／４ガラクトース基盤の構造はタンパク質結合および糖脂質グライコームの特徴的な特性を生ずることが観察された。
本発明はさらに、Ｇａｌβ３／４ＧｌｃＮＡｃ構造が、各種幹細胞型の糖脂質上の、分化と関連する構造の主要な特徴であることを明らかにした。このような糖脂質は２つの本発明の好ましい構造エピトープを有する。最も好ましい糖脂質型としては、従って、ラクトシルセラミド基盤のスフィンゴ糖脂質および特にラクト−（Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ）、例えばラクトテトラオシルセラミドＧａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌβ４ＧｌｃβＣｅｒが挙げられ、好ましい構造はさらに：Ｇａｌβ３（Ｆｕｃα４）ＧｌｃＮＡｃ（Ｌｅｗｉｓ ａ）、Ｆｕｃα２Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ（Ｈ−１型）、構造、およびＦｕｃα２Ｇａｌβ３（Ｆｕｃα４）ＧｌｃＮＡｃ（Ｌｅｗｉｓ ｂ）またはシアル化構造ＳＡα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃもしくはＳＡα３Ｇａｌβ３（Ｆｕｃα４）ＧｌｃＮＡｃ［式中、ＳＡはシアル酸、好ましくはＮｅｕ５Ａｃであって好ましくはラクトテトラオシルセラミドのＧａｌβ３ＧｌｃＮＡｃを置換する］の群から選択される非還元末端構造を有し、
ならびに好ましくは式：
（Ｓａｃα３）ｎ５（Ｆｕｃα２）ｎ１Ｇａｌβ３（Ｆｕｃα４）ｎ３ＧｌｃＮＡｃβ３［Ｇａｌβ３／４（Ｆｕｃα４／３）ｎ２ＧｌｃＮＡｃβ３］ｎ４Ｇａｌβ４ＧｌｃβＣｅｒ
［式中、ｎ１は０または１であってＦｕｃα２の存在または非存在を表し、
ｎ２は０または１であってＦｕｃα４／３（分岐）の存在または非存在を表し、
ｎ３は０または１であってＦｕｃα４（分岐）の存在または非存在を表し、
ｎ４は０または１であって（フコシル化）Ｎ−アセチルラクトサミン伸長の存在または非存在を表し、
ｎ５は０または１であってＳａｃα３伸長の存在または非存在を表し、
Ｓａｃは末端構造、好ましくはα３結合を有するシアル酸であって、ただしＳａｃが存在する場合、ｎ５は１であり、その場合ｎ１は０である］
などのそのフコシル化および／または伸長バリアント
ならびに、ネオラクト（Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ）含有糖脂質、例えばネオラクトテトラオシルセラミドＧａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌβ４ＧｌｃβＣｅｒであって、好ましい構造はさらにその非還元末端のＧａｌβ４（Ｆｕｃα３）ＧｌｃＮＡｃ （Ｌｅｗｉｓ ｘ）、Ｆｕｃα２Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ Ｈ−２型、構造、および、Ｆｕｃα２Ｇａｌβ４（Ｆｕｃα３）ＧｌｃＮＡｃ（Ｌｅｗｉｓ ｙ）を有するもの
ならびに、好ましくは、
（Ｓａｃα３／６）ｎ５（Ｆｕｃα２）ｎ１Ｇａｌβ４（Ｆｕｃα３）ｎ３ＧｌｃＮＡｃβ３［Ｇａｌβ４（Ｆｕｃα３）ｎ２ＧｌｃＮＡｃβ３］ｎ４Ｇａｌβ４ＧｌｃβＣｅｒ
［ｎ１は０または１であってＦｕｃα２の存在または非存在を表し、
ｎ２は０または１であってＦｕｃα３（分岐）の存在または非存在を表し、
ｎ３は０または１であってＦｕｃα３（分岐）の存在または非存在を表し
ｎ４は０または１であって（フコシル化）Ｎ−アセチルラクトサミン伸長の存在または非存在を表し、
ｎ５は０または１であってＳａｃα３／６伸長の存在または非存在を表し、
Ｓａｃは末端構造、好ましくはα３結合を有するシアル酸（ＳＡ）、またはα６結合を有するシアル酸であって、ただしＳａｃが存在する場合、ｎ５は１であり、その場合ｎ１は０であり、およびシアル酸がα６結合により結合する場合、好ましくはｎ３も０である］
などのそのフコシル化および／または伸長バリアント等が挙げられる。
好ましい幹細胞スフィンゴ糖脂質グリカンプロファイル、組成、およびマーカー構造
本願発明者らは幹細胞糖脂質グライコームを、遊離させた遊離グリカンの質量分析プロファイリングにより記載し、約８０個のグリカンシグナルを各種幹細胞型から明らかにすることができた。中性グリカンの提案された単糖組成は２−７Ｈｅｘ、０−５ＨｅｘＮＡｃ、および０−４ｄＨｅｘからなっていた。酸性グリカンシグナルの提案された単糖組成は０−２ＮｅｕＡｃ、２−９Ｈｅｘ、０−６ＨｅｘＮＡｃ、０−３ｄＨｅｘ、および／または０−１硫酸もしくはリン酸エステルからなっていた。本発明は特に、このような幹細胞グリカンプロファイルならびに／または本発明において幹細胞に関して記載される使用のための構造の、分析およびターゲッティングに関する。
本発明はさらに、特に、実施例に記載されるような幹細胞型に特異的なスフィンゴ糖脂質グリカンシグナルに関する。好ましい一態様において、ｈＥＳＣに典型的なグリカンシグナル、優先的には８７６および８９２等がそれらの分析において用いられ、より優先的にはＦｕｃＨｅｘＨｅｘＮＡｃＬａｃであって、ここでα１，２−Ｆｕｃはα１，３／４−Ｆｕｃ、およびＨｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ１Ｌａｃに対して、ならびにより優先的にはＧａｌβ３［Ｈｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ１］Ｌａｃに対して、優先的である。他の好ましい態様において、ＭＳＣ、特にＣＢ ＭＳＣに典型的なグリカンシグナル、優先的には１４６０および１２９８等、ならびに大型中性糖脂質、特にＨｅｘ２−３ＨｅｘＮＡｃ３Ｌａｃ、より優先的にはポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン鎖、さらに優先的にはβ１，６−分岐、および優先的には上記のＩＩ型ＬａｃＮＡｃエピトープを末端とするものが、本発明に記載される使用のＭＳＣとの関連で使用される。
本実験で幹細胞スフィンゴ糖脂質グリカンにおいて示された末端グリカンエピトープは、幹細胞の識別またはグリカンを介した幹細胞に対する特異的結合、および本発明の他の使用において有用であり、Ｇａｌ、Ｇａｌβ４Ｇｌｃ（Ｌａｃ）、Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ（ＬａｃＮＡｃ ２型）、Ｇａｌβ３、非還元末端ＨｅｘＮＡｃ、Ｆｕｃ、α１，２−Ｆｕｃ、α１，３−Ｆｕｃ、Ｆｕｃα２Ｇａｌ、Ｆｕｃα２Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ（Ｈ ２型）、Ｆｕｃα２Ｇａｌβ４Ｇｌｃ（２’−フコシルラクトース）、Ｆｕｃα３ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ４（Ｆｕｃα３）ＧｌｃＮＡｃ（Ｌｅｘ）、Ｆｕｃα３Ｇｌｃ、
Ｇａｌβ４（Ｆｕｃα３）Ｇｌｃ（３−フコシルラクトース）、Ｎｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２，３、およびＮｅｕ５Ａｃα２，６の末端エピトープ等が挙げられる。本発明はさらに、全幹細胞スフィンゴ糖脂質グライコームおよび／またはグライコーム内の全末端エピトーププロファイルに関する。
本願発明者らはさらに、ｈＥＳＣにおいて、ＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４発生関連抗原に対応するグリカンシグナル、および幹細胞グライコーム中におけるそのモル比を分析することができた。本発明はさらに、全グライコームまたはサブグライコーム中のこのような幹細胞エピトープの定量的分析に関するものであり、これは表面抗原のみを認識する抗体のより効果的な代替として有用である。さらなる一態様において、本発明は、マウスＥＳ細胞におけるＳＳＥＡ−１発現と対比した、ｈＥＳＣにおけるα１，２−フコシル化抗原の発現に関する実施例において示されるように、全グリカンプロファイルの研究によって全グライコームプロファイル中の隠れた発生および／または幹細胞抗原の発現を発見および分析することに関する。
本発明は、本発明の各種細胞材料中の両者の構造型の特徴的変異（同様な対照細胞または混入細胞等と比較して上昇または低下した発現）を明らかにした。該構造は３つの異なるグライコーム型：Ｎ−グリカン、Ｏ−グリカン、および糖脂質、内の特徴的かつ相違する発現により明らかにされた。本発明は、グリカン構造が幹細胞の特徴的な特性であり、本発明の各種分析に有用であることを明らかにした。これらの量ならびにエピトープおよび／または誘導体の相対量は、細胞株間で、または増殖中、貯蔵中、もしくはサイトカインおよび／もしくはホルモン等のエフェクター分子による誘導中に異なった条件に曝露された細胞間において、相違する。
細胞培養のための好ましい結合剤分子
細胞培養法のための好ましい結合剤分子としては、レクチン、抗体、およびグリカン修飾酵素等が挙げられる。
レクチン
特定のレクチン分子は、細胞培養下の細胞を維持するための好ましい分子の群であると考えられる。より好ましい群のレクチンとしては本発明の末端グリカンエピトープを対象とする植物レクチンおよび動物レクチン等が挙げられる。
ａ）植物レクチン。植物レクチンは、これらが非哺乳動物の細胞培養物または生物学的材料由来である場合に特に好ましい。
ｂ）好ましい動物レクチンとしてはガレクチンおよびセレクチン等が挙げられる。
レクチンは特に、これらが非動物供給源、例えば植物または非哺乳動物または非動物細胞培養物に由来する場合に好ましい。好ましい細胞培養物としては微生物細胞培養物、例えば細菌または菌類またはイースト細胞培養物または植物細胞培養物が挙げられる。
レクチンはタンパク質または糖タンパク質であり、一般に植物または海生動物（細菌、ウイルス、および哺乳動物からのレクチンも周知である）から得られ、特定の糖または糖類、通常は単または二糖構造に対して結合特異性を有する。例えば、Ｃｏｎｃａｎｖａｌｉｎ Ａ（Ｃｏｎ Ａ）は．アルファ．−Ｄ−Ｇｌｃおよび．アルファ．−Ｄ−Ｍａｎを結合する。抗原に対する抗体結合のようなレクチン結合は、非共有結合性であり、可逆的である（典型的には十分な濃度の糖リガンドによる。従って、例えば、グルコースまたはマンノース（または．アルファ．−メチルマンノシド−）の溶液は、細胞に、または固定化糖タンパク質に結合したＣｏｎ Ａを遊離させる。植物レクチンの詳細な記載については、例えば、ＥＪＭ Ｖａｎ Ｄａｍｍｅ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｌｅｃｔｉｎｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９８を参照のこと；市販のレクチンについてはウェブサイトｈｔｔｐ ：／／ｗｗｗ．ｐｌａｂ．ｋｕ．ｄｋ／ｔｃｂｈ／及びｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ．ｃｏｍ／Ｌｅｃｔｉ−ｎｓ／Ｌｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌも参照のこと。他の有用な総説としてはＧｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｉ Ｊ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ａｄｖ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：１２７−３４０；Ｄ．Ｍｉｒｅｌｍａｎ（ｅｄ．），Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｌｅｃｔｉｎｓ ａｎｄ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８６）；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ Ｉ Ｊ，Ｉｎｄｉａｎ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ，１９９０，２７：３６８−３６９等が挙げられる。
レクチンは直接表面上に（受動的に）固定化することができ、または、抗体のように、サンドイッチ様式で用いることができ、この場合第１のレクチン結合タンパク質はレクチンに対する結合特異性および親和性を有し（例えば抗レクチン抗体または、レクチンがビオチン化されている場合はストレプトアビジン）、該レクチンは結合剤として働き、第１のレクチン結合タンパク質に非共有結合的に結合する。該レクチンは捕捉剤として作用し、その特異的標的、好ましくは特定のグリカン構造を細胞表面上に提示する細胞を結合する。典型的には、このようなグリカン構造は糖タンパク質または糖脂質上の炭水化物鎖の形態である。
下記の表Ａに、多数の有用なレクチンおよびそれらの糖結合特異性を列挙する。
さらに本発明においてレクチンとして含められるのは、共有結合的に結合されたレクチン−抗体またはレクチン−抗原複合体である（例えばＣｈｕ、米国特許第４，４９３，７９３号を参照のこと）。
本発明におけるさらに他の種類の結合剤は、細胞膜の脂質二重層に対して親和性を有する塩基性分子、例えばプロタミンおよびハチ毒ペプチド、メリチンの膜結合部分である。これらの標的構造は正式に「リガンド」ではないかもしれないが、概念は同じである−固体表面に固定化されたこの結合剤に結合する細胞の親和性捕捉。
表Ａ レクチンおよびそれらの結合特異性
Figure 2010516239
幹細胞の結合剤との接触
調製された幹細胞を結合剤と接触させることができる。これは、例えば、単純に結合剤を幹細胞調製物の培養物と混合することにより行うことができる。混合は幹細胞の生存能力を維持することができる多くの適した容器内で行うことができる。前記容器としては組織培養フラスコ、コニカルチューブ、培養バッグ（ｃｕｌｔｕｒｅ ｂａｇ）、バイオリアクター、または連続的に混合される培養液（ｃｕｌｔｕｒｅｓ）等が挙げられるがこれらに限定されない。幹細胞／ＬＰＣＭ混合物は次いで所望のように増殖させられる。
調製された幹細胞を表面上の結合剤と接触させることができる。これは、例えば、結合剤を培養皿上にコーティングすることにより行うことができる。コーティングは幹細胞の生存能力を維持することができる多くの適した容器内で行うことができる。前記容器としては組織培養フラスコ、コニカルチューブ、培養バッグ（ｃｕｌｔｕｒｅ ｂａｇ）、バイオリアクター、または培養液（ｃｕｌｔｕｒｅｓ）等が挙げられるがこれらに限定されない。幹細胞集団は次いで所望のように増殖させられる。幹細胞の増殖および結合剤との接触の例を実施例１０および２２に示す。細胞培養ウェルのコーティング処理を実施例１０に示す。
幹細胞の生存能力を維持するのに適した培養皿および容器をコーティングする方法は当業者に公知である。典型的には、試薬、例えば、本発明の結合剤をバッファー中で培養皿の表面上に塗布し、一晩接着させ、洗浄して、幹細胞をウェル上にプレーティングして増殖させる。本発明の結合剤を表面上にコーティングおよび共有結合的に連結するためのさらなるプロトコル、および幹細胞培養物の利用については、当業者は、例えばＰｉｅｒｃｅ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｂｏｏｋ （ｗｗｗ．ｐｉｅｒｃｅｎｅｔ．ｃｏｍ／）を参考にすることができる。
上記に示す通り、本発明の方法は好ましくは表面に結合した結合剤を用いる。該表面はそこに結合した、または組み込まれた結合剤を保つことができ、生体適合性、すなわち刺激されるべき標的細胞に対して実質的に非毒性の任意の表面であってよい。生体適合性表面は生分解性または非生分解性であってよい。該表面は天然または合成であってよく、合成表面はポリマーであってよい。他のポリマーとしてはポリエステル、ポリエーテル、ポリアンヒドリド（ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅｓ）、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリオルトエステル、ポリホスファゼン、ポリ酢酸ビニル、ブロック共重合体、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、またはポリウレタン等が挙げられる。前記ポリマーは乳酸または共重合体であってよい。共重合体は乳酸およびグリコール酸（ＰＬＧＡ）を含んでいてよい。非生分解性表面はポリ（ジメチルシロキサン）およびポリ（エチレン−酢酸ビニル）等のポリマーを含んでいてよい。生体適合性表面としては例えば、ガラス、（例えばバイオガラス）、コラーゲン、金属、ヒドロキシアパタイト、アルミン酸塩、バイオセラミック材料、ヒアルロン酸ポリマー、アルギン酸塩、アクリル酸エステルポリマー、乳酸ポリマー、グリコール酸ポリマー、乳酸／グリコール酸ポリマー、精製タンパク質、精製ペプチド、または細胞外マトリクス組成物等が挙げられる。表面を有する他のポリマーは、ガラス、シリカ、シリコン、ヒドロキシアパタイト、ヒドロゲル、コラーゲン、アクロレイン、ポリアクリルアミド、ポリプロピレン、ポリスチレン、ナイロン、または任意の数のプラスチックまたは合成有機ポリマー等を含んでいてよい。前記表面は生物学的構造、例えばリポソームを含んでいてよい。前記表面は脂質、プレート、バッグ、ペレット、ファイバー、メッシュ、または粒子の形態であってよい。粒子はコロイド粒子、ミクロスフィア、ナノ粒子、ビーズ等を含んでいてよい。各種態様において、市販の表面、例えばビーズまたは他の粒子は有用である（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ；Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｗｅｄｅｎ；ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ．ＴＭ．，Ｄｙｎａｌ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；ＰＵＲＡＢＥＡＤＳ．ＴＭ．，Ｐｒｏｍｅｔｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
ビーズが用いられる場合、該ビーズは標的細胞の刺激を達成する任意の径のものであってよい。一態様において、ビーズは好ましくは約５ナノメートル〜約５００ｕｍの径である。従って、ビーズ径の選択はビーズが役割を果たすであろう具体的な使用によって異なる。例えば、濾過によるビーズの分離が望まれる場合、５０．ｍｕ．ｍ以上のビーズ径が典型的に用いられる。さらに、常磁性ビーズが用いられる場合、ビーズは典型的には約２．８．ｍｕ．ｍ〜約５００．ｍｕ．ｍ、およびより好ましくは約２．８．ｍｕ．ｍ〜約５０．ｍｕ．ｍの径の範囲である。最後に、約１０ｎｍという小ささであり得る超常磁性ナノ粒子を用いることを選択することができる。従って、上記考察から容易に明らかであるように、事実上任意の粒径を利用することができる。
結合剤は表面に、当該分野において公知で利用可能な各種の方法により、付着させて、結合させて、または組み込んでよい。付着は共有結合性または非共有結合性、静電気的、または疎水性であってよく、化学的、機械的、酵素的、または他の手段等の各種の付着手段により達成することができ、それにより結合剤が細胞を刺激／調節することができる。例えば、まず抗体を表面に付着させ、またはアビジンもしくはストレプトアビジンを表面に付着させ、ビオチン化結合剤／抗体に結合させてよい。抗体は表面に抗イディオタイプ抗体を介して付着させてよい。他の例としては、抗体を結合する表面に付着させたプロテインＡまたはプロテインＧ、または他の非特異的抗体結合分子の使用等が挙げられる。あるいは、結合剤は表面に化学的手段により、例えば市販の架橋剤（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．）を用いた表面への架橋を使用し、または他の手段により、付着させてよい。特定の態様において、結合剤は表面に共有結合的に結合させられる。さらに、一態様においては、市販のトシル活性化ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ．ＴＭ．またはエポキシ表面反応性基を有するＤＹＮＡＢＥＡＳ．ＴＭ．を、目的とするポリペプチド結合剤とともに製品の使用説明書に従いインキュベートする。簡単に述べると、このような条件は典型的にはｐＨ４〜ｐＨ９．５のリン酸緩衝液中における、４〜３７℃の範囲の温度でのインキュベートを伴う。
共有結合
結合剤で被覆された表面は上記および実施例に記載される。結合剤、例えばレクチンおよび抗体によるコーティングは、２つの反応性アルデヒド基の生成を伴う一連の化学的カップリング反応によって行うことができ、この方法は当業者に公知である。例えば、どのような特定の理論にも拘束されるものではないが、アルデヒド部分（ＲＣＨＯ）が１級アミン（Ｒ’ＮＨ．ｓｕｂ．２）と反応すると、比較的不安定なイミン部分（Ｒ’Ｎ ＣＨＲ）である反応産物と平衡に達する。カップリング反応は酸化に対するものと同一の、糖タンパク質を損傷から保護するように考案された条件下で行うことができる。糖タンパク質および生体材料表面の間の結合を安定化するために、それに続くイミン部分の還元的アルキル化が、例えば水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ほう素ナトリウム、およびアミンボラン等の還元剤（すなわち安定化剤）を用いて行われ、２級アミン（Ｒ’ＮＨ−−ＣＨ．ｓｕｂ．２Ｒ）が形成される。この反応も酸化に対するものと同一の条件下で行われ得る。典型的には、しかし、カップリングおよび安定化反応は中性またはやや塩基性の溶液中において、約０〜５０度Ｃの温度で行われる。好ましくは、カップリングおよび安定化反応に対して、ｐＨは約６〜１０であり、温度は約４〜３７度Ｃである。これらの反応（カップリングおよび安定化）は、ほんの数分間または何時間もの間行われる。一般に、反応は２４時間以内に完了する（すなわちカップリングおよび安定化）。
一局面において、特定のレクチン等の結合剤は単一起源または複数起源であってよく、抗体またはその断片であってよい。これらの結合剤は表面と、上記で考察される各種の付着手段のいずれかにより表面に結合される。
表面と結合されるレクチンＥＣＡ分子は、例えばそれを発現する植物細胞から単離され得る。ｈＥＳＣを結合し、それを未分化状態で維持する能力を保持するＥＣＡレクチン分子の断片、変異体、またはバリアントも用いることができる。さらに、当業者は幹細胞のサブセットの増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）／接着／形態／成長（ｇｒｏｗｔｈ）状態の活性化／調節において有用な任意の結合剤もビーズまたは培養槽表面または任意の表面上に固定化することができることを認識するであろう。さらに、表面への結合剤の共有結合は１つの好ましい方法論であるが、二次モノクローナル抗体による吸着または捕捉も用いてよい。表面に付着する特定の結合剤の量は、表面がビーズのものである場合はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析により容易に測定することができ、表面が例えば組織培養皿、メッシュ、ファイバー、バッグである場合は酵素結合免疫吸着（ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂａｎｔ）法（ＥＬＩＳＡ）により測定することができる。
一部の状況においては、細胞を最初に結合剤との接触の下で増殖させ、次いで、例えば細胞を分化させる際に、他の培養条件下で増殖させる、組み合わせ培養系を用いることが望ましいであろう。例えば、幹細胞を結合剤との接触の下で継代し、次いでサイトカインおよび／または増殖因子を添加して幹細胞の分化および／または生物学的特徴の調節を行うことができる。
サイトカインはＩＬ−３、ＩＬ−６、ＳＣＦ、ＴＰＯ、およびｆｌｔ−３Ｌであり得る。
例えば表面上に固定化した結合剤の濃度は当業者により決定されうる。
結合剤の濃度は様々であり得、例えば温度、インキュベート時間、幹細胞の数、幹細胞において求められる所望の活性、幹細胞の種類、幹細胞の純度等によって異なる。幹細胞をその本来の供給源から単離し、フィーダー層の存在下で増殖させ、結合剤と接触させることができ、または幹細胞をその供給源から単離し、結合剤と接触させることができる。好ましくは、ｈＥＳＣを胚盤胞より得て結合剤で被覆した培養皿上で培養する。
本発明は、レクチンによる表面の幹細胞増殖促進および／または調節被覆密度、すなわち、幹細胞、好ましくはヒト胚幹細胞の増殖および／または調節を促進する被覆密度に関する。正確な有効密度は表面の形状および材質により異なると考えられる。実施例に記載の通り、本願発明者らは、レクチンによる増殖支持表面の有効な被覆を得ることができた。レクチンタンパク質／表面領域の適した被覆密度を得るために多量の被覆分子が必要な場合があり、当業者は本発明による好ましい被覆効率、好ましくは１ｎｇ〜１０００ｎｇタンパク質／ｃｍ２表面領域、より好ましくは１０ｎｇ〜１０００ｎｇ／ｃｍ２、さらに好ましくは１００ｎｇ〜９００ｎｇ／ｃｍ２、または最も好ましくは２００ｎｇ〜８００ｎｇ／ｃｍ２を得ることができる。表面形状に基づく有効な被覆密度は当業者に公知であり、文献、例えばＮｕｎｃマイクロタイターウェルプレートの製造者から入手可能なＮｕｎｃ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．６“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｉｎ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｔｏ ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ”に記載されている。
さらに、特定の型の細胞の増殖または分化を促進する条件を培養中に用いることができる。これらの条件としては、温度の変化；酸素／二酸化炭素含有量の変化；前記培地の濁度の変化；または、細胞培養の小分子調節剤、例えば栄養素、特定の酵素の阻害剤、特定の酵素の刺激剤、バルプロ酸（Ｂｕｇ，ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６５：２５３７−２５４１）、トリコスタチン−Ａ（Ｙｏｕｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ ６：３２８−３３６）、トラポキシンＡ（Ｋｉｊｉｍａ，ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６８：２２４２９−２２４３５）またはデプシペプチド（Ｇａｇｎｏｎ，ｅｔ ａｌ．，２００３，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ １４：１９３−２０２；Ｆｕｊｉｅｄａ，ｅｔ ａｌ．，２００５， Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ ２７：７４３−７４８）等のヒストン脱アセチル化活性の阻害剤（それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み入れられたものとする）、５−アザシチジン等のＤＮＡメチル基転移酵素活性の阻害剤、酵素ＧＳＫ−３の阻害剤（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ， ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｎａｔ Ｍｅｄ １２：８９−９８、参照によりその全体が本明細書に組み入れられたものとする）などへの曝露；等が挙げられるが、これらに限定されない。
先に述べられた各種因子が幹細胞の生存、複製、および分化のための能力に影響する。例えば、栄養素に関しては、アミノ酸タウリンは特定の条件下で優先的にマウス骨髄細胞の破骨細胞形成を阻害し（Ｋｏｉｄｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｒｃｈ Ｏｒａｌ Ｂｉｏｌ ４４：７１１−７１９）、アミノ酸Ｌ−アルギニンは赤血球分化および赤血球前駆細胞の増殖を刺激し（Ｓｈｉｍａ，ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｂｌｏｏｄ １０７：１３５２−１３５６）、Ｐ２Ｙ受容体を介して作用する細胞外ＡＴＰは造血および非造血幹細胞の両者に広範な変化を媒介し（Ｌｅｅ，ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ１７：１５９２−１６０４）、多孔質高分子足場に付着したアルギニン−グリシン−アスパラギン酸は骨芽細胞前駆体の分化および生存を増加させる（Ｈｕ，ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ Ａ ６４：５８３−５９０）（それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み入れられたものとする）。従って、当業者にとって、特定の型の幹細胞および／またはその前駆体の分化の誘導または生存能力の維持のために各種の栄養素を用いることは公知であろう。
細胞集団の刺激
本発明の方法は末端グリカン構造に結合する結合剤を接触させることによる幹細胞の刺激に関する。結合剤の細胞への結合はシグナル伝達経路の引き金となり、特定の表現型上のまたは生物学的な変化を細胞において活性化する。細胞の活性化は、異常な細胞において、正常な細胞機能を増進し、または正常な細胞機能を開始させ得る。
結合剤の導入により、細胞の刺激を増大させることができ、または特定の細胞的事象（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｖｅｎｔ）を刺激することができる。この方法を、細胞表面末端グリカン構造の連結がシグナル伝達事象をもたらす任意の幹細胞に適用してよい。本発明はさらに、刺激された／調節された幹細胞を選択または培養するための方法を提供する。
記載される典型例は間葉系幹細胞の刺激である（実施例参照であるが、当業者は前記方法を他の幹細胞型に適用することができると容易に理解するであろう）。例えば、刺激または選択され得る細胞型としては造血幹細胞および造血前駆細胞（ＣＤ３４＋細胞）、多能性幹細胞、および多分化能幹細胞等が挙げられる。従って、本発明はこの方法論から生ずる細胞の集団、および特定の表現型上の特徴を有する間葉系幹細胞などの異なった表現型上の特徴を有する細胞集団も提供する。
以下に２つの例を示し、このような細胞表面グリカン構造の結合がどのように実際上の利益をもたらし得るか説明する。
一例において、結合剤（実施例のレクチンを参照のこと）による正常な間葉系幹細胞の活性化は、例えば形態学的変化および接着における変化をもたらす。本明細書に記載されるもののような人為的アプローチを用いることにより、特に促進された、調節された、および空間的に方向性のある、グリカンを有するタンパク質の連結を介して、「正常な」ｉｎ ｖｉｖｏ活性化の非存在下で上記の機能を促進し、向上させ、またはそれに影響を与えることができる。利益は、治療用途のための、より多数の注入可能かつより強固な細胞を生ずるｉｎ ｖｉｔｒｏにおける向上した細胞の拡張であってよい。他の利益は表面への向上した細胞接着であってよい。
拡張に先だって、幹細胞の供給源が被検者から得られる。「被検者」という語は、免疫反応を誘発させることができる生物（例えば哺乳類）を含むことが意図される。被検者の例としてはヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそれらのトランスジェニック種（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｓｐｅｃｉｅｓ）等が挙げられる。
本発明の方法論を用いて幹細胞の集団の長期の刺激／調節を維持することが有利であり得る。特に好ましいのは、数回の継代の間未分化状態で維持することができ、その表現型上の特徴を維持するヒト胚幹細胞である。
好ましい一態様において、培養フラスコの表面は結合剤、例えばＥＣＡレクチン（中間層を有するまたは有しない）で被覆され、ヒト胚幹細胞の集団が該表面に添加され、接着させられる。
本発明の表面は、任意のパターンまたは配列、例えばポリマー表面上のあらかじめ選択されたパターンで並ぶ点のマイクロアレイパターンで分布する結合剤を用いて調製され得る。従って、例えば、１または複数種の異なる型の結合剤、例えばレクチンまたは抗体のマイクロアレイを、本明細書に記載される表面に固定化してよい。増殖または結合または調節または無傷細胞に加え、本明細書に記載の、例えば抗体および／またはレクチンマイクロアレイの形態の被覆表面は、幹細胞の増殖、接着、もしくは形態、または幹細胞、幹細胞ライセートもしくは他の細胞内調製物上の任意の多数の対応する抗原もしくはエピトープを、検出または定量または調節するのに用いられる。従って、本発明は、幹細胞の調節および／または分析のための抗体またはレクチン等の本発明の結合剤の高密度アレイを含んだ装置を製造するための方法を提供する。このような装置は幹細胞集団、たとえばｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて選択的な様式で分化または他の細胞活性を誘導するように処理された細胞における、特異的グリカン構造の発現量を定量するための方法において有用であり得る。これらの装置および方法は薬物等の検査薬で処理された（もしくは処理されない）または分化するように誘導された幹細胞のハイスループットな分析に容易に適合させることができる。例えば、幹細胞を結合剤と接触させ、好ましくは結合剤被覆アレイ上で増殖させ、各種薬物で処理し、その後溶解してライセートを回収し、または培養上清を回収し、分析することができる。
ｈＥＳＣ
本開示の多能性ＥＳ細胞は系統非拘束（ｕｎｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）（すなわち、それらは内胚葉、中胚葉および外胚葉等の特定の胚系統（ｇｅｒｍ ｌｉｎｅａｇｅ）に拘束されない）である。多能性ヒトＥＳ細胞も、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両者において、高い自己複製能を有する場合があり、分化能を有する。あるいは、細胞、組織、または器官内で、休眠または静止したままでいることができる。ヒトＥＳ細胞が単離される、単離された胚盤胞は、体外受精、卵細胞質内精子注入法、および卵細胞質移植等の当業者に周知の多くの方法により生成することができる。特定の態様においては、単離されたヒトＥＳ細胞を、マウス胚性線維芽細胞、ヒト胚性線維芽細胞、または成体ヒト組織から得られた線維芽細胞様細胞等であるが限定されない胚性線維芽細胞上で増殖させる。好ましい一態様においては、ヒトＥＳ細胞を結合剤の存在下で増殖させる。
好ましい態様に記載される胚盤胞から得られたヒトＥＳ細胞の集団は、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ１、Ｓｏｘ−２、ＦＧＦ４、Ｕｔｆ１、Ｔｈｙ１、Ｃｒｉｐｔｏｌ、ＡＢＣＧ２、Ｄｐｐａ５、ｈＴＥＲＴ、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ−４３、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ−４５等であるが限定されないＥＳ細胞の特異的マーカーを発現する。ヒトＥＳ細胞は分化した細胞の特徴的なマーカー、Ｋｅｒａｔｉｎ ５、Ｋｅｒａｔｉｎ １５、Ｋｅｒａｔｉｎ １８、Ｓｏｘ−１、ＮＦＨ（外胚葉）；ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｍｓｘ１、ＭｙｏＤ、ＨＡＮＤ１、心臓アクチン（中胚葉）；ＧＡＴＡ４、ＡＦＰ、ＨＮＦ−４ａ、ＨＮＦ−３０、アルブミン、およびＰＤＸ １（内胚葉）を発現しない。ヒトＥＳ細胞はステージ特異的胚抗原３（ＳＳＥＡ−３）、ＳＳＥＡ−４、腫瘍認識抗原１−６０（ＴＲＡ−１−６０）、ＴＲＡ−１−８１、Ｏｃｔ−４、Ｅ−カドヘリン、コネキシン−４３、およびアルカリホスファターゼ等の細胞表面マーカーも発現する。発現量は免疫細胞化学により検出され得る。本開示のヒトＥＳ細胞株の大規模な分子特性解析は、初期胚発生に対する極めて重要な知見を提供し得るものである。
本開示の特定の態様においては、単離されたヒトＥＳ細胞を好ましくは増殖因子を含む栄養培地中で培養し、手作業での継代によって維持する。本明細書で用いられる「増殖因子」という語は、細胞表面受容体に結合し、主な結果として、細胞増殖の活性化、およびシグナル伝達経路の活性化による分化を伴うタンパク質のことを指す。増殖因子／添加物の大部分は極めて汎用性が高く、多数の異なる細胞型において細胞分裂を刺激することができるが、一部の増殖因子の特異性は特定の細胞型に限定される。多能性ＥＳ細胞に特異的な増殖因子を使用し、ニューロン、肝細胞、心筋細胞、ベータ島、軟骨細胞、骨芽細胞、筋細胞等の各種系統に分化するようにそれらを誘導することができる。ＥＳ細胞培地の一例は、８０％ ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、１５％ ＥＳ試験済ＦＢＳ、５％ 血清代替物、１％ 非必須アミノ酸溶液、１ｍＭ グルタミン（ＧＩＢＣＯ）、０．１％ ベータメルカプトエタノール、４ｎｇ／ｍｌ ヒトｂＦＧＦおよび１０ｎｇ／ｍｌ ヒト白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含む。細胞を手作業で継代する方法が、一般的に用いられる酵素処理による継代の方法よりも有利であり、これは細胞株の遺伝的安定性を維持する手助けとなるためである。細胞株の正常な核型の維持はその治療目的における利用のために重要である。
胚幹細胞の分析のために特に好ましいエピトープおよび抗体結合剤
胚幹細胞を用いた抗体標識実験表１９は、非修飾二糖Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ（Ｌｅ ｃ、Ｌｅｗｉｓ ｃ）およびフコシル化誘導体Ｈ型およびＬｅｗｉｓ ｂを認識する、１型Ｎ−アセチルラクトサミン抗原認識抗体の特異性を明らかにした。前記抗体は幹細胞の培養に用いられるマウスフィーダー細胞ｍＥＦと比べ、ｈＥＳＣ細胞集団の認識において有効であった。
特異的な各種のＨ２型認識抗体は胚幹細胞の各種亜集団を認識することが示され、そのため細胞の亜集団の定義に対する有用性が明らかになった。本発明はさらに、胚幹細胞上の特異的Ｌｅｗｉｓ ｘおよびシアリルＬｅｗｉｓ ｘ構造を明らかにした（本発明の図を参照のこと）。
ｈＥＳＣのための好ましいエピトープおよびレクチン結合剤（本発明の図を参照のこと）
他の好ましい結合剤および／またはレクチンは、ＥＣＡ（Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ ｃｒｉｓｔａｃａｌｌｉ）と同一のエピトープに結合する結合剤を含む。好ましい一態様において、前記レクチンはＸＸＸＸエピトープに結合する。より好ましいレクチンはレクチンＥＣＡを含む。このエピトープは幹細胞の増殖または幹細胞もしくは幹細胞のサブセットの状態の調節に有用である。より好ましい態様において、幹細胞はヒト胚幹細胞を含む。ＥＣＡ被覆表面、好ましくは培養皿は、本発明の好ましい一態様である。好ましい一態様においては、ｈＥＳＣはＥＣＡ被覆表面上で増殖させられ、本質的にフィーダー細胞を含まない。好ましくは、ＥＣＡ被覆表面はｈＥＳＣを実質的に未分化の状態で維持する。好ましい一態様においては、ｈＥＳＣはマウスフィーダー細胞に曝露されることなく、直接胚盤胞から得られる。他の好ましい態様においては、ｈＥＳＣ培地は馴化培地、好ましくはｍＥＦまたはｈＥＦ馴化のものを含む。好ましくは、ｈＥＳＣはマウスフィーダー細胞上で増殖させられ、ＥＣＡ被覆プレート上に移されて増殖させられる。より好ましい一態様において、ｈＥＳＣは胚盤胞から得られ、ＥＣＡ被覆表面上で増殖させられる。
他の好ましい結合剤および／または抗体は、ＧＦ２８７（Ｈ１型）と同一のエピトープに結合する結合剤を含む。好ましい一態様において、抗体はＦｕｃα２Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡエピトープに結合する。より好ましい抗体は、Ａｂｃａｍによるクローン１７−２０６（ａｂ３３５５）の抗体を含む。このエピトープは幹細胞、好ましくはヒト胚幹細胞の分化段階および／または多能性の検出、単離および評価に適しており、用いることができる。前記検出はｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＦＡＣＳ用途および／または細胞系統特異的用途のために行われ得る。この抗体は幹細胞、好ましくはヒト胚幹細胞を、フィーダーおよび幹細胞を含んだ細胞の混合物からポジティブに単離および／または分離および／または濃縮するのに用いることができる。結合剤およびそれに認識されるエピトープは幹細胞の増殖においても有用であり、幹細胞または幹細胞のサブセットの状態の調節、接着状態の変化、分化関連状態、増殖速度の変化が、幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤に接触させることにより提供される。結合剤は表面上での幹細胞の増殖のための結合剤のスクリーニングにおいても有用であり、幹細胞または幹細胞のサブセットの状態の調節、接着状態の変化、分化関連状態、増殖速度の変化が、幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤に接触させることにより提供される。
他の好ましい結合剤および／または抗体は、ＧＦ２７９（Ｌｅｗｉｓ ｃ、Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ）と同一のエピトープに結合する結合剤を含む。好ましい一態様において、抗体は複合糖質中、より好ましくは糖タンパク質およびラクトテトラオシルセラミド等の糖脂質中のＧａｌβ３ＧｌｃＮＡｃエピトープに結合する。より好ましい抗体は、ＡｂｃａｍによるクローンＫ２１（ａｂ３３５２）の抗体を含む。このエピトープは幹細胞、好ましくはヒト胚幹細胞の分化段階および／または多能性の検出、単離および評価に適しており、用いることができる。前記検出はｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＦＡＣＳ用途および／または細胞系統特異的用途のために行われ得る。この抗体は幹細胞、好ましくはヒト胚幹細胞を、フィーダーおよび幹細胞を含んだ細胞の混合物からポジティブに単離および／または分離および／または濃縮するのに用いることができる。結合剤およびそれに認識されるエピトープは幹細胞の増殖においても有用であり、幹細胞または幹細胞のサブセットの状態の調節、接着状態の変化、分化関連状態、増殖速度の変化が、幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤に接触させることにより提供される。結合剤は表面上での幹細胞の増殖のための結合剤のスクリーニングにおいても有用であり、幹細胞または幹細胞のサブセットの状態の調節、接着状態の変化、分化関連状態、増殖速度の変化が、幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤に接触させることにより提供される。
他の好ましい結合剤および／または抗体は、ＧＦ２８８（Ｇｌｏｂｏ Ｈ）と同一のエピトープに結合する結合剤を含む。好ましい一態様において、抗体はＦｕｃα２Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃβエピトープ、より好ましくはＦｕｃα２Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃβ３ＧａｌαＬａｃＣｅｒエピトープに結合する。より好ましい抗体は、ＧｌｙｃｏｔｏｐｅによるクローンＡ６９−Ａ／Ｅ８（ＭＡＢ−Ｓ２０６）の抗体を含む。このエピトープは幹細胞、好ましくはヒト胚幹細胞の分化段階および／または多能性の検出、単離および評価に適しており、用いることができる。前記検出はｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＦＡＣＳ用途および／または細胞系統特異的用途のために行われ得る。この抗体は幹細胞、好ましくはヒト胚幹細胞を、フィーダーおよび幹細胞を含んだ細胞の混合物からポジティブに単離および／または分離および／または濃縮するのに用いることができる。結合剤およびそれに認識されるエピトープは幹細胞の増殖においても有用であり、幹細胞または幹細胞のサブセットの状態の調節、接着状態の変化、分化関連状態、増殖速度の変化が、幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤に接触させることにより提供される。結合剤は表面上での幹細胞の増殖のための結合剤のスクリーニングにおいても有用であり、幹細胞または幹細胞のサブセットの状態の調節、接着状態の変化、分化関連状態、増殖速度の変化が、幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤に接触させることにより提供される。
他の好ましい結合剤および／または抗体は、ＧＦ２８４（Ｈ２型）と同一のエピトープに結合する結合剤を含む。好ましい一態様において、抗体はＦｕｃα２Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃエピトープに結合する。より好ましい抗体は、ＡｃｒｉｓによるクローンＢ３９３（ＤＭ３０１５）の抗体を含む。このエピトープは幹細胞、好ましくはヒト胚幹細胞の分化段階および／または多能性の検出、単離および評価に適しており、用いることができる。前記検出はｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＦＡＣＳ用途および／または細胞系統特異的用途のために行われ得る。この抗体は幹細胞、好ましくはヒト胚幹細胞を、フィーダーおよび幹細胞を含んだ細胞の混合物からポジティブに単離および／または分離および／または濃縮するのに用いることができる。結合剤およびそれに認識されるエピトープは幹細胞の増殖においても有用であり、幹細胞または幹細胞のサブセットの状態の調節、接着状態の変化、分化関連状態、増殖速度の変化が、幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤に接触させることにより提供される。結合剤は表面上での幹細胞の増殖のための結合剤のスクリーニングにおいても有用であり、幹細胞または幹細胞のサブセットの状態の調節、接着状態の変化、分化関連状態、増殖速度の変化が、幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤に接触させることにより提供される。
他の好ましい結合剤および／または抗体は、ＧＦ２８３（Ｌｅｗｉｓ ｂ）と同一のエピトープに結合する結合剤を含む。好ましい一態様において、抗体はＦｕｃα２Ｇａｌβ３（Ｆｕｃα４）ＧｌｃＮＡｃエピトープに結合する。より好ましい抗体は、Ａｃｒｉｓによるクローン２−２５ＬＥ（ＤＭ３１２２）の抗体を含む。このエピトープは幹細胞、好ましくはヒト胚幹細胞の分化段階および／または多能性の検出、単離および評価に適しており、用いることができる。前記検出はｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＦＡＣＳ用途および／または細胞系統特異的用途のために行われ得る。この抗体は幹細胞、好ましくはヒト胚幹細胞を、フィーダーおよび幹細胞を含んだ細胞の混合物からポジティブに単離および／または分離および／または濃縮するのに用いることができる。結合剤およびそれに認識されるエピトープは幹細胞の増殖においても有用であり、幹細胞または幹細胞のサブセットの状態の調節、接着状態の変化、分化関連状態、増殖速度の変化が、幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤に接触させることにより提供される。結合剤は表面上での幹細胞の増殖のための結合剤のスクリーニングにおいても有用であり、幹細胞または幹細胞のサブセットの状態の調節、接着状態の変化、分化関連状態、増殖速度の変化が、幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤に接触させることにより提供される。
他の好ましい結合剤および／または抗体は、ＧＦ２８６（Ｈ２型）と同一のエピトープに結合する結合剤を含む。好ましい一態様において、抗体はＦｕｃα２Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃエピトープに結合する。より好ましい抗体は、ＡｃｒｉｓによるクローンＢ３９３（ＢＭ２５８Ｐ）の抗体を含む。このエピトープは幹細胞、好ましくはヒト胚幹細胞の分化段階および／または多能性の検出、単離および評価に適しており、用いることができる。前記検出はｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＦＡＣＳ用途および／または細胞系統特異的用途のために行われ得る。この抗体は幹細胞、好ましくはヒト胚幹細胞を、フィーダーおよび幹細胞を含んだ細胞の混合物からポジティブに単離および／または分離および／または濃縮するのに用いることができる。結合剤およびそれに認識されるエピトープは幹細胞の増殖においても有用であり、幹細胞または幹細胞のサブセットの状態の調節、接着状態の変化、分化関連状態、増殖速度の変化が、幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤に接触させることにより提供される。結合剤は表面上での幹細胞の増殖のための結合剤のスクリーニングにおいても有用であり、幹細胞または幹細胞のサブセットの状態の調節、接着状態の変化、分化関連状態、増殖速度の変化が、幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤に接触させることにより提供される。
他の好ましい結合剤および／または抗体は、ＧＦ２９０（Ｈ２型）と同一のエピトープに結合する結合剤を含む。好ましい一態様において、抗体はＦｕｃα２Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃエピトープに結合する。より好ましい抗体は、ＧｌｙｃｏｔｏｐｅによるクローンＡ５１−Ｂ／Ａ６（ＭＡＢ−Ｓ２０４）の抗体を含む。このエピトープは幹細胞、好ましくはヒト胚幹細胞の分化段階および／または多能性の検出、単離および評価に適しており、用いることができる。前記検出はｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＦＡＣＳ用途および／または細胞系統特異的用途のために行われ得る。この抗体は幹細胞、好ましくはヒト胚幹細胞を、フィーダーおよび幹細胞を含んだ細胞の混合物からポジティブに単離および／または分離および／または濃縮するのに用いることができる。結合剤およびそれに認識されるエピトープも幹細胞の増殖において有用であり、幹細胞または幹細胞のサブセットの状態の調節、接着状態の変化、分化関連状態、増殖速度の変化が、幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤に接触させることにより提供される。結合剤は表面上での幹細胞の増殖のための結合剤のスクリーニングにおいても有用であり、幹細胞または幹細胞のサブセットの状態の調節、接着状態の変化、分化関連状態、増殖速度の変化が、幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤に接触させることにより提供される。
フィーダー細胞、好ましくはマウスフィーダー細胞に結合する他の結合剤は、ＧＦ２８５（Ｈ２型）と同一のエピトープに結合する結合剤を含む。好ましい一態様において、抗体はＦｕｃα２Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、Ｆｕｃα２Ｇａｌβ３（Ｆｕｃα４）ＧｌｃＮＡｃ、Ｆｕｃα２Ｇａｌβ４（Ｆｕｃα３）ＧｌｃＮＡｃエピトープに結合する。より好ましい抗体は、ＡｃｒｉｓによるクローンＢ３８９（ＤＭ３０１４）の抗体を含む。このエピトープはフィーダー細胞、好ましくはヒト胚幹細胞を含む培養液中のマウスフィーダー細胞を検出、単離および評価するのに適しており、用いることができる。前記検出はｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＦＡＣＳ用途および／または細胞系統特異的用途のために行われ得る。この抗体はフィーダー細胞、好ましくはマウス胚フィーダー細胞を、フィーダーおよび幹細胞を含んだ細胞の混合物からポジティブに単離および／または分離および／または濃縮する（ネガティブに幹細胞を選択する）ために用いることができる。
幹細胞、好ましくはヒト幹細胞に結合する他の結合剤は、ＧＦ２８９（Ｌｅｗｉｓ ｙ）と同一のエピトープに結合する結合剤を含む。好ましい一態様において、抗体はＦｕｃα２Ｇａｌβ４（Ｆｕｃα３）ＧｌｃＮＡｃエピトープに結合する。より好ましい抗体は、ＧｌｙｃｏｔｏｐｅによるクローンＡ７０−Ｃ／Ｃ８（ＭＡＢ−Ｓ２０１）の抗体を含む。このエピトープは幹細胞、好ましくはフィーダー細胞を含む培養液中のヒト幹細胞を検出、単離および評価するのに適しており、用いることができる。前記検出はｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＦＡＣＳ用途および／または細胞系統特異的用途のために行われ得る。この抗体は幹細胞、好ましくはヒト幹細胞を、フィーダーおよび幹細胞を含んだ細胞の混合物からポジティブに単離および／または分離および／または濃縮する（ネガティブにフィーダー細胞を選択する）ために用いることができる。結合剤およびそれに認識されるエピトープは幹細胞の増殖においても有用であり、幹細胞または幹細胞のサブセットの状態の調節、接着状態の変化、分化関連状態、増殖速度の変化が、幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤に接触させることにより提供される。結合剤は表面上での幹細胞の増殖のための結合剤のスクリーニングにおいても有用であり、幹細胞または幹細胞のサブセットの状態の調節、接着状態の変化、分化関連状態、増殖速度の変化が、幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤に接触させることにより提供される。
染色された幹細胞の染色強度および細胞数、すなわち幹細胞上の本発明のグリカン構造は、単離および分化マーカーのための結合剤の適合性および有用性を表す。例えば、グリカン構造発現細胞の数が比較的少ないことは系統特異性、およびそのコロニーから選択／単離され、培養される場合のサブセットの選択に対する有用性を表す場合がある。少ない発現数とは、５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、３０％未満、または４０％未満である。さらに、発現量が１〜１０％、１０％〜２０％、１５〜２５％、２０〜４０％、２５〜３５％、または３５〜５０％である場合には少ない発現数と考えられる。典型的には、ＦＡＣＳ分析を行って、グリカン構造を発現する細胞のサブセットを濃縮、単離および／または選択することができる。
グリカン発現細胞の数が多いことは、多能性／多分化能マーカーにおける有用性、および結合剤が哺乳動物細胞の集団内の多能性または多分化能幹細胞を同定、分析、選択または単離するのに有用であることを表す場合がある。多い発現数とは５０％超、より好ましくは６０％超、さらに好ましくは７０％超、および最も好ましくは８０％、９０または９５％超である。さらに、発現量が５０〜６０、５５％〜６５％、６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜９０％、９０〜１００％、または９５〜１００％である場合には多い発現数と考えられる。典型的には、ＦＡＣＳ分析を行って、グリカン構造を発現する細胞のサブセットを濃縮、単離および／または選択することができる。
結合剤ＧＦ２７９、ＧＦ２８７、およびＧＦ２８９に認識されるエピトープおよび該結合剤は、培養液中の幹細胞の多能性および多分化能を分析するのに特に有用である。結合剤ＧＦ２８３、ＧＦ２８４、ＧＦ２８６、ＧＦ２８８、およびＧＦ２９０に認識されるエピトープおよび該結合剤は、幹細胞のサブセットを選択または単離するために特に有用である。これらのサブセットまたは亜集団をさらに増殖させ、ｉｎ ｖｉｔｒｏでそれらの分化能を、および分化した細胞または特定の分化経路に拘束された細胞を、研究することができる。
本明細書で用いられる百分率は、分析または実験にかけられた全細胞に対してどれだけ多くの細胞がグリカン構造を発現しているかの平均割合を意味する。例えば、幹細胞コロニー内でグリカン構造を発現する２０％の幹細胞は、視覚的に評価された際に、結合剤、例えば抗体染色が約２０％の細胞において観察され得ることを意味する。
コロニー内において、グリカン構造を有する細胞は特定の一領域に分布する場合があり、またはそれらは小パッチ状のコロニー内に分散している場合がある。パッチ状の観察された幹細胞は細胞系統特異的な研究、単離および分離のために有用である。パッチ状特性はＧＦ２８３、ＧＦ２８４、ＧＦ２８６、ＧＦ２８８、およびＧＦ２９０で観察された。
フィーダー細胞、好ましくはマウスフィーダー細胞、最も好ましくは胚線維芽細胞のポジティブセレクションのためには、ＧＦ２８５が有用である。この抗体は低い特異性を有しており、例えばｍＥＦ細胞においても観察されたＬｅｗｉｓ ｙへの結合を有し得る。これはほぼ全てのフィーダー細胞を染色するが、幹細胞においては、あったとしても非常にわずかな染色しか見出されない。該抗体はしかし、最適化された条件下では、胚様体（ｅｍｂｒｙｏｎａｌ ｂｏｄｉｅｓ）の薄表面（ｔｈｉｎ ｌａｙｅｒ）に結合することが明らかになり、これは胚様体のコアに対するＬｅｗｉｓ ｙ抗体に対して補完的であった。発現の全割合については表１９を参照のこと。
間葉系幹細胞およびそれに由来する分化した組織型幹細胞
間葉系幹細胞の分化状態の評価のために有用な抗体
実施例１４および表１９（下部）に、間葉系幹細胞および分化した間葉系幹細胞の標識を示す。
本発明は、抗体ＧＦ３０３、好ましくはＦｕｃα２Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ、およびＧＦ２７６により認識される構造が、間葉系幹細胞が骨原性に分化した幹細胞へと分化する際に現れることを明らかにした。さらに、Ｔｎ抗原に対応するＧａｌＮＡｃα基構造ＧＦ２７８、およびＧＦ２７７、シアリル−Ｔｎが同時に増加することも明らかにした。
本発明はさらに、間葉系幹細胞（特に骨髄由来）および骨原性に分化した間葉系幹細胞の両者に特徴的ないくつかの標的構造に対する結合剤のための本発明による好ましい使用に関する。好ましい標的構造は抗体ＧＦ２７５により認識され得る１つのＧａｌＮＡｃα基構造を含み、該抗体の抗原は好ましくは該抗体に対して公知のシアル化Ｏ−グリカン糖ペプチドエピトープである。間葉系および骨原性に分化した幹細胞の両者に発現するエピトープはさらに２つの特徴的グロボ型抗原構造：結合がグロボトリオース（Ｇｂ３）型抗原に対応するＧＦ２９８の抗原、およびグロボテトラオース（Ｇｂ４）型抗原に対応するＧＦ２９７の抗原を含む。本発明はさらに、末端２型ラクトサミンエピトープが特に両型の間葉系幹細胞に発現していることを明らかにしたものであり、これは、実施例１４表１９において、両細胞をＨＩＩ型抗原を認識する抗体で染色することにより例示された。
本発明はさらに、間葉系幹細胞（特に骨髄由来）がより分化した、好ましくは骨原性間葉系幹細胞に分化する際に、実質的に減少する、または事実上観察できない程度にまで低下／減少するいくつかの標的構造に対する結合剤のための、本発明の好ましい使用に関する。これらの標的構造は２つのグロボ系列構造を含み、これらは好ましくは、抗原ＳＳＥＡ−３として認識されるガラクトシル−グロボシド型構造、抗原ＳＳＥＡ−４として認識されるシアリル−ガラクトシルグロボシド型構造である。好ましい減少する標的構造はさらに、２つの２型Ｎ−アセチルラクトサミン標的構造、Ｌｅｗｉｓ ｘおよびシアリル−Ｌｅｗｉｓ ｘを含む。グロボシド型スフィンゴ糖脂質構造が、本願発明者らにより、ＭＳＣにおいて、直接的な構造分析、より具体的にはＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４グリカン抗原単糖組成に対応するグリカンシグナルによって、ｈＥＳＣと比較して少量、しかし有意な量検出された。これらの抗原はＭＳＣにおいてモノクローナル抗体によっても検出された。本発明は従って、特に、本発明に記載の使用における、ＭＳＣおよびそれらから得られた細胞と関連したこれらのグロボシド構造に関する。
本発明の好ましい一態様において、ＧＦ２７５、ＧＦ２７７、ＧＦ２７８、ＧＦ２９７、ＧＦ２９８、ＧＦ３０２、ＧＦ３０５、ＧＦ３０７、ＧＦ３５３、またはＧＦ３５４と同一のエピトープに結合する抗体または結合剤は、好ましくは骨髄由来の、間葉系幹細胞の検出／識別に有用である（該抗体に認識される対応するエピトープを実施例３ １４に列挙する）。これらのエピトープは、培養における、またはｉｎ ｖｉｖｏにおける、好ましくは骨髄由来の（間葉系）幹細胞の検出、単離および評価に適しており、用いることができる。検出はｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＦＡＣＳ用途のため、および／または細胞系統特異的な用途のため、行われ得る。これらの抗体は、他の骨髄由来細胞を含んだ細胞の混合物から、好ましくは間葉系および／または骨髄由来の幹細胞を、ポジティブに単離および／または分離および／または濃縮するために用いることができる。結合剤およびそれ／それらに認識されるエピトープは幹細胞の増殖においても有用であり、幹細胞または幹細胞のサブセットの状態の調節、接着状態の変化、分化関連状態、増殖速度の変化が、幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤に接触させることにより提供される。結合剤は表面上での幹細胞の増殖のための結合剤のスクリーニングにおいても有用であり、幹細胞または幹細胞のサブセットの状態の調節、接着状態の変化、分化関連状態、増殖速度の変化が、幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤に接触させることにより提供される。
幹細胞、好ましくはヒト幹細胞に結合する他の結合剤は、ＧＦ２７５（ＭＵＣ−１糖タンパク質のシアル化炭水化物エピトープ）と同一のエピトープに結合する結合剤を含む。より好ましい抗体はＡｃｒｉｓによるクローンＢＭ３３５９の抗体を含む。このエピトープは培養における、またはｉｎ ｖｉｖｏにおける、好ましくは骨髄由来の（間葉系）幹細胞の検出、単離および評価に適しており、用いることができる。検出はｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＦＡＣＳ用途のため、および／または細胞系統特異的な用途のため、行われ得る。これらの抗体または結合剤は、他の骨髄由来細胞を含んだ細胞の混合物から、好ましくは間葉系および／または骨髄由来の、または骨原性方向に分化した幹細胞を、ポジティブに単離および／または分離および／または濃縮するために用いることができる。結合剤およびそれ／それらに認識されるエピトープは幹細胞の増殖においても有用であり、幹細胞または幹細胞のサブセットの状態の調節、接着状態の変化、分化関連状態、増殖速度の変化が、幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤に接触させることにより提供される。結合剤は表面上での幹細胞の増殖のための結合剤のスクリーニングにおいても有用であり、幹細胞または幹細胞のサブセットの状態の調節、接着状態の変化、分化関連状態、増殖速度の変化が、幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤に接触させることにより提供される。
幹細胞、好ましくはヒト幹細胞に結合する他の結合剤は、ＧＦ３０５（ｌｅｗｉｓ ｘ）と同一のエピトープに結合する結合剤を含む。より好ましい抗体はＣｈｅｍｉｃｏｎによるクローンＣＢＬ１４４の抗体を含む。このエピトープは、培養における、またはｉｎ ｖｉｖｏにおける、好ましくは骨髄由来の（間葉系）幹細胞の検出、単離および評価に適しており、用いることができる。検出はｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＦＡＣＳ用途のため、および／または細胞系統特異的な用途のため、行われ得る。この抗体または結合剤は、細胞の混合物から、好ましくは間葉系および／または骨髄由来の幹細胞を、ポジティブに単離および／または分離および／または濃縮するために用いることができる。結合剤およびそれ／それらに認識されるエピトープは幹細胞の増殖においても有用であり、幹細胞または幹細胞のサブセットの状態の調節、接着状態の変化、分化関連状態、増殖速度の変化が、幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤に接触させることにより提供される。結合剤は表面上での幹細胞の増殖のための結合剤のスクリーニングにおいても有用であり、幹細胞または幹細胞のサブセットの状態の調節、接着状態の変化、分化関連状態、増殖速度の変化が、幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤に接触させることにより提供される。
幹細胞、好ましくはヒト幹細胞に結合する他の結合剤は、ＧＦ３０７（シアリルｌｅｗｉｓ ｘ）と同一のエピトープに結合する結合剤を含む。より好ましい抗体はＣｈｅｍｉｃｏｎによるクローンＭＡＢ２０９６の抗体を含む。このエピトープは、培養における、またはｉｎ ｖｉｖｏにおける、好ましくは骨髄由来の（間葉系）幹細胞の検出、単離および評価に適しており、用いることができる。検出はｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＦＡＣＳ用途のため、および／または細胞系統特異的な用途のため、行われ得る。この抗体または結合剤は、細胞の混合物から、好ましくは間葉系および／または骨髄由来の幹細胞を、ポジティブに単離および／または分離および／または濃縮するために用いることができる。結合剤およびそれ／それらに認識されるエピトープは幹細胞の増殖においても有用であり、幹細胞または幹細胞のサブセットの状態の調節、接着状態の変化、分化関連状態、増殖速度の変化が、幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤に接触させることにより提供される。結合剤は表面上での幹細胞の増殖のための結合剤のスクリーニングにおいても有用であり、幹細胞または幹細胞のサブセットの状態の調節、接着状態の変化、分化関連状態、増殖速度の変化が、幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤に接触させることにより提供される。
好ましい一態様において、ＧＦ３０５、ＧＦ３０７、ＧＦ３５３またはＧＦ３５４と同一のエピトープに結合する抗体または結合剤は間葉系幹細胞のポジティブセレクションおよび／または濃縮に有用である（該抗体により認識される対応するエピトープを実施例１４に列挙する）。
本発明の他の好ましい態様において、ＧＦ２７５、ＧＦ２７６、ＧＦ２７７、ＧＦ２７８、ＧＦ２９７、ＧＦ２９８、ＧＦ３０２、ＧＦ３０３、ＧＦ３０７またはＧＦ３５３と同一のエピトープに結合する抗体または結合剤は、分化した、好ましくは骨髄由来の、および／または骨原性方向に分化した、間葉系幹細胞を検出／識別するのに有用である（該抗体により認識される対応するエピトープを実施例１４に列挙する）。これらのエピトープは培養における、またはｉｎ ｖｉｖｏにおける、好ましくは骨髄由来の（間葉系）幹細胞の検出、単離および評価に適しており、用いることができる。検出はｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＦＡＣＳ用途のため、および／または細胞系統特異的な用途のため、行われ得る。これらの抗体は、他の骨髄由来細胞を含んだ細胞の混合物から、好ましくは間葉系および／または骨髄由来の幹細胞を、ポジティブに単離および／または分離および／または濃縮するために用いることができる。結合剤およびそれ／それらに認識されるエピトープは幹細胞の増殖においても有用であり、幹細胞または幹細胞のサブセットの状態の調節、接着状態の変化、分化関連状態、増殖速度の変化が、幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤に接触させることにより提供される。結合剤は表面上での幹細胞の増殖のための結合剤のスクリーニングにおいても有用であり、幹細胞または幹細胞のサブセットの状態の調節、接着状態の変化、分化関連状態、増殖速度の変化が、幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤に接触させることにより提供される。
幹細胞、好ましくはヒト幹細胞に結合する他の結合剤は、ＧＦ２９７（グロボシドＧＬ４）と同一のエピトープに結合する結合剤を含む。より好ましい抗体はＡｂｃａｍによるクローンａｂ２３９４９の抗体を含む。このエピトープは培養における、またはｉｎ ｖｉｖｏにおける、好ましくは骨髄由来の未分化（間葉系）幹細胞、および好ましくは骨原性方向に分化したものの検出、単離および評価に適しており、用いることができる。検出はｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＦＡＣＳ用途のため、および／または細胞系統特異的な用途のため、行われ得る。この抗体または結合剤は、細胞の混合物から、細胞、好ましくは骨原性方向の間葉系幹細胞を、ポジティブに単離および／または分離および／または濃縮するために用いることができる。結合剤およびそれ／それらに認識されるエピトープは幹細胞の増殖においても有用であり、幹細胞または幹細胞のサブセットの状態の調節、接着状態の変化、分化関連状態、増殖速度の変化が、幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤に接触させることにより提供される。結合剤は表面上での幹細胞の増殖のための結合剤のスクリーニングにおいても有用であり、幹細胞または幹細胞のサブセットの状態の調節、接着状態の変化、分化関連状態、増殖速度の変化が、幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤に接触させることにより提供される。
幹細胞、好ましくはヒト幹細胞に結合する他の結合剤は、ＧＦ２９８（ヒトＣＤ７７；ＧＢ３）と同一のエピトープに結合する結合剤を含む。より好ましい抗体はＡｃｒｉｓによるクローンＳＭ１１６０の抗体を含む。このエピトープは培養における、またはｉｎ ｖｉｖｏにおける、好ましくは骨髄由来の未分化（間葉系）幹細胞、および好ましくは骨原性方向に分化したものの検出、単離および評価に適しており、用いることができる。検出はｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＦＡＣＳ用途のため、および／または細胞系統特異的な用途のため、行われ得る。この抗体または結合剤は、細胞の混合物から、細胞、好ましくは骨原性方向の間葉系幹細胞を、ポジティブに単離および／または分離および／または濃縮するために用いることができる。結合剤およびそれ／それらに認識されるエピトープは幹細胞の増殖においても有用であり、幹細胞または幹細胞のサブセットの状態の調節、接着状態の変化、分化関連状態、増殖速度の変化が、幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤に接触させることにより提供される。結合剤は表面上での幹細胞の増殖のための結合剤のスクリーニングにおいても有用であり、幹細胞または幹細胞のサブセットの状態の調節、接着状態の変化、分化関連状態、増殖速度の変化が、幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤に接触させることにより提供される。
幹細胞、好ましくはヒト幹細胞に結合する他の結合剤は、ＧＦ３０２（Ｈ２型血液抗原）と同一のエピトープに結合する結合剤を含む。好ましい一態様において、抗体はＦｕｃα２Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃエピトープに結合する。より好ましい抗体はＡｃｒｉｓによるクローンＤＭ３０１５の抗体を含む。このエピトープは培養における、またはｉｎ ｖｉｖｏにおける、好ましくは骨髄由来の未分化（間葉系）幹細胞、および好ましくは骨原性方向に分化したものの検出、単離および評価に適しており、用いることができる。検出はｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＦＡＣＳ用途のため、および／または細胞系統特異的な用途のため、行われ得る。この抗体または結合剤は、細胞の混合物から、細胞、好ましくは骨原性方向の間葉系幹細胞を、ポジティブに単離および／または分離および／または濃縮するために用いることができる。結合剤およびそれ／それらに認識されるエピトープは幹細胞の増殖においても有用であり、幹細胞または幹細胞のサブセットの状態の調節、接着状態の変化、分化関連状態、増殖速度の変化が、幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤に接触させることにより提供される。結合剤は表面上での幹細胞の増殖のための結合剤のスクリーニングにおいても有用であり、幹細胞または幹細胞のサブセットの状態の調節、接着状態の変化、分化関連状態、増殖速度の変化が、幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤に接触させることにより提供される。
本発明の好ましい一態様において、ＧＦ２７６、ＧＦ２７７、ＧＦ２７８、ＧＦ３０３、ＧＦ３０５、ＧＦ３０７、ＧＦ３５３、またはＧＦ３５４と同一のエピトープに結合する抗体または結合剤は、好ましくは骨髄由来の、および骨原性方向に分化した、間葉系幹細胞を検出／識別するのに有用である（該抗体により認識される対応するエピトープを実施例１４に列挙する）。これらのエピトープは培養における、またはｉｎ ｖｉｖｏにおける、好ましくは骨髄由来の（間葉系）幹細胞の検出、単離および評価に適しており、用いることができる。検出はｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＦＡＣＳ用途のため、および／または細胞系統特異的な用途のため、行われ得る。これらの抗体は、他の骨髄由来細胞を含んだ細胞の混合物から、好ましくは間葉系および／もしくは骨髄由来の、または骨原性方向に分化した、幹細胞を、ポジティブに単離および／または分離および／または濃縮するために用いることができる。結合剤およびそれ／それらに認識されるエピトープは幹細胞の増殖においても有用であり、幹細胞または幹細胞のサブセットの状態の調節、接着状態の変化、分化関連状態、増殖速度の変化が、幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤に接触させることにより提供される。結合剤は表面上での幹細胞の増殖のための結合剤のスクリーニングにおいても有用であり、幹細胞または幹細胞のサブセットの状態の調節、接着状態の変化、分化関連状態、増殖速度の変化が、幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤に接触させることにより提供される。
さらに、ＧＦ２７６もしくはＧＦ３０３と同一のエピトープに結合する結合剤、または抗体ＧＦ２７６および／もしくはＧＦ３０３は、培養における、またはｉｎ ｖｉｖｏにおける、骨原性に分化した幹細胞の検出、単離および評価に特に有用である（該抗体により認識される対応するエピトープを実施例１４に列挙する）。
幹細胞、好ましくはヒト幹細胞に結合する他の結合剤は、ＧＦ２７６（癌胎児性抗原）と同一のエピトープに結合する結合剤を含む。より好ましい抗体はＡｃｒｉｓによるクローンＤＭ２８８の抗体を含む。このエピトープは培養における、またはｉｎ ｖｉｖｏにおける、好ましくは骨髄由来の、および骨原性方向の、分化した（間葉系）幹細胞の検出、単離および評価に適しており、用いることができる。検出はｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＦＡＣＳ用途のため、および／または細胞系統特異的な用途のため、行われ得る。この抗体または結合剤は、細胞の混合物から、細胞、好ましくは骨原性方向の間葉系幹細胞を、ポジティブに単離および／または分離および／または濃縮するために用いることができる。結合剤およびそれ／それらに認識されるエピトープは幹細胞の増殖においても有用であり、幹細胞または幹細胞のサブセットの状態の調節、接着状態の変化、分化関連状態、増殖速度の変化が、幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤に接触させることにより提供される。結合剤は表面上での幹細胞の増殖のための結合剤のスクリーニングにおいても有用であり、幹細胞または幹細胞のサブセットの状態の調節、接着状態の変化、分化関連状態、増殖速度の変化が、幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤に接触させることにより提供される。
幹細胞、好ましくはヒト幹細胞に結合する他の結合剤は、ＧＦ２７７（ヒトシアロシル−Ｔｎ抗原；ＳＴｎ、ｓＣＤ１７５）と同一のエピトープに結合する結合剤を含む。より好ましい抗体はＡｃｒｉｓによるクローンＤＭ３１９７の抗体を含む。このエピトープは培養における、またはｉｎ ｖｉｖｏにおける、好ましくは骨髄由来の、および骨原性方向の、分化した（間葉系）幹細胞の検出、単離および評価に適しており、用いることができる。検出はｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＦＡＣＳ用途のため、および／または細胞系統特異的な用途のため、行われ得る。この抗体または結合剤は、細胞の混合物から、細胞、好ましくは骨原性方向の間葉系幹細胞を、ポジティブに単離および／または分離および／または濃縮するために用いることができる。結合剤およびそれ／それらに認識されるエピトープは幹細胞の増殖においても有用であり、幹細胞または幹細胞のサブセットの状態の調節、接着状態の変化、分化関連状態、増殖速度の変化が、幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤に接触させることにより提供される。結合剤は表面上での幹細胞の増殖のための結合剤のスクリーニングにおいても有用であり、幹細胞または幹細胞のサブセットの状態の調節、接着状態の変化、分化関連状態、増殖速度の変化が、幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤に接触させることにより提供される。
幹細胞、好ましくはヒト幹細胞に結合する他の結合剤は、ＧＦ２７８（ヒトシアロシル−Ｔｎ抗原；ＳＴｎ、ｓＣＤ１７５ Ｂ１．１）と同一のエピトープに結合する結合剤を含む。より好ましい抗体はＡｃｒｉｓによるクローンＤＭ３２１８の抗体を含む。このエピトープは培養における、またはｉｎ ｖｉｖｏにおける、好ましくは骨髄由来の、および骨原性方向の、分化した（間葉系）幹細胞の検出、単離および評価に適しており、用いることができる。検出はｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＦＡＣＳ用途のため、および／または細胞系統特異的な用途のため、行われ得る。この抗体または結合剤は、細胞の混合物から、細胞、好ましくは骨原性方向の間葉系幹細胞を、ポジティブに単離および／または分離および／または濃縮するために用いることができる。結合剤およびそれ／それらに認識されるエピトープは幹細胞の増殖においても有用であり、幹細胞または幹細胞のサブセットの状態の調節、接着状態の変化、分化関連状態、増殖速度の変化が、幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤に接触させることにより提供される。結合剤は表面上での幹細胞の増殖のための結合剤のスクリーニングにおいても有用であり、幹細胞または幹細胞のサブセットの状態の調節、接着状態の変化、分化関連状態、増殖速度の変化が、幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤に接触させることにより提供される。
幹細胞、好ましくはヒト幹細胞に結合する他の結合剤は、ＧＦ３０３（血液型Ｈ１抗原、ＢＧ４）と同一のエピトープに結合する結合剤を含む。好ましい一態様において、抗体はＦｕｃα２Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃエピトープに結合する。より好ましい抗体はＡｂｃａｍによるクローンａｂ３３５５の抗体を含む。このエピトープは培養における、またはｉｎ ｖｉｖｏにおける、好ましくは骨髄由来の、および骨原性方向の、分化した（間葉系）幹細胞の検出、単離および評価に適しており、用いることができる。検出はｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＦＡＣＳ用途のため、および／または細胞系統特異的な用途のため、行われ得る。この抗体または結合剤は、細胞の混合物から、細胞、好ましくは骨原性方向の間葉系幹細胞を、ポジティブに単離および／または分離および／または濃縮するために用いることができる。結合剤およびそれ／それらに認識されるエピトープは幹細胞の増殖においても有用であり、幹細胞または幹細胞のサブセットの状態の調節、接着状態の変化、分化関連状態、増殖速度の変化が、幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤に接触させることにより提供される。結合剤は表面上での幹細胞の増殖のための結合剤のスクリーニングにおいても有用であり、幹細胞または幹細胞のサブセットの状態の調節、接着状態の変化、分化関連状態、増殖速度の変化が、幹細胞を幹細胞の末端グリカン構造を認識する結合剤に接触させることにより提供される。
さらに、前記抗体または結合剤は骨原性系統（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｌｉｎｅａｇｅ）のための幹細胞を単離および濃縮するのに有用である。これは、例えば抗体ＧＦ２７６、ＧＦ２７７、ＧＦ２７８、およびＧＦ３０３を用いた、ポジティブセレクションにより行うことができる（該抗体に認識される対応するエピトープを実施例３、１４に列挙する）。ネガティブディプリーション（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）については、好ましいエピトープは抗体ＧＦ３０５、ＧＦ３０７、ＧＦ３５３、またはＧＦ３５４で認識されるものと同じである。ネガティブディプリーションについては、好ましいエピトープは抗体ＧＦ３５４（ＳＳＥＡ−４）またはＧＦ３０７（シアリルＬｅｗｉｓ ｘ）で認識されるものと同じである。
各種幹細胞型間の比較
本データは、１型および２型Ｎ−アセチルラクトサミンの群の比較が、間葉系幹細胞および胚幹細胞等の幹細胞の分析のために、および／または線維芽細胞様フィーダー細胞等の混入細胞集団からの細胞の分離のために、有用な方法であることを明らかにした。未分化間葉系細胞はｈＥＳＣ細胞から明らかになったＩ型Ｎ−アセチルラクトサミン抗原を欠いていたが、両細胞型および潜在的混入線維芽細胞はＩＩ型Ｎ−アセチルラクトサミン認識抗体による一様でない標識を有している。
「主に」という語は好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７５％、および最も好ましくは少なくとも９０％を表す。幹細胞との関連において、「主に」という語は、グリカン構造を発現し、哺乳動物細胞の集団中の多能性または多分化能幹細胞を同定、分析、選択または単離するのに有用な、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７５％、および最も好ましくは少なくとも９０％の細胞を表す。
細胞成分およびその混合物の単離のための結合剤の使用
本発明は、新規結合試薬が好ましい一態様において新規標的／マーカー構造を有する幹細胞からの細胞成分の単離に用いられることを明らかにした。単離された細胞は好ましくは遊離グリカン、またはタンパク質もしくは脂質もしくはその断片に結合したグリカンである。
本発明は特に、構造が１つまたはいくつかの型のグリカン材料ｓｅｌｅ
ａ）幹細胞材料から遊離した遊離グリカンならびに／または
ｂ）グリカン複合体材料、例えば
ｂ１）糖アミノ酸材料、例えば
ｂ１ａ）糖タンパク質
ｂ１ｂ）糖オリゴペプチドおよび糖ポリペプチド等の糖ペプチド
および／もしくは
ｂ２）本発明により明らかになった好ましい炭水化物構造を有する脂質結合材料
を含む場合の、前記構造を含む細胞成分の単離に関する。
標的構造を有する細胞成分の単離のための一般的方法
本発明の細胞成分の単離とは、特異的結合剤によって結合されるグリカン構造である対応する標的構造に本発明の結合剤分子を結合させる工程を含む方法において、本発明の標的構造を有する増加した（または濃縮された）量のグリカンを含んだ分子画分を産生することを意味する。
前記画分の単離の過程は、本発明の結合剤分子を幹細胞由来の対応する標的構造と接触させることと、濃縮された標的構造組成物を単離することとを伴う。
細胞成分を単離するための好ましい方法は次の工程
１）幹細胞試料を提供すること
２）本発明の結合剤分子を対応する標的構造と接触させること
３）前記結合剤と標的構造との複合体を少なくとも細胞材料の一部から単離すること
を含む。
前記成分は一般に細胞構造の特定の画分、例えば原形質膜を含む細胞膜画分；およびオルガネラ画分；および可溶性タンパク質、脂質または遊離グリカン画分等の可溶性グリカン含有画分；において豊富に存在すると理解される。前記結合剤は全細胞画分に対して用いることができると理解される。
好ましい一態様において、標的構造は、プロテアーゼにより遊離する細胞表面タンパク質または界面活性剤可溶性膜タンパク質等の、細胞タンパク質の画分内に豊富に存在する。
好ましい標的構造組成物は、幹細胞において、または幹細胞に特徴的な割合で、特異的に発現する、結合剤構造に対応するグリカン構造を有する糖タンパク質または糖ペプチド、およびペプチドまたはタンパク質エピトープを含む。
より好ましくは、本発明は、前記単離工程における標的構造画分の精製に関する。精製は本発明の好ましい一態様において、少なくとも部分的精製である。好ましくは、標的グリカン含有材料は、好ましくはそれが発現される細胞画分の成分の中で、少なくとも２倍に精製される。より好ましい精製水準としては５倍および１０倍精製、より好ましくは１００、さらに好ましくは１０００倍精製等が挙げられる。好ましくは、精製された画分は少なくとも１０％の標的グリカン含有分子を含み、より好ましくは少なくとも３０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、さらになお好ましくは少なくとも７０％の純粋、および最も好ましくは少なくとも９０％の純粋を含む。好ましくは前記％値は他の標的グリカン非含有複合糖質分子に対するモルパーセントであり、より好ましくは前記材料は本質的に他の主要な有機混入分子を含まない。
好ましい精製標的グリカン組成物および標的グリカン−結合剤複合体
本発明は単離または精製された標的グリカン−結合剤複合体および単離された標的グリカン分子組成物に関するものであり、ここで該標的グリカンは本発明の特異的標的構造に富む。
好ましくは、精製された標的グリカン−結合剤複合体組成物は少なくとも１０％の、結合剤と複合した標的グリカン含有分子、より好ましくは少なくとも３０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、さらになお好ましくは少なくとも７０％の純粋な、および最も好ましくは少なくとも９０％の純粋な、結合剤と複合した標的グリカン含有分子を含む。
好ましくは、精製された標的グリカン組成物は少なくとも１０％の標的グリカン含有分子、より好ましくは少なくとも３０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、さらになお好ましくは少なくとも７０％の純粋な、および最も好ましくは少なくとも９０％の純粋な、標的グリカン含有分子を含む。
本発明はさらに、本発明の結合剤分子を幹細胞由来の対応する標的構造に接触させて濃縮された標的構造を単離する工程を伴う画分の単離の方法によって産生された、濃縮された標的グリカン組成物に関する。
標的グリカンの精製のための結合剤技術
細胞の糖タンパク質、糖ペプチド、遊離オリゴ糖および他のグリカン複合体の親和性精製のための方法は、当該分野において周知である。好ましい方法としては、アフィニティークロマトグラフィー等の固相を用いる結合剤技術、免疫沈降等の沈降、免疫磁性ビーズ法等の結合剤−磁性法などが挙げられる。アフィニティークロマトグラフィーは、レクチン（Ｗａｎｇ Ｙ ｅｔ ａｌ（２００６）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ１６（６）５１４−２３）を用いた、もしくは抗体による、糖ペプチドの精製に対して、または、抗体（例えばＰｒａｔ Ｍ ｅｔ ａｌ ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（１９８９）４９，１４１５−２１；Ｋｉｍ ＹＤ ｅｔ ａｌ ｅｔ ａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（１９８９）４９、２３７９）および／もしくはレクチン（例えばＣｕｍｍｉｎｇ ａｎｄ Ｋｏｒｎｆｅｌｄ（１９８２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５７、１１２３５−４０； Ｙａｅ Ｅ ｅｔ ａｌ．（１９９１）１０７８（３）３６９−７６；Ｓｈｉｂｕｙａ Ｎ ｅｔ ａｌ（１９８８）２６７（２）６７６−８０；Ｇｏｎｃｈｏｒｏｆｆ ＤＧ ｅｔ ａｌ．１９８９、３５、２９−３２；Ｈｅｎｔｇｅｓ ａｎｄ Ｂａｕｓｅ（１９９７）Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ３７８（９）１０３１−８）を用いた糖タンパク質／ペプチドの精製に対して、記載されている。遊離オリゴ糖の識別も対象とする弱く結合する抗体のための具体的な方法が例えば（Ｏｈｌｓｏｎ Ｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ （１９９７）７５８（２）１９９−２０８）、Ｏｈｌｓｏｎ Ｓ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ （１９８８）１６９（１）２０４−８）に記載のように開発されている。該方法は例えば（Ｃｕｍｍｉｎｇｓ ａｎｄ Ｋｏｒｎｆｅｌｄ（１９８２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５７、１１２３５−４０）に示されるように異なった特異性の結合剤による複数の工程を伴っている場合がある。オリゴ糖混合物のための抗体またはタンパク質（レクチン）結合剤アフィニティークロマトグラフィーも、例えば（Ｋｉｔａｇａｗａ Ｈ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ１１０（４９ ５９８−６０４；Ｋｉｔａｇａｗａ Ｈ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８（２２）８８９１−７；Ｄａｋｏｕｒ Ｊ ｅｔ ａｌ Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ（１９８８）２６４，２０３− １３）、糖脂質のためのものが、例えば（Ｂｏｕｈｏｕｒｓ Ｄ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ２８２（１）１４１−６）に記載されている。グリカンを対象とするアフィニティークロマトグラフィーおよび／または有用なレクチンおよび抗体特異性のさらなる情報は、（Ｄｅｂａｒａｙ ａｎｄ Ｍｏｎｔｒｅｕｉｌ（１９９１）Ａｄｖ．Ｌｅｃｔｉｎ Ｒｅｓ ４、５１−９６；“Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ”Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ（２００１）４９１（ｅｄ Ａｌｂｅｒｔ Ｍ Ｗｕ）Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；“Ｌｅｃｔｉｎｓ”ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００３）（ｅｄｓ Ｓｈａｒｏｎ、Ｎａｔｈａｎ ａｎｄ Ｌｉｓ、Ｈａｌｉｎａ）Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ Ｎｅａｔｈｅｒｌａｎｄｓ）等の総説およびモノグラフから入手可能である。
前記方法は常圧またはＨＰＬＣクロマトグラフィーを用い、従来のクロマトグラフィー法または他のタンパク質およびペプチド精製法を用いるさらなる工程を含んでいてよいく、好ましいさらなる単離法は、特に低Ｍｗグリカンおよび複合体、好ましくは糖ペプチドの単離のためのゲル濾過（サイズ排除）クロマトグラフィーである。
さらに、単離されたタンパク質およびペプチドは質量分析法、例えば（Ｗａｎｇ Ｙ ｅｔ ａｌ（２００６）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １６（６）５１４−２３）により識別され得ることが知られている。本発明は特に、質量分析、ペプチドシーケンシング、化学的分析、アレイ分析等の方法または他の当該分野に公知の方法によるグリカンおよび／またはその複合体の精製、および単離された成分の識別のための、本発明の結合剤の使用に関する。
トリプシン感受性型グリカン標的の存在の解明
本発明は実施例２０において本グリカン結合剤、特にモノクローナル抗体、の標的構造の一部が、トリプシン感受性であることを明らかにした。細胞がトリプシンにより処理（培養から解放）されると、細胞表面抗原のＦＡＣＳ分析において、抗原構造は本質的に観察されないか、またはこれらは少ない量で観察されるが、Ｖｅｒｓｅｎｅ処理（ＰＢＳ中の０．０２％ＥＤＴＡ）後には観察可能である。これは例えば、ＳＳＥＡ−４抗原に結合することが示されている抗体ＧＦ３５４による間葉系幹細胞の標識において観察された。この標的抗原構造は従来、シアリル−ガラクトシルグロボシド糖脂質と考えられてきたが、明らかに抗体はグリカン配列の非還元末端のエピトープのみを認識する。本発明はそこで特に、ＳＳＥＡ−４抗体によって結合・濃縮される、間葉系幹細胞糖ペプチド結合グリカン構造の単離および分析の方法、および対応する糖ペプチドおよび糖タンパク質の分析に関する。本発明はさらに、幹細胞、特に間葉系幹細胞および胚幹細胞由来のトリプシン非感受性グリカン材料の分析に関する。
本発明はまた、ａｂ ＧＦ２７５のシアリルムチン型標的の大部分はトリプシン感受性であり、少数は非トリプシン感受性であることも明らかにした。本発明は、トリプシン感受性およびトリプシン非感受性の両者のグリカン画分、好ましくは糖タンパク質および糖ペプチドの、本発明の方法による単離に関する。本発明はさらに、好ましくは材料が間葉系幹細胞から単離された場合の、抗体ＧＦ３０２によって結合されるタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）感受性様糖ペプチドおよび糖タンパク質の単離および分析に関する。
本明細書において、「結合剤」、「結合物質」および「マーカー」は互換的に用いられる。
抗体
本発明の有用なレクチンおよび有用な抗体特異性、および還元末端伸長抗体エピトープに関する情報は、（Ｄｅｂａｒａｙ ａｎｄ Ｍｏｎｔｒｅｕｉｌ（１９９１）Ａｄｖ．Ｌｅｃｔｉｎ Ｒｅｓ ４，５１−９６；“Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ”Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ（２００１）４９１（ｅｄ Ａｌｂｅｒｔ Ｍ Ｗｕ）Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；“Ｌｅｃｔｉｎｓ”ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００３）（ｅｄｓ Ｓｈａｒｏｎ，Ｎａｔｈａｎ ａｎｄ Ｌｉｓ，Ｈａｌｉｎａ）Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ、Ｔｈｅ Ｎｅａｔｈｅｒｌａｎｄｓ等の総説およびモノグラフならびにｐｕｂｍｅｄ／ｅｓｐａｃｅｎｅｔ等のインターネットデータベース、またはモノクローナル抗体特異性を列挙するｗｗｗ．ｇｌｙｃｏ．ｉｓ．ｒｉｔｓｕｍｅｉ．ａｃ．ｊｐ／ｅｐｉｔｏｐｅ／等の抗体データベース）から入手可能である。
当該分野で公知の各種方法を用いて、ペプチドモチーフおよびその領域または断片に対するポリクローナル抗体を産生することができる。抗体の産生においては、任意の適した宿主動物（ウサギ、マウス、ラット、またはハムスター等であるが限定されない）がペプチド（免疫原性断片）の注射により免疫される。宿主動物種により、各種アジュバントを用いて免疫反応を高めることができ、例えばフロイントの（完全および不完全）アジュバント、水酸化アルミニウム等のミネラルゲル（ｍｉｎｅｒａｌ ｇｅｌ）、リゾレシチン等の界面活性物質、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、および、ＢＣＧ｛Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒγｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ等の潜在的に有用なヒトアジュバント等が挙げられるがこれらに限定されない。
ペプチドモチーフに対するモノクローナル抗体は、培養における連続細胞系による抗体分子の産生のために提供される任意の手法を用いて調製してよい。これらとしては、Ｋδｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ，（Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５−４９７，１９７５）により最初に記載されたハイブリドーマ技術、およびより最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，４：７２、１９８３）およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６、１９８５）等が挙げられるがこれらに限定されない。これらは全て参照により具体的に本明細書に組み込まれる。抗体はクローン化された免疫グロブリンｃＤＮＡから細菌内で産生することもできる。組み替えファージ抗体系の使用により、細菌培養物中の抗体を速やかに産生および選択することができ、また遺伝的にその構造を操作することができる場合がある。
ハイブリドーマ技術が用いられる場合、ミエローマ細胞株を用いてよい。このようなハイブリドーマ産生融合法において用いるために適した細胞株は、好ましくは抗体非産生性であり、高い融合効率を有し、また、所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖を補助する特定の選択的培地においてそれらを増殖できなくする酵素欠損を示す。例えば、免疫した動物がマウスである場合、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ ４ １、Ｓｐ２１０−Ａｇｌ４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−Ｉ１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ １．７およびＳ１９４／５ＸＸ０ ＢｕＩを使用してよく；ラットである場合、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ １．２．３、ＩＲ９８３Ｆおよび４Ｂ２１０を使用してよく；ならびにＵ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２およびＵＣ７２９−６は全て細胞融合において有用である。
モノクローナル抗体の産生に加え、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術、すなわちマウス抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子につないで適当な抗原特異性および生物活性を有する分子を得る技術を用いることができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｄ ８１：６８５１−６８５５，１９８４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８，１９８４；Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４；１９８５）。あるいは、一本鎖抗体の産生のために記載された技術（米国特許第４，９４６，７７８号）を適合させ、インフルエンザ特異的一本鎖抗体を産生することができる。
前記分子のイディオタイプを有する抗体断片は、公知の手法により生成することができる。例えば、このような断片として、抗体分子のペプシン消化により生成し得るＦ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成し得るＦａｂ’フラグメント、ならびに抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することにより生成し得る２つのＦａｂフラグメント等が挙げられるが、これらに限定されない。
非ヒト抗体は当該分野で公知の任意の手法を用いてヒト化することができる。好ましい「ヒト化抗体」は、ヒト定常領域を有するが、該抗体の可変領域、または少なくとも相補性決定領域（ＣＤＲ）は非ヒト動物由来である。ヒト軽鎖定常領域はκまたはλ軽鎖のいずれからのものであってもよく、一方ヒト重鎖定常領域はＩｇＭ、ＩｇＧ（ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４）、ＩｇＤ、ＩｇＡ、またはＩｇＥ免疫グロブリンのいずれからのものであってもよい。
非ヒト抗体のヒト化のための方法は、当該分野で周知である（米国特許第５，５８５，０８９号、および５，６９３，７６２号を参照）。一般に、ヒト化抗体は、そのフレームワーク領域に導入された、非ヒト供給源からの１または複数個のアミノ酸残基を有する。ヒト化は、例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５，１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７，１９８８）およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６，１９８８）に記載される方法を用い、齧歯類相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一部をヒト抗体の対応する領域に対して置換することにより行うことができる。改変抗体の調製のための数多くの手法が、例えばＯｗｅｎｓ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１６８：１４９−１６５，１９９４において、記載されている。そして、さらなる変化を抗体フレームワークに導入し、親和性または免疫原性を調節することができる。
同様に、ＣＤＲを単離するための当該分野に公知の手法を用いて、ＣＤＲを含んだ組成物が生成される。相補性決定領域は６個のポリペプチドループ、重鎖または軽鎖の可変領域のそれぞれに対する３個のループを特徴とする。ＣＤＲおよびフレームワーク領域におけるアミノ酸部位はＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、（１９８３）に記述されており、これは参照により本明細書に組み込まれたものとする。例えば、ヒト抗体の超可変領域はおおまかには重鎖および軽鎖可変領域の残基２８〜３５、残基４９〜５９、および残基９２〜１０３にあると定義される（Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｔｒａｖｅｒｓ， Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９６）。任意の所定の抗体におけるＣＤＲ領域は、上述のこれらのおおよその残基のうちのいくつかのアミノ酸の内部に存在し得る。免疫グロブリン可変領域もＣＤＲを囲む「フレームワーク」領域を有する。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域配列は種内で高度に保存されており、ヒトおよびマウスの配列間でも保存されている。
モノクローナル抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域の１、２、および／または３個のＣＤＲを有する組成物が生成される。ハイブリドーマから分泌されるモノクローナル抗体の１、２、３、４、５および／または６個の相補性決定領域を含むポリペプチド組成物も考えられる。ＣＤＲを囲む保存されたフレームワーク配列を用いて、これらのコンセンサス配列に相補的なＰＣＲプライマーが生成され、プライマー領域間に位置するＣＤＲ配列が増幅される。ヌクレオチドおよびポリペプチド配列のクローニングおよび発現のための手法は当該分野において確立されている（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８９）を参照）。増幅されたＣＤＲ配列は適当なプラスミドに連結される。１、２、３、４、５および／または６個のクローニングされたＣＤＲを有するプラスミドは任意に、該ＣＤＲに連結されたさらなるポリペプチドコード領域を有する。
好ましくは、前記抗体は式（Ｉ）のグリカン構造またはその断片に対して特異的な任意の抗体である。本発明で用いられる該抗体は、幹細胞の指標である、式（Ｉ）のグリカン構造に特異的に結合するのに十分な特異性を保持した、天然または組み替えの、合成または天然由来の、モノクローナルまたはポリクローナルの、任意の抗体またはその断片を含む。本明細書で用いられる「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」または「抗体群（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という用語は、抗体全体、およびその機能的部分を含んだ抗体断片を包含する。「抗体」という用語は、抗体全体が結合特異性を有するエピトープに結合を達成するのに十分な軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域の部分を有する、任意の単一特異性または二重特異性化合物を包含する。前記断片は少なくとも１個の重鎖または軽鎖免疫グロブリンポリペプチドの可変領域を含むことができ、ならびにＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）．ｓｕｂ．２フラグメント、およびＦｖフラグメントを含むことができるがこれらに限定されない。
前記抗体は、酵素、磁性ビーズ、コロイド磁性ビーズ（ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓ）、ハプテン、蛍光色素、金属化合物、放射性化合物、クロマトグラフィー樹脂、固相または薬物等ではあるが限定されない他の適した分子および化合物に結合させることができる。前記抗体に結合させることができる前記酵素としてはアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ウレアーゼおよびベータ−ガラクトシダーゼ等が挙げられるがこれらに限定されない。前記抗体に結合させることができる前記蛍光色素としてはフルオレッセインイソチオシアネート、イソチオシアン酸テトラメチルローダミン、フィコエリトリン、アロフィコシアニンおよびテキサスレッド等が挙げられるがこれらに限定されない。抗体に結合させることができるさらなる蛍光色素についてはＨａｕｇｌａｎｄ、Ｒ．Ｐ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（１９９２−１９９４）を参照のこと。前記抗体に結合させることができる前記金属化合物としてはフェリチン、金コロイド、および特に、コロイド超磁性ビーズ（ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓ）等が挙げられるがこれらに限定されない。前記抗体に結合させることができる前記ハプテンとしては、ビオチン、ジゴキシゲニン、オキサザロン、およびニトロフェノール等が挙げられるがこれらに限定されない。前記抗体に結合させるまたは組み込むことができる前記放射性化合物は当該分野において公知であり、テクネチウム９９ｍ、．ｓｕｐ．１２５ Ｉ、ならびに、．ｓｕｐ．１４ Ｃ、．ｓｕｐ．３ Ｈ、および．ｓｕｐ．３５ Ｓ等の限定されない任意の放射性核種を有するアミノ酸などが挙げられるが、これらに限定されない。
式（Ｉ）のグリカン構造に対する抗体は任意の供給源から入手してよい。これらは市販されている場合がある。事実上、幹細胞上のグリカン構造の存在を検出する任意の手段が本発明に含まれる。このような抗体の一例はＡｂｃａｍからのＨ１型（クローン１７−２０６；ＧＦ２８７）抗体である。
ＨＳＣ
本明細書に概要を述べる方法は特にＨＳＣまたはその子孫を細胞の集団から同定するために有用である。しかし、さらなるマーカーを、一般的なＨＳＣ、または幹細胞、集団内の亜集団をさらに区別するために用いてもよい。
幹細胞上の式（Ｉ）のグリカン構造への結合剤のレベルにより各種亜集団を区別することができる。これは本明細書に概要を述べる方法により検出することができる幹細胞表面上に（またはフィーダー細胞特異的結合剤が用いられる場合はフィーダー細胞上に）現れ得る。しかし、本発明は、ＣＤ３４．ｓｕｐ．＋、ＣＤ３８．ｓｕｐ．−、ＣＤ９０．ｓｕｐ．＋（ｔｈｙ１）およびＬｉｎ．ｓｕｐ．−細胞等であるが限定されない幹細胞またはＨＳＣ集団の各種表現型を区別するために用いてもよい。好ましくは、同定される細胞は、ＣＤ３４．ｓｕｐ．＋、ＣＤ３８．ｓｕｐ．−、ＣＤ９０＋（ｔｈｙ １）、またはＬｉｎ．ｓｕｐ．−を含むが限定されない群から選択される。
本発明は従って、幹および／もしくはＨＳＣまたはその子孫のための、集団を濃縮する方法を包含する。本方法は、ＨＳＣまたはその子孫の混合物を、幹細胞上の式（Ｉ）のグリカン構造を認識してそこに結合する抗体またはマーカーまたは結合タンパク質／物質または結合剤と、該抗体またはマーカーまたは結合剤が幹細胞上の式（Ｉ）のグリカン構造に結合することを可能にする条件の下で混合し、該抗体またはマーカーにより認識される細胞を分離して幹細胞またはその子孫が実質的に濃縮された集団を得ることを伴う。前記方法は、試料中の多くのＨＳＣまたはその子孫に対する診断アッセイ（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｓｓａｙ）として用いることができる。細胞および抗体またはマーカーは、抗体またはマーカーが幹細胞上の式（Ｉ）のグリカン構造に特異的に結合することを可能にするのに十分な条件の下で混合され、次いで定量が行われる。ＨＳＣもしくは幹細胞またはその子孫を、単離し、またはさらに精製することができる。
上記に考察されるように、前記細胞集団は、幹細胞もしくはＨＣＳまたはその子孫の任意の供給源、例えば上記に考察されるそれらの試料から得ることができる。
幹細胞上の式（Ｉ）のグリカン構造の存在の検出は、幹細胞上の式（Ｉ）のグリカン構造を同定するための任意の方法により行われてよい。好ましくは、この検出は幹細胞上の式（Ｉ）のグリカン構造に対するマーカーまたは結合タンパク質の使用によるものである。幹細胞上の式（Ｉ）のグリカン構造のための該結合剤／マーカーは上記で議論されるマーカーのいずれのものであってもよい。しかし、幹細胞上の式（Ｉ）のグリカン構造に対する抗体または結合タンパク質が特に幹細胞上の式（Ｉ）のグリカン構造に対するマーカーとして有用である。
最初に特化した系統（ｄｅｄｉｃａｔｅｄ ｌｉｎｅａｇｅ）の細胞を取り出すことによって細胞を分離または濃縮するために、各種手法を用いることができる。モノクローナル抗体、結合タンパク質およびレクチンが、細胞系統および／または分化の段階を同定するために特に有用である。抗体を固相に結合し、粗分離を可能にすることができる。用いる分離手法は回収される画分の生存能力の保持を最大限にするものであるべきである。効果の異なる各種手法を用いて「比較的粗精製の」分離物を得ることができる。用いられる個々の手法は分離の効率、関連する細胞毒性、簡便性および実施スピード、ならびに高度な器具および／または技術的手腕の必要性によって異なる。
分離および濃縮の手順としては、抗体被覆磁性ビーズを用いた磁気分離；アフィニティークロマトグラフィー；モノクローナル抗体に結合した、またはモノクローナル抗体と併せて用いられる、細胞毒性薬、例えば補体および細胞毒等が挙げられるが限定されないもの；ならびに、プレート等の固体マトリクスに結合した抗体による「パンニング」；エルトリエーション（ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ）；または任意の他の好都合な手法；などが挙げられるがこれらに限定されない。
分離または濃縮手法の使用としては、物理的な（密度勾配遠心および対流遠心エルトリエーション（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｆｌｏｗ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ））、細胞表面の（レクチンおよび抗体親和性）、および生体染色特性の（ミトコンドリア結合色素ｒｈｏ１２３およびＤＮＡ結合色素Ｈｏｅｓｃｈｔ ３３３４２）相違に基づくもの等が挙げられるがこれらに限定されない。
正確な分離を提供する手法としては、複数のカラーチャネル、低角度および鈍角の光散乱検出チャネル、インピーデンスチャネル等、様々な程度の精巧さを有し得るＦＡＣＳなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらの細胞を幹細胞上の式（Ｉ）のグリカン構造の発現量によって単離および識別できる任意の方法を用いることができる。
最初の分離においては、典型的には約１．ｔｉｍｅｓ．１０．ｓｕｐ．１０、好ましくは約５．ｔｉｍｅｓ．１０．ｓｕｐ．８−９細胞で開始し、幹細胞上の式（Ｉ）のグリカン構造に対する抗体または結合タンパク質またはレクチンは少なくとも１種の蛍光色素で標識することができ、一方、各種の特化した系統に対する抗体または結合タンパク質は少なくとも１種の異なる蛍光色素に結合することができる。それぞれの系統は別々の工程で分離することができるが、望ましくはこれらの系統は、幹細胞マーカー上の式（Ｉ）のグリカン構造に対するポジティブセレクションを行っている際に同時に分離される。死細胞と関連する色素（ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）等が挙げられるがこれに限定されない）を用いることにより、前記細胞から死細胞を選択的に除くことができる。
さらに任意の細胞集団を濃縮するため、それらの細胞集団に対する特異的マーカーを用いることができる。例えば、リンパ、骨髄、または赤血球系統等の特異的細胞系統に対する特異的マーカーを用いて、これらの細胞を濃縮し、または減らすことができる。これらのマーカーは、間葉系またはケラチノサイト幹細胞を除去または選び出すことによってＨＳＣまたはその子孫を濃縮するために用いることができる。
上記方法はさらに、他の幹細胞特異的マーカーに対するポジティブセレクションにより細胞をさらに濃縮する工程を含むことができる。適したポジティブな幹細胞マーカーとしては、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ １−６０、ＣＤ３４．ｓｕｐ．＋、Ｔｈｙ−１．ｓｕｐ．＋、およびｃ−ｋｉｔ．ｓｕｐ．＋等が挙げられるがこれらに限定されない。個々の要素による適当な選択、ＨＳＣまたはその子孫の自己再生を可能にするバイオアッセイの開発、およびＨＳＣまたはその子孫のそのマーカーに関するスクリーニングにより、生存能力のあるＨＳＣまたはその子孫を多く含む組成物を各種目的のために生成することができる。
幹細胞またはＨＳＣまたはその子孫の集団が単離されると、さらなる単離技術を用いて該ＨＳＣまたはその子孫内部の亜集団を単離することができる。細胞系統に対するＦＡＣＳ等の細胞選択システムなどの特異的マーカーを用いて、各種細胞系統を同定および単離することができる。
本発明のさらに他の局面において、幹細胞もしくはＨＳＣまたはその子孫の含有量を測定する方法が提供され、該方法は：
幹細胞またはその子孫を含んだ細胞集団を得ること；
前記細胞集団を、その幹細胞上の式（Ｉ）のグリカン構造に対する結合タンパク質または結合剤と結合させること；
その幹細胞上の式（Ｉ）のグリカン構造に対する前記結合タンパク質または結合剤により同定されるそれらの細胞を選択すること；および
選択された細胞の量を、結合タンパク質による選択前の細胞集団内の細胞の量との比較において定量すること；
を含む。
結合剤−標識複合体
本発明は特に、前記結合剤が「標識構造」と結合させられる場合の、本発明の構造の結合に関する。この標識構造とは、アッセイにおいて観察可能な分子、例えば蛍光分子、放射性分子、西洋わさびペルオキシダーゼ等の検出可能な酵素またはビオチン／ストレプトアビジン／アビジンを意味する。標識された結合分子を本発明の細胞に接触させると、細胞を細胞表面上の標識の存在に基づいてモニタリング、観察および／または選別することができる。モニタリングおよび観察は標識を観察するための常法、例えば蛍光測定装置、顕微鏡、シンチレーションカウンターおよび他の放射能を測定するための装置により行うことができる。
細胞選別のための、結合剤および標識結合剤複合体の使用
本発明は特に、他の細胞型を含んだ細胞材料等の生体材料または試料からのヒト幹細胞の選別または選択のための、結合剤およびその標識された複合体の使用に関する。好ましい細胞型としては、臍帯血、末梢血、および胚幹細胞、ならびに関連した細胞などが挙げられる。標識は本発明の細胞型を他の類似した細胞から選別するために用いることができる。他の態様において、前記細胞は、血液細胞；または培養細胞については好ましくはフィーダー細胞、例えば胚幹細胞についてはヒトまたはマウスフィーダー細胞等の対応するフィーダー細胞；等の各種細胞型から選別される。好ましい細胞選別法はＦＡＣＳ選別である。他の選別法では固定化した結合剤構造が用いられ、結合および未結合細胞の分離のために未結合細胞が除去される。
固定化した結合剤構造の使用
好ましい一態様において、前記結合剤構造は固相に結合される。細胞が固相と接触させられ、材料の一部が表面に結合する。この方法は細胞の分離および細胞表面構造の分析、または固定化による細胞の細胞生物学的変化の研究に用いることができる。分析を伴う方法において、細胞は好ましくは試薬によってタグをつけられ、または標識され、固相上の結合剤構造を介して固相に結合した細胞が検出される。この方法は好ましくはさらに１または複数個の、未結合細胞除去のための洗浄の工程を含むことができる。
好ましい固相としては、細胞を接触させるのに用いる、細胞に適したプラスチック材料、例えば細胞培養瓶、シャーレおよびマイクロタイターウェル、発酵槽表面材料等が挙げられる。
好ましい幹細胞と混入細胞との間の特異的識別
本発明はさらに、幹細胞を、フィーダー細胞等の分化した細胞、好ましくは動物フィーダー細胞およびより好ましくはマウスフィーダー細胞から識別する方法に関する。さらに、本試薬は特異的結合試薬を用いた任意の分別法による幹細胞の精製のために用いることができると理解される。
好ましい分別法としては、蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）、アフィニティークロマトグラフィー法、および磁性ビーズ法等のビーズ法などが挙げられる。
好ましい細胞、好ましくは胚性細胞と、混入細胞、例えばフィーダー細胞、最も好ましくはマウスフィーダー細胞とを識別するための好ましい試薬としては、表２３による試薬、より好ましくはレクチンＰＳＡ、ＭＡＡ、およびＰＮＡと類似の特異性を有するタンパク質等が挙げられる。
本発明はさらに、幹細胞集団への特異的結合を示すが混入細胞集団には示さない、ポジティブセレクション法に関する。本発明はさらに、混入細胞集団への特異的結合を示すが幹細胞集団には示さない、ネガティブセレクション法に関する。幹細胞の識別のさらに他の態様においては、幹細胞集団はフィーダー細胞集団等の均質な細胞集団とともに識別され、好ましくはこれは他の材料の分離が必要な場合に行われる。ポジティブセレクションのための試薬は、本発明における幹細胞に結合し、混入細胞集団には結合しないように選択することができ、ネガティブセレクションのための試薬は、反対の特異性を示すように選択することができると理解される。本発明の細胞の１つの集団が本発明で研究されていない新規細胞集団から選択される必要がある場合、本発明の結合分子は、該新規細胞集団に対して適した特異性（結合または非結合）を有すると確認されれば用いることができる。本発明は特に、本発明の新規結合または選択法の開発のための、このような結合特異性の分析に関する。
本発明の好ましい特異性としては、
ｉ）マンノース型構造、特にレクチンＰＳＡのようにアルファ−Ｍａｎ構造であって、好ましくは混入細胞の表面上のもの
ｉｉ）ＭＡＡレクチンによるものと同様に、α３−シアル化構造であって、好ましくは胚性幹細胞の識別のためのもの
ｉｉｉ）Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃ結合特異性、好ましくはＧａｌ１−３／ＧａｌＮＡｃ１−３結合特異性、より好ましくはＰＮＡと類似のＧａｌβ１−３／ＧａｌＮＡｃβ１−３結合特異性であって、好ましくは胚性幹細胞の識別のためのもの
の認識等が挙げられる。
結合剤による細胞の操作
本発明は特に、特異的結合タンパク質による細胞の操作に関する。記載されたグリカンは細胞間の相互作用において重要な役割を担っており、従って結合剤または結合分子を細胞の特定の生物学的操作のために用いることができると考えられる。この操作は遊離または固定化結合剤により行われ得る。好ましい一態様において、細胞は、該細胞の増殖速度に影響する細胞培養条件下で細胞の操作のために用いられる。
幹細胞の命名
本発明は全ての幹細胞型、好ましくはヒト幹細胞の分析に関する。幹細胞の一般的な命名を図９に記す。本発明の別の命名基準は、図９に示すように、好ましい一態様において成体幹細胞（臍帯血型材料等）の同等物である、初期ヒト細胞を記載する。骨髄および血液中の成体幹細胞は「血液関連組織」由来の幹細胞に対する同等物である。
特に細胞培養条件下での幹細胞の操作のためのレクチン
本発明は特に、幹細胞の状態の分析のための、および／または幹細胞の操作のための、特異的結合タンパク質としてのレクチンの使用に関する。
本発明は特に、レクチンの存在下で幹細胞を増殖させる細胞培養条件下での幹細胞の操作に関する。操作は好ましくは細胞培養槽の表面上の固定化されたレクチンにより行われる。本発明は特に、表２４に示すようなレクチンの存在下で細胞を増殖させることによる幹細胞の増殖速度の操作に関する。
本発明は、好ましい一態様において、細胞表面からの本発明の特異的グリカンマーカー構造を認識する特異的レクチンによる、幹細胞の操作に関する。本発明は、好ましい一態様における、ＥＣＡレクチン等のＧａｌ認識レクチン；または細胞表面から同定されるガレクチンリガンドグリカンの識別のためのガレクチン等の類似のヒトレクチン；の使用に関する。さらに、幹細胞中のゲノムレベルでのガレクチン発現の特異的変異が、特にガレクチン−１、−３および−８について、存在すると考えられた。本発明は特に、胚性幹細胞の、ならびに骨髄および血液中の成体幹細胞およびその分化派生物に対する、増殖速度の操作のための、これらレクチンの試験の方法に関する。
特異的レクチンによる幹細胞の選別
本発明は、特にＦＡＣＳ法による、幹細胞の選別のための、本発明の細胞表面グリカンエピトープを認識する特異的レクチン型の使用を明らかにした。最も好ましい選別される細胞型として血液および骨髄中の成体幹細胞、特に臍帯血細胞などが挙げられる。臍帯血細胞の選別のための好ましいレクチンとしては、ＧＮＡ、ＳＴＡ、ＧＳ−ＩＩ、ＰＷＡ、ＨＨＡ、ＰＳＡ、ＲＣＡおよび実施例１２に示される他のものなどが挙げられる。特定の幹細胞集団の単離のためのレクチンの妥当性は、実施例１２に示すように公知の幹細胞マーカーを用いた二重標識により示された。
幹細胞のＯ−グリカングライコームの好ましい構造
本発明は特に、幹細胞の次のＯ−グリカンマーカー構造に関する：
マーカー組成ＮｅｕＡｃ２Ｈｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ１に従うコア１型Ｏ−グリカン構造、好ましくは構造ＳＡα３Ｇａｌβ３ＧａＩＮＡｃおよび／またはＳＡα３Ｇａｌβ３（Ｓａα６）ＧａｌＮＡｃを含む；
ならびに、マーカー組成ＮｅｕＡｃ０−２Ｈｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ２ｄＨｅｘ０−１に従うコア２型Ｏ−グリカン構造、より優先的にはさらにグリカン系列ＮｅｕＡｃ０−２Ｈｅｘ２＋ｎＨｅｘＮＡｃ２＋ｎｄＨｅｘ０−１［式中、ｎは１、２または３であり、より優先的にはｎは１または２であり、さらに優先的にはｎは１である］を含む；
より具体的に好ましくはＲ１Ｇａｌβ４（Ｒ３）ＧｌｃＮＡｃβ６（Ｒ２Ｇａｌβ３）ＧａｌＮＡｃ
［式中、Ｒ１およびＲ２は独立に無またはシアル酸残基、好ましくはα２，３−結合シアル酸残基、またはＨｅｘｎＨｅｘＮＡｃｎによる伸長であって、ここでｎは独立に少なくとも１、好ましくは１〜３、最も好ましくは１〜２、最も好ましくは１、の整数であり、前記伸長はシアル酸残基、好ましくはα２，３−結合シアル酸残基で終結してよく；そして
Ｒ３は独立に無またはフコース残基、好ましくはα１，３−結合フコース残基である］を含む。
これらの構造はコア２構造を合成するβ６ＧｌｃＮＡｃ転移酵素の発現と相関していると考えられる。
好ましい分岐Ｎ−アセチルラクトサミン型スフィンゴ糖脂質
本発明はさらに、分岐した、Ｉ型の、２個の末端Ｇａｌβ４残基を有するポリ−Ｎ−アセチルラクトサミンを、ヒト幹細胞の糖脂質から明らかにした。この構造は、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミンを分岐させることができるβ６ＧｌｃＮＡｃ転移酵素の発現と、またさらに分岐ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミンに特異的なレクチンの結合と、相関している。さらに、ＰＷＡレクチンは幹細胞の操作、特にその増殖速度における作用を有していることが注目された。
幹細胞の好ましい定性的および定量的完全Ｎ−グライコーム
幹細胞選別および単離のための好ましい結合剤
実施例に記載されるように、本願発明者らは、特にマンノース特異的および特にα１，３−結合マンノース結合レクチンＧＮＡがＣＢ ＭＮＣからのＣＤ３４＋幹細胞のネガティブセレクション濃縮のために適していたことを見出した。さらに、ポリ−ＬａｃＮＡｃ特異的レクチンＳＴＡ、ならびにフコース特異的および特にα１，２−結合フコース特異的レクチンＵＥＡがＣＢ ＭＮＣからのＣＤ３４＋幹細胞のポジティブセレクション濃縮のために適していた。
本発明は特に、幹細胞結合試薬、優先的にはタンパク質、優先的にはマンノース結合またはα１，３結合マンノース結合、ポリ−ＬａｃＮＡｃ結合、ＬａｃＮＡｃ結合、および／またはフコースもしくは優先的にはα１，２−結合フコース結合のもの；好ましい一態様においては幹細胞結合もしくは非結合のレクチン、より優先的にはＧＮＡ、ＳＴＡ、および／またはＵＥＡ；ならびに、さらに好ましい一態様においてはそれらの組み合わせ；に関するものであり、また、選択的に幹細胞に結合するまたは結合しないグリカン結合試薬を利用した本発明に記載される使用に関するものである。
幹細胞型特異的ガレクチンおよび／またはガレクチンリガンドのための好ましい使用
実施例に記載されるように、本願発明者らは、異なる幹細胞が異なったガレクチン発現プロファイル、および異なったガレクチン（グリカン）リガンド発現プロファイルを有していることも見出した。本発明はさらに、ガラクトース結合試薬、優先的にはガラクトース結合レクチン、より優先的には特異的ガレクチンを；幹細胞型特異的様式で、記載の前記使用に対して本発明に記載される特定の幹細胞を調節するために、またはそれに結合するために、使用することに関する。さらに好ましい一態様において、本発明は、ガレクチンリガンド構造、その誘導体、またはリガンド模倣試薬を、幹細胞型特異的様式で、本発明に記載される使用に対して使用することに関する。
実施例
実施例１
臍帯血由来および骨髄由来間葉系幹細胞株のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によるＮ−グリカンプロファイリング、グリコシダーゼおよびレクチンプロファイリング
細胞試料生成の例
臍帯血由来間葉系幹細胞株
臍帯血の採取
ヒト出産臍帯血（ＵＣＢ）ユニットを母親のインフォームドコンセントを得て出産後に採取し、該ＵＣＢを採取後２４時間以内に処理した。該ＵＣＢをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に１：１で希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）密度勾配遠心（４００ｇ／４０分間）を行って、単核球（ＭＮＣ）を各ＵＣＢユニットから単離した。単核球フラグメントをグラジエントから回収し、ＰＢＳで２回洗浄した。
臍帯血細胞の単離および培養
ＣＤ４５／グリコホリンＡ（ＧｌｙＡ）陰性細胞選択を、免疫標識磁性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて行った。ＭＮＣをＣＤ４５およびＧｌｙＡ磁性マイクロビーズの両者と同時に３０分間インキュベートし、ＬＤカラムを用いて製品の使用説明書に従って（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）ネガティブに選択した。ＣＤ４５／ＧｌｙＡ陰性溶出画分および陽性画分の両者を回収し、培地中に懸濁して計数した。ＣＤ４５／ＧｌｙＡ陽性細胞はフィブロネクチン（ＦＮ）被覆６ウェルプレート上に１ｘ１０６／ｃｍ２の密度でプレーティングした。ＣＤ４５／ＧｌｙＡ陰性細胞はＦＮ被覆９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）上に約１ｘ１０４細胞／ウェルでプレーティングした。翌日培地を交換したため、非接着細胞のほとんどが除去された。残った非接着細胞はそれに続く週２回の培地交換で除去した。
細胞は最初に５６％ＤＭＥＭ低グルコース（ＤＭＥＭ−ＬＧ、Ｇｉｂｃｏ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）４０％ ＭＣＤＢ−２０１（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１ｘペニシリン−ストレプトマイシン（両型ともＧｉｂｃｏ）、１ｘＩＴＳ液体培地サプリメント（インシュリン−トランスフェリン−セレン）、１ｘリノール酸−ＢＳＡ、５ｘ１０−８Ｍ デキサメタゾン、０．１ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸（３者とも全てＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０ｎＭ ＰＤＧＦ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ＲｎＤＳｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ）および１０ｎＭ ＥＧＦ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）からなる培地中で培養した。後の継代（継代７の後）において、細胞はＦＣＳ濃度を１０％に増やした以外は同一の増殖培地中でも培養した。
プレートをコロニーに対してスクリーニングし、コロニー中の細胞が８０−９０％コンフルエントである場合に細胞を継代培養した。最初の継代において、細胞数がまだ少ない場合は、細胞を最小量のトリプシン／ＥＤＴＡ（０．２５％／１ｍＭ、Ｇｉｂｃｏ）を用いて室温で剥がし、トリプシンをＦＣＳで抑制した。細胞を無血清培地で洗い、血清濃度を２％に調整した通常の培地中に懸濁した。細胞を約２０００〜３０００／ｃｍ２でプレーティングした。後の継代において、細胞をトリプシン／ＥＤＴＡを用いて、特定の領域で、特定の時点で剥がし、血球計数器を用いてカウントし、２０００〜３０００細胞／ｃｍ２の密度で再プレーティングした。
骨髄由来間葉系幹細胞株
骨髄由来幹細胞の単離および培養
骨髄（ＢＭ）由来ＭＳＣを、Ｌｅｓｋｅｌa ｅｔ ａｌ．（２００３）による記載のように得た。簡単に述べると、整形外科手術中に得られた骨髄を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０％ ＦＣＳ、１ｘペニシリン−ストレプトマイシンおよび２ｍＭ Ｌ−グルタミン（全てＧｉｂｃｏから）を添加した最小必須アルファ培地（α−ＭＥＭ）中で培養した。２日間の細胞接着期の後、細胞をＣａ２＋およびＭｇ２＋不含ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で洗浄し、さらに同一培地中に２０００〜３０００細胞／ｃｍ２の密度でプレーティングし、週２回、半分の培地を除去し、新鮮な培地に置き換えることにより、ほぼコンフルエントになるまで継代培養した。
実験手順
間葉系幹細胞表現型のフローサイトメトリー分析
ＵＢＣおよびＢＭの両者に由来する間葉系幹細胞をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ， Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって表現型分析した。ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ２９、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ７３およびＨＬＡ−ＡＢＣ（全てＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ， ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍから）、ＣＤ１０５（Ａｂｃａｍ Ｌｔｄ．， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＵＫ， ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ）ならびにＣＤ１３３（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に対するフルオレセインイソチシアネート（ＦＩＴＣ）またはフィコエリトリン（ＰＥ）結合抗体を用いて直接標識を行った。適当なＦＩＴＣおよびＰＥ結合アイソタイプコントロール（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた。ＣＤ９０およびＨＬＡ−ＤＲ（両者ともＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから）に対する非結合抗体を用いて間接標識を行った。間接標識のため、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ）を二次抗体として用いた。
ＵＢＣ由来細胞は造血マーカーＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１４およびＣＤ１３３に対して陰性であった。該細胞はＣＤ１３（アミノペプチダーゼＮ）、ＣＤ２９（β１−インテグリン）、ＣＤ４４（ヒアルロン酸受容体）、ＣＤ７３（ＳＨ３）、ＣＤ９０（Ｔｈｙ１）、ＣＤ１０５（ＳＨ２／エンドグリン）およびＣＤ４９ｅに対して陽性に染色された。細胞はＨＬＡ−ＡＢＣに対しても陽性に染色されたが、ＨＬＡ−ＤＲに対しては陰性であった。ＢＭ由来細胞は類似の表現型を有することが示された。これらはＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＨＬＡ−ＤＲに対して陰性であり、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＨＬＡ−ＡＢＣに対して陽性であった。
脂質生成の相違
ＵＣＢ由来ＭＳＣの脂質生成能力を評価するために、細胞を３ｘ１０３／ｃｍ２の密度で２４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）中に３ウェルずつの重複で播種した。ＵＣＢ由来ＭＳＣを、試料がグライコーム分析のために調製される前に、５週間、ＤＭＥＭ低グルコース、２％ ＦＣＳ（両者ともＧｉｂｃｏから）、１０μｇ／ｍｌ インシュリン、０．１ｍＭ インドメタシン、０．１μＭ デキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）からなる脂質生成誘導培地中で培養した。培地は週に２回、分化培養中に交換した。
骨原性分化
ＢＭ由来ＭＳＣの骨原性分化を誘導するため、細胞をそれらの通常の増殖培地に３ｘ１０３／ｃｍ２の密度で２４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）上に播種した。翌日、培地を、１０％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、０．１μＭ デキサメタゾン、１０ｍＭ β−グリセロリン酸、０．０５ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびペニシリンーストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を添加したα−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）からなる骨原性誘導培地に交換した。ＢＭ由来ＭＳＣを、グライコーム分析のための試料を調製する前に、３週間、週２回の培地交換を行いながら培養した。
グライコーム分析のための細胞収穫
１ｍｌの細胞培養液をグライコーム分析のために確保し、残りの培地を吸引により除去した。細胞培養プレートをＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．２で洗浄した。ＰＢＳを吸引し、細胞を掻き取り、５ｍｌのＰＢＳで回収した（２回反復した）。この時点で少量の細胞画分（１０μｌ）を細胞計数のために採取し、残りの試料を５分間４００ｇで遠心分離した。上清を吸引し、ペレットをＰＢＳ中でさらに２回洗浄した。
細胞を１．５ｍｌのＰＢＳで回収し、５０ｍｌチューブから１．５ｍｌ回収チューブ内に移し、７分間５４００ｒｐｍで遠心分離した。上清を吸引し、もう１回洗浄を繰り返した。細胞ペレットを−７０℃で貯蔵し、グライコーム分析のために用いた。
レクチン染色
ＦＩＴＣ標識したＭａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ凝集素（ＭＡＡ）をＥＹ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＵＳＡ）より購入し、ＦＩＴＣ標識したＳａｍｂｕｃｕｓ ｎｉｇｒａ凝集素（ＳＮＡ）をＶｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＵＫ）より購入した。骨随由来間葉系幹細胞株を上記のように培養した。培養後、細胞を５回ＰＢＳ（１０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１４０ｍＭ ＮａＣｌ）で洗浄し、４％ ＰＢＳ緩衝パラホルムアルデヒドｐＨ７．２で室温（ＲＴ）において１０分間固定した。固定後、細胞を３回ＰＢＳで洗浄し、非特異的結合部位を３％ ＨＳＡ−ＰＢＳ（ＦＲＣ Ｂｌｏｏｄ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｆｉｎｌａｎｄ）または３％ ＢＳＡ−ＰＢＳ（純度＞９９％のＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ）で３０分間、ＲＴでブロックした。レクチンインキュベーションの前に、製品の使用説明書記載の方法により、細胞をＰＢＳ、ＴＢＳ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２）またはＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で２回洗浄した。ＦＩＴＣ標識したレクチンをバッファー中の１％ ＨＳＡまたは１％ ＢＳＡ中で希釈し、細胞とともに６０分間、ＲＴで暗所においてインキュベートした。さらに、細胞を３回、１０分間、ＰＢＳ／ＴＢＳ／ＨＥＰＥＳで洗浄し、ＤＡＰＩ染色剤を含有するＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＫ）中に封入した。レクチン染色を、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｋｏｐ ２ ｐｌｕｓ蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｖｉｓｉｏｎ ＧｍｂＨ、ドイツ）を用いて、ＦＩＴＣおよびＤＡＰＩフィルターとともに観察した。像をＺｅｉｓｓ ＡｘｉｏＣａｍ ＭＲｃカメラを用いて、ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ３．１／４．０（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を使用し、４００Ｘの倍率で撮影した。
結果
間葉系幹細胞集団からのグリカンの単離
本結果は２つの臍帯血由来間葉系幹細胞株および脂質生成方向に分化するように誘導された細胞、ならびに２つの骨髄由来間葉系幹細胞株および骨原性方向に分化するように誘導された細胞から生成される。細胞株およびそれらに由来する分化した細胞の分析は上記の通りである。Ｎ−グリカンを試料から単離し、グリカンプロファイルを、先の例に記載されるように単離された中性およびシアル化Ｎ−グリカン画分のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＦ質量分析データから生成した。
臍帯血由来間葉系幹細胞（ＣＢ ＭＳＣ）株
中性Ｎ−グリカンの構造的特徴
２つのＣＢ ＭＳＣ株に対して提案された中性Ｎ−グリカンのグルーピングは互いによく類似しており、それらの中性Ｎ−グリカンの構造的特徴に大きな相違は無いことを示している。しかし、ＣＢ ＭＳＣはＣＢ単核球集団と異なり、それらはプロファイルにおいて、例えば他の構造群と比較して比較的多量の中性複合型Ｎ−グリカンおよびハイブリッド型または単分岐中性Ｎ−グリカンを有している。
可溶性グリカン成分の同定
ＣＢ単核球集団と同様に、本分析において、グリカン群Ｈｅｘ２−１２ＨｅｘＮＡｃ１からの成分を含む提案された単糖組成に基づいて可溶性グリカンと同定された中性グリカン成分が全ての細胞型において同定された（図参照）。これらのグリカン成分の存在量は、互いに対して、また他のグリカンシグナルに対して、個々の試料および細胞型間で異なる。
シアル化Ｎ−グリカンプロファイル
２つのＣＢ ＭＳＣ株から得られたシアル化Ｎ−グリカンプロファイルは、そのシアル化Ｎ−グリカンプロファイル全体に関して互いによく類似している。しかし、プロファイル間で小さな相違が観察され、一部のグリカンシグナルは１つの細胞株においてのみ観察することができ、この２つの細胞株が違いに異なるグリカン構造を有することを示している。分析は、各細胞型において、酸性Ｎ−グリカン成分に割り当てられる約５０〜７０個のグリカンシグナルの相対的な割合を明らかにした。典型的には、グリカンプロファイルにおける細胞集団間の有意な相違は複数の実験を通じて一貫性がある。
グリカンプロファイルの分化と関連した変化
ＣＢ ＭＳＣの中性Ｎ−グリカンプロファイルは脂質生成細胞培養液中での分化の際に変化する。本結果は、いくつかの個々のグリカンシグナルおよびグリカンシグナル群の相対存在量が分化培地内での細胞培養により変化することを示す。分化と関連したグリカン構造群の主要な変化は中性複合型Ｎ−グリカン、例えばＨｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４およびＨｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４ｄＨｅｘ１単糖組成にそれぞれ対応するｍ／ｚ １６６３およびｍ／ｚ １８０９におけるシグナルの量の増加などである。変化はシアル化グリカンプロファイルでも観察された。
中性Ｎ−グリカンのグリコシダーゼ分析
特異的エキソグリコシダーゼ消化を、実施例に記載のように、ＣＢ ＭＳＣ株から単離した中性Ｎ−グリカン画分に対して行った。α−マンノシダーゼ分析の結果は、ＣＢ ＭＳＣ株の中性Ｎ−グリカンプロファイルにおけるどのＮ−グリカンシグナルがαマンノシダーゼ消化に感受性であるかを詳細に示し、非還元末端α−マンノース残基の、対応するグリカン構造における存在を示す。例えば、提案された単糖組成Ｈｅｘ５−９ＨｅｘＮＡｃ２によって予備的に高マンノース型Ｎ−グリカンに割り当てられたｍ／ｚ １２５７、１４１９、１５８１、１７４３、および１９０５の主要な中性Ｎ−グリカンシグナルは、末端α−マンノース残基を含んでいることが示され、従って前記の予備的な割当てが確認された。結果は、対応するグリカン構造における非還元末端β１，４−ガラクトース残基の存在を示す。例えば、ｍ／ｚ １６６３およびｍ／ｚ １８０９における主要な中性複合型Ｎ−グリカンシグナルは末端β１，４−結合ガラクトース残基を含むことが示された。
骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ ＭＳＣ）株
中性Ｎ−グリカンプロファイル、およびグリカンプロファイルにおける分化と関連した変化
増殖培地中および骨原性培地中で増殖させたＢＭ ＭＳＣ株から得られた中性Ｎ−グリカンプロファイルは、その中性Ｎ−グリカンプロファイル全体がＣＢ ＭＳＣ株と類似している。しかし、２つの供給源に由来する細胞株間の相違が観察され、一部のグリカンシグナルは１つの細胞株においてのみ観察することができ、これらの細胞株が違いに異なるグリカン構造を有することを示している。ＢＭ ＭＳＣの主要な特徴的構造特性は、ＣＢ ＭＳＣ株と比べてさらに豊富な中性複合型Ｎ−グリカンである。ＣＢ ＭＳＣと同様、これらのグリカンもＢＭ ＭＳＣの分化の際の主要な増加したグリカンシグナル群であった。分析は、各細胞型において、非シアル化Ｎ−グリカン成分に割り当てられる約５０〜７０個のグリカンシグナルの相対的な割合を明らかにした。典型的には、グリカンプロファイルの細胞集団間の有意な相違は複数の実験を通じて一貫性がある。
シアル化Ｎ−グリカンプロファイル
増殖培地中および骨原性培地中で増殖させたＢＭ ＭＳＣ株から得られたシアル化Ｎ−グリカンプロファイル。未分化のおよび分化した細胞はそのシアル化Ｎ−グリカンプロファイル全体が互いによく類似している。しかし、プロファイル間の小さな相違が観察され、一部のグリカンシグナルは１つの細胞株においてのみ観察することができ、２つの細胞型が違いに異なるグリカン構造を有することを示している。分析は、各細胞型において、酸性Ｎ−グリカン成分に割り当てられた約５０個のグリカンシグナルの相対的な割合を明らかにした。典型的には、グリカンプロファイルの細胞集団間の有意な相違は複数の実験を通して一貫性がある。
シアリダーゼ分析
ＢＭ ＭＳＣから単離されたシアル化Ｎ−グリカン画分を先の実施例に記載のように広範なシアリダーゼで消化した。反応後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により、シアル化Ｎ−グリカンの大部分が脱シアル化され、対応する中性Ｎ−グリカンに変換されたことが観察され、それらが、提案された単糖組成により示唆されるように、シアル酸残基（ＮｅｕＡｃおよび／またはＮｅｕＧｃ）を有していたことが示された。増殖培地中および骨原性培地中で増殖させたＢＭ ＭＳＣの中性および脱シアル化（元シアル化）Ｎ−グリカン画分の組み合わせのグリカンプロファイルは、（脱シアル化型の）細胞試料から単離された全Ｎ−グリカンプロファイルに対応する。未分化ＢＭ ＭＳＣ（骨原性培地中で増殖）においては、およそ５３％のＮ−グリカンシグナルが高マンノース型Ｎ−グリカン単糖組成、８％が低マンノース型Ｎ−グリカン、３１％が複合型Ｎ−グリカン、および７％がハイブリッド型または単分岐Ｎ−グリカン単糖組成に対応すると算出される。分化したＢＭ ＭＳＣ（骨原性培地中で増殖）においては、およそ２８％のＮ−グリカンシグナルが高マンノース型Ｎ−グリカン単糖組成、９％が低マンノース型Ｎ−グリカン、５０％が複合型Ｎ−グリカン、および１１％がハイブリッド型または単分岐Ｎ−グリカン単糖組成に対応すると算出される。
間葉系幹細胞のレクチン結合分析
実験手順の下で記載されるように、骨髄由来間葉系幹細胞を、それらの表面上のα２，３−結合シアル酸特異的（ＭＡＡ）およびα２，６−結合シアル酸特異的（ＳＮＡ）レクチンのリガンドの存在に関して分析した。ＭＡＡは強く細胞と結合したのに対し、ＳＮＡは弱く結合したことが明らかになり、細胞培養条件において細胞が、α２，６−結合シアル酸よりも有意に多いα２，３−結合シアル酸をその表面複合糖質上に有していたことが示された。本結果はレクチン染色を異なる細胞型の識別のためのさらなる手段として用いることができ、それが質量分析プロファイリングの結果を補完することを示唆する。
細胞培養試薬からの潜在的グリカン混入の検出
ＭＳＣ株のシアル化Ｎ−グリカンプロファイルにおいて、異常なシアル酸残基による間葉系幹細胞複合糖質の汚染を示す特異的Ｎ−グリカンシグナルが観察された。まず、細胞を、ウマ血清のウシ等の添加動物血清とともに細胞培地中で培養した際、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）による潜在的混入が検出された。ＮｅｕＧｃ１Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４の［Ｍ−Ｈ］−イオンに対応するｍ／ｚ １９４６、ならびにＮｅｕＧｃ１ＮｅｕＡｃ１Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４およびＮｅｕＧｃ２Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４の［Ｍ−Ｈ］−イオンにそれぞれ対応するｍ／ｚ ２２３７およびｍ／ｚ ２２５３におけるグリカンシグナルは、Ｎｅｕ５Ｇｃ、すなわちＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）よりも１６Ｄａ大きい質量を有するシアル酸残基の存在を示した。さらに、細胞がウマ血清を添加した細胞培養液中で培養された際、Ｏ−アセチル化シアル酸による潜在的な混入が検出された。Ｏ−アセチル化シアル酸含有シアル化Ｎ−グリカンの検出のために用いられた特徴的シグナルには、算出されたｍ／ｚ １９７２．７、２２６３．８および２３０５．８における、それぞれ、Ａｃ１ＮｅｕＡｃ１Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４、Ａｃ１ＮｅｕＡｃ２Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４、およびＡｃ２ＮｅｕＡｃ２ＨｅＸ５ＨｅＸＮＡｃ４の［Ｍ−Ｈ］−イオンが含まれた。
結論
グリカンプロファイリング法の使用
本結果は、本グリカンプロファイリング法がＣＢ ＭＳＣ株およびＢＭ ＭＳＣ株を互いに、また臍帯血単核球集団等の他の細胞型から、識別するのに用いることができることを示している。分化に誘導された変化、および細胞培養液等からの潜在的グリカン混入もグリカンプロファイルにおいて検出することができ、細胞状態の変化が本方法により検出され得ることを示している。本方法は、以下で議論されるものを含むＭＳＣ特異的グリコシル化特性の検出にも用いることができる。
培養細胞および天然ヒト細胞間におけるグリコシル化の相違
本結果は、ＢＭ ＭＳＣ株が、臍帯血から単離された単核球よりも、他のＮーグリカン構造群と比較して多くの高マンノース型Ｎ−グリカンおよび少ない低マンノース型Ｎ−グリカンを有することを示す。以下の実施例で培養ヒト胚幹細胞から得られた結果と併せて考えると、これは、天然の単離された幹細胞との比較における、培養された幹細胞の一般的傾向であることが示唆される。しかし、ＢＭ ＭＳＣの骨原性培地中での分化は有意な複合型Ｎ−グリカンの量の増加および高マンノース型Ｎ−グリカンの量の減少をもたらす。
間葉系幹細胞株特異的なグリコシル化特性
本結果は、間葉系幹細胞株がそのグリコシル化の特異的特性：
１）ＣＢ ＭＳＣ株およびＢＭ ＭＳＣ株の両者が固有の中性およびシアル化Ｎ−グリカンプロファイルを有する；
２）ＣＢおよびＢＭ ＭＳＣ株の主要な特徴的構造特性は豊富な中性複合型Ｎ−グリカンである；
３）さらなる特徴的な特性は複合型Ｎ−グリカンの低シアル化水準である；
等に関して、本研究で研究された他の細胞型と異なることを示唆する。
実施例２
ヒト胚幹細胞株のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によるＮ−グリカンプロファイリング
細胞材料生成の例
ヒト胚幹細胞株（ｈＥＳＣ）
未分化ｈＥＳＣ
胚盤胞期の体外受精過剰ヒト胚からのｈＥＳＣ株の生成の方法は先に記載されている（例えばＴｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。本研究における分析された細胞株のうち２つは、最初に得られ、マウス胚線維芽細胞フィーダー（ＭＥＦ；ＩＣＲ系の交尾後１２〜１３の胎児）上で、２つはヒト包皮線維芽フィーダー細胞（ＨＦＦ；ＣＲＬ−２４２９ ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｎａｓ，ＵＳＡ）上で培養された。本研究のため、全ての株をマイトマイシン−Ｃ（１μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理したＨＦＦフィーダー細胞に移し、２ｍＭ Ｌ−グルタミン／ペニシリンストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、２０％ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ）、１ Ｘ 非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、１ Ｘ ＩＴＳＦ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および４ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（Ｓｉｇｍａ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した無血清培地（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標） Ｄ−ＭＥＭ； Ｇｉｂｃｏ（登録商標） Ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｐａｉｓｌｅｙ， ＵＫ）中で培養した。
ステージ２の分化したｈＥＳＣ（胚様体）
胚様体（ＥＢ）の形成を誘導するため、ｈＥＳＣのコロニーを最初に１０〜１４日間増殖させ、その後該コロニーを小片に切断し、非接着性シャーレ上に移して浮遊培養を形成した。形成されたＥＢを次の１０日間、ｂＦＧＦを含まない標準培地（上記参照）中で浮遊培養した。
ステージ３の分化したｈＥＳＣ
さらなる分化のため、ＥＢを、ＩＴＳ、フィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）、Ｌ−グルタミンおよび抗生物質を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２混合物（Ｇｉｂｃｏ）からなる培地中の、ゼラチン被覆（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）接着性培養皿上に移した。接着した細胞を１０日間培養し、その後それらを回収した。
試料調製
細胞を機械的に回収し、洗浄し、グリカン分析の前に凍結保存した。
結果
中性Ｎ−グリカンプロファイル − 分化状態の影響
ヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）株、その胚様体（ＥＢ）分化型、およびそのステージ３（ｓｔ．３）分化型から得られた中性Ｎ−グリカンプロファイル。細胞型は主要な中性Ｎ−グリカンシグナルに関しては互いに類似するが、２つの分化した細胞型の中性Ｎ−グリカンプロファイルは未分化ｈＥＳＣのプロファイルとは有意に異なる。実際、細胞型の分化が進むほど、その中性Ｎ−グリカンプロファイルは未分化ｈＥＳＣのプロファイルとより大きく異なってくる。プロファイル間の多数の相違が観察され、多くのグリカンシグナルは３つの細胞型のうち１つまたは２つにおいてのみ観察することができ、分化が新たなグリカン型の出現を誘導することが示唆される。分析は、各細胞型において、非シアル化Ｎ−グリカン成分に割り当てられた約４０〜５５個のグリカンシグナルの相対的割合を明らかにした。典型的には、グリカンプロファイルにおける細胞集団間の有意な相違は複数の実験を通して一貫している。
中性Ｎ−グリカンプロファイル − ｈＥＳＣ株の比較
４つのｈＥＳＣ株から得られた中性Ｎ−グリカンプロファイルは互いによく似ている。個々のプロファイルの特徴および細胞株特異的グリカンシグナルはグリカンプロファイル中に存在するが、ｈＥＳＣ株はそれらの中性Ｎ−グリカンプロファイルに関して互いにより類似しており、分化したＥＢおよびｓｔ．３細胞型とは異なっていると結論される。ｈＥＳＣ株３および４は兄弟胚（ｓｉｇｌｉｎｇ ｅｍｂｒｙｏ）由来であり、それらの中性Ｎ−グリカンプロファイルは互いにより類似しており、２つの他の細胞株とは異なっていた：すなわち、それらは共通のグリカンシグナルを有していた。分析は、各細胞型において、非シアル化Ｎ−グリカン成分に割り当てられた約４０〜５５個のグリカンシグナルの相対的割合を明らかにした。典型的には、グリカンプロファイルにおける細胞集団間の有意な相違は複数の実験を通して一貫している。
中性Ｎ−グリカンの構造的特徴
分析された細胞型に対して提案された中性Ｎ−グリカンの分類を表６に示す。ここでも、分析された３つの主要な細胞型、すなわち未分化ｈＥＳＣ、分化細胞、およびヒト線維芽細胞フィーダー細胞は、互いに有意に異なる。各細胞型内では、しかし、個々の細胞株間で小さな相違が存在する。さらに、分化と関連した中性Ｎ−グリカンの構造的特徴はｓｔ．３の分化した細胞において、ＥＢ細胞におけるよりも強く発現している。細胞型特異的グリコシル化特性を、以下、結論において考察する。
中性Ｎ−グリカン画分のグリコシダーゼ分析
特異的エキソグリコシダーゼ消化を、先の実施例に記載されるｈＥＳＣ株から単離された中性Ｎ−グリカン画分に対して行った。α−マンノシダーゼ分析においては、いくつかの中性グリカンシグナルがα−マンノシダーゼ消化に対して感受性が高いことが示され、対応するグリカン構造における非還元末端α−マンノース残基の潜在的な存在が示唆された。ｈＥＳＣおよびＥＢ細胞においては、これらのシグナルはｍ／ｚ ９１７、１０７９、１０９５、１２４１、１２５７、１３７８、１３９３、１４０３、１４４４、１５５５、１５４０、１５６５、１５８１、１６０６、１６２２、１６８８、１７４３、１７６８、１９０５、１９９６、２０４１、２０６７、２１５８、および２３２０を含んでいた。β１，４−ガラクトシダーゼ分析においては、いくつかの中性グリカンシグナルがβ１，４−ガラクトシダーゼ消化に対して感受性が高いことが示され、対応するグリカン構造における非還元末端β１，４−ガラクトース残基の潜在的な存在が示唆された。ｈＥＳＣおよびＥＢ細胞においては、これらのシグナルはｍ／ｚ ６０９、７７１、８９２、９１７、１２４１、１３７８、１３９３、１５５５、１５６５、１６０６、１６２２、１６４７、１６６３、１７０４、１８０９、１８５０、１８６６、１９５５、１９７１、１９９６、２０１２、２０２８、２０４１、２１４２、２１７４、および２３２０を含んでいた。α１，３／４−フコシダーゼ分析においては、いくつかの中性グリカンシグナルがα１，３／４−フコシダーゼ消化に対して感受性が高いことが示され、対応するグリカン構造における非還元末端α１，３−および／またはα１，４−フコース残基の潜在的な存在が示唆された。ｈＥＳＣおよびＥＢ細胞においては、これらのシグナルはｍ／ｚ １１２０、１５９０、１７８４、１７９３、１９５５、１９９６、２１０１、２１１７、２１４２、２１５８、２１９０、２２１５、２２４７、２２６３、２３０４、２３２０、２３９３、および２４６６を含んでいた。
可溶性グリカン成分の同定
先の実施例に記載された細胞型と同様に、本分析において、中性グリカン成分であって、グリカン群Ｈｅｘ２−１２ＨｅｘＮＡｃ１からの成分を含むそれらの提案された単糖組成に基づき可溶性グリカンに割り当てられたものが、全ての細胞型において同定された（図参照）。これらのグリカン成分の互いに対する、および他のグリカンシグナルに対する、存在量は、個々の試料および細胞型間で異なる。
シアル化Ｎ−グリカンプロファイル − 分化状態の影響
ヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）株、その胚様体（ＥＢ）分化型、およびそのステージ３（ｓｔ．３）分化型から得られたシアル化Ｎ−グリカンプロファイル。細胞型は主要なシアル化Ｎ−グリカンシグナルに関しては互いに類似するが、２つの分化した細胞型のシアル化Ｎ−グリカンプロファイルは未分化ｈＥＳＣのプロファイルとは有意に異なる。実際、細胞型の分化が進むほど、そのシアル化Ｎ−グリカンプロファイルは未分化ｈＥＳＣのプロファイルとより大きく異なってくる。プロファイル間の多数の相違が観察され、多くのグリカンシグナルは３つの細胞型のうち１つまたは２つにおいてのみ観察することができ、分化が新たなグリカン型の出現および幹細胞特異的グリカン型の量の減少を誘導することが示唆される。例えば、ｍ／ｚ １９４６および２２２２における、それぞれ単糖組成ＮｅｕＧｃ１Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４およびＮｅｕＡｃ１Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４ｄＨｅｘ２に対応するグリカンシグナルの相対量の、分化と関連した有意な減少が存在する。分析は、各細胞型において、酸性Ｎ−グリカン成分に割り当てられた約５０〜７０個のグリカンシグナルの相対的割合を明らかにした。典型的には、グリカンプロファイルにおける細胞集団間の有意な相違は複数の実験を通して一貫している。
シアル化Ｎ−グリカンプロファイル − ｈＥＳＣ株の比較
４つのｈＥＳＣ株から得られたシアル化Ｎ−グリカンプロファイルは互いによく似ている。個々のプロファイルの特徴および細胞株特異的グリカンシグナルはグリカンプロファイル中に存在するが、ｈＥＳＣ株はそれらのシアル化Ｎ−グリカンプロファイルに関して互いにより類似しており、分化したＥＢおよびｓｔ．３細胞型とは異なっていると結論される。分析は、各細胞型において、酸性Ｎ−グリカン成分に割り当てられた約５０〜７０個のグリカンシグナルの相対的割合を明らかにした。典型的には、グリカンプロファイルにおける細胞集団間の有意な相違は複数の実験を通して一貫している。
ヒト線維芽細胞フィーダー細胞株
ヒト線維芽細胞フィーダー細胞株から得られたシアル化Ｎ−グリカンプロファイルはｈＥＳＣ、ＥＢ、およびｓｔ．３分化細胞とは異なっており、ｈＥＳＣ細胞と別々におよび一緒に増殖させたそのフィーダー細胞は互いに異なっている。
シアル化Ｎ−グリカンの構造的特徴
分析された細胞型に対して提案されたシアル化Ｎ−グリカンの分類を表７に示す。ここでも、分析された３つの主要な細胞型、すなわち未分化ｈＥＳＣ、分化細胞、およびヒト線維芽細胞フィーダー細胞は、互いに有意に異なる。各細胞型内では、しかし、個々の細胞株間で小さな相違が存在する。さらに、分化と関連したシアル化Ｎ−グリカンの構造的特徴はｓｔ．３の分化した細胞において、ＥＢ細胞におけるよりも強く発現している。細胞型特異的グリコシル化特性を、以下、結論において考察する。
結論
グリカンプロファイルの比較
細胞型間のグリカンプロファイルの相違は複数の試料および実験を通じて一貫しており、グリカンプロファイリングの本方法、および本グリカンプロファイルにおける相違を、ｈＥＳＣもしくはそこから分化した細胞またはフィーダー細胞等の他の細胞を同定するために、またはそれらの純度を測定するために、または試料中に存在する細胞型を同定するために、用いることができると示唆された。本方法および本結果は、細胞型特異的グリカンの構造的特徴または細胞型特異的グリカンプロファイルを同定するために用いることもできる。該方法は、ｈＥＳＣ、ＥＢ、およびｓｔ．３分化細胞間での分析結果の比較により示されたように、特に分化段階の決定において有用であることが分かった。さらに、ｈＥＳＣは固有のグリコシル化プロファイルを有することが示され、これは分化した細胞型から、およびＭＳＣ等の他の幹細胞型から、識別することが可能であり、幹細胞一般および特定の幹細胞型も本方法により同定することができることが示唆された。本方法は、兄弟胚由来のｈＥＳＣ株に共通のグリカン構造も検出することができ、本方法によって、異なる細胞株において関連する構造的特徴を同定し得ること、またはそれらの類似性を評価し得ることが示唆された。
中性Ｎ−グリカンの構造的特徴の比較
分析された細胞型間のグリコシル化プロファイルの相違を、提案された構造的特徴に基づき同定し、これを細胞型特異的グリカンの構造的特徴の同定のために用いることができる。同定された中性Ｎ−グリカンプロファイルの細胞型特異的特徴は以下のように結論される。
ＨＥＳＣ株：
１）増加した量のフコシル化中性Ｎ−グリカン、特に鎖あたり２つ以上ののデオキシヘキソース残基を有するグリカン。α１，２−、α１，３−、またはα１，４−結合フコース残基を有する中性Ｎ−グリカンの増加した発現を表す；そして
２）増加した量の、より大型の中性Ｎ−グリカン。
ＥＢおよびｓｔ．３分化細胞（ｓｔ．３細胞は特徴をより強く発現する）：
１）より少ない量の、鎖あたり２つ以上のデオキシヘキソース残基を有する中性Ｎ−グリカン。α１，２−、α１，３−、またはα１，４−結合フコース残基を有する中性Ｎ−グリカンの減少した発現を表す；
２）増加した量のハイブリッド型、単分岐、および複合型中性Ｎ−グリカン。
３）増加した量の末端ＨｅｘＮＡｃ残基；そして
４）潜在的に増加した量の二分岐ＧｌｃＮＡｃ構造。
ヒト線維芽細胞フィーダー細胞
１）増加した量の、より大型の中性Ｎ−グリカン；
２）より少ない量の、鎖あたり２つ以上のデオキシヘキソース残基を有する中性Ｎ−グリカン。α１，２−、α１，３−、またはα１，４−結合フコース残基を有する中性Ｎ−グリカンの減少した発現を表す；
３）増加した量の末端ＨｅｘＮＡｃ残基；そして
４）潜在的に二分岐ＧｌｃＮＡｃ構造を有しない。
シアル化Ｎ−グリカンの構造的特徴の比較
分析された細胞型間のグリコシル化プロファイルの相違を提案された構造的特徴に基づき同定し、これを細胞型特異的グリカンの構造的特徴を同定するために用いることができる。シアル化Ｎ−グリカンプロファイルの同定された細胞型特異的な特徴は以下のように結論された。
ＨＥＳＣ株：
１）増加した量のフコシル化シアル化Ｎ−グリカン、特に鎖あたり２つ以上ののデオキシヘキソース残基を有するグリカン。α１，２−、α１，３−、またはα１，４−結合フコース残基を有するシアル化Ｎ−グリカンの増加した発現を表す；
２）増加した量の末端ＨｅｘＮＡｃ残基；そして
３）増加した量のＮｅｕ５Ｇｃ含有シアル化Ｎ−グリカン。
ＥＢおよびｓｔ．３分化細胞（ｓｔ．３細胞は特徴をより強く発現する）：
１）より少ない量の、鎖あたり２つ以上のデオキシヘキソース残基を有するシアル化Ｎ−グリカン。α１，２−、α１，３−、またはα１，４−結合フコース残基を有するシアル化Ｎ−グリカンの減少した発現を表す；
２）増加した量のハイブリッド型または単分岐シアル化中性Ｎ−グリカン；そして
３）潜在的に増加した量の二分岐ＧｌｃＮＡｃ構造。
ヒト線維芽細胞フィーダー細胞：
１）増加した量の、より大型のシアル化Ｎ−グリカン；
２）より少ない量の末端ＨｅｘＮＡｃ残基；そして
３）潜在的に、より少ない量の二分岐ＧｌｃＮＡｃ構造。
実施例３
ヒト胚幹細胞のレクチンおよび抗体プロファイリング
実験手順
細胞試料
ヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）株ＦＥＳ２２およびＦＥＳ３０（Ｆａｍｉｌｙ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｉｎｌａｎｄ）を、上記のように、マウスフィーダー細胞（ｍＥＦ）層上で増殖させた。
ＦＩＴＣ標識レクチン
フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識レクチンをいくつかの製造者から購入した：ＦＩＴＣ−ＧＮＡ、−ＨＨＡ、−ＭＡＡ、−ＰＷＡ、−ＳＴＡおよび−ＬＴＡはＥＹ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （ＵＳＡ）から；ＦＩＴＣ−ＰＳＡおよび−ＵＥＡならびにビオチン標識ＷＦＡはＳｉｇｍａ（ＵＳＡ）から；およびＦＩＴＣ−ＲＣＡ、−ＰＮＡおよび−ＳＮＡはＶｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （ＵＫ）から。
蛍光顕微鏡標識実験を本質的に先の実施例に記載されるように行った。ビオチン標識をフルオレセイン結合ストレプトアビジンにより可視化した。
結果
表１９に、試験したＦＩＴＣ標識レクチンおよび抗体、それらの標的単糖配列の例、ならびに、顕微鏡スライド上の増殖させた固定細胞の蛍光顕微鏡検査における、表の説明文中に記載されるようにグレード分けされたレクチン結合強度を示す。用いたレクチンの複数の結合特異性が当該分野において記載されており、一般に本実験におけるレクチンの結合は細胞がその表面上にレクチンに対する特異的リガンドを発現していることを意味するが、該レクチンによって認識される他のリガンドの存在も排除しない。ＧＦ抗体の特異性については実施例１４を参照のこと。
α−結合マンノースおよびコアＦｕｃａ６−エピトープ
Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ （ＰＳＡ）レクチンによるｍＥＦの多量の標識は、それらがマンノース、より具体的にはＮ−グリカン等のそれらの表面（または細胞内）複合糖質上のα結合マンノース残基およびコアＦｕｃα６エピトープを発現することを示唆する。結果はさらに、両者ｈＥＳＣ株がこれらのリガンドをそれらの表面上にｍＥＦほど高い濃度では発現しないことを示唆する。
β−結合ガラクトース
ｈＥＳＣの、ピーナッツレクチン（ＰＮＡ）による、多量の標識、およびＲｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓレクチンＩ（ＲＣＡ−Ｉ）による、より弱い標識は、ｈＥＳＣがβ結合非還元末端ガラクトース残基をＮ−および／またはＯ−グリカン等のその表面複合糖質上に発現していることを示唆する。より具体的には、ＲＣＡ−Ｉの結合は、細胞が多量の非置換Ｇａｌβエピトープをその表面上に有していることを示唆する。ＰＮＡの結合は、非置換Ｇａｌβの存在を示唆し、ｍＥＦに対するＰＮＡの特異的結合が無いことは、このレクチンの結合エピトープが、ｍＥＦにおいて、より少ないことを示唆する。
シアル酸
Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ（ＭＡＡ）およびＳａｍｂｕｃｕｓ ｎｉｇｒａ（ＳＮＡ）レクチンの両者によるｈＥＳＣの特異的標識は、細胞がシアル酸残基を、Ｎ−および／もしくはＯ−グリカンならびに／または糖脂質等のその表面複合糖質上に発現していることを示唆する。より具体的には、ｈＥＳＣの特異的なＭＡＡの結合は、該細胞が多量のα２，３−結合シアル酸残基を有していることを示唆する。一方、結果は、これらのエピトープがｍＥＦにおいてはより少ないことを示唆する。両細胞型におけるＳＮＡの結合は、細胞表面上のシアル酸残基におけるα２，６−結合の存在も示唆する。
ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン配列
アメリカヤマゴボウ（ＰＷＡ）レクチンによる、細胞の標識、およびＳｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（ＳＴＡ）レクチンによる、より弱い標識は、細胞がポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン配列をＮ−および／もしくはＯ−グリカンならびに／または糖脂質等のその表面複合糖質上に発現していることを示唆する。結果はさらに、細胞表面ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン鎖が直鎖および分岐鎖配列の両者を含んでいることを示唆する。
β−結合Ｎ−アセチルガラクトサミン
Ｗｉｓｔｅｒｉａ ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａレクチン（ＷＦＡ）によるｈＥＳＣの多量の標識は、ｈＥＳＣがβ−結合非還元末端Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を、Ｎ−および／またはＯ−グリカン等のその表面複合糖質上に発現していることを示唆する。ｍＥＦに対するＷＦＡの特異的結合が無いことは、前記レクチンリガンドエピトープが、ｍＥＦにおいて、より少ないことを示唆する。
フコシル化
Ｕｌｅｘ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ（ＵＥＡ）による、細胞の標識、およびＬｏｔｕｓ ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ（ＬＴＡ）レクチンによる、より弱い標識は、細胞がフコース残基をＮ−および／もしくはＯ−グリカンならびに／または糖脂質等のその表面複合糖質上に発現していることを示唆する。より具体的には、ＵＥＡの結合は、細胞がα１，２−結合フコース残基等のα結合フコース残基を有していることを示唆する。ＬＴＡの結合は、α１，３−またはα１，４−結合フコース残基等のα−結合フコース残基の細胞表面上における存在を示唆する。
特異的抗体抗Ｌｅｘおよび抗ｓＬｅｘ抗体の結合の結果は、ｈＥＳＣの試料が、それぞれＧａｌβ４（Ｆｕｃα３）ＧｌｃＮＡｃβおよびＳＡα３Ｇａｌβ４（Ｆｕｃα３）ＧｌｃＮＡｃβ炭水化物エピトープをそれらの表面上に有することを示す。
まとめると、本実験において、レクチンＰＮＡ、ＭＡＡ、およびＷＦＡ、ならびに抗体抗Ｌｅｘおよび抗ｓＬｅｘは、特異的にｈＥＳＣに結合し、しかしｍＥＦには結合しなかった。一方、レクチンＰＳＡは特異的にｍＥＦに結合し、しかしｈＥＳＣには結合しなかった。これは、これらの試薬が認識するグリカンエピトープがｈＥＳＣまたはｍＥＦ特異的発現様式を有することを示唆する。一方、試験した試薬パネルにおける他の試薬は
前記の２つのｈＥＳＣ株ＦＥＳ２２およびＦＥＳ３０に異なって結合し、ｈＥＳＣ細胞表面の細胞株特異的グリコシル化が示唆された（表１９）。
考察
Ｖｅｎａｂｌｅ， Ａ． ｅｔ ａｌ．（２００５ ＢＭＣ Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．）は、マウスフィーダー細胞上で増殖させたＳＳＥＡ−４を多く含むヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）のレクチン結合プロファイルを先に記載した。用いたレクチンは、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（ＬＥＡ、ＴＬ）、ＲＣＡ、Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ（ＣｏｎＡ）、ＷＦＡ、ＰＮＡ、ＳＮＡ、Ｈｉｐｐｅａｓｔｒｕｍ ｈｙｂｒｉｄ（ＨＨＡ、ＨＨＬ）、Ｖｉｃｉａ ｖｉｌｌｏｓａ（ＶＶＡ）、ＵＥＡ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ（ＰＨＡ−ＬおよびＰＨＡ−Ｅ）、ＭＡＡ、ＬＴＡ（ＬＴＬ）、およびＤｏｌｉｃｈｏｓ ｂｉｆｌｏｒｕｓ（ＤＢＡ）レクチンであった。ＦＡＣＳおよび細胞化学分析においては、４種のレクチンがＳＳＥＡ−４と同様な結合割合を有する（ＬＥＡ、ＲＣＡ、ＣｏｎＡ、およびＷＦＡ）ことが見出され、さらに２種のレクチンも高い結合割合を有していた（ＰＮＡおよびＳＮＡ）。２種のレクチンはｈＥＳＣに結合しなかった（ＤＢＡおよびＬＴＡ）。６種のレクチンは部分的にｈＥＳＣに結合することが見出された（ＰＨＡ−Ｅ、ＶＶＡ、ＵＥＡ、ＰＨＡ−Ｌ、ＭＡＡ、およびＨＨＡ）。著者らは、前記の相違するレクチン結合特異性を、炭水化物提示に基づくｈＥＳＣおよび分化したｈＥＳＣ型の識別に用いることができることを示唆した。
Ｖｅｎａｂｌｅ ｅｔ ａｌ．（２００５）は、多能性ＳＳＥＡ−４ ｈＥＳＣの表面上に高発現を有すると主張されるいくつかの炭水化物構造（Ｖｅｎａｂｌｅほかによる対応するレクチンを括弧内に示す）：α−Ｍａｎ（ＣｏｎＡ、ＨＨＡ）、Ｇｌｃ（ＣｏｎＡ）、Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃβ（ＰＮＡ）、非還元末端Ｇａｌ（ＲＣＡ）、非還元末端β−ＧａｌＮＡｃ（ＲＣＡ）、ＧａｌＮＡｃβ４Ｇａｌ（ＷＦＡ）、ＧｌｃＮＡｃ（ＬＥＡ）、およびＳＡα６ＧａｌＮＡｃ（ＳＮＡ）について考察している。さらに、Ｖｅｎａｂｌｅほかは、ある割合の多能性ＳＳＥＡ−４ ｈＥＳＣの表面上に発現を有すると主張されるいくつかの炭水化物構造（Ｖｅｎａｂｌｅほかによる対応するレクチンを括弧内に示す）：Ｇａｌ（ＰＨＡ−Ｌ、ＰＨＡ−Ｅ、ＭＡＡ）、ＧａｌＮＡｃ（ＶＶＡ）およびＦｕｃ（ＵＥＡ）について考察している。しかし、前記単糖特異性に基づいて標的上のオリゴ糖特異性を知ることはできない。例えば、ＣｏｎＡはＧｌｃまたはＭａｎ−構造に対して特異的な任意のものに容易に割り当てられず、さらに我々のＭＡＡはＧａｌ残基に特異性を有しないが、ＳＡα３−構造には有する；植物種の、多数である場合が多いイソレクチン間には大きな相違が存在すると考えられ、Ｖｅｎａｂｌｅは用いた正確なレクチンを開示しなかった。正確な解釈を避ける技術的な問題は背景の節である。
本実験において、ＲＣＡの結合はｈＥＳＣ株ＦＥＳ２２およびｍＥＦの両者に観察されたが、ＦＥＳ３０には観察されなかった。これは、ｈＥＳＣにおけるＲＣＡの結合特異性が細胞株同士で異なることを示唆する。本実験は、２つのｈＥＳＣ株のうち１つのみで発現する他のレクチンも示し（表１９）、一部のレクチンの結合において個別の変異が存在することが示唆された。
Ｖｅｎａｂｌｅほか（２００５）は、その実験の中で、ＬＴＡがｈＥＳＣに結合しないことに基づき、ｈＥＳＣ表面上にはＧｌｃＮＡｃにα−結合した非修飾フコース残基は存在しないことを示唆する。しかし、本実験において、ＬＴＡならびに抗Ｌｅｘおよび抗ｓＬｅｘモノクローナル抗体が、ｈＥＳＣ株ＦＥＳ２２に結合することが見出された。この抗体結合の結果は、ＦｕｃαＧｌｃＮＡｃエピトープ、特にＧａｌβ４（Ｆｕｃα３）ＧｌｃＮＡｃ配列が、ｈＥＳＣ表面上に存在することを示す。
Ｖｅｎａｂｌｅほか（２００５）は、そのｈＥＳＣ試料において、ＰＮＡが特異的にＧａｌβ３ＧａｌＮＡｃ構造を認識し、ここで該ＧａｌＮＡｃ残基はβ−結合していることを記載する。本実験において、ＰＮＡは、β−結合ガラクトース残基を有する炭水化物構造一般を、ＧａｌＮＡｃ残基に対するβ−結合を必要とすることなく、識別するために用いられた。
Ｖｅｎａｂｌｅほか（２００５）は、そのｈＥＳＣ試料において、ＳＮＡが特異的にＳＡα６ＧａｌＮＡｃ構造を認識することを記載する。本実験において、ＳＮＡは、α２，６−結合シアル酸一般を識別するために用いられ、そのリガンドはｍＥＦ上にも見出された。
Ｖｅｎａｂｌｅほか（２００５）により記載された実験における、２００ｍＭ ラクトースによるＭＡＡの結合の阻害は、彼らのＭＡＡのシアル酸に対する非特異的結合を示唆する。本実験によると、我々のＭＡＡはｈＥＳＣ表面上のα２，３−結合シアル酸残基を認識し、ｈＥＳＣとｍＥＦとを区別することができる。
実施例４
ヒト間葉系幹細胞のレクチンおよび抗体プロファイリング
実験手順
細胞サンプル
骨髄由来ヒト間葉系幹細胞株（ＭＳＣ）を生成し、上記のように増殖培地中で培養した。
ＦＩＴＣ標識レクチン
フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識レクチンをいくつかの製造者から購入した：ＦＩＴＣ−ＧＮＡ、−ＨＨＡ、−ＭＡＡ、−ＰＷＡ、−ＳＴＡおよび−ＬＴＡはＥＹ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＵＳＡ）から；ＦＩＴＣ−ＰＳＡおよび−ＵＥＡはＳｉｇｍａ（ＵＳＡ）から；およびＦＩＴＣ−ＲＣＡ、−ＰＮＡおよび−ＳＮＡはＶｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＵＫ）から。レクチンはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ；ＦＲＣ Ｂｌｏｏｄ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｆｉｎｌａｎｄ）中において５μｇ／１０５細胞に希釈して用いた。
フローサイトメトリー
レクチン結合のフローサイトメトリー分析を用いてＭＳＣの細胞表面炭水化物発現を分析した。継代９〜１１における９０％コンフルエントのＭＳＣ層をＰＢＳで洗浄し、０．２５％トリプシン−１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（Ｇｉｂｃｏ）により回収し、単細胞懸濁液にした。トリプシン処理は穏やかに行うようにしたが、抗体による実験と比較して、認識される構造の一部は部分的に失われるか、または減少する場合があると考えられる。剥がされた細胞を６００ｇで５分間室温にて遠心分離した。細胞ペレットを２回１％ ＨＳＡ−ＰＢＳで洗浄し、６００ｇで遠心分離し、１％ ＨＳＡ−ＰＢＳ中に再懸濁した。細胞を、コニカルチューブ中に７００００〜８３０００細胞ずつに小分けにして入れた。小分けした細胞をＦＩＴＣ標識レクチンの一つとともに２０分間室温にてインキュベートした。インキュベート後、細胞を１％ ＨＳＡ−ＰＢＳで洗浄し、遠心分離し、１％ ＨＳＡ−ＰＢＳ中に再懸濁した。非処理細胞を対照として用いた。レクチン結合はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ， Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により検出した。データ分析はＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標） Ｍｕｌｔｉ Ｄｏｃｕｍｅｎｔ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｆｏｒ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ （ＷｉｎＭＤＩ ２．８）を用いて行った。２回の独立した実験を行った。
蛍光顕微鏡標識実験を先の実施例において記載されるように行った。
結果および考察
表２０に、試験したＦＩＴＣ標識レクチン、その標的単糖配列の例、および穏やかなトリプシン処理後のＦＡＣＳ分析における陽性レクチン結合を示す細胞の量（％）を示す。表２１に、試験したＦＩＴＣ標識レクチン、その標的単糖配列の例、および、顕微鏡スライド上の増殖させた固定細胞の蛍光顕微鏡検査における、表の説明文中に記載されるようにグレード分けされたレクチン結合強度を示す。用いたレクチンの結合特異性は当該分野において記載されており、一般に本実験におけるレクチンの結合は細胞がその表面上にレクチンに対する特異的リガンドを発現していることを意味する。以下に議論される特異性の一部および表中に記されるものの例は、従って事実上非排他的である。
α結合マンノース
Ｈｉｐｐｅａｓｔｒｕｍ ｈｙｂｒｉｄ（ＨＨＡ）およびＰｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ（ＰＳＡ）レクチン両者による細胞の多量の標識は、それらがマンノース、より具体的にはＮ−グリカン等のそれらの表面複合糖質上のα結合マンノース残基を発現することを示唆する。有り得るα−マンノース結合としては、α１→２、α１→３、およびα１→６等が挙げられる。Ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｖａｌｉｓ（ＧＮＡ）レクチンの低結合は、細胞表面上の一部のα−マンノース結合が他よりも優勢であることを示唆する。
β結合ガラクトース
Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓレクチンＩ（ＲＣＡ−Ｉ）による細胞の多量の標識およびピーナッツレクチン（ＰＮＡ）によるより弱い標識は、細胞がβ結合非還元末端ガラクトース残基をＮ−および／またはＯ−グリカン等のその表面複合糖質上に発現していることを示唆する。より具体的には、強いＲＣＡ−Ｉ結合は、細胞が多量の非置換Ｇａｌβエピトープをその表面上に有していることを示唆する。ＲＣＡ−Ｉの結合はレクチン結合前の細胞のシアリダーゼ処理により増加し、ＭＳＣ上のＲＣＡ−Ｉのリガンドが本来部分的にシアル酸残基に被覆されていたことを示唆している。ＰＮＡ結合は、コア１ Ｏ−グリカンエピトープ等の他の型の非置換Ｇａｌβエピトープの細胞表面上における存在を示唆する。ＰＮＡの結合もレクチン結合前の細胞のシアリダーゼ処理により増加し、ＭＳＣ上のＰＮＡのリガンドが本来ほとんどシアル酸残基により被覆されていたことを示唆する。これらの結果は、ＲＣＡ−ＩおよびＰＮＡの両者を、ＢＭ ＭＳＣの細胞表面上のそれらの特異的リガンドの量を評価するために、それらの特異的エピトープのシアル化水準を評価するためのシアリダーゼ処理と併せて、または併せずに、用いることができることを示唆する。
シアル酸
Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ（ＭＡＡ）による細胞の多量の標識、およびＳａｍｂｕｃｕｓ ｎｉｇｒａ（ＳＮＡ）レクチンによるより弱い標識は、細胞がシアル酸残基を、Ｎ−および／もしくはＯ−グリカンならびに／または糖脂質等のその表面複合糖質上に発現していることを示唆する。より具体的には、強いＭＡＡ結合は、細胞が多量のα２，３−結合シアル酸残基をその表面上に有していることを示唆する。ＳＮＡ結合は、α２，６−結合シアル酸残基が細胞表面上に存在するが、しかしα２，３−結合シアル酸よりも少量であることを示唆する。これら両者のレクチン結合活性はシアリダーゼ処理により減少する可能性があり、ＢＭ ＭＳＣにおけるレクチンの特異性がほぼシアル酸を標的としていることを示唆している。
ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン配列
Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（ＳＴＡ）による細胞の標識およびアメリカヤマゴボウ（ＰＷＡ）レクチンによるより弱い標識は、細胞がポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン配列をＮ−および／もしくはＯ−グリカンならびに／または糖脂質等のその表面複合糖質上に発現していることを示唆する。ＳＴＡによる、ＰＷＡによるよりも強い標識は、細胞表面ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン配列のほとんどが直鎖であり、分岐または置換された鎖ではないことを示唆する。
フコシル化
Ｕｌｅｘ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ（ＵＥＡ）による細胞の標識およびＬｏｔｕｓ ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ（ＬＴＡ）レクチンによるより弱い標識は、細胞がフコース残基をＮ−および／もしくはＯ−グリカンならびに／または糖脂質等のその表面複合糖質上に発現していることを示唆する。より具体的には、ＵＥＡの結合は、細胞がα１，２−結合フコース残基等のα結合フコース残基をその表面上に有していることを示唆する。ＬＴＡの結合は、α１，３−結合フコース残基等のα結合フコース残基が細胞表面上に存在するが、しかしＵＥＡリガンドフコース残基よりも少量であることを示唆する。
マンノース結合レクチン標識
弱い標識強度が、フルオレセイン標識に結合したヒト血清マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）でも検出され、この先天性免疫系成分に対するリガンドがｉｎ ｖｉｔｒｏ培養したＢＭ ＭＳＣ細胞表面上に発現している場合があることを示唆している。
ＮｅｕＧｃ高分子プローブ（Ｌｅｃｔｉｎｉｔｙ Ｌｔｄ．， Ｒｕｓｓｉａ）の非固定ｈＥＳＣへの結合は、ＮｅｕＧｃ特異的レクチンの細胞表面上における存在を示唆する。一方、高分子ＮｅｕＡｃプローブは本実験において同一の強度で細胞に結合しなかった。
特異的抗体のｈＥＳＣへの結合は、Ｌｅｘおよびシアリル−Ｌｅｗｉｓ ｘエピトープのその表面上における存在を示唆しており、ＮｅｕＧｃ特異的抗体のｈＥＳＣへの結合はＮｅｕＧｃエピトープのその表面上における存在を示唆している。
実施例５
ヒト臍帯血細胞集団のレクチンおよび抗体プロファイリング
結果および考察
図１に、７つの個々の臍帯血単核球（ＣＢ ＭＮＣ）調製物に結合するＦＩＴＣ標識レクチンのＦＡＣＳ分析の結果を示す（実験は上記の通り行った）。ＧＮＡ、ＨＨＡ、ＰＳＡ、ＭＡＡ、ＳＴＡ、およびＵＥＡ ＦＩＴＣ標識されたレクチンによる強い結合が全ての試料で観察され、それらの特異的リガンド構造のＣＢ ＭＮＣ細胞表面上における存在が示唆される。中程度（ｍｅｄｉｏｃｒｅ）の結合（ＰＷＡ）、ＣＢ試料間で異なる結合（ＰＮＡ）、および弱い結合（ＬＴＡ）も観察され、これらレクチンに対するリガンドはＣＢ ＭＮＣ細胞表面上において上記レクチンのように様々であるかまたはより希であることが示唆される。
実施例６
ヒト幹細胞および細胞集団の全Ｎ−グライコームの分析
実験手順
細胞およびグリカン試料を先の実施例のように調製した。
先の実施例に記載のように、Ａ．ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓシアリダーゼを用いて、単離された酸性グリカン画分を脱シアル化し、次いで脱シアル化グリカンを同一試料から単離された中性グリカンと組み合わせることにより、中性および酸性Ｎ−グリカン画分の相対的な割合を分析した。次に、組み合わせられたグリカン画分を陽イオンモードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＦ質量分析により、先の実施例に記載されるように分析した。組み合わせられたＮ−グリカンのシアル化Ｎ−グリカンの割合は、組み合わせられたＮ−グリカン画分の中性Ｎ−グリカンの、本来の中性Ｎ−グリカン画分との比較における、相対強度のパーセント減少の算出により、式：
Figure 2010516239
［式中、ＩｎｅｕｔｒａｌおよびＩｃｏｍｂｉｎｅｄは、中性および併せられたＮ−グリカン画分それぞれにおける、ｍ／ｚ １２５７、１４１９、１５８１、１７４３および１９０５における５つの高マンノース型Ｎ−グリカンの［Ｍ＋Ｎａ］＋イオンシグナルの相対強度の合計に相当する］
に従って計算された。
結果および考察
分析された幹細胞型における酸性Ｎ−グリカン画分の相対的割合は次の通りであった：ヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）においては約３５％（シアル化および中性Ｎ−グリカンの割合は約１：２）、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ ＭＳＣ）においては約１９％（シアル化および中性Ｎ−グリカンの割合は約１：４）、骨芽細胞に分化したＢＭ ＭＳＣにおいては約２８％（シアル化および中性Ｎ−グリカンの割合は約１：３）、およびヒト臍帯血（ＣＢ）ＣＤ１３３＋細胞においては約３８％（シアル化および中性Ｎ−グリカンの割合は約２：３）。
結論として、ＢＭ ＭＳＣは、それらが中性Ｎ−グリカンと比べ有意に少ない量のシアル化Ｎ−グリカンを有するという点において、ｈＥＳＣおよびＣＢ ＣＤ１３３＋細胞とは異なる。しかし、ＢＭ ＭＳＣの骨芽細胞分化後、シアル化Ｎ−グリカンの割合は増加する。
実施例７
ヒト胚幹細胞Ｎ−グライコームの分析
実験手順
ヒト胚幹細胞株（ｈＥＳＣ）
４つのフィンランド人ｈＥＳＣ株、ＦＥＳ２１、ＦＥＳ２２、ＦＥＳ２９、およびＦＥＳ３０が本研究で用いられた。該株の生成は記載されている（Ｓｋｏｔｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５、およびＭ．Ｍ．，Ｃ．Ｏ．，Ｔ．Ｔ．，ａｎｄ Ｔ．Ｏ．，投稿中）。本研究において分析された細胞株のうち２つは、最初に得られ、マウス胚線維芽細胞フィーダー上で、および２つはヒト包皮線維芽フィーダー細胞上で培養された。質量分析法のため、全ての株をマイトマイシン−Ｃ（１μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， ＵＳＡ）で処理したＨＦＦフィーダー細胞上に移し、２ｍＭ Ｌ−グルタミン／ペニシリンストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、２０％ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ）、１ Ｘ 非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、１ Ｘ ＩＴＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および４ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（Ｓｉｇｍａ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した無血清培地（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標） Ｄ−ＭＥＭ； Ｇｉｂｃｏ（登録商標） Ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， ＵＫ）中で培養した。胚様体（ＥＢ）の形成を誘導するため、ｈＥＳＣのコロニーを最初に１０〜１４日間増殖させ、その後該コロニーを小片に切断し、非接着性シャーレ上に移して浮遊培養を形成した。形成されたＥＢを次の１０日間、ｂＦＧＦを含まない標準培地（上記参照）中で浮遊培養した。さらなる分化（ステージ３分化細胞へ）のため、ＥＢを、ＩＴＳ、フィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）、Ｌ−グルタミンおよび抗生物質を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２混合物（Ｇｉｂｃｏ）からなる培地中の、ゼラチン被覆（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）接着性培養皿上に移した。接着した細胞を１０日間培養し、その後それらを回収した。グリカン分析のため、細胞を機械的に回収し、洗浄し、分析まで凍結保存した。ＦＡＣＳ分析において、機械的に単離したｈＥＳＣコロニーからの７０〜９０％の細胞が典型的にはＴｒａ１−６０およびＴｒａ１−８１陽性であった（不掲載）。胚様体（ＥＢ）に分化した細胞、およびＥＢから単層として増殖したさらに分化した細胞（ステージ３分化）を、ｈＥＳＣに対する比較のために用いた。分化のプロトコルは神経上皮細胞の発生に有利であるが、異なる最終分化細胞型への分化は導かない（Ｏｋａｂｅ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。ステージ３の培養物は、線維芽細胞様およびニューロンの形態が優位を占める、細胞の不均質な集団からなっていた。
グリカンの単離
アスパラギン結合グリカンを、基本的に記載（Ｎｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８）の通りに、Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ Ｎ−グリコシダーゼＦ消化（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ＵＳＡ）によって細胞糖タンパク質から遊離させた。遊離したグリカンを、シアル酸残基の負電荷に基づき、シアル化および非シアル化画分に分けた。細胞の混入を、基本的に先の記載（Ｖｅｒｏｓｔｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０００）のように、グリカンの８０−９０％（ｖ／ｖ）含水アセトンを用いた−２０℃における沈殿および６０％（ｖ／ｖ）氷冷メタノールを用いたそれらの抽出により除去した。次いでグリカンを水中でＣ１８シリカ樹脂（ＢｏｎｄＥｌｕｔ、Ｖａｒｉａｎ、ＵＳＡ）に通し、先の方法（Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３）に基づき多孔質グラファイトカーボン（Ｃａｒｂｏｇｒａｐｈ、Ａｌｌｔｅｃｈ、ＵＳＡ）に吸着させた。カーボンカラムを水で洗浄し、次いで中性グリカンを水中の２５％（ｖ／ｖ）アセトニトリルで溶出し、シアル化グリカンを水中の２５％アセトニトリル（ｖ／ｖ）中の０．０５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸で溶出した。両グリカン画分をさらに水中で強陽イオン交換樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＵＳＡ）およびＣ１８シリカ樹脂（ＺｉｐＴｉｐ， Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）に通した。シアル化グリカンをさらに、それらをｎ−ブタノール：エタノール：水（１０：１：２、ｖ／ｖ）中で微結晶性セルロースに吸着させ、同一の溶媒で洗浄し、５０％エタノール：水（ｖ／ｖ）で溶出することにより、精製した。上記の全ての工程は小型クロマトグラフィーカラム上で行い、少ない溶出および処理容量を用いた。グリカン分析法はヒト細胞試料を５人の異なる個人による分析にかけることで確実なものとした。結果は、特に個々のグリカンシグナルおよびその相対シグナル強度の検出に関して、高度に類似しており、本方法の信頼性が異なる細胞型からの分析結果の比較に適したものであることが示された。
質量分析およびデータ分析
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を、Ｂｒｕｋｅｒ Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ ＴＯＦ／ＴＯＦ装置（Ｂｒｕｋｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、基本的に記載（Ｓａａｒｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）のように行った。中性およびシアル化グリカン成分の相対モル存在量は、質量スペクトル中のそれらの相対シグナル強度に基づき正確に付与され得る（Ｎａｖｅｎ ａｎｄ Ｈａｒｖｅｙ， １９９６； Ｐａｐａｃ ｅｔ ａｌ．，１９９６； Ｓａａｒｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９； Ｈａｒｖｅｙ，１９９３）。質量分析法の各工程は合成グリカンの混合物またはヒト細胞から抽出されたグリカン混合物によってその再現性を管理した。質量分析の粗データを、同位体パターン重複、複数のアルカリ金属付加物（ａｌｋａｌｉ ｍｅｔａｌ ａｄｄｕｃｔ）のシグナル、還元オリゴ糖からの水の除去産物、および、試料の本来のグリカンから生じたものではない他の干渉する質量分析シグナルの影響を注意深く排除することにより、本グリカンプロファイルに変換した。示されたグリカンプロファイル中に生じたグリカンシグナルは試料間の比較を可能にするために１００％に対して標準化した。２つのグリカンプロファイル間の量的相違（％）は式：
Figure 2010516239

［式中、ｐはプロファイルａまたはｂにおけるグリカンシグナルｉの相対存在量（％）であり、ｎはグリカンシグナルの総数である］
により算出した。
グリコシダーゼ分析
中性Ｎ−グリカン画分を、タチナタマメα−マンノシダーゼ（Ｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ； Ｓｉｇｍａ， ＵＳＡ）を用いて、基本的に記載（Ｓａａｒｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９）に従い、消化にかけた。酵素の特異性はヒト組織から単離されたグリカンおよび精製されたオリゴ糖を用いて制御した。
ＮＭＲ法
ＮＭＲ分析のため、多量のｈＥＳＣをマウスフィーダー細胞（ＭＥＦ）層上で増殖させた。回収されたｈＥＳＣ試料の純度（約７０％）はＨＦＦ上で増殖させた質量分析試料におけるよりも低かった。しかし、同一のＨ５−９Ｎ２グリカンがＭＥＦおよびｈＥＳＣの両者において主要な中性Ｎ−グリカンシグナルであった。単離されたグリカンを、さらにゲル濾過高圧液体クロマトグラフィーにより、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ｐｅｐｔｉｄｅ ＨＲ １０／３０（Ａｍｅｒｓｈａｍ）中で、水（中性グリカン）または５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３（シアル化グリカン）を溶出液として用いて、１ｍｌ／分の溶出速度で、分析のために精製した。溶出液を２１４ｎｍで測定し、オリゴ糖を外部標準に対して定量した。ＮＭＲ分析におけるＮ−グリカンの量は５ナノモル未満であった。
統計学的手法
３種類全ての分化ステージ（ｈＥＳＣ、ＥＢ、およびｓｔ．３）のグリカンスコア分布を、クラスカル・ワリス検定により分析した。対比較を、ウェルチの近似を用いた両側スチューデントｔ検定および両側マンホイットニーＵ検定により行った。０．０５未満のｐ値を有意とみなした。
レクチン染色
フルオレセイン標識レクチンはＥＹ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＵＳＡ）からのものであり、染色は基本的に製品の説明書に従って行った。染色の特異性は、特異的オリゴおよび単糖によるレクチンの結合の阻害による並行実験において制御した。
結果
ｈＥＳＣ Ｎ−グライコームの質量分析プロファイリング
ｈＥＳＣ、胚様体（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｂｏｄｉｅｓ）、およびさらに分化した細胞のグリカンプロファイルを生成するため、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を基盤とした分析を行った。我々は、タンパク質の最も一般的な種類の翻訳後修飾、アスパラギン結合グリカン（Ｎ−グリカン）を細胞糖タンパク質から酵素的に遊離したものに焦点を当てた。グリカンの単離および精製の過程で、全Ｎ−グリカンプールを、イオン交換工程によって中性Ｎ−グリカンおよびシアル化Ｎ−グリカンに分離した。次いで、これら２つのグリカン画分を別々に質量分析プロファイリングにより分析し（図１２）、これにより試料のＮ−グリカンのレパートリーの全体像を生成した。観察されたグリカンシグナルの相対存在量をそれらの相対シグナル強度に基づいて決定し（Ｎａｖｅｎ ａｎｄ Ｈａｒｖｅｙ， １９９６； Ｐａｐａｃ ｅｔ ａｌ．， １９９６； Ｓａａｒｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９）、これにより試料間のグライコームの相違の定量的な比較が可能となった。１００個超のＮ−グリカンシグナルが各細胞型から検出された。
図１２における個々のシグナルの、検出された質量に対応する提案された単糖組成は、文字記号により示されている。しかし、本分析における質量分析シグナルの多くは複数の異性体構造を含むと考えるのが重要であり、１００個の最も多量なシグナルは数百種の異なる分子を表している可能性が極めて高い。例えば、ヒトＮ−グリカンに生ずる一般的なヘキソース（Ｈ）はＤ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、およびＤ−グルコース（全て１６２．０５Ｄａの残基質量（ｒｅｓｉｄｕｅ ｍａｓｓ）を有する）を含み、一般的なＮ−アセチルヘキソサミン（Ｎ）はＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンおよびＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（２０３．０８Ｄａ）の両者を含み；デオキシヘキソース（Ｆ）は典型的にはＬ−フコース残基（１４６．０６Ｄａ）である。
他の哺乳動物組織のグライコームの先の研究のほとんどにおいて、単離されたグリカンは質量分析プロファイリング（Ｓｕｔｔｏｎ−Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｄｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓ，２００１；Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｌｙｃｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ）またはクロマトグラフィー分離（Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００４）に先立って誘導体化（パーメチル化）された。しかし、本研究において、我々はピコモル量の非修飾グリカンを直接分析することを選択し、誘導体化およびその後のさらなる精製工程を省くことにより増加した感度が実現した。さらに、グリカンシグナルを１回に１つずつ分析する代わりに、我々は核磁気共鳴分光学（ＮＭＲ）および特異的グリコシダーゼ酵素により非修飾グライコーム中に存在する全てのグリカンを同時に分析することができた。本データは、質量分析プロファイリングが全グライコームの定量的分析において、特に関連する試料間の主要なグリコシル化の相違を特定するために、用いられ得ることを示した。
ｈＥＳＣ Ｎ−グライコームの概要：中性Ｎ−グリカン
中性Ｎ−グリカンは中性およびシアル化Ｎ−グリカンを組み合わせたプールのうち約３分の２を構成していた。ｈＥＳＣ株の５０個の最も多量な中性Ｎ−グリカンシグナルを図１２ａ（灰色のカラム）に示す。グリカンシグナルの変異が少ないことにより示されるプロファイルの類似性は、４つの細胞株が互いによく似ていることを示唆する。例えば、２０個の最も多量なグリカンシグナルのうちの１５個は、全てのｈＥＳＣ株において同一であった。５つの最も多量のシグナルがｈＥＳＣの中性Ｎ−グリカンのうちの７６％を構成しており、プロファイルにおいて優勢であった。
シアル化Ｎ−グリカン
シアル化Ｎ−グリカン画分における全てのＮ−グリカンシグナル（図１２ｂ、灰色のカラム）はシアル酸残基（Ｓ：Ｎ−アセチル−Ｄ−ノイラミン酸、またはＧ：Ｎ−グリコリル−Ｄ−ノイラミン酸）を含む。４つのｈＥＳＣ株における５０個の最も多量なシアル化Ｎ−グリカンは、中性Ｎ−グリカンよりも個々の細胞株間で大きな変異を示していた。しかし、４つの細胞株はこの場合も互いに類似していた。５つの最も多量なシアル化Ｎ−グリカンシグナルは全ての細胞株において同一であった：Ｓ１Ｈ５Ｎ４Ｆ１、Ｓ１Ｈ５Ｎ４Ｆ２、Ｓ２Ｈ５Ｎ４Ｆ１、Ｓ１Ｈ５Ｎ４、およびＳ１Ｈ６Ｎ５Ｆ１（略号については図１２参照）。シアル化グリカンシグナルの大部分（６１％、８つのシグナルにおける）はＨ５Ｎ４コア組成を含み、シアル酸（ＳまたはＧ）およびデオキシヘキソース（Ｆ）残基の量の相違によってのみ異なっていた。同様に、他の一般的なコア構造はＨ６Ｎ５（１２％、７つのシグナルにおける）であった。これは、細胞におけるスペクトルの全領域のＮ−グリカン構造をもたらす生合成機構を浮き彫りにする：Ｎ−グリカンは典型的には各種エピトープの付加によって修飾された一般的コア構造からなる。
重要なことに、我々はｈＥＳＣ試料においてＮ−グリコリルノイラミン酸（Ｇ）を有するＮ−グリカン、例えばグリカンＧ１Ｈ５Ｎ４、Ｇ１Ｓ１Ｈ５Ｎ４、およびＧ２Ｈ５Ｎ４を検出することができた。Ｎ−グリコリルノイラミン酸はｈＥＳＣにおいて動物由来材料を含んだ培地から移行した抗原として先に報告されている（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）。それに応じて、本実験に用いた血清代替培地はウシ血清タンパク質を含んでいた。
個々の細胞株間の変異
４つのｈＥＳＣ株は同一の全体のＮ−グリカンプロファイルを共有していたが、プロフィール内に細胞株特異的な変異が存在した。各細胞株に固有の個々のグリカンシグナルが検出され、全ての細胞株が、それらが合成した約１００個の最も多量なＮ−グリカン構造に関して、互いにわずかに異なっていたことが示唆された。
一般に、各ｈＥＳＣ株における３０個の最も一般的なＮ−グリカンシグナルは検出された全てのＮ−グリカンの約８５％の割合を占め、ｈＥＳＣ Ｎ−グライコームの有用な近似を表す。言い換えると、６個のうち５個超の糖タンパク質分子は、本ｈＥＳＣ株のいずれから単離したものであっても、このようなＮ−グリカン構造を有するであろう。
ｈＥＳＣの分化中におけるＮ−グライコームの変化
本研究の主要な目的は幹細胞または分化した細胞のいずれかに特異的であり、従って分化段階のマーカーとして役立ち得るグリカン構造を同定することであった。ｈＥＳＣのＮ−グライコームが分化中に変化を受けるか決定するため、ｈＥＳＣ、ＥＢ、およびステージ３分化細胞から得たＮ−グリカンプロファイルを比較した（図１２）。分化した細胞型（ＥＢおよびｓｔ．３）のプロファイルは未分化ｈＥＳＣのプロファイルとは有意に異なっており、これは多くのグリカンシグナルにおける重ならない分布バー（ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｂａｒ）により示された。さらに、ｈＥＳＣおよびＥＢの両者に存在するがステージ３分化細胞では検出されない多数のシグナルが存在した。全体で、ｈＥＳＣに存在するグリカンシグナルの１０％がステージ３分化細胞において消失していた。同時に多数の新規シグナルがＥＢおよびステージ３分化細胞に出現した。ＥＢおよびステージ３分化細胞におけるそれらの割合はそれぞれ１４％および１６％であった。ｈＥＳＣに特徴的であったグリカンシグナルは典型的にはＥＢにおいて減少し、ステージ３分化細胞ではさらに減少したかまたは完全に消失した。しかし、最も一般的であった１００個のグリカンシグナルのうち、ｈＥＳＣのシグナルであってＥＢで発現されていなかったものは存在せず、ＥＢのＮ−グライコームがｈＥＳＣとステージ３分化細胞との中間物であることが示唆された。
まとめると、分化は新規Ｎ−グリカン型の出現を誘導し、一方で、より初期のグリカン型が消失した。さらに、我々は、主要なｈＥＳＣ特異的Ｎ−グリコシル化特性が個別のグリカンシグナルとして発現されておらず、しかし、代わりに、特異的な単糖組成の特徴（下記参照）によって特徴付けられたグリカンシグナル群として発現されていたことを見出した。言い換えると、ｈＥＳＣのＥＢへの分化は１つだけでなく、複数の、ｈＥＳＣと関連した特徴を有するグリカンシグナルの消失、および同時に、分化した細胞型と関連する他の特徴を有するグリカンシグナル群の出現も誘導した。
分化した細胞のＮ−グリカンプロファイルは、未分化ｈＥＳＣプロファイルと量的にも異なっていた。個々のグリカンプロファイル間の相違を定量する実用的方法は、２つの細胞プロファイル間のシグナル強度の相違の合計を算出することである（方法を参照）。この方法によると、ＥＢの中性およびシアル化Ｎ−グリカンプロファイルはｈＥＳＣプロファイルからそれぞれ１４％および２９％の量的な変化を受けていた。同様に、ステージ３分化細胞の中性およびシアル化Ｎ−グリカンプロファイルはｈＥＳＣプロファイルからそれぞれ１５％および４３％変化していた。これは、ｈＥＳＣのステージ３分化細胞への分化の際に細胞に存在する全シアル化Ｎ−グリカンの半分近くが異なる分子構造に変換され、一方で有意に少ない割合の中性Ｎ−グリカン分子が分化過程で変化したことを表す。ｈＥＳＣにおけるシアル化Ｎ−グリカンの中性Ｎ−グリカンに対する割合が約１：２であったことを考慮すると、ｈＥＳＣからステージ３分化細胞への遷移中において全Ｎ−グライコームの変化は約２５％であった。この場合も、ＥＢのＮ−グリカンプロファイルはｈＥＳＣとステージ３分化細胞との間に位置する。
データは、ｈＥＳＣのＮ−グライコームが、ｈＥＳＣの分化中の変化の傾向に関して、２つの別個の部分 − 約７５％の一定の部分および約２５％の変化する部分からなっていたことを示した。関連するＮ−グリカン構造を分析するため、ならびにＮ−グライコームの一定のおよび変化する部分の潜在的な生物学的役割を同定するため、単離されたｈＥＳＣのＮ−グリカン試料の構造分析を行った。
主要なｈＥＳＣのＮ−グリカンの構造分析：単糖組成に基づく予備的な構造割当て
ヒトＮ−グリカンは高マンノース型、ハイブリッド型、および複合型Ｎ−グリカンの主要な生合成群（ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇｒｏｕｐｓ）に分けることができる。これらＮ−グリカン群のｈＥＳＣおよびその子孫における存在を決定するため、ヒトＮ−グリカンの生合成の確立した経路（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ ａｎｄ Ｋｏｒｎｆｅｌｄ，１９８５； Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ，１９９１）を利用し、各シグナルの単糖組成に一致する確からしい構造の割当てを行った。ここでは、検出されたＮ−グリカンシグナルを、ＮおよびＨ残基の数によって４つのＮ−グリカン群：提案された単糖組成における２個のＮ残基（Ｎ＝２）によって両者とも特徴付けられる１）高マンノース型および２）低マンノース型Ｎ−グリカン、３）３個のＮ残基（Ｎ＝３）によって特徴付けられるハイブリッド型または単分岐Ｎ−グリカン、ならびに４）４個以上のＮ残基（Ｎ≧４）によって特徴付けられる複合型Ｎ−グリカン、に分類した。これは近似であり：例えば、複合型Ｎ−グリカンに加え、ハイブリッド型および単分岐型Ｎ−グリカンも３個を超えるＮ残基を有する場合がある。
データは、全Ｎ−グライコームにおける各構造群に属するグリカンシグナルの割合を算出することにより定量的に分析された（表２２、列Ａ〜ＥおよびＪ〜Ｌ）。構造群の量的な変化は各細胞型における異なる生合成経路の相対的な活性を反映する。例えば、ハイブリッド型または単分岐型Ｎ−グリカンの割合はｈＥＳＣがＥＢに分化する際に増加した。一般に、ほとんどのグリカン構造クラスの相対的割合はｈＥＳＣの分化過程を通じてほぼ一定のままであり、これはｈＥＳＣおよび分化した細胞型の両者に同等に高度に複雑なＮ−グリコシル化の能力があることを示した。全ての分析された細胞型における、低マンノースＮ−グリカンとして分類されるＮ−グリカンの高い割合は、ヒトのＮ−グリコシル化に関する以前の公表された研究と照らし合わせると、いくらか驚くべきものであった。しかし、従来の研究は生細胞の全Ｎ−グリカンプロファイルは調査していなかった。我々は、他のヒト細胞および組織においても低マンノースＮ−グリカンの有意な量を検出し、これらはｈＥＳＣに特異的ではなかった（Ｔ．Ｓ．、Ａ．Ｈ．、Ｍ．Ｂ．、Ａ．Ｏ．、Ｊ．Ｈ．、Ｊ．Ｎ、Ｊ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．、未発表結果）。
酵素分解および核磁気共鳴分光法による、構造の割当ての確認
検出された質量および確からしい単糖組成に基づき行われたグリカン構造の割当ての妥当性を検証するため、選択された中性およびシアル化Ｎ−グリカンの酵素分解およびプロトン核磁気共鳴分析（１Ｈ−ＮＭＲ）を行った。
中性Ｎ−グリカンの検証のため、単糖組成において５〜９個のヘキソース（Ｈ）および２個のＮ−アセチルヘキソサミン（Ｎ）残基を有するグリカン（Ｈ５Ｎ２、Ｈ６Ｎ２、Ｈ７Ｎ２、Ｈ８Ｎ２、およびＨ９Ｎ２）を選んだ。これらは分析された全ての細胞型の中で最も多量なＮ−グリカンであった（図１２ａ）。単糖組成は、これらのグリカンが高マンノース型Ｎ−グリカンであったことを示唆した（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ ａｎｄ Ｋｏｒｎｆｅｌｄ，１９８５）。この仮説を試験するため、幹細胞および分化した細胞の試料からの中性Ｎ−グリカンをα−マンノシダーゼで処理し、酵素処理の前後で分析した（データ不掲載）。問題のグリカンは分解され、対応するシグナルは質量スペクトルから消失し、それらがα−結合マンノース残基を有していたことが示唆された。
中性Ｎ−グリカン画分をさらにナノスケールプロトン核磁気共鳴分光分析（１Ｈ−ＮＭＲ）により分析した。得られたｈＥＳＣの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおいて、高マンノース型Ｎ−グリカンと一致する中性Ｎ−グリカンシグナルが検出され、それらが試料中の主要なグリカン成分であるという結論が支持された。
α−マンノシダーゼおよびＮＭＲ実験の両者は、Ｈ５−９Ｎ２グリカンシグナルが高マンノース型Ｎ−グリカンに対応することを示した。図１２ａのデータから、それらはｈＥＳＣにおいて全ての検出された糖タンパク質Ｎ−グリカンの半分を構成していたと見積もることができた。これはヒト細胞における高マンノース型Ｎ−グリカンの確立された役割と一致している（Ｈｅｌｅｎｉｕｓ ａｎｄ Ａｅｂｉ，２００１，２００４）。このような構造的に発現されたＮ−グリカンの存在は、なぜ中性Ｎ−グリカンプロファイルが分化中にシアル化Ｎ−グリカンプロファイルと同じ程度変化しなかったのかも説明した。
シアル化Ｎ−グリカン間の構造の割当ての検証のため、ｈＥＳＣから単離されたシアル化Ｎ−グリカンシグナルの大部分が、それらが複合型Ｎ−グリカンであることを示唆するＮ≧４の単糖組成により特徴付けられた（図１２ａ）ことに注目した。１Ｈ−ＮＭＲ分析においては、二分岐複合型Ｎ−グリカンと一致するＮ−グリカン主鎖シグナルが主要な検出されたシグナルであり、実験から得た単糖組成に基づいて行われた割当てと一致していた。本結果は、全Ｎ−グライコームデータ内のグリカンシグナルの分類を用いてＮ−グライコーム全体の近似を構築することができることを示した。しかし、このような分類は単一のＮ−グリカンシグナルの分析に適用されるべきではない。
分化段階と関連した構造的グリコシル化特性
上記のグリカンシグナルの分類は、Ｎ−グリカンのコア配列の変化を示唆した。本データは、Ｎ−グリカンコア構造に付加された各種エピトープ、すなわち多くの個々のグリカンシグナル中に存在するグリカン特性、の相違も示唆した。このようなグリカンの構造特性を定量するため、Ｎ−グライコームのデータを、類似した特徴をその提案された単糖組成において共有するグリカンシグナル群にさらに分類した（表２２、列Ｆ〜ＩおよびＭ〜Ｐ）。その結果、ＥＢおよびステージ３分化細胞試料における分化と関連したグリカンシグナルの大部分がｈＥＳＣ特異的グリカンとは異なる群に分類された。複雑なフコシル化を有するグリカンシグナル（表２２、列Ｎ）は未分化ｈＥＳＣと関連しており、一方、潜在的な末端Ｎ−アセチルヘキソサミン（表２２、列ＨおよびＰ）を有するグリカンシグナルは分化した細胞と関連していた。
Ｎ−グリカンの複雑なフコシル化はｈＥＳＣに特徴的である
シアル化Ｎ−グリカンプロファイルにおける分化段階と関連した変化は、中性Ｎ−グリカン画分におけるよりもより激しく、５つの最も多量なシアル化Ｎ−グリカンシグナルの群が全ての分化段階において異なっていた（図１２ｂ）。特に、グリカンＳ１Ｈ５Ｎ４Ｆ２およびＳ１Ｈ５Ｎ４Ｆ３、ならびに、提案された単糖組成において少なくとも２つのデオキシヘキソース残基を有していた（Ｆ≧２）他のグリカンシグナルの相対量の、分化と関連した有意な減少があった。一方、Ｆを含まなかったＳ２Ｈ５Ｎ４等のグリカンシグナルは分化した細胞型において増加した。結果は、未分化のｈＥＳＣにおけるシアル化Ｎ−グリカンが、分化した細胞型におけるよりも複雑なフコシル化を受けやすいことを示唆した（表２２、列Ｎ）。
ヒトＮ−グリカンにおける最も一般的なフコシル化型はＮ−グリカンコア構造のα１，６−フコシル化である。ｈＥＳＣのシアル化Ｎ−グリカン画分のＮＭＲ分析も、Ｎ−グリカンコアのα１，６−フコシル化をフコシル化の最も多量な型として示した。１個を上回るフコース残基を有するＮ−グリカンにおいては、α１，６−結合に加え、他のフコース結合が存在したはずである（Ｓｔａｕｄａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。Ｆ≧２の構造特性は細胞が分化するに従い減少し、複雑なフコシル化が未分化ｈＥＳＣの特徴であったことが示唆された。
末端Ｎ−アセチルヘキソサミン残基を有するＮ−グリカンは分化とともにより一般的になる
分化中に増加したＮ−グリカンシグナルの群は、等しい量のＮ−アセチルヘキソサミンおよびヘキソース残基（Ｎ＝Ｈ）をそれらの単糖組成、例えばＳ１Ｈ５Ｎ５Ｆ１中に含んでいた。これは非還元末端Ｎ−アセチルヘキソサミン残基を有する構造と一致した。通常、Ｎ−グリカンコア構造はＮ−アセチルヘキソサミン残基よりも多くのヘキソースを有する。しかし、複合型Ｎ−グリカンがヘキソースによってキャップされていない末端Ｎ−アセチルヘキソサミン残基を有する場合、それらの単糖組成はＮ＝ＨまたはＮ＞Ｈのいずれかに変化する。ＥＢおよびステージ３分化細胞は増加した量の潜在的末端Ｎ−アセチルヘキソサミン構造を示し、分化中にそのＮ＝Ｈ構造特性は中性およびシアル化両者のＮ−グリカンプールにおいて増加した（表２２、列ＩおよびＰ）が、Ｎ＞Ｈ構造特性は中性Ｎ−グリカンプールにおいて上昇し、しかしシアル化Ｎ−グリカンプールにおいて減少した（表２２、列ＨおよびＯ）。
グライコームプロファイリングはｈＥＳＣの分化段階を同定し得る
グライコームプロファイルの分析は、分析したｈＥＳＣ株および分化した細胞が分化段階特異的Ｎ−グリカン特性を有していたことを示唆した。しかし、データは、個々のｈＥＳＣ株のＮ−グリカンプロファイルが互いに相違しており、特にｈＥＳＣ株ＦＥＳ２２は他の３つの幹細胞株から異なっていたことも示した（表２２、列ＣおよびＩ）。得られたＮ−グリカンプロファイルが、細胞株特異的変異を考慮した際においても、ｈＥＳＣと分化した細胞との間を判別するであろうアルゴリズムを生成するために使用できるかを試験するため、表２２のデータを用いて分析を行った。ｈＥＳＣ株ＦＥＳ２９およびそれに由来する胚様体（ＥＢ２９）を計算のためのトレーニンググループ（ｔｒａｉｎｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）として選択した。アルゴリズム、グリカンスコア（式１）を、ＦＥＳ２９においてＥＢ２９におけるよりも少なくとも２倍大きかったそれらの構造特性の合計と定義し（表２２における列Ｎ）、そこからＥＢ２９においてＦＥＳ２９におけるよりも少なくとも２倍大きかった構造特性の割合の合計を引いた（表２２における列Ｃ、Ｉ、ＪおよびＰ）：
グリカンスコア＝Ｎ−（Ｃ＋Ｉ＋Ｊ＋Ｐ） （１）
［式中、文字は表２２の列の番号を表す］。
同定されたｈＥＳＣグリカンは細胞表面上で標的になり得る
実用的観点から、幹細胞の研究には細胞表面上の標的構造の同定が最も役立つであろう。同定した個々のグリカン構造が細胞表面上でそれらを標的とする試薬にとって到達可能であるか調査するため、２つの候補となる構造型のレクチン標識を行った。レクチンはグリカンを認識するタンパク質であり、ｈＥＳＣにおいても特定のグリカン構造に対する特異性を有する（Ｖｅｎａｂｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００５）。ｈＥＳＣにおけるグリカン成分の局在を分析するため、マウスフィーダー細胞層上で増殖させた幹細胞コロニーを、フルオレセイン標識したレクチンによりｉｎ ｖｉｔｒｏで標識した（図２）。ｈＥＳＣ細胞表面は、α２，３−結合シアル化を有する構造を認識するＭａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ凝集素（ＭＡＡ）により明瞭に標識され、シアル化グリカンがｈＥＳＣ細胞表面上に豊富であることが示唆された（図２ａ）。このようなグリカンは、従って、抗体等のより特異的なグリカン認識試薬による識別のために利用可能であろう。一方、細胞表面はα−マンノシル化グリカンを認識するＰｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ凝集素（ＰＳＡ）によっては標識されなかった（図２ｂ）。しかし、ＰＳＡは透過処理（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）後の細胞は標識し（データ不掲載）、ｈＥＳＣにおけるマンノシル化Ｎ−グリカンは小胞体（ＥＲ）またはゴルジ複合体等の細胞内区画に局在していたことが示唆された。興味深いことに、マウス線維芽細胞は相補的な染色様式を示し、これらのレクチン試薬が効果的にｈＥＳＣとフィーダー細胞とを識別したことが示唆された。まとめると、結果は、同定されたグリカン構造がｈＥＳＣを標的とする特異的試薬の設計に利用できることを示唆した。
Ｎ−グライコームの比較分析
４つのｈＥＳＣ株のＮ−グリカンプロファイルは類似した全体的なプロファイル形状を共有するが、細胞株特異的変異がＮ−グリカンプロファイル中に存在した。各細胞株に固有の個々のグリカンシグナルが見出され、全ての細胞株が、それらが合成する約１００個の最も多量なグリカン構造に関して、互いにわずかに異なっていたことが示唆された。これを、中性および酸性Ｎ−グリカン画分の両者からの全ての検出されたグリカンシグナルを合わせたベン図として、３４ａに示す。ＦＥＳ２９およびＦＥＳ３０は兄弟胚に由来するが、それらのＮ−グリカンプロファイルは、互いに、それらがベン図においてＦＥＳ２１に類似するほどにはよく似ていなかった。さらに、核型ＸＸを有するＦＥＳ３０は、３つのＸＹ ｈＥＳＣ株とは有意に異なっていなかった。
分化中にｈＥＳＣのＮ−グライコームが変化を受けるか決定するため、ｈＥＳＣ、ＥＢ、およびステージ３分化細胞から得たＮ−グリカンプロファイルを比較した（図１２）。分化した細胞型（ＥＢおよびｓｔ．３）のＮ−グリカンプロファイルは未分化ｈＥＳＣのプロファイルとは有意に異なっており、これは多くのグリカンシグナルにおける重ならない分布バー（ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｂａｒ）により示された。ｈＥＳＣおよびＥＢの間で共通しており、ステージ３分化細胞では消失した多くのシグナルが存在した。全体で、ｈＥＳＣに存在するグリカンシグナルの１７％がＥＢにおいて消失しており、ステージ３分化細胞においては本来のＮ−グリカンシグナルの５８％が消失していた。同時に多数の新規シグナルがＥＢおよびステージ３分化細胞において出現した。ＥＢおよびステージ３分化細胞におけるそれらの割合はそれぞれ２４％および１０％であった。これは、分化が新規Ｎ−グリカン型の出現を誘導し、一方で初期のグリカン型が消失したことを示す。
同定された主要なｈＥＳＣ特異的グリコシル化特性はＮ−グリカンにおける１個を超えるデオキシヘキソース残基の存在であり、複雑なフコシル化が示唆された。フコシル化は細胞接着およびシグナル伝達事象において重要であることが知られ（Ｂｅｃｋｅｒ ａｎｄ Ｌｏｗｅ，２００３）、ならびに胚発生にとって不可欠である。Ｎ−グリカンコアα１，６−フコース転移酵素遺伝子ＦＵＴ８のノックアウトはマウスにおいて出生後の致死性をもたらし（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５）、フコシル化グリカン生合成が完全に欠損したマウスは初期胚発生よりも先まで生存しない（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，２００２）。ヒトにおけるフコシル化欠損は白血球接着不全（ＬＡＤ；Ｌｕｈｎ ｅｔ ａｌ．，２００１）として知られる疾患を引き起こす。
ＳＳＥＡ−１抗原等のフコシル化グリカンは、先に、マウス胚幹細胞（ｍＥＳＣ）およびおよびヒト胚性癌腫細胞（ＥＣ； Ｍｕｒａｍａｔｓｕ ａｎｄ Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，２００４）の両者と関連づけられているが、ｈＥＳＣとは関連づけられていない。さらに、構造的に関連するＬｅｘオリゴ糖は胚細胞緊密化（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｃｏｍｐａｃｔｉｏｎ）を阻害する（Ｆｅｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４）ことができ、フコシル化グリカンが胚発生の過程で細胞同士の接触に直接関与することが示唆される。胚性ＬｅｘおよびＳＳＥＡ−１抗原の合成において示唆されたα１，３−フコース転移酵素遺伝子は、ＦＵＴ４およびＦＵＴ９である（Ｎａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｋｕｄｏ ｅｔ ａｌ．，２００４）。興味深いことに、本明細書で分析されたものと同一のｈＥＳＣ株に対して発表された遺伝子発現プロファイル（Ｓｋｏｔｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）は、３種のヒトフコース転移酵素遺伝子、ＦＵＴ１、ＦＵＴ４、およびＦＵＴ８がｈＥＳＣにおいて発現していること、ならびにＦＵＴ１およびＦＵＴ４がｈＥＳＣにおいてＥＢと比べ過剰発現していることを示した。これらのフコース転移酵素の公知の特異性（Ｍｏｌｌｉｃｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５）は、我々が見出したＥＢにおける単純なフコシル化およびｈＥＳＣにおける複雑なフコシル化（図３）と相関する。まとめると、ｈＥＳＣはＳＳＥＡ−１抗体に認識される特異的糖脂質抗原を発現しないが、それらは複合フコシル化の特徴的な特性をｍＥＳＣと共有しており、フコシル化グリカンエピトープの生物学的機能を保存している可能性がある。
新規Ｎ−グリカン型がＥＢおよびステージ３分化細胞において出現した。これらの構造特性は、潜在的に新規Ｎ−グリカン末端エピトープをもたらす、さらなるＮ−アセチルヘキソサミン残基を含んでいた。他の分化と関連した特徴は、ハイブリッド型または単分岐Ｎ−グリカンのモル比の増加であった。ハイブリッド型および複合型Ｎ−グリカンの生合成は、マウスにおける胚および出生後の発生に対して生物学的に重要であることが示されている（Ｉｏｆｆｅ ａｎｄ Ｓｔａｎｌｅｙ，１９９４ ＰＮＡＳ； Ｍｅｔｚｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４ ＥＭＢＯ Ｊ； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ； Ａｋａｍａ ｅｔ ａｌ．，２００６ ＰＮＡＳ）。ｈＥＳＣにおける複合型Ｎ−グリカンの優先的な発現、およびその後の、分化するＥＢにおける、より多くのハイブリッド型または単分岐Ｎ−グリカンを発現するようになる変化は、従って、幹細胞の分化の過程にとって重要であると考えられる。
結論として、ｈＥＳＣは固有のグライコームを有し、これは細胞が分化する際に大きな変化を受ける。特定のグライコームに関する情報を用いてこれらの細胞およびそれらの子孫を標的とする試薬を開発することができる。観察されたグリカンプロファイルをもたらす発生学的および分子的調節過程を調査する将来の研究は、ヒトの発生およびグリコシル化の調節の機構に重要な知見を提供するであろう。
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実施例８
ヒトおよびマウス線維芽細胞フィーダー細胞の分析
マウス（ｍＥＦ）およびヒト（ｈＥＦ）線維芽細胞フィーダー細胞を調製し、それらのＮ−グリカン画分を先の実施例に記載するように分析した。
結果および考察
結果は、ｍＥＦおよびｈＥＦ細胞Ｎ−グリカン画分は互いに有意に相違することを示した。この相違としては、該細胞試料から得られた、異なったグリカン群の割合、主要なグリカンシグナル、およびグリカンプロファイル等が挙げられる。さらに、主要な相違は、本発明の先の実施例で考察された、ｍＥＦ細胞におけるＧａｌα３Ｇａｌエピトープの存在である。
実施例９
ヒト胚幹細胞のグライコームはそれらの分化段階を反映する
本発明において、我々はｈＥＳＣ、ＥＢ、およびステージ３分化細胞のＮ−グライコームプロファイルを分析した（図４）。
４つのｈＥＳＣ株の群内におけるＮ−グリカンプロファイルの類似性は、得られたＮ−グリカンプロファイルがｈＥＳＣの特徴的Ｎ−グライコームの記載であることを示唆した。全体で、ｈＥＳＣに存在する１００個の最も多量なＮ−グリカンシグナルのうち１０％がｓｔ．３分化細胞において消失し、ｓｔ．３分化細胞の最も多量なシグナルのうち１６％がｈＥＳＣおいて存在しなかった。これは分化が新規Ｎ−グリカン型の出現を誘導し、一方で初期のグリカン型が消失したことを示唆する。定量的観点からは、ｈＥＳＣ、ＥＢ、およびｓｔ．３分化細胞のグリカンプロファイル間の相違は、ｈＥＳＣ対ＥＢ １９％、ｈＥＳＣ対ｓｔ．３ ２４％、およびＥＢ対ｓｔ．３ １２％であった。
グライコームプロファイルデータを用いてｈＥＳＣのためのグリカン特異的標識試薬を設計することができた。最も興味深いグリカン型を選び、それらの発現プロファイルを、ｈＥＳＣ細胞に結合するα２，３−シアル化（ＭＡＡレクチン、図５Ａ）またはフィーダー細胞（ＭＥＦ）の表面に結合するα−マンノシル化グリカン（ＰＳＡレクチン、図５Ｂ）のいずれかを認識するレクチンに対して図５に例示されるようにレクチン組織化学により分析した。レクチン試薬の結合は、それぞれ特異的炭水化物阻害剤、シアリルα２−ラクトースおよびマンノースにより阻害された（図５Ｃおよび５Ｄ）。結果を表２３にまとめる。
表２３にさらに、２つの他のレクチンである、特に末端Ｇａｌβ構造、特にＧａｌβ４Ｇｌｃ（ＮＡｃ）型構造を認識することが知られるＲｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ凝集素（ＲＣＡ、リシンレクチン）、およびＧａｌ／ＧａｌＮＡｃ構造を認識するピーナッツ凝集素（ＰＮＡ）による、フィーダーおよび幹細胞の異なった認識を示す。ｈＥＳＣ細胞上の、２つの他のレクチンＲＣＡおよびＰＮＡに対するリガンドの、しかしフィーダー細胞のＲＣＡリガンドのみの、細胞表面発現。
本結果は、ｈＥＳＣグリカンが幹細胞特異的試薬による認識の潜在的な標的であることを示し、本発明はそれに関するものである。本発明はさらに、ｈＥＳＣおよびフィーダー細胞等の分化した細胞の、レクチン等のグリカン構造特異的試薬による特異的識別および／または分離の方法に関する。ヒト胚幹細胞はそれらの分化段階を反映する固有のグライコームを有する。本発明は特に、分化段階に関する本発明による細胞の分析に関する。
結論
本データは、ｈＥＳＣのグライコームプロファイリングを示す：
・ｈＥＳＣは１００超のグリカン成分からなる固有のＮ−グライコームを有する
・分化は、ｈＥＳＣのＮ−グライコームおよび細胞表面の分子環境の大きな変化を誘導する
ｈＥＳＣグライコームデータの利用：
・例えば抗体開発のための、新規幹細胞マーカーの同定
・幹細胞製品の品質管理
・ｈＥＳＣ分化段階の同定
・ｈＥＳＣ株間の変異の管理
・ｈＥＳＣの状態に対する外的要因および培養条件の影響
多能性ｈＥＳＣに特徴的な特異的細胞表面マーカーの同定のためのｈＥＳＣグライコームの使用。本発明は今回のおよび類似したグライコームデータのさらなる分析および生成と、新規幹細胞特異的グリコシル化特性のさらなる同定のための方法の使用とに関するものであり、ｈＥＳＣ糖鎖生物学の研究およびその結果として生ずる本発明による用途のための基礎を形成する。
実施例１０
幹細胞増殖速度に対するレクチンの影響
実験手順
リン酸緩衝生理食塩水中での一晩のインキュベートにより、レクチン（ＥＹ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）を受動的に４８ウェルプレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ ｓｕｒｆａｃｅ、ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ １５０６８７、Ｎｕｎｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ）上に吸着させた。
１２ウェルプレート：
レクチン（ＥＹ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）をリン酸緩衝生理食塩水中に溶解した（１４０μｇ／１ｍｌ）。レクチンの希釈物を、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶシリンジ駆動フィルターユニット（０．２２μｍ、ＳＬＧＶ ０１３ ＳＬ， Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｒｅｌａｎｄ）を用いて滅菌濾過し、リン酸緩衝生理食塩水中での＋４℃における一晩のインキュベートによりレクチンを受動的に１２ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ ３５１３，Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）上に吸着させた。インキュベート後、ウェルをリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、幹細胞をそれらの上にプレーティングした。
４８ウェルプレート：
レクチン（ＥＹ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）をリン酸緩衝生理食塩水中に溶解した（１００μｇ／１ｍｌ）。レクチンの希釈物を、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶシリンジ駆動フィルターユニット（０．２２μｍ、ＳＬＧＶ ００４ ＳＬ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｒｅｌａｎｄ）を用いて滅菌濾過し、リン酸緩衝生理食塩水中での＋４℃における一晩のインキュベートによりレクチンを受動的に４８ウェルプレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ ｓｕｒｆａｃｅ，カタログ番号１５０６８７ Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）上に吸着させた。インキュベート後、ウェルをリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、幹細胞をそれらの上にプレーティングした。
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ ＭＳＣ）を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０％ ＦＣＳ、ペニシリン−ストレプトマイシン、および２ｍＭ Ｌ−グルタミン（全てＧｉｂｃｏから）を添加した最小必須α−培地（α−ＭＥＭ）中で、各種レクチンで被覆した４８ウェルプレート上において培養した。細胞をＣｅｌｌ ＩＱ（ＣｈｉｐＭａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔａｍｐｅｒｅ、Ｆｉｎｌａｎｄ）中で、＋３７℃において、５％ＣＯ２とともに培養した。１５分間毎に画像を撮影した。データをＣｅｌｌ ＩＱ Ａｎａｌｙｚｅｒソフトウェアを用いて、Ｕｌｌａ Ｉｍｐｏｌａ博士（Ｆｉｎｎｉｓｈ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ Ｂｌｏｏｄ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｈｅｌｓｉｎｋｉ、Ｆｉｎｌａｎｄ）によって構築されたアナライザプロトコルにより分析した。
結果および考察
ＢＭ ＭＳＣの増殖速度は各種レクチン被覆表面において、互いに、および非被覆プラスチック表面との比較において、異なっており（表２４）、幹細胞表面グリカンに結合する異なるグリカン結合特異性を有するタンパク質は特異的にその増殖速度に影響することが示唆された。
ＢＭ ＭＳＣ増殖速度を高める効果を有するレクチンは、相対的な効果の順に：
ＧＳ ＩＩ（β−ＧｌｃＮＡｃ）＞ＥＣＡ（ＬａｃＮＡｃ／β−Ｇａｌ）＞ＰＷＡ（Ｉ−分岐ポリ−ＬａｃＮＡｃ）＞ＬＴＡ（α１，３−Ｆｕｃ）＞ＰＳＡ（α−Ｍａｎ）、
を含んでおり、式中、レクチンの好ましいオリゴ糖特異性を括弧内に示す。しかし、ＰＳＡは本実験においてほぼプラスチックに等しかった。
ＢＭ ＭＳＣの増殖速度に阻害的な効果を有するレクチンは、相対的な効果の順に：
ＲＣＡ（β−Ｇａｌ／ＬａｃＮＡｃ）＞＞ＵＥＡ（α１，２−Ｆｕｃ）＞ＷＦＡ（β−ＧａｌＮＡｃ）＞ＳＴＡ（直鎖ポリ−ＬａｃＮＡｃ）＞ＮＰＡ（α−Ｍａｎ）＞ＳＮＡ（α２，６−結合シアル酸）＝ＭＡＡ（α２，３−結合シアル酸／α３’−シアリルＬａｃＮＡｃ）、
を含んでおり、式中、レクチンの好ましいオリゴ糖特異性を括弧内に示す。しかし、ＮＰＡ、ＳＮＡ、およびＭＡＡは本実験においてほぼプラスチックに等しかった。
結果
細胞増殖
プラスチックまたは他の型の表面と比べると、細胞は恐らくＭＡＡおよびＥＣＡ上で最も効果的に増殖した。全てのウェルが１週間以内にコンフルエントに達した。ＷＦＡおよびＰＷＡ上で培養した細胞はそれらの増殖能を５週間の期間の間に緩めるようであり、ＷＦＡコーティング上では形態学的に異なる細胞がいくらか存在した。
細胞の形態および接着
形態学的に、ＰＳＡコーティング上で増殖させた細胞はそれらが網状単層を形成する様式において他と異なっていた。ＭＡＡおよびＰＳＡ上の細胞はまた、より強固に表面に接着しており、トリプシンによるそれらの剥離は不可能であり、それらの細胞は機械的に掻き取る必要があった。
実施例１１
ヒト幹細胞のスフィンゴ糖脂質グリカン
実験手順
マウス線維芽細胞フィーダー細胞上で増殖させたＭＳＣ、ＣＢ ＭＮＣ、およびｈＥＳＣからの試料を、先の実施例に記載のように生成した。中性および酸性スフィンゴ糖脂質画分を細胞から、基本的に記載（Ｍｉｌｌｅｒ−Ｐｏｄｒａｚａ ｅｔ ａｌ， ２０００）されるように単離した。グリカンをＭａｃｒｏｂｄｅｌｌａ ｄｅｃｏｒａエンドグリコセラミダーゼ消化（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， ＵＳＡ）により、基本的に製品の説明書に従って遊離し、試料からの全グリカンオリゴ糖画分を生成した。オリゴ糖を精製し、タンパク質結合オリゴ糖画分のための先の実施例に記載のようにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって分析した。
結果および考察
ヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）
ｈＥＳＣ中性脂質グリカン
ｈＥＳＣのスフィンゴ糖脂質中性グリカン画分の分析された質量分析プロファイルを図１０に示す。
主要な中性脂質グリカンの構造分析
全部で全グリカンシグナル強度の９０％超を構成していた６つの主要なグリカンシグナルは、単糖組成Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ１（７３０）、Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ１ｄＨｅｘ１（８７６）、Ｈｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ１（５６８）、Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ２（９３３）、Ｈｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ１（８９２）、およびＨｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ２（１０９５）に対応した。
β１，４−ガラクトシダーゼ消化において、１０９５および７３０の相対シグナル強度は、それぞれ約３０％および１０％減少した。これは、７３０および１０９５が非還元末端β１，４−Ｇａｌエピトープ、好ましくは構造Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃＬａｃおよびＧａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ［Ｈｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ１］Ｌａｃ等を有する少ない成分を含むことを示唆する。他の主要な成分は従って、他の末端エピトープを含むことが示された。さらに、グリカンシグナルＨｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ３（１４６０）は消化されてＨｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ３（１１３６）となり、本来のシグナルが２つのβ１，４−Ｇａｌを有するグリカン構造を含んでいたことが示された。
主要なグリカンシグナルはα−ガラクトシダーゼ消化に対して感受性ではなかった。
α１，３／４−フコシダーゼ消化において、８７６のシグナル強度は約１０％減少し、α１，３−またはα１，４−結合フコース残基を有するグリカンに対応するグリカンシグナルの割合が少ししかないことが示唆された。全プロファイル中の影響を受けた主要なシグナルはＨｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ１ｄＨｅｘ２（１０２２）であり、それがα１，３−Ｆｕｃまたはα１，４−Ｆｕｃのいずれかを有するグリカンを含んでいたことが示唆された。５１１は約３０％減少し、このシグナルがα１，２−Ｆｕｃ、優先的にはＦｕｃα２Ｇａｌβ４Ｇｌｃ（Ｆｕｃα２’Ｌａｃ、２’−フコシルラクトース）等の少ない成分を含んでいたことが示唆された。
α１，３／４−フコシダーゼ反応産物がさらにα１，２−フコシダーゼにより消化された際、８７６は完全に消化されて７３０となり、シグナル強度の大部分の構造が非還元末端α１，２−Ｆｕｃ、好ましくは構造Ｆｕｃα２［Ｈｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ１］Ｌａｃ等、より好ましくはＦｕｃα２ＧａｌＨｅｘＮＡｃＬａｃ等を含んでいたことが示唆された。他の部分的に消化されたグリカンシグナルはＨｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ２ｄＨｅｘ１（１２４１）であり、これは従ってα１，２−Ｆｕｃ、好ましくは構造Ｆｕｃα２［Ｈｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ２］Ｌａｃ等、より好ましくはＦｕｃα２Ｇａｌ［Ｈｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ２］Ｌａｃ等を含むことが示唆された。５１１は完全に消化され、本来のシグナルがα１，３／４−Ｆｕｃ、優先的にはＧａｌβ４（Ｆｕｃα３）Ｇｌｃ（３−フコシルラクトース）等を有する主要な成分を含んでいたことが示唆された。
α１，３／４−フコシダーゼおよびα１，２−フコシダーゼ反応産物がβ１，４−ガラクトシダーゼによりさらに消化された際、新たに形成された７３０の大部分は消化されなかった、すなわち５６８の相対的な割合は、先にフコシダーゼ処理を行わなかったβ１，４−ガラクトシダーゼ消化と比べて増加しなかった。これは、８７６の大部分がＦｕｃの次端部のβ１，４−Ｇａｌを含まなかったことを示唆した。さらに、８９２は消化されず、それが非還元末端β１，４−Ｇａｌを含まなかったことが示唆された。
α１，３／４−フコシダーゼ、α１，２−フコシダーゼ、およびβ１，４−ガラクトシダーゼ反応産物がβ１，３−ガラクトシダーゼによりさらに消化された際、８９２のシグナル強度が減少し、それが末端β１，３−Ｇａｌを有するグリカンを含んでいたことが示唆された。５６８のシグナル強度が７３０と比べ増加し、７３０も末端β１，３−Ｇａｌを有するグリカンを含んでいたことが示唆された。
ｈＥＳＣの主要なスフィンゴ糖脂質中性グリカンシグナルの実験に基づく構造がこのように決定された（‘＞’はｈＥＳＣの脂質グリカン構造の中で好ましい順を表し；‘［］’は、括弧内のオリゴ糖配列が分岐または非分岐のいずれであってもよいことを表し；‘（）’は構造内の分岐を表す）：
７３０ Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ１ ＞ Ｈｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ１Ｌａｃ ＞ Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃＬａｃ
８７６ Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ１ｄＨｅｘ１ ＞ Ｆｕｃα２［Ｈｅｘ１ＨｅｃＮＡｃ１］Ｌａｃ ＞ Ｆｕｃα２Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃＬａｃ ＞ Ｆｕｃα３／４［Ｈｅｘ１ＨｅｃＮＡｃ１］Ｌａｃ
５６８ Ｈｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ１ ＞ ＨｅｃＮＡｃＬａｃ
９３３ Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ２ ＞ ［Ｈｅｘ１ＨｅｃＮＡｃ２］Ｌａｃ
８９２ Ｈｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ１ ＞ ［Ｈｅｘ２ＨｅｃＮＡｃ１］Ｌａｃ ＞ Ｇａｌβ３［Ｈｅｘ１ＨｅｃＮＡｃ１］Ｌａｃ
１０９５ Ｈｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ２ ＞ ［Ｈｅｘ２ＨｅｃＮＡｃ２］Ｌａｃ ＞ Ｇａｌβ３ＨｅｘＮＡｃ［Ｈｅｘ１ＨｅｃＮＡｃ１］Ｌａｃ ＞ Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ［Ｈｅｘ１ＨｅｃＮＡｃ１］Ｌａｃ
１４６０ Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ３ ＞ ［Ｈｅｘ３ＨｅｃＮＡｃ３］Ｌａｃ ＞ Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ（Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ）［Ｈｅｘ１ＨｅｃＮＡｃ１］Ｌａｃ
酸性脂質グリカン
ｈＥＳＣのスフィンゴ糖脂質シアル化グリカン画分の分析された質量分析プロファイリングを図１１に示す。４つの主要なグリカンシグナルが、合わせて全グリカンシグナル強度の９６％超を構成しており、単糖組成ＮｅｕＡｃ１Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ１（９９７）、ＮｅｕＡｃ１Ｈｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ１（８３５）、ＮｅｕＡｃ１Ｈｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ１（１１５９）、およびＮｅｕＡｃ２Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ１（１２８８）に対応した。
酸性グリカン画分をα２，３−シアリダーゼ消化にかけ、生じた中性および酸性グリカン画分を別々に精製および分析した。酸性画分においては、シグナル１１５９および１２８８が消化され、８３５が部分的に消化された。中性画分においては、シグナル７３０および８９２が主要な出現したシグナルであった。これらの結果は：１１５９は主にα２，３−ＮｅｕＡｃを有するグリカンからなり、１２８８は少なくとも１個のα２，３−ＮｅｕＡｃを含み、８３５におけるグリカンの大部分はα２，３−ＮｅｕＡｃを含み、および、本来の試料においてはＮｅｕＡｃ１−２Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ１の大部分がα２，３−結合ＮｅｕＡｃのみを含んでいたことを示唆した。
ヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）
骨髄由来（ＢＭ）ＭＳＣ中性脂質グリカン
ＢＭ ＭＳＣスフィンゴ糖脂質中性グリカン画分の分析された質量分析プロファイルを図１０に示す。６つの主要なグリカンシグナルが合わせて全グリカンシグナル強度の９４％超を構成しており、単糖組成Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ１（７３０）、Ｈｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ１（５６８）、Ｈｅｘ２ｄＨｅｘ１（５１１）、Ｈｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ２ｄＨｅｘ２（１０６３）、Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ２ｄＨｅｘ２（１２２５）、およびＨｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ２ｄＨｅｘ１（１０７９）に対応した。４つの最も多量なシグナル（７３０、５６８、５１１、および１０６３）は合わせて全強度の７５％超を含んでいた。
臍帯血由来（ＣＢ）ＭＳＣ中性脂質グリカン
ＣＢ ＭＳＣスフィンゴ糖脂質中性グリカン画分の分析された質量分析プロファイルを図１０に示す。１０個の主要なグリカンシグナルが合わせて全グリカンシグナル強度の９２％超を構成しており、単糖組成Ｈｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ１（５６８）、Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ１（７３０）、Ｈｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ２（１０９５）、Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ３（１４６０）、Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ２（９３３）、Ｈｅｘ２ｄＨｅｘ１（５１１）、Ｈｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ２ｄＨｅｘ２（１０６３）、Ｈｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ３（１２９８）、Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ２ｄＨｅｘ２（１２２５）、およびＨｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ２（７７１）に対応した。５つの最も多量なシグナル（５６８、７３０、１０９５、１４６０、および９３３）は合わせて全強度の８２％超を含んでいた。
β１，４−ガラクトシダーゼ消化においては、１０９５、１４６０、および７３０の相対シグナル強度がそれぞれ約９０％、９５％、および２０％減少した。これは、ＣＢ ＭＳＣが、好ましくは構造Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ［Ｈｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ１］Ｌａｃ、Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ［Ｈｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ２］Ｌａｃ、およびＧａｌβ４ＧｌｃＮＡｃＬａｃ等の非還元末端β１，４−Ｇａｌエピトープを有する主要グリカン成分を有していたことを示唆する。さらに、グリカンシグナルＨｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ３（１４６０）は消化されてＨｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ３（１２９８）に、および多くはＨｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ３（１１３６）になり、本来のシグナルが１または２個のβ１，４−Ｇａｌを有するグリカン構造を含んでいたこと、および本来のグリカンの大部分が２個のβ１，４−Ｇａｌ、優先的には構造Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ（Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ）［Ｈｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ１］Ｌａｃ等を有していたことが示唆された。同様に、１０９５は消化されて、９３３に加え、Ｈｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ２（７７１）になり、本来のシグナルが１または２個のβ１，４−Ｇａｌを有するグリカン構造を含んでいたこと、および本来のグリカンの少数が２個のβ１，４−Ｇａｌ、優先的には構造Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ（Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ）Ｌａｃ等を有していたことが示唆された。
主要ＣＢ ＭＳＣスフィンゴ糖脂質中性グリカンシグナルの実験に基づく構造はこのように決定された（‘＞’はｈＥＳＣの脂質グリカン構造の中で好ましい順を表し；‘［］’は括弧内のオリゴ糖配列が分岐または非分岐のいずれであってもよいことを表し；‘（）’は構造内の分岐を表す）：
５６８ Ｈｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ１ ＞ ＨｅｃＮＡｃＬａｃ
７３０ Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ１ ＞ Ｈｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ１Ｌａｃ ＞ Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃＬａｃ
１０９５ Ｈｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ２ ＞ ［Ｈｅｘ２ＨｅｃＮＡｃ２］Ｌａｃ ＞ Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ ［Ｈｅｘ１ＨｅｃＮＡｃ１］Ｌａｃ ＞ Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ（Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ）Ｌａｃ
１４６０ Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ３ ＞ ［Ｈｅｘ３ＨｅｃＮＡｃ３］Ｌａｃ ＞ Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ［Ｈｅｘ２ＨｅｃＮＡｃ２］Ｌａｃ ＞ Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ（Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ）［Ｈｅｘ１ＨｅｃＮＡｃ１］Ｌａｃ
９３３ Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ２ ＞ Ｈｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ２Ｌａｃ
シアル化脂質グリカン
ｈＥＳＣスフィンゴ糖脂質シアル化グリカン画分の分析された質量分析プロファイルを図１１に示す。ＢＭ ＭＳＣの５個の主要なグリカンシグナルが合わせて全グリカンシグナル強度の９６％超を構成しており、単糖組成ＮｅｕＡｃ１Ｈｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ１（８３５）、ＮｅｕＡｃ１Ｈｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ１ｄＨｅｘ１（８１９）、ＮｅｕＡｃ１Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ１（９９７）、ＮｅｕＡｃ１Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ１ｄＨｅｘ１（１１４３）、およびＮｅｕＡｃ２Ｈｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ２ｄＨｅｘ１（１３１３）に対応した。ＣＢ ＭＳＣの６つの主要なシグナルが合わせて全グリカンシグナル強度の９２％超を構成しており、単糖組成ＮｅｕＡｃ１Ｈｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ１（８３５）、ＮｅｕＡｃ１Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ１（９９７）、ＮｅｕＡｃ２Ｈｅｘ２（９０５）、ＮｅｕＡｃ１Ｈｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ２（１３６２）、ＮｅｕＡｃ１Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ３（１７２７）、およびＮｅｕＡｃ２Ｈｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ１（１１２６）に対応した。
ヒト臍帯血単核球（ＣＢ ＭＮＣ）
ＣＢ ＭＮＣ中性脂質グリカン
ＣＢ ＭＮＣスフィンゴ糖脂質中性グリカン画分の分析された質量分析プロファイルを図１０に示す。５つの主要なグリカンシグナルが全グリカンシグナル強度の合わせて９１％超を含んでおり、単糖組成Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ１（７３０）、Ｈｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ１（５６８）、Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ１ｄＨｅｘ１（８７６）、Ｈｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ２（１０９５）、およびＨｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ２ｄＨｅｘ１（１２４１）に対応した。
β１，４−ガラクトシダーゼ消化においては、７３０および１０９５の相対シグナル強度がそれぞれ約５０％および９０％減少した。これは、該シグナルが、好ましくは構造Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβＬａｃおよびＧａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ［Ｈｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ１］Ｌａｃ等の非還元末端β１，４−Ｇａｌエピトープを有する主要成分を有していたことを示唆する。さらに、グリカンシグナルＨｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ３（１４６０）は消化されてＨｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ３（１２９８）およびＨｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ３（１１３６）になり、本来のシグナルが１または２個のβ１，４−Ｇａｌを有するグリカン構造を含んでいたことが示唆された。
主要ＣＢ ＭＳＣスフィンゴ糖脂質中性グリカンシグナルの実験に基づく構造はこのように決定された（‘＞’はｈＥＳＣの脂質グリカン構造の中で好ましい順を表し；‘［］’は括弧内のオリゴ糖配列が分岐または非分岐のいずれであってもよいことを表し；‘（）’は構造内の分岐を表す）：
７３０ Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ１ ＞ Ｈｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ１Ｌａｃ ＞ Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃＬａｃ
５６８ Ｈｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ１ ＞ ＨｅｃＮＡｃＬａｃ
８７６ Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ１ｄＨｅｘ１ ＞ ［Ｈｅｘ１ＨｅｃＮＡｃ１ｄＨｅｘ１］Ｌａｃ ＞ Ｆｕｃ［Ｈｅｘ１ＨｅｃＮＡｃ１］Ｌａｃ
１０９５ Ｈｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ２ ＞ ［Ｈｅｘ２ＨｅｃＮＡｃ２］Ｌａｃ ＞ Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ ［Ｈｅｘ１ＨｅｃＮＡｃ１］Ｌａｃ
１２４１ Ｈｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ２ｄＨｅｘ１ ＞ ［Ｈｅｘ２ＨｅｃＮＡｃ２ｄＨｅｘ１］Ｌａｃ ＞ Ｆｕｃ［Ｈｅｘ２ＨｅｃＮＡｃ２］Ｌａｃ
１４６０ Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ３ ＞ ［Ｈｅｘ３ＨｅｃＮＡｃ３］Ｌａｃ ＞ Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ［Ｈｅｘ２ＨｅｃＮＡｃ２］Ｌａｃ ＞ Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ（Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ）［Ｈｅｘ１ＨｅｃＮＡｃ１］Ｌａｃ
シアル化脂質グリカン
ＣＢ ＭＮＣスフィンゴ糖脂質シアル化グリカン画分の分析された質量分析プロファイルを図１１に示す。ＣＢ ＭＮＣの３個の主要なグリカンシグナルが合わせて全グリカンシグナル強度の９６％超を構成しており、単糖組成ＮｅｕＡｃ１Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ１（９９７）、ＮｅｕＡｃ１Ｈｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ２（１３６２）、およびＮｅｕＡｃ１Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ３（１７２７）に対応した。
ヒト幹細胞のスフィンゴ糖脂質グリカンプロファイルの概要
全ての本試料型の中性グリカン画分は合わせて４５個のグリカンシグナルを含んでいた。シグナルの提案された単糖組成は２−７Ｈｅｘ、０−５ＨｅｘＮＡｃ、および０−４ｄＨｅｘからなっていた。グリカンシグナルは５１１〜２２６３の間のモノアイソトピックｍ／ｚ値で検出された（［Ｍ＋Ｎａ］＋イオンに対して）。
全試料型に共通の主要な中性グリカンシグナルは７３０、５６８、１０９５、および９３３であり、グリカン構造群Ｈｅｘ０−１ＨｅｘＮＡｃ１Ｌａｃ（５６８または７３０）およびＨｅｘ１−２ＨｅｘＮＡｃ２Ｌａｃ（９３３または１０９５）に対応し、前者のグリカンはより多く、後者はより少なかった。これらの共通のグリカンの一般式はＨｅｘｍＨｅｘＮＡｃｎＬａｃであり、式中、ｍはｎまたはｎ−１のいずれかであり、ｎは１または２のいずれかである。
ヒト幹細胞型の中性糖脂質プロファイル
ｈＥＳＣに典型的なグリカンシグナルは優先的には（特にＭＳＣと比べて）８７６および８９２を含み；前者は優先的にはＦｕｃＨｅｘＨｅｘＮＡｃＬａｃに対応し、ここでα１，２−Ｆｕｃはα１，３／４−Ｆｕｃに対して優先的であり、後者は優先的にはＨｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ１Ｌａｃ、より優先的にはＧａｌβ３［Ｈｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ１］Ｌａｃに対応し；フコシル化、およびより優先的にはα１，２−結合フコシル化に加え、グリカンコア組成Ｈｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ１は他のヒト幹細胞型と比べてｈＥＳＣに特に特徴的であった。
ＣＢおよびＢＭ ＭＳＣの両者に典型的なグリカンシグナルは優先的には７７１、１０６３、１２２５を含んでおり；より優先的には組成ｄＨｅｘ０／２Ｈｅｘ０−１ＨｅｘＮＡｃ２Ｌａｃを含む。
特にＢＭ ＭＳＣに典型的なグリカンシグナルは優先的には５１１およびフコシル化構造、優先的には多フコシル化構造を含む。
特にＣＢ ＭＳＣに典型的なグリカンシグナルは優先的には１４６０および１２９８ならびに大型中性糖脂質、特にＨｅｘ２−３ＨｅｘＮＡｃ３Ｌａｃを含む。さらに、末端β１，４−Ｇａｌの低フコシル化および／または高発現が特にＣＢ ＭＳＣに典型的であった。
ＣＢ ＭＮＣに典型的なグリカンシグナルは優先的には組成ｄＨｅｘ０−１［ＨｅｘＨｅｘＮＡｃ］１−２Ｌａｃ、より優先的には他のシグナルと比較して高い相対量の７３０；およびフコシル化構造；および他の幹細胞型よりもばらつきおよび／または複雑さの程度が低いグリカンプロファイルを有していた。
本試料型全ての酸性グリカン画分は全体で３８個のグリカンシグナルを含んでいた。該シグナルの提案された単糖組成は０−２ＮｅｕＡｃ、２−９Ｈｅｘ、０−６ＨｅｘＮＡｃ、０−３ｄＨｅｘ、および／または０−１硫酸またはリン酸エステルからなっていた。グリカンシグナルは７８６〜２７８１の間のモノアイソトピックｍ／ｚ値で検出された（［Ｍ−Ｈ］−イオンに対して）。
ＣＢ ＭＮＣの酸性スフィンゴ糖脂質グリカンは主にＮｅｕＡｃ１Ｈｅｘｎ＋２ＨｅｘＮＡｃｎからなっており、式中、１≦ｎ≦３であり、その構造がＮｅｕＡｃ１［ＨｅｘＨｅｘＮＡｃ］１−３Ｌａｃであることが示唆された。
幹細胞スフィンゴ糖脂質グリカンにおける本実験において示された末端グリカンエピトープとしては：
Ｇａｌ
Ｇａｌβ４Ｇｌｃ（Ｌａｃ）
Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ（ＬａｃＮＡｃ２型）
Ｇａｌβ３
非還元末端ＨｅｘＮＡｃ
Ｆｕｃ
α１，２−Ｆｕｃ
α１，３−Ｆｕｃ
Ｆｕｃα２Ｇａｌ
Ｆｕｃα２Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ（Ｈ２型）
Ｆｕｃα２Ｇａｌβ４Ｇｌｃ（２’−フコシルラクトース）
Ｆｕｃα３ＧｌｃＮＡｃ
Ｇａｌβ４（Ｆｕｃα３）ＧｌｃＮＡｃ（Ｌｅｘ）
Ｆｕｃα３Ｇｌｃ
Ｇａｌβ４（Ｆｕｃα３）Ｇｌｃ（３−フコシルラクトース）
Ｎｅｕ５Ａｃ
Ｎｅｕ５Ａｃα２，３
Ｎｅｕ５Ａｃα２，６
等が挙げられる。
発生関連グリカンエピトープの発現
本発明によると、スフィンゴ糖脂質グリカン組成Ｈｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ１は優先的には（イソ）グロボ構造に対応する。ＳＳＥＡ−３糖脂質抗原のグリカン配列はＧａｌβ３ＧａｌＮＡｃβ３Ｇａｌα４Ｇａｌβ４Ｇｌｃと同定され、本実験においてｈＥＳＣに検出されたグリカンシグナルＨｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ１（８９２）に対応する。同様に、ＳＳＥＡ−４糖脂質抗原のグリカン配列はＮｅｕＡｃα３Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃβ３Ｇａｌα４Ｇａｌβ４Ｇｌｃと決定され、これは本実験においてｈＥＳＣで検出されたグリカンシグナルＮｅｕＡｃ１Ｈｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ１（１１５９）に対応する。本グリカン構造分析と一致して、ｈＥＳＣ試料は先の実施例に記載されるモノクローナル抗体染色によりＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４陽性と決定された。高解像度分析において、グリカンシグナル Ｈｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ１およびＮｅｕＡｃ１Ｈｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ１がＭＳＣにおいても少量検出され、ＭＳＣにおいてはグロボシド型スフィンゴ糖脂質が比較的希ではあるが有意な構造であることが示唆された（表２９）。マウスＥＳ細胞とは対照的に、ｈＥＳＣはＳＳＥＡ−１抗原を発現しない。これと一致して、α１，３／４−フコシル化中性糖脂質グリカンは低水準の発現しか見出されなかった。一方、ｈＥＳＣスフィンゴ糖脂質グリカンの主要なフコシル化構造はα１，２−Ｆｕｃを有するということを示すことができた。これはＳＳＥＡ−１反応性におけるマウス−ヒト間の相違に対する分子レベルでの説明となる。
実施例１２
ＣＢ ＭＮＣ細胞集団のレクチンに基づく選択
フルオレセイン標識レクチンおよびＣＢ ＭＮＣを用いたＦＡＣＳ実験を、本質的に実施例４と同様に行った。二重染色を、ＣＤ３４特異的モノクローナル抗体（Ｊａａｔｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）を相補的な蛍光色素とともに用いて行った。ＣＢ ＭＮＣ画分からの赤芽球減少（ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）を、抗グリコホリンＡ（ＧｌｙＡ）モノクローナル抗体ネガティブセレクションにより行った。
結果および考察
ＣＢ ＭＮＣ画分と比べ、ＧｌｙＡ減少（ＧｌｙＡ ｄｅｐｌｅｔｅｄ）ＣＢ ＭＮＣは、次のレクチンを用いたＦＡＣＳにおいて減少した染色を示し（減少を％で括弧内に示す）：ＰＷＡ（４８％）、ＬＴＡ（５９％）、ＵＥＡ（３４％）、ＳＴＡ、ＭＡＡ、およびＰＮＡ（最後の３つは全て２３％未満）；ＧｌｙＡ減少が細胞選別におけるレクチンの分解能を増加させたことが示唆された。
フルオレセイン標識レクチンおよび抗ＣＤ３４抗体の両者を用いたＦＡＣＳ二重染色において、次のレクチンがＣＤ３４＋細胞と共存していた：ＳＴＡ（３／３試料）、ＨＨＡ（３／３試料）、ＰＳＡ（３／３試料）、ＲＣＡ（３／３試料）、および部分的にＮＰＡ（２／３試料）。一方、次のレクチンはＣＤ３４＋細胞と共存していなかった：ＧＮＡ（３／３試料）およびＰＷＡ（３／３試料）、ならびに部分的にＬＴＡ（２／３試料）、ＷＦＡ（２／３試料）、およびＧＳ−ＩＩ（２／３試料）。
実施例５の結果と総合すると、本結果は、レクチンがＣＢ ＭＮＣからＣＤ３４＋細胞をネガティブおよびポジティブ選択により濃縮することができることを示す。例えば、
１）ＧＮＡは、ＣＤ３４＋細胞の単離におけるＣＢ ＭＮＣのネガティブセレクションにおいて、ＣＢ ＭＮＣの約７０％に結合するがＣＤ３４＋細胞には結合せず、約３Ｘの濃縮をもたらす。
２）ＳＴＡは、ＣＤ３４＋細胞の単離におけるＣＢ ＭＮＣのポジティブセレクションにおいて、ＣＢ ＭＮＣの約５０％およびＣＤ３４＋細胞にも結合し、約２Ｘの濃縮をもたらす。
３）ＵＥＡは、ＣＤ３４＋細胞の単離におけるＣＢ ＭＮＣのポジティブセレクションにおいて、ＣＢ ＭＮＣの約５０％およびＣＤ３４＋細胞にも結合し、約２Ｘの濃縮をもたらす。
実施例１３
幹細胞のガレクチン遺伝子発現プロファイル
実験手順
ＣＢ ＣＤ１３３＋細胞の遺伝子発現分析は記載されており（Ｊａａｔｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）、本分析は本質的に同様に行った。遺伝子発現プロファイルが分析されたガレクチンとしては（対応するアフィメトリクスの記号を括弧内に記す）：ガレクチン−１（２０１１０５＿ａｔ）、ガレクチン−２（２０８４５０＿ａｔ）、ガレクチン−３（２０８９４９＿ｓ＿ａｔ）、ガレクチン−４（２０４２７２＿ａｔ）、ガレクチン−６（２００９２３＿ａｔ）、ガレクチン−７（２０６４００＿ａｔ）、ガレクチン−８（２０８９３３＿ｓ＿ａｔ）、ガレクチン−９（２０３２３６＿ｓ＿ａｔ）、ガレクチン−１０（２０６２０７＿ａｔ）、ガレクチン−１３（２２０１５８＿ａｔ）が含まれた。
結果および考察
ＣＢ ＣＤ１３３＋対ＣＤ１３３−、およびＣＤ３４＋対ＣＤ３４− ＣＢ ＭＮＣ細胞においては、ガレクチン遺伝子発現プロファイルは次の通りであった：全体として、ガレクチン１、２、３、６、８、９、および１０はＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞において遺伝子発現を示した。ガレクチン１、２、および３は、ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋の両者細胞において、ＣＤ３４−／ＣＤ１３３−細胞よりも下方制御されており、さらにガレクチン１０は、ＣＤ１３３＋細胞において、ＣＤ１３３−細胞よりも下方制御されていた。一方、ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋の両者細胞において、ガレクチン８は、ＣＤ３４−／ＣＤ１３３−細胞よりも上方制御されていた。
ｈＥＳＣ対ＥＢ試料において、ガレクチン遺伝子発現プロファイルは次の通りであった：全体として、ガレクチン１、３、６、８、および１３はｈＥＳＣにおいて遺伝子発現を示した。ガレクチン３は明らかにＥＢよりも下方制御されており、さらにガレクチン１３は４つのうち２つのｈＥＳＣ株において下方制御されていた。一方、ガレクチン１は明らかに全てのｈＥＳＣ株において上方制御されていた。
結果は、ＣＢ ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋の両者幹細胞集団およびｈＥＳＣが興味深い異なったガレクチン発現プロファイルを有しており、異なったガレクチンリガンド親和性プロファイル（Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００２）をもたらすことを示唆する。結果はさらに、これらの幹細胞における多量のガレクチンリガンドの発現、特に非還元末端β−ＧａｌおよびＩＩ型ＬａｃＮＡｃ、ポリ−ＬａｃＮＡｃ、β１，６−分岐ポリ−ＬａｃＮＡｃ、および複合型Ｎ−グリカンの発現を示したグリカン分析の結果と相関している。
実施例１４
幹細胞の免疫組織化学染色
（培養中の）胚幹細胞の免疫組織化学染色による研究（ＧＦ系列の染色）
ｈＥＳＣ細胞を実施例に記載のように培養した。細胞を固定し、ＰＢＳでリンスした後、幹細胞培養物／切片をＰＢＳ中の３％の高純度に精製されたＢＳＡ中で３０分間、室温でインキュベートし、非特異的結合部位をブロックした。一次抗体（ＧＦ２７９、２８８、２８７、２８４、２８５、２８３，２８６，２９０および２８９）を、１％ ＢＳＡ−ＰＢＳを含むＰＢＳ中で希釈（１：１０）し、１時間、室温でインキュベートした。ＰＢＳで３回リンスした後、切片を、ＰＢＳ中のビオチン化ウサギ抗マウス、二次抗体（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ， ＵＳＡ）とともに３０分間室温でインキュベートし、ＰＢＳ中でリンスし、ＰＢＳ中に希釈されたペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とともにインキュベートした。切片を最後にＡＥＣ基質（３−アミノ−９−エチルカルバゾール； Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｆｒｅｍｏｎｔ， ＣＡ， ＵＳＡ）で現像した。水でリンス後、対比染色をＭａｙｅｒのヘマラム溶液で行った。
免疫染色で用いた抗体、それらの抗原／エピトープおよび記号。結果については表１９も参照のこと。
Figure 2010516239
特異的抗体による幹細胞試料における細胞表面上の炭水化物構造の検出
材料および方法
細胞試料
骨髄からの間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を生成し、増殖培地中で上記のように培養した。ＭＳＣを分化培地（４ｎｇ／ｍｌ デキサメタゾン、１０ｍｍｏｌ／Ｌ β−グリセロリン酸、および５０μｍｏｌ／Ｌ アスコルビン酸を含む増殖培地）中で６週間培養し、骨原性分化を誘導した。分化培地は分化期間を通じて週２回新しいものに換えた。
抗体
免疫染色
継代９〜１２における骨髄由来間葉系幹細胞を、０．０１％ ポリ−Ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）で被覆したガラス８チャンバースライド（Ｌａｂ−ＴｅｋＩＩ、Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ）上で、３７℃、５％ＣＯ２の下、２〜４日間増殖させた。骨原性細胞を同一の８チャンバースライドを用いて分化培地中で６週間培養した。培養後、細胞を５回ＰＢＳ（１０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１４０ｍＭ ＮａＣｌ）で洗浄し、４％ ＰＢＳ緩衝パラホルムアルデヒドｐＨ７．２で室温（ＲＴ）において１０〜１５分間固定し、次いでＰＢＳで３回５分間洗浄した。非特異的結合部位を３％ ＨＳＡ−ＰＢＳ（ＦＲＣ Ｂｌｏｏｄ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｆｉｎｌａｎｄ）で３０分間、ＲＴでブロックした。一次抗体を１％ ＨＳＡ−ＰＢＳ（１：１０〜１：２００）中で希釈し、６０分間ＲＴでインキュベートし、次いでＰＢＳで３回１０分間洗浄した。１％ ＨＳＡ−ＰＢＳ中の二次抗体、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ；１：１０００）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ；１：１０００）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、またはＦＩＴＣ−結合ウサギ抗ラットＩｇＧ（１：３２０）（Ｓｉｇｍａ）を６０分間ＲＴで暗所においてインキュベートした。さらに、細胞をＰＢＳで３回１０分間洗浄し、ＤＡＰＩ染色剤を含有するＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＫ）に封入した。免疫染色を、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｋｏｐ ２ ｐｌｕｓ蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｖｉｓｉｏｎ ＧｍｂＨ、ドイツ）を用いて、ＦＩＴＣおよびＤＡＰＩフィルターとともに観察した。像をＺｅｉｓｓ ＡｘｉｏＣａｍ ＭＲｃカメラを用いて、ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ３．１／４．０（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を使用し、４００Ｘの倍率で撮影した。
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析
継代１２における増殖中ＭＳＣを、０．０２％ Ｖｅｒｓｅｎｅ溶液（ｐＨ７．４）、４５分間、３７℃により、培養プレートから遊離させた。抗体標識の前に、細胞を２回、０．３％ ＨＳＡ−ＰＢＳ溶液で洗浄した。一次抗体を３０分間ＲＴでインキュベート（４μｌ／１００μｌ 細胞懸濁液／５００００細胞）し、１回０．３％ ＨＳＡ−ＰＢＳで洗浄した後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗マウス（１：５００）による二次抗体検出を３０分間ＲＴで暗所中において行った。ネガティブコントロールとして、細胞を一次抗体無しでインキュベートした以外は標識細胞と同様に処理した。細胞をＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により、波長４８８のＦＩＴＣ検出器を用いて分析した。結果をＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア バージョン５．０．１（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により分析した。
免疫染色で用いた抗体、それらの抗原／エピトープおよび記号。結果については表１９も参照のこと。
Figure 2010516239
実施例１５
臍帯血単核球Ｎ−グリカンのグリコシダーゼプロファイリング
実験手順
エキソグリコシダーゼ消化
中性Ｎ−グリカン画分を上記のように臍帯血単核球集団から単離した。エキソグリコシダーゼ反応を本質的に製品の使用説明書に従い、および（Ｓａａｒｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）に記載されるように行った。各種反応は；α−Ｍａｎ：タチナタマメからのα−マンノシダーゼ（Ｃ．ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ；Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）；β１，４−Ｇａｌ：Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからのβ１，４−ガラクトシダーゼ（大腸菌における組み替え体；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＵＳＡ）；β１，３−Ｇａｌ：組み替えβ１，３−ガラクトシダーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＵＳＡ）；β−ＧｌｃＮＡｃ：Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからのβ−グルコサミニダーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＵＳＡ）；α２，３−ＳＡ：Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからのα２，３−シアリダーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＵＳＡ）；であった。分析のための反応は、特異性に関して、並行したコントロール反応において合成オリゴ糖を用い、それをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により分析して注意深く制御された。α２，３−ＳＡのシアル酸結合特異性は、並行したコントロール反応において合成オリゴ糖を用いて制御され、反応条件下で酵素がα２，３−結合シアル酸を加水分解したがα２，６−結合シアル酸を加水分解しなかったことが確認された。分析は先の実施例に記載のようにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により行った。消化の結果を、反応前後のグリカンプロファイルの比較により分析した。
結果
中性Ｎ−グリカンのグリコシダーゼプロファイリング
臍帯血単核球からのアフィニティー精製されたＣＤ３４＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１３３＋、ＣＤ１３３−、Ｌｉｎ＋、およびＬｉｎ−細胞試料からの中性Ｎ−グリカン画分を上記のように単離した。グリカン試料を、実験手順に記載されるように並行したグリコシダーゼ消化にかけた。プロファイリングの結果を表２（ＣＤ３４＋およびＣＤ３４−細胞）、表３（ＣＤ１３３＋およびＣＤ１３３−細胞）、および表４（Ｌｉｎ−およびＬｉｎ＋細胞）にまとめる。本結果は、いくつかの中性Ｎ−グリカンシグナルが個々に全てのエキソグリコシダーゼに対して感受性であることを示し、全ての細胞型においていくつかの中性Ｎ−グリカンがそれらの非還元末端に特異的基質グリカン構造を有することが示唆された。結果は、前述の表中に詳細に述べたように、個々のグリカンシグナルの各酵素に対する感受性、およびさらにはプロファイル全体にわたる細胞型間の相違、の両者における、細胞型間の明瞭な違いも示す。
シアル化Ｎ−グリカンのグリコシダーゼプロファイリング
臍帯血単核球からのアフィニティー精製されたＣＤ１３３＋およびＣＤ１３３−細胞試料からのシアル化Ｎ−グリカン画分を上記のように単離した。グリカン試料を、実験手順に記載されるように並行したグリコシダーゼ消化にかけた。ａ２，３−シアリダーゼによるプロファイリングの結果を表５に示す。結果は、反応中に生ずるシアル化および中性グリカン画分における、分析された細胞型のグリカンプロファイル間の有意な相違を示す。本結果は、プロファイル全体にわたる様式で複数のシグナルにおいて相違が認められることを示す。上で考察されるように、個々のシグナルも細胞型間で相違する。
臍帯血ＣＤ１３３＋およびＣＤ１３３−細胞のＮ−グリカンは異なってα２，３−シアル化されている
実験手順に記載のように、臍帯血ＣＤ１３３＋およびＣＤ１３３−細胞からのシアル化Ｎ−グリカンをα２，３−シアリダーゼで処理し、その後生じたグリカンをシアル化および非シアル化画分に分けた。α２，３−シアリダーゼ抵抗性および感受性の両者のシアル化Ｎ−グリカンが観察された。すなわち、シアリダーゼ処理後、シアル化グリカンがシアル化Ｎ−グリカン画分で観察され、脱シアル化グリカンが中性Ｎ−グリカン画分で観察された。結果は、臍帯血ＣＤ１３３＋およびＣＤ１３３−細胞が異なってα２，３−シアル化されていることを示す。例えば、α２，３−シアリダーゼ処理後、ＮｅｕＡｃ１Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４ｄＨｅｘ１の［Ｍ−Ｈ］−イオンに対応するｍ／ｚ ２０７６におけるモノシアル化（ＳＡ１）グリカンシグナルと、ＮｅｕＡｃ２Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４ｄＨｅｘ１の［Ｍ−Ｈ］−イオンに対応するｍ／ｚ ２３６７におけるジシアル化（ＳＡ２）グリカンシグナルとの相対的な割合は、α２，３−シアリダーゼ抵抗性ジシアル化Ｎ−グリカンが、α２，３−シアリダーゼ抵抗性モノシアル化Ｎ−グリカンと比較した際に、ＣＤ１３３−細胞において、ＣＤ１３３＋細胞におけるよりも相対的に多量であることを示す。Ｎ−グリカンのα２，３−シアル化は、特にα２，６−シアル化等の他のシアル酸結合と比べ、臍帯血ＣＤ１３３＋細胞において、ＣＤ１３３−細胞におけるよりも、多量であると結論される。
臍帯血ＣＤ１３３−細胞においては、α２，３−シアリダーゼ処理に抵抗性のいくつかのシアル化Ｎ−グリカンが観察された。すなわち、本来のシアル化グリカンの脱シアル化型に対応するであろう中性グリカンは観察されなかった。臍帯血ＣＤ１３３＋およびＣＤ１３３−細胞間の個々のＮ−グリカン構造の異なったα２，３−シアル化を明らかにする結果を表５に示す。本結果は、Ｎ−グリカンのα２，３−シアル化が、他のシアル酸結合と比べ、臍帯血ＣＤ１３３＋細胞において、ＣＤ１３３−細胞におけるよりも多量であるということを示す。
シアリダーゼ分析
臍帯血単核球集団（ＣＢ ＭＮＣ）から単離されたシアル化Ｎ−グリカン画分を、先の実施例に記載される広範なシアリダーゼで消化した。反応後、シアル化Ｎ−グリカンの圧倒的多数が脱シアル化され、対応する中性Ｎ−グリカンに変換されたことがＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって観察され、それらが、提案された単糖組成によって示唆されたように、シアル酸残基（ＮｅｕＡｃおよび／またはＮｅｕＧｃ）を有していたことが示された。ＣＢ ＭＮＣ集団の中性および脱シアル化（本来はシアル化）Ｎ−グリカン画分の組み合わせグリカンプロファイルを生成した。プロファイルは細胞試料から単離された全Ｎ−グリカンプロファイル（脱シアル化型のもの）に対応する。Ｎ−グリカンシグナルの約２５％が高マンノース型Ｎ−グリカンの単糖組成に、２８％が低マンノース型Ｎ−グリカンの、３４％が複合型Ｎ−グリカンの、そして１３％がハイブリッド型または単分岐Ｎ−グリカンの単糖組成に対応すると計算される。
結論
本結果は、１）グリコシダーゼプロファイリング法を用いて個々のグリカンシグナルの構造的特徴、および個々のグリカンの細胞型間での相違を分析することができること、２）異なる細胞型は互いにグリコシダーゼに対する個々のグリカンシグナルおよびグリカンプロファイルの両者の感受性に関して異なっていること、そして３）グリコシダーゼプロファイリングは各種細胞型を区別するためのさらなる手段として用いることができ、このような場合、比較のためのパラメーターは個々のシグナルおよびプロファイル全体にわたる相違の両者であること、を示唆する。
実施例１６
細胞表面グリカン構造の酵素修飾
実験手順
酵素修飾
シアル酸転移酵素反応：ヒト臍帯血単核球（３ｘ１０６細胞）を、全量１００μｌの５０ｍＭ ３−モルフォリノプロパンスルホン酸ナトリウム（ＭＯＰＳ）バッファー ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中の、６０ｍＵ α２，３−（Ｎ）−シアル酸転移酵素（ラット、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａにおける組み替え体、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、１．６μモル ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃを用いて、１２時間まで修飾した。フコース転移酵素反応：ヒト臍帯血単核球（３ｘ１０６細胞）を、全量１００μｌの５０ｍＭ ＭＯＰＳバッファー ｐＨ７．２、１５０ｍＭ Ｎａｃｌ中の、４ｍＵ α１，３−フコース転移酵素ＶＩ（ヒト、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａにおける組み替え体、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、１μモル ＧＤＰ−Ｆｕｃを用いて、３時間まで修飾した。広範なシアリダーゼ反応：ヒト臍帯血単核球（３ｘ１０６細胞）を、全量１００μｌの５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー ｐＨ５．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中の、５ｍＵ シアリダーゼ（Ａ．ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ， Ｇｌｙｋｏ， ＵＫ）を用いて、１２時間まで修飾した。α２，３−特異的シアリダーゼ反応：細胞を、全量１００μｌの５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー ｐＨ５．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中の、α２，３−シアリダーゼ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、大腸菌における組み替え体）を用いて修飾した。α−マンノシダーゼ反応：α−マンノシダーゼはタチナタマメからのものであり、反応は本質的に上記の他の酵素と同様に行った。逐次的酵素修飾：逐次反応の間に、細胞を遠心分離で沈殿させ、上清を捨て、その後、適当なバッファー中の次の修飾酵素および基質溶液を上記のように細胞に加えた。洗浄手順：修飾後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。
グリカン分析
細胞を洗浄後、全細胞糖タンパク質をＮ−グリコシダーゼ消化にかけ、シアル化および中性Ｎ−グリカンを単離して上記のように質量分析により分析した。Ｏ−グリカンの分析のため、糖タンパク質を、本質的に先の記載（Ｎｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）の通りに還元アルカリβ脱離（ｒｅｄｕｃｉｎｇ ａｌｋａｌｉｎｅ β−ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ）にかけ、その後シアル化および中性グリカンアルジトール画分を単離し、上記のように質量分析で分析した。
結果
シアリダーゼ消化
広範なシアリダーゼに触媒された生きた臍帯血単核球の脱シアル化の際、シアル化Ｎ−グリカン構造およびＯ−グリカン構造（データ不掲載）が、対応する中性Ｎ−グリカン構造、例えばＨｅｘ６ＨｅｘＮＡｃ３、Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４ｄＨｅｘ０−２、およびＨｅｘ６ＨｅｘＮＡｃ５ｄＨｅｘ０−１単糖組成の相対量の増加で示されるように、脱シアル化された（表９）。一般に、グリコシル化プロファイルの、シアル酸残基がより少ないグリカン構造への変化が、シアル化Ｎ−グリカンの分析において広範なシアリダーゼ処理の際に観察された。反応の際の細胞のグリカンプロファイルの変化は、反応結果を特徴付けるための効果的な手段として役立った。生じた修飾された細胞は、より少ないシアル酸残基とより多くの末端ガラクトース残基とをそれらの表面に反応後に有していたと結論される。
α２，３−特異的シアリダーゼ消化
同様に、α２，３−特異的シアリダーゼに触媒された生きた単核球の脱シアル化の際、対応する中性Ｎ−グリカン構造の相対量の増加で示されるように、シアル化Ｎ−グリカン構造が脱シアル化された（データ不掲載）。一般に、グリコシル化プロファイルの、シアル酸残基がより少ないグリカン構造への変化が、シアル化Ｎ−グリカンの分析においてα２，３−特異的シアリダーゼ処理の際に観察された。反応の際の細胞のグリカンプロファイルの変化は、反応結果を特徴付けるための効果的な手段として役立った。生じた修飾された細胞は、より少ないα２，３−結合シアル酸残基とより多くの末端ガラクトース残基とをそれらの表面に反応後に有していたと結論される。
シアル酸転移酵素反応
α２，３−シアル酸転移酵素に触媒された生きた臍帯血単核球のシアル化の際、中性Ｎ−グリカン構造（表９におけるＨｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４ｄＨｅｘ０−３およびＨｅｘ６ＨｅｘＮＡｃ５ｄＨｅｘ０−２単糖組成）の相対量の減少および対応するシアル化構造（例えば表８のＮｅｕＡｃ２Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４ｄＨｅｘ１グリカン）の増加により示されるように、多数の中性（表９）およびシアル化Ｎ−グリカン（表８）構造ならびにＯ−グリカン構造（データ不掲載）がシアル化された。一般に、グリコシル化プロファイルの、シアル酸残基がより多いグリカン構造への変化が、Ｎ−グリカンおよびＯ−グリカン両者の分析において観察された。生じた修飾された細胞は、より多くのα２，３−結合シアル酸残基とより少ない末端ガラクトース残基とをそれらの表面に反応後に有していたと結論される。
フコース転移酵素反応
α１，３−フコース転移酵素に触媒された生きた臍帯血単核球のフコシル化の際、非フコシル化グリカン構造（提案された単糖組成においてｄＨｅｘを有しない）の相対量の減少および対応するフコシル化構造（提案された単糖組成においてｎｄＨｅｘ＞０を有する）の増加により示されるように、多数の中性（表９）およびシアル化Ｎ−グリカン構造ならびにＯ−グリカン構造（下記参照）がフコシル化された。例えば、フコシル化前には、Ｈｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ２アルジトールの［Ｍ＋Ｎａ］＋イオンに対応するｍ／ｚ ７７３の、およびＨｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ２ｄＨｅｘ１アルジトールの［Ｍ＋Ｎａ］＋イオンに対応するｍ／ｚ ９１９の、Ｏ−グリカンアルジトールシグナルが、それぞれ約９：１の相対的割合で観察された（データ不掲載）。フコシル化後、前記シグナルのおおよその相対的割合は３：１であり、中性Ｏ−グリカンの有意なフコシル化が起こったことが示唆された。本来の細胞に観察されなかったいくつかのフコシル化Ｎ−グリカン構造、例えば提案された構造Ｈｅｘ６ＨｅｘＮＡｃ５ｄＨｅｘ１およびＨｅｘ６ＨｅｘＮＡｃ５ｄＨｅｘ２を有する中性Ｎ−グリカン（表９）さえも反応後において観察され、α１，３−フコース転移酵素反応において、生細胞の細胞表面が、増加した量または通常と異なる構造型のフコシル化グリカン、特にタンパク質結合Ｎ−グリカンにおける、およびＯ−グリカンにおける、末端Ｌｅｗｉｓ ｘエピトープで修飾され得ることが示唆された。
シアリダーゼ消化とその後のシアル酸転移酵素反応
実験手順に記載されるように、臍帯血単核球を広範なシアリダーゼ反応にかけ、その後α２，３−シアル酸転移酵素およびＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃを同一の反応物に添加した。この反応順序の効果はＮ−グリカンプロファイル上で観察可能であった。シアル化Ｎ−グリカンプロファイルも反応工程間で分析され、結果は、シアル酸がまずシアル化Ｎ−グリカンから除去され（例えば増加した量の中性Ｎ−グリカンの出現により示される）、次いでα２，３−結合シアル酸残基に置き換わった（例えば前記の新規に形成された中性Ｎ−グリカンの消失により示される；データ不掲載）ことを明瞭に示した。生じた修飾された細胞は反応後により多くのα２，３−結合シアル酸残基を有していたと結論される。
シアル酸転移酵素反応とその後のフコース転移酵素反応
実験手順に記載されるように、臍帯血単核球をα２，３−シアル酸転移酵素反応にかけ、その後α１，３−フコース転移酵素およびＧＤＰ−フコースを同一の反応物に添加した。この反応順序の効果はシアル化Ｎ−グリカンプロファイル上で観察可能であった。結果はグリカンシグナルの主要な部分（表８および９における例）がそれらの相対強度に変化を受け、細胞に存在するシアル化Ｎ−グリカンの主要な部分が前記酵素の基質であったことが示唆された。前記酵素反応工程の組み合わせは、どちらか一方のみの反応工程とは異なる結果を生じたことも明らかであった。
上述のα１，３−フコース転移酵素反応とは異なり、フコシル化前のシアル化は、臍帯血単核球表面上に存在する中性フコース転移酵素受容グリカン構造をシアル化し、単独でのα１，３−フコース転移酵素反応後に生じた中性フコシル化Ｎ−グリカン構造の検出可能な形成（上記で考察される；表９）をもたらさなかった。
α−マンノシダーゼ反応
全細胞のα−マンノシダーゼ反応は、先の実施例でα−マンノース残基を有することが示されたものを含むグリカンシグナルの軽微な減少を示した。
糖転移酵素由来グリカン構造
修飾反応において、グリコシル化された糖転移酵素が細胞に混入し得ることが検出された。例えば、細胞がＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞で産生された組み替えフコース転移酵素またはシアル酸転移酵素とともにインキュベートされた際に、細胞および／または細胞関連糖タンパク質のＮ−グリコシダーゼおよび質量分析は、Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ２ｄＨｅｘ１グリカン成分の［Ｍ＋Ｎａ］＋イオンに対応するｍ／ｚ １０７９における多量の中性Ｎ−グリカンシグナルの検出をもたらした（計算値 ｍ／ｚ １０７９．３８）。典型的には、組み替え糖転移酵素で処理された細胞において、このグリカンシグナルはその細胞自身のグリカンシグナルよりも多量であるかまたは少なくとも同程度であり、昆虫由来の複合糖質が、昆虫細胞内で産生された、組み替え体の、グリカン修飾された酵素と関連した非常に有力な混入物であることが示唆された。さらに、このグリカンの混入は細胞の洗浄後にも持続し、糖転移酵素に対応するまたは関連する昆虫型複合糖質が細胞に対して親和性を有するか、または細胞からの洗浄に対して抵抗性である傾向を有することが示唆された。前記グリカンシグナルの由来を確認するため、我々は市販の組み替えフコース転移酵素およびシアル酸転移酵素の調製物のグリカン含有物を分析し、ｍ／ｚ １０７９グリカンシグナルがこれらの酵素と関連した主要なＮ−グリカンシグナルであることを見出した。対応するＮ−グリカン構造、例えばＭａｎα３（Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃα３／６）ＧｌｃＮＡｃ（β−Ｎ−Ａｓｎ）は、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞において産生される糖タンパク質から先に記載されている（Ｓｔａｕｄａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２； Ｋｒｅｔｚｃｈｍａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｋｕｂｅｌｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ａｌｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。文献に記載されるように、これらのグリカン構造、および組み替え体のまたは精製された酵素で処理された細胞に潜在的に混入する他のグリカン構造、特に昆虫由来産物は、潜在的にヒトにおいて免疫原性であり、および／または、そうでなければ修飾された細胞の使用に対して有害である。グリカン修飾酵素はヒト細胞の、特に臨床用途のための、修飾のために、免疫原性のグリカンエピトープ、非ヒトグリカン構造、および／または潜在的に望ましくない生物学的効果を有する他のグリカン構造を含まないように注意深く選択されるべきであると結論される。
実施例１７
ヒト胚幹細胞のエキソグリコシダーゼ分析
実験手順
ｈＥＳＣおよび分化した細胞試料
ヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）および胚様体（ＥＢ）試料をｈＥＳＣ株ＦＥＳ２９（Ｓｋｏｔｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）から本質的に先の実施例に記載されるように調製したが、本実施例においてはｈＥＳＣはマウス線維芽細胞フィーダー細胞（ｍＥＦ）上で増殖させ、ｈＥＳＣ試料はある程度のｍＥＦ細胞を含んだ。
エキソグリコシダーゼ消化を本質的に記載（Ｓａａｒｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）のように、および先の実施例に記載されるように行った。用いた酵素はタチナタマメからのα−マンノシダーゼおよびβ−ヘキソサミニダーゼ（Ｃ．ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ，Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからのβ−グルコサミニダーゼおよびβ１，４−ガラクトシダーゼ（大腸菌における組み替え体、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＵＳＡ）、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからのα２，３−シアリダーゼ（Ｇｌｙｋｏ，ＵＫ）、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ．からのα１，３／４−フコシダーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＵＳＡ）、Ｘ．ｍａｎｉｈｏｔｉｓからのα１，２−フコシダーゼ（Ｇｌｙｋｏ）、β１，３−ガラクトシダーゼ（大腸菌における組み替え体、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、およびＡ．ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓからのα２，３／６／８／９−シアリダーゼ（Ｇｌｙｋｏ）であった。酵素の特異的活性は精製したオリゴ糖またはオリゴ糖混合物を用いた並行的な反応において制御され、前記分析反応と同様に分析された。エキソグリコシダーゼ消化結果表における変化は、記録された質量スペクトルにおける相対的な変化であり、それらはグリコシダーゼ処理から生じたグリカンプロファイルの絶対的な変化を反映するものではない。
結果および考察
ｈＥＳＣ
中性および酸性Ｎ−グリカン画分を、マウスおよびヒト両者の線維芽細胞フィーダー細胞上で先の実施例に記載のように増殖させたｈＥＳＣから単離した。中性（表１０および１１）および酸性（表１２）グリカン画分の並行的なエキソグリコシダーゼ消化の結果を以下に考察する。以下の章においては、グリカンシグナルは、本発明の表の、その提案された単糖組成によって参照され、対応するｍ／ｚ値を表から読み取ることができる。
α−マンノシダーゼ感受性構造
中性Ｎ−グリカン画分のαマンノシダーゼ消化の際に減少を示した全てのグリカンシグナル（表１０および１１）は、末端α−マンノース残基を有するグリカンに対応することが示唆される。本結果は、ｈＥＳＣの中性Ｎ−グリカンの大部分が末端α−マンノース残基を有することを示す。一方、増加したシグナルはそれらの反応産物に対応する。中性Ｎ−グリカン画分中のα−マンノシル化グリカンの系列および個々のα−マンノシル化グリカンを形成する構造群を以下に詳細に考察する。
Ｈｅｘ１−９ＨｅｘＮＡｃ１グリカン系列は、Ｈｅｘ３−９ＨｅｘＮＡｃ１が消化されてＨｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ１に変換されるように消化され（データ不掲載）、それらが末端α−マンノース残基を有していたことが示唆された。それらがＨｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ１に変換されたことから、それらの実験に基づく構造は（Ｍａｎα）１−８Ｈｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ１であった。
Ｈｅｘ１−１２ＨｅｘＮＡｃ２グリカン系列は、Ｈｅｘ３−１２ＨｅｘＮＡｃ２が消化されてＨｅｘ１−７ＨｅｘＮＡｃ２に、および特に、反応前には存在しておらず、主要な反応産物であったＨｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ２に変換されるように消化された。これは、１）グリカンＨｅｘ３−１２ＨｅｘＮＡｃ２が末端α−マンノース残基を有するグリカンを含むこと、２）グリカンＨｅｘ１−７ＨｅｘＮＡｃ２がより大型のα−マンノシル化グリカンから形成され得ること、および３）グリカンＨｅｘ３−１２ＨｅｘＮＡｃ２の大部分が新規に形成されたＨｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ２に変換され、そのため実験に基づく構造（Ｍａｎα）ｎＨｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ２［式中、ｎ≧１］を有していたことを示す。α−マンノシダーゼ反応が多くのシグナルに対して部分的にしか完了しなかったという事実は、他のグリカン成分もＨｅｘ１−１２ＨｅｘＮＡｃ２グリカン系列中に含まれることを示唆する。特に、Ｈｅｘ１０−１２ＨｅｘＮＡｃ２成分は最も大型の典型的な哺乳類高マンノース型Ｎ−グリカンよりも１〜３個多いヘキソース残基を有しており、それらが（Ｇｌｃα）１−３Ｈｅｘ８ＨｅｘＮＡｃ２等のグルコシル化構造、優先的にはα２−および／またはα３−結合Ｇｌｃを含み、ならびにより優先的にはグルコシル化Ｎ−グリカンＧｌｃα３→Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇｌｃα２Ｇｌｃα３→Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２、および／またはＧｌｃα２Ｇｌｃα２Ｇｌｃα３→Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２に存在することが示唆される。対応するグルコシル化断片がα−マンノシダーゼ消化後に観察され、優先的にはＧｌｃ１−３Ｍａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２（Ｈｅｘ５−７ＨｅｘＮＡｃ２）に対応した。
Ｈｅｘ１−６ＨｅｘＮＡｃ１ｄＨｅｘ１グリカン系列は、Ｈｅｘ３−９ＨｅｘＮＡｃ１ｄＨｅｘ１が消化されてＨｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ１ｄＨｅｘ１に変換されるように消化され、それらが末端α−マンノース残基を有し、それらの実験に基づく構造が（Ｍａｎα）２−５Ｈｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ１ｄＨｅｘ１であったことが示唆された。Ｈｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ１ｄＨｅｘ１が新規シグナルとして出現し、構造（Ｍａｎα）ｎＨｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ１ｄＨｅｘ１［式中、ｎ≧１］を有するグリカンが試料中に存在していたことが示唆された。
Ｈｅｘ２−７ＨｅｘＮＡｃ３グリカン系列は、Ｈｅｘ５−７ＨｅｘＮＡｃ３が消化されて系列内の他のグリカンに変換されるように消化され、それらが末端α−マンノース残基を有していたことが示唆された。Ｈｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ３が新規シグナルとして出現し、構造（Ｍａｎα）ｎＨｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ３［式中、ｎ≧１］を有するグリカンが試料中に存在していたことが示唆された。
Ｈｅｘ２−７ＨｅｘＮＡｃ３ｄＨｅｘ１グリカン系列は、Ｈｅｘ５−７ＨｅｘＮＡｃ３ｄＨｅｘ１が消化されて系列内の他のグリカンに変換されるように消化され、それらが末端α−マンノース残基を有していたことが示唆された。Ｈｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ３ｄＨｅｘ１が有意に増加し、構造（Ｍａｎα）ｎＨｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ３ｄＨｅｘ１［式中、ｎ≧１］を有するグリカンが試料中に存在していたことが示唆された。
Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ３ｄＨｅｘ２が新規シグナルとして出現し、構造（Ｍａｎα）ｎＨｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ３ｄＨｅｘ２［式中、ｎ≧１］を有するグリカンが試料中に存在していたことが示唆された。
β−グルコサミニダーゼ感受性構造
Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ２−５およびＨｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ２−５ｄＨｅｘ１グリカン系列は、Ｈｅｘ３−５ＨｅｘＮＡｃ１ｄＨｅｘ０−１が消化されてＨｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ２ｄＨｅｘ０−１に変換されるように消化され、それらが末端β−ＧｌｃＮＡｃ残基を有し、それらの実験に基づく構造がそれぞれ（ＧｌｃＮＡｃβ→）１−３Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ２および（ＧｌｃＮＡｃβ→）１−３Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ２ｄＨｅｘ１であったことが示唆された。
Ｈｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ４、Ｈｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ４ｄＨｅｘ１、Ｈｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ４ｄＨｅｘ２、およびＨｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ５ｄＨｅｘ１も消化され、それらがそれぞれ、（ＧｌｃＮＡｃβ→）Ｈｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ３、（ＧｌｃＮＡｃβ→）Ｈｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ３ｄＨｅｘ１、（ＧｌｃＮＡｃβ→）Ｈｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ３ｄＨｅｘ２、および（ＧｌｃＮＡｃβ→）Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４ｄＨｅｘ１を含む構造を有していたことが示唆された。
Ｈｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ５ｄＨｅｘ１およびＨｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ５ｄＨｅｘ２はβ−グルコサミニダーゼにより消化され、２個のβ−ＧｌｃＮＡｃ残基をそれぞれ含むことが示された。一方、Ｈｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ５はβ−グルコサミニダーゼによって消化されなかった。
β−ヘキソサミニダーゼ感受性構造
Ｈｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ５グリカンシグナルはβ−ヘキソサミニダーゼに対して感受性であったが、β−グルコサミニダーゼには感受性ではなく、それがβ−ＧｌｃＮＡｃ以外の末端β−Ｎ−アセチルヘキソサミン残基、優先的にはβ−ＧａｌＮａｃを有するグリカン構造に対応したことが示唆された。β−ヘキソサミニダーゼ消化の際、シグナルはＨｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ３に変換され、酵素が２個のＨｅｘＮＡｃ残基を対応するグルカン構造から遊離させたことが示唆された。
β１，４−ガラクトシダーゼ感受性構造
β１，４−ガラクトシダーゼに対して感受性であったグリカンシグナルはｈＥＳＣグリカンの主要な部分を構成しており、β１，４−結合ガラクトースがｈＥＳＣの中性Ｎ−グリカンにおいて一般的な末端エピトープでることが示唆された。
Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４およびＨｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４ｄＨｅｘ１は消化されてＨｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ４およびＨｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ４ｄＨｅｘ１となり、それらがそれぞれ構造（Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ→）２Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ２および（Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ→）２Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ２ｄＨｅｘ１を有していたことが示唆された。一方、Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４ｄＨｅｘ２は消化されてＨｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ４ｄＨｅｘ２となり、それが構造（Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ→）Ｈｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ３ｄＨｅｘ２を有していたことが示唆され、Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４ｄＨｅｘ３は全く消化されなかった。まとめると、ｈＥＳＣにおいて、ヘキソース残基はＮ−グリカン構造においてβ１，４−ガラクトシダーゼの作用からデオキシヘキソース残基によって保護されている。β１，４−結合ガラクトースを有するこのようなｄＨｅｘ−保護構造としてはＧａｌβ４（Ｆｕｃα３）ＧｌｃＮＡｃおよびＦｕｃα２Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ等が挙げられる。
β−ヘキソサミニダーゼ感受性成分も有していたＨｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ５はβ１，４−ガラクトシダーゼによって消化された。まとめると、結果は、Ｈｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ５グリカンシグナルがＧａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ（ＧａｌＮＡｃβＨｅｘＮＡｃβ）Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ２等のグリカン構造を含むことを示唆する。
β１，３−ガラクトシダーゼ感受性構造
ｈＥＳＣの中性Ｎ−グリカン画分における少数の構造のみがβ１，３−ガラクトシダーゼの作用に対して感受性であったことから、末端ガラクトース残基の大部分はβ１，４−結合しているようである。
グリコシダーゼ抵抗性構造
本実験において、Ｈｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ３、Ｈｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ３ｄＨｅｘ２、およびＨｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ５は試験したエキソグリコシダーゼに対して抵抗性であった。２番目の単糖組成は１個を上回るデオキシヘキソース残基を有しており、それが、優先的にはＦｕｃα２Ｇａｌ、Ｆｕｃα３ＧｌｃＮＡｃ、および／またはＦｕｃα４ＧｌｃＮＡｃエピトープに存在する、α２−、α３−、またはα４−結合フコース残基等のｄＨｅｘ残基によってグリコシダーゼ消化から保護されていることが示唆される。
ｈＥＳＣのエキソグリコシダーゼ消化に基づいてまとめられた中性Ｎ−グリカン画分のグリカン構造を表１３に示す。
酸性Ｎ−グリカン画分
ｍＥＦ細胞層上で増殖させたｈＥＳＣの酸性Ｎ−グリカン画分を、並行したα２，３−シアリダーゼおよびＡ．ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓシアリダーゼ処理ならびにα１，３／４−フコシダーゼおよびα１，２−フコシダーゼを用いた逐次消化によって分析した。これらの反応からの結果をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって分析したものを表１２に記載する。結果は、ｈＥＳＣ試料中の複数のＮ−グリカン成分がこれらの酵素に対する特異的グリカン基質、すなわちα２，３−結合および他のシアル酸残基ならびにα１，２−およびα１，３／４−結合フコース残基を含むことを示唆した。一部のグリカンシグナルは多数のこれらのエピトープの存在を示し、例えばｍ／ｚ ２２２２におけるグリカンシグナル（ＮｅｕＡｃ１Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４ｄＨｅｘ２に対応）はこれらのエピトープの全てを、優先的には複数のグリカン構造に含むことが示唆された。ｈＥＳＣのエキソグリコシダーゼ消化に基づきまとめられた酸性Ｎ−グリカン画分のグリカン構造を表２５に示す。
ＥＢ
表１０に記載するように、胚様体（ＥＢ；表１０におけるＦＥＳ２９ ｓｔ ２）とｈＥＳＣ（表１０におけるＦＥＳ２９ ｓｔ １）との間の分化特異的変化がそれらの中性Ｎ−グリカン画分エキソグリコシダーゼ消化プロファイル中に反映されていた。異なったエキソグリコシダーゼ消化結果が、各種中性Ｎ−グリカン画分グリカンプロファイルに対応するｍ／ｚ １６８８、１７０４、１７９３、１８６６、１９５５、１９７１、２０１２、２０２８、２１４２、２１５８、および２３２０等のグリカンシグナルにおいて観察された。
ｍＥＦ
表２６および表１０の比較により、マウスフィーダー細胞（ｍＥＦ）特異的中性Ｎ−グリカン画分グリカン成分が同定され、それらを表２７に列挙する。これらのグリカン成分は本発明のｈＥＳＣまたはｈＥＦ特異的構造と比べ、さらなるヘキソース残基によって特徴付けられる。エキソグリコシダーゼ実験はβ１，４−結合ガラクトースエピトープが前記単糖組成中の任意のさらなるヘキソース残基によってβ１，４−ガラクトシダーゼ消化から保護されていることも示唆する。本発明のＮＭＲ分析結果と総合すると、表２７に記載されるように、前記のさらなるヘキソース残基は、α−結合したガラクトース残基、より具体的にはＮ−グリカン分岐中のＧａｌα３Ｇａｌエピトープを含むと示唆される。
実施例１８
ヒト間葉系幹細胞のエキソグリコシダーゼ分析
エキソグリコシダーゼ消化結果表における変化は、記録された質量スペクトルにおける相対的な変化であり、それらはグリコシダーゼ処理の結果生じたグリカンプロファイルの絶対的な変化を反映するものではない。実験手順は先の実施例に記載される。
結果
未分化ＢＭ ＭＳＣ
中性および酸性Ｎ−グリカン画分を、記載のようにＢＭ ＭＳＣから単離した。中性（表１４）および酸性（データ不掲載）グリカン画分の並行的なエキソグリコシダーゼ消化の結果を以下に考察する。以下の章においては、グリカンシグナルは、本発明の表の、それらの提案された単糖組成によって参照され、対応するｍ／ｚ値を表から読み取ることができる。
α−マンノシダーゼ感受性構造
中性Ｎ−グリカン画分のαマンノシダーゼ消化の際に減少を示した全てのグリカンシグナル（表１４）は、末端α−マンノース残基を有するグリカンに対応することが示唆される。本結果は、ＢＭ ＭＳＣの中性Ｎ−グリカンの大部分が末端α−マンノース残基を有することを示している。一方、増大したシグナルはその反応産物に対応する。中性Ｎ−グリカン画分中の一連のα−マンノシル化グリカンを形成する構造群および個々のα−マンノシル化グリカンについて以下に詳細に考察する。
Ｈｅｘ１−９ＨｅｘＮＡｃ１グリカン系列は、Ｈｅｘ３−９ＨｅｘＮＡｃ１が消化されてＨｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ１に変換されるように消化され（データ不掲載）、それらが末端α−マンノース残基を有していたことが示唆される。これらはＨｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ１に変換されたことから、それらの実験に基づく構造は（Ｍａｎα）１−８Ｈｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ１であった。
Ｈｅｘ１−１０ＨｅｘＮＡｃ２グリカン系列は、Ｈｅｘ４−１０ＨｅｘＮＡｃ２が消化されてＨｅｘ１−４ＨｅｘＮＡｃ２に、および、特に、反応前は存在しておらず、主要な反応産物であったＨｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ２に、変換されるように消化された。これは、１）グリカンＨｅｘ４−１０ＨｅｘＮＡｃ２が末端α−マンノース残基を有するグリカンを含む、２）グリカンＨｅｘ１−４ＨｅｘＮＡｃ２がより大型のα−マンノシル化グリカンから形成され得る、および、３）グリカンＨｅｘ４−１０ＨｅｘＮＡｃ２の大部分が新たに形成されたＨｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ２に変換され、そのため実験に基づく構造（Ｍａｎα）ｎＨｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ２［式中、ｎ≧１］を有する、ということを示す。α−マンノシダーゼ反応が多くのシグナルに対して部分的にしか完了しなかったとう事実は、他のグリカン成分もＨｅｘ１−１０ＨｅｘＮＡｃ２グリカン系列中に含まれるということを示唆している。特に、Ｈｅｘ１０ＨｅｘＮＡｃ２成分は１個のヘキソース残基を最大の典型的哺乳動物高マンノース型Ｎ−グリカンよりも多く有しており、それが（Ｇｌｃα→）Ｈｅｘ８ＨｅｘＮＡｃ２等のグルコシル化構造、優先的にはα３−結合Ｇｌｃを含み、および、より優先的にはグルコシル化Ｎ−グリカン（Ｇｌｃα３→）Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２に存在することが示唆される。
Ｈｅｘ１−６ＨｅｘＮＡｃ１ｄＨｅｘ１グリカン系列は、Ｈｅｘ３−９ＨｅｘＮＡｃ１ｄＨｅｘ１が消化されてＨｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ１ｄＨｅｘ１に変換されるように消化され、それらが末端α−マンノース残基を有しており、その実験に基づく構造は（Ｍａｎα）２−５Ｈｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ１ｄＨｅｘ１であったことが示唆された。Ｈｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ１ｄＨｅｘ１は新たなシグナルとして現れ、構造（Ｍａｎα）ｎＨｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ１ｄＨｅｘ１［式中、ｎ≧１］を有するグリカンが試料中に存在していたことをが示唆された。
Ｈｅｘ２−７ＨｅｘＮＡｃ３グリカン系列は、Ｈｅｘ６−７ＨｅｘＮＡｃ３が消化されて該系列の他のグリカンに変換されるように消化され、それが末端α−マンノース残基を有していたことが示唆された。Ｈｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ３は新たなシグナルとして現れ、構造（Ｍａｎα）ｎＨｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ３［式中、ｎ≧１］を有するグリカンが試料中に存在していたことをが示唆された。
Ｈｅｘ２−７ＨｅｘＮＡｃ３ｄＨｅｘ１グリカン系列は、Ｈｅｘ６−７ＨｅｘＮＡｃ３ｄＨｅｘ１が消化されて該系列の他のグリカンに変換されるように消化され、それが末端α−マンノース残基を有していたことが示唆された。Ｈｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ３ｄＨｅｘ１は新たなシグナルとして現れ、構造（Ｍａｎα）ｎＨｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ３ｄＨｅｘ１［式中、ｎ≧１］を有するグリカンが試料中に存在していたことをが示唆された。
Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ３ｄＨｅｘ２およびＨｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ４は新たなシグナルとして現れ、それぞれ構造（Ｍａｎα）ｎＨｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ３ｄＨｅｘ２および（Ｍａｎα）ｎＨｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ４［式中、ｎ≧１］を有するグリカンが試料中に存在していたことをが示唆された。
β−グルコサミニダーゼ感受性構造
Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ２−５ｄＨｅｘ１グリカン系列は、Ｈｅｘ３−９ＨｅｘＮＡｃ１ｄＨｅｘ１が消化されてＨｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ１ｄＨｅｘ１に変換されるように消化され、それが末端α−マンノース残基を有していたことが示唆され、その実験に基づく構造が（Ｍａｎα）２−５Ｈｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ１ｄＨｅｘ１であったことが示唆された。Ｈｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ１ｄＨｅｘ１は新たなシグナルとして現れ、構造（Ｍａｎα）ｎＨｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ１ｄＨｅｘ１［式中、ｎ≧１］を有するグリカンが試料中に存在していたことをが示唆された。しかし、Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ６ｄＨｅｘ１は消化されず、それがβ結合ＧｌｃＮＡｃ残基以外の末端ＨｅｘＮＡｃ残基を有していたことが示唆された。
Ｈｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ３およびＨｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ３ｄＨｅｘ１は消化されてＨｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ２およびＨｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ２ｄＨｅｘ１となり、それらがそれぞれ構造（ＧｌｃＮＡｃβ→）Ｈｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ２および（ＧｌｃＮＡｃβ→）Ｈｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ２ｄＨｅｘ１を有していたことが示唆された。
Ｈｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ４ｄＨｅｘ１、Ｈｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ４ｄＨｅｘ２、Ｈｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ５ｄＨｅｘ２、およびＨｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ５ｄＨｅｘ１も消化され、それらがそれぞれ、（ＧｌｃＮＡｃβ→）Ｈｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ３ｄＨｅｘ１、（ＧｌｃＮＡｃβ→）Ｈｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ３ｄＨｅｘ２、（ＧｌｃＮＡｃβ→）Ｈｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ４ｄＨｅｘ２、および（ＧｌｃＮＡｃβ→）Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４ｄＨｅｘ１を有していたことが示唆された。
β１，４−ガラクトシダーゼ感受性構造
β１，４−ガラクトシダーゼに感受性だったグリカンシグナルは、ＢＭ ＭＳＣグリカンの大きな割合を構成しており、β１，４−結合ガラクトースがＢＭ ＭＳＣ中性Ｎ−グリカンにおける一般的な末端エピトープであることが示唆された。
Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４およびＨｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４ｄＨｅｘ１は消化されてＨｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ４および Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ４ｄＨｅｘ１となり、それらがそれぞれ構造（Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ→）２Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ２および（Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ→）２Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ２ｄＨｅｘ１を有していたことが示唆された。一方、Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４ｄＨｅｘ２は消化されてＨｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ４ｄＨｅｘ２となり、それがそれぞれ構造（Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ→）Ｈｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ３ｄＨｅｘ２を有していたことが示唆され、Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４ｄＨｅｘ３は全く消化されなかった。まとめると、ＢＭ ＭＳＣにおいて、ｎ−１ヘキソース残基は、Ｎ−グリカン構造Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４ｄＨｅｘｎ［式中、０≦ｎ≦３］中において、デオキシヘキソース残基により、β１，４−ガラクトシダーゼの作用から保護されている。β１，４−結合ガラクトースを有するこのようなｄＨｅｘ保護構造としては、Ｇａｌβ４（Ｆｕｃα３）ＧｌｃＮＡｃおよびＦｕｃα２Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ等が挙げられる。
同様に、Ｈｅｘ６ＨｅｘＮＡｃ５、Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ５ｄＨｅｘ１、Ｈｅｘ６ＨｅｘＮＡｃ５、およびＨｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ５ｄＨｅｘ１が消化されてＨｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ５、Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ５ｄＨｅｘ１、およびＨｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ６ｄＨｅｘ１となり、それらがそれぞれ構造（Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ→）３Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ２、（Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ→）２Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ３ｄＨｅｘ１、および（Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ→）３Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ３ｄＨｅｘ１を有することが示唆された。一方、Ｈｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ５ｄＨｅｘ２、Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ５ｄＨｅｘ３、Ｈｅｘ６ＨｅｘＮＡｃ５ｄＨｅｘ２、およびＨｅｘ６ＨｅｘＮＡｃ５ｄＨｅｘ３は消化されず、これらの構造中のヘキソース残基がデオキシヘキソース残基により保護されていたことが示唆された。β１，４−結合ガラクトースを有するこのようなｄＨｅｘ保護構造としては、Ｇａｌβ４（Ｆｕｃα３）ＧｌｃＮＡｃおよびＦｕｃα２Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ等が挙げられる。しかし、Ｈｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ５ｄＨｅｘ３は消化され、それが１または複数個の末端β１，４−結合ガラクトース残基を有していたことが示唆された。
Ｈｅｘ７ＨｅｘＮＡｃ３、Ｈｅｘ６ＨｅｘＮＡｃ３ｄＨｅｘ１、Ｈｅｘ６ＨｅｘＮＡｃ３、およびＨｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ３ｄＨｅｘ１は消化されてＨｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ３およびＨｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ３ｄＨｅｘ１等の産物となり、それらがそれぞれ構造（Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ→）Ｈｅｘ５−６ＨｅｘＮＡｃ２および（Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ→）Ｈｅｘ４−５ＨｅｘＮＡｃ３ｄＨｅｘ１を有することが示唆された。Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ３、およびＨｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ３ｄＨｅｘ１の相対量が増加し、それらがそれぞれ、（Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ→）Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ２および（Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ→）Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ２ｄＨｅｘ１の産物であったことが示唆された。
β１，３−ガラクトシダーゼ感受性構造
ＢＭ ＭＳＣ中性Ｎ−グリカン画分中の少数の構造のみがβ１，３−ガラクトシダーゼの作用に対し感受性であることから、末端ガラクトース残基の大部分はβ１，４−結合しているようである。β１，３−ガラクトシダーゼ感受性グリカンに対応するグリカンシグナルとしてはＨｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ５ｄＨｅｘ１およびＨｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ５ｄＨｅｘ３等が挙げられる。
グリコシダーゼ抵抗性構造
本実験において、Ｈｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ３ｄＨｅｘ２、Ｈｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ３ｄＨｅｘ２、およびＨｅｘ１１ＨｅｘＮＡｃ２は試験したエキソグリコシダーゼに対し抵抗性であった。最初の２つの提案された単糖組成は２つ以上のデオキシヘキソース残基を有しており、それらが、優先的にはＦｕｃα２Ｇａｌ、Ｆｕｃα３ＧｌｃＮＡｃ、および／またはＦｕｃα４ＧｌｃＮＡｃエピトープに存在する、α２−、α３−、またはα４−結合フコース残基等の第２のｄＨｅｘ残基によりグリコシダーゼ消化から保護されていることが示唆される。最後の提案された単糖組成は、２個のヘキソース残基を最大の典型的哺乳動物高マンノース型Ｎ−グリカンよりも多く有しており、それが（Ｇｌｃα→）２Ｈｅｘ９ＨｅｘＮＡｃ２等のグルコシル化構造を、より優先的にはジグルコシル化Ｎ−グリカン（ＧｌｃαＧｌｃα→）Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２中に存在するものを有していることが示唆される。
ＢＭ ＭＳＣのエキソグリコシダーゼ消化に基づいてまとめられた中性Ｎ−グリカン画分グリカン構造を表１５に示す。
骨芽細胞分化ＢＭ ＭＳＣ
骨芽細胞分化ＢＭ ＭＳＣの分析を、ＣＢ ＭＳＣにおける分化特異的変化の比較ができるように表１６に示す。ＢＭ ＭＳＣおよび骨芽細胞分化ＢＭ ＭＳＣに対して生成されたエキソグリコシダーゼプロファイルはこれら２つの細胞型に特徴的である。例えば、ｍ／ｚ １３３９、１７８４、および２４６６のシグナルはこの２つの実験において異なって消化される。特に、骨芽細胞分化ＢＭ ＭＳＣにおけるβ１，３−ガラクトシダーゼ感受性中性Ｎ−グリカンシグナルは、分化した細胞が未分化細胞よりも多くのβ１，３−結合ガラクトース残基を有することを示唆する。
ＢＭ ＭＳＣの酸性Ｎ−グリカン画分に対して行われたシアリダーゼ分析は、該酸性Ｎ−グリカン画分中のシアル化（ＮｅｕＡｃまたはＮｅｕＧｃ含有）Ｎ−グリカンに基づき、提案された単糖組成を支持した。
エキソグリコシダーゼによるＣＢ ＭＳＣ中性グリカンの分析
β１，４−ガラクトシダーゼおよびβ−グルコサミニダーゼによる分析の結果を表１７に示す。結果は、ＣＢ ＭＳＣにおいても、非還元末端β１，４−結合ガラクトース残基を有する中性Ｎ−グリカンが豊富であり、それらは、観察されたグリカンシグナルのほとんどに対して特徴的非還元末端エピトープの存在を示唆する。ＢＭ ＭＳＣに対して上記に記載されたものと同様に、脂肪細胞分化ＣＢ ＭＳＣの分析を、ＣＢ ＭＳＣにおける分化特異的変化の比較ができるように表１８に示す。
ＣＢ ＭＳＣの酸性Ｎ−グリカン画分に対して行われたシアリダーゼ分析は、該酸性Ｎ−グリカン画分中のシアル化（ＮｅｕＡｃまたはＮｅｕＧｃ含有）Ｎ−グリカンに基づき、提案された単糖組成を支持した。
実施例１９
ヒト胚幹細胞上で式（Ｉ）のグリカン構造を発現するサブセットの単離
細胞の培養および継代
正常な核型を有するＦＥＳ ｈＥＳＣ株を得て、Ｍｉｋｋｏｌａ ｅｔ ａｌ．（２００６；Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ，ＢＭＣ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．２００６；６：４０）に記載されるように増殖させた。
ヒトＥＳＣを、有糸分裂を不活性化した一次マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー層上で、ルーチン維持（ｒｏｕｔｉｎｅ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ）のために維持する。細胞を組織培養処理ディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）内で増殖させる。細胞を、１０ｍｇ／ｍｌ コラゲナーゼ５分間による前処理、または炎で伸ばした（ｆｉｒｅ ｐｕｌｌｅｄ）パスツールピペットを用いた手作業での剥離のいずれかを用い、６日ごとに継代する。
免疫細胞化学をルーチン維持された接着性ｈＥＳＣコロニーに対して行い、本発明の抗体、レクチンまたはグリコシダーゼに対して染色されたルーチン維持されたｈＥＳＣコロニーを用いてフローサイトメトリーを行う。
式（Ｉ）のグリカン構造を発現する幹細胞の濃縮
ＦＡＣＳ分析を、本質的にＶｅｎａｂｌｅ ｅｔ ａｌ．（２００５）の記載のように行うが、代わりに生細胞およびＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）セルソーター（ＢＤ）を用いる。
コラゲナーゼおよび細胞解離液（Ｓｉｇｍａ）を用いてヒトＥＳＣを回収し、単細胞懸濁液とする。次いで、細胞を、滅菌されたチューブにそれぞれ１０６細胞ずつに分けて入れ、１：１００溶液のＧＦ抗体の１つを用いて染色する。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次いで二次抗体（抗ヤギマウスＩｇＧまたはＩｇＭ ＦＩＴＣ結合）で染色する。染色されないＦＥＳをコントロールとして用いる。ＦＩＴＣ陽性細胞を細胞培地中に回収する（＋４℃において）（ＢＤの説明書に従う）。
次に、細胞をＭＥＦまたはＨＨＦフィーダー層上に置き、クローンまたは細胞系統に対してモニターする。未分化ステージを確認するため、選別された細胞の遺伝子発現をリアルタイムＰＣＲで分析する。
または、ＦＡＣＳで濃縮された細胞をゼラチン上で自発的に分化させる。免疫組織化学を各種組織特異的抗体を用いてＭｉｋｋｏｌａ ｅｔ ａｌ．（２００６）に記載されるように行うか、またはＰＣＲによって分析する。
実施例２０
プロテアーゼ感受性および非感受性抗体標的構造の解明
上記実施例中に記載された骨髄間葉系幹細胞をＦＡＣＳ分析により分析した。細胞がトリプシンにより処理（培養から解放）されると、細胞表面抗原のＦＡＣＳ分析において、いくつかの抗原構造は本質的に観察されないか、またはこれらは減少した量で観察されるが、Ｖｅｒｓｅｎｅ処理（ＰＢＳ中の０．０２％ＥＤＴＡ）後には観察可能である。これは例えば、大部分のトリプシンに感受性の標的構造である抗体ＧＦ３５４およびＧＦ２７５による、ならびに標的構造が事実上完全にトリプシン感受性である抗体ＧＦ３０２による、間葉系幹細胞の標識により観察された。
実施例２１
特異的結合剤標的構造を有するプロテアーゼ遊離糖ペプチドの単離および分析
糖ペプチドをトリプシン等のプロテアーゼによる幹細胞の処理によって遊離させる。糖ペプチドをクロマトグラフ的に単離し、好ましい方法はＳｕｐｅｒｄｅｘ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ（ＧＥ））カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ｐｅｐｔｉｄｅまたはｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５）におけるゲル濾過クロマトグラフィーを使用し、ペプチドは、該ペプチドを特異的標識でタギングすることにより、または該ペプチド（またはグリカン）の紫外吸光度により、クロマトグラフィー内で観察することができる。前記方法のための好ましい試料としては比較的多量（数百万細胞）の間葉系幹細胞等が挙げられ、本実施例で用いられる好ましい抗体としては、抗体ＧＦ３５４、ＧＦ２７５もしくはＧＦ３０２、または同様の特異性を有する抗体もしくはレクチン等の他の結合剤が挙げられる。
次に、単離された糖ペプチドを固定化抗体（例えばＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａのシアンプロミド（ｃｙａｎｏｇｅｎｓ ｐｒｏｍｉｄｅ）活性化カラムに固定化した抗体（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｄｉｖｉｓｉｏｎまたはＰｉｅｒｃｅカタログに記載のように固定化された抗体）のカラムに通す。結合する、および／または、弱く結合し、クロマトグラフ的に遅延する画分を、標的ペプチド画分として回収する。高親和性結合の場合、グリカンを、抗体の標的エピトープに対応する１００〜１０００ｍＭの単糖または単糖群を用いて、または単糖もしくはオリゴ糖の混合物により、および／または５００〜１０００ｍＭ ＮａＣｌ等の高塩濃度を用いて、溶出する。糖ペプチドをグライコプロテオミクス法により、分子量を得るために質量分析を用いて、ならびに好ましくは糖ペプチドのペプチドおよび／またはグリカンをシーケンシングするためにフラグメンテーション質量分析も用いて、分析する。
別の方法においては、糖ペプチドを結合剤アフィニティークロマトグラフィーによる単一のアフィニティークロマトグラフィー工程により単離し、質量分析により分析する。これはＷａｎｇ Ｙ ｅｔ ａｌ．（２００６） Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １６（６）５１４−２３等の記載と本質的に同様に行うが、しかし、レクチンアフィニティークロマトグラフィーは、固定化抗体、例えばこの実施例における上記の好ましい抗体または結合剤によるアフィニティークロマトグラフィーで置き換えられる。
実施例２２
レクチン被覆培養プレート上でのヒト胚幹細胞の増殖
ＦＥＳ３０ ｈＥＳＣ株を用いた。ｈＥＳＣをｍＥＦからマトリゲル（商標）に移し、Ｇｅｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｒｏｎ．ｃｏｍ／ｓｈｏｗｐａｇｅ．ａｓｐ？ｃｏｄｅ＝ｐｒｏｄｓｔｐｒｏｔに見出されるプロトコルに従い培養した。
全ての継代はコラゲナーゼを用いて行った。継代はコラゲナーゼ処理無しにＰＢＳを用いても行った。
細胞をＥＣＡ被覆１２ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移し、ｍＥＦ馴化培地中で５〜１１日間培養し、その後それらを１：２または３：４に分けた。ＲＮＡ試料を２回または３回の継代ごとに抽出し、幹細胞および分化マーカーの発現を分析した（図３１）。
結果
細胞は、ＥＣＡ被覆およびマトリゲル（商標）被覆プレート上で、同様の効率で、顕微鏡観察された際に同様の形態を伴って、増殖した。分析された幹細胞および分化マーカーの発現プロファイルは類似していた（図３１参照）。
細胞はＥＣＡ被覆プレート上で、マトリゲル（商標）被覆プレート上におけるよりも均一に増殖し、増殖密度の明瞭なバッチ間変異は見られなかった。それらは小さなコロニーを形成し、これはマトリゲルとは異なっていた。コロニーはフィーダー細胞上で増殖したｈＥＳＣによって形成されるものよりも小さかった。
実施例２３
ｈＥＳＣ（ＦＥＳ２９細胞、継代（ｐ）３６）を、プラスチック上で、またはＥＣＡ、ＵＥＡ１、ＤＳＡ、またはガレクチン−１の存在下で、図３２および３３に示す期間の間、ならびに実施例２２に記載されるように、増殖させた。
ＥＣＡ（ＥＹ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ；Ｌ−５９０１−５）コーティングを、１２ウェルプレートに対して次の通り行った。ＥＣＡレクチンは１ｍｇ／ｍｌのストック溶液として凍結保存した。これを氷上で溶かし、層フード（ｌａｍｉｎａｒ ｈｏｏｄ）内でフィルター滅菌（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ，ＳＬＧＶ ０１３ ＳＬ，０．２２μｍ）された１００μｌレクチンストック ＋６００μｌ ＰＢＳとして希釈した。この溶液、すなわち１００μｇ／７００μｌ ＰＢＳ溶液を各ウェルに加え、一晩、＋４Ｃでインキュベートした。翌日、レクチン溶液を除去し、ウェルを３ｘ１ｍｌ滅菌ＰＢＳで洗浄した。
材料および方法
ヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）
２つのフィンランド人ヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）株、ＦＥＳ２９およびＦＥＳ３０を用いて、レクチン被覆ウェル（Ｍｉｋｋｏｌａ Ｍ．ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．６：４０，２００６に記載される）上で培養中のｈＥＳＣを分析した。
ｈＥＳＣを、レクチン上へのプレーティングの前にマトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）上でフィーダー細胞無しに少なくとも２回の継代の間培養した。マトリゲル培養をレクチン培養と並行して比較のために継続した。細胞は、実験全体にわたる間、マウスフィーダー細胞上で２４時間馴化した、２０％ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）血清代替物および８ｎｇ／ｍｌの組み替え塩基性ＦＧＦを含む標準Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）ＤＭＥＭ培地（全てＧｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫから；Ｍｉｋｋｏｌａ Ｍ．ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．６：４０，２００６）中で培養した。細胞は分割時にコラゲナーゼＩＶで剥離した。
レクチンコーティング
レクチンをＰＢＳ中に希釈し、Ｎｕｎｃｌｏｎ細胞培養プレート（Ｎｕｎｃ， Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）上に加える前にフィルター滅菌した。レクチンの量は２７μｇ／ｃｍ２であり、プレートは一晩、＋４℃でインキュベートした。細胞をレクチン上に分割する前に、ウェルを３回ＰＢＳで洗浄した。
結果および考察
ＥＣＡレクチン上での培養
ＦＥＳ３０ ｈＥＳＣをマトリゲルからＥＣＡ、ＭＡＡ、ＷＦＡおよびＰＷＡレクチン上に分割した。ＥＣＡ上でのみ細胞が増殖し、さらに分割することができた。ＦＥＳ３０細胞は全部で２３回の継代の間ＥＣＡ上で培養された。ＥＣＡ培養は、他のｈＥＳＣ株ＦＥＳ２９を用いて６回の継代の間確認した。
ＥＣＡ上で培養したｈＥＳＣは形態学的に変化しており、分化しているように見え、典型的なｈＥＳＣのコロニーを形成していなかった。ＥＣＡ培養は「フィーダー様」細胞に有利なようであり、多能性マーカー、Ｔｒａ−１−６０およびＳＳＥＡ−３の発現も減少した。ＦＥＳ２９細胞をＥＣＡ上での５回の継代後にマトリゲルに分けて戻し、マトリゲル上で５〜６回継代した後で、細胞は典型的なｈＥＳＣコロニーを再び形成し始めた。従って、ｈＥＳＣはＥＣＡ上で２０回超の継代の間維持することができ、それらは典型的なｈＥＳＣ培養とは異なって見えても典型的な未分化ｈＥＳＣとして増殖する能力を失っていない。
他のレクチン上での培養
ＦＥＳ２９ ｈＥＳＣは、マウスフィーダー細胞馴化培地中のＵＥＡ−１、ＤＳＡおよびウシガレクチン−１上でも７回の継代の間維持された。ｈＥＳＣは形態学的に、これらのレクチン上で、ＥＣＡ上と同様に見えた。７回の継代後、これら３種のレクチンの中ではガレクチン−１培養の細胞がＴｒａ−１−６０およびＳＳＥＡ−３の最も多い発現量を有していたが、その発現量は少なかった（それぞれ２１．６％および３２．３％）。
実施例２４
イーストにおける、組み替えＥｒｙｔｈｒｉｎａ ｃｒｉｓｔａｇａｌｌｉ凝集素（ＥＣＡ）およびその非グリコシル化型の発現および精製
Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓのコドン選択で最適化された合成ヌクレオチド配列を、ジーンバンクアクセッション番号ＡＹ１５８０７２（Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ ｃｒｉｓｔａｃａｌｌｉ凝集素遺伝子の部分コード配列）に従って構築した。天然アミノ酸配列（図３８；遺伝子配列番号８９９）および非グリコシル化型（図３９；遺伝子配列番号９００）の両者をコードする遺伝子を構築した。ＤＮＡ合成および遺伝子構築はＧｅｎｅＡｒｔ ＡＧからの商業サービスとして得た。
組み替えＥＣＡ（ｒＥＣＡ）および非グリコシル化組み替えＥＣＡ（ｎｇＥＣＡ）のための合成配列を、標準的なクローニング手順により、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ発現ベクターｐＢＬＵＲＡ−ＳＸ（Ｌｉｎ Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．２００１，Ｇｅｎｅ ２６３：１５９−１６９）に、単一クローニング工程で、制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩ／ＫｐｎＩで切断した断片としてクローニングした。配列はＡＯＸ１プロモーターおよびＡＯＸ１ ３’ＵＴＲ領域の調節下に置き、合成されたタンパク質の標的を増殖培地とするＭＡＴａ分泌シグナルとともに正確な読み枠に配列を合わせた。標準的な手順により、相同組み替えによって発現ベクターをＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓに移した。組み替えタンパク質の発現を、同様に、一般的に知られる標準的な手順に従って行った。イースト細胞を、グリセロール含有培地上で、＋３０℃を超えない適当な温度下で対数期まで培養し、回収し、光学濃度Ａ６００＝１で誘導培地に入れた。誘導をメタノールの添加により達成した。
ｒＥＣＡおよびｎｇＥＣＡの両者を、濃縮したタンパク質発現培養上清から、次の工程により精製した：１．硫安沈殿（３０〜６０％沈殿、Ｉｇｌｅｓｉａｓ ｅｔ ａｌ．１９８２，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２３，２４７−２５２から採用）、２．結合バッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８、１ｍＭ ＭｎＣｌ２、１ｍＭ ＣａＣｌ２；Ｓｔａｎｃｏｍｂｅ ｅｔ ａｌ． ２００３，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ．３０，２８３−２９２から採用）への透析、３．ラクトースアフィニティークロマトグラフィー（下記参照）、４．水への透析、５．凍結乾燥。ラクトースラクトースアフィニティークロマトグラフィーはＳｔａｎｃｏｍｂｅ ｅｔ ａｌ．（２００３）から採用し、変更を加えた。Ｌａｃ−アガロースを親和性マトリクス（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）として用い、洗浄を結合バッファーで行い、結合したＥＣＡを結合バッファー中の０．３Ｍラクトースで溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図４０）により検出されたＥＣＡを含む画分をプールし、透析および凍結乾燥した。精製したタンパク質は、ラクトースアガロースに対する親和性により活性があると決定され、ＳＤＳーＰＡＧＥ（図４０、レーン３）により本質的に純粋であると決定された。
実施例２５
ＥＣＡのグリカンの酸化およびビオチン化
ＥＣＡ、Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ ｃｒｉｓｔａｇａｌｌｉレクチンをＰＢＳ中に溶解した。ＥＣＡ試料の濃度は、０，７％の試料をＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬカラム上でサイズ排除クロマトグラフィーにかけて測定した。ＥＣＡ試料の濃度は０，７％のＥＣＡ試料のＵＶ吸光度をＢＳＡ標準に対して比較することにより０，３１μｇ／μｌと決定された。
ＥＣＡ試料のグリカンを、メタ過ヨウ素酸ナトリウムを最終反応濃度８ｍＭで添加することにより酸化した。反応混合物を＋４℃で暗所下、一晩インキュベートした。反応を、最終反応濃度８ｍＭのエチレングリコールを用いて２時間で未反応過ヨウ素酸塩を破壊することにより停止した。反応混合物をＰＤ−１０脱塩カラム上で精製した。修飾されたＥＣＡを３，５ｍｌのＰＢＳで溶出した。
ＥＣＡの酸化したグリカンを、ビオチン−アミドヘキサン酸ヒドラジン（Ｓｉｇｍａ、Ｍｗ＝３７１，５ｇ／ｍｏｌ）を最終反応濃度０，２８ｍＭで添加することによりビオチン化した。反応混合物を室温で一晩インキュベートした。試料溶液をＰＤ−１０脱塩カラムにかけた。修飾されたＥＣＡを３，５ｍｌのＰＢＳで溶出した。２，５％の試料をＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬカラム上でサイズ排除クロマトグラフィーにかけ、修飾されたＥＣＡの存在および量を決定した。修飾されたＥＣＡは天然ＥＣＡ二量体と同じ画分中に溶出した。酸化−ビオチン化反応の収率は７０％超であった。修飾されたＥＣＡのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルはｍ／ｚ ２９２３６を中心とする分子イオン［Ｍ＋Ｎａ］＋を示したが、天然ＥＣＡはｍ／ｚ ２７５４５を中心とする分子イオン［Ｍ＋Ｎａ］＋を示し、４〜５個のビオチン／ＥＣＡ分子の付加が示唆された。分析において分解産物は検出されなかった。
各種ＥＣＡ型を用いた細胞培養
先の実施例に記載のように、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を増殖させ、マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＫｎｏｃｋｏｕｔ血清代替細胞培養培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に移し、馴化させ、その後それらを、並行した実験において、各種の型のＥＣＡ：天然ＥＣＡ（ＥＹ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ； Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、タンパク質ビオチン化ＥＣＡ（ＥＹ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、またはグリカンビオチン化ＥＣＡ（上記参照）、で吸着被覆された細胞培養プレート（マトリゲル表面を置換）上に移した。細胞増殖の水準、幹細胞マーカーの発現および幹細胞特異的な形態学的特徴を何回かの継代の間追跡することにより、グリカンビオチン化ＥＣＡは、ｈＥＳＣ培養を支持することに関して、天然ＥＣＡ（＋＋）またはタンパク質ビオチン化ＥＣＡ（＋＋）よりも優れている（＋＋＋）と結論された。増殖支持能力は括弧内の−、＋、＋＋、または＋＋＋（増殖無し＝−から、優れた増殖＝＋＋＋まで）により評価された。
実施例２６
ＭＳＣ
細胞試料
間葉系幹細胞試料
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）をＬｅｓｋｅｌａ ｅｔ ａｌ． （Ｌｅｓｋｅｌａ Ｈ， Ｒｉｓｔｅｌｉ Ｊ， Ｎｉｓｋａｎｅｎ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｆｒｏｍ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ｄｅｃｒｅａｓｅ ａｔ ｌａｔｅ ａｄｕｌｔｈｏｏｄ； Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ３１１：１００８−１０１３，２００３）に記載のように生成した。簡単に述べると、整形外科手術中に得られた骨髄を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０％ ＦＣＳ、１ｘペニシリン−ストレプトマイシンおよび２ｍＭ Ｌ−グルタミン（全てＧｉｂｃｏから）を添加した最小必須アルファ培地（α−ＭＥＭ）中で培養した。２日間の細胞接着期の後、細胞をＣａ２＋およびＭｇ２＋不含ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で洗浄し、レクチン分子で被覆された２４ウェルチャンバースライド上の同一の培地内で２０００〜３０００細胞／ｃｍ２の密度で継代培養した。細胞を３７℃で５％ ＣＯ２の下、クラウンであり、新鮮な培地を週２回、ほぼコンフルエントになるまで交換した。ＭＳＣをレクチン被覆ウェルプレート上で５回の継代にわたり培養した。継代５〜１０のＭＳＣを実験に用いた。
ＭＳＣ培養アッセイに用いた分子
Figure 2010516239
フローサイトメトリー
継代５の増殖しているＭＳＣを各種レクチン上で５日間増殖させた。細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｖｅｒｓｅｎｅ溶液により回収して単細胞懸濁液とした。剥離した細胞を６００ ｘ ｇで５分間、室温において遠心分離した。細胞ペレットを２回、０．３％ ＢＳＡ−ＰＢＳで洗浄し、６００ ｘ ｇで遠心分離し、０．３％ ＢＳＡ−ＰＢＳ中に再懸濁した。細胞を５００００細胞ずつに分けてコニカルチューブに入れた。分割した細胞を、抗体と共に、２μｌ／１０５細胞の希釈で、３０分間、４℃で、暗所にてインキュベートした。インキュベート後、細胞を０．３％ ＢＳＡ−ＰＢＳで洗浄し、遠心分離し、０．３％ ＢＳＡ−ＰＢＳ中に再懸濁した。
未標識細胞およびプラスチックで増殖した細胞をコントロールとして用いた。抗体結合をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＡｒｉａ， Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で検出した。データ分析はＦＡＣＳＤｉｖａ（商標） Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０２を用いて行った。
表．ＭＳＣの分析に用いた抗体およびそれらの蛍光標識
Figure 2010516239
ＲＮＡ精製および定量的逆転写（ＲＴ）−ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
選択されたレクチン上で５回の継代にわたり増殖させたＢＭ由来間葉系幹細胞からの全細胞ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉｐｒｅｐ−ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を用いて、製品の使用説明書に従って抽出した。次に、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、製品の使用説明書に従ってＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、ＴａｑＭａｎ（登録商標） ＰＣＲ反応の鋳型として用いた。
ＴａｑＭａｎ（登録商標） ＰＣＲ反応を用いて幹細胞分化マーカーの量的な水準を推定した。ＴａｑＭａｎ（登録商標） ＰＣＲ反応は標準的な条件の下、ＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＰｒｅ−ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ Ｉｎｖｅｎｔｏｒｅｄ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ＦＡＢＰ４（Ｈｓ００６０９７９１＿ｍ１）およびＲＵＮＸ２（Ｈｓ００２３１６９２＿ｍ１）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。
リアルタイム定量ＰＣＲ反応を、標準的な条件でＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７０００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて行った。ＰＣＲ増幅は、１μｌのｃＤＮＡ試料を含む全量５０μｌで行った。ＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を全ての実験に用いた。Ｐｒｅ−ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ Ｉｎｖｅｎｔｏｒｅｄ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ＦＡＢＰ４（Ｈｓ００６０９７９１＿ｍ１）およびＲＵＮＸ２（Ｈｓ００２３１６９２＿ｍ１）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて幹細胞分化マーカーの量的な水準を推定した。ＶＩＣレポーター色素で標識された内在性コントロールヒトＴＡＴＡボックス結合遺伝子のためのＰｒｅ−ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ試薬（Ｈｓ ９９９９９９＿ｍ１９）をコントロール遺伝子の増幅のために用いた。
ＰＣＲは２分間５０℃から開始し、最初の１０分間の変性温度は９４℃であり、その後１５秒間の変性ならびに１分間のアニーリングおよび伸長（６０℃）を全部で４０サイクル行った。
結果
各種レクチン上で増殖させたＭＳＣ細胞の相対的遺伝子発現量
我々の結果は、レクチン上で増殖させたＭＳＣが、骨原性分化マーカーＲＵＮＸ２を、プラスチック上で増殖させた同一の細胞よりも少なく発現することを示す。しかし、これらの細胞は、以下に示すように、脂質生成マーカー脂肪酸結合タンパク質４（ＦＡＢＰ４）を、プラスチック上で増殖させた細胞と比べてやや多く発現する。
Figure 2010516239
データは、レクチンが細胞の未分化状態を大部分維持することを示している。シアル化構造、特にＮｅｕＮＡｃα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃに対するＭＡＡの特異性を有するレクチン、およびＮ−アセチルラクトサミンＧａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ結合を示すガレクチン−１／ＥＣＡが、ｅｓｐｅであり、脂肪細胞方向への一部の分化の誘導に対して好ましいが、Ｎ−グリカンコア特異的レクチンＣｏｎ Ａは未分化状態の維持に対して最も好ましい。本発明は、末端マンノース特異的ＨＨＡレクチンも細胞の分化していない状態を支持する能力を有することを示す。本結果は、細胞を分化させる必要がある場合においてＣｏｎ Ａが動物間葉系幹細胞の培養に特に有用であろうことを示す他の結果とは対照的であると考えられる。
他の実験において、間葉系幹細胞の分化に対するＨＬＡ−ＤＲマーカーが測定され、ＭＡＡとともにＣｏｎ Ａも最低値を示した。この研究は、２つの還元末端の末端フコースエピトープを認識するレクチンＰＳＡおよびＬｃＨＡ／ＬＣＡを含み、これらもＣｏｎＡとは明瞭な相違、またはいくらか増加したＨＬＡ−ＤＲ値を示す。データは、グリカン中央部（ｍｉｄｇｌｙｃａｎ）を認識するｃｏｎＡがヒト間葉系幹細胞の活性化において異なっていることを示す。好ましい一態様において、本発明は、細胞の未分化状態の維持のための、表面上に固定化されたｃｏｎ Ａ Ｎ−グリカン認識型レクチン；および、分化を誘導する条件における、または条件のための、末端エピトープ認識レクチン；を用いた、ヒト間葉系幹細胞の培養に関する。
実施例２７
レクチンのｈＥＳＣ細胞の培養
図３２に、Ａ 継代ｐ４およびｐ６のｈＥＳＣ細胞を、それぞれＥＣＡレクチンまたはマトリゲル上で増殖させたものを示す。４回の継代後、ＦＡＳ分析は、ＥＣＡ培養細胞に対する胚幹細胞マーカーＴｒａ−１−６０ ３２％およびＳＳＥＡ３ ８３％を示し、一方マトリゲル上での値は４９％および７９％であった。Ｃ、継代ｐ５。Ｄ、ＥＣＡ上での培養のためのマーカーおよびｈＥＳＣ（ＦＥＳ２９ ｐ３６）のＦＡＣＳ分析。Ｅ、マトリゲルｐ４対マトリゲルｐ２＋ＥＣＡのＦＡＣＳ分析。
図３３に、マトリゲルｐ３およびレクチンｐ１上で増殖させたＦＥＳ２９ ｐ３８細胞を示す。ＦＡＣＳ：Ｔｒａ−１−６０ ７０％およびＳＳＥＡ３ ８９％。Ｂ、レクチン上で増殖させた細胞の継代４の像。ＵＥＡ、ＤＳＡおよびガレクチン。
各種レクチンおよびその誘導体上におけるｈＥＳＣ細胞の培養
本実施例は、Ｎ−グリコシル化部位変異組み替えＥＣＡが細胞培養条件下で効果的に機能することを明らかにする。他のＮ−アセチルラクトサミン認識レクチンＤＳＡ ｊａ ガレクチン−１も効果的であり、同様にＦｕｃα２Ｇａｌｂ４ＧｌｃＮＡｃ認識ＵＥＡレクチンとして、ＵＥＡ−１は最初はＬａｃＮＡｃ特異的レクチンほど効果的ではなかった。初期の細胞接着および増殖は、末端を認識しないがＮ−グリカンコアエピトープを認識するレクチンＰＨＡ−Ｅに対しては弱かった。可溶性ガレクチンは細胞増殖を支持することができず、可溶性ＥＣＡもプラスチックコントロールより悪かったため、レクチンの固定化は非常に重要である。他の特異性を有するレクチン（ＭＡＡ、ＷＦＡおよびＰＷＡ）は効果的ではなかった。
Figure 2010516239
ＥＣＡ型および複合体の比較
データは、グリカンビオチン化ＥＣＡが、ランダムにタンパク質をビオチン化したレクチンよりも効果的であることを示す。初期接着のアッセイは、接着だけでは効果的な細胞培養に対して十分ではないことを示す。
Figure 2010516239
ＵＥＡ−１、ＤＳＡおよびガレクチン−１培養細胞の幹細胞マーカー水準
データは、これらのレクチン上においては、初期低下後にＭａｔｇｅｌ培養に匹敵する値を生ずるＥＣＡレクチンと比べ、マーカーが減少することを示した。
Figure 2010516239
表１
臍帯血細胞集団、臍帯血単核球（ＣＢ ＭＮＣ）、および末梢血単核球（ＰＢ ＭＮＣ）の中性Ｎ−グリカンの分類。
Figure 2010516239
表２ 臍帯血ＣＤ３４＋およびＣＤ３４−細胞の中性Ｎ−グリカン画分のエキソグリコシダーゼプロファイリング。α−Ｍａｎ、β１，４−Ｇａｌ、β１，３−Ｇａｌ、およびβ−ＧｌｃＮＡｃは、本文中に記載される特異的エキソグリコシダーゼ酵素を示す。プロファイリング結果の記号は、反応前のプロファイルと比較した際のものであり；＋＋＋：新規シグナルの出現；＋＋：シグナルの有意な増加；＋：シグナルの増加；−：シグナルの減少；−−：シグナルの有意な減少；−−−：シグナルの消失；空白：変化無し。
Figure 2010516239
表３ 臍帯血ＣＤ１３３＋およびＣＤ１３３−細胞の中性Ｎ−グリカン画分のエキソグリコシダーゼプロファイリング。α−Ｍａｎ、β１，４−Ｇａｌ、β１，３−Ｇａｌ、およびβ−ＧｌｃＮＡｃは、本文中に記載される特異的エキソグリコシダーゼ酵素を示す。プロファイリング結果の記号は、反応前のプロファイルと比較した際のものであり；＋＋＋：新規シグナルの出現；＋＋：シグナルの有意な増加；＋：シグナルの増加；−：シグナルの減少；−−：シグナルの有意な減少；−−−：シグナルの消失；空白：変化無し。
Figure 2010516239
表４ 臍帯血Ｌｉｎ＋およびＬｉｎ−細胞の中性Ｎ−グリカン画分のエキソグリコシダーゼプロファイリング。
Figure 2010516239
表５
臍帯血ＣＤ１３３＋およびＣＤ１３３−細胞から単離されたシアル化Ｎ−グリカンに対するα２，３−シアリダーゼ処理の異なる影響。中性Ｎ−グリカンの列は、列挙されるシアル化Ｎ−グリカンに対応する中性Ｎ−グリカンがＣＤ１３３＋細胞Ｎ−グリカンの分析では出現するがＣＤ１３３−細胞Ｎ−グリカンでは出現しないことを示す。括弧外の提案されたグリカン組成は、ＣＤ１３３＋細胞のシアル化Ｎ−グリカンのα２，３−シアリダーゼ消化後の中性Ｎ−グリカン画分において認められる。
Figure 2010516239
表６
試料の提案された中性Ｎ−グリカンの分類；ｈＥＳＣ、ヒト胚幹細胞株、株１〜４、ＥＢ、ｈＥＳＣ株３および４由来の胚様体、ｓｔ．３ ３、ｈＥＳＣ株３からのステージ３分化細胞、ＨＥＦ フィーダー細胞として用いたヒト線維芽細胞。
Figure 2010516239
表７
試料の提案されたシアル化Ｎ−グリカンの分類；ｈＥＳＣ、ヒト胚幹細胞株、株２〜４、ＥＢ、ｈＥＳＣ株３由来の胚様体、ｓｔ．３ ３、ｈＥＳＣ株３からのステージ３分化細胞、ＨＥＦ フィーダー細胞として用いたヒト線維芽細胞。
Figure 2010516239
表８
ヒト臍帯血単核球の逐次酵素修飾工程における、単糖組成ＮｅｕＡｃ１−２Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４ｄＨｅｘ０−３を有するシアル化Ｎ−グリカンの質量分析の結果。列は、修飾反応前の（ＭＮＣ）、α２，３−シアル酸転移酵素反応後の（α２，３ＳＡＴ）、および逐次的α２，３−シアル酸転移酵素およびα１，３−フコース転移酵素反応後の（α２，３ＳＡＴ＋α１，３ＦｕｃＴ）相対グリカンシグナル強度（表中のシグナルの％）を示す。明瞭性のため、各列におけるグリカンシグナル強度の合計を１００％に対して標準化した。
Figure 2010516239
表９
ヒト臍帯血単核球の酵素修飾工程における、選択された中性Ｎ−グリカンの質量分析の結果。列は、修飾反応前の（ＭＮＣ）、広範なシアリダーゼ反応後の（ＳＡ’ｓｅ）、α２，３−シアル酸転移酵素反応後の（α２，３ＳＡＴ）、α１，３−フコース転移酵素反応後の（α１，３ＦｕｃＴ）、および逐次的α２，３−シアル酸転移酵素およびα１，３−フコース転移酵素反応後の（α２，３ＳＡＴ＋α１，３ＦｕｃＴ）相対グリカンシグナル強度（全グリカンシグナルの％）を示す。
Figure 2010516239
表１０
ｍＥＦ上で増殖させたｈＥＳＣ株ＦＥＳ２９のエキソグリコシダーゼ分析の結果。
Figure 2010516239
表１１
ｈＥＦおよび胚様体（ＥＢ、ｓｔ ２）上で増殖させたｈＥＳＣ株ＦＥＳ２９（ｓｔ １）のエキソグリコシダーゼ分析の結果。
Figure 2010516239
表１２
Figure 2010516239

Figure 2010516239

Figure 2010516239

１）記号：＋＋＋ 出現した新規シグナル、＋＋ 高度に増加した相対シグナル強度、＋＋ 増加した相対シグナル強度、− 減少した相対シグナル強度、−− 大きく減少した相対シグナル強度、−−− 消失したシグナル、空白：変化無し。
表１３
Figure 2010516239

Figure 2010516239

＊［Ｍ＋Ｎａ］＋イオン、第１の同位体。
§“→”は、残りの構造内の単糖への結合を表す；“［］”は、構造内の分岐を表す。
＃本発明による単糖組成に基づく好ましい構造群。ＨＩ、高マンノース；ＬＯ、低マンノース；Ｓ、可溶性マンノシル化；ＨＦ、フコシル化高マンノース；Ｇ、グルコシル化高マンノース；ＨＹ、ハイブリッド型または単分岐；ＣＯ、複合型；Ｆ、フコシル化；ＦＣ、複雑なフコシル化；Ｎ＝Ｈ、末端ＨｅｘＮＡｃ（ＨｅｘＮＡｃ＝Ｈｅｘ）；Ｎ＞Ｈ、末端ＨｅｘＮＡｃ（ＨｅｘＮＡｃ＞Ｈｅｘ）。
表１４
Figure 2010516239
表１５
Figure 2010516239

Figure 2010516239

＊［Ｍ＋Ｎａ］＋イオン、第１の同位体。
§“→”は、残りの構造内の単糖への結合を表す；“［］”は、構造内の分岐を表す。
＃本発明による単糖組成に基づく好ましい構造群。ＨＩ、高マンノース；ＬＯ、低マンノース；Ｓ、可溶性マンノシル化；ＨＦ、フコシル化高マンノース；Ｇ、グルコシル化高マンノース；ＨＹ、ハイブリッド型または単分岐；ＣＯ、複合型；Ｆ、フコシル化；ＦＣ、複雑なフコシル化；Ｎ＝Ｈ、末端ＨｅｘＮＡｃ（ＨｅｘＮＡｃ＝Ｈｅｘ）；Ｎ＞Ｈ、末端ＨｅｘＮＡｃ（ＨｅｘＮＡｃ＞Ｈｅｘ）。
表１６
Figure 2010516239
表１７
Figure 2010516239
表１８
Figure 2010516239
表１９
実施例１４も参照。
Figure 2010516239

Figure 2010516239

＋＝陽性、（＋）＝弱陽性、（＋／−）＝単一の陽性細胞、−＝陰性；ＮＴ＝試験されず；＊＝結果がＦＡＣＳ分析によって確認された、＊＊＝特定の細胞バッチにおいてより高い結合または結合細胞が観察され、本発明においてはこれらのマーカーに関する。
表２０
Figure 2010516239
表２１
Figure 2010516239

１）染色／標識の等級付け：＋＋＋ 非常に強い、＋＋ 強い、＋ 低い、＋／− ほとんど検出されない、− 標識されない。
表２２
４つのｈＥＳＣ株ＦＥＳ２１、ＦＥＳ２２、ＦＥＳ２９、およびＦＥＳ３０の提案された単糖組成に基づくＮ−グリカンの構造的特徴の分析。数字は、中性（Ａ〜Ｅ）もしくは酸性（Ｊ〜Ｌ）Ｎ−グリカンプールのいずれかからの、またはハイブリッド／単分岐および複合型Ｎ−グリカンの亜画分（Ｎ≧３、Ｆ〜ＩおよびＭ〜Ｐ）からの、パーセンテージを示す。ＥＢ２９およびＥＢ３０：それぞれｈＥＳＣ株ＦＥＳ２９およびＦＥＳ３０由来の胚様体；ｓｔ．３ ２９：ｈＥＳＣ株ＦＥＳ２９由来のステージ３分化細胞。Ｈ：ヘキソース；Ｎ：Ｎ−アセチルヘキソサミン；Ｆ：デオキシヘキソース。
Figure 2010516239
表２３ ｈＥＳＣおよびＭＥＦにおけるレクチンリガンドプロファイルの比較
Figure 2010516239
＋ 細胞表面に存在
− 細胞表面に存在しない
表２４
各種固定化レクチン表面上で増殖させたＢＭ ＭＳＣの結果のまとめ。増殖率＝３日目の細胞の数／１日目の細胞の数。３重反復を計算に用いた。プラスチックと対比した効果：‘ｎ．ｇ．’＝増殖無し；‘−’＝遅い増殖速度；‘＋’＝プラスチック上よりも速い増殖速度；‘（）’ プラスチックとほぼ等しい。
Figure 2010516239
表２５
Figure 2010516239

Figure 2010516239

Figure 2010516239

Figure 2010516239

＊［Ｍ＋Ｈ］−イオン、第１の同位体。
＃本発明による単糖組成に基づく好ましい構造群。ＨＹ、ハイブリッド型または単分岐；ＣＯ、複合型；Ｆ、フコシル化；ＦＣ、複雑なフコシル化；Ｎ＝Ｈ、末端ＨｅｘＮＡｃ（ＨｅｘＮＡｃ＝Ｈｅｘ）；Ｎ＞Ｈ、末端ＨｅｘＮＡｃ（ＨｅｘＮＡｃ＞Ｈｅｘ）；ＳＰ、硫酸および／またはリン酸エステル；“（）”はグリカンシグナルが他の構造型も含むことを示す。
表２６
ｈＥＳＣから検出された酸性Ｏ−グリカンシグナル。
Figure 2010516239
表２７
Figure 2010516239

＊［Ｍ＋Ｎａ］＋イオン、第１の同位体。
§“→”は、残りの構造内の単糖への結合を表す；“［］”は、構造内の分岐を表す。
＃本発明による単糖組成に基づく好ましい構造群。ＨＩ、高マンノース；ＬＯ、低マンノース；Ｓ、可溶性マンノシル化；ＨＦ、フコシル化高マンノース；Ｇ、グルコシル化高マンノース；ＨＹ、ハイブリッド型または単分岐；ＣＯ、複合型；Ｆ、フコシル化；ＦＣ、複雑なフコシル化；Ｎ＝Ｈ、末端ＨｅｘＮＡｃ（ＨｅｘＮＡｃ＝Ｈｅｘ）；Ｎ＞Ｈ、末端ＨｅｘＮＡｃ（ＨｅｘＮＡｃ＞Ｈｅｘ）。
表２８
Figure 2010516239

１）幹細胞および分化した細胞型は本文書の他の部分におけるように省略される；ｓｔ．３はステージ３に分化した、優先的にはニューロン型に分化した細胞を示す；脂肪／骨はＭＳＣから脂肪細胞または骨芽細胞方向に分化した細胞を示す。
２）複合糖質における、ならびに／または特にＮ−グリカン（Ｎ）、Ｏ−グリカン（Ｏ）、および／もしくはスフィンゴ糖脂質（Ｌ）における、末端エピトープの存在。記号：ｑ、定性的データ；＋／−、低発現；＋、一般的；＋＋、多量。
表２９
Figure 2010516239
ａ）本定量分析中に含まれない。
参考文献
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Ｓｋｏｔｔｍａｎ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ
Ｓｔａｕｄａｃｈｅｒ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０７（３）：９８７−９３
Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５−７
Ｖｅｎａｂｌｅ ｅｔ ａｌ．（２００５）ＢＭＣ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ．

Claims (113)

  1. 非造血幹細胞の調節または培養のための方法であって：（ｉ）少なくとも１個の幹細胞または幹細胞集団を提供すること；ならびに（ｉｉ）前記の少なくとも１個の幹細胞または幹細胞集団を、非還元末端の末端および還元末端の末端グリカン構造から選択される末端グリカン構造を結合する１または複数種の結合剤と接触させること；を含む方法。
  2. さらに（ｉｉｉ）前記細胞を、所望の刺激、状態変化または増殖を達成するに十分な期間インキュベートすること、またはｉｉｉ）幹細胞の増殖が実質的に分化を伴わずに起こる場合に幹細胞を培養すること、を含む、請求項１記載の方法。
  3. 前記結合剤がタンパク質またはポリペプチド結合剤であり、末端単糖エピトープＧａｌβ、ＧａｌＮＡｃβ、ＧｌｃＮＡｃβ、ＭａｎαまたはＦｕｃαまたはシアル酸α、好ましくはＮｅｕ５ＡｃαまたはＮｅｕ５Ｇｃαの群から選択される１または複数種の末端グリカン構造を認識する、請求項１記載の方法。
  4. 前記の１または複数種の結合剤が１または数種の末端β−結合Ｈｅｘ（ＮＡｃ）ｎを認識し、式中、ｎは０または１であり、ＨｅｘはＧａｌまたはＧｌｃであり、ただしＨｅｘがＧｌｃである場合、ｎは１であり：末端Ｇａｌβ、ＧａｌＮＡｃβ、またはＧｌｃＮＡｃβを含む、請求項１記載の方法。
  5. 前記の１または複数種の結合剤が１または数種の末端非還元末端α−結合ピラノシド残基Ｍａｎα Ｆｕｃα、またはシアル酸α、好ましくはＮｅｕ５ＡｃまたはＮｅｕ５Ｇｃを認識する、請求項１記載の方法。
  6. 前記の１または複数種の結合剤が幹細胞または幹細胞群上の末端グリカン構造を認識する、請求項１記載の方法。
  7. 前記の１または複数種の結合剤が表面に付着する、請求項１記載の方法。
  8. 幹細胞がヒト胚幹細胞であり、本質的にフィーダー細胞を含まず、または幹細胞はヒト間葉系幹細胞である、請求項１記載の方法。
  9. ヒト胚幹細胞が、好ましくはＥＣＡ、ガレクチン、ＤＳＡおよびＵＥＡ−１の群から選択される、（Ｆｕｃα２）ｎＧａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ［式中、ｎは０または１である］を認識するレクチンとの接触の下で培養される、請求項８記載の方法。
  10. 前記細胞が未分化状態で２０回の継代の間維持される、請求項９記載の方法。
  11. 幹細胞がヒト間葉系幹細胞である、請求項１記載の方法。
  12. 幹細胞の状態の変化の調節が、接着、形態、増殖速度または分化を含む、請求項１または２に記載の方法。
  13. 前記結合剤が、抗体、レクチン、グリコシダーゼ、糖転移酵素およびそれらの断片からなる群より選択されるポリペプチドである、請求項１記載の方法。
  14. 前記結合剤がレクチン、好ましくは植物レクチンである、請求項１記載の方法。
  15. 前記グリカン構造が式ＣＣ０
    ［ＳＡ］ｐＨｅｘ（ＮＡｃ）ｎβ４［ＦｕｃαＸ］ｍＧｌｃＮＡｃβＲ
    ［式中、ｎ、ｍ、およびｐは独立に０または１であり
    Ｘは３または６のいずれかの結合位置であり、
    ＨｅｘはＧａｌまたはＧｌｃであり
    ＳＡは伸長する単一またはオリゴ糖構造、
    好ましくはシアル酸であり、これは好ましくはＳＡα３、もしくはＳＡα６であって、好ましいシアル酸型はＮｅｕ５ＡｃまたはＮｅｕ５Ｇｃであり、または、Ｎ−グリカンコア構造Ｍａｎα３［Ｍａｎα６］Ｍａｎβ４であって、ここでＭａｎα残基はさらに１つまたはいくつかのＧｌｃＮＡｃβ２またはＬａｃＮＡｃβ２等の複合型末端構造により伸長されていてよく、Ｒは任意の伸長単糖残基構造であって、好ましくはＮ−アセチルラクトサミンの／ラクトシル−セラミド等の糖脂質の／Ｏ−グリカンの／３／６Ｇａｌ（ＮＡｃ）、またはＮ−グリカンの２Ｍａｎ、または、Ｈｅｘ（ＮＡｃ）がＧｌｃＮＡｃである場合の潜在的な結合コアタンパク質／ペプチドを表すＡｓｎ−（ペプチド）０または１であり、ただしｍが１であり、Ｘが６である場合、ｎは１であり、およびＨｅｘはＧｌｃであり、およびＳＡはＮ−グリカンコア構造Ｍａｎα３［Ｍａｎα６］Ｍａｎβまたはその伸長バリアントであり、ｎが１であり、ＨｅｘがＧａｌである場合、ｐは０である］
    によるものである、請求項１記載の方法。
  16. 前記末端構造がＧａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、Ｆｕｃα２Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ４（Ｆｕｃα３）ＧｌｃＮＡｃ、およびＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ＧｌｃＮＡｃからなる群より選択される、請求項１５記載の方法。
  17. 前記結合剤がＥＣＡ、ＰＷＡ、ＷＦＡ、ＭＡＡ、ＳＮＡ、ＵＥＡ、ＬＴＡおよびＰＳＡからなる植物レクチン群から選択される、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
  18. 前記幹細胞がヒト間葉系幹細胞である、請求項１５〜１７のいずれかに記載の方法。
  19. 前記間葉系幹細胞が本質的に未分化の形態で維持される、請求項１８記載の方法。
  20. 前記結合剤が短縮された末端エピトープＧｌｃＮＡｃβまたはＭａｎα、好ましくはＧＳＡＩＩまたはＮＰＡを認識する植物レクチン群から選択される、請求項１記載の方法。
  21. 前記グリカン構造が式ＣＣ１：
    ［ＳＡ］ｐＨｅｘ（ＮＡｃ）ｎβ４［Ｆｕｃα６］ｍＧｌｃＮＡｃβＲ
    ［式中、ｎ、ｍ、およびｐは独立に０または１であり、ＨｅｘはＧａｌまたはＧｌｃであり、
    ＳＡは伸長する単−またはオリゴ糖構造、
    好ましくはシアル酸であり、これは好ましくはＳＡα３であって、好ましいシアル酸型はＮｅｕ５ＡｃまたはＮｅｕ５ＧｃまたはＮ−グリカンコア構造Ｍａｎα３［Ｍａｎα６］Ｍａｎβ４であって、ここで前記Ｍａｎα残基はさらに１つまたはいくつかのＧｌｃＮＡｃβ２またはＬａｃＮＡｃβ２等の複合型末端構造により伸長されていてよく、Ｒは任意の伸長単糖残基構造であって、好ましくはＮ−アセチルラクトサミンの／ラクトシル−セラミド等の糖脂質の／Ｏ−グリカンの／３／６Ｇａｌ（ＮＡｃ）、または、Ｎ−グリカンの２Ｍａｎ、またはＨｅｘ（ＮＡｃ）がＧｌｃＮＡｃである場合の潜在的な結合コアタンパク質／ペプチドを表すＡｓｎ−（ペプチド）０または１であり、
    ただし、ｍが１である場合、ｎは１であり、およびＨｅｘはＧｌｃであり、およびＳＡはＮ−グリカンコア構造Ｍａｎα３［Ｍａｎα６］Ｍａｎβまたはその伸長バリアントであり、
    ｎが１であり、ＨｅｘがＧａｌである場合、ｐは０である］
    によるものである、請求項１記載の方法。
  22. 前記構造がＧａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃ、およびＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ＧｌｃＮＡｃからなる群より選択される、請求項２１記載の方法。
  23. 前記結合剤がＥＣＡ、ＰＳＡ、ＰＷＡ、ＭＡＡ、およびＷＦＡからなる植物レクチン群より選択される、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
  24. 前記グリカン構造が式ＣＣ２：
    ［ＳＡ］ｐＧａｌ（ＮＡｃ）ｎβ４ＧｌｃＮＡｃβＲ、
    ［式中、残っており
    ｐおよびｎは独立に０または１であり
    ＳＡはシアル酸ＳＡα３であり、好ましいシアル酸型はＮｅｕ５ＡｃまたはＮｅｕ５Ｇｃ、より好ましくはＮｅｕ５Ａｃであり、ｎが１であり、ＨｅｘがＧａｌである場合、ｐは０である］
    によるものである、請求項１記載の方法。
  25. 前記構造がＧａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、およびＧａｌＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃからなる群より選択される、請求項２４記載の方法。
  26. 前記グリカン構造が式ＣＣ３
    Ｍａｎα３［Ｍａｎα６］Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ＧｌｃＮＡｃβＲ
    ［式中、Ｍａｎα残基はさらに１つまたはいくつかのＧｌｃＮＡｃβ２、またはＬａｃＮＡｃβ２、またはＬａｃＮＡｃの末端シアル化バリアント、好ましくはＧａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、等の複合型末端構造により伸長されてよく、Ｒは任意にＡｓｎ−（ペプチド）０または１であり、潜在的な結合コアタンパク質／ペプチドを示す］
    によるものである、請求項１記載の方法。
  27. 前記構造が、
    ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ＧｌｃＮＡｃβ
    ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ＧｌｃＮＡｃβＡｓｎ、Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ＧｌｃＮＡｃ、Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ＧｌｃＮＡｃβＲ、
    Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ＧｌｃＮＡｃβＡｓｎ、
    Ｍａｎα３［Ｍａｎα６］Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ＧｌｃＮＡｃβ、
    Ｍａｎα３［ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６］Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ＧｌｃＮＡｃβ、
    ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３［Ｍａｎα６］Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ＧｌｃＮＡｃβ、および
    ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３［ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６］Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ＧｌｃＮＡｃβ
    からなる群より選択される、請求項２６記載の方法。
  28. 前記結合物質がレクチンＧＳ ＩＩまたはＬＴＡと同一のエピトープに結合する、請求項１記載の方法。
  29. 前記レクチンがＥＣＡ、ＰＳＡ、ＰＷＡ、ＭＡＡ、ＷＦＡ、ＧＳ ＩＩおよびＬＴＡからなる群より選択される、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
  30. 前記の少なくとも１個の幹細胞が：身体の全ての組織型の細胞へと分化することができる、全能性；身体の多数の細胞へと分化することができるが全てではない、多能性；の群より選択される特徴を有するか、またはそれは限られた組織型へと分化することができる前駆細胞である、請求項１記載の方法。
  31. 前記幹細胞が；全能性幹細胞は胚幹細胞、非胚幹細胞（ｅｘｔｒａｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、クローン化された幹細胞、および単為生殖由来細胞からなる群より選択される；多能性幹細胞は造血幹細胞、脂肪幹細胞、間葉系幹細胞、臍帯血幹細胞、および胎盤幹細胞からなる群より選択される；前駆幹細胞は神経、肝臓、腎形成、脂質生成、骨芽、破骨、肺胞、心臓、腸、および内皮前駆細胞からなる群より選択される；群より選択される、請求項３０記載の方法。
  32. 前記胚幹細胞が、ステージ特異的胚抗原（ＳＳＥＡ）３、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１、Ｏｃｔ−３／４、Ｃｒｉｐｔｏ、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）受容体、ポドカリキシン様タンパク質（ＰＯＤＸＬ）、ならびにヒトテロメラーゼ逆転写酵素からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーを発現する、請求項３１記載の方法。
  33. 前記細胞が請求項９または１０に従って増殖させられる、請求項３２記載の方法。
  34. 前記間葉系幹細胞がＳＴＲＯ−１、ＣＤ１０５、ＣＤ５４、ＣＤ１０６、ＨＬＡ−Ｉマーカー、ビメンチン、ＡＳＭＡ、コラーゲン−１、およびフィブロネクチンからなるがＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１１７、および造血細胞ではないマーカーの群より選択される少なくとも１種のマーカーを発現するか、またはＲＵＮＸ ｏｒの少ない発現量を有する、請求項３０記載の方法。
  35. 前記細胞が請求項１８または１９に従って増殖させられる、請求項３４記載の方法。
  36. さらに細胞培養培地、少なくとも１種の増殖因子を添加した細胞培養培地、または馴化培地を含む、請求項１記載の方法。
  37. 前記の少なくとも１種の増殖因子が、ＷＮＴシグナル伝達アゴニスト、ＴＧＦ−ｂ、ｂＦＧＦ、ＩＬ−６、ＳＣＦ、ＢＭＰ−２、トロンボポエチン、ＥＰＯ、ＩＧＦ−１、ＩＬ−１１、ＩＬ−５、Ｆｌｔ−３／Ｆｌｋ−２リガンド、フィブロネクチン、ＬＩＦ、ＨＧＦ、ＮＦＧ、アンギオポイエチン様２および３、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｔｐｏ、Ｓｈｈ、Ｗｎｔ−３ａ、Ｋｉｒｒｅ、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項３６記載の方法。
  38. 前記馴化培地が、マウスフィーダー細胞馴化培地およびヒトフィーダー細胞馴化培地からなる群より選択される、請求項３６記載の方法。
  39. 前記培地が、Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ （ＲＰＭＩ−１６４０）、ダルベッコ修飾必須培地（ＤＭＥＭ）、イーグル修飾必須培地（ＥＭＥＭ）、Ｏｐｔｉｍｅｍ、およびＩｓｃｏｖｅ培地からなる群より選択される、請求項３６記載の方法。
  40. 前記表面が、プレート、ディッシュ、バッグ、ロッド、ペレット、ファイバー、粒子およびメッシュからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
  41. 前記粒子が、ビーズ、ミクロスフィア、ナノ粒子、およびコロイド粒子からなる群より選択される、請求項４０記載の方法。
  42. 前記表面が、ガラス、シリカ、シリコン、コラーゲン、ヒドロキシアパタイト、ヒドロゲル、ＰＴＦＥ、ポリプロピレン、ポリスチレン、ナイロン、デキストラン、およびポリアクリルアミドからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
  43. 前記表面が生体適合性、天然、合成であるか、またはポリマーを含む、請求項１記載の方法。
  44. 前記ポリマーが、ポリエステル、ポリエーテル、ポリアンヒドリド（ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅｓ）、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリオルトエステル、ポリホスファゼン、ポリ酢酸ビニル、ブロック共重合体、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、およびポリウレタンからなる群より選択される、請求項４３記載の方法。
  45. 前記生体適合性表面が、コラーゲン、金属、ヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミン酸塩、バイオセラミック材料、ヒアルロン酸ポリマー、アルギン酸塩、アクリル酸エステルポリマー、乳酸ポリマー、グリコール酸ポリマー、乳酸／グリコール酸ポリマー、精製タンパク質、精製ペプチド、および細胞外マトリクス組成物からなる群より選択される、請求項４３記載の方法。
  46. 前記結合剤が前記表面に共有結合的に、非共有結合的に、静電的に、または疎水的に付着する、請求項１記載の方法。
  47. 少なくとも１個の幹細胞または幹細胞集団が、培養において、２０、４０、または１００回の継代後に実質的に未分化のままである、請求項２記載の方法。
  48. 結合剤と接触させられる前記の少なくとも１個の幹細胞が、薬剤を用いて分化するように誘導される、請求項４７記載の方法。
  49. 少なくとも１個の幹細胞の拡張を誘導することができる前記薬剤が、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−７、ｆｌｔ−３Ｌ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｅｐｏ、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−２０、ＶＥＧＦ、アクチビン−Ａ、ＩＧＦ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＬＩＦ、ＰＤＧＦ、および骨形成タンパク質ファミリーのメンバーからなる群より選択される、請求項４８記載の方法。
  50. 多分化能または多能性ヒト胚幹細胞の精製された調製物であって、前記細胞が：（ｉ）内胚葉、中胚葉、および外胚葉組織の派生物に分化する能力、（ｉｉ）正常な核型、（ｉｉｉ）少なくとも約１０回の継代の間、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養において増殖する能力を有し、ならびに（ｉｖ）請求項１記載の方法から得られる、調製物。
  51. 前記細胞が、結合剤と接触した際、本質的に分化を阻害される、請求項５０記載の調製物。
  52. 前記結合剤が、抗体、抗体断片、レクチン、およびグリコシダーゼからなる群より選択される、請求項５０記載の調製物。
  53. 前記結合剤がレクチンである、請求項２２記載の調製物。
  54. 前記レクチンがＥＣＡ、ＰＳＡ、ＰＷＡ、ＭＡＡ、ＷＦＡ、ＧＳ ＩＩおよびＬＴＡからなる群より選択される、請求項５３記載の調製物。
  55. 前記調製物が、培養において、２０、４０、または１００回の継代後に実質的に未分化のままである、請求項５０記載の調製物。
  56. 前記調製物が動物で生成された抗体または血清に曝露されていない、請求項５０記載の調製物。
  57. 前記細胞がＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４マーカーに対して陽性である、請求項５０記載の調製物。
  58. 前記細胞がＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１マーカーに対して陽性である、請求項５０記載の調製物。
  59. 前記細胞が、懸濁培養にかけられたか、または免疫無防備状態の動物に移植された際に、胚様体を形成することができる、請求項５０記載の調製物。
  60. 請求項１に従って得ることができる、幹細胞の集団または少なくとも１個の幹細胞。
  61. 前記細胞または細胞群が幹細胞マーカーを少なくとも２０回の継代の間維持する、請求項５０記載の幹細胞の集団または少なくとも１個の幹細胞。
  62. 式Ｔ１
    Figure 2010516239

    ［式中、Ｘは結合位置であり Ｒ１、Ｒ２、およびＲ６はＯＨもしくはグリコシド結合した単糖残基シアル酸、好ましくはＮｅｕ５Ａｃα２もしくはＮｅｕ５Ｇｃ α２、最も好ましくはＮｅｕ５Ａｃα２であり、またはＲ３、はＯＨまたはグリコシド結合した単糖残基Ｆｕｃα１（Ｌ−フコース）またはＮ−アセチル（Ｎ−アセトアミド、ＮＣＯＣＨ３）であり；Ｒ４、はＨ、ＯＨまたはグリコシド結合した単糖残基Ｆｕｃα１（Ｌ−フコース）であり、Ｒ４がＨである場合、Ｒ５はＯＨであり、Ｒ４がＨではない場合、Ｒ５はＨであり；Ｒ７はＮ−アセチルまたはＯＨであり、Ｘは前記細胞からの天然オリゴ糖主鎖構造、好ましくはＮ−グリカン、Ｏ−グリカンもしくは糖脂質構造であり；またはｎが０である場合、Ｘは無であり、Ｙはリンカー基、好ましくはＯ−グリカンおよびＯ−結合末端オリゴ糖および糖脂質のための酸素、ならびにＮ−グリカンのためのＮ、またはｎが０である場合、無であり；Ｚは担体構造、好ましくは細胞により産生された天然担体であり、例えばタンパク質または脂質であって、好ましくは担体上のセラミドもしくは分岐グリカンコア構造、またはＨであり；アーチはガラクトピラノシルからの結合が左側の残基の３位または４位いずれかに対するものであること、およびＲ４構造が他の４または３位にあることを表し；ｎは０または１の整数であり、ｍは１〜１０００、好ましくは１〜１００、および最も好ましくは１〜１０の整数（担体上のグリカンの数）であり、ただしＲ２およびＲ３のうち１つはＯＨまたはＲ３はＮ−アセチルであり、左側の第１の残基が右側の残基の４位に結合する場合、Ｒ６はＯＨであり：ＸはＧａｌα４Ｇａｌβ４Ｇｌｃではなく、（ＳＳＥＡ−３または４のコア構造）またはＲ３はフコシルである］
    の幹細胞上のグリカン構造を認識することができる結合剤の群より選択される結合剤を選択する工程を含む方法。
  63. 前記グリカン構造が式Ｔ２
    Figure 2010516239

    ［式中、Ｒ１〜Ｒ６を含む変数は式Ｔ１に対して記載されるものと同様である］
    によるものである、請求項６２記載の方法。
  64. 前記グリカン構造が式Ｔ３
    Figure 2010516239

    ［式中、Ｒ１〜Ｒ７を含む変数は式Ｔ１に対して記載されるものと同様である］
    によるものである、請求項６２記載の方法。
  65. 前記グリカン構造が式Ｔ４：
    Ｇａｌβ１−ｘＨｅｘ（ＮＡｃ）ｐ、 （Ｔ４）
    ［ｘは結合位置３または４であり、
    および、ＨｅｘはＧａｌまたはＧｌｃであり
    ただしｐは０または１であり、ｘが結合位置３である場合、ｐは１であり、ＨｅｘＮＡｃはＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃであり、および、ｘが結合位置４である場合、ＨｅｘはＧｌｃである。コアＧａｌβ１−３／４エピトープは、１または２個の構造ＳＡαまたはＦｕｃαにより、任意に水酸基に置換され、ここでＳＡはシアル酸である］
    のグリカン構造である、請求項６２記載の方法。
  66. 前記細胞調製物が胚性幹細胞または非造血成体幹細胞調製物である、請求項６２記載の方法。
  67. （ｉ）少なくとも１個の幹細胞または幹細胞集団を提供すること；および（ｉｉ）前記の少なくとも１個の幹細胞または幹細胞集団を、グリカン構造を結合する１または複数種の結合剤と接触させること、を含み、前記結合剤はＭａｎα結合レクチンＦＲＩＬ群レクチンもしくは同様な特異性を有するレクチンまたは造血幹細胞の培養のために用いられる他のレクチンではなく、または前記結合剤は共有結合的に表面に付着する、造血幹細胞の調節または培養のための方法。
  68. 前記結合剤が上記請求項のうちいずれかに記載される特異性を有する、請求項６４記載の方法。
  69. 前記調節が前記細胞の分化を伴う、請求項６７および６８のいずれかに記載の方法。
  70. 前記結合物質がＧＦ２８７、ＧＦ２７９、ＧＦ２８８、ＧＦ２８４、ＧＦ２８３、ＧＦ２８６、ＧＦ２９０、ＧＦ２８９、ＧＦ２７５、ＧＦ２７６、ＧＦ２７７、ＧＦ２７８、ＧＦ２９７、ＧＦ２９８、ＧＦ３０２、ＧＦ３０３、ＧＦ３０５、ＧＦ３０７、ＧＦ３５３、およびＧＦ３５４からなる群より選択される抗体と同一のエピトープに結合する、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
  71. 前記結合物質がＧＦ２８７、ＧＦ２７９、ＧＦ２８８、ＧＦ２８４、ＧＦ２８３、ＧＦ２８６、ＧＦ２９０、およびＧＦ２８９、ＧＦ２７５、ＧＦ２７６、ＧＦ２７７、ＧＦ２７８、ＧＦ２９７、ＧＦ２９８、ＧＦ３０２、ＧＦ３０３、ＧＦ３０５、ＧＦ３０７、ＧＦ３５３、およびＧＦ３５４からなる群より選択される、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
  72. 前記タンパク質が、少なくとも部分的に２つの単糖構造および前記単糖残基間の結合構造を認識する高特異性結合剤である、請求項１３記載の方法。
  73. 保存された増殖する能力を有するが、本発明の幹細胞を本発明の結合剤との接触の下で培養することを含む、分化状態における阻害を有し、ここで任意に前記結合剤は表面に付着する、幹細胞。
  74. 前記細胞が全能性幹細胞、多能性幹細胞、および前駆幹細胞からなる群より選択される、請求項７３記載の方法。
  75. 最初にある期間結合剤との接触の下で培養され、次いで第２の／異なる結合剤を含んだ第２の培養液中およびサイトカインまたは増殖因子の同一のまたは各種の混合物中で培養される、請求項７３記載の細胞。
  76. 任意に少なくとも１種の、幹細胞を支持するまたはその分化を誘導することが知られる、ＷＮＴシグナル伝達アゴニスト、ＴＧＦ−ｂ、ｂＦＧＦ、ＩＬ−６、ＳＣＦ、ＢＭＰ−２、トロンボポエチン、ＥＰＯ、ＩＧＦ−１、ＩＬ−１１、ＩＬ−５、Ｆｌｔ−３／Ｆｌｋ−２リガンド、フィブロネクチン、ＬＩＦ、ＨＧＦ、ＮＦＧ、アンギオポイエチン様２および３、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｔｐｏ、Ｓｈｈ、Ｗｎｔ−３ａ、Ｋｉｒｒｅ、およびそれらの混合物からなる群より選択される増殖因子を添加した細胞培養液または増殖培地中で前記細胞が維持される、請求項７３記載の細胞。
  77. ＩＬ−３（約２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（約２５０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（約１０ｎｇ／ｍｌ）、ＴＰＯ（約２５０ｎｇ／ｍｌ）、ｆｌｔ−３Ｌ（約１００ｎｇ／ｍｌ）からなる群より選択される増殖因子を添加した、請求項７６記載の培地。
  78. 前記細胞が、ＧＳＫ−３の阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素活性の阻害剤、およびＤＮＡメチル基転移酵素活性の阻害剤、のうちの１または複数種から選択される薬剤の存在下で維持される、請求項７３または７６に記載の細胞。
  79. 前記結合剤がレクチン、抗体またはグリコシダーゼである、請求項７３〜７６のうちいずれか１項に記載の細胞。
  80. 前記表面が、金属、ガラス、プラスチック、共重合体、コロイド、脂質、細胞表面等からなる群より選択される、上記請求項のうちいずれかに記載される方法または細胞。
  81. 前記結合剤がグリカン結合タンパク質の複合体であって、好ましくは前記結合剤タンパク質のグリカンから結合する、好ましくはポリバレントな複合体である、請求項１記載の方法。
  82. 前記結合剤が固定化される、請求項１または８１記載の方法。
  83. 固定化が非共有結合的な相互作用または共有結合的な固定化を含む、請求項８２記載の方法。
  84. （ｉ）少なくとも１個の幹細胞または幹細胞集団を提供すること；ならびに（ｉｉ）前記の少なくとも１個の幹細胞または幹細胞集団を、１または複数種の、グリカン構造を結合する結合剤または幹細胞の培養に用いられる他のレクチンと接触させ、または前記結合剤は特異的にもしくは共有結合的に表面に付着し、および任意に、ここで前記結合剤は図のいずれかに記載の結合剤を含むこと；を含む、幹細胞の調節または培養のための結合剤を選択するための方法。
  85. 幹細胞上の前記グリカン構造が請求項または明細書内の上記グリカン構造の式のうちいずれかを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
  86. （ｉ）少なくとも１個の幹細胞または幹細胞集団を提供すること；および（ｉｉ）前記の少なくとも１個の幹細胞または幹細胞集団を、１または複数種の結合剤に接触させること；を含み、ここで、任意に、前記結合剤は上記請求項のうちいずれかに記載のグリカン構造に結合し、およびここで幹細胞の増殖の速度が増加し、前記幹細胞の未分化状態が維持される、結合剤の選択または最適化のための方法。
  87. （ｉ）少なくとも１個の幹細胞または幹細胞集団を提供すること；および（ｉｉ）前記の少なくとも１個の幹細胞または幹細胞集団を、１または複数種の結合剤に接触させること；を含み、ここで、任意に、前記結合剤は上記請求項のうちいずれかに記載のグリカン構造に結合し、およびここで幹細胞の増殖の速度が減少し、前記幹細胞の未分化状態が維持される、結合剤の選択のための方法。
  88. （ｉ）少なくとも１個の幹細胞または幹細胞集団を提供すること；および（ｉｉ）前記の少なくとも１個の幹細胞または幹細胞集団を、１または複数種の結合剤に接触させること；を含み、ここで、任意に、前記結合剤は上記請求項のうちいずれかに記載のグリカン構造に結合し、およびここで幹細胞の増殖の速度が減少し、前記幹細胞の未分化状態が維持される、結合剤の選択のための方法。
  89. （ｉ）少なくとも１個の幹細胞または幹細胞集団を提供すること；および（ｉｉ）前記の少なくとも１個の幹細胞または幹細胞集団を、１または複数種の結合剤に接触させること；を含み、ここで、任意に、前記結合剤は上記請求項のうちいずれかに記載のグリカン構造に結合し、ならびにここで幹細胞の接着状態、形態、増殖速度および／または分化状態が変化する、結合剤の選択のための方法。
  90. グリカン構造がα３−フコシル化構造を含む、上記請求項のうちいずれかに記載の方法または細胞。
  91. 前記構造がＬｅｗｉｓ ｘおよびシアリルＬｅｗｉｓ ｘからなる群より選択される、請求項９０記載の方法または細胞。
  92. 前記結合剤が、α３−フコシル化構造、α２−フコシル化構造、非フコシル化シアリルラクトサミン、Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃ構造、ＧａｌＮＡｃα構造、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン構造、および特異的マンノース構造からなる群より選択される構造を認識する、上記請求項のうちいずれかに記載の方法。
  93. 前記表面が、プレート、ディッシュ、バッグ、ロッド、ペレット、ファイバー、粒子およびメッシュからなる群より選択される、請求項７３または８０に記載の方法。
  94. 前記粒子が、ビーズ、ミクロスフィア、ナノ粒子、およびコロイド粒子からなる群より選択される、請求項９３記載の方法。
  95. 前記表面が、ガラス、シリカ、シリコン、コラーゲン、ヒドロキシアパタイト、ヒドロゲル、ＰＴＦＥ、ポリプロピレン、ポリスチレン、ナイロン、デキストラン、およびポリアクリルアミドからなる群より選択される、請求項９３記載の方法。
  96. 前記表面が生体適合性、天然、合成であるか、またはポリマーを含む、請求項９３記載の方法。
  97. 前記ポリマーが、ポリエステル、ポリエーテル、ポリアンヒドリド（ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅｓ）、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリオルトエステル、ポリホスファゼン、ポリ酢酸ビニル、ブロック共重合体、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、およびポリウレタンからなる群より選択される、請求項９６記載の方法。
  98. 前記生体適合性表面が、コラーゲン、金属、ヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミン酸塩、バイオセラミック材料、ヒアルロン酸ポリマー、アルギン酸塩、アクリル酸エステルポリマー、乳酸ポリマー、グリコール酸ポリマー、乳酸／グリコール酸ポリマー、精製タンパク質、精製ペプチド、および細胞外マトリクス組成物からなる群より選択される、請求項９６記載の方法。
  99. 前記結合剤が前記表面に共有結合的に、非共有結合的に、静電的に、疎水的に付着し、または前記結合剤はグリカン結合タンパク質の複合体であって、好ましくは前記結合剤タンパク質のグリカンから結合する、好ましくはポリバレントな複合体である、請求項７２〜９８のうちいずれか１項に記載の方法。
  100. 少なくとも１個の幹細胞または幹細胞集団が、培養において、２０、４０、または１００回の継代後に実質的に未分化のままである、請求項７２〜９９のうちいずれか１項に記載の方法。
  101. 結合剤と接触させられる前記の少なくとも１個の幹細胞が、前記結合剤を用いて分化するように誘導される、請求項７２〜９９のうちいずれか１項に記載の方法。
  102. 前記構造がＧａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、Ｆｕｃα２Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、およびＧａｌβ４（Ｆｕｃα３）ＧｌｃＮＡｃからなる群より選択される、請求項１〜１０１に記載の方法。
  103. 前記結合剤がＥＣＡ、ＤＰＡ、ガレクチン−１、およびＵＥＡからなる植物レクチン群から選択される、請求項１〜１０２のうちいずれか１項に記載の方法。
  104. 前記タンパク質のＮ グリコシル化部位が変異している、組み替え非グリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）ＥＣＡタンパク質。
  105. 表面に結合した、請求項１０４記載の組み替え非グリコシル化ＥＣＡタンパク質。
  106. 請求項１０４記載の組み替え非グリコシル化ＥＣＡタンパク質またはその機能断片をコードするアミノ酸配列。
  107. 請求項１０４記載の非グリコシル化ＥＣＡタンパク質またはその機能断片をコードする核酸配列。
  108. 請求項１０７記載の核酸を含む宿主細胞。’
  109. 式ＣＯＮＪ
    Ｂ−（Ｇ−）ｍＲ１−Ｒ２−（Ｓ１−）ｎＴ−
    ［式中、Ｂは前記結合剤であり、Ｇはグリカン（前記結合剤がグリカンを結合する場合）であり、
    Ｒ１およびＲ２は化学選択的連結基であり、Ｔはタグ、好ましくはビオチンであり、Ｌはタグに特異的に結合するリガンドであり；Ｓ１は任意のスペーサー基、好ましくは炭素数１〜１０のアルキルであり、
    ｍおよびｎは独立に０または１のいずれかの整数である］
    の結合剤複合体構造。
  110. 前記結合剤が、好ましくは酸化グリカンを介してグリカンと複合化する、請求項１０９記載の結合剤複合体。
  111. 式ＣＯＭＰ
    Ｂ−（Ｇ−）ｍＲ１−Ｒ２−（Ｓ１−）ｎ（Ｔ−）ｐ（Ｌ−）ｒ−（Ｓ２）ｓ−ＳＯＬ
    ［式中、Ｂは結合剤であり、ＳＯＬは固相またはマトリクスまたは表面であり、Ｇはグリカン（前記結合剤がグリカンを結合する場合）であり、Ｒ１およびＲ２は化学選択的連結基であり、Ｔはタグ、好ましくはビオチンであり、Ｌはタグに特異的に結合するリガンドであり、Ｓ１およびＳ２は任意のスペーサー基、好ましくは炭素数１〜１０のアルキルであり、ｍ、ｎ、ｐ、ｒおよびｓは独立に０または１のいずれかの整数である］
    の構造を含む複合体。
  112. 請求項１１１に記載の複合化結合剤。
  113. 前記結合剤が、好ましくはＳＯＬへの酸化グリカンを介してグリカンと複合化する、請求項１１１記載の結合剤結合複合体。
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