TWI735875B - 用於偵測膽管癌細胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種用於偵測膽管癌細胞的方法。本發明對於膽管癌細胞的抓取率高於70%，可配合多種具高親和力與專一性的八醣體修飾於磁珠表面上，對待測膽管癌細胞進行抓取與分析，其中該膽管癌細胞可為膽管癌循環腫瘤細胞。

Description

用於偵測膽管癌細胞的方法
本發明是有關於一種用於偵測膽管癌(cholangiocarcinoma)細胞的方法。
癌症，或惡性腫瘤，每年在全球造成數以百萬計的死亡，其亦是臺灣地區近幾年來十大死因排名的第一位。在各種癌症中，膽管癌是較少見的原發性惡性肝腫瘤，與另一種原發性惡性肝腫瘤肝細胞癌(hepatocellular carcinoma)相比較，其臨床症狀、診斷及流行病學特徵各方面皆不相同。膽道系統分布在整個肝內，從肝細胞表面凹槽形成的微膽管開始，逐漸匯流成小膽管、左右肝內膽管再穿出肝外合成為總肝管，與膽囊交匯後成為總膽管，最後流入十二指腸。膽管癌可以從任何有膽管的地方產生，包括肝內膽管及肝外膽管。膽管癌分為兩型：肝門型及週邊型，前者即使腫瘤很小也可能造成阻塞性黃疸，後者往往像肝癌一樣在肝臟內形成一個病灶佔住部分肝臟，直到末期才會有黃疸之症狀。不論是那一型，預後都很不好。
由於膽管癌在早期並沒有明顯症狀，難以診斷及偵測，多數患者在診斷出膽管癌時，疾病已經進展至晚期，無法治癒。在這些無法治癒的病人可進行和緩醫療，包含手術切除、化學療法、放射線療法，以及置放膽道支架等。完全手術切除是唯一的治癒希望，但有約三分之一的病人腫瘤會侵犯總膽管，而此類腫瘤無法手術切除，因此僅有少數腫瘤可以進行完全切除。完全切除後仍然建議繼續進行化療及放療。有些符合特定條件的病人可以進行肝臟移植，但術後的五年存活率仍不到五成。因此，本領域的研究人員皆致力於開發新的膽管癌治療及偵測方式，以達到早期發現早期治療之目的。
癌症轉移(cancer metastasis)是癌症引起死亡的主要原因。循環腫瘤細胞(circulating tumor cells,CTCs)，自1869年即被證實，是從原發性腫瘤部位逃逸至鄰近脈管系統並隨後存在於血液循環中的細胞。已有證據表明，血液循環中循環腫瘤細胞的存在與癌症轉移有關。因此，本領域的技術人員已致力於研究循環腫瘤細胞以理解癌症轉移的機制。此研究方向可刺激本領域的技術人員開發出新的癌症治療策略。
此外，在臨床應用方面，循環腫瘤細胞的分析(被視為液體腫瘤活檢(liquid tumor biopsy))可被使用作為診斷或預後工具，以供監測癌症轉移或治療反應，及指導個體化治療。為了實現這些目標，有必要自血液樣品中分離出高純度的循環腫瘤細胞以盡可能避免周邊血液細胞(主要是白血球)造成的分析干擾。
然而，循環腫瘤細胞在血液樣品中非常稀少，其濃度大約為每105~107個血液單核細胞有1個循環腫瘤細胞。此現象使循環腫瘤細胞難以分離及純化，特別是以高純度方式純化。目前已有各種不同的循環腫瘤細胞分離及純化方法，大致可分類為物理及生化方法。總體而言，以物理為基礎之循環腫瘤細胞的分離方法(主要是過濾)易於實施且不需要標記收穫的細胞，但細胞純度低於生化方法所達到的純度。在生化方法中，免疫式細胞分離法(例如免疫磁珠法)主要用於循環腫瘤細胞分離及純化。在此方法中，與循環腫瘤細胞的表面標誌蛋白(主要是上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)及細胞角蛋白(cytokeratins,CKs))專一性抗體偶合的磁珠通常用於辨識及結合循環腫瘤細胞。透過施加的磁場將磁性標記的循環腫瘤細胞從周邊細胞分離。根據此方法的循環腫瘤細胞分離主要用於目前的循環腫瘤細胞分離或偵測系統(例如CellSearchTM系統、磁性活化的細胞篩選系統或DynabeadsTM)。總體而言，透過上述細胞分離方式所得到的循環腫瘤細胞的細胞純度範圍從20%至50%。
雖然已有上述循環腫瘤細胞偵測及分離方式，但得到的循環腫瘤細胞中白血球的汙染往往是不可避免的，可能在之後的循環腫瘤細胞相關分析(特別是基因表現分析)中產生問題，容易造成低估或錯判。此問題主要是因為某些白血球基因的表現位準(level)尚不清楚。因此，這些白血球的存在會干擾後續的分析工作。此事實突顯了分離出高純度(理想為100%)循環腫瘤細胞以供後 續高精度分析的重要性。除了循環腫瘤細胞的純度問題，還有一些重要的生物學問題需要進一步考慮。如前所述，大部分循環腫瘤細胞的分離或純化方式主要依賴使用EpCAM或CKs來鑑定循環腫瘤細胞。然而，循環腫瘤細胞(特別是具有高轉移性的循環腫瘤細胞)可能經歷上皮間質轉化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)。之後，循環腫瘤細胞可能會降低EpCAM及CKs的表現並變成運動細胞移動至遠處轉移部位。在此情況下，若採用傳統的循環腫瘤細胞分離及偵測方法，可能會遺漏這些臨床上重要的與癌症轉移有關聯的循環腫瘤細胞，特別是難以偵測的膽管癌循環腫瘤細胞。
因此，本領域的技術人員亟需研發出新穎之用於偵測膽管癌細胞(例如膽管癌循環腫瘤細胞)的方法，以克服習知技術的缺點並造福有此需求的廣大族群。
有鑑於此，本發明之目的為提供一種用於偵測膽管癌細胞的方法，包含以下步驟：(a)將一檢體與至少一八醣體(octasaccharide)接觸，使該檢體中的膽管癌細胞與該八醣體結合，以及(b)藉由一結合反應偵測該檢體中膽管癌細胞的存在。
在本發明的一實施例中，在步驟(a)中，該方法進一步包含以該八醣體修飾一磁珠表面。
在本發明的一實施例中，該結合反應係該八醣體修飾之磁珠抓取膽管癌細胞，且經一磁場導引分離出已與該八醣體結合之膽管癌細胞。
在本發明的一實施例中，該八醣體係與一標記結合，該標記係螢光標記、化學發光標記、放射性同位素、酶標記或生物素。
在本發明的一實施例中，在步驟(b)中，該方法進一步包含對已與該八醣體結合之膽管癌細胞進行一免疫螢光染色。
在本發明的一實施例中，該膽管癌細胞是一膽管癌循環腫瘤細胞。
在本發明的一實施例中，該免疫螢光染色是利用一細胞角蛋白17(cytokeratin 17,CK17)抗體及一CD45抗體來進行，該膽管癌循環腫瘤細胞是一CK17陽性及CD45陰性之細胞。
在本發明的一實施例中，該方法是於一微流體晶片上進行，其中該微流體晶片包括一在4Hz的驅動頻率下施加-100~-400mmHg的表壓之操作條件。
在本發明的一實施例中，該八醣體具有下列結構式(I)：
Figure 108116267-A0101-12-0004-2
在本發明的一實施例中，該八醣體具有下列結構式(II)：
Figure 108116267-A0101-12-0004-3
在本發明的一實施例中，該檢體是來自於一個體的一全血，該全血被進行一移除紅血球及白血球的前處理。
綜上所述，本發明用於偵測膽管癌細胞的方法的功效在於：對於膽管癌細胞的抓取率(capture rate)高於70%、可配合多種具高親和力與專一性的八醣體修飾於磁珠表面上，對待測CTCs進行抓取與分析。另外，相較於傳統混合器，本發明方法利用微流體晶片可將待測檢體與專一性磁珠的混合時間從30分鐘大幅降至5分鐘，並且透過整套檢測流程，膽管癌細胞可成功被抓取呈現赫斯特33258(Hoechst 33258)及細胞角蛋白17(cytokeratin 17,CK17)而無抗-CD45(anti-CD45)的膽管癌之專一性螢光訊號，排除白血球與其它細胞干擾。再者，比照傳統CellSearch®機台之檢測時間，藉由微流體晶片系統之應用可減半至2小時。而本發明更進一步運用在臨床檢體進行晶片外的初步測試，並成功在兩位肝內膽管癌患者之3mL血液中分別偵測到1及4顆膽管癌細胞，即相較於先前技術，本發明所需之全血量僅為2~3mL即可進行膽管癌細胞之偵測，先 前技術則需要用到至少7.5mL的全血量。因此，本發明的技術特徵在於首次成功發展以整合型微流體作為微量循環腫瘤細胞偵測之方法。
以下將進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
1‧‧‧微流體晶片
11‧‧‧開放型微混合器
12‧‧‧微幫浦
13‧‧‧試劑槽
14‧‧‧常閉閥
15‧‧‧廢物出口
16‧‧‧玻璃基板
17‧‧‧空氣通道層
18‧‧‧液體通道層
a‧‧‧血液樣品
b‧‧‧上清液儲存器
c‧‧‧八醣體包覆的珠粒
d‧‧‧CD45包覆的珠粒
e‧‧‧4%三聚甲醛
f‧‧‧0.1% Triton X-100
g‧‧‧一級抗體
h‧‧‧二級抗體
i‧‧‧清洗緩衝液
圖1A是微流體晶片的示意圖。
圖1B是微流體晶片的組裝示意圖。
圖1C是微流體晶片的製備之示意圖。
圖2是自動化微流體系統的操作流程之示意圖。
圖3A至圖3E顯示在施加-100至-500mmHg的表壓下的混合指數。
圖4是微混合器的剪切力之數據圖。
圖5A是八醣體的雙醣單元的結構示意圖。
圖5B是八醣體的雙醣單元的另一結構示意圖。
圖6A顯示使用100μM包覆珠粒的八醣體SCH-46(具有式(II)結構式)，Huh28細胞的抓取率與作用時間之間的關係。
圖6B是加入全血的膽管癌(cholangiocarcinoma,CCA)細胞的免疫螢光染色圖。
圖7顯示從兩名患者的血液樣品中檢測到的抓取細胞之明視野及螢光影像。
定義
本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在20%的範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內。
如本文中所使用的，用語“循環腫瘤細胞(circulating tumor cell,CTC)”意為包含存在於與癌症有關的生物樣品中之任何稀少的腫瘤細胞。
如本文中所使用的，「微流體晶片」、「微流體裝置」、及「晶片」一詞在本文中可互換使用，以表示一獨立的整合單元，其具有一微流體反應器、一個或多個微流體流道、及一個或多個閥門(valve)。微流體晶片亦典型地具有其他微流體組件，例如：泵浦(pump)、槽(chamber)、混合器(mixer)、及其類似的組件。微流體晶片通常係由合成橡膠(elastomer)、玻璃(glass)、或矽(silicon)製成。典型地，微流體晶片係為具有一高度相較於長度及寬度為短的盒狀物，然而，晶片亦可為任意形狀，例如：立方體、圓柱體、或其他。
「檢體」一詞，係任何衍生自病患之生物檢體，包括但不限於生物液體，諸如：血液、血清、血漿、尿液、腦脊髓液、淚液、唾液、淋巴、透析液、灌洗液及其他液體樣本，以及生物來源之細胞及組織。該辭彙亦包括細胞或其衍生之細胞及其子代，包括培養物中之細胞、細胞上清液及細胞裂解物。該辭彙亦包括器官或組織培養物衍生的液體、組生檢樣本、腫瘤生檢樣本、糞便樣本、萃取自生理組織之液體以及分離自固態組織、組織切片及細胞裂解物之細胞。此一定義涵括在其獲得之後以任何方式操作之樣本，諸如：以試劑處理、溶解或使其富含某些組成份，諸如：聚核苷酸或胜肽；亦包括病患樣本之衛生物及區份。病患樣本可用於診斷或其他監測分析；亦可應用於來自非人類哺乳動物之生物檢體。該檢體可來自人類病患或非人類哺乳動物。
如本文中所使用的，用語“八醣體(octasaccharide)”意指由八個醣類(saccharides)所組成的四個雙醣單元(disaccharide units)。
如本文中所使用的，用語“磁珠”與“珠粒”可交換使用。
實施例1. 微流體晶片的設計與製備
本實施例中的微流體平台包括一血球細胞消除模組、一癌細胞分離模組及一免疫螢光染色模組。微流體晶片1的元件包括一開放型微混合器(open-type micromixer)11、複數微幫浦(micropump)12、八個試劑槽13(包括圖1A中的符號c、d、e、i、f、g及h)、一上清液儲存器(supernatant reservoir)b、複數常閉閥(normally-closed valve)14、及一廢物出口(waste outlet)15，如圖1A 所示，其中a表示血液樣品；b表示上清液儲存器；c表示八醣體包覆的珠粒；d表示CD45包覆的珠粒；e表示4%三聚甲醛(paraformaldehyde)；f表示0.1% Triton X-100；g表示一級抗體、h表示二級抗體(赫斯特33258(Hoechst 33258))；i表示清洗緩衝液。開放型微混合器11、微幫浦12及常閉閥14可利用已知或自製機器的程式及電磁閥經由施加正與負表壓來使膜變而控制，以執行樣品及試劑的混合與運輸。藉由整合上述元件，本實施例的微流體晶片可執行血液樣品預處理、癌細胞分離及免疫螢光染色的程序。
如圖1B所示，使用兩個聚二甲基矽氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)層及一玻璃基板16製備微流體晶片。厚膜PDMS用作空氣通道層17，另一個薄膜PDMS用作液體通道層18。空氣通道層17及液體通道層18的主模是由配備有一個0.5mm鑽頭的電腦數值控制(computer-numerical-control,GNC)機(GX-400,Roland Inc.，日本)來刻製。聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate,PMMA)上的主模微結構藉由CNC機械加工過程形成，如圖1C的(a)及(d)所示。接著，進行PDMS澆鑄及複製模塑程序以得到主模的反向結構。透過將固化劑(curing agent)及PDMS預聚物(pre-polymer)(Sylgard 184A/B,Sil-More Industrial Ltd.,USA)以1：10的重量比混合而製備PDMS，透過將PDMS置於真空室中40分鐘以除去所有氣泡。除去氣泡後，用PDMS混合物手動填充主模，並在85℃下固化3小時(參見圖1C的(b)及(e))。接著，將兩個PDMS層從主模上剝離，如圖1C的(c)及(f)所示，然後透過電漿氧化程序將厚與薄的PDMS層黏合在一起(參見圖1C的(g))。最後，透過相同的電漿氧化程序將組合的PDMS與玻璃基板黏合，如圖1C的(h)所示。
實施例2. 自動化微流體系統的操作流程
本實施例說明微流體系統可以自動化進行白血球移除、膽管癌(cholangiocarcinoma,CCA)細胞分離及免疫螢光染色。首先，加入105個人類膽管癌細胞株Huh28細胞(由成大醫院外科提供)的全血樣品(2~3mL)以紅血球裂解緩衝液預處理5分鐘。在以1,200rpm離心並再懸浮於1×PBS中後(參見圖2的(a))，將樣品裝載到微流體系統上的微混合器中藉由抗-CD45抗體(Dynabeads® CD45)進行白血球移除，Dynabeads® CD45為CD45包覆的珠粒。簡言之，將樣品中的白血球與Dynabeads® CD45一起培養，並透過施加磁場收集被抓取的白 血球，將上清液轉移至上清液儲存器，然後洗去聚集的Dynabeads® CD45，接而將上清液轉移回微混合器(參見圖2的(b))。在進行白血球移除三次之後，將八醣體包覆的珠粒轉移到含有CCA細胞的腔室中，並藉由八醣體包覆的珠粒分離CCA細胞(參見圖2的(c))，然後在4%三聚甲醛(PFA)中固定(fixation)並用0.1% triton X-100通透化(permeabilization)。接著，以赫斯特33258(Hoechst 33258)(核染料)、陽性(細胞角蛋白17(cytokeratin 17,CK17))及陰性(CD45)抗體進行染色，如圖2的(d)所示。
實施例3. 微流體系統的效能評估
在本實施例中，用於CCA細胞偵測的微流體晶片由數個元件組成，包括微混合器、微幫浦及常閉閥。在整個晶片上(on-chip)實驗之前，測量微流體晶片的效能，包括混合指數(mixing index)及剪切力(shear force)，使得最佳操作條件可以應用於微流體系統。
3.1 微混合器的混合指數
為了透過氣動微混合器(pneumatic micromixer)將細胞及八醣體包覆的珠粒有效地作用，測試並計算能夠反映微混合器混合效率的混合指數。選擇用於混合效率測試的兩種液體樣品是120μL去離子水及5μL藍色墨水。在1、2及4Hz的驅動頻率下施加-100至-500mmHg的表壓，以產生不同的混合效率。而常閉閥上的恆定表壓為51.7mmHg。實驗在顯微鏡下進行，該顯微鏡連接到用於獲得光學圖像的冷卻電荷耦合裝置(charge-coupled-device,CCD)相機(EvolutionTM VF Color Cooled，加拿大)。接著，透過數位影像加工處理被抓取的圖像，並用ImageJ分析以計算混合指數。混合指數(σ)是微混合器的混合效率的定量效能，如公式(1)所示：
Figure 108116267-A0101-12-0008-4
 其中C+是在混合室(mixing chamber)(A)的截面積內分布的局部正規化濃度(local normalized concentration)，且
Figure 108116267-A0101-12-0008-50
及
Figure 108116267-A0101-12-0008-51
是關於完全未混合及完全混合的狀態之濃度。當混合物完全未混合時，σ設定為0%。相反地，若混合物完全混合，則σ為100%。
圖3A至圖3E顯示在施加-100至-500mmHg的表壓下的混合指數，並且每一圖是在三個選定的頻率(1Hz、2Hz及4Hz)下進行。五個施加的表壓的結果說明最佳混合效能為4Hz。當在4Hz下施加-100、-200及-300mmHg時，在2秒內達到完全混合，並且在相同的驅動頻率下施加-400或-500mmHg的壓力僅需要1秒來混合。在4Hz下施加的五個表壓的混合指數達到約97%。根據混合指數測試的結果，以4Hz施加的表壓-400mmHg會是在微流體晶片上反應的最佳操作條件。然而，仍然需要參考微混合器的剪切力測試結果，以優化培育細胞及八醣體包覆的珠粒的最佳操作條件。剪切力試驗的結果如下所示。
3.2 微混合器的剪切力
為了避免細胞表面上的受體與八醣體之間的任何結合破壞，本實施例透過控制剪切力實現氣動微混合器內的溫和混合。在本實施例中，選擇懸浮在去離子水中的聚苯乙烯(polystyrene)珠粒(
Figure 108116267-A0101-12-0009-49
=40μm,4240A,Thermo Fisher Scientific,USA)來測試及計算剪切力。施加的表壓與選擇用來測量混合指數的值相同，即-100至-500mmHg，驅動頻率為0.5Hz，以形成塑膠珠粒的不同流速。而常閉閥上的恆定表壓為51.7mmHg。在連接到冷卻CCD相機(EvolutionTM VF Color Cooled，加拿大)的顯微鏡下進行實驗。將相機鏡頭設置在腔室的中間高度，並透過數位影像加工及被抓取的圖像分析來測量塑膠珠粒的流速，以計算出剪切力，如公式(2)所示：
Figure 108116267-A0101-12-0009-5
 其中τ是剪切應力(shear stress)，μ是動態黏度(dynamic viscosity)(H2O,25℃=0.89×10-3Ns/m2)，u是塑膠珠粒的流速，y是腔室的中間高度(y=3×10-4m)，A是環形區域(annular field)面積(A=3.28×10-6m2)。
可以觀察到，施加的表壓越高，剪切力越大，如圖4所示。在每個施加的表壓下測量的壁剪切力分別為15±2nN、20±1nN、24±3nN、29±2nN及31±1nN。為了透過溫和混合達到透過八醣體抓取細胞，將最佳表壓的選擇與混合指數測試的結果相結合。儘管-400mmHg是完全混合的最佳操作條件，但-100mmHg壓力對於溫和混合是最佳的，使得細胞和八醣體之間僅在2秒內有 足夠的結合。因此，選擇在4Hz的驅動頻率下施加-100mmHg的表壓作為在微流體系統上的微混合器的最佳操作條件。
實施例4. 利用抓取效率進行八醣體的專一性測試
本實施例中所使用的細胞包括膽管癌細胞株：SNU478、HuCCT1、Huh28、KKU100、不朽化膽管上皮細胞株MMNK1、胰臟癌細胞株BxPC3、肝癌細胞株HepG2及結腸直腸癌細胞株HCT8，其中SNU478、HuCCT1、Huh28、KKU100、及不朽化膽管上皮細胞株MMNK1由成大醫院外科提供；胰臟癌細胞株BxPC3及肝癌細胞株HepG2由中山大學生醫所鄭光宏博士提供；結腸直腸癌細胞株HCT8由清華大學生科所張晃猷教授提供。SNU478、HuCCT1、Huh28及KKU100用作陽性選擇的標的細胞，其分別衍生自Vater氏壺腹(ampulla of Vater)、肝內轉移性腹水、肝內膽管及與泰國肝吸蟲(Opisthorchis viverrini)有關的肝門膽管的CCA細胞株。關於陰性選擇，使用MMNK1(不朽化膽管上皮(immortalized biliary epithelial))及各種類型的癌細胞株，包括BxPC3(胰臟癌)、HepG2(肝癌)及HCT8(結腸直腸癌)。在這些細胞株中，SNU478、HuCCT1、Huh28、BxPC3及HCT8在含有100U/mL青黴素及100μg/mL鏈黴素(Pen Strep,Gibco®,Thermo Fisher Scientific,USA)、10%胎牛血清(FBS,Gibco®,Thermo Fisher Scientific,USA)的洛斯維帕克紀念研究所1640(Roswell Park Memorial Institute 1640,RPMI 1640)培養基(Gibco®,Thermo Fisher Scientific,USA)中培養。KKU100、MMNK1及HepG2的生長培養基是補充有上述添加劑的杜貝可氏改良的依格氏培養基(Dulbecco’s modified Eagle medium,DMEM)(Gibco®,Thermo Fisher Scientific,USA)。所有細胞在37℃，含5% CO2的環境下在潮濕的培養箱中培養。
另外，在本實施例中，透過磁珠抓取細胞。磁珠表面分別包覆有三種濃度的10種硫酸乙醯肝素(heparan sulfate,HS)八醣體，即SCH-43至SCH-52。本實施例中所使用的磁珠是Dynabeads® MyOneTM鏈黴抗生物素蛋白T1(Dynabeads® MyOneTM Streptavidin T1)(約7-10×109珠粒/mL，
Figure 108116267-A0101-12-0010-52
=1μm,Invitrogen,Thermo Fisher Scientific,USA)。簡言之，首先將1μM、10μM及100μM濃度的每種八醣體與體積比為1：10的磁珠一起作用，並置於轉動旋轉器(wheeling rotator)(RM-2L INTELLI-mixer,ELMI Ltd.,Latvia)上，在25rpm，C2 模式下在室溫下保持30分鐘。接著，使用磁性顆粒濃縮器(magnetic particle concentrator)(MPC,Dynabeads® MPC®-1,Life Technologies)收集珠粒2分鐘，然後去除上清液並用1mL的去離子水洗滌包覆的珠粒三次。最後，將包覆的珠粒懸浮在與Dynabeads®的初始體積相同體積的去離子水中。
用於鑑定上面細胞株的十種八醣體是由台灣中央研究院基因體研究中心(Genomics Research Center at Academia Sinica,Taiwan)的洪上程博士合成的。這十種八醣體的結構由四種可變硫酸化雙醣單元(variably sulfated disaccharide unit)組成，其中包括N-乙醯-α-D-葡萄糖胺(N-acetyl-α-D-glucosamine,α-D-GlcNAc)及β-D-葡萄糖醛酸(β-D-glucuronic acid,β-D-GlcA)(參見圖5A)或α-L-艾杜糖醛酸(α-L-iduronic acid,α-L-IdoA)(參見圖5B)透過1→4連接，然後是生物素(biotin)連接，以便與Dynabeads®上的鏈黴抗生物素蛋白結合。透過一系列酵素程序修飾上述骨架，包括α-D-GlcNAc的N及/或O6位置的磺化(sulfonation)(顯示為NS及6S)，及β-D-GlcA/α-L-IdoA的O2位置(顯示為2S)。 α-D-GlcNAc、β-D-GlcA及α-L-IdoA的符號分別定義為■、
Figure 108116267-A0101-12-0011-53
、以及
Figure 108116267-A0101-12-0011-54
。藉由重複雙醣單元的組合，將來自SCH-43至SCH-52的十種八醣體分為兩組，即
Figure 108116267-A0101-12-0011-7
(NINININI)及
Figure 108116267-A0101-12-0011-8
(NINGNING)。SCH-43及SCH-49~52是NINININI組的成員，SCH-44~48的骨架是NINGNING組。SCH-43~52的磺化位置差異描述如下。
八醣體SCH-43的生物描述(Biologic depiction)為
Figure 108116267-A0101-12-0011-6
，並具有以下結構式：
Figure 108116267-A0101-12-0011-9
八醣體SCH-49的生物描述為
Figure 108116267-A0101-12-0011-11
，並具有以下結構式：
Figure 108116267-A0101-12-0011-10
八醣體SCH-50的生物描述為
Figure 108116267-A0101-12-0012-47
，並具有以下結構式：
Figure 108116267-A0101-12-0012-48
八醣體SCH-51的生物描述為
Figure 108116267-A0101-12-0012-19
，並具有以下結構式：
Figure 108116267-A0101-12-0012-18
八醣體SCH-52的生物描述為
Figure 108116267-A0101-12-0012-17
，並具有以下結構式：
Figure 108116267-A0101-12-0012-16
八醣體SCH-44的生物描述為
Figure 108116267-A0101-12-0012-12
，並具有以下結構式：
Figure 108116267-A0101-12-0012-13
八醣體SCH-45的生物描述為
Figure 108116267-A0101-12-0013-22
，並具有以下結構式(I)：
Figure 108116267-A0101-12-0013-20
八醣體SCH-46的生物描述為
Figure 108116267-A0101-12-0013-21
，並具有以下結構式(II)：
Figure 108116267-A0101-12-0013-23
八醣體SCH-47的生物描述為
Figure 108116267-A0101-12-0013-24
，並具有以下結構式：
Figure 108116267-A0101-12-0013-25
八醣體SCH-48的生物描述為
Figure 108116267-A0101-12-0013-26
，並具有以下結構式：
Figure 108116267-A0101-12-0013-27
在本實施例中，以上述10種八醣體對上述8種細胞株進行抓取實驗，以確定它們的親和力。因此，藉由使用傳統的振盪器，將2×105個細胞與三種濃度(1μM、10μM及100μM)的每種八醣體一起培育30分鐘。培育後洗滌，並在倒置顯微鏡下透過血球計計算抓取細胞的量。透過ANOVA的統計分析， 將與一具有高專一性的細胞株結合的八醣體與其他細胞株進行比較。表1顯示用預先包覆有八醣體SCH-45(具有式(I)結構式)及SCH-46(具有式(II)結構式)的珠粒結合的各種細胞株的抓取率。
Figure 108116267-A0101-12-0014-28
由表1可見，在本實施例所使用的10種八醣體中，SCH-45及SCH-46對CCA細胞株Huh28具有高度專一性。由SCH-45及SCH-46抓取的100μM包覆珠粒的膽管癌細胞株Huh28的最高抓取率分別為73±4%及78±14%，顯著高於其他類型的細胞株，甚至包含不朽化膽管上皮細胞株MMNK1，其抓取率僅分別為16±8%及34±5%。SCH-45及SCH-46能夠抓取超過70%的膽管癌細胞株Huh28，其高於上皮細胞黏附分子(EpCAM)包覆的珠粒，其抓取率僅為58±19%。此外，EpCAM無法區分不朽化膽管上皮細胞株MMNK1及其他癌類型的細胞，導致錯誤診斷。
實施例5. 八醣體作為早期臨床檢查或癌症預後追蹤的潛力工具之測試
為了確定SCH-45及SCH-46是否可以成為早期臨床檢查或癌症預後追蹤的潛力工具，如血液檢測，本實施例使用100μM包覆珠粒的SCH-45及SCH-46進行白血球的抓取測試。
本實施例中使用的全血由國立成功大學醫學院附設醫院提供，儲存於4℃(IRB編號：A-ER-103-063及A-ER-105-109)。為了在用血液樣品使用八醣體包覆的珠粒獲得良好的抓取效率，預處理全血以除去血球細胞，包括紅血球(RBC)及白血球(WBC)。換言之，全血預處理過程包括RBC裂解步驟及WBC消除步驟。由於發現本發明的微流體系統透過SCH-46包覆的珠粒有效地檢測膽管癌細胞株Huh28細胞，因此將Huh28細胞摻入全血中以模擬用CCA患者的血液樣品檢測CTCs。在1.5mL微量離心管(Eppendorf tube)中用105 Huh28細胞接種全血。接著，使用以去離子水稀釋至1×工作濃度的商用RBC裂解緩衝液(Cat.420301,BioLegend,USA)進行RBC裂解。將100μL加料樣品與1×RBC裂解緩衝液以1：10體積/體積比在轉動旋轉器上以25rpm，C2模式作用5分鐘，然後以1200rpm離心5分鐘以移除上清液。將沉澱物洗滌兩次並再懸浮於100μL的1×磷酸鹽緩衝液(PBS)中。
在RBC裂解步驟後，進行WBC消除步驟。當與上述物質(RBC裂解處理過之含添加Huh28細胞的血液樣品)以7：1的比例混合時，WBC被Dynabeads® CD45(4×108珠粒/mL,
Figure 108116267-A0101-12-0015-55
=4.5μm,Invitrogen,Thermo Fisher Scientific,USA)抓取。對於1mL全血，有7×107珠粒，並且表明三次消除可以去除99.8% WBC以降低對標的細胞的抓取效率的干擾。在RBC裂解後，將100μL包含約105至106個WBC的再懸浮溶液與7×106Dynabeads® CD45透過轉動旋轉器以25rpm，C2模式在室溫下混合30分鐘。在使用磁性顆粒濃縮器分離珠粒-WBC複合物2分鐘後，將上清液轉移到新的微量離心管中。將WBC消除過程重複兩次以除去大部分WBC，然後培育30分鐘，以使CCA細胞透過SCH-46包覆的珠粒被抓取。
本實施例透過紅血球(RBC)裂解緩衝液預處理2mL全血，並分成兩個相等的體積以在有和沒有白血球(WBC)消除的情況下進行WBC的抓取測試。透過與Dynabeads® CD45培育30分鐘進行WBC消除的那一次，磁力分離並洗掉被珠粒抓取的WBC。接著，與八醣體包覆的珠粒混合30分鐘，以計算抓取的WBC的數量，結果顯示於下表2。
Figure 108116267-A0101-12-0016-29
表2顯示的結果表明透過消除與否，透過100μM包覆珠粒的SCH-45及SCH-46抓取的WBC數量。可以觀察到，在沒有消除WBC的情況下，使用SCH-45及SCH-46包覆珠粒抓取的WBC的數量分別為約6×104及3×104個細胞。對於臨床樣品，大量的白血球會影響八醣體包覆的珠粒對少數CTC的抓取效率，從而導致錯誤診斷。然而，當WBC消除三次時，抓取的WBC的量顯著減少至少於50個細胞，使得WBC對CTC抓取的影響被減少，進而提高診斷準確性。根據八醣體對細胞株及WBC的親和力及專一性測試，藉由SCH-45及SCH-46測試之WBC抓取率對CCA的比例分別為5×10-5及1×10-5。結果表明，SCH-45及SCH-46以高抓取率專一性辨識Huh28，而非WBC。因此，SCH-45及SCH-46可能是有潛力的親和試劑，用於在CCA患者的血液樣品早期診斷CTC或癌症預後。
實施例6. 利用微流體系統進行細胞抓取 6.1 細胞與八醣體包覆珠粒之間的培育時間
在本實施例中，使用微流體系統執行前述每個細胞株的抓取測試。為了證實八醣體對CCA及其他癌細胞株的親和力，在微流體系統進行細胞株與八醣體之間的混合過程。在倒置顯微鏡下透過血球計觀察併計算被包覆有八醣體的珠粒抓取的細胞數。並且細胞株與包覆有八醣體的珠粒之間的抓取率(公式(3))呈現如下：抓取率=被結合的細胞數/初始被裝載的細胞數×100% (3)
為了在精確控制及防止任何人為誤差的情況下獲得細胞與八醣體之間的高親和力，將實驗程序移至本發明研發的微流體晶片。此外，為了實現使用微晶片的高效檢測過程，本實施例測試了標的細胞與八醣體包覆的珠粒 之間的培育時間。圖6A顯示使用100μM包覆珠粒的SCH-46，Huh28細胞的抓取率與培育時間之間的關係。由圖6A可見，抓取率增加直至混合5分鐘，並且在作用5分鐘後變得飽和。因此，晶片上的最佳作用時間設定為5分鐘，抓取率為78±9%，類似於使用傳統振盪器的抓取率。然而，與傳統在實驗台上接近30分鐘相比，混合時間大幅縮短，同時對於標的細胞Huh28實現類似的抓取效率。
6.2 加入全血的CCA細胞的免疫螢光染色
在本實施例中，在晶片上進行WBC消除的流程包括將再懸浮的溶液注入微晶片的微混合器中。接著，將Dynabeads® CD45從儲存室(storage chamber)轉移到微混合器中，並以4Hz的驅動頻率在-100mmHg的施加表壓下作用。在混合10分鐘後，用磁力(約2980~3200Gauss,
Figure 108116267-A0101-12-0017-56
=10mm)將珠粒-WBC複合物分離2分鐘。將上清液轉移至上清液儲存器，並透過抽吸移除珠粒-WBC複合物。上述整個WBC消除過程重複兩次，然後用SCH-46包覆的珠粒在晶片上抓取CCA細胞5分鐘。
將加入Huh28細胞的全血樣品預先進行RBC裂解及以上述方式進行WBC消除預處理，然後使用SCH-46包覆的珠粒抓取Huh28細胞，接而用陽性、陰性抗體(Abs)及核酸染料(即CK17、CD45及赫斯特33258)進行免疫螢光染色，其中CK17對CCA細胞具有高度專一性及靈敏度，CD45可識別WBC。在晶片上進行WBC消除後，仍然存在約0.2%的WBC。為了避免WBC與SCH-46的非專一性結合的誤判，用SCH-46包覆的珠粒抓取的細胞以上述試劑染色以進行確認。
在用CK17、CD45及赫斯特33258進行免疫螢光染色之前，透過在4%三聚甲醛(PFA)(Amresco,LLC.,USA)中固定5分鐘及用0.1% triton X-100(Sigma,USA)進行5分鐘通透化來預處理珠粒-細胞複合物。接著，用含有3%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)(Sigma-Aldrich)的50μL的1×PBS稀釋1μL的CK17一級抗體(100μL,0.6μg/mL,GTX103765，兔子，GeneTex,USA)及1μL的CD45抗體(ARG21370,Arigo Biolaboratories Corporation，台灣)，並與珠粒-細胞複合物一起培育60分鐘。在洗去未結合的一級抗體後，用50μL的1×PBS適當稀釋1μL的螢光標記的CK17二級抗體(山羊抗兔子IgG，Alexa 488； GeneTex,USA)，並與樣品混合30分鐘。接著，將1μL的赫斯特33258(Invitrogen,USA)用50μL的1×PBS稀釋，並用於將細胞核染色5分鐘。免疫螢光染色的所有步驟均在室溫下進行。
與在實驗台上進行免疫螢光染色相比，在微流體系統上經由WBC消除及CCA細胞分離處理的樣品如上所述固定並通透化。在清洗兩次後，將稀釋的CK17一級抗體及CD45抗體轉移至微混合器並與珠粒-細胞複合物一起培育30分鐘。在珠粒-細胞複合物的磁性分離並洗去未結合的抗體之後，將稀釋的CK17二級抗體及赫斯特33258轉移到微混合器中並混合5分鐘。接著，去除未結合的二級抗體及赫斯特。將處理過的樣品從微混合器中取出並裝載在載玻片上，在具有數位控制模組的倒置顯微鏡下觀察。所有明視野(bright field)及螢光影像最終由NIS-Elements Basic Research軟體(Br,version 4.20.00,64 bit,Nikon，日本)抓取。
加入全血的CCA細胞的整個檢測過程由晶片外RBC裂解過程、晶片上WBC消除過程、晶片上CCA細胞抓取及晶片上免疫螢光染色過程組成。接著，用SCH-46包覆的珠粒抓取的細胞以赫斯特33258(藍色)、CK17(綠色，陽性)及CD45(紅色，陰性)染色以進行確認。圖6B的(a)顯示由SCH-46包覆的珠粒抓取的Huh28細胞的明視野影像，CD45、CK17及赫斯特33258的螢光訊號分別顯示在圖6B的(b)、(c)及(d)，CD45、CK17及赫斯特33258合併的螢光影像如圖6B的(e)所示，珠粒抓取的Huh28細胞的合併影像顯示於圖6B的(f)。所有影像在500×放大率下被捕捉。可以觀察到抓取的細胞被赫斯特33258及CK17成功染色而沒有CD45，結果證實抓取的細胞是CCA細胞。因此，本發明的微流體系統能夠實現加入全血的CCA細胞的檢測程序。與CellSearch®系統相比，SCH-46被用作具有高度專一性及親和力的試劑，可將CCA細胞由樣品中的其他組分分離，優於EpCAM。藉由微流體系統，將整個檢測過程所需時間從4小時減少到2小時。
實施例7. 用臨床樣品在實驗台上檢測CTC
來自正常人及兩名肝內膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,iCCA)患者的血液樣品透過實驗台上CTC檢測程序進行預測試。對每個血液樣 品(3mL)進行處理，包括RBC裂解、WBC消除、CCA細胞分離及免疫螢光染色步驟。檢測來自經處理的患者血液樣品的SCH-46包覆的珠粒抓取的某些細胞並以赫斯特染色。透過CK17及CD45抗體的螢光訊號進一步證實被抓取的細胞。細胞顯示CK17但沒有CD45訊號，這進一步證實其為CCA細胞(陽性細胞)。相反地，若細胞具有CD45訊號，將其定義為非CCA細胞(陰性細胞)。對於正常的血液樣品，沒有檢測到CCA細胞。
臨床前試驗的結果如圖7所示，所有影像在500×放大率下被捕捉，其顯示從兩名患者的血液樣品中檢測到的抓取細胞的明視野及螢光影像。圖7的a-1至a-4表明在來自患者(a)的3mL血液中發現4顆陽性細胞，其患有iCCA，4B期(stage 4B)，並且抓取一顆陰性細胞並用CD45抗體染色，如圖7的a-5所示。在患有iCCA的患者(b)的血液中，分別檢測到一顆陽性細胞及一顆陰性細胞，如圖7的b-1及b-2所示。結果初步證明，對Huh28細胞具有專一性的八醣體SCH-46可應用於iCCA的臨床樣品。根據螢光影像，證實SCH-46包覆的珠粒能夠以高專一性及親和力從血球細胞中分離CCA細胞。整個CTC檢測程序也證實了其在臨床診斷中的適用性。
綜上所述，本發明用於偵測膽管癌細胞的方法對於膽管癌細胞的抓取率高於70%、可配合多種具高親和力與專一性的八醣體修飾於磁珠表面上，對待測CTCs進行抓取與分析。另外，相較於傳統混合器，本發明方法利用微流體晶片可將待測檢體與專一性磁珠的混合時間從30分鐘大幅降至5分鐘，並且透過整套檢測流程，膽管癌細胞可成功被抓取呈現赫斯特33258及CK17而無抗-CD45的膽管癌之專一性螢光訊號，排除白血球與其它細胞干擾。再者，比照傳統CellSearch®機台之檢測時間，藉由微流體晶片系統之應用可減半至2小時。而本發明更進一步運用在臨床檢體進行晶片外的初步測試，並成功在兩位肝內膽管癌患者之3mL血液中分別偵測到1及4顆膽管癌細胞，即相較於先前技術，本發明所需之全血量僅為2~3mL即可進行膽管癌細胞之偵測，先前技術則需要用到至少7.5mL的全血量。因此，本發明首次成功發展以整合型微流體作為微量循環腫瘤細胞偵測之方法。
以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。

Claims (6)

  1. 一種用於偵測膽管癌細胞的方法，包含以下步驟：(a)將一檢體與至少一八醣體(octasaccharide)接觸，使該檢體中的膽管癌細胞與該八醣體結合，以及(b)藉由一結合反應偵測該檢體中膽管癌細胞的存在，其中該膽管癌細胞是一膽管癌循環腫瘤細胞，該方法的步驟(a)與(b)是於一微流體晶片上進行，該八醣體具有一選自於下列所組成之群組中的結構式：
    Figure 108116267-A0305-02-0023-1
    Figure 108116267-A0305-02-0023-3
     及其組合；其中，該免疫螢光染色是利用一細胞角蛋白17(cytokeratin 17,CK17)抗體及一CD45抗體來進行，該膽管癌循環腫瘤細胞是一CK17陽性及CD45陰性之細胞；該檢體是來自於一個體的一全血，該全血被進行一移除紅血球及白血球的前處理；以及該微流體晶片包括一開放型微混合器、複數微幫浦、八個試劑槽、一上清液儲存器、複數常閉閥、及一廢物出口。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中在步驟(a)，該方法進一步包含以該八醣體修飾一磁珠表面。
  3. 如申請專利範圍第2項所述的方法，其中該結合反應係該八醣體修飾之磁珠抓取膽管癌細胞，且經一磁場導引分離出已與該八醣體結合之膽管癌細胞。
  4. 如申請專利範圍第3項所述的方法，其中該八醣體係與一標記結合，該標記係螢光標記、化學發光標記、放射性同位素、酶標記或生物素。
  5. 如申請專利範圍第4項所述的方法，其中在步驟(b)中，該方法進一步包含對已與該八醣體結合之膽管癌細胞進行一免疫螢光染色。
  6. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該微流體晶片包括一在4Hz的驅動頻率下施加-100~-400mmHg的表壓之操作條件。
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JP2021515220A (ja) * 2018-03-01 2021-06-17 アカデミア シニカＡｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａ がん細胞検出用の装置及び方法
CN117777216A (zh) * 2022-09-21 2024-03-29 中国科学院上海药物研究所 可中和的生物素化肝素五糖的制备方法和用途

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JP2021515220A (ja) * 2018-03-01 2021-06-17 アカデミア シニカＡｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａ がん細胞検出用の装置及び方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Wei-Chun Tsai, et al. " A Microfluidic System for Detection of holangiocarcinoma Cells by Using Heparan Sulfate Octasaccharides" Proceedings of the 12th IEEE International Conference on Nano/Micro Engineered and Molecular Systems, April 9 2017,Page(s):489-493. *

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