TW201937167A - 用來偵測癌細胞的裝置及方法 - Google Patents

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柯彥均
蔡政芳
李國賓
蔡瑋純
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Abstract

本揭示內容是關於一種用以偵測癌細胞之微流體晶片，特別是一生物樣本中的膽管癌細胞。本揭示內容亦涵蓋一種使用本發明之微流體晶片來偵測一生物樣本中的膽管癌細胞之方法。

Description

用來偵測癌細胞的裝置及方法
本揭示內容整體來說是關於一種用以偵測生物樣本中的癌細胞之裝置與方法。
膽管癌（cholangiocarcinoma，CCA）為一種發生於膽管的原發性惡性肝臟腫瘤，其預後相對惡劣，確診後之五年存活率低於10％。現今之影像學技術：包括超音波檢查、磁振造影與電腦斷層檢查，與利用活體組織切片或細胞學檢查等病理診斷法為膽管癌之主要診斷工具。但這些方法皆因腫瘤大小、位置、與病灶的限制，而難以在膽管癌早期即發現。最常用於診斷的膽管癌之腫瘤標記為醣抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）與癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）。然而，CA19-9和CEA在臨床應用中的敏感性和特異性仍然不令人滿意。
因此，相關領域亟需一種可用以偵測早期膽管癌的新穎生物標記，以利早期診斷與治療膽管癌。
本揭示內容的發明人意外性地發現一些新穎的磺化八醣可作為可結合到膽管癌細胞之表面的生物標記，故其可用以預斷（prognosis）一個體是否具有罹患膽管癌的風險。因此，本揭示內容提供一種用以分析一生物樣本的整合式微流體晶片，以及一種基於該整合式微流體晶片所產生之分析結果，來預斷一個體是否罹患或或具有罹患膽管癌之風險的方法。
據此，本揭示內容的第一態樣是關於一種磺化八醣的新穎用途，其可作為一種用以鑑定一生物樣本中之膽管癌細胞的生物標記。該磺化八醣具有式(I)之結構：其中R1 是-NHAc或-NHSO3 M；R2 與R3 個別為H或-SO3 M；且M是一單價陽離子，其選自由鈉離子、鉀離子、鋰離子及銨離子所組成的群組。
依據本揭示內容之一較佳實施例，在該式(I)中，R1 是–NHSO3 Na；且R2 與R3 個別為-SO3 Na。
依據本揭示內容之另一較佳實施例，在該式(I)中，R1 是-NHSO3 Na，R2 與R3 個別為H。
本揭示內容的第二態樣是關於一種用以偵測一生物樣本中之膽管癌細胞的方法。該方法包括一步驟，其中該步驟是使一生物樣本與一預先塗佈上述式(I)之磺化八醣或其藥學上可接受的鹽的磁珠接觸，其中該生物樣本與該磁珠之間的結合表示該生物樣本中具有膽管癌細胞。
依據本揭示內容之實施方式，式(I)之磺化八醣更與一生物素（biotin）連接。
依據本揭示內容之一較佳實施方式，該磁珠是以式(I)之磺化八醣預先塗佈，其中R1 是-NHSO3 Na，R2 與R3 個別為H。
依據本揭示內容之其他實施方式，該磁珠是以式(I)之磺化八醣預先塗佈，其中R1 是-NHSO3 Na；且R2 與R3 個別為-SO3 Na。
依據本揭示內容之實施方式，該生物樣本可為血液、血漿、血清、尿液、痰液、唾液、組織樣本、活體組織切片或組織溶胞產物。
本揭示內容的第三態樣是關於一種用以分析一生物樣本之微流體晶片，例如確認該生物樣本中是否具有癌症。該微流體晶片包含： 複數個洗滌緩衝液腔（wash buffer chambers），其分別用以滯留（hold）其中的洗滌緩衝液； 複數個捕捉腔（capture chambers），其分別用以將一癌細胞捕捉至一預先塗佈有癌細胞之生物標記的磁珠上； 一廢液腔（waste chamber），其用以滯留自該複數個捕捉腔中洗出之未被捕捉到的癌細胞；以及 複數個微通道（microchannels），其用以連接該複數個洗滌緩衝液腔、該複數個捕捉腔與該廢液腔。
依據本揭示內容之實施方式，該微流體晶片是由一玻璃基板和至少一聚二甲基矽氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）層所製成。
依據本揭示內容之一較佳實施方式，該微流體晶片的結構包含六個洗滌緩衝液腔、六個捕捉腔和一個廢液腔，其分別與彼此連接並以微通道相通。
依據本揭示內容之實施方式，各該捕捉腔是用以分離出一液體樣本中與磁珠結合之癌細胞。
依據本揭示內容之實施方式，該磁珠是以式(I)之磺化八醣預先塗佈，其中， R1 是-NHAc或-NHSO3 M；R2 與R3 個別為H或-SO3 M；且M是一單價陽離子，其選自由鈉離子、鉀離子、鋰離子及銨離子所組成的群組。
依據本揭示內容之實施方式，該式(I)之磺化八醣更與一生物素連接。
依據本揭示內容之實施方式，在該式(I)之磺化八醣中，R1 是-NHSO3 Na；且R2 與R3 個別為-SO3 Na。
依據本揭示內容之實施方式，在該式(I)之磺化八醣中，R1 是-NHSO3 Na，R2 與R3 個別為H。
本揭示內容的第四態樣是關於一種用以分析一生物樣本之套組。該套組包括：本揭示內容中微流體晶片、預先塗佈一生物標記之磁珠、至少一試劑，其可與本揭示內容微流體晶片一起使用來分析一生物樣本；以及一用以指示使用者如何使用該套組之使用說明。
依據本揭示內容之特定實施方式，該生物標記為上述式(I)之磺化八醣，其中R1 是-NHSO3 Na；且R2 與R3 個別為-SO3 Na。
依據本揭示內容之另一實施方式，該生物標記為上述式(I)之磺化八醣，其中R1 是-NHSO3 Na，R2 與R3 個別為H。
本揭示內容之一或多個實施方式的細節將在以下的敘述中呈現，根據詳細說明和申請專利範圍，本發明的其他特徵和優點將更顯而易見。
當可理解，前面的一般性描述和以下的詳細描述都是通過實施例，並且旨在對本發明的提供進一步說明。
下文提供了詳細說明及附隨圖式是為使本揭示內容實施例的敘述更加詳盡與完備，而非代表用以理解或運用本揭示內容實施例的唯一形式。
1. 定義
除非另有指明，所述「個體」（subject）或「病患」（patient）在本揭示內容內可互換使用，係指任一種動物。該動物可以是一人類或非人類個體。該個體可以是人類；但亦可以是一需要獸醫治療之哺乳動物，例如家畜或比賽用動物，農用動物和實驗動物（例如大鼠、小鼠、豚鼠、靈長類等）。通常該動物是一非人類之哺乳類動物，例如非人類之靈長類動物。非人類之靈長類動物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和獼猴（例如恒河猴或黑猩猩（Pan））。家畜或比賽用動物包括牛、馬、豬、羊、鹿、野牛、水牛、貂、貓科動物（例如家貓）、犬科動物（例如狗、狼和狐狸）、禽類（例如雞、火雞和鴕鳥）和魚（例如鱒魚、鯰魚和鮭魚）。
在此所述「接觸」（contacting）在本文中是與細胞（例如一生物樣本中之細胞）相關，且是指任何將試劑遞送或「施予」（administration）至細胞或生物樣本的方式，其中將所述試劑（例如本發明的磺化八醣或預先塗佈本發明之磺化八醣的磁珠）與一或多個細胞接觸，其量足以達到彼此間的親和性結合。
儘管在本發明概括的範圍所列舉之數值範圍與參數設定為近似值，於具體實施例中所提出之數值則盡可能地精確。然而，任何數值與生俱有因各別測試性測量產生之標準偏差而產生的某些誤差。同樣地，如同文內所使用，所謂的「約」（about）通常表示給定值或範圍的10％、5％、1％或0.5％。或者，在熟知該領域之技術者的觀點，所述「約」意指在平均值的可接受之標準誤差內。除了操作或工作實例，或除非另有特別說明，所有數值範圍、數量、數值和百分比，例如材料數量、持續時間、溫度、操作條件、數量比值，和其他本文內公開所有相似術語，應理解為在所有情況下均由「約」修飾。至少，每個數值參數應根據報告的有效數字的數量與透過普通的捨入技術來解釋。
除非本說明書另有定義，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型。
2. 本發明的磺化八 醣
本揭示內容之態樣是關於發現特定的磺化八醣可作為方法和/或套組中的生物標記，用以鑑定和/或偵測一生物樣本中的癌細胞。例示性之磺化八醣於本文中描述。
在一態樣中，本發明是關於式(I)之磺化八醣：其中R1 是-NHAc或-NHSO3 M；R2 與R3 個別為H-SO3 M；且M是一單價陽離子，其選自由鈉離子、鉀離子、鋰離子及銨離子所組成的群組。
在本揭示內容之某些實施方式中，R1 是-NHSO3 Na；且R2 與R3 個別為-SO3 Na。
在本揭示內容之進一步實施方式中，R1 是-NHSO3 Na，且R2 與R3 個別為H。
可依據操作實施例中所描述之方法來製備本揭示內容之磺化八醣。所有本發明化合物的立體異構物，例如該些因式(I)之化合物的R取代基上的不對稱碳原子而存在的立體異構物，包含鏡像和非鏡像形式，都視為涵蓋在本發明的範圍內。本發明化合物中的各立體異構物可以是，舉例來說，實質上不含其它異構物，或者可以是混合物，舉例來說，是外消旋物、或與其他所有或其他特定異構物的混合。此外，本發明的掌性中心可具有以IUPAC 1974命名法定義的S或R構型。
3. 使用方法
式(I)之磺化八醣可與癌細胞表面結合，特別是源自於膽管之癌症。因此，本揭示內容涵蓋一種用以鑑定或偵測一生物樣本中之膽管癌細胞的方法。
本揭示內容方法包括使一個體的生物樣本與一預先塗佈式(I)磺化八醣之磁珠接觸，其中該磁珠與該生物樣本之間的結合表示該生物樣本中具有膽管癌細胞。
依據本揭示內容之實施方式，預先塗佈式(I)磺化八醣之磁珠更與一生物素連接。
依據本揭示內容之較佳實施方式，在該式(I)之磺化八醣中，R1 是-NHSO3 Na，R2 與R3 個別為H。
依據本揭示內容之其他實施方式，在該式(I)之磺化八醣中，R1 是-NHSO3 Na；且R2 與R3 個別為-SO3 Na。
適用於本揭示內容方法之生物樣本實例包括，但不限於，血液、血漿、血清、尿液、痰液、唾液、組織樣本、活體組織切片及組織溶胞產物。在一較佳實施方式中，該生物樣本為血液。
本揭示內容因此提供一種用以預斷一個體是否罹患膽管癌之方法。該預斷為對一個體之樣本來進行，其可以是以下任一種：血液、血漿、血清、尿液、痰液、唾液、組織樣本、活體組織切片及組織溶胞產物。該方法包含：將組織樣本與預先塗佈式(I)之磺化八醣的磁珠作用足夠時間，其中，若觀察到該組織樣本與該預先塗佈式(I)之磺化八醣的磁珠發生結合，則該個體罹患膽管癌。
依據本揭示內容之特定實施方式，組織樣本可以是血液、血漿、血清、尿液、痰液、唾液、組織樣本、活體組織切片或組織溶胞產物。在一較佳實施方式中，該組織樣本為血液。
依據本揭示內容之較佳實施方式，該磁珠是以式(I)之磺化八醣預先塗佈，其中R1 是-NHSO3 Na，R2 與R3 個別為H。
依據本揭示內容之其他實施方式，該磁珠是以式(I)之磺化八醣預先塗佈，其中R1 是-NHSO3 Na；且R2 與R3 個別為-SO3 Na。
4. 微流體晶片
在特定實施方式中，本揭示內容是關於一種整合性微流體晶片，其可加速偵測和/或分離一生物樣本中的癌細胞。
參照第1圖，其為本揭示內容之微流體晶片100 的示意圖，其由一玻璃基板與至少一聚二甲基矽氧烷（PDMS）層所製成。如第 1 圖 (a) 所示，微流體晶片100 自底部到頂部包含一玻璃基板110 、一第一PDMS層120 ，與一第二PDMS層130 ，其中該第一與該第二PDMS層120 、130 分別作為一液體通道層與一空氣通道層。較佳地，該第一PDMS層120 的厚度較第二PDMS層130 為薄。可藉由本領域已知的電腦數值控制（computer numerical control，CNC）機製程序（machining process）（例如EGX-400, Roland Inc., Japan）來將微結構（microstructures）（例如流體腔（fluid chambers）與流體導管（fluid conducts）（或流體通道（fluid channels）））建構或蝕刻在該第一與第二PDMS層120 、130 上。
第1圖(b)為在第二PDMS層130 上建構流體腔和/或流體導管的代表示意圖。如圖所示，在PDMS層130 上建構6個洗滌緩衝液腔102 （a 到f ）、6個捕捉腔104 （a 到f ）、1個廢液腔106 ，與複數個微通道108 。為求簡潔，在第1圖(b)中，僅標示出6個洗滌緩衝液腔中的一個（即102 ）與6個捕捉腔中的一個（104 ）。這些腔室（chambers）以環狀排列，並將廢液腔106 設置於PDMS層的中心，6個捕捉腔104 （a 到f ）蝕刻在廢液腔106 的周圍，且各捕捉腔藉由複數個微通道108 與相鄰的捕捉腔及廢液腔連接。接著，將6個洗滌緩衝液腔102 （a 到f ）蝕刻在6個捕捉腔104 （a 到f ）的周圍，且各洗滌緩衝液腔藉由複數個微通道108 與相鄰的洗滌緩衝液腔及捕捉腔連接。藉由這樣的排列，各洗滌緩衝液腔102 （a 到f ）、捕捉腔104 （a 到f ）與廢液腔106 藉由複數個微通道108 可達到流體連通。可將腔室與微通道以相同的方式建構在第一PDMS層120 上。
操作時，首先將合適量之液體樣本（例如血液或血漿）注入各捕捉腔104 （a 到f ），接著將預先塗佈生物標記（例如本發明式(I)之磺化八糖）的磁珠被加入各捕捉腔104 （a 到f ）中，並使各捕捉腔104 （a 到f ）中的混合物反應足夠時間（例如至少15分鐘），使癌細胞可藉由親和力結合而與磁珠上的生物標記結合。接著以磁力收集其上帶有欲求癌細胞的磁珠，而該些在生物樣本中未結合的癌細胞與其他成分則以裝載於洗滌緩衝液腔102 （a 到f ）的洗滌緩衝液洗出並收集在廢液腔106 中。
根據本揭示內容之較佳實施例，該微流體晶片由6個洗滌緩衝液腔與6個捕捉腔所組成。因此，此微流體晶片可在六種不同條件下鑑定和/或捕捉所需的癌細胞，例如分別使用六種其上塗佈不同類型之生物標記的磁珠，或是使用一種生物標記但六種不同結合條件（例如酸鹼值、離子強度等）。藉由這樣的方式，可加速偵測流體樣本中癌細胞，其中偵測相對更完整，因為可採用更廣範圍的生物標記和/或條件。
在本揭示內容的一較佳實施例中，將預先塗佈本發明式(I)之磺化八醣的磁珠各別裝載在微流體晶片的捕捉腔中，並以預先塗佈磺化八醣HS1與HS12的磁珠來辨識膽管癌細胞。
此外或可任選性地，各磁珠可更與一生物素（biotin）連接以放大偵測訊號。
5. 套組
本發明另一態樣是關於一種用以辨識和/或偵測一生物樣本中的癌細胞之套組。該套組至少包括，本揭示內容的微流體晶片、預先塗佈有一生物標記之磁珠、至少一試劑、及一用以指示使用者如何使用該套組之使用說明。
根據本揭示內容的較佳實施例，該套組至少包含三個容器，與一份用以指示使用者如何使用該套組之使用說明。第一容器可於其中儲存本揭示內容的微流體晶片。第二容器可於其中容納預先塗佈磺化八醣HS1的磁珠、磺化八醣HS12的磁珠、或其混合物。第三容器可於其中儲存分析時所必需的緩衝溶液，例如用以清洗未與磁珠結合之癌細胞。使用說明可以是小冊子、錄音帶、CD、VCD或DVD等形式。
下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明，且不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。儘管用於這些具體實施例的方法為那些典型常用的方法，其他為本領域技術者所熟知之程序、方法、技術亦有可能替代使用。
實施例
材料與方法
細胞培養 ：將HEK293（人類人胚胎腎細胞）與COS-1（猴腎細胞）細胞培養在混有10％已熱去活之胎牛血清的杜氏改良式依格爾培養基（Dulbecco’s modified eagle’s medium，DMEM）中。將Neuro2a（源自小鼠神經母細胞瘤）細胞培養在混有10％胎牛血清的RPMI-1640培養基中。
將SNU478、HuCCT1、Huh28、BxPC3與HCT8細胞分別培養於含有盤尼西林（100U/毫升）與鏈黴素（100微克/毫升）混合液（Pen Strep, Gibco® ）、10％胎牛血清（FBS, Gibco® ）的RPMI-1640培養基（Gibco® ）中。將KKU100、MMNK1與HepG2細胞則分別培養在含有盤尼西林（100U/毫升）與鏈黴素（100微克/毫升）混合液，10％胎牛血清（FBS, Gibco® ）的DMEM培養基內。所有的細胞皆培養在37°C、5％ CO2 的環境中。
製備預先塗佈磺化八 醣之磁珠 ：將磁珠表面分別預先塗佈三種不同濃度（1、10、100微體積莫耳濃度）的本發明磺化八醣（例如HS1、HS12等）。簡單來說，首先將磺化八醣與鏈親和素T1磁珠（Dynabeads® MyOneTM Streptavidin T1）（~7-10×109 個/毫升，Ø=1微米，Invitrogen Co., USA）以體積比1：10的比例培養30分鐘。接著以磁鐵吸附5分鐘收集磁珠，之後去除上清液並以1毫升的去離子水（deionized，DI）清洗三次。最後，再將塗佈完成之磁珠懸浮在DI水中，其體積與一開始自Dynabeads® 瓶中取出的體積相同。
建構微流體晶片 ：為能使磁珠有效地捕捉癌細胞，依據蔡（Tsai W. C.）等人所述之方法（“A Microfluidic System for Detection of Cholangiocarinoma Cells by Using Heparan Sulfate Octasaccharides.” 2017 IEEE 12th International Conference, Los Angeles, CA USA）來建構整合性微流體晶片。簡言之，此整合性微流體晶片是以兩層聚二甲基矽氧烷（PDMS）層與一玻璃基板所製成；二PDMS層中的其中一層比另一層厚，此PDMS厚層是作為空氣通道層，而PDMS薄層則是作液體通道層，最後，玻璃基板則用於密封PDMS層。
藉由電腦數值控制（CNC）機製程序（EGX-400, Roland Inc., Japan）搭配0.5毫米鑽頭，來將空氣與液體通道層的母模型蝕刻在聚甲基丙烯酸甲酯（polymethylmethacrylate，PMMA）上的微結構中。接著，進行聚二甲基矽氧烷（PDMS）鑄造與翻模製程以獲得母模型的逆向結構（inverse structures）。透過混合重量比例為1:10的固化劑與PDMS預聚合物（Sylgard 184A/B, Sil-More Industrial Ltd., USA），並置於真空中以去除所有的氣泡，來製備聚二甲基矽氧烷（PDMS）。在去除氣泡40分鐘後，以手動填充方式將PDMS混合物填入母模型並於70°C中固化2小時。接著，以機械式地自母模型剝離兩個固化的PDMS層，再以電漿氧化方式將該厚的與薄的PDMS層互相黏合。最後再以同樣的電漿氧化方式將組裝好的PDMS層與玻璃基互相板黏合，而形成微流體晶片。
以微流體晶片捕捉癌細胞
利用上述建構的微流體晶片來捕捉癌細胞。簡言之，分別將2×105 個不同種類的癌細胞株懸浮於100微升的1倍磷酸鹽緩衝溶液（phosphate buffered saline，PBS）中，並注入六個捕捉腔中。將10微升之不同濃度的磺化八醣磁珠以手動方式分注到捕捉腔中，並以微型泵浦溫和地與細胞混合15分鐘。在作用後，預先塗佈本發明中式(I)磺化八醣的磁珠會辨認並結合細胞。接著，以磁力收集被捕捉的細胞，並用1倍磷酸鹽緩衝溶液洗滌。在分離後，以100微升之1倍磷酸鹽緩衝溶液來懸浮磁珠與細胞，再將樣本加載到血球計數器中以計算捕捉率。
統計分析
此處並無統計學方法用於預先確定實驗的樣本量。以平均值±標準誤（s.e.m.）或標準差（s.d.）來表示（於各別圖式說明中指出）分析數據結果。以T檢定來比較兩組數據以分析數據組。在二組數據以上的情形，則使用單因子變異數分析法（one-way ANOVA），搭配Duncan’s或Tukey檢定以校正多重比較。所有檢定均以雙面方式進行。P值等於或小於0.05的實驗結果是具有顯著差異。使用Excel 2013（Microsoft software）來計算平均值、標準差、標準誤差與統計分析。在本研究中沒有使用包含或排除數據的判斷標準。
實施例 1 化學合成本發明磺化八 醣
兩組可依據流程I和流程II所述步驟來分別合成本發明磺化八醣HS1~HS8與HS9~HS16。大體上，是使用雙醣與四醣建構組元（building blocks）搭配thiotolyl官能基作為離去基，並以收斂聚合方式形成醣骨架。根據最近用於肝素和肝素合成的模式（Hu et al., 2011 Nat. Chem. 3, 557-563; Zulueta et al., 2012 J. Am. Chem. Soc. 134, 8988-8995）來選用保護基。對於完全保護的骨架，則以發散方式（Hu et al., 2011 Nat. Chem. 3, 557-563; Zulueta et al., 2012 J. Am. Chem. Soc. 134, 8988-8995）來進行官能基轉換，以提供帶有一胺戊基糖苷配基基團（aminopentyl aglycon moiety）的不同磺化終產物。
流程I
流程II
以下提供HS1至HS16的化學數據。
5-胺戊基(2-乙醯胺基-2-去氧-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-a-L-艾杜吡喃環草隆基（idopyranosiduronyl）-(1→4)-(2-乙醯胺基-2-去氧-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-a-L-艾杜吡喃環草隆基-(1→4)-(2-乙醯胺基-2-去氧-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-a-L-艾杜吡喃環草隆基-(1→4)-(2-乙醯胺基-2-去氧-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-a-L-艾杜吡喃環草隆酸酯（idopyranosiduronate）鈉鹽(HS1)。1 H NMR (600 MHz, D2 O): d 5.12–5.06 (m, 4H), 4.84–4.82 (m, H), 4.79–4.76 (m, 2H), 4.67–4.63 (m, 3H), 4.42 (d,J = 2.8 Hz, 1H), 4.02–3.93 (m, 4H), 3.90–3.83 (m, 5H), 3.83–3.71 (m, 15H), 3.71–3.62 (m, 8H), 3.62–3.53 (m, 4H), 3.53–3.49 (m, 1H), 3.38 (t,J = 9.5 Hz, 1H), 2.90 (t,J = 7.6 Hz, 2H), 1.94 (s, 3H, Ac), 1.93 (s, 6H, Ac × 2), 1.92 (s, 3H, Ac), 1.63–1.54 (m, 4H, CH2 linker), 1.40-1.32 (m, 2H, CH2 linker);13 C NMR (150 MHz, D2 O): d 175.0 (C), 174.9 (C), 174.8 (C), 174.3 (C), 174.28 (C), 174.2(C), 101.6 (CH), 100.7 (CH), 94.4 (CH), 94.3 (CH), 76.6 (CH), 76.5 (CH), 76.4 (CH), 74.5 (CH), 74.4 (CH), 74.3 (CH), 73.9 (CH), 71.9 (CH), 71.1 (CH), 71.05 (CH), 71.0 (CH), 69.9 (CH), 69.8 (CH), 69.7 (CH), 69.6 (CH), 69.4 (CH), 69.3 (CH), 68.8 (CH), 68.6 (CH), 68.0 (CH2 ), 60.1 (CH2 ), 60.0 (CH2 ), 53.6 (CH), 53.5 (CH), 39.3 (CH2 ), 28.0 (CH2 ), 26.2 (CH2 ), 22.2 (CH2 ), 21.8 (CH3 ); HRMS (ESI):m /z calcd for C61 H95 N5 O45 ([M – 2H]2– ): 808.7650, found: 808.7641.
5-胺戊基(2-乙醯胺基-2-去氧-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-a-L-艾杜吡喃環草隆基-(1→4)-(2-乙醯胺基-2-去氧-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-b-D-葡萄吡喃環草隆基（glucopyranosiduronyl）-(1→4)-(2-乙醯胺基-2-去氧-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-a-L-艾杜吡喃環草隆基-(1→4)-(2-乙醯胺基-2-去氧-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-b-D-葡萄吡喃環草隆酸酯（glucopyranosiduronate）鈉鹽(HS9)。1 H NMR (600 MHz, D2 O): d 5.40 (d,J = 3.8 Hz, 1H), 5.38 (d,J = 3.8 Hz, 1H), 5.20 (d,J = 3.7 Hz, 1H), 5.19 (d,J = 3.7 Hz, 1H), 4.94 (d,J = 3.7 Hz, 1H), 4.93 (d,J = 3.9 Hz, 1H), 4.75 (d,J = 3.1 Hz, 1H), 4.74 (d,J = 2.9 Hz, 1H), 4.51 (d,J = 7.9 Hz, 1H), 4.46 (d,J = 8.0 Hz, 1H), 4.10 (t,J = 6.8 Hz, 1H), 4.08 (t,J = 6.6 Hz, 1H), 3.97–3.95 (m, 1H), 3.95–3.91 (m, 5H), 3.90–3.87 (m, 5H), 3.86–3.83 (m, 7H), 3.83–3.79 (m, 4H), 3.79–3.77 (m, 2H), 3.77–3.76 (m, 2H), 3.76–3.74 (m, 2H), 3.74–3.71 (m, 3H), 3.71–3.69 (m, 4H), 3.69–3.66 (m, 1H), 3.49 (t,J = 9.4 Hz, 1H), 3.38 (t,J = 8.6 Hz, 1H), 3.31 (t,J = 8.6 Hz, 1H), 3.01 (t,J = 7.5 Hz, 1H), 2.06 (s, 6H, Ac × 2), 2.04 (s, 3H, Ac), 2.03 (s, 3H, Ac), 1.73-1.65 (m, 4H), 1.52–1.43 (m, 2H);13 C NMR (150 MHz, D2 O): d 176.0 (C), 175.9 (C), 175.82 (C), 175.77 (C), 175.3(C), 175.24 (C), 175.20 (C), 103.3 (CH), 103.2 (CH), 102.8 (C), 102.7 (CH), 97.95 (CH), 95.4 (CH), 95.3 (CH), 79.1 (CH), 78.1 (CH), 77.91 (CH), 77.87 (CH), 77.7 (CH), 77.5 (CH), 77.3 (CH), 77.19 (CH), 77.17 (CH), 75.6 (CH), 75.3 (CH), 74.5 (CH), 74.4 (CH), 72.9 (CH), 72.1 (CH), 71.7 (CH), 71.03 (CH2 ), 71.00 (CH), 70.95 (CH), 70.9 (CH), 70.8 (CH), 70.7 (CH), 70.6 (CH), 70.5 (CH), 70.4 (CH), 61.2 (CH2 ), 60.7 (CH2 ), 60.6 (CH2 ), 60.4 (CH2 ), 54.8 (CH), 54.5 (CH), 54.1 (CH), 40.4 (CH2 ), 29.1 (CH2 ), 27.3 (CH2 ), 22.9 (CH2 ), 22.9 (CH3 ); HRMS (ESI):m/z calcd for C61 H94 N5 Na5 O45 ([M + 5Na – 3H]2+ ): 865.7355, found: 865.7357.
5-胺戊基(2-去氧-2-磺胺基（sulfamido）-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-a-L-艾杜吡喃環草隆基-(1→4)-(2-去氧-2-磺胺基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-a-L-艾杜吡喃環草隆基-(1→4)-(2-去氧-2-磺胺基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-a-L-艾杜吡喃環草隆基-(1→4)-(2-去氧-2-磺胺基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-a-L-艾杜吡喃環草隆酸酯鈉鹽(HS2)。1 H NMR (600 MHz, D2 O): d 5.41–5.35 (m, 4H), 4.98–4.94 (m, 2H), 4.92–4.89 (m, 2H), 4.51 (d,J = 1.9 Hz, 1H), 4.16–4.02 (m, 8H), 3.92–3.59 (m, 27 H), 3.47 (t,J = 9.4 Hz, 1H), 3.28–3.19 (m, 4H), 3.00 (t,J = 7.4 Hz, 2H), 1.72–1.63 (m, 2H), 1.48–1.43 (m, 2H);13 C NMR (150 MHz, D2 O): d 175.2 (C), 101.6 (CH), 100.7 (CH), 95.64 (CH), 95.6 (CH), 95.5 (CH), 95.4 (CH), 77.1 (CH), 77.0 (CH), 76.9 (CH), 74.9 (CH), 74.8 (CH), 74.7 (CH), 71.7 (CH), 71.3 (CH), 71.0 (CH), 70.9 (CH), 69.8 (CH), 69.73 (CH), 69.7 (CH), 69.3 (CH), 69.1 (CH), 69.0 (CH), 68.8 (CH), 68.5 (CH), 68.4 (CH), 68.2 (CH), 68.1 (CH2 ), 60.2 (CH2 ), 59.7 (CH2 ), 58.0 (CH), 57.8 (CH), 39.4 (CH2 ), 28.0 (CH2 ), 26.2 (CH2 ), 22.2 (CH2 ); HRMS (ESI):m /z calcd for C53 H86 N5 O53 S4 Na3 ([M + 3Na – 6H]3– ): 611.4177, found: 611.4167.
5-胺戊基(2-乙醯胺基-2-去氧-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-(2-O -磺酸根基-a-L-艾杜吡喃環草隆基)-(1→4)-(2-乙醯胺基-2-去氧-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-(2-O -磺酸根基-a-L-艾杜吡喃環草隆基)-(1→4)-(2-乙醯胺基-2-去氧-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-(2-O -磺酸根基-a-L-艾杜吡喃環草隆基)-(1→4)-(2-乙醯胺基-2-去氧-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-2-O -磺酸根基-a-L-艾杜吡喃環草隆酸酯鈉鹽(HS7)。1 H NMR (600 MHz, D2 O): d 5.17 (bs, 4H), 5.11–5.08 (m, 4H), 4.90 (d,J = 10.1 Hz, 2H), 4.54 (d,J = 1.9 Hz, 1H), 4.32 (bs, 3H), 4.30-4.25 (m, 4H), 4.21 (bs, 1H), 4.03–3.96 (m, 9H), 3.90–3.83 (m, 9H), 3.82–3.76 (m, 4H), 3.75–3.67 (m, 8H), 3.45 (t,J = 9.3 Hz, 1H), 2.99 (t,J = 7.5 Hz, 2H), 2.05 (s, 6H, Ac × 2), 2.04 (s, 6H, Ac × 2), 1.70–1.61 (m, 4H, CH2 linker), 1.50–1.40 (m, 2H, CH2 linker);13 C NMR (150 MHz, D2 O): d 175.8 (C), 175.2 (C), 174.8 (C), 174.7 (C), 99.3 (CH), 99.2 (CH), 98.6 (CH), 93.5 (CH), 93.4 (CH), 93.3 (CH), 77.2 (CH), 74.1 (CH), 73.3 (CH), 73.2 (CH), 73.1 (CH), 71.9 (CH), 71.3 (CH), 71.2 (CH), 70.7 (CH), 70.4 (CH), 70.2 (CH), 69.9 (CH), 69.8 (CH), 69.7 (CH), 68.1 (CH2 ), 67.4 (CH), 67.3 (CH), 67.2 (CH), 64.0 (CH), 63.4 (CH), 63.3 (CH), 63.1 (CH), 60.2 (CH2 ), 59.7(CH2 ), 39.4 (CH2 ), 27.8 (CH2 ), 26.2 (CH2 ), 22.24 (CH3 ), 22.2 (CH3 ), 22.1 (CH3 ); HRMS (ESI):m /z calcd for C61 H94 N5 O57 S4 ([M – 3H]3– ) 645.4498, found 645.4489.
5-胺戊基(2-去氧-2-磺胺基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-a-L-艾杜吡喃環草隆基-(1→4)-(2-去氧-2-磺胺基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-b-D-葡萄吡喃環草隆基-(1→4)-(2-去氧-2-磺胺基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-a-L-艾杜吡喃環草隆基-(1→4)-(2-去氧-2-磺胺基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-b-D-葡萄吡喃環草隆酸酯鈉鹽(HS10)。1 H NMR (600 MHz, D2 O): d 5.62 (d,J = 3.7 Hz, 1H), 5.61 (d,J = 3.6 Hz, 1H), 5.41 (d,J = 3.4 Hz, 1H), 5.39 (d,J = 3.4 Hz, 1H), 4.98 (bs, 1H), 4.96 (d,J = 2.8 Hz, 1H), 4.55 (d,J = 7.9 Hz, 1H), 4.50 (d,J = 8.0 Hz, 1H), 4.14–4.07 (m, 4H), 3.94–3.88 (m, 4H), 3.88–3.84 (m, 6H), 3.84–3.81 (m, 7H), 3.81–3.78 (m, 4H), 3.76–3.74 (m, 3H), 3.74–3.70 (m, 4H), 3.68–3.63 (m, 3H), 3.48 (t,J = 9.5 Hz, 1H), 3.43 (t,J = 8.6 Hz, 1H), 3.36 (t,J = 8.6 Hz, 1H), 3.31–3.25 (m, 3H), 3.23 (dd,J = 10.3, 3.6 Hz, 1H), 3.02 (t,J = 7.5 Hz, 2H), 1.75–1.65 (m, 4H), 1.53–1.43 (m, 2H);13 C NMR (150 MHz, D2 O): d 176.3 (C), 176.1 (C), 176.0 (C), 103.3 (CH), 103.2 (CH), 102.8 (CH), 102.7 (CH), 98.5 (CH), 98.4 (CH), 96.5 (CH), 96.4 (CH), 78.9 (CH), 78.3 (CH), 78.11 (CH), 78.06 (CH), 77.94 (CH), 77.89 (CH), 77.6 (CH), 77.5 (CH), 76.0 (CH), 75.9 (CH), 73.81 (CH), 73.76 (CH), 72.7 (CH), 72.4 (CH), 71.94 (CH), 71.91 (C), 71.6 (CH), 71.1 (CH2 ), 70.9 (CH), 70.84 (CH), 70.80 (CH), 70.5 (CH), 70.33 (CH), 70.28 (CH), 70.0 (CH), 69.6 (CH), 61.4 (CH2 ), 60.81 (CH2 ), 60.79 (CH2 ), 60.5 (CH2 ), 59.3 (CH), 59.0 (CH), 58.6 (CH), 40.5 (CH2 ), 29.2 (CH2 ), 27.3 (CH2 ), 23.0 (CH2 ); HRMS (ESI):m /z calcd for C53 H81 N5 Na8 O53 S4 ([M + 3Na – 6H]3– ): 611.4177, found: 611.4176; calcd for C53 H81 N5 Na8 O53 S4 ([M + 4Na – 7H]3– ): 618.7449, found: 618.7449.
5-胺戊基(2-乙醯胺基-2-去氧-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-(2-O -磺酸根基-a-L-艾杜吡喃環草隆基)-(1→4)-(2-乙醯胺基-2-去氧-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-(2-O -磺酸根基-b-D-葡萄吡喃環草隆基-(1→4)-(2-乙醯胺基-2-去氧-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-(2-O -磺酸根基-a-L-艾杜吡喃環草隆基)-(1→4)-(2-乙醯胺基-2-去氧-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-2-O -磺酸根基-b-D-葡萄吡喃環草隆酸酯鈉鹽(HS13)。1 H NMR (600 MHz, D2 O): d 5.39 (d,J = 3.6 Hz, 1H), 5.38 (d,J = 3.4 Hz, 1H), 5.23–5.20 (m, 2H), 5.14–5.12 (m, 2H), 4.92 (d,J = 1.6 Hz, 1H), 4.89 (s, 1H), 4.73 (d,J = 7.7 Hz, 1H), 4.63 (d,J = 7.9 Hz, 1H), 4.35 (s, 1H), 4.34 (s, 1H), 4.32 (s, 1H), 4.28 (s, 1H), 4.16 (t,J = 8.3 Hz, 1H), 4.10 (t,J = 8.7 Hz, 1H), 4.06–4.00 (m, 4H), 4.00–3.97 (m, 2H), 3.95–3.90 (m, 5H), 3.88–3.85 (m, 10H), 3.84–3.80 (m, 6H), 3.78–3.66 (m, 6H), 3.48 (t,J = 9.3 Hz, 1H), 3.03 (t,J = 7.4 Hz, 2H), 2.09 (bs, 3H, Ac), 2.08 (bs, 3H, Ac), 2.07 (bs, 3H, Ac), 2.06 (bs, 3H, Ac), 1.74–1.65 (m, 4H, CH2 linker), 1.56–1.48 (m, 2H, CH2 linker);13 C NMR (150 MHz, D2 O): d 176.8 (C), 176.4 (C), 175.9 (C), 175.8 (C), 175.7 (C), 175.6 (C), 175.4 (C), 175.3 (C), 101.7 (CH), 101.6 (CH), 100.4 (CH), 100.3 (CH), 98.3 (CH), 98.2 (CH), 94.70 (CH), 94.65 (CH), 81.6 (CH), 81.3 (CH), 80.7 (CH), 78.4 (CH), 77.7 (CH), 77.6 (CH), 77.4 (CH), 77.2 (CH), 76.6 (CH), 76.4 (CH), 74.8 (CH), 74.4 (CH), 73.0 (CH), 72.4 (CH), 72.34 (CH), 72.30 (CH), 71.8 (CH), 71.5 (CH), 71.1 (CH2 ), 70.9 (CH), 70.6 (CH), 70.5 (CH), 68.6 (CH), 68.5 (CH), 65.1 (CH), 64.4 (CH), 61.4 (CH2 ), 60.7 (CH2 ), 60.5 (CH2 ), 55.1 (CH), 54.5 (CH), 54.1 (CH), 40.5 (CH2 ), 29.0 (CH2 ), 27.3 (CH2 ), 23.3 (CH3 ), 23.0 (CH2 ), 22.9 (CH3 ); HRMS (ESI):m /z calcd for C61 H91 N5 O57 S4 Na8 ([M + 8Na – 6H]2+ ): 1058.6221, found: 1058.6226.
5-胺戊基(2-乙醯胺基-2-去氧-6-O -磺酸根基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-a-L-艾杜吡喃環草隆基-(1→4)-(2-乙醯胺基-2-去氧-6-O -磺酸根基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-b-D-葡萄吡喃環草隆基-(1→4)-(2-乙醯胺基-2-去氧-6-O -磺酸根基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-a-L-艾杜吡喃環草隆基-(1→4)-(2-乙醯胺基-2-去氧-6-O -磺酸根基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-b-D-葡萄吡喃環草隆酸酯鈉鹽(HS15)。1 H NMR (600 MHz, D2 O): d 5.43–5.38 (m, 2H), 5.21–5.18 (m, 2H), 5.01–4.99 (m, 2H), 4.62–4.58 (m, 2H), 4.49–4.46 (m, 2H), 4.39–4.36 (m, 4H), 4.25–4.22 (m, 3H), 4.12–4.10 (m, 3H), 4.02–3.98 (m, 5H), 3.99–3.96 (m, 2H), 3.93–3.91 (m, 2H), 3.85–3.82 (m, 3H), 3.80–3.73 (m, 14H), 3.61–3.57 (m, 2H), 3.39–3.36 (m, 2H), 3.35–3.31 (m, 1H), 3.04–3.00 (m, 2H), 2.07 (bs, 3H, Ac), 2.06 (bs, 3H, Ac), 2.04 (bs, 3H, Ac), 2.03 (bs, 3H, Ac), 1.71–1.67 (m, 4H, CH2 linker), 1.52–1.46 (m, 2H, CH2 linker);13 C NMR (150 MHz, D2 O): d 176.1 (C), 176.02 (C), 175.99 (C), 175.42 (C), 175.37 (C), 175.32 (C), 175.28 (C), 103.3 (CH), 103.09 (CH), 103.06 (CH), 103.03 (CH), 103.0 (CH), 102.9 (CH), 98.1 (CH), 95.5 (CH), 83.1 (CH), 80.9 (CH), 78.4 (CH), 77.9 (CH), 77.8 (CH), 77.7 (CH), 77.6 (CH), 77.5 (CH), 77.3 (CH), 76.2 (CH), 75.2 (CH), 74.62 (CH), 74.57 (CH), 74.1 (CH), 73.0 (CH), 72.2 (CH), 71.2 (CH), 71.1 (CH2 ), 70.7 (CH), 70.6 (CH), 70.5 (CH), 70.4 (CH), 70.3 (CH), 70.2 (CH), 70.1 (CH), 70.0 (CH), 67.4 (CH2 ), 67.2 (CH2 ), 66.9 (CH2 ), 54.8 (CH), 54.5 (CH), 54.1 (CH), 40.5 (CH2 ), 29.2 (CH2 ), 27.3 (CH2 ), 23.0 (CH3 ).
5-胺戊基(2-乙醯胺基-2-去氧-6-O -磺酸根基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-a-L-艾杜吡喃環草隆基-(1→4)-(2-乙醯胺基-2-去氧-6-O -磺酸根基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-a-L-艾杜吡喃環草隆基-(1→4)-(2-乙醯胺基-2-去氧-6-O -磺酸根基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-a-L-艾杜吡喃環草隆基-(1→4)-(2-乙醯胺基-2-去氧-6-O -磺酸根基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-a-L-艾杜吡喃環草隆酸酯鈉鹽(HS3)。1 H NMR (600 MHz, D2 O): d 5.23–5.10 (m, 7H), 5.03–4.93 (m, 3H), 4.33–4.20 (m, 12H), 4.16–3.96 (m, 11H), 3.95–3.84 (m, 6H), 3.83–3.66 (m, 10H), 3.63–3.58 (m, 2H), 3.10–3.00 (m, 1H), 2.08 (bs, 6H, Ac), 2.04 (bs, 3H, Ac), 2.03 (bs, 3H, Ac), 1.80–1.65 (m, 4H, CH2 linker), 1.52–1.46 (m, 2H, CH2 linker);13 C NMR (150 MHz, D2 O): d 175.5 (C), 175.3 (C), 175.2 (C), 175.0 (C), 174.8 (C), 174.4 (C), 102.0 (CH), 101.8 (CH), 100.8 (CH), 99.2 (CH), 94.4 (CH), 93.7 (CH), 74.0 (CH), 71.2 (CH), 71.0 (CH), 70.7 (CH), 70.1 (CH), 70.0 (CH), 69.8 (CH), 69.4 (CH), 69.3 (CH), 69.1 (CH), 69.0 (CH), 68.6 (CH), 68.1 (CH), 66.4 (CH), 66.2 (CH), 66.1 (CH2 ), 53.6 (CH), 53.4 (CH), 53.2 (CH), 53.1 (CH), 39.4 (CH2 ), 28.0 (CH2 ), 26.1 (CH2 ), 22.2 (CH3 ); HRMS (MALDI):m /z calcd for C61 H94 N5 O57 S4 ([M – 3H]3– ): 645.4498, found: 645.4493.
5-胺戊基(2-乙醯胺基-2-去氧-6-O -磺酸根基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-(2-O -磺酸根基-a-L-艾杜吡喃環草隆基)-(1→4)-(2-乙醯胺基-2-去氧-6-O -磺酸根基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-(2-O -磺酸根基-a-L-艾杜吡喃環草隆基)-(1→4)-(2-乙醯胺基-2-去氧-6-O -磺酸根基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-(2-O -磺酸根基-a-L-艾杜吡喃環草隆基)-(1→4)-(2-乙醯胺基-2-去氧-6-O -磺酸根基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-2-O -磺酸根基-a-L-艾杜吡喃環草隆酸酯鈉鹽(HS5)。1 H NMR (600 MHz, D2 O): d 5.24–2.18 (m 5H), 5.18–5.08 (m, 5H), 5.04–4.89 (m, 2H), 4.35–4.20 (m, 13H), 4.15–3.93 (m, 9H), 3.94–3.79 (m, 4H), 3.79–3.59 (m, 10 H), 3.56 (t,J = 9.7 Hz, 1H), 3.00 (t,J = 7.2 Hz, 2H), 2.08 (s, 3H, Ac), 2.06 (s, 3H, Ac), 2.01 (s, 6H, Ac × 2), 1.73–1.59 (m, 4H), 1.52–1.38 (m, 2H);13 C NMR (150 MHz, D2 O): d 174.8 (C), 174.4 (C), 174.3 (C), 172.7 (C), 101.8 (CH), 100.9 (CH), 99.1 (CH), 99.0 (CH), 98.5 (CH), 95.3 (CH), 94.9 (CH), 76.3 (CH), 76.2 (CH), 73.7 (CH), 73.6 (CH), 71.0 (CH), 70.8 (CH), 70.6 (CH), 70.56 (CH), 69.7 (CH), 69.6 (CH), 68.9 (CH), 68.7 (CH), 68.6 (CH2 ), 67.4 (CH), 67.3 (CH), 66.5 (CH), 66.3 (CH2 ), 66.1 (CH2 ), 53.4 (CH), 53.3 (CH), 53.1 (CH), 39.3 (CH2 ), 27.9 (CH2 ), 27.6 (CH2 ), 26.4 (CH2 ), 22.2 (CH2 ), 22.1 (CH3 ), 21.9 (CH3 ), 21.8 (CH3 ); HRMS (ESI):m /z calcd for C61 H93 N5 O69 S8 ([M – 4H]4– ): 563.7922, found: 563.7941.
5-胺戊基(2-去氧-2-磺胺基-6-O -磺酸根基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-a-L-艾杜吡喃環草隆基-(1→4)-(2-去氧-2-磺胺基-6-O -磺酸根基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-a-L-艾杜吡喃環草隆基-(1→4)-(2-去氧-2-磺胺基-6-O -磺酸根基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-a-L-艾杜吡喃環草隆基-(1→4)-(2-去氧-2-磺胺基-6-O -磺酸根基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-a-L-艾杜吡喃環草隆酸酯鈉鹽(HS4)。1 H NMR (600 MHz, D2 O): d 5.38–5.33 (m, 4H), 5.02 (bs, 4H), 4.89 (bs, 2H), 4.51 (d,J = 2.4 Hz, 1H), 4.40–4.33 (m, 4H), 4.25–4.17 (m, 4H), 4.16–4.10 (m, 4H), 4.10–4.05 (m, 4H), 4.05–3.93 (m, 5H), 3.88–3.83 (m, 1H), 3.82–3.73 (m, 7H), 3.70–3.65 (m, 5H), 3.58 (t,J = 9.7 Hz, 1H), 3.30–3.20 (m, 4H), 3.00 (td,J = 2.1, 7.5 Hz, 2H), 1.73–1.64 (m, 4H, CH2 linker), 1.49–1.43 (m, 2H, CH2 linker);13 C NMR (150 MHz, D2 O): d 175.4 (C), 175.2 (C), 101.9 (CH), 100.7 (CH), 95.6 (CH), 95.58 (CH), 95.5 (CH), 77.6 (CH), 77.4 (CH), 77.3 (CH), 71.2 (CH), 69.9 (CH), 69.8 (CH), 69.0(CH), 68.9 (CH), 68.6 (CH), 68.4 (CH), 68.3 (CH), 68.0 (CH2 ), 67.8 (CH), 67.5 (CH), 66.4 (CH2 ), 66.2 (CH2 ), 57.8 (CH), 57.7 (CH), 39.4 (CH2 ), 28.0 (CH2 ), 26.2 (CH2 ), 22.2 (CH2 ); HRMS (ESI):m /z calcd for C53 H78 N5 O65 S8 Na8 ([M + 8Na – 11H]3– ): 754.6633, found: 754.6641.
5-胺戊基(2-去氧-2-磺胺基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-(2-O -磺酸根基-a-L-艾杜吡喃環草隆基)-(1→4)-(2-去氧-2-磺胺基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-(2-O -磺酸根基-b-D-葡萄吡喃環草隆基-(1→4)-(2-去氧-2-磺胺基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-(2-O -磺酸根基-a-L-艾杜吡喃環草隆基)-(1→4)-(2-去氧-2-磺胺基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-2-O -磺酸根基-b-D-葡萄吡喃環草隆酸酯鈉鹽(HS14)。1 H NMR (600 MHz, D2 O): d 5.61 (d,J = 3.7 Hz, 1H), 5.60 (d,J = 3.5 Hz, 1H), 5.35–5.32 (m, 2H), 5.27 (bs, 2H), 4.89–4.87 (m, 1H), 4.72 (d,J = 7.7 Hz, 1H), 4.64 (d,J = 7.8 Hz, 1H), 4.37–4.34 (m, 2H), 4.29–4.25 (m, 2H), 4.18 (t,J = 8.5 Hz, 1H), 4.12 (t,J = 8.6 Hz, 1H), 4.08–4.04 (m, 3H), 4.01–3.98 (m, 2H), 3.90–3.84 (m, 12H), 3.83–3.80 (m, 4H), 3.77–3.73 (m, 2H), 3.73–3.70 (m, 3H), 3.70–3.65 (m, 5H), 3.48 (t,J = 9.5 Hz, 1H), 3.28 (dd,J = 10.6, 3.5 Hz, 1H), 3.27–3.22 (m, 3H), 3.02 (t,J = 7.4 Hz, 1H), 1.72–1.63 (m, 4H, CH2 linker), 1.57–1.46 (m, 2H, CH2 linker);13 C NMR (150 MHz, D2 O): d 176.5 (C), 176.2 (C), 175.9 (C), 175.6 (C), 101.8 (CH), 101.7 (CH), 100.2 (CH), 98.9 (CH), 98.3 (CH), 81.1 (CH), 80.7 (CH), 80.6 (CH), 78.4 (CH), 78.2 (CH), 78.1 (CH), 77.9 (CH), 77.5 (CH), 77.4 (CH), 76.6 (CH), 76.2 (CH), 75.9 (CH), 75.7 (CH), 72.7 (CH), 72.3 (CH), 72.2 (CH), 71.7 (CH), 71.10 (CH2 ), 71.08 (CH), 70.93 (CH), 70.90 (CH), 70.4 (CH), 69.5 (CH), 69.3 (CH), 69.0 (CH), 68.8 (CH), 61.4 (CH2 ), 60.8 (CH2 ), 60.4 (CH2 ), 59.4 (CH), 59.2 (CH), 58.9 (CH), 40.6 (CH2 ), 29.1 (CH2 ), 27.5 (CH2 ), 23.0 (CH2 ).
5-胺戊基(2-去氧-2-磺胺基-6-O -磺酸根基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-a-L-艾杜吡喃環草隆基-(1→4)-(2-去氧-2-磺胺基-6-O -磺酸根基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-b-D-葡萄吡喃環草隆基-(1→4)-(2-去氧-2-磺胺基-6-O -磺酸根基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-a-L-艾杜吡喃環草隆基-(1→4)-(2-去氧-2-磺胺基-6-O -磺酸根基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-b-D-葡萄吡喃環草隆酸酯鈉鹽(HS16)。1 H NMR (600 MHz, D2 O): d 5.58 (bs, 1H), 5.38–5.32 (m, 2H), 5.04-4.99 (m, 2H), 4.76–4.72 (m, 2H), 4.62–4.58 (m, 2H), 4.46 (d,J = 7.9 Hz, 1H), 4.38–4.30 (m, 2H), 4.21–4.17 (m, 3H), 4.12–4.10 (m, 2H), 4.03–4.00 (m, 1H), 3.95–3.92 (m, 1H), 3.88–3.83 (m, 2H), 3.81–3.67 (m, 13H), 3.66–3.62 (m, 2H), 3.58–3.54 (m, 2H), 3.53–3.49 (m, 1H), 3.40–3.36 (m, 1H), 3.34 (d,J = 7.7 Hz, 1H), 3.32–3.30 (m, 2H), 3.29–3.24 (m, 3H), 3.21 (dd,J = 10.3, 3.3 Hz, 1H), 2.99 (t,J = 7.4 Hz, 1H), 1.71–1.60 (m, 4H, CH2 linker), 1.50–1.40 (m, 2H, CH2 linker);13 C NMR (150 MHz, D2 O): d 176.51 (C), 176.47 (C), 176.1 (C), 176.0 (C), 103.2 (CH), 103.0 (CH), 102.94 (CH), 102.91 (CH), 98.7 (CH), 98.5 (CH), 96.6 (CH), 96.4 (CH), 78.7 (CH), 78.3 (CH), 78.2 (CH), 78.1 (CH), 77.8 (CH), 77.5 (CH), 77.4 (CH), 76.9 (CH), 76.7 (CH), 76.2 (CH), 75.6 (CH), 75.44 (CH), 75.40 (CH), 74.1 (CH), 73.9 (CH), 73.8 (CH), 73.0 (CH), 72.3 (CH), 71.02 (CH2 ), 70.96 (CH), 70.9 (CH), 70.7 (CH), 70.1 (CH), 70.0 (CH), 69.9 (CH), 69.8 (CH), 69.65 (CH), 69.56 (CH), 69.5 (CH), 68.8 (CH), 67.4 (CH2 ), 67.3 (CH2 ), 66.9 (CH2 ), 59.2 (CH), 58.8 (CH), 58.3 (CH), 40.5 (CH2 ), 29.2 (CH2 ), 27.3 (CH2 ), 23.0 (CH2 ); HRMS (ESI):m /z calcd for C53 H79 N5 O65 S8 Na6 ([M + 6Na – 10H]4– ): 554.7546, found: 554.7562.
5-胺戊基(2-乙醯胺基-2-去氧-6-O -磺酸根基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-(2-O -磺酸根基-a-L-艾杜吡喃環草隆基)-(1→4)-(2-乙醯胺基-2-去氧-6-O -磺酸根基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-(2-O -磺酸根基-b-D-葡萄吡喃環草隆基)-(1→4)-(2-乙醯胺基-2-去氧-6-O -磺酸根基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-(2-O -磺酸根基-a-L-艾杜吡喃環草隆基)-(1→4)-(2-乙醯胺基-2-去氧-6-O -磺酸根基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-2-O -磺酸根基-b-D-葡萄吡喃環草隆酸酯鈉鹽(HS11)。1 H NMR (600 MHz, D2 O): d 5.42 (s, 1H), 5.38 (s, 1H), 5.23 (s, 2H), 5.19 (s, 2H), 4.94 (s, 1H), 4.89 (s, 1H), 4.64 (d,J = 7.7 Hz, 1H), 4.60 (d,J = 10.6 Hz, 1H), 4.40–4.35 (m, 5H), 4.33 (bs, 1H), 4.29–4.25 (m, 5H), 4.18 (t,J = 8.4 Hz, 1H), 4.13–4.07 (m, 4H), 4.07–4.00 (m, 6H), 3.98–3.91 (m, 5H), 3.89–3.81 (m, 9H), 3.77 (d,J = 9.6 Hz, 1H), 3.75–3.70 (m, 2H), 3.59 (t,J = 9.6 Hz, 1H), 3.04 (t,J = 7.3 Hz, 2H), 2.09 (bs, 6H, CH3 × 2), 2.08 (bs, 3H, Ac), 2.07 (bs, 3H, Ac), 1.75–1.66 (m, 4H, CH2 linker), 1.56–1.49 (m, 2H, CH2 linker);13 C NMR (150 MHz, D2 O): d 176.4 (C), 176.1 (C), 175.8 (C), 175.7 (C), 175.4 (C), 175.3 (C), 101.5 (CH), 101.0 (CH), 100.1 (CH), 100.0 (CH), 98.3 (CH), 98.1 (CH), 95.2 (CH), 94.8 (CH), 81.6 (CH), 81.1 (CH), 78.9 (CH), 77.8 (CH), 77.6 (CH), 77.3 (CH), 77.1 (CH), 76.9 (CH), 76.5 (CH), 76.4 (CH), 75.4 (CH), 74.9 (CH), 73.4 (CH), 72.3 (CH), 72.1 (CH), 71.13 (CH), 71.11 (CH2 ), 70.5 (CH), 70.4 (CH), 70.34 (CH), 70.30 (CH), 70.26 (CH), 70.1 (CH), 69.2 (CH), 68.9 (CH), 67.5 (CH2 ), 67.3 (CH2 ), 66.8 (CH2 ), 66.3 (CH), 65.2 (CH), 54.7 (CH), 54.3 (CH), 54.0 (CH), 40.5 (CH2 ), 29.0 (CH2 ), 27.3 (CH2 ), 23.3 (CH3 ), 22.97 (CH2 ), 22.95 (CH3 ); HRMS (ESI):m /z calcd for C61 H87 N5 O69 S8 Na6 ([M + 6Na – 10H]4– ): 596.7651, found: 596.7657.
5-胺戊基(2-去氧-2-磺胺基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-(2-O -磺酸根基-a-L-艾杜吡喃環草隆基)-(1→4)-(2-去氧-2-磺胺基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-(2-O -磺酸根基-a-L-艾杜吡喃環草隆基)-(1→4)-(2-去氧-2-磺胺基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-(2-O -磺酸根基-a-L-艾杜吡喃環草隆基)-(1→4)-(2-去氧-2-磺胺基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-2-O -磺酸根基-a-L-艾杜吡喃環草隆酸酯鈉鹽(HS8)。1 H NMR (600 MHz, D2 O): d 5.40–5.27 (m,7H), 5.10 (d,J = 2.5 Hz, 1H), 4.93–4.90 (m, 1H), 4.87–4.85 (m, 1H), 4.89–4.87 (m, 1H), 4.48–4.47 (m,1H), 4.38–4.31 (m, 4H), 4.27–4.20 (m, 4H), 4.19–4.17 (m, 1H), 4.11–4.00 (m, 5H), 3.91–3.80 (m, 12H), 3.78–3.64 (m, 11H), 3.45 (t,J = 9.6 Hz, 1H), 3.26–3.20 (m,4H), 2.99 (t,J = 7.9 Hz, 1H), 1.71–1.59 (m, 4H, CH2 linker), 1.50–1.39 (m, 2H, CH2 linker); HRMS (ESI):m /z calcd for C53 H84 N5 O65 S8 ([M – 5H]5– ): 417.2238, found: 417.2224.
5-胺戊基(2-去氧-2-磺胺基-6-O -磺酸根基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-(2-O -磺酸根基-a-L-艾杜吡喃環草隆基)-(1→4)-(2-去氧-2-磺胺基-6-O -磺酸根基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-(2-O -磺酸根基-b-D-葡萄吡喃環草隆基)-(1→4)-(2-去氧-2-磺胺基-6-O -磺酸根基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-(2-O -磺酸根基-a-L-艾杜吡喃環草隆基)-(1→4)-(2-去氧-2-磺胺基-6-O -磺酸根基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-2-O -磺酸根基-b-D-葡萄吡喃環草隆酸酯鈉鹽(HS12)。1 H NMR (600 MHz, D2 O): d 5.68 (d,J = 3.6 Hz, 1H), 5.64 (d,J = 3.6 Hz, 1H), 5.49–5.46 (m, 2H), 5.30 (bs, 2H), 4.98 (d,J = 1.08 Hz, 1H), 4.94 (d,J = 1.0 Hz, 1H), 4.66 (d,J = 7.7 Hz, 1H), 4.60 (d,J = 10.8 Hz, 1H), 4.44–4.38 (m, 5H), 4.38-4.34 (m, 2H), 4.33–4.28 (m, 2H), 4.26 (d,J = 10.0 Hz, 2H), 4.24–4.20 (m, 3H), 4.16 (dd,J = 8.70, 8.19 Hz, 1H), 4.10–4.06 (m, 2H), 4.05–3.98 (m, 6H), 3.98–3.97 (m, 1H), 3.97–3.92 (m, 4H), 3.92 (bs, 1H), 3.91–3.84 (m, 4H), 3.79 (t,J = 9.7 Hz, 1H), 3.75–3.70 (m, 1H), 3.61 (t,J = 9.7 Hz, 1H), 3.45 (dd,J = 10.7, 3.7 Hz, 1H), 3.43–3.38 (m, 3H), 3.05 (t,J = 7.4 Hz, 2H), 1.76–1.66 (m, 4H, CH2 linker), 1.59–1.49 (m, 2H, CH2 linker);13 C NMR (150 MHz, D2 O): d 176.4 (C), 176.1 (C), 175.6 (C), 101.6 (CH), 101.0 (CH), 99.9 (CH), 99.6 (CH), 97.0 (CH), 96.7 (CH), 92.3 (CH), 92.2 (CH), 81.1 (CH), 80.7 (CH), 78.3 (CH), 78.0 (CH), 77.9 (CH), 77.2 (CH), 77.0 (CH), 76.9 (CH), 76.3 (CH), 76.1 (CH), 76.0 (CH), 74.0 (CH), 73.8 (CH), 71.8 (CH), 71.3 (CH), 71.1 (CH2 ), 70.8 (CH), 70.7 (CH), 70.4 (CH), 69.8 (CH), 69.5 (CH), 69.3 (CH), 68.7 (CH), 68.3 (CH), 68.2 (CH), 67.14 (CH2 ), 67.07 (CH2 ), 66.5 (CH2 ), 64.0 (CH), 63.6 (CH), 55.4 (CH), 55.2 (CH), 55.0 (CH), 40.5 (CH2 ), 29.0 (CH2 ), 27.2 (CH2 ), 23.0 (CH2 ).
5-胺戊基(2-去氧-2-磺胺基-6-O -磺酸根基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-(2-O -磺酸根基-a-L-艾杜吡喃環草隆基)-(1→4)-(2-去氧-2-磺胺基-6-O -磺酸根基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-(2-O -磺酸根基-a-L-艾杜吡喃環草隆基)-(1→4)-(2-去氧-2-磺胺基-6-O -磺酸根基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-(2-O -磺酸根基-a-L-艾杜吡喃環草隆基)-(1→4)-(2-去氧-2-磺胺基-6-O -磺酸根基-a-D-葡萄吡喃醣基)-(1→4)-2-O -磺酸根基-a-L-艾杜吡喃環草隆酸酯鈉鹽(HS6)。1 H NMR (600 MHz, D2 O): d 5.43–5.36 (m 4H), 5.24–5.15 (m, 4H), 5.09–5.04 (m, 2H), 4.76–4.75 (m, 2H), 4.48–4.46 (m, 1H), 4.43–4.29 (m, 7H), 4.28–4.15 (m, 9 H), 4.12–3.95 (m, 8 H), 3.83–3.71 (m, 5 H), 3.69–3.60 (m, 5 H), 3.54 (t,J = 9.4 Hz, 1H), 3.29–3.19 (m, 4H), 3.01–2.93 (m, 2H), 1.69–1.51 (m, 4H), 1.47–1.39 (m, 2H);13 C NMR (150 MHz, D2 O): d 99.0 (CH), 97.7 (CH), 97.3 (CH), 97.2 (CH), 96.8 (CH), 76.4 (CH), 76.3 (CH), 76.2 (CH), 76.1 (CH), 76.0 (CH), 75.9 (CH), 75.8 (CH), 75.4 (CH), 68.9 (CH), 68.8 (CH), 68.6 (CH), 68.2 (CH2 ), 66.4 (CH2 ), 66.3 (CH2 ), 57.9 (CH), 39.4 (CH2 ), 27.8 (CH2 ), 26.2 (CH2 ), 22.2 (CH2 ); HRMS (ESI):m /z calcd for C53 H73 N5 O77 S12 Na4 H12 ([M + 4Na – 9H]5– ): 498.7747, found: 498.7736.
實施例 2 使用預先塗佈實施例一之磺化八 醣的磁珠來捕捉膽管癌細胞
按照「材料與方法」章節所述之步驟來建構一種使用實施例一之磺化八糖的磁珠來捕捉癌細胞的微流體系統。
在一預測試中，分別將八種細胞株（MMNK-1、SNU-478、HuCCT-1、Huh-28、KKU-100、HepG2、BxPC3與HCT8）注入微系統中並與磁珠作用，接著以磁力收集被捕捉之細胞，最後注入血球細胞計數器中計算捕捉率。其結果總結於表一。
表一 以實施例一之HS1或HS12來捕捉不同細胞株之捕捉率（％）。
在八種細胞株中，HS12與HS1對Huh28細胞（一種膽管癌細胞株）具有高度專一性。HS12與HS1對Huh28細胞的最高捕捉率分別為73±4％與78±14％，其比塗佈上皮細胞黏附因子（EpCAM）之磁珠的捕捉率（58±19％）為高。此外，相較於對正常細胞（MMNK-1）和轉移性膽管癌細胞（HuCCT-1）的低捕捉率，HS12和HS1甚至更具專一性。因此，HS12和HS1有潛力作為用於檢測膽管癌細胞的專一性親和試劑。
第2圖說明預先塗佈100微體積莫耳濃度之HS1的磁珠可成功地捕捉Huh-28癌細胞。第2圖a為磁珠捕捉之前的Huh-28細胞。在將Huh-28細胞與磁珠充分混合30分鐘後，細胞被磁珠包圍（第2圖b）。在作用30分鐘後，藉由磁力分離並收集上清液，如第2圖c所示。幾乎所有的Huh-28細胞均被磁珠捕捉並分離，且只有極為少數的細胞可在上清液中觀察到。這表示大多數Huh-28細胞均被捕獲。
雖然實施例於上述文中僅作為示範例之用，然於本發明所屬技術領域中具有通常知識者，可以對其進行各種修改。以上說明書、實施例與數據提供對於本發明示範性實施例的結構與用途之完整描述。雖然上述文字已以一定程度之特殊性描述本發明中不同實施例，或參考一或多個單獨實施例，但本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。
100‧‧‧微流體晶片
102‧‧‧洗滌緩衝液腔
104‧‧‧捕捉腔
106‧‧‧廢液腔
108‧‧‧微通道
110‧‧‧玻璃基板
120‧‧‧第一PDMS層
130‧‧‧第二PDMS層
以下隨附圖式包含在說明書中並構成說明書的一部分，闡述了本發明不同態樣的實施例系統、方法與例示範性實施方式。在參閱以下的詳細說明及附隨圖式後，本揭示內容將更明顯易懂，其中：
第 1 圖：微流體晶片之示意圖。 (a)微流體晶片之示意圖，其自底部到頂部包括一玻璃基板、一PDMS薄層及一PDMS厚層。(b)一示意圖，其說明刻在PDMS層中的洗滌緩衝液腔、捕捉腔、廢液腔及微通道。
第 2 圖：相片圖闡述以 HS-1 塗佈之磁珠來捕捉 Huh-28 細胞。 (a)未捕捉的Huh-28細胞；(b)在作用30分鐘後，以HS-1塗佈之磁珠來捕捉Huh-28細胞；以及(c)自磁珠與細胞的複合物中所收集之上清液。所有影像均為100×放大。

Claims (16)

  1. 一種用以偵測一生物樣本中膽管癌細胞（cholangio-cancerous cells）之方法，該方法包含：使該生物樣本與一預先塗佈有一式(I)之磺化八醣（sulfated octasaccharide）的磁珠接觸，其中， R1 是-NHAc或-NHSO3 M； R2 與R3 個別為H或-SO3 M；以及 M是一單價陽離子，其選自由鈉離子、鉀離子、鋰離子及銨離子所組成的群組；以及 該生物樣本與該磁珠之間的結合表示該生物樣本中具有膽管癌細胞。
  2. 如請求項1所述之方法，其中該式(I)之磺化八醣更與一生物素（biotin）連接。
  3. 如請求項1所述之方法，其中在該式(I)之磺化八醣中，R1 是-NHSO3 Na；且R2 與R3 個別為-SO3 Na。
  4. 如請求項1所述之方法，其中在該式(I)之磺化八醣中，R1 是-NHSO3 Na，R2 與R3 個別為H。
  5. 如請求項1所述之方法，其中該生物樣本是選自由血液、血漿、血清、尿液、痰液、唾液、組織樣本、活體組織切片和組織溶胞產物（tissue lysate）所組成之群組。
  6. 一種微流體晶片，包含： 複數個洗滌緩衝液腔（wash buffer chambers），其分別用以滯留（hold）其中的洗滌緩衝液； 複數個捕捉腔（capture chambers），其分別用以將一癌細胞捕捉至一預先塗佈有一癌細胞生物標記的磁珠上； 一廢液腔（waste chamber），其用以滯留自該複數個捕捉腔中洗出之未被捕捉到的癌細胞；以及 複數個微通道（microchannels），其用以連接該複數個洗滌緩衝液腔、該複數個捕捉腔與該廢液腔。
  7. 如請求項6所述之微流體晶片，其中該微流體晶片是由一玻璃基板和至少一聚二甲基矽氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）層所製成。
  8. 如請求項7所述之微流體晶片，其中各該捕捉腔是用以自一液體樣本中分離出與該磁珠結合之癌細胞。
  9. 如請求項8所述之微流體晶片，其中該磁珠上預先塗佈有式(I)之磺化八醣，其中， R1 是-NHAc或-NHSO3 M； R2 與R3 個別為H或-SO3 M；以及 M是一單價陽離子，其選自由鈉離子、鉀離子、鋰離子及銨離子所組成的群組。
  10. 如請求項9所述之微流體晶片，其中該式(I)之磺化八醣更與一生物素連接。
  11. 如請求項9所述之微流體晶片，其中在該式(I)之磺化八醣中，R1 是-NHSO3 Na；且R2 與R3 個別為–SO3 Na。
  12. 如請求項9所述之微流體晶片，其中在該式(I)之磺化八醣中，R1 是-NHSO3 Na，R2 與R3 個別為H。
  13. 一種套組，包含： 如請求項6所述之微流體晶片， 複數個磁珠，其上分別塗佈有一生物標記， 至少一試劑，其可與如請求項6所述之微流體晶片一起使用來分析一生物樣本，以及 一使用說明，其用以指示一使用者如何使用該套組； 其中， 該生物標記為一具式(I)結構之磺化八醣，其中， R1 是-NHAc或-NHSO3 M；R2 與R3 個別為H或-SO3 M；且M是一單價陽離子，其選自由鈉離子、鉀離子、鋰離子及銨離子所組成的群組。
  14. 如請求項13所述之套組，其中在該式(I)之磺化八醣中，R1 是-NHSO3 Na；且R2 與R3 個別為-SO3 Na。
  15. 如請求項13所述之套組，其中在該式(I)之磺化八醣中，R1 是-NHSO3 Na，R2 與R3 個別為H。
  16. 如請求項13所述之套組，其中該生物樣本是血液、血漿、血清、尿液、痰液、唾液、組織、活體組織切片或組織溶胞產物。
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